KR101626343B1 - 30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 - Google Patents
30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101626343B1 KR101626343B1 KR1020150001973A KR20150001973A KR101626343B1 KR 101626343 B1 KR101626343 B1 KR 101626343B1 KR 1020150001973 A KR1020150001973 A KR 1020150001973A KR 20150001973 A KR20150001973 A KR 20150001973A KR 101626343 B1 KR101626343 B1 KR 101626343B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- cell
- peptide
- cells
- 30kc19α
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 79
- 208000011616 HELIX syndrome Diseases 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 98
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 76
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NKIJBSVPDYIEAT-UHFFFAOYSA-N 1,4,7,10-tetrazacyclododec-10-ene Chemical compound C1CNCCN=CCNCCN1 NKIJBSVPDYIEAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZOOGPBRAOKZFK-UHFFFAOYSA-K gadopentetate Chemical compound [Gd+3].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O IZOOGPBRAOKZFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940032362 superoxide dismutase Drugs 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N 0.000 description 1
- XMUIKZODBRYDCK-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6,9-hexahydro-1h-1,4,7-triazonine Chemical compound C1CNCC=NCCN1 XMUIKZODBRYDCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRUVVLWKPGIYEG-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[carboxymethyl-[(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]ethyl-[(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]acetic acid Chemical compound C=1C=CC=C(O)C=1CN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC1=CC=CC=C1O GRUVVLWKPGIYEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 JHALWMSZGCVVEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJPMYXWVWQWCSR-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJPMYXWVWQWCSR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N RZZMZYZXNJRPOJ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N Ala-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- BHFOJPDOQPWJRN-XDTLVQLUSA-N Ala-Tyr-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O BHFOJPDOQPWJRN-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 1
- RCAUJZASOAFTAJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N RCAUJZASOAFTAJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N Arg-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KWQPAXYXVMHJJR-AVGNSLFASA-N Asn-Gln-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KWQPAXYXVMHJJR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JTXVXGXTRXMOFJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PZXPWHFYZXTFBI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N Asp-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O DONWIPDSZZJHHK-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-His Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- HARKMOWFMWOEPY-UHFFFAOYSA-N C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(CN)N.N1CCNCCCNCNCCCC1 Chemical compound C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(CN)N.N1CCNCCCNCNCCCC1 HARKMOWFMWOEPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108700006830 Drosophila Antp Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052691 Erbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SMLDOQHTOAAFJQ-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SMLDOQHTOAAFJQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KJBGAZSLZAQDPV-KKUMJFAQSA-N Glu-Phe-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N KJBGAZSLZAQDPV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MXJYXYDREQWUMS-XKBZYTNZSA-N Glu-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MXJYXYDREQWUMS-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DWUKOTKSTDWGAE-BQBZGAKWSA-N Gly-Asn-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DWUKOTKSTDWGAE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LLXVQPKEQQCISF-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN LLXVQPKEQQCISF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- DLTCGJZBNFOWFL-LKTVYLICSA-N His-Tyr-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DLTCGJZBNFOWFL-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- TWYOYAKMLHWMOJ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Leu-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TWYOYAKMLHWMOJ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- FXJLRZFMKGHYJP-CFMVVWHZSA-N Ile-Tyr-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N FXJLRZFMKGHYJP-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- -1 Leu / Val Chemical compound 0.000 description 1
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLDHBYRUNQZIJQ-DKIMLUQUSA-N Leu-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QLDHBYRUNQZIJQ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- MVVSHHJKJRZVNY-ACRUOGEOSA-N Leu-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MVVSHHJKJRZVNY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WGAZVKFCPHXZLO-SZMVWBNQSA-N Leu-Trp-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N WGAZVKFCPHXZLO-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N Leu-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- YIBOAHAOAWACDK-QEJZJMRPSA-N Lys-Ala-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YIBOAHAOAWACDK-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- KPJJOZUXFOLGMQ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Asn Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N KPJJOZUXFOLGMQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WGCKDDHUFPQSMZ-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN WGCKDDHUFPQSMZ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N Met-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N WYEXWKAWMNJKPN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- PWPBGAJJYJJVPI-PJODQICGSA-N Met-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 PWPBGAJJYJJVPI-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- ANCPZNHGZUCSSC-ULQDDVLXSA-N Met-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)CC1=CC=C(O)C=C1 ANCPZNHGZUCSSC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- DPUOLKQSMYLRDR-UBHSHLNASA-N