CN109762903A - miR-1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供miR‑1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤中的应用。本发明首次公开了microRNA‑1246(miR‑1246)是胶质瘤衍生的外泌体(GDEs)中表达最丰富的microRNA，在缺氧胶质瘤衍生的外泌体(H‑GDEs)中显着上调。此外，miR‑1246还富集了术前胶质母细胞瘤(GBM)患者脑脊液(CSF)分离的外泌体，肿瘤切除后GBM患者脑脊液中外泌体miR‑1246显着减少。MicroRNA‑1246被证明具有最强的诱导M2巨噬细胞极化的能力。此外，研究发现H‑GDEs诱导的M2巨噬细胞极化是由miR‑1246/TERF2IP/STAT3和miR‑1246/TERF2IP/NF‑κB途径所介导。

Description

miR-1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及miR-1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胶质瘤是中枢神经系统中最常见和最具侵袭性的原发性肿瘤，占恶性脑肿瘤的80％以上。尽管对胶质瘤的分子认识和外科技术，放疗和化疗的进展有所增加，但胶质瘤(特别是胶质母细胞瘤(GBM)，WHO IV级胶质瘤)患者的预后仍然很差，初次诊断后中位生存时间不到15 个月。恶性神经胶质瘤对标准疗法和免疫疗法的顽固性被认为是由其独特的免疫抑制肿瘤微环境引起的，其由许多不同因子和多种类型的细胞组成，包括肿瘤细胞，成纤维细胞和各种免疫细胞。

缺氧是神经胶质瘤微环境的公认特征。此外，作为位于神经胶质瘤微环境中和周围的原代免疫细胞，巨噬细胞优先积聚在缺氧区域，在那里它们极化成特定的细胞类型。已经鉴定出两种极化的巨噬细胞表型，包括经典活化的巨噬细胞(M1型)和活化的巨噬细胞(M2型)。已经提出IL-6，TNF-α，IL-12等作为M1型巨噬细胞的标志物，其被认为抑制肿瘤进展。CD163， CD206，IL-10和IL-1RA用于鉴定可促进肿瘤进展的M2型巨噬细胞。作为胶质瘤中最丰富的浸润性免疫细胞，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)更可能成为免疫抑制性肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞。此外，缺氧可以促进TAM M2极化。

外来体是由大多数细胞分泌的内吞起源的小膜囊泡(大小为30nm～150nm)。外泌体含有功能性mRNA，microRNA，长非编码RNA(lncRNAs)等，通过提供其内容在细胞间通讯中发挥重要作用。据报道，肿瘤外泌体通过转移遗传物质来抑制免疫细胞的功能。且发明人发现，缺氧可以改变外泌体的释放和内容，并通过调节细胞间通讯来影响受体细胞功能。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供miR-1246和/或TERF2IP在诊治胶质瘤M2巨噬细胞极化中的应用。经研究发现，microRNA-1246(miR-1246)是胶质瘤衍生的外泌体(GDEs) 中表达最丰富的microRNA，在缺氧胶质瘤衍生的外泌体(H-GDEs)中显着上调。此外， miR-1246还富集了术前胶质母细胞瘤(GBM)患者脑脊液(CSF)分离的外泌体，肿瘤切除后GBM患者脑脊液中外泌体miR-1246显着减少。MicroRNA-1246被证明具有最强的诱导 M2巨噬细胞极化的能力。此外，研究发现H-GDEs诱导的M2巨噬细胞极化是由miR-1246/端粒重复结合因子2相互作用蛋白(TERF2IP)/STAT3和miR-1246/TERF2IP/NF-κB途径所介导。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供miR-1246和/或TERF2IP在制备胶质瘤分子标志物中的应用。

进一步的，miR-1246和/或TERF2IP在制备胶质瘤分子标志物中的应用，所述标志物用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展。

所述胶质瘤的进展包括胶质瘤的增殖、迁移、侵袭和/或胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化；更进一步的，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化；

其中，所述miR-1246和TERF2IP为人源；

本发明的第二个方面，提供一种用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中 miR-1246；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中miR-1246调控的靶基因的表达情况或 TERF2IP的表达情况的物质。

其中，所述miR-1246调控的靶基因的表达情况包括TERF2IP的表达情况；

优选采用液相杂交、Northern杂交、microRNA芯片、原位杂交检测胶质瘤样品中miR-1246；采用酶联免疫吸附测定、胶体金检测、蛋白质芯片检测胶质瘤样品中miR-1246调控的靶基因的表达情况或TERF2IP表达情况；

其中，所述miR-1246调控的靶基因的表达情况包括TERF2IP的表达情况；

更进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展的组合物。

本发明的第三个方面，提供能够抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质和/或促进 TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质在如下(a)-(d)至少一种中的应用：

(a)抑制胶质瘤细胞的增殖，或制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；

(b)抑制胶质瘤细胞的迁移，或者制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(c)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；

(d)抑制胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化，或制备抑制胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2 极化的产品。

本发明的第四个方面，提供一种用于预防或治疗胶质瘤的药物组合物，其包含抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质和/或促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质；

