WO2021194257A1 - 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 - Google Patents

세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 Download PDF

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WO2021194257A1
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peptide
cell
linker
dimer
cargo
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PCT/KR2021/003651
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박태현
이해인
박영규
류수희
김성훈
이형석
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(주) 업테라
서울대학교 산학협력단
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the present invention relates to a cell-permeable peptide dimer, a method for preparing the same, and an intracellular delivery system using the same.
  • Peptides, proteins, nucleic acids, etc. have great potential as therapeutic substances, but their use is very limited because they do not penetrate the cell membrane of target cells. In addition, even small molecule compounds are often unable to penetrate the lipid bilayer of the cell membrane due to their properties or structure. There have been attempts to move therapeutic substances into cells by electroporation, membrane fusion using liposomes, or thermal shock. is subject to many restrictions.
  • cell-permeable proteins or peptides have recently been attracting attention.
  • the most studied is the TAT protein derived from human immunodeficiency virus-1 (HIV-1).
  • HSV-1 human immunodeficiency virus-1
  • the peptide consisting of amino acids 47-57 among the TAT protein consisting of 86 amino acids has a cell-penetrating function.
  • amino acids 267 to 300 of the VP22 protein of HSV-1, amino acids 339 to 355 of Antennapedia (Antp) in Drosophila, and artificially synthesized positively charged peptides are known to function as cell-penetrating peptides. have.
  • the 30Kc19 protein is a protein with a size of about 28 kDa derived from the hemolymph of the silkworm ( Bombyx mori ), and has been applied in several studies because it has anti-apoptotic activity, protein stabilization or solubility improvement function.
  • 30Kc19 protein is also known to be a cell-permeable peptide having a cell-penetrating function (Korean Patent Publication No. 10-2011-0003889).
  • 30Kc19 ⁇ is an N-terminal domain of an alpha-helical structure
  • 30Kc19 ⁇ which is a C-terminal domain of a beta-fold structure.
  • 30Kc19 ⁇ is a domain having a cell-permeable function (review [Ryu, Jina, et al. Biotechnology journal 11.11 (2016): 1443-1451.]).
  • a cargo material can be attached to the recombinant 30Kc19 ⁇ domain and used as a cargo carrier (Korean Patent Registration No. 10-1626343).
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the peptide dimer.
  • Another object of the present invention is to provide a cargo delivery system using the peptide dimer and uses thereof.
  • the present inventors confirmed that the cell permeation efficiency of a peptide dimer in which two peptide domains composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 were linked to each other by a peptide linker was significantly excellent, and completed the present invention (FIG. 1). Accordingly, the present invention provides a cell-permeable peptide dimer, a preparation method thereof, a cargo delivery system using the same, and uses thereof.
  • the present invention provides a first peptide domain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; a second peptide domain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and a peptide linker connecting the first and second peptide domains as a cell-permeable peptide dimer as a fusion protein, wherein the peptide linker comprises a carboxy-terminus of the first peptide domain and the second peptide domain. It provides a novel cell-permeable peptide dimer, which is composed of 100 or less amino acids by linking the amino-terminus of
  • the novel cell-penetrating peptide dimer provided in the present invention is characterized in that each peptide domain (first, second peptide domain), which is a protein composed of 88 amino acids, is linked to each other by a peptide linker composed of 100 amino acids or less (Fig. One).
  • first, second peptide domain which is a protein composed of 88 amino acids
  • a peptide linker composed of 100 amino acids or less (Fig. One).
  • additional protein modification methods such as short-length peptides (eg, target peptides) or glycosylation (eg, PEGylation) are known without changing the sequence of the novel protein.
  • the peptide according to the present invention It can be expected that the intrinsic function of the present invention of cell permeability will be exhibited as it is without intrinsic effect on the tertiary structure of the dimer protein.
  • the cell-penetrating peptide dimer of the present invention “comprising” the first and second peptide domains and a peptide linker connected thereto, consists only of the first and second peptide domains and these
  • the cell-permeable peptide dimer “consisting of” a peptide linker linked to It should be construed to further include embodiments used “as is”, or cell-permeable peptide dimers “consisting essentially of” said cell-permeable peptide dimers.
  • the peptide linker connects the carboxy-terminus of the first peptide domain and the amino-terminus of the second peptide domain to each other, and amino acid residues of natural and/or synthetic origin consisting of 100 amino acids or less are peptide bonds. It is a linear chain formed by The peptide linker connects the first peptide domain and the second peptide domain to each other and appropriately induces dimer formation between the two domains, thereby remarkably improving the cell permeability of the cell-permeable peptide dimer according to the present invention.
  • the peptide linkers be long enough to prevent interfering with each other's activities by steric hindrance and to provide a degree of flexibility that allows for proper protein folding, and also within the cell. It is preferably short enough to provide stability (eg, proteolytic stability).
  • the peptide linker is between 1 and 100 amino acids in length.
  • a peptide linker has a length of at least 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids and no more than 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 or 50 amino acids in length. Specifically, it may have a length of 1 to 75 amino acids or 5 to 75 amino acids, and more specifically 5 to 50 amino acids in length.
  • the peptide linker is at least 5, at least 10, at least 15 or at least 20 amino acids in length and has a length of 50 or less, 40 or less or 30 or less amino acids.
  • the peptide linker is 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ,48, 49 or 50 amino acids in length can have
  • peptide linkers are classified into flexible, rigid and in vivo cleavable linkers (Advanced drug delivery reviews 65.10 (2013): 1357-1369) and [ Biotechnology advances 33.1 (2015): 155-164] et al.).
  • the peptide linker of the present invention may be a flexible linker or a rigid linker.
  • the present inventors selected peptide linkers that are recognized to represent flexible linkers and rigid linkers among peptide linkers in the field of protein engineering, and a total of 7 types of novel cell-permeable peptide dimers Sieves (Examples 1 to 7) were designed (FIG. 5), and their cell permeability improvement effect was confirmed (FIGS. 6 and 7).
  • the peptide linker is a flexible linker.
  • the flexible linker may comprise at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or 100% of the amino acids specific amino acid residues, such as glycine, serine and/or threonine. .
  • the flexible linker may comprise a repeat sequence of specific amino acids.
  • the flexible linker is characterized in that it comprises glycine (G) and serine (S).
  • the flexible linker of the present invention may include an amino acid sequence repeating unit composed of glycine (G) and serine (S).
  • the flexible linker includes 1 to 20 repeating units of G, S, GGS, GSS, GGGS, GGSS, GSSS, GGGGS, GGGSS, GGSSS, GSSSS, GGGGGS, GGGGSS, GGGSSS, GGSSSS, and GSSSSS.
  • 10 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1 additional optional amino acid at the amino-terminus and/or carboxy-terminus of the peptide linker may be added.
  • the present inventors synthesized cell-permeable peptide dimers (Examples 1 to 6) using repeat sequences containing G and S amino acid residues (SEQ ID NOs: 2 to 7), which are known to represent the structural and functional characteristics of flexible linkers in the field of protein engineering. And (FIG. 5), it was experimentally confirmed that their cell permeability was significantly improved compared to the existing peptide monomer (Comparative Example 1) and the peptide dimer without a peptide linker (Comparative Example 2) (FIG. 7). Accordingly, one of ordinary skill in the art can reasonably expect that the cell permeability improving effect will be exerted at an equivalent level for the cell permeable peptide dimer using the flexible linker.
  • the peptide linker is a rigid linker.
  • the rigid linker comprises 1 to 10 repeating units of EAAAK.
  • the rigid linker comprises 2 to 25 repeating units of XP, wherein X is any amino acid residue, preferably alanine, lysine or glutamic acid.
  • Rigid linkers are peptide linkers that have different properties from elastic linkers, and have been widely used in the field of protein engineering due to the advantage of maintaining a gap between each peptide domain and thus having little interference with their independent functions, and double EAAAK repeats It is known that constructed rigid linkers are best studied and can represent the structural and functional characteristics of other rigid linkers (Advanced drug delivery reviews 65.10 (2013): 1357-1369 and Biotechnology advances 33.1 (2015): 155). -164] et al.). Accordingly, the present inventors synthesized a cell-permeable peptide dimer (Example 7) using the EAAAK repeat sequence (SEQ ID NO: 8) (FIG.
  • the peptide linker includes not only the specified structure but also variants of the peptide linker that perform equivalent biological functions.