Phe-Arg-Ala Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DPUOLKQSMYLRDR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N Phe-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 VZFPYFRVHMSSNA-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- ZLAKUZDMKVKFAI-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZLAKUZDMKVKFAI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WOIFYRZPIORBRY-AVGNSLFASA-N Pro-Lys-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WOIFYRZPIORBRY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BSXKBOUZDAZXHE-CIUDSAMLSA-N Ser-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BSXKBOUZDAZXHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XPVIVVLLLOFBRH-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(O)=O XPVIVVLLLOFBRH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091060271 Small temporal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHDLKMFZKRUQCE-HJGDQZAQSA-N Thr-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FHDLKMFZKRUQCE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- WSGPBCAGEGHKQJ-BBRMVZONSA-N Trp-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N WSGPBCAGEGHKQJ-BBRMVZONSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFHYISDTIWZUSU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GFHYISDTIWZUSU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NKUGCYDFQKFVOJ-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NKUGCYDFQKFVOJ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N Tyr-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YODDULVCGFQRFZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N Val-Gly-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N Val-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UKEVLVBHRKWECS-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- SSKPSTBQVXGUME-UHFFFAOYSA-N [Eu].[Eu] Chemical compound [Eu].[Eu] SSKPSTBQVXGUME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIJJJPBJUGJMME-UHFFFAOYSA-N [Ta].[Ta] Chemical compound [Ta].[Ta] CIJJJPBJUGJMME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001166 anti-perspirative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003213 antiperspirant Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 159000000009 barium salts Chemical class 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N dysprosium atom Chemical compound [Dy] KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N erbium Chemical compound [Er] UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940060037 fluorine Drugs 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000003668 hormone analog Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006289 hydroxybenzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 239000001023 inorganic pigment Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002497 iodine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010090114 methionyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 150000005527 organic iodine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012860 organic pigment Substances 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940078501 superparamagnetic contrast media Drugs 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N tantalum atom Chemical compound [Ta] GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 239000006097 ultraviolet radiation absorber Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43586—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
-
- A61K47/48246—
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Botany (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 30Kc19α 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 30Kc19α는 30Kc19 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 전체 도메인 보다 우수한 세포 투과성, 세포내 안정성, 또는 세포 투과성 및 세포내 안정성을 나타내므로, 세포 투과 펩티드로서 카고와 결합하여 카고를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
Description
본 발명은 30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인(30Kc19α) 의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 30Kc19α는 30Kc19 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 전체 도메인 보다 우수한 세포 투과성, 세포내 안정성, 또는 세포 투과성 및 세포내 안정성을 나타내므로, 세포 투과 펩티드로서 카고와 결합하여 카고를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
일반적으로, 인간의 세포를 비롯한 살아있는 동물의 세포막은 단백질 혹은 핵산 등과 같은 거대 생체 분자, 그리고 자성 나노 입자와 양자점과 같은 거대 무기 물질을 통과시키지 아니한다. 일부 크기가 작은 물질들은 낮은 효율로 세포막을 통과하여 세포 내로 전달되기도 하지만, 거대 물질은 이에 대한 특이적인 수용체가 세포막에 있지 않은 한 세포 내로 전달될 수 없다. 따라서 대부분의 질병 치료 및 진단을 위해 사용되는 물질들이 세포 내로 도입하거나 전달하기 어렵다.
세포 내부로 물질을 도입하거나 전달하기 위한 다양한 방법들이 개발되었는데, 특히 핵산 등을 전달하기 위한 전기 충격(electroporation), 미세 주사체를 이용한 투사법, 그리고 리포좀을 이용한 막 융합 방법 등이 대표적이다. 그러나 상기 핵산 전달 방법은 극히 제한된 수의 세포에만 핵산을 전달할 수 있고, 세포의 종류에 따라 그 효율이 크게 다르다는 단점이 있다. 더욱이, 핵산과 달리 단백질의 경우는 현재까지 검증된 효율적인 세포 내 전달방법이 없다.
이러한 상황에서 최근 세포 투과성 단백질 또는 펩타이드가 주목받고 있다. 이 중 가장 많은 연구가 이루어진 것이 인간 면역 결핍 바이러스-1(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)에서 유래된 TAT 단백질인데, 86개의 아미노산으로 구성된 TAT 단백질에서 47번부터 57번까지의 11개 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 세포 투과 기능이 있다는 사실이 보고되었다[Fawell S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994)]. 이와 비슷한 예로는 HSV-1(Herpes Simplex Virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산[Elliott G. et al. Cell, 88,223-233(1997)]과 초파리(Drosophila)의 Antennapedia(Antp)의 339번째부터 355번째 아미노산 등이 있다[Schwarze S.R. et al. Trends Pharmacol Sci. 21, 45-48(2000)]. 최근에는 인위적으로 합성한 양전하를 띠는 펩타이드도 세포 투과 기능이 있다고 보고되었다[Laus R. et al. Nature Biotechnol. 18, 1269-1272(2000)]. 위와 같은 사실을 바탕으로 이러한 세포 투과 단백질의 PTD(Protein transduction domain)에 단백질 및 핵산을결합시켜 이들을 세포 내로 전달하는 연구들이 수행되고 있다. TAT PTD에 녹색형광단백질(Green Fluorescence Protein, GFP)를 결합시켜 세포막을 투과한다는 사실을 관찰 하였고[Park J. et al. J. Gen. Virol., 83, 1173-1181 (2002)], 역시 TAT에 Cre recombinase[Nicolas J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 316, 12-20 (2004)]와 SOD(Super Oxide Dismutase)[Eum W. et al. Free Radical Biol. Med. 37, 339-349 (2004)]를 결합시켜 세포 내로 전달하여 이 결합 단백질의 활성이 세포 내에서 나타나는지를 확인한 결과들이 보고되어 왔다. 그러나 종래에 많이 연구된 TAT을 비롯한 대다수의 세포 투과 단백질들은 바이러스 유래인 경우가 많아 생체 내(in vivo) 도입 시 세포 독성을 나타낼 수 있는 점이 문제로 지적되어 왔다. 이를 극복하기 위해 인간 유래 세포 투과 단백질이나 인위적으로 합성한 PTD들이 그 대안으로 연구가 되어 왔다. 그러나 이마저도 세포 독성에 대한 정확한 연구가 이뤄져 있지는 않은 상황이다.
