CN113082216B - 含miR-124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含miR‑124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法和应用，属于中枢神经系统损伤修复药物技术领域。含miR‑124的胶质瘤细胞外泌体的制备方法，将胶质瘤细胞系培养得到的上清液经固液分离；将分离的外泌体和miR‑124混合，共同孵育，得到含miR‑124的胶质瘤细胞外泌体。上述制备的外泌体可有效与胆固醇修饰的miR‑124相结合并被反应性星形胶质细胞吸收，显著提升反应性星形胶质细胞中miR‑124表达，具有抑制星形胶质细胞活化及瘢痕形成的作用。因此，本发明还提供了含miR‑124的胶质瘤细胞外泌体在制备抑制星形胶质细胞活化和/或胶质瘢痕形成的药物中的应用，进而治疗中枢神经损伤疾病。

Description

含miR-124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中枢神经系统损伤修复药物技术领域，具体涉及含miR-124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

星形胶质细胞(Astrocytes，As)是脊椎动物中枢神经系统中神经胶质细胞的主要组成部分。中枢神经系统损伤时，As活化为反应性星形胶质细胞(Reactive astrocytes,RAs)，合成和分泌以软骨素和硫酸角质素蛋白聚糖为主要成分的细胞外基质，与小胶质细胞、巨噬细胞等形成致密的胶质瘢痕，影响轴突的再生、延长和融合，并且压迫微血管，影响局部血液供应^[1]。RAs所形成的胶质瘢痕可形成物理屏障，阻碍移植细胞的迁移，导致利用神经干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等细胞治疗中枢神经系统损伤无法达到预期的效果。因此，如何抑制和消除RAs形成的胶质瘢痕成为治疗中枢神经系统损伤的重要科学难题。

miR-124是中枢神经系统中表达最丰富的miRNA，通过调节自噬、神经炎症、氧化应激、神经分化和线粒体功能等方面在诸多生理和病理过程中发挥着重要作用。已有证据表明，miR-124与中枢神经系统的损伤修复密切相关。Niina Vuokila等人发现脑损伤后mir-124后海马基因表达网络受到miR-124的长期调控，是脑损伤后基因表达的慢性调节剂^[2]。miR-124同时还可以调节活化的小胶质细胞的极化，并促使巨噬细胞向抗炎M2表型转变，并在脑部疾病后以多种方式保护神经元^[3]。在最近的研究中发现，miR-124与星形胶质细胞同样具有密切的联系，在氧-葡萄糖剥夺/再灌注后，星形胶质细胞中miR-124的表达明显降低，提升miR-124可以抑制星形胶质细胞的活化，促进损伤修复，这一发现为治疗中枢神经系统损伤提供了新的思路^[4]。在最近的研究中发现，miR-124与星形胶质细胞同样具有密切的联系，在氧-葡萄糖剥夺/再灌注后，星形胶质细胞中miR-124的表达明显降低，提升miR-124可以抑制星形胶质细胞的活化，促进损伤修复，这一发现为治疗中枢神经系统损伤提供了新的思路^[4,5]。

现需要解决的技术问题是：如何将miR-124高效地递送到CNS损伤部位，抑制星形胶质细胞活化并减弱胶质瘢痕的形成。寻找一个具有安全性，特异性和高效率的运输载体是将miR-124应用于临床实践的关键。

根据文献报道，外泌体(exosome)可能是解决这一问题的理想载体。外泌体是直径30～150nm的盘状囊泡，以胞吐的形式向胞外分泌，几乎所有类型的细胞都分泌外泌体，广泛的存在于血、尿、唾液、脑脊液等多种类型的体液中。随着研究的进一步深入，最初仅被视为废物处理系统的外泌体如今作为细胞间信号传递的关键介质大放异彩，它通过将信号分子从原始细胞传递至受体细胞来介导细胞通讯。外泌体运输系统已发展多年，相较于基于病毒，细菌，噬菌体和合成脂质的递送方法，它更加稳定，生物相容好，可通过血脑屏障，免疫原性，非细胞毒性和非诱变性也较低。由于外泌体天然携带miRNA，两者相容性极好，其他类型的生物活性物质几乎不可能大量装载到外泌体中，因此进行的最广泛的研究就是对外泌体进行工程改造，递送治疗性miRNA至特定的靶细胞，治疗不同的疾病^[6]。已有研究结果已经证实，携带miR-124的外泌体在促进神经再生^[7]、抑制炎症^[8]、改善认知^[9]、控制自噬^[10]等方面具有显著高效的作用，但具体其对星形胶质细胞的影响尚未见报导。并且研究者往往选择小胶质细胞、间充质干细胞作为分泌外泌体的母体细胞，这些细胞虽然技术较为成熟，但也存在着难于获得，不容易大量扩增，不同培养代次细胞表型不稳定，外泌体产量和成分不稳定以及细胞培养成本贵等一系列问题。

