KR20110003889A - 세포 내부로 외래 물질을 도입하기 위한 30킬로 단백질을 포함하는 운반체 및 외래 물질 도입 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 내부로 외래 물질을 도입하기 위한 30K 단백질로 이루어진 운반체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질에 세포 내부로 도입하고자 하는 외래 물질이 결합된 30K 단백질 결합체가 상기 세포의 세포막을 통과하도록 하는, 세포 내부로 외래 물질을 도입하는 기능을 갖는 30K 단백질을 포함하는 운반체, 그리고 외래 물질을 세포 내부로 도입하는 방법에 대한 것이다.

30K 단백질

Description

세포 내부로 외래 물질을 도입하기 위한 30킬로 단백질을 포함하는 운반체 및 외래 물질 도입 방법{VEHICLE COMPRISING 30K PROTEIN WHICH INTRODUCES FOREIGN SUBSTANCE INTO CELL AND A PROCESS FOR INTRODUCING FOREIGN SUBSTANCE INTO CELL}

본 발명은 세포 내부로 외래 물질을 도입하기 위한 30K 단백질로 이루어진 운반체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질에 세포 내부로 도입하고자 하는 외래 물질이 결합된 30K 단백질 결합체가 상기 세포의 세포막을 통과하도록 하는, 세포 내부로 외래 물질을 도입하는 기능을 갖는 30K 단백질을 포함하는 운반체, 그리고 외래 물질을 세포 내부로 도입하는 방법에 대한 것이다.

일반적으로, 인간의 세포를 비롯한 살아있는 동물의 세포막은 단백질 혹은 핵산 등과 같은 거대 생체 분자, 그리고 자성 나노 입자와 양자점과 같은 거대 무기 물질을 통과시키지 아니한다. 일부 크기가 작은 물질들은 낮은 효율로 세포막을 통과하여 세포 내로 전달되기도 하지만, 거대 물질은 이에 대한 특이적인 수용체가 세포막에 있지 않은 한 세포 내로 전달될 수 없다. 따라서 대부분의 질병 치료 및 진단을 위해 사용되는 물질들이 세포 내로 도입하거나 전달하기 어렵다.

세포 내부로 물질을 도입하거나 전달하기 위한 다양한 방법들이 개발되었는데, 특히 핵산 등을 전달하기 위한 전기 충격(electroporation), 미세 주사체를 이용한 투사법, 그리고 리포좀을 이용한 막 융합 방법 등이 대표적이다.

그러나 상기 핵산 전달 방법은 극히 제한된 수의 세포에만 핵산을 전달할 수 있고, 세포의 종류에 따라 그 효율이 크게 다르다는 단점이 있다. 더욱이, 핵산과 달리 단백질의 경우는 현재까지 검증된 효율적인 세포 내 전달 방법이 없다.

이러한 상황에서 최근 세포 투과성 단백질 또는 펩타이드(Cell-Permeable Protein or Peptide)가 주목받고 있다. 이 중 가장 많은 연구가 이루어진 것이 인간 면역 결핍 바이러스-1(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)에서 유래된 TAT 단백질인데, 86개의 아미노산으로 구성된 TAT 단백질에서 47번부터 57번까지의 11개 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 세포 투과 기능이 있다는 사실이 보고되었다[Fawell S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994)].

이와 비슷한 예로는 HSV-1(Herpes Simplex Virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산[Elliott G. et al. Cell, 88,223-233(1997)]과 드로소필라(Drosophila)의 Antennapedia(Antp)의 339번째부터 355번째 아미노산 등이 있다[Schwarze S.R. et al. Trends Pharmacol Sci. 21, 45-48(2000)]. 최근에는 인위적으로 합성한 양전하를 띠는 펩타이드도 세포 투과 기능이 있다고 보고되었다[Laus R. et al. Nature Biotechnol. 18, 1269-1272(2000)].

위와 같은 사실을 바탕으로 이러한 세포 투과 단백질의 PTD(Protein transduction domain)에 단백질 및 핵산을 결합시켜 이들을 세포 내로 전달하는 연구들이 수행되고 있다. TAT PTD에 녹색형광단백질(Green Fluorescence Protein, GFP)를 결합시캐면 세포막을 투과한다는 사실이 관찰되었고[Park J. et al. J. Gen. Virol., 83, 1173-1181 (2002)], 역시 TAT에 Cre recombinase[Nicolas J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 316, 12-20 (2004)]와 SOD(Super Oxide Dismutase)[Eum W. et al. Free Radical Biol. Med. 37, 339-349 (2004)]를 결합시켜 세포 내로 전달하여 이 결합 단백질의 활성이 세포 내에서 나타나는지를 확인한 결과들이 보고되어 왔다.

그러나 종래에 많이 연구된 TAT을 비롯한 대다수의 세포 투과 단백질들은 바이러스 유래인 경우가 많아 생체 내(in vivo) 도입 시 세포 독성을 나타낼 수 있는 점이 문제로 지적되어 왔다. 이를 극복하기 위해 인간 유래 세포 투과 단백질이나 인위적으로 합성한 PTD들이 그 대안으로 연구가 되어 왔다. 그러나 이마저도 세포 독성에 대한 정확한 연구가 이뤄져 있지는 않은 상황이다.

가장 많이 알려진 PTD인 TAT PTD를 이용하여 단백질 및 핵산을 살아있는 세포 내로 전달하고자 하는 기술은 종래의 연구 및 특허에서 다양하게 개시되어 있다.

미국 특허공개 제20050112640호 및 제20050282281호는 TAT PTD의 유전자를 포함하는 벡터(vector)를 개시하며, 상기 벡터를 이용하여 원하는 단백질에 TAT가 결합되어 발현되도록 하였다.

또한 미국 특허공개 제20080166755호는 뼈의 형성을 돕는 단백질을 TAT와 결 합시켜 뼈 생산 세포에 전달하는 기술을 개시하고 있다. 이외에도 TAT을 이용한 단백질 전달은 다양한 특허에 기재되어 있다.