가장 많이 알려진 PTD인 TAT PTD를 이용하여 단백질 및 핵산을 살아있는 세포 내로 전달하고자 하는 기술은 종래의 연구 및 특허에서 다양하게 개시되어 있다. 미국 특허공개 제20050112640호 및 제20050282281호는 TAT PTD의 유전자를 포함하는 벡터(vector)를 개시하며, 상기 벡터를 이용하여 원하는 단백질에 TAT가 결합되어 발현되도록 하였다. 또한 미국 특허공개 제20080166755호는 뼈의 형성을 돕는 단백질을 TAT와 결합시켜 뼈 생산 세포에 전달하는 기술을 개시하고 있다. 이외에도 TAT을 이용한 단백질 전달은 다양한 특허에 기재되어 있다. 또한 미국 특허공개 제20060182736호는 TAT 이외에 VP22와 Antp 같은 다른 세포 투과 단백질의 PTD를 이용한 단백질의 세포 내 전달 기술을 개시하고 있다. 상기 선행기술들은 단백질과 같은 거대 분자의 세포 전달 기술이다. 그러나 TAT와 VP22는 인체에 매우 유해한 바이러스에서 유래한 것으로서, 전장 TAT는 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있다. TAT나 VP22의 PTD 부분만을 취하여 세포에 전달시키면 전달 효율이 상승하면서 세포 독성은 상대적으로 적다는 연구 보고들이 있지만, 이에 대한 정확한 검증은 부족한 실정이다.
본 발명자들은 누에(Bombyx mori)로부터 유래하고 세포 투과 기능이 알려진 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인이 세포 투과성을 지니는 부분인 PTD(protein transduction domain)임을 규명하고, 상기 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인이 30Kc19 단백질의 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 단백질의 전체 도메인 보다 우수한 세포 투과성, 세포내 안정성, 또는 세포 투과성 및 세포내 안정성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인(30Kc19α)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩티드가 개시된다.
본 발명에 따른 세포 투과 펩티드에 있어서, 상기 30Kc19α는 30Kc19 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 전체 도메인 보다 우수한 세포 투과성, 세포내 안정성, 또는 세포 투과성 및 세포내 안정성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포 투과 펩티드에 있어서, 상기 30Kc19α는 누에(Bombyx mori)로부터 유래된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포 투과 펩티드에 있어서, 상기 30Kc19α는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드, 및 상기 세포 투과 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는 카고 전달 시스템이 개시된다.
본 발명에 따른 카고 전달 시스템에 있어서, 상기 카고는 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 조영물질, 약물 또는 화학 물질인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 카고 전달 시스템에 있어서, 상기 펩티드는 사이토카인, 항체, 항체 단편, 치료용 효소 또는 가용성 수용체인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 카고 전달 시스템에 있어서, 상기 조영물질은 방사선 비투과성 조영물질, 상자성 조영물질, 초상자성 조영물질 또는 CT 조영물질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드 및 조영 물질을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 적용 약물 전달 경로 추적 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 약물 전달 경로 추적 방법에 있어서, 상기 30Kc19α는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드 및 약물을 포함하는 조성물 및 상기 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 대상의 세포 내 약물 전달용 키트가 개시된다.
본 발명에 따른 세포 내 약물 전달용 키트에 있어서, 상기 30Kc19α는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드를 포함하여 유효성분을 세포 내에 전달하는 효과가 우수한 약품, 화장품 또는 식품 조성물이 개시된다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 30Kc19α는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 30Kc19α는 30Kc19 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 전체 도메인 보다 우수한 세포 투과성, 세포내 안정성, 또는 세포 투과성 및 세포내 안정성을 나타내므로, 세포 투과 펩티드로서 카고와 결합하여 카고를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
도 1은 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인과 β-sheet 도메인의 구조를 나타낸다.
도 2는 α-helix 도메인과 β-sheet 도메인의 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 30Kc19 단백질 내에서 α-helix 도메인이 PTD(protein trasnduction domain)로서 역할을 하며 수용성단백질로 생산이 되는 것을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따른 30Kc19α의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 비교예 1에 따른 30Kc19의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 실험예 1(1)에 따른 세포에 들어간 30Kc19α 단백질의웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 실험예 1(2)에 따른 세포에 들어간 30Kc19α의 형광이미지 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 실험예 1(3)에 따른 30Kc19a와 30Kc19의 세포 투과성을 비교한 실험 결과를 나타낸다.