参考文献

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[2]VUOKILA N,LUKASIUK K,BOT A M,et al.miR-124-3p is a chronicregulator of gene expression after brain injury[J].Cell Mol Life Sci,2018,75(24):4557-81.

[3]HAMZEI TAJ S,KHO W,RIOU A,et al.MiRNA-124induces neuroprotectionand functional improvement after focal cerebral ischemia[J].Biomaterials,2016,91(151-65.

[4]JIANG D,GONG F,GE X,et al.Neuron-derived exosomes-transmitted miR-124-3p protect traumatically injured spinal cord by suppressing theactivation ofneurotoxic microglia and astrocytes[J].J Nanobiotechnology,2020,18(1):105.

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[10]LI D,HUANG S,YIN Z,et al.Increases in miR-124-3p in MicroglialExosomes Confer Neuroprotective Effects by Targeting FIP200-Mediated NeuronalAutophagy Following Traumatic Brain Injury[J].Neurochem Res,2019,44(8):1903-23.

[11]Yaying Song,Zongwei,Tingting He,et al.M2 microglia-derivedexosomes protect the mouse brain from ischemia-reperfusion injury viaexosomal miR-124Theranostics[J].2019May 4；9(10):2910-2923.

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含miR-124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法，以胶质瘤细胞系作为外泌体母体细胞，可大量获得性质稳定的外泌体。

本发明还提供了含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备抑制星形胶质细胞活化和/或胶质瘢痕形成的药物中的应用，从而达到促进中枢神经系统损伤修复的目的。

本发明提供了一种含miR-124的胶质瘤细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)将胶质瘤细胞系培养得到的上清液经固液分离，得到外泌体；

2)将所述外泌体和miR-124混合，共同孵育，得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体。

优选的，步骤2)中所述外泌体的质量和miR-124的体积比为1000μg：(45～55)μl；

所述miR-124的浓度为18～22μM。

优选的，所述miR-124包括miR-124-3Pmimic。

优选的，所述miR-124包括胆固醇修饰的miR-124-3P mimic。

优选的，步骤2)中所述共同孵育的温度为35～38℃；

所述共同孵育的时间为1～1.5h。

优选的，所述共同孵育后，将孵育产物进行纯化；所述纯化的方法为将孵育产物经固液分离，收集固相，用PBS缓冲液洗涤和重悬，经离心得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体。

优选的，步骤1)中所述固液分离包括离心和过滤；

所述固液分离的方法为将所述上清液依次经2800～3200g和9000～11000g离心力进行离心，收集沉淀后滤膜过滤，再经11500～12500g离心。

本发明提供了含miR-124的胶质瘤细胞外泌体，所述外泌体的质量和miR-124的体积比为1000μg：(45～55)μl；所述miR-124的浓度为18～22μM。

本发明提供了所述制备方法制备得到的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备抑制星形胶质细胞活化和/或胶质瘢痕形成的药物中的应用。

本发明提供了所述制备方法制备得到的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备治疗中枢神经系统损伤疾病的药物中的应用。

本发明提供了一种含miR-124的胶质瘤细胞外泌体的制备方法，以胶质瘤细胞系为母体细胞收集外泌体，胶质瘤细胞系易于购买、表型稳定、可长期扩增培养，并且细胞增殖速度快、培养成本低，可短期内获得大量且性质稳定的外泌体，为制备含miR-124的外泌体提供了丰富的外泌体材料。

