KR102185390B1 - 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인을 포함하는 신규 세포 투과성 재조합 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질은 세레블론 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 및 이의 용도{Cell-penetrating cereblon recombinant fusion protein and use thereof}

본 발명은 신규 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

세레블론(Cereblon)은 인간에서 CRBN 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, DDB(DNA binding protein 1), CUL4A(Cullin-4A) 및 ROC1(regulator of cullins 1)과 함께 E3 유비퀴틴 라이게이즈 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 다수의 다른 단백질을 유비퀴틴화시킨다. 예컨대, 세레블론에 의한 표적 단백질의 유비퀴틴화는 FGF8 및 FGF10 수준의 증가를 유발하고, 다수의 발달 과정에서 사지 및 청각 소포 형성을 조절함으로써, 태아에서 사지 생장에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

면역 조절성 약물(Immunomodulatory imide drugs; IMiD)은 탈리도마이드 및 그의 유사체인 레날리도마이드, 포말리도마이드 등이 속한 이미드 계열 약물로, 나성결절홍반, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 급성 골수성 백혈병의 치료 효능이 알려져 있다. IMiD의 핵심 표적은 세레블론이며, IMiD의 다발성 골수종 치료 기전은 IMiD와 세레블론의 결합에 따라 전사 인자인 이카로스(Ikaros)(IKZF1) 및 아이올로스(Aiolos)(IKZF3)의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 복합체 특이성을 변경하는 것과 연관되어 있다. 세레블론의 발현 증가는 다발성 골수종에 대한 IMiD 치료 효능 개선과 연관되어 있음이 알려져 있다(문헌[Zhu et al (2013)] 등). 반대로, 세레블론 발현 감소 또는 돌연변이와 같은 기능 이상은 IMiD 요법에 대한 치료 반응성 감소를 야기한다. 다발성 골수종에서 이와 같은 상관관계가 주로 알려져 있다(문헌[Zhu et al (2019)], 문헌 [Franssen et al (2018)] 등)

한편, E3 유비퀴틴 라이게이즈인 세레블론에 대한 IMiD 결합능에 착안하여, 질환 단백질 분해 유도 화합물인 PROTAC(proteolysis targeting chimera) 기술이 최근 각광받고 있다. PROTAC 화합물이란 질환 관련 표적 단백질에 결합하는 리간드 분자와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 연결된 이기능성 화합물로서, 표적 단백질의 체내 단백질 분해(proteolysis)를 유도한다. 세레블론 기능이 결여된 경우, IMiD 저항성이 야기되는 것과 마찬가지로 IMiD를 활용한 세레블론 PROTAC의 저항성 역시 유발된다는 점이 보고된 바 있다(문헌[Ottis et al. (2019)] 등).

따라서 세레블론 기능 이상을 회복시켜, 세레블론 표적 약물의 기능을 개선하기 위한 신규한 의약품에 대한 충족되지 않은 수요가 존재한다. 세레블론 발현을 인위적으로 조절하는 등 유전자 수준에서 세레블론 관련 질환을 치료하기 위한 시도가 있었으나, 세레블론 기능 이상이 보고된 세포 내 mRNA 수준과 단백질 수준의 상관성은 적은 것으로 알려져 있어, 일정한 한계가 존재한다(문헌[Gandhi et al. (2014) 등]).

한편, 세레블론 단백질 자체를 인위적으로 발현시켜 표적 세포에 도입하는 방식은 세레블론 단백질 자체의 반감기가 약 0.6 h로 매우 불안정하다고 알려져있음을 고려할 때 세레블론 기능 이상을 회복하기 위한 방식으로는 매우 부적절한 것으로 알려져왔다(문헌 [Chen et al. (2015)] 등). 더구나, 외생 단백질을 세포 내로 도입하는 방법은 고분자량의 단백질이 표적 세포의 세포막을 투과하지 못해 그 사용이 매우 제한적이기도 하다.

세포내 운반 단백질 투과를 위해 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)를 접합시키는 방안이 있으나, 세레블론은 단백질 수준의 접합체가 추가될 경우, 그 접합위치에 따라 구조적 입체장애로 인해 세포 내에서 E3 유비퀴틴 라이게이즈 복합체 형성에 실패할 수 있고, 원래 결합하던 약물이 결합되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 세포 투과성 펩티드를 세레블론에 단순히 접합시킨다고 하여 온전히 세레블론의 기능을 발휘할 것인지 예상하기는 대단히 어렵다.

세포 투과성 펩티드의 경우, 가장 많은 연구가 이루어진 세포 투과성 펩티드는 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)에서 유래된 TAT 단백질이다. 86개의 아미노산으로 구성된 TAT 단백질 중 47-57번 아미노산으로 이루어진 펩티드가 세포 투과 기능이 있다는 사실이 알려져 있다. 비슷한 예로 HSV-1의 VP22 단백질의 267번에서 300번째까지 아미노산과 초파리의 Antennapedia(Antp)의 339번 내지 355번째 아미노산, 인위적으로 합성한 양전하를 띄는 펩티드 등이 세포 투과성 펩티드로 기능한다는 사실이 알려져 있다. 이같은 사실을 바탕으로 세포 투과성 펩티드에 단백질 또는 핵산과 같은 카고 물질을 결합시켜 이들을 세포 내로 전달하는 연구들이 수행되고 있다(문헌[Guidotti et al.(2017)]).

한편, 30Kc19 단백질은 누에(Bombyx mori)의 혈림프에서 유래한 약 28kDa 크기의 단백질로서, 항-아폽토시스 활성, 단백질 안정화 또는 용해도 향상 기능 등을 갖고 있어 여러 연구에 적용되어 왔다. 대한민국 공개특허 10-2011-0003889는 세포 투과성 펩티드로서 30Kc19 단백질의 세포 투과성 펩티드 기능을 개시한다. 대한민국 등록특허 제10-1626343호는 30Kc19 단백질의 α-나선 도메인(30Kc19α)의 세포 투과성 기능을 개시한다.

대한민국 공개특허 10-2011-0003889 대한민국 등록특허 10-1626343

Zhu, Yuan Xiao, K. Martin Kortuem, and A. Keith Stewart. Leukemia & lymphoma 54.4 (2013): 683-687. Zhu, Yuan Xiao, et al. Blood cancer journal 9.2 (2019): 1-12. Franssen, Laurens E., et al. haematologica 103.8 (2018): e368. Ottis, Philipp, et al. ACS chemical biology 14.10 (2019): 2215-2223. Gandhi, Anita K., et al. British journal of haematology 164.2 (2014): 233-244. Chen, Yi-An, et al. Scientific reports 5 (2015): 10667. Guidotti, Giulia, Liliana Brambilla, and Daniela Rossi. Trends in pharmacological sciences 38.4 (2017): 406-424.

본 발명의 목적은 세포 투과성 펩티드 도메인에 연결된 세레블론(cereblon)을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 형질전환된 숙주 세포, 상기 숙주 세포를 이용한 재조합 융합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합 융합 단백질 단독 또는 세레블론 표적 약물과의 병용에 따른 세레블론 관련 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자는 30Kc19 단백질의 α-나선 도메인(30Kc19α)으로 이루어지는 세포 투과성 펩티드 및 상기 세포 투과성 펩티드 도메인에 연결된 세레블론(cereblon)을 포함하는 신규 재조합 융합 단백질을 제조하고, 상기 재조합 융합 단백질을 세레블론 표적 약물과 병용할 경우 세레블론 관련 질환에 대한 치료 효과가 현저히 우수해짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명은 30Kc19α 및 세레블론을 포함하는 재조합 융합 단백질, 이의 제조방법, 이를 이용한 세레블론 관련 질환 예방 또는 치료 용도 등을 제공한다.

세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질

일 측면에서, 본 발명은 30Kc19 단백질의 α-나선 도메인(30Kc19α)으로 이루어지는 세포 투과성 펩티드 도메인 및 상기 세포 투과성 펩티드 도메인에 연결된 세레블론(cereblon)을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공한다.

본 발명에서, 30Kc19 단백질의 α-나선 도메인(30Kc19α)은 누에(Bombyx mori)로부터 유래한 30Kc19 단백질에서 세포 투과성 기능을 갖는 α-나선 도메인을 지칭한다. 구체적으로, 30Kc19α은 총 239개의 아미노산으로 구성된 누에(Bombyx mori) 유래의 30KDa 리포단백질(lipoprotein) 패밀리의 구성원인 Chain A, 30k Protein 1(PDB: 4IY8_A)의 1 내지 88번 아미노산 서열로 구성된 도메인(서열번호 1)이다. 일 실시양태에서, 30Kc19α은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명에서, 세레블론(cereblon)은 CRBN 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 세레블론은 식물에서 인간에 이르기까지 고도로 보존된 서열을 가지며, 탈리도마이드에 결합하는 핵심 분자 표적임이 보고된 바 있다(문헌[ITo, 2010] 등). 일 실시양태에서, 세레블론은 총 424개의 아미노산으로 구성된 인간 세레블론 isoform 1(NCBI Reference Sequence: NP_057386.2; 서열번호 2)이다. 일 실시양태에서, 세레블론(cereblon)은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된다.

일 실시양태에서, 30Kc19α은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 세레블론은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 재조합 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된다.

일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인을 포함하는 세포 투과성 재조합 융합 단백질을 제공한다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인으로 구성된다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인의 카복시 말단에 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인이 연결된다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인의 아미노 말단에 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인이 연결된다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인의 카복시 말단과 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인의 아미노 말단이 서로 연결된다.

본 발명에서 상기 재조합 융합 단백질은 명시된 아미노산 서열구조 뿐 아니라 그와 동등한 생물학적 기능을 수행하는 단백질 변이체를 포함한다. 여기서 단백질 변이체는 기준이 되는 본 발명의 재조합 융합 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이 또는 변형이 있는 단백질을 의미하며, 예컨대 기존 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에서의 치환, 결실, 삽입 및/또는 화학적 변형에 의해 생산될 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 단백질 변이체는 기준이 되는 본 발명의 재조합 융합 단백질의 기능에 유의미한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함하며, 보존적 아미노산 치환의 다른 예시는 하기의 표에 나타난다.

[표 1]

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질 내 세포 투과성 펩티드 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질 변이체이다. 일 실시양태에서, 상기 세포 투과성 펩티드 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 보존적 아미노산 치환체이다.

