KR20210072021A - 생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법 - Google Patents

생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210072021A
KR20210072021A KR1020217012784A KR20217012784A KR20210072021A KR 20210072021 A KR20210072021 A KR 20210072021A KR 1020217012784 A KR1020217012784 A KR 1020217012784A KR 20217012784 A KR20217012784 A KR 20217012784A KR 20210072021 A KR20210072021 A KR 20210072021A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
parallel
polypeptide
xaa
cell
polypeptide molecules
Prior art date
Application number
KR1020217012784A
Other languages
English (en)
Inventor
올리버 하틀리
마리안느 파올리니-베르트랑
Original Assignee
유니베르시떼 드 제네브
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니베르시떼 드 제네브 filed Critical 유니베르시떼 드 제네브
Publication of KR20210072021A publication Critical patent/KR20210072021A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C07K1/026—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution by fragment condensation in solution
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본원은 폴리펩티드 결찰, 결찰 반응으로부터 결찰된 폴리펩티드 분리, 폴리펩티드의 폴딩, 및 폴리펩티드의 탈염에 의해, 무-컬럼 기술을 사용하여 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 무-컬럼 기술을 사용하여 병렬로 생산된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 효과 및 특성을 결정하는 방법이 기재된다.

Description

생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법
관련 출원의 상호참조
본원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 가출원 제62/739,555호(출원일: 2018년 10월 1일)를 우선권 주장한다.
기술분야
본원은 폴리펩티드 결찰(ligation) 및 폴딩(folding)에 의해 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하고, 상기 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 분석하여 이의 효과 및 특성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
생물학 연구 분야에서, 및 약리학 연구에서 특히, 바람직한 효과를 갖는 분자를 식별하는 것은 중요하다. 바람직한 생물학적 효과는 비제한적으로 리간드 또는 수용체에 대한 결합, 리간드 또는 수용체 차단, 세포 내에 수용체의 내제화 야기, 수용체 신호전달 경로의 선택적 활성화, 세포 자극, 세포 사멸 및 세포 조절을 포함한다. 분자의 바람직한 의학적 효과는 비제한적으로 박테리아 사멸, 바이러스의 불능화, 암 세포 사멸, 세포 증식 억제, 질병 경로 억제 및 건강 경로의 기능 회복을 포함한다.
후보자 분자가 하나 이상의 바람직한 효과를 갖는 것으로 확인된 경우에, 후보자 분자의 변이체를 생산함으로써 후보자 분자의 효과 또는 특성을 개선하는 것이 추가로 가능하다. 후보자 분자의 변이체는 보다 큰 규모의 목적하는 효과 및 감소된 규모의 바람직하지 않는 효과를 생성하는 것이 가능하다. 또한, 후보자 분자의 변이체는, 개선된 안정성, 개선된 가용성, 감소된 독성, 및 특이적 리간드 또는 수용체에 대한 증가되거나 감소된 결합을 포함하는 증진된 특성을 나타낼 수 있다.
흔히, 후보자 분자의 어떤 특정 변이체 또는 심지어 어떤 일반 카테고리의 변이체가 개선된 특성을 가질지는 미공지되어 있다. 또한, 일부 변이체가 뜻밖의 놀라운 특성을 갖는 것이 가능하다. 따라서, 많은 수의 변이체를 생산하고 이의 효과 및 특성에 대해 이들 모두를 스크리닝하는 것이 유용하다. 또한, 많은 수의 변이체를 병렬로(in parallel) 생산한 후에(즉 분자 라이브러리), 상기 변이체를 이의 효과 및 특성에 대해 병렬로 스크리닝하는 것이 효율적이고 경제적이다. 이러한 대규모의 병렬 스크리닝은 많은 수의 유용하지 않은 변이체 중에서 유용한 변이체의 신속한 식별을 가능하게 한다. 이어서, 이러한 방법으로 식별된 유용한 변이체는 추가적 조사를 위해 선택될 수 있다.
폴리펩티드는 생물학 및 의학 연구에서 중요한 부류의 분자이다. 폴리펩티드는 아미노산의 중합체이며 단백질의 주요 구성성분이다. 25개 이하의 아미노산 잔기의 길이의 보다 작은 펩티드를 생산하기 위해, 큰 펩티드 라이브러리의 병행 생산 및 스크리닝에 기존 기술이 용이하게 사용될 수 있다. 그러나, 이들 기술은 단백질을 구성하는 폴리펩티드를 포함하는 보다 긴 폴리펩티드에 적합하지 않다. 펩티드 합성의 확실성은 25개의 잔기 이후에 급격히 감소된다. 또한, 보다 긴 폴리펩티드의 합성에 시간 소모적이고 많은 비용이 드는 정제 단계, 예컨대 컬럼 크로마토그래피가 필요하다. 컬럼 크로마토그래피는 수고롭고 시간 소모적이며 많은 비용이 들고, 따라서 다수의 폴리펩티드 변이체의 병렬 생산 및 스크리닝에 적합하지 않다.
재조합 발현 또는 파지 디스플레이에 의한 폴리펩티드 생산에 방대한 클로닝, 서브클로닝, 발현 및 정제 단계가 필요하고, 이는 분자를 신속히 병렬로 수 많이 스크리닝하는 능력을 상당히 제한한다.
폴리펩티드 변이체를 생산하는 다른 기술은, 보다 짧은 펩티드 단편의 합성 후에, 상기 단편의 화학적 결찰에 의해 보다 긴 폴리펩티드를 생산하는 것을 사용한다. 적은 선택물의 폴리펩티드 변이체의 생산에 효과적이나, 이들 기술은 폴리펩티드의 정제를 위해 하나 이상의 컬럼 크로마토그래피 단계를 필요로 한다(Canne US 7,094,871; Low WO2004/105685). 상술된 바와 같이, 컬럼 크로마토그래피는 다수의 폴리펩티드 변이체의 병렬 생산 및 스크리닝에 적합하지 않다.
펩티드 결찰의 기술은 결찰된 폴리펩티드의 컬럼 크로마토그래피를 요구하지 않도록 발전하였다(Loibl 2016). 그러나, 이들 기술은 펩티드 단편의 단부에 공유결합된 태그의 첨가를 필요로 하며, 이러한 태그는 최종 폴리펩티드 분자의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이들 기술은 다수의 태그-기반 수지-포착 단계를 필요로 하여 비용 및 복잡성이 커진다. 이러한 특징은 병렬 생산 및 스크리닝을 위한 이러한 기술의 규모 및 적용가능성을 저해한다.
따라서, 특징, 예컨대 생체내 발현, 컬럼 크로마토그래피, 또는 고상 상에 태그된 펩티드의 포착을 제한하지 않고 많은 수의 폴리펩티드 변이체를 생산하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 특징은 많은 수의 폴리펩티드 변이체를 병렬로 생산하고 스크리닝하는 능력을 제한하기 때문에, 이들 특징이 없는 방법은 연구 및 약제에 유용한 특성을 갖는 폴리펩티드 변이체를 식별하는 데 필요한 시간 및 비용을 감소시킴으로써 큰 유용성을 가질 수 있다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 효과 및 특성이 분석을 위해 보존되고 적합한 상태의 폴리펩티드 변이체를 생산할 수 있다.
본원은 많은 수의 폴리펩티드 변이체를 병렬로 이의 효과 및 특성의 분석에 적합한 형태로 생산하는 새로운 방법을 개시한다. 중요하게는, 본원의 방법은 태그에 의한 폴리펩티드의 변형을 필요로 하지 않고, 폴리펩티드 변이체를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하는 것도 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 많은 수의 폴리펩티드 변이체를 병렬로 분석에 적합한 형태로 생산한 후에, 상기 폴리펩티드 변이체를 유용한 효과 및 특성에 대해 스크리닝하는 것을 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 많은 수의 폴리펩티드 변이체를 병렬로 스크리닝 및 분석에 적합한 형태로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 많은 수의 폴리펩티드 변이체를 병렬로 상기 폴리펩티드 변이체의 하나 이상의 효과 및/또는 하나 이상의 특성을 결정하기에 적합한 형태로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계, b) 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계, 및 c) 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계를 포함하는, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 병렬로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계, b) 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계, c) 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계, 및 d) 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬로 동결건조시키는 단계를 포함하는, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계, b) 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계, c) 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계, d) 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬의 별개의 폴딩 반응으로 폴딩하여 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계, 및 e) 조건을 상기 별개의 폴딩 반응에 병렬로 적용하여 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 폴딩 반응으로부터 분리하는 단계를 포함하는, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계, b) 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계, c) 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계, d) 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬의 별개의 폴딩 반응으로 폴딩하여 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계, e) 조건을 상기 별개의 폴딩 반응에 병렬로 적용하여 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 폴딩 반응으로부터 분리하는 단계, 및 f) 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬로 동결건조시키는 단계를 포함하는, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 본원에 기재된 방법에 의해 제공하는 단계, b) 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 별개로 병렬로 세포와 접촉시키는 단계, 및 c) 상기 세포에 대한 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 효과를 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 효과를 병렬로 결정하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 본원에 기재된 방법에 의해 제공하는 단계, b) 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 별개로 병렬로 세포에 접촉시키는 단계, 및 c) 상기 세포에 대한 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 효과를 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 효과를 병렬로 결정하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 본원에 기재된 방법에 의해 생산한 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계, 및 b) 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 병렬로 결정하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 본원에 기재된 방법에 의해 생산한 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계, 및 b) 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 병렬로 결정하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 많은 패널의 케모카인 유사체의 신속하고 저 비용의 생산을 위한 간결한 공정의 설계 및 평가를 나타낸다.
(좌측 패널) 케모카인 구조-활성 관계를 탐구하는 종래 기술은 개별적 분자의 화학적 합성을 기반으로 하였다. 본 발명의 실시양태에서(우측 패널), 폴리펩티드 변이체의 병렬 생산을 위한 공정이 제공된다. 실선 박스(
Figure pct00001
): 직렬로 수행되는 단계, 점/대시 박스(
Figure pct00002
): 병렬 단계, 대시 박스(
Figure pct00003
): 컬럼 크로마토그래피 단계, 점 박스(
Figure pct00004
): 컬럼 크로마토그래피 단계를 대체하는 데 사용된 병렬 절차.
도 2, 2a 및 2b는 코어 단편 배취 1을 사용하여 생산한, 병렬 합성된 케모카인 유사체의 RP-HPLC에 의한 분석을 나타낸다.
합성의 최종 단계 후에, 각각의 반응의 샘플에 분석용 RP-HPLC를 적용하였다. 각각의 패널에서, x-축은 분 단위의 시간이고, y-축은 UV 흡광도(AU 214 nm)이다.
도 3 및 3a는 코어 단편 배취 2를 사용하여 생산된, 병렬 합성된 케모카인 유사체의 RP-HPLC에 의한 분석을 나타낸다.
합성의 최종 단계 후에, 각각의 반응의 샘플에 분석용 RP-HPLC를 적용하였다. 각각의 패널에서, x-축은 분 단위의 시간이고, y-축은 UV 흡광도(AU 214 nm)이다.
도 4는 2개의 주요 생성물을 산출하는 합성에서, 보다 짧은 RP-HPLC 체류 시간을 갖는 피크가 표적 생성물의 Met67(O) 동종체(congener)에 해당하는 질량을 갖는다는 것을 나타낸다.
2개의 주요 생성물 피크를 산출하는 2개의 완료된 병렬 합성 반응에 분석용 RP-HPLC를 적용하고, 각각의 피크를 수집하고 MALDI MS에 의해 분석하였다. 보다 긴 체류 시간을 갖는 피크의 관찰된 질량은 표적 생성물의 것에 부합하였고(2P14-RANTES 및 8P2-RANTES에 대해 각각 7987 Da 및 7891 Da의 예측된 질량), 보다 짧은 체류 시간을 갖는 피크의 것은 표적 생성물의 Met67(O) 동종체의 것에 부합하였다(2P14-RANTES 및 8P2-RANTES에 대해 각각 +17 Da 및 +13 Da의 보다 짧은 체류 시간 피크와 보다 긴 체류 시간 피크 사이의 질량 차이).
도 5는 기준 표준 케모카인 유사체를 사용한 병렬 합성 생성물의 RP-HPLC 체류 시간의 비교를 나타낸다.
대표적 병렬 합성 생성물(웰내(in-well) 혼합물)의 RP-HPLC 프로필을 동일한 분석 컬럼을 사용하고 동일한 조건 하에 기준 표준 케모카인 유사체(Gaertner 2008의 ref. std)의 것과 비교하였다. 주요 피크의 피크 체류 시간은 각각의 샘플에 대해 언급된다. A는 코어 단편 배취 1을 사용하여 생산한 대표적 샘플에 대한 것이고, B는 코어 단편 배취 2를 사용하여 생산한 대표적인 샘플에 대한 것이다.
도 6은 병렬 합성된 케모카인 유사체의 항-HIV 효능과 상응하는 기준 표준 샘플에서 이전에 수득한 것의 비교를 나타낸다.
A. 층화에 사용된 데이터의 예로서, R5-향성(tropic) 외피-의존성 세포 융합 분석을 4개의 공칭 농도에서 수행하였고, 이때 세포 융합의 완전한 억제가 달성되는 농도의 숫자에 따라 샘플을 (-) 내지 (++++)로 순위 매겼다. 기호는 평균 세포 융합 활성 ± 범위를 나타낸다(n=3). 흑색 사각형: M9-RANTES, 흑색 삼각형: M19-RANTES, 흑색 원: 8P5-RANTES, 백색 사각형: 8P6-RANTES, 백색 삼각형: M21-RANTES, 백색 원: 5P12-RANTES 기준 표준. B. 기준 연구(Gaertner 2008)에서 생산되고 시험된 상응하는 분자의 효능과 비교한 본 연구에서 생산되고 층화된 각각의 화합물의 효능(pIC50).
도 7은 병렬 합성된 케모카인 유사체의 Ca2+ 신호전달 활성의 평가를 나타낸다.
본 연구에서 합성한 유사체 각각의 신호전달 활성을 Fluo4-AM이 적재된 HEK-CCR5 세포 상에서 384-웰 포맷 Ca2+ 플럭스 분석을 사용하여 결정하였다. 유사체를, 5P12-RANTES(비-신호전달 대조군) 및 PSC-RANTES(최대 신호전달 대조군)의 기준 표준 샘플(300 nM)을 함께 사용하여, 300 nM의 공칭 Emax 농도에서 시험하였다. 신호전달률을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다:
[수학식 1]
100 × (샘플 신호 - 5P12-RANTES 신호) ÷ (PSC-RANTES 신호 - 5P12-RANTES 신호)
막대는 평균 ± SEM(n=4)을 나타낸다.
도 8은 병렬 합성된 케모카인 유사체의 칼슘 신호전달 활성과 상응하는 기준 표준 샘플에서 이전에 수득한 것의 비교를 나타낸다.
병렬 합성된 케모카인 유사체 각각의 칼슘 신호전달 분석을 384-웰 플레이트 기반 분석에서 Emax 농도(300 nM)에서 결정하였다(도 7 참조). 수득한 결과에 따라, 유사체를 3개의 군(저, 중간 및 고 신호전달)으로 층화하였다. 본 도면은 기준 연구(Gaertner 2008)에서 생산하고 시험한 분자를 사용하여 각각의 군에서 유사체에 대해 결정한 신호전달 효능의 분포를 나타낸다.
도 9는 병렬 합성된 케모카인 유사체의 CCR5 내재화 활성의 평가를 나타낸다.
본 발명의 방법에 따라 합성한 유사체 각각의 CCR5 내재화 활성을 CHO-CCR5-RLuc8/YFP-CAAX 리포터 세포 상에서 96-웰 포맷 바이스탠더(bystander) BRET 분석을 사용하여 결정하였다. 유사체를 5P12-RANTES(비-내재화 대조군) 및 PSC-RANTES(최대 내재화 대조군)의 기준 표준 샘플(300 nM)과 함께 300 nM의 공칭 Emax 농도에서 시험하였다. 신호전달률을 하기 수학식 2에 따라 계산하였다:
[수학식 2]
100 × (샘플 신호 - 5P12-RANTES 신호) ÷ (PSC-RANTES 신호 - 5P12-RANTES 신호)
막대는 평균 ± SEM(n=6)을 나타낸다.
도 10은 병렬 합성된 케모카인 유사체의 CCR5 하향조절 활성과 상응하는 기준 표준 샘플에서 이전에 수득한 것의 비교를 나타낸다.