所述抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质，包括采用基于RNA的microRNA功能性获得技术和/或基因特异性miR Mimics技术下调miR-1246表达和/或抑制其活性；优选为miR-1246拮抗剂或下调miR-1246表达的启动子；其中，所述miR-1246拮抗剂为根据miR-1246 人工合成的单链RNA；

所述促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质，包括TERF2IP蛋白激活剂。

在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和/或胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化。

本发明的药物组合物还包括药物可接受的载体，并且该药物组合物可以为各种口服或非口服剂型。

对此，本发明的药物组合物可以与稀释剂或赋形剂如填充剂、增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等组合配制。预期口服给药的固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊等形式。

本发明有益效果：本发明首次公开了microRNA-1246(miR-1246)是胶质瘤衍生的外泌体 (GDEs)中表达最丰富的microRNA，在缺氧胶质瘤衍生的外泌体(H-GDEs)中显着上调。此外，miR-1246还富集了术前胶质母细胞瘤(GBM)患者脑脊液(CSF)分离的外泌体，肿瘤切除后GBM患者脑脊液中外泌体miR-1246显着减少。MicroRNA-1246被证明具有最强的诱导M2巨噬细胞极化的能力。此外，研究发现H-GDEs诱导的M2巨噬细胞极化是由miR-1246 /TERF2IP/STAT3和miR-1246/TERF2IP/NF-κB途径所介导。表明miR-1246和/或TERF2IP 可作为诊治胶质瘤的分子标志物。

附图说明

图1为常氧和缺氧神经胶质瘤外泌体的特征和巨噬细胞对神经胶质瘤外泌体的吞噬作用系列图；其中，图1A为通过密度梯度离心从胶质瘤细胞系U87MG，U251，A172和P3的含氧量正常和缺氧培养物上清液中分离的外来体的代表性电子显微照片，显示它们的典型形态和大小；比例尺，100nm；图1B为通过密度梯度离心从胶质瘤细胞系U87MG，U251，A172和P3的含氧量正常和缺氧培养物上清液中分离的外来体的qNano结果，显示它们的大小 (30-150nm)；图1C为在常氧和缺氧神经胶质瘤外泌体中存在TSG101和不存在钙联接蛋白的Western印迹分析；图1D为来自巨噬细胞的PKH67标记的神经胶质瘤外泌体内化的共聚焦显微镜的代表性图像；比例尺，10微米。

图2为H-GDEs在体外和体内显着诱导M2巨噬细胞极化系列图；其中，图2A，2B分别从U87MG和U251神经胶质瘤细胞的培养物上清液中分离的PBS，含氧量正常的神经胶质瘤外泌体或低氧神经胶质瘤外泌体(5μg/ml)用于刺激PMA处理的U937细胞；刺激24-48小时后，通过qRT-PCR测定CD163，IL-10和IL-1RA的表达水平图；图2C，D的刺激方法与图 2A中描述的相同；刺激48-72小时后，进行流式细胞术以分析CD11b+CD163+巨噬细胞的比例；图2E为培养48-72小时的上清液用于通过酶联免疫吸附测定测定IL-10的分泌图；图 2F、图2G分别为进行EdU测定以检测与用PBS，常氧神经胶质瘤外泌体或缺氧神经胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞共培养的U87MG细胞的增殖48小时；比例尺＝100μm；图2H，图2I 为通过体外共培养系统测定与条件性巨噬细胞共培养的U87MG的迁移和侵袭能力，显示了在涂有或不涂有Matrigel的膜上的迁移或侵入细胞的代表性照片，比例尺＝200μm；图2J为在携带用萤火虫荧光素酶和PBS-巨噬细胞，常氧神经胶质瘤外泌体-巨噬细胞或缺氧神经胶质瘤外泌体-巨噬细胞转导的U87MG的异种移植裸鼠中的肿瘤生长的离体生物发光成像分析图；显示了移植后第20天的代表性图像(来自5只小鼠的数据)；图2K为来自异种移植小鼠脑的切片的H&E染色，其中U87MG+PBS-巨噬细胞，U87MG+常氧神经胶质瘤外泌体-巨噬细胞或U87MG+常氧神经胶质瘤外泌体-巨噬细胞在执行的同一天(比例尺＝200μm；图2L为植入U87MG+PBS-巨噬细胞，U87MG+常氧神经胶质瘤外泌体-巨噬细胞或U87MG+常氧神经胶质瘤外泌体-巨噬细胞的动物的存活分析(通过对数秩检验P<0.05；每组n＝5只动物；图2M，图2N为来自所示异种移植物的切片中Ki67的IHC染色的代表性图像和定量；比例尺在上面板中为200μm，在下面板中为100μm；数据显示为三次独立实验的平均值±SD(*P<0.05)。

图3为miR-1246在低氧胶质瘤衍生的外泌体和GBM患者的脑脊液中高表达，并可通过外泌体递送至巨噬细胞系列图；其中，图3A，图3B为常氧和缺氧胶质瘤外泌体之间差异miRNA 表达的热图；图3C为神经胶质瘤外泌体中缺氧水平上调和下调微小RNA；图3D为常氧和缺氧神经胶质瘤外泌体之间差异miRNA表达的MA图；图3E和图3F为通过qRT-PCR测定在U87MG和U251神经胶质瘤细胞系的含氧量正常和缺氧外泌体中miR-1246的表达水平；图 3G和图3H为通过qRT-PCR测定用含氧量正常或缺氧的神经胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞中miR-1246的表达水平图；图3I为LGG和GBM患者的CSF中miR-1246的表达水平；图3J 和图3K为LGG和GBM患者的CSF中miR-1246在术前和术后的变化；数据显示为三次独立实验的平均值±SD(*P<0.05)。

图4为缺氧胶质瘤衍生的外泌体miR-1246使M2巨噬细胞极化，促进体外和体内胶质瘤细胞的迁移，侵袭和增殖系列图；其中，图4A为用miR-1246模拟物，miR-1246抑制剂或miR-Nc 处理巨噬细胞。48小时后，使用M2标记物的引物(CD163，IL-10，IL-1RA)进行qRT-PCR；图4B巨噬细胞处理与图4A中描述的相同，并且使用3天培养物的上清液通过酶联免疫吸附测定确定IL-10的分泌；图4C和图4D用miR-1246模拟物，miR-1246抑制剂和miR-Nc处理巨噬细胞；48小时后通过流式细胞术测定诱导的CD11b+CD163+M2巨噬细胞；图4E和图 4F为在用条件性巨噬细胞共培养48小时后进行U87MG细胞的EdU测定，并显示代表性照片 (比例尺＝100μm；图4G和图4H为使用体外共培养系统测定与用miR-1246模拟物或miR-Nc 转染的巨噬细胞共培养的U87MG的迁移和侵袭能力。显示了涂有或不涂有Matrigel的膜上的迁移或侵入细胞的代表性照片，比例尺＝200μm；图4I为在携带用萤火虫荧光素酶和巨噬细胞 -Nc或巨噬细胞-ov-miR-1246转导的U87MG的异种移植裸鼠中的肿瘤生长的离体生物发光成像分析图，显示了移植后第15天的代表性图像(来自5只小鼠的数据)；图4J为在约40天时植入U87MG+巨噬细胞-Nc或U87MG+巨噬细胞-ov-miR-1246的动物的存活分析(通过对数秩检验P<0.05；每组n＝5只动物；图4K为H&E染色来自异种移植小鼠脑的部分与U87MG +巨噬细胞-Nc或U87MG+巨噬细胞-ov-miR-1246在执行的同一天，比例尺＝200μm；图4L和图4M为来自所示异种移植物的切片中Ki67的IHC染色的代表性图像；比例尺在上面板中为 200μm，在下面板中为100μm。

图5为外显子miR-1246直接靶向巨噬细胞中的TERF2IP系列图；其中，图5A和图5B来自条件巨噬细胞的mRNA的微阵列分析在热图和火山图中呈现；图5C为利用生物信息学工具 TargetScan靶向基因预测miR-1246并在微阵列分析中下调基因；图5D为含氧量正常的外泌体或来自U87MG细胞，miR-1246模拟物/抑制剂或质粒的缺氧外泌体处理的巨噬细胞中的 TERF2IP表达通过WB检测；图5E为通过用miR-1246模拟物/抑制剂和质粒转染后的qRT-PCR 检查巨噬细胞中的TERF2IP表达；图5F为miR-1246和TERF2IP 3'UTR之间的野生型和突变型结合位点的示意图；图5G为在指定的处理存在下U937的相对荧光素酶活性。

图6为外泌体miR-1246靶向TERF2IP并极化M2巨噬细胞以促进体外胶质瘤细胞的迁移，侵袭和增殖系列图；其中，图6A为用si-TERF2IP或si-Nc处理巨噬细胞。48小时后，使用 M2标记物的引物(CD163，IL-10，IL-1RA)进行qRT-PCR；图6B中巨噬细胞处理与图6A 中描述的相同，并且使用3天培养物的上清液通过酶联免疫吸附测定确定IL-10的分泌；图6C和图6D为用si-TERF2IP或si-Nc处理巨噬细胞；48小时后通过流式细胞术测定诱导的CD11b+CD163+M2巨噬细胞；图6E为用miR-1246模拟物和过表达无义序列或全长TERF2IP cDNA 的质粒转染巨噬细胞；48小时后，使用M2标记物的引物(CD163，IL-10，IL-1RA)进行qRT-PCR；图6F中巨噬细胞处理与图6E中描述的相同，并且使用3天培养物的上清液通过酶联免疫吸附测定确定IL-10的分泌；图6G和图6H中巨噬细胞处理与描述的相同，诱导的CD11b+CD163+M2巨噬细胞在48小时后通过流式细胞术测定；图6I和图6J为在与用si-Nc或si-TERF2IP(比例尺＝100μm)转染的巨噬细胞共培养后48小时进行U87MG细胞的EdU测定；图6K和图6L为使用体外共培养系统测定与用si-Nc或si-TERF2IP转染的巨噬细胞共培养的U87MG 的迁移和侵袭能力。显示了代表性的照片(比例尺＝100μm)。

图7为不同处理下的巨噬细胞通路验证图；其中，图7A为U87MG外泌体处理下巨噬细胞的通路改变情况。图7B为分别在敲除TERF2IP，敲除或过表达miR-1246，以及过表达TERF2IP 后的miR-1246过表达逆转情况下的巨噬细胞通路改变情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的一个具体实施方式中，提供miR-1246和/或TERF2IP在作为胶质瘤分子标志物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述miR-1246和/或TERF2IP作为胶质瘤分子标志物的应用中，所述标志物用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展。

本发明的又一具体实施方式中，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤的增殖、迁移、侵袭和/或胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化；更进一步的，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化；

其中，所述miR-1246和TERF2IP为人源；

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中miR-1246；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中miR-1246调控的靶基因的表达情况或 TERF2IP的表达情况的物质。

其中，所述miR-1246调控的靶基因的表达情况包括TERF2IP的表达情况；

优选的，采用液相杂交、Northern杂交、microRNA芯片、核酶保护分析技术、原位杂交检测胶质瘤样品中miR-1246；采用酶联免疫吸附测定、胶体金检测、蛋白质芯片检测胶质瘤样品中miR-1246调控的靶基因的表达情况或TERF2IP表达情况；

其中，所述miR-1246调控的靶基因的表达情况包括TERF2IP的表达情况；

本发明的又一具体实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展的组合物。

本发明的又一具体实施方式中，提供能够抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质和/或促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质在如下(a)-(d)至少一种中的应用：

(a)抑制胶质瘤细胞的增殖，或制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；

(b)抑制胶质瘤细胞的迁移，或者制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(c)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；

(d)抑制胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化，或制备抑制胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2 极化的产品。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于预防或治疗胶质瘤的药物组合物，其包含抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质和/或促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质；

所述抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质，包括采用基于RNA的microRNA功能性获得技术和/或基因特异性miR Mimics技术下调miR-1246表达和/或抑制其活性；优选为miR-1246拮抗剂或下调miR-1246表达的启动子；其中，所述miR-1246拮抗剂为根据miR-1246 人工合成的单链RNA；

所述促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质，包括TERF2IP蛋白激活剂。

本发明的又一具体实施方式中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和/或胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物组合物还包括药物可接受的载体，并且该药物组合物可以为各种口服或非口服剂型。对此，本发明的药物组合物可以与稀释剂或赋形剂如填充剂、增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等组合配制。预期口服给药的固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊等形式。对于这些固体试剂，本发明的化合物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶组合配制。除了单一的赋形剂，可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。

本发明的又一具体实施方式中，预期口服给药的液体制剂为混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆等。除了单一的稀释剂如水或液体石蜡，在液体制剂中可以包含各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。此外，本发明的药物组合物可以为肠胃外剂型，例如无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。可注射的丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及酯如油酸乙酯可以适于非水性溶剂和栓剂。栓剂的基质材料包括Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可油脂、月桂精油脂以及甘油明胶。

本发明的又一具体实施方式中，根据目的，本发明的组合物可口服施用或肠胃外施用。对于肠胃外施用，本发明的组合物施用的途径可为：外用、腹膜内、直肠内、皮下、静脉内、肌肉内或胸内。施用的剂量可根据患者体重、年龄和性别、健康状况、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和疾病严重性而变化。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例

1、方法

1.1细胞培养

人GBM细胞系U87MG，U251，A172和人单核细胞系U937获自中国科学院细胞库。原代人胶质母细胞瘤细胞系P3由Rolf Bjerkvig教授友情提供。U87MG和U251在DMEM[10％胎牛血清(FBS)中培养，U937用RPMI-1640(10％FBS)维持。将P3细胞系维持在含有2mM GlutaMAX和B-27(1×)，青霉素/链霉素(1×)，20ng/ml表皮生长因子和2型成纤维细胞生长因子的神经基质培养基中。所有细胞均在补充有10％胎牛血清的培养基中培养。100U/ml 青霉素和100mg/ml链霉素，并在37℃下在含有5％CO₂和95％空气的潮湿气氛中温育。为了诱导分化成巨噬细胞，将U937细胞(1×10 6)与100ng/ml PMA(Sigma，MO，USA)一起温育24小时。所有细胞系均通过短串联重复(STR)分析进行鉴定，并确认为支原体阴性。

1.2外泌体分离

将细胞系在正常培养基中培养至80-90％汇合；此后，用含有10％外泌体缺失的FBS的DMEM替换培养基，并在含氧量正常(21％CO 2)或低氧(1％O 2)条件下培养。然后，3天后收获细胞培养基(30ml)，以300×g离心10分钟，2000×g离心10分钟，10000×g离心30分钟，0.22μm过滤除去残留细胞，然后将培养基以100 000×g超离子分离70分钟(BecKmanCoulter，California，USA)以收集沉淀物，然后通过外泌体沉淀物的洗涤步骤以100 000×g离心70分钟(BecKman Coulter)，加利福尼亚州，美国)。然后将外来体沉淀重悬于50-100μlPBS (22)中。根据制造商的说明书，使用ExoquicK TM Reagent(SBI，CA，USA)通过沉淀法分离外泌体。简言之，将条件培养基与ExoquicK TM试剂(5：1)一起温育超过12小时，并以1500g离心30分钟，并将沉淀的外来体重悬于100μlPBS中并在-80℃下储存直至进一步使用。