또한 미국 특허공개 제20060182736호는 TAT 이외에 VP22와 Antp 같은 다른 세포 투과 단백질의 PTD를 이용한 단백질의 세포 내 전달 기술을 개시하고 있다.

상기 선행기술들은 단백질과 같은 거대 분자의 세포 전달 기술이다. 그러나 TAT와 VP22는 인체에 매우 유해한 바이러스에서 유래한 것으로서, 전장 TAT는 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있다. TAT나 VP22의 PTD 부분만을 취하여 세포에 전달시키면 전달 효율이 상승하면서 세포 독성은 상대적으로 적다는 연구 보고들이 있지만, 이에 대한 정확한 검증은 부족한 실정이다.

가장 많이 연구된 TAT와 같은 PTD들은 전달 효율이 매우 높지만, 바이러스로부터 유래하였기 때문에 세포 독성을 나타낼 수 있다는 문제점이 있다. 따라서 인간에서 유래한 PTD나 인위적으로 합성한 PTD를 이용한 세포 전달체 기술이 다양하게 개발되고 있다.

미국 특허 제7,166,692호와 대한민국 특허 제10-2008-0084937호는 인위적으로 합성한 PTD에 단백질과 핵산 등을 결합시켜 살아있는 세포 내로 전달하는 전달체 기술을 개시하고 있다. 상기 특허들에 따르면, GFP와 같은 형광 단백질과 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase)와 합성된 PTD를 유전적으로 결합시킨 후, 대장균에서 생산, 정제하고 이것을 세포에 첨가하였을 때 효과적으로 세포 내부로 전달되었다.

비록 전술한 합성 PTD들이 바이러스 유래가 아니기 때문에 현저한 세포 독성 을 나타내지는 않지만, 잠재적으로 위험 요소가 될 수 있다는 가능성이 있다. 또한 이러한 PTD들은 단백질 등을 세포 내로 전달하는 효과 외에 다른 유용한 효과를 기대하기 어렵다.

현재 다양한 질병 진단 및 치료, 생물학 연구의 목적을 달성하고자 다양한 나노 입자를 세포 내로 효율적으로 도입하기 위한 필요성이 증대되고 있다. 이를 테면, 열을 발생시켜 암세포를 특이적으로 사멸시키기 위한 자성 나노 입자나 MRI의 조영제로 사용되는 망간 옥사이드(MnO) 등을 효율적으로 전달하기 위한 다양한 운반체 기술들이 개발되어 왔다.

자성 나노입자나 조영제를 세포 내로 도입하기 위하여 PTD를 이용하는 기술들이 개발되어 있다. 미국 특허공개 제20050059031호는 TAT의 PTD를 나노입자에 결합시켜 살아있는 진핵 세포 내부로 효율적 전달을 시키기 위한 방법과 전달체를 개시하고 있다.

그러나 상기 미국 특허공개 제20050059031호 또한 바이러스 유래의 TAT을 사용하였다는 점에서 세포 독성 및 생체 내(in vivo) 전달 시 잠재적 위험 요소가 있다는 문제점이 있다.

본 발명자들은, 세포 활성을 증대하고 에이파토시스(apoptosis)를 억제한다고 알려져 있는 누에에서 유래한 30K 단백질이 세포 투과 기능이 있음을 최초로 확인하고, 이를 이용해 세포 독성 없이 단백질 및 핵산과 같은 거대 물질을 생체 외(in vitro) 혹은 생체 내(in vivo)에서 세포의 내부로 전달하는 운반체와 이를 사용하는 방법을 발명하기에 이르렀다.

본 발명에서, 에이파토시스는 동물세포에서 나타나는 프로그램된 세포 사멸 기작을 의미한다. 동물세포는 여러 가지 이유에서 전체 조직 및 개체를 보호하고 목적하는 바를 이뤄내기 위해 단일 세포를 스스로 사멸시키는 기작을 보유하고 있는데 이를 에이파토시스라고 한다. 에이파토시스는 수많은 종류의 세포 내 단백질이 관여하고 DNA 응축, apoptotic body 형성 등의 특징을 보인다.

본 발명에서 생체 거대 분자란 단백질이나 DNA/RNA같은 핵산을 포함하는 개념으로써 일반적인 경우에서는 살아있는 진핵 및 원핵세포의 내부로 전달되지 아니하는 물질을 의미한다. 그러나 단백질과 핵산에만 국한되지는 않는다.

본 발명에서 펩타이드는 수개 혹은 십수개의 아미노산이 아미드 결합을 통해 결합되어 있는 물질을 의미한다.

본 발명에서 단백질은 펩타이드보다 많은 수의 아미노산이 결합하여 3차구조를 가지는 물질을 의미한다.

본 발명에서 도메인은 단백질 내에서 단백질이 어떠한 기능을 갖도록 하는 작은 부분을 의미한다.

본 발명에서 DNA는 Deoxyribonucleic acid의 약자로 생명체의 유전정보를 가지고 있는 핵산을 의미한다. 본 발명에서 RNA는 Ribonucleic acid의 약자로 DNA의 유전정보로부터 만들어져 단백질이 만들어지는데 유전정보를 제공하는 핵산을 의미한다.

본 발명에서 거대 무기 물질이란, 자성 나노 입자나 양자점(Quantum Dots) 등 질병의 진단 및 치료, 각종 생물학적 연구에 사용되는 합성 무기 물질을 의미한 다. 이러한 물질들은 일반적으로 세포에 도입이 어렵고, 도입되더라도 높은 세포 독성을 보이는 경우가 많다. 그런 이유로 이러한 물질을 세포에 독성 없이 높은 효율로 전달하기 위한 기술의 개발이 필요한 실정이다. 여기서 자성 나노 입자와 양자점은 거대 무기 물질을 설명하기 위한 예시일 뿐 이에 국한되지는 않는다.

