CN102634485A - 一种表达il-17的胶质瘤细胞株 - Google Patents
一种表达il-17的胶质瘤细胞株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102634485A CN102634485A CN2012100683305A CN201210068330A CN102634485A CN 102634485 A CN102634485 A CN 102634485A CN 2012100683305 A CN2012100683305 A CN 2012100683305A CN 201210068330 A CN201210068330 A CN 201210068330A CN 102634485 A CN102634485 A CN 102634485A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- u87mg
- pegfp
- glioma
- cell strain
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种胶质瘤细胞株，该细胞株为含有编码IL-17基因的U87MG胶质瘤细胞株，所述的IL-17为免疫细胞亚群Th17的标记分子。本发明的胶质瘤细胞株可用于胶质瘤研究动物模型中，用于观察稳定表达IL-17状态下胶质瘤细胞的成瘤情况，同时可通过荧光标签实时观察到胶质瘤细胞在动物模型体内位置，为研究IL-17在胶质瘤发生、发展中的作用提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达IL-17的胶质瘤细胞株，具体涉及表达IL-17的胶质瘤细胞株pEGFP-N1-IL-17-U87MG。本发明属于基因工程领域，具体来说，涉及基因重组细胞领域。
背景技术
IL-17是新近发现的免疫细胞亚群Th17的标记分子，其最初通过活化的淋巴细胞库消减杂交鉴定，且被命名为CTLA-8(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原8)。
IL-17被证实与多种病理过程相关，如自身免疫、感染、过敏、排斥反应的。研究表明，IL-17可以激活NF-κB、MAKP-ERK等多条信号途径，通过促进炎症因子、趋化因子、抗菌肽、组织重构分子、基质金属蛋白酶分子的表达，介导多方面的生物学活性。
同时，IL-17也被证明与多种肿瘤相关，目前IL-17被证实至少可以通过以下途径促进肿瘤：
1)上调VEGF、CD31等因子表达，从而促进血管增生，加速肿瘤生长；2)上调IL-6，STAT3信号途径促进肿瘤进展；3)下调Th1表面IL-12Rβ2分子表达，从而下调Th1细胞功能，抵抗有效肿瘤免疫；4)使CD8+细胞共表达IL-17，从而失去细胞毒效应，抗凋亡。
尽管已证实IL-17与多种促进肿瘤的途径相关，但它在肿瘤细胞微环境中的具体作用途径、靶点仍需将进一步研究阐明，以期能够将其作为临床治疗肿瘤疾病的干预靶点。
目前相关研究人员常以IL-17作为外源物质加入肿瘤细胞培养体系中或者是将IL-17短期表达于肿瘤细胞中作为研究IL-17在肿瘤细胞微环境中的具体作用途径、靶点的一个手段；然而这些方法不但不能很直观地观察到携带有IL-17的作用位点，同时也影响对IL-17在肿瘤微环境中作用的深入研究。
因此，发明人希望能够建立一种表达IL-17的肿瘤细胞株，为研究IL-17的促进肿瘤形成的作用机制提供适宜的研究模型材料。
发明内容
本发明一方面提供了一种胶质瘤细胞株，该细胞株为含有编码IL-17基因的U87MG胶质瘤细胞株，所述的IL-17为免疫细胞亚群Th17的标记分子。
本发明另一方面提供了一种制备上述胶质瘤细胞株的方法，该方法包括以下步骤：首先将所述IL-17基因的cDNA与
19-T载体连接构建
19-T-IL-17载体；再构建pEGFP-N1-IL-17真核载体；将构建的pEGFP-N1-IL-17真核载体转染U87MG胶质瘤细胞株；筛选成功转染了pEGFP-N1-IL-17真核载体的U87MG细胞株并鉴定。
本发明的表达IL-17的胶质瘤细胞株，可用于胶质瘤研究动物模型中，用于观察稳定表达IL-17状态下胶质瘤细胞的成瘤情况，同时可通过荧光标签实时观察到胶质瘤细胞在动物模型体内位置，为研究IL-17在胶质瘤发生、发展中的作用提供了基础。
附图说明
图1为IL-17cDNA的PCR扩增产物电泳图谱；
图2为鉴定
19-T-IL-17载体的电泳图谱；
图3为鉴定
19-T-IL-17载体的测序图谱；
图4为鉴定pEGFP-N1-IL-17真核载体的电泳图谱；
图5为鉴定pEGFP-N1-IL-17真核载体的测序图谱；
图6为荧光显微镜观察结果；
图7为定量PCR方法检测pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG培养细胞IL-17mRNA浓度的对比结果；
图8为ELISA方法检测pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG培养细胞的IL-17表达水平的对比结果。
图9为pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG三细胞株注射裸鼠后在39天时成瘤图；