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질 내 세레블론은 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질 변이체이다. 일 실시양태에서, 상기 세레블론은 서열번호 2의 아미노산 서열에 대한 보존적 아미노산 치환체이다.

일 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질 변이체이다. 일 실시양태에서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열에 대한 보존적 아미노산 치환체이다.

본 발명에서, 재조합 융합 단백질은 기원이 상이한 아미노산 서열들이 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 인-프레임 조합에 의해 하나의 폴리펩티드 사슬로 조합된 형태의 단백질을 지칭하며, 폴리펩티드 사슬 말단 중 하나에 융합되는 것은 물론, 상이한 기원의 서열이 폴리펩티드 사슬 내에 삽입되는 내부 융합을 포함한다. 상기 융합 단백질은 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 생산된 재조합 단백질일 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질은 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다.

세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 재조합 벡터

일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및/또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서, 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 재조합 융합 단백질을 발현하고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 통상의 기술자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 핵산은 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서, 재조합 벡터는 외래 핵산을 숙주 세포로 도입하고, 상기 숙주 세포를 형질전환하며, 도입된 핵산의 발현을 촉진할 수 있는 비히클로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용된다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 또는 인공 염색체 벡터이다. 상기 플라스미드 벡터는 외래 DNA를 용이하게 수용할 수 있고, 숙주 세포에 용이하게 도입될 수 있는 DNA 분자로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용된다. 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환 된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다. 상기 플라스미드 벡터의 비제한적인 예로 pKK 플라스미드(Clonetech), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(Novagen, Inc., Madison, WI), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, San Diego, CA), 또는 pMAL 플라스미드(New England Biolabs, Beverly, MA)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 벡터 또는 RNA 바이러스 벡터일 수 있고, 박테리오파지, 동물 바이러스 또는 식물 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스 벡터는 백시니아, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV), 렌티 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 핵산을 포함한다.

일 실시양태에서, 상기 재조합 벡터는 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 용어 “작동 가능하게 연결된”은 특정 핵산이 그 기능을 발휘할 수 있도록 다른 핵산에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 상기 프로모터에 의해 해당 유전자가 mRNA로 전사되어 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있음을 의미한다.

세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 제조용 숙주세포 및 제조방법

일 측면에서, 본 발명은 상술한 재조합 벡터가 형질전환된 숙주 세포 및/또는 이를 이용한 재조합 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 “형질전환”은 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 과정을 의미하며, 형질전환된 유전자는 숙주 세포 내에 발현될 수 있으면 숙주 세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한되지 않고 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 핵산으로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 어떠한 형태로 도입되는 것이든 제한되지 않고 사용될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환하는 방법은 본 발명의 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 본 발명이 속한 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 일시적 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질 감염(DEAE dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지된 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 대장균과 같은 원핵세포; 효모와 같은 진균류; 식물세포; 또는 곤충 세포 또는 식물세포와 같은 포유류 세포일 수 있고, 상기 세포로부터 유래된 세포주일 수 있다. 상기 세포주의 비제한적인 예로는 CHO, HeLa, COS7, COP5, HEK293, HEK293T, HepG2, CV1, BHK, TM4, VERO-76, MDCK, W138 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 재조합 단백질 생산을 위해 적합한 숙주 세포의 종류를 적절히 선택할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상술한 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 숙주 세포로부터 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 30Kc19α 및 세레블론을 포함하는 재조합 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

재조합 융합 단백질 생산에 적합한 숙주 세포 배양 방법, 단백질 발현 유도 방법 및 발현된 단백질 회수 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술자는 상술한 벡터 및 숙주 세포를 이용하여 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질을 효과적으로 발현시키는 방법을 적절히 선택할 수 있다.

세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질의 의약 용도 및 병용 투여

상술한 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질은 의약으로서 유용하게 활용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 30Kc19 단백질의 α-나선 도메인(30Kc19α)으로 이루어지는 세포 투과성 펩티드 도메인 및 상기 세포 투과성 펩티드 도메인에 연결된 세레블론(cereblon)을 포함하는 재조합 융합 단백질을 포함하는 세레블론 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

세레블론 관련 질환의 치료를 위해 세레블론 재조합 단백질 자체를 발현시키는 것은 세레블론 단백질의 반감기가 매우 짧아 불안정하므로 매우 불리한 방식으로 여겨져왔다. 본 발명자는, 위와 같은 당업계의 부정적 인식에도 불구하고 안정성이 낮은 세레블론에 특정 세포 투과성 펩티드를 결합한 재조합 융합 단백질을 도입함으로써, 기존 세레블론 단백질의 안정성 문제를 해결함과 동시에 정상적인 세레블론 활성을 세포 내로 도입하는 데에 성공하였다(도 2).

본 발명에서, 세레블론 관련 질환은 체내 세레블론의 기능 이상에 의해 발생하고/하거나 세레블론의 활성을 증진시킴으로써 예방, 완화, 개선 또는 치료될 수 있는 임의의 질환을 지칭한다. 세레블론의 기능 이상은 세레블론의 발현 감소 및/또는 세레블론 돌연변이 등에 의한 것일 수 있다.