본 발명에서 자성 나노 입자란 니켈, 철 등의 금속 혹은 금속 산화물 등으로 이루어진 강자성 혹은 초상자성을 가지고 있는 직경 5 ~ 50nm 의 무기물을 총칭한다. 이런 자성 나노 입자는 질병의 치료 및 진단 등의 목적을 위해 생체 외 혹은 생체 내에서 살아있는 세포 내부로 전달된 필요가 있는 경우가 많다. 예를 들면 외부 교류 자기장을 통해 열을 발생시켜 암세포를 특이적으로 제거하는 등의 응용에 사용되고 있다.

본 발명에서 양자점이란 카드뮴 등의 중금속 물질로 이루어진 화합물로써 크기나 조성에 따라 다양한 종류의 형광을 띠는 것으 특징으로 한다. 이런 양자점은 생체 표지 물질의 형광 염색을 통해 생체 내 반응 및 기작, 이동 경로들을 분석하는 등의 용도로 많이 응용되고 있다.

본 발명에서 융합단백질이란 서로 다른 기능을 가지는 두 개 이상의 단백질들 간의 융합체를 의미한다. 여기에서의 단백질은 서로 같은 종류일 수도 있고 다른 종류의 단백질일 수도 있다. 이러한 단백질들이 유전적 결합을 통해 재조합 방법으로 세포를 통해 융합되어 생산되는 경우와 각각의 단백질을 화학적 방법으로 결합시키는 경우를 모두 포함한다.

본 발명에서 결합체란 단백질과 핵산, 혹은 단백질과 거대 무기 물질과 같이 서로 다른 특성을 가지는 물질이 유전적, 화학적, 혹은 전기적 방법을 통해 결합되어 있는 복합체를 의미한다.

본 발명에서 세포 투과란 생체 외(in vitro) 혹은 생체 내(in vivo)에서 살아있는 진핵 혹은 원핵세포의 세포질 혹은 핵으로 일반적으로는 전달될 수 없는 생체 및 무기 거대 물질이 투과 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 세포 투과 단백질이란 세포 표면의 수용체와 세포의 종류와 상관없이 세포에 전달될 수 있는 단백질을 의미하고 이러한 단백질들은 일반적으로 PTD라는 도메인을 가진다. 인간 면역결핍 바이러스-1(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)에서 유래한 TAT, 1형 단순포진바이러스(Herpes Simplex Virus type 1)에서 유래한 VP22, 그리고 드로소필라(Drosophila)에서 유래한 Antp 등이 자연계에 존재하는 대표적인 세포 투과 단백질이다.

본 발명에서 PTD(Protein Transduction Domain)는 세포 투과 단백질에서 투과 효과를 나타내게 하는 작은 크기의 펩타이드 서열을 의미한다. 또한, 이 PTD는 공유 혹은 비공유 결합으로 결합된 다른 단백질을 간접적으로 진핵 혹은 원핵세포의 세포질 혹은 핵으로 전달하게 하는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에서 세포의 활성은 MTT 분석을 통해 측정된다. MTT 분석은 세포의 활성을 나타내는 가장 대표적 지표인 미토콘드리아의 활성을 측정하는 방법 중 하나로써, 미토콘드리아 전자 전달계에 관여하는 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase)의 활성을 측정한다. 이를 통해 현재 세포의 활성 및 생존율을 측정할 수 있다.

본 발명의 기본적인 목적은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질에 세포 내부로 도입하고자 하는 외래 물질이 결합된 30K 단백질 결합체가 상기 세포의 세포막을 통과하도록 하는, 세포 내부로 상기 외래 물질을 도입하는 기능을 갖는 30K 단백질을 포함하는 운반체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (i) 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질의 유전자와 외래 단백질의 유전자을 벡터에 삽입하여 플라스미드를 제조하는 단계; (ii) 상기 플라스미드를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 형질전환된 세포를 배양한 후 상기 30K 단백질과 상기 외래 단백질이 결합된 융합단백질을 분리하는 단계; 그리고 (iv) 상기 융합단백질을 세포와 접촉시킴으로써 상기 세포 내부로 상기 융합단백질을 도입하는 단계를 포함하는, 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질에 세포 내부로 도입하고자 하는 외래 물질이 결합된 30K 단백질 결합체가 상기 세포의 세포막을 통과하도록 하는, 세포 내부로 상기 외래 물질을 도입하는 기능을 갖는 30K 단백질을 포함하는 운반체를 제공함으로써 달성될 수 있다

상기 30K 단백질은 누에 체액으로부터 얻거나, 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포로부터 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 또한, 상기 외래 물질은 상기 30K 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다.

상기 외래 물질은 단백질일 수 있고, 상기 단백질은 질병의 치료 및 진단을 목적으로 하는 것일 수 있다. 또한, 상기 외래 물질은 핵산일 수 있고, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수있다.

또한, 상기 외래 물질은 거대 무기 물질일 수 있고, 상기 거대 무기 물질은 자성 나노입자 또는 양자점일 수 있다.

본 발명의 외래 물질과 30K 단백질의 결합체는 세포막을 통과함으로써, 상기 외래 물질을 세포 내부로 효과적으로 전달시킨다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 (i) 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질의 유전자와 외래 단백질의 유전자을 벡터에 삽입하여 플라스미드를 제조하는 단계; (ii) 상기 플라스미드를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 형질전환된 세포를 배양한 후 상기 30K 단백질과 상기 외래 단백질이 결합된 융합단백질을 분리하는 단계; 그리고 (iv) 상기 융합단백질을 세포와 접촉시킴으로써 상기 세포 내부로 상기 융합단백질을 도입하는 단계를 포함하는, 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 상기 30K 단백질은 누에 체액으로부터 얻거나, 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포로부터 얻 을 수 있다. 또한, 상기 외래 단백질은 질병의 치료 및 진단을 목적으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 상기 숙주 세포는 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포일 수 있다.

핵산이나 자성 나노 입자, 양자점 등의 외래 물질의 경우엔 각 물질 표면의 대표적 작용기를 대상으로 화학적 방법을 동원하여 30K 단백질과 결합시킬 수 있다. 이렇게 얻어진 결합단백질을 사용하여 상기 외래 물질을 살아있는 세포 속으로 전달할 수 있다. 이 방법은 종래의 PTD를 사용하는 방법과 달리 상기 결합단백질의 농도가 높은 경우에도 세포 독성을 나타내지 않고 오히려 세포의 활성을 증진시킨다.

30K 단백질과 DNA 및 RNA 등의 핵산을 결합하는 방법은 전기적 인력을 이용한 직접 결합 방식이 사용될 수 있다.

대표적 세포 투과 단백질인 VP22는 RNA와 직접 결합하여 이것을 세포 내로 전달한다고 알려져 있는데, 이는 VP22에 존재하는 PTD가 양전하를 띠고 있어 음전하를 띠는 핵산과 전기적 인력을 통해 결합하기 때문이라 생각된다. 따라서 30K 단백질도 핵산과 직접 결합하여 이 핵산을 세포 내부로 전달할 수 있을 것이다.

30K 단백질과 자성 나노 입자, 양자점과 같은 거대 무기 물질을 결합하는 방법으로서 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 커플링제(coupling reagent)를 사용하는 방식이 사용될 수 있다.

거대 무기 물질 표면에 카르복시기를 도입하고, 상기 카르복시기를 EDC와 반 응시킴으로써 상기 카르복시기에 상기 EDC를 결합시킨다. 이 상태에서 30K 단백질을 첨가하게 되면 30K 단백질의 일차 아민기(primary amine)와 반응하여 상기 거대 무기 물질과 30K 단백질의 결합체를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 30K 단백질은, 종래의 외래 물질을 세포 내부로 전달하는 물질들과 달리, 거대 외래 물질을 효율적으로 세포 내부로 전달할 수 있음과 동시에 세포 독성을 나타내지 않고, 오히려 세포의 활성을 증대함으로써 전달된 외래 물질이 효율적으로 작용할 수 있게 도울 수 있다.

따라서 본 발명은 질병의 치료 및 진단, 혹은 생물학적 연구 목적을 달성하기 위해 단백질, 핵산과 같은 거대 생체물질이나 자성 나노입자, 양자점과 같은 거대 무기 물질을 살아있는 세포에 전달하고자 하는 연구 및 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 30 Kc19 유전자 발현 플라스미드를 사용한 대장균으로의 전달, 그리고 30Kc19의 생산 및 정제

30K 단백질의 5개의 유사체 중 누에체액에 그 함량이 가장 많이 포함된 30Kc19의 유전자를 pET3a 벡터(Novagen사)의 BamH I 부위(site)에 삽입하였다. 이렇게 얻은 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환(transformation)시킨 후 플라스미드가 삽입된 대장균 클론만을 암피실린(ampicillin) 선별법을 사용하여 선별하였다. 이때 생산되는 30Kc19의 카르복실 말단에 히스티딘 태그(His₆-tag)서열을 추가시켜 정제를 용이하게 하였다.

상기 균주를 LB배지에서 배양한 뒤 1mM의 이소프로필 - 베타 - 디 - 티오칼락토피라노시드(isopropyl - β - D - thiogalactopyranoside: IPTG)를 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 배양하여 30Kc19 단백질을 생산하였다. 그 후, 원심분리를 통해 모은 세포를 음파처리(sonication)하여 파쇄하였다. 이렇게 얻은 파쇄액을 원심분리하여 얻은 상등액을 HisTrap HP column (1mL, Amersham)을 사용하여 30Kc19을 정제하였다. 정제한 30Kc19을 PBS로 완충액 교환을 하여 보관한 뒤 실험에 사용하였다.

실시예 2. 웨스턴 블랏을 이용한 30 Kc19 의 세포 투과 효과 관찰

HEK293T 세포와 CHO 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco)이 첨가된 DMEM 배지(JBI)에서 배양하였다. 세포가 바닥면의 70% 정도를 차지했을 때, 일정한 농도의 30Kc19이 첨가된 새로운 배지로 교체하였고, 그 후 일정한 시간 동안 배양하였다. 세포로 전달된 30Kc19을 확인하기 위해 먼저 세포를 PBS로 3회 세척한 후 1% 트립 신 용액을 이용해 플레이트 바닥에서 떼어내었다. 원심분리를 통해 떼어낸 세포를 취득하고 이를 RIPA 완충액으로 파쇄하였다. 원심분리를 통해 얻은 상등액을 이용해 12% SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다. 전기영동 후 젤을 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 전이시킨 뒤 5% 탈지유(skim milk)로 차단(blocking)하였다. 이후 토끼에서 얻은 30Kc19의 항체를 이용하여 세포에 전달된 30Kc19을 검출하였다.

도 1A는 초(CHO) 세포에 농도별로 30Kc19을 첨가하고 12시간을 배양한 뒤, 세포를 파쇄하여 얻은 파쇄액에 존재하는 30Kc19을 웨스턴 블랏으로 검출한 결과이다. 처리한 농도가 높아질수록 세포에 전달된 30Kc19의 양도 증가하는 것으로 보아 30Kc19의 세포 투과 정도는 외부에서의 처리 농도에 비례함을 알 수 있다.

도 1B는 HEK293T 세포에 0.2mg/ml의 30Kc19을 첨가하고 배양 시간에 따른 30Kc19의 세포 내 전달 정도를 웨스턴 블랏으로 검출한 결과이다. 그 결과, 15분 정도의 비교적 짧은 시간의 처리만으로도 30Kc19이 세포에 충분이 전달되었음을 알 수 있다.

실시예 3. 덱스트란 설페이트(dextran sulfate)가 30 Kc19 의 세포 전달 효율에 미치는 영향 분석

세포 투과 단백질은 일반적으로 양전하를 띠는 도메인을 가지고 있고, 상기 도메인이 음전하를 띠는 세포 표면과 전기적 결함을 함으로써 세포를 투과한다고 알려져 있다. 따라서 음전하를 띠는 덱스트란 설페이트를 처리하면 세포 투과 단백 질이 세포 표면과 잘 결합하지 못하기 때문에 투과도가 떨어진다는 사실이 알려져 있다. 본 실시예에서는 분자량이 5,000 가량 되는 덱스트란 설페이트를 사용하였다.

도 2는 음전하를 띠는 물질인 덱스트란 설페이트가 30Kc19의 세포 투과에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 이를 위해 HEK293T 세포에 0.2mg/ml의 30Kc19을 표시된 농도만큼의 덱스트란 설페이트와 함께 4시간 동안 처리한 후 세포를 수거해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과 덱스트란 설페이트의 농도가 증가할수록 30Kc19의 세포 전달이 저해되었음을 확인하였다.

실시예 4. 세포 내부로 전달된 30 Kc19 의 외부 유출 현상

HEK293T 세포를 포함하는 배지에 0.2mg/ml의 농도로 30Kc19를 첨가하였고, 4시간 동안 배양한 뒤, 30Kc19를 포함하지 않은 새로운 배지로 교체하였으며, 추가로 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포와 배지에 존재하는 30Kc19을 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

도 3은 30Kc19이 포함된 배지에서 HEK293T 세포를 4시간 동안 배양한 후 상기 세포에 존재하는 30Kc19와 그 후 30Kc19가 포함되지 아니한 배지에서 4시간 동안 추가 배양 한 세포와 배지에 존재하는 30Kc19의 양을 확인한 실험 결과이다. 30Kc19가 포함된 배지에서 HEK293T 세포를 배양했을 때에는 상기 세포에서 30Kc19이 발견되었고, 반면에 30Kc19가 포함되지 아니한 새로운 배지로 교체한 후에는 세포에 존재하였던 30Kc19가 배지에서 발견되었음을 확인하였다. 이를 통하여 세포 내부로 들어온 30Kc19이 다시 외부로 유출될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 공초점 현미경을 이용한 세포 내 30 Kc19 의 위치 분석

HeLa 세포에 0.4mg/ml의 농도로 30Kc19를 첨가하고 일정 시간 배양한 뒤, PBS로 3회 세척하였다. 상기 세척된 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 20분간 고정하였고, 0.25% 트리톤 X-100(Trition X-100) 용액으로 상기 HeLa 세포 표면에 항체가 들어가기 위한 구멍을 내었다. 이 후 세포 내 30Kc19을 형광 염색하기 위하여 30Kc19의 항체를 1시간 동안 처리하였고 PBS로 5회 세척한 후, 알렉스 플루오르 488(Alex Fluor 488)로 표지된 이차 항체를 1시간 처리하였으며, PBS로 5회 세척하였다. 최종적으로 핵을 염색하기 위한 propidium iodide(PI)를 10분간 처리한 후 공초점 현미경(Olympus사, 일본)을 이용해 세포를 관찰하였다.

처리 시간에 따른 30Kc19의 세포 내 위치를 형광 이미지를 통해 분석한 결과를 도 4에 나타내었다. 각 시간에서 핵을 염색한 결과와 30Kc19와 핵을 합친 이미지를 함께 나타내었다. 도 4의 결과로 보아, 30Kc19를 15분만 처리했을 때는 30Kc19가 미처 세포 내부로 완전히 전달되지 않았고 주로 표면에 달라붙은 채로 존재하였지만, 1시간이 경과한 후에는 대부분의 30Kc19이 세포 내부에 존재함을 알 수 있다. 핵과 함께 염색한 이미지를 보면 30Kc19이 핵에는 위치하지 않음을 알 수 있다. 30Kc19을 24시간 동안 처리했을 때에도, 1시간 처리했을 때와 비슷한 결과를 보였다.

실시예 6. 30 Kc19 이 세포의 활성에 미치는 영향 분석

HeLa 세포에 각기 다른 농도의 30Kc19 단백질을 첨가하였고 24시간 동안 배양한 뒤, 세포의 활성을 측정하는 가장 대표적인 분석 방법인 MTT 분석을 통해 30Kc19이 세포 활성에 미치는 영향을 분석하였다.

도 5는 HeLa 세포에 다양한 농도의 30Kc19 단백질을 24시간 동안 처리한 후 세포의 활성을 MTT 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 5의 결과로 알 수 있듯이, 약 1mg/ml(약 34μM)의 고농도로 30Kc19 단백질을 처리한 경우에도, 세포 독성 및 활성 저하가 전혀 나타나지 않았고 오히려 활성이 40% 가까이 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 7. GFP -30 Kc19 융합 단백질의 생산 및 세포 투과 효과 분석

일반적으로 세포 내부로 전달되지 아니한 거대 물질에 30Kc19을 결합시킴으로써, 상기 거대 물질을 세포 내부로 전달시킬 수 있는지를 알아보기 위하여 30Kc19에 외래 단백질을 결합시켰다. 본 실시예에서는 외래 단백질로서 형광을 띠는 GFP를 선정하였다.

30Kc19의 유전자를 pET23a 벡터(Novagen사)에 EcoR I과 Xho I 부위에 삽입하고 라이게이션(ligation)하여 벡터를 얻었다. 30Kc19의 유전자가 포함된 pET23a 벡터에 GFP 유전자를 BamH I과 EcoR I 부위에 삽입하고 라이게이션하여 융합 단백질을 생산하기 위한 플라스미드를 완성하였다. 상기 플라스미드를 사용하여 형질전환 된 대장균 BL21(DE3) 균주를 LB배지에서 배양한 후, 0.5mM의 이소프로필 - 베타 - 디 - 티오칼락토피라노시드(isopropyl - β - D - thiogalactopyranoside: IPTG)를 첨가하여 6시간 동안 30℃에서 배양함으로써, GFP가 30Kc19 단백질의 N-말단에 결합한 GFP-30Kc19 융합 단백질을 생산하였다. 그 후, 원심분리를 통해 모은 세포를 음파파쇄하였다. 이때 생산된 융합 단백질은 GFP의 카르복실 말단에 30Kc19이 결합되어 있고, 상기 30Kc19의 카르복실 말단에 정제를 용이하게 하기 위한 히스티딘 태그를 결합시켜 생산하였다. 상기 융합 단백질에서 GFP와 30Kc19 사이에는 유전자 조합 시 사용된 EcoR I 인지 부위에 의한 2개의 아미노산(Glu-Phe)이 존재하게 되고, 30Kc19과 히스티딘 태그 사이에는 역시 유전자 조합 시 사용된 Xho I 인지 부위에 의한 2개의 아미노산(Leu-Glu)이 존재하게 된다. 상기 파쇄액을 원심분리하여 얻은 상층액을 HisTrap HP column(1mL, Amersham)을 사용하여 GFP-30Kc19을 정제하였다. 상기 정제한 GFP-30Kc19을 PBS로 완충액 교환을 하여 보관한 뒤 실험에 사용하였다.