도 9은 실험예 2에 따른 30Kc19 및 30Kc19α의 분광형광계 분석 결과를 나타낸다.
도 10는 실험예 2에 따른 30Kc19α의 첨가 농도와 시간에 따른 분광형광계 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 실험예 3(1)에 따른 세포의 β-gal 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 실험예 3(2)에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸다.
도 2는 α-helix 도메인과 β-sheet 도메인의 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 30Kc19 단백질 내에서 α-helix 도메인이 PTD(protein trasnduction domain)로서 역할을 하며 수용성단백질로 생산이 되는 것을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따른 30Kc19α의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 비교예 1에 따른 30Kc19의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 실험예 1(1)에 따른 세포에 들어간 30Kc19α 단백질의웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 실험예 1(2)에 따른 세포에 들어간 30Kc19α의 형광이미지 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 실험예 1(3)에 따른 30Kc19a와 30Kc19의 세포 투과성을 비교한 실험 결과를 나타낸다.
도 9은 실험예 2에 따른 30Kc19 및 30Kc19α의 분광형광계 분석 결과를 나타낸다.
도 10는 실험예 2에 따른 30Kc19α의 첨가 농도와 시간에 따른 분광형광계 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 실험예 3(1)에 따른 세포의 β-gal 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 실험예 3(2)에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않은 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사건이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", "이루어지는" 및 "구성되는"은 제한적이지 않다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 발명은 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인(이하, "30Kc19α"라 함)으로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템을 제공하고자 한다.
단백질, 핵산, 펩티드 또는 바이러스 등은 치료 물질로서 큰 잠재력을 가지고 있으나, 분자 수준의 크기를 가지므로 조직 및 세포막을 침투하지 못해 그 사용이 매우 제한적이었다. 또한 크기가 작은 물질이라 하더라도 그 성질이나 구조상 세포막의 지질 이중층을 투과하지 못하는 경우가 많다. 이에 전기 천공법(electroporation) 또는 열 충격(heatshock) 등으로, 단백질, 핵산, 펩티드 또는 바이러스 등을 세포 내로 이동시키려는 시도가 있었으나, 세포막에 손상을 주지 않음과 동시에 상기 물질들의 활성을 그대로 유지하면서 상기 물질들을 세포 내로 이동시키기는 곤란하였다. 그러던 중 누에(Bombyx mori)로부터 유래된 30Kc19 단백질이 거대 활성 물질들을 세포 내로 이동시킬 수 있는 세포 투과성 펩티드로 작용할 수 있음이 알려지면서, 이에 대한 연구가 활발히 진행되었다.
누에(Bombyx mori)로부터 유래된 30Kc19 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 30Kc19 단백질은 크게 2개의 도메인, α-helix 도메인(서열번호 1의 1-88 아미노산) 및 β-sheet 도메인(서열번호 1의 89-239 아미노산)으로 이루어져 있는 것으로(도 1), 이에 본 발명자들은 지속적인 연구를 통해 30Kc19 단백질에서 세포 투과성을 지니는 부분인 PTD(protein transduction domain)의 아미노산 서열로서, 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인 만으로도 세포 투과성 펩티드로서 우수한 효과를 가짐을 발견하였다.
본 발명에 따른 30Kc19단백질의 α-helix 도메인은 30Kc19 단백질의 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 단백질의 전체 도메인 보다 우수한 세포 투과성을 가질 수 있다 (실험예 1). 또한, 본 발명에 따른 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인은 30Kc19 단백질의 전체 도메인과 대등하거나 30Kc19 단백질의 전체 도메인 보다 우수한 안정성을 가질 수 있다 (실험예 2 및 3).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드가 개시된다. 상기 세포 투과 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드일 수 있다. 상기 세포 투과 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 세포 투과 펩티드는 서열번호 1로 나타내어지는 펩티드 또는 상기 서열과 1개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산 또는 15개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수도 있다. 상기 서열번호 1로 나타내어지는 펩티드 또는 상기 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 안전하면서도 우수한 세포 투과 펩티드로 작용할 수 있으므로, 카고와 결합하여 카고를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptide, CPP)"는 인비트로(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)에서 카고(cargo)를 세포 내로 이동시킬 수 있는 펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 또한, 상기 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 변역 후 변형은 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예를 들면, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예를 들면, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예를 들면, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 상기 펩티드는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수도 있다. 인공 변이체뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 기술분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함할 수 있다. 보존적 치환의 다른 예를 하기의 표 1에 나타내었다.
