HU229520B1 - Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies - Google Patents

Description

A találmány primer tumorok és áttételek gátlására vonatkozik valamely antí-angiogéri terápiás szer és valamely célzott tumorellenes immunterápiás szer kombinált beadásán alapuló terápia alkalmazásával.

A találmány elsőbbsége az 1999. február 12-én benyújtott 60/119,721 számú amerikai egyesült államokbeli Ideiglenes bejelentésen

Az itt leírt munkát részben a National Institutes of Health (NÍH) támogatta az Amerikai Egyesült Államok nevében. Ennek megfelelően az Amerikai Egyesült Államok kormánya bizonyos jogokkal rendelkezhet a találmánnyal kapcsolatban.

Az alábbiakban megvilágítjuk a találmány hátterét.

Áz új véredények kialakulása,, vagyis az angiogenezis kulcsszerepet játszik a rosszindulatú betegségek előrehaladásában, így sok figyelmet fordítottak már olyan szerek kifejlesztésére, amelyek gátolják az angiogenezist [lásd például: Holmgren L., O'Reilly M, S. és Eolkman J,: Mikro-áttételek alvó állapota: kiegyensúlyozott burjánzás és apoptózis angiogenezis gátlók jelenlétében (Dormaney of micrometastases; balanced prollferaiion and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression), Natúré Medicine 1, 149-153 (1995); Folkman J<:

tézis rákban, érrendszeri.

reumás és más betegségekben.

(Angiogenesís in cancer, vasadat, rheumatoid and other disease), Natúré Medicine X 27-31 (1995); O'Reillv ML S. és munkatársai; Ángiosziatin: új angiogenezís gátló, amely közvetíti a Lewis tüdő karcinóma általi áttétetek visszaszorítását (Angiostatin; a növel angiogenesís inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis tag careinoma), Célt 79, 315-328 (1994); Kerbel M. S.i A rezisztenciára rezisztens rák terápia (A cancer therapy resistant to resistanee), Natúré 390, 335-336 (1997); Boehm Tv és munkatársai; Kísérteti rák anti-angiogén terápiája nem indukál szerzett gyógyszer rezisztenciát (Antiangíogenie therapy of experimental cancer does nőt induce acquíred drog resistanee). Natúré 390, 404-7 (1997); és Volpert Ο. V. és munkatársai; Egy emberi fibroszarkóma gátolja a szisztémás angiogenezist és a kísérleti áttételek növekedését trombospondin-l révén (A humán fibrosarcoma. inhibits systeruic angiogenesís and the growth ot experimental metastases vía trombospondin-l),< Proc Natl, Acad. Sci. (USA) 95, 6343-6348 (1998)1Az nvps integrin. antagonisták alkalmazása angiogenezís gátlására ismert azokban az eljárásokban, amelyek szilárd tumor növekedés gátlására szolgálnak a vérszolgáltatás csökkentésével a szilárd tumorhoz. Ezzel kapcsolatban lásd például az 5,753,230 lajstromszáméi amerikai egyesült államokbeli szabadalmat (Brooks· és Cheresh) és az 5,766,591 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat (Brooks és Cheresh), amelyek leírják az ötvps antagonisták, így például szintetikus polipeptidek,, monoklonális antitestek és olyan ovik utánzók (mimetikumok) alkalmazását, amelyek kötődnek az cups receptorhoz és gátolják az angiogenezist.

ón fúziós le >seg:

antitestet tumorok» például kardnóma áttételek tminímví közvetített gátlását. így például az interfeukin~2 (íL-2) citok'in fuzionál egy monoklonális antitest nehéz lánchoz», amely ímmunreaktiv, két külön fúziós fehérjében» a tumorral társult antigénekkel vagyis a hámsejt adhéziós molekulával' (epithelial cell adhesion molecule) (Ερ-CAM» KSA, KS1/4 antigén) vagy a GDs diszíaloganglioziddal a K81/4, illetve chl4.18 antitestek alkalmazásával így alakítva ki a chl4.18-IL-2» Illetve KS1/4-IL-2 fúziós fehérjéket Ezzel kapcsolatban lásd például az 5,650,150 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat (Gillies).

Az angíogenezís érrendszer-fajlagos inhibitorainak, amelyek szinergisták a tumor területét speciálisan becélző terápiákkal azonosítása lehetővé feszi, hogy optimálisan hatékony rákkezelés legyen megtervezhető.

Az angiogenezist endoteliálís sejtek behatolása.

dása és burjánzása jellemzi; ezek olyan folyamatok, amelyek függenek a sejt és extracelluláris mátrix komponensek kölcsönhatásától. Ezzel összefüggésben az u._vp3 integnn endoteliálís adhéziós receptoráról kimutatták, hogy kulcsszerepet játszik egy érrendszer-fajlagos célpont szolgáltatásával, anti-angíogén kezelési stratégiákhoz fBrooks P, C, Clark R. A. és Cheresh D, Au Érrendszeri uvps integrin szükségessége angíogenezishez (Requirement of vascular integrin alpha v béta 3 te angiogenesis), Science 264, 569-571 (1994); Eríedlander M. és munkatársai: Két angíogén út meghatározása elkülönült αν ínfegrinekkel (Definítion of two angiogeníc pathways by dísünet alpha v íntegrins)» Science 270,15004

1502 (1995)]. Az «νβ·3 érrendszeri (vaszkuláris) infegrm szükségességét angíogenezisben számos in vívó modellben demonstrálták, ahol az új véredények átültetett humán tumorok révén történő kialakítását teljes mértékben gátolták vagy oops integrln pepiid antagonisiáinak szisztémás beadásával, vagy az L.M6Ö9 autí-ovpa antitest beadásával [Brooks P- C. és munkatársai: az előzőekben idézett munka, Science (1994); Brooks P. C. és munkatársai (1994): avps integrál antagonisták elősegítik a tumor elsorvasztását az angiogén véredények apoptózisának mdukálásával (Integrál alpha v béta 3 antagonists promole tumor regression by inducing apoptosís of angiogenie blood vessels), Ceü 79, 1157-1164 (1994)}. Az LM6Ö9 rágcsáld hibridóma letétbe van helyezve az American Type Culture Collection-nél (ATCC, Rock vilié, Maryland, Amerikai Egyesült Államok), amely intézmény nemzetközi letétbe helyezési .intézmény (International Depository Authority) a Budapesti Szerződés szerint. A nevezett hibridóma ATCC HB 9537 letéti számot kapott 1987. szeptember 15-én. Az ilyen antagonisták blokkolják az «vps integrál ligálását, ami elősegíti a burjánzó angiogén érsejtek apoptőzisát és ezáltal megszakítják az újonnan keletkező véredények érését, amely pedig nélkülözhetetlen esemény a tumorok burjánzásához.

Az érrendszeri endoteliáhs növekedési faktort [Vascular Rndoihelial Growth Factor (VEGF)} .szelektív angiogén növekedési faktorként azonosították, amely stimulálni képes az ertdotelialis sejt ontogenezist A humán tumor bíopsziák VEGE mRNS-ek megnövekedett expresszíőját mutatják rosszindulatú sejtek révén és VEGE receptor mRNS-ek révén a szomszédos endoteliális sejtekben. A VEGE expresszié a tumor azon területeiben látszik a legnagyobbnak, amelyek szomszédosak az elhalás (nekrózis) avaszkuláris területeivel [ezzel kapcsolatban érdemes tanulmányozni Thomas és munkatársai összefoglald munkáját Érrendszeri endoteliális növekedési faktor, egy hatékony és szelektív anglogén szer (Vascular Endothellal Growth Paetor, a Fotent and SeJective Angiogenic Agent), J. Bioi, Chem. 271 (2), 603-606 (1906)}. Hatékony tumorellenes terápiák hasznosíthatnak becélzó VEGF receptort az angiogenezis gátlására monoklonális antitesteket alkalmazva [Wítte L, és munkatársai; A VEGF reeepfor-2-t (Flkl/KDR) becélzó monoklonális antitestek, mint anti-angiogén terápiás stratégia részei (Monodonal antihodies targeting fhe VEGE reeeptor~2 (Flkl/KDR) as an anti-artgiogenic therapeutíc sirategy), Cancer Metastasis Rév. 17 (2), 155A szétszóródott rosszindulatú gócok hatékony kezelésének fő akadálya magában foglal minimális maradék betegséget, amelyet olyan mikro-áttételek jellemeznek, amelyek nélkülözik a jól kialakult vaszkuláris ellátást a gyógyszerek szállításához. Ebből a szempontból egy új immunterápiás stratégia bizonyult hatékonynak, tumor területre fajlagos monoklonális antitesteket alkalmazva, amelyek a eífokínekef a tumor mikro környezetébe irányítják. Ezt rekombínáns anfitest-dtokin fúziós fehérjékkel érik el, amelyek úgy vannak kialakítva, hogy fenntartsák a monoklonális antitestek egyedi tumor-fajlagos becélzó képességét és a citokinok immun-módosító funkcióit. Az antitest-IL-Z fúziós fehérje alkalmazása az. IL-2 irányítására a tumor területibe indukálja a tumor mikrokórnyezetbe behatoló effektor sejtek aktiválását, ez pedig a létrejött mikroáttételek hatékony kiirtását -eredményezi három különböző szingenikus egér tumor modellben (Becker L C és munkatársai: Rágcsáló áttételes melanóma T-sejt közvetített kiirtása, amelyet célzott interleukin-2 terápia indukál (T cell-mediated eradication of murine metastatic melanóma induced bv targeted inferleukín 2 therapy), j. Exp. Med. 183, 2361-2366 (1996); Xiang R. és munkatársai: Létrejött rágcsáló vastagbél kardnóma áttételek eltüntetése antitestinterleukin-2 fúziós fehérje terápiával (Elimínaöon of established murine colon carcinorna metastases by antibody-interleukin 2 tusion protein therapy), Cancer Rés. 57, 4948-4955 (1997); Lode Η. N. és munkatársai: Csontvelőbe terjedő neuroblasztóma áttételek természetes ölő sejtközvetített kiirtása célzott interleukin-2 terápiával (Natúrái kíller cellmediated eradicatíon of neurobiastoma metastases to boné marrow by targeted interleukin-2 therapy), Blood 91, 1706-1715 (1998)]. Bár a tumor áttételek korai stádiumaiban elég hatékony, ez- a tumor területbe irányító megközelítés csak halasztja az áttételek növekedését a tumor növekedés későbbi stádiumainál, amelyeket teljesen kifejlődött érrendszeri hálózat jellemez. Itt fel tehetjük a kérdést, vajon van-e a fajlagos érrendszeri- és tumor területhez irányított kezelési stratégiáknak,. amelyek szinergisták, kiegészítő előnye, amikor egymás utáni és egyidejű kombinációkban

Ezt három szingenikus rágcsáló tumor modellben, mégpedig vastagbél karcínóma, melanóma és neuroblasztóma modellben vizsgálták, ahoi az utóbbit spontán máj áttételek jellemzik. Mindhárom modell szoros hasonlóságot mutat az emberekben előforduló betegségekkel. A melanóma és neuroblasztóma modellek a GD2 diszialoganglíozídot expresszálják, amely jól megalapozott, tumorral társult antigén ilyen neuröektodermáfis rosszindulatú gócokban {.tóé R, R, Matsuki T_v és Morfon D. La Humán monoklonális antitest GM2 gangiiozidhoz melanóma kezelésére (Humán monodonal antíbody to ganghoside GM2 tor melanóma. treatment), Láncét 1, 786-787 (1989); Handgretinger R. és munkatársai: I, fázisú tanulmány humán/egér kiméra anti-GD2 gangiiozid chl4/18 antitestről neuroblasztómában szenvedő betegekkel (A phase 1 study of human/mouse diimeric antiganglioside GD2 antíbody ebi4,18 in patíents- with neuroblasfoma). Eun J. Cancer 31 A, 261-267 (1995)], míg a vastagbél kardnóma modellt az epiteliáiis sejt adhéziós molekula (Ep-CAM, KSA, KS1/4 antigén) expresszlőja jellemzi, ahol az epiteliáiis sejt adhéziós molekula olyan cél molekula, amely sikeresen hasznosítható passzív immunterápiához emberekben (Riethmuller G. és munkatársai: Monoklonális antitest véletlenszerű kísérlete kimetszett Duke-féle C vastag- és végbél kardnóma adjuváns terápiájához (Randomised tóal of monodonal antíbody fór adjuvant. fherapy of reseeted Duke's C colorectal eareinoma). Láncét 343,1177-1183 (1994)}. Ezek az antigének fajlagosan behatárolják a tumor területet ezekben a modellekben, becélozva az antítest-ínterleukín2 fúziós fehérjékkel,, amelyek humán/egér kiméra anö-GD2 antitestekkel alakulnak ki (chl4.18-IL-2) [Gillies 5. D. és munkatársai: Antitest-célzott interleukin-2 stimulálja autológ tumorsejtek T-sejt pusztítását (Antíbodytargeted interleukin 2 stimulafes T-cell killíng of autoiogous tumor cells), Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 892,1428-1432 (1992)), és humanizált antí-Epδ

CAM (antí-KSA, Anti-KSl/4 antigén) antitestekkel alakulnak ki (KS1/4íL-2) [Xiang R. és munkatársai (1997): az előzőekben idézett munka; Gillies S. és munkatársai: Az J.L-12 antitest fúziós fehérjék hatékonyak a. prosztata- és vastagbél kardnóma áttételek SCID egér modelljeiben (Antíbody~ll.-12 tusion proteins are effecúve in SCID mouse models of prostrate and colon eardnoma metastases), J, Immunoi. 160, 6195-6203 (1998)]. Ezeknek a tumor modelleknek az érrendszeri területét, ahogyan sok állat modellnél leírták, az α-vffe integrin expressziöja határozza meg újonnan kialakult véredényeken (Brooks F. C és .munkatársai; előzőekben idézett munka (1994)]. Áz itt bemutatott adatok színergikus hatékonyságot demonstrálnak egyidejű és egymás utáni kezeléseknél, fajlagosan célozva tumorokat, primer tumorok érrendszeri területeit és távoli, áttételeket. Ennek a szinergizmusnak a mechanizmusát, a csökkenés szolgáltatja a véredény képződésben, és növekedés szolgáltatja a gyulladásban, csak azokban az állatokban, amelyek kombinált terápiával vannak kezelve. Ezek a megfigyelések hangsúlyozzák az anti-anglogén hatás kombinálásának előnyös hatását tumor-fajlagos, tumorellenes immunterápiás megközelitésekkel

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmányt,

A jelen találmány egy η.νβ3 antagonisfa mint angiogenezis gátló szer,· amelyet az RGD-tartalmú pepiid,, anii-oívps monoklonális anitest és anti-mjh receptor monoklonális antitest által alkotott csoportból választunk, és egy tumorellenes anögén/dtokin fúziós fehérje mint tumor-ellenes immunterápiás szer alkalmazására vonatkozik gyógyászati kompozíció előállítására tumor sejt kezelésére betegben, ahol az említett angiogenezls gátló szert és antí-tumor ímmunterápiás szert tumorsejtburjánzást gátló menny bégben adagoljuk a betegnek, ahol az említett tumorellenes antigén egy tumor antigénhez irányított antitestnek legalább az antigénkötő részletét tartalmazza.

A tumorsejt burjánzásának gátlása magában foglalhatja a tumorsejtek növekedésének gátlását létező tumorokban és tumor áttételekben, további tumor áttételek képződésének gátlását, és még a tumorsejtek elpusztítását is. Az angíogenezist gátló szer és a tumorellenes immunterápiás szer beadható lényegében együtt, valamint egymás után is.

A beteg ez előbb említett terápiás kompozidókat kaphatja a tumornak vagy a tumor egy részének eltávolítását szolgáló sebészeti beavatkozás előtt, közben vagv után. A beadás kivitelezhető közvetlen bemerítéssel; szisztémás vagy lokalizált intravénás (i.v.), intraperitoneális (i.p.), szubkufán (s.e), intramuszkuláris (i.m.) injekcióval vagy közvetlen injekcióval a tumor tömegébe; és/vagv a megfelelő kiszerelések orális beadásával.

A találmány szerinti felhasználáshoz alkalmas angiogenezls gátló szer olyan, amely gátolni képes űj véredények kialakulását (neurovaszkularizáoíó) vagy a meglevő kapilláris hálózatok megnagyobbodását a tumorsejt körüli szövetek felé. Angíogenezist gátló szerek többek között a lineáris- vagy dklo-RGD-tartalmú polipeptidek. Egy előnyös monoklonális antitest, amely kötődik az Uvps integrínhez, az LM609-ké.nt azonosított monoklonális antitest (ÁTCC HB 9537).

Egy avps antagonista legelőnyösebb kiviteli formája a szintetikus RGD-fartalmu pepiid, a ciklolRGDtN-MeV) (SEQ ÍD NO: 11). Ilyen általános típusú ciklusos peptideket írnak le az 5,,262,,520 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban (Plow és munkatársai).

A tumorral társult antigének, amelyek immunterápiás szerek célpontjaihoz alkalmazhatók, többek között azok a tumorral társult antigének, amelyek az alábbiak által alkotott csoportból kerülnek ki: AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, EGE receptor, GDs, GDa, GM!, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), 1L-2 receptor, Lewis-Y, Lewis-X (CD15), melanómával társult MCSP proteoglikán, FSA és transzferrin

Az előnyös immunterápiás szernek olyan effektor alkotórésze van, amely egy citokin polipeptid csatlakoztatva a hecélző alkotórészhez, amely valamely immunglobulin (lg) polipeptid lánc. Az lg polipeptid lánc tartalmaz egy változó területet, amely kötődik egy tumorral társult antigénhez. Előnyös, ha az említett immunglobulin lánc, amikor kombinálódik a megfelelő komplementer lánccal (vagyis egy nehéz lánc kiegészít egy könnyű láncot), meghatároz egy antitest aktív helyet, amely fajlagos egy tumorral társult antigénhez.

Az immunterápiás szer tumor becélzó lg része tartalmazhat egy teljes immunglobulin lánc aminosav szekvenciát, vagy annak legalább egv olyan fragmentumát, amely tartalmazza a fehérje antigén kötő fajlagosságú részét Igv egy megfelelő lg polipeptid láncnak van legalább egy lg változó területe, amely fajlagos egy tumorral társult antigénhez.

Egy antitest és ebből polipepfid láncok, amelyek alkalmasak felhasználásra a találmányban, olyan aminosav-szekve.ndával bírnak, amely lehet bármilyen emlős eredetű. Amikor egy ilyen antitest fehérje nem azonos eredetű, mint a szóban forgó beteg, az antitest fehérje fragmentumai, mint az E(ab^f)z hab, Fv vagy manipulált Ev egyedi lánc antitest fehérje, alkalmazhatók. Abból a. célból, hogy tovább csökkentsük az antitest fehérje anhgeniciíását, végrehajtható az antitest aminosav szekvenciájának módosítása, hogy ezt csökkentsük, és igy a fehérjét hasonlóbbá tegyük a beteg normális antitest alkotórészeihez. így például a monoklonális rágcsáló antitest amínosav-szekvendák módosíthatók úgy, hogy emberibb jellegűnek tűnjenek a humán betegekbe való beadáshoz; az. antitestek humanizálásának sokféle munkameneté áll ehhez rendelkezésre.

Egy másik megoldás szerint az antitest lehet humán eredetű (genetikailag kódolt humán lg gének által), de transzgenlkus állatokban termelt, amely állatok úgy vannak transzformálva, hogy a humán lg gént exp.resszálják saját natív lg génjeik helyett. így például franszgenikus egerek alakíthatók ki, amelyek humán eredetű, humán lg fehérjéket kódoló DMS-eket expresszálnak. Monoklonális antitestek kialakítása ilyen transzgenikus egerekből rágcsáló B sejt hibridómákat eredményez, amelyek humán eredetű aminosav~sz.ekvenciákkal bíró antitesteket kódoló humán DNS-ekef expresszálnak. Ez nagymértékben csökkenti az ilyen antitestek immunogenicitását a. humán betegekben való felhasználáshoz.

{ £.

Humán betegek kezelésére előnyös antitestek a találmányban való felhasználáshoz a humanizált anti~GD2 tumorral társult antigén chMIS monoklonálís antiteste és az anti~KSl/4 tumorral társult antigén (amely ismert Ep~CAM~ként és KSA-kén t is) KSl/4 monoklonálís antiteste.

Egv a jelen találmányban való felhasználásra alkalmas immun terápiás szer sejt-effektor alkotórésze egy eitokin, amelyet előnyösen az IL-2, IL-12 és az IL-15 által alkotott csoportból választunk. Az előzőekben említett immunterápiás szerek eitokin része lehet a teljes eitokin fehérje aminosav-szekvenda, vagy lehet egy ilyen fehérje valamely fragmentuma, amely alkalmas arra, hogy dtokxn-fajlagos /álaszt váltson ki.

Egy előnyös kiviteli formában az immunterápiás szer dtokín része az IL~2 biológiai aktivitásával bír.

Egy eitokin polípeptidet egy lg polipeptidhez. kötve tartalmazó immunterápiás szerben egy megfelelő csatlakozás a eitokin polipeptid lánc és egy lg polipeptid lánc között magában foglalhat egy közvetlen polipeptid kötést és egy olyan csatlakozást, amely valamely polipeptid kapcsolóval (Iinkerrel) bír a két lánc között. Ez a közvetlen kapcsolás lehetővé teszi az .immunterápiás szer expresszíóját egyedi fúziós fehérjeként egy olyan gazdasejtből, amely transzformálva van a fúziós fehérje immunterápiás szert kódoló megfelelő expresszíós vektorral így egv előnyös immunterápiás szer a találmányban való alkalmazáshoz egy kétfunkciós fúziós fehérje, amelynek van egy eitokin alkotórésze és egy tumorral társult antigén becélzó alkotórésze, ahol a becélzó alkotórész valamely lg polipeptid lánc, amely fajlagos egy tumorral társult antigénre. Az ilyen előnyös immunterápiás szerekre példa többek között a GD2~re célzott ehl4.18-lL-2 fúziós fehérje, és a KS1/4 tumorral társult antigénre (amely Ep-CAM-ként és KSA-kent is ismeretes) célzott KS1/4-ÍL-2 fúziós fehérje.

A jelen találmány egy másik aspektusa tumor vagy tumor áttételek kezelésére alkalmas gyógyászati kompozíciót foglal magában, amely tartalmaz legalább egy íXvps antagonístáf mint angogenezist gátló szert, amelyet az RGD-tartalmú pepiid, anti-eufb monoklonálís antitest és antiOvps receptor monoklonálís antitest által alkotott csoportból választunk, és legalább egy tumorellenes antigén/citokin fúziós fehérjét mint tumorellenes immunterápiás szert, ahol az említett tumorellenes antigén egy tumor antigénhez irányított antitestnek legalább az anfígénköto részletét tartalmazza.

Előnyös, ha a tumoreílenes immunterápíás szer becélozza a tumort vagy tumor áttétel sejteket, Egy találmány szerinti előnyös gyógyászati kompozícióban a tumorellenes immunterápíás szer valamely kétfunkciós e; ez olyan effektor alkotórésszel bír, amely valamely átokin esszel összekapcsolva, és ez egy

egy tumor becel rmmunglobulín (lg az említet tarts olyan változó területet, amely kötődik egy tumorral társult antigénhez.

-*X?

A találmány egy további aspektusa egy készlet tumorsejt tumorban vagy tumor áttételekben történő kezelésére. A készlet egy csomagot tartalmaz.; ez magában foglal: a) egy mfb antagorústát mint angogenezist gátló szert, amelyet az RGD-tartalmú pepiid, anti-avps monoklonálís antitest és antwxvps receptor monoklonálís antitest által alkotott csoportból választunk, és amely képes angiogenezis gátlására az említett tumorban vagy az említett tumor áttételekben; és b) egy fumorllenes anügén/citökín fúziós fehérjét mint tumorellenes immunterápiás szert, ahol az említett tumorellenes antigén tartalmazza egy -tumor antigénhez irányított, antitestnek legalább az antigénkötő részét.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

A találmány előnyös kiviteli formáit és módjait ismertetjük a továbbiakban, utalva a mellékelt ábrákra.

Az 1. ábra grafikusan mutatja be egy kombinált terápia hatását anö-angíogén av integrin antagonístával és tumorellenes, területre fajlagos immunterápiával antitest-IL-2 fúziós fehérjével primer tumorokon. Az 1A, ábra mutatja be az eredményeket NXS2 neuroblasztóma szubkután injekciójával kált tumorokból. Az 1B, ábra eredményeket mutat be CT26-KSÁ vastat karcinóma szubkután injekciójával (2xlÖ⁶) indukált primer tumorokból. Az IC. ábra eredményeket mutat be B78-D 14 melanőma sejtek szubkután Injekciójával (2xlÖ⁶) indukált primer tumorokból

A 2. ábra grafikusan ábrázolja a kombinált antivaszkuláris és anhtumor terápiák hatását a vaszkulanzálásra és fumorellenes immunválaszra, A 2A. ábra eredményeket mutat be a primer tumorok véredény sűrűségére vasxkuláris és tumor terület kezelést követően αν integrin antagonistával, ohl4J.84L-2 fúziós fehérjével és ezek köxnbinációjával (*P<O,ÖÖ1; Student-féle T-teszt), A 211 ábra bemutatja az eredményeket a primer tumorok leukocita beszűrődéséhez vaszkuláris illetve tumor terület kezelések után (*P«Ö,ÖG1; Studeni-íéle T-teszt).

A 3. ábra grafikusan ábrázolja az anti-angiogén no- integrin antagonista és a fumorellenes terület-fajlagos immunterápia egymás utáni kombinációjának hatását. antitest-íL-2 fúziós fehérjével spontán máj neuroblasztőma áttéteteken. A spontán máj áttételek szamát a máj gócok makroszkópos számlálásával határoztuk meg (rm-S) (**P«Ö/Ö1; Witeoxon rangsor összesítő vizsga

Á 4. ábra grafikusan ábrázolja az anti-angiogén ov integrin antagonista és tumoreltenes terület-fajlagos immunterápia lényegében együttes kombinációjának hatását antitest-IL-2 fúziós fehérjével spontán máj neuroblasztóma áttételeken. Az eredményeket mutatjuk be az mtegrinnel vagy antagonistával (17,.5 pg/h) és tumor-fajlagos chI4.18-.IL~2 fúziós fehérjével (5 pgxő) történő kezelésből a primer tumor eltávolítása előtt (4Á. ábra) vagy után (4B, ábra) beindítva. A spontán máj áttételeket a máj gócok makroszkópos megszámlálásával határoztuk meg (n=8) (*.P<0,01; Wílcoxon rangsor összesítő vizsgálat).

Az alábbiakban részletesen, leírjuk a találmányt.

A primer tumorok és távoli áttételek visszaszorítása és kiirtása a rák alternatív kezelési stratégiájának fő célja, ilyen az anglogenezis gátlása és a célzott immunterápia.

Arra jöttünk rá, hogy váratlan szinergizmus létezik a hatékonyságban tumorokban és tumor áttételekben levő tumorsejtek kezelésénél két terápiás módozat kombinált alkalmazásával, amely két módozatra a következőképpen utalunk: (1) fantí-angiogén) angiogenezis í; és (2) tumoreltenes Immunterápia. Elsősorban a kombinált rtv antagomsta terápiát és a lumorellenes anflgénkítokm fúziós fehérje terápiát Írjuk le.

Árra jöttünk rá, hogy szinergizmus lép fel két egyedi monoterápia között, amely vaszkuláris, illetve tumor terület ellen irányul; pontosabban egy tumor érrendszer-fajlagos antí-angiogén <Xv integrin antagomsta és tumor-fajlagos antitesf~interleukin~2 fúziós fehérjék között.

Ezeknek a monoterápiáknak szimultán és egymás utáni kombinációja hatékonyan kiirtja a spontán máj áttételeket neuroblasztóma gyengén immunogén szingenikus modelljében. Ez ellentétben van a monoterápíáknak kitett kontroliokkal, legyen ez a kontroll akár anti-angiogén integrin öv autagonísta, akár antitest-IL-2 fúziós fehérje, amelyek csak részben hatékonyak az alkalmazott dózisszinteknél

Ezen kívül a szimultán kezelések az u.v integrin antagonistával és a tumor-fajlagos antitest-IL-2 fúziós fehérjékkel drámai primer tumor visszaszorulást indukáltak három szingenikus rágcsáló tumor modellben,, vagyis melanóma, vastagbél karcinóma és neuroblasztóma modellben. Amikor azonban az egyes szereket monoterápiás szerekként alkalmaztuk egymagukban, csak némi késleltetést indukáltak a tumor növekedésben.

A tumorellenes válasz társult egyidejű 50 %-os csökkenéssel a tumor véredény sűrűségben és ötszörös növekedéssel a gyulladásos sejtekben a tumor ntíkrokömyezetében. Ezt követően tumor elhalást (nekrözisf) csak olyan állatokban mulattunk ki, amelyek kombinált terápiát kaptak, de azoknál viszont nem, amelyek az egyes szereket csak monoterápiaként kapták. Az eredmények azt mutatják, hogy ezek a módozatok új és hatékony eszközt biztosítanak az 'ák jövőbeli terápiáihoz.

A találmány leírja tumorok és tumor áttételek kezelését, ismertet gyógyászati kompozíciókat és gyógyászati készleteket (csomagolt amelyek használhatók az itt leírt szinergísta gyakorlati kivitelezéséhez.

Sokféle gyógyászati, kompozíciót írunk le, amelyek alkalmasak a találmány gyakorlati kivitelezéséhez.

Angiogenezis gátlókat (inhibitorokat), amelyek gátolják az angiogenezist az ezekkel kezelt szövetekben, alkalmazunk a találmány szerint. Egy angiogenezis gátló egy angiogenezis gátló (anfi-angiogén) Ovffe antagonista, amely lehet RGEMartalmú pepiid, anti-mfk antitest vagy antí~a.vp3 receptor antitest. Az ανβί antitestekre példák találhatók az 5,753,230 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban (Brooks és Cheresh) és az 5,766,59llajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban (Brooks és Cheresh), ezeknek azon leírási részei, amelyek ovps antagonisták elkészítésére és alkalmazására vonatkoznak, speciálisan referenciaként beépülnek a jelen bejelentésbe.

Előnyös antagonisták az RGD-tartalmú peptidek, mint például a. clklo(RGDfN-MeV) ciklusos pepiid (SEQID NO; 1!),

Az antagonistaként való felhasználáshoz alkalmas ανβδ antagonisták azonosítására szolgáló vizsgálatok le vannak írva az említett amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban, ennél fogva úgy lehet tekinteni, hogy a különböző antagonistákat könnyű azonosítani a találmány gyakorlati kivitelezéséhez.

A megfelelő anti-avps monoklonális antitesteket úgy lehet módosítani, hogy körülöleljék antigén kötő .fragmentumaikat, ide értve a l?(ab)2~t, Fah-ot, és a manipulált Fv~t vagy egyláncos antitestet [singlechain antibody (SCA)j. Az ilyen fragmentumok előállítási eljárásai a szakirodalomban jól ismertek [ilyenek találhatok például Hermámon G. T. szakkönyvében: Bioconjugate Techmques, Academic Press (1996)}. A találmány megvalósítási módjai, amelyek leírják az. antitestek alkalmazását, szintén tartalmazzák a teljes antitest megfelelő módosítását antigén-kötő fragmentumaivá. Egy megfelelő monoklonális antitestet LM.609-ként azonosítunk (ATCC HB 9537).

Más «vps receptor antagonistákról is kimutatták, hogy hatékonyak angiogenezis gátlásában. így például kémiai receptor antagonistákat, például az (S)“1.0,ll-'dibidro-3-[3~(píridín“2-íl-amino)-l-propü-oxi}-5Hdibenzo[a,d}eíkloheptén~löecetsavat (amely SB-265123-ként ismeretes), megvizsgáltak sokféle emlős modell rendszerben [lásd például Keenan R. M. és munkatársak Bloorg. Med. Chem. Lett. 8 (22), 3171-6 (1998); Ward K. W. és· munkatársak Drug Méták Dispos. 27 (11), 1232-41 (1999)}.

Az érrendszeri, endoteliális növekedési faktort [Vascuíar Endothelial Growth Factor (VEGE)} úgy azonosították, mint szelektív z

angiogén. növekedési faktort. így egy további angiogenezis gátló szer lehet valamely VEGE aktivitás inhibitor, amely alkalmas az angiogén növekedés gátlására. Egy ilyen inhibitor lehet valamely versengő inhibitor vagy egy VEGE kötö/maktiváló molekula, vagy egy VEGE receptor antagonista. így például lehetséges inhibitorok lehetnek VEGE nem-angiogén kémiai utánzók hogy versengjenek a VEGE célhoz/receptoihoz való kötésért, lehetnek módosított nem-angíogén VEGE származékok, lehetnek antitestek, amelyek fajlagosan kötődnek VEGF-hez olyan alkalmas módon,, hogy gátolják az angiogén aktivitást, vagy lehetnek esetleg további fajlagos fehérjék, amelyek kötődnek VEGEhez (például izolált VEGE receptor fehérje), vagy lehetnek antitestek, amelyek VEGE receptorhoz kötődnek és blokkolják a kölcsönhatást VEGF-íei.

Más vegyületeket a vegyületek azon képessége alapján azonosítottak, hogy gátolják az angiogenezist, így például az izolált tumorhoz társult FSA antigént

B. Tumorellenes immunterápia

A találmány célul tűzi ki legalább egy (anti-angtogenezís) angiogenezis gátló terápiás szer kombinált beadását legalább egy tumorellenes rmmunterápiás szerrel együtt. A tumorellenes immunterápíás szer kombinál egy tumor becélzó alkotórészt valamely sejt effektor alkotórésszel, amely citokin. A tumor becélzó alkotórész tartalmazza egy antitest legalább egy antigén kötő részét egy tumorral társult antigénre irányítva,

a) Tumorral társult antigének

A tumorral társult antigének azok a célpontok, amelyek révén az Immunterápiás szer végül megcélozza a tumorsejteket, A tumorral társult antigénekről a szakterületen ismert, hogy korrelációban vannak bizonyos típusú rákokkal Az összes eset legtöbbjében a tumorral társult antigének sejtfeluletá antigének; ezek olyan módon expresszálődnak,. amely normálisan nem található meg a rák tumorok eredete körüli társult normális sejteknél Más tumorral társult antigének olyan molekulákat vagy extracelluláris mátrix-rokon alkotórészeket választanak ki, amelyek normálisan nem találhatók meg az érett normális szövettel társulva.

Bizonyos tumorral társait antigének fehérjék, amelyek a szövet korai fejlődési stádiumaiban expresszálődnak és normálisan nem társulnak az érett szövetekkel (ezeket néha onkofetáiis fehérjéknek nevezik). Más tumorral társult antigéneket normál érett sejtek expresszálnak ugyan, de a ráksejtek nagyobb mennyiségben expresszálnak. A tumorral társult antigének lehetnek a normálisan expresszált sejt markerek vagy extracelluláris' alkotórészek mutált formái. Még további tumorral társult antigének fehérjék, lipídek vagy extracelluláris alkotórészek glikozilezésének megváltozott vagy szokatlan formáival, vagy új szénhidrát részekkel kapcsolatosak..

z így a tumorral társult antigének széles körben változhatnak és legalábbis részben meghatározzák a jelen találmány szerint kezelendő tumor típusát. A tumor típusok és tumor antigének, amelyek expresszálődnak, változatossága nagyfokú, és még továbbra is tanulmányozott a rák szakterületén.

Tumorok sok további markere van tanulmányozás alatt, és amikor valamit azonosítanak és jellemeznek tumorral társult antigénként, ezek is megfelelő cél antigének immunterápiás szerek becélzásához egy kívánt tumor- vagy áttétel helyhez.

A génterápiás vektorok becélzásáról ráksejtekbe már beszámoltak anti-Lewís-Y antigén monoklonális antitesteket alkalmazva [Kurane S. és munkatársai; Jpn. J. Cancer Rés. 89 (11), 1212-9 (1998)], Hasonlóképpen beszámoltak liposzómák beeélzásáröl anb~gangl.íozid GM3 antitestet vagy and-Lewis-X antigén antitestet alkalmazva [Nam S, M. és munkatársai: Oncot .Rés, 11 (1), 9-16 (1999)],

Ahogyan a későbbiekben megtárgyaljuk, a szakterületen ismeretesek eljárások azonosított antigének felhasználására megfelelő antitestek kialakítására, amelyek fajlagosan kötődnek ehhez az antigénhez. Ilyen módon tumor antigéneket lehet azonosítani és monoklonális antitesteket lehet készíteni, amelyek használhatók a jelen találmányban. Tumor antigének készítésének összefoglalását adja meg az alábbi szakkőnyvben található kitanítás: Humán Cancer Markers; kiadó; The Humana Press Inc.; szerkesztők: Seli és VVahren (1982). Antigének és/vagy dtokinek és hasonlók előállításához alkalmas standard biokémiai és moiekulárbiológiai technikák találhatók például Sambrook és munkatársai szakkönyvében:. Moleeular Cloning, 2. kiadás; kiadó; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok (1989).

A tumorsejt felületi antigének fajlagosak lehetnek a tumor valamely osztályára vagy tumor egyedi típusára. Sok nukleinsav és/vagy aminosav szekvencia, amely tumorral társult antigénekre vonatkozik és kódolja azokat, áll rendelkezésre publikus számítógépes adatbázisokból, amelyek Internet révén is hozzáférhetők különböző szolgáltatók segítségével, elsősorban az NCBI-től (National Center fór Biotechnology Information;

www3.ncbi.nlm.nih.gov), ezek az adatok általában névvel és hozzáférési számmal vannak azonosítva (néhány., nem korlátozó jellegű példában, a hozzáférhető szekvencia típusokról való információkban ezekre az alábbi ában utalunk: „hozzáférési szám).

: előnyös tumorral társult antigén célpontokként a korlátozás a nélkül, megemuhuk az alt .3 hozzáférési szám: NP szám: NP 005890), CEA (hozzáférési szám: AAA62835)> CDT9 (hozzáférési szám: P1539I), CD2Ö (hozzáférési szám: P11836), CD44. (hozzáférési szám: P16Ö7Ö), CD45 (hozzáférési szám: PG8575), EGF receptor (hozzáférési szám: PÖ0533), GEb, GDs, GM1, G.M2, Her-2/Neu (hozzáférési szám: AAA58637), Ep-CAM (KSA) (hozzáférési szám: Ρ16422, AAA36151), IL-2 receptor (hozzáférési szám: P14784, NP 000197, BÜ1589), Lewís-Y, Lewis-X (CD 15), MCSP meíanőmávaí társult >zzáiérési szám: NF Ü0I888), FSA (hozzáférési szám: SA, transzferem átvivő receptor (hozzáférési szám: NP )3225, AAF04564), GA-733-1 hasnyálmirigy kardnóma jelző térje (Pancreatic Carcinoma Marker Protein) (hozzáférési szám: 19758), folát receptor (hozzáférési szám: NP 000793), L6 (hozzáférési szám: P30408), és CO-Ü29 (hozzáférési szám: A36056, P19075).

Különösen előnyös tumorral társult antigén célpontok az immunterápiás szerek becélzásához a GDa és a KSA (Ep-CAM; KS1/4 antigén), amint ezt itt leírjuk.

Tumorral társult antigén fehérjék kereskedelmi forgalomban kaphatók vagy kialakíthatók standard rekombináns· DNS, sejttenyésztő, fehérje expresszálási technikákkal, amelyek, a szakterületen jól is:

2a így például a Sigma. cég (St Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) kereskedelmi listáján szerepelnek az alábbiak; GD2 diszialogangliozid (G 0776), GD3 diszialogangliozid (G 5904), GM1 monoszialogangliozid (G GM2 monoszialogangliozid (G 4651), Ca 19-9 gyomor- és Iszeri tumor antigén (Gastrointestmal Tumor Antigén) (G 8660, G 8535), CEA karcinoembrionális antigén (C4835), Lewis-X triszachariri (1, 5152) és Lewis-Y (L 7401).

Kereskedelmi forgalomban kaphatók olyan antitestek, amelyek fajlagosak sokra ezek közül a tumorral társult antigének közül (például az USB, RDI, Aecurate Chemical and Sdentific Corp., Zymed Láb

X cégektől). így például a Sigma cég (Sf. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült monoklonális antitestet hoz forgalomba, Ilyenek az antiP (Á 8452), anÖ-CEA (C2331), anti-EGF receptor (E 3138), antí-IL-2 o receptor (I 5652, 1 5777, I 5902), anti~CD19 (F 3899), anü-CD20 (C8Ö80), antí~CD44 (C7923), és az anti-CD45 (C7556).

forgalomban nem is kaphatók, a monoklonális antitestek készítésének ismert eljárásait alkalmazva kialakíthatók tumorral társult antigénekre fajlagos antitestek, immunogénként az antigént alkalmazva. így például leírták az antiLewis-Y antigén rágcsáló antitest nehéz és könnyű lánc változó doméneket (hozzáférési szám: ÁAB25798 és AAB25799). Hasonlóképpen leírták az anti-aszialo GM1 gangiiozid rágcsáló antitest nehéz és könnyű lánc változó doméneket (hozzáférési szám: ÁA.DÖ9194 és AAD09195). Megoldottak egy kristályszerkezetet egy anti-GD2 gangiiozid monoklonális antitest nehéz és könnyű lánchoz, (hozzáférési szám:

2554841, 2554842). Beszámoltak olyan antitestekről, amelyek megkötik a folát receptort (kötő fehérje), ezt markéiként azonosították petefészek rákhoz (hozzáférési szám; N'P 000793). Beszámoltak anti~CA125 monoklonális változó terület nehéz és könnyű lánc nukleinsav szekvenciáról, és ezt felhasználták beiktatásra egy kazetta vektorba (hozzáférési szám: AAB33454,33455).

Különösen előnyös antitestek az itt leírt chl<J8 és KS1/4 antitestek,

b) Monoklonális antitestek és antigén kötő részeik és hasonlók Amióta a monoklonális antitestek kialakítási eljárásainak hajnalán erről Kohier és Milstein először beszámolt a szakterületen számos javított eljárás vált ismeretessé [lásd például az alábbi szakkönyveket: Methods in Molecular Biology, 80, kötet: Immunochemkal Protocols, 2. kiadás (szerkesztő: Pound 1. D., kiadó: Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok, 1998), ezen belül a 4, fejezet (Dean C, j.); és Ausubel P, M. és munkatársai: Sbort Protocols in Molecular Biology, 2.

kiadás (Current Protocols, kiadó: John Wiley and Sons, New York, New York, Amerikai Egyesült Államok, 1992), ezen belül all. fejezet]. Ma már rutinfeladat olyan monoklonális antitesteket kialakítani, amelyek adott antigénhez kötődnek. Az átvizsgálási (sereening) munkamenetek szintén javultak a nagy affínítású kötő antigének kiválasztására, ha

A hibridőmák kialakításának gazdaszervezetei általában egér- vagy más rágcsáló eredetűek.

Az egyik gát a rágcsáló monoklonális antitestekkel történő ismételt kezeléshez humán betegekben a HAMA [humán anti-egér antitestek megn (humán anti-mouse anübodies)], amelyet a beteg alakít ki a kezelésre adott válaszként Azok között az eljárások között, amelyekkel megkísérlik leküzdeni ezt a gátat található a rágcsáló antitest amzáiása az egér fehérje antigén aminosavak helye ?endákkal, amelyekről feltételezhetők, hogy k antigének. További eljárás lehet a kötő fapagosságot meghatározó aminosav gyökök vagy területek beültetése humán fehérje keretekbe.

Az a képesség, hogy antitest fehérje expresszálódjék fág bemutatási , lehetővé teszi olyan .antitestek kiválasztását, amelyek át vagy azért, hogy javítsák, kötésüket, vagy azért, hogy csökkentsék immunogenicitásukat (lásd például az alábbi szakkönyvet: Antíbody Engíneering (szerkesztők: McCafferty és munkatársai; kiadó: Oxford University Press (1996)], Jelenleg a humán immunglobulin gének helyettesítése transzgenikus egetekbe lehetővé teszi rágcsáló gazdaszervezetek felhasználását antitestek kialakítására, és így olyan monoklonális antitestek kialakítására, amelyek humán nukleinsav szekvencia eredetűek.

Az antitestek csökkenthetők méretükben is fragmentálással, hogy lehetővé váljék a csökkentett antigenicitás, vagy hogy kisebb terápiás molekulák legyenek megalkothatok így például egy teljes antitest fehérje csökkenthető vagy emésztéssel a megfelelő enzimek segítségével, vagy kialakításával rekombináns DNS eljárásokkal. A atumok között olyanok találhatók, amelyek tartalmazzák a teljes molekula legalább egy antigén kötő részét, ezek között lehetnek a Fafo, F.(ab)2, F(ab)a, Fv vagy egyedi láncos Fv [egyedi láncos antitest .fsingíe chaín antibody, SCA)j konstrukciók..

Fel kell idéznünk, hogy gyógyászad szerek .minden monekionális antitesten alapuló alkotórésze a találmánnyal összhangban történő felhasználása emberek kezelésére, előnyt szerezhet a módosítás lehetőségéből az immanogenidtás és a lehetséges HAMA csökkentésére, amint ezt az előzőekben leírtuk.

c) Citokínek

A tumorellenes ímmunterápiás konstrukciók, amelyeket a találmány szerint használunk,, magukba építenek egy sejt effektor részt, amely valamely diókra.

A találmány szerint alkalmazott hrmorellenes terápiás sz effektor alkotórésze tartalmazhatja sokféle cítokin bármelyikét fajlagos biológiai válasz, indukálására olyan sejtek által, amelyek a dk receptorát hordozzák, A citokínek jól jellemzett anyagok, ennél, fogva a találmányt nem kívánjuk egy-egy dtokinre korlátozni. A dtokinek magukba foglalják a kemokinekként ismert molekulákat egyik alosztályként. A jelen találmány összefüggésében a kemokineket a dtokín szupercsalád egyik tagjának tekintjük. Ennél fogva a citokin kifejezés, ahogyan itt használjuk, általában utal mind a citokinekre, mind a kemokinekre. A dtokinek szakterületének egy leírása megtalálható az alábbi szakkönyvben: Callard és Gearing: The Cytokine Facts Book, kiadó: Academic. Press, Inc. (1994). A kemokinek szakterületének egy itő az alábbi szakkönyvben: Vaddi és munkatársai: The

Facts Book, kiadó: Academic Press, Inc. (1997). Több, a leírása megtaia dtokinekkel kapcsolatos nukieinsav és/vagy aminosav szekvencia áll rendelkezésre a publi'kus adatbázisokban, amelyek Internet révén is hozzáférhetők különböző szolgáltatók segítségével, elsősorban az NCBItői (National Center tor Bioteehnology Information; www3.ncfeí.nlm.nih..gov)_/ ezek az adatok általában névvel és hozzáférési számmal azonosíthatók (néhány, nem korlátozó jellegű példában az itt idézett szekvencia információk hozzáférhetőségére úgy utalunk a későbbiekben, mint azonosítható „hozzáférési szanC-ra).

A dtokínek az emlősöknél fajspecifikusak lehetnek és változhatnak egy fajon belül Is mutációnak és/vagy alléi variációknak tulajdoníthatóan. A megfelelő dtokínek a kezelendő emlős faja szerint választhatók ki a felhasználáshoz. Amikor többszörös ahélek léteznek, a szelekciót a dtokin aktivitás szerint lehet elvégezni, vagy alléi variánsok keverékét lehet alkalmazni választható citokinként. így a találmány állatorvosi felhasználását meg lehet szabni a kezelendő állat fajokra, vagy szelekciót lehet kivitelezni közelebbi rokon fajok kiválasztott dtokínjeíbőí, ha a cél fajból ilyen nem áll rendelkezésre. Az emberek kezelésénél előnyös, ha humán homológot alkalmazunk, amennyiben ez ismeretes.

A jelen találmányban történő felhasználáshoz alkalmas dtokínek, a korlátozás szándéka nélkül, az alábbiak lehetnek: 11,-2, it-12 és II,~15 (hozzáférési számok: P01585, P29459, P46658, P40933) A találmányban való felhasználáshoz előnyös dtokínek az IL~2 és ít-12, vagy biológiailag aktív fragmentumaik, amelyek megőrzik a teljes, ép molekula effekfcs aktivitásának legalább egy részét.

A találmányban való felhasználásra előnyös citokin az 11-2.

Megfelelő dtokinek a találmány szerinti alkalmazáshoz a megfelelő nukleinsav szekvenciákból készíthetők el standard molekulárbiológiai technikákat alkalmazva. A gén expresszióhoz való eljárások a szakterületen jól Ismertek [lásd például Goeddel D. V. (szerkesztő) szakkönyvét,, a Methods in Enzymology sorozat 185. kötetét: Gene Expression Technology (Academic Press, Inc,, New York, New York, Amerikai Egyesült Államok)!· A citokinek rendelkezésre állnak kereskedelmi forrásokból is (elsősorban a Sigma cégtől, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok).

d) Tumorelienes/citokm Immnnferápiás szerek

Ezek a tumorellenes ímmunterápiás szerek, amelyek alkalmasak a találmány gyakorlati kivitelezéséhez, egy sejt-effektor alkotórészt építenek he, amely valamely dtokin egy tumor becélzó alkotórészhez kapcsolva. Egy tumor kötő alkotórész összekapcsolását az effektor alkotórésszel sokféle eljárással hajthatjuk végre.

1) Antitest fúziós fehérjék ímmunterápiás rákellenes reagenseket Írtak már le, amelyek dtokin funkciót céloznak be egy olyan sejthez vagy szövethez, amely tenor antigéneket visel, a dtokin alkalmazásával így felerősítve egy immunválaszt olyan sejtek ellen, amelyek tumor antigént hordoznak vagy társultak a tumor antigénnel. Ezekre az immunterápiás szerekre úgy utalunk, mint fumorellenes aídigén/cífokin fúziós fehérjékre, mivel a fúziós fehérje tartalmazza a dtokin fúziós terméket egy rekombináns immunglobulin (lg) polipeptid lánccal, amely immun-reagál egy előre kiválasztott, tumorral társult antigénneL

Ahogyan itt használjuk, az immunterápiás tumorellenes aníígén/dtokin fúziós fehérje szer kifejezés körülöleli a fúziós konstrukciókat antitest fehérje fragmentumok, amelyek' tartalmaznak legalább egy antigén kötő részt, és citokinek között, amelyek tartalmazzák a citokin legalább egy effektor részét, amely elegendő ahhoz, hogy megőrizze a dtokin biológiai jelző funkcióját. A találmány szerint alkalmazott fúziós fehérjék lehetnek közvetlen kapcsolásnak vagy át lehetnek hidalva valamely pepiid kapcsolóval vagy peptidekkek

A szakterületen ismeretesek tumorellenes antigén/cltokín fúziós fehérjék, ilyenek vannak leírva elsősorban az 5,65(1,150 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban (Gillies), amelynek a fúziós fehérjék elkészítésével és alkalmazásával foglalkozó leírási részei referenciaként, határozottan be vannak építve a jelen bejelentésbe.

A fúziós fehérjék irányulhatnak sokféle tumor antigén bármelyikére, amelyek se antigének, így a találmány semmiféleppen nem kíván bármelyikre korlátozódni, így például ismeretes fúziós fehérje egy dtoklnt és egy lg nehéz láncot alkalmazó előállítása, akárcsak valamely monoklonális antitestből származó rekomblnáns lg nehéz lánc előállítása. Ezen kívül a monoklonális antitestek előállítása jól megalapozott a szakterületen, és ismeretes az is, hogyan lehet ilyen antitesteket előállítani tumor antigének ellen. Monoklonális antitestek előállítására vonatkozó küanitások találhatók az könyvben; Monodénál Antibodies and Cancer Therapy, szerkesztők: Reisfeld és Seb, kiadó: Ahm R. Liss, Inc. (1985).

Az lg polipeptid lánc tipikusan valamely lg nehéz vagy könnyű lánc polipeptid, amely tartalmaz egy, valamely sejtfelnleti tumor antigént hordozó sejtre fajlagos N-termínálís változó területet A fúziós fehérje tipikusan rendelkezik az íg polipeptíddel karboxi terminálisánál csatolva egy pepiid kötés révén a citokin amino terminális aminosavához. Amikor az lg polipeptid egy nehéz lánc, az íg nehéz lánc továbbá tipikusan tartalmazza a CH1 és CH2 doméneket, és kívánt esetben tartalmazhat továbbá egy CH3 doménf. Ha kívánatos, az ilyen konstans terület dómén azonban ki lehet küszöbölve, hogy a létrejövő fúziós fehérje konstrukciónak csökkenjen az immunogenicitása, mérete vagy nemfajlagos kötése. Abból a célból, hogy megkönnyítsük a nehéz és 'könnyű lánc dómén asszociációt, kívánatos lehet egy kapcsoló Fv molekulát megalkotni, ahol a nehéz lánc Fv össze lehet pányvázva egy könnyű lánc Ev-vel. A pányva. az egyik lánc karboxi vége és a másik lánc amino terminális vége között feszül ki, és elég hosszú ahhoz, hogy ne változtassa meg drasztikusan térbeííleg az antigén kötő zsebet az újrahajtogaíási/domén asszociáció után.

Egy előnyös fúziós fehérje tartalmazza az ÍL~2 citokinf és tartalmaz egy lg nehéz láncot, amely Immun-reagál a tumorral társult GEh antigénnel. Egy másik kiviteli formában egy előnyös fúziós fehérje tartalmazza az IL-2 citokinf és tartalmaz egy lg nehéz láncot, amely immun-reagál a tumorral társult Ep-CAM (ismeretes KSA, KS1./4 antigénként is) antigénnel. Ezen kiviteli formák fúziós fehérjéire példák lehetnek a későbbiekben leírt chl4.18-ÍE-2, illetve KS1/4-IL-2 fúziós fehérjék.

2- Terápia

A találmány szerinti terápia tumor sejtek kezelésére tumorokban és tumor áttételekben az angiogenezis gátló (antí-angiogén) terápia és a tumorellenes Immunterápia kombinált alkalmazásán alapul. Több, mint egy típusú angiogenezis gátló szer alkalmazható több, mint egy típusú tumorellenes immunterápiás szerrel kombinálva. A kombinált alkalmazás történhet egyidejűleg vagy egymás után, vagy egy időköz beiktatásával a kezelések között. Bármelyik fajlagos terápiás szer beadható egynél többször a kezelés folyamán. A találmány szolgáltatja az angiogenezis gátló terápiás szerek és tumorellenes immun terápiás szerek kombinált alkalmazását amely a tumorsejt burjánzást gátló hatás szinergetikus potencírozását eredményezheti az egyedi terápiás szerekhez viszonyítva, hatékonyabb kezelést alakítva ki, mint amely az egyedi alkotórészek Önmagukban történő beadásánál észlelhető. Igv egyik aspektusban a találmány magában foglalja egy angiogenezis gátló szer és egy tumorellenes ímmunterápiás szer olyan mennyiségeinek beadását kombinációban egy betegbe, amely mennyiségek nem. eredményeznének hatékony angiogenezis gátlást vagy tumorsejt elleni aktivitást,, ha ebben a mennyiségben egyedül adnánk be ezeket.

A találmány magában foglalja módosulatok sokféleségét a találmány gyakorlati kivitelezésében, ami a lépéseket illeti, így például az, antagonista és a tumorellenes Ímmunterápiás szer beadható az összekeverést követően, vagyis egyidejűleg, vagy he lehet adni egymás után, vagyis külön-külön. Ezen kívül az antagonista és a fúziós fehérje külön-külön beadható mintegy 3 hét időintervallumon belül a beadások között vagyis lényegében az első aktív szer beadása után lényegében azonnal vagy attól számítva mintegy 3 héten belül beadható a második szer. Ezen kívül elképzelhető az is, hogy a sorrend változtatható, vagyis hogy az antagonistát adjuk be a fúziós fehérje beadása előtt, vagy a beadás végrehajtható fordított sorrendben.

Az egyik kiviteli módban a találmány magában foglalja egy angíogenezís gátló szer angiogenezíst gátló mennyiségének és egy tumorellenes immunterápiás szer biológiai válasz kiváltására alkalmas mennyiségének beadását is tumorok vagy áttételek kezelését igénylő

X betegbe. így például elegendő kiváltani egy citokin-fajlagos biológiai, választ ahol egy cítokinnel és egy rekombináns immunglobulin (lg) polipeptid lánccal bíró kétfunkciós fúziós fehérjéről van szó., ahol az lg lánc tartalmaz egy, tumorral társult sejtíelü.lefí antigént hordozó tumorsejtre fajlagos változó területet, és ahol az lg lánc egy pepiid kötésen keresztül van. csatlakoztatva a. citokínhez.

Egy másik kiviteli módban a találmány gyakorlatba vehető sebészeti beavatkozásokkal együtt, ahol a tumor tömeg egy részét vagy egészét eltávolítjuk. Ebből a szempontból a találmány egy sebészeti munkamenetet követően vehető gyakorlatba. Egy másik megoldás szerint a sebészeti munkamenetet az első aktív szer és a második aktív szer beadása közti időszak során végezhetjük el. Erre példa a jelen találmány sebészeti tumor eltávolítással történő kombinálása, amelyet a későbbiekben írunk le.

A találmány szerinti kezelés tipikusan a terápiás kompozíciók beadását tartalmazza a beadás egy vagy több ciklusában. így például ahol az egyidejű beadást gyakoroljuk, olyan terápiás kompozíciót adunk be, amely tartalmaz mind «.vffe antagonistát, mind tumorellenes immun terápiás szert, mintegy 2 naptól mintegy 3 hétig terjedő időköz során egyetlen ciklusban. Ezután a kezelési ciklus megismételhető, ahogyan a kezelő orvos elbírálása szerint szükséges. Hasonlóképpen, amikor az egymás utáni alkalmazást tartjuk célszerűnek, a beadási időt az egyes egyedi gyógyászati szerek között úgy állítjuk be, hogy az tipikusan azonos időtartamot fedjen le. Az időköz a ciklusok között változhat zérótól 2 hónapig.

A beadás végrehajtható periodikus egység adagolással, folyamatos infúzióval, perisztaltikus szolgáltatással, bólusz injekcióval, és hasonlókkal. A beadási út lehet intravénás, szubkután, intramuszkuláris.

ortotopikus injekció, ortotopíkus infúzió, orális alkalmazás, és hasonlók.

Egy a jelen találmány szerint alkalmazott gyógyászati kompozíció az aktív szert valamely gyógyászatílag elfogadható hordozóban tartalmazza, amint ez a szakterületen jól ismert, ennél fogva a találmányt nem szándékozunk .korlátozni a kompozíció tekintetében, csak az a lényeg, hogy az aktív szer vagy szerek koncentrációja a kompozícióban elegendő legyen az idézett aktív szer szolgáltatásához (beadásához) az itt leírt mennyiségekben,

A tumorellenes immun terápiás szer adagja tipikusan 0,01 mg és 10 mg közti mennyiség, előnyösen mintegy ö/l és I mg közti mennyiség, és még előnyösebben mintegy ö,ó mg/testtőmeg kg/nap.

Az σνβ3 antagonista tipikus dózisa 10 mg és 1000 mg közti mennyiség, előnyösen mintegy 20 mg és 100 mg közti mennyiség, és még előnyösebben mintegy 50 mg/ testtömeg kg/nap.

Meg kell érteni, hogy a rák mindenütt megtalálható az állatvilágon belül, és azt is, hogy az itt leírt elvek alkalmazhatók minden állatnál, ahol az angíogenezis gátolható valamely ηνβ.-? antagonistával, és ahol cítokmek vannak jelen az immunrendszerben. Ezért úgy lehet tekintem, hogy a találmány gyakorlatilag alkalmazható minden emlősnél, és különösen embernél.

Ezen kívül ismeretes, hogy igen nagy számú különböző tumor létezik, amely növekedéséhez érképzést (vaszkularizátíót) igényel, ennél fogva jelölt a jelen eljárások kombinált terápiás módosulataira. Azok között a tumorok között, amelyek növekedésükben angiogenezist indukálnak, találhatók a neuro-ektodermálís, epitelíális és hasonló szövetekből kialakuló tumorok. A tumorokra és tumor áttételekre példák lehetnek az adenóma, angioszarkóma, asztrocifőma, epitelíális karcinóma, germinóma, glloblaszfóma, glíőma, hamartóma, hemangíoendotelióma, hemangío-szarkóma, hematéma, hepatoblasztéma, leukémia, limíöma, medullo-blasztőma, melanóma, neuroblasztóma, oszteoszarkóma, retino-blasztőma, rabdomíoszarkóma, szarkóma, teratóma és hasonló tumorok.

3. Terápiás rendszerek

Az egyik kiviteli formában a találmány olyan rendszereket céloz meg, amelyek csomagolásokat és/vagy készleteket tartalmaznak; ezek szolgáltatják a jelen találmány gyakorlati kivitelezéséhez szükséges reagenseket Egy készlet tumorsejtek kezelésére tumorokban vagy tumor áttételekben egy csomagot tartalmaz az alábbiakból:

a) valamely angiogenezis gátló szer, .amint azt a jelen leírásban ismertettük, amely angiogenezis gátlására képes a tumorban vagy tumor áttételekben;

b) valamely tumorellenes immunterápiás szer, amint azt a jelen leírásban ismertettük, például egy kétfunkciós fúziós fehérje reagens, amely egy citokinnel és egy rekomhínáns immunglobulin (lg) polipeptid lánccal bír, ahol az lg lánc tartalmaz egy, valamely tumorral társult sejtfelületi antigént hordozó tumorsejtre fajlagos változó területet, ahol az lg lánc egy pepiid kötéssel, csatlakozik a citokinhez; és

c) útmutatások a reagensek alkalmazásához tumorok és tumor áttételek kezelésére.

Egy reagens a találmány szerinti készletben tipikusan terápiás kompozícióként van kiszerelve, ahogyan itt leírjuk, ennél fogva a sokféle lehetséges forma bármelyike lehet, amely alkalmas egy készletbe való elosztáshoz. Az ilven formák között találhatók a folyadékok, porok, tabletták, .szuszpenziók és hasonló kiszerelések a találmány szerint alkalmazott antagonisták és/vagy fúziós fehérjék szolgáltatására, A reagenseket szolgáltathatjuk elkülönült tartályokban, amelyek, alkalmasak a külön-külön beadáshoz, vagy egy másik megoldás szerint szolgáltathatjuk kombinált kompozícióként egyetlen tartályban a csomagban.

Hasonlóképpen egy ilyen csomag tartalmazhat az előzőekben leírt alkotórészeken kívül bármely más tumorellenes terápiás szert.

A csomagolás tartalmazhat a reagensek egy vagy több adagjához elegendő mennyiséget az itt leírt kezelésekhez. Tipikusan egy csomag egy kezelési ciklushoz elegendő mennyiséget tartalmaz, ahogyan itt leírjuk. A csomag jelölése jelezheti, hogy a mellékelt reagensek kombinált vagy egymás utáni alkalmazásáról van-e szó a tumor és/vagy az áttételek terápiás kezeléséhez a találmány szerint. Az ilyen csomag jelölések rögzítve lehetnek az egyes reagens csövekre és/vagy az anyagok, komplett csomagolására.

A találmány szerinti készlet tartalmazza a csomagban található anyagok „felhasználási útmutató~ját is. Az útmutatók az antagonísta és a fúziós fehérje kombinált alkalmazására vonatkoznak tumorok vagy tumor áttételek kezelésére a találmány szerint. Mivel a kezelések széles körben változhatnak a tumortól, a betegtől és a betegség állapotától függően, az útmutatások következésképpen változhatnak a beadás adott munkamenetétől függően. A találmánnyal kapcsolatban nem tekintjük azútmutató természetét korlátozó fényezőnek, így nem tekintjük másnak, mint szabatos segítségnek az antagonísták és a fúziós fehérjék kombinált alkalmazását illetően a találmány szerint.

Hasonlóképpen a reagensek magukban foglalhatnak tumorellenes immunterápiás· citotoxikus szereket, például tumor antigén kötő antitesteket radioaktívan jelzett izotópokkal vagy citotoxikus szerekkel, például citotoxikus peptidekkel vagy citotoxikus gyógyszerekkel és hasonlókkal összekapcsolva.

4. Szintetikus peptidek előállítása

a) Szintézis munkamenet

A későbbiekben, az 1. táblázatban felsorolt lineáris és ciklusos poHpeptideket standard szilárd fázisú szintézis technikával szintetizáltuk, ahogyan például Merrifieíd. R, B, és más szerzők leírják [Memfield R. Bz Szilárd fázisú pepiid szintézis (Solid~Pha.se Synthesís), Adv. EnzymoL Relat Areas Mól. Bioi, 32, 221-96 (ίξ Merritieíd R. B.: Biológiailag aktív peptidek és fehérjék szintézise synthesis of biologically active peptides and proteins), JAMA 210 (7), 1247-54 (1969); és .Flelds G. B. és Noble R. La Szilárd fázisú pepiid szintézis 9-£luorenll-metoxí~karbonil~aminosavakat hasznosítva (Solid synthesís utilizing 9-fluorenyImethoxycarbonyI amino >}, Int. J. Peptide Protein Rés, 35 (3), 161-214 (1990)), gramm (g) BOC-Gly-D-Arg~GJy~Asp~PhmVal~OMe-t (SEQ ID ): 1) először feloldunk 60 milliliter (ml) metanolban, amelyhez hozzáadunk 1,5 ml 2 n nátrium-hidroxid oldatot, hogy keveréket kapjunk. A keveréket azután 3 órán át kevertetjük 2ÖC hőmérsékleten (20C). Bepárlás után a maradékot vízben felvesszük, pH 3 értél savanyítjuk hígított HG oldattal, majd extraháljuk eiíi-aeetáttal Az extraktumoi NazSCh-en víztelenítjük, ismét bepároljuk, és a létrejövő BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH-t (SEQ ID NO; 2) 200 hőmérsékleten kevertetjük 2 órán át 20 ml 2 n dioxános HC1 oldattak A létrejövő keveréket bepároljuk, így kapjuk meg a H-Gly-D-Arg-Gly-ÁspPhe-Val~OH-f (SEQ ID NO; 3), amelyet azután féloldunk 1800 ml diklórmetán és 200 ml dímetil-tormamíd keverékében, majd lehűtjük Ö“C hőmérsékletre. Ezután egymás után 0,5 g didklohexil-karbodilmídet (DCC.I), 0,3 g l-hidroxi-bertzotriazolt (HOBt) és 0.,23 ml N-metíl-morfoIínt adunk hozzá, kevertetés közben.

A létrejött keveréket további. 24 órán át kevertetjök ÖC hőmérsékleten, majd 48 órán át 20’C hőmérsékleten. Az oldatot koncentráljuk, majd kevert ágyas ioncserélővel kezeljük, hogy sóiból felszabadítsuk. Miután a létrejött gyantát szűréssel eltávolxtottuk, a derített oldatot bepároljuk és a maradékot kromatográfiával tisztítjuk, így nyerjük ki a cíklo(Gly-D-Arg“Gly-Asp-Phe-Val)“t (SEQ. 1D NO: 4),

Az alábbi, az 1. táblázatban, felsorolt peptideket kapjuk meg analóg módon, ott az egybetűs aminosavgyök kódokat alkalmazva és egy pepiid szám megjelöléssel azonosítva: ciklo(Arg~Gly~Asp~D~Phe-Val) (SEQ ID NO: 5); dklo(Arg-AIa-Asp~D-Phe~Vaí) (SEQ ID NO: 6); tíklo(Arg-D-AlaAsp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 8); áklo(Arg~Gíy~Ásp~Phe~D~Val) (SEQ ID NO: 7); és cIklo(Árg~Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) (ahol metilezés található- a valin gyök amid kötésének a-ambo nitrogénjénél) (SEQ ID NO: 11).

A 662Ö3 jelölésű pepiidnek, azonos szekvenciája van, mint a 62184 jelzésű pepiidnek, azzal az egyetlen különbséggel, hogy ez a .HC1 sót tartalmazza a 62184-gyel ellentétben (SEQ ID NO: 5), ahol a TFA (tdfluoracetát) só van jelen. Ugyanez a helyzet a 69601 és 62185 jelzésű peptideknél is (SEQ ID NO: 6) és a 85189 és 121974 jelzésű peptideknél is (SEQ íD NO: 11).

b) Alternatív .szintézis eljárás

i) ciklo(Arg-Gíy-Ásp-D-Phe-NMeVal) (SEP ID NO;ll) TEA só előállítása

Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Pbe-NMeVal~ONa (SEQ ID NO: 14) pepiidet szintetizálunk szilárd fázisú, Merrifield-trpusú munka-menetet alkalmazva, egymás után adva NMeVal-t, D-Phe-t, Asp{OBut)-of, Gly-t és Fmoe~Arg(Mtr)~i lépcsőzetesen 4-hidroxi-metilfenoxi-metil-pohsztirol gyantához (Wang-típusú gyanta) (a pepiid szintézis szokásos Memfieid-típusú eljárásait alkalmazva). A polisztirol gyanta és az aminosav gyök prekurzorok kereskedelmi forgalomban kaphatók az Áldrich, SIgma vagy FJuka cégeknél. Miután az aminosav gyökök egymás utáni adagolása befejeződött, a gyantát eltüntetjük a peptid láncról TFA/dikfór-metán 1:1 keverékét alkalmazva, amely művelet kialakítja az Pmoc-Arg(M.tr)-Gly“Asp(OBut)-D-Phe-NMeVal-OH terméket (SEQ ID NO: 15). Ezután eltávolítjuk az Prnoc csoportot piperidin/DMB 1:1 arányú keverékével, így kapjuk meg a nyers Arg(Mtr)Gly-Asp(ÖBut)-D-Pbe-NMeVaI-OH prekurzort (SEQ ID NO: lő), amelyet azután HPLG-vel tisztítunk szokásos módon.

A eiklizáláshoz 0,6 g Arg.(MtT)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-NMeVaÍ-Gíi (amelyet az előzőekben szintetizáltunk) (SEQ ID NO: 16) 15 ml DMP-fel (dimetíl-formamid; Áldrich) képzett oldatát hígítjuk 85 ml diklórmetánnal (Aldrich), majd 50 mg NaHCOs-at adunk hozzá. A keveréket szárazjég/aceton keverékben lehűtjük, és 40 μΐ dífeml-foszforil-azidot (Aldrich) adunk hozzá. Szobahőmérsékleten állni hagyjuk 16 órán át, majd az oldatot koncentráljuk. A koncentrátumot gélszűrésnek vetjük alá .(Sephadex G1Ö oszlop izopropanol/viz 8:2-ben), majd HPLG-vel tisztítjuk szokásos módon. Á kezelés TFA-val [trííluor-ecetsav/víz (98:2)] szolgáltatja a eikíoíÁrg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal), (amelyre itt ,,dklo(RGD£N-MeV)~ként is utalunk SEQ ID NO: 11) x TFA terméket, amelyet HPLC-vel tisztítunk szokásos módon; RT = 19,5; FAB-MS (M+H):

ii) „Belső .só szintézise

A TFA sót eltávolítjuk az előzőekben előállított ciklikus olyan, módon, hogy a ciklo(Arg-G!y~Asp~D-Fhe-NMeVal) (SEQ

ID NO: 11) x TFA-t vízben szuszpendáljuk, majd vákuum alatt bepárlást végzünk, hogy a TFA-t eliávelitsuk. A kialakult ciklusos pepiidre „belső só-ként utalunk, és ezt dklo(Arg-Gly-Asp4>Phe~NMeVal)-nak jelöljük (SEQ ID NO; TI), A „belső só kifejezést azért használjuk, mert a ciklusos peptid két ellentétes töltésű gyököt tartalmaz, amelyek intraelektromosan kiegyensúlyozottak egy összességében nem töltött molekulát alakítva ki. A töltött gyökök egyike egy savgyököt tartalmaz, és a másik töltött gyök aminogyököt tartalmaz. Amikor a savgyök és az aminogyök szoros közelségben vannak egymáshoz, a savgyök deprotonálódhat az aminogyök segítségévei, amellyel karboxilát/ammőnium só fajta keletkezik összességében semleges ssel.

ákioíArg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) (SEQ : 11) x HC1 kialakítására mg ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)-t (SEQ ID NO: 11) feloldunk 0,01 mó.1/1. HCEben S~ő alkalommal, és mindegyik oldás! művelet után fagyasztva szárítjuk. Az ezt követő tisztítás .HPLC-vel adja

-D~Phe-NMeVaí) ív) Kezelés meiánszulfonsavval dkíofArg-Gly-Asp-D-PheNMeVal) (SEQID NO; 11) x MeSOsfl kialakítására 80 mg dklo(Arg~Gly-Asp-D~Pbe-NMeVal)~t (SEQ ID NO;

11} feloldunk 0,01 rnől/1 MeSOsH-ban (metánsznlfonsavban) 5-6 alkalommal, és mindegyik oldás! művelet után fagyasztva szárítjuk, Az ezt követő tisztítás HPLC-vel adja a tíklo(Arg-Gly-Asp~D~Phe-NMeVal) (SEQ ID NO; 11) x MeSOsH-t; RM7,8; FAB-MS 589,

A dklizálás alternatív eljárásai magukban foglalják az acíklusos pepiid prekurzor oldalcsoport láncainak származékképzését szuííhidril gyökökkel, és amikor a normális fiziológiai pH körülményeknél valamivel magasabb pH-nak tesszük ki (pH 7,5), mtramolekulárisan diszulfid kötések, keletkeznek más, a molekulában jelen levő szulfhidril csoportokkal, ciklusos pepiidet alakítva ki. Ezen kívül egy aeiklusos pepiid prekurzor C-terminális karboxilát gyöke reagálhat a molekulában jelen levő szabad szulfhidril gyökkel, így tíoészter eiklízált peptídeket alakítva ki.

TÁBLÁZAT

Aminosav szekvencia

62181

Gklo(GrGDFV)

Gkio(RGDfV)

CUdo(RADf¥)

62186

62175

Gklo(RGDFv)

Gklo(RaDFV) o

<8

62179

112784

335981

Gkíö(GRGDíL) 10

CMo(RGDfN-MeV) 11

Gklo(RGEfN-MeV) 12

GkJo(RADfN-MeV) 13 *' A csillaggal megjelölt peptídeket HCl-ben készítjük el, és ezek szekvenciájukban azonosak azokkal a peptídekkel, amelyek ugyanabban a sorban vannak megjelölve; a csillag nélküli peptidek TFÁ-ban vannak elkészítve. A kisbetűk D-aminosavakat jelölnek; a nagybetűk Laminosavakat jelölnek.

5. Tnmorfajlagos· antitesf-citokin fúziós fehérjék és érrendszerfajlagos αν integrín antagonisták kialakítása és jellemzése a) Fehérjék és érrendszer-fajlagos cn- integrín antagonisták

A chí4.I8-ÍL.-2 és huKSl/4-IL-2 antitest-dtokin fúziós fehérjék megalkotását és jellemzését már korábban leírták [Xiang R, és munkatársai (1997); Gillies S. és munkatársai (1992), korábban idézett munkák). Mindkét konstrukció antigénkötő jellemzői azonosak vonatkozó antitesteik antigénkötő tulajdonságaival és a fajlagos EL-2 aktivitás ekvivalens a kereskedelemi forgalomban kapható rhIL~2~ével. A 121974 [ciklo(RGDfN-MeV)] (SEQ ID NO; 11). avps integrin antagonista ciklusos pepiidet és a 135931 |dkto(RADfN-MeV)} (SEQ ID NO; 13) kontroll pepiidet szintetizáljuk és jellemezzük.

ú. Sejtvonalak és állati modellek sejtvonalai és megfelelő állati modellt lényegében úgy létesítünk, ahogyan ezt korábban leírták [Beeker J. C és munkatársai (1996); Xíang R. és munkatársai (1996); Lödé Η. N. és munkatársai (1998), korábbiakban idézett munkák). Áz asfá integrin távollétét NXS2 és CT26KSA sejteken anti-egér CDó! (integrin β:< lánc) antitest (Pharmíngen; La Jolla, Kalifornia, Amerikai. Egyesült Államok) alkalmazásával demonstráljuk. Egyik sejtvonal sem tár fel szignált (1 pg anti-egér CDól mAö az αψ3 integrin-pozitív B16FG3 és B78-D14 rágcsáló melanóma sejtekkel, amelyeket pozitív kontrollként alkalmazunk. Ezen kívül az NXS2 sejtek nem képesek az anti-egér CDól m Ab-vei borított műanyaghoz tapadni (10 pg/ml; 4X; 24 óra), ellentétben a pozitív kontrollként alkalmazott chlAd.S anti~GD2 antitesttel (10 pg/ml; 4’C; 24 óra). Az összes tumorsejt expresszá! azonban eu integrált PACS-sel, és tapad vitronek tinen, jelezve az co-ps integrin

Az összes sebészeti munkamenetnél egereket érzéstelenítünk ketamin injekcióval [100 mg/kg Intraperitoneálísan {í,p.}] és egyidejűleg metofán inhalálással (Pitman-Moore, Mundelem, Illinois, Amerikai Egyesült Államok). Ozmotikus .szivattyúkat (AlzetO, 2001 modell, Palo Alto, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazunk az otv. integrin antagonísta és a kontroll pepiid bevezetéséhez, 17,5 pg/öra szolgáltatási ?esseg:

a szivattyúkat a gyártó cég útmutatásai szerint etjük a dorzálís szubkután szövetbe steril körülmények között. Minden szivattyút kicserélünk a 7. napon a beültetés után, és eltávolítunk a antivaszkuláris kezelés 10. napján. Minden állatkísérletet az NIH „Guide fór the Care and Use of Laboratory Arúmals (Irányvonal a laboratóriumi állatok felügyeletéről és alkalmazásáról) című irány v onala szerint hajtunk végre.

7. Hbztológia. és immunhisztokémia

Primer tumorok acetonnal rögzített, fagyasztott metszeteit inkubáljuk 4% kecske szérummal, hogy blokkoljuk a nem-fajlagos kötést. Áz. inkubálást antí-egér CD31 és antí-egér CD45 monoklonális antitestekkel (Pharmíngen; La Jolla, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) (1:100) végezzük, és az ezt követő festést rodammnal jelzett kecske-anti-patkány antitesttel (1:300), nedvesített kamrában hajtjuk végre szobahőmérsékleten. Minden inkubálást mosás követ háromszor PBS-sel (foszfáttal pufiéról! fiziológiás konyhasóoldat). A véredény- és fehérvérsejtszámöt nagy erejű területenként („high power tieid. (HPE)j mikroszkóposaxi határozzuk meg 200-szoros nagyításban [Brooks P. C és munkatársak Ánti-mpk integrin blokkolja a humán mellrák növekedést és az angiogenezist emberi bőrben (Antí-íntegrin alpha v béta 3 hlocks humán breast cancer growth and angiogenesis in humán skín), J, Cfin. Inves. 96, 1815-1822 (1995)]. A .reprezentatív területek 200-szoros nagyításban (véredények), illetve 8ö0~szoros nagyításban (fehérvérsejtek) vannak lefényképezve.

δ. Primer tumorok csak a? integrin antagonistákkai kombinált antiteshfL-2 fúziós fehérjékkel kezelt egerekben fejlődnek vissza Az angíogenezls gátló terápia («_v integrin antagonisla) és immunterápia (antttest-lL-2 fúziós fehérjék) szinergetikus hatását megállapított' szubkután tumorokkal (110-130 pl) bíró egerekben határozzuk meg, illetve mindhárom szingenikus modellben.

Az '.L ábra grafikusan ábrázolja a kombinált terápia hatását antiangiogén öv integrin antagonistávai, és antitest-IL-2 fúziós fehérjékkel együtt! fumorellenes immunterápiás terület-fajlagos immunteráplával primer tumorokon. Az 1A. ábra mutatja be az eredményeket az NXS2 neuroblaszfóma szubkután injekciójával (2xlí>) indukált primer tumorokból. Az 1B. ábra eredményeket mutat be CT26-KSA vastagbél karcmóma szubkután. injekciójával (2x1.0) indukált primer tumorokból. Az IC. ábra eredményeket mutat be a B78-O14 melanóma sejtek szubkután injekciójával (2x10) indukált primer tumorokból, A megállapított tumorok (110-130 mm³) kezelését a huXSl/4-IL-2 (10 pg; vastagbél kareinóma) és ehl4J.8-IL~2 (5 pg; neuroblaszfóma.; 10 pg; melanóma) (x5) tumorfajlagos antitesHL-2. fúziós fehéxjék napi

Lszer-lajlagos m· mtegrm intravénás injekciójával indítjuk be, és az antagonísta vagy a kontroll pepiid folyamatos szubkután infúziójával ozmotikus szivattyúval 7 napon át 17,5 pg/óránál (felső határ), A kezelés beindulásának időpontját fekete nyíl jelzi. Az egerek primer tumorjainak méretét minden kísérleti csoportban (n=6) mikrokaliber méréssel (szélesség x hosszúság x széiesség/2) (átlag ± standard hiba) határozzuk meg. A visszafejlődés a kombinációs .kezelést kapott egerek primer tumor méretében összehasonlítva a megállapított' tumorok méretével a kezelés kiindulásának időpontjában szignifikáns mindhárom különböző szingenikus tumor modellben (P<Ö,001; Wílcoxon rangsor-összesítő vizsgálat) ellentétben az összes kontrollal (P>ö,05).

Először az egyes gyógyászati módosulatokhoz a szuboptímális mennyiségeket állapítjuk meg, és ezután beindítjuk alkalmazásukat különböző kombinációkban. Csak az. m· integrál antagonistával és az ÍL-2 .fúziós- fehérjékkel kezelt egerek mutatnak tumor visszafejlődést 50-90% közti tartományban mindhárom modellben (ΡΟ,ΟΟΙ), Valójában a neuroblasztöma és vastagbél kartínóma sejtekkel inokulált állatok fele teljesen visszautasítja primer tumorjait (adatokat nem mutatunk be). Ez ellentétben van az egyes stratégiákkal, amelyeket monoterápiaként alkalmaznak, ez pedig legjobb esetben a késleltetett növekedés, összehasonlítva a kontroll csoporttal. Az egyes kezelési módosulatok és kombinációik hatását elemezzük ezután a vaszkuláris és tumor területekre.

A megállapított primer neuroblasztöma tumorok kombinált antiangiogén és tumor-fajlagos immunterápiáját követően hajtjuk végre a hiszfológiai vizsgálatokat a iumorsejt inokulálást követő 20. napon sebészetileg eltávolított tumorokon. Röviden ismertetve, formaiinnal rögzített primer tumorokat vetünk alá paraffinos beágyazásnak és az ezt .követő hematoxiiin/eozin festésnek. Azonosítjuk a nekroti.kus területeket és a leukocita készülődéseket

A 2. ábra grafikusan ábrázolja az anti-vaszkuláris terápia és tumorellenes ímmunterápia kombinációjának hatását az érképzésre és fumorellenes immunválaszokra. Egerek (n«6) megállapított primer nenroblasztóma tumorokkal kombinált kezelést kapnak érrendszerfajlagos. ce integrin antagonistával egy nem-fajlagos pepiid kontrollal és egy temorfajlagos chl4.184t.~2 fúziós fehérjével, ahogyan az 1. ábrában, bemutatjuk, ide értve olyan kontroliokat, amelyek csak egyetlen terápiát kapnak. A kezelés végén a szubkután (s.c.) tumorokat sebészíleg eltávolítjuk. Az egyes tumorok fagyasztott metszeteit immunhísztokémíai úton elemezzük, véredény endoteliálís sejtek (CD-31)-.re, illetve leukodta beszűrődésre (CD45) fajlagos antitestek alkalmazásával· Az utóbbi jól meghatározott markere a ch!4.18-IL-2 fúziós fehérje által indukált, a tumor területre fajlagos immunválasznak [Becker J, C. és munkatársai (1996); Xiang és munkatársai (1996); Lode .Η, N. és munkatársai (1.998); korábban idézett munkák].

A 2Á. ábra az eredményeket mutatja be a primer tumorok véredény-sűraségevel kapcsolatban a vaszkuláris és tumor terület kezelést követően az a* integrin antagonistával, ehl4.18-íL~2 fúziós fehérjével és kombinációjukkal (*P<Ö,OÖ1; Student-féle T-teszt). A 2B, ábra az eredményeket mutatja be a primer tumorok leukodta beszűrődésével kapcsolatban a vaszkuláris- illetve tumor t ke:

ek után. {

Az. á» integrin antagonistát kapott egerek 50%-os csökkenést mutatnak a vaszkularizálásban (2, ábra), ez egybevág a primer tumorok növekedésének késleltetésével ez pedig a vaszkuláris terület hatékony hecélzását demonstrálja. Ebben az esetben a tumor területre közvetlenül nincs hatás (1. ábra). Ezzel ellentétben azok az egerek, amelyek csak az anti”GD2-ÍL-2 fúziós fehérjével vannak kezelve,

I önült heszűrődést tárnak fel, amelv ennek az anti-tnmor-területre irányuló v V¹ terápiának jól meghatározott jellemzője [Beeker j, C és munkatársai (1996); Xiang R. és munkatársai (1996); köde Η, H. és munkatársai (1998), korábban idézett munkák], amely az s,e. tumor növekedés jelentős csökkenéséhez vezet (1. ábra).

Csak azok az egerek tárnak fel azonban ötszörös növekedést a fehérvérsejt beszűrődéshen a tumorba a csak anii-GD2~IL~2~veI kezelt egerekkel összehasonlítva, amelyek az. αν integrin antagonísta és antiGD2-JL-2 fúziós fehérje kombinációjával' vannak kezelve, és csak ezek mutatnak hasonló csökkenést a vaszkularízálásban is, A növekedést a gyulladt sejtek, számában hiszfológiával és inununhisztokémiával demonstráljuk, és ezt makrofagok benyomulásának tulajdonítjuk; ez olyan séma, amely gyakran látható nekrotikus szövetekben sejttörmelék eltávolítása során. Valójában az ilyen nekrotikus területek csak olyan tumorokban vannak jelen, amelyek kombinációs kezelést kaptak.

ellentétben a kontrollokkal, amelyek az egyes alkotórészekkel külön9. Az. egymás utáni és szimultán vaszkuláris- és tumor becébás a spontán máj áttételek kiirtását indukálja A primer tumorok sikeres kezelésén kívül még inkább releváns kérdés az, vajon az elkülönült áttételekre is hat-e az ilyen kombinált antivaszkuláris és antí-tumor-fajlagos kezelési stratégia. Ezt a neuroblasztóma modellre értelmezzük, amelyet spontán májáttéfe.lek jellemeznek. Ebből a célból a primer tumorok kezelését az anti-angiogén αν integrál antagonistával egymás utáni formában kombináljuk. az antifesí-IL-2 fúziós fehérjével végzett tumorellenes ímmunterápiávat

A 3. ábra grafikusan ábrázolja anti-angiogén αν integrín antagonista terápia és az antitest-íL-2 fúziós fehérjével együtti. anti-tumór terület-fajlagos immunterápia, egymás utáni kombinációjának hatását a spontán máj neuroblasztóma áttételekre. Az anti-vaszkuláris kezelést megállapított primer tumorokkal bíró egerekben úgy indítjuk el, ahogyan az 1. ábrára leírtuk, összesen 10 napon át. A primer tumorok sebészeti eltávolítása után az egerek 5 pg napi ehl4.18-II,-2 fúziós fehérje i, v. (intravénás) injekciójával (x5) tumor-terület fajlagos immunferápiát kapnak. A spontán májáttételek számát a máj gócok (n~^:8) makroszkópos számlálásával kapjuk meg (**P<0,Ö1; Wílcoxon rangsor-összesítő teszt).

Az összes kontrollal ellentétben csak azok az egerek mutatnak 1,5-2 fog csökkenést a máj áttételekben, amelyeket mindkét szerrel egymás után kezeltünk, míg a kontroll egereknél az egyes szerekkel monoterápiaként alkalmazott, az. egyes szerekkel egyénileg végzett kezelés hatástalan (P<0,01) (3, ábra). Valójában a kombinált terápiának kitett 8 egérből 4 tárja fel a máj áttételek teljes hiányát, míg a többi állat csak 1-5 kis áttételes elváltozást mutat. lényegében hasonló eredményeket kapunk az αν integrín antagomsta egyidejű kombinációival is a chl4.18-íL-2 fúziós fehérjével (4, ábra, felső rész).

A 4. ábra grafikusan ábrázolja az anti-angiogén infegrin antagonista terápia és az anütest-11,-2 fúziós fehérjével együtt! anti-tumor terület-fajlagos immunterápia szimultán kombinációjának hatását spontán máj neuroblasztóma áttételekre. A spontán áttételek primer tumorok indukcióját követően indukálódnak a 2x10 NXS2 neuroblasztóma sejtekkel s.c. A kezelés integrfnnel vagy aniagonistával (17,5 pg/Óra) és tumor-fajlagos chl4,18~Il-2 fúziós fehérjével (5 pg x 5) a primer tumor eltávolítása előtt (4A, ábra) vagy után (4B. ábra) indul be. A spontán máj áttételeket a máj gócok (n=8) makroszkópos számlálásával határozzuk meg (*P<0,01; Wikoxon rangsor-összesítő teszt).

Csak olyan egerek tárnak fel vagy teljes hiányt a máj áttételekben (4A. ábra) vagy >1,5 lóg csökkenést a máj áttételekben (5B. ábra) (P<Ö,01), amelyeket mindkét szerrel kezelünk, a beadásuk módjától függően a primer tumor eltávolítása előtt vagy után. Ez ellentétben áll az összes kontrollal, ahol a kezelés hatástalan, amikor az egyes szereket monoterápíaként alkalmazzuk,

IQ, A szlnergetikus kombináció és a hatékony terápia

A véredények szétzúzása rosszindulatú tumorok vaszkuláris területében erőteljes sta tégla a rák elleni harcban. A tumor érrendszerének endofeüális sejtjeit megcélozva a tumort sikerrel lehet kezelni. Egy pepiid anlagonista, amely megcélozza az érrendszert az arrgiogén véredényeken expresszált <Xv íntegrinekkel való kölcsönhatás révén [Brooks P. C, és munkatársai (Science, 1994); Friedlander M, és munkatársai (1995), az előzőekben idézett munkák)] visszaszorítja a véredények képződését és drámai módon visszafejleszii az ezt követő tumor növekedést. Ezt bárom agresszíven növekvő primer tumor és egy spontánul áttételeket képző tumor kezelésével demonstráljuk. Miközben az alkalmazott .αν integrin antagonista elsődlegesen az avfb-ra irányul, ez kötődik a közeli rokon cups mtegrinre is. A vizsgált vastagbél kareinóma és neuroblasztóma tumorokból világosan hiányzik az avps, de valószínűleg expresszálnak valamennyi avps-öt A melanóma modell expresszál mps-at is. Ennek az integrín antagonistának a hatása határozottan a tumor érrendszerre korlátozódik mindhárom állat modellben, amint ezt a neuroblasztóma modellben demonstráljuk (2.

ábra). Nagyon fontos, hogy a tumor érrendsz tumorellenes hatását megsokszorozza az egyidejű támadás a tumor terület ellen, amely hatásos mind a primer tumorokra, mind a spontán áttételekre. Ez különösen idevág, mivel a primer tumor eltávolítása a kezelés előtt megnöveli a neuroblasztóma áttételek növekedését és szétszóródását; ez az. észlelés jól dokumentált más tumor modellekben a csökkenés miatt az angiogenezis inhibitorok keringő szintjében a primer tumor .kimetszését követően [Holmgren L. és munkatársai (1995); Eoíkman J. (1995), korábban Idézett munkák)}. A vaszkuláris terület és a tumor terület szimultán becélzása nagyon hatékonynak bizonyul, mivel ez kombinálja a csökkenést a tumorsejt táplálásában a tumorsejtek aktív rombolásával, és ez a primer tumorok sorvadásához és az elkülönült áttételek kiirtásához vezet. Ez ellentétben van az egyedi vaszkuláris területre irányuló megközelítéssel, amely két különböző antbangiogén kezelési stratégiát alkalmaz, amelyek csak a s,c, tumor növekedés visszaszorítását eredményezik egy szingenikus modellben [Mattéért H, j. és mukatársai: Az anglosztatln és az ionizáló sugárzás kombinált hatásai a tumorellenes terápiában (Combined effects of angiostatin and íonizing radíation ín antítumor therapy), Natúré 394, 287-291 (1998)],

A jelen stratégia szerint a tumor területre fajlagos választ gyulladásos sejtek közvetítik, amelyek a tumor-fajlagos anütest-IL-2 fúziós fehérjék révén aktiválódnak és irányulnak a tumor mikrokömyezetébe. Nagyon fontos, hogy bár az anti-angiogén stratégia elég hatékony a jól megalapozott érrendszeri .szolgáltatással bíró primer tumorok növekedésének visszaszorításában., hiányzik belőle a ha tékonyság az. elkülönült mikro-áttételek ellen, amikor monoterápiaként alkalmazzuk ezt (3. és 4, ábra). Egy ilyen minimális maradék betegségben azonban, amely gyenge vaszkularizáeíóval jellemzett kis tumor terhelésekkel van csillapítva, a kombinációs kezelésben alkalmazott tumorellenes terület kezelési fegyver nagyon hatékony, amikor monoterápiaként alkalmazzuk [Xiang R. és munkatársai ('1997); kodé H.

N. és munkatársai (1998), az előzőekben idézett munkák]. Ebben a szituációban az anti-angiogén kezelés egyik szerepe az, hogy visszaszorítsa a mikro-áttétel-indukált neovaszkularizádói és az áttétel gócok ezt követő megnagyobbodását [Volpert Ο. V. és munkatársai (1998), az előzőekben idézett munka]. Ez viszont megkönnyíti az ilyen mikroáttételek kiirtását tumor területre irányuló terápiákkal, amelyek optimálisan hatékonyak a minimális maradék betegség csillapításában (Becker J, C. és munkatársai. (1996), az előzőekben, idézett munka],

A primer tumorok és a szétszóródott áttételek hatékony kezelése továbbra is nagy kihívás marad a klinikai, onkológiában, Az eredmények ebben a leírásban azt mutatják, hogy a fajlagos anti-angiogén- és immonterápíák kombinációi szinergízábiak a primer visszafejlesztésében és a mikro-áttételek kiirtásában. Mivel mindkét kezelési módosulat, vagyis az «v integrm antagonisták és antitestínterieukin-2 fúziós fehérjék, jelenleg: a klinikai értékelésben monoterápiaként szerepelnek, kombinációik szinergizmusa új és hatékony eszközt biztosit a rák terápiában,

Az. eddig bemutatott kiviteli példák, amelyek leírják a találmány bizonyos kiviteli módjait, csak a bemutatás célját szolgálják, és nem tekintendők a találmány oltalmi körét speciálisan korlátozóaknak Ezen kívül a találmány olyan változatait, amelyek már most ismertek vagy csak később lesznek kifejlesztve, és amelyek azok látókörén belül vannak, akik a szakterületen járatosak, úgy tekintjük, hogy a találmány ez után következő igénypontjainak oltalmi körén belül vannak.

* « » *

SZEKVENCIALISTA <ilL> í.,ode Holqer IL

Gillies stephen l<

Cheresh Dávid A.

Reiereld Ralph A··

The Scripps Research lestiteee Deciden Ncachaeerticale Cornorahíen < 12D> EL. JÁRÁS TUMOROK ÉS ÁTTÉTELEK KEZELÉSÉRE ANTLANSIÖGÉN a TERÁPIÁK ÉS : VON ΑΓ ÉRÁVÁ T KON3;KASíőJÁT ALKALMAZVA <13.0> LsríSSUpe

0 •-'LA :· <150 LL/11SL72T 1:133·· 02-12 <1GO> DG <T?0> Datenhin Ver. 20 <210> 1 <;m> e <212 - PRT ' 213 :?· Mesterséges szekvencia.

<22 ö>

<221 > MOD__EBS < 2 2 2 f 1) <223> BLOKKOLT - BOO <220>

<22 0 MQD__E.ES <222> {Sf <22 3 > AOETíLEZÉS ·· OMe <23; 0 >

<221> MOD_EDS <222:, (2;

< 2 2 3 > D - Arg <22 0>

<223:;· Mesterséges szekvencia lekása: 00000 anyag <400> 1

Oly Arg Oly Asp Phe Val 1 5 <21ö> 2 «211:, E <212> LET < 2 O > MeOcrOncs szekvencia

<22 0>

<221> HODJMS < 2 2 2 > ί 1 L <22 Μ BLOKKOLT-BOC <220>

<221ν OOr; Μ <222> (2>~ <223> D-Krg < 2 23 > Mesterséges szekvencia oír&sa: első (érmék <40ö> 2

Oly Arg OTy Lap Phe Vak

5

MIM 3 <211> S <2 KM PRO •MIM· Mesterséges szekvencia

M.M <221> ?M_m?K <222> (2) <2.23 > D-Arq <220 >

MM RMgersézes szekvencia leírása: második (érmék « « * «.

* * x * # « * ♦ φ * # * * « >* »» az ♦ * φ

X# <4ϋδ> 3

Gly Arg Oly Asp Phe Vei ! 5 <210> 4 <211» 5 <212» P.RT <213 ,·- Mesterséges szekvencia <222 >

<221> MÓD RÉS <223- · 2)' <223 > D-Arg < 2 2 0 '· <221> Í.Alio <222> m , . (Ml <223» eiklo <22 ö» , ......._....... <223.» Mesterséges szekvencia. etkfö Mis< ?' 2l· V <400» 4

Oly Arg Oly Azé Pke Vak.

5 <210» S <211> 5 <212» P.RT < 213 ?, Mesterséges szekvencia »»« <220>

<221> MOS RÉS <222 < (4)'' <223 > Ö-Ehe '22ö> • 2 2 ' >

M « A í'síúes BzsxvsnciS.

h-írász: c?klo AAUlífV <22 Q>

<22! > RÁNC <222> ηι,.ίδ;

<223.:· cAb < A 0 2 > 3

Arg Gly ,A.sp Phe Vzl

5 <2!0> S <211> S <212 > PÉT <213 > M.esfer?,égss szekvencia. <221 >

<221> GGlyEES A .£· Z ?«> \ 'S / •32 3 > D-Piae * Λ

VSr <220 .· <23i> LÁNC < 2 2 2 > { i } . . í 5 ;

<22 3> cHdo ’ <22 0>

< 2 2 3 > MeAerséges szekvencia leírása: cikk) (RADÍR) <4'0Ő> 6 &rg Als Asp Phe Val

2 < 2 i 0 > 7 <211> S <212 > FAT < 213 > Mesterséges szekvencia <230.>

<221 > MÓD PPM <:222> (5í.....

<223> D-Val <220n <221> LÁNC <222> M) . - (5) <22 3 > cikk) <22 3 > Mesterséges szekvencia leírása: dklo C Μ. AA' v) *x * «« *♦

XX * 6 * * ο <4G2> 7

Arg· Gly Asp Phe Val

5

LLV· 8 <2X1> 5 <217> ARI' ·: 212 > Mesterséges szekvencia <22O>

<z2!> LCVJMM < 2 z z > sz} <223> D-Ala <22 3<

<221-, LÁNC <222 > ilto.Mi <223 > MM <22 0>

< 2 2 3 > Mesierséges szelcencie leírása; cikio (RsDF'Ví •MLCs S

Arg Alá Asp Aca Val

5 <21 0> 5 <211> 6 <212 > ALT <213 > Mester séges szekvencia «*»♦ φφ*

<22 0 >
<221?:·	ΜΟΒ RÉS
<222>	15)
<223>	D - Rhe
<22 0:·.
<2 2 λ >	RANG
<22 2 >	01; . ... OS)
<223 >	CikRi
<220>
<223>	MeMerAgss :	oG< v&iMa RRása
< 4 0 2 >	2
Alá Arc? Gly As$	> Phs Leó
1		3

í'ARGDÍL)

<22 0?·· < 211> < 2 1 2 ?> <223 >	20 3 PRT Mesterséges szekvencia
<23 0 >
<22X>	ROM MBS
·· D G x V· Xj X.Í ίλ» -·	<S)
<223>	D- Phe
<22ö>
<221?·	LÁNC
< 2 2 2 >	Pl; . . OSI
<223>	cikJo

** X# **· ♦ « » * * « *♦* -XX <2<ο>

<2,η > Mmn-ségfö szekvencia leirása; cikío öGRöDíL) <4ö3> IS

Oly Arg Oly Asp Aha Leu s

<2io> ii < '211 > 5 •:2i2> ART < 212 .-·- Mesterséges szekvencia;

<220>

<221 :> MGD RÉS <222 > H).....

<222< D-Phe <220 v <221 > ΗΟΐρΕΒΕ <· 2 2 2 '> (A ’í <222λ kRiTHRZM NMsVú < 22 0>

<221v RÁNC <222> U).. >5) <222> '{.ΙΜο <220>

' ’ > ' . ' s. v ' \ V , ' ) >A * ❖ *»·** * <4 0G» 11

Arg Giy Asp Phe Vsl

5 <21G> 12 <211> 5 <212> IRT ·; 213 > Mesterséges szekvencia <22 o>

<2 21 > COL KAS < 2.2 /. » { 4) <223 > D-Phe <22 0» «221» AGG KSS <22 2 > (.0) <223» MKTÉLEZES, NMevai 0 <2 2 2··· <221» LÁNC <222 > (1) . . (S) <223:···· <2 zy>

«223» Mesterséges szekvencia leírása: cikk; (RülirnV) <2 03:·· 12

Arg Oly Glu Phe Vei *

* »0»

♦ Λ ·« * »* • . <(>

telke	1.3
<211 >	5
<213 >	PRT
telke	Mesterséges szekvencia
teléé
<221 >	12.13 2.23
<222>	Úf
... 2 2 3 >	D ~i?hc
-telke
<221 >	tette 2.23
-tete-	tek
tette r	ΜηΠίΕΖΙΜ. Nikééi
teste-
< Z 2 .·.	i.Aki
telke	ti) . . te)
<223 >	eikie

< 2 2 Ο >

< 2 23 > Mesterséges szekvencia. kertes: cikk) (RGBíffiV) <4OO> 13

Arg kin <<< pg_s Vaj.

5

-telke 14 <211 > 5 <212e 2RT <213:.' Mesterséges szekvencia >· ^Α««* * χ ·’Χ· '»»

< 22 0· <22 0 3ÖD 333 <222> Μ.) <223 > j'ORyn?..EZÉS. FMOC Μΰ <220 >

<221> Μ0Ρ__333 <222> (3) <22 3 > 03:0 <22 0 , <221, 30Ώ 333 <222> %f~

-::223, D-Phe <220>

<22 2., 202 333 <222> (5}“ < 2 η a > ο η ;; ί < ? η g. NMeVk. -ONa <220> .......

<22 3, Mesterséges szekvencia ktrása: Ah Sva Start 0.Ό <23:· 13

Arg Gly .Asp Phe Val ·’·ί

Jl * « <··$ * *

Μ ^Α' <210;· <312> δ <212 > 12.2 <21? < s.fes Dr sínes szék vend’ <22ö>

<2 21:·· «OD IBS <222;· U;

<223> 11 )RΜ!LIZÁI FM.OC,Mó <221;· <221> DÓD 223

212...

<223> -öBut <2 21;· <221> MŰD SIS < 2 2 2 > {4) <223> D-lhn <22 0>

<221> MQDJLB3 <22 2.- ;5) <223 > MEOLEZÉS, NMeVsi < 2 2 0 > <22 2 ;·

M t; Zeraége s szék venass fefeasaoÁZ Són Preá <3 0 0;· 12

Zrg Oly Zsp 2hs vs.l

X « »

X X

<210> IS
<2 21. > <212> <213 >	..A PRT Mesiersáycs szekvencia
<220>
<221 >	MÓD KÉS
<222 >	W.....
< 2 2 3 >	Már
<220 >
<221:>	Rop RAS
<222 >	OÍ
< Λ < í ’·	• 23 ve
<220> <221 >	MÓD RAS
<22 2 >	(·*)''
< 2 2 s v	D~Phe
< .2 v >
<222>	MÓD 22.3
<222>	ÍS3
< 2 2 3 >	METILEZÉS, NMeVal

< 22 Q>

<22 3 > Mesierseges szekvencia leírása: Ali Sy.e Prad <400> lé &rg Qly Asp Phs Val

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy «νβ3 antagonista mint angiogenezís gátló szer, amelyet az RGDtartalmú peptíd, anfi-avps monoklonális anitest és anti-nvps receptor monoklonális antitest által alkotott csoportból választunk, és egv tumorellenes aniágén/citokin fúziós fehérje mint tumor-ellenes Immunterápíás szer alkalmazása gyógyászati kompozíció előállítására tumor sejt kezelésére betegben, ahol az említett angíogenezis gátló szert és anti-tumor immnnterápiás szert tamorsejf-burjánzást gátló mennyiségben adagoljuk a betegnek, ahol az említett tumorellenes antigén egy tumor antigénhez irányított antitestnek legalább az antigénkötő részletét tartalmazza.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az; említett angíogenezis gátló szert és az említett tumorellenes immunterápíás szert lényegében egyidejűleg vagy egy mást követően adagoljuk mintegy 3 .hét időintervallumon belül
3. 3. A 2, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett angíogenezis gátló szert az említett tumorellenes immimterápiás szer előtt adjuk be.
4. 4. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett tumorellenes Immun terápiás szert az említett angíogenezis gátló szer előtt adjuk be.
5. 5. A 2. igénypont szerinti, alkalmazás, ahol az említett angíogenezis gátló szert és az említett tumorellenes immunterápiás szert akkor adjuk be,

   15444/kO amikor a tumort vagy tumor áttéteteket sebészeti úton eltávolítjuk az említett betegből az említett időintervallum alatt.
6. 6. Az 1. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett angíogenezís gátló szert és az említett tumorellenes immunterápiás szert azután adagoljuk, miután a tumort vagy tumor áttételeket sebészeti úton eltávolítottuk az említett betegből.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett angiogenezis gátló szert 10 mg és 1000 mg/testtömeg kg/nap közötti mennyiségben adagoljuk.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett tumorellenes immunterápiás szert 0,01 mg és 10 mg/testtömeg kg/nap közötti mennyiségben adagoljuk.
9. 9. Az L igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett tumorsejt neuroektodermálís vagy epitelíálís.

   lö.Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett tumorsejtet az adenóma, angioszarkóma, asztrodtóma, epitelíálís karcinöma, germínóma, glíoblasztőma, glióma, hamartőma, hemangioendoteliőma, hemangioszarköma, hematóma, hepatofelasztóma, leukémia, límíőma, medulloblasztőma, melanóma, neurofelasztőma, oszteoszarkóma, retinoblasztóma, rabdomioszarkóma, szarkóma és teratóma által alkotott csoportból választjuk.
10. 11. Gyógyászati kompozíció tumor vagy tumor-áttételek kezelésére, amely tartalmaz legalább egy avps antagonistát mint angogenezist gátló szert, amelyet az RGD-tartalmú peptid, anti-nvps monoklonálís antitest és antí-«vp3 receptor monoklonális antitest által alkotott csoportból választunk, és legalább egy tumorellenes antigén/títokín fúziós fehérjét mint tumorellenes immunterápiás szert, ahol az említett tumorellenes antigén egy tumor antigénhez irányított antitestnek legalább az antígénkötő részletét tartalmazza.
11. 12. A 11. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol

    a) az említett legalább egy angiogenezis gátló szer a gyógyászati kompozícióban elegendő mennyiségben van jelen az angiogenezis gátlásához valamely tumorban vagy tumor áttételekben; és

    h) az említett legalább egy tumorellenes immunterápiás szer a gyógyászati kompozícióban elegendő mennyiségben van jelen citokm-specifikus biológiai válasz kiváltásához.
12. 13. Készlet tumorsejt kezelésére tumorban vagy tumor-áttételekben, amely készlet csomagot tartalmaz, és ez a csomag tartalmaz:

    a) avpa antagonistát mint angogenezist gátló szert, amelyet az ÉGDtartalmú pepttd, antí-m^k monoklonális antitest és anfcwxvps receptor monoklonális antitest által alkotott csoportból választunk, és amely képes angíogenezist gátolni az említett tumorban vagy az említett tumor áttételekben; és

    b) tumorellenes antigén/cifokín fúziós fehérjét mint tumorellenes ímmunterápiás szert, ahol az említett tumorellenes antigén egy tumor antigénhez irányított antitestnek legalább az antigénkötő részét tartalmazza.
13. 14. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, a II. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, vagy a 13. Igénypont szerinti, készlet, ahol az említett RDG-tartalmú pepiid olyan peptid, amelynek az amlnosavmaradék szekvenciája dkio(SGDíN~MeV) (SEQXD NO: 11).
14. 15. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, a 11. igénypont szerinti kompozíció vagy a 13. igénypont szerinti készlet, ahol az említett citokint az 11-2, IL-12 és az IL-15 által alkotott csoportból választjuk.
15. 16. Az 1, igénypont szerinti alkalmazás, a 11. igénypont szerinti kompozíció vagy a 13. igénypont szerinti készlet, ahol az említett tumorellenes immunterápíás szer tumorellenes antigénje Immunglobulin (lg) lánc, amely tartalmaz egy változó területet, amely a tumorral társult antigén célponthoz kötődik.
16. 17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett tumorral társult antigén célpontot az AFP, CA 125, CEA, CDI 9, CD2Ö, CD44, CD45, EGE receptor, GDy GDs, GM.I, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), IL-2 receptor, Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), meian óméval társult proteoglikán MCSP, FSA és a transzferrín receptor által alkotott csoportból választjuk.
17. 18. Áz 1. igénypont szerinti alkalmazás, a 11. igénypont szerinti kompozíció vagy a 13. igénypont szerinti készlet, ahol. az említett tumorellenes· immunterápíás szer valamely fúziós fehérje, amely IL-2 dtokint és lg nehéz láncot tartalmaz, amely immun-reagál a tumorral társult GEb antigénnel,
18. 19. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, a 11. igénypont szerinti kompozíció vagy a 13. igénypont szerinti, készlet, ahol az említett tumorellenes rmmunterápiás szer valamely fúziós fehérje, amely IL-2 )ϊ dtokint és lg nehéz láncot tartalmaz, amely ímmun-reagál a tumorral társult KSA (Ep-CAM;KSl/4. antigén) antigénnel.

    . A 13. igénypont szerinti készlet, ahol az említett tumort vagy tumor áttételeket az adenóma, angioszarkóma, aszirodlörns, epíteliális kardnóma, germinóma, glioblasztóma, gixőma, hamartóma, hemairgioend öielíóma.

    aa, xblasztóma, leukémia, limfóma, medulloblasztóma, melanóma, neuroblasztóma, oszteoszarkőma, retinoblasztóma, rabdomioszarkóma, szarkóma és a teratóma által alkotott v;
19. 21. A.'13. igénypont szerinti készlet, ahol az említett angiogenezis gátló szert és a touorellen.es immunterápiás szert külön tartályokban bocsátjuk rendelkezésre vagy egyetlen tartályban az említett csomagban.
20. 22. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, kompozíció vagy készlet, ahol az említett tumorral társult antigén célpont neuroektodermálís vagy epíteliális tumorsejtből való.
21. 23. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, kompozíció vagy készlet, ahol az említett tumorral társult antigén célpont olyan tumorsejtből való, amelyet az adenóma, angioszarkóma, asztrotíióma, epíteliális kardnóma, germinóma.

    nemansoenclotelioma.

    xsztőma, leukémia glioblasztóma, glióma, hamartóma, hemangíoszarkőma, hematóma, limfóma, medulloblasztóma, melanóma.

    neuroblasztóma.

    öszteoszarkóma, retinoblasztóma.