KR20140111178A - 세포 투과 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 누에 체액 단백질로부터 유래한 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 누에 체액 30K 단백질 에서 유래한 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide) 또는 이를 포함하는 복합체에 관한 것이다.

Description

세포 투과 펩타이드{cell-penetrating peptide}
본 발명은 세포 투과 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 누에 체액 30K 단백질로부터 유래한 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide) 또는 이를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
약물 전달에 있어서 치료 분자(therapeutic molecule)의 세포내 전달(intracellular delivery)은 매우 중요하다. 세포질, 핵, 리소솜 및 미토콘드리아와 같은 세포내 소기관내에서 약물이 치료 효과를 발휘하기 위해서는 이들이 세포막을 통과하여야 한다. 그러나, 단백질이나 핵산과 같은 거대한 친수성 치료 시약은 세포내에 들어갈 수가 없다.
이와 같은 문제를 해결하기 위한 대안중에 하나가 세포질막을 통과 할 수 있는 펩타이드 서열을 이용하는 “펩타이드 기반 전달시스템(peptide-based delivery system)”이다. 이 시스템은 1988년에 세포막을 통과 할 수 있는 HIV (Human Immunodeficiency Virus)의 TAT (TransActivator of Transcription) 부분으로부터 발견되었다. 그 이후로 1994년에 세포막을 통과 할 수 있는 Antennapediahomeodomain, pAnt의 세번째 helix로부터도 발견된 바 있다. 그 이후로 몇몇 펩타이드들이 세포내로 들어간다는 사실이 밝혀지고 이들 펩타이드를 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP)라고 부르게 되었다.
이러한 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP)의 공통적인 특징은 아르기닌 또는 리신과 같은 염기성 서열을 다량 포함하고, 높은 양전하를 띄는 8-16개의 아미노산으로 이루어진 PTD(protein transduction domain)라는 특정 서열을 가진다는 점이다.
세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP)의 세포 투과 과정은 현재까지 논의 중이나, 특정 수용체와 관련이 없고, endocytic pathway와 무관하므로 4℃에서도 세포내로 투과가 되는, 특별히 에너지가 필요하지 않는 과정이라고 알려져 있다.
세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP)를 이용한 세포내 전달은 양이온성 지질 또는 polyethyleneimine (PEI)를 이용한 시스템 보다 펩타이드 서열의 변형이 가능하므로 여러 부위의 세포내 sub domain에 운반이 가능하고, cargo(세포내 운반하고자 하는 물질)의 여러가지 형태를 운반 할 수 있다는 여러가지 장점을 가지고 있다.
누에 체액은 베큘로바이러스 발현 시스템에서 배지에 첨가되면 숙주 세포의 아포토시스(apoptosis)를 억제하여, 숙주 세포의 생존률을 증가 시킨다. 본 연구자들은 누에 체액이 곤충 세포뿐만 아니라, 포유 동물이나 인간 세포에서도 바이러스나 각종 화학 물질들에 의해 유도되는 아포토시스(apoptosis)를 억제하고, 세포의 생장과 생산성을 증대시키는 것을 확인 하였다.
누에 체액 내에 특별히 아포토시스를 억제하는 효과를 가지는 물질은 약 30kDa의 단백질 군인 30K 단백질이다. 30K 단백질은 구조적으로 유사성을 가지는 일련의 단백질 군으로 분자량 뿐만 아니라 아미노산의 서열이 유사한 5개의 하위 단백질로 구성되어 있다.
본 연구자들은 또한, 30Kc19는 30K 단백질 내에서 가장 많은 부분을 차지하는 하위 단백질로 30Kc19 또한 곤충세포나 포유동물 세포의 아포토시스를 억제하고, EPO(erythropoietin)를 생산하는 CHO cell 시스템에 적용하였을 때 EPO의 생산량을 증대시키는 것뿐 아니라, 시아릴전달효소(sialyltransferase)의 활성을 증대시켜, 당단백질의 시알산의 함량을 높여 양질의 유용한 단백질을 생산하도록 하는 것을 확인하였다.