병렬 합성된 케모카인 유사체 각각의 CCR5 하향조절 활성을 BRET-바이스탠더 분석에서 Emax 농도(300 nM)에서 결정하였다(도 9 참조). 수득한 결과에 따라, 유사체를 3개의 군(저, 중간 및 고 하향조절)으로 층화하였다. 본 도면은 기준 연구(Gaertner 2008)에서 생산하고 시험한 분자를 사용하여 각각의 군에서 유사체에 대해 결정한 하향조절 효능의 분포를 나타낸다.
도 11 내지 11b는 HPLC에 의한 표적 CCL25 유사체의 분석을 나타낸다.
합성 후에, CCL25 유사체를 HPLC에 의해 분석하였다.
도 12는 생물발광 공명 에너지 전달에 의한 아레스틴-3를 CCR9에 모집하는CCL25 유사체의 능력의 평가를 나타낸다.
BRET 신호(평균 및 표준 편차, n=4)를 CCR9-발현 리포터 세포 상에서 CCL25 유사체(300 nM)에 대해 수득하였다. 가로 점선은 백그라운드 신호전달 수준을 나타낸다.
표의 간단한 설명
표 1은 병렬 합성된 N-말단 펩티드 단편의 MALDI MS 분석을 나타낸다.
합성 후에, N-말단-SEA 단편 각각을 MALDI MS에 의해 분석하였다. 단편 각각의 서열 및 예측된 질량을, 관찰된 질량, 질량 차이 및 설명과 함께 나타냈다.
표 2A는 코어 단편 배취 1을 사용하여 생산한 병렬 케모카인 유사체의 MALDI MS 분석을 나타낸다.
합성의 최종 단계 후에, 각각의 반응의 샘플을 MALDI MS에 의해 분석하였다. 유사체 각각의 예측된 질량 및 관찰된 질량을 나타냈다.
표 2B는 코어 단편 배취 2를 사용하여 생산한 병렬 케모카인 유사체의 MALDI MS 분석을 나타낸다.
합성의 최종 단계 후에, 각각의 반응의 샘플을 MALDI MS에 의해 분석하였다. 대부분의 경우에, 2개의 주요 질량이 검출되었다. 이들 질량(Mobs1 및 Mobs2)을 각각의 유사체의 예측된 질량과 함께 나타냈다.
표 3은 병렬 합성된 케모카인 유사체의 샘플에서 표적 단백질 농도 측정을 나타낸다.
합성의 최종 단계 후에, 선택된 반응의 샘플을 250 μL 물에 용해시키고 분석용 RP-HPLC를 적용하고, 진정한 표적 단백질 및 이의 Met67(O) 동종체로 해석되는 피크 면적의 백분율을 Empower 소프트웨어(Waters)를 사용하여 계산하였다. 총 단백질 농도(μM) 및 함량(nmol)을 각각의 용액의 흡광도(280 nm)를 측정하고 각각의 유사체의 이론적 흡광 계수를 사용하여 추정하였다(web.expasy.org/protparam). 표적 단백질의 추정된 수율(%)을 하기 수학식 3에 따라 계산하였다:
[수학식 3]
100 × 합한 % 표적 피크 면적 × 추정된 총 단백질 함량(nmol) ÷ 100 nmol(초기 반응에서 코어 단편의 양)
작업 용액(250 μL)에서 추정 농도를, 추정된 총 펩티드 농도(280 nm에서의 흡광도에 의해 결정)를 추정된 표적 단백질의 수율(%)을 곱함으로써 계산하였다.
표 4는 CCL25 유사체의 변이 영역 N-말단 펩티드를 나타낸다.
합성된 CCL25 유사체의 N-말단 서열을 나타낸다. 나타낸 서열은 천연 CCL25의 N-말단 내지 Cys8이다. 특정 유사체는 N-말단 연장을 특징으로 한다. Z = 피로글루타메이트.
표 5는 표적 CCL25 유사체의 MALDI MS 분석을 나타낸다.
합성 후에, CCL25 유사체를 MALDI 질량 분석법에 의해 분석하였다.
발명의 상세한 설명
많은 수의 변이 폴리펩티드 분자를 이의 효과 및/또는 특성을 후속 분석에 의해 결정하기에 적합한 형태로 병렬로 생산하는 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 경제 및 병렬 특성은 많은 수의 폴리펩티드 분자가 생물학 또는 의학 연구를위해 신속하고 효과적으로 스크리닝되는 것을 가능하게 한다.
본원 실시예 1 내지 4에 기재되고 비제한적인 예로서 제공되는 본 발명의 실시양태에서, 케모카인 RANTES/CCL5의 96개의 후보 변이체가 본 발명의 방법에 의한 생산 및 후속 분석을 위해 선택되었다. 이들 96개의 변이체는 RANTES/CCL5 단백질의 유사체를 나타낸다(Gaertner 2008). RANTES/CCL5의 불변 코어 단편의 2개의 큰 배취는 고상 펩티드 합성에 의해 생산되었다. 또한, RANTES/CCL5의 변이 영역에 해당하는 변이 펩티드의 어레이는 병렬로 고상 펩티드 합성에 의해 생산되었다. 코어 단편은 병렬로 변이 펩티드 각각에 결찰되어 구조적 변이 RANTES/CCL5 유사체의 어레이를 생산하였다. 이어서, 결찰된 RANTES/CCL5 유사체를 컬럼 크로마토그래피를 사용하지 않는 크기 배제에 의해 결찰 반응 혼합물로부터 분리하여 신속하게 병렬로 절차를 완료하였다. 이어서, RANTES/CCL5 유사체를 병렬로 폴딩하고 탈염하고 동결건조시켰다. 당분야에 공지된 종래 기술과 비교하여 본 발명의 본 실시양태의 단계를 도시하는 흐름도가 도 1에서 비제한적인 예로 제공된다.
본원 실시예 5 내지 7에 기재되고 본 발명의 비제한적인 예로 제공된 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 RANTES/CCL5 유사체의 선택을 세포에 대한 이의 생물학적 효과의 분석을 위해 선택하였고, HPLC 정제를 사용하는 보다 수고스럽고 고 비용의 방법(Gaertner 2008)에 의해 생산된 이들 동일한 유사체에 대해 이전에 기재된 데이터와 비교하였다. 방법은 분석을 위해 85 RANTES/CCL5 유사체를 병렬로 생산하는 데 있어서 성공적이었다. 이어서, 이들 RANTES/CCL5 유사체를 세포에 적용하고 세포 융합 분석(도 6), CCR5 작용제(agonist) 분석(도 7 및 도 8) 및 세포 표면 하향조절 분석(도 9 및 도 10)에 의해 이의 생물학적 활성에 대해 분석하였다. 본원에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생산한 유사체의 세포 효과의 분석으로 이전에 기재된 방법(Gaertner 2008)에 의해 생산된 동일한 유사체의 효과와의 양호한 상관관계를 수득하였다. 본 발명의 방법에 의해 생산한 유사체가 컬럼 크로마토그래피(Canne US 7,094,871) 또는 태그-기반 수지-포착(Loibl 2016) 단계를 사용하는 공지된 방법에 의해 생산한 것보다 낮은 순도를 갖지만, 이들이 3개의 세포 분석에서 이들의 생물학적 효과를 정확하게 개괄할 수 있었다는 점에서, 이들 결과는 놀라웠다.
본원 실시예 8에 기재되고 본 발명의 비제한적인 예로서 제공되는 본 발명의 또 다른 실시양태에서, CCL25의 50개의 유사체를 생산한 후에, 본 발명의 방법에 의해 생물학적 활성에 대해 분석하였다. 상기 방법은 50개의 CCL25 유사체를 생산함에 있어서 성공적이었고, 이를 CCR9-발현 리포터 세포 상에 CCR9에 대한 아레스틴-3을 모집하는 유사체의 능력을 측정하는 세포 분석에서 이들의 생물학적 활성에 대해 스크리닝하였다. 일부 유사체는 모 화합물보다 높은 활성을 나타냈다(도 12).
본원에 기재된 예는 본 발명의 방법에 의해 생산한 폴리펩티드 변이체가 이의 효과 및/또는 특성에 대해 확실하게 스크리닝될 수 있음을 나타낸다. 또한, 본 발명의 방법은, 공지된 방법에 필요한 고 비용이며 제한적인 정제 절차의 필요 없이, 수 많이 병렬로 이들 스크리닝 가능한 폴리펩티드 변이체를 생산할 수 있다(Canne US 7,094,871; Low WO2004105685; Loibl 2016).
폴리펩티드
본 발명에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 생산에서 사용하기 위한 공통의 불변 폴리펩티드뿐만 아니라, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드가 제공된다.
본원에 사용된 용어 "구조적 변이"는 상응하거나 유사한 다른 폴리펩티드와 비교하여 폴리펩티드의 구조에 있어서 하나 이상의 변이를 지칭한다. 구조적 변이는 예를 들어 다른 변이체와 비교하여 아미노산 서열의 하나 이상의 변화, 예컨대 결실, 삽입, 대체 또는 변형일 수 있다. 또한, 구조적 변이는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체, 아미노산 유도체 또는 비-아미노산 모이어티의 혼입일 수 있다. 구조적 변이 폴리펩티드에 존재하는 구조적 변이는 본원에 기재된 분석에 의해 검출될 수 있는 방식으로 최종 폴리펩티드 분자의 특성 및/또는 효과를 변경하기 쉽다.
본원에 사용된 용어 "구조적 불변"은 최종 폴리펩티드 분자의 특성 및/또는 효과를 유의미하게 변경하는 상응하거나 유사한 다른 폴리펩티드와 비교하여 변이를 갖지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 불변 폴리펩티드는 동일할 수 있거나 예를 들어 폴리펩티드의 형태 또는 기능에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있거나 표적 결합을 수반되지 않는 것으로 공지된 부위에서 변형을 함유할 수 있다. 공통의 구조적 불변 폴리펩티드 중에서 임의의 변이는 최종 폴리펩티드 분자의 특성 및/또는 효과를 변경하지 않아야 하고, 따라서 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 중에서 특성 및/또는 효과의 임의의 차이가 구조적 변이 영역에 기인한다.
본원에 정의된 용어 "병렬"은 2개 이상의 폴리펩티드가 한번에 생산되거나 합성되거나 결찰되거나 폴딩되거나 탈염되거나 반응하거나 분리되거나 동결건조되거나 달리 조작되는 것을 지칭한다. 폴리펩티드는 예를 들어 병렬로 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 생산되거나 합성되거나 결찰되거나 폴딩되거나 탈염되거나 반응하거나 분리되거나 동결건조되거나 달리 조작될 수 있다.
폴리펩티드의 합성은 개별적으로 단일 반응 용기를 갖춘 펩티드 합성기, 예컨대 ABI 433 펩티드 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 수행될 수 있다. 이의 비제한적인 예는 본원 실시예 1에 개시된 코어 단편 배취 1의 합성이다.
또한, 폴리펩티드의 합성은 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 예를 들어 Prelude(등록상표) 펩티드 합성기(Protein Technologies Inc.)의 사용은 1 내지 6개의 별개의 폴리펩티드의 합성을 병렬로 가능하게 한다. 예를 들어, ABI 433 펩티드 합성기(Applied Biosystems)의 사용은 병렬로 48, 72, 96, 192, 288 및 384개의 군으로 폴리펩티드의 합성을 가능하게 한다. 이의 비제한적인 예는 본원 실시예 2에 개시된 96개의 변이 영역 펩티드의 병렬 합성이다. 실시예 2는 비제한적인 예로서 본 발명이 후속 결찰 반응에서 사용하기 위해 무-컬럼 방식으로 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 영역을 제공하는 방법을 개시한다.
상기에 기재된 폴리펩티드의 병렬 합성에 적합한 반응 용기는 비제한적으로 12, 24, 48 또는 72개의 컬럼 또는 튜브의 블록, 96-웰 플레이트 및 384-웰 플레이트를 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드를, 당분야에 공지된 화학적 방법을 사용하여 아미노산을 연결시킴으로써 전체적으로 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 합성을 다양한 고상 기술을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 Roberge 1995; Merrifield 1997; Ollivier 2010; Raibaut 2015 참조). 고상 펩티드 합성은 당분야에 공지된 Foc 또는 Bmoc 화학을 사용할 수 있다(Jaradat 2018). 또한, 자동화된 합성이 예를 들어 비제한적으로 ABI 433 펩티드 합성기(Applied Biosystems), Prelude(등록상표) 합성기(Protein Technologies Inc.) 또는 MultiPep RSi 384-웰 펩티드 합성기(Intavis)를 제조사가 제공한 지시서에 따라 사용함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 본원 실시예 1 및 2에 개시된 바와 같이 합성될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드가 레이저-기반 기술(Loeffler 2016) 또는 유동-기반 기술(Mijalis 2017)을 포함하는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 병렬로 합성될 수 있음이 본 발명자들에 의해 고려된다.
폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 공유결합된 아미노산의 중합체이다. 10개 미만, 15개 미만, 20개 미만 또는 50개 미만의 아미노산 길이의 짧은 폴리펩티드는 흔히 당분야에서 "펩티드"로서 지칭된다. 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상 또는 50개 이상의 아미노산 길이의 긴 폴리펩티드는 흔히 당분야에서 "폴리펩티드"로서 지칭된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 중합체를 기재하기 위해 사용된다.
본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 예를 들어 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 길이로 합성될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 구조적 변이 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 공통의 불변 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 구조적 불변 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 및 공통의 불변 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드 분자의 구조적 변이 영역 및 구조적 불변 영역에 각각 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 및/또는 공통의 불변 펩티드는 고상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 고상 펩티드 합성은 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다(예를 들어 Roberge 1995; Merrifield 1997; Raibaut 2015 참조).
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드는 고상 펩티드 합성에 의해 병렬로 합성된다. 고상 펩티드 합성은 예를 들어 비제한적으로 MultiPep RSi 384-웰 펩티드 합성기를 사용하여 병렬로 수행될 수 있다.
폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산을 포함하는 중합체이다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 폴리펩티드에 혼입될 수 있는 천연 또는 천연이 아닌 임의의 아미노산을 기재하기 위해 사용된다. 아미노산은 아민(-NH2) 기, 카복시(-COOH), 및 각각의 아미노산에 특이적인 가변 측쇄(R-기)를 포함하는 소분자이다. 아미노산은 하나의 아미노산의 아민 기와 또 다른 아미노산의 카복시 기 사이에 펩티드 연결에 의해 공유결합되어 폴리펩티드를 형성한다. 폴리펩티드 내의 아미노산은 흔히 당분야에서 "잔기"로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 구조적 변이 폴리펩티드 및/또는 공통의 불변 폴리펩티드는 아미노산 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산 유사체"는 20개의 표준 유전자-암호화된 아미노산 이외에 인공, 합성 또는 비천연 아미노산을 지칭하기 위해 사용된다(Zou 2018).
본 발명에서 사용하기 위한 아미노산 유사체는 공지된 방법에 의해 합성될 수 있거나(예를 들어 Zou 2018; Boto 2007; He 2014 참조) 공지된 공급사(Millipore Sigma)로부터 구매할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 내로 혼입될 수 있는 아미노산 유사체의 예는 비제한적으로 β-아미노산, 호모-아미노산, 합성 프롤린 및 피루브산 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 글리신 유도체, 고리-치환된 페닐알라닌 및 티로신 유도체, 선형 코어 아미노산, N-메틸 아미노산, 및 합성 R-기를 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조적 변이 폴리펩티드 및/또는 공통의 불변 폴리펩티드는 아미노산 유도체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산 유도체"는 20개의 표준 유전자-암호화된 아미노산 중 하나의 변형으로부터 유래된 아미노산을 기재하기 위해 사용된다. 아미노산 유도체는 예를 들어 화학 반응에 의해 시험관내 합성될 수 있거나, 이는 유기체에서 자연발생할 수 있다(예를 들어 생체내 대사물). 아미노산 유도체의 예는 피로글루타메이트/피로글루탐산, 글루타민의 환화된 유도체(여기서 글루탐산의 유리 아미노 기가 환화되어 락탐을 형성함)이다.
일부 실시양태에서, 비제한적으로 형광 색소, 킬레이터 및 비오틴을 포함하는 표지용 구조물의 부착을 가능하게 하는 분자 후크(molecular hook)가 구조적 변이 폴리펩티드 분자 내로 혼입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 다양한 유용한 구조물, 특히 검출을 위해 사용될 수 있는 것(예를 들어 형광 색소) 및 정제를 위해 사용될 수 있는 것(예를 들어 비오틴)에 의해 유도체화된 코어 단편의 부위-특이적 변형된 변이체의 생산을 가능하게 하는 모이어티의 도입이 가능하다. 이러한 모이어티는 예를 들어 폴리펩티드에서 선택된 리신의 엡실론 아민을 통해 혼입될 수 있다. 혼입될 수 있는 모이어티는 비제한적으로 (i) '클릭 케미스트리(click chemistry)'와 양립성인 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산(Kolb, 2001), 및 (ii) 옥심 케미스트리와 양립성인 알데하이드 작용기를 생산하도록 산화될 수 있는 세린 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산이 아닌 모이어티를 혼입할 수 있다. 아미노산이 아닌 모이어티를 함유하는 폴리펩티드는 본원에 개시된 합성 및 결찰 기술을 사용하여 합성되고 결찰될 수 있는 경우 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다.
단백질 및 단백질 유사체
본 발명은 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드로 주로 구성되는 생물학적 분자의 한 부류이다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 분자를 기재하기 위해 사용된다.
단백질이 하나 초과의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 상기 폴리펩티드는 공유결합되거나 비-공유결합될 수 있다. 또한, 단백질의 폴리펩티드는 2개의 R-기 사이에 공유결합, 예를 들어 다이설파이드 가교를 통해 자체에 공유결합될 수 있다. 단백질의 폴리펩티드는 지질 분자(리포펩티드 및 리포단백질) 또는 탄수화물 분자(글리코펩티드 및 글리코단백질)를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 단백질은 비-유기 성분(예를 들어 헤모글로빈 단백질의 헴 기의 철 이온)에 연결될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드는 단백질의 구조적 변이 영역에 해당한다.
일부 실시양태에서, 공통의 불변 폴리펩티드는 단백질의 구조적 불변 영역에 해당한다.
일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 및 공통의 불변 폴리펩티드는 동일한 단백질의 구조적 변이 영역 및 구조적 불변 영역에 각각 해당한다.
일부 경우에, 단백질은 많은 구조적 변이 형태로 존재할 수 있다. 단백질의 구조적 변이 형태는 흔히 당분야에서 "유사체"로서 지칭된다. 이들 단백질 유사체는 하나 이상의 공통의 구조적 불변 영역을 공유하나, 하나 이상의 구조적 변이 영역에 있어서 상이하다. 단백질 유사체는 이의 공유된 불변 영역을 기반으로 특정 효과 또는 특성을 공유할 수 있고, 또한 변이 영역에 의해 부여된 차이점으로 인해 차등의 효과 또는 특성을 나타낼 수 있다.
복수의 구조적 변이 폴리펩티드가 공지된 폴리펩티드 또는 단백질의 한 영역에 해당하는 실시양태에서, 이는 동일한 폴리펩티드 또는 단백질의 한 영역에 해당하는 공통의 불변 폴리펩티드에 결찰되어 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 복수의 유사체를 생산할 수 있다.
복수의 구조적 변이 폴리펩티드가 공지된 폴리펩티드 또는 단백질의 한 영역에 해당하는 실시양태에서, 이는 상이한 폴리펩티드 또는 단백질의 한 영역에 해당하는 공통의 불변 폴리펩티드에 결찰되어 키메라 폴리펩티드 또는 단백질의 복수의 유사체를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 및/또는 공통의 불변 폴리펩티드는 임의의 공지된 단백질의 한 영역에 해당되지 않는 인공 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공의 구조적 변이 폴리펩티드는 인공의 공통의 불변 폴리펩티드에 결찰되어 인공 폴리펩티드 또는 단백질의 복수의 유사체를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 구조적 변이 폴리펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 공지된 영역에 해당하는 공통의 불변 폴리펩티드에 결찰되어 키메라 폴리펩티드 또는 단백질의 복수의 유사체를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공의 공통의 불변 폴리펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질의 공지된 영역에 해당하는 인공의 구조적 변이 폴리펩티드에 결찰되어 키메라 폴리펩티드 또는 단백질의 복수의 유사체를 생산할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법에 의해 생산된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 단백질이다. 본 발명에 의해 생산할 수 있는 단백질의 예는 비제한적으로 전사 인자, 전사 증진자, 전사 억제자, DNA/RNA-결합 단백질, 상보성 단편, 시토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체 도메인, 세포내 수용체, 효소, 항체 단편, 호르몬, 독소, 개별적 단백질 도메인 및 인공 단백질을 포함한다. 인공 단백질은 소분자의 모방체 및 기타 비-폴리펩티드 리간드(예를 들어 뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 지질)이도록 설계된 폴리펩티드, 및 구조적 변이 영역이 공지된 단백질로부터 유도된 인공 공통의 불변 영역 또는 공통의 불변 영역에 결찰된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 시토카인은 면역계에 중요한 단백질의 한 부류이다. 시토카인은 면역 세포가 면역 반응을 조정하도록 또 다른 면역 세포에 신호전달하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생산한 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 시토카인이다. 본 발명에 의해 생산할 수 있는 시토카인의 예는 비제한적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, 인터페론-알파, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자 알파 및 종양 성장 인자-베타를 포함한다.
케모카인은 케모카인 수용체를 통해 신호전달에 의해 주화성을 유도함으로써 특정 위치에 세포를 모집하는 시토카인의 특정 부류이다. 케모카인은 4개의군(C 케모카인, CC 케모카인, CXC 케모카인 및 CXXXC 케모카인)으로 분류된다. 케모카인의 예는 RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)(CCL5(C-C 모티프 리간드 5)로도 공지됨)이다. RANTES/CCL5는 수용체 CCR5에 결합하여 주화성을 유도하고 면역 반응을 촉진한다. HIV의 치료에서 유용한 RANTES/CCL5의 유사체는 당분야에 공지되어 있다(Gaertner 2008). RANTES/CCL5는 실시예 1 내지 7에서 본 발명에서 사용하기에 적합한 케모카인 단백질의 비제한적인 예로서 본원에 개시되어 있다. 케모카인의 또 다른 예는 수용체 CCR9에 결합하는 CCL25이다. CCL25는 예를 들어 장 상피 세포에 의해 발현되고 CCR9-발현 림프구의 모집을 촉진한다. CCL25는 실시예 8에서 본 발명에 적합한 케모카인 단백질의 비제한적인 예로서 본원에 개시되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법에 의해 생산한 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 케모카인이다. 본 발명에 의해 생산할 수 있는 케모카인은 비제한적으로 C 케모카인, CC 케모카인, CXC 케모카인 및 CXXXC 케모카인을 포함한다. 본 발명에 의해 생산할 수 있는 케모카인은 비제한적으로 항상성 케모카인 및 염증성 케모카인을 포함한다.
폴리펩티드의 결찰
본 발명은 복수의 구조적 변이 폴리펩티드가 공통의 불변 폴리펩티드에 결찰되는 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 생산 방법을 제공한다.
폴리펩티드의 결찰은 이민 포착, 슈도프롤린 결찰, 슈타우딩거 결찰, 티오에스터 포착 결찰 및 하이드라진 형성 결찰을 포함하는 당분야에 공지된 많은 기술에 의해 수행될 수 있다(Tam 2001).
폴리펩티드의 결찰은 당분야에 공지된 천연 화학 결찰에 의해 수행될 수 있다(Dawson 1994; Raibaut 2015; Engelhard 2016). 천연 화학 결찰은 2개 이상의 보호되지 않은 펩티드 분절의 공유결합 조립으로 보다 큰 폴리펩티드의 생산을 가능하게 한다. 천연 화학 결찰 반응은 가용성 결찰(여기서 접합시킬 폴리펩티드가 용액으로 존재함) 또는 고상 결찰(여기서 N-말단 폴리펩티드 단편이 검출가능한 링커를 통해 고상 수지에 공유결합으로 부착됨)로서 발생할 수 있다(Canne US 7,094,871; Low WO2004105685).
폴리펩티드의 결찰은 당분야에 공지된 SEA 천연 펩티드 결찰에 의해 수행될 수 있다(Ollivier 2010). 이러한 방법에서, 결찰은 하나의 펩티드 C-말단 비스(2-설판일에틸)아미도(SEA) 기와 또 다른 펩티드의 N-말단 시스테인 사이에서 발생한다. 천연 화학 결찰와 유사하게, SEA 천연 펩티드 결찰은 가용성 또는 고상 결찰 반응으로서 발생할 수 있다. 본 발명에서 SEA 천연 펩티드 결찰의 사용은 실시예 3에서 본 발명의 실시양태의 비제한적인 예에 개시되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드와 공통의 불변 폴리펩티드 사이의 결찰 반응은 천연 화학 결찰을 통해 발생한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드와 공통의 불변 폴리펩티드 사이의 결찰 반응은 SEA 천연 펩티드 결찰을 통해 발생한다. SEA 천연 펩티드 결찰은 당분야에 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다(Ollivier 2010).
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드와 공통의 불변 폴리펩티드 사이의 결찰 반응은 가용성 결찰을 통해 발생한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드와 공통의 불변 폴리펩티드 사이의 결찰 반응은 가용성 SEA 천연 펩티드 결찰을 통해 발생한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드와 공통의 불변 폴리펩티드 사이의 결찰 반응은 가용성 SEA 천연 펩티드 결찰을 통해 병렬로 발생한다.
폴리펩티드의 결찰은 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 결찰은 적합한 용기에서 결찰 반응 혼합물을 병렬로 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 0.2 mL 튜브, 0.5 mL 튜브, 1.5 mL 튜브, 2 mL 튜브, 15 mL 튜브, 48-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 및 384-웰 플레이트를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 구조적 변이 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 N-말단 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 구조적 변이 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 C-말단 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 구조적 변이 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 내부 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 공통의 불변 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 N-말단 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 공통의 불변 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 C-말단 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 공통의 불변 폴리펩티드는 폴리펩티드 분자의 내부 영역에 해당한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 분자는 단백질이다.
크기 배제, 반응 분리 및 컬럼 크로마토그래피
본 발명은 상기 폴리펩티드 분자가 결찰 후에 결찰 반응 용액으로부터 분리되는, 2개의 폴리펩티드 단편의 결찰에 의한 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 생산 방법을 제공한다.
반응 혼합물 및/또는 불완전 반응 생성물로부터 분자를 분리하기 위한 많은 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이들 기술은 반응 혼합물 또는 반응 생성물에서 화학 물질이 목적하는 반응 생성물의 하류 사용을 간섭할 수 있기 때문에 중요할 수 있다. 예로서, 완료된 SEA 천연 펩티드 결찰의 반응 혼합물은 폴리펩티드 결찰 생성물의 하류 폴딩을 간섭할 수 있는 티올 제거제, 환원제 및 미반응 N-말단 펩티드를 함유한다. 따라서, 이들 원치 않는 반응 성분을, 반응 생성물을 정제함으로써 제거하는 것이 중요하다.
폴리펩티드 분자를 반응 혼합물로부터 분리하는 데 가장 강하고 효과적인 기술은 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 또한, HPLC는 컬럼 크로마토그래피로서 통상적으로 당분야에 공지되어 있다. 컬럼 크로마토그래피는 분자를 함유하는 용액을 펌핑하여 고상을 함유하는 컬럼 내로 분리하는 것을 수반한다. 고상의 특성은 분자를 분리하는 특정 컬럼 크로마토그래피 기술 및 메커니즘을 결정한다. 컬럼 크로마토그래피의 예는 크기 배제 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 다른 용질 및 용매가 컬럼을 통과하는 동안에 소수성 고상이 흡착 폴리펩티드를 흡착하는 데 사용되는 역상 크로마토그래피가 특히 관련성을 갖는다. 컬럼 크로마토그래피의 모든 이들 방법은 당분야에 공지되어 있고 목적하는 분자의고 순도를 달성하는 데 사용될 수 있다(Snyder 2000 참조). 컬럼 크로마토그래피의 하나의 주요 단점은 재료 및 시간 둘 모두의 비용이다. 컬럼 크로마토그래피는 저속 공정일 수 있고, 하나의 샘플만이 한번에 컬럼을 통과할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 기계는 비교적 크고 비용 소모적이며, 많은 수를 병렬로 운영하는 것은 논리적으로 터무니 없이 비싸다. 따라서, 폴리펩티드를 생산하거나 분석하기 위한 임의의 방법에 있어서 임의의 컬럼 크로마토그래피에 대한 필요요건은 대규모 병렬 작업을 방지하는 속도-제한 단계이다.
폴리펩티드 분자를 반응 혼합물로부터 분리하기 위한 다른 기술이 당분야에 공지되어 있다. 이들 기술은 컬럼-기반 기술, 예컨대 HPLC과 구별하도록 "무-컬럼"으로서 통상적으로 공지되어 있다. 본 발명에 특히 적합한 무-컬럼 기술은 무-컬럼 역상 분리, 막 여과, 침전/원심분리 및 투석이다. 무-컬럼 정제 기술이 HPLC와 동일한 최종 생성물의 고 순도를 달성하지는 않지만, 이는 시간, 비용 및 확장성에 있어서 유리점을 가지며, 따라서 병렬로 사용하기 위해 매우 적합하다.
막 여과는, 목적하는 분자를 함유하는 분자를 한정된 공극 크기를 갖는 막 또는 필터에 적용하는 무-컬럼 크기 배제 기술이다. 막 또는 필터의 공극 크기는 킬로달톤(kDa) 단위를 사용하여 컷-오프 크기(cut-off size)에 의해 당분야에 통상적으로 정의된다. 컷-오프 크기(kDa)는 컷-오프 크기보다 작은 kDa을 갖는 모든 액체, 용질 및 분자가 막 또는 필터를 통과할 수 있음을 나타낸다. 역으로, 컷-오프 크기보다 큰 kDa을 갖는 모든 분자는 막 또는 필터에 의해 잔류할 수 있다. 이러한 방법으로, 해당 분자를 용액 또는 반응 혼합물로부터 분리한다. 폴리펩티드를 정제하는 데 사용된 막 또는 필터의 컷-오프 크기의 예는 비제한적으로 3.5 kDa, 10 kDa, 30 kDa 및 50 kDa을 포함한다.
폴리펩티드 분자의 분리에 적합한 막 여과 용기의 예는 비제한적으로 Microcon(등록상표) 튜브(Millipore Sigma), Amicon Ultra 튜브(Millipore Sigma) 및 96-웰 MultiScreen(상표) 필터 플레이트(Millipore Sigma)를 포함한다. 본 발명에서 병렬 폴리펩티드 정제를 위한 10 kDa 컷-오프 Microcon(등록상표) 튜브의 사용은 본원 실시예 3에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
막 여과에 의한 반응 혼합물로부터 폴리펩티드의 분리는 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 분리는 적합한 용기에서 해당 폴리펩티드를 함유하는 반응 혼합물을 병렬로 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 Microcon(등록상표) 튜브(Millipore Sigma), Amicon Ultra 튜브(Millipore Sigma) 및 96-웰 MultiScreen(상표) 필터 플레이트(Millipore Sigma)를 포함한다.
막 여과 기술에서, 목적하는 분자를 함유하는 용액은 압력 없이 적용될 수 있고 중력 단독에 의해 막 또는 필터를 통과하도록 할 수 있다. 대안적으로 목적하는 분자를 함유하는 용액은 용액이 통과하도록 하는 압력에 의해 막 또는 필터에 적용될 수 있다. 압력은 원심분리기 또는 펌프의 사용을 통해 적용될 수 있다.
막 여과를 수행할 때, 용액을 막 또는 필터 통해 유동시킬 수 있고 폐기시킬 수 있고, 목적하는 분자를 필터에 의해 잔류시킬 수 있다. 이어서, 세척 용액을 막 또는 필터에 반복하여 적용하고 세척 용액을 막 또는 필터에 통과시킴으로써 목적하는 분자를 세척 단계에 적용할 수 있다. 적합한 세척 용액은 비제한적으로 물 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함한다.
막 여과를 수행할 때, 목적하는 분자를 막 또는 필터에 의해 잔류시킬 수 있고 목적하는 분자를 함유하는 액체를 직접 제거함으로써 회수할 수 있다. 막 또는 필터 상에 충분한 액체가 존재하지 않는 경우, 목적하는 분자는 적합한 용매를 막 또는 필터에 적용하고 용매를 제거하여 용액의 목적하는 분자를 회수함으로써 회수될 수 있다. 막 또는 필터로부터 목적하는 폴리펩티드를 재현탁하기에 적합한 용매는 물, 구아니딘 하이드로클로라이드 및 폴딩 완충제를 포함한다.