本发明提供了所述制备方法制备得到的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备抑制星形胶质细胞活化和/或胶质瘢痕形成的药物中的应用。本发明将含miR-124的外泌体培养星形胶质细胞，检测星形胶质细胞中miR-124相对表达水平，培养48h后实验组细胞中miR-124显著提升8倍左右，阴性对照组无显著变化，说明外泌体成功将miR-124转运至RAs中；同时通过检测表征细胞活性水平的蛋白(GFAP、SOX9、STAT3蛋白)的相对表达量，结果表明miR-124的外泌体可以有效降低RAs活化水平。RAs反应特性降低，瘢痕形成能力减弱。因此，含miR-124的胶质瘤细胞外泌体可有效抑制星形胶质细胞活化，减少瘢痕形成，进而促进中枢神经系统损伤修复。

附图说明

图1a为U-87细胞外泌体电镜观察图片；

图1b为U-87细胞外泌体标志物鉴定结果；

图1c为U-87细胞外泌体粒径检测结果；

图2a为RAs原代培养及提纯结果；

图2b为RAs的提纯结果；

图3为U-87细胞外泌体的标记摄取结果；

图4a为高表达miR-124的U-87细胞外泌体处理后RAs中miR-124基因表达水平检测；

图4b为高表达miR-124的U-87细胞外泌体处理后RAS活化相关信号通路的基因表达水平检测；

图4c为高表达miR-124的U-87细胞外泌体处理后RAS活化相关信号通路的蛋白表达水平检测。

具体实施方式

本发明提供了一种含miR-124的胶质瘤细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)将胶质瘤细胞系培养得到的上清液经固液分离，得到外泌体；

2)将所述外泌体和miR-124混合，共同孵育，得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体。

本发明将胶质瘤细胞系培养得到的上清液经固液分离，得到外泌体。

本发明对胶质瘤细胞系的种类和来源不做具体限定，采用本领域所熟知的胶质瘤细胞系即可，例如U-87细胞系。本发明对所述胶质瘤细胞的培养方法不做具体限定限定，采用本领域所熟知的胶质瘤细胞培养方法即可。

在本发明中，所述固液分离优选包括离心和过滤。所述固液分离的方法为将所述上清液优选依次经2800～3200g和9000～11000g离心力进行离心，收集沉淀后滤膜过滤，再经11500～12500g离心，更优选为依次经3000g和10000g离心力进行离心，收集沉淀后滤膜过滤，再经12000g离心。所述滤膜的孔径优选为0.22μg。

在本发明中，优选对分离的外泌体进行鉴定。经检测分离的胶质瘤细胞外泌体的粒径范围优选为30～150nm，占总外泌体质量的56％以上。粒子分布系数(PDI)在0.08-0.7之间，证明体系分散度适。所述胶质瘤细胞外泌体能够特异性表达CD9、CD63、TSG101等外泌体标志性蛋白。

得到胶质瘤细胞外泌体后，本发明将所述外泌体和miR-124混合，共同孵育，得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体。

在本发明中，所述外泌体的质量和miR-124的体积比优选为1000μg：(45～55)μl，更优选为1000μg：50μl。所述miR-124的浓度优选为18～22μM，更优选为20μM。所述miR-124优选包括miR-124-3P mimic。所述miR-124-3P mimic为5`端含有UAAGGCA碱基核苷酸序列的成熟体模拟物，种属以人(MIMAT0000422)为例，miR-124-3P mimic的核苷酸序列为5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA-3'(SEQ ID NO:1)；以小鼠(MIMAT0000134)，为例，核苷酸序列为5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3'(SEQ ID NO:2)。

在本发明中，所述miR-124优选包括胆固醇修饰的miR-124-3P mimic。所述miR-124-3Pmimic经胆固醇修饰后，性质更加稳定，不容易降解，维持更长的在细胞内作用时间；亲脂性增强，修饰后的mimic通过简单的共同孵育即可与外泌体结合进入其内。

在本发明中，所述共同孵育的温度优选为35～38℃，更优选为37℃。所述共同孵育的时间优选为1～1.5h，更优选为1h。所述共同孵育期间，所述miR-124被外泌体包裹，进入外泌体内部。所述共同孵育后，优选将孵育产物进行纯化；所述纯化的方法为将孵育产物经固液分离，收集固相，用PBS缓冲液洗涤和重悬，经离心得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体。所述离心的转速优选为120000g。所述离心的时间优选为70min。

本发明提供了含miR-124的胶质瘤细胞外泌体，所述外泌体的质量和miR-124的体积比为1000μg：(45～55)μl；所述miR-124的浓度为18～22μM。本发明制备的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体性质稳定，可有效将所携带的miR-124传递至星形胶质细胞内，抑制星形胶质细胞活化及胶质瘢痕形成，有利于中枢神经的再生修复。

基于此，本发明提供了所述制备方法制备得到的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备抑制星形胶质细胞活化和/或胶质瘢痕形成的药物中的应用。

由于含miR-124的胶质瘤细胞外泌体能够抑制胶质瘢痕形成，不能阻碍移植细胞迁移从而实现利用神经干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等迁移值损伤部位，发挥细胞治疗的效果，因此本发明提供了所述制备方法制备得到的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备治疗中枢神经系统损伤疾病的药物中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的含miR-124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

星形胶质细胞外泌体的分离和鉴定

使用无外泌体血清培养液培养U-87细胞(美国ATCC细胞资源中心)24h，收集U-87细胞上清。在3000g、4℃的条件下离心上清20min，离心后收集上清；以10000g、4℃的条件下离心60min，离心后收集上清，0.22μm滤器过滤所得上清；将过滤后的上清转移至超离管中，在120000g、4℃的条件下离心70min，离心后弃去上清，所得沉淀即为外泌体，用100μl PBS缓冲液重悬沉淀转移到1.5ml EP管中，得到外泌体悬液，于-80℃长期保存。

将5μl外泌体悬液加到Formvar-carbon载样铜网上，使其吸附4～5min，然后进行标准乙酸铀酰染色，在80kV下拍摄电镜照片。电镜观察结果如图1a所示，外泌体呈典型的盘状结构，尺寸范围为30～150nm。

通过蛋白免疫印迹(Westernblot)检测外泌体标记蛋白的表达，所述蛋白免疫印迹的具体操作方法参见参考文献^[11]。结果如图1b所示，检测到CD9、CD63、TSG101的表达。

通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量外泌体颗粒浓度(颗粒/ml)和尺寸(纳米)，每次测量重复三次。

结果如图1c所示，出外泌体粒径主峰在160.4nm处，30～150nm的占比达到56％。检测得到的粒子分布系数(PDI)在0.08～0.7之间，证明体系分散度适中，检测结果置信度高。

实施例2

RAs原代培养及提纯:

取出生1～3天的大鼠乳鼠置于75％酒精中浸泡消毒15min，转移至无菌操作台中，用PBS清洗大鼠乳鼠皮肤表面酒精，用显微剪刀和显微镊剥取大脑，置于无菌PBS中，显微镜下剥离大脑皮层，放入含有10ml DME/F12(HyClone,SH30023.01)的不粘附细胞皿中，用5ml枪头吹打将大脑皮层组织打碎至均匀无颗粒混悬液。将组织液收集于离心管中，1500rpm离心5min弃上清收集沉淀。将组织用0.05％胰蛋白酶(trypsin)和DNA酶(DeoxyribonucleaseI,Worthington)于37℃震荡消化25分钟。终止消化后用无菌滤网40μm-sterileEASYstrainerTM(Greiner bio-one)过滤得到单细胞悬液。待离心后收集沉淀，用PBS清洗三次。细胞沉淀用RAs培养液(DMEM/F12+10％FBS+bFGF+TGF-β1+N2 supplement)混悬，均匀铺于T25细胞培养瓶中，于恒温细胞培养箱中贴壁培养。待细胞汇合至80～90％，在恒温震荡箱中震荡2天，每天震荡8小时，去除小胶质细胞和少突胶质细胞等杂细胞，震荡完后在细胞培养液中加入阿糖胞苷(Sigma，C1768)处理24h，用于提纯RAs。通过细胞免疫荧光检测细胞纯度及提纯效果，待反应性星形胶质细胞培养至汇合率70％-80％，弃上清液，PBS清洗三次，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS清洗三次。随后用0.2％tritonX-100打孔30min，PBS清洗三次。10％山羊血清封闭1小时，随后用星形胶质细胞相关标志物GFAP抗体封闭，4度过夜。第二天弃一抗，PBS清洗后用荧光二抗封闭1小时，PBS清洗三次。随后用Hoechst 33342染核15分钟，PBS清洗后用在倒置相差荧光显微镜下观察。

