CN101548008A - 失活的人工抗原提呈细胞的制备及其在细胞疗法中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了处理失活的人工抗原提呈细胞(aAPC)的方法和对选定的抗原性肽具有特异性的人工抗原提呈细胞，包括它们的产生和在包含活化的细胞毒性T淋巴细胞的细胞治疗组合物中的用途。有利的是，通过交联产生失活的aAPC，例如经由包括补骨脂素衍生物和UVA照射的光反应。

Description

失活的人工抗原提呈细胞的制备及其在细胞疗法中的用途
发明领域
一般地说，本发明涉及通过交联失活人工APC从而处理细胞疗法的方法，所述细胞疗法用于治疗疾病、障碍或医学病症，如癌症。
发明背景
为利于了解本发明，本章节论述导致产生本发明的历史背景和技术背景，包括可能为发明人特有的观测、结论和观点。因此，本文的背景陈述不应被解释为关于先有技术内容的认可。
已开发出许多疗法来治疗多种癌症。许多工作集中于化疗方案。在一个为转移性黑素瘤治疗设计的具体的联合化疗方案中，采用“Dartmouth方案”(DTIC、顺铂、BCNU和他莫昔芬的组合)报道了35-50％的响应率，但存活持续时间保持在6-10个月。还有报告积极的高剂量强度化疗(Hryniuk等人，J.Clin.Oncol.第4卷，1162-1170页(1986))和采用自体骨髓移植的造血作用补充的高缓解率。尽管如此，平均存活期还是较短，约为4个月(Herzig，High-Dose Cancer Therapy： Pharmacology，Hematopoietins，Stem Cells(Armitage和Antman编辑)，Williams and Wilkins(Baltimore)，750-754页(1992))。
已在经历某些免疫疗法的小部分黑素瘤患者中注意到若干年存活的显著改善。免疫疗法包括采用癌症疫苗的主动特异性免疫疗法，以及使用免疫系统的非特异性加强剂，例如白介素-2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)Saunders(Philadelphia)，57-69页(1995)；Mitchell等人，J.Clin.Oncol.，第12卷，402-411页(1994))。另参见美国专利申请公布号US2003/0022820。
鉴定黑素瘤中限于T-细胞的肿瘤抗原已产生通过尝试增大抗原特异性细胞免疫应答靶向癌细胞的临床实验。该方案已以多种接种策略被推行，其中抗原在免疫原性背景中被递送，试图在体内诱导有效的T细胞应答。尽管已在疫苗实验中观察到某些临床反应，但所诱导的T细胞应答的程度一般来说较低或不可检测，且与临床反应的关联差。用癌症抗原免疫黑素瘤患者可增加循环CTL前体数；然而，其与临床肿瘤退化无关联，提示在体内无功能或未活化。
在小鼠肿瘤模型中的研究已证实，包含体外免疫对一种或多种肿瘤抗原特异性的T细胞的过继免疫疗法可能以最小毒性生效。应用该策略治疗人肿瘤的障碍是鉴定使肿瘤细胞对CTL介导的破坏敏感的免疫原性抗原。由黑素瘤患者分离肿瘤反应性T细胞已导致鉴定出一些CTL所针对的肿瘤抗原(表位)。这些抗原包括酪氨酸酶、MART-1/Melan A、gp100和MAGE。其中，酪氨酸酶和MART-1在黑素瘤上几乎普遍表达，因此代表了用于过继免疫疗法的所需靶标选择(Van der Bruggen等人，Science，第254卷，1643-1647页(1991)；Gaugler等人，J.Exp.Med.第179卷，921-930页(1994)；Kawakami等人，J.Exp.Med.，第180卷，347-352(1994)；Brichard等人，J.Exp.Med.，178卷：489-495，1993；Robbins等人，Cancer Res.54：3124-3126，1994；Bakker等人，J.Exp.Med.第179卷，1005-1009页(1994)；Wolfel等人，Eur.J.Immnol.第24卷，759-764页(1994)；和Visseren等人，J.Immunol.第154卷，3991-3998页(1995))。
过继T细胞疗法包括由其中致耐受机制在癌症患者体内有活性的宿主环境中除去T细胞，并促成在该患者群体中证实的无效响应。可离体刺激CD8+T细胞，以产生抗原特异性CTL(参见例如美国专利号6,225,042)。早期的过继免疫治疗方案使用活化的淋巴细胞作为多种癌症的治疗(Rubin等人Biological Approaches to Cancer Treatment Biomodulation(Mitchell编辑)，McGraw-Hill(New York)，379-410页(1993))。最初使用淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)，后来使用以IL-2离体活化的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，但功效证明不可靠。这些早期受控的临床实验不能表明使用离体活化的细胞超越直接给予黑素瘤患者IL-2的优势。Yee等人在Fred Hutchinson癌症研究中心的近期研究(Yee等人，PNAS，第99卷，16168-16173页，(2002))和Dudley等人在NCI的近期研究(Dudley等人，Science，第298卷，850-854页，(2002))已证实了某些过继T细胞治疗方案的潜力。这些研究包括使用对MART-1或gp100和低剂量IL-2特异性的T细胞克隆，或者使用以异源饲养细胞和高剂量IL-2离体扩增的TIL。这些研究证实，过继免疫疗法保留了作为癌症治疗的希望，尽管其充分发展受到没有可重复的方法用于离体产生治疗数量的抗原特异性CD8+CTL的阻碍(Oelke等人，Nat.Med.，第9卷：619-624(2003))。
溶细胞的或细胞毒性的CD8+T细胞是抗病毒感染的主要防御细胞系。CD8+淋巴细胞特异性识别并裂解用病毒感染的宿主细胞。尽管应当希望控制CTL的细胞毒活性，但几乎没有得到特异性活化CTL的体外/离体方法。关键的黑素瘤相关抗原的鉴定和特异性体外活化CTL的方法允许有效评价用于转移性黑素瘤的过继免疫疗法(除了以上的Yee等人、Dudley等人以及Oelke等人(出处同上)之外，参见Leturcq等人，“Ex Vivo Generation of Potent Cytotoxic T Lymphocytesfor the Treatment of Cancer：A Novel Antigen Presentation System”，Society of Biological Therapy 17th Annual Meeting，Abstract #40(2002))。
尽管有可能使用天然抗原提呈细胞(APC)进行体外原初T细胞活化(例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞或自体肿瘤细胞)，但活化效率低，因为天然APC的MHC分子包含许多其它肽表位，由此使选定表位的提呈最低。这些被提呈的肽大部分代表正常的、无害的内源蛋白。针对该问题的更直接方法应是活化与对抗疾病相关的那些表位特异性的CD8+T细胞。
已利用果蝇(Drosophila melanogaster)胚细胞系开发了一个为xAPC的人工APC，其表达主要组织相容性复合体(MHC)I类分子(Leturcq等人，出处同上；Jackson等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，第89卷，12117-12121页(1992)；另参见美国专利号6,225,042和6,355,479)。因为果蝇没有高级免疫系统，所以没有人TAP-1和2肽转运体的果蝇同源物，所述人TAP-1和2肽转运体涉及将肽表位载入人MHC分子中。因此，转染的I类分子和II类分子在果蝇细胞表面上显现为空壳。通过使采用MHC I类或MHC II类编码表达载体转染的果蝇细胞与结合特定MHC分子(即肿瘤抗原T细胞肽表位)的外源合成肽温育，所有可利用的MHC分子都可以被MHC限制性特定肽表位占据。具体地说，提呈单个或多个表位的MHC I类分子的高密度表达，以及将关键的共刺激分子B7-1(CD80)、CD70、LFA-3(CD58)和ICAM-1(CD54)加至这些果蝇APC上，可允许体外产生有效的自体细胞毒性CD8+T细胞，其对选定肽是特异性的(Cai等人，Immunol.Rev.，第165卷，249-265页(1998))。
已开发了细胞疗法的多种改良。参见例如以下的专利公开：美国专利号5,314,813、5,529,921、5,827,737、6,001,365、6,225,042、6,251,627、6,255,073、6,362,001、6,461,867、6,790,662和6,828,150；WO 2002/065992和2002/092773；和EP 814,838。例如，已在晚期恶性黑素瘤患者中进行了3个临床研究(称为CTL-01、CTL-02和CTL-03)，其中自体CD8+T细胞分离自所述患者，离体刺激并扩增，然后作为抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)返回至患者。可重复地离体产生有效的抗原特异性CTL的能力包括采用以人HLA I类共刺激和粘附分子转染的胚果蝇细胞系(SC2)的初始刺激，所述分子对最优的T细胞活化很重要。转染细胞用作人工抗原提呈细胞，以刺激原初CD8+T细胞，从而将它们送至对靶细胞具有细胞毒活性的效应细胞，所述靶细胞表达针对其在体外免疫CTL的蛋白。在这些临床研究中已使用两种不同的人工APC细胞系。一种表达HLA-A2、B7.1和ICAM(克隆666)，另一种表达这三种相同分子，加上B7.2和LFA-3(克隆668)。
已用基于果蝇的APC开发了正进行临床研究的细胞治疗产品，称为CTL-04。该细胞治疗产品是用离体活化的自体CD8+ CTL制备的自体免疫治疗性产物或产品，所述CTL对来自黑素瘤相关抗原的至多6种选定的HLA-A2.1-限制性肽表现出肽特异性，所述黑素瘤相关抗原通过列于SEQ ID NO：5、6、7、8、9和70的序列来鉴定。细胞治疗产品的活性组分是患者自身的CD8+细胞，其已通过接触加载选定肽的aAPC被离体活化，对以上提供的SEQ ID NO.中列出的6种HLA-A2.1限制性肽中的至少一种具有特异性。这些CTL：来源于在临床场所收集的淋巴单采样品分离的自体原初T细胞；使用人工的失活果蝇细胞作为APC针对黑素瘤抗原肽表位离体致敏；在白介素-2(IL-2)和白介素-7(IL-7)存在下通过用加载黑素瘤抗原性表位的自体单核细胞再刺激来扩增，接着使用
Figure A200780044507D0011111129QIETU
进行非特异性扩增；收集，洗涤，重悬浮在最终的输注用制剂中；输注入患者体内。用于再输注的终产品包含在300mL乳酸盐化林格氏注射溶液(76％v/v)、5％葡萄糖的生理盐水溶液(D5NS)(4％v/v)和人血清白蛋白(HSA)(20％v/v)中的1-10×109个CTL细胞。
当然，如同任何药物一样，重要的是确保治疗产品的安全性和功效。因此，在细胞治疗产品如CTL-04被放行用于临床用途之前，通常进行多种质量保证测试。例如，可通过基于PCR的技术测试细胞治疗产品，以证实没有果蝇DNA。另外，可对该产品进行RT/PCR，以证实没有已知的内源昆虫特异性RNA病毒，例如果蝇野田村病毒(Drosophila Nodavirus)(DrNV)；果蝇X病毒(DXV)和果蝇HPS-1样病毒。而且，可使用BacT/
Figure A200780044507D0011111147QIETU
测试过程中的无菌性和成品的无菌性。在美国专利申请公布号US 2006/0159667中提到NIH输血医学部对真菌、细菌和内毒素含量的细胞产品的无菌测试。
尽管这类细胞治疗剂安全有效，但仍需要进一步开发更加确保为安全有效的细胞治疗剂，尤其是考虑到FDA将这样的细胞治疗剂重新分类为异体移植产品。该分类要求一类单独的指引，其包括作为异体移植产品的药品的特别叙述、对受体和密切的身体接触者的可能的动物传染风险、在接受治疗后禁止器官或血液捐赠以及建立长期的监测程序，以确定晚期毒性是否由于所述治疗剂而发生。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及离体产生用于给予患者的活化T淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤：用核酸交联剂失活人工抗原提呈细胞(aAPC)；使分离自诊断患有疾病或障碍的患者的T淋巴细胞与所述失活的人工抗原提呈细胞接触；并收集T淋巴细胞，用于返回该患者。在该实施方案的一个方面，交联剂为补骨脂素衍生物，所述失活步骤包括使采用补骨脂素衍生物处理的人工抗原提呈细胞暴露于光活化剂量的UVA辐射。优选地，补骨脂素衍生物为补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)、4’-(氨基甲基)-4，5’，8-补骨脂素(AMT)或amotosalen(S59)。还优选在交联剂为补骨脂素衍生物的情况下，失活步骤包括使采用1-100μg/ml浓度的补骨脂素衍生物处理后的人工抗原提呈细胞暴露于1-100焦耳/cm2UVA照射剂量的UVA辐射持续1-60分钟。
该实施方案的方法可以离体方法用于治疗癌症和属于本发明范围的典型癌症，这些方法进一步包括使人工抗原提呈细胞载荷至少一种癌症相关肽抗原的步骤。此外，活化的T淋巴细胞优选对表达所述肽的靶细胞有细胞毒性，所述肽选自黑素瘤癌症相关肽抗原、卵巢癌相关肽抗原、乳癌相关肽抗原、肺癌相关肽抗原、白血病-、多发性骨髓瘤-和淋巴瘤-相关肽抗原以及前列腺癌相关肽抗原。优选的肽是那些包含MART-1、酪氨酸酶、gp100、NY-ESO-1、MUC-1、CA-125、Her-2、存活素、端粒酶、CAMEL、CEA、livin、SART-1、SCP-1、SSX-2、PRAME、C-凝集素、Pec60、AES、MAGE-3、G250、FBP、SSX-4、SP17、hTRT、MUC-16、MAGE-1、拓扑异构酶II、整联蛋白β8亚基前体、MUC-1、MAGE-B2、STAT1、γ-连环蛋白或H-RYK的氨基酸序列的至少8个连续抗原性氨基酸的肽。还更优选使用一种或多种选自以下的肽：SILSLKEAST(SEQ ID NO：1)、KMASRSMRL(SEQ IDNO：2)、ALALAALLVV(SEQ ID NO：3)、ALLVVDREV(SEQID NO：4)、YMNGTMSQV(SEQ ID NO：5)、YMDGTMSQV(SEQ IDNO：6)、ITDQVPFSV(SEQ I DNO：7)、YLEPGPVTA(SEQ ID NO：8)、AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)、ELAGIGILTV(SEQ ID NO：10)、CLTSTVQLV(SEQ ID NO：11)、HLYQGCQVV(SEQ ID NO：12)、KIFGSLAFL(SEQ ID NO：13)、IISAVVGIL(SEQ ID NO：14)、PLTSIISAV(SEQ ID NO：15)、VMAGVGSPYV(SEQ ID NO：16)、VLVKSPNHV(SEQ ID NO：17)、ELVSEFSRM(SEQ ID NO：18)、YLSGANLNL(SEQ ID NO：19)、GPLTPLPV(SEQ ID NO：20)、SLLMWITQC(SEQ ID NO：21)、KALFAGPPV(SEQ ID NO：22)、YLETFREQV(SEQ ID NO：23)、GLQSPKSPL(SEQ ID NO：24)、VLLKLRRPV(SEQ ID NO：25)、ELYIPSVDL(SEQ ID NO：26)、SