ES2235847T3 - Utilizacion de colagenasa en la preparacion de cultivos de celulas madre neuronales. - Google Patents
Utilizacion de colagenasa en la preparacion de cultivos de celulas madre neuronales.Info
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Abstract
Método para la proliferación in vitro de un cultivo de células madre neuronales, en el que dicho método excluye la proliferación de células madre embrionarias humanas, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: (a) obtener un tejido neuronal disociado en una suspensión celular, conteniendo la suspensión una o más células madre neuronales multipotentes capaces de producir una progenie que es capaz de diferenciarse en neuronas y glías; (b) cultivar la suspensión celular en un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar las células madre neuronales de (a) para generar un cultivo de células madre neuronales; y (c) realizar el pasaje del cultivo celular de (b) mediante el tratamiento del cultivo con una cantidad de una preparación de colagenasa eficaz para disociar las células en el cultivo y realizar el pasaje del cultivo celular a un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar adicionalmente el cultivo de células madre neuronales.
Description
Utilización de colagenasa en la preparación de
cultivos de células madre neuronales.
La presente invención reivindica prioridad de la
solicitud de la Patente USA 09/258529, publicada el 26 de febrero de
1999.
La presente invención se refiere de modo general
a un proceso de producción o de fabricación para la proliferación
in vitro y el cultivo de células madre neuronales utilizando
colagenasa para disociar las células cultivadas.
El desarrollo del sistema nervioso central de
mamíferos (CNS) comienza en la etapa inicial del desarrollo fetal y
continúa hasta el periodo post-natal. El CNS del
mamífero maduro se compone de células neuronales (neuronas), y de
células gliales (astrocitos y oligodendrocitos). La primera etapa en
el desarrollo neuronal es el nacimiento celular, que es la secuencia
temporal y espacial precisa, en el que proliferan células madre y la
progenie de células madre (es decir, células hijas y células
progenitoras).
Una característica que identifica una célula
madre es su capacidad de exhibir autorrenovación o de generar más
células iguales a sí misma. Se da una definición de una célula madre
por Potten & Loeffler, 110 Development 1001 (1990) que han
definido las células madre como "células no diferenciadas capaces
de (a) una proliferación, (b) automantenimiento, (c) producción de
un gran número de progenies funcionales diferenciadas, (d) regenerar
el tejido después de una herida, y (e) una flexibilidad de
utilización de estas opciones". El papel de las células madre es
reemplazar células que se han perdido por muerte natural, por
heridas o por enfermedad.
Las patentes USA 5.750.376 y 5.851.832 (ambas de
Weiss) y 5.753.506 (de Johe) se refieren a cultivos in vitro
que contienen células madre neuronales. Las patentes de Weiss se
refieren al cultivo en suspensión y adherente, mientras que Johe se
refiere a cultivos adherentes particulares. Cuando se propagan las
células como neuroesferas en un cultivo en suspensión, durante
3-4 días en presencia de un factor de crecimiento
que induce a la proliferación, una célula madre neuronal
multipotente comienza a dividirse dando lugar a un grupo de células
no diferenciadas que se designan como una "neuroesfera". Las
células de una neuroesfera simple son clónicas por naturaleza porque
son la progenie de una célula madre neuronal simple. En la presencia
continua de uno o más factores de crecimiento que inducen a la
proliferación, tales como EGF, bFGF, o similares (y combinaciones de
los mismos), las células en la neuroesfera continúan dividiéndose
resultando en un incremento de tamaño de la neuroesfera y en el
número de células no diferenciadas. Las células en la neuroesfera
son inmunorreactivas para la nestina, una proteína intermediaria
filamentosa encontrada en muchos tipos de células del CNS no
diferenciadas. Por el contrario, los tipos de células diferenciadas
maduras derivadas a partir de la progenie de la célula madre
neuronal son predominantemente negativas para la nestina.
En la técnica anterior, se han disociado
mecánicamente las células en el grupo mediante trituración para
producir células simples entre pasajes. La trituración, debido a que
es un proceso mecánico, ejerce fuerzas de cizalladura sobre las
células, que pueden reducir la viabilidad celular entre los pasajes.
El objeto de la presente invención es dar a conocer un cultivo
mejorado y un proceso de fabricación que aumenta la viabilidad
celular desde un pasaje a otro y que mantiene la mayoría de células
primitivas (con el potencial mayor de diferenciación y de capacidad
de autorrenovación).
La invención da a conocer un método para la
proliferación in vitro de un cultivo de células madre neuronales
multipotentes, en el que dicho método excluye la proliferación de
células madre embrionarias humanas, utilizando colagenasa para
disociar células en neuroesferas entre pasajes. De acuerdo con el
método de la presente invención, la utilización de colagenasa
resulta en una viabilidad mejorada de cultivo de células madre
neuronales, un aumento del número de células proliferadas en
aquéllos cultivos a lo largo del tiempo, y en un mantenimiento
mejorado de los cultivos celulares, tal como se compara con la
disociación mediante trituración u otros tratamientos enzimáticos
tales como la tripsinización.