图10为定量PCR方法检测pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG成瘤细胞中IL-17mRNA浓度的对比结果。
具体实施方式
制备表达IL-17的胶质瘤细胞株pEGFP-N1-IL-17-U87MG
步骤一：IL-17cDNA合成
无菌抽取人外周血2mL，采用Ficoll分离法获得外周血单个核细胞(PBMC)，再向其中加入2mL RPMI1640培养液、50ng/mL佛波酯(PMA)(CAS NUMBER：16561-29-8，SIGMA)、1μM离子霉素(Ionomycin，购自Catalog Number：I9657，SIGMA)、10μg/mL brefeldinA(CASNUMBER：20350-15-6，SIGMA)；37℃，5％CO2环境下培养4h后，抽提mRNA(按上海生工EZ-10广谱总RNA抽提试剂盒提取mRNA)
对抽提的mRNA进行逆转录操作，获得其cDNA(按Takara逆转录试剂操作说明)，再以该cDNA为模板PCR扩增IL-17cDNA。
参照NCBI给出的IL-17cDNA参考序列(NM_002190.2)中的CDS(编码序列从46-513，ATG-TAA)来设计引物。
引物序列为：上游引5’-CAGTCGACGATGACTCCTGGGAAGACCTCATTG-3’(SEQ ID No：1)；下游引物5’-GGTGGATCCCGGGCCACATGGTGGACAATCGG-3’(SEQ ID No：2)。上游引物包含了Sal I酶切位点，下游引物包含了BamH I酶切位点。
PCR条件为：
94℃4min；94℃10sec，60℃20sec，72℃20sec；40个循环，72℃7min。
经过PCR扩增获得两端带有酶切位点(Sal I、BamH I酶切位点)的IL-17cDNA。扩增产物电泳图谱参见图1，目标片段(预期目标片段大小为468bp)清晰可见，与预期相符。
紫外灯下，从电泳凝胶中切下目标片段，并采用胶纯化试剂盒(EZ-10SpinColumn PAGE Gel DNA Extraction Kit)纯化PCR产物(IL-17cDNA)。
步骤二：
19-T-IL-17载体构建
将步骤一获得的IL-17cDNA与
19-T载体连接。具体地说：将
19-TSimple Vector(购自Takara)1μL、Solution I(购自Takara)5μL、步骤一获得的IL-17cDNA PCR产物4μL混匀，16℃，4小时。
连接产物的转化：将上述获得的连接产物10μL加入到100μL的大肠杆菌DH5α溶液(购自Takara)中，依次在冰上放置30分钟、42℃水浴90秒、冰上1-2分钟，再向其中加入500μL SOC培养基，37℃水浴慢摇45分钟，取200μL铺平板(IPTGX-gal，含氨苄青霉素抗性，)37℃过夜。挑选白色菌落扩大培养。
取扩大培养后菌液5ml，(5ml菌液12000rpm离心1min，弃上清，加入250μL已加Rnase溶液P1混匀，加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，12000rpm离心10分钟，上清液用移液器转移到吸附柱CP3中12000rpm离心30-60秒，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW 12000rpm离心30-60秒，重复一次，弃废液后12000rpm(～13,400×g)离心2分钟，晾干，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，质粒溶液收集到离心管中)质粒抽提试剂购自上海生工(SK8188)，抽提得到的质粒经SalI，BamH I双酶切后，电泳。
电泳图谱参见图2：图2中的A条带参照Marker2(1kb marker)，其分子量约为2692，A条带为
19-T Simple Vector；图2中的B条带参照Marker1(DL2000marker)，其分子量约为468bp，B条带为两端带有Sal I，BamH I识别序列的IL-17序列。
B条带切下，纯化后送上海生工测序。测序结果参见图3。从图3结果可以看出，从
19-T Simple Vector载体中切下的序列与NCBI给出的IL-17cDNA参考序列(NM_002190.2)比对，序列完全一致。
步骤三：pEGFP-N1-IL-17真核载体构建
用BamH I及Sal I酶切上述
19-T-IL-17载体及pEGFP-N1载体。质粒(
19-T-IL-17或pEGFP-N1)25μL+Sal I 11μL+buffer 4μL，37℃4hours，胶回收，25μL水复溶，再次酶切，质粒(19-T-IL-17、pEGFP-N1)25μL+BamHI 11μL+buffer 4μL，37℃过夜，胶回收，连接上述二个质粒酶切产物buffer2.5μL+IL-17 7μL+pEGFP-N1 3μL+T4 DNA ligase 2μL+水10.5μL，16℃，过夜，转化，涂布于卡那霉素抗性平板，挑选菌落，扩大培养，酶切及测序鉴定。
电泳图谱参见图4：图4中的C条带参照M2(marker DL 2000)，其分子量约为468bp，C条带为IL-17；图4中的D条带参照M1(marker 1kb)，其分子量约为5000bp，D条带为pEGFP-N1。
D条带切下，纯化后送上海生工测序。测序结果参见图5。从图5结果可以看出，pEGPF-N1-IL-17载体中的IL-17序列与NCBI给出的IL-17cDNA参考序列(NM_02190.2)比对，序列完全一致。