폴리펩티드를 반응 혼합물로부터 분리하기에 적합한 또 다른 무-컬럼 기술은 침전/원심분리이며, 여기서 목적하는 분자는 용액에 남아 있고 원심분리 및 가용성 상의 제거에 의해 단리될 수 있는 반면에, 바람직하지 않은 오염물 중 하나 이상은 침전된다. 이러한 기술은 예를 들어 a) TCEP(0.2 M)로 보충된 2 부피의 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액을 각각의 100 uL 결찰 혼합물에 첨가하고, b) 반응 생성물을 50 uL의 33% 아세트산에 의해 산성화시키고, c) 4 mL의 2 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액을 첨가하여 MPAA 제거제를 침전시키고, d) 반응 생성물을 2000 g에서 5분 동안 원심분리하고, e) 상청액을 후속 역상 추출을 위해 제거함으로써 수행될 수 있다. 본원에 제공된 침전/원심분리에 의한 정제 방법은 100 uL 반응 부피의 경우에 대한 것이다. 상기 방법을 다른 반응 부피를 사용하도록 변형하는 것이 당업자에 의해 성취될 수 있다.
침전/원심분리에 의한 반응 혼합물로부터 폴리펩티드의 분리는 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 분리는 WO 2020/070587의 [00110]에 기재된 침전 조건을 적합한 용기에서 해당 폴리펩티드를 함유하는 반응 혼합물에 병렬로 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 0.2 mL 튜브, 0.5 mL 튜브, 1.5 mL 튜브, 2 mL 튜브, 15 mL 튜브, 48-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 및 384-웰 플레이트를 포함한다.
폴리펩티드를 반응 혼합물로부터 분리하기 위한 또 다른 적합한 무-컬럼 기술은 투석이다. 투석은 해당 분자를 함유하는 용액(용액 1)을 하나 이상의 다공성 표면을 갖는 용기에 두는 기술이다. 용기의 공극은 kDa 컷-오프에 의해 명시된 크기의 것이다. 해당 분자는 용기에 잔류할 수 있는데, 이는 이것이 kDa 컷-오프에 의해 정의된 공극보다 크기 때문이다. 이어서, 용기를 소정의 부피의 상이한 목적하는 용액(용액 2)에 둔다. 용액 1의 목적하지 않는 용매 및 용질은 삼투의 공정에 의해 공극에 통과시켜 용기를 통과할 수 있고, 마찬가지로, 목적하는 용액 2는 용기 내로 공극을 통해 유동할 수 있다. 이에 따라, 해당 분자는 삼투에 의해 용액 1(예를 들어 결찰 반응)로부터 분리될 수 있다.
투석에 의한 분리에 적합한 용기는 비제한적으로 투석 배관, Slide-A-Lyzer(상표) 투석 카세트(ThermoFisher), Pur-A-Lyzer(상표) 투석 키트(Millipore Sigma) 및 Pierce(상표) 96-웰 마이크로 투석 플레이트(ThermoFisher)를 포함한다.
폴리펩티드 분자의 투석에 적합한 kDa 컷-오프는 비제한적으로 3.5 kDa, 6 kDA, 8 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 14 kDa 및 20 kDa을 포함한다.
투석에 의한 반응 혼합물로부터 폴리펩티드의 분리는 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 분리는 적합한 투석 용기에서 해당 폴리펩티드를 함유하는 반응 혼합물을 병렬로 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 투석 배관, Slide-A-Lyzer(상표) 투석 카세트(ThermoFisher), Pur-A-Lyzer(상표) 투석 키트(Millipore Sigma) 및 Pierce(상표) 96-웰 마이크로 투석 플레이트(ThermoFisher)를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 막 여과에 의해 결찰 반응으로부터 분리된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 병렬로 막 여과에 의해 결찰 반응으로부터 분리된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 침전/원심분리에 의해 결찰 반응으로부터 분리된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 침전/원심분리에 의해 병렬로 결찰 반응으로부터 분리된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 투석에 의해 결찰 반응으로부터 분리된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 투석에 의해 병렬로 결찰 반응으로부터 분리된다.
단백질 폴딩
본 발명은 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 생산 방법을 제공하되, 여기서 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 폴딩된다.
단백질은 4개의 층의 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 단백질의 일차 구조는 이의 선형 아미노산 서열에 의해 암호화된다. 아미노산 사이에 수소결합에 의해 국부화되어 α-나선 및 β-시트로 지칭되는 하위-구조, 뿐만 아니라 랜덤 코일로 공지된 구조화되지 않은 유닛을 형성함으로써 단백질의 이차 구조를 형성한다. 단백질의 삼차 구조는, α-나선, β-시트 및 랜덤 코일을 구형 구조로 3-차원 폴딩시킴으로써 형성된다. 삼차 구로조의 단백질의 폴딩은 수소결합, 염 가교, 소수성 상호작용 및 공유결합 다이설파이드 가교에 의해 야기된다. 최종적으로 단백질의 사차 구조는, 다수의 폴리펩티드 및 기타 비-유기 기의 회합에 의해 형성된다.
본원에 사용된 용어 "폴딩된"은 천연 3-차원 형태의 하나 이상의 단백질 도메인에 해당하는 단백질 또는 단백질의 한 영역을 기재하는 데 사용된다. 천연 3-차원 형태는 상기에 기재된 수준의 단백질 구조를 포함할 수 있다.
임의의 단백질의 생물학적 기능은 이의 3-차원 형태에 의존적이다. 따라서, 합성 단백질의 적절한 폴딩은 이의 생물학적 효과 및 특성을 가능하게 하도록 필요하다. 적합한 조건은 폴리펩티드에 적용되어 정확한 폴딩을 보장해야 한다. 일부 단백질은 수용액에 현탁될 때 정확하게 폴딩될 수 있고, 이러한 단백질의 생산은 폴딩 반응을 포함하는 추가적 단계를 필요로 하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 폴딩 반응을 포함하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 단백질은 천연 형태의 달성을 위해 공유결합 다이설파이드 가교의 형성을 필요로 하고, 이러한 단백질의 생산은 폴딩 반응을 포함하는 추가적 단계를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 폴딩 반응을 포함하는 단계를 포함한다. 일부 단백질의 3-차원 구조에 중요한 공유결합 다이설파이드 가교를 형성하기 위해, 폴딩은 산화성 조건에서 수행되어야 한다.
단백질 폴딩 반응을 위한 완충제는 전형적으로 4개의 주요 성분을 포함한다: (i) 단백질 용해도를 보조하는 제제(카오트로프(chaotrope)), (ii) 반응의 pH를 완충하는 제제, (iii) 다이설파이드 가교의 형성 및 교환을 가능하게 하는 제제(산화환원 쌍), (iv) 표적 단백질의 메티오닌 잔기의 산화를 방지하는 제거제, 및 (v) 종결시 폴딩 반응을 중단시키기 위해 첨가하는 산성화 시약. 성분 (i)의 예는 비제한적으로 구아니딘, 우레아, 메탄올, 트라이플루오로에탄올 및 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함한다. 성분 (ii)의 예는 비제한적으로 Tris 완충제, HEPES 및 CHAPS를 포함한다. 성분 (iii)의 예는 비제한적으로 환원된 글루타티온 및 산화된 글루타티온, 및 시스테인/시스틴을 포함한다. 성분 (iv)의 예는 비제한적으로 메티오닌을 포함한다. 성분 (v)의 예는 비제한적으로 아세트산, 폼산 및 트라이플루오로아세트산을 포함한다. 본 발명에서 병렬로 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 폴딩시키기 위해 산화성 폴딩 조건을 사용하는 폴딩 반응의 예는 비제한적인 예로서 본원 실시예 4에 개시되어 있다.
폴리펩티드 분자의 폴딩은 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 폴딩은 적합한 용기에서 병렬로 해당 폴리펩티드에 폴딩 조건을 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 0.2 mL 튜브, 0.5 mL 튜브, 1.5 mL 튜브, 2 mL 튜브, 15 mL 튜브, 48-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 및 384-웰 플레이트를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 병렬로 적용된 균일한 폴딩 조건을 사용하여 폴딩된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 병렬로 적용된 균일한 산화성 폴딩 조건을 사용하여 폴딩된다.
탈염 및 동결건조
본 발명은 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 생산 방법을 제공하되, 여기서 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 폴딩된 후에 탈염된다.
단백질의 폴딩은 적합한 폴딩 조건을 제공하도록 폴리펩티드가 용액에 현탁되는 것을 필요로 한다. 폴딩 용액의 성분은 단백질 상에서 수행되어 이의 효과 및 특성을 결정하는 하류 분석을 억제할 수 있다. 따라서, 탈염 단계를 수행하여 원치 않거나 유해한 용매 및 용질을 제거하는 것이 유용하다. 탈염에 의해 제거되는 폴딩 용액의 원치 않거나 유해한 성분은 비제한적으로 카오트로프, 대안적 완충제 성분, 대안적 산화환원 쌍 성분, 대안적 제거제, 아세트산, 대안적 산성화제, 트리스 완충제, 메티오닌 및 산화환원 쌍(예컨대 산화된 글루타티온 및 환원된 글루타티온)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "탈염"은 보다 큰 해당 분자를 용액 또는 반응 혼합물에 함유된 보다 작고 원치 않는 염, 용질 및 화학 물질로부터 분리하는 데 사용되는 임의의 기술을 기재하기 위해 사용된다.
폴리펩티드의 탈염은 당분야에 공지된 많은 기술에 의해 수행될 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 탈염을 위해 사용될 수 있다. 탈염을 위해 사용될 수 있는 컬럼 크로마토그래피 중 하나의 형태는 구체적으로 크기 배제 크로마토그래피이고, 여기서 분자를 함유하는 용액은 다공성 비드의 고상을 통과한다(Snyder 2000). 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 작은 용질은 다공성 비드에 의한 이의 잔류로 인해 컬럼을 통과하는 속도가 느려지는 반면에, 목적하는 보다 큰 분자는 빠르게 통과한다. 컬럼을 선택된 용매로 씻어 내리는 것은 분자가 목적하는 최종 용매에 용해된 상태로 컬럼을 퇴장하는 것을 보장한다. 또 다른 컬럼 크로마토그래피 기술은 역상 크로마토그래피이다. 그러나, 본원에 논의된 바와 같이, 컬럼 크로마토그래피는 시간, 비용 및 확장성에 있어서 많은 단점을 갖는다.
폴리펩티드의 탈염은 비제한적으로 막 여과, 무-컬럼 역상 분리 및 투석을 포함하는 당분야에 공지된 많은 무-컬럼 기술에 의해 수행될 수 있다.
폴리펩티드의 탈염은 막 여과 기술에 의해 수행될 수 있다. 이들 기술에서, 해당 분자는 정의된 kDa 컷-오프를 갖는 막 또는 필터에 의해 잔류하는 반면에, 원치 않는 용매 및 용질은 통과하고 폐기된다. 이어서, 잔류하는 목적하는 분자는 막 또는 필터 상에서 세척된 후에, 상기에 기재된 방법에 의해 목적하는 용매에 현탁된다.
폴리펩티드의 탈염에 적합한 막 여과 용기의 예는 비제한적으로 Microcon(등록상표) 튜브(Millipore Sigma), Amicon Ultra 튜브(Millipore Sigma) 및 96-웰 MultiScreen(상표) 필터 플레이트(Millipore Sigma)를 포함한다.
막 여과에 의한 폴리펩티드의 탈염은 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 막 여과에 의한 폴리펩티드의 탈염은 적합한 용기에서 병렬로 해당 폴리펩티드를 함유하는 용액을 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 Microcon(등록상표) 튜브(Millipore Sigma), Amicon Ultra 튜브(Millipore Sigma) 및 96-웰 MultiScreen(상표) 필터 플레이트(Millipore Sigma)를 포함한다.
폴리펩티드의 탈염은 무-컬럼 역상 수지 결합에 의해 수행될 수 있다. 이러한 기술에서, 목적하는 분자를 함유하는 용액을 목적하는 분자를 흡착하는 소수성 수지를 함유하는 웰 또는 컨테이너에 적용한다. 폴리펩티드의 탈염에서 사용하기 위해 적합한 수지는 비제한적으로 Chromabond(등록상표)(Macherey-Nagel)를 포함한다. 목적하는 분자는 수지에 결합된 반면에, 원치 않는 용매 및 용질은 제거될 수 있고, 수지-결합된 분자는 적합한 세척 용액에 의해 1회 이상 세척될 수 있다. 수지 결합된 폴리펩티드를 세척하기 위해 적합한 용액은 비제한적으로 물, 용액 B(90% 아세토니트릴 및 10% 물 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산, 본원 실시예 4에 기재됨)를 포함한다.
무-컬럼 역상 수지 결합에 의한 폴리펩티드의 탈염은 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 무-컬럼 역상 수지 결합에 의한 폴리펩티드의 탈염은 적합한 용기에서 병렬로 해당 폴리펩티드를 함유하는 용액을 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 Chromabond 96-웰 플레이트(Macherey-Nagel), Sep-Pak C18 카트리지(Water) 및 Sep-Pak C18 96-웰 플레이트(Waters)를 포함한다.
본 발명에서 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 탈염시키기 위한 Chromabond(등록상표) 수지의 사용은 본원 실시예 4에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
폴리펩티드의 탈염은 투석 기술에 의해 수행될 수 있다. 투석은 해당 분자를 함유하는 용액(용액 1)을 하나 이상의 다공성 표면을 갖는 용기 내에 두는 기술이다. 용기의 공극은 kDa 컷-오프에 의해 명시된 크기의 것이다. 해당 분자는 용기에 잔류할 수 있는데, 이는 이것이 kDa 컷-오프에 의해 정의된 공극보다 크기 때문이다. 이어서, 용기를 소정 부피의 상이한 목적하는 용액(용액 2)에 둔다. 용액 1의 바람직하지 않은 염 및 용질은 삼투 공정에 의해 공극을 통해 용기로부터 통과할 수 있고, 마찬가지로 목적하는 용액 2는 공극을 통해 용기 내로 유동할 수 있다. 이에 따라, 해당 분자는 용액 1(예를 들어 결찰 반응 생성물)로부터 삼투에 의해 분리될 수 있다.
투석에 의해 폴리펩티드를 탈염시키기에 적합한 용기는 비제한적으로 투석 배관, Slide-A-Lyzer(상표) 투석 카세트(ThermoFisher), Pur-A-Lyzer(상표) 투석 키트(Millipore Sigma) 및 Pierce(상표) 96-웰 마이크로 투석 플레이트(ThermoFisher)를 포함한다.
투석에 의해 폴리펩티드를 탈염시키기에 적합한 kDa 컷-오프는 비제한적으로 3.5 kDa, 6 kDa, 8 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 14 kDa 및 20 kDa을 포함한다.
투석에 의한 폴리펩티드의 탈염은 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 탈염은 적합한 투석 용기에서 병렬로 해당 폴리펩티드를 함유하는 용액을 적용함으로써 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 투석 배관, Slide-A-Lyzer(상표) 투석 카세트(ThermoFisher), Pur-A-Lyzer(상표) 투석 키트(Millipore Sigma) 및 Pierce(상표) 96-웰 마이크로 투석 플레이트(ThermoFisher)를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 막 여과에 의해 탈염된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 막 여과에 의해 병렬로 탈염된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 무-컬럼 역상 수지 결합에 의해 탈염된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 무-컬럼 역상 수지 결합에 의해 병렬로 탈염된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 투석에 의해 탈염된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 투석에 의해 병렬로 탈염된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 탈염 후에 동결건조된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 탈염 후에 병렬로 동결건조된다.
동결건조는 분자가 완전히 건조되어 모든 미량의 액체 용매를 제거하는 공정이다. 이어서, 생산된 동결건조된 분자는 건조 분말 또는 결정으로서 존재한다. 동결건조는 장기간 저장 동안 분자의 안정성을 개선할 수 있다. 또한, 동결건조는 분자의 하류 사용을 간섭할 수 있는 원치 않는 유기 또는 무기 용매를 제거할 수 있다.
폴리펩티드의 동결건조는 예를 들어 해당 폴리펩티드를 함유하는 용액을 동결시킨 후에, 이에 모든 용매가 승화될 때까지 진공을 적용함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에서 병렬로 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 동결건조시키는 것은 본원 실시예 4에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
동결건조 후에, 펩티드는 이의 효과 및 특성의 하류 분석에 적합한 용매 또는 완충제 용액에 재현탁될 수 있다. 적합한 용매는 비제한적으로 물, 포스페이트-완충된 염수, 세포 배양 배지, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸설폭사이드 용액, 에탄올 용액, 메탄올 용액, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 용액, 또는 살아있는 세포에 대한 분석 및/또는 생체 분자를 수반하는 무세포 분석과 양립성인 임의의 완충된 수용액을 포함한다.
폴리펩티드의 동결건조는 병렬로 예를 들어 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96, 192, 288 또는 384개 이상의 군으로 수행될 수 있다. 동결건조는 적합한 용기에서 병렬로 해당 폴리펩티드를 함유하는 용액을 비제한적인 예로서 본원 실시예 4에 개시된 동결건조 조건을 적용함으로서 병렬로 수행될 수 있다. 이러한 용기는 비제한적으로 0.2 mL 튜브, 0.5 mL 튜브, 1.5 mL 튜브, 2 mL 튜브, 15 mL 튜브, 48-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 및 384-웰 플레이트를 포함한다.
평가 및 분석
본 발명은 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 효과 및 특성을 평가하는 방법을 제공하되, 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 병렬 결찰, 분리, 폴딩 및 탈염에 의해 생산된다.
또한, 본 발명은 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 효과 및 특성을 평가하는 방법을 제공하되, 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자는 병렬 결찰, 분리, 폴딩, 탈염 및 동결건조에 의해 생산된다.
동결건조된 폴리펩티드는 이의 효과 및/또는 특성의 후속 평가에 적합한 용매에 재현탁될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 하류 분석을 위해 동결건조된 펩티드를 현탁하기에 적합한 용매는 비제한적으로 물, 포스페이트-완충된 염수, 세포 배양 배지, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸설폭사이드 용액, 에탄올 용액, 메탄올 용액, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 용액을 포함한다.
세포에 대한 폴리펩티드의 효과는 상기 폴리펩티드를 세포에 접촉시킴으로써 측정될 수 있다. 폴리펩티드를, 해당 폴리펩티드를 세포 배지 내로 혼합시켜 폴리펩티드를 용액으로 제공함으로써 세포에 접촉시킬 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 세포 배양 플레이트, 세포 배양플레이트의 웰 또는 기타 적합한 용기의 표면에 흡착되어 세포에 접촉시키기 위한 폴리펩티드-코팅된 표면을 제공할 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 비제한적으로 폴리스티렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 및 혼합된 셀룰로스 에스터를 포함하는 특정 물질로 이루어진 용기의 표면에 흡착될 수 있다.
세포를 해당 폴리펩티드에 병렬로 접촉시키기에 적합한 세포 배양 용기는 비제한적으로 6-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 128-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 및 세포 배양 접시를 포함한다.
세포를 해당 폴리펩티드에 접촉시킨 후에, 상기 세포에 대한 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 효과를 당분야에 공지된 많은 분석에 의해 평가할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 분석은 비제한적으로 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 바이러스 복제 분석, 형광성 또는 색소성 리포터 유전자 분석, 단백질-단백질 상호작용에 대한 FRET- 또는 BRET-기반 리포터 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석, 효소 상보성 분석, 이차 메신저 분석, 수용체 신호전달 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석을 포함한다.
본 발명에 의해 평가될 수 있는 세포에 대한 폴리펩티드의 유용한 효과는 리간드 또는 수용체에 대한 결합, 리간드 또는 수용체 차단, 세포 자극, 세포 사멸 및 세포 조절을 포함한다. 분자의 바람직한 의학적 효과는 비제한적으로 박테리아 사멸, 바이러스 불능화, 암 세포 사멸, 세포 증식 억제, 질병 경로 억제 및 건강 경로 기능의 회복을 포함한다.
세포에 대한 복수의 구조적 변이 폴리펩티드의 하나 이상의 효과를 결정하는 세포 융합 분석의 사용은 본원 실시예 5에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
세포에 대한 복수의 구조적 변이 폴리펩티드의 하나 이상의 효과를 결정하는 수용체 신호전달의 사용은 본원 실시예 6에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
세포에 대한 복수의 구조적 변이 폴리펩티드의 하나 이상의 효과를 결정하는 수용체의 내재화를 측정하는 분석의 사용은 본원 실시예 7에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
세포에 대한 복수의 구조적 변이 폴리펩티드의 하나 이상의 효과를 측정하는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 리포터 분석의 사용은 본원 실시예 7에서 비제한적인 예로서 개시되어 있다.
본 발명에서 폴리펩티드의 효과 및/또는 특성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 세포는 비제한적으로 일차 진핵 세포, 형질전환된 진핵 세포, 불멸 진핵 세포, 암 세포, 생체외 세포 및 원핵 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 림프구 또는 백혈구이다. 한 실시양태에서, 세포는 복수의 구조적 변이 폴리펩티드와 상호작용하는 표적 분자를 발현하는 유전자 변형된 세포이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상기에 기재된 임의의 방법에 의해 병원체에 접촉하여 병원체와 관련하여 상기 폴리펩티드의 효과 및/또는 특성을 측정할 수 있음이 고려된다. 폴리펩티드에 접촉할 수 있는 병원체는 비제한적으로 바이러스, 예컨대 HIV, HPV, MCV, 인플루엔자, 에볼라, 미즐즈(Measles); 박테리아, 예컨대 스타필로코커스(Staphylococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 슈도모나스(Pseudomonas); 및 기생충, 예컨대 플라스모듐, 톡소플라즈마 및 크립토포리듐을 포함한다.
폴리펩티드의 특성은 당분야에 공지된 기술에 의해 평가될 수 있다. 폴리펩티드의 특성을 평가하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 기술은 비제한적으로 방사성 리간드 결합 분석, 공-면역 침전, 생체 분자 형광 상보성, 친화도 전기영동, 표지 이동, 탠덤 친화도 정제, 근접성 결찰 분석, 이중 분극 간섭 측정, 정적 광 산란, 동적 광 산란, 유동-유도된 분산액 분석, ELISA, ELISPOT, 표면 플라스몬 공명, 침전 적정 및 단백질 어레이 분석을 포함한다.
평가를 위한 폴리펩티드의 유용한 특성은 비제한적으로 개선된 안정성, 개선된 가용성, 감소된 독성, 및 특정 리간드 또는 수용체에 대한 증가되거나 감소된 결합을 포함한다.
본 발명의 실시양태
본 발명의 비제한적인 예시적 실시양태는 하기를 포함한다:
1. a. 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계;
b. 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계;
c. 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계;
d. 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬의 별개의 폴딩 반응으로 폴딩하여 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계; 및
e. 조건을 상기 별개의 폴딩 반응에 병렬로 적용하여 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 폴딩 반응으로부터 분리하는 단계
를 포함하는 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법.
2. 실시양태 1에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계가 무-컬럼으로 수행되는, 방법.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 결찰 반응이 용액 내 SEA 천연 펩티드 결찰을 포함하는, 방법.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용된 조건이 무-컬럼 분리를 포함하는, 방법.
5. 실시양태 4에 있어서, 무-컬럼 분리가 막 여과를 포함하는, 방법.
6. 실시양태 4에 있어서, 무-컬럼 분리가 침전/원심분리를 포함하는, 방법.
7. 실시양태 4에 있어서, 무-컬럼 분리가 투석을 포함하는, 방법.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 폴딩이 균일 폴딩 조건을 포함하는, 방법.
9. 실시양태 8에 있어서, 균일 폴딩 조건이 산화성 폴딩을 포함하는, 방법.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 별개의 폴딩 반응 각각에 병렬로 적용된 조건이 무-컬럼 분리를 포함하는, 방법.
11. 실시양태 10에 있어서, 무-컬럼 분리가 막 여과를 포함하는, 방법.
12. 실시양태 10에 있어서, 무-컬럼 분리가 역상 수지 결합을 포함하는, 방법.
13. 실시양태 10에 있어서, 무-컬럼 분리가 투석을 포함하는, 방법.
14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단계 e 후에 병렬로 동결건조되는, 방법.
15. 실시양태 14에 있어서, 동결건조된 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 동결건조 후에 용매에 의해 현탁되는, 방법.
16. 실시양태 15에 있어서, 용매가 물, 포스페이트-완충된 염수, 세포 배양 배지, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸설폭사이드 용액, 에탄올 용액, 메탄올 용액, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 모든 병렬 단계가 무-컬럼으로 수행되는, 방법.
18. a. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계;
b. 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 별개로 병렬로 세포에 접촉시키는 단계; 및
c. 상기 세포에 대한 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 결정하는 단계
를 포함하는 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 병렬로 결정하는 방법.
19. 실시양태 18에 있어서, 세포가 박테리아, 일차 진핵 세포, 형질전환된 진핵 세포 및 불멸 진핵 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
20. 실시양태 18 또는 19에 있어서, 하나 이상의 효과가 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석을 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
21. a. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계; 및
b. 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 특성을 결정하는 단계
를 포함하는 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 병렬로 결정하는 방법.
22. 실시양태 21에 있어서, 하나 이상의 특성이 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석을 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자이 복수의 구조적 변이 영역이 고상 펩티드 합성에 의해 생산되는, 방법.
24. 실시양태 23에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Fmoc 화학을 포함하는, 방법.
25. 실시양태 23에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Boc 화학을 포함하는, 방법.
26. 실시양태 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 병렬 펩티드 합성기를 사용하여 멀티-웰 플레이트에서 고상 펩티드 합성에 의해 병렬로 생산되는, 방법.
27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 고상 펩티드 합성에 의해 생산되는, 방법.
28. 실시양태 27에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Fmoc 화학을 포함하는, 방법.
29. 실시양태 27에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Boc 화학을 포함하는, 방법.
30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 구조적 변이 영역이 무-태그인, 방법.
31. 실시양태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 무-태그인 방법.
32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 분자의 구조적 변이 영역이 아미노산 유사체를 포함하는, 방법.
33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 아미노산 유사체를 포함하는, 방법.
34. 실시양태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단백질인, 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 단백질이 단백질 유사체인, 방법.
36. 실시양태 34에 있어서, 단백질이 시토카인인, 방법.
37. 실시양태 36에 있어서, 시토카인이 시토카인 유사체인, 방법.
38. 실시양태 34에 있어서, 단백질이 케모카인인, 방법.
39. 실시양태 38에 있어서, 케모카인이 케모카인 유사체인, 방법.
40. a. 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계;
b. 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계; 및
c. 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계
를 포함하는 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법.
41. 실시양태 40에 있어서, 단계 c 후에,
d. 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬의 별개의 폴딩 반응으로 폴딩하여 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계; 및
e. 조건을 상기 별개의 폴딩 반응에 병렬로 적용하여 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 폴딩 반응으로부터 분리하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
42. 실시양태 40 또는 41에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계가 무-컬럼으로 수행되는, 방법.
43. 실시양태 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 결찰 반응이 용액 내 SEA 천연 펩티드 결찰을 포함하는, 방법.
44. 실시양태 40 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용된 조건이 무-컬럼 분리를 포함하는, 방법.
45. 실시양태 44에 있어서, 무-컬럼 분리가 막 여과를 포함하는, 방법.
46. 실시양태 44에 있어서, 무-컬럼 분리라 침전/원심분리를 포함하는, 방법.
47. 실시양태 44에 있어서, 무-컬럼 분리가 투석을 포함하는, 방법.
48. 실시양태 41 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 폴딩이 균일 폴딩 조건을 포함하는, 방법.
49. 실시양태 48에 있어서, 균일 폴딩 조건이 산화성 폴딩을 포함하는, 방법.
50. 실시양태 41 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 별개의 폴딩 반응 각각에 병렬로 적용된 조건이 무-컬럼 분리를 포함하는, 방법.
51. 실시양태 50에 있어서, 무-컬럼 분리가 막 여과를 포함하는, 방법.
52. 실시양태 50에 있어서, 무-컬럼 분리가 역상 수지 결합을 포함하는, 방법.
53. 실시양태 50에 있어서, 무-컬럼 분리가 투석을 포함하는, 방법.
54. 실시양태 41 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단계 e 후에 병렬로 동결건조되는, 방법.
55. 실시양태 40 및 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단계 c 후에 병렬로 동결건조되는, 방법.
56. 실시양태 54 또는 55에 있어서, 동결건조된 폴리펩티드 분자가 동결건조 후에 용매에 의해 현탁되는, 방법.
57. 실시양태 56에 있어서, 용매가 물, 포스페이트-완충된 염수, 세포 배양 배지, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸설폭사이드 용액, 에탄올 용액, 메탄올 용액, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 용액을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
58. 실시양태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 모든 병렬 단계가 무-컬럼으로 수행되는, 방법.
59. a. 실시양태 40, 42 내지 47, 및 55 내지 58 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계;
b. 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 별개로 병렬로 세포와 접촉시키는 단계; 및
c. 상기 세포에 대한 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 결정하는 단계
를 포함하는 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 병렬로 결정하는 방법.
60. a. 실시양태 41 내지 58 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계;
b. 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 별개로 병렬로 세포에 접촉시키는 단계; 및
c. 상기 세포에 대한 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 결정하는 단계
를 포함하는 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 병렬로 결정하는 방법.
61. 실시양태 59 또는 60에 있어서, 세포가 박테리아, 유전자 변형된 진핵 세포, 일차 진핵 세포, 형질전환된 진핵 세포 및 불멸 진핵 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
62. 실시양태 59 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 효과가 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석을 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
63. a. 실시양태 40, 42 내지 47, 및 55 내지 58 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계; 및
b. 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 특성을 결정하는 단계
를 포함하는 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 병렬로 결정하는 방법.
64. a. 실시양태 41 내지 58 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계; 및
b. 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 특성을 결정하는 단계
를 포함하는 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 병렬로 결정하는 방법.
65. 실시양태 63 또는 64에 있어서, 하나 이상의 특성이 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석을 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
66. 실시양태 40 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 고상 펩티드 합성에 의해 생산되는, 방법.
67. 실시양태 66에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Fmoc 화학을 포함하는, 방법.
68. 실시양태 66에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Boc 화학을 포함하는, 방법.
69. 실시양태 66 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 병렬 펩티드 합성기를 사용하여 멀티-웰 플레이트에서 고상 펩티드 합성에 의해 병렬로 생산되는, 방법.
70. 실시양태 40 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 고상 펩티드 합성에 의해 생산되는, 방법.
71. 실시양태 70에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Fmoc 화학을 포함하는, 방법.
72. 실시양태 70에 있어서, 고상 펩티드 합성이 Boc 화학을 포함하는, 방법.
73. 실시양태 40 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 구조적 변이 영역이 무-태그인, 방법.
74. 실시양태 40 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 무-태그인, 방법.
75. 실시양태 40 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 분자의 구조적 변이 영역이 아미노산 유사체를 포함하는, 방법.
76. 실시양태 40 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 아미노산 유사체를 포함하는, 방법.
77. 실시양태 40 내지 76 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단백질인, 방법.
78. 실시양태 40, 42 내지 47, 55 내지 59, 61 내지 63, 및 65 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단백질인, 방법.
79. 실시양태 77 또는 78에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 단백질의 한 영역에 해당하고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 동일한 단백질의 한 영역에 해당하는, 방법.
80. 실시양태 77 또는 78에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 제1 단백질의 한 영역에 해당하고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 제2 단백질의 한 영역에 해당하는, 방법.
81. 실시양태 77 또는 78에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 인공 폴리펩티드이고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 단백질의 한 영역에 해당하는, 방법.
82. 실시양태 77 또는 78에 있어서, 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 단백질의 한 영역에 해당하고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 인공 폴리펩티드인, 방법.
83. 실시양태 77 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 단백질이 단백질 유사체인, 방법.
84. 실시양태 77 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 단백질이 시토카인인, 방법.
85. 실시양태 84에 있어서, 시토카인이 시토카인 유사체인, 방법.
86. 실시양태 77 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 케모카인인, 방법.
