CN111378617B - 一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法 - Google Patents

一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，包括在添加了细胞因子bFGF和FGF8的neurobasal medium培养基中培养人脐带间充质干细胞的步骤。本发明能够明显增加间充质干细胞的胶质细胞源性神经营养因子分泌量，安全且易产业化。通过细胞因子诱导的方法，而非基因修饰、共培养和条件培养基培养的方法提高其分泌胶质细胞源性神经营养因子的能力，避免了其它方法所带来的风险和不确定性，更适用于产业化和临床应用。与现有文献中所报道的刺激或诱导的技术相比，使用本方法培养间充质干细胞6天后，胶质细胞源性神经营养因子的分泌量较之前培养方法有明显的增多。

Description

一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因 子的方法
技术领域
本发明提供间充质干细胞的培养方法，尤其是一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法。
背景技术
胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是1993年Lin等从大鼠B49胶质细胞系中分离、纯化获得的一种神经营养因子，属于TGF-β超家族。胚胎发育期时它存在于整个中枢神经系统，在成熟的脑组织内主要广泛分布于皮质、海马、纹状体、黑质、丘脑、小脑、胼胝体等部位。胶质细胞源性神经营养因子是一种多效能的神经营养因子，不仅对运动神经元而且对感觉神经元，尤其是对其它神经营养因子相对不敏感的神经元有很强大的神经营养作用，还能够特异性保护多巴胺能神经元，对抗缺血性损害以及促进内源性神经干细胞的增殖和分化。胶质细胞源性神经营养因子在治疗帕金森病、神经损伤以及运动神经元病等神经系统疾病中发挥的有效作用已被大量的体内外试验所证实。近年来研究还发现提高抑郁症患者体内的胶质细胞源性神经营养因子水平可改善患者症状、蛛网膜下腔注射胶质细胞源性神经营养因子能减轻大鼠的神经病理性疼痛，将胶质细胞源性神经营养因子递送到单侧癫痫病灶中还能有效减少癫痫大鼠的自发性反复发作数量等等，胶质细胞源性神经营养因子作为治疗神经系统疾病的潜在性药物越来越受到研究人员的关注。
胶质细胞源性神经营养因子是分子量为24kDa的大分子蛋白，直接静脉使用难以通过血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB),一定程度上限制了其临床应用，因此如何增加胶质细胞源性神经营养因子在中枢神经系统内的有效浓度是研究人员一直致力于解决的问题。近年来大量的动物实验和临床研究表明间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)能够有效治疗一些神经系统疾病，特别是帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性病变、脑血管疾病以及脑脊髓损伤等。探究其作用机制，我们发现其中一个重要机制是间充质干细胞可通过自分泌和旁分泌神经营养因子对神经损伤区域进行营养支持和损伤修复，而胶质细胞源性神经营养因子是其中最重要的神经营养因子之一。此外，间充质干细胞还具有归巢功能，能够通过血脑屏障迁移至损伤部位，增加病变区域胶质细胞源性神经营养因子的浓度。
研究表明间充质干细胞能够分泌胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)等神经营养因子，但对于治疗帕金森病、脊髓侧所硬化症和抑郁症等神经系统疾病，其分泌量还需增加。目前增加间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，主要有：与其它细胞共培养或使用条件培养基；或利用病毒载体将人的外源胶质细胞源性神经营养因子基因导入间充质干细胞中，使其高表达胶质细胞源性神经营养因子。就现有技术而言，虽然胶质细胞源性神经营养因子的分泌量提高了，但仍存在很多安全问题，比如条件培养基的成分不明确、外源基因转染存在异位表达、插入突变、基因片段丢失以及难以控制表达水平等，都限制了其进一步的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，其特征在于，包括：
在添加了碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和成纤维细胞生长因子8(fibroblast growth factor 8,FGF8)的neurobasal medium培养基中培养人脐带间充质干细胞的步骤。
进一步，本发明的提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，还具有这样的特征：
其中，细胞因子bFGF用量为20～100ng/mL、细胞因子FGF8用量为50～150ng/mL。
进一步，本发明的提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，还具有这样的特征：
其中，细胞因子bFGF用量为50ng/mL、细胞因子FGF8用量为100ng/mL。
进一步，本发明的提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，还具有这样的特征：
包括以下步骤：
取P3～P5代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸弃培养上清，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入培养瓶内洗涤后吸弃洗液，共计两次；
2)加入0.125％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液，消化至细胞呈圆形漂起时终止；