일반적으로 동물세포는 지질이중층(lipid bilayer)이라는 소수성을 띄는 세포막을 가지고 있어, 펩타이드, 단백질, 뉴클레오타이드, 리포좀 등이 세포막을 투과해 세포내로 이동하는 것이 거의 불가능하다. 하지만 본 발명자들의 연구 결과 흥미롭게도 30Kc19 는 동물세포이면서도 세포막을 투과하여 세포 내부로 이동하는 특성을 가지는 것을 알아내었다. 또한, 세포 내부에 위치하여 세포 내 효소의 활성이 저하되는 것을 억제시켜 주고, 미토콘드리아의 활성을 높여 ATP의 생산량을 증대시켜 주는 것을 확인한 바 있다.
본 발명은 누에 체액 단백질인 30K 단백질이 세포 내부로 이동하는 특성을 가지는 것을 알아내고, 이러한 누에 체액 단백질로부터 새로운 구조의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 다음과 같은 일반식으로 나타내어지는 연속적인 아미노산을 포함하는 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)를 제공한다.
B1-B2- ... -Bn -1-Bn (n≥13)
상기 일반식에서, B1은 Val 이고, B13은 Cys 이며, B1과 B13을 제외한 아미노산은 서로 독립적으로 Ala, Asx, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Glx으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음 표 1에서와 같이 약어로 기재하였다.
이름 약자 기호
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파르트산 Asp D
시스테인 Cys C
글루탐산 Glu E
글루타민 Gln Q
글라이신 Gly G
히스티딘 His H
이소루신 Ile I
루신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 n 은 13인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 B2 는 Val 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 B3, B8, B9, 및 B12 는 모두 동일한 펩타이드 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 B4, B7, 및 B10는 염기성 (basic) 아미노산인 것을 특징으로 한다. 상기 염기성 아미노산으로서 모든 염기성 아미노산이 가능하며, 특히, 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 또는 히스티딘(His) 등이 바람직하다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 B1, B2, B5, B6, 및 B11는 소수성 (hydrophobic) 아미노산인 것을 특징으로 한다. 상기 소수성 아미노산으로서 모든 소수성 아미노산이 가능하며, 특히, 알라닌(Ala), 발린(Val), 루신(Leu), 또는 이소루신(Ile) 등이 바람직하다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 펩타이드는 10~20%의 아미노산이 양이온성인 것을 특징으로 한다. 세포외막이 음전하를 많이 띠고 있기 때문에 펩타이드가 세포막에 쉽게 접착할 수 있도록 하기 위해 세포투과 펩타이드 아미노산의 10 내지 20% 가 양이온성 아미노산인 것이 바람직하다.
상기 양이온성 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘 및 오르니틴 중에서 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 바람직하게는 B6와 B7이 양이온성 아미노산인 것이 바람직하며, 상기 B6은 소수성 아미노산인 이소루신이고, 상기 B7은 염기성 아미노산인 아르기닌인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 펩타이드는 나선-고리-나선 구조 모티브(Helix-Loop-Helix motif)를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)는 누에 체액 단백질로부터 유래하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)는 서열 번호 1 내지 4를 포함하는 것을 특징으로 한다.
서열 번호 1 - VVNKLIRNNKMNC
서열 번호 2 - NVVNKLIRNNKMNC
서열 번호 3 - TNVVNKLIRNNKMNC
서열 번호 4 - ITNVVNKLIRNNKMNC
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 펩타이드의 말단에는 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 추가적으로 결합되는 것이 가능하다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 카고(cargo) 분자가 펩타이드에 공유 결합 또는 비-공유결합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 있어서, 상기 운반 대상 카고(cargo)는 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질 및 소분자 그리고 이들 중 임의의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 누에 체액 단백질로부터 유래한 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)는 세포 막을 투과하는 성질을 가지고 있어서, 결합된 외래 물질(cargo 분자)을 세포 내로 효과적으로 이동시켜, 세포내부로 물질전달을 위한 도구로 사용될 수 있다.
도 1은 Insilicogen 社의 CLC protein workbench 프로그램을 이용하여 30Kc19의 단백질의 2차 구조를 예측하여 분석한 결과 이다.
도 2는 Pasteur 연구소에서 제공하는 software를 사용하여 30Kc19의 단백질의 표면전하를 예측한 결과이다.
도 3은 insilicogen 社의 CLC protein workbench 프로그램을 이용하여 30Kc19의 단백질의 소수성(hydrophobicity)을 예측한 결과이다.
