PL200919B1 - Zastosowanie kompozycji czynnika hamującego angiogenezę i czynnika przeciwnowotworowego, kompozycja terapeutyczna do leczenia nowotworów i zestaw do traktowania komórki nowotworowej - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji czynnika hamuj acego angiogenez e i czynnika przeciwnowotworowego do wytwarzania leku do leczenia nowotworów, kompozycji terapeutycznej do leczenia nowotworów i zestawu do traktowania komórki nowotworowej. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji czynnika hamującego angiogenezę i czynnika przeciwnowotworowego, kompozycja terapeutyczna do leczenia nowotworów i zestaw do traktowania komórki nowotworowej.

Wynalazek dotyczy hamowania nowotworów pierwotnych i przerzutów przy użyciu terapii opartej na łącznym stosowaniu terapii antyangiogennej i ukierunkowanej przeciwnowotworowej immunoterapii.

Tworzenie się nowych naczyń krwionośnych, czyli angiogeneza, odgrywa kluczową rolę w rozwoju złośliwej choroby i stanowi przedmiot zainteresowania przy poszukiwaniu czynników hamujących angiogenezę (patrz przykładowo, Holmgren L., O'Reilly M.S. & Folkman J. (1995) „Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression”, Nature Medicine 1, 149-153; Folkman J. (1995) „Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease”, Nature Medicine 1, 2731; O'Reilly M.S. i wsp., (1994) „Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediatesthe suppression of metastases by Lewis lung carcinoma”, Cell 79, 315-328; Kerbel R.S. (1997) „A cancer therapy resistant to resistance”, Nature 390, 335-336; Boehm T. i wsp., (1997), Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance”, Nature, 390, 404-7; Volpert O.V. i wsp., (1998) „A human fibrosarcoma inhibits systemic angiogenesis and the growth of experimental metastases via thrombospondin-1”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95, 6343-6348).

Stosowanie antagonistów integryny α_νβ₃ do hamowania angiogenezy jest znaną metodą hamowania rozwoju guza litego dzięki ograniczeniu dostarczania krwi do takiego guza. Patrz przykładowo patent USA nr 5,753,230 (Brooks & Cheresh) oraz patent USA nr 5,766,591 (Brooks & Cheresh), w których opisano użycie antagonistów α_νβ₃, takich jak polipeptydy syntetyczne, przeciwciała monoklonalne oraz mimetyki a_ve₃, które wiążą się z receptorem a_ve₃ i hamują angiogenezę.

Dodatkowo, opisano terapie wykorzystujące białko fuzyjne przeciwciało-cytokina, które promują hamowanie za pośrednictwem odpowiedzi odpornościowej ustalonych nowotworów, takich jak raki przerzutowe. Przykładowo cytokinę, interleukinę 2 (IL-2), połączono w fuzję z łańcuchem ciężkim przeciwciała monoklonalnego, w dwóch oddzielnych białkach fuzyjnych, immunoreaktywnym z antygenową cząsteczką adhezyjną komórki nabłonkowej towarzyszącą nowotworowi (Ep-CAM, KSA, antygen KS1/4) lub disialogangliozydem GD2 przy użyciu odpowiednio przeciwciał KS1/4 i ch14.18 tworząc odpowiednio białka fuzyjne ch14.18-IL-2 i KS1/4-IL-2. Patrz przykładowo patent USA nr 5,650,150 (Gillies).

Zidentyfikowanie specyficznych dla układu naczyniowego inhibitorów angiogenezy, które są synergistyczne z terapiami swoiście skierowanymi przeciwko przedziałowi nowotworowemu, pozwoli na opracowanie optymalnie skutecznego leczenia raka.

Angiogeneza charakteryzuje się inwazją, migracją i proliferacją komórek śródbłonka, procesami które zależą od oddziaływań komórkowych ze składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym kontekście wykazano, że receptor śródbłonkowy dla integryny a_ve₃ odgrywa kluczową rolę przez dostarczanie specyficznego dla układu naczyniowego celu dla strategii leczenia przeciwangiogenicznego. (Brooks P.C., Clark R.A. & Cheresh D.A. (1994) „Requirement of vascular integrin alfa v beta 3 for angiogenesis” Science 264, 569-571; Friedlander M. i wsp., (1995) „Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v integrins” Science 270, 1500-1502). Wymaganie integryny a_ve₃ z naczyń krwionośnych w procesie angiogenezy wykazano na wielu modelach in vivo, w których wytwarzanie nowych naczyń krwionośnych przez transplantowane ludzkie guzy było całkowicie zahamowane albo przez ogólnoustrojowe podawanie antagonistów peptydowych dla integryny a_ve₃ lub przeciwciał LM609 przeciwko a_ve₃. (Brooks P.C. i wsp., (1994) Science supra; Brooks P.C. i wsp., (1994) „Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels”, Cell 79, 11571164). Hybrydoma mysią LM609 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) jako Międzynarodowym Organie Depozytowym (International Deposit Authority) zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, pod numerem dostępu ATCC HB 9537, 15 września 1987. Tacy antagoniści blokują łączenie się integryny a_ve₃, która promuje apoptozę proliferujących angiogennych komórek naczyniowych, a tym samym przerywa dojrzewanie nowotworzących się naczyń krwionośnych, istotnego zdarzenia dla proliferacji nowotworów.

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) zidentyfikowano jako selektywny angiogenny czynnik wzrostu, który może stymulować mitogenezę komórek śródbłonka. Bioptaty ludzkiego nowotworu wykazują wzmocnioną ekspresję mRNA dla VEGF w komórkach złośliwych oraz mRNA dla receptora VEGF w przylegających komórkach śródbłonka. Wydaje się, że ekspresja VEGF jest wyższa w regionach guzów przyległych do martwiczych obszarów pozbawionych naczyń (jako artykuł

PL 200 919 B1 przeglądowy patrz Thomas i wsp., (1996) „Vascular Endothelial Growth Factor, a Potent and Selective Angiogenic Agent”, J. Biol. Chem. 271(2): 603-606). Skuteczne terapie przeciwnowotworowe mogą wykorzystywać docelowy receptor VEGF w celu hamowania angiogenezy przy użyciu przeciwciał monoklonalnych. (Witte L. i wsp., (1998) „Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2 (Flkl/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy”, Cancer Metastasis Rev 17 (2) :155-61).

Główną przeszkodą w skutecznym leczeniu rozsianych przerzutów jest szczątkowa choroba charakteryzująca się mikroprzerzutami, którym brak dobrze rozwiniętych naczyń krwionośnych dostarczających leki. Pod tym względem nowa strategia immunoterapii dostarcza skutecznych w użyciu swoistych dla przedziału nowotworowego przeciwciał monoklonalnych kierujących cytokiny do mikrośrodowiska nowotworowego. Uzyskuje się to stosując zrekombinowane białka fuzyjne przeciwciało-cytokina wytwarzane w celu utrzymania unikalnej swoistej zdolności przeciwciał monoklonalnych do kierowania do nowotworu oraz modulującej funkcji immunologicznej cytokin. Użycie białka fuzyjnego przeciwciało IL-2 kierującego IL-2 do przedziału nowotworowego indukowało aktywację komórek efektorowych atakujących mikrośrodowisko nowotworowe oraz powodowało skuteczną likwidację ustalonych przerzutów w trzech różnych syngenicznych modelach mysich nowotworów. (Becker J.C. i wsp., (1996) „T cell-mediated eradication of murine metastatic melanoma induced by targeted interleukin 2 therapy”, J. Exp. Med. 183, 2361-2366, Xiang R. i wsp., (1997) „Elimination of established murine colon carcinoma metastases by antibody-interleukin 2 fusion protein therapy”, Cancer Res. 57, 4948-4955; Lode H.N. i wsp., (1998) „Natural killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bone marrow by targeted interleukin-2 therapy”, Blood 91, 1706-1715). Chociaż całkiem skuteczne we wczesnych stadiach przerzutów nowotworowych, podejście to zastosowane w stosunku do przedziału nowotworowego może jedynie opóźniać rozwój przerzutów w późnych stadiach rozwoju nowotworu, charakteryzujących się w pełni rozwiniętym przedziałem naczyniowym. Postawiliśmy tu pytanie, czy istnieje korzystna komplementacja strategii leczenia kierowanego do naczyń krwionośnych i przedziału nowotworowego, które są synergistyczne, gdy są stosowane jako kombinacje strategii następujących po sobie lub jednocześnie.

Badano to w trzech modelach syngenicznych mysich nowotworów raka okrężnicy, czerniaka i nerwiaka niedojrzał ego, który charakteryzował się samorzutnymi przerzutami do w ą troby. Wszystkie trzy modele wykazują bliskie podobieństwo do chorób u ludzi. W modelach czerniaka i nerwiaka niedojrzałego wytwarzany jest disialogangliozyd GD2, dobrze wykształcony antygen towarzyszący nowotworowi w takich neuroektodermalnych zmianach nowotworowych (Irie R.F., Matsuki T. & Morton D.L. (1989) „Human monoclonal antibody to ganglioside GM2 for melanoma treatment”, Lancet 1, 786-787; Handgretinger R. i wsp., (1995) „A phase I study of human/mouse chimeric antiganglioside GD2 antibody ch14.18 in patients with neuroblastoma”, Eur. J. Cancer 31A, 261-267) natomiast modelraka okrężnicy charakteryzował się wytwarzaniem cząsteczki adhezyjnej komórki nabłonkowej (Ep-CAM, KSA, antygen KS 1/4), stanowiącej cząsteczkę docelową z powodzeniem wykorzystywaną w biernej terapii odpornościowej u człowieka (Riethmuller G. i wsp., (1994) „Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Duke's C colorectal carcinoma”, Lancet 343, 1177-1183). Antygeny te specyficznie zarysowują w tych modelach przedział nowotworowy, przeciwko któremu skierowane są białka fuzyjne przeciwciało-interleukina-2 z chimerowym ludzkim/mysim przeciwciałem przeciwko GD2 (ch14.18-IL-2) (Gillies S.D. i wsp., (1992) „Antibody-targeted interleukin 2 stimulates Tcell killing of autologous tumor cells”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 892, 1428-1432) oraz humanizowanym przeciwciałem KS1/4-IL-2 anty-Ep-CAM (antygen przeciw-KSA, przeciw-KS1/4) (Xiang R. i wsp., (1997) supra; Gillies S. i wsp., (1998) „Antibody-IL-12 fusion proteins are effective in SCID mouse models of prostrate and colon carcinoma metastases”, J.Immunol. 160, 6195-6203). Przedział naczyniowy w tych modelach nowotworów, jak opisano dla kilku modeli zwierzęcych, jest określany przez ekspresję integryny α_νβ₃ w nowo tworzących się naczyniach krwionośnych. (Brooks P.C. i wsp., (1994) supra). Przedstawiane tu wyniki pokazują synergistyczną skuteczność jednoczesnego lub następującego po sobie leczenia swoiście skierowanego na przedziały nowotworowe i naczyniowe nowotworów pierwotnych i odległych przerzutów. Mechanizm tego synergistycznego działania wynika ze zmniejszenia się tworzenia naczyń krwionośnych i zwiększenia zapalenia jedynie u zwierząt poddawanych terapii łączonej. Obserwacje te podkreślają korzystny wpływ łączonego podejścia przeciwangiogennnego ze swoistą dla nowotworu przeciwnowotworową immunoterapią.

PL 200 919 B1

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji obejmującej:

a) czynnik hamujący angiogenezę, którym jest antagonista α_νβ₃ wybrany z grupy składającej się z peptydu, peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciwko a_ve₃, przeciwciała monoklonalnego przeciwko receptorowi a_vp₃, oraz mimetyku a_ve₃, i

b) immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy obejmujący składnik, którym jest efektor komórkowy oraz składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi, przy czym efektor komórkowy jest cytokiną wybraną z grupy składającej się z BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF,. Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I309/TCA-3, gamma- IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF, a składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuchem immunoglobuliny (Ig) obejmującym region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wybranym z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptora EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptora IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikanu MCSP towarzyszącego czerniakowi, PSA oraz receptora transferyny do wytwarzania leku do leczenia nowotworów.

Korzystnie peptyd zawierający RGD ma sekwencję reszt aminokwasowych cyklo(RGDfN-MeV)(Sekw. Id. Nr:11).

Korzystnie cytokina jest chemokiną wybraną z grupy składającej się z C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyny, GCP-2, HCC-1, I309, IL-8, IP-10, limfotaktyny, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

Korzystnie immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem GD2 towarzyszący nowotworowi lub cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem KSA (Ep-CAM; antygen KS 1/4) związanym z nowotworem.

Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku korzystnie podaje się gdy nowotwór jest pochodzenia neuroektodermalnego lub nabłonkowego, lub równie korzystnie podaje się gdy nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z: gruczolaka, mięsakonaczyniaka krwionośnego, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, glioblastoma, glejaka, hamartomy, naczyniaka krwionośnego z komórek śródbłonka, naczyniakomięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka, rdzeniaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, glejaka siatkówki, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja terapeutyczna do leczenia nowotworu obejmująca co najmniej jeden czynnik hamujący angiogenezę, który jest antagonistą a_ve₃ wybranym z grupy składającej się z peptydu, peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciwko a_ve₃, przeciwciała monoklonalnego przeciwko receptorowi a_ve₃, oraz mimetyku a_ve₃, oraz co najmniej jeden immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy, który obejmuje składnik, który jest efektorem komórkowym połączonym ze składnikiem kierującym na antygen towarzyszący nowotworowi, przy czym efektor komórkowy jest cytokiną wybraną z grupy składającej się z BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Ft3L, G-CSF, GM-CSF, I309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-l, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL- 17, IL- 18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF, a składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuchem immunoglobuliny (Ig) obejmującym region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi wybranym z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptora EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptora IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikanu MCSP towarzyszącego czerniakowi, PSA oraz receptora transferyny.