Figura 1 muestra una comparación entre el método
de trituración de la técnica anterior para disociar neuroesferas
humanas de proliferación y el método de colagenasa de la invención,
demostrando un número incrementado de células viables a lo largo del
tiempo utilizando el método de colagenasa.
La invención da a conocer un nuevo proceso de
fabricación para la proliferación de cultivos de células madre
neuronales, en el que dicho método excluye la proliferación de
células madre embrionarias humanas, utilizando colagenasa para
disociar neuroesferas (células "agregadas"). Este método
resulta en una viabilidad de cultivo de células madre neuronales
inesperadamente mejorada y en un incremento de número de células
proliferadas a lo largo del tiempo, tal como se compara con los
métodos de trituración y tripsinización de la técnica anterior para
disociar cultivos de células madre neuronales.
En una realización del proceso de fabricación de
la colagenasa, se recogen las células neuroesferas y se centrifugan
(por ejemplo, a 1000 rpm durante 3-5 minutos).
Después de aspirar el medio, se resuspenden las neuroesferas en una
solución de colagenasa (por ejemplo, 1 ml de una solución de 0,5
mg/ml precalentada (37ºC)), y se incuban con la colagenasa. Después
de la incubación, se diluye la suspensión celular en el medio y se
cultivan.
En el método de trituración de la técnica
anterior, se recogieron y centrifugaron células neuroesferas.
Después de aspirar el medio, se resuspendieron las neuroesferas en
\sim200 \mul de medio. Se trituraron las neuroesferas utilizando
una pipeta (por ejemplo, un Pipetman P200 con volúmenes de 75
\mul, 100 veces aproximadamente). Luego, se ha diluido la
suspensión celular en el medio y se ha cultivado.
Colagenasa. Se puede utilizar cualquier
colagenasa que es eficaz para disociar células madre neuronales en
un cultivo, en el proceso de fabricación de la invención. La
"colagenasa" es una enzima que digiere el colágeno proteico de
la matriz extracelular (Harper, 49 Ann. Rev. Biochem. 1063 (1980)).
Una fuente de colagenasa es la bacteria Clostridium
histolyticum. Un ensayo de la colagenasa es una modificación de
Mandl y otros, 32 J. Clin. Invest. 1323 (1953), en la que se incuba
la colagenasa durante 5 horas con colágeno nativo. Se determina la
proporción de descomposición del colágeno utilizando el método
colorimétrico de ninhidrina de Moore & Stein, 176 Biol. Chem 367
(1948). Para la definición de la unidad de colagenasa, una unidad
libera un \mumol de equivalentes de L-leucina a
partir de colágeno durante 5 horas a 37ºC, pH 7,5.
Se pueden utilizar colagenasas crudas para
procedimientos de disociación celular. Las preparaciones de la
colagenasa cruda contienen no solamente varias colagenasas, sino
también una proteasa de sulfhidrilo, clostripaína, una enzima
similar a tripsina, y una aminopeptidasa. En algunas realizaciones,
las preparaciones de colagenasa cruda son preferentes debido a la
presencia de estas actividades adicionales. Esta combinación de
actividades colagenolíticas y proteolíticas es eficaz para
descomponer matrices intercelulares, la parte esencial de la
disociación del tejido. Se inhibe la colagenasa cruda mediante
agentes quelantes de metal tales como cisteína, EDTA u
o-fenantrolina. También se inhibe mediante
alfa-2-macroglobulina, una
glicoproteína grande de plasma. Para la actividad enzimática se
requiere la utilización de Ca^{2+}.
Las fuentes de colagenasa comercialmente
disponibles son útiles en los métodos de la presente invención. Por
ejemplo, la colagenasa purificada contiene actividades proteolíticas
secundarias mínimas, pero con una alta actividad de colagenasa. La
colagenasa purificada puede ser colagenasa H (cat # 1087789) de
Boerhinger Mannheim (Indianápolis, IN). Se prepara una solución de
reserva de 0,5 mg/ml de colagenasa en DPBS que contiene 0,1% de BSA,
y se almacena a -20ºC. Otras fuentes comercialmente disponibles son
Dispase® (Boehringer Mannheim), Liberase® (Boehringer Mannheim) o
colagenasa (Serva). El rango de colagenasa utilizado puede estar
desde 100-1000 \mug/ml (18-180
mU/ml), preferentemente entre 300-700 \mug/ml,
(54-126 mU/ml), siendo el más preferente de 500
\mug/ml (90 mU/ml) aproximadamente.