87. 실시양태 86에 있어서, 케모카인이 케모카인 유사체인, 방법.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1 - RANTES/CCL5의 불변 코어 단편의 배취식 합성
RANTES/CCL5의 공통의 구조적 불변 영역을 제공하기 위해, C-말단 단편, RANTES(11-68)의 대형 배취를 고상 펩티드 합성에 의해 합성하였다. RANTES(11-68)는 RANTES/CCL5의 복수의 N-말단 구조적 변이 영역을 사용한 하류 병렬 결찰 반응을 위해 사용되는 유사체의 패널에 걸쳐 변하지 않는 코어 단편으로 구성되었다.
코어 케모카인 단편 RANTES(11-68)의 2개의 배취를 생산하였다. 코어 단편 배취 1을, ABI 433 펩티드 합성기 상에서 Boc 화학을 사용하여 RANTES/CCL5(34-68) 단편을 합성하고 Prelude(등록상표) 합성기 상에서 Fmoc 화학을 사용하여 RANTES/CCL5(11-33)-C-말단 티오에스터 단편을 합성함으로써 생산하였다. 이어서, RANTES/CCL5(34-68) 단편 및 RANTES/CCL5(11-33)-C-말단 티오에스터 단편을 천연 화학 결찰에 의해 연결하여 RANTES(11-68) 코어 단편 배취 1을 생산하였다. 코어 단편 배취 2를, Prelude(등록상표) 합성기 상에서 Fmoc 화학을 사용하여 전장 단편을 합성함으로써 생산하였다. 합성 후에, 둘 모두의 배취를 Vydac(등록상표) 250 x 22 mm C8 컬럼을 갖춘 Waters1525 시스템을 사용하여 역상 HPLC(RP-HPLC)에 의해 정제하고 AB Sciex 4800 MALDI TOF/TOF(상표) 질량 분석계(선형 양성 모드, 2,5-다이하이드록시벤조산을 매트릭스로서 사용) 상에서 MALDI MS 분석에 적용하였다.
코어 단편 배취 1의 MALDI MS 분석은 표적 생성물의 것(예측된 질량 6812 Da, 관찰된 질량 6806 Da)에 부합하는 질량을 나타냈다. 코어 단편 배취 2의 MALDI MS 분석은 산화된 메티오닌 잔기를 갖는 표적 생성물(예측된 질량 6828 Da)에 부합하는 질량(6832 Da)을 나타냈다. 이러한 단편에서 Met67로부터 Met67(O)로의 완전한 산화는 트립신 분해 펩티드의 MALDI MS 분석에 의해 확인되었다.
실시예 2 - RANTES/CCL5의 N-말단 구조적 변이 영역의 병렬 플레이트-기반 합성
RANTES/CCL5의 복수의 구조적 변이 영역을 제공하기 위해, 96개의 RANTES/CCL5 유사체의 군의 잔기 0 내지 10에 상응하는 96개의 N-말단-SEA 펩티드를 병렬 합성 플레이트 상에서 개별적 웰에서 병렬로 합성하였다. 이들 펩티드는 RANTES/CCL5의 C-말단 코어 단편을 사용하는 하류 병렬 결찰 반응에서 사용되는 변이 영역으로 구성되었다.
절단으로 웰내 천연 화학 결찰 단계에 필요한 C-말단 티오에스터 포맷의 단편을 수득하도록, 이전에 식별된 RANTES/CCL5 유사체의 세트의 N-말단 잔기 잔기 0 내지 10에 상응하는 단편(Gaertner 2008)을 이전에 기재된 방법(Ollivier 2010)에 의해 생산한 비스(2-설판일에틸)아미노(SEA) 수지를 사용하여 2 μmol 규모에서 Intavis MultiPep RSi 384-웰 펩티드 합성기 상에서 합성하였다. 수지 절단 후에, 각각의 웰의 미가공 생성물을 1% TFA를 함유하는 500 μL 물/아세토니트릴(1:1)에 용해시켰다. 추정된 0.6 μmol 펩티드(150 μL)에 상응하는 부피의 용액을 2 mL 딥웰 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에 옮기고 동결건조시켰다. 변이 영역 펩티드를 병렬로 무-컬럼으로 생산하였다.
96개의 반응 중 87개가 예측된 질량을 갖는 펩티드에 해당하는 생성물을 산출하였고, 9개의 합성이 캡핑된 절단된 펩티드에 해당하는 생성물을 산출하였다(표 1).
실시예 3 - RANTES/CCL5의 코어 단편의 변이 영역의 병렬 웰내 결찰, 및 크기 배제
복수의 완전한 변이 RANTES/CCL5 유사체를 생산하기 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산한 C-말단 코어 단편[RANTES/CCL5(11-68)]과 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산한 각각의 변이 영역 N-말단 SEA-티오에스터 펩티드[RANTES/CCL5(0-10)] 사이의 웰내 천연 화학 결찰 반응을 딥웰 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 병렬로 수행하였다. 51개의 결찰은 코어 단편 배취 1을 사용하였고, 36개의 결찰은 코어 단편 배취 2를 사용하여 총 87개의 RANTES/CCL5 유사체를 생산하였다.
웰내 천연 화학 결찰을, 87개의 반응 각각에서 C-말단 코어 단편(0.1 μmol)에 비해 6-배 과량(0.6 μmol)으로 추정된 변이 영역 N-말단 SEA 단편을 사용하여 병렬로 수행하였다. 코어 단편의 1 mM 용액을 결찰 완충제(0.2 M 인산 나트륨 완충제, pH 7.2, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 50 mM 메티오닌, 0.1 M 4-머캅토페닐아세트산 및 0.1 M 트리스(2-카복시에틸)포스핀 함유)에서 생산하고, 및 상기 용액 100 μL를 동결건조된 미가공 변이 영역 N-말단 SEA 단편 합성 생성물을 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 반응 혼합물을 밤새 37℃에서 교반하였다.
결찰 후에, 과량의 미반응 N-말단 펩티드 및 결찰 완충제의 나머지 구성성분(티올 제거제를 포함함)을 병렬 크기 배제 단계를 사용하여 제거하였다. 웰의 결찰 혼합물을, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드의 용액으로 사전에 적신 kDa 컷-오프 막을 갖는 Millipore Microcon(등록상표) 튜브에 적용하였다. 이어서, 튜브를 10분 동안 14000 x g에서 원심분리하고, 통과액을 폐기하였다. 3회의 세척 단계를, 150 μL 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액을 적용하고 10분 동안 14000 x g에서 원심분리함으로써 수행한 후에, 여과 잔류물을 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 용해된 0.28 M 트리스(2-카복시에틸)포스핀의 용액 50 μL (pH 5.3)로 보충시키고 주위 온도에서 30분 동안 교반 없이 방치하였다. 8회의 추가적 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액 세척 단계를 수행한 후에, 여과 잔류물(100 μL)을, Microcon(등록상표) 튜브 인서트를 뒤집고 이를 제조사에 의해 제공된 받아들이는 튜브 위에 둔 후에, 1000 x g에서 4분 동안 원심분리함으로써 회수하였다.
실시예 4 - 결찰된 RANTES/CCL5 폴리펩티드 유사체의 병렬 폴딩, 탈염 및 동결건조
복수의 폴딩된 RANTES/CCL5 유사체를 생산하기 위해, 실시예 3에 기재된 바와 같이 생산된 85개의 결찰되고 크기 배제된 RANTES/CCL5 폴리펩티드 유사체를 딥웰 96-웰 플레이트에서 웰내 폴딩 단계 및 최종 웰내 탈염 단계에 병렬로 적용하였다.
결찰된 물질의 폴딩을 1.2 mL의 폴딩 완충제(2 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.1 M 트리스 염기, 0.5 mM 환원된 글루타티온, 0.3 mM 산화된 글루타티온, 10 mM 메티오닌, pH 8.0)를 직접 RANTES/CCL5 유사체 각각에 병렬로 딥웰 96-웰 플레이트에서 첨가한 후에, 혼합물을 주위 온도에서 3일 동안 교반 없이 방치함으로써 수행하였다.
탈염을 위해, 폴딩 반응 생성물을 폴딩 반응 생성물 각각에 50 μL의 아세트산(33% v/v)을 병렬로 첨가함으로써 산성화시킨 후에, 각각의 반응 생성물을 3개의 45 μL의 분액으로 나누고 2 mL 딥웰 96-웰 폴리프로필렌 플레이트의 웰에 두었다. 900 μL의 2 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 각각의 웰에 병렬로 첨가하고, 웰내용물을 C18 Chromabond(등록상표) 수지(Machery-Nagel, 130 mg/웰)로 충전되고 500 μL의 아세토니트릴로 사전 처리되고 5% 용매 B(90% 아세토니트릴 중 및 10% 물 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산) 및 95% 용매 A(물 중의 0.1% 트라이플루오로아세트산)의 2회 세척(500 μL)에 의해 평형시킨 프릿화된 96-웰 플레이트 내로 옮겼다. 웰의 수지를 500 μL의 5% 용매 B를 사용하여 4회 세척하고 2개의 200 μL 부피의 50% 용매 B 혼합물을 사용한 후에 하나의 200 μL 부피의 90% 용매 B를 사용하여 회수용 딥웰 플레이트 내로 용리시켰다.
탈염 후에, 용리액을 동결건조시켰다. 용리액을 밤새 딥웰 96-웰 플레이트에서 동결시키고, 플레이트를 딥웰 플레이트와 호환성인 speedvac(상표) 회전자(Savant(상표) SVC 200, ThermoFisher)에 두고 2000 g에서 밤새 진공에서 회전시켰다.
최종 생성물(복수의 변이형의 폴딩된 RANTES/CCL5 유사체)을 특성규명하기 위해, 동결건조된 RANTES/CCL5 유사체를 250 μL의 물에 용해시키고, 0.5 μL의 샘플을 AB Sciex 4800 MALDI TOF/TOF(상표) 질량 분석계(선형 양성 모드, 2,5-다이하이드록시벤조산을 매트릭스로서 사용) 상에서의 MALDI MS 분석을 위해 취하고, 2.5 μL의 샘플을 Alliance 2695 시스템(Waters) 및 nucleosil(등록상표) C8-300-5 컬럼(Machery Nagel)을 사용하는 RP-HPLC 분석(구배: 1분 당 1%, 10% 내지 70% 용매 B/용매 A)을 위해 취하였다.
임의의 크로마토그래피 정제 단계의 부재에도 불구하고, MALDI MS 분석은, 병렬의 웰내 결찰 및 폴딩 반응 모두가 (i) 폴딩된 표적 생성물의 것에 해당하는 단일의 관찰된 질량(코어 단편 배취 1을 사용한 반응, 표 2A), (ii) Met67(O)을 포함하는 폴딩된 표적 생성물의 것에 해당하는 단일의 관찰된 질량(코어 단편 배취 2를 사용한 반응의 하위 세트, 표 2B), 또는 (iii) 2개의 관찰된 질량(폴딩된 표적 생성물의 것에 해당하는 하나, 및 Met67(O)를 포함하는 폴딩된 표적 생성물의 것에 해당하는 나머지 하나(코어 단편 배취 2를 사용한 반응의 나머지, 표 2B))을 갖는 생성물을 산출하였음을 나타냈다.
유사하게, RP-HPLC에 의한 분석은 단일의 주요 피크(코어 단편 배취 1을 사용한 반응, 도 2, 2a 및 2b) 또는 2개의 주요 피크(코어 단편 배취 2, 예를 들어 2P14-RANTES, 8P2-RANTES를 사용한 반응, 도 3 및 3a)를 나타냈다. 2개의 대표적 웰(2P14-RANTES 및 8P2-RANTES)에서 이중 주요 피크의 추가적 분석은, 둘 모두의 경우에서, 보다 긴 체류 시간을 갖는 피크가 표적 단백질의 것에 부합하는 질량을 갖고, 보다 짧은 체류 시간을 갖는 피크가 단일의 산화된 메티오닌(Met67(O))을 포함하는 표적 단백질의 것에 부합함을 나타낸다(도 4). 이러한 합성에서 전적으로 Met67(O) 코어 단편 배취 2로부터 유래된 산화되지 않은 Met67을 갖는 생성물은 짐작건대 결찰 반응에서 사용된 환원 조건 하에 산화된 Met67(O) 잔기의 부분적 환원의 결과이다.
예비 분석에서 다양한 품질의 합성을 나타내는 6개의 선택된 웰(5P12-RANTES, 7P1-RANTES, 5P6-RANTES 5P7-RANTES, 5P2-RANTES 및 6P9-RANTES)을 RP-HPLC에 의한 추가적 분석에 적용하였다. 주요 피크의 체류 시간을 상응하는 기준 표준 케모카인의 것과 비교하였다(도 5). 코어 단편 배취 1을 사용하는 합성의 경우, 각각의 경우의 단일의 주요 피크는 기준 표준 샘플의 것에 부합하는 용리 프로필을 가졌다. 코어 단편 배취 2를 사용한 합성의 경우, 이중의 주요 피크가 분명한 경우에서(5P12-RANTES 및 7P1-RANTES), 보다 긴 체류 시간을 갖는 피크는 기준 표준 샘플의 것에 부합하는 용리 프로필을 가졌다. 단지 단일의 주요 피크가 분명한 경우에서(5P6-RANTES), 이의 체류 시간은 기준 표준 샘플의 것에 부합하지 않았으나 Met67(O) 변이체의 감소된 체류 시간 특징을 가졌다. 숄더 피크는 기준 표준 샘플의 것에 부합하는 체류 시간을 나타냈고, 이는 산화되지 않은 Met67 변이체가 부수적 생성물로서 존재하였음을 나타낸다.
이러한 병렬 합성의 수율의 범위를 추정하기 위해, 고 수율(예를 들어 7P1-RANTES, 5P7-RANTES) 및 저 수율(예를 들어 5P6-RANTES, 5P2-RANTES) 모두를 제공하는 합성에 포함되는 6개의 선택된 웰(5P12-RANTES, 7P1-RANTES, 5P6-RANTES 5P7-RANTES, 5P2-RANTES 및 6P9-RANTES)을 HPLC 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하여 피크 면적을 기반으로 표적 생성물에 해당하는 피크의 정제율을 추정하였다. RANTES/CCL5의 C-말단의 변형이 약리학 활성에 영향을 미치지 않기 때문에(Escola 2010), Met67(O) 동종체에 해당하는 피크는 웰 당 최종 수율을 추정할 때 총 표적 생성물 수율의 부분으로서 간주되었다. 6개의 웰에 대해, 또한 웰의 내용물을 250 μL의 물에 용해시키고 280 nm에서 흡광도를 측정하하여 유사체의 예측된 흡광 계수의 사용하여 총 단백질 함량을 추정하였다.
6개의 웰의 군의 웰내 결찰 및 폴딩 절차 순도는 범위 17 내지 56%에 걸쳐 있는 표적 단백질 순도를 제공하고, 이는 C-말단 표적 단편에 관하여 약 7 내지 14%의 수율에 해당한다. 250 μL의 물에 용해된 웰 내용물에 대하여, 표적 단백질의 추정 농도는 26 내지 56 μM 범위였다(표 3). 이러한 농도는 분석용 RP-HPLC 추적(도 2, 2a 및 2b)이 최저 수준의 순도 및 수율을 나타내는 특정 웰 혼합물(예를 들어 M44-RANTES, 7P19-RANTES, M23-RANTES)에 대해 과대 추정치이기 쉽다는 점에 주목하여 50 μM의 공칭 농도가 각각의 표적 단백질에 대해 정의되었다.
실시예 5 - 세포 융합 분석에 의한 RANTES/CCL5 유사체의 항-HIV 효능의 평가
실시예 4에 기재된 방법에 의해 생산한 RANTES/CCL5 유사체의 약리학 활성을 R5-의존성 외피 중재 세포 융합 분석을 사용하여 결정하였다. R5-향성 외피-의존성 세포 융합 분석을 HeLa-P5L(Simmons 1997) 및 HeLa-Env-ADA(Pleskoff 1997) 세포주를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이(Hartley 2004; Gaertner 2008; Cerini 2008) 수행하였다.