步骤四：pEGFP-N1-IL-17转染U87MG细胞及鉴定
胶质瘤细胞株U87MG购自中科院上海细胞库(ATCC Number：HTB-14TM)。U87MG细胞6孔板中培养至1×106(DMEM、2mM谷胱甘肽，10％胎牛血清，100U/mL penicillin and 100μg/ml streptomycin)，更换培养液，次日转染。
待转染质粒(pEGFP-N1-IL-17和pEGFP-N1，其中pEGFP-N1作为空白对照)与转染试剂(Xfect，购自Takara)按以下体系配置两个反应体系：
①pEGFP-N1-IL-17或者pEGFP-N1 20μg Xfect buffer80μL混匀
②Xfect polymer 1.5μL Xfect buffer 98.5μL混匀
将①和②混匀，震荡10秒，室温10分钟，滴加到U87MG的细胞培养液(2ml，浓度1×106个/ml)中，轻摇，37℃4小时，弃上清，加入新鲜培养液2ml，转染培养36hour后，荧光显微镜观察。
见到荧光表达后，按预实验界定浓度加入200μg/mL的G418(100mg/mL，Takara)2μL，继续培养10天，未转染成功的细胞死亡。
有限稀释法筛选阳性转染单克隆(细胞消化后，稀释至＜1个/10μL，加于96孔板中，每孔10μL，显微镜下观察，标记有细胞孔，培养10天后，200倍的荧光显微镜下观察，标记荧光阳性孔)。荧光观察结果参见图6，图6A为pEGFP-N1-IL-17-U87MG，图6B为pEGFP-N1-U87MG，图6C为未转染U87MG；可以看出pEGFP-N1-IL-17及pEGFP-N1均分别成功转染至U87MG细胞。。
将上述荧光阳性孔的细胞消化，转入24孔板扩大培养，再转入6孔板，最后转入培养瓶中扩大培养)。
pEGFP-N1-IL-17及pEGFP-N1质粒转染U87MG细胞，经单克隆筛选后扩大培养，采用荧光定量PCR、具体如下：细胞1×106，离心，沉淀加1mL Trizol试剂，混匀，静置10min，加入0.2mL氯仿，震荡混匀30sec，静置5min，4℃12000rpm离心15min，吸取上清至另一1.5mL Eppendorf管中，加入半量体积无水乙醇，混匀，液体全部转移入RNA抽提柱中，静置5min，4℃10000rpm 3min，加入0.5mL 75％乙醇，静置2min，4℃10000rpm 1min，重复一次，RNA抽提柱再4℃10000rpm 3min，静置5min，35μL DEPC水溶解，静置3min，4℃10000rpm 2min，收集RNA溶液。
采用定量PCR(Real time PCR)方法检测pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG培养细胞中IL-17mRNA的浓度；
上游引物5’-CTGAACATCCATAACCGGAATACCA-3’(SEQ ID No：3)；
下游引物5’-AGCGTTGATGCAGCCCAAG-3’(SEQ ID No：4)；
定量PCR条件：95℃30sec；95℃10sec，60℃20sec，40repeats；95℃---60℃---95℃；观察熔解曲线。
RNA量nomarlized to GAPDH，结果以2-ΔΔCT计算(定量PCR计算的方法)，结果参见图7，图7纵坐标表示IL-17mRNA/GAPDH RNA表达量，横坐标1、2、3分别为pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG的IL-17mRNA；从图7可以看出，pEGFP-N1-IL-17-U87MG细胞成功获得了外源基因IL-17的表达。
经2-ΔΔCT计算转染株pEGFP-N1-IL-17-U87MG之IL-17mRNA表达量相对于转染空载体pEGFP-N1-U87MG、未转染株U87MG分别为1012858及1264381倍。
采用ELISA方法检测pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG培养细胞的IL-17表达水平。
将细胞培养液2ml浓度调整至1×106个/ml后，再培养三天后检测上清中IL-17浓度。(上清加入板中，37℃孵育90min，洗板5次，加入生物素化抗体工作液100μL，37℃60min，洗板5次，加入酶结合工作液100，37℃30min，洗板5次，加入显色底物100μL，37℃15min，加入终止液100μL/，酶标仪读板。)结果参见图8，图8纵坐标表示IL-17浓度，横坐标表示pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG，从图8中可以看出，转染重组载体pEGFP-N1-IL-17组、转染空载体pEGFP-N1组、未转染U87MG组分别为391.2±65.7pg/ml、17.3±3.62pg/ml、16.2±6.2pg/ml(n＝3；p＜0.001)。
从图7、图8的结果可以看出，荧光定量PCR、ELISA方法鉴定显示pEGFP-N1-IL-17及pEGFP-N1质粒转染U87MG细胞成功。
应用实施例
pEGFP-N1-IL-17-U87MG胶质瘤细胞株的裸鼠成瘤实验
构建成功的pEGFP-N1-IL-17-U87MG胶质瘤细胞株，细胞培养液0.1mL(浓度1×106个/ml)，皮下注射裸鼠右侧背部，在39天处死裸鼠。