  • a peptide linker variant refers to a peptide having one or more amino acid mutations or modifications compared to a reference peptide linker, such as to be produced by substitution, deletion, insertion and/or chemical modification in one or more amino acids in an existing amino acid sequence.
  • the peptide linker variant comprises conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the function performed by the original peptide linker variant.
  • the conservative substitutions include basic amino acids (arginine, lysine and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine, valine and methionine), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan) and tyrosine) and small amino acids (glycine, alanine, serine and threonine). Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art.
  • the most common exchanges are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Other examples of conservative amino acid substitutions are shown in the table below, including Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly.
  • the peptide linker consists of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 8. In one embodiment, the peptide linker comprises at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2-8. It is a peptide linker variant having the above sequence homology. In one embodiment, the peptide linker is a conservative amino acid substitution for the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2-8.
  • the peptide linker of the present invention may be encoded by a nucleic acid molecule and thus expressed as a recombinant protein.
  • the peptide linker can be expressed as a recombinant protein by linking the first peptide domain and the second peptide domain with a peptide bond.
  • the cell penetrating peptide dimer of the invention is a fusion protein.
  • a fusion protein refers to a protein in which amino acid sequences of different origins are combined into one polypeptide chain by in-frame combination of nucleotide sequences encoding them, and is fused to one of the ends of the polypeptide chain, Including internal fusions in which sequences of different origins are inserted within a polypeptide chain.
  • the fusion protein may be a recombinant protein produced from any one selected from the group consisting of E. coli, yeast, insect cells and mammalian cells by a genetic recombination method.
  • a cargo may be conjugated to the cell penetrating peptide dimer of the present invention.
  • conjugation refers to any form of covalent or non-covalent linkage, direct genetic or chemical fusion, coupling through a cross-linking agent, and non-covalent association, such as van der Waals forces. including meetings through
  • a cell-permeable peptide dimer protein comprising a peptide linker having various types and lengths is prepared (FIG. 5), and the protein is a conventional peptide composed of amino acids of SEQ ID NO: 1, as well as a linker. It was confirmed that cell permeability was significantly improved compared to the peptide dimer not containing ( FIGS. 6 and 7 ).
  • the peptide linker is typically divided into a flexible linker and a rigid linker.
  • Examples 1 to 6 represent GGSSS repeat amino acid sequences (length 5 to 50) representing a flexible linker
  • Example 7 is a rigid linker.
  • the experimental results using the EAAAK repeat amino acid sequence (length 20) representing the linker are shown.
  • Examples 1 to 6 show experimental results when the same stretchable linker is used but different in length
  • Example 7 shows experimental results when the stretchable linker is changed to a rigid linker.
  • the present invention provides a method for preparing the above-described cell-penetrating peptide dimer.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the cell-permeable peptide dimer described above, a recombinant vector containing the nucleic acid, a host cell transformed with the recombinant vector, and a cell-penetrating peptide dimer using the host cell. provide a way
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the cell penetrating peptide dimer described above.
  • the nucleic acid is codon degeneracy (degeneracy) or codon preferred in the organism to express the cell-permeable peptide dimer, within the range that does not change the amino acid sequence of the cell-permeable peptide dimer expressed from the coding region Various modifications can be made to the coding region, and various modifications or modifications can be made within the range that does not affect the expression of the gene even in parts other than the coding region. will be well understood.
  • nucleic acid of the present invention encodes a protein having an equivalent activity
  • one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the above-described nucleic acid.
  • a recombinant vector is a vehicle capable of introducing a foreign nucleic acid into a host cell, transforming the host cell, and promoting the expression of the introduced nucleic acid, and has the same meaning as commonly used in the art to which the present invention pertains. is used as
  • the recombinant vector is a plasmid vector, a cosmid vector, a viral vector or an artificial chromosome vector.
  • the plasmid vector is a DNA molecule that can easily accommodate foreign DNA and can be easily introduced into a host cell, and is used in the same meaning as commonly used in the art to which the present invention pertains.
  • a typical plasmid vector contains (a) an initiation point of replication that allows efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, (b) a selection marker that allows selection of host cells transformed with the plasmid vector, and (c) ) has a structure including a restriction enzyme cleavage site into which a foreign DNA fragment can be inserted.
  • Non-limiting examples of the plasmid vector include pKK plasmid (Clonetech), pUC plasmid, pET plasmid (Novagen, Inc., Madison, WI), pRSET or pREP plasmid (Invitrogen, San Diego, CA), or pMAL plasmid (New England Biolabs). , Beverly, MA), but is not limited thereto.
  • the viral vector may be a DNA viral vector or an RNA viral vector, and may be a bacteriophage, an animal virus, or a plant virus.
  • the viral vector may be vaccinia, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), lentivirus, retrovirus, or herpes virus, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector comprises a nucleic acid encoding a first peptide domain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; a nucleic acid encoding a second peptide domain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and a nucleic acid encoding a peptide linker connecting the 3' end of the nucleic acid encoding the first peptide domain and the 5' end of the nucleic acid encoding the second peptide domain to each other.
  • the recombinant vector comprises a promoter operably linked to a nucleic acid encoding the cell penetrating peptide dimer.
  • operably linked means that a specific nucleic acid is linked to another nucleic acid so that it can exert its function. That is, the fact that a gene encoding a specific protein or peptide is operably linked to a promoter means that the gene can be transcribed into mRNA and translated into a protein or peptide by the promoter.
  • the recombinant vector further comprises a nucleic acid encoding a cargo that is a peptide or protein, wherein the nucleic acid encoding the cargo encodes the 5' end of the nucleic acid encoding the first peptide domain or a second peptide domain linked to the 3' end of the nucleic acid.
  • the cargo which is the peptide or protein, has the same meaning as described above.
  • the present invention provides a host cell transformed with the above-described recombinant vector.
  • transformation refers to a process of introducing a gene into a host cell so that it can be expressed in the host cell, and if the transformed gene can be expressed in the host cell, it can be inserted into the chromosome of the host cell or added to the chromosome other than the chromosome. Included, but not limited to, whatever is located.
  • the gene is a nucleic acid capable of encoding a polypeptide, and includes DNA and RNA. The gene may be used without limitation as long as it can be introduced into a host cell and expressed in any form.
  • a method of transforming a host cell by introducing the recombinant vector of the present invention is a method known in the art to which the present invention belongs, such as transient transfection, micro-injection, transfection Transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection ), including, but not limited to, known methods such as electroporation.
  • the host cell is a prokaryotic cell such as E. coli; fungi such as yeast; plant cells; Alternatively, it may be a mammalian cell such as an insect cell or a plant cell, or a cell line derived from the cell.
  • the cell line include, but are not limited to, CHO, HeLa, COS7, COP5, HEK293, HEK293T, HepG2, CV1, BHK, TM4, VERO-76, MDCK, W138, and the like.
  • a person skilled in the art can appropriately select the type of host cell suitable for recombinant protein production.
  • the present invention provides a method for producing a cell-penetrating peptide dimer using a host cell transformed with the above-described recombinant vector.
  • the method for producing a cell-permeable peptide dimer comprises the steps of transforming the aforementioned recombinant vector into the aforementioned recombinant host cell; culturing the host cell; inducing expression of a cell penetrating peptide dimer from the cultured host cell; and recovering the expressed cell-penetrating peptide.
  • a method for culturing a host cell suitable for recombinant protein production, a method for inducing protein expression, and a method for recovering an expressed protein are known in the art to which the present invention pertains, and a person skilled in the art can use the above-described vector and host cell to obtain a cell according to the present invention.
  • a method for effectively expressing the permeable peptide dimer can be appropriately selected.
  • the present invention provides a cargo delivery system comprising the above-described cell-permeable peptide dimer and a cargo conjugated thereto.
  • “cargo” refers to any substance that can be moved into a cell by being conjugated to the peptide dimer according to the present invention, for example, any substance desired to increase cell permeation efficiency, specifically drugs, cosmetics or health It may be an active substance in food, more specifically, a substance that does not easily move into cells through a general route.
  • the drug delivered into the cell may further include a drug delivery system such as liposomes, micelles, magnetic particles or quantum dots.
  • the cargo is a peptide, protein, nucleic acid, lipid, glycolipid, carbohydrate, mineral, nanoparticle, virus, contrast material, chemical material, or a combination thereof.
