JP5909812B2 - 生物的に生成される環状アフィニティータグ - Google Patents
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Description
a)前記対象のタンパク質と、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフとを含み;X1およびX2はアミノ酸を表わし、それらの側鎖が、残基X1と残基X2との間にチオエーテル架橋を形成することが可能なランチビオティック酵素により連結されえ;タグは、環化すると(タンパク質性)結合パートナーに結合することが可能なアミノ酸配列である、少なくとも1つの前駆体タンパク質性物質を供給するステップと; b)前記前駆体を、X1とX2との間に共有結合を形成することが可能な少なくとも1つの酵素と接触させ、これにより、タグ配列を含む分子内環構造を導入するステップと; c)結果として得られる環化タンパク質性物質を単離するステップと
を含む方法に関する。
a)前記対象のタンパク質と、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフとを含み、
X1およびX2はアミノ酸を表わし、それらの側鎖が、残基X1と残基X2との間にチオエーテル架橋を形成することが可能なランチビオティック酵素により連結されえ;
タグは、環化するとアフィニティータグとして用いられるアミノ酸配列であり、前記アフィニティータグは、その特異的結合パートナーにタンパク質性物質を捕捉させ;
前記モチーフのN末端側に、ランチビオティックスのリーダー配列が先行する、
少なくとも1つの前駆体タンパク質性物質を供給するステップと;
b)前記前駆体を、少なくとも1つのランチビオティック酵素と接触させて、X1とX2との間にチオエーテル架橋を形成させ、これにより、タグ配列を含む分子内環構造を導入するステップと;
c)結果として得られる環化タンパク質性物質を単離するステップと
を含む酵素的方法を提供する。
a)前記対象のタンパク質と、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフとを含み、X1が、Dhb(デヒドロブチリン)、Dha(デヒドロアラニン)、Thr、およびSerから選択され、X2が、CysもしくはLysであるか;またはX1が、CysもしくはLysであり、X2が、Dhb、Dha、Thr、およびSerから選択され;前記モチーフのN末端側に、ランチビオティックスのリーダー配列が先行し;リーダー配列とタグ配列との距離が変化しうるが、典型的には0〜100アミノ酸、好ましくは0〜50アミノ酸、より優先的には0〜20アミノ酸である、少なくとも1つの前駆体タンパク質性物質を供給するステップと;
b)前記前駆体を、X1とX2との間に共有結合を形成することが可能な少なくとも1つのランチビオティック酵素と接触させ、これにより、タグ配列を含む分子内環構造を導入するステップと;
c)結果として得られる、ランチビオティック酵素環化チオエーテル架橋アフィニティータグを含み;チオエーテル結合が、D-アミノ酸とL-アミノ酸との間の結合であるか、またはL-アミノ酸とD-アミノ酸との間の結合である、タンパク質性物質を単離するステップと
を含む酵素的方法を提供する。
a)前記対象のタンパク質と、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフとを含み、
X1およびX2はアミノ酸を表わし、それらの側鎖が、残基X1と残基X2との間にチオエーテル架橋を形成することが可能なランチビオティック酵素により連結されえ;
タグは、環化するとアフィニティータグとして用いられるアミノ酸配列であり、前記アフィニティータグが、その特異的結合パートナーにタンパク質性物質を捕捉させ;典型的には、タンパク質性物質のタグ部分だけが結合パートナーへの結合を媒介し、該物質の他の部分はタグ結合パートナーとは相互作用せず;
前記モチーフのN末端側に、ランチビオティックスのリーダー配列が先行する、
少なくとも1つの前駆体タンパク質性物質を供給するステップと;
b)前記前駆体を、少なくとも1つのランチビオティック酵素と接触させて、X1とX2との間にチオエーテル架橋を形成させ、これにより、タグ配列を含む分子内環構造を導入するステップと;
c)結果として得られる環化タンパク質性物質を、10μM未満の解離定数で環化アフィニティータグに結合する特異的な捕捉試薬と接触させ、これにより、該物質を単離、精製、および/または固定化するステップと
を含む方法も提供する。捕捉試薬は、固体支持体、例えば、カラム、アレイ表面、または(磁気)ビーズへと固定化することができる。
(実施例1)
HPQFによるニシンの環C配列の置換
材料および方法
対照ペプチドは、LMRTTSSLELSDYEQACであった。ニシンの突然変異体は、遺伝子操作により作製した。このH14、P15、Q16、F17、ΔG18突然変異体では、GALMGからなるニシンの環CをHPQFで置換した。コードプラスミドを、pIl3BTC [Rink, R.ら、2005、Biochemistry 44:8873〜8882頁]と共に共発現させた。[Rink, R.ら、2005、Biochemistry 44:8873〜8882頁]に従い、質量分析を実施した。トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP)を添加することにより、ジスルフィド架橋の形成を回避した。1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)による処理を実施して、システインの結合可能性を測定した。システインがチオエーテル架橋内に取り込まれていなければ、該突然変異体は、CDAPと反応性となり、その結果として、25Daの上方シフトがもたらされる。TCEPおよびCDAPで処理したシステイン含有ペプチドに25Daの上方シフトが見られなければ、チオエーテル架橋の存在が示される。
非修飾対照ペプチドの平均質量(m/z)は、1948.2Daであった。質量分析は、非修飾ペプチドに対応する1947.5Daのピークと、このペプチドの酸化形態に対応しうる1963.6Daのピークとを明らかにした(メチオニン2が、酸化の候補残基でありうる) (図1A;実線)。対照ペプチドでは、ピークが、観察されたピークに対応しており、25Daの増大が、CDAP修飾に対応することが明らかである(図1A;点線)。この手順により、対照ペプチド内のシステインが、修飾可能であることが明らかに示された。
実施例1は、HPQFを、シクラーゼであるNisCにより、ニシンの環Cへと酵素的に導入しうることを裏付ける。
環C内にアフィニティータグを含有する切断型ニシン変異体の抗微生物活性
材料および方法
内部Strepタグと外部mycタグとを伴う切断型ニシン突然変異体を、遺伝子操作により構築した。構築物は、mycタグ: EQKLISEEDに連結された、ニシン(1〜22)のH14、P15、Q16、F17、ΔG18突然変異体、すなわち、ITSISLCTPGCKTHPQFCNMKに連結されたニシンのリーダーペプチド(MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR)をコードした。したがって、全プレ配列は、MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTHPQFCNMKEQKLISEEDであった。このペプチドは、pIl3BTCを含有する乳酸連鎖球菌により作製した。
図2は、HPQFを含有する環Cを伴う切断型ニシン変異体が、抗微生物活性を明らかに有することを示す。
実施例2は、環C内にHPQFが存在することで、切断型ニシン突然変異体の抗微生物活性が消失しないことを裏付ける。同時に4つのアミノ酸を突然変異させる一方で、1つのアミノ酸は欠失させているため、これは驚くべきことである。切断(既に10分の1に短縮されている場合がある)にも関わらず、環Cが短縮されているにも関わらず、テールが負に帯電している(これは、陰イオン性膜への結合を抑制する)にもかかわらず、ペプチドは依然として活性を有する。
Claims (18)
- 対象の生物学的に活性なポリペプチドと環状アフィニティータグとを含むタンパク質性物質を供給する酵素的方法であって、
a)前記対象のポリペプチドと、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフとを含み、
X1およびX2はアミノ酸を表わし、それらの側鎖が、残基X1と残基X2との間にチオエーテル架橋を形成することが可能なランチビオティック酵素により連結されることができ、ここで、X1は、Dhb、Dha、Thr、およびSerからなる群から選択され、X2は、Cysであるか;またはX1は、Cysであり、X2は、Dhb、Dha、Thr、およびSerからなる群から選択され;
タグは、環化するとアフィニティータグとして用いられるアミノ酸配列であり、前記アフィニティータグは、前記タグの特異的結合パートナーにタンパク質性物質を捕捉させ;
前記モチーフのN末端側に、ランチビオティックスのリーダー配列が先行する、
少なくとも1つの前駆体タンパク質性物質を供給するステップと;
b)前記前駆体を、少なくとも1つのランチビオティック酵素と接触させて、X1とX2との間にチオエーテル架橋を形成させ、これにより、タグ配列を含む分子内環構造を導入するステップと;
c)結果として得られる環化タンパク質性物質を単離するステップと
を含む酵素的方法。 - 前記対象のポリペプチドを、N末端またはC末端側で、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフに融合させる、請求項1に記載の方法。
- タンパク質性物質が、前記対象のポリペプチドと、少なくとも1つのモチーフとの間に切断部位を含み、切断部位が、因子X切断部位またはGlu-C切断部位である、請求項2に記載の方法。
- ステップc)の後に、環化タンパク質性物質を切断部位で切断して、対象のポリペプチドを放出させる、請求項3に記載の方法。
- 前記タンパク質性物質が対象のポリペプチドであり、その一部が前記少なくとも1つのモチーフにより置換されて、前記少なくとも1つのモチーフが前記対象のポリペプチドの構成部分となっている、請求項1に記載の方法。
- ステップa)およびb)を、X1とX2との間にチオエーテル架橋結合を形成することが可能な前記少なくとも1つのランチビオティック酵素を含む宿主細胞内で実施し、前記宿主細胞に、前記前駆体タンパク質性物質をコードする核酸配列が供給されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- タグが、配列Arg-Gly-Aspを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- タグが、10μM未満の解離定数でストレプトアビジンと結合することが可能なストレプトアビジン結合配列を含み、ストレプトアビジン結合配列が、His-Pro-Gly (HPG)、His-Pro-Lys (HPK)、His-Pro-Met (HPM)、His-Pro-Gln (HPQ)、およびHis-Pro-Gln-Phe (HPQF)からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- モチーフX1-タグ-X2が、Dha-His-Pro-Gln-Phe-Cys;Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Cys;Ser-His-Pro-Gln-Phe-Cys;Thr-His-Pro-Gln-Phe-Cys;Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dha;Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dhb;Cys-His-Pro-Gln-Phe-Ser;Cys-His-Pro-Gln-Phe-Thr;Dha-His-Pro-Gln-Cys;Dhb-His-Pro-Gln-Cys;Ser-His-Pro-Gln-Cys;Thr-His-Pro-Gln-Cys;Cys-His-Pro-Gln-Dha;Cys-His-Pro-Gln-Dhb;Cys-His-Pro-Gln-Ser;およびCys-His-Pro-Gln-Thrからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項8に記載の方法。
- ステップb)が、前駆体を、ランチビオティック酵素であるLanM、ランチビオティックシクラーゼであるLanC (デヒドロ残基とシステインとの組合せの場合)、またはランチビオティックデヒドラターゼであるLanBとランチビオティックシクラーゼであるLanCとの組合せと接触させるステップを含み、ステップa)およびb)が、ランチオニンタンパク質であるLanB; LanCおよびLanT; LanMおよびLanT; LanBおよびLanC;またはLanMを含む宿主細胞内で実施される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のポリペプチドが、少なくとも1つのチオエーテル含有分子内環構造を天然で含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の生物学的に活性なポリペプチドと、一般式がX1-タグ-X2である少なくとも1つのモチーフを環化させた環状アフィニティータグとを含むタンパク質性物質であって、
X1およびX2はアミノ酸を表わし、それらの側鎖は、残基X1と残基X2との間でチオエーテル架橋により連結されており、ここで、X1は、Dhb、Dha、Thr、およびSerからなる群から選択され、X2は、Cysであるか;またはX1は、Cysであり、X2は、Dhb、Dha、Thr、およびSerからなる群から選択され;
前記タグは、アフィニティータグとして用いられるアミノ酸配列であり;
前記モチーフのN末端側に、ランチビオティックスのリーダー配列が先行する、タンパク質性物質。 - 少なくとも1つの環状タグ配列を含み、タグ配列が、(N末端からC末端の方向で)D-アミノ酸とL-アミノ酸とを架橋するか、またはL-アミノ酸をD-アミノ酸へと架橋するチオエーテル結合環構造の一部である、請求項12に記載のタンパク質性物質。
- 前記環状タグ配列が、環化ストレプトアビジン結合配列であり、His-Pro-Gly、His-Pro-Lys、His-Pro-Met、His-Pro-Gln、およびHis-Pro-Gln-Pheからなる群から選択される配列を含むかまたはこれらからなる、請求項13に記載のタンパク質性物質。
- 環構造を含む突然変異体ランチビオティック断片またはランチビオティック断片を含み、前記環構造が、(N末端からC末端の方向で)D-アミノ酸をL-アミノ酸へと架橋するか、またはL-アミノ酸をD-アミノ酸へと架橋する、チオエーテル架橋を含有する少なくとも1つの環状ストレプトアビジン結合モチーフを含む、請求項13または14に記載のタンパク質性物質。
- 請求項12〜15のいずれか一項に記載の複数のタンパク質性物質を含むペプチドライブラリー。
- 各メンバーが、アレイフォーマットで、固体支持体上に固定化されている、請求項16に記載のライブラリー。
- 少なくとも1つの環状ストレプトアビジン結合モチーフを含む複数のタンパク質性物質を含み、各メンバーが、少なくとも1つの環状ストレプトアビジン結合モチーフを介して、アレイフォーマットで固体支持体上にスポッティングされたストレプトアビジンへと固定化されている、請求項17に記載のライブラリー。
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