[표 1]
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드 및 상기 세포 투과 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는 카고 전달 시스템이 개시된다. 상기 세포 투과 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "카고(cargo)"는 본 발명에 따른 30Kc19α 세포 투과성 펩티드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하는 것으로, 예를 들면 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물, 화장품 또는 건강 식품의 유효 물질, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질, 핵산, 펩티드, 미네랄, 포도당을 포함하는 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 바이러스, 조영 물질 또는 기타 화학 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "운반 펩티드(carrier peptide)"는 유효성분과 결합하여 유효성분을 원하는 부위로 이동시키는 역할을 수행하는 펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약물"은 질병, 상처 또는 특정 증상을 완화, 예방, 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 상기 구현예에 있어서, 세포 투과성 펩티드에 의해 세포 내로 전달되는 약물은 리포좀, 미셀, 나노 입자, 자성 입자 또는 콴텀 도트와 같은 약물 전달체를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "펩티드"는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 신호 전달 단백질(또는 펩티드), 항체 또는 백신을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 핵산은 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예를 들면, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "조영물질"은 의학적 영상 촬영(imaging)에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 의미한다. 상기 조영물질은 방사선비투과 조영물질(radiopaque contrast agent), 상자성 조영물질(paramagnetic contrast agent), 초상자성 조영물질(superparamagnetic contrast agent), CT (computed tomography) 조영물질 또는 기타 조영물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 방사선비투과 조영물질(X-레이 영상용)은 무기 요오드 화합물 및 유기 요오드 화합물(예를 들면, 디아트리조아트), 방사선비투과 금속 및 그의 염(예를 들면, 은, 금, 백금 등) 및 기타 방사선비투과 화합물(예를 들면, 칼슘염, 황산바륨과 같은 바륨염, 탄탈룸 및 산화 탄탈룸)을 포함할 수 있다. 상자성 조영물질(MR 영상용)은 가돌리늄 디에틸렌 트리아민펜타아세트산(gadolinium diethylene triaminepentaacetic acid, Gd-DTPA) 및 그의 유도체, 및 기타 가돌리늄, 망간, 철, 디스프로시움(dysprosium), 구리, 유로피움(europium), 에르비움(erbium), 크롬, 니켈 및 코발트 복합체, 예를 들면, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,-N',N"-트리아세트산(D03A), 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 1,4,8,10-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (TETA), 히드록시벤질에틸렌-디아민 디아세트산(HBED)을 포함할 수 있다. 초상자성 조영물질(MR 영상용)은 자철석(magnetite), 초상자성 산화철 (super-paramagnetic iron oxide, SPIO), 초소 초상자성 산화철(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO) 및 단결정성(monocrystailine) 산화철을 포함할 수 있다. 다른 적합한 조영물질은 요오드화 및 비요오드화(non-iodinated), 이온성 및 비이온성 CT 조영물질, 및 스핀-표지(spin-label)와 같은 조영물질, 또는 기타 진단 활성제(diagnostically effective agent)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조영물질은 β-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질 또는 루시페라아제를 포함할 수 있다. 세포에서 발현되는 경우, 용이하게 검출가능한 단백질을 코딩하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 방사선핵종(radionuclide), 형광물질(fluor), 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제 등과 같은 다양한 표지들이 이용될 수 있다.
일 예로서, 본 발명에 따른 카고가 단백질 또는 펩티드인 경우, 이동 대상을 발현하는 DNA에 운반 펩티드를 발현하는 DNA를 결합시킨 후 이를 발현시킴으로써, 이동 대상과 펩티드의 융합 단백질 형태로 운반 펩티드와 이동 대상을 결합시킬 수 있다. 융합 단백질에 의한 결합의 구체적인 예는 다음과 같다: 융합 단백질을 생산하기 위한 프라이머(primer) 제작시, 이동 대상을 발현하는 뉴클레오티드 앞에 운반 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드를 붙인 다음, 수득한 뉴클레오티드를 제한 효소로 pET 벡터를 예로 들 수 있는 벡터에 삽입하고, BL-21(DE3)을 예로 들 수 있는 세포에 도입(transformation)하여 발현시킨다. 이때, IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 같은 발현 유도제를 처리하여 융합 단백질이 효과적으로 발현되도록 할 수 있다. 이후, His tag 정제(purification)와 같은 방법을 통해 발현시킨 융합 단백질을 정제한 후, PBS를 이용하여 투석하고, 키트에 넣어 예를 들면, 2,000 내지 4,000 rpm에서 5 내지 20 여분간 원심 분리하여 농축시킬 수 있다. 상기 운반 펩티드는 염색 물질 또는 형광 물질, 구체적으로 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, fluorescein isothiocyanate) 또는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)과 결합할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드 및 조영 물질을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 적용 약물 전달 경로 추적 방법이 개시된다. 상기 세포 투과 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드 및 약물을 포함하는 조성물 및 상기 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 대상의 세포 내 약물 전달용 키트가 개시된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 30Kc19α 세포 투과 펩티드를 포함하여 유효성분을 세포 내에 전달하는 효과가 우수한 약품, 화장품 또는 식품 조성물이 개시된다.