  • the cargo is a peptide or protein, a hormone, a hormone analog, a cytokine, a neurotransmitter peptide, a vaccine, an antibody, an antibody fragment, an enzyme, an enzyme inhibitor, a soluble receptor, a signal transduction protein, a transcription factor, a coactivator, a transcription repression protein , but may include a mitochondrial protein, but is not limited thereto.
  • the cargo in the form of a cargo and peptide dimer fusion protein can be conjugated to the peptide dimer by binding the DNA expressing the peptide dimer according to the present invention to the DNA expressing the cargo peptide and expressing it at once. have.
  • nucleic acid When the cargo is a nucleic acid, it may be a naturally occurring or artificial DNA or RNA molecule, and may be single-stranded or double-stranded. There can be more than one nucleic acid molecule, either a nucleic acid molecule of the same type (eg, having the same nucleotide sequence) or different types of nucleic acid molecules.
  • nucleic acids include, but are not limited to, one or more of cDNA, decoy DNA, cfDNA, ctDNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, antisense oligomer, plasmid and other modified nucleic acids. it is not limited to, one or more of cDNA, decoy DNA, cfDNA, ctDNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, antisense oligomer, plasm
  • the contrast material refers to any material used for imaging of structures or fluids in a living body in medical imaging.
  • the contrast material includes, but is not limited to, a radiopaque contrast material, a paramagnetic contrast material, a superparamagnetic contrast material, a CT contrast material, or other contrast material.
  • the cargo is covalently linked to a cell penetrating peptide dimer.
  • the cargo is covalently linked to the amino-terminus of the first peptide domain or the carboxy-terminus of the second peptide domain of the cell permeable peptide dimer.
  • a cell-permeable peptide dimer protein was prepared (FIG. 5), and it was confirmed that the protein significantly improved cell permeability as compared to a conventional monomer and a peptide dimer protein that does not contain a linker at all (FIG. 6 and FIG. 7) .
  • a cargo carrier in which a cargo protein (GFP) is linked to a cell-permeable peptide dimer protein including a peptide linker having various types and lengths is prepared (FIG. 5), and the cargo carrier is a conventional monomeric cargo carrier
  • GFP cargo protein
  • FIGS. 6 and 7 cell permeability was significantly improved compared to the dimer cargo carrier that does not contain a linker
  • the delivery system according to the present invention is characterized in that the cell delivery efficiency is significantly improved compared to the conventional cell-permeable peptide monomer cargo delivery system.
  • each 30Kc19 ⁇ domain moves within the scope of the peptide linker and can bind to each other regardless of in vitro or in vivo space, so it is estimated that the dimer formation probability is higher (Fig. 2b). ).
  • the cargo delivery system using the 30Kc19 ⁇ cell-permeable peptide dimer of the present invention has significantly improved characteristics compared to the cargo system using the conventional 30Kc19 ⁇ cell-permeable peptide monomer in the administration route and the resulting pharmacokinetics in vivo or in clinical conditions. have.
  • the above-described cargo carrier may be used in pharmaceuticals, cosmetics or food.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition, a cosmetic composition or a food composition comprising the above-described cargo carrier.
  • the composition may contain the above-described cell-penetrating peptide dimer in an amount suitable for pharmaceuticals, cosmetics or food.
  • the composition can be applied to all animals including humans, dogs, chickens, pigs, cattle, sheep, guinea pigs or monkeys.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally, rectal, transdermally, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, intramedullary, intrathecally or subcutaneously.
  • Formulations for oral administration may be tablets, pills, soft or hard capsules, granules, powders, solutions, or emulsions, but are not limited thereto.
  • Formulations for parenteral administration may be injections, drops, lotions, ointments, gels, creams, suspensions, emulsions, suppositories, patches, or sprays, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may include additives such as diluents, excipients, lubricants, binders, disintegrants, buffers, dispersants, surfactants, colorants, flavorings or sweeteners, if necessary.
  • the cosmetic composition may be provided in any formulation suitable for topical application.
  • it may be provided in the form of a solution, an emulsion obtained by dispersing an oil phase in an aqueous phase, an emulsion obtained by dispersing an aqueous phase in an oil phase, a suspension, a solid, a gel, a powder, a paste, a foam, or an aerosol.
  • Such formulations can be prepared according to conventional methods in the art.
  • the cosmetic composition may include other ingredients capable of giving a synergistic effect to the main effect, preferably within a range that does not impair the main effect.
  • the cosmetic composition may further include a moisturizer, an emollient, a surfactant, an ultraviolet absorber, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a pH adjuster, an organic or inorganic pigment, a fragrance, a cooling agent or a limiting agent.
  • a moisturizer an emollient, a surfactant, an ultraviolet absorber, a preservative, a bactericide, an antioxidant, a pH adjuster, an organic or inorganic pigment, a fragrance, a cooling agent or a limiting agent.
  • the formulation of the food composition is not particularly limited, but may be formulated as, for example, tablets, granules, powders, liquids, solid preparations, and the like.
  • each formulation can be appropriately selected and formulated by those skilled in the art without difficulty depending on the formulation or purpose of use in addition to the active ingredient, and a synergistic effect may occur when applied simultaneously with other raw materials.
  • the cell-permeable peptide dimer according to the present invention has significantly superior cell-permeability compared to the 30Kc19 ⁇ peptide monomer, and thus can be usefully used as a cargo carrier.
  • FIG. 1 is a schematic of the cell penetrating peptide dimer of the present invention.
  • FIGS. 2 to 4 are schematics visually illustrating the improved cell penetrating effect of the cell penetrating peptide dimer of the present invention
  • FIG. 5 is a photograph showing the result of preparing the cell-permeable peptide dimer of the present invention.
  • FIG. 6 is a photograph confirming the intracellular cell permeability of the cargo-conjugated cell-penetrating peptide dimer of the present invention by immunocytochemistry;
  • FIG. 7 shows a graph comparing the cell permeability of cargo-conjugated cell-penetrating peptide dimers of the present invention using various linkers.
  • pET-23a vector (Novagen, Madison, WI, USA), which is advantageous for expression in E. coli and His tag protein purification, was purchased and used.
  • the synthesis of 30Kc19 ⁇ or 30Kc19 ⁇ gene including a linker was requested to Geneart. During synthesis, codon optimization was performed for E. coli strain.
  • the TurboGFP-30Kc19 ⁇ gene sequence (SEQ ID NO: 10) in which the TurboGFP gene sequence is fused to the top of the 30Kc19 ⁇ gene sequence (SEQ ID NO: 9) was inserted using the BamHI/XhoI restriction site in the MCS (multiple cloning site) of the pET-23a vector. .
  • the genes requested for synthesis were inserted into the pET-23a vector containing TurboGFP using the EcoRI/XhoI restriction enzyme site in the sequence.
  • each vector and insert was first added with EcoRI/XhoI enzymes (NEB) and Custom buffer, and incubated for 18 hours in a 37°C heat block. Then, after electrophoresis of the insert and vector on an agarose gel, each insert and vector were extracted from the gel using AccuPrep® PCR/Gel DNA Purification Kit (Bioneer). After mixing the extracted insert and vector in a ratio of 3:1, T4 ligase (NEB's Cat. No. M0202M) was added thereto and cultured for 18 hours. After the resulting plasmid was transformed into DH5 ⁇ competent cells (RBC cat.no.
  • the plasmid extracted according to the above procedure was transformed into BL21 cells, placed in LB broth medium, and cultured in a shaking incubator. After treatment with IPTG 1mM, it was cultured for 4 hours. A cell lysate was obtained using a centrifuge and lysed using a sonicator. Then, the protein was purified using FPLC (GE Healthcare), dialyzed and stored.
  • Lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0
  • Washing buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 50 mM imidazole, pH 8.0
  • Elution buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 350 mM imidazole, pH 8.0
  • dialysis buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)
  • recombinant proteins having the structure of N'-GFP-30Kc19 ⁇ -linker-30Kc19 ⁇ -C' were obtained.
  • All of GFP-30Kc19 ⁇ contained in the recombinant proteins of Examples 1 to 7 have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the linker has the amino acid sequence shown in the table below.
  • linkers L5, L10, L20, L30, L40 and L50 are flexible linkers of 5 to 50 amino acids in length (GGSSS repeat), and Rigid 20 is a rigid linker of 20 amino acids in length (EAAAK repeat).