도 4는 Cornell University CBSU (Computational Biology Service Unit) 연구소의 LOOPP (Learning, Observing and Outputting Protein Patterns) 프로그램을 이용하여 30Kc19의 단백질의 용매 접근성 (solvent accessibility)을 예측한 결과이다.
도 5는 분광형광계(spectrofluorometer)를 이용하여 본 발명의 실시예에 따른 FITC-펩타이드의 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6 내지 도 11은 공초점현미경(confocal microscope)를 이용하여 관찰한 본 발명의 실시예에 따른 펩타이드의 세포 투과 반응 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 FITC-펩타이드를 사이토칼라신 B와 수크로스로 처리하기 전후의 세포내 투과 정도를 측정하기 위해 분광형광계(spectrofluorometer)를 이용하여 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 GFP가 부착된 30Kc19와 30Kc19 CPP의 세포 침투 양상을 형광 현미경(fluorescence microscope)과 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 세포 내의 형광을 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 HeLa 세포에 상기 (GFP-실시예 12의 펩타이드) 및 비교예의 단백질을 4시간 동안 처리한 후, 형광 현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 세포 내의 형광을 확인한 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 누에 체액 단백질로부터 세포투과 펩타이드 디자인
서열이 알려진 누에 체액 단백질인 30Kc19 로부터 CPP 특성을 나타내는 펩타이드 부분을 분리하기 위해 일반적으로 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)에 대해 요구되는 아래의 특성을 만족하는 부분을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 예측하였다.
i)나선 고리 나선 구조 모티브 (Helix-Loop-Helix motif)
ii)양전하 표면 (positive surface charge)
iii)소수성(hydrophobic)
iv)용매 접근성 (solvent accessibility)
상기 i) 내지 iv)에 대한 컴퓨터 프로그램 예측 결과를 각각 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 상기 i) 내지 iv)의 특징을 모두 가지는 17가지 부분의 펩타이드를 아래 표 2에서와 같이 디자인하였다.
FITC-30Kc19펩타이드
실시예1 FITC-VITNVVNKLIRNNKM
실시예2 FITC-ITNVVNKLIRNNKM
실시예3 FITC-TNVVNKLIRNNKM
실시예4 FITC-NVVNKLIRNNKM
실시예5 FITC-VVNKLIRNNKM
실시예6 FITC-VITNVVNKLIRNNKMN
실시예7 FITC-ITNVVNKLIRNNKMN
실시예8 FITC-TNVVNKLIRNNKMN
실시예9 FITC-NVVNKLIRNNKMN
실시예10 FITC-VVNKLIRNNKMN
실시예11 FITC-VITNVVNKLIRNNKMNC
실시예12 FITC-ITNVVNKLIRNNKMNC
실시예13 FITC-TNVVNKLIRNNKMNC
실시예14 FITC-NVVNKLIRNNKMNC
실시예15 FITC-VVNKLIRNNKMNC
실시예16 FITC-VNKLIRNNKMNC
실시예17 FITC-NKLIRNNKMNC
< 실험예 1> 형광분광계( spectrofluorometer )를 이용한 펩타이드의 세포 내 투과 정도 측정
상기 실시예에서 디자인된 17개의 펩타이드들의 세포 내로의 투과 실험에는 세포주(cell line) 로는 HEK 239 혹은 HeLa가 사용되었다.
HEK 293과 HeLa는 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 사용하여 37℃, 5% CO2 가 포함된 인큐베이터에서 배양한 후, 상기 표 1의 펩타이드들이 200 mM 농도로 포함된 배양 배지를 제조하고, 상기 세포들을 37℃ 조건으로 배양하였다.
상기 실시예에서 디자인된 17개의 펩타이드들의 HEK 239 세포내로의 투과 정도를 형광분광계(spectrofluorometer)를 이용하여 측정하고 그 결과를 도 5 에 나타내었다. 도 5에서 실시예 1,2, 6, 7, 14 및 15의 펩타이드의 경우 세포내 투과성이 우수하게 측정되었다.
< 실험예 2> 공초점현미경(confocal microscopy)를 이용한 펩타이드의 세포 내 투과 정도 측정
실시예 1 내지 17의 17개의 FITC-펩타이드 중에서 상기 실험예 1의 형광분광계 (spectrofluorometer)를 이용한 FITC-펩타이드의 세포 내 투과 정도가 높게 측정된 6개 실시예(실시예 1,2, 6, 7, 14, 15)의 FITC-펩타이드를 선택하였다.