각각의 케모카인 유사체를 세포 융합 분석을 사용하여 각각의 화합물을 4개의 추정 농도(1 nM, 4.6 nM, 21.5 nM 및 100 nM) 각각에서 세포 융합을 차단하는 이의 능력에 대해 점수를 매겨 항-HIV 효능을 시험하였다. 화합물을 5개의 군으로 나누었다: 1: 임의의 농도에서 완전한 억제를 달성하지 않음; 2: 최고 농도(100 nM)에서만 완전한 억제를 달성함; 3: 2개의 최고 농도(21.5 nM 및 100 nM)에서 완전한 억제를 달성함; 4: 3개의 농도(4.6 nM, 21.5 nM 및 100 nM)에서 완전한 억제를 달성함; 및 5: 4개 모두의 농도에서 완전한 억제를 달성함(도 6A). 병렬 합성된 유사체를 이러한 방식으로 항-HIV 효능 군으로 나누고 앞선 연구에서(Gaertner 2008) 상응하는 기준 표준 케모카인 유사체를 사용하여 수득한 pIC50 값과 비교하였을 때, 타당한 상호관계를 수득하였고(도 6B), 군 1 내지 5의 유사체는 각각 범위 7.2 내지 8.2, 7.8 내지 9.6, 8.6 내지 10.0, 9.4 내지 10.7 및 10.0 내지 11.0에 걸친 원래 연구의 pIC50 값에 상응하였다. 이는 실시예 4에서 기재된 방법에 의해 생산한 병렬 합성된 케모카인 유사체를 스크리닝하는 것이, 패널로부터 가장 강한 항-HIV 케모카인 유사체를 식별하고 합리적으로 높은 해상도에서 덜 강한 유사체를 층화하는 데 충분하다는 것을 나타낸다.
실시예 6 - CCR5 작용제 분석에 의한 RANTES/CCL5 유사체의 평가
실시예 4에 기재된 방법에 의해 생산한 RANTES/CCL5 유사체의 약리학 활성을 칼슘 플럭스 분석을 사용하여 CCR5 작용제 활성(안전성 관점으로부터 바람직하지 않은 특징)을 측정함으로써 결정하였다. 이러한 분석에서, HEK-CCR5 세포를 사용하였다. 안정하게 형질도입된 클론 인간 배아 신장 293(HEK) 세포주를 렌티 바이러스 벡터에 의한 형질도입에 의해 수득한 후에(Hartley 2004), 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의한 클론 선택이 뒤따랐다. 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM)에서 유지하였다.
HEK-CCR5 세포를, 10 μg/ml의 폴리오르니틴으로 사전 처리된(37℃, 1시간) 384-웰 플레이트에서 밤새 시딩하였다(20,000 세포/웰). 이어서, 세포를 제조사의 권고에 따라 Fluo4-AM(Invitrogen)과 함께 적재하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 세척하고 분석 완충제(143 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% 글루코스, 20 mM HEPES, pH 7.4)에서 배양하였다. Ca2+-의존 형광 측정을 FDSS 384-웰 플레이트 리더(Hammamatsu) 상에서 수행하였다. 분자를, PSC-RANTES가 최대 신호를 내는 단일 농도(300 nM)에서 스크리닝하였다(n=4)((2)Gaertner 2008). 신호전달 활성을, 300 nM 5P12-RANTES 기준 표준(백그라운드 신호전달)에 대해 수득한 값을 감한 후에, 300 nM PSC-RANTES 기준 표준(최대 신호전달)에 대해 수득한 값에 대한 백분율로서 표현하였다.
병렬 합성된 케모카인 유사체의 패널을 이전에 기재된 바와 유사한(Gaertner 2008), 플레이트-기반 G 단백질 신호전달 분석에 대해 시험하였으나, 여기서 CCR5는 HeLa 세포 백그라운드 대신에 인간 배아 신장(HEK) 세포 백그라운드에서 발현되었다. 화합물을 단일 Emax 농도(300 nM)에서 시험하고, 수득한 신호를 CCR5 과작용제 PSC-RANTES(100% 신호전달) 및 비-신호전달 리간드 5P12-RANTES(0% 신호전달)의 기준 표준 샘플을 사용한 동일한 실험에서 수득한 신호에 대한 백분율로서 표현하였다. 이러한 규모로 표현하였을 때(도 7), 화합물은 -5% 내지 200%의 활성 범위를 가졌다. 화합물을 3개의 군으로 나누었다: 저 신호전달 또는 신호전달 없음(0 내지 25% 신호), 중간 신호전달(25 내지 100% 신호) 및 고 신호전달(100% 신호 초과). 이러한 방식으로 나누고 이전에 식별된 상응하는 기준 표준 케모카인 유사체를 사용하여(Gaertner 2008) 수득한 Emax와 비교하였고, 타당한 상호관계를 수득하였다(도 8). 이는, 실시예 4에 기재된 방법에 의해 생산한 병렬 합성된 케모카인 유사체를 G 단백질 신호전달에 대해 스크리닝하는 것이 병렬 합성된 케모카인 유사체를 비-신호전달, 중간 신호전달 및 고 신호전달 군으로 적절한 정확성으로 층화하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 본 연구에서 중간 신호전달 군은, 이전에 기재된(Gaertner 2008) 비-신호전달 분자로 간주되는 많은 유사체, 및 고 신호전달 분자에 속하는 3개의 화합물을 함유하였다. 작용제에 대한 G 단백질-커플링된 수용체 신호전달 반응은 사용된 세포 백그라운드에 따라 다소 변할 수 있음이 지적되었고(Kenakin 2002), 본 실험의 결과와 기준 실험의 결과 사이의 차이에 대한 가장 가능성 있는 설명이다.
실시예 7 - 세포 표면 하향조절 분석에 의한 RANTES/CCL5 유사체의 평가
실시예 4에 기재된 방법에 의해 생산한 RANTES/CCL5 유사체의 약리학 활성을 바이스탠더 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)을 기반으로 한 기술을 사용하여 세포 표면 항체 결합 분석에 의해 결정하였다(Namkung 2016).
본 분석에서, CHO-CCR5-RLuc8/YFP-CAAX 세포를 사용하였다. 이들 세포는, 원형질 막 발현을 유도하기 위해 KRAS의 프레닐화 CAAX 박스에 융합된 YFP와 공발현된 레닐라 루시페라제(Rluc8)의 유도체에 의해 C-말단 태그된 CCR5를 함유하였다(Namkung 2016). CCR5-Rluc와 세포 표면 YFP 사이의 근접성은 수용체 내재화시 손실되는 BRET 신호를 생성한다. 이들 세포를 생산하기 위해, C-말단을 통해 레닐라 루시페라제 8(RLuc8)에 융합된 CCR5를 암호화하는 개방형 해독 프레임을 PCR 어셈블리에 의해 생산하고 XbaI 및 NotI 사이트를 사용하여 pCDNA 3.1(-) 발현 벡터 내로 삽입하였다. CHO-K1 세포를 X-tremeGENE(상표) HP DNA 형질감염 시약(Roche)을 사용하여 pCDNA3.1(-)-CCR5-RLuc8 플라스미드에 의해 형질감염시키고, 안정하게 형질감염된 CHO-CCR5-Rluc8 세포의 클론을 단리하였다. KRas로부터 프레닐화 CAAX box 서열(KKKKKKSKTKCVIM)이 첨부된 황색 형광 단백질(YFP)을 암호화하는 개방형 해독 프레임(Namkung 2016)을 Gibson Assembly(등록상표)(New England Biolabs)에 의해, FUGW-YFP-CAAX 벡터를 생산하도록 BamHI 및 EcoRI 사이트에서 절단된 FUGW 렌티 바이러스 벡터 내로 삽입하였다(Lois 2002). CHO-CCR5-RLuc8 세포를 FUGW-YFP-Kras에 의해 형질도입하고, YFP-양성 집단을 유세포 분석에 의해 단리하였다. 생산된 CHO-CCR5-RLuc8/YFP-CAAX 클론을 37℃ 및 5% CO2에서 10% FBS 및 1% 게네티신으로 보충된 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI)에서 유지하였다.
CHO-CCR5-RLuc8/YFP-CAAX 세포를 96-웰 플레이트(20,000 세포/웰)에서 밤새 시딩한 후에, 배지를 제거하고, BRET 완충제(5 M NaCl, 1 M KCl, 100 mM MgSO4, 1 M HEPES, 20% 글루코스, 1% 소 혈청 알부민, 5 μM Coelenterazine H)에 희석된 케모카인 유사체(300 nM)로 대체하였다. BRET 측정을 475/30 nm(공여자) 및 535/30 nm(수용자)의 필터 세트(중앙 파장/밴드 너비)를 사용하여 Polarstar(등록상표)(BMG Labtech) 플레이트 리더 상에서 수행하였다. 발광을 37℃에서 25분의 배양 직후 기록하였고, BRET 비(공여자 RLuc8(475nm)로부터의 방출로 나눈 수용자 YFP(535 nm)로부터의 방출로서 정의됨)를 계산하였다. 분자를 단일 Emax 농도(300 nM)에서 스크리닝하였다(n=4)(47). 내재화 활성을, 300 nM 5P12-RANTES 기준 표준(백그라운드 내재화)에 대해 수득한 값을 감한 후에, 300 nM PSC- RANTES 기준 표준(최대 내재화)에 대해 수득한 값에 대한 백분율로서 표현하였다.
이어서, CHO-CCR5-RLuc8/YFP-CAAX 세포를 사용하여 CCR5의 정상 상태 하향조절을 유도하는 RANTES/CCL5 병렬 합성된 케모카인 유사체의 능력을 측정하였다. 개별적 웰의BRET 신호를 단일 Emax 농도(300 nM)에서 병렬 합성된 케모카인 유사체와의 25분의 배양 후에 기록하고, 수용체 내재화 수준을 CCR5 과작용제 PSC-RANTES(100% 내재화) 및 비-내재화 리간드 5P12-RANTES(0% 신호전달)의 기준 표준 샘플에 의해 수득한 내재화 신호에 대한 백분율로서 표현하였다. 이러한 규모에서 표현하였을 때(도 9), 화합물은 -10% 내지 115%의 활성 범위를 가졌다. 화합물을 3개의 군으로 나누었다: 저 하향조절 또는 하향조절 없음(0 내지 25%), 중간 하향조절(25 내지 80%) 및 고 하향조절(80% 초과). 이러한 방식으로 나누고 이전에 기재된 상응하는 기준 표준 케모카인 유사체를 사용하여(Gaertner 2008) 수득한 값과 비교하였고, 타당한 상호관계를 수득하였다(도 10). 이는, 실시예 4에 기재된 방법에 의해 생산한 병렬 합성된 케모카인 유사체를 G CCR5 하향조절에 대해 스크리닝하는 것이 병렬 합성된 케모카인 유사체를 비-신호전달, 중간-신호전달 및 고 신호전달 군으로 신속하고 저렴하게 층화하기에 적합하다는 것을 나타낸다.
실시예 8 - CCL25 유사체의 생산 및 스크리닝
일련의 42개의 CCL25 유사체를 종래의 파지 디스플레이 기술을 사용하여 동질 케모카인 CCR9를 발현하는 세포에 대해 파지 케모카인 라이브러리 선택 실험에서 식별하였다(Dorgham 2016; Hartley 2003). 추가적 10개의 CCL25 유사체를 합리적으로 설계하였다(N-말단 영역 연장, 알라닌 스캐닝 돌연변이). 따라서, 52개의 CCL25 유사체의 군을 식별하였다. 이어서, 이러한 52개의 CCL25 유사체의 군을 본원에 기재된 본 발명의 방법에 따라 합성하였다.
CCL25의 공통의 구조적 불변 영역을 생산하기 위해, CCL25의 잔기 8 내지 74에 해당하는 CCL25의 C-말단 단편 큰 배취를 실시예 1에 기재된 고상 펩티드 합성에 의해 생산하였다. CCL25(8-74)는 CCL25의 복수의 N-말단 구조적 변이 영역을 사용한 하류 병렬 결찰 반응을 위해 사용되는 유사체의 패널에 걸쳐 변하지 않는 코어 단편으로 구성되었다.
CCL25의 복수의 구조적 변이 영역을 제공하기 위해, 야생형 CCL25 및 52개의 이전에 식별된 유사체의 N-말단 영역을 실시예 2에 기재된 바와 같이 병렬로 합성하였다. 이들 변이 영역 N-말단 펩티드는 CCL25의 잔기 1 내지 7에 상응하였고, 일부 변이체는 1 또는 2개의 추가적 아미노산 연장을 포함하였다(표 4).
복수의 완전한 변이 CCL25 유사체를 생산하기 위해, 변이 영역 N-말단 펩티드 상의 C-말단 Cys7 티오에스터 잔기를 실시예 3에 기재된 바와 같이 병렬 웰내 천연 화학 결찰 반응을 사용하여 코어 단편 상의 Cys8 N-말단 잔기에 결찰시켰다. 이들 유사체의 샘플을 HPLC(도 11, 11a, 11b) 및 MS(표 5)에 의해 순도 및 온전성에 대해 평가하였다. 52개의 표적 유사체 중 2개(1P27-CCL25 및 1P43-CCL25)를 제외한 모두를 성공적으로 합성하였다. CCL25 유사체를 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 병렬로 분리하고 폴딩하고 탈염시키고 동결건조시켜 CCL25 유사체 중 하나를 함유하는 병렬 샘플 각각을 생산하였다.
용액을 각각의 샘플로부터 생산하고, 농도를 추정된 순도 및 총 단백질 농도를 기반으로 100 μM의 추정 농도에 대해 정규화하였다. 이어서, 이들 용액을 각각의 웰이 표적 CCL25 유사체를 함유하는 멀티-웰 분석 플레이트를 제조하였다. 각각의 표적 유사체를 도 12에 나타낸 바와 같이 살아 있는 세포에 대해 멀티-웰 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 분석을 사용하여 CCR9에 아레스틴-3을 모집하는 능력에 대해 단일 농도(300 nM)에서 병렬로 스크리닝하였다. 유사체의 활성을 기준 표준 1(Std1)(상업적으로 공급된 정제된 재조합 CCL25(1-127)); 기준 표준 2(Std2)(합성되고 정제된 CCL25(1-74)); 및 기준 표준 2 및 3(Std2 및 Std3)(, 본 발명의 방법에 의해 생산한 CCL25 분자(1-74))과 비교하였다. 예측되는 바와 같이, 정제된 CCL25 표준 샘플(Std1 및 Std2)은 강한 신호를 제공하였다. 특히, CCL25 표준 샘플은 고도로 정제된 표준 샘플과 비슷한 신호를 생성하였다. 유사체(A1 내지 F7) 중 다수는 검출가능한 신호전달 활성을 갖지 않은 반면에, 일부는 중간 수준 또는 모 화합물의 것보다 높은 수준을 나타냈다.
이들 결과는 본 발명의 방법에 의해 생산한 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드가 스크리닝 분석에서 검출될 수 있는 생물학적 활성을 나타냄을 나타낸다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 생산한 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드의 생물학적 활성은 이전에 공지된 방법으로 생산한 보다 고도로 정제된 폴리펩티드와 비교하여 분석에서 비슷하거나 큰 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
참고문헌
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 개시내용에 대한 것이며, 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
전술한 발명이 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예를 통해 다소 상세히 기재되었으나, 본 발명의 교시에 비추어 볼 때, 첨부된 특허청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 변화 및 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백하다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 분명하게 명시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 이에 의해 결합된 요소 중 하나 또는 둘 모두, 즉 일부 경우에 결합적으로 존재하는 원소 및 다른 경우에는 분리 적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
"및/또는"과 함께 나열된 여러 요소는 동일한 방식으로 해석되어야 하고, 즉 이에 의해 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별 된 요소와 관련이 있든 무관하든 "및/또는"에 의해 구체적으로 식별된 요소 외에 다른 요소가 임의적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, 개방형 용어, 예컨대 "포함함"과 함께 사용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 하나의 실시태에서 A만을 지칭 할 수 있거나(B 이외의 요소를 임의적으로 포함함); 또 다른 다른 실시양태에서 B만을 지칭할 수 있거나(A 이외의 요소를 임의적으로 포함함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 모두를 지칭할 수 있다(다른 요소를 임의적으로 포함함).
본원 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "또는"은 상기에 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 구분할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 원소의 목록, 및 임의적으로 나열되지 않은 추가적 항목의 목록 중 적어도 하나(하나 초과를 포함함)의 포함으로 해석되어야 한다.
본원에서 사용 된 바와 같이, 본원 또는 첨부된 특허청구범위에서, 변천의 용어 "포함함", "비롯함", "지님", "가짐", "함유함", "수반함" 등은 포괄적 또는 개방형인 것으로 이해되어야 하고(즉 포함하나 이에 제한되지 않음을 의미함), 언급되지 않은 요소, 물질 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 단지 변천의 용어 "~로 구성됨" 또는 "~로 본질적으로 구성됨"만이 본원의 특허청구범위 및 예시적인 실시양태 단락과 관련하여 폐쇄되거나 반-폐쇄된 변천의 어구이다. 변천의 용어 "~로 구성됨"은 는 구체적으로 언급되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 변천의 용어 "~로 본질적으로 구성됨"은 범위를 명시된, 물질 또는 단계, 및 본원에 개시되고/되거나 청구된 본 발명의 기본 특징에 물질적으로 영향을 미치는 것에 제한하지 않는다.