  • a recombinant protein having a structure of N'GFP-30Kc19 ⁇ -C' (Comparative Example 1) and a recombinant protein having a structure of N'GFP-30Kc19 ⁇ -30Kc19 ⁇ ' (Comparative Example 2) were prepared together. All of GFP-30Kc19 ⁇ included in Comparative Examples 1 and 2 have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the prepared protein was confirmed using SDS-PAGE. 3 ⁇ g of the prepared protein is mixed with 4X Laemmli sample buffer (Bio-Rad's Cat No. 1610747) and heated for 5 minutes using a 95°C heat block. Each sample was loaded on 4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel (Bio-Rad Cat. No. 456-1085) and stained with Coomassie Brilliant Blue G-250 (ThermoFisher Scientific Cat No. 20279). to observe The result of confirming the prepared protein is shown in FIG. 5 .
  • HeLa cells and GFP-conjugated cell-penetrating peptide dimers according to the present invention were incubated for 4 hours, and then washed vigorously with PBS three times. After fixation by treatment with 4% paraformaldehyde for 20 minutes, incubation was performed with PBS containing 0.25% Triton X-100 for 10 minutes to permeabilize. The fixed cells were blocked with 0.1% PBS-T containing 3% BSA for 1 hour. Then, the cells were treated with anti-Rab-7 antibody (anti-mouse) (Cat. #: ab50533; Abcam, USA) and anti-GFP antibody (anti-rabbit) (Invitrogen Cat. No.
  • PA5-22688 for 16 hours. Incubated at 4°C. After washing 3 times for 10 minutes with PBS, the secondary antibody, anti-rabbit antibody (Cat # A32731; Invitrogen, USA) and anti-mouse antibody (Invitrogen's Cat. No, A32744) was diluted 1:2000 and treated with cells for 1 hour. did. After washing 5 times with PBS for 10 minutes each, the cell nucleus was stained with Hoechst 33342 for 10 minutes. After washing with PBS for 10 minutes, intracellular fluorescence was observed using a confocal laser microscope (Leica, Germany), and images were taken using the manufacturer's software (Leica, Germany). The results are shown in FIG. 6 .
  • blue fluorescence indicates the cell nucleus
  • red fluorescence indicates the intracellular distribution of Rab7
  • an endosome marker indicates the intracellular distribution of GFP.
  • green fluorescence indicates the intracellular distribution of GFP.
  • control group in which the peptide was not added to HeLa cells and the experimental group (GFP) treated with GFP protein alone
  • green fluorescence in cells did not appear
  • GFP-conjugated cell-penetrating peptide dimer Example 2
  • green fluorescence was clearly observed in the cells. That is, it was confirmed that the cell-permeable peptide dimer according to the present invention has effective cell-penetrating ability (FIG. 6).
  • HeLa cells were seeded to a confluency of 70% in 96-well plates and stabilized for 24 hours.
  • the GFP-conjugated peptides of Examples 1 to 7 produced in the above-described Examples were added to the medium at a final concentration of 1 ⁇ M. After 1 hour, after washing 3 times with PBS, the GFP fluorescence intensity was measured using a plate reader.
  • the cell-permeable peptide dimer according to the present invention has significantly improved cell permeability compared to the peptide of Comparative Example 1, which is a cell-permeable peptide monomer, as well as the peptide of Comparative Example 2, which is a peptide dimer that does not use a linker. Furthermore, it was confirmed that the cell-permeable peptide dimers of the present invention using linkers of various lengths and amino acid configurations were significantly superior in cell permeability compared to Comparative Examples (FIG. 7).

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 제1 펩티드 도메인, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 제2 30Kc19α 펩티드 도메인 및 상기 제1 및 제2 펩티드 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 세포 투과성 펩티드 이량체; 상기 펩티드 이량체의 제조방법; 상기 이량체에 카고가 컨쥬게이션된 카고 전달체; 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드 이량체는 세포 투과성이 우수하여 카고 전달체로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템
본 발명은 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포내 전달 시스템에 관한 것이다.
펩티드, 단백질, 핵산 등은 치료 물질로서 큰 잠재력을 가지고 있으나, 표적 세포의 세포막을 투과하지 못해 그 사용이 매우 제한적이다. 또한 소분자 화합물이라 하더라도 그 성질이나 구조상 세포막의 지질 이중층을 투과하지 못하는 경우가 많다. 이에 전기 천공법, 리포좀을 이용한 막 융합 방법 또는 열 충격 등으로 치료 물질을 세포 내로 이동시키려는 시도가 있었으나, 세포막에 손상을 주지 않음과 동시에 상기 물질들의 활성을 그대로 유지하면서 상기 물질들을 세포 내로 이동시키기에는 많은 제약이 따른다.
이러한 상황에서 최근 세포 투과성 단백질 또는 펩티드가 주목받고 있다. 이중 가장 많은 연구가 이루어진 것이 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)에서 유래된 TAT 단백질이다. 86개의 아미노산으로 구성된 TAT 단백질 중 47-57번 아미노산으로 이루어진 펩티드가 세포 투과 기능이 있다는 사실이 알려져 있다. 비슷한 예로 HSV-1의 VP22 단백질의 267번에서 300번째까지 아미노산과 초파리의 Antennapedia(Antp)의 339번 내지 355번째 아미노산, 인위적으로 합성한 양전하를 띄는 펩티드 등이 세포 투과성 펩티드로 기능한다는 사실이 알려져 있다. 이같은 사실을 바탕으로 세포 투과성 펩티드에 단백질 또는 핵산과 같은 카고 물질을 결합시켜 이들을 세포 내로 전달하는 연구들이 수행되고 있다(문헌[Guidotti, Giulia, Liliana Brambilla, and Daniela Rossi. Trends in pharmacological sciences 38.4 (2017): 406-424.]).
30Kc19 단백질은 누에( Bombyx mori)의 혈림프에서 유래한 약 28 kDa 크기의 단백질로서, 항-아폽토시스 활성, 단백질 안정화 또는 용해도 향상 기능 등을 갖고 있어 여러 연구에 적용되어 왔다. 30Kc19 단백질 역시 세포 투과 기능을 가지는 세포 투과성 펩티드임이 알려져있다(대한민국 공개특허 10-2011-0003889).
30Kc19 단백질의 세포 투과 메커니즘은 명확히 규명되지 않았으나, 소듐 도데실 설페이트 또는 인지질과 같은 양친매성 물질이 존재할 경우 30Kc19 단백질 이량체를 형성하는 경향이 보고된 바 있다(문헌[Park, Hee Ho, et al. Biotechnology journal 9.12 (2014): 1582-1593.]).
한편, 30Kc19 단백질의 구조는 크게 알파-나선 구조의 N-말단 도메인인 30Kc19α와 베타-병풍 구조의 C-말단 도메인인 30Kc19β로 구분된다. 이중 30Kc19α가 세포 투과성 기능을 갖는 도메인이라는 점이 알려져 있다(문헌[Ryu, Jina, et al. Biotechnology journal 11.11 (2016): 1443-1451.]). 또한, 재조합 30Kc19α 도메인에 카고 물질을 부착하여 카고 전달체로 이용할 수 있음이 개시된 바 있다(대한민국 등록특허 10-1626343).
본 발명의 목적은 세포 투과성이 개선된 펩티드 이량체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 펩티드 이량체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 펩티드 이량체를 이용한 카고 전달체 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인 2 개를 펩티드 링커로 서로 연결한 펩티드 이량체의 세포 투과 효율이 현저히 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다(도 1). 이에 따라, 본 발명은 세포 투과성 펩티드 이량체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 및 이의 용도를 제공한다.