이와 같이 선택된 6개의 실시예의 FITC-펩타이드에 대해서 공초점 현미경을 이용하여 세포 내부로의 투과 정도를 세포 내부에서의 형광 정도로 측정하였다.
HeLa 세포에 10 mM의 농도로 상기 FITC-펩타이드를 첨가하고 일정 시간 배양한 뒤, PBS로 3회 세척하였다. 상기 세척된 세포의 핵을 염색하기 위한 Hoechst 33342 를 10분간 처리한 후 공초점현미경(Nikon사, 일본)을 이용해 세포를 관찰하고, 그 결과를 도 6 내지 도 11에 나타내었다. 도 6 내지 도 11에서 보는 바와 같이 실시예 1,2, 6, 7 에서는 세포 투과 반응이 나타나지 않고, 펩타이드가 세포 외부에 뭉쳐있는 것이 관찰되었으나, 실시예 14, 15에서는 세포 투과 반응을 나타내어 세포 내부에서도 형광물질이 검출되었다.
< 실험예 3> 펩타이드의 세포 내 투과 메커니즘 측정
상기 실험예 2에서 투과율이 높게 측정된 상기 실시예 14, 15의 펩타이드의 세포 내 투과 메커니즘을 알아보기 위해 사이토칼라신 B와 수크로스로 처리하기 전후의 세포내 투과 정도를 형광분광계 현미경을 이용하여 측정하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 실시예 14, 15의 펩타이드는 사이토칼라신 B와 수크로스로 처리한 경우 세포내 투과 정도가 감소하지만 여전히 세포내 투과가 일어나며, microfilament 의 붕괴 및 macropinocytosis가 관찰되는 것으로 보아 실시예 14, 15의 펩타이드의 세포 침투에 관여를 하는 것 같아 보이고, 또한 clathrin 매개엔도시토시스가 실시예 14, 15의 펩타이드의 세포 침투에 관여하는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 4> GFP -30 Kc19 CPP 융합 단백질의 생산 및 세포 투과 효과 분석
일반적으로 세포 내부로 전달되지 못하는 거대 물질인 카고를 결합시켜 본 발명의 펩타이드가 외부 거대 물질을 세포 내로 전달시킬 수 있는지 분석하였다.
본 실험예에서는 카고인 외래 단백질로서 형광을 띠는 GFP를 선정하고, 펩타이드로는 상기 실험예 3에서 세포 침투 효과를 나타낸 실시예 14의 펩타이드의 말단에 아미노산이 추가로 결합되어 있는 실시예 12의 펩타이드를 이용하여 외래 단백질로서 형광을 띠는 GFP와 펩타이드가 결합된 (GFP-실시예 12의 펩타이드)를 다음과 같이 제조하였다.
상기 실시예 12의 펩타이드의 유전자를 pET23a 벡터(Novagen사)에 EcoR I과 XhoI 부위에 삽입하고 라이게이션(ligation)하여 벡터를 얻었다.
상기 벡터에 GFP 유전자를 BamH I과 EcoR I 부위에 삽입하고 ligation 하여 융합 단백질을 생산하기 위한 플라스미드를 완성하였다. 상기 플라스미드를 사용하여 형질전환된 대장균BL21(DE3) 균주를 LB 배지에서 배양한 후, 1 mM의 이소프로필-베타-디-티오칼락토피라노시드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside :IPTG)를 첨가하여 6시간 동안 30℃에서 배양함으로써, GFP가 실시예 12의 펩타이드의 유전자의 N-말단에 결합한 GFP-펩타이드 융합 단백질을 생산하였다. 그 후, 원심분리를 통해 모은 세포를 음파 파쇄하였다. 이 때, 생산된 융합 단백질은 GFP의 카르복실말단에 상기 실시예 12의 펩타이드가 결합되어 있고, 상기 펩타이드의 카르복실 말단에 정제를 용이하게 하기 위한 히스티딘 태그를 결합시켜 생산하였다.