HEK293T 세포에 각기 다른 농도의 GFP-30Kc19 융합 단백질을 4시간 동안 처리한 후, 분광형광계(spectrofluorometer)를 이용하여 세포의 형광 정도를 분석한 결과를 도 6에 나타내었다. 상기 융합 단백질의 첨가 농도가 높을수록 형광이 강해지는 것으로 보아 GFP-30Kc19가 농도에 비례하여 세포에 전달되었음을 확인하였다.

또한 HeLa 세포에 15μM의 GFP-30Kc19를 첨가하고 24시간 동안 배양한 후 세척 및 고정화 과정, PI를 이용한 핵의 염색 과정을 거친 후, 세포 내 GFP-30Kc19을 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 도 7A에 나타내었다. 이 경우엔 30Kc19을 항체를 이용하여 염색하지 아니하였고 GFP의 형광을 이용해 직접적으로 관찰하였다. 30Kc19의 경우와 마찬가지로, GFP-30Kc19도 핵을 제외한 세포 내부로 잘 전달되었음을 확인하였다. 도 7A와 같은 조건에서 세포 고정화 과정 없이 생세포 영상화(live cell imaging) 결과를 도 7B에 나타내었다. 상기 생세포 영상화는 세포 고정에 따른 잘못된 인공적 결과가 나올 가능성을 배제하기 위함이다. 동일한 농도의 GFP-30Kc19로 동일한 시간 동안 처리한 후, 살아있는 세포를 그대로 공초점 현미경으로 관찰했을 때에도, 세포를 고정했을 때와 마찬가지로 핵을 제외한 세포 내부에 GFP-30Kc19이 전달되었음을 확인하였다.

위의 결과를 통하여 본질적으로 세포 내부로 전달되지 아니하는 GFP와 같은 생체 거대 물질을 30Kc19과 결합시킴으로써 세포 내부로 전달할 수 있음을 확인하였다.

도 1은 본 발명의 실시예 2의 30Kc19을 처리하는 농도 및 시간 변화에 따라 세포에 전달된 30Kc19의 양을 분석한 결과이다.

도 2는 본 발명의 실시예 3의 30Kc19을 HEK293T 세포에 전달할 때 덱스트란 설페이트를 함께 첨가한 경우에, 세포에 전달된 30Kc19을 웨스턴 블랏으로 검출한 결과이다.

도 3은 본 발명의 실시예 4의 30Kc19이 포함된 배지에서 HEK293T 세포를 4시간 동안 배양한 후 상기 세포에 존재하는 30Kc19와 그 후 30Kc19가 포함되지 아니한 배지에서 4시간 동안 추가 배양 한 세포와 배지에 존재하는 30Kc19의 양을 확인한 실험 결과이다.

도 4는 본 발명의 실시예 5의 처리 시간에 따른 30Kc19의 세포 내 위치를 형광 이미지를 통해 분석한 결과이다.

도 5는 본 발명의 실시예 6의 HeLa 세포에 각기 다른 농도의 30Kc19을 첨가하여 배양한 후 MTT 분석을 통해 30Kc19이 세포 활성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 6은 본 발명의 실시예 7의 HEK293T 세포에 각기 다른 농도의 GFP-30Kc19 융합 단백질을 4시간 동안 처리한 후, 분광형광계(spectrofluorometer)를 이용하여 세포의 형광 정도를 분석한 결과이다.

도 7은 본 발명의 실시예 7의 HeLa 세포에 15μM의 GFP-30Kc19를 첨가하고 24시간 동안 배양한 후 세척 및 고정화 과정, PI를 이용한 핵의 염색 과정을 거친 후, 세포 내 GFP-30Kc19을 공초점 현미경으로 관찰한 결과(도 7A)와 세포 고정화 과정 없이 생세포를 영상화(live cell imaging)한 결과(도 7B)이다.