3)加入20mL 0.01M磷酸缓冲液PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12培养基重悬细胞，在T75培养瓶中按照1×104/cm2～2×104/cm2接种人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为添加了10％胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h；
5)将培养瓶中的基础培养基吸弃，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
6)加入添加了50ng/mL细胞因子bFGF和100ng/mL细胞因子FGF8的neurobasalmedium培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。
进一步，本发明的提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，还具有这样的特征：
其中，人脐带间充质干细胞的使用来源于骨髓、脂肪、脐血或牙髓组织的间充质干细胞进行替代。
本发明还提供细胞因子bFGF和细胞因子FGF8在制备提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的试剂中的应用。
进一步，本发明的应用，还具有这样的特征:所述细胞因子bFGF的用量为20～100ng/mL、细胞因子FGF8的用量为50～150ng/mL。
本发明的应用，还具有这样的特征:所述细胞因子bFGF用量为50ng/mL、细胞因子FGF8用量为100ng/mL。
本发明还提供细胞因子bFGF和细胞因子FGF8在制备提高来源于骨髓、脂肪、脐血或牙髓中的间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的试剂中的应用。
发明的有益效果：本发明能够明显增加间充质干细胞的胶质细胞源性神经营养因子分泌量，安全且易产业化。选用人脐带间充质干细胞，通过细胞因子诱导的方法，而非基因修饰、共培养和条件培养基培养的方法提高其分泌胶质细胞源性神经营养因子的能力，避免了其它方法所带来的风险和不确定性，更适用于产业化和临床应用。与现有文献中所报道的刺激或诱导的技术相比，使用本方法培养6天每106个人脐带间充质干细胞可分泌的胶质细胞源性神经营养因子可达471.29±80.68pg/mL，较之前基础培养基中检测到的73.56±21.32pg/mL有明显增多。间充质干细胞可以来源于骨髓、脂肪、脐血和牙髓等组织，选择脐带来源的间充质干细胞主要是考虑到其取材方便、操作简单、免疫原性低、体外扩增能力强，短时间即可获得大量临床所需的细胞，因此更适用于产业化和临床应用。
附图说明
图1是本发明实施例一的方法所得到的人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的结果图。
图2是本发明实施例二的方法所得到的人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的结果图。
图3是本发明实施例三的方法所得到的人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并不限于下述实施例。本发明中未详细描述的实验步骤均按照生物技术相应教材例如《分子生物学实验手册》或者商品化试剂盒的说明书进行操作。
<实施例一>
1.人脐带间充质干细胞的培养
1)取P3～5代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸弃培养上清，取10mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
2)加入0.125％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫整个T75培养瓶底部，倒置显微镜下观察细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清终止胰蛋白酶消化；
3)加入20mL 0.01M磷酸缓冲液PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12培养基(ThermoFisher GibcoTM Cat:12500096，按其说明书配制)重悬细胞，在T75培养瓶中按照1～2×104/cm2接种人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为添加了10％胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h；
5)将培养瓶中的基础培养基吸弃，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
6)加入添加了20ng/mL细胞因子bFGF和50ng/mL细胞因子FGF8的neurobasalmedium培养基(ThermoFisher GibcoTM Cat:21103049)，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。每3天补充一次bFGF和FGF8。
2.ELISA检测培养上清中的胶质细胞源性神经营养因子
检测样品为P4～6代人脐带间充质干细胞的培养上清以及更换添加细胞因子bFGF和细胞因子FGF8的neurobasal medium培养基后培养2、4、6和8天的培养上清。结果如图1所示，图中MSC组代表：添加10％胎牛血清的DMEM/F-12培养条件下P4～P6代人脐带间充质干细胞培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的分泌情况；2、4、6和8组分别代表：更换添加细胞因子bFGF和FGF8的neurobasal medium培养基培养人脐带间充质干细胞后2、4、6和8天的培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的分泌情况。
具体方法如下：
1)从冰箱中取出试剂盒(Invitrogen，Cat#EHGDNF 96tests)，平衡到室温；
2)按照说明书要求配制8个标准品备用(单位为pg/mL)；
3)每孔加100uL配制好的标准品或样品，于室温下孵育2.5h。同时，配制1XWashBuffer和BiotinylatedAntibody Reagent工作液：