pEGFP-N1-U87MG、U87MG胶质瘤细胞株作为对照，同样按上述操作。
参见图9，为pEGFP-N1-IL-17-U87MG、pEGFP-N1-U87MG、U87MG三细胞株注射裸鼠后在39天时成瘤图。
在39天处死裸鼠之后，取瘤组织，提取RNA，采用定量PCR(Real time PCR)方法检测IL-17mRNA的浓度。
参见图10，纵坐标表示IL-17mRNA/GAPDH RNA表达量。
pEGFP-N1-IL-17-U87MG细胞成瘤的瘤组织中IL-17mRNA的表达较
pEGFP-N1-U87MG及U87MG成瘤的瘤组织中高，超过1500倍。
从图9、10可以看出，39天后胶质瘤细胞pEGFP-N1-IL-17-U87MG在裸鼠体内在IL-17高表达状态下成瘤。
Claims (2)
1.一种胶质瘤细胞株，其特征在于：该细胞株为含有编码IL-17基因的U87MG胶质瘤细胞株，所述的IL-17为免疫细胞亚群Th17的标记分子。
2.一种制备权利要求1所述胶质瘤细胞株的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：首先将所述IL-17基因的cDNA与
19-T载体连接构建
19-T-IL-17载体；再构建pEGFP-N1-IL-17真核载体；将构建的pEGFP-N1-IL-17真核载体转染U87MG胶质瘤细胞株；筛选成功转染了pEGFP-N1-IL-17真核载体的U87MG细胞株并鉴定。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100683305A CN102634485A (zh) | 2012-03-15 | 2012-03-15 | 一种表达il-17的胶质瘤细胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012100683305A CN102634485A (zh) | 2012-03-15 | 2012-03-15 | 一种表达il-17的胶质瘤细胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102634485A true CN102634485A (zh) | 2012-08-15 |
Family
ID=46619064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012100683305A Pending CN102634485A (zh) | 2012-03-15 | 2012-03-15 | 一种表达il-17的胶质瘤细胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102634485A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1346279A (zh) * | 1999-02-12 | 2002-04-24 | 斯克里普斯研究学院 | 联合应用抗血管生成和免疫治疗以治疗肿瘤和转移的方法 |
| CN101548008A (zh) * | 2006-10-04 | 2009-09-30 | 詹森药业有限公司 | 失活的人工抗原提呈细胞的制备及其在细胞疗法中的用途 |
-
2012
- 2012-03-15 CN CN2012100683305A patent/CN102634485A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1346279A (zh) * | 1999-02-12 | 2002-04-24 | 斯克里普斯研究学院 | 联合应用抗血管生成和免疫治疗以治疗肿瘤和转移的方法 |
| CN101548008A (zh) * | 2006-10-04 | 2009-09-30 | 詹森药业有限公司 | 失活的人工抗原提呈细胞的制备及其在细胞疗法中的用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 付立主: "TH17细胞的研究进展", 《临床肺科杂志》 * |
| 胡锦辉: "Th17细胞在胶质瘤中表达、分化及肿瘤免疫作用的研究", 《中国博士学位论文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hombrink et al. | Programs for the persistence, vigilance and control of human CD8+ lung-resident memory T cells | |
| Hoyer et al. | Candida albicans agglutinin-like sequence (Als) family vignettes: a review of Als protein structure and function | |
| Lim et al. | Prenatal maternal infection promotes tissue-specific immunity and inflammation in offspring | |
| Wambre et al. | A phenotypically and functionally distinct human TH2 cell subpopulation is associated with allergic disorders | |