<110> HAN Kyuboem; Hanson Biotech Co. Ltd. <120> VEHICLE COMPRISING 30K PROTEIN WHICH INTRODUCES FOREIGN SUBSTANCE INTO CELL AND A PROCESS FOR INTRODUCING FOREIGN SUBSTANCE INTO CELL <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 1 Thr Leu Ala Pro Arg Thr Asp Asp Val Leu Ala Glu Gln Leu Tyr Met 1 5 10 15 Ser Val Val Ile Gly Glu Tyr Glu Thr Ala Ile Ala Lys Cys Ser Glu 20 25 30 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Gly Glu Val Ile Lys Glu Ala Val Lys Arg 35 40 45 Leu Ile Glu Asn Gly Lys Arg Asn Thr Met Asp Phe Ala Tyr Gln Leu 50 55 60 Trp Thr Lys Asp Gly Lys Glu Ile Val Lys Ser Tyr Phe Pro Ile Gln 65 70 75 80 Phe Arg Val Ile Phe Thr Glu Gln Thr Val Lys Leu Ile Asn Lys Arg 85 90 95 Asp His His Ala Leu Lys Leu Ile Asp Gln Gln Asn His Asn Lys Ile 100 105 110 Ala Phe Gly Asp Ser Lys Asp Lys Thr Ser Lys Lys Val Ser Trp Lys 115 120 125 Phe Thr Pro Val Leu Glu Asn Asn Arg Val Tyr Phe Lys Thr Met Ser 130 135 140 Thr Glu Asp Lys Gln Tyr Leu Lys Leu Asp Asn Thr Lys Gly Ser Ser 145 150 155 160 Asp Asp Arg Ile Ile Tyr Gly Asp Ser Thr Ala Asp Thr Phe Lys His 165 170 175 His Trp Tyr Leu Glu Pro Ser Met Tyr Glu Ser Asp Val Met Phe Phe 180 185 190 Val Tyr Asn Arg Glu Tyr Asn Ser Val Met Thr Leu Asp Glu Asp Met 195 200 205 Ala Ala Asn Glu Asp Arg Glu Ala Leu Gly His Ser Gly Glu Val Ser 210 215 220 Gly Tyr Pro Gln Leu Phe Ala Trp Tyr Ile Val Pro Tyr 225 230 235 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 2 Gly Val Val Glu Leu Ser Ala Asp Ser Met Ser Pro Ser Asn Gln Asp 1 5 10 15 Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asn Ser Ile Leu Thr Gly Asp Tyr Asp Ser 20 25 30 Ala Val Arg Lys Ser Leu Glu Tyr Glu Ser Gln Gly Gln Gly Ser Ile 35 40 45 Val Gln Asn Val Val Asn Asn Leu Ile Ile Asp Lys Arg Arg Asn Thr 50 55 60 Met Glu Tyr Cys Tyr Lys Leu Trp Val Gly Asn Gly Gln Asp Ile Val 65 70 75 80 Lys Lys Tyr Phe Pro Leu Ser Phe Arg Leu Ile Met Ala Gly Asn Tyr 85 90 95 Val Lys Leu Ile Tyr Arg Asn Tyr Asn Leu Ala Leu Lys Leu Gly Ser 100 105 110 Thr Thr Asn Pro Ser Asn Glu Arg Ile Ala Tyr Gly Asp Gly Val Asp 115 120 125 Lys His Thr Asp Leu Val Ser Trp Lys Phe Ile Thr Leu Trp Glu Asn 130 135 140 Asn Arg Val Tyr Phe Lys Ala His Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Tyr Leu 145 150 155 160 Lys Met Ser Thr Ser Thr Cys Asn Cys Asn Ala Arg Asp Arg Val Val 165 170 175 Tyr Gly Gly Asn Ser Ala Asp Ser Thr Arg Glu Gln Trp Phe Phe Gln 180 185 190 Pro Ala Lys Tyr Glu Asn Asp Val Leu Phe Phe Ile Tyr Asn Arg Gln 195 200 205 Phe Asn Asp Ala Leu Glu Leu Gly Thr Ile Val Asn Ala Ser Gly Asp 210 215 220 Arg Lys Ala Val Gly His Asp Gly Glu Val Ala Gly Leu Pro Asp Ile 225 230 235 240 Tyr Ser Trp Phe Ile Thr Pro Phe 245 <210> 3 <211> 239 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 3 Ala Asp Ser Asp Val Pro Asn Asp Ile Leu Glu Glu Gln Leu Tyr Asn 1 5 10 15 Ser Val Val Val Ala Asp Tyr Asp Ser Ala Val Glu Lys Ser Lys His 20 25 30 Leu Tyr Glu Glu Lys Lys Ser Glu Val Ile Thr Asn Val Val Asn Lys 35 40 45 Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys Met Glu Tyr Ala Tyr Gln Leu 50 55 60 Trp Leu Gln Gly Ser Lys Asp Ile Val Arg Asp Cys Phe Pro Val Glu 65 70 75 80 Phe Arg Leu Ile Phe Ala Glu Asn Ala Ile Lys Leu Met Tyr Lys Arg 85 90 95 Asp Gly Leu Ala Leu Thr Leu Ser Asn Asp Val Gln Gly Asp Asp Gly 100 105 110 Arg Pro Arg Tyr Gly Asp Gly Lys Asp Lys Thr Ser Pro Arg Val Ser 115 120 125 Trp Lys Leu Ile Ala Leu Trp Glu Asn Asn Lys Val Tyr Phe Lys Ile 130 135 140 Leu Asn Thr Glu Arg Asn Gln Tyr Leu Val Leu Gly Val Gly Thr Asn 145 150 155 160 Trp Asn Gly Asp His Met Ala Phe Gly Val Asn Ser Val Asp Ser Phe 165 170 175 Arg Ala Gln Trp Tyr Leu Gln Pro Ala Lys Tyr Asp Asn Asp Val Leu 180 185 190 Phe Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Tyr Ser Lys Ala Leu Thr Leu Ser Arg 195 200 205 Thr Val Glu Pro Ser Gly His Arg Met Ala Trp Gly Tyr Asn Gly Arg 210 215 220 Val Ile Gly Ser Pro Glu His Tyr Ala Trp Gly Ile Lys Ala Phe 225 230 235 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 4 Gly Val Ala Glu Met Ser Ala Val Ser Met Ser Ser Ser Asn Lys Glu 1 5 10 15 Leu Glu Glu Lys Leu Tyr Asn Ser Ile Leu Thr Gly Asp Tyr Asp Ser 20 25 30 Ala Val Arg Gln Ser Leu Glu Tyr Glu Asn Gln Gly Lys Gly Ser Ile 35 40 45 Ile Gln Asn Val Val Asn Asn Leu Ile Ile Asp Gly Ser Arg Asn Thr 50 55 60 Met Glu Tyr Cys Tyr Lys Leu Trp Val Gly Asn Gly Gln His Ile Val 65 70 75 80 Arg Lys Tyr Phe Pro Tyr Asn Phe Arg Leu Ile Met Ala Gly Asn Phe 85 90 95 Val Lys Leu Ile Tyr Arg Asn Tyr Asn Leu Ala Leu Lys Leu Gly Pro 100 105 110 Thr Leu Asp Pro Ala Asn Glu Arg Leu Ala Tyr Gly Asp Gly Lys Glu 115 120 125 Lys Asn Ser Asp Leu Ile Arg Trp Lys Phe Ile Thr Leu Trp Glu Asn 130 135 140 Asn Arg Val Tyr Phe Lys Ile His Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Ser Ser Thr Thr Asp Cys Asn Thr Gln Asp Arg Val Ile Phe 165 170 175 Gly Thr Asn Thr Ala Asp Thr Thr Arg Glu Gln Trp Phe Leu Gln Pro 180 185 190 Thr Lys Tyr Glu Asn Asp Val Leu Phe Phe Ile Tyr Asn Arg Glu Tyr 195 200 205 Asn Asp Ala Leu Lys Leu Gly Arg Ile Val Asp Ala Ser Gly Asp Arg 210 215 220 Met Ala Phe Gly His Asp Gly Glu Val Ala Gly Leu Pro Asp Ile Phe 225 230 235 240 Cys Trp Phe Val Thr Pro Phe 245 <210> 5 <211> 247 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 5 Cys Ala Glu Met Ser Ala Val Ser Met Ser Ser Ser Asn Lys Glu Leu 1 5 10 15 Glu Glu Lys Leu Tyr Asn Ser Ile Leu Thr Gly Asp Tyr Asp Ser Ala 20 25 30 Val Arg Gln Ser Leu Glu Tyr Glu Ser Gln Gly Lys Gly Ser Ile Ile 35 40 45 Gln Asn Val Val Asn Asn Leu Ile Ile Asp Lys Arg Arg Asn Thr Met 50 55 60 Glu Tyr Cys Tyr Lys Leu Trp Val Gly Asn Gly Gln Glu Ile Val Arg 65 70 75 80 Lys Tyr Phe Pro Leu Asn Phe Arg Leu Ile Met Ala Gly Asn Tyr Val 85 90 95 Lys Ile Ile Tyr Arg Asn Tyr Asn Leu Ala Leu Lys Leu Gly Ser Thr 100 105 110 Thr Asn Pro Ser Asn Glu Arg Ile Ala Tyr Gly Asp Gly Val Asp Lys 115 120 125 His Thr Glu Leu Val Ser Trp Lys Phe Ile Thr Leu Trp Glu Asn Asn 130 135 140 Arg Val Tyr Phe Lys Ile His Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Tyr Leu Lys 145 150 155 160 Met Ser Thr Thr Thr Cys Asn Cys Asn Ser Arg Asp Arg Val Val Tyr 165 170 175 Gly Gly Asn Ser Ala Asp Ser Thr Arg Glu Gln Trp Phe Phe Gln Pro 180 185 190 Ala Lys Tyr Glu Asn Asp Val Leu Phe Phe Ile Tyr Asn Arg Gln Phe 195 200 205 Asn Asp Ala Leu Glu Leu Gly Thr Ile Val Asn Ala Ser Gly Asp Arg 210 215 220 Lys Ala Val Gly His Asp Gly Glu Val Ala Gly Leu Pro Asp Ile Tyr 225 230 235 240 Ser Trp Phe Ile Thr Pro Phe 245