본 발명에서, 세레블론 돌연변이는 유전 질환과 관련성이 보고된 세레블론 돌연변이를 포함한다. 예컨대, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 391번째 시스테인이 아르기닌으로 치환된 C391R 돌연변이가 상염색체 열성 비증후군 지적장애(Autosomal-recessive non-syndromic intellectual disability; ARNS-ID) 환자에서 유의미하게 보고된 바 있다(문헌[Sheereen et al. Journal of Medical Genetics 54.4 (2017): 236-240.] 등). 본 발명에서 세레블론 관련 질환은 상기 세레블론 돌연변이 관련 유전질환을 포함한다.

본 발명에서 세레블론 돌연변이는 임상적으로 확인된 세레블론 돌연변이 외에도, 세레블론 내 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 내지 삽입으로 인한 돌연변이로서, 세레블론 기능 이상을 야기하는 것이라면 제한되지 않고 포함된다.

상기 세레블론 관련 질환은 암, 자가면역질환 또는 염증성 질환일 수 있다.

본 발명에서, 암은 조절되지 않는 또는 이상조절된 세포 증식, 감소된 세포성 분화, 주위의 조직에 침입하는 부절적한 능력, 및/또는 이소성 부위에서 신규 성장을 확립하는 능력을 특징으로 하는 세포성 장애를 의미한다. 비제한적인 예로, 상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 나아가, 바람직하게 상기 암은 급성 골수 백혈병(AML); 만성적 골수성 백혈병(CML); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 만성적 림프구성 백혈병(CLL); 호지킨 질환(HD); 비-호지킨 림프종(NHL); B-세포 림프종; T-세포 림프종; 다발성 골수종(MM); 아밀로이드증; 발덴스트롬 거대글로불린혈증; 골수이형성 증후군(MDS); 작은 림프구 림프종(SLL); 변연부 림프종; 무증상 다발성 골수종; 및 골수증식성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 암은 바람직하게는 다발성 골수종이다. 본 발명의 실시예에서, 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질을 제조하고, 다발성골수종에서 항암제인 레날리도마이드와 병용 투여시 항암 효과를 현저히 개선함을 확인하였다(도 2).

상기 자가면역질환은 면역계의 자가 항원에 대한 부적절한 반응을 수반하는 질환을 지칭한다. 비제한적인 예로, 상기 자가면역질환은 이식편숙주질환(GvHD), 면역성 호중구감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성천포창, 낙엽성천포창, 수포성류천포창, 후천성표피수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP), 루프스 신염 및 막성 신병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 염증성 질환은 염증을 주요 병변으로 수반하는 질환을 말한다. 상기 염증성 질환은 예를 들어, 패혈증, 위염, 장염, 신장염, 간염, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease: COPD), 나성결절홍반, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 세균 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글란딘 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 세레블론 관련 질환은 세레블론 표적 약물에 대한 저항성을 가진다. 본 발명에서, 약물 저항성(drug resistance)이란 질병이 약물 또는 약물들의 치료에 기대보다 약하게 반응하거나 반응하지 않는 상태를 의미한다. 상기 약물 저항성은 질병이 약물 또는 약물들에 처음부터 반응성이 낮거나 없는 내재성일 수도 있고, 질병이 이전에는 반응하였던 약물 또는 약물들에 대하여 반응이 감소 또는 중단한 경우를 의미하는 후천성일 수도 있다.

본 발명에서, 세레블론 표적 약물은 세레블론 결합 활성을 갖는 의약 물질을 지칭한다. 구체적으로, 상기 세레블론 표적 약물은 면역조절성 약물(immunomodulatory imid drug; IMiD), 세레블론 표적 이기능성 화합물(또는 PROTAC), 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 면역조절성 약물은 이미드기를 함유하는 면역조절 기능성 화합물로서, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 포말리도마이드 등을 포함한다. 용어 면역조절 약물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 그 의미가 명확히 정의되어 있으며, 어떤 화합물이 면역조절 약물인지 여부에 대한 기준이 당업계에 공지되어 있다(국제특허공개 제WO2014/004990호, 제WO2015/085172호 등). 상기 면역조절성 약물은 구체적으로 레날리도마이드, 포말리도마이도, 탈리도마이도 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에서, 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질을 레날리도마이드 저항성 암에 처리할 경우, 암 생존율이 현저히 감소함을 확인하였다(도 2).

본 발명에서, 세레블론 표적 이기능성 화합물은 세레블론에 결합하는 모이어티와 임의의 질환 단백질을 표적으로 하는 모이어티로 구성된 이기능성 화합물을 지칭한다. 상기 이기능성 화합물은 당업계에서 PROTAC(proteolysis targeting chimera)으로 언급된다. 세레블론 표적 이기능성 화합물은 세레블론 결합능과 질환 단백질 결합능을 이용하여, 질환 단백질을 E3 유비퀴틴 라이게이즈인 세레블론 단백질에 근접시켜, 질환 단백질을 효과적으로 분해할 수 있음이 알려져 있다(국제특허공개 제WO2015/160845호, 제WO2018/144649호 등).

일 측면에서, 본 발명은 상술한 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질을 포함하는 제1 약학 조성물; 및 세레블론 표적 약물을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 세레블론 관련 질환의 예방 또는 치료용 조합물을 제공한다.

세레블론 표적 약물 및 세레블론 관련 질환에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

상기 조성물에서, 제1 약학 조성물 및 제2 약학 조성물은 동시 또는 이시에 투여된다.

일 측면에서, 본 발명은 상술한 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질을 포함하는 세레블론 표적 약물 보조용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 “약물 보조용”은 단독으로 투여할 때에는 의약적 효과가 상대적으로 낮지만, 세레블론 표적 약물과 병용투여될 경우 상기 세레블론 표적 약물의 효능을 현저히 개선하는 용도를 의미한다.

본 발명의 실시예에서, 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질은 다발성 골수종 세포에 대한 면역조절성 약물의 치료 효능을 현저히 강화시켰음을 확인하였다(도 2). 따라서, 본 발명의 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질은 세레블론 표적 약물 보조제로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상술한 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질의 약학적으로 허용가능한 염, 담체, 부형제, 희석제, 가용화제 등을 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용가능한 염은 제약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 리튬, 구리, 망간, 아연, 철 등을 비롯한 무기이온의 염과 염산, 인산, 황산과 같은 무기산의 염이 있으며, 그 외에 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 글리콜산, 숙신산, 프로피온산, 아세트산, 오로테이트산, 아세틸살리실산과 같은 유기산의 염 등과 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염이 있다. 또한 약학적인 반응, 정제 및 분리과정에서 사용될 수 있는 테트라메틸 암모늄, 테트라에틸 암모늄, 테트라프로필 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 벤질 트리메틸 암모늄, 벤제토늄 등의 유기이온의 염이 있다. 다만, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있고, 가용화제로는 폴록사머 및 라브라솔 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시킬 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 경구 투여용 제형으로 제조할 경우, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할수 있다.

상기 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 치료적 유효량은 단독투여시 또는 다른 약물과 병용시 효과적인 의약적 효과를 발휘하는 약물 투여량을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 병용투여되는 항암제의 종류와 양, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

일 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량으로 상술한 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 세레블론 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 세레블론 관련 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서 상술한 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질의 용도를 제공한다.

본 발명의 약학 조성물, 조합물, 치료방법 및 용도에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.

본 발명에 따른 신규 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질은 세레블론 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질의 생산 결과를 나타내는 사진이고,
도 2는 레날리도마이드 저항성 다발성 골수종 세포에서 본 발명에 따른 세포 투과성 세레블론 재조합 융합 단백질 처리 후 세포 생존율을 보여주는 그래프이다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시예는 발명의 이해를 쉽게하기 위해 제공되는 것일뿐 발명의 보호범위가 이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실험 재료 및 방법>

1. 플라스미드의 제작

재조합 단백질 생산을 위한 플라스미드로 E.coli에서 발현 및 His tag 단백질 정제에 유리한 pET-23a 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)를 구입하여 사용하였다. 30Kcα-CRBN 유전자 일체를 Geneart社에 합성 의뢰하였다. 합성 진행시 E.coli strain에 맞게 코돈 최적화를 수행하였다.

pET-23a 벡터의 MCS(multiple cloning site) 내 BamHI/XhoI 제한효소 사이트를 이용하여 30Kcα-CRBN 유전자 서열(서열번호 4)를 삽입하였다.

구체적으로, 먼저 각각의 벡터 및 인서트를 EcoRI/XhoI 효소(NEB^TM) 및 Custom buffer를 첨가하고 37℃ 열 블록에서 18 시간 배양하였다. 그 다음, 아가로오스 겔에서 인서트 및 벡터를 전기영동한 뒤, 겔에서 각각의 인서트와 벡터를 AccuPrep®PCR/Gel DNA Purification Kit(바이오니아社)를 이용하여 추출하였다. 추출한 인서트 및 벡터를 3:1의 비율로 혼합한 후 T4 리가아제(NEB cat.no. M0202M)를 넣고 18 시간 동안 배양하였다. 생성된 플라스미드를 DH5α competent cell(RBC社 cat.no. RH617-J80)에 형질전환시킨 후, 암피실린 내성 콜로니만을 골라 2 ml LB broth media(0.1% 암피실린)에서 12 시간 동안 배양하였다. AccuPrep®Nano-Plus Plasmid Extraction Kit을 이용하여 세포 펠렛에서 플라스미드를 추출하고 최종 염기서열을 확인하였다.

2. 재조합 단백질의 생산 및 정제

상술한 과정에 따라 추출한 플라스미드를 BL21 세포에 형질전환하고 LB broth medium에 넣고 shaker incubator에서 배양하였다. IPTG 1mM를 처리한 후 4 시간 동안 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 세포 용해물을 얻고 초음파분쇄기를 이용하여 용해시켰다. 그 다음, FPLC(GE Healthcare社)를 이용하여 단백질을 정제하고, 투석한 후 보관하였다. 정제용 버퍼로 Lysis buffer(20 mMTris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0), Washing buffer(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 50 mM imidazole, pH 8.0), Elution buffer(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 350 mM imidazole, pH 8.0), Dialysis buffer(20 mMTris-HCl buffer (pH 8.0))를 사용하였다.

정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔(Bio-Rad社 Cat no. 456-1086)에 로딩 후 전기영동을 진행하고, 이 겔을 staining buffer(Invitrogen社 Cat no. LC6060)를 이용하여 염색 후 수득한 단백질(N'-30Kcα-CRBN-C'의 구조를 갖는 융합 재조합 단백질)을 최종 확인하였다(도 1).