Los neurobiólogos han utilizado varios términos
de forma intercambiable para describir las células no diferenciadas
del CNS. En la literatura científica, se han utilizado términos
tales como "célula madre", "célula precursora" y "célula
progenitora". Sin embargo, existen diferentes tipos de células
neuronales no diferenciadas, con diferentes características y
destinos. La terminología utilizada para las células neuronales
multipotentes no diferenciadas ha evolucionado de tal modo que
actualmente estas células se nominan "células madre
neuronales". La Patente USA 5.750.376 define la célula "madre
neuronal" proliferada in vitro como "una célula madre
oligopotente o multipotente que es capaz de dividirse sin limite y,
bajo condiciones específicas, puede producir células hijas que se
diferencian terminalmente en neuronas y glías". La capacidad de
una célula en dividirse sin límite y producir células hijas que se
diferencian terminalmente en neuronas y glías son características de
las células madre del CNS. Una célula madre neuronal del CNS es
capaz de automantenerse, lo que significa que con cada división
celular, una célula hija será también una célula madre. Se puede
inducir una célula madre neuronal del CNS a la proliferación
utilizando los métodos de la presente invención.
La progenie de la célula no madre de una célula
madre neuronal puede incluir células progenitoras. Las células
progenitoras generadas de una célula madre neuronal del CNS que es
autorrenovable, multipotente y simple, son capaces de diferenciarse
en neuronas, astrocitos (de tipo I y tipo II) u oligodendrocitos.
Por el contrario, la célula madre neuronal del CNS es
"multipotente" porque su progenie tiene múltiples vías de
diferenciación.
Una "célula progenitora neuronal" es una
célula no diferenciada derivada de una célula madre neuronal del CNS
autorrenovable y multipotente, y no es en sí una célula madre.
Algunas células progenitoras pueden producir una progenie que es
capaz de diferenciarse en más de un tipo celular. Por ejemplo, una
célula O-2A es una célula progenitora glial que da
lugar a oligodendrocitos y astrocitos de tipo II y, por lo tanto, se
podría nombrar una célula progenitora "bipotencial". Una
característica que distingue una célula progenitora es que, a
diferencia de una célula madre, la capacidad de proliferación está
limitada y, por lo tanto, no exhibe un automantenimiento. Se designa
a una vía particular de diferenciación y, bajo condiciones
apropiadas, se diferenciará eventualmente en glías o neuronas.
El término "células precursoras" se refiere
a la progenie de células madre neuronales del CNS autorrenovables y
multipotentes y, por consiguiente, incluye ambas células
progenitoras y células hijas neuronales del CNS autorrenovables y
multipotentes.
Se pueden obtener células madre neuronales del
CNS autorrenovables y multipotentes a partir del tejido neuronal
embrionario, post-natal, juvenil o adulto
(excluyendo el tejido embrionario humano en vista de la ley 23d
EPC). La fuente preferente de tejido neuronal se obtiene a partir de
mamíferos, preferentemente de roedores (por ejemplo, ratones y
ratas) y de primates, siendo el más preferente a partir de humanos
(excluyendo tejidos embrionarios humanos en vista de la ley 23d
EPC). Se dan a conocer por Weiss y otros en las patentes USA
5.750.376 y 5.851.832 un método para el aislamiento, proliferación,
y pasaje de células madre neuronales del CNS autorrenovables y
multipotentes a partir de tejido neuronal humano adulto, mono adulto
(Rhesus),tejido neuronal, tejido neuronal embrionario de
ratón, y de tejido cerebral de ratón juvenil y adulto, incluyendo el
establecimiento de células madre neuronales en el cultivo a partir
de células madre neuronales del CNS, así como la diferenciación de
la progenie de la célula madre neuronal del CNS. Sin embargo, en el
método de la presente invención, se tratan las neuroesferas mediante
colagenasa para disociar las células agregadas, en vez de la
trituración o la tripsinización de acuerdo con los métodos
utilizados por Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376 y
5.851.832 y por Johe en la Patente USA 5.753.506.
Se pueden obtener células madre neuronales del
CNS autorrenovables y multipotentes a partir de tejido donante
excluyendo tejido embrionario humano, mediante disociación de
células individuales a partir de la matriz extracelular contigua del
tejido, tal como se ha descrito por Weiss y otros, en las patentes
USA 5.750.376 y 5.851.832 y por Johe en la Patente USA 5.753.506. Se
elimina el tejido a partir de una región neuronal utilizando un
procedimiento estéril, y las células se disocian en el medio de
cultivo del tejido utilizando cualquier método conocido en el
sector, incluyendo tratamiento con enzimas tales como tripsina,
colagenasa y similar, o mediante la utilización de métodos físicos
de disociación tales como con un instrumento de aguja corta, tal
como se ha descrito por Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376
y 5.851.832. Se centrifugan las células disociadas a baja velocidad,
entre 200 y 2000 rpm, usualmente entre 400 y 1000 rpm, y luego se
resuspenden en un medio de cultivo. Se pueden cultivar las células
neuronales en suspensión o sobre un sustrato fijo. Se siembran las
suspensiones celulares en cualquier recipiente capaz de sostener las
células, particularmente frascos de cultivo, placas de cultivo o
botellas cilíndricas, y más particularmente en frascos pequeños de
cultivo tales como frascos de cultivo de 25 cm^{2}. Se resuspenden
las células cultivadas en suspensión a aproximadamente 5x10^{4} a
1x10^{6} células/ml, preferentemente a 1x10^{6} células/ml
(durante 20 semanas g. w. tejido). Se depositan las células
depositadas sobre un sustrato fijo a aproximadamente
2-3 x 10^{3} 10 células/cm^{2}, preferentemente
a 2,5 x 10^{3} células/cm^{2}.