본 발명에 따른 조성물은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 0.2 mg/ml 내지 2 ㎎/ml, 또는 0.3 mg/ml 내지 1.5 mg/ml, 또는 0.4 mg/ml 내지 1.0 mg/ml의 함량을 포함할 수 있다. 구체적으로 1 ㎍/㎎ 내지 0.5 ㎎/㎎, 더 구체적으로 10 ㎍/㎎ 내지 0.1 ㎎/㎎ 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다. 상기 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장품 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 상기 화장품 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 또는 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 화장품 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시예는 발명의 이해를 쉽게하기 위해 제공되는 것 일뿐 발명의 보호범위가 이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 30Kc19α 단백질의 분리
누에(Bombyx mori)로부터의 30Kc19α 유전자를 pET23a 벡터(Novagen)의 EcoR I 과 Xho I 사이 부위(site)에 삽입하였다. 이렇게 얻은 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후 플라스미드가 삽입된 대장균 클론만을 암피실린선별법을 사용하여 선별하였다. 이때 생산되는 30Kc19α의 카르복실 말단에 히스티딘 태그(His6-tag)서열이 포함되어 정제를 용이하게 하였다. 상기 균주를 LB배지에서 배양한 뒤 1mM의 이소프로필 - 베타 - 디 - 티오칼락토피라노시드(isopropyl -β-D - thiogalactopyranoside: IPTG)를 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 배양하여 30Kc19α 단백질을 생산하였다. 그 다음, 원심분리를 통해 모은 세포를 음파처리(sonication)하여 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 HisTrap HP column (5mL, GE Healthcare)을 사용하여 30Kc19α를 정제하였다. 정제한 30Kc19α를 Tris-HCl (pH 8.0)로 완충액 교환을 하여 이를 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 4). 도 4에서 볼 수 있듯이, 약 15kDa에서 30Kc19α에 해당하는 밴드를 관찰할 수 있었다. 정제를 한 단백질들은 -70℃에서 보관한 뒤 실험에 사용하였다. Standard protein인 Bovine serum albumin (BSA)를 이용하여 생산한 단백질의 정량을 실시하였다.
비교예 1. 30Kc19 단백질의 분리
30Kc19α 유전자 대신에 30Kc19 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였다 (도 5). 상기 30Kc19를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도 5로부터 알 수 있듯이 약 35kDa에서 30Kc19 에 해당하는 밴드를 관찰할 수 있었다.
<실험예>
실험예 1. 30Kc19α 단백질의 세포 투과성 평가 (in vitro)
(1) 30Kc19α의 세포 투과성 분석
HeLa 세포와 CHO 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco)과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Hyclone)에서 배양하였다. 세포가 바닥면의 70% 정도를 차지했을 때, 0 mg/ml, 0.5 mg/ml 및 1.0 mg/ml 농도의 30Kc19α가 첨가된 새로운 배지로 교체하였고, 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 세포로 전달된 30Kc19를 확인하기 위해 먼저 세포를 PBS로 3회 세척한 후 1% 트립신 용액을 이용하여 플레이트 바닥에서 떼어내었다. 원심분리를 통해 떼어낸 세포를 취득하고 이를 RIPA 완충액으로 파쇄하였다. 원심분리를 통해 얻은 상등액을 이용해 12% SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 전기영동 후 젤을 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 전이시킨 뒤 5% 탈지유(skim milk)로 차단(blocking)하였다. 이후 토끼에서 얻은 30Kc19α의 항체를 이용하여 세포에 전달된 30Kc19α를 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 검출하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6으로부터 알 수 있듯이, 30Kc19α가 세포 내에서 검출되었으므로, 세포 투과성이 있음이 확인되었다. 또한, 처리한 농도가 높아질 수록 세포에 전달된 30Kc19α의 양도 증가하는 것으로 보아 30Kc19α의 세포 투과성은 외부에서의 처리 농도에 비례함을 알 수 있었다.
(2) 세포 내 30Kc19α의 위치 분석
30Kc19α 단백질을 green fluorescent Alexa Fluor®488 (Invitrogen)로 Labeling을 하였다. 형광이 결합된 30Kc19α 단백질을 HeLa 세포에 첨가하고 37℃에서 4 시간 동안 배양한 후, PBS로 3회 세척하였다. 상기 세척된 세포에 Hoechst로 핵을 염색하고 세포가 살아있는 상태에서 live cell image를 공초점현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 세포를 관찰하였다. 30Kc19α 단백질의 농도(0 mg/ml, 0.2 mg/ml 및 0.4 mg/ml)에 따른 세포 내 위치를 형광 이미지를 통해 분석한 결과를 도 7에 나타내었다. 각 농도에서 핵을 염색한 결과와 30Kc19α와 핵을 합친 이미지를 함께 나타내었다.
도 7로부터 알 수 있듯이, 30Kc19α의 농도가 높아질수록 더 많은 양의 단백질이 세포질에 위치하는 것이 확인되었다.
(3) 30Kc19α와 30Kc19의 세포 투과성 비교
30Kc19α와 30Kc19의 세포 투과성을 비교하기 위하여 동일한 농도로 HeLa 세포와 CHO 세포에 30Kc19a와 30Kc19을 각각 처리하고, 24시간 후에 세포를 RIPA buffer를 이용하여 lysis 시켜 세포질에 들어간 단백질의 농도를 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8로부터 알 수 있듯이, 30Kc19보다 30Kc19α가 세포질 내로 더 많이 들어가는 것이 확인 되었다.