상기 파쇄액을 원심분리하여 얻은 상층액을 HisTrap HP column(GE Health care)을 사용하여 (GFP-실시예 12의 펩타이드)를 정제하였다. 상기 정제한 (GFP-실시예 12의 펩타이드)를 Tris-HCl (pH 8)로 완충액 교환을 하여 보관한 뒤 실험에 사용하였다.
비교예로서 30Kc19 전체 단백질, GFP, 및 GFP-30Kc19 전체 단백질을 사용하였다. (GFP-30Kc19 전체 단백질)은 상기 펩타이드 대신에 30Kc19 단백질을 이용하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 제조하였다. 도 13에 실험에 사용된 단백질의 구조를 나타내었다.
HeLa 세포에 상기 (GFP-실시예 12의 펩타이드) 및 비교예의 단백질을 4시간 동안 처리한 후, 형광 현미경(fluorescence microscope)을 이용하여 세포 내의 형광을 확인한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 (GFP-실시예 12의 펩타이드)의 경우 세포 내부에 펩타이드가 투과된 상태를 확인할 수 있다.
<110> seoul national university <120> cell penetrating peptide <130> DPP-2012-0038 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Val Val Asn Lys Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 2 Asn Val Val Asn Lys Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Thr Asn Val Val Asn Lys Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Ile Thr Asn Val Val Asn Lys Leu Ile Arg Asn Asn Lys Met Asn Cys 1 5 10 15

Claims (15)

  1. 다음과 같은 일반식으로 나타내어지는 아미노산으로 표시되는 세포 투과 펩타이드.
    B1-B2- ... Bn -1-Bn (n≥13)
    (상기 일반식에서, B1은 Val 이고, B13 은 Cys 이며, B1과 B13 을 제외한 아미노산은 Ala, Asx, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Glx으로 구성된 군으로부터 선택되는 것임)
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 n 은 13 인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 B2 는 Val 인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 B3, B8, B9, 및 B12 가 모두 같은 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 B4, B7, 및 B10 는 염기성 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 B1, B2, B5, B6, 및 B11는 소수성 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 전체 아미노산의 10 내지 20 %의 아미노산이 양이온성인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  8. 제 3항에 있어서,
    상기 B6 와 B7이 양이온성 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  9. 제 3항에 있어서,
    상기 B6 와 B7이 소수성 아미노산인 I(이소루신) 또는 염기성 아미노산인 Arg인 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 나선 고리 나선구조 모티브(Helix-Loop-Helix motif)를 가지는 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 누에 체액 단백질로부터 유래한 것인 세포 투과 펩타이드.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열 1 내지 4를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
    서열 번호 1 - VVNKLIRNNKMNC
    서열 번호 2 - NVVNKLIRNNKMNC
    서열 번호 3 - TNVVNKLIRNNKMNC
    서열 번호 4 - ITNVVNKLIRNNKMNC
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드의 말단에는 세포내 운반 대상의 카고가 추가적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 카고 분자가 펩타이드에 공유 결합 또는 비-공유 결합되는 것인 세포 투과 펩타이드.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 카고는 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질 및 소분자 그리고 이들 중 임의의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 투과 펩타이드.
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KR101626343B1 (ko) * 2015-01-07 2016-06-01 서울대학교산학협력단 30Kc19 단백질 내 α－ｈｅｌｉｘ 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020130548A1 (ko) * 2018-12-19 2020-06-25 한국화학연구원 인간 쥐피에이티씨에치4 단백질 유래 세포막 투과 도메인

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006308989A1 (en) * 2005-11-01 2007-05-10 The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University Novel protein transduction domains and uses therefor
WO2007134151A2 (en) * 2006-05-10 2007-11-22 Smithkline Beecham Corporation Composition and method for increasing cell permeability of a compound
KR100955075B1 (ko) * 2007-10-10 2010-04-30 대한민국(농촌진흥청장) 실크 펩타이드를 활성성분으로 함유하는 골다공증 예방 및치료용 조성물
KR101169030B1 (ko) * 2009-01-21 2012-07-26 애니젠 주식회사 신규한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101626343B1 (ko) * 2015-01-07 2016-06-01 서울대학교산학협력단 30Kc19 단백질 내 α－ｈｅｌｉｘ 도메인의 세포 투과성과 효소 안정화 기능 및 이를 이용한 카고 전달 시스템

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