使用配备有快速视频捕获和粒子追踪软件的Nanosight LM10系统(NanosightLtd，Navato， CA)分析外泌体的大小，通过测量布朗运动的速率来计算纳米粒子浓度和粒度分布。此外，通过透射电子显微镜(TEM)检查的外泌体悬浮在戊二醛中，滴入碳涂覆的铜网格中，用2％乙酸铀酰染色，干燥并成像。

1.4电子显微镜和qNano

将分离的外泌体加载到碳涂覆的电子显微镜网格上并使用TEM检查。将一滴戊二醛(3％) 置于每个网格上5分钟。然后，用蒸馏水洗涤网格2分钟，并进行总共十次洗涤。接下来，将网格用乙酸铀酰溶液(4％)处理10分钟，并用甲基纤维素溶液(1％)处理5分钟以对比外来体样品。将网格干燥并使用TEM 1011电子显微镜在80KV(JEOL-1200EX)下观察。qNano (Izon Sciences Ltd，NZ)用于外来体粒径和浓度分析。

1.5小干扰RNA，miR抑制剂/模拟物和病毒转染

TERF2IP，对照siRNA，miR-1246模拟物，miR-1246抑制剂和对照RNA购自GenePharma (中国上海)。miR-1246过表达和对照慢病毒由Genechem(中国上海)合成，并在检查前转染到U937细胞中72小时。补充材料中提供了小干扰RNA和敲低/过表达效率的序列。

1.6RNA提取和qRT-PCR

在使用Exoquick(System Biosciences)分离外泌体后，使用SeraMirTM ExosomeRNA ExtractionKit(System Biosciences，USA)进行外来体RNA提取。TRIzol用于根据制造商的方案提取总细胞RNA。根据制造商的说明书，用逆转录系统(Toyobo，OsaKa，Japan)合成互补DNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，USA)进行qRT-PCR。将表达数据统一标准化为内部对照GAPDH和U6。使用ΔΔCt方法评估相对表达水平。引物序列可在补充材料中找到。

1.7蛋白质印迹

将来自巨噬细胞的全细胞蛋白质提取物在裂解缓冲液中匀浆，并以12,000转/分钟离心。20分钟进行双辛可宁酸(BCA)测定以测量蛋白质浓度。免疫印迹后，将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上并与特异性抗体一起孵育。使用以下一抗：钙联接蛋白(Abcam，UK，ab133615)， TSG101(Abcam，ab125011)，STAT3(Abcam，ab60134)，p-STAT3(Abcam，ab76315)，GAPDH (Proteintech，8457)，磷酸化NF-κBp65(S536)(Cell SignalingTechnology，3033)，NF-κBp65 (Cell Signaling Technology，8242)和IκBα(CellSignaling Technology，4812)。将免疫复合物与荧光素缀合的第二抗体一起温育，然后通过Odyssey荧光扫描仪(ChemiDoc XRS+， BIO-RAD)检测。

1.8流式细胞术

为了检测CD11b+CD163+巨噬细胞，使用抗CD163-PE(BD Biosciences，USA)和抗CD11b-APC(eBioscience，USA)来染色细胞。同种型对照并行运行。每个样品收集大约1×10⁵个事件。使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences，USA)进行流式细胞术。

1.9细胞因子测定

在指定的处理后3天收集细胞培养基。根据制造商的说明，通过ELISA测定(Proteintech， China)检测IL-10的分泌水平。

1.10细胞增殖，迁移和侵袭测定

将U87MG细胞从共培养系统的上室分离并准备用于随后的实验。根据制造商的方案，使用EdU测定试剂盒(Ribobio，China)检查细胞增殖能力。将细胞与250μl5-乙炔基-20-脱氧尿苷在37℃下孵育2小时，然后用4％多聚甲醛固定15分钟并用0.5％Triton X-100透化10分钟。制备阿波罗试剂并将其加入细胞中30分钟。用Hoechst染色细胞核，用Leica倒置荧光显微镜获得代表性图像。对于迁移和侵袭测定，将2×10 4个细胞置于具有或不具有Matrigel(8μm孔径，Corning)的插入物的上室中。将含有10％FBS的DMEM加入下室中。在温育8小时(迁移)或24小时(侵入)后，用棉签除去残留在上室中的细胞，固定通过膜的细胞并用结晶紫染色。代表性图像以100x放大率显示。