실험예 2. 30Kc19α 단백질의 효소 안정성 평가 (in vitro)
GFP(Green Fluorescent Protein)를 사용하여 30Kc19α 단백질의 효소 안정성을 평가하였다. GFP 유전자를 pET23a 벡터 (Invitrogen)의 EcoR 1, Xho 1 부위에 삽입하여 벡터를 얻었다. 상기 플라스미드를 사용하여 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 균주를 LB배지에서 배양한 후, 1mM의 IPTG를 첨가하여 6시간동안 27℃에서 배양하여 GFP 단백질을 생산하였다. 그 다음 원심분리를 통해 모은 세포를 음파 파쇄하였다. 이를 His Trp HP column (5ml, GE Healthcare)을 이용하여 정제하여 얻었다. GFP를 상기 실험예 1에서 배양된 400 ug/ml의 30Kc19α 단백질과 30Kc19 단백질의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 24시간 동안 배양하고, GFP의 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
또한, 30Kc19α의 첨가 농도와 시간에 따른 GFP의 형광 정도를 측정하여 도 10에 나타내었다.
도 9로부터 알 수 있듯이, 30Kc19α 또는 30Kc19 단백질의 부재 하에서는 GFP 활성이 24시간 이후에 약 30% 이상 감소하였으나, 30Kc19α 또는 30Kc19 단백질을 400㎍/ml 첨가한 경우에는 GFP 활성이 50% 이상 유지된다는 것이 확인되었다. 또한, 도 10으로부터 30Kc19α의 첨가 농도가 높을수록 GFP 활성이 높게 유지된다는 것이 확인되었다.
실험예 3. 30Kc19α 단백질의 세포 내 안정성 평가 (in vivo)
(1) 세포 내 안정성 평가
HeLa cell에 beta galactosidase를 lipofectamine3000으로 transfection시키고, 24 시간 이후에 30Kc19α 단백질을 각각 0 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 120 ㎍/ml 및 200 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 24시간 이후에 β-gal assay을 수행하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 11으로부터 알 수 있듯이, 30Kc19α 단백질이 세포 내에서 안정하다는 것이 확인되었다. 특히, 30Kc19a 단백질이 80 ㎍/ml농도인 경우, 가장 높은 안정성을 나타내었다.
(2) 세포 독성 평가
30Kc19α 단백질을 CHO cell에 처리하고 24 시간 배양 후 CCK-8 assay를 수행하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12로부터 알 수 있듯이, 30Kc19α 단백질을 처리한 세포가 단백질을 처리하지 않은 대조군 세포와 유사한 생존도를 보이는 것을 확인하였다. 이로부터 본 발명에 따른 30Kc19α 단백질이 세포 내에서 독성을 유발하지 않아 세포 내 주입이 가능하다는 것을 입증하였다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION
<120> Cell penetration and enzyme stabilizing properties of alpha helix
domain of the 30Kc19 protein and cargo delivery system using the
same
<130> DPP-2014-0257
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 179
<212> PRT
<213> Bombyx mori
<400> 1
Ala Tyr Gln Leu Trp Leu Gln Gly Ser Lys Asp Ile Val Arg Asp Cys
1 5 10 15
Phe Pro Val Glu Phe Arg Leu Ile Phe Ala Glu Asn Ala Ile Lys Leu
20 25 30
Met Tyr Lys Arg Asp Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Asn Asp Val His
35 40 45
Gly Asn Asp Gly Arg Leu Ala Phe Gly Asp Gly Lys Asp Lys Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Val Ser Trp Lys Phe Ile Ala Leu Trp Glu Asn Asn Lys Val
65 70 75 80
Tyr Phe Lys Ile Leu Asn Thr Glu Arg Asn Gln Tyr Leu Val Leu Gly
85 90 95
Val Gly Thr Asn Pro Asn Gly Asp His Met Ala Phe Gly Val Asn Ser
100 105 110
Val Asp Ser Phe Arg Ala Gln Xaa Tyr Leu Gln Pro Ala Lys Tyr Asp
115 120 125
Lys Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Tyr Ser Lys Ala Leu
130 135 140
Thr Leu Ser Arg Thr Leu Glu Thr Ser Gly Asn Arg Met Ala Trp Gly
145 150 155 160
Tyr Asn Gly Arg Val Ile Gly Ser Pro Glu His Tyr Ala Trp Gly Val
165 170 175
Lys Ala Phe
Claims (10)
- 30Kc19 단백질의 α-helix 도메인(30Kc19α)으로 이루어지는 세포 투과 펩티드로서,
상기 30Kc19α는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 88번째 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 세포 투과 펩티드.
- 제1항에 있어서,
상기 30Kc19α는 30Kc19 전체 도메인과 대등한 세포 투과성, 세포내 안정성, 또는 세포 투과성 및 세포내 안정성을 가지는 것인, 세포 투과 펩티드.