세포 투과성 펩티드 이량체
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 제1 펩티드 도메인; 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 제2 펩티드 도메인; 및 상기 제1 및 제2 펩티드 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질인 세포 투과성 펩티드 이량체로서, 상기 펩티드 링커는 상기 제1 펩티드 도메인의 카복시-말단과 상기 제2 펩티드 도메인의 아미노-말단을 서로 연결하고, 100개 이하의 아미노산으로 구성되는 것인, 신규 세포 투과성 펩티드 이량체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 신규 세포 투과성 펩티드 이량체는 아미노산 88개로 구성된 단백질인 각 펩티드 도메인(제1, 제2 펩티드 도메인)이 100개 이하의 아미노산으로 구성된 펩티드 링커로 서로 연결된 구성을 특징으로 한다(도 1). 본 발명이 속한 단백질 공학 분야에는 신규 단백질의 서열을 변경하지 않으면서 짧은 길이의 펩티드(예컨대, 타겟 펩티드) 또는 당화(예컨대, PEGylation)와 같은 추가적인 단백질 개질 방법이 알려져 있다. 본 발명의 펩티드 이량체를 구성하는 각 펩티드 도메인의 아미노산 개수 및 분자량을 고려할 때, 본 발명에 따른 신규 세포 투과성 펩티드 이량체에 당업계의 통상적인 단백질 개질 방법을 추가로 적용하더라도 본 발명에 따른 펩티드 이량체의 단백질 3차 구조에 본질적인 영향을 주지 않으며, 세포투과성이라는 본 발명의 고유 기능이 그대로 발휘되리라는 것을 예상할 수 있다. 따라서, 상술한 것과 같이 제1, 제2 펩티드 도메인과 이들에 연결된 펩티드 링커를 “포함하는 것을 특징으로”하는 본 발명의 세포투과성 펩티드 이량체의 구성은, 오직 제1, 제2 펩티드 도메인과 이들에 연결된 펩티드 링커로 “구성되는” 세포투과성 펩티드 이량체 외에도, 상기 세포 투과성 펩티드 이량체의 본질적 기능에 영향을 미치지 않는 범위에서 단백질 공학 분야의 통상적인 개질 기법을 적용함으로써 상기 세포 투과성 펩티드 이량체를 “그대로” 사용한 실시양태, 또는 상기 세포 투과성 펩티드 이량체로 “필수적으로 구성되는” 세포투과성 펩티드 이량체를 더 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서, 펩티드 링커는 상기 제1 펩티드 도메인의 카복시-말단과 상기 제2 펩티드 도메인의 아미노-말단을 서로 연결하고, 100개 이하의 아미노산으로 구성되는 천연 및/또는 합성 기원 아미노산 잔기들이 펩티드 결합에 의해 형성된 선형 사슬이다. 펩티드 링커는 제1 펩티드 도메인과 제2 펩티드 도메인을 서로 연결하고, 두 도메인의 이량체 형성을 적절히 유도함으로써, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드 이량체의 세포 투과성을 현저히 개선할 수 있다.
이론에 제한되지 않으나, 펩티드 링커는 입체 장애에 의해 서로의 활성을 간섭하는 것을 방지하고 적절한 단백질 폴딩을 가능하게 하는 정도의 가요성(flexibility)을 제공하기에 충분히 긴 것이 바람직하고, 또한 세포 내에서 안정성(예컨대, 단백질 분해 안정성)을 제공하기에 충분히 짧은 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 펩티드 링커는 1 내지 100개의 아미노산 길이를 가진다. 예컨대, 펩티드 링커는 1, 2, 3, 4 또는 5 이상의 아미노산 길이를 가지고, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50 이하의 아미노산 길이를 가진다. 구체적으로 1 내지 75 개의 아미노산 또는 5 내지 75개의 아미노산 길이를 가질 수 있고, 보다 구체적으로 5 내지 50개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 펩티드 링커는 5 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상 또는 20 개 이상의 아미노산 길이를 가지고, 50 개 이하, 40 개 이하 또는 30 개 이하의 아미노산 길이를 가진다. 구체적으로, 펩티드 링커는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ,48, 49 또는 50개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
본 발명이 속한 기술 분야에서, 펩티드 링커는 신축성(flexible), 경직성(rigid) 및 in vivo 절단성(cleavable) 링커로 분류된다(문헌[Advanced drug delivery reviews 65.10 (2013): 1357-1369] 및 [Biotechnology advances 33.1 (2015): 155-164] 등 참조). 이중, 본 발명의 펩티드 링커는 신축성 링커 또는 경직성 링커일 수 있다. 본 발명자는 발명의 기술적 과제인 신규 세포투과성 펩티드 이량체 제공을 위해, 단백질 공학 분야에서 펩티드 링커 중 신축성 링커 및 경직성 링커를 대표하는 것으로 인정되는 펩티드 링커들을 선택하여 총 7종의 신규 세포투과성 펩티드 이량체(실시예 1 내지 7)를 설계하고(도 5), 이들의 세포투과성 개선 효과를 확인하였다(도 6, 7).
일 구현예에서, 펩티드 링커는 신축성(flexible) 링커이다. 상기 신축성 링커는 아미노산의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%가 특정 아미노산 잔기, 예컨대 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 신축성 링커는 특정 아미노산의 반복 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 신축성 링커는 글리신(G) 및 세린(S)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적인 구현예에서, 본 발명의 신축성 링커는 글리신(G) 및 세린(S)으로 구성된 아미노산 서열 반복 단위를 포함하는 것일 수 있다.
신축성 링커는 링커에 연결되는 각 펩티드 도메인의 이동성, 유연성 및 상호작용을 부여할 수 있다는 장점으로 인해 단백질 공학 분야에서 널리 활용되어 왔으며, 이중 크기가 작은 아미노산인 글리신(G) 및 세린(S) 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 신축성 링커가 대표적으로 사용되어왔다(문헌[Advanced drug delivery reviews 65.10 (2013): 1357-1369], [Biotechnology advances 33.1 (2015): 155-164] 및 [Protein Science 22.2 (2013): 153-167] 등 참조)
예컨대, 상기 신축성 링커는 G, S, GGS, GSS, GGGS, GGSS, GSSS, GGGGS, GGGSS, GGSSS, GSSSS, GGGGGS, GGGGSS, GGGSSS, GGSSSS, GSSSSS의 반복 단위를 1 내지 20개 포함한다. 이 경우, 펩티드 링커의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단에서 10 개 이하 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 2 개 이하, 또는 1 개의 추가적인 임의의 아미노산인 첨가될 수 있다.
본 발명자는, 단백질 공학 분야에서 신축성 링커의 구조 및 기능적 특징을 대변한다고 알려진 G, S 아미노산 잔기 함유 반복서열(서열번호 2 내지 7)을 사용한 세포투과성 펩티드 이량체(실시예 1 내지 6)를 합성하고(도 5), 이들의 세포 투과성이 기존 펩티드 단량체(비교예 1) 및 펩티드 링커가 없는 펩티드 이량체(비교예 2) 대비 현저히 개선되었음을 실험적으로 확인하였다(도 7). 따라서, 이로부터 통상의 기술자는 신축성 링커를 사용한 세포투과성 펩티드 이량체에 대해 세포투과성 개선 효과가 동등한 수준으로 발휘될 것임을 합리적으로 예상할 수 있다.
일 구현예에서, 펩티드 링커는 경직성(rigid) 링커이다. 상기 경직성 링커는 EAAAK의 반복 단위를 1 내지 10개 포함한다. 또다른 일 구현예에서, 경직성 링커는 XP의 반복 단위를 2 내지 25개 포함한다(여기서, X는 임의의 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌, 리신 또는 글루탐산이다). 경직성 링커는 신축성 링커와 성질이 구분되는 펩티드 링커로, 각 펩티드 도메인 사이의 간격을 유지하여 그들의 독립적인 기능에 대한 간섭이 적다는 장점으로 인해 단백질 공학 분야에서 널리 활용되어 왔으며, 이중 EAAAK 반복서열로 구성된 경직성 링커가 가장 잘 연구되고 다른 경직성 링커의 구조 및 기능적 특징을 대표할 수 있는 것으로 알려져있다(문헌 [Advanced drug delivery reviews 65.10 (2013): 1357-1369] 및 [Biotechnology advances 33.1 (2015): 155-164] 등 참조). 이에 본 발명자는, EAAAK 반복서열(서열번호 8)을 사용한 세포투과성 펩티드 이량체(실시예 7)를 합성하고(도 5), 세포 투과성이 기존 펩티드 단량체(비교예 1) 및 펩티드 링커가 없는 펩티드 이량체(비교예 2) 대비 현저히 개선되었음을 실험적으로 확인하였다(도 7). 따라서, 이로부터 통상의 기술자는 경직성 링커를 사용한 세포투과성 펩티드 이량체에 대해 세포투과성 개선 효과가 동등한 수준으로 발휘될 것임을 합리적으로 예상할 수 있다.
본 발명에서 펩티드 링커는 명시된 구조 뿐만 아니라 그와 동등한 생물학적 기능을 수행하는 펩티드 링커 변이체를 포함한다. 여기서 펩티드 링커 변이체는 기준이 되는 펩티드 링커와 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이 또는 변형이 있는 펩티드를 의미하며, 예컨대 기존 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에서의 치환, 결실, 삽입 및/또는 화학적 변형에 의해 생산될 수 있다.
일 구현예에서, 펩티드 링커 변이체는 원래 펩티드 링커 변이체가 수행하는 기능에 유의미한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함하며, 보존적 아미노산 치환의 다른 예시는 하기의 표에 나타난다.
[표 1]
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일 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 서열번호 2 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된다. 일 구현예에서, 펩티드 링커는 서열번호 2 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 링커 변이체이다. 일 구현예에서, 펩티드 링커는 서열번호 2 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대한 보존적 아미노산 치환체이다.
본 발명의 펩티드 링커는 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있으며 따라서 재조합 단백질로 발현될 수 있다. 또한, 펩티드 링커는 제1 펩티드 도메인 및 제2 펩티드 도메인을 펩티드 결합으로 연결하여 재조합 단백질로 발현될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 세포 투과성 펩티드 이량체는 융합 단백질이다. 본 발명에서, 융합 단백질은 기원이 상이한 아미노산 서열들이 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 인-프레임 조합에 의해 하나의 폴리펩티드 사슬로 조합된 형태의 단백질을 지칭하며, 폴리펩티드 사슬 말단 중 하나에 융합되는 것은 물론, 상이한 기원의 서열이 폴리펩티드 사슬 내에 삽입되는 내부 융합을 포함한다. 상기 융합 단백질은 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 생산된 재조합 단백질일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 세포 투과성 펩티드 이량체에는 카고가 컨쥬게이션될 수 있다. 본 발명에서 "컨쥬게이션"은 임의의 형태의 공유결합 또는 비공유결합성 연결을 지칭하고, 직접적인 유전학적 또는 화학적 융합, 가교제를 통한 커플링, 및 비-공유결합성 회합, 예컨대 반데르발스 힘을 통한 회합을 포함한다.
본 발명의 실시예에서는 다양한 종류와 길이를 갖는 펩티드 링커를 포함하는 세포투과성 펩티드 이량체 단백질을 제조하고(도 5), 상기 단백질이 종래의 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 펩티드는 물론, 링커를 전혀 포함하지 않는 펩티드 이량체와 비교하여 세포 투과성이 현저히 개선되었음을 확인하였다(도 6 및 도 7).
상술한 바와 같이, 펩티드 링커는 대표적으로 신축성 링커와 경직성 링커로 구분되고, 도 7에서 실시예 1 내지 6은 신축성 링커를 대표하는 GGSSS 반복 아미노산 서열(길이 5~50)을, 실시예 7은 경직성 링커를 대표하는 EAAAK 반복 아미노산 서열(길이 20)을 사용한 실험 결과를 나타낸다. 실시예 1 내지 6은 동일한 신축성 링커를 사용하되 길이가 상이한 경우의 실험 결과를 나타내고, 실시예 7은 신축성 링커를 경직성 링커로 변경한 경우의 실험 결과를 나타낸다. 링커의 길이가 상이하더라도(실시예 1 내지 6), 그리고 링커의 종류가 신축성 링커에서 경직성 링커로 변경되더라도(실시예 7) 비교예 펩티드와 대비하여 세포투과성 개선 효과라는 발명의 유용성이 공통적으로 충분히 달성되었음을 확인할 수 있다. 특히, 펩티드 링커를 사용하지 않고 서열번호 1의 펩티드 도메인을 연결한 비교예 2의 펩티드와 비교하여, 다양한 펩티드 링커를 사용한 실시예 1 내지 7에서 공통적으로 세포투과성 개선 효과가 충분히 달성되고 있으며, 이는 “펩티드 링커”를 통해 연결된 30Kc19α 이량체 구성이라는 본 발명의 핵심적 기술사상을 잘 반영하는 것이다.
세포 투과성 펩티드 이량체의 제조방법
일 측면에서, 본 발명은 상술한 세포 투과성 펩티드 이량체의 제조방법을 제공한다. 이를 위해, 본 발명은 상술한 세포 투과성 펩티드 이량체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용하여 세포 투과성 펩티드 이량체를 생산하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 세포 투과성 펩티드 이량체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 상기 세포 투과성 펩티드 이량체를 발현하고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 세포 투과성 펩티드 이량체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 통상의 기술자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산은 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에서 재조합 벡터는 외래 핵산을 숙주 세포로 도입하고, 상기 숙주 세포를 형질전환하며, 도입된 핵산의 발현을 촉진할 수 있는 비히클로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용된다.
일 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 인공 염색체 벡터이다. 상기 플라스미드 벡터는 외래 DNA를 용이하게 수용할 수 있고, 숙주 세포에 용이하게 도입될 수 있는 DNA 분자로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용된다. 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환 된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다. 상기 플라스미드 벡터의 비제한적인 예로 pKK 플라스미드(Clonetech), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(Novagen, Inc., Madison, WI), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, San Diego, CA), 또는 pMAL 플라스미드(New England Biolabs, Beverly, MA)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 벡터 또는 RNA 바이러스 벡터일 수 있고, 박테리오파지, 동물 바이러스 또는 식물 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스 벡터는 백시니아, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV), 렌티 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 제1 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산; 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 제 2 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산; 및 상기 제1 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 3‘ 말단과 상기 제2 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 5’ 말단을 서로 연결하는 펩티드 링커를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 상기 세포 투과성 펩티드 이량체를 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 용어 “작동 가능하게 연결된”은 특정 핵산이 그 기능을 발휘할 수 있도록 다른 핵산에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 상기 프로모터에 의해 해당 유전자가 mRNA로 전사되어 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있음을 의미한다.
일 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 펩티드 또는 단백질인 카고를 코딩하는 핵산을 더 포함하고, 여기서 상기 카고를 코딩하는 핵산은 제1 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 5‘ 말단 또는 제2 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 3’ 말단에 연결된다. 상기 펩티드 또는 단백질인 카고의 의미는 상술한 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 벡터가 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에서 “형질전환”은 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 과정을 의미하며, 형질전환된 유전자는 숙주 세포 내에 발현될 수 있으면 숙주 세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한되지 않고 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 핵산으로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 어떠한 형태로 도입되는 것이든 제한되지 않고 사용될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환하는 방법은 본 발명의 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 본 발명이 속한 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 일시적 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질 감염(DEAE dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지된 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵세포; 효모와 같은 진균류; 식물세포; 또는 곤충 세포 또는 식물세포와 같은 포유류 세포일 수 있고, 상기 세포로부터 유래된 세포주일 수 있다. 상기 세포주의 비제한적인 예로는 CHO, HeLa, COS7, COP5, HEK293, HEK293T, HepG2, CV1, BHK, TM4, VERO-76, MDCK, W138 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 재조합 단백질 생산을 위해 적합한 숙주 세포의 종류를 적절히 선택할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 벡터가 형질전환된 숙주 세포를 이용하여 세포 투과성 펩티드 이량체를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 세포 투과성 펩티드 이량체의 제조 방법은 상술한 재조합 벡터를 상술한 재조합 숙주 세포에 형질전환하는 단계; 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 숙주 세포로부터 세포 투과성 펩티드 이량체의 발현을 유도하는 단계; 및 상기 발현된 세포 투과성 펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 재조합 단백질 생산에 적합한 숙주 세포 배양 방법, 단백질 발현 유도 방법 및 발현된 단백질 회수 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술자는 상술한 벡터 및 숙주 세포를 이용하여 본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드 이량체를 효과적으로 발현시키는 방법을 적절히 선택할 수 있다.
세포 투과성 펩티드 이량체를 이용한 카고 전달 시스템
일 측면에서, 본 발명은 상술한 세포 투과성 펩티드 이량체 및 이에 컨쥬게이션된 카고를 포함하는 카고 전달체를 제공한다.
본 발명에서 "카고(cargo)"는 본 발명에 따른 펩티드 이량체에 컨쥬게이션되어 세포 내로 이동할 수 있는 모든 물질을 지칭하며, 예컨대 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물, 화장품 또는 건강 식품의 유효 물질, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질일 수 있다. 세포 내로 전달되는 약물은 리포좀, 미셀, 자성 입자 또는 퀀텀 닷과 같은 약물 전달체를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 카고는 펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 탄수화물, 미네랄, 나노 입자, 바이러스, 조영 물질, 화학 물질 또는 이들의 조합이다.
