CN102803287A - 生物法制备的环状亲和标签 - Google Patents

生物法制备的环状亲和标签 Download PDF

Info

Publication number
CN102803287A
CN102803287A CN2010800253560A CN201080025356A CN102803287A CN 102803287 A CN102803287 A CN 102803287A CN 2010800253560 A CN2010800253560 A CN 2010800253560A CN 201080025356 A CN201080025356 A CN 201080025356A CN 102803287 A CN102803287 A CN 102803287A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pro
gln
lys
cys
phe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800253560A
Other languages
English (en)
Inventor
缇比·波萨马
安可·凯珀斯
里克·林克
杰特·里古拉斯·摩尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morphosys AG
Original Assignee
LanthioPep BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LanthioPep BV filed Critical LanthioPep BV
Publication of CN102803287A publication Critical patent/CN102803287A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及向目的蛋白中引入亲和标签的新方法。本发明提供了一种用于提供包括目的多肽和环状亲和标签的蛋白物质的酶法，包括步骤：(a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体包括所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中X1和X2代表侧链可由共价键酶法连接的氨基酸；标签是当环化时能够结合标签的结合配偶体的短氨基酸序列；(b)使所述前体与至少一种能在X1和X2之间形成共价键的酶接触，从而引入包括标签序列的分子内环状结构；以及(c)分离所得的环化蛋白物质。本发明还提供由此获得的蛋白物质及其用途，例如用于制备肽库。

Description

生物法制备的环状亲和标签
本发明涉及重组蛋白表达、纯化和固定化领域。特别是，它涉及向目的蛋白中引入亲和标签的新方法。
人们已开发出多种亲和标签并应用于整个生物技术领域。亲和标签在整个生物科学领域的巨大成功，促进了人们在开发新的和方便的标记策略方面的兴趣。亲和标签是捕获重组蛋白的完善工具，例如在固定化和/或纯化过程中。最近，这些标签已被用于在许多成像应用以及药物递送中选择性的生物靶向多元蛋白(multiplexed protein)的检测。最常用的亲和标签的范围从短的多肽序列至整个蛋白，其可对溶解度产生有利的影响。例如，小肽表位，如可结合到固定的金属螯合物上的多组氨酸标签，以及可结合到固定的抗体上的myc-标签和FLAG-标签，通常用于重组蛋白的分离和固定。
另一种获得广泛使用的小肽表位是链菌素特异性Strep-标签[Schmidt，等.，蛋白质工程(Protein Eng.)6(1993)109-122；US2006/0106199和US 6,841,359.]。链菌素结合肽序列已通过筛选肽库被发现，其中大多数但并非所有的都包含His-Pro-Gln(HPQ)基序。链菌素融合肽已在各种独特的生化中应用，使链菌素，相对于细菌非糖基化的亲和素成为在许多(链菌素)亲和素-生物素技术中应用的首选蛋白[Keefe，等，蛋白表达和纯化(Protein Expr.Purif.)，23(2001)440-446；Lamla，等，蛋白表达和纯化，33(2003)39-47]。小肽，如Strep-标签可容易地与较大的蛋白融合表达用于纯化或其它的接合应用。标记的链菌素的可用性，以及固定于固相支持物上的链菌素，使这些肽非常有用。以链菌素作为受体系统模型，发现二硫键限制的环肽Strep-基序以高至相应的线性序列3个数量级的亲和力结合链菌素(Giebel等，生物化学1995，34，15430-15435)。Katz等(J.Am.Chem.Soc.1995，117，8541-8547)设计和化学合成了含有基序CHPQGPPC的环状链菌素结合肽，其中二硫键被硫醚交联所取代。报道显示，与它们的二硫键对应物相比，硫醚交联的肽具有增强的稳定性。
因此，环状亲和标签，如环化的链菌素基序比它们的线性对应物更利于作为蛋白标签使用。然而，与含有线性蛋白的，可以简单地通过重组蛋白表达获得的融合蛋白相比，含有环状亲和标签的蛋白的提供需要化学修饰，这在时间、精力和成本上是极不可取的。二硫桥的自发形成通常缺乏特异性，同时桥本身缺乏稳定性。
因此，本发明人提供替代性方法，以提供带有环化的亲和标签的目的蛋白。发现如果标签序列在每侧与能够在酶作用下共同形成共价键的氨基酸侧接，例如与存在于表达编码含有标签序列的目的蛋白的构建体的宿主细胞中的酶侧接，那么线性标签序列可发生生物环化，即非化学的环化。
因此，本发明涉及一种提供包括目的蛋白和环状亲和标签的蛋白物质的方法，其包括下述步骤：
a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体包括所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中X1和X2代表侧链可由共价键酶法连接的氨基酸；标签是当环化时能够结合(蛋白)结合配偶体(binding partner)的氨基酸序列；b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成共价键的酶接触，从而引入包括标签序列的分子内环状结构；以及c)分离所得的环化的蛋白物质。
因此，本发明涉及酶介导的环化的方法。本文中所使用的表述“酶介导的环化”是指至少有一个成环所需的步骤是靠酶来完成的，即非化学的。酶的步骤可在体内(非人类或非动物宿主细胞)或体外进行。酶介导的步骤可包括氨基酸残基的酶修饰(如脱水)，和/或酶法使环闭合。酶法环化可仅包括高反应活性的脱氢丙氨酸的酶法形成，也可包括环化酶作用(Rink，R.，2007.生物化学46：13179-13189)。
特别是，本发明提供用于提供含有目的多肽和环状亲和标签的蛋白物质的酶法，包括下述步骤：
a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体含有所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中
X1和X2代表侧链可由能够在残基X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶(lantibiotic emzyme)连接的氨基酸；
标签是当环化时作为亲和标签的氨基酸序列，所述亲和标签可将蛋白物质捕获到该标签的特异结合配偶体上；
且其中所述基序N端带有羊毛硫抗生素前导序列；
b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶接触，从而引入含有标签序列的分子内环状结构；以及
c)分离所得的环化的蛋白物质。
在一个实施方案中，步骤a)和b)在含有所述至少一种能在X1和X2之间形成共价键的酶的宿主细胞中进行的，所述宿主提供编码所述前体蛋白物质的核酸序列。也可通过重组表达来提供所述前体蛋白物质，并通过在体内使该物质与适合的酶接触实现环的闭合。优选步骤c)包括使用该环化的标签序列的固定化结合配偶体，如抗体或其它蛋白物质。例如，适合使用亲和层析法。
目的多肽可以是任何蛋白分子，包括生物活性多肽，如激素、抗菌肽、受体激动剂、受体拮抗剂或无生物效应的受体结合肽。向(生物)活性的目的羊毛硫抗生素多肽中引入羊毛硫抗生素酶介导的硫醚桥是本领域已知的。例如见Kluskens等.J.Pharm.and Exp.治疗学(Therapeutics)，2009，Vol.328，No.3；Rink等，2007，生物化学，Vol46，No.45，13179-13189；US 2005/164339。然而，能够特异性捕获多肽的含有硫醚环化的亲和标签的多肽，迄今为止从未被披露或提出。
根据本发明，蛋白物质中至少一种通式为X1-标签-X2的标签序列(基序)相对于目的多肽的位置可以有所不同。在一个实施方案中，基序插入到目的多肽的氨基酸序列中(“内在”标签)。然而，外源序列的插入可能对蛋白的功能是有害的。因此，优选将基序，例如通过N-或C-端融合(“外部”或“外源性”标签)添加到目的多肽上。在这种情况下，蛋白物质可包括所述目的多肽和至少一种基序之间的裂解位点，使该基序可以通过下述步骤c)的适合的裂解酶的接触释放目的多肽而去除。典型的裂解位点包括因子X或Glu-C裂解位点。
在优选的实施方案中，蛋白物质是其中一部分被至少一种所述基序取代的目的多肽，因此该基序是所述目的多肽不可分割的一部分(“内在”标签)。正如将在下面描述的，可通过将组成天然存在的分子内环状结构的一段氨基酸替换为编码(至少当环化时)亲和标签的氨基酸序列来实现内在标签，而该替换保持该多肽的所需特性完好。这种方法特别适合向生物法生产的硫醚桥的肽中引入亲和标签，如乳酸链菌素或任何其它类型的羊毛硫抗生素。内在亲和标签的一个好处是，它无需高成本地去除标签。
标签是当环化时作为亲和标签的氨基酸序列。术语“亲和标签”是本领域众所周知的，本技术人员应知晓，它是指能够结合(蛋白)非天然结合配偶体的氨基酸序列，通常其解离常数在微摩尔范围，例如小于10μM。本文中所使用的术语“亲和标签”，是指多肽序列，其具有特异性地捕获试剂的亲和力，且可从蛋白库中分离得到，从而基于它对所述结合配偶体的亲和力而进行纯化。因此，所述亲和标签可将本发明的蛋白物质捕获到特异性的结合配偶体上。优选的标签序列由2-20个氨基酸残基组成，更优选2-15个。因此，X1和X2可被最多20个，优选最多15个，更优选2-8个氨基酸残基，例如4、5、6或7个氨基酸分隔开。本文中所使用的术语亲和标签是指能够特异性地结合到标签特异性结合配偶体的任何序列。通常该结合的特点是高Kon和低Koff。含有标签的蛋白物质通常比标签本身大至少1.5倍，一般大2-8倍。虽然本发明是以环化的Strep-标签为例，但是本发明的方法不限于任何类型的能够捕获蛋白物质，从而使该物质得以纯化、分离和/或固定的亲和标签。该物质的其它部分，即含有待修饰的肽的“非标签”部分，将不结合到标签结合配偶体上，但当然可以有独特的结合配偶体，如受体或酶。
在一个实施方案中，标签序列包括或由Arg-Gly-Asp(RGD)组成，且能够结合糖蛋白IIb/IIIa粘附分子。在另一个实施方案中，标签序列是具有对链菌素亲和力至少亚微摩尔级Kd的结合亲和力的链菌素结合序列(链菌素标签)。例如，链菌素结合序列选自下组：His-Pro-Gly(HPG)、His-Pro-Lys(HPK)、His-Pro-Met(HPM)、His-Pro-Gln(HPQ)和His-Pro-Gln-Phe(HPQF)。在一个特定的方面，链菌素结合序列是His-Pro-Gln(HPQ)或His-Pro-Gln-Phe(HPQF)。其它有用的标签序列包括DVEAW、DVEAWL/I、DVEA、VEAW、DVE、VEA、EAW、VPLVET、DVXAW、EPDWF/Y、GDF/WXF、PWXWL、VPEY，其中X为任意氨基酸(见US 6841359和US2008/0032340)。这些标签中的任一个有利于用于其中步骤c)包括基于链菌素亲和层析的方法中。
含有标签序列的形成细胞内环状结构的氨基酸残基X1和X2的选择，当然要取决于所使用的酶的活性。例如，如果羊毛硫抗生素酶的活性用于酶法的环闭合，则X1和X2代表侧链可转化为(甲基)羊毛硫氨酸桥的残基。此外，为使基序可被羊毛硫抗生素酶识别，使基序前端带有羊毛硫抗生素前导序列。因此，本发明提供用于提供含有目的蛋白和环状亲和标签的蛋白物质的酶法，包括步骤：
a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体含有所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中X1选自Dhb(脱氢丁氨酸)、Dha(脱氢丙氨酸)、Thr和Ser，且其中X2是Cys或Lys；或其中X1是Cys或Lys，且X2选自：Dhb、Dha、Thr和Ser；且其中所述基序N端带有羊毛硫抗生素前导序列。前导序列和标签序列之间的距离可有所不同，但一般为0和100个氨基酸之间，优选0和50个氨基酸之间，更优选0和20个氨基酸之间；
b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成共价键的羊毛硫抗生素酶接触，从而引入含有标签序列的分子内环状结构；以及
c)分离所得的含有羊毛硫抗生素酶环化的硫醚桥亲和标签的蛋白物质；该硫醚键在D-和L-氨基酸之间或在L-和D-氨基酸之间。
在优选的实施方案中，X1是Dha或Dhb，且X2是Cys。合适的羊毛硫抗生素前导序列是本领域众所周知的，其包括天然存在的或基因改造的羊毛硫抗生素前导序列。例如乳酸链球菌素(nisin)或乳链球菌素3147前导序列。用于本发明的优选的前导序列包括该前导序列内带有从裂解位点开始至因子X或GluC裂解位点结束的-18～-15位置处的保守的FNLD盒的前导序列。或者，前导序列可在-8～-6位置处带有保守的ELD盒且在-14～-12位置处带有EEV，其C末端也带有因子X或GluC裂解位点。用于本发明的带有保守盒的一些比对的前导序列描述于US2009042246中。
各种可能的羊毛硫抗生素酶可用于催化环闭合。部分取决于X1和X2的性质，所述前体蛋白物质可与羊毛硫抗生素酶LanM、环化酶LanC(在脱氢残基和半胱氨酸组合的情况下)或(例如在X1或X2是Ser或Thr的情况下)羊毛硫抗生素脱水酶LanB和环化酶LanC的组合接触。本发明的方法可在含有一种或多种产羊毛硫氨酸蛋白的酶的宿主细胞中有效地实施。例如，所述宿主细胞含有蛋白LanB；LanC和LanT；LanM和LanT；LanB和LanC；或仅LanM。合适的宿主细胞是革兰氏阳性菌，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、表皮链霉菌(Streptococcus epidermis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或放线菌，如加尔巴丁游动放线菌(Actinoplanes garbadinensis)。优选用编码所述前体蛋白物质的多核苷酸转化的产羊毛硫抗生素的宿主是产乳链球菌素3147的宿主，或产乳酸链菌素的宿主。更优选的，产乳链球菌素3147的宿主和产乳酸链菌素的宿主是乳酸乳球菌菌株NZ9000。当用带有羊毛硫抗生素酶系统的，其中转运蛋白(transporter)也具有前导肽酶(leaderpeptidase)活性的宿主细胞时，相应地它不含有自身防御系统对新的羊毛硫抗生素的识别。在其它系统中，前导肽酶可被留在宿主细胞外，从而产生仍连接有前导肽的新的羊毛硫抗生素，从而确保该羊毛硫抗生素前体(prelantibiotic)无活性且对产生细胞无害，直至从收获的羊毛硫抗生素前体中去掉该前导肽。由LanM体外合成含有链菌素结合基序的硫醚环也是可能的。
含多肽的(甲基)羊毛硫氨酸环化的标签基序可由包含两个质粒的表达系统的细胞方便地制备。lanBTC或lanMT可由一个质粒编码，例如双向复制的pIL质粒。前体蛋白物质可由第二个质粒编码，比如pNZ4048滚环复制质粒。在同一质粒中具有修饰的基因和编码将被环化的蛋白的多核苷酸也是可能的，但很少实际使用。因此，在一个特定的方面，所述宿主细胞含有编码所述前体蛋白质物质的第一载体和编码一种或多种羊毛硫抗生素酶，例如LanBTC或LanMT的第二载体。因此，本发明还涉及编码前体蛋白物质的核酸序列，含有所述核酸序列的载体以及提供所述核酸序列，优选为合适的表达载体一部分的宿主细胞。
如果目的蛋白本身还(即除了所述环化的亲和标签外)含有至少一种含硫醚的分子内环状结构，则本发明用于提供带有硫醚环化的亲和标签的目的蛋白的方法是特别有利的。例如，它提供了高效、一步完成和纯化生物法制备的硫醚桥肽的具体过程。另一个有吸引力的应用为羊毛硫抗生素的纯化，其中环化的标签作为羊毛硫抗生素的内在标签存在。例如，它提供了以硫醚桥Strep-标签取代环DE的乳酸链菌素。由此产生的乳酸链菌素突变体易于用链菌素标签柱纯化。由于乳酸链菌素A为全世界广泛应用，显著提高产量的方法有着巨大的商业重要性。与用于羊毛硫抗生素纯化的已有(即外部)标签相比，优点是高亲和力使产量高、纯度高，且不需要高成本地去除外部标签。
然而，另一个应用涉及产生固定于芯片上的硫醚肽库。硫醚桥肽可强烈的增强治疗潜力(Kluskens等.(2009)J.of Pharm.and Exp.Therapeutics，Vol.328，849-854)。为了获得稳定的硫醚桥肽，通常通过筛选以选出功能肽。特异的硫醚桥肽可在含有羊毛硫抗生素酶的宿主细胞，像乳酸乳球菌中产生。然而，在后一种情况下，所述肽没有物理连接于它们的DNA，从而对选定的肽的序列的鉴定构成了障碍。根据本发明披露的方法，含有羊毛硫抗生素酶引入的硫醚亲和标签的硫醚桥肽可由生物法制备。因此，肽可被制备、鉴定和固定于，如提供环化的标签的合适结合配偶体的多个相同芯片的具体点上。这可生产具有羊毛硫抗生素酶环化的硫醚肽库，其可用来筛选特殊性质，如结合或激酶介导的磷酸化。在一个特定的方面，目的多肽是硫醚桥肽库的成员，例如，六、七或八肽库的成员。库内的肽可用来筛选种类繁多的特性，包括作为激酶底物或受体配体，如Her-2受体结合肽或G3P受体结合肽。
在优选的实施方案中，设计基序X1-标签-X2用于生物法制备硫醚环化的链菌素结合序列。为此，基序可含有选自His-Pro-Gly(HPG)、His-Pro-Lys(HPK)、His-Pro-Met(HPM)、His-Pro-Gln(HPQ)和His-Pro-Gln-Phe(HPQF)的序列，该序列两侧是X1和X2，其中X1选自Dhb、Dha、Thr和Ser，且其中X2是Cys或Lys；或其中X1是Cys或Lys，且X2选自Dhb、Dha、Thr和Ser。优选所述基序含有链菌素结合序列His-Pro-Gln(HPQ)或His-Pro-Gln-Phe(HPQF)。发明人发现羊毛硫抗生素环化酶可催化含链菌素序列(如DhbHPQFC和DhbHPQFGC)的环闭合。至少下列原因是预料不到的：(i)这些序列根本不会在天然羊毛硫抗生素中出现；(ii)几乎没有任何乳酸链菌素的环C突变被公开，1个羊毛硫抗生素硫醚环中4个残基同时被取代的也没有报道，(iii)破坏螺旋的残基Pro的存在预计将可能降低环的形成。
例如组成氨基酸序列的X1-标签-X2基序选自下组：
Dha-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Cys；
Ser-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Thr-His-Pro-Gln-Phe-Cys；
Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dha；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dhb；
Cys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Cys；Ser-His-Pro-Gln-Cys；
Thr-His-Pro-Gln-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Dha；Cys-His-Pro-Gln-Dhb；
Cys-His-Pro-Gln-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Thr；Ser-His-Pro-Gln-Phe-Lys；
Thr-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；
Lys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Phe-Lys；
Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Dha；Lys-His-Pro-Gln-Dhb；Ser-His-Pro-Gln-Lys；Thr-His-Pro-Gln-Lys；
Lys-His-Pro-Gln-Ser；Lys-His-Pro-Gln-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Lys；
Dhb-His-Pro-Gln-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Dha；and Lys-His-Pro-Gln-Dhb。
在一个优选的实施方案中，序列选自下组：Dha-His-Pro-Gln-Phe-Cys；
Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Cys  ；Ser-His-Pro-Gln-Phe-Cys  ；Thr-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dha；
Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dhb；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Cys；
Ser-His-Pro-Gln-Cys；Thr-His-Pro-Gln-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Dha；
Cys-His-Pro-Gln-Dhb；Cys-His-Pro-Gln-Ser and Cys-His-Pro-Gln-Thr。
另一个方面涉及可由本发明方法获得的含有环状亲和标签的蛋白物质。更具体而言，所述蛋白物质含有羊毛硫抗生素酶介导的环化的亲和标签。例如，它包括两侧是dAla-S-Ala或Ala-S-dAla或dAbu-S-Ala或Ala-S-dAbu或Ala-N-Lys或Lys-N-Ala的环状标签序列。与其中“桥”氨基酸都具有L立体化学结构的化学合成的硫醚交联的标签相比，生物法制备的硫醚环化标签包含D，L-或L，D-硫醚连接的环状结构。因此，在一个实施方案中，提供了含有至少一种环状标签序列的蛋白物质，该标签序列是连接(由N-到C-末端的方向)D-氨基酸和L-氨基酸，或L-氨基酸到D-氨基酸的含有D，L-或L，D-硫醚连接的环状结构的基序的一部分。优选硫醚连接的环状结构连接(由N-到C-末端的方向)D-氨基酸到L-氨基酸。根据本发明，还提供编码蛋白物质的多核苷酸，以及含有所述多核苷酸的载体。根据本发明，还提供含有多核苷酸或载体的宿主细胞。这些是实践本发明方法的特殊用途。
如上所述，所述环状标签可以是外部(无论是N-或C-端)、内部(internal)或内在(intrinsic)标签。在外部标签的情况下，蛋白物质优选含有所述目的多肽和至少一个环状结合基序之间的裂解位点。但优选内在标签。
在一个实施方案中，含有可由本发明方法获得的环状亲和标签的蛋白物质至少含有一条环化的链菌素结合序列，例如选自下组：His-Pro-Gly(HPG)、His-Pro-Lys(HPK)、His-Pro-Met(HPM)、His-Pro-Gln(HPQ)、His-Pro-Gln-Phe(HPQF)。羊毛硫氨酸酶环化的链菌素结合基序有利于用来结合含(甲基)羊毛硫氨酸的目的多肽。例如，所述目的多肽是含有连接D-到L-氨基酸或L-到D-氨基酸的硫醚键的D，L-硫醚桥肽库的成员，如六、七或八肽库的成员。在另一个实施方案中，所述蛋白物质含有或由非天然存在的(突变的)羊毛硫抗生素或含有所述环结构的羊毛硫抗生素片段组成的，且其中所述环状结构包括至少一个含有连接(由N-到C-末端的方向)D-氨基酸到L-氨基酸，或L-氨基酸到D-氨基酸的硫醚桥的环状链菌素结合基序。本领域已描述了30多种羊毛硫抗生素(Sahl等，微生物学年评(AnnualReviews in Microbiology)，52，41-79)。根据它们的结构特点和它们作用方式的不同，将它们分成两大类。A型羊毛硫抗生素(如乳酸链菌素、表皮素和Pep5)是易曲的、拉长的、两亲性分子，其主要在细菌胞浆膜中通过形成孔起作用。相比之下，B型羊毛硫抗生素(如细菌素)具有抑制特定酶的刚性球状末端。羊毛硫抗生素是本领域已知的，任何那些已知的或仍有待发现的，或其片段可被适当地修饰，使至少其中一个环含有亲和标签。例子包括A型羊毛硫抗生素，如乳酸链菌素或枯草菌素、表皮素、鸡葡萄球菌素、变链素1140、变链素I、变链素B-Ny266、金丝桃素A、金丝桃素S，其片段，如乳酸链菌素的环ABC和乳酸链菌素前体(1-45)。在一个实施方案中，本发明提供其中环A突变成含有环状亲和标签序列，如含HPQ的链菌素结合序列的突变羊毛硫抗生素。令人惊讶的是，发现可不丢失抗生素活性作出对环结构的改变。在乳酸链菌素突变体G14H、A15P、L16Q、M17F、ΔG18中，环C的五个残基，GALMG已被四个残基，HPQF取代。这种突变，HPQF-乳酸链菌素以及HPQF-乳酸链菌素Δ(23-34)对指示菌株MG1363的生长产生抑制效果。具体活性比乳酸链菌素略有下降，但产量更高。因此，本发明提供突变羊毛硫抗生素，其中至少环A含有亲和标签，优选其中在天然乳酸链菌素或枯草菌素中4-6位置处的氨基酸序列被链菌素结合序列，如His-Pro-Gln(HPQ)所取代。其它含有HPQ-羊毛硫氨酸的潜在活性的乳酸链菌素突变体在乳酸链菌素的环A中具有如I4H、S5P、L6Q乳酸链菌素中的HPQ序列，或具有被含有如乳酸链菌素A24H、T25P、C26Q、H27F中的序列HPQF的一个环取代的环DE。或乳链球菌素A2的突变体，其中环A中残基16-18(TNT)被HPQ取代。在进一步的实施方案中，至少环C含有亲和标签，优选其中在天然乳酸链菌素或枯草菌素中14-17位置处的氨基酸序列被序列His-Pro-Gln-Phe-Gly(HPQFG)或His-Pro-Gln-Phe(HPQF)，优选His-Pro-Gln-Phe(HPQF)所取代。在其它典型的突变羊毛硫抗生素中，至少环D和E含有亲和标签序列，优选其中在天然乳酸链菌素或枯草菌素中24-27位置处的氨基酸序列被序列His-Pro-Gln-Phe或His-Pro-Gln所取代。
含环状亲和标签的羊毛硫抗生素结构，可方便地用作任何目的多肽的外部标签。然而，它特别适合与本身包含一个或多个硫醚桥的多肽组合(如融合到)使用，例如经遗传工程改造的包含(甲基)羊毛硫氨酸的以提高其代谢稳定性的治疗性蛋白。通过硫醚环的稳定化，将无需频繁的施用肽且以较低剂量施用，而生物利用度和保质期可能会增加。根据本发明连有硫醚环亲和标签可便于蛋白的纯化、检测和/或固定。例如，环化的蛋白物质是由修饰后的其中环C含有链菌素标签序列的乳酸链菌素序列、因子X裂解位点和硫醚连接的Ang-(1-7)类似物组成。典型的硫醚衔接的Ang-(1-7)类似物包括那些在WO2008/018792中披露的。这种分子可以结合到链菌素亲和柱上，并在纯化步骤中经洗涤后，与传统的疏水相互作用相比，获得更高产量和更高纯度。羊毛硫抗生素或其它包含改造的(甲基)羊毛硫氨酸-链菌素结合基序的肽，可采用链菌素柱有效地纯化，这些柱可从一些公司，例如GE Healthcare公司购买到，按照制造商的方案，保持pH值不要过高于7(脱氢残基在碱性条件下不稳定)。
本申请还提供由大量的含有至少一种环状标签序列，例如链菌素结合基序的蛋白物质组成的库，所述标签序列是含有连接(方向由N-到C-)D-氨基酸和L-氨基酸，或L-氨基酸到D-氨基酸的D，L-或L，D-硫醚连接的环状结构的基序的一部分。除了标签序列外，所述蛋白物质可包含一个或多个硫醚桥。例如，所述库含有大量硫醚桥肽，而且每个肽还含有羊毛硫抗生素酶引入的硫醚环化的Strep-标签。库中的每个成员可被固定在固相支持物上，优选以阵列形式。更优选每个成员通过至少一种环状标签序列而固定于以阵列形式点在固相支持物上的合适的(蛋白)结合配偶体上。在一个特定的方面，本发明提供了含有羊毛硫抗生素酶环化的Strep-标签序列库的蛋白物质，每个成员通过Strep-标签固定于以阵列形式点在固相支持物(链菌素芯片)上的链菌素上。在本发明的范围内，还包括这种库在鉴定目的肽序列，例如蛋白激酶底物或受体配体中的应用。
本技术人员应理解本发明其它有用的应用。例如，硫醚桥亲和标签可用于纯化、分离和/或固定含有所述标签的多肽。因此，本发明还提供分离、纯化和/或固定含有目的多肽和环状亲和标签的蛋白物质，其包括下列步骤：
a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体包括所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中
X1和X2代表侧链可由能够在X1和X2残基之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶连接的氨基酸；
标签是当环化时作为亲和标签的氨基酸序列，所述亲和标签可将蛋白物质捕获到该标签的特异结合配偶体上。通常情况下，只有所述蛋白物质的标签部分介导结合到结合配偶体上，该物质的其它部分不与所述标签结合配偶体相互作用；
且其中所述基序N端带有羊毛硫抗生素前导序列；
b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶接触，从而引入含有标签序列的分子内环状结构；以及
c)使得到的环化的蛋白物质与以解离常数小于10μM结合环化的亲和标签的特异捕获试剂作用，从而分离、纯化和/或固定该物质。所述捕获试剂可固定于固相支持物，例如柱，阵列表面或(磁)珠上。
附图说明
图1：向乳酸链球菌素的环C中酶法引入HPQF
图1A：对半胱氨酸进行DCAP修饰前(实线)和修饰后(虚线)对照肽LMRTTSSLELSDYEQAC的质谱，修饰后质量增加了25Da。
图1B：诱导含编码H14、P15、Q16、F17、ΔG18乳酸链菌素前体的一个质粒以及编码NisB、NisT和NisC的第二质粒的前乳酸链球菌 素，加入阻止二硫键形成的TCEP(实线)和与游离半胱氨酸反应的CDAP(虚线)后，通过质谱分析上清。不与CDAP反应，证明缺少5个半胱氨酸和所有5个硫醚环闭合。
图2：环C中含HPQF的截短的乳酸链菌素突变体的抗菌活性
诱导含编码NisB、NisT和NisC的第一质粒和编码MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTHPQFCNMKEQKLISEED的第二质粒的乳酸乳杆菌(Lactococcus lactis)。上清用胰蛋白酶处理切掉前导肽。在微孔板中形成2倍稀释系列，孵育6小时后通过测定OD600的值来检测肽抑制乳酸乳杆菌(L.lactis)MG1363生长的能力。○：PBS对照，■：截短的乳酸链菌素突变体，
Figure BDA0000117451020000141
产乳酸链球菌素A的乳酸乳杆菌NZ9700的上清。
实验部分
实施例1HPQF替换乳酸链球菌素的环C序列
材料和方法
对照肽是LMRTTSSLELSDYEQAC。基因改造生成乳酸链球菌素突变体。在H14、P15、Q16、F17、ΔG18突变中，由GALMG组成的乳酸链球菌素的环C被HPQF替换。该编码质粒与pIl3BTC[Rink，R.，等2005.(生物化学)Biochemistry 44：8873-8882.]共表达。参照[Rink，R.，等2005.(生物化学)Biochemistry 44：8873-8882]进行质谱分析。通过加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)去掉形成的二硫桥。用1-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)处理，测定半胱氨酸的可获得性。如果硫醚桥中不包含半胱氨酸，它与CDAP反应形成25Da的上移。TCEP-和CDAP-处理的含半胱氨酸的肽，无25Da的上移，表明硫醚桥的存在。
结果
未修饰的对照肽的平均质量(m/z)为1948.2Da。质谱显示1947.5Da的峰对应于未修饰的肽，1963.6Da的峰可能对应这种肽的氧化形式；甲硫氨酸2可能是发生氧化作用的候选氨基酸(图1A，实线)。对应于CDAP修饰，对照肽中清晰的峰相对于所观察到的峰增加了25Da(图1A，虚线)。该过程清楚地证明对照肽中半胱氨酸可被修饰。
含有HPQF，且不含甲硫氨酸-1的完全脱水的乳酸链球菌素前体突变的预计质量是：5911.8-144＝5767.8Da。在上清中观察到质量为5764.2的肽(未示出)。CDAP处理没有导致25Da质量的增加，其应该是CDAP与游离半胱氨酸反应的情况。无反应表明，所有五个半胱氨酸包括于硫醚环中。
为了通过去除前导肽提高质谱的灵敏度，用胰蛋白酶处理含完全脱水的包括基序HPQF的乳酸链球菌素前体突变体的上清，去掉前导肽并进行分析(图1B；实线为CDAP添加前，虚线为CDAP处理后)。预计完全脱水并去掉前导肽后该乳酸链球菌素突变体的质量为3578.2-144＝3434.2Da。此值接近于图1B中测定的主峰3442Da。其它两个峰，3369Da和3486Da的身份未知。图1B表明CDAP的加入没有引起质量值的任何变化。这再次证明，所有的硫醚环是闭合的。显然，缩短的含HPQF，而不含GALMG的环C很好的形成了。
结论
实施例1表明HPQF可由环化酶NisC通过酶法引入到乳酸链球菌素的环C中。
实施例2环C中含亲和标签的截短的乳酸链球菌素突变体的抗菌活性
材料与方法
通过基因工程构建带有内在链菌素标签和外在myc标签的截短的乳酸链球菌素突变体。该构建体编码乳酸链球菌素前导肽(MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR)，其偶联至乳酸链球菌素(1-22)的H14、P15、Q16、F17、ΔG18突变体，即ITSISLCTPGCKTHPQFCNMK上，再偶联至myc标签：EQKLISEED上。因此，总的前导序列是MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTHPQFCNMKEQKLISEED。所述肽是由含pIl3BTC的前乳酸链球菌素产生的。
用胰蛋白酶切掉所述前导肽，并按如下步骤测定抗菌活性：在微孔板中：向第一个柱的孔中加入200μl乳酸链球菌素融合菌株的上清，其它孔中加入200μl对照(阳性，如NZ9700过滤后的上清及阴性)溶液。向其余空的孔中加入100μl培养基。将来自第一个柱的每行(row)100μl加入到第二行中，混合后从第二行加入第三行中等等，形成二倍稀释步骤。以OD600值：0.05-0.1的低密度向所有孔中加入100μl敏感菌株MG1363。6小时后测定OD600值。
结果
图2显示，所述带有含HPQF的环C的截短的乳酸链球菌素变异体具有明显的抗菌活性。
结论
实施例2表明，环C中HPQF的存在不会消除所述截短的乳酸链球菌素突变体的抗菌活性。这是令人惊讶的，因为同时有4个氨基酸发生了突变，并缺失了一个氨基酸。尽管截短了(可能导致缩短了10倍)，尽管带有缩短的环C，尽管带负电荷的尾巴(降低了与阴离子膜的结合)，肽仍然具有活性。

Claims (19)

1.用于提供包括目的多肽和环状亲和标签的蛋白物质的酶法，包括步骤：
a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体含有所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中
X1和X2表示侧链可通过能够在X1和X2残基之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶连接的氨基酸；
标签是当环化时作为亲和标签的氨基酸序列，所述亲和标签可将蛋白物质捕获到该标签的特异性结合配偶体上；
且其中所述基序N端带有羊毛硫抗生素前导序列；
b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶接触，从而引入含有标签序列的分子内环状结构；以及
c)分离所得的环化的蛋白物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目的多肽在N-或C-端融合有至少一种通式为X1-标签-X2的基序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白物质在所述目的多肽和至少一种基序之间含有一个裂解位点，优选其中裂解位点是因子X或Glu-C裂解位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤c)之后，在裂解位点处裂解所述环化的蛋白物质，释放目的多肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白物质为目的多肽，其中目的多肽一部分被至少一种基序取代，使得该基序是所述目的多肽不可分割的一部分。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中X1选自：Dhb、Dha、Thr和Ser，且其中X2是Cys或Lys；或其中X1是Cys或Lys，且X2选自：Dhb、Dha、Thr和Ser。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤a)和b)在含有所述至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶的宿主细胞中完成，所述宿主细胞提供编码所述前体蛋白物质的核酸序列。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中标签含有序列Arg-Gly-Asp。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中标签含有能够与解离常数小于10μM的链菌素结合的链菌素结合序列，优选其中所述链菌素结合序列选自下组：His-Pro-Gly(HPG)、His-Pro-Lys(HPK)、His-Pro-Met(HPM)、His-Pro-Gln(HPQ)和His-Pro-Gln-Phe(HPQF)，优选其中所述链菌素结合序列是His-Pro-Gln(HPQ)或His-Pro-Gln-Phe(HPQF)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中基序X1-标签-X2由选自下组的氨基酸序列组成：Dha-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Ser-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Thr-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dha；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dhb；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Cys；Ser-His-Pro-Gln-Cys；Thr-His-Pro-Gln-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Dha；Cys-His-Pro-Gln-Dhb；Cys-His-Pro-Gln-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Thr；Ser-His-Pro-Gln-Phe  -Lys；Thr-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；Lys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Dha；Lys-His-Pro-Gln-Dhb；Ser-His-Pro-Gln-Lys；Thr-His-Pro-Gln Lys；Lys-His-Pro-Gln-Ser；Lys-His-Pro-Gln-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Lys；Dhb-His-Pro-Gln-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Dha；和Lys-His-Pro-Gln-Dhb。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤b)包括使该前体与羊毛硫抗生素酶LanM、环化酶LanC(在脱氢残基和半胱氨酸组合的情况下)或羊毛硫抗生素脱水酶LanB和环化酶LanC的组合接触，优选其中的步骤a)和b)在含有羊毛硫氨酸蛋白LanB；LanC和LanT；LanM和LanT；LanB和LanC；或LanM的宿主细胞中完成。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述目的多肽天然地含有至少一种含硫醚的分子内环状结构。
13.由根据权利要求1-12任一项所述方法获得的含有环状标签序列的蛋白物质。
14.含有至少一种环状标签序列的蛋白物质，该标签序列是桥接D-氨基酸和L-氨基酸，或L-氨基酸和D-氨基酸(方向由N-至C-)的硫醚连接的环状结构的一部分。
15.根据权利要求14所述的蛋白物质，其中所述环状标签序列是环化的链菌素结合序列，优选含有或由选自下组的序列组成：His-Pro-Gly、His-Pro-Lys、His-Pro-Met、His-Pro-Gln和His-Pro-Gln-Phe。
16.根据权利要求14或15所述的蛋白物质，其包括含有环状结构的突变羊毛硫抗生素或羊毛硫抗生素片段，其中所述环状结构包括至少一种含有桥接D-氨基酸和L-氨基酸，或L-氨基酸和D-氨基酸(方向由N-至C-)的硫醚桥的链菌素结合基序。
17.含有大量权利要求13-16任一项所述蛋白物质的肽库。
18.根据权利要求17所述的肽库，其中每个成员固定在固相支持物上，优选以阵列形式。
19.根据权利要求18所述的肽库，其包括大量含有至少一种环状链菌素结合基序的蛋白物质，其中每个成员通过至少一种环状链菌素结合基序而固定于以阵列形式点在固相支持物上的链菌素上。
CN2010800253560A 2009-06-24 2010-06-23 生物法制备的环状亲和标签 Pending CN102803287A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09163581.3 2009-06-24
EP09163581A EP2267003A1 (en) 2009-06-24 2009-06-24 Biologically produced cyclic affinity tags
PCT/NL2010/050389 WO2010151126A1 (en) 2009-06-24 2010-06-23 Biologically produced cyclic affinity tags

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102803287A true CN102803287A (zh) 2012-11-28

Family

ID=41064553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800253560A Pending CN102803287A (zh) 2009-06-24 2010-06-23 生物法制备的环状亲和标签

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20120165230A1 (zh)
EP (2) EP2267003A1 (zh)
JP (1) JP5909812B2 (zh)
CN (1) CN102803287A (zh)
AU (1) AU2010263353B2 (zh)
CA (1) CA2761471C (zh)
DK (1) DK2445926T3 (zh)
ES (1) ES2551855T3 (zh)
NZ (1) NZ596259A (zh)
WO (1) WO2010151126A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6669670B2 (ja) * 2014-05-15 2020-03-18 クリーヴランド ハートラボ インコーポレイテッド Ｈｄｌ及びａｐｏａ１の精製及び検出のための組成物及び方法
KR102357604B1 (ko) * 2017-07-31 2022-02-08 도꾜 다이가꾸 환상 펩티드를 단백질 구조에 제시시키는 초범용법
CN113354718B (zh) * 2021-06-21 2023-06-02 重庆市畜牧科学院 一种哌尼生素前体、表达盒及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050164339A1 (en) * 2004-01-12 2005-07-28 Van Der Donk Willem A. Compositions and methods for dehydration and cyclization of peptides, synthetic compounds, and lantibiotics

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6028168A (en) * 1991-08-09 2000-02-22 Winfried Kolbeck Lanthionine bridged peptides
US6841359B2 (en) 2000-10-31 2005-01-11 The General Hospital Corporation Streptavidin-binding peptides and uses thereof
ATE370159T1 (de) 2002-03-01 2007-09-15 Volker A Erdmann Streptavidin-bindungspeptid
US6861236B2 (en) * 2002-05-24 2005-03-01 Applied Nanosystems B.V. Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
US6794181B2 (en) * 2002-10-09 2004-09-21 Immucell Corporation Method of purifying lantibiotics
WO2006062398A2 (en) * 2004-12-07 2006-06-15 Applied Nanosystems B.V. Methods for the production and secretion of modified peptides
JP4955001B2 (ja) * 2005-08-12 2012-06-20 オラジェニックス，インコーポレイテッド 特異的に保護された直交ランチオニン技術
US20080032340A1 (en) 2006-06-09 2008-02-07 University Of Arizona Peptide motifs for binding avidin or neutravidin
WO2008130217A1 (en) 2006-08-08 2008-10-30 Applied Nanosystems B.V. Cyclic angiotensin analogs
EP2405008A1 (en) * 2010-07-06 2012-01-11 LanthioPep B.V. Bacterial surface display of thioether-bridge-containing peptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050164339A1 (en) * 2004-01-12 2005-07-28 Van Der Donk Willem A. Compositions and methods for dehydration and cyclization of peptides, synthetic compounds, and lantibiotics

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUDREY KELLEMAN ET AL: "Incorporation of Thioether Building Blocks into an αvβ3-Specific RGD Peptide:", 《BIOPOLYMERS》 *
J. LUBELSKI等: "Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin", 《CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES》 *
LEON D. KLUSKENS ET AL.: "Angiotensin-(1–7) with Thioether Bridge：An Angiotensin-Converting Enzyme-Resistant, Potent Angiotensin-(1–7) Analog", 《THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS》 *
LEON D. KLUSKENS ET AL.: "Angiotensin-(1–7) with Thioether Bridge：An Angiotensin-Converting Enzyme-Resistant, Potent Angiotensin-(1–7) Analog", 《THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS》, vol. 328, no. 3, 31 March 2009 (2009-03-31), XP009123055, DOI: doi:10.1124/jpet.108.146431 *
LUTZ B. GIEBEL ET AL.: "Screening of Cyclic Peptide Phage Libraries Identifies Ligands That Bind Streptavidin with High Affinities", 《BIOCHEMISTRY》 *
RINK RICK等: "NisC, the cyclase of the lantibiotic nisin, can catalyze Cyclization of designed nonlantibiotic peptides", 《BIOCHEMISTRY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5909812B2 (ja) 2016-04-27
DK2445926T3 (en) 2015-10-19
WO2010151126A1 (en) 2010-12-29
CA2761471C (en) 2018-06-12
CA2761471A1 (en) 2010-12-29
ES2551855T3 (es) 2015-11-24
AU2010263353A1 (en) 2011-12-08
EP2267003A1 (en) 2010-12-29
NZ596259A (en) 2013-07-26
EP2445926B1 (en) 2015-08-12
EP2445926A1 (en) 2012-05-02
AU2010263353B2 (en) 2016-05-12
JP2012531199A (ja) 2012-12-10
US20120165230A1 (en) 2012-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kreil D-amino acids in animal peptides
JP5352234B2 (ja) 特定のエンドプロテアーゼによって塩基性アミノ酸のｃ末端を用いてポリペプチドをアミド化する方法
EP1507798B2 (en) Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way
US8114632B2 (en) Method of producing biologically active polypeptide having insulinotropic activity
CN103080318B (zh) 含硫醚桥的肽的细菌表面展示和筛选
US10752931B2 (en) Designing an enzymatic peptide fragment condensation strategy
JP6653979B2 (ja) ペプチドライブラリの構成方法
CN111349177B (zh) 一种融合抗菌肽cat的制备方法和应用
CN102803287A (zh) 生物法制备的环状亲和标签
US10336994B2 (en) Subtilisin variants having a mutation in the S2 or S2# pocket
US6337194B1 (en) Method for the preparation of insulin by cleavage of a fusion protein and fusion proteins containing insulin A and B chains
US5837485A (en) DNA encoding and biosynthetic process for the preparation of chemical compounds, lantibiotics
Altamura et al. Systems for production of proteins for biomimetic membrane devices
CN114560911B (zh) 一种抗真菌肽及其制备方法
Hill et al. Lantibiotic immunity
Acher Evolution of Proteins: From Gene Determinism to Cellular Integration
Maddy et al. Membrane biogenesis
McKinney Studies of the Saccharomyces cerevisiae alpha-factor mating pheromone and its receptor (the STE2 gene product)

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: GERMANY MORPHOSYS COMPANY

Free format text: FORMER OWNER: LANTHIOPEP B. V.

Effective date: 20150226

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150226

Address after: German Pla Neg

Applicant after: Germany MorphoSys company

Address before: Groningen

Applicant before: Lanthiopep B.V.

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20121128