<실험예>

실험예 1. 면역세포화학을 이용한 세포 투과성 펩티드 이량체의 세포 투과능 확인

MM1.S 세포주(ATCC社,USA)를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 인큐베이션하였다. 상기 세포주 배양액에 레날리도마이드(Sigma-Aldrich, Cat No. D2438) 10 mL를 초기 5μM에서 200μM까지 점진적으로 첨가하여 레날리도마이드 저항성 MM1.S 세포주를 확립하였다.

30Kcα-CRBN 재조합 융합 단백질에 의한 세포독성 영향을 평가하기 위해, 96 웰 플레이트의 각 웰마다 MM1.S 레날리도마이드 저항성 세포를 1×10⁴ 개 시딩하였다. 실험군에 맞게 각 웰에 레날리도마이드 200 μM 및/또는 30Kcα-CRBN 재조합 융합 단백질 3μM을 첨가하였다. 각 웰의 총 배지 부피를 100 μ로 맞추었다. 그 다음, 각 배지를 42 시간 배양하고 각 웰에 EZ-Cytox(Dogen社 Cat.No. EZ-3000) 10 μl을 첨가한 후 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 마이크로플레이트 리더기(BMGlabtech社 Clarostar^TM)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 이를 세포 생존율(%)로 계산하여 도 2에 나타내었다.

30Kcα-CRBN 재조합 융합 단백질을 처리하지 않은 경우, 레날리도마이드 단독 처리시 MM1.S 세포주의 생존율을 감소시키지 못하여, 상기 세포주에서 레날리도마이드에 대한 저항성이 획득되었음을 확인하였다(도 2의 A). 반면, 30Kcα-CRBN 재조합 융합 단백질과 레날리도마이드를 병용 처리하였을 경우, 레날리도마이드 저항성 세포주의 생존율이 대조군 대비 무려 50% 가까이 감소됨을 확인하였다(도 2의 B).

즉, 상기 실시예는 본 발명에 따른 30Kcα-CRBN 재조합 융합 단백질이 항암제 저항성 암과 같이 기존 항암 치료에 한계를 극복한 대안적인 항암 요법에 유용하게 활용될 수 있음을 보여준다.