结果如图2a和图2b所示，相较于提纯前，纯化后细胞纯度显著提升，达到98％以上，可用于后续实验。

实施例3

星形胶质细胞外泌体的标记和摄取

将4μl PKH67(细胞膜染色试剂盒)加入到1ml稀释液中，与200μl实施例1分离的外泌体溶液混合，室温孵育4分钟，加入2ml培养基终止反应，转移至超离管中，加入10ml PBS，在120000g、4℃条件下离心70min，用100μl PBS重悬沉淀。将PKH67标记的外泌体与RAs共孵育18h，弃上清液，用PBS清洗后置于倒置相差荧光显微镜下观察。

结果如图3所示，外泌体被细胞吸收并内在化。

实施例4

应富含miR-124的U87细胞外泌体抑制RAs活化实验

取实施例1分离的外泌体溶液20μl，加入10μl蛋白裂解液(RIPA裂解液：PMSF＝100：1)，置于冰上裂解30min，在12000g，4℃条件下离心20min。弃沉淀取上清，用BCA试剂盒测上清蛋白浓度，所测浓度的1.5倍即为外泌体实际蛋白浓度。将外泌体溶液与胆固醇修饰的miR-124-3p mimic(20μM)混合，外泌体溶液与mimic的混合体积比为：1体积外泌体溶液：1体积×测定的外泌体浓度(μg/μl)/20μl的mimic溶液体积(如每100μl的外泌体溶液加入100μl×外泌体蛋白浓度(μg/μl)/20μl的mimic溶液)。随后，将外泌体和mimic混合体在37℃孵育1h，孵育后转移至超离管中，加入30ml PBS，在120000g、4℃条件下离心70min，所得沉淀即为过表达miR-124的外泌体，用PBS溶解置于-80℃保存。

将原代RAs以3×10⁵铺于六孔板中，培养24h，待汇合达到约60％～70％时，准备进行后续实验。将细胞分为三组，分别为空白对照组(WT)和阴性对照组(NC)以及实验组(miR-124)。WT组不作处理，NC组加入70μg/孔阴性对照外泌体，miR-124组加入70μg/孔过表达miR-124的外泌体，培养48h。

(1)检测miR-124相对表达水平

通过RNA提取试剂盒提取WT组、NC组和miR-124组的总RNA，逆转录为cDNA，逆转录体系为：1000ng总RNA、1μl2.5U/μl Poly A Polymerase、1μl RTase Mix、5μl 5XPAP/RTBuffer，用双蒸水将体系补充至25μl。逆转录反应温度设定为：37℃反应60分钟，85℃反应5分钟，停止反应逐渐降温至4℃。

通过实时荧光定量PCR检测各组miR-124的表达，内参引物为RsnRNAU6(GeneCopoeia,RQP9003)，miR-124-3P引物为rno-miR-124-3P(GeneCopoeia,RQP0074)，均由广州复能公司合成提供。反应体系为：10μl2x多合一qPCR混合物(All-in-one ^TM QpcrMix)，2μl通用接头PCR引物(Universal Adaptor PCR Primer)(2μM)，2μl多合一microRNAqPCR引物混合物(All-in-One ^TM miRNA qPCR Primer)(2μM)，0.4μl 50×Rox参比染料(ROXReference Dye)，2μl cDNA以及3.6μl双蒸水。反应温度设定为：95℃预变性反应10min，然后以95℃变性反应10秒、60℃复性反应20秒、72℃延伸反应10秒为一个循环共反应40个循环。将体系通过AppliedBiosystem 7300Plus Real-time PCR System software进行荧光定量结果分析并通过2^-△△Ct的方法进行结果定量统计。