Korzystnie kompozycja obejmuje:

a) ilość co najmniej jednego czynnika hamującego angiogenezę wystarczającą do zahamowania angiogenezy w nowotworze lub przerzutach nowotworowych oraz

b) ilość co najmniej jednego immunoterapeutycznego czynnika przeciwnowotworowego wystarczającą do wywołania odpowiedzi biologicznej.

Korzystnie antagonista jest peptydem zawierającym RGD, który ma sekwencję aminokwasową cyklo(RGDfN-MeV) (SEQ ID NO: 11).

PL 200 919 B1

Korzystnie w kompozycji terapeutycznej cytokina jest chemokiną i jest wybrana z grupy składającej się z: C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyna, GCP-2, HCC-1, I-309, IL-8, IP-10, limfotaktyna, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

Korzystnie immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem GD2 towarzyszącym nowotworowi lub białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem KSA (Ep-CAM; antygen KS1/4) towarzyszą cym nowotworowi.

Kompozycję terapeutyczną według wynalazku korzystnie podaje się gdy nowotwór jest wybrany spośród gruczolaka, mięsakonaczyniaka krwionośnego, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, globlastoma, glejaka, hamartomy, naczyniaka krwionośnego z komórek śródbłonka, naczyniakomięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka, rdzeniaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, glejaka siatkówki, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

Wynalazek dotyczy również zestawu do traktowania komórki nowotworowej w nowotworze lub przerzutach nowotworowych obejmującego pakiet zawierający:

a) czynnik hamujący angiogenezę zdolny do hamowania angiogenezy w nowotworze lub przerzutach nowotworowych, którym jest antagonista α_νβ₃ wybrany z grupy składającej się z peptydu, peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciwko α....β₃, przeciwciała monoklonalnego przeciwko receptorowi α....β₃, oraz mimetyku a_ve₃,

b) immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy, który obejmuje składnik, który jest efektorem komórkowym oraz składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi; przy czym składnik efektora komórkowego jest cytokiną wybraną z grupy składającej się z BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Ft3L, G-CSF, GM-CSF, I309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL- 17, IL- 18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF, a składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuchem immunoglobuliny (Ig) obejmującym region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi wybranym z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptora EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptora IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikanu MCSP towarzyszącego czerniakowi, PSA oraz receptora transferyny

c) instrukcję użycia czynników w sposobach leczenia nowotworu i przerzutów nowotworowych.

Korzystnie w zestawie peptyd zawierający RGD jest peptydem o sekwencji aminokwasowej cyklo(RGDfN-MeV) (Sekw Id. Nr: 11).

Korzystnie w zestawie cytokina jest chemokiną wybraną z grupy składającej się z: C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyna, GCP-2, HCC1, I-309, IL-8, IP-10, limfotaktyna, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

Korzystnie w zestawie immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem GD2 towarzyszącym nowotworowi lub białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem KSA (Ep-CAM; antygen KS 1/4) towarzyszącym nowotworowi.

Zestaw według wynalazku korzystnie stosuje się gdy nowotwór lub przerzuty nowotworowe są pochodzenia neuroektodermalnego lub nabłonkowego oraz nowotwór lub przerzuty nowotworowe są wybrane z grupy składającej się z gruczolaka, mięsakonaczyniaka krwionośnego, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, glioblastoma, glejaka, hamartomy, naczyniaka krwionośnego z komórek śródbłonka, naczyniakomięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka, rdzeniaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, glejaka siatkówki, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

Korzystnie czynnik hamujący angiogenezę i immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy są dostarczone w oddzielnych pojemnikach w pakiecie lub czynnik hamujący angiogenezę i immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy są połączone w jednym pojemniku w pakiecie.

Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, kompozycja farmaceutyczna i zestaw według wynalazku służą do leczenia nowotworu i przerzutów nowotworowych przez podawanie pacjentowi kombinacji co najmniej jednego czynnika hamującego angiogenezę i co najmniej jednego immunoterapeutycznego czynnika przeciwnowotworowego. Zahamowanie proliferacji komórki nowotworowej może obejmować zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych w istniejącym nowotworze

PL 200 919 B1 lub przerzutów nowotworowych, zahamowanie tworzenia się dodatkowych przerzutów nowotworowych a nawet śmierci komórki. Czynnik hamujący angiogenezę i czynnik immunoterapeutyczny mogą być podawane zasadniczo równocześnie jak również kolejno. Pacjent może otrzymać kompozycje terapeutyczne według wynalazku przed, w czasie lub po operacji chirurgicznej, której wynikiem jest usunięcie nowotworu w całości lub w części. Podawanie można przeprowadzić przez bezpośrednie zanurzenie; podawanie dożylne (i.v.) układowe lub miejscowe, wewnątrzotrzewnowe (i.p.), podskórne (s.c.), domięśniowe (i.m.) lub przez bezpośrednią iniekcję do masy nowotworowej; i/lub doustne podanie odpowiednich formulacji.

Czynnik hamujący angiogenezę odpowiedni do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku hamuje tworzenie nowych naczyń krwionośnych (neowaskularyzację) lub powiększanie sieci istniejących naczyń kapilarnych w tkankach blisko komórki nowotworowej. Odpowiednimi czynnikami hamującymi angiogenezę mogą być peptydy o aktywności hamującej angiogenezę, takie jak antygen PSA towarzyszący nowotworowi. Innymi dogodnymi czynnikami hamującymi angiogenezę mogą być antagoniści VEGF towarzyszącego angiogenezie, przykładowo antagoniści receptora VEGF z powierzchni komórek. Korzystnym czynnikiem hamującym angiogenezę jest antagonista wiązania integryny α_νβ₃ z komórkami. Antagonistą α_νβ₃ do zastosowania w rozwiązaniach według niniejszego wynalazku jest cząsteczka, która hamuje angiogenezę w nowotworze lub tkankach objętych przerzutami nowotworowymi, gdy podawana jest do docelowej tkanki lub komórek. Antagonistami takimi mogą być unikalne liniowe lub cykliczne polipeptydy, liniowe lub cykliczne polipeptydy zawierające RGD, przeciwciała lub mimetyki a_ve₃, które wiążą się z receptorem a_ve₃ i hamują angiogenezę.

Gdy antagonistą a_ve₃ jest przeciwciało jest nim przeciwciało monoklonalne wiążące antygen, mające swoistość wiązania z a_ve₃ lub receptorem a_ve₃. Korzystnym przeciwciałem monoklonalnym, które wiąże się z integryną a_ve₃ jest przeciwciało monoklonalne zidentyfikowane jako LM609 (ATCC HB 9537).

Korzystnym czynnikiem hamującym angiogenezę jest polipeptyd będący antagonistą receptora α....β₃, który może blokować receptor integryny na komórkach docelowych. Najbardziej korzystnym przykładem antagonisty a_ve₃ jest syntetyczny peptyd, zawierający RGD cyklo(RGDfN-MeV) (Sekw. Id. Nr: 11) i jemu podobne. Cykliczne polipeptydy tego ogólnego typu są opisane w patencie USA nr 5,262,520 (Plow i wsp.). Peptydy niezawierające RGD są opisane w patencie USA 5,780,426 (Palladino i wsp.).

Czynnikiem przeciwnowotworowej immunoterapii odpowiednim do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku jest czynnik immunoterapeutyczny, który obejmuje składnik będący efektorem komórkowym połączony ze składnikiem skierowanym przeciwko antygenowi towarzyszącemu nowotworowi. Odpowiednie efektory komórki mogą obejmować związki cytotoksyczne, radioizotopy cytotoksyczne oraz czynniki sygnałowe komórki, takie jak cytokiny.

Odpowiednimi składnikami skierowanymi przeciwko nowotworowi są łańcuchy polipeptydowe, które wiążą się z antygenami towarzyszącymi nowotworowi, obecnymi na komórce nowotworowej lub w macierzy tkankowej otaczającej komórkę nowotworową, takie jak łańcuchy białka receptorowego lub łańcuchy immunoglobulin.

Antygeny towarzyszące nowotworowi, które można zastosować jako cele dla czynników immunoterapeutycznych obejmują antygen towarzyszący nowotworowi wybrany z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptor EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptor IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikan MCSP towarzyszący czerniakowi, PSA oraz receptor transferyny.

Korzystny czynnik immunoterapeutyczny ma efektor, którym jest polipeptyd cytokinowy połączony ze składnikiem kierującym, którym jest polipeptydowy łańcuch immunoglobulinowy (Ig). Łańcuch polipeptydowy Ig obejmuje region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi. Korzystnie łańcuch immunoglobulinowy występuje w kombinacji z odpowiednim łańcuchem komplementarnym (tzn. łańcuch ciężki komplementuje łańcuch lekki) określa miejsce aktywne przeciwciała, które jest swoiste dla antygenu towarzyszącego nowotworowi.

Kierująca do nowotworu część Ig z czynnika immunoterapeutycznego może obejmować całą sekwencję aminokwasową łańcucha immunoglobulinowego lub co najmniej fragment, który obejmuje część białka swoiście wiążącą antygen. Zatem, odpowiedni łańcuch polipeptydowy Ig będzie miał co najmniej region zmienny Ig, swoisty dla antygenu towarzyszącego nowotworowi.

Przeciwciało i jego łańcuchy polipeptydowe odpowiednie do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku mają sekwencję aminokwasową pochodzącą od dowolnego ssaka. Wówczas, gdy

PL 200 919 B1 takie białko przeciwciała nie jest tego samego pochodzenia co przewidywany pacjent, można zastosować fragmenty białka przeciwciała, takie jak F(ab')2, Fab, Fv lub zmieniony metodami inżynierii genetycznej pojedynczy łańcuch białka przeciwciała Fv. Dla dalszego zmniejszenia antygenowości białka przeciwciała można wykonać modyfikację sekwencji aminokwasowej w celu jej skrócenia tworząc białko bardziej przypominające składniki prawidłowe przeciwciała pacjentów. Przykładowo, w celu podawania ludziom, sekwencje aminokwasowe mysich przeciwciał monoklonalnych można zmodyfikować, przez różnorodne procesy humanizacji przeciwciała, aby bardziej przypominały ludzkie.

Alternatywnie, przeciwciało może być pochodzenia ludzkiego (genetycznie kodowane przez ludzkie geny Ig) lecz wytwarzane w zwierzęciu transgenicznym stransformowanym w celu uzyskania ekspresji ludzkich genów Ig zamiast jego własnych naturalnie występujących genów Ig. Przykładowo można skonstruować transgeniczne myszy, w których zachodzi ekspresja DNA pochodzenia ludzkiego kodującego ludzkie białka Ig. Wytworzenie monoklonalnego przeciwciała w takich transgenicznych myszach prowadzi do uzyskania mysich hybrydoma limfocytów B, w których zachodzi ekspresja ludzkiego DNA kodującego przeciwciała posiadające sekwencje aminokwasowe pochodzenia ludzkiego. W znacznym stopniu zmniejszy to immunogenność takich przeciwciał przeznaczonych do leczenia ludzi.

Korzystnymi przeciwciałami używanymi w rozwiązaniach według wynalazku przeznaczonych do leczenia ludzi są humanizowane przeciwciała monoklonalne ch14.18 przeciw antygenowi GD2 towarzyszącemu nowotworowi oraz przeciwciała monoklonalne KS1/4przeciw antygenowi KS1/4 (znanemu również jako Ep-CAM i KSA) towarzyszącemu nowotworowi.

Składnikiem, którym jest efektor komórkowy immunoterapeutycznie odpowiednim do zastosowania, kompozycji i zestawu według niniejszego wynalazku jest cytokina wybrana spośród BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, GCSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 do MCP3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF. Odpowiednią cytokinę, która jest chemokiną, można wybrać spośród C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyny, GCP-2, HCC-1, I-309, IL-8, IP-10, limfotaktyny, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

Część cytokiny wspomnianego powyżej czynnika immunoterapeutycznego może być całą sekwencją aminokwasową białka cytokiny lub fragmentem takiego białka fuzyjnego, który jest wystarczający dla wywołania swoistej dla cytokiny odpowiedzi biologicznej.

W korzystnym wykonaniu część cytokiny z czynnika immunoterapeutycznego ma aktywność biologiczną IL-2.

W czynniku immunoterapeutycznym obejmującym polipeptyd cytokiny połączony z polipeptydem Ig, odpowiednie połączenie pomiędzy łańcuchem polipeptydowym cytokiny a łańcuchem polipeptydowym Ig obejmuje bezpośrednie wiązanie polipeptydowe, połączenie mające łącznik polipeptydowy między dwoma łańcuchami lub inne połączenie chemiczne między łańcuchami, w tym wykorzystanie biotynylacji oraz kompleksu awidyna-biotyna. Korzystnym połączeniem jest albo połączenie bezpośrednie albo wiązanie polipeptydowe oddzielone łącznikiem polipeptydowym. To bezpośrednie wiązanie umożliwia ekspresję czynnika immunoterapeutycznego jako pojedynczego białka fuzyjnego w komórce gospodarza stransformowanej odpowiednim wektorem ekspresyjnym kodującym białko fuzyjne czynnika immunoterapeutycznego.

Zatem korzystny czynnik immunoterapeutyczny do stosowania w rozwiązaniach według wynalazku jest bifunkcyjnym białkiem fuzyjnym, mającym cytokinę jako komponentę oraz komponentę skierowaną na antygen towarzyszący nowotworowi, gdzie komponentą kierującą jest łańcuch polipeptydowy Ig swoisty dla antygenu towarzyszącego nowotworowi. Przykłady korzystnych czynników immunoterapeutycznych obejmują białko fuzyjne ch14.18-IL2 skierowane na GD2 oraz białko fuzyjne KS1/4 IL2 skierowane na antygen towarzyszący nowotworowi KS1/4 (znany także jako Ep-CAM i KSA).