4)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
5)每孔加100uLBiotinylatedAntibody Reagent工作液，置于摇床上室温下孵育1h；
6)孵育同时，配制Streptavidin-HRP Reagent工作液：
7)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
8)每孔加100uL Streptavidin-HRP Reagent工作液，置于摇床上37℃孵育45min；
9)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
10)每孔中加入100uLTMB Substrate显色底物，置于摇床上37℃下避光孵育至少30min，至观察到显色；
11)每孔中加入50uL Stop Solution，终止反应，立即使用分光光度计在450nm和550nm波长处测定OD值。
12)制作标准曲线后进行结果分析。
<实施例二>
1.人脐带间充质干细胞的培养
1)取P3～5代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸弃培养上清，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
2)加入0.125％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫整个T75培养瓶底部，倒置显微镜下观察细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清终止胰蛋白酶消化；
3)加入20mL 0.01M磷酸缓冲液PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12培养基重悬细胞，在T75培养瓶中按照1～2×104/cm2接种人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为添加了10％胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h；
5)将培养瓶中的基础培养基吸弃，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
6)加入添加了50ng/mL细胞因子bFGF和100ng/mL细胞因子FGF8的neurobasalmedium培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。每3天补充一次细胞因子bFGF和FGF8。
2.ELISA检测培养上清中的胶质细胞源性神经营养因子
检测样品为P4～6代人脐带间充质干细胞的培养上清以及更换添加细胞因子bFGF和FGF8的neurobasal medium培养基后培养2、4、6和8天的培养上清。结果如图2所示，图中MSC组代表：添加10％胎牛血清的DMEM/F-12培养条件下P4～P6代人脐带间充质干细胞培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的分泌情况；2、4、6和8组分别代表：更换添加细胞因子bFGF和FGF8的neurobasal medium培养基培养人脐带间充质干细胞后2、4、6和8天的培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的分泌情况。
具体方法如下：
1)从冰箱中取出试剂盒(Invitrogen，Cat#EHGDNF 96tests)，平衡到室温；
2)按照说明书要求配制8个标准品备用(单位为pg/mL)；
3)每孔加100uL配制好的标准品或样品，于室温下孵育2.5h。同时，配制1XWashBuffer和BiotinylatedAntibody Reagent工作液：
4)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
5)每孔加100uLBiotinylatedAntibody Reagent工作液，置于摇床上室温下孵育1h；
6)孵育同时，配制Streptavidin-HRP Reagent工作液：
7)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
8)每孔加100uL Streptavidin-HRP Reagent工作液，置于摇床上37℃孵育45min；
9)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
10)每孔中加入100uLTMB Substrate显色底物，置于摇床上37℃下避光孵育至少30min，至观察到显色；
11)每孔中加入50uL Stop Solution，终止反应，立即使用分光光度计在450nm和550nm波长处测定OD值。
12)制作标准曲线后进行结果分析。
<实施例三>
1.人脐带间充质干细胞的培养
1)取P3～5代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸弃培养上清，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
2)加入0.125％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫整个T75培养瓶底部，倒置显微镜下观察细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清终止胰蛋白酶消化；
3)加入20mL 0.01M磷酸缓冲液PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12培养基重悬细胞，在T75培养瓶中按照1～2×104/cm2接种人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为添加了10％胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h；
5)将培养瓶中的基础培养基吸弃，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