1.11生物信息学分析和荧光素酶报告基因测定

在线miRNA预测工具TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)用于预测miR-1246 的靶标。含有pGL3-TERF2IP-3'UTR-野生型和pGL3-TERF2IP-3'UTR-mut的报告基因由Bio-Asia(济南，中国)合成。使用Lipofectamine3000(Invitrogen，CA，USA)，用荧光素酶报道分子和miR-1246模拟物共转染U937衍生的巨噬细胞。转染后48小时收获细胞裂解物，并根据制造商的说明书通过双荧光素酶报告基因测定试剂盒测量报告蛋白活性。海肾荧光素酶活性用于标准化。

1.12免疫组化(IHC)

将福尔马林固定和石蜡包埋的样品切成4μm切片，然后在柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中煮沸用于抗原修复。然后，使用3％H₂O₂来阻断内源性HRP活性。接下来，用10％正常山羊血清封闭切片，并与第一抗体(兔抗Ki67单克隆抗体，1：100，Servicebio，中国)在4℃温育过夜，然后在第二生物素化抗体中于37°温育30分钟。最后用DAB溶液观察C并用苏木精复染。使用Olympus倒置显微镜拍摄代表性图像。

1.13动物研究

为了检查外泌体在体内的作用，通过以下方法构建异种移植模型。在植入前，用PBS， N-GDE或H-GDE处理巨噬细胞超过48小时。然后将与不同条件性巨噬细胞(2×10⁵/小鼠) 混合的荧光素酶标记的U87MG细胞(1×10⁶/小鼠)重悬于10μlPBS中并注射到裸鼠的脑中。随后，将3组小鼠静脉注射PBS或来自指定肿瘤细胞的等量外泌体，分别通过尾静脉，每周两次，持续一个月。在植入后每5天通过使用IVIS Lumina系列III(PerKinElmer，USA)的离体生物发光成像测量和定量肿瘤体积。

对于体内miR-1246的功能实验，根据随机数表法将小鼠随机分成2组。将荧光素酶标记的1×10⁶U87MG细胞的总数与2x10⁵个条件化的巨噬细胞混合，重悬浮于10μlPBS中并注射到裸鼠的脑中。生物发光成像用于在植入后每5天对小鼠脑进行成像。

所有涉及小鼠的手术均经山东大学齐鲁医院动物护理和使用委员会批准并遵守。

1.14统计分析

使用SPSS22.0进行数据分析，并使用GraphPad Prism 7进行可视化。每个实验至少一式三份进行，所有结果表示为平均值±SD。χ²检验和学生t检验用于评估统计学显着性。

2、结果

2.1胶质瘤来源外泌体的鉴定与吞噬实验

首先，利用3种胶质瘤细胞系(U87MG，U251，A172)和原代胶质瘤细胞系(P3)的细胞培养上清，通过密度梯度离心的方式分离肿瘤外泌体。电镜显示外泌体是直径介于 30nm-100nm的圆形囊泡(图1A)，并且通过qNano分析得到了所收集的外泌体的直径分布及浓度(图1B)。为了进一步确定所分离的囊泡结构是外泌体，分别制备了分离囊泡和细胞的蛋白样本，WB结果显示，外泌体蛋白TSG-101在二者中均有表达，但细胞特异性的内质网钙链接蛋白Calnexin仅在细胞样品中表达(图1C)。随后，用外泌体特异性的PKH67-GFP标记胶质瘤外泌体，将其加入巨噬细胞培养体系中，分别于0h，12h和24h进行共聚焦显微镜观察，结果显示GFP标记的外泌体随时间推移可被巨噬细胞大量吞噬(图1D)。

2.2低氧胶质瘤外泌体在体内/体外可显著促进巨噬细胞M2极化并促进肿瘤进展

为了验证常氧及低氧胶质瘤来源的外泌体对巨噬细胞极化的作用，将体外诱导的巨噬细胞分别用PBS、常氧胶质瘤外泌体和低氧胶质瘤外泌体(U87MG和U251)刺激48小时，并通过后续实验对巨噬细胞的功能改变进行研究。实时定量PCR检测M2型巨噬细胞相关分子如 CD163，IL-10和IL1Ra的表达发现，常氧胶质瘤外泌体和低氧胶质瘤外泌体均可以显著提高以上分子的表达水平，但低氧胶质瘤外泌体作用更为显著(图2A，B)。为了进一步验证以上结果，利用流式细胞术检测上述处理的巨噬细胞中CD11b⁺/CD163⁺的M2型巨噬细胞比例，发现低氧胶质瘤外泌体相较于常氧胶质瘤外泌体更显著地促进了M2型巨噬细胞的转化(图2C， D)。随后，用酶联免疫吸附测定法检测经上述处理的巨噬细胞上清中IL-10的因子表达水平，结果同样证明了低氧胶质瘤具有更强的促巨噬细胞M2极化的作用(图2E，F)。为了验证经胶质瘤外泌体处理过的巨噬细胞对胶质瘤细胞的作用，构建了体外共培养体系，并对经过与上述巨噬细胞共培养后的胶质瘤细胞(U87MG)进行功能学检测。EdU实验证实，低氧胶质瘤外泌体刺激过的巨噬细胞较常氧胶质瘤外泌体和PBS处理组的巨噬细胞具有更强的促进胶质瘤细胞增殖的作用(图2G)。随后，对经上述处理胶质瘤细胞进行迁移和侵袭能力检测。相对于PBS组而言，胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞均可显著促进胶质瘤细胞的迁移，侵袭能力，且低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞促进作用更加明显(图2H)。综合以上结论，证实低氧胶质瘤外泌体相较常氧胶质瘤外泌体在体外可以更显著地诱导巨噬细胞M2极化并促进胶质瘤细胞恶性生物学行为。为了进一步验证外泌体在体内的作用，将荧光素酶标记的U87MG细胞与分别经PBS、常氧胶质瘤外泌体、低氧胶质瘤外泌体处理过的巨噬细胞以5:1的比例原位接种与裸鼠颅内，并在接种后每3天通过尾静脉分别注射PBS、常氧及低氧胶质瘤外泌体，同时每周进行生物发光成像评价肿瘤大小及。第3周的成像结果显示，经低氧胶质瘤外泌体处理组的裸鼠，其肿瘤生长速度更快(图2I)。将实验裸鼠在死亡前1天处死，固定取脑切片，HE 染色和Ki67染色结果显示，相对于PBS组及常氧胶质瘤外泌体组，低氧胶质瘤外泌体处理组的肿瘤具有更高的增殖速度及更模糊的肿瘤边界(图2J，K)，其总体生存时间也更短(图2L)。所以，以上结论说明，低氧胶质瘤外泌体在体内和体外条件下都具有更强的促巨噬细胞M2极化的作用。