<110> UPPTHERA <120> Cell-penetrating cereblon recombinant fusion protein and use thereof <130> P20014-UPTR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 30Kc alpha <400> 1 Ala Asp Ser Asp Val Pro Asn Asp Ile Leu Glu Glu Gln Leu Tyr Asn 1 5 10 15 Ser Val Val Val Ala Asp Tyr Asp Ser Ala Val Glu Lys Ser Lys His 20 25 30 Leu Tyr Glu Glu Lys Lys Ser Glu Val Ile Thr Asn Val Val Asn Lys 35 40 45 Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys Met Glu Tyr Ala Tyr Gln Leu 50 55 60 Trp Leu Gln Gly Ser Lys Asp Ile Val Arg Asp Cys Phe Pro Val Glu 65 70 75 80 Phe Arg Leu Ile Phe Ala Glu Asn 85 <210> 2 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Glu Gly Asp Gln Gln Asp Ala Ala His Asn Met Gly Asn 1 5 10 15 His Leu Pro Leu Leu Pro Ala Glu Ser Glu Glu Glu Asp Glu Met Glu 20 25 30 Val Glu Asp Gln Asp Ser Lys Glu Ala Lys Lys Pro Asn Ile Ile Asn 35 40 45 Phe Asp Thr Ser Leu Pro Thr Ser His Thr Tyr Leu Gly Ala Asp Met 50 55 60 Glu Glu Phe His Gly Arg Thr Leu His Asp Asp Asp Ser Cys Gln Val 65 70 75 80 Ile Pro Val Leu Pro Gln Val Met Met Ile Leu Ile Pro Gly Gln Thr 85 90 95 Leu Pro Leu Gln Leu Phe His Pro Gln Glu Val Ser Met Val Arg Asn 100 105 110 Leu Ile Gln Lys Asp Arg Thr Phe Ala Val Leu Ala Tyr Ser Asn Val 115 120 125 Gln Glu Arg Glu Ala Gln Phe Gly Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr 130 135 140 Arg Glu Glu Gln Asp Phe Gly Ile Glu Ile Val Lys Val Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Phe Lys Val Leu Glu Leu Arg Thr Gln Ser Asp Gly 165 170 175 Ile Gln Gln Ala Lys Val Gln Ile Leu Pro Glu Cys Val Leu Pro Ser 180 185 190 Thr Met Ser Ala Val Gln Leu Glu Ser Leu Asn Lys Cys Gln Ile Phe 195 200 205 Pro Ser Lys Pro Val Ser Arg Glu Asp Gln Cys Ser Tyr Lys Trp Trp 210 215 220 Gln Lys Tyr Gln Lys Arg Lys Phe His Cys Ala Asn Leu Thr Ser Trp 225 230 235 240 Pro Arg Trp Leu Tyr Ser Leu Tyr Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Arg 245 250 255 Ile Lys Lys Gln Leu Arg Glu Trp Asp Glu Asn Leu Lys Asp Asp Ser 260 265 270 Leu Pro Ser Asn Pro Ile Asp Phe Ser Tyr Arg Val Ala Ala Cys Leu 275 280 285 Pro Ile Asp Asp Val Leu Arg Ile Gln Leu Leu Lys Ile Gly Ser Ala 290 295 300 Ile Gln Arg Leu Arg Cys Glu Leu Asp Ile Met Asn Lys Cys Thr Ser 305 310 315 320 Leu Cys Cys Lys Gln Cys Gln Glu Thr Glu Ile Thr Thr Lys Asn Glu 325 330 335 Ile Phe Ser Leu Ser Leu Cys Gly Pro Met Ala Ala Tyr Val Asn Pro 340 345 350 His Gly Tyr Val His Glu Thr Leu Thr Val Tyr Lys Ala Cys Asn Leu 355 360 365 Asn Leu Ile Gly Arg Pro Ser Thr Glu His Ser Trp Phe Pro Gly Tyr 370 375 380 Ala Trp Thr Val Ala Gln Cys Lys Ile Cys Ala Ser His Ile Gly Trp 385 390 395 400 Lys Phe Thr Ala Thr Lys Lys Asp Met Ser Pro Gln Lys Phe Trp Gly 405 410 415 Leu Thr Arg Ser Ala Leu Leu Pro Thr Ile Pro Asp Thr Glu Asp Glu 420 425 430 Ile Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Cys Leu 435 440 <210> 3 <211> 530 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 30Kc alpha-CRBN <400> 3 Ala Asp Ser Asp Val Pro Asn Asp Ile Leu Glu Glu Gln Leu Tyr Asn 1 5 10 15 Ser Val Val Val Ala Asp Tyr Asp Ser Ala Val Glu Lys Ser Lys His 20 25 30 Leu Tyr Glu Glu Lys Lys Ser Glu Val Ile Thr Asn Val Val Asn Lys 35 40 45 Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys Met Glu Tyr Ala Tyr Gln Leu 50 55 60 Trp Leu Gln Gly Ser Lys Asp Ile Val Arg Asp Cys Phe Pro Val Glu 65 70 75 80 Phe Arg Leu Ile Phe Ala Glu Asn Met Ala Gly Glu Gly Asp Gln Gln 85 90 95 Asp Ala Ala His Asn Met Gly Asn His Leu Pro Leu Leu Pro Ala Glu 100 105 110 Ser Glu Glu Glu Asp Glu Met Glu Val Glu Asp Gln Asp Ser Lys Glu 115 120 125 Ala Lys Lys Pro Asn Ile Ile Asn Phe Asp Thr Ser Leu Pro Thr Ser 130 135 140 His Thr Tyr Leu Gly Ala Asp Met Glu Glu Phe His Gly Arg Thr Leu 145 150 155 160 His Asp Asp Asp Ser Cys Gln Val Ile Pro Val Leu Pro Gln Val Met 165 170 175 Met Ile Leu Ile Pro Gly Gln Thr Leu Pro Leu Gln Leu Phe His Pro 180 185 190 Gln Glu Val Ser Met Val Arg Asn Leu Ile Gln Lys Asp Arg Thr Phe 195 200 205 Ala Val Leu Ala Tyr Ser Asn Val Gln Glu Arg Glu Ala Gln Phe Gly 210 215 220 Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Arg Glu Glu Gln Asp Phe Gly Ile 225 230 235 240 Glu Ile Val Lys Val Lys Ala Ile Gly Arg Gln Arg Phe Lys Val Leu 245 250 255 Glu Leu Arg Thr Gln Ser Asp Gly Ile Gln Gln Ala Lys Val Gln Ile 260 265 270 Leu Pro Glu Cys Val Leu Pro Ser Thr Met Ser Ala Val Gln Leu Glu 275 280 285 Ser Leu Asn Lys Cys Gln Ile Phe Pro Ser Lys Pro Val Ser Arg Glu 290 295 300 Asp Gln Cys Ser Tyr Lys Trp Trp Gln Lys Tyr Gln Lys Arg Lys Phe 305 310 315 320 His Cys Ala Asn Leu Thr Ser Trp Pro Arg Trp Leu Tyr Ser Leu Tyr 325 330 335 Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Arg Ile Lys Lys Gln Leu Arg Glu Trp 340 345 350 Asp Glu Asn Leu Lys Asp Asp Ser Leu Pro Ser Asn Pro Ile Asp Phe 355 360 365 Ser Tyr Arg Val Ala Ala Cys Leu Pro Ile Asp Asp Val Leu Arg Ile 370 375 380 Gln Leu Leu Lys Ile Gly Ser Ala Ile Gln Arg Leu Arg Cys Glu Leu 385 390 395 400 Asp Ile Met Asn Lys Cys Thr Ser Leu Cys Cys Lys Gln Cys Gln Glu 405 410 415 Thr Glu Ile Thr Thr Lys Asn Glu Ile Phe Ser Leu Ser Leu Cys Gly 420 425 430 Pro Met Ala Ala Tyr Val Asn Pro His Gly Tyr Val His Glu Thr Leu 435 440 445 Thr Val Tyr Lys Ala Cys Asn Leu Asn Leu Ile Gly Arg Pro Ser Thr 450 455 460 Glu His Ser Trp Phe Pro Gly Tyr Ala Trp Thr Val Ala Gln Cys Lys 465 470 475 480 Ile Cys Ala Ser His Ile Gly Trp Lys Phe Thr Ala Thr Lys Lys Asp 485 490 495 Met Ser Pro Gln Lys Phe Trp Gly Leu Thr Arg Ser Ala Leu Leu Pro 500 505 510 Thr Ile Pro Asp Thr Glu Asp Glu Ile Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu 515 520 525 Cys Leu 530 <210> 4 <211> 1605 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30Kc alpha-CRBN <400> 4 ggatccgcag attccgacgt ccctaacgac attctggagg agcagcttta caatagcgtc 60 gtcgtcgccg attacgacag tgcggttgaa aagagcaagc atttatacga ggagaagaag 120 agcgaagtca tcacaaatgt cgtgaacaaa ctgatacgaa acaacaagat gaactgcatg 180 gagtacgcct atcaactttg gctccagggc tccaaggaca tcgtccggga ttgtttccca 240 gttgagttca gacttatctt cgccgaaaac atggccggcg aaggagatca gcaggacgct 300 gcgcacaaca tgggcaacca cctgccgctc ctgcctgcag agagtgagga agaagatgaa 360 atggaagttg aagaccagga tagtaaagaa gccaaaaaac caaacatcat aaattttgac 420 accagtctgc cgacatcaca tacataccta ggtgctgata tggaagaatt tcatggcagg 480 actttgcacg atgacgacag ctgtcaggtg attccagttc ttccacaagt gatgatgatc 540 ctgattcccg gacagacatt acctcttcag ctttttcacc ctcaagaagt cagtatggtg 600 cggaatttaa ttcagaaaga tagaaccttt gctgttcttg catacagcaa tgtacaggaa 660 agggaagcac agtttggaac aacagcagag atatatgcct atcgagaaga acaggatttt 720 ggaattgaga tagtgaaagt gaaagcaatt ggaagacaaa ggttcaaagt ccttgagcta 780 agaacacagt cagatggaat ccagcaagct aaagtgcaaa ttcttcccga atgtgtgttg 840 ccttcaacca tgtctgcagt tcaattagaa tccctcaata agtgccagat atttccttca 900 aaacctgtct caagagaaga ccaatgttca tataaatggt ggcagaaata ccagaagaga 960 aagtttcatt gtgcaaatct aacttcatgg cctcgctggc tgtattcctt atatgatgct 1020 gagaccttaa tggacagaat caagaaacag ctacgtgaat gggatgaaaa tctaaaagat 1080 gattctcttc cttcaaatcc aatagatttt tcttacagag tagctgcttg tcttcctatt 1140 gatgatgtat tgagaattca gctccttaaa attggcagtg ctatccagcg acttcgctgt 1200 gaattagaca ttatgaataa atgtacttcc ctttgctgta aacaatgtca agaaacagaa 1260 ataacaacca aaaatgaaat attcagttta tccttatgtg ggccgatggc agcttatgtg 1320 aatcctcatg gatatgtgca tgagacactt actgtgtata aggcttgcaa cttgaatctg 1380 ataggccggc cttctacaga acacagctgg tttcctgggt atgcctggac tgttgcccag 1440 tgtaagatct gtgcaagcca tattggatgg aagtttacgg ccaccaaaaa agacatgtca 1500 cctcaaaaat tttggggctt aacgcgatct gctctgttgc ccacgatccc agacactgaa 1560 gatgaaataa gtccagacaa agtaatactt tgcttgtaac tcgag 1605