상기 카고가 펩티드 또는 단백질일 경우, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 신경전달펩티드, 백신, 항체, 항체 단편, 효소, 효소 저해제, 가용성 수용체, 신호 전달 단백질, 전사인자, 보조 활성화 인자, 전사 억제 단백질, 미토콘드리아 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 경우, 카고 펩티드를 발현하는 DNA에 본 발명에 따른 펩티드 이량체를 발현하는 DNA를 결합시킨 후 이를 한번에 발현시킴으로써, 카고와 펩티드 이량체 융합 단백질의 형태로 카고를 펩티드 이량체에 컨쥬게이션시킬 수 있다.
상기 카고가 핵산일 경우, 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예를 들면, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수도 있다. 구체적으로, 핵산은 cDNA, decoy DNA, cfDNA, ctDNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머, 플라스미드 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조영물질은 의학적 영상 촬영에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 의미한다. 상기 조영물질은 방사선 비투과 조영물질, 상자성 조영물질, 초상자성 조영물질, CT 조영물질 또는 기타 조영물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 카고는 세포 투과성 펩티드 이량체에 공유결합된다.
일 구현예에서, 상기 카고는 세포 투과성 펩티드 이량체의 제1 펩티드 도메인의 아미노-말단 또는 제2 펩티드 도메인의 카복시-말단에 공유결합된다.
세포투과성 펩티드 이량체 단백질을 제조하고(도 5), 상기 단백질이 종래의 단량체 물론, 링커를 전혀 포함하지 않는 펩티드 이량체 단백질과 비교하여 세포 투과성이 현저히 개선되었음을 확인하였다(도 6 및 도 7).
본 발명의 실시예에서는 다양한 종류와 길이를 갖는 펩티드 링커를 포함하는 세포투과성 펩티드 이량체 단백질에 카고 단백질(GFP)가 연결된 카고 전달체를 제조하고(도 5), 상기 카고 전달체가 종래의 단량체 카고 전달체는 물론, 링커를 전혀 포함하지 않는 이량체 카고 전달체와 비교하여 세포 투과성이 현저히 개선되었음을 확인하였다(도 6 및 도 7).
즉, 본 발명에 따른 전달체는 세포 전달 효율이 종래의 세포투과성 펩티드 단량체 카고 전달체 대비 현저히 개선된 점에 특징이 있다.
이론에 제한되지 않으나, 본 발명자에 의해 새롭게 확인된 이량체 전달체의 현저한 세포 투과 효과는 하기와 같이 설명될 수 있다.
결합의 구성 측면에서, 종래의 세포투과성 펩티드 단량체 카고 전달체의 경우 상대적으로 분자량이 큰 카고가 컨쥬게이션된 형태에서 in vitro 또는 in vivo 공간을 부유하다가 서로 이량체를 형성하여야 하므로 입체적인 장애를 받을 것으로 추측된다(도 2a). 반면, 본 발명에 따른 카고 전달체는 in vitro 또는 in vivo 공간과 무관하게 각각의 30Kc19α 도메인이 펩티드 링커의 범위 안에서 움직이다가 서로 결합할 수 있으므로, 이량체 형성 확률이 더 높을 것으로 추측된다(도 2b).
in vitro에서 펩티드 이량체 형성의 측면에서, 종래의 30Kc19α 세포투과성 펩티드 단량체 카고 전달체의 경우 in vivo에 사용되는 농도에서 이량체 형성 확률이 낮아지게 되어 세포 투과 효과가 열악할 것으로 추측된다(도 3a). 반면, 본 발명에 따른 카고 전달체는 in vivo 환경에서도 높은 이량체 형성 확률을 나타내어 세포투과 효과가 현저히 개선되는 것으로 추측된다(도 3b).
이량체 형성에 따른 분자량 측면에서, 종래의 30Kc19α 세포투과성 펩티드 단량체 카고 전달체의 경우 이량체를 형성할 경우 이량체에 결합된 카고 물질이 2개가 되므로, 상대적으로 분자량이 과도하게 되어 세포 투과 효율이 열악할 것으로 추측된다(도 4a). 반면, 본 발명에 따른 카고 전달체는 1개의 카고 물질이 30Kc19α 도메인 이량체에 연결된 형태를 가지므로, 세포투과 효과가 현저히 개선되는 것으로 추측된다(도 4b).
따라서, 본 발명의 30Kc19α 세포 투과성 펩티드 이량체를 이용한 카고 전달 시스템은 in vivo 또는 임상 조건에서 투여 경로 및 이에 따른 약물동력학(pharmacokinetics) 등에서 종래 30Kc19α 세포투과성 펩티드 단량체를 이용한 카고 시스템 대비 현저히 개선된 특징이 있다.
세포 투과성 펩티드 이량체를 이용한 카고 전달 시스템의 용도
일 측면에서, 상술한 카고 전달체는 약품, 화장품 또는 식품에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 상술한 카고 전달체를 포함하는 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상술한 세포 투과성 펩티드 이량체를 의약품, 화장품 또는 식품에 적합한 함량으로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패치 또는 분무제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 폼 또는 에어로졸의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장품 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 상기 화장품 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 또는 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 통상의 기술자가 용이하게 선정 가능하다.
상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드 이량체는 30Kc19α 펩티드 단량체 대비 현저히 우수한 세포 투과성을 가져, 카고 전달체로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 세포 투과성 펩티드 이량체에 대한 도식이고;
도 2 내지 4는 본 발명의 세포 투과성 펩티드 이량체의 개선된 세포 투과 효과를 시각적으로 설명하는 도식이고;
도 5는 본 발명의 세포 투과성 펩티드 이량체를 제조한 결과를 나타낸 사진이고;
도 6은 발명의 카고 컨쥬게이션된 세포 투과성 펩티드 이량체의 세포 내 세포투과능을 면역세포화학으로 확인한 사진이고;
도 7은 다양한 링커를 사용한 본 발명의 카고 컨쥬게이션된 세포 투과성 펩티드 이량체의 세포투과능을 비교한 그래프를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시예는 발명의 이해를 쉽게하기 위해 제공되는 것 일뿐 발명의 보호범위가 이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실험 재료 및 방법>
1. 플라스미드의 제작
재조합 단백질 생산을 위한 플라스미드로 E. coli에서 발현 및 His tag 단백질 정제에 유리한 pET-23a 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)를 구입하여 사용하였다. 30Kc19α 또는 링커가 포함된 30Kc19α 유전자 일체를 Geneart社에 합성 의뢰하였다. 합성 진행시 E. coli strain에 맞게 코돈 최적화를 수행하였다.
pET-23a 벡터의 MCS(multiple cloning site) 내 BamHI/XhoI 제한효소 사이트를 이용하여 30Kc19α 유전자 서열(서열번호 9) 상단에 TurboGFP 유전자 서열이 융합된 TurboGFP-30Kc19α 유전자 서열(서열번호 10)을 삽입하였다. 상기 서열 내 EcoRI/XhoI 제한효소를 사이트를 이용하여 상기 합성 의뢰한 유전자들을 TurboGFP가 포함된 pET-23a 벡터에 삽입하였다.
구체적으로, 먼저 각각의 벡터 및 인서트를 EcoRI/XhoI 효소(NEB社) 및 Custom buffer를 첨가하고 37℃ 열 블록에서 18 시간 배양하였다. 그 다음, 아가로오스 겔에서 인서트 및 벡터를 전기영동한 뒤, 겔에서 각각의 인서트와 벡터를 AccuPrep® PCR/Gel DNA Purification Kit(바이오니아社)를 이용하여 추출하였다. 추출한 인서트 및 벡터를 3:1의 비율로 혼합한 후 T4 리가아제(NEB社 Cat. No. M0202M)를 넣고 18 시간 동안 배양하였다. 생성된 플라스미드를 DH5α competent cell(RBC社 cat.no. RH617-J80)에 형질전환시킨 후, 암피실린 내성 콜로니만을 골라 2 ml LB broth media(0.1% 암피실린)에서 12 시간 동안 배양하였다. AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Extraction Kit을 이용하여 세포 펠렛에서 플라스미드를 추출하고 최종 염기서열을 확인하였다.
2. 재조합 단백질의 생산 및 정제
상술한 과정에 따라 추출한 플라스미드를 BL21 세포에 형질전환하고 LB broth medium에 넣고 shaking incubator에서 배양하였다. IPTG 1mM를 처리한 후 4 시간 동안 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 세포 용해물을 얻고 초음파분쇄기를 이용하여 용해시켰다. 그 다음, FPLC(GE Healthcare社)를 이용하여 단백질을 정제하고, 투석한 후 보관하였다. 정제용 버퍼로 Lysis buffer(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0), Washing buffer(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 50 mM imidazole, pH 8.0), Elution buffer(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl,350 mM imidazole, pH 8.0), Dialysis buffer(20mM Tris-HCl buffer (pH 8.0))를 사용하였다.