Se pueden hacer proliferar cultivos de células
madre neuronales tratadas con colagenasa, incluyendo las células
madre neuronales del CNS autorrenovables y multipotentes de las
neuroesferas, tanto sobre sustratos como en suspensión,
preferentemente formando grupos de células no diferenciadas
asociadas que se designan como "neuroesferas". Después del
cultivo en ausencia de un sustrato, las neuroesferas de
proliferación se despegan del fondo del recipiente de cultivo y
tienden a formar grupos de flotación libre característicos de las
neuroesferas. Las células precursoras de proliferación de la
neuroesfera continúan proliferando en suspensión. Las neuroesferas
del cultivo en suspensión pueden realizar pasajes fácilmente para
reiniciar la proliferación. En el método de la invención, se separan
células individuales en las neuroesferas mediante tratamiento de
colagenasa. Luego se depositan las células neuroesferas tratadas con
colagenasa a la densidad deseada para reiniciar la proliferación. Se
suspenden células simples, que provienen de las neuroesferas
disociadas, en un medio de cultivo que contiene el factor de
crecimiento, y un porcentaje de estas células proliferan y forman
nuevas neuroesferas que se componen de modo amplio de células no
diferenciadas. Se puede repetir este proceso de fabricación para
obtener como resultado un incremento logarítmico en el número de
células viables en cada pasaje. Se continúa el procedimiento hasta
que se obtiene el número deseado de
células.
células.
Weiss y otros, en las patentes USA 5.750.376 y
5.851.832, dan a conocer "medio de cultivo que contiene uno o más
factores de crecimiento predeterminados eficaces para inducir la
proliferación de células madre neuronales multipotentes". Sin
embargo, se pueden utilizar medios básicos diferentes incluyendo,
pero sin limitación a los
mismos:
mismos:
D-MEM/F12 (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD);
Ex Vivo 15 (Bio Whittaker, Walkersville,
MD);
Medios básicos progenitores neuronales,
(Clonetics. San Diego, CA); o
combinación de los medios básicos listados
anteriormente.
Se suplementa el medio de cultivo, por lo menos,
con un factor de crecimiento que induce a la proliferación. Tal como
se utiliza en la presente invención, el término "factor de
crecimiento" se refiere a una proteína, péptido u otra molécula
que tiene un efecto de crecimiento, proliferación, diferenciación o
efecto trófico sobre células madre neuronales y/o progenie de
células madre neuronales. Los factores de crecimiento que se pueden
utilizar para inducir a la proliferación incluyen cualquier factor
trófico que permite la proliferación de las células madre neuronales
y de las células precursoras, incluyendo cualquier molécula que se
une a un receptor en la superficie de la célula para ejercer un
efecto trófico o un efecto que induce al crecimiento sobre la
célula. Los factores preferentes de crecimiento que inducen a la
proliferación incluyen miembros de la superfamilia EGF, superfamilia
FGF, y superfamilia TGF^{\alpha}, tales como EGF, anfirregulina,
factor de crecimiento de fibroblasto ácido (aFGF ó
FGF-1), factor de crecimiento de fibroblasto básico
(bFGF ó FGF-2), factor alfa de crecimiento de
transformación (TGF^{\alpha}), factor inhibitorio de leucocito
(LIF), glicostatina C y combinaciones de los mismos. Una combinación
preferente de los factores de crecimiento que inducen a la
proliferación es EGF ó TGF^{\alpha} con FGF-1 ó
FGF-2. Usualmente, se añaden factores de crecimiento
al medio de cultivo a concentraciones que están en un rango de entre
1 fg/ml y 1 mg/ml aproximadamente. Usualmente, las concentraciones
que están entre 1 y 100 ng/ml aproximadamente son suficientes. Se
pueden realizar fácilmente experimentos de titulación simple para
determinar la concentración óptima de un factor de crecimiento
particular.
La optimización de la formulación de los medios
permite un porcentaje más alto de neuroesferas iniciadas a partir de
tejido cerebral primario que se debe establecer. Es preferente la
utilización del medio Ex vivo 15. La optimización de la
formulación de los medios permite también un crecimiento más
consistente de las neuroesferas. Para maximizar el desarrollo de las
neuroesferas, se cultivan típicamente células neuroesferas tratadas
con colagenasa en presencia de LIF, bFGF, EGF, y factor de
supervivencia neuronal, NSF (Cat. CC-4323,
Clonetics, San Diego, CA).
Se presenta en la tabla 1 una formulación típica
de los medios para cultivar cultivos de células madre neuronales
humanas.
Se añade EGF a 100 ml de medio base para cultivos
de células madre neuronales humanas después de filtrar el medio. EGF
es relativamente estable en el medio. Cuando el medio está listo
para su utilización, se añaden FGF-2 y LIF. Las
concentraciones finales de los reactivos de suplemento son:
También se pueden diferenciar cultivos de células
madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando los paradigmas
de diferenciación tal como se ha descrito por Weiss y otros,
patentes USA 5.750.376 y 5.851.832. Por ejemplo, (1) se pueden
diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con
colagenasa mediante una diferenciación rápida después de depositarse
sobre una cubierta de vidrio recubierta con
poli-L-omitina en un medio que
contiene un 0,5% de suero bovino fetal (FBS); (2) se pueden
diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con
colagenasa utilizando neuroesferas disociadas en un medio completo
libre de EGF que contiene un 1% de FBS; (3) se pueden diferenciar
cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa
utilizando neuroesferas simples depositadas sobre cubiertas de
vidrio recubiertas con laminina; (4) se pueden diferenciar cultivos
de células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando
neuroesferas simples disociadas, tratadas con colagenasa, y
depositadas sobre un recipiente de cultivo de 35 mm; (5) se pueden
diferenciar cultivos de células madre neuronales tratadas con
colagenasa utilizando neuroesferas cocultivadas con astrocitos
estriatales. En un método preferente de diferenciación, se depositan
células neuroesferas sobre un sustrato recubierto con laminina en
presencia de FBS. Se prueban las células diferenciadas resultantes
mediante inmunocitoquímica indirecta para la presencia de neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos, por ejemplo, utilizando anticuerpos a
MAP-2, tau-1, neurofilamento 168
kDa, \beta-tubulina, GABA, sustancia P (marcadores
neuronales), GFAP (un marcador astrocito), O4 y MBP (marcadores
oligodendrocitos). Se prevé la identificación de los tres tipos de
las células neuronales.
Se pueden modificar genéticamente los cultivos de
células madre neuronales descritas en la presente invención de
acuerdo con cualquier método adecuado y conocido en el sector,
incluyendo modificación genética in vitro, o generación de
cultivos de células madre neuronales modificadas genéticamente a
partir de mamíferos transgénicos. Se realiza la modificación
genética de células madre neuronales tanto mediante infección con
los retrovirus recombinantes como mediante transfección utilizando
métodos conocidos en el sector (ver, Sambrook y otros, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.
Y., 1989). Se describen métodos para hacer cultivos de células madre
neuronales modificadas genéticamente, por ejemplo, en Weiss, Patente
USA 5.750.376.
Generalmente, el término "modificación
genética" se refiere a la alteración estable o transitoria del
genotipo de una célula precursora mediante la introducción
intencionada de ADN exógeno. El ADN puede ser sintético, o derivado
de una fuente natural, y puede contener genes, porciones de genes, u
otras secuencias útiles de ADN. El término "modificación
genética" incluye varios métodos de activación génica conocidos
en el sector. Ver por ejemplo, patentes USA 5.733.761 y
5.733.746.
En realizaciones concretas, se modifican
genéticamente las células madre neuronales para producir una
molécula biológicamente activa, incluyendo hormonas, enzimas,
neurotransmisores, anticuerpos, citocinas, linfocinas, factores de
crecimiento, factores tróficos, o modificadores de respuesta
biológica. Alternativamente, se modifican genéticamente las células
madre neuronales para dar una función metabólica o inmunológica bajo
implante en un huésped, preferentemente un humano. También puede ser
deseable modificar genéticamente células de modo que segreguen un
producto concreto de factor de crecimiento. El término "producto
de factor de crecimiento" se refiere a una proteína, péptido,
mitogeno, u otra molécula que tiene un efecto de crecimiento, de
proliferación, de diferenciación o efecto trófico (por ejemplo, NGF,
BDNF, las neurotrofinas, CNTF, anfirregulina, FGF-1,
FGF-2, EGF, TGF-_{\alpha},
TGF-_{\beta s}, PDGF, IGF_{S} y las
interleucinas). También, se pueden modificar células progenies de
neuroesferas para expresar un receptor concreto de factor de
crecimiento (por ejemplo, receptor NGF de baja afinidad p75,
receptor CNTF, la familia trk de receptores neurotrofinas,
EGF-R, FGF-R, y receptores
anfirregulina). Se puede realizar ingeniería sobre cultivos de
células madre neuronales tratadas con colagenasa para producir
varios neurotransmisores, receptores neurotransmisores, o enzimas
que sintetizan neurotransmisores.
Se pueden producir cultivos de células madre
neuronales tratadas con colagenasa y transplantar a mamíferos
huéspedes, preferentemente pacientes humanos, para el tratamiento de
varios desórdenes en el sistema nervioso central ("CNS") de
forma sistemática. Se envían las células al sujeto mediante
cualquier medio adecuado conocido en el sector. Si se envía al
sistema nervioso central, entonces se administran las células a una
región particular utilizando cualquier método que mantiene la
integridad de los alrededores del cerebro, preferentemente mediante
cánula de inyección. Son preferentes los métodos de inyección
descritos como ejemplos en Duncan y otros, 17 J. Neurocytology
351-361 (1988), y mejorados y modificados para su
utilización en humanos. También se pueden emplear métodos para la
inyección de suspensiones celulares, tales como fibroblastos, en el
CNS para la inyección de células precursoras neuronales. Se pueden
encontrar enfoques y métodos adicionales en Neural Grafting in
the Mammalian CNS, Bjorklund & Stenevi, eds. (1985).
Se pueden producir y transplantar cultivos de
células madre neuronales tratadas con colagenasa utilizando los
procedimientos anteriores para tratar varios desórdenes
neurodegenerativos. Los desórdenes del CNS de este tipo comprenden
aflicciones numerosas tales como enfermedades neurodegenerativas
(por ejemplo, Alzheimer y Parkinson), herida cerebral aguda (por
ejemplo, golpe, herida en la cabeza, parálisis cerebral) y un gran
número de disfunciones del CNS (por ejemplo, depresión, epilepsia, y
esquizofrenia). En los últimos años la enfermedad neurodegenerativa
se ha convertido es una preocupación importante debido a la
expansión de la población de mayor edad que están en un gran riesgo
para estos desórdenes. Estas enfermedades, que incluyen la
enfermedad del Alzheimer, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de
Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de
Parkinson, han estado relacionadas con la degeneración de células
neuronales en sitios particulares del CNS, induciendo a la
incapacidad de estas células o de la región cerebral para llevar a
cabo su función pretendida. En la preparación de la maduración,
proliferación y diferenciación en uno o más linajes seleccionados a
través de diferentes factores de crecimiento específicos, se pueden
utilizar las células progenitoras como una fuente de células
comprometidas. En una serie de realizaciones, se pueden producir y
transplantar cultivos de células madre neuronales tratadas con
colagenasa utilizando los procedimientos anteriores para el
tratamiento de enfermedades de desmielinización. Se puede utilizar
cualquier método adecuado para el implante de células que están
cerca de las dianas desmielinizadas de modo que se pueden asociar
las células con los axones desmielinizados.
Se pueden utilizar también cultivos de células
madre neuronales preparadas de acuerdo con la presente invención
para producir una variedad de tipos de células sanguíneas,
incluyendo células mieloides y linfoides, así como células
hematopoiéticas precoces (ver, Bjornson y otros, 283 SCIENCE 534
(1999)).
Se pueden utilizar cultivos de células madre
neuronales tratadas con colagenasa cultivadas in vitro para
el análisis de compuestos potenciales neurológicamente terapéuticos.
Se pueden aplicar estos compuestos a células en cultivo a varias
dosis, y se controla la respuesta de las células para varios
periodos de tiempo. Se pueden analizar las características físicas
de las células mediante la observación de la célula y del
crecimiento axónico con el microscopio. Se puede analizar la
inducción de expresión de niveles nuevos o incrementados de
proteínas tales como enzimas, receptores y otras moléculas de
superficie celular, o de neurotransmisores, aminoácidos,
neuropéptidos y aminas biogénicas, con cualquier técnica conocida en
el sector que pueda identificar la alteración del nivel de las
moléculas de este tipo. Estas técnicas incluyen la
inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra moléculas de este
tipo, o el análisis bioquímico. El análisis bioquímico de este tipo
incluye ensayos de proteína, ensayos enzimáticos, ensayos de unión
de receptor, ensayos de inmunoabsorbencia (ELISA) relacionada por
enzimas, análisis electroforético, análisis con cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), ensayo "Western blot", y
ensayos radioinmunes (RIA). Se puede utilizar el análisis del ácido
nucleico tal como ensayo "Northern blot" para examinar los
niveles de codificación de ARNm para estas moléculas, o para enzimas
que sintetizan estas moléculas. Alternativamente, se pueden
transplantar células tratadas con estos compuestos farmacéuticos a
un animal, y se pueden examinar su supervivencia y su capacidad para
formar conexiones neuronales, y las características bioquímicas e
inmunológicas tal como se ha descrito previamente.
Se pueden utilizar los cultivos de células madre
neuronales tratadas con colagenasa en métodos para determinar el
efecto de agentes biológicos sobre células neuronales. El término
"agente biológico" se refiere a cualquier agente, tal como un
virus, proteína, péptido, aminoácido, lípido, hidrato de carbono,
ácido nucleico, nucleótido, medicamento, promedicamento u otra
sustancia que pueda tener un efecto sobre células neuronales ya sea
un efecto nocivo, beneficioso u otro distinto. Los agentes
biológicos que son beneficiosos a las células neuronales se refieren
en la presente invención como "agentes neurológicos", un
término que comprende cualquier sustancia biológica o
farmacéuticamente activa que puede ser potencialmente útil para la
proliferación, diferenciación o funcionamiento de células del CNS o
para el tratamiento de enfermedad o desorden neurológico. Para
determinar el efecto de un agente biológico potencial sobre células
neuronales, se obtiene un cultivo de los cultivos de células madre
neuronales tratadas con colagenasa y se proliferan in vitro
en presencia de un factor de crecimiento que induce a la
proliferación. Generalmente, se solubilizará el agente biológico y
se añadirá al medio de cultivo en varias concentraciones para
determinar el efecto del agente en cada dosis. Se puede rellenar el
medio de cultivo con el agente biológico cada dos días en cantidades
suficientes para mantener algo constante la concentración del
agente.
Por consiguiente, es posible realizar un estudio
para agentes biológicos que aumentan la capacidad de proliferación
de células progenitoras que sería útil para generar un gran número
de células para finalidades de implante. También es posible realizar
un estudio para agentes biológicos que inhiben la proliferación de
células precursoras, utilizando cultivos de células madre neuronales
tratadas con colagenasa. Además, la capacidad de varios agentes
biológicos en aumentar, desminuir o modificar de otro modo el número
y la naturaleza de células neuronales diferenciadas se puede
estudiar en cultivos de células madre neuronales tratadas con
colagenasa que se han inducido para la diferenciación. Luego se
pueden determinar los efectos de un agente biológico o combinación
de agentes biológicos sobre la diferenciación y la supervivencia de
células neuronales diferenciadas. También, y previamente a la
diferenciación, es posible determinar los efectos de los agentes
biológicos sobre el proceso de diferenciación mediante su aplicación
a cultivos de células madre neuronales tratadas con colagenasa.
Otras características, objetivos y ventajas de la
invención serán aparentes a partir de la descripción y a partir de
las reivindicaciones. En la descripción y las reivindicaciones
adjuntas las formas singulares incluyen referentes plurales excepto
si el contexto dicta claramente lo contrario. A menos que sea
definido lo contrario, todos los términos técnicos y científicos
utilizados en la presente invención tienen el mismo significado tal
como se entiende comúnmente por un técnico en la materia a la que
pertenece esta invención. Se presentan los siguientes ejemplos para
describir más completamente las realizaciones preferentes de la
invención. Estos ejemplos no se deben entender de ningún modo como
limitantes al ámbito de la invención, tal como se define por las
reivindicaciones adjuntas.
- 1.
- Aclarar el tejido varias veces con solución salina tamponada con fosfato libre de Ca^{++} y Mg^{++} (PBS).
- 2.
- En una placa petri, cortar el tejido en piezas cúbicas de 1-2 mm utilizando bisturís cruzados. Verter el tejido (volumen comprimido de \sim7,5 ml) y PBS (\sim8 ml) en un tubo de centrifugación de 50 ml. Aclarar la placa con PBS tanto como sea necesario para eliminar el tejido, y transferir al tubo de centrifugación.
- 3.
- Centrifugar los tubos suavemente para sedimentar el tejido y las células libres (< 1000 rpm).
- 4.
- Eliminar con cuidado el sobrenadante utilizando una línea de vacío.
- 5.
- Hasta 1,0 gr de tejido, añadir 5,0 ml de 0,1% de colagenasa, 0,1% de hialuronidasa en HBSS sin Ca^{++}, Mg^{++} que contiene 1,0% de albúmina de suero bovino (BSA).
- 6.
- Incubar en baño maría a 37ºC con agitación ligera ocasional durante 1 hora. Al final de la hora, realizar un vórtice durante 3 s aproximadamente, y evaluar la disociación del tejido. Si permanecen grandes piezas de tejido intacto, continuar la incubación a 37ºC durante otros 30-45 min. Poner el tubo recto durante 1-2 minutos para permitir la deposición de los agregados de las células grandes. Transferir el sobrenadante a un tubo fresco (1).
- 7.
- Rellenar hasta arriba el tubo fresco (1) con PBS + 0,1% de BSA y centrifugar a 900 rpm aproximadamente durante 6 min. Eliminar el sobrenadante, que debería ser turbio con restos, a un tubo fresco de centrifugación de 50 ml (2). Recentrifugar ambos tubos (1) y (2) a 900 rpm.
- 8.