Claims (16)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인을 포함하는 세포 투과성 재조합 융합 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, 세레블론 표적 약물과 병용 투여되는 세포 투과성 재조합 융합 단백질.
3. 제 2 항에 있어서, 세레블론 표적 약물은 면역조절성 약물(IMiD), 세레블론 표적 모이어티를 갖는 PROTAC(proteolysis targeting chimera) 화합물 또는 이들의 조합인 세포 투과성 재조합 융합 단백질.
4. 제 3 항에 있어서, 면역조절성 약물(IMiD) 또는 세레블론 표적 모이어티를 갖는 PROTAC 화합물에 대한 치료 저항성을 개선하는 것인 세포 투과성 재조합 융합 단백질.
5. 제 1 항에 따른 재조합 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
6. 제 5 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
7. 제 6 항에 따른 재조합 벡터가 형질전환된 숙주 세포.
8. 제 7 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 숙주 세포로부터 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩티드 도메인을 포함하는 세포 투과성 재조합 융합 단백질의 제조 방법.
9. 제 1 항에 따른 재조합 융합 단백질을 포함하는 면역조절성 약물(IMiD) 저항성 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 제 9 항에 있어서, 면역조절성 약물은 레날리도마이드, 포말리도마이드, 탈리도마이드 또는 이들의 조합인 약학 조성물.
11. 제 9 항에 따른 제1 약학 조성물; 및 면역조절성 약물(IMiD)을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조합물.
12. 제 11 항에 있어서, 제1 약학 조성물 및 제2 약학 조성물은 동시 또는 이시에 투여되는 것인 조합물.
13. 제 1 항에 따른 재조합 융합 단백질을 포함하는 면역조절성 약물(IMiD) 보조용 약학 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, 면역조절성 약물(IMiD)의 효능을 증진시키는 것인 약학 조성물.
15. 삭제
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