2.3miR-1246在低氧胶质瘤外泌体中高表达且可传递到受体巨噬细胞中

近期研究表明，外泌体中的RNA组分在细胞间通讯中起到至关重要的作用。在各种RNA 成分中，外泌体中microRNA的改变引起了的注意，于是对常氧和低氧胶质瘤外泌体进行了 microRNA测序并发现了其中表达量显著改变的microRNA成分(图3A)。其中，在低氧外泌体中表达量前20位的microRNA相较常氧外泌体中对应的表达量均有显著升高(图3B-D)。由于miR-1246是在低氧胶质瘤外泌体中表达最高的microRNA，其在巨噬细胞M2极化中是否起到重要作用引起了的兴趣。在验证miR-1246的功能之前，首先在细胞实验中验证了测序结果。同测序结果一样，低氧胶质瘤外泌体中miR-1246的表达量较常氧胶质瘤外泌体显著上调(图3E，F)。同时，低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞中miR-1246表达量较常氧外泌体处理组和PBS处理组均显著升高(图3G，H)。以上结果证实，低氧外泌体中miR-1246高表达且可传递至受体巨噬细胞中。

2.4低氧胶质瘤外泌体来源的miR-1246诱导巨噬细胞M2极化并在体内，体外促进胶质瘤增殖，迁移及侵袭。

最近研究表明，miR-1246可以在p53突变的结肠癌细胞外泌体中富集并参与改造巨噬细胞成促肿瘤型巨噬细胞。所以利用实时定量PCR的方法在miR-1246过表达/敲除的巨噬细胞中检测相关基因水平的改变。如4A所示，miR-1246过表达可以增加巨噬细胞中CD163，IL-10， IL-1Ra等M2指标的表达。且miR-1246敲除可以降低上述指标的表达水平。随后，用流式细胞术检测上述处理的巨噬细胞中CD11b+CD163+的M2型细胞比例，并用酶联免疫吸附测定检测细胞上清中IL-10的浓度。结果发现，miR-1246过表达可以提升上述M2型巨噬细胞的比例及细胞上清中IL-10的浓度，而miR-1246敲除则可降低相应指标(图4B-D)。随后，应用之前所建立的共培养体系以探究过表达miR-1246的巨噬细胞对胶质瘤细胞的作用。EdU结果表明，miR-1246过表达的巨噬细胞具有更强的促胶质瘤细胞增殖作用(图4G，H)，而迁移和侵袭同样证实，miR-1246过表达的巨噬细胞可以显著促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力(图 4E，F)。以上结果证实，miR-1246可以诱导巨噬细胞M2极化并在体外促进胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。为了在体内实验中证实以上结果，将荧光素酶标记的U87MG细胞与过表达Nc序列或miR-1246的巨噬细胞以5:1的比例原位注射到裸鼠颅内，每周进行活体荧光成像定量。结果发现，miR-1246过表达的巨噬细胞可显著促进胶质瘤的生长，且裸鼠生存期更短(图4I-K)。同上，实验裸鼠于死亡前1天处死，取脑固定并切片，HE染色和Ki67免疫组化结果显示，miR-1246过表达的巨噬细胞可显著促进胶质瘤增殖，且肿瘤边界模糊(图4L)。以上结果证实，miR-1246可诱导巨噬细胞M2型极化并在体外和体内促进胶质瘤进展。