结果如图4a所示，培养48h后实验组细胞中miR-124显著提升8倍左右，阴性对照组无显著变化，说明外泌体成功将miR-124转运至RAs中。

(2)检测GFAP、SOX9、STAT3相对表达水平

通过RNA提取试剂盒提取RAs(WT组、NC组和miR-124组)的总RNA，逆转录为cDNA，逆转录体系为：500ng总RNA，1μl寡聚胸腺嘧啶18引物(Anchored Oligo(dT)18primer)(0.5μg/μl)，10μl 2×TS反应混合液(TS Reaction Mix)，1μl转运酶混合物(ransScript RT/RIEnzyme Mix)T以及1μl gDNA去除剂(gDNARemover)，用双蒸水将体系补充至20μl。逆转录反应温度设定为：42℃反应15分钟，85℃反应5分钟，停止反应逐渐降温至4℃。通过实时荧光定量PCR检测各组GFAP、SOX9、STAT3的表达，所用引物均由上海生物工程有限公司合成提供，内参选用GAPDH，引物序列为：正向引物(5’-3’)AGACAGCCGCATCTTCTTGT(SEQ ID NO:3)，反向引物(5’-3’)CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT(SEQ ID NO:4)。GFAP引物序列为：正向引物(5’-3’)GGTGGAGAGGGACAATCTCA(SEQ ID NO:5)，反向引物(5’-3’)TGTGAGGTCTGCAAACTTGG(SEQID NO:6)。SOX9引物序列为：正向引物(5’-3’)GTGCTGAAGGGCTACGACTGGA(SEQ ID NO:7)，反向引物(5’-3’)GTTGTGCAGATGCGGGTACTGG(SEQ ID NO:8)。STAT3引物序列为：正向引物(5’-3’)CACAACCTGCGAAGAATCAAG(SEQ ID NO:9)，反向引物(5’-3’)TCTGAACAGATCCACGATCCT(SEQ ID NO:10)。反应体系为：10μl 2×miRNA通用qPCR原料混合物(miRNA UniversalSYBR qPCR Master Mix)，0.4μl特异指定引物(Specific Primer)(10μM)，0.4μl m Qy引物R(QPrimer R)(10μM)，100ng cDNA，用双蒸水将体系补充至20μl。反应温度设定为：95℃预变性反应10min，然后以95℃变性反应10秒、60℃复性反应20秒、72℃延伸反应10秒为一个循环共反应40个循环。将体系通过Applied Biosystem 7300Plus Real-time PCR Systemsoftware进行荧光定量结果分析并通过2^-△△Ct的方法进行结果定量统计。结果如图4b所示，相对于空白对照组和阴性对照组而言，实验组GFAP、SOX9、STAT3相对表达水平显著降低，说明过表达miR-124的外泌体可以有效降低RAs活化水平。

通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测三组细胞GFAP、SOX9、STAT3表达。结果如图4c所示，相对于空白对照组和阴性对照组而言，实验组GFAP、SOX9、STAT3蛋白表达显著下降，表明RAs反应特性降低，瘢痕形成能力减弱。

由以上实施例可知，U-87细胞外泌体可有效与胆固醇修饰的miR-124mimic相结合，并被反应性星形胶质细胞吸收，显著提升反应性星形胶质细胞中miR-124表达，显著降低GFAP、SOX9和STAT3表达，具有抑制星形胶质细胞活化及瘢痕形成的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 含miR-124的胶质瘤细胞外泌体及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uaaggcacgc ggugaaugcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agacagccgc atcttcttgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgccgtgg gtagagtcat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggagagg gacaatctca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgaggtct gcaaacttgg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgctgaagg gctacgactg ga 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttgtgcaga tgcgggtact gg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacaacctgc gaagaatcaa g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctgaacaga tccacgatcc t 21

Claims (4)

1.一种含miR-124的胶质瘤细胞外泌体在制备治疗中枢神经系统损伤疾病的药物中的应用，所述含miR-124的胶质瘤细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)将胶质瘤细胞系培养得到的上清液经固液分离，得到外泌体；

2)将所述外泌体和miR-124混合，共同孵育，得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体；所述miR-124为胆固醇修饰的miR-124-3P mimic；所述外泌体的质量和miR-124的体积比为1000μg：(45～55)μl；

所述miR-124的浓度为18～22μM。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤2)中所述共同孵育的温度为35～38℃；

所述共同孵育的时间为1～1.5h。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述共同孵育后，将孵育产物进行纯化；所述纯化的方法为将孵育产物经固液分离，收集固相，用PBS缓冲液洗涤和重悬，经离心得到含miR-124的胶质瘤细胞外泌体。

4.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，步骤1)中所述固液分离包括离心和过滤；

所述固液分离的方法为将所述上清液依次经2800～3200g和9000～11000g离心力进行离心，收集沉淀后滤膜过滤，再经11500～12500g离心。

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