[표 1]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
[표 2A]
Figure pct00014
[표 2B]
Figure pct00015
[표 3]
Figure pct00016
[표 4]
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
[표 5]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> Universite de Geneve <120> Methods for Producing a Plurality of Polypeptide Variants Suitable for Biological Analysis <130> 85617704 <140> PCT/IB2019/058129 <141> 2019-09-25 <150> US 62/739,555 <151> 2018-10-01 <160> 149 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Leu Ser Pro Val Ser Ser Gln Ser Ser Ala Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Phe Ser Pro Leu Ser Ser Gln Ser Ser Ala Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Trp Ser Pro Leu Ser Ser Gln Ser Pro Ala Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Leu Ser Pro Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ser Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 6 Xaa Ser Pro Gly Ser Ser Trp Ser Ala Ala Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Met Ser Pro Leu Ser Ser Gln Ala Ser Ala Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Phe Val Pro Gln Ser Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 Leu Val Pro Gln Pro Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 10 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Gln Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 Met Val Pro Gln Ser Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 12 Xaa Gly Pro Pro Met Met Gln Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 13 Xaa Gly Pro Pro Gly Gly Gln Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Phe Ala Pro Met Ser Gln Gln Ser Thr Ser Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 15 Xaa Gly Pro Leu Ser Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 16 Xaa Gly Pro Pro Gly Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 17 Xaa Gly Pro Pro Met Met Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 Thr Gly Pro Pro Gly Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 Val Gly Pro Leu Ser Gln Gln Ala Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 20 Xaa Phe Pro Pro Gly Gly Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 Phe Ala Pro Met Ser Gln Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 Ala Ala Pro Leu Ser Gln Gln Ser Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 23 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 24 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Leu Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 25 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Met Gln Val Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 26 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Met Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 27 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Thr Gln Val Cys 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 28 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Thr Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 29 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ala Leu Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 30 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Thr Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 31 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Phe Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 32 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Leu Gln Thr Cys 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 33 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Arg Gly Ser Cys 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 34 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ala Thr Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 35 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Leu Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 36 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 37 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Leu Ser Val Cys 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 38 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Gly Leu Ser Val Cys 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 39 Xaa Gly Pro Pro Gly Gly Gly Gly Leu Gly Cys 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 40 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Gly Gly Gln Val Cys 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 41 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Gly Gly Ser Val Cys 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 42 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Ile Val Leu Ala Cys 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 43 Xaa Gly Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 44 Xaa Gly Pro Pro Gly Gly Gly Gly Thr Arg Cys 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 45 Xaa Gly Pro Pro Gly Ser Trp Ser Ser Val Cys 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 46 Xaa Gly Pro Pro Met Gly Gly Gln Val Thr Cys 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 47 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Thr Tyr Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 48 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Thr Val Leu Trp Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 49 Xaa Gly Pro Pro Gly Ser Tyr Asp Tyr Ser Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 50 Xaa Gly Pro Pro Leu Gly Ala Gly Ser Ser Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 51 Xaa Gly Pro Pro Leu Gly Ser Met Gly Pro Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 52 Xaa Gly Pro Pro Leu Asp Phe Gly Gly Ala Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 53 Xaa Gly Pro Pro Met Gly Gly Thr Ser Ala Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 54 Xaa Gly Pro Pro Met Gln Gly Gly Leu Ser Cys 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 55 Xaa Gly Pro Pro Met Met Ala Gly Leu Ser Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 56 Xaa Gly Pro Pro Leu Gln Ala Ser Val Thr Cys 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 57 Xaa Gly Pro Pro Met Ser Gly His Ser Thr Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 58 Xaa Gly Pro Pro Met Ser Ala Tyr Gln Val Cys 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 59 Xaa Gly Pro Pro Gly Gln Trp Tyr Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 60 Xaa Gly Pro Pro Leu Ser Trp Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 61 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Trp Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 62 Xaa Gly Pro Pro Gln Gly Trp Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 63 Xaa Gly Pro Pro Gln Ser Trp Ser Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 64 Xaa Gly Pro Pro Gly Gln Trp Gly Gln Val Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 65 Xaa Gly Pro Pro Gly Met Trp Ser Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 66 Xaa Gly Pro Pro Leu Gln Trp Met Gln Val Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 67 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Trp Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 68 Xaa Gly Pro Pro Gly Gln Trp Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 69 Xaa Gly Pro Pro Leu Gln Trp Met Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 70 Xaa Gly Pro Pro Leu Gln Trp Phe Gln Val Cys 1 5 10 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 71 Xaa Gly Pro Pro Leu Gln Trp Thr Gln Val Cys 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 72 Xaa Gly Pro Pro Leu Ser Trp Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 73 Xaa Gly Pro Leu Ser Gln Ala Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 74 Xaa Gly Pro Leu Ser Gln Ala Phe Gln Val Cys 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 75 Xaa Gly Pro Leu Ser Gln Ser Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 76 Xaa Gly Pro Leu Ser Ser Gln Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 77 Xaa Gly Pro Leu Ser Gly Trp Ala Gln Val Cys 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 78 Xaa Gly Pro Leu Ser Gln Trp Gln Gln Val Cys 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 79 Xaa Gly Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 80 Met Ser Pro Pro Leu Ser Asp Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 81 Met Ser Pro Tyr Ser Met Gln Thr Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 82 Met Ser Pro Leu Ser Ser Trp Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 83 Met Ser Pro Leu Ser Ser Gln Ala Gln Val Cys 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 84 Xaa Gly Pro Leu Ser Gly Trp Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 85 Xaa Gly Pro Leu Ser Gly Gln Ser Gln Val Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 86 Xaa Gly Pro Pro Gly Asp Trp Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 87 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Val Leu Ala Cys 1 5 10 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 88 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Gly Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 89 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ala Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 90 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Arg Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 91 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Thr Leu Gln Val Cys 1 5 10 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 92 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Val Thr Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 93 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Leu Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 94 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Gly Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 95 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Ser Gln Ser Cys 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 96 Xaa Gly Pro Pro Leu Met Ser Leu Thr Val Cys 1 5 10 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 97 Xaa Gly Ala Leu Arg Gln Cys 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 98 Xaa Gly Val Ala Arg Asn Cys 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 99 Xaa Gly Val Ala Arg Arg Cys 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 100 Xaa Gly Val Gln Arg Ile Cys 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 101 Tyr Gln Ala Ser Glu Asp Cys 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 102 Tyr Gln Ser Arg Glu Asp Cys 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 103 Tyr Ser Gln Arg Glu Asp Cys 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 104 Xaa Gly Ala Phe Gln Pro Asp Cys 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 105 Xaa Gly Gly Phe Lys Gln Asp Cys 1 5 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 106 Xaa Gly Phe Leu Thr Ala Asp Cys 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 107 Xaa Gly Leu Leu Gln Gln Asp Cys 1 5 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 108 Lys Asp Leu Gln Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 109 Leu Asp Ala Gln Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 110 Thr Asp Ile Gln Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 111 Val Asp Gly Gln Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 112 Glu Phe Leu Arg Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 113 Gly Gln Leu Lys Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 114 Ile Thr Gln Arg Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 115 Ser Ile Gln Arg Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 116 Xaa Gly Ile Gln Phe Ile Asp Cys 1 5 <210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 117 Xaa Gly Ile Trp Ile Ile Asp Cys 1 5 <210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 118 Xaa Gly Ile Trp Gln Tyr Asp Cys 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 119 Xaa Gly Val Gln Tyr Gly Asp Cys 1 5 <210> 120 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 120 Xaa Leu Leu Trp Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 121 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 121 Xaa Gly Asp Ile Gln Pro Asp Cys 1 5 <210> 122 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 122 Xaa Gly Asp Gln Pro Ile Asp Cys 1 5 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 123 Arg Arg Ala Glu Glu Asp Cys 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 124 Arg Arg Lys Gln Glu Asp Cys 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 125 Xaa Gly Lys Ser Gln Gly Cys 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 126 Xaa Gly Arg Gln Ala Gln Cys 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 127 Xaa Gly Arg Ser Gln Gln Cys 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 128 Xaa Ser Lys Arg Glu Asp Cys 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 129 Xaa Tyr Lys Gln Glu Asp Cys 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 130 Xaa Gly Ala Trp Trp Arg Cys 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 131 Xaa Gly Glu Leu His Gln Cys 1 5 <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 132 Xaa Gly Gln Val Trp Leu Cys 1 5 <210> 133 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 133 Xaa Gly Gln Trp Ser Gly Cys 1 5 <210> 134 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 134 Xaa Gly Gln Tyr Leu Asp Asp Cys 1 5 <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is pyroglutamate <400> 135 Xaa Gly Ser Gln Leu Gln Asp Cys 1 5 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 136 Gly Arg Asp Gln Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 137 Gly Arg Glu Gln Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 138 Val Gln Arg Leu Glu Asp Cys 1 5 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 139 Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 140 Ala Gly Val Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 141 Gln Ala Val Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 142 Gln Asp Ala Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 143 Gln Gly Val Ala Glu Asp Cys 1 5 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 144 Gln Gly Val Phe Ala Asp Cys 1 5 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 145 Gln Gly Val Phe Glu Ala Cys 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 146 Gln Gly Ala Val Phe Glu Asp Cys 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 147 Gln Gly Val Phe Ala Glu Asp Cys 1 5 <210> 148 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 148 Gln Gly Val Phe Glu Asp Ala Cys 1 5 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 149 Gln Gly Val Phe Glu Asp Ala Ser Cys 1 5

Claims (20)

  1. a. 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계;
    b. 상기 폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역 각각을 상기 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역에 병렬의 별개의 결찰 반응으로 결찰시켜 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계; 및
    c. 조건을 상기 별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용하여 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 별개의 결찰 반응 각각으로부터 분리하는 단계
    를 포함하는, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 병렬로 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 c 후에
    d. 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각을 병렬의 별개의 폴딩 반응으로 폴딩하여 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 생산하는 단계; 및
    e. 조건을 상기 별개의 폴딩 반응에 병렬로 적용하여 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 상기 폴딩 반응으로부터 분리하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역을 병렬로 제공하는 단계가 무-컬럼으로 수행되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    별개의 결찰 반응 각각에 병렬로 적용된 조건이 무-컬럼 분리를 포함하는, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴딩이 산화성 폴딩을 포함하는, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    별개의 폴딩 반응 각각에 병렬로 적용된 조건이 무-컬럼 분리를 포함하는, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 e 후에, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 병렬로 동결건조되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계 c 후에, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 병렬로 동결건조되는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    동결건조 후에, 동결건조된 폴리펩티드 분자가 용매에 의해 현탁되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    모든 병렬 단계가 무-컬럼으로 수행되는, 방법.
  11. a. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계;
    b. 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 별개로 병렬로 세포와 접촉시키는 단계; 및
    c. 상기 세포에 대한 상기 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 결정하는 단계
    를 포함하는, 복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 효과를 병렬로 결정하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    세포가 박테리아, 유전자 변형된 일차 진핵 세포, 형질전환된 진핵 세포 및 불멸 진핵 세포로부터 선택되는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    하나 이상의 효과가 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
  14. a. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자 각각의 하나 이상의 특성을 결정하는 단계
    를 포함하는, 복수의 폴딩된 구조적 변이 폴리펩티드 분자의 하나 이상의 특성을 병렬로 결정하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    하나 이상의 특성이 유세포 분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 웨스턴 블롯, 효소-연결된 면역 흡착 분석, 효소-연결된 면역 스팟 분석, 세포 이동 분석, 세포 증식 분석, 세포 독성 사멸 분석, 게놈-와이드 서열 분석, 엑솜 서열 분석, RNA 서열 분석, 염색질 면역 침전 서열 분석, 세포 융합 분석, 칼슘 플럭스 분석 및 세포 표면 항체 결합 분석으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 구조적 변이 폴리펩티드 분자가 단백질인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 단백질의 한 영역에 해당하고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 동일한 단백질의 한 영역에 해당하는, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 제1 단백질의 한 영역에 해당하고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 제2 단백질의 한 영역에 해당하는, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 인공 폴리펩티드이고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 단백질의 한 영역에 해당하는, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    폴리펩티드 분자의 복수의 구조적 변이 영역이 단백질의 한 영역에 해당하고, 폴리펩티드 분자의 공통의 구조적 불변 영역이 인공 폴리펩티드인, 방법.
KR1020217012784A 2018-10-01 2019-09-25 생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법 KR20210072021A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862739555P 2018-10-01 2018-10-01
US62/739,555 2018-10-01
PCT/IB2019/058129 WO2020070587A1 (en) 2018-10-01 2019-09-25 Methods for producing a plurality of polypeptide variants suitable for biological analysis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210072021A true KR20210072021A (ko) 2021-06-16

Family

ID=68211139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217012784A KR20210072021A (ko) 2018-10-01 2019-09-25 생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210340173A1 (ko)
EP (1) EP3861006A1 (ko)
JP (1) JP2022508558A (ko)
KR (1) KR20210072021A (ko)
CN (1) CN113166196A (ko)
CA (1) CA3114571A1 (ko)
WO (1) WO2020070587A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4198123A1 (de) 2021-12-17 2023-06-21 Covestro Deutschland AG Besonders geeignete 3-desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-synthase zur fermentativen herstellung von ortho-aminobenzoesäure

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE354584T1 (de) 1997-06-13 2007-03-15 Gryphon Therapeutics Inc Festphasige native chemische ligation von ungeschützten oder n-cystein-geschützten peptiden in wässrigen lösungen
AU750244B2 (en) * 1997-09-04 2002-07-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
WO2004105685A2 (en) 2003-05-22 2004-12-09 Gryphon Therapeutics, Inc. Displaceable linker solid phase chemical ligation

Also Published As

Publication number Publication date
EP3861006A1 (en) 2021-08-11
WO2020070587A1 (en) 2020-04-09
JP2022508558A (ja) 2022-01-19
CN113166196A (zh) 2021-07-23
CA3114571A1 (en) 2020-04-09
US20210340173A1 (en) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4907542B2 (ja) 治療、診断およびクロマトグラフィーに使用するためのタンパク質複合体
JP4423542B2 (ja) 抗菌性ポリペプチド及びその利用
JP2015522020A (ja) スプリットインテイン、複合体およびそれらの使用
AU2013300549B2 (en) Peptide library and use thereof
US20160146786A1 (en) Method of monitoring cellular trafficking of peptides
KR101695792B1 (ko) 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도
Lele et al. Understanding the importance of glycosylated threonine and stereospecific action of Drosocin, a Proline rich antimicrobial peptide
WO2017070742A1 (en) Use of spycatcher as a protein scaffold for peptide display; and spycatcher/spytag cyclised peptides displayed on bacteriophage
Zuo et al. Chemical synthesis and biophysical applications of membrane proteins
Haque et al. Contacts between mammalian mitochondrial translational initiation factor 3 and ribosomal proteins in the small subunit
AU2020396647A1 (en) Method for producing peptide having physiological activity, and peptide comprising short linker
Brown et al. Multiple synthetic routes to the mini-protein omomyc and coiled-coil domain truncations
KR20210072021A (ko) 생물학 분석에 적합한 복수의 폴리펩티드 변이체의 생산 방법
CN109752557B (zh) 检测生物分子间相互作用及其调控因子的成套试剂与应用
WO2008133929A2 (en) Cell permeable miniature proteins
JP5909812B2 (ja) 生物的に生成される環状アフィニティータグ
US10280196B2 (en) Heparin affinity tag and application thereof
CN109917120B (zh) 检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂
Wolf et al. The ring size of monocyclic ET‐1 controls selectivity and signaling efficiency at both endothelin receptor subtypes
KR101475744B1 (ko) 세포 투과 펩타이드
Paolini-Bertrand et al. Rapid and low-cost multiplex synthesis of chemokine analogs
WO2018074498A1 (ja) リムルス属由来の組換え蛋白質及びこれをコードするｄｎａ
US20230039851A1 (en) Serum albumin-binding fibronectin type iii domains and uses thereof
US20220073908A1 (en) Methods of producing high diversity peptide libraries and promoting protein folding
JP2010071744A (ja) 化合物のスクリーニング方法、並びに、スクリーニング用キット