| Lam et al. | IL-25/IL-33–responsive TH2 cells characterize nasal polyps with a default TH17 signature in nasal mucosa | |
| Daridon et al. | Aberrant expression of BAFF by B lymphocytes infiltrating the salivary glands of patients with primary Sjögren's syndrome | |
| Ichii et al. | Role for Bcl-6 in the generation and maintenance of memory CD8+ T cells | |
| CN103403181B (zh) | ncRNA及其用途 | |
| Blankenhorn et al. | Genetic analysis of the influence of pertussis toxin on experimental allergic encephalomyelitis susceptibility: an environmental agent can override genetic checkpoints | |
| CN104593372B (zh) | 一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法 | |
| CN107075569A (zh) | 用于诊断结核病的生物标记物及其组合 | |
| CN109762903A (zh) | miR-1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤中的应用 | |
| Heckendorn et al. | The genetic basis for the selection of dairy goats with enhanced resistance to gastrointestinal nematodes | |
| CN103235119B (zh) | 一种用于弓形虫感染的诊断抗原的应用 | |
| CN105879061A (zh) | 一组与Th17分化相关的micro RNA在制备治疗和疗效判断药物中的应用 | |
| Alula et al. | Targeting mitochondrial damage as a therapeutic for ileal Crohn’s disease | |
| Barin et al. | Collaborative interferon-γ and interleukin-17 signaling protects the oral mucosa from Staphylococcus aureus | |
| Zhang et al. | Widespread outbreaks of the emerging mandarinfish ranavirus (MRV) both in natural and ISKNV-FKC vaccinated mandarinfish Siniperca chuatsi in Guangdong, South China, 2017 | |
| Li et al. | Serotonin system is partially involved in immunomodulation of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) immune cells | |
| Sun et al. | Cytotoxin-associated gene A-negative Helicobacter pylori promotes gastric mucosal CX3CR1+ CD4+ effector memory T cell recruitment in mice | |
| Li et al. | Whole-genome resequencing to study brucellosis susceptibility in sheep | |
| Wang et al. | T cell infiltration is associated with increased Lyme arthritis in TLR2−/− mice | |
| Lazarus et al. | ELISA‐Based Measurement of Antibody Responses and PCR‐Based Detection Profiles Can Distinguish between Active Infection and Early Clearance of Borrelia burgdorferi | |
| CN102634487A (zh) | Gpc3单克隆抗体杂交瘤细胞株8g6及其制备方法和应用 | |
| CN102634485A (zh) | 一种表达il-17的胶质瘤细胞株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120815 |