Claims (17)

1. 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질에 세포 내부로 도입하고자 하는 외래 물질이 결합된 30K 단백질 결합체가 상기 세포의 세포막을 통과하도록 하는, 세포 내부로 상기 외래 물질을 도입하기 위한 30K 단백질을 포함하는 운반체.
2. 제1항에 있어서, 상기 외래 물질이 상기 30K 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합하는 것임을 특징으로 하는 운반체.
3. 제1항에 있어서, 상기 30K 단백질이 누에 체액으로부터 얻는 것임을 특징으로 하는 운반체.
4. 제1항에 있어서, 상기 30K 단백질이 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 생산된 재조합 단백질인 것임을 특징으로 하는 운반체.
5. 제1항에 있어서, 상기 외래 물질이 단백질인 것임을 특징으로 하는 운반체.
6. 제5항에 있어서, 상기 단백질이 질병의 치료 및 진단을 목적으로 하는 것임 을 특징으로 하는 운반체.
7. 제1항에 있어서, 상기 외래 물질이 핵산인 것임을 특징으로 하는 운반체.
8. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 DNA 또는 RNA인 것임을 특징으로 하는 세포 내부로 외래 물질을 운반하는 운반체.
9. 제1항에 있어서, 상기 외래 물질이 거대 무기 물질인 것임을 특징으로 하는 운반체.
10. 제1항에 있어서, 상기 거대 무기 물질이 자성 나노입자 또는 양자점인 것임을 특징으로 하는 운반체.
11. (i) 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질의 유전자와 외래 단백질의 유전자을 벡터에 삽입하여 플라스미드를 제조하는 단계;

    (ii) 상기 플라스미드를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

    (iii) 상기 형질전환된 세포를 배양한 후 상기 30K 단백질과 상기 외래 단백질이 결합된 융합단백질을 분리하는 단계; 그리고

    (iv) 상기 융합단백질을 세포와 접촉시킴으로써 상기 세포 내부로 상기 융합 단백질을 도입하는 단계를 포함하는, 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 30K 단백질이 누에 체액으로부터 얻는 것임을 특징으로 하는 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 30K 단백질이 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 생산된 재조합 단백질인 것임을 특징으로 하는 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 외래 단백질이 질병의 치료 및 진단을 목적으로 하는 것임을 특징으로 하는 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 외래 단백질을 세포 내부로 도입하는 방법.
16. (i) 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질과 핵산을 결합하는 단계; 그리고

    (ii) 상기 핵산과 30K단백질의 결합체를 세포와 접촉시킴으로써 상기 세포 내부로 상기 핵산을 도입하는 단계를 포함하는, 핵산을 세포 내부로 도입하는 방법.
17. (i) 거대 무기 물질 표면에 카르복시기를 도입하는 단계;

    (ii) 상기 카르복시기를 EDC와 반응시켜 상기 카르복시기에 EDC를 결합시키는 단계;

    (iii) 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 30K 단백질과 상기 (ii)단계의 결과물과 반응시켜 거대 무기 물질과 30K 단백질의 결합체를 제조하는 단계; 그리고

    (iv) 상기 거대 무기 물질과 30K 단백질의 결합체를 세포와 접촉시킴으로써 상기 세포 내부로 상기 거대 무기 물질을 도입하는 단계를 포함하는, 거대 무기 물질을 세포 내부로 도입하는 방법.

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