그 결과, N'-GFP-30Kc19α-링커-30Kc19α-C'의 구조를 갖는 재조합 단백질(실시예 1 내지 7)을 수득하였다. 실시예 1 내지 7의 재조합 단백질에 포함된 GFP-30Kc19α는 모두 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 링커는 하기 표에 표시된 아미노산 서열을 가진다. 여기서, 링커 L5, L10, L20, L30, L40 및 L50은 5 내지 50개 아미노산 길이의 신축성 링커(GGSSS 반복서열)이고, Rigid 20은 20개 아미노산 길이의 경직성 링커(EAAAK 반복서열)이다.
[표 2]
Figure PCTKR2021003651-appb-img-000002
비교용 펩타이드로 N'GFP-30Kc19α-C'의 구조를 갖는 재조합 단백질(비교예 1)과 N'GFP-30Kc19α-30Kc19α'의 구조를 갖는 재조합 단백질(비교예 2)을 함께 제조하였다. 비교예 1, 2에 포함된 GFP-30Kc19α는 모두 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다.
제조된 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. 제조된 단백질 3㎍을 4X Laemmli sample buffer(Bio-Rad社 Cat No. 1610747)와 섞고 95℃ Heat block을 이용하여 5분간 가열한다. 각각의 샘플을 4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel(Bio-Rad社 Cat. No. 456-1085)에 loading 한 후 Coomassie Brilliant Blue G-250 (ThermoFisher Scientific社 Cat No. 20279)로 염색하여 관찰한다. 제조된 단백질 확인 결과는 도 5와 같다.
<실험예>
실험예 1. 면역세포화학을 이용한 세포투과성 펩티드 이량체의 세포 투과능 확인
면역세포화학 실험을 위해, HeLa 세포와 본 발명에 따른 GFP 컨쥬게이션된 세포투과성 펩티드 이량체(실시예 2)를 4 시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 강하게 세척하였다. 4% 파라포름알데히드를 20 분 동안 처리하여 고정한 뒤, 0.25% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS로 10 분 동안 인큐베이션하여 투과화하였다. 고정된 세포를 3% BSA를 포함하는 0.1% PBS-T로 1 시간 동안 블로킹하였다. 그 다음, 세포를 항 Rab-7 항체 (anti-mouse) (Cat. #: ab50533; Abcam, USA), 항 GFP 항체 (anti-rabbit) (Invitrogen社 Cat. No. PA5-22688)로 16시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 10분씩 3회 세척 후 2차 항체인 항 rabbit 항체 (Cat # A32731; Invitrogen, USA)와 항 mouse 항체(Invitrogen社 Cat. No, A32744)를 1:2000으로 희석하여 1시간 동안 세포에 처리하였다. 다시 PBS로 10분씩 5회 세척 후 세포핵은 Hoechst 33342로 10 분 동안 염색하였다. PBS로 10분간 세척 후 컨포칼 레이저 현미경(Leica, Germany)을 사용하여 세포내 형광을 관측하고, 이미지를 제작사 소프트웨어(Leica, Germany)를 사용하여 촬영하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서, 파란색 형광은 세포핵을 나타내고 빨간색 형광은 엔도좀 마커인 Rab7의 세포 내 분포를 나타내며 초록색 형광은 GFP의 세포 내 분포를 나타낸다. HeLa 세포에 펩티드를 첨가하지 않은 대조군(Control)과 GFP 단백질을 단독 처리한 실험군(GFP)의 경우 세포 내 초록색 형광이 나타나지 않는 반면, GFP 컨쥬게이션된 세포투과성 펩티드 이량체(실시예 2)를 처리한 실험군에서는 세포 내에 초록색 형광이 뚜렷하게 관찰된다. 즉, 본 발명에 따른 세포투과성 펩티드 이량체는 효과적인 세포 투과능을 갖는다는 점을 확인하였다(도 6).
실험예 2. 다양한 링커에 따른 세포투과성 펩티드 이량체의 세포 투과능 확인
96-웰 플레이트에 HeLa 세포를 confluency가 70%가 되도록 시딩하고 24시간동안 안정화시켰다. 상술한 실시예에서 생산한 실시예 1 내지 7의 GFP 컨쥬게이션된 펩티드들을 최종 농도 1μM으로 배지에 첨가하였다. 1 시간 뒤 PBS로 3번 세척한 후 플레이트 리더기를 이용하여 GFP 형광 세기를 측정하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 세포투과성 펩티드 이량체는 세포투과성 펩티드 단량체인 비교예 1 펩티드 뿐만 아니라 링커를 사용하지 않은 펩티드 이량체인 비교예 2 펩티드와 비교하여 세포투과성이 현저히 개선되었음을 확인하였다. 나아가, 다양한 길이 및 아미노산 구성의 링커를 사용한 본 발명의 세포투과성 펩티드 이량체 모두에서 비교예 대비 세포투과성이 현저히 우수하다는 점을 확인하였다(도 7).
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 제1 펩티드 도메인; 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 제2 펩티드 도메인; 및 상기 제1 및 제2 펩티드 도메인을 연결하는 펩티드 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질인 세포 투과성 펩티드 이량체로서, 상기 펩티드 링커는 상기 제1 펩티드 도메인의 카복시-말단과 상기 제2 펩티드 도메인의 아미노-말단을 서로 연결하고, 100개 이하의 아미노산으로 구성되는 것인, 세포 투과성 펩티드 이량체.
  2. 제 1 항에 있어서, 펩티드 링커는 신축성(flexible) 링커 또는 경직성(rigid) 링커인 세포 투과성 펩티드 이량체.
  3. 제 2 항에 있어서, 펩티드 링커는 글리신(G) 및 세린(S)을 포함하는 것을 특징으로 하는 신축성 링커인 세포 투과성 펩티드 이량체.
  4. 제 3 항에 있어서, 펩티드 링커는 글리신(G) 및 세린(S)으로 구성된 아미노산 서열 반복 단위를 포함하는 신축성 링커인 세포 투과성 펩티드 이량체.
  5. 제 2 항에 있어서, 펩티드 링커는 EAAAK의 아미노산 서열 반복 단위를 포함하는 경직성 링커인 세포 투과성 펩티드 이량체.
  6. 제 2 항에 있어서, 펩티드 링커는 서열번호 2 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것인 세포 투과성 펩티드 이량체.
  7. 제 1 항에 있어서, 카고가 컨쥬게이션될 수 있는 세포 투과성 펩티드 이량체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 세포 투과성 펩티드 이량체를 코딩하는 핵산.
  9. 제 8 항에 있어서, 펩티드 링커를 코딩하는 핵산은 제1 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 3‘ 말단과 상기 제2 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 5’ 말단을 서로 연결하는 것인 핵산.
  10. 제 9 항에 있어서, 펩티드 또는 단백질인 카고를 코딩하는 핵산을 더 포함하고, 여기서 상기 카고를 코딩하는 핵산은 제1 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 5‘ 말단 또는 제2 펩티드 도메인을 코딩하는 핵산의 3’ 말단에 연결되는 것인 핵산.
  11. 제 8 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제 11 항에 따른 재조합 벡터가 형질전환된 숙주 세포.
  13. 제 12 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 숙주 세포로부터 세포 투과성 펩티드 이량체의 발현을 유도하는 단계; 및 발현된 세포 투과성 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 세포 투과성 펩티드 이량체의 제조 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 세포 투과성 펩티드 이량체 및 상기 이량체에 컨쥬게이션된 카고를 포함하는 카고 전달체.
  15. 제 14 항에 있어서 카고는 펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 탄수화물, 미네랄, 나노 입자, 바이러스, 조영 물질, 화학 물질 또는 이들의 조합인 카고 전달체.
  16. 제 15 항에 있어서 카고는 세포 투과성 펩티드 이량체에 공유결합되는 것인 카고 전달체.
  17. 제 16 항에 있어서, 카고는 세포 투과성 펩티드 이량체의 제1 펩티드 도메인의 아미노-말단 또는 제2 펩티드 도메인의 카복시-말단에 공유결합되는 것인 카고 전달체.
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