6)加入添加了100ng/mL细胞因子bFGF和150ng/mL FGF8的neurobasal medium培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。每3天补充一次细胞因子bFGF和FGF8。
2.ELISA检测培养上清中的胶质细胞源性神经营养因子
检测样品为P4～6代人脐带间充质干细胞的培养上清以及更换添加细胞因子bFGF和FGF8的neurobasal medium培养基后培养2、4、6和8天的培养上清。结果如图3所示，图中MSC组代表：添加10％胎牛血清的DMEM/F-12培养条件下P4～P6代人脐带间充质干细胞培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的分泌情况；2、4、6和8组分别代表：更换添加细胞因子bFGF和FGF8的neurobasal medium培养基培养人脐带间充质干细胞后2、4、6和8天的培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的分泌情况。
具体方法如下：
1)从冰箱中取出试剂盒(Invitrogen，Cat#EHGDNF 96tests)，平衡到室温；
2)按照说明书要求配制8个标准品备用(单位为pg/mL)；
3)每孔加100uL配制好的标准品或样品，于室温下孵育2.5h。同时，配制1XWashBuffer和BiotinylatedAntibody Reagent工作液：
4)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
5)每孔加100uLBiotinylatedAntibody Reagent工作液，置于摇床上室温下孵育1h；
6)孵育同时，配制Streptavidin-HRP Reagent工作液：
7)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
8)每孔加100uL Streptavidin-HRP Reagent工作液，置于摇床上37℃孵育45min；
9)孵育结束后，使用自动洗板机，每孔加入300uL 1X Wash Buffer，反复洗板4次。结束后，用吸水纸拍干；
10)每孔中加入100uLTMB Substrate显色底物，置于摇床上37℃下避光孵育至少30min，至观察到显色；
11)每孔中加入50uL Stop Solution，终止反应，立即使用分光光度计在450nm和550nm波长处测定OD值。
12)制作标准曲线后进行结果分析。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，本领域的技术人员可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这些实施例均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取P3～P5代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸弃培养上清，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入培养瓶内洗涤后吸弃洗液，共计两次；
2)加入0.125％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液，消化至细胞呈圆形漂起时终止；
3)加入20mL 0.01M磷酸缓冲液PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12培养基重悬细胞，在T75培养瓶中按照1×104/cm2～2×104/cm2接种人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为添加了10％胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h；
5)将培养瓶中的基础培养基吸弃，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
6)加入添加了50ng/mL细胞因子bFGF和100ng/mL细胞因子FGF8的neurobasal medium培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。
2.细胞因子bFGF和细胞因子FGF8在制备提高人脐带间充质干细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子的试剂中的应用，其特征在于：
1)取P3～P5代人脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸弃培养上清，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入培养瓶内洗涤后吸弃洗液，共计两次；
2)加入0.125％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液，消化至细胞呈圆形漂起时终止；
3)加入20mL 0.01M磷酸缓冲液PBS反复吹打冲洗，在室温下1000转/分离心5分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12培养基重悬细胞，在T75培养瓶中按照1×104/cm2～2×104/cm2接种人脐带间充质干细胞；
4)培养体系为添加了10％胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h；
5)将培养瓶中的基础培养基吸弃，取10～15mL 0.01M磷酸缓冲液PBS加入T75培养瓶内洗涤后吸弃，共计两次；
6)加入添加了50ng/mL细胞因子bFGF和100ng/mL细胞因子FGF8的neurobasal medium培养基，总体积为15mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。
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