Alternatywnie inne czynniki immunoterapeutyczne dla rozwiązań według wynalazku mogą zawierać składnik, którym jest efektor komórkowy, który jest czynnikiem cytotoksycznym. Odpowiednim czynnikiem cytotoksycznym jest taki, który ma bezpośrednie działanie cytotoksyczne na komórkę nowotworową tzn. immunotoksyny, radioizotopy, leki cytotoksyczne i im podobne. Podobnie jak immunoterapeutyki cytokinowe opisane powyżej peptydy cytotoksyczne można łączyć z polipeptydem Ig skierowanym na antygen towarzyszący nowotworowi tworząc białka fuzyjne albo bezpośrednio lub z łącznikiem peptydowym lub łańcuchem. Można wytworzyć chemiczne wiązanie między chemicznymi cytotoksynami i kierującymi łańcuchami Ig. Można także skonstruować radioizotop z łańcuchami przeciwciała.

PL 200 919 B1

Inny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji terapeutycznej obejmującej czynnik hamujący angiogenezę oraz immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy. Korzystnie jeśli immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest skierowany na komórki nowotworu lub przerzuty nowotworowe dzięki temu, że posiada składnik swoisty dla antygenu towarzyszącego nowotworowi połączony ze składnikiem, którym jest efektor komórkowy. W korzystnej kompozycji terapeutycznej według wynalazku immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem bifunkcyjnym posiadającym komponentę efektorową, którą jest polipeptyd cytokiny połączony z komponentą kierującą na nowotwór, którą jest łańcuch polipeptydowy immunoglobuliny (Ig), który obejmuje region zmienny wiążący się z antygenem towarzyszącym nowotworowi.

Wynalazek dotyczy też zestawu do leczenia nowotworu lub przerzutów nowotworowych. Zestaw obejmuje pakiet zawierający czynnik hamujący angiogenezę, którym jest antagonista α_νβ₃ zdolny do hamowania procesu angiogenezy w omawianym nowotworze lub przerzutach nowotworowych; bifunkcjonalny składnik białkowy o aktywności cytokiny i swoistości przeciwko antygenowi nowotworowemu oraz instrukcję użycia. Zestaw zawiera także swoistą etykietkę wskazującą zastosowanie składników zestawu do leczenia nowotworu i przerzutów nowotworowych.

Krótki opis rysunków

Korzystne wykonania wynalazku są poniżej opisane w odniesieniu do załączonych rysunków:

Na Fig. 1 przedstawiono graficznie wpływ na nowotwory pierwotne skojarzonej terapii przeciwangiogennej antagonistą integryny α, i immunoterapii przeciwnowotworowej swoistej dla kompartmentu z białkami fuzyjnymi przeciwciało-IL-2

Na Figurze 1A przedstawiono wyniki dla nowotworów pierwotnych indukowanych przez podskórne wstrzyknięcie komórek (2x10⁶) z nerwiaka niedojrzałego NXS2. Na Figurze 1B przedstawiono wyniki dla nowotworów pierwotnych indukowanych przez podskórne wstrzyknięcie komórek (2x10⁶) z raka okrężnicy CT26-KSA. Na Figurze 1C przedstawiono wyniki dla nowotworów pierwotnych indukowanych przez podskórne wstrzyknięcie komórek(2x10⁶) z czerniaka B78-D 14.

Na Figurze 2 przedstawiono graficznie wpływ łączonych terapii przeciwnaczyniowych i przeciwnowotworowych na proces waskularyzacji i przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Na Figurze 2A przedstawiono wyniki gęstości naczyń krwionośnych w nowotworach pierwotnych po leczeniu przedziału naczyniowego i nowotworowego antagonistą integryny α białka fuzyjnego ch14.18-IL-2 oraz ich kombinacją (*P<0,001, Test-T Studenta). Na Figurze 2B przedstawiono wyniki naciekania limfocytów w nowotworach pierwotnych odpowiednio po leczeniu przedziału naczyniowego i nowotworowego (*P<0,001; Test-T Studenta).

Na Figurze 3 przedstawiono graficznie wpływ kombinacji następujących po sobie terapii z przeciwangiogennym antagonistą integryny a_v, oraz immunoterapii swoiście skierowanej przeciwko przedziałowi nowotworowemu wykorzystującej białko fuzyjne przeciwciało-IL-2 na spontaniczne przerzuty nerwiaka niedojrzałego w wątrobie. Liczbę spontanicznych przerzutów w wątrobie określano przez makroskopowe zliczanie ognisk wątrobowych (n=8) (**P<0,01; Test Wilcoxon Rank-Sum).

Na Figurze 4 przedstawiono graficznie wpływ stosowanej zasadniczo jednocześnie kombinacji przeciwangiogennego antagonisty integryny α, oraz immunoterapii swoiście skierowanej przeciwko kompartmentowi nowotworowemu wykorzystującej białko fuzyjne przeciwciało-IL-2 na spontaniczne przerzuty nerwiaka niedojrzałego w wątrobie. Pokazano wyniki leczenia integryną lub antagonistą (17,5 μg/h) oraz białkiem fuzyjnym ch14.18-IL-2 swoistym dla nowotworu (5 μgx5) rozpoczętego przed (Figura 4A) lub po (Figura 4B) usunięciu nowotworu pierwotnego. Liczbę spontanicznych przerzutów w wątrobie określano przez makroskopowe zliczanie ognisk wątrobowych (n=8) (*P<0,01; Test Wilcoxon Rank-Sum).

Zahamowanie rozwoju oraz likwidacja pierwotnych nowotworów i odległych przerzutów jest głównym celem alternatywnych strategii leczenia raka, takich jak zahamowanie angiogenezy i ukierunkowana immunoterapia. Odkryto obecnie, że jest nieoczekiwana synergia w skuteczności leczenia komórek nowotworowych w nowotworach i w przerzutach nowotworowych, przez połączone stosowanie dwóch modeli leczenia, przedstawionych tutaj jako (1) (antyangiogenny) terapia hamująca angiogenezę i (2) immunoterapia przeciwnowotworowa. Konkretnie opisano skojarzoną terapię antagonistą a_v z terapią przeciwnowotworową białkiem fuzyjnym antygen/cytokina.

Stwierdzono, że zachodzi synergia między dwiema unikalnymi monoterapiami, ukierunkowanymi przeciw przedziałom naczyniowemu i nowotworowemu; odpowiednio, między przeciw angiogennym antagonistą integryny α swoistej dla unaczynienia nowotworu i swoistymi dla nowotworu białkami fuzyjnymi przeciwciało-interleukina-2.

PL 200 919 B1

Jednoczesne i następujące po sobie łączenie tych monoterapii efektywnie likwidowało spontaniczne przerzuty do wątroby, w słabo immunogennym, syngenicznym modelu nerwiaka niedojrzałego. Wyniki te kontrastowały z kontrolami poddanymi monoterapii albo angiogennym antagonistą integryny αν, albo białkami fuzyjnymi przeciwciało-IL-2, które były tylko częściowo skuteczne w stosowanych poziomach dawek.

Następnie, jednoczesne traktowania antagonistą integryny αν i swoistymi dla nowotworu białkami fuzyjnymi przeciwciało-IL-2 bardzo silnie indukowały regresje pierwotnego nowotworu w trzech syngenicznych mysich modelach nowotworu, tj. czerniaka, raka okrężnicy i nerwiaka niedojrzałego. Jakkolwiek, każdy z czynników użyty sam w monoterapii, wywoływał jedynie zwłokę we wzroście guza.

Jednocześnie, odpowiedzi przeciw nowotworowi towarzyszyło 50% zmniejszenie gęstości naczyń guza i pięciokrotny wzrost ilości komórek zapalnych w mikro środowisku guza. Jednocześnie, martwica nowotworu została wykazana jedynie u zwierząt otrzymujących terapię skojarzoną, ale nie wtedy, gdy każdy z czynników był stosowany jako monoterapia. Wyniki pokazują że metody synergistycznego leczenia dostarczają nowego i skutecznego narzędzia dla przyszłych terapii przerzutów raków.

1. Kompozycje terapeutyczne

Opisano szereg kompozycji terapeutycznych, przydatnych do opisanych powyżej sposobów leczenia Kompozycje zawierają (przeciw angiogenezie) reagenty hamujące angiogenezę, którymi są antagoniści ανβ3 i czynniki przeciwnowotworowe, takie jak antygen nowotworowy/białka fuzyjne cytokina, zarówno z osobna jak i w wielu kombinacjach.

A. Inhibitor angiogenezy

W rozwiązaniach według wynalazku mogą być użyte inhibitory angiogenezy, które hamują angiogenezę w tkankach nimi traktowanych. Inhibitorem angiogenezy tylko taki antagonista ανβ3. Antagonistą ανβ3 hamującym angiogenezę (przeciw angiogenezie) może być peptyd, peptyd zawierający RGD, przeciwciało przeciw-a_vp₃, przeciwciało przeciw receptorowi α₇β₃ lub mimetyk a^. Przykładowi antagoniści ανβ3 są przedstawieni w patentach US Nr. 5,753,230 (Brooks & Cheresh) i US Nr. 5,766,591 (Brooks & Cheresh), których ujawnienia związane z wytwarzaniem i stosowaniem antagonisty ανβ3 są włączone tutaj przez odniesienie.

Korzystnymi antagonistami są peptydy zawierające RGD, takie jak cykliczny peptydcyklo(RGDfN-MeV) (Sekw. Id. Nr: 11). W literaturze opisano innych antagonistów, w tym organiczne mimetyki i cykliczne peptydy nie zawierające RGD, działające jako antagoniści ανβ3. Patrz np. Brooks i wsp., Międzynarodowa Publikacja nr. WO 97/45137, (PCT/US97/09158).

Testy do identyfikacji antagonisty ανβ3 odpowiedniego do stosowania jako antagonista zostały opisane w cytowanych patentach US, i dlatego wzięto pod uwagę, że alternatywni antagoniści mogą być z łatwością zidentyfikowani dla wykorzystania w niniejszym wynalazku.

Odpowiednie przeciwciało monoklonalne przeciw ανβ3 może być modyfikowane, tak aby zawierało własne fragmenty wiążące antygen, w tym F(ab)2, Fab i zmienione metodami inżynierii genetycznej Fv lub przeciwciało jednołańcuchowe (SCA). Sposoby wytwarzania takich fragmentów są znane w technice (patrz dla przykładu Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996). Rozwiązania według wynalazku, w których stosuje się przeciwciała obejmują również odpowiednie modyfikacje całego przeciwciała do jego fragmentów wiążących antygen. Jedno z odpowiednich przeciwciał monoklonalnych jest określone jako LM609 (ATCC HB 9537).

Wykazano, że inni antagoniści receptora ανβ3 skutecznie hamują angiogenezę i są odpowiedni do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku. Dla przykładu, antagoniści chemicznego receptora tacy jak kwas (S)-10,11dihydro-3-[3-(pirydyn-2-yloamino)-1-propyloksy]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10octowy (znany jako SB-265123) został przetestowany w różnorodnych ssaczych układach modelowych. (Patrz np., Keenan RM i wsp., (1998) Bioorg Med. Chem Lett 8 (22) : 3171-6; Ward KW iwsp., (1999) Drug Metab Dispos 27 (11) : 1232-41).

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) został zidentyfikowany jako selektywny czynnik wzrostu angiogenezy. Tak więc alternatywnym lub dodatkowym czynnikiem hamującym angiogenezę może być inhibitor aktywności VEGF, wystarczający do zahamowania wzrostu angiogennego. Takim inhibitorem może być inhibitor kompetycyjny lub cząsteczka wiążąca/inaktywująca VEGF lub antagonista receptora VEGF. Na przykład, możliwymi inhibitorami mogą być np. nieangiogenna, chemiczna cząsteczka mimiczna dla VEGF, konkurująca o wiązanie z cząsteczką docelową dla VEGF/receptorem, zmodyfikowana, nieangiogenna pochodna VEGF, przeciwciało swoiście wiążące VEGF wystarczające aby zahamować aktywność angiogenną lub możliwie inne swoiste białko, które wiąże VEGF (takie jak

PL 200 919 B1 izolowane białko receptora VEGF) lub przeciwciało, które wiążąc się z receptorem VEGF i blokuje oddziaływanie z VEGF.

Inne związki zostały zidentyfikowane na podstawie zdolności związku do hamowania angiogenezy, dla przykładu, izolowany związany z guzem antygen PSA.

B. Przeciwnowotworowy czynnik immunoterapeutyczny

Przeciwwnowotworowy czynnik immunoterapeutyczny obejmuje składnik, którym jest efektor komórkowy oraz składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi. Efektorem komórkowym jest cytokina, a składnikiem kierującym na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuch immunoglobuliny obejmujący region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, a) Antygeny związane z nowotworem

Antygeny związane z nowotworem są celem, dzięki któremu czynnik immunoterapeutyczny używany w zastosowaniach, kompozycjach i zestawach według wynalazku jest ostatecznie nakierowywany na komórkę nowotworu. Antygeny związane z nowotworem są szeroko poznane i skorelowane z pewnymi typami raka. W większości przypadków antygeny związane z nowotworem są antygenami powierzchniowymi komórek, wyrażanymi w sposób normalnie nie stwierdzany dla prawidłowych komórek towarzyszących miejscom powstawania nowotworu. Inne antygeny towarzyszące nowotworom są cząsteczkami ulegającymi sekrecji lub składnikami związanymi z macierzą pozakomórkową, których normalnie nie znajduje się w połączeniu z prawidłowymi, dojrzałymi tkankami.

Niektórymi antygenami towarzyszącymi nowotworom są białka wyrażane we wcześniejszych stadiach rozwojowych tkanki, i normalnie nie związane z dojrzałymi tkankami (czasem określane jako białka onkozarodkowe). Inne antygeny związane z nowotworem są wyrażane przez prawidłowe, dojrzałe komórki, ale są wyrażane w większej ilości przez komórki rakowe. Antygenami towarzyszącymi nowotworom mogą być zmutowane formy normalnie wyrażanych markerów komórkowych lub składników pozakomórkowych. Jeszcze inne antygeny związane z nowotworem związane z uszkodzonymi lub niezwykłymi formami glikozylacji białek, lipidów lub składników pozakomórkowych lub nowych ugrupowań węglowodanowych. Dlatego więc antygeny towarzyszące nowotworom mogą zmieniać się w szerokim zakresie i określać co najmniej częściowo typ nowotworu nadającego się do leczenia przy pomocy rozwiązań według niniejszego wynalazku. Różnorodność typów nowotworów i antygenów nowotworowych, które są przez nie wyrażane, jest intensywnie badana przez naukowców.

Badanych jest wiele dodatkowych markerów dla nowotworów i gdy są zidentyfikowane i scharakteryzowane jako antygen towarzyszący nowotworowi mogą być odpowiednim antygenem docelowym do kierowania immunoterapeutyku do żądanego nowotworu lub miejsca przerzutu.

Doniesiono o kierowaniu wektorów terapii genowej do komórek raka z użyciem monoklonalnych przeciwciał przeciw-antygenowi Lewis-Y. (Kurane S i wsp., Jpn J. Cancer Res 89(11): 1212-9 (1998)). Podobnie, doniesiono o kierowaniu liposomów stosując przeciwciało przeciw-gangliozydowi GM3 lub przeciwciało przeciw antygenowi Lewis-X. (Nam, S.M, i wsp., Oncol Res 11(1): 9-16 (1999).

Jak omówiono poniżej, znane są w stanie techniki metody wykorzystania zidentyfikowanego antygenu do wytworzenia odpowiednich przeciwciał, które będą swoiście wiązać ten antygen. W ten sposób antygeny nowotworów mogą być identyfikowane i można otrzymać monoklonalne przeciwciała, które są przydatne w niniejszym wynalazku. W celu dokonania przeglądu wytwarzania antygenów nowotworowych patrz wskazówki w Human Cancer Markers, The Humana Press Inc., wyd. Sell and Wahren, 1982. Standardowe techniki biochemiczne i biologii molekularnej mające zastosowanie w preparatyce antygenów i/lub cytokin i tym podobnych, można znaleźć, na przykład, w Sambrook i wsp., (1989) Molecular Cloning 2 wyd. (Cold Spring Harbor Press, CSH NY).

Antygeny powierzchniowe komórki nowotworowej mogą być swoiste dla poszczególnych klas nowotworów lub dla indywidualnego typu nowotworu. Wiele sekwencji kwasów nukleinowych i/lub sekwencji aminokwasowych związanych z i kodujących antygeny towarzyszące nowotworom są dostępne w publicznych, komputerowych bazach danych, do których dostęp jest możliwy przez Internet przez różne serwisy, m. in. NCBI (National Center for Biotechnology Information; www3.ncbi.nlm.nih.gov) i są głównie identyfikowane przez nazwę i numer dostępu (kilka, nie ograniczających przykładów tego typu dostępnych informacji o sekwencji jest opisanych komentarzem „patrz numer dostępu”).

Antygeny towarzyszące nowotworom, które stosuje się obejmują ale nie ograniczają się do, AFP (numer dostępu NP 001125), CA125 (numer dostępu NP 005890), CEA (numer dostępu AAA62835), CD19 (numer dostępu P15391), CD20 (numer dostępu P11836), CD44 (numer dostępu P16070), CD45 (numer dostępu P08575), receptor EGF (numer dostępu P00533), GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu (numer dostępu AAA58637), Ep-CAM (KSA) (numer dostępu P16422, AAA36151),

PL 200 919 B1 receptor IL-2 (numer dostępu P14784, NP 000197, P01589), Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), proteoglikan związany z czerniakiem MCSP (numer dostępu NP 001888), PSA (numer dostępu P07288), PMSA, receptor transferyny (numer dostępu NP 003218, NP 003225, AAF04564).

Jak tutaj opisano, szczególnie korzystnymi antygenami towarzyszącymi nowotworom jako cel dla czynnika immunoterapeutycznego kierującego są GD2 i KSA (Ep-CAM; antygen KS1/4). Białka antygenowe związane z nowotworem są dostępne w handlu, lub mogą być wytworzone z użyciem znanych, standardowych technik rekombinacji DNA i technik hodowli komórek, oraz ekspresji białek. Dla przykładu, Sigma (St. Louis, MO) udostępnia w sprzedaży disialogangliozyd GD2 (G 0776), disialogangliozyd GD3 (G 5904), monosialogangliozyd GM1 (G 7641), monosialogangliozyd GM2 (G 4651), antygen nowotworu żołądkowo-jelitowego Ca 19-9 (G 8660, G 8535), antygen rakowo-zarodkowy CEA (C4835), trisacharyd Lewis-X (L 5152) i Lewis-Y (L 7401).

Dostępne są komercyjnie przeciwciała swoiste wobec wielu z tych antygenów (m in. z USB, RDI, Accurate Chemical and Scientific Corp., Zymed Lab). Dla przykładu, Sigma (St. Louis, MO) sprzedaje wiele przeciwciał monoklonalnych, takich jak przeciwciało przeciw AFP (A 8452), przeciwCEA (C2331), przeciw-receptorowi EGF (E 3138), przeciwrozpuszczalnemu receptorowi IL-2, (I 5652,

I 5777, I 5902), przeciw-CD19 (F 3899), przeciw-CD20 (C8080), przeciw-CD44 (C7923) i przeciw-CD45 (C7556).

Nawet jeżeli przeciwciała monoklonalne nie są dostępne w handlu stosując znane sposoby ich produkcji można wytworzyć przeciwciała swoiste wobec antygenów towarzyszących nowotworom przy użyciu antygenu jako immunogenu. Na przykład, zostały opisane domeny zmienne ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała mysiego przeciw antygenowi Lewis-Y (numer dostępu AAB25798 i AAB25799). Podobnie domeny zmienne ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała mysiego przeciwasialogangliozydowi GM1 (numer dostępu AAD09194 i AAD09195). Została wyznaczona struktura krystaliczna dla łańcuchów ciężkiego i lekkiego monoklonalnego przeciwciała przeciw-gangliozydowi GD2 (numer dostępu 2554841, 2554842). Doniesiono o przeciwciałach wiążących receptor folianowy (białko wiążące), zidentyfikowany jako marker raka jajników (numer dostępu NP 000793). Przedstawiono także sekwencję kwasu nukleinowego dla regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała monoklonalnego przeciw-CA125, która została użyta do wstawienia do wektora kasetowego (numer dostępu ABB33454, 33455).

Szczególnie korzystnymi przeciwciałami są tutaj opisane przeciwciała ch14.18 i KS1/4.

b) Przeciwciało monoklonalne i jego część wiążąca antygen i tym podobne

Od czasu gdy po raz pierwszy Kohler i Milstein opublikowali zestaw metod wytwarzania przeciwciał monoklonalnych, dobrze znane w nauce stały się metody udoskonalone, (patrz na przykład Dean, C. J. Methods In Molecular Biology Vol. 80: Immunochemical Protocols, 2 wyd. (Pound, J. D. wydawca, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) rozdział 4; i Ausbel, F. M. i wsp., Short Protocols in Molecular Biology, 2 wyd. (Current Protocols, John Wiley & Sons, NY NY, 1992) rozdział 11). Obecnie wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych wiążących się z konkretnym antygenem jest rutynową praktyką. Protokoły przeszukiwania zostały udoskonalone dla selekcji przeciwciał o wysokim powinowactwie, jeśli takie są wymagane.

Zwykle gospodarzem do produkcji hybrydoma są myszy lub inne gryzonie.

Jedną z barier dla powtarzalnego leczenia ludzi mysimi przeciwciałami monoklonalnymi są HAMA (ludzkie przeciwciała przeciw mysie) wytwarzane przez pacjentów w odpowiedzi na leczenie. Metody pozwalające pokonać tę barierę obejmują humanizację białek mysich przeciwciał przez substytucję antygennych aminokwasów w mysim białku sekwencją ludzkich białek, które, jak się zakłada, są mniej antygenne. Inne metody obejmują przeszczepienie reszt lub regionów aminokwasów determinujących specyficzność wiązania do zrębów białka ludzkiego.

Zdolność do ekspresji białka przeciwciała w układzie fagowym pozwala na selekcję przeciwciał poddanych mutagenezie w celu albo zwiększenia powinowactwa albo zmniejszenia immunogenności (patrz na przykład Antibody Engineering (McCafferty, J. i wsp. wydawcy, Oxford University Press, 1996). Ostatnio substytucja ludzkich genów immunoglobulin do myszy transgenicznych pozwoliła na zastosowanie mysich gospodarzy do wytwarzania przeciwciał, i to takich monoklonalnych przeciwciał, które pochodzą z sekwencji ludzkiego kwasu nukleinowego.

Można także zmniejszyć rozmiar przeciwciał przez fragmentowanie aby umożliwić zmniejszenie antygenowości lub wytworzenie mniejszych cząsteczek terapeutycznych. Przykładowo całe białko przeciwciała może być zmniejszone albo przez trawienie odpowiednim enzymem albo przez wytworzenie mniejszego białka metodami rekombinacji DNA. Odpowiednie fragmenty powinny zawierać

PL 200 919 B1 przynajmniej część całej cząsteczki wiążącą antygen i mogą zawierać konstrukty z Fab, F(ab)2,

F(ab)3, Fv lub pojedynczy łańcuch Fv (przeciwciało jednołańcuchowe; SCA).

Jest widoczne jak opisano powyżej, że w rozwiązaniach według wynalazku można osiągnąć korzyści przez modyfikacje wszystkich komponentów składowych opartych na przeciwciałach monoklonalnych czynników terapeutycznych dzięki zmniejszeniu immunogenności i potencjalnego HAMA.

c) Cytokiny

Immunoterapeutyczny konstrukt przeciw nowotworowy zawiera część, która stanowi efektor komórkowy którym jest cytokina. Cytokiny odpowiednie do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują BDNF (numer dostępu 4502393), CNTF (numer dostępu 4758020), EGF (numer dostępu p01133), Epo (numer dostępu 4503589), FGF (numer dostępu CAB61690), Flt3L, G-CSF (numer dostępu CAA27290), GM-CSF (numer dostępu 4503077), I-309/TCA-3, gamma-IP-10 (numer dostępu P02778), IFN alpha (numer dostępu P01563), IFN beta (numer dostępu P01574), IFN gamma (numer dostępu P01579), IL-1 do IL-18 (numer dostępu P01583, P01584, P0185, P08700, P05112, P05113, P05231, P13232, P41324, P15248, P22301, P20809, P29459, P46658, P35225, P40222, P40933, Q14005, NP002181, Q14116), LIF (numer dostępu AAC05174), LT (numer dostępu 4504031), MCP-1 do MCP-3, M-CSF (numer dostępu 4503075), MIF (numer dostępu 4505185), MlP-1alpha , MlP-1beta, MIP-2, NGF (numer dostępu 4505391), NT-3 ( numer dostępu P20783), NT-4 (numer dostępu P34130), OSM (numer dostępu P13725), PBP (numer dostępu 4505621) PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF ( numer dostępu P21583), TGF alfa ( numer dostępu P01135), TGF beta (numer dostępu P01137), TNF alfa (numer dostępu P01375), Tpo (numer dostępu P40225) i VEGF (numer dostępu AAD03710).

Korzystną cytokiną do zastosowania w wynalazku jest IL-2.

Odpowiednie cytokiny do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku mogą być wytworzone z wykorzystaniem odpowiednich sekwencji kwasów nukleinowych i standardowych technik biologii molekularnej. Metody ekspresji genów są znane w technice (patrz na przykład Goeddel, D. V. wydawca, Methods in Enzymology Vol 185: Gene Expression Technology (Academic Press, Inc., NY NY, 1991). Cytokiny są także dostępne ze źródeł komercyjnych (m. in. Sigma, St. Louis MO).

d) Przeciw nowotworowy/cytokinowy czynnik immunoterapeutyczny

Przeciwnowotworowe czynniki immunoterapeutyczne odpowiednie do realizowania wynalazku w praktyce, zawierają składnik, którym jest efektor komórkowy, który jest cytokiną połączony ze składnikiem kierującym do nowotworu. Związanie składnika wiążącego z nowotworem ze składnikiem efektorowym można osiągnąć różnymi metodami.

1) Białka fuzyjne przeciwciał

Opisano immunoterapeutyczne czynniki przeciw rakowe, które kierują działanie cytokiny w stosunku do komórki lub tkanki niosącej antygeny nowotworowe i przez stosowanie cytokiny wzmacniają odpowiedź odpornościową przeciw komórkom niosącym lub związanym z antygenem nowotworowym. Te immunoterapeutyczne czynniki są określone jako przeciwnowotworowe białka fuzyjne antygen/cytokina, ponieważ białka fuzyjne składają się z połączenia cytokiny z rekombinowanym łańcuchem polipeptydowym immunoglobiny (Ig), który ulega immunizacji z wcześniej wybranym antygenem towarzyszącym nowotworowi. Jak jest tu stosowane, immunoterapeutyczne przeciwrakowe białka fuzyjne antygen/cytokina obejmują konstrukty fuzyjne między fragmentami, które zawierają co najmniej część wiążącą antygen z cytokinami, które obejmują co najmniej część efektorową cytokiny wystarczającą do zachowania biologicznej, sygnałowej funkcji cytokiny. Białka fuzyjne zastosowane w rozwiązaniach według wynalazku mogą być wynikiem bezpośredniego połączenia lub mogą być zmostkowane przez peptyd lub peptydy łącznikowe. Przeciwnowotworowe białka fuzyjne antygen/cytokina są znane w stanie techniki i opisane w szczegółach, na przykład w patencie US Nr. 5,650,150 (Gillies), który ujawnia sposoby wytwarzania i zastosowanie białek fuzyjnych.

Białka fuzyjne mogą być ukierunkowane na każdy z rożnych antygenów nowotworowych, które są antygenami powierzchniowymi komórek, tak więc wynalazek nie jest tym ograniczony. Przykładowo, znane jest przygotowywanie białka fuzyjnego z użyciem cytokiny i ciężkiego łańcucha Ig, jak przygotowywanie rekombinowanego ciężkiego łańcucha Ig pochodzącego od przeciwciała monoklonalnego. Dodatkowo, wytworzenie przeciwciał monoklonalnych jest rozwiniętą nauką i wiadomo jak wytłumaczyć takie przeciwciała przeciw antygenom nowotworowym. Wskazówki odnośnie wytwarzania przeciwciał monoklonalnych można znaleźć w „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy” Alan R. Liss, Inc., wyd., Reisfeld i Sell, 1985.

PL 200 919 B1

Zwykle, polipeptydowym łańcuchem Ig jest ciężki lub lekki polipeptydowy łańcuch Ig, zawierający N-końcowy zmienny region swoisty wobec komórki niosącej nowotworowy antygen powierzchniowy komórki. Białko fuzyjne zwykle ma łańcuch polipeptydowy Ig połączony na końcu karboksylowym wiązaniem peptydowym z aminokońcowym aminokwasem cytokiny. Gdy polipeptydem Ig jest łańcuch ciężki, łańcuch ciężki Ig zwykle dodatkowo zawiera domeny CH1 i CH2 i może ewentualnie dodatkowo zawierać domenę CH3. Jednak, jeżeli się tego wymaga, takie domeny regionów stałych mogą być wyeliminowane, aby zmniejszyć immunogenność, rozmiar lub niespecyficzne wiązanie się otrzymywanego konstruktu białka fuzyjnego. W celu ułatwienia połączenia domen łańcucha ciężkiego i lekkiego może być konieczne skonstruowanie związanej cząsteczki Fv, w której Fv łańcucha ciężkiego jest przyłączony do Fv lekkiego łańcucha. Łącznik znajduje się pomiędzy końcem karboksylowym jednego łańcucha a końcem aminokwasowym drugiego i jest wystarczająco długi, tak aby po ponownym sfałdowaniu/połączeniu domen drastycznie, sterycznie nie zmieniać kieszeni wiążącej antygen.

Korzystne białko fuzyjne zawiera cytokinę IL-2 i łańcuch ciężki Ig, który ulega immunoreakcji z antygenem GD2 towarzyszącym nowotworowi.

W innym wykonaniu, korzystne białko fuzyjne zawiera cytokinę IL-2 i łańcuch ciężki Ig, który reaguje immunologicznie z antygenem Ep-CAM (także znanym jako antygen KSA, KS1/4) związanym z nowotworem. Przykładowe białka fuzyjne tych wykonań są opisane poniżej, odpowiednio jako ch14.18-IL-2 i KS1/4-IL-2.

2) Koniugaty przeciwciał

W rozwiązaniach według wynalazku mogą być użyte alternatywne immunoterapeutyczne konstrukty. Na przykład, wykorzystując system wysokiego powinowactwa biotyna-awidyna można skonstruować, z użyciem odpowiedniego łączenia, niezależne biotynylowane białka, zawierające łańcuch przeciwciała swoistego wobec antygenu towarzyszącego nowotworowi, połączony z biotyną (lub awidyną) i cytokiną połączoną z odpowiednim koniugatem (z awidyną lub biotyną). W praktyce, biotynylowane białko przeciwciała może być łączone z białkiem cytokiny in vitro lub in vivo, przed lub po podaniu, tak aby powstał dwu funkcjonalny immunoterapeutyk, posiadający składnik wiążący antygen nowotworowy i składnik, którym jest cytokiną efektorowa połączone kompleksem biotyna-awidyna.

Biotynylowane przeciwciała i białka są znane w stanie techniki i mogą być wytworzone z zastosowaniem komercyjnie dostępnych reagentów. Jedną cechą wykorzystywania biotynylowanego przeciwciała kierunkującego na antygen nowotworowy jest to, że cząsteczka biotyny ma wiele miejsc wiązania awidyny, które pozwalają na zwiększenie mocy składnika efektorowego, takiego jak cytokina powiązana z awidyną do każdego związanego przeciwciała, lub na połączone zastosowanie więcej niż jednego składnika efektorowego. W stanie techniki są znane także inne metody i reagenty do bezpośredniego, chemicznego koniugowania, które stosuje się do koniugowania przeciwciał z cząsteczkami efektora, zarówno bezpośrednio lub z wykorzystaniem łącznika. (Dla przykładu patrz, Haugland i You, w Methods in Molecular Biology Vol. 80: Immunochemical Protocols, 2 wyd. (Pound, J. D. wydawca, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) rozdział 17; i Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, NY NY, 1996). Zatem, tak jak opisano powyżej, czynniki immunoterapeutyczne w rozwiązaniach według niniejszego wynalazku obejmują także biotynylowane konstrukty, między fragmentami białka przeciwciała, które zawierają przynajmniej część wiążącą antygen i cytokinami zawierającymi przynajmniej część efektorową cytokiny wystarczającą do zachowania biologicznej sygnałowej funkcji cytokiny.

Metody leczenia

Metody leczenia wykorzystujące rozwiązania według wynalazku przez traktowanie komórek nowotworowych w guzie i przerzutach nowotworu są oparte na łączeniu terapii hamującej angiogenezę (przeciwangiogeneza) i immunoterapii przeciw nowotworowi. W metodach leczenia może być użyty więcej niż jeden typ czynnika hamującego angiogenezę, w połączeniu z więcej niż jednym typem przeciwnowotworowego czynnika immunoterapeutycznego. Łączne użycie może być jednoczesne, jedna terapia może zachodzić po drugiej lub z przerwą pomiędzy leczeniami. Każdy ze specyficznych leków może być podawany więcej niż raz w trakcie trwania leczenia. Rozwiązania według wynalazku pozwalają na połączone użycie leków hamujących angiogenezę i immunoterapeutyków przeciw nowotworowych, co może dać w rezultacie synergiczne wzmocnienie działania hamującego proliferację komórek nowotworu dla każdego indywidualnego leku, co skutkuje bardziej efektywnym leczeniem niż zaobserwowane przy oddzielnym podawaniu indywidualnych składników. Sposób leczenia zatem obejmuje podawanie pacjentowi, w kombinacji, czynnika hamującego angiogenezę i przeciwnowotworowego czynnika immunoterapeutycznego w ilościach, które mogą nie prowadzić do efektywnego

PL 200 919 B1 hamowania angiogenezy lub aktywności przeciw komórkom nowotworowym, jeżeli są same podawane oddzielnie w tej ilości.

Rozwiązania według wynalazku można wykorzystać w praktyce w różny sposób. Na przykład, antagonista i przeciwnowotworowy czynnik immunoterapeutyczny (taki jak białka fuzyjne antygen nowotworowy/ białka fuzyjne cytokina) mogą być podawane w jednej mieszaninie, tzn. jednocześnie lub mogą być podawane jeden po drugim, tzn. oddzielnie. Następnie, antagonista i białko fuzyjne mogą być podawane oddzielnie, z 3 tygodniową przerwą w czasie pomiędzy podaniem, tj. dokładnie natychmiast po podaniu pierwszego aktywnego czynnika do około trzech tygodni po podaniu pierwszego czynnika. Dodatkowo jest rozważone że kolejność podawania może być inna, tzn. że antagonista a_ve₃ może być podany przed białkiem fuzyjnym lub podawanie może być przeprowadzone w odwrotnej kolejności.

Rozwiązania według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z procedurami chirurgicznymi, gdy usunięto część lub całość masy guza. W takiej sytuacji leczenie można przeprowadzić po procedurze chirurgicznej. Alternatywnie, procedurę chirurgiczną można przeprowadzić w przerwie pomiędzy podawaniem pierwszego aktywnego czynnika a drugiego aktywnego czynnika. Przykładem tego sposobu leczenia jest połączenie niniejszego sposobu z chirurgicznym usuwaniem guza, opisanym poniżej. Leczenie zgodnie z tym sposobem, będzie się typowo składać z podawania kompozycji terapeutycznej w jednym lub więcej cyklach podawania. Na przykład, gdy stosuje się jednoczesne podawanie, kompozycja terapeutyczna zawierająca zarówno antagonistę a_ve₃ i przeciwnowotworowy czynnik immunoterapeutyczny jest podawana w pojedynczym cyklu trwającym od 2 dni do około 3 tygodni. Następnie, jeżeli zachodzi potrzeba, cykl leczenia może być powtórzony zgodnie z oceną lekarza prowadzącego. Podobnie, gdy rozważane jest podawanie sekwencyjne, czas podawania dla każdego indywidualnego leku będzie zwykle tak ustalony tak aby obejmował taki sam okres. Odstępy pomiędzy cyklami mogą trwać od około zera do dwóch miesięcy.

Podawać można w okresowych dawkach, przez ciągłą infuzję, dostarczanie perystaltyczne, przez iniekcję i tym podobne. Podawać można dożylnie, podskórnie, domięśniowo, przez iniekcję domiejscową, infuzję domiejscową, doustnie i tym podobnie. Kompozycja terapeutyczna według tego wynalazku stosowana w tych sposobach leczenia zawiera czynnik aktywny w dopuszczalnym w farmaceutycznie nośniku. Typowo dawka przeciwnowotworowego czynnika immunoterapeutycznego, takiego jak białko fuzyjne antygen kierujący/cytokina, wynosi 0,01 mg do 10 mg, korzystnie około 0,1 do 1 mg, a jeszcze bardziej korzystnie około 0,6 mg na kilogram masy ciała na dzień.

Typowe dawkowanie antagonisty a_v0₃ wynosi 10 mg do 1000 mg, bardziej korzystnie około 20 do 100 mg, a jeszcze bardziej korzystnie około 50 mg na kilogram masy ciała na dobę.

Jest zrozumiałe, że występowanie raka stwierdzono w całym królestwie zwierząt i że podstawowe zasady tutaj opisane stosują się do wszystkich zwierząt posiadających w układzie (immunologicznym cytokiny i u których angiogeneza może być hamowana antagonistą a_ve₃. Zatem uważa się, że rozwiązania według wynalazku mogą być stosowane u wszystkich ssaków a zwłaszcza u ludzi. Ponadto, wiadomo że jest szereg różnych nowotworów, które wymagają do wzrostu unaczynienia, dlatego więc są kandydatami do terapii skojarzonej. Nowotwory, których wzrost indukuje angiogenezę, obejmują nowotwory wywodzące się z tkanek neuroektodermalnych, nabłonkowych i tym podobnych. Do przykładowych nowotworów i przerzutów nowotworów należą gruczolak, mięsakonaczyniak krwionośny, gwiaździak, rak nabłonkowy, rozrodczak, glioblastoma, glejak, hamartoma, naczyniak z komórkami śródbłonka, naczyniakomięsak krwionośny, krwiak, wątrobiak zarodkowy, białaczka, chłoniak, rdzeniak, czerniak, nerwiak niedojrzały, kostniakomiesak, glejak siatkówki, mięśniakomięsak prążkowany, mięsak, potworniak i podobne nowotwory.

Układy terapeutyczne

Wynalazek obejmuje też zestaw, który dostarcza odczynników potrzebnych do terapii. Zestaw do traktowania komórek nowotworowych w nowotworach lub przerzutach nowotworowych zawiera opakowanie z:

a) czynnikiem hamującym angiogenezę, którym jest antagonista a_v0₃, zdolny do hamowania angiogenezy w nowotworach lub przerzutach nowotworowych;

b) przeciwnowotworowym czynnikiem immunoterapeutycznym, którym jest dwu funkcjonalne białko fuzyjne, w skład którego wchodzi cytokina i rekombinowany, polipeptydowy łańcuch immunoglobuliny (Ig), przy czym łańcuch Ig zawiera region zmienny swoisty wobec komórki nowotworowej niosącej powierzchniowy, komórkowy antygen towarzyszący nowotworowi, przy czym łańcuch peptydowy jest połączony wiązaniem peptydowym z cytokina; i

PL 200 919 B1

c) instrukcje użytkowania czynników w sposobach leczenia nowotworów i przerzutów nowotworowych. Reagent w zestawie według wynalazku jest zwykle w formułowany jako kompozycja terapeutyczna jak tu opisano, i dlatego może być pod dowolną postacią odpowiednią do dystrybucji zestawu. Postacie takie obejmują płyn, proszek, tabletkę, zawiesinę i podobne formulacje do dostarczania antagonisty i/lub białka fuzyjnego wykorzystywanych w terapii. Reagenty mogą być dostarczone w oddzielnych pojemnikach, odpowiednich do oddzielnego podawania lub alternatywnie, mogą być dostarczone jako połączone w kompozycji w pojedynczym pojemniku w pakiecie.

Podobnie, taki pakiet może zawierać dodatkowo do składników opisanych powyżej, inne przeciwnowotworowe czynniki immunoterapeutyczne, takie jak opisane powyżej.

Pakiet może zawierać ilość wystarczającą dla jednorazowego lub wielokrotnego dozowania reagentów, zgodnie z zastosowaniami tutaj opisanymi. Zwykle pakiet będzie zawierał ilość wystarczającą do jednego cyklu opisanego tutaj leczenia. Etykietka pakietu może wskazywać łączony lub sekwencyjny sposób użycia zawartych w nim reagentów do terapeutycznego leczenia nowotworu i/lub przerzutów. Taka etykietka może być przymocowana na opakowaniu każdego z reagentów i/lub na całym opakowaniu materiałów.

Zestaw według wynalazku zawiera „instrukcję stosowania” substancji zawartych w pakiecie. Instrukcje odnoszą się do metod łączonego stosowania antagonisty i białka fuzyjnego do leczenia nowotworu lub przerzutów nowotworowych. Ponieważ sposoby leczenia mogą zmieniać się w zależności od nowotworu, pacjenta i stanu choroby, instrukcje mogą być różne aby odpowiednio, specyficznie przystosować procedury podawania. Wynalazek nie może być rozważany jako ograniczony z uwagi na charakter instrukcji innych niż rozpatrywane w szczególnym przypadku, połączonego zastosowania antagonistów i białek fuzyjnych. Podobnie, czynniki mogą zawierać przeciwnowotworowe, cytotoksyczne czynniki immunoterapeutyczne, takie jak przeciwciało wiążące antygen nowotworowy, połączone z izotopowym radioznacznikiem lub czynnikiem cytotoksycznym, takim jak cytotoksyczny peptyd lub cytotoksyczne leki i tym podobne.

Wytworzenie syntetycznych peptydów a. Procedura syntezy

Liniowe i cykliczne polipeptydy wyszczególnione w Tabeli 1 poniżej zostały zsyntetyzowane z wykorzystaniem standardowych technik syntezy w fazie stałej, na przykład takich jak opisane przez Merrifielda, RB, (1969) „Solid-Phase Peptide Synthesis”, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol Biol., 32 : 221-96; Merrifield, RB, (1969) „The synthesis of biologically active peptides and proteins”, JAMA 210(7): 1247-54; oraz Fields, G.B. i Noble, R.L., (1990) Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids”, Int. J. Peptide Protein Res., 35 (3):161-214. W celu otrzymania mieszaniny, najpierw rozpuszczono 2 g BOC-GlyDArg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (Sekw. Id. Nr 1) w 60 ml metanolu, do którego dodano 1,5 ml 2 N roztwór wodorotlenku sodu. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze 20°C. Po odparowaniu do pozostałości dodano wody, zakwaszonej do pH 3 rozcieńczonym HCl i ekstrahowano octanem etylu. Ekstrakt suszono nad Na2SO4, ponownie odparowano a otrzymany BOC-GlyDArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (Sekw. Id. Nr 2) mieszano w 20°C przez 2 godziny z 20 ml 2 N roztworu HCl w dioksanie. Otrzymaną mieszaninę odparowano aby otrzymać HGly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (Sekw. Id. Nr 3), który następnie rozpuszczono w mieszaninie 1800 ml dichlorometanu i 200 ml dimetyloformamidu (DMF) i schłodzono do 0°C. Następnie, kolejno dodano mieszając 0,5 g dicykloheksylokarbodiimidu (DCCI), 0,3 g 1hydroksybenzotriazolu (HOBt) i 0,23 ml N-metylmorfoliny.

Otrzymaną mieszankę mieszano przez następne 24 godziny w 0°C, a potem w 20°C przez następne 48 godzin. Roztwór zatężano i aby uwolnić od soli poddano działaniu mieszanego złoża wymieniacza jonowego. Po usunięciu otrzymanej żywicy przez filtrację, oczyszczony roztwór odparowano, a pozostałość oczyszczono chromatograficznie i odzyskano cyklo(Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val) (Sekw. Id. Nr 4).

Analogicznie otrzymano następujące peptydy, wyszczególnione w Tabeli 1 z użyciem kodu jednoliterowych skrótów dla aminokwasowych podstawników i określone przypisaniem numeru peptydu:

cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val) (Sekw. Id. Nr 5); cyklo(Arg-Ala-Asp-DPhe-Val) (Sekw. Id. Nr 6); cyklo(Arg-DAla-Asp-Phe-Val) (Sekw. Id. Nr 8); cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal) (Sekw. Id. Nr 7); i cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (gdzie w reszcie waliny jest metylowany azot alfa-aminowy wiązania amidowego) (Sekw. Id. Nr 11);

PL 200 919 B1

Peptyd oznaczony jako 66203, mający sekwencję identyczną z peptydem 62184, różnił się od niego tym, że zawiera sól HCl zamiast soli TFA obecnej w 62184 20 (Sekw. Id. Nr 5). Tak samo jest w przypadku peptydów 69601 i 62185 (Sekw. Id. Nr 6) i dla 85189 i 121974 (Sekw. Id. Nr 11).

b. Alternatywna procedura syntezy i Synteza cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11), sól TFA

FmocArg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa (Sekw. Id. Nr. 14), został zsyntetyzowany z wykorzystaniem procedury stałej fazy typu Merrifield'a, przez kolejne dodawanie do żywicy 4-hydroksymetylo-fenoksymetylo-polistyrenowej (żywicy typu Wang'a), NMeVaL, DPhe, Asp(OBut), Gly i Fmoc-Arg(Mtr) w sposób krok po kroku, (zastosowano zwyczajowe metody syntezy peptydów typu Merrifield'a). Żywica polistyrenowa i prekursory reszt aminokwasów są komercyjnie dostępne z przedsiębiorstw chemicznych Aldrich, Sigma lub Fluka). Po zakończeniu sekwencyjnego dodawania reszt aminokwasowych, żywicę następnie odrywa się od łańcucha peptydowego stosując mieszaninę TFA/dichlorometan w stosunku 1:1, co daje produkt Fmoc- Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)DPhe-NMeVal-OH (Sekw. Id. Nr. 15).

Następnie jest usuwana grupa Fmoc przy pomocy mieszaniny piperydyna/DMF w stosunku 1:1, co daje surowy prekursor Arg(Mtr)-GlyAsp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH (Sekw. Id. Nr. 16), który jest następnie czyszczona się w zwyczajowy sposób przez HPLC.

Do cyklizacji, roztwór 0,6 g Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH (zsyntetyzowanego jak powyżej) (Sekw. Id. Nr 16) w 15ml DMF (dimetyloformamid, Aldrich) rozcieńcza się 85 ml dichlorometanu (Aldrich) i dodaje 50 mg NaHCO₃. Po ochłodzeniu w mieszaninie suchy lód/aceton, dodaje się 40 μl azydku difenylfosforylu (Aldrich). Po odstaniu w temperaturze pokojowej przez 16 godzin roztwór zatęża się. Koncentrat filtruje się na żelu (na kolumnie Sephadex G10 w mieszaninie izopropanol/woda w stosunku 8:2) a następnie oczyszcza się w zwyczajowy sposób przez HPLC. Traktowanie TFA (kwasem trifluorooctowym)/H2O (98:2) daje cyklo(Arg-Gly-AspDPhe-NMeVal) (także określany tutaj jako „cyklo(RGDfN-MeV)”; Sekw. Id. Nr 11) x TFA, który następnie oczyszcza się w zwyczajowy sposób przez HPLC; RT=19,5; FABMS (M+H): 589.

ii. Synteza „soli wewnętrznej”

Sól TFA jest usuwana z cyklicznego peptydu zsyntetyzowanego w sposób opisany powyżej, przez zawieszenie cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11) x TFA w wodzie, następnie przez odparowanie pod próżnią w celu usunięcia TFA. Otrzymany peptyd cykliczny jest określany jako „sól wewnętrzna” i jest oznaczony jako cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11). Użyty został termin „sól wewnętrzna” gdyż peptyd cykliczny zawiera dwie reszty obdarzone ładunkami o przeciwnych znakach, które wewnątrzelektronowo, wzajemnie się równoważą tworząc nienaładowaną cząsteczkę. Jedna z naładowanych reszt zawiera resztę kwasową, a drugi naładowany podstawnik zawiera resztę aminową. Gdy reszta kwasowa i reszta aminowa są w bliskiej odległości w stosunku do siebie, reszta kwasowa może być deprotonowana przez resztę aminową z wytworzeniem soli karboksylanowej/amonowej soli z ogólnym ładunkiem obojętnym.

iii. Traktowanie HCl, w celu otrzymania cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11) x HCl.

mg cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11) rozpuszcza się w 0,01 M HCl pięć do sześciu razy i liofilizuje się po każdym rozpuszczaniu. Po oczyszczeniu przez HPLC cyklo(Arg-GlyAsp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr otrzymuje się 11 x HCl; FAB-MS (M+H): 589.

iv. Traktowanie kwasem metanosulfonowym w celu otrzymania cyklo(Arg-Gly-AspDPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11) x MeSO₃H mg cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11) rozpuszcza się pięć do sześciu razy w 0,01 M McSO3H (kwas metylosulfonowy) i liofilizuje się po każdym rozpuszczaniu. Po oczyszczeniu przez HPLC uzyskuje się cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (Sekw. Id. Nr 11) x MeSO3H; RT = 17,8; FAB-MS (M+H): 589.

Alternatywne metody cyklizacji obejmują derywatyzację łańcuchów grup bocznych acyklicznego prekursora peptydu resztami sufhydrylowymi, które wystawione na nieco wyższe pH niż pH fizjologiczne (7,5), tworzą wewnątrzcząsteczkowe wiązania disulfidowe z innymi grupami sulfhydrylowymi obecnymi w cząsteczce, w rezultacie tworząc peptyd cykliczny. Dodatkowo, C-końcowa grupa karboksylanowa, acyklicznego peptydowego prekursora, może przereagować z wolną grupą sulfhydrylową obecną wewnątrz cząsteczki, z wytworzeniem tioestropeptydów.

PL 200 919 B1

T a b e l a 1

Oznaczanie peptydu	Sekwencja aminokwasowa	Sekw. Id. Nr
62181	cyklo (GrGDFV)	4
62184 (66203*)	cyklo (RGDfV)	5
62185 (69601*)	cyklo (RADfV)	6
62187	cyklo (RGDFv)	7
62186	cyklo (RaDFV)	8
62175	cyklo (ARGDfL)	9
62179	cyklo (GRGDfL)	10
121974 (85189*)	cyklo (RGDfN-MeV)	11
112784	cyklo (RGEfN-MeV)	12
135981	cyklo (RADfN-MeV)	13

* Peptydy oznaczone symbolem * został y wytworzone w HCl i mają identyczną sekwencję jak peptyd wyszczególniony w tej samej linii; peptydy bez symbolu * zostały wytworzone w TFA. Małe litery oznaczają D-aminokwasy; duże litery oznaczają L-aminokwasy.

Wytwarzanie i charakterystyka białek fuzyjnych przeciwciało swoiste wobec nowotworu-cytokina

a. Białka i antagonista swoistej dla unaczynienia integryny α,:

Konstrukcja i charakterystyka białek fuzyjnych przeciwciało-cytokina ch14.8-IL-2 i huKS1/4-IL-2 zostały opisane wcześniej (Xiang, R., i wsp., (1997); Gillies, S., i wsp., (1992) supra). Właściwości wiązania antygenu obu konstruktów były identyczne jak odpowiednich dla nich przeciwciał i swoista aktywność IL-2 była równoważna z komercyjnie dostępną rhIL-2. Zsyntetyzowano i scharakteryzowano cykliczny peptyd 121974 (cyklo(RGDfN-MeV)) (Sekw. Id. Nr 11) antagonistyczny do integryny a_vp₃, i peptyd kontrolny (cyklo(RADfN-MeV)) (Sekw. Id. Nr 13).

Linie komórkowe i modele zwierzęce

Wszystkie linie komórkowe i poszczególne modele zwierzęce zostały wybrane zasadniczo jak wcześniej opisano (Becker, J.C., i wsp., (1996); Xiang, R., i wsp., (1996); Lode, H.N., i wsp., (1998) supra). Brak integryny α.β₃ na komórkach NXS2 i CT26-KSA został wykazany z wykorzystaniem przeciwciała przeciw mysiemu CD61 (łańcuchowi integryny β3 ) (Pharmingen, La Jolla, CA). Podczas analizy FACS obie linie komórkowe nie dały sygnału (1 μg mAB przeciw mysiemu CD61/10⁶ komórek), w odróżnieniu od pozytywnych pod względem integryn α....β3 mysich komórek czerniaka B16FG3 i B78-D14 użytych jako kontrole pozytywne. Ponadto komórki NXS2 nie były zdolne do adhezji na plastyku pokrytym mAb przeciw mysiemu CD61 (10 μg/ml 4°C, 24 h) w odróżnieniu od pokrytego przeciwciałem przeciw-GD2 ch14.18 (10 μg/mi 4^oC, 24 h) użytego jako kontrola pozytywna. Jednakże, dowiedziono przez FACS, że wszystkie komórki nowotworowe wyrażają integrynę av i są zdolne do adhezji na witronektynie, co wskazuje na obecność integryny α....β₃ Do wszystkich procedur chirurgicznych myszy były poddane anestezji poprzez iniekcję ketaminy (100 mg/kg i.p.) z jednoczesną inhalacją metofanem (Pitman-Moore, Mundelein, IL). Do podawania antagonisty integryny a_v i peptydu kontrolnego wykorzystano pompy osmotyczne (Alzet®, model 2001, Palo Alto, CA), przy wydajności podawania 17,5 μg/h. Pompy te były obsługiwane zgodnie ze wskazówkami producenta i były wszczepiane do grzbietowej tkanki podskórnej przy zachowaniu sterylnych warunków. Wszystkie pompy zostały wymienione 7 dnia po implantacji i usunięte w 10 dniu leczenia przeciwnaczyniowego. Wszystkie eksperymenty ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z instrukcjami NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Histologia i immunohistochemia

W celu zablokowania niespecyficznych wiązań, utrwalone acetonem, zamrożone wycinki nowotworów pierwotnych były inkubowane z 4% kozią surowicą. Inkubacje z monoklonalnymi przeciwciałami przeciw mysiemu CD31 i przeciw mysiemu CD45 (Pharmingen, La Jolla, CA) (1:100) i następujące później barwienia znakowanym rodaminą, kozim przeciwszczurzym przeciwciałem (1:300) przeprowadzano w nawilżanej komorze w temperaturze pokojowej. Po każdej inkubacji płukano PBS (x3). Zliczenia w polu wysokiej mocy (HPF) naczyń krwionośnych i białych ciałek krwi wykonano mikroskopowo przy powiększeniu 200x (Brooks, P.C., i wsp., (1995) „Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human

PL 200 919 B1 breast cancer growth and angiogenesis in human skin”, J. Clin. Inves. 96, 1815-1822). Reprezentacyjne obszary sfotografowano odpowiednio przy 200x (naczynia krwionośne) i 800x (białe ciałka krwi).

Cofanie się pierwotnych nowotworów zachodzi tylko u myszy leczonych antagonistą integryny a_v w połączeniu z białkiem fuzyjnym przeciwciało- IL-2

Wykazano synergiczny efekt terapii hamującej angiogenezę (antagonista integryny α) i immunoterapii (białka fuzyjne przeciwciało-IL-2) u myszy z rozwiniętymi podskórnymi guzami (110-130 μθ, odpowiednio we wszystkich trzech syngenicznych modelach.

Na Fig. 1 przedstawiono graficznie efekt połączonej terapii pierwotnych nowotworów przeciwangiogennym antagonistą integryny a_v i przeciw nowotworowej, immunoterapeutycznej swoistej dla przedziału immunoterapii białkami fuzyjnymi przeciwciało-IL-2. Na Fig. 1A przedstawiono wyniki dla guzów pierwotnych wywołanych podskórną iniekcją (2x10⁶) komórek NXS2 nerwiaka niedojrzałego. Na Fig. 1B przedstawiono wyniki dla guzów pierwotnych wywołanych podskórną iniekcją (2x10⁶) komórek CT26-KSA raka okrężnicy. Na Fig. 1C przedstawiono wyniki dla nowotworów pierwotnych wywołanych podskórną iniekcją (2x10⁶) komórek B78-D14 czerniaka. Leczenie ustalonych guzów pierwotnych (110 - 130 mm³) zostało zapoczątkowane przez codzienne, dożylne iniekcje białek fuzyjnych przeciwciało swoiste wobec nowotworu-IL-2, huKS1/4-IL-2 (10 μg, rak okrężnicy) i ch14.18-IL-2 (5 μg nerwiak niedojrzały, 10 μg czerniak)(x5) oraz ciągłą podskórną infuzję antagonisty integryny a_v specyficznej wobec układu naczyniowego, lub peptydu kontrolnego, przy pomocy pompy osmotycznej przez 7 dni przy 17,5 μg/h (góra). Czas zapoczątkowania leczenia jest wskazany czarna strzałką. Rozmiar guzów pierwotnych u myszy we wszystkich badanych grupach (n=6) wyznaczono dzięki pomiarom mikrokapilarnym (szerokość x długość x szerokość/2) (średnia ± błąd standardowy). Regresja rozmiaru guza pierwotnego u myszy otrzymujących połączone leczenie, w porównaniu z rozmiarem rozwiniętych nowotworów w czasie zapoczątkowania leczenia, była istotna statystycznie w trzech różnych, syngenicznych modelach guza(P<0,001, Wilcoxon Rank-Sum Test), w przeciwieństwie do wszystkich kontroli (P>0,05).

Najpierw, wyznaczono bliskie optymalnym dawki dla każdego sposobu leczenia i następnie zapoczątkowano łączne stosowanie. Jedynie u myszy leczonych antagonistą integryny a_v, i białkami fuzyjnymi IL-2 zaobserwowano regresję nowotworu we wszystkich trzech modelach, w zakresie od 50 do 90% (P<0,001). Właściwie, połowa zwierząt zaszczepiona komórkami nerwiaka niedojrzałego i raka okrężnicy całkowicie odrzuciła swoje nowotwory pierwotne, dane nie pokazane. Różni się to od sytuacji gdy każda ze strategii była stosowana jako monoterapia, w najlepszym przypadku opóźniając wzrost w porównaniu z kontrolą. Następnie został przeanalizowany wpływ każdego postępowania i ich połączenia na przedziały naczyniowe i nowotworowe.

Badania histologiczne przeprowadzono po połączonej, przeciwangiogennnej i swoistej wobec nowotworu immunoterapii rozwiniętych nowotworów pierwotnych, chirurgicznie usuniętych 20 dni po wykonaniu wszczepienia komórek nowotworu. Krótko, utrwalone formaliną nowotwory pierwotne zatopiono w parafinie i następnie wykonano barwienie hematoksyliną/eozyną. Zostały zidentyfikowane obszary martwicowe i obszary nacieknięte leukocytami.

Na Fig. 2 przedstawiono graficznie wpływ połączonych przeciwnaczyniowych i przeciwnowotworowych immunoterapeutycznych terapii na unaczynienie i przeciwnowotworową odpowiedź odpornościową. Myszy (n=6) z rozwiniętymi pierwotnymi guzami nerwiaka, otrzymały połączone leczenie swoistą wobec unaczynienia integryną cc, antagonistą, nie specyficznym peptydem kontrolnym i białkiem fuzyjnym ch14.18-IL-2 swoistym wobec guza, tak jak opisano na Fig. 1, włącznie z kontrolami które były poddane każdej z terapii oddzielnie. Na koniec leczenia nowotwory s.c. zostały usunięte chirurgicznie. Zamrożone wycinki każdego z guzów analizowano immunohistochemicznie z wykorzystaniem przeciwciał swoistych odpowiednio wobec komórek nabłonkowych naczyń krwionośnych (CD-31) i wobec nacieków leukocytów (CD45). Ostatni jest dobrze poznanym markerem odpowiedzi odpornościowej, swoistej dla przedziału nowotworowego, indukowanej białkiem fuzyjnym ch14.18-IL-2 (Becker, J. C., i wsp., (1996) supra; Xiang, R., i wsp., (1996) supra, Lode, H.N., i wsp., (1998) supra).

Na Fig. 2A przedstawiono wpływ leczenia na gęstość naczyń krwionośnych guzów pierwotnych, poddanych leczeniu przedziału nowotworowego i naczyniowego, albo antagonistą integryny α, i białkiem fuzyjnym ch14.18-IL-2 i ich kombinacją (*P<0,001, test T Studenta). Na Fig. 2B przedstawiono wyniki badania nacieków pierwotnych guzów przez leukocyty, odpowiednio po leczeniach przedziału nowotworowego i naczyniowego (*P<0,001, test T Studenta).

U myszy otrzymujących antagonistę integryny a_v wykazano 50% spadek unaczynienia (Fig. 2) zbieżny z opóźnieniem wzrostu guzów pierwotnych, wykazując efektywność kierunkowania do przedziału

PL 200 919 B1 naczyniowego. W tym przypadku nie było bezpośredniego wpływu na przedział nowotworowy (Fig. 1).

Dla odmiany, u myszy leczonych jedynie białkiem fuzyjnym przeciw-GD2-IL-2 wykazano wyraźne nacieki leukocytami, będące dobrze poznaną cechą tej, ukierunkowanej przeciw przedziałowi nowotworowemu terapii (Becker, J.C., i wsp., (1996) supra; Xiang, R., i wsp., (1996) supra; Lode, H.N., i wsp., (1998) supra), prowadzącej do znaczącego zmniejszenia wzrostu s.c. guza (fig. 1).

Jakkolwiek, tylko myszy leczone kombinacją antagonisty integryny a_v, z białkiem fuzyjnym przeciw-GD2-IL-2 wykazywały pięciokrotny wzrost nacieków w guzie przez białe ciałka krwi w porównaniu do myszy leczonych samym białkiem fuzyjnym przeciw-GD2-EL-2 i podobny spadek unaczynienia. Wzrost komórek zapalnych wykazano histologicznie i immunohistochemicznie i przypisywano napływowi makrofagów, co jest cechą często obserwowaną w tkankach martwicowych, podczas usuwania pozostałości komórek. W rzeczywistości, takie obszary martwicowe zaprezentowano jedynie dla guzów poddanych połączonemu leczeniu, w przeciwieństwie do kontroli leczonych każdym składnikiem z osobna.

Sekwencyjne i jednoczesne ukierunkowanie na naczynia i nowotwór indukuje usuwanie spontanicznych przerzutów do wątroby

Dodatkowo do udanego leczenia pierwotnych guzów, bardziej znaczącym pytaniem jest, czy także odległe przerzuty mogą być poddane takiej łączonej przeciwnaczyniowej i przeciwnowotworowej swoistej strategii leczenia. Badano to w modelu nerwiaka niedojrzałego, charakteryzującym się spontanicznymi przerzutami do wątroby. W tym celu leczenie nowotworu pierwotnego przeciwangiogennym antagonistą integryny a_v, było sekwencyjnie połączone z przeciwnowotworową immunoterapią białkiem fuzyjnym przeciwciało-IL-2.

Na Fig. 3 graficznie przedstawiono wpływ łączenia następującej po sobie kombinacji przeciwangiogennego antagonisty integryny a_v, i przeciwnowotworowej, swoistej wobec przedziału nowotworowego immunoterapii białkiem fuzyjnym przeciwciało-IL-2 na spontaniczne przerzuty nerwiaka niedojrzałego do wątroby. Przeciwnaczyniowe leczenie zapoczątkowano u myszy z rozwiniętymi, pierwotnymi guzami, tak jak opisano dla Fig. 1, w sumie trwało 10 dni. Po chirurgicznym usunięciu pierwotnych guzów, myszy poddano immunoterapii swoistej dla przedziału nowotworowego przez codzienne dożylne iniekcje 5 μg białka fuzyjnego ch14.18-IL2 (x5). Liczbę spontanicznych przerzutów do wątroby określono przez mikroskopowo prowadzone zliczenia ognisk nowotworowych w wątrobie (n=8) (**P<0,01, Wilcoxon Rank-Sum Test).

Jedynie u myszy poddanych leczeniu sekwencyjnemu obydwoma czynnikami wykazano 1,5-2 log spadek przerzutów do wątroby, w przeciwieństwie do wszystkich kontroli, gdzie leczenie każdym z czynników, stosowanych jako monoterapia było nieskuteczne (P<0,01) (Fig. 3). W rzeczywistości, 4/8 myszy poddanych połączonej terapii ujawniło całkowity brak przerzutów do wątroby, a u pozostałych zwierząt wykazano jedynie 1-5 małych zmian przerzutowych. W zasadzie, podobne wyniki otrzymano przy jednoczesnych połączeniach antagonisty integryny a_v, i białka fuzyjnego ch14.18-IL-2 (Fig. 4 góra).

Na Fig. 4 przedstawiono graficznie wpływ jednoczesnego łączenia terapii przeciw angiogennnej antagonistą integryny a_v i przeciwnowotworowej swoistej wobec przedziału nowotworowego immunoterapii białkiem fuzyjnym przeciwciało-IL-2 na spontaniczne przerzuty nerwiaka niedojrzałego do wątroby. Indukcja spontanicznych przerzutów następowała po indukcji guzów pierwotnych przez podskórne podanie 2x10⁶ komórek NXS2 nerwiaka niedojrzałego. Leczenie integryną lub antagonistą (17,5 μg/h) i swoistym wobec nowotworu białkiem fuzyjnym ch14.18-IL-2 (5 μgx5) zapoczątkowano przed (Fig. 4A) lub po (Fig. 4B) usunięciu pierwotnego guza. Liczbę spontanicznych przerzutów do wątroby określono mikroskopowo prowadzonym zliczeniem ognisk nowotworowych w wątrobie (n=8) (**P<0,01, Wilcoxon Rank-Sum Test).

Jedynie myszy poddane leczeniu obydwoma czynnikami, ujawniły albo pełny brak (Fig. 4A) lub >1,5 log spadek (Fig. 5B) przerzutów do wątroby (P<0,01), w zależności od podawania czynników przed lub po usunięciu guza. Różni się to od wszystkich kontroli, gdzie leczenie było bezskuteczne gdy, każdy z czynników stosowano jako monoterapię.

Synergiczne łączenie i skuteczna terapia

Przerwanie naczyń krwionośnych w przedziale naczyniowym nowotworów złośliwych jest potężną strategią w zwalczaniu raka. Nowotwór może być skutecznie zwalczany przez ukierunkowanie leczenia na nabłonkowe komórki naczyń krwionośnych nowotworu.

Antagonista peptydowy, ukierunkowany na naczynia przez interakcję z integrynami a_v, wyrażonymi na angiogennych naczyniach krwionośnych (Brooks, P.C. i wsp., (1994) Science supra; Friedlander, M., i wsp., (1995) supra) blokował powstawanie naczyń krionośnych i wywoływał bardzo

PL 200 919 B1 dużą regresję wzrostu guza. Wykazano to w leczeniu trzech agresywnie rosnących guzów pierwotnych i jednego nowotworu wywołującego spontaniczne przerzuty. Mimo że użyty antagonista integryny a_v był głównie ukierunkowany na integryny a_vp₃ to także wiąże się z blisko spokrewnioną integryną a_vp₃. Badane guzy raka okrężnicy i nerwiaka niedojrzałego niewątpliwie nie mają integryny α....β₃, ale prawdopodobnie na powierzchni ich komórek zachodzi niska ekspresja α....β₅. W modelu czerniaka ulega ekspresji a_ve₃. Jakkolwiek, efekt działania tego antagonisty integryny wyraźnie był ograniczony do naczyń krwionośnych guza we wszystkich trzech modelach zwierzęcych, tak jak zademonstrowano dla modelu nerwiaka niedojrzałego (Fig. 2). Co istotne, przeciwnowotworowy wpływ ukierunkowania na unaczynienie guza jest wzmacniany przez jednoczesny atak na przedział nowotworowy, co jest skuteczne przeciw zarówno guzom pierwotnym jak i spontanicznym przerzutom. Jest to szczególnie istotne, ponieważ usunięcie pierwotnego nowotworu przed leczeniem zwiększa wzrost i rozsiewanie przerzutów nerwiaka niedojrzałego, co jest dobrze udokumentowane w modelach innych nowotworów z powodu zmniejszenia się poziomu inhibitorów angiogenezy w krążeniu, po wycięciu pierwotnego guza (Holmgren, L., i wsp., (1995) supra; Folkman, J., (1995) supra). Równoczesne ukierunkowanie na przedział naczyniowy i nowotworowy okazało się być bardzo skuteczne, ponieważ łączy zmniejszenie wyżywienia komórki nowotworowej z aktywnym niszczeniem komórek nowotworowych, prowadząc do cofania się pierwotnego nowotworu i usunięcia odległych przerzutów,w odróżnieniu od pojedynczego podejścia ukierunkowanego na przedział naczyniowy z wykorzystaniem dwóch różnych strategii leczenia przeciwangiogennego, które tylko powodują zahamowanie wzrostu podskórnego guza w modelu syngenicznym (Mauceri, H.J., i wsp., (1998) „Combined effects of angiostatin and ionizing radiation in antitumor therapy”, Nature 394, 287-291).

W niniejszej strategii, w odpowiedzi swoistej wobec przedziału nowotworowego pośredniczą komórki stanu zapalnego, które są aktywowane i kierowane do mikrośrodowiska guza przez białka fuzyjne przeciwciało swoiste wobec guza-IL-2. Co ważne, strategia przeciwangiogenna, choć dość skuteczna w hamowaniu wzrostu nowotworów pierwotnych z dobrze rozwiniętym unaczynieniem, gdy jest stosowana jako monoterapia, jest pozbawiona podobnej skuteczności przeciw odległym mikroprzerzutom (Fig. 3,4). Jednakże, w takich minimalnych pozostałościach miejsc chorobowych z małymi obciążeniami nowotworowymi scharakteryzowanymi przez słabe unaczynienie, leczenie przeciwnowotworowe ukierunkowane na przedział nowotworowy stosowane w terapii połączonej jest też skuteczne jako monoterapia (Xiang, R., i wsp., 1997) supra; Lode, H.N., i wsp., (1998) supra). W takiej sytuacji, jednym z zadań leczenia przeciwangiogennego jest zahamowanie tworzenia nowych naczyń krwionośnych, indukowanego mikroprzerzutami i następującego po tym powiększania ognisk przerzutów (Volpert, O.V., i wsp., (1998) supra). To z kolei umożliwia likwidację takich mikroprzerzutów przez terapie ukierunkowane na przedział nowotworowy, które są optymalnie skuteczne, gdy prowadzone są w minimalnych pozostałościach stanu chorobowego (Becker, J.C., i wsp., (1996) supra).

Skuteczne leczenie pierwotnych nowotworów i rozsianych przerzutów, pozostaje głównym wyzwaniem dla klinicznej onkologii. Przedstawione tutaj wyniki wykazują że połączenie swoistej przeciwangiogennej terapii i immunoterapii działa synergistycznie w regresji pierwotnych guzów i likwidacji mikroprzerzutów. Wobec tego że środki lecznicze powyższych strategii, tj. antagoniści integryny a_v i białka fuzyjne przeciwciało interleukina-2, znajdują się obecnie w fazie badań klinicznych jako oddzielne monoterapie, synergiczny efekt ich łączenia dostarcza nowego i efektywnego narzędzia dla terapii raka.

Powyższe przykłady opisujące określone postaci wynalazku są jego ilustracją i oczywiście nie powinny być postrzegane jako specyficznie ograniczające wynalazek.

PL 200 919 B1

Lista sekwencji <110> Lode, Holger N

Gillies, Stephen D Cheresh, David A Reisfeld, Ralph A

The Scripps Research Institute ,

Lexigen Pharmaceuticals Corporation

120>sposoby leczenia nowotworów i przerzutów przy użyciu łączonej terapii anty-angiogennej i terapii immunologicznej <130> tsri6811pc <140>

<141>

<150> 60/119,721 <151> 1999-02-12 <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> sekwencja Sztuczna;

<220> ' <221> MOD_RES <222> (1) <223> BLOCKED - BOC <220>

<221> MOD_RES <222> (6) ' .

<223 > ACETYLATION - OMe <220>

<221> MOD_RES <222> (2) , <223> D-Arg ' <220>

Opis Sekwencji Sztucznej: materiał wyjściowy <400> 1

Gly Arg Gly Asp Phe Val

PL 200 919 B1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> MOD_RES <222> (1) <223> BL0CKED - B0C <220>

<221> M0D_RES <222> (2) <223> D-Arg <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: pierwszy produkt <400> 2

Gly Arg Gly Asp Phe Val

5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja Sztuczna:

<220>

<221> M0D_RES <222> (2) <223> D-Arg <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: drugi produkt <400> 3

Gly Arg Gly Asp Phe Val

5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> sekwencja Sztuczna

PL 200 919 B1

<220> <221> <222> <223>	MOD RES (2) . D-Arg
<220> <221> <222> <223>	CHAIN (1)..(6) cyclo
<220> <223>	Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(GrGDFV)

<400> 4

Gly Arg Gly Asp Phe Val

5

<210> <211> <212> <213>	5 5 PRT Sekwencja Sztuczna
<220> <221> <222> <223>	MOD RES (4) D-Phe

<220> <223>	Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RGDfV)
<220> <221> <222> <223>	CHAIN (1) - - (5) cyclo

<400> 5

Arg Gly Asp Phe Val

5

<210> <211> <212> <213>	6 5 PRT Sekwencja Sztuczna
<220> <221> <222>	MOD RES (4)

PL 200 919 B1 <223> D-Phe <220>

<221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RADfV) <400> 6

Arg Ala Asp Phe Val .

5 <210> 7 <211> 5 <212 > PRT <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Val <220> .

<221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RGDFv) <400> 7

Arg Gly Asp Phe Val

5 - ' <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Ala <220>

PL 200 919 B1 <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RaDFV) <400> 8

Arg Ala Asp Phe Val

5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Phe <220>

<221> CHAIN <222> (1)..(6) <223> cyclo <223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(ARGDfL) <400> 9

Ala Arg Gly Asp Phe Leu

1	5
<210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja	Sztuczna
<220> <221> MOD RES <222> (5) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1)..(6) <223> cyclo

PL 200 919 B1 <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(GRGDfL) <400> 10

Gly Arg Gly Asp Phe Leu

5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220>

<221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220>

<221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RGDfmV) <400> 11

Arg Gly Asp Phe Val

5

<210>	12
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Sekwencj a
<220>
<221>	MOD	_RES
<222>	(4)'
<223>	D-Phe
<220>
<221>	MOD	RES
<222>	(5)'

PL 200 919 B1 <223 > METHYLATION, NMeVal <220>

<221> CHAIN <222> (1) . . (5) <223> cyclo <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RGEfmV) <400> 12

Arg Gly Glu Phe Val

5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT ^<213> Sekwencja Sztuczna <220>

<2 21> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220>

<221> MOD_RES <222> (5) <223 > METHYLATION, NMeVal <220>

<221> CHAIN <222> (1) . . (5) <223> cyclo <220> <223> Opis Sekwencji Sztucznej: cyklo(RGEfmV) <400> 13 '

Arg Ala Asp Phe Val

1	5
<210> 14 <211> 5 <212> PRT
<213> Sekwencja <220>	Sztuczna

PL 200 919 B1 <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION - FMOC, Mtr <220>

<221> MOD_RES <222> (3) <223> OBut <220>

<221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220>

<221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal, -ONa <220>

<223> opis Sekwencji Sztucznej: Alt Syn Product <400> 14

Arg Gly Asp Phe Val

5

<210> 15 <211> 5 <212> PRT
<213>	Sekwencja Sztuczna
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(1)
<223>	FORMYLATION , FMOC, Mtr
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(3)
<223>	-OBut
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(4)
<223>	D-Phe
<220>
<221>	MOD_RES .

PL 200 919 B1 <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220>

<223> Opis Sekwencji Sztucznej: Alt Syn Start Prod <400> 15

Arg Gly Asp Phe Val

5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT ^<213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> MOD_RES <222> (1) <223> Mtr <220>

<221> MOD_RES <222> (3) <223> -OBut <220>

<221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220>

<221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220> <223> Opis Sekwencji Sztucznej: Alt Syn Prod <400> 16

Arg Gly Asp Phe Val

5

PL 200 919 B1

Claims (23)

1. Zastosowanie kompozycji obejmującej:

a) czynnik hamujący angiogenezę, którym jest antagonista a_vp₃ wybrany z grupy składającej się z peptydu, peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciwko a_vp₃, przeciwciała monoklonalnego przeciwko receptorowi a_vp₃, oraz mimetyku a_vp₃, i

b) immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy obejmujący składnik, którym jest efektor komórkowy oraz składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi, przy czym efektor komórkowy jest cytokiną wybraną z grupy składającej się z BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF, a składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuchem immunoglobuliny (Ig) obejmującym region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wybranym z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptora EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptora IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikanu MCSP towarzyszącego czerniakowi, PSA oraz receptora transferyny, do wytwarzania leku do leczenia nowotworów.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że peptyd zawierający RGD ma sekwencję reszt aminokwasowych cyklo(RGDfN-MeV)(Sekw. Id. Nr: 11).

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cytokina jest chemokiną wybraną z grupy składającej się z C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyny, GCP-2, HCC-1, I309, IL-8, IP-10, limfotaktyny, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1 alfa, MIP1 beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem GD2 towarzyszącym nowotworowi.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem KSA (Ep-CAM; antygen KS1/4) towarzyszący nowotworowi.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotwór jest pochodzenia neuroektodermalnego lub nabłonkowego.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z gruczolaka, mięsakonaczyniaka krwionośnego, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, glioblastoma, glejaka, hamartomy, naczyniaka krwionośnego z komórek śródbłonka, naczyniakomięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka, rdzeniaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, glejaka siatkówki, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

8. Kompozycja terapeutyczna do leczenia nowotworu, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden czynnik hamujący angiogenezę, który jest antagonistą a_vp₃ wybranym z grupy składającej się z peptydu, peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciwko a_vp₃, przeciwciała monoklonalnego przeciwko receptorowi a_vp₃, oraz mimetyku a_vp₃, oraz co najmniej jeden immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy, który obejmuje składnik, którym jest efektor komórkowy połączony ze składnikiem kierującym na antygen towarzyszący nowotworowi, przy czym efektor komórkowy jest cytokiną wybraną z grupy składającej się z BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Ft3L, G-CSF, GM-CSF, I309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL- 17, IL- 18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF, a składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuchem immunoglobuliny (Ig) obejmującym region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi wybranym z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptora EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptora IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikanu MCSP towarzyszącego czerniakowi, PSA oraz receptora transferyny.

9. Kompozycja terapeutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że obejmuje:

a) ilość co najmniej jednego czynnika hamującego angiogenezę wystarczającą do zahamowania angiogenezy w nowotworze lub przerzutach nowotworowych oraz

PL 200 919 B1

b) ilość co najmniej jednego immunoterapeutycznego czynnika przeciwnowotworowego wystarczającą do wywołania odpowiedzi biologicznej.

10. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że antagonista jest peptydem zawierającym RGD, który ma sekwencję aminokwasową cyklo(RGDfN-MeV) (Sekw. Id. Nr: 11).

11. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że cytokina jest chemokiną i jest wybrana z grupy składającej się z C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyna, GCP-2, HCC-1, 1-309, IL-8, IP-10, limfotaktyna, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP1 alfa, MIP-1 beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

12. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem GD2 towarzyszącym nowotworowi.

13. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem KSA (Ep-CAM; antygen KS1/4) towarzyszący nowotworowi.

14. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że nowotwór jest wybrany spośród gruczolaka, mięsakonaczyniaka krwionośnego, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, glejaka, hamartomy, naczyniaka krwionośnego z komórek śródbłonka, naczyniakomięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka, rdzeniaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, glejaka siatkówki, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

15. Zestaw do traktowania komórki nowotworowej w nowotworze lub przerzutach nowotworowych, znamienny tym, że obejmuje pakiet zawierający:

a) czynnik hamujący angiogenezę zdolny do hamowania angiogenezy w nowotworze lub przerzutach nowotworowych, którym jest antagonista ανβ3 wybrany z grupy składającej się z peptydu, peptydu zawierającego RGD, przeciwciała monoklonalnego przeciwko ανβ3, przeciwciała monoklonalnego przeciwko receptorowi ανβ3, oraz mimetyku ανβ3,

b) immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy, który obejmuje składnik, który jest efektorem komórkowym oraz składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi; przy czym składnik efektora komórkowego jest cytokiną wybraną z grupy składającej się z BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Ft3L, G-CSF, GM-CSF, I309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL- 17, IL- 18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-1alfa, MlP-1beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo i VEGF, a składnik kierujący na antygen towarzyszący nowotworowi jest łańcuchem immunoglobuliny (Ig) obejmującym region zmienny, który wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi wybranym z grupy składającej się z AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptora EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptora IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), proteoglikanu MCSP towarzyszącego czerniakowi, PSA oraz receptora transferyny

c) instrukcję użycia czynników w sposobach leczenia nowotworu i przerzutów nowotworowych.

16. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że peptyd zawierający RGD jest peptydem o sekwencji aminokwasowej cyklo(RGDfN-MeV) (Sekw. Id. Nr: 11).

17. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że cytokina jest chemokiną wyselekcjonowaną z grupy składającej się z: C10, EMF-1, ENA-78, eotaksyna, GCP-2, HCCl, I-309, IL-8, IP-10, limfotaktyna, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MlP-1alfa, 20 MlP-1beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 i SDF-1.

18. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem GD2 towarzyszącym nowotworowi.

19. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy jest białkiem fuzyjnym, które obejmuje cytokinę IL-2 oraz łańcuch ciężki Ig, który reaguje z antygenem KSA (Ep-CAM; antygen KS1/4) towarzyszącym nowotworowi.

20. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że nowotwór lub przerzuty nowotworowe są pochodzenia neuroektodermalnego lub nabłonkowego.

21. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że nowotwór lub przerzuty nowotworowe są wybrane z grupy składającej się z gruczolaka, mięsakonaczyniaka krwionośnego, gwiaździaka, raka nabłonkowego, rozrodczaka, glioblastoma, glejaka, hamartomy, naczyniaka krwionośnego z komórek śródbłonka, naczyniakomięsaka krwionośnego, krwiaka, wątrobiaka zarodkowego, białaczki, chłoniaka,

PL 200 919 B1 rdzeniaka, czerniaka, nerwiaka niedojrzałego, kostniakomięsaka, glejaka siatkówki, mięśniakomięsaka prążkowanego, mięsaka i potworniaka.

22. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnik hamujący angiogenezę i immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy są dostarczone w oddzielnych pojemnikach w pakiecie.

23. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnik hamujący angiogenezę i immunoterapeutyczny czynnik przeciwnowotworowy są połączone w jednym pojemniku w pakiecie.