- 제1항에 있어서,
상기 30Kc19α는 누에(Bombyx mori)로부터 유래된 것인, 세포 투과 펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 세포 투과 펩티드; 및
상기 세포 투과 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하고,
상기 카고는 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 조영물질, 약물 또는 화학 물질인 것인, 카고 전달 시스템.
- 제4항에 있어서,
상기 펩티드는 사이토카인, 항체, 항체 단편, 치료용 효소 또는 가용성 수용체인 것인, 카고 전달 시스템.
- 제4항에 있어서,
상기 조영물질은 방사선 비투과성 조영물질, 상자성 조영물질, 초상자성 조영물질 또는 CT 조영물질인 것인, 카고 전달 시스템.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020150001973A KR101626343B1 (ko) | 2015-01-07 | 2015-01-07 | 30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
PCT/KR2015/004297 WO2016111420A1 (ko) | 2015-01-07 | 2015-04-29 | 30KC19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020150001973A KR101626343B1 (ko) | 2015-01-07 | 2015-01-07 | 30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR101626343B1 true KR101626343B1 (ko) | 2016-06-01 |
Family
ID=56138482
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020150001973A KR101626343B1 (ko) | 2015-01-07 | 2015-01-07 | 30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101626343B1 (ko) |
WO (1) | WO2016111420A1 (ko) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102185390B1 (ko) | 2020-04-17 | 2020-12-01 | (주) 업테라 | 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 |
KR102195740B1 (ko) | 2020-03-25 | 2020-12-28 | 서울대학교산학협력단 | 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
WO2021194257A1 (ko) * | 2020-03-25 | 2021-09-30 | (주) 업테라 | 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
US11358992B2 (en) | 2020-04-17 | 2022-06-14 | Uppthera | Cell-penetrating cereblon recombinant fusion protein and use thereof |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110372780B (zh) * | 2019-07-08 | 2020-06-02 | 吉林大学 | 抗肿瘤多肽及其在抗肿瘤领域的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20110003889A (ko) * | 2009-07-06 | 2011-01-13 | (주)차바이오앤디오스텍 | 세포 내부로 외래 물질을 도입하기 위한 30킬로 단백질을 포함하는 운반체 및 외래 물질 도입 방법 |
KR20140111178A (ko) * | 2013-03-08 | 2014-09-18 | 서울대학교산학협력단 | 세포 투과 펩타이드 |
-
2015
- 2015-01-07 KR KR1020150001973A patent/KR101626343B1/ko active IP Right Grant
- 2015-04-29 WO PCT/KR2015/004297 patent/WO2016111420A1/ko active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20110003889A (ko) * | 2009-07-06 | 2011-01-13 | (주)차바이오앤디오스텍 | 세포 내부로 외래 물질을 도입하기 위한 30킬로 단백질을 포함하는 운반체 및 외래 물질 도입 방법 |
KR20140111178A (ko) * | 2013-03-08 | 2014-09-18 | 서울대학교산학협력단 | 세포 투과 펩타이드 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIOMATERIALS * |
PDB: 4EFP_A * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102195740B1 (ko) | 2020-03-25 | 2020-12-28 | 서울대학교산학협력단 | 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
WO2021194257A1 (ko) * | 2020-03-25 | 2021-09-30 | (주) 업테라 | 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
KR102185390B1 (ko) | 2020-04-17 | 2020-12-01 | (주) 업테라 | 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 |
WO2021210718A1 (ko) * | 2020-04-17 | 2021-10-21 | (주) 업테라 | 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 |
US11358992B2 (en) | 2020-04-17 | 2022-06-14 | Uppthera | Cell-penetrating cereblon recombinant fusion protein and use thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016111420A1 (ko) | 2016-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7007423B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
JP6697028B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
KR102201430B1 (ko) | 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물 | |
KR101626343B1 (ko) | 30Kc19 단백질 내 α-helix 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 | |
JP6272853B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
ES2381206T3 (es) | Inhibidores peptídicos con permeabilidad celular de la ruta de transducción de la señal JNK | |
EP3118212B1 (en) | Cell penetrating peptide and method for delivering biologically active substance using same | |
KR101669203B1 (ko) | 신규 세포투과성 펩타이드 및 이의 용도 | |
BRPI0620806A2 (pt) | peptìdeos úteis como peptìdeos de penetração de célula | |
Sudo et al. | Human-derived fusogenic peptides for the intracellular delivery of proteins | |
Zhang et al. | Stearylated antimicrobial peptide [D]-K6L9 with cell penetrating property for efficient gene transfer | |
Huang et al. | Cloning, expression, purification and functional characterization of the oligomerization domain of Bcr–Abl oncoprotein fused to the cytoplasmic transduction peptide | |
CA3122428A1 (en) | Transmembrane domain derived from human lrrc24 protein | |
JP7429454B2 (ja) | ペプチド及びその使用 | |
CN113195704A (zh) | 用于治疗癌症的肽治疗剂及其用途 | |
KR20140103544A (ko) | 유효성분의 생체내 반감기 연장용 유효성분 전달 시스템 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190429 Year of fee payment: 4 |