- Quitar el sobrenadante del tubo (1) y examinar el gránulo del tubo (2) para células viables. Si es útil, combinar las células granuladas del tubo (2) con los contenidos del tubo (1). Rellenar el tubo con PBS + 0,1% de BSA y hacer girar durante 6 minutos a 900 rpm, eliminando el sobrenadante al finalizar el vórtice. Resuspender las células en PBS y realizar el contaje con azul tripan. En esta etapa, la suspensión celular debería estar relativamente libre de restos, y debería consistir predominantemente en células sanas.
El tratamiento de colagenasa realizado ha
aumentado el número de células madre neuronales viables utilizando
el método de colagenasa. Se realiza el contaje de las células en
azul tripan sobre hemocitómetro. Un contaje en bruto es el número de
células vivas en un área definida.
El tratamiento de colagenasa realizado ha
aumentado el número de células madre neuronales proliferadas a lo
largo del tiempo utilizando el método de colagenasa.
Se ha presentado la descripción anterior
solamente para los propósitos de descripción y no se pretende
limitar la invención de la forma precisa descrita, pero sí mediante
las reivindicaciones adjuntas.
Claims (19)
1. Método para la proliferación in vitro
de un cultivo de células madre neuronales, en el que dicho método
excluye la proliferación de células madre embrionarias humanas,
comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
- (a)
- obtener un tejido neuronal disociado en una suspensión celular, conteniendo la suspensión una o más células madre neuronales multipotentes capaces de producir una progenie que es capaz de diferenciarse en neuronas y glías;
- (b)
- cultivar la suspensión celular en un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar las células madre neuronales de (a) para generar un cultivo de células madre neuronales; y
- (c)
- realizar el pasaje del cultivo celular de (b) mediante el tratamiento del cultivo con una cantidad de una preparación de colagenasa eficaz para disociar las células en el cultivo y realizar el pasaje del cultivo celular a un medio de cultivo que contiene, por lo menos, un factor de crecimiento que induce a la proliferación para hacer proliferar adicionalmente el cultivo de células madre neuronales.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
el porcentaje de viabilidad de las células en el cultivo es, por lo
menos, de 60%.
3. Método, según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la cantidad de la preparación de
colagenasa está entre 18-180 mU/ml.
4. Método, según la reivindicación 3, en el que
la cantidad de la preparación de colagenasa está entre
54-126 mU/ml.
5. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que la preparación de
colagenasa comprende adicionalmente, por lo menos, una molécula
seleccionada del grupo que consiste en proteasa de sulfidrilo,
clostripaína, aminopeptidasa, o combinaciones de las mismas.
6. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la preparación de colagenasa
es sustancialmente pura, y contiene una actividad proteolítica
secundaria mínima.
7. Método, según la reivindicación 1, en el que
el factor de crecimiento que induce a la proliferación es
seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento
epidérmico, anfirregulina, factor de crecimiento de fibroblasto
ácido, factor de crecimiento de fibroblasto básico, factor alfa de
crecimiento de transformación, factor inhibitorio de leucocitos
(LIF), glicostatina C y combinaciones de los mismos.
8. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de células madre
neuronales comprende células madre neuronales modificadas
genéticamente.
9. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa
de diferenciación del cultivo de células madre neuronales de (c)
para producir un cultivo celular que comprende células neuronales
diferenciadas seleccionadas del grupo que consiste en astrocitos,
neuronas, oligodendrocitos, y combinaciones de los mismos.
10. Método, según la reivindicación 1 o la
reivindicación 9, que comprende adicionalmente poner en contacto el
cultivo de células madre neuronales con un agente biológico, y
determinar los efectos del agente biológico sobre células en el
cultivo.
11. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de células madre
neuronales es un cultivo en suspensión o un cultivo en
adherencia.
12. Método, según la reivindicación 2, en el que
el porcentaje de viabilidad de las células en el cultivo es, por lo
menos, de 75% después de realizar el pasaje.
13. Método, según la reivindicación 2, en el que
el porcentaje de viabilidad de las células en el cultivo es, por lo
menos, de 85% después de realizar el pasaje.
14. Método, según la reivindicación 1, en el que
se realiza el pasaje del cultivo celular semanalmente y en el que
existe, por lo menos, un incremento de tres veces en el número de
células entre los pasajes semanales.
15. Método, según la reivindicación 14, en el que
existe, por lo menos, un incremento de cinco veces en el número de
células entre los pasajes semanales.
\newpage
16. Método, según la reivindicación 14, en el que
se puede ampliar el número de células acumuladas desde 10^{6}
células hasta, por lo menos, 10^{9} células en menos de 49
días.
17. Método, según la reivindicación 16, en el que
se puede ampliar el número de células acumuladas desde 10^{6}
células hasta, por lo menos, 10^{9} células en menos de 42
días.
18. Método, según la reivindicación 14 ó 16, en
el que el cultivo de células madre neuronales es un cultivo en
suspensión o un cultivo en adherencia.
19. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de células madre
neuronales comprende células madre neuronales humanas.
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