2.5miR-1246直接靶向巨噬细胞TERF2IP并降低其表达

为了明确巨噬细胞中miR-1246的靶点，将巨噬细胞分成两组并设立3组平行对照，一组过表达随机序列Nc，另外一组过表达miR-1246，随后对两组巨噬细胞进行转录组芯片检测以寻找差异表达的基因(图5A，B)，并利用在线靶点预测网站Targetscan进行靶点预测。随后，将芯片结果中显著下调的基因与Targetscan预测的靶点进行合并，得到了34个潜在的miR-1246 靶点(图5C)。其中，TERF2IP作为可能靶点之一，其在细胞核中可维持端粒的正常功能，而在细胞质中，TERF2IP可与IKK结合并激活下游NF-κB通路。首先，利用WB证实了巨噬细胞中TERF2IP的表达可被胶质瘤外泌体特别是低氧胶质瘤外泌体所抑制，同样，miR-1246过表达可以降低而miR-1246敲除可以增加其表达量。随后，在巨噬细胞中过表达了TERF2IP，并发现过表达效率可被miR-1246的过表达抑制(图5D)，同样的结果在RNA水平也得到证实(图5E)。随后，构建了TERF2IP的3p’UTR野生型和突变型的双荧光素酶报告基因质粒(图 5F)，并将其与miR-1246，miR-Nc共转染至巨噬细胞中，结果表明，miR-1246可显著抑制野生型质粒组的荧光素报告强度，而突变型质粒组无显著差异(图5G)。以上结果说明，miR-1246 可直接靶向TERF2IP并抑制其表达。

2.6miR-1246靶向抑制TERF2IP并通过激活STAT3通路/抑制NF-κB通路诱导巨噬细胞M2 极化

为了验证TERF2IP在巨噬细胞中的作用，利用小干扰RNA(siRNA)在巨噬细胞中敲减 TERF2IP，并用WB和PCR验证敲减效率(图6A，B)。随后，在敲减TERF2IP的巨噬细胞中检测巨噬细胞相关分子的表达水平。如图6C所示，M2型巨噬细胞相关基因CD163，IL-10 和IL-1Ra的表达量在TERF2IP敲减的巨噬细胞中均明显上升(图6C)。流式细胞检测CD11b⁺ CD163⁺M2巨噬细胞比例和酶联免疫吸附测定实验检测上清IL-10浓度均证实上述结论(图 6D-F)。并且，在巨噬细胞中过表达TERF2IP可以在一定程度上减弱或者逆转miR-1246过表达对巨噬细胞的作用(图4G-J)。随后，利用共培养体系去验证在巨噬细胞中敲除TERF2IP 是否可以在体外促进胶质瘤细胞进展。如图6K-L所示，敲减TERF2IP的巨噬细胞可在体外显著促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。以上结果证实，miR-1246在巨噬细胞中靶向抑制TERF2IP并提高M2相关标志如CD163，IL-10的表达，他们作为STAT3通路的下游分子，预示着STAT3通路可能参与了miR-1246介导的巨噬细胞M2极化。而如前所述，TERF2IP参与NF-κB通路的活化，所以设计了不同分组以验证STAT3通路及NF-κB通路的改变情况。在图7A中，胶质瘤外泌体特别是低氧胶质瘤外泌体促进了STAT3的磷酸化，并降低了磷酸化 p65的表达，且miR-1246过表达、TERF2IP敲除可以起到同样的作用。而miR-1246敲除或 TERF2IP过表达则可降低STAT3磷酸化水平并提高NF-κB活性(图7B)。以上结果说明， miR-1246靶向抑制TERF2IP并通过激活STAT3通路/抑制NF-κB通路诱导巨噬细胞M2极化。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.miR-1246和/或TERF2IP在制备胶质瘤分子标志物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述标志物用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤的增殖、迁移、侵袭和/或胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化；

优选的，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化；

优选的，所述miR-1246和TERF2IP为人源。

4.一种用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展的组合物，其特征在于，包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中miR-1246；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中miR-1246调控的靶基因的表达情况或TERF2IP的表达情况的物质。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，采用液相杂交、Northern杂交、microRNA芯片、核酶保护分析技术、原位杂交检测胶质瘤样品中miR-1246；采用酶联免疫吸附测定、胶体金检测、蛋白质芯片检测胶质瘤样品中miR-1246调控的靶基因的表达情况或TERF2IP表达情况；

其中，所述miR-1246调控的靶基因的表达情况包括TERF2IP的表达情况。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测、诊断或预测胶质瘤的进展的组合物。

7.抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质和/或促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质在如下(a)-(d)至少一种中的应用：

(a)抑制胶质瘤细胞的增殖，或制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；

(b)抑制胶质瘤细胞的迁移，或者制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(c)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；

(d)抑制胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化，或制备抑制胶质瘤肿瘤相关巨噬细胞M2极化的产品。

8.一种用于预防或治疗胶质瘤的药物组合物，其特征在于，包含抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质和/或促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制miR-1246表达和/或活性降低的物质为miR-1246拮抗剂或下调miR-1246表达的启动子；其中，所述miR-1246拮抗剂为根据miR-1246人工合成的单链RNA；

所述促进TERF2IP蛋白表达和/或活性提高的物质，包括TERF2IP蛋白激活剂。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，还包括药物可接受的载体，且所述药物组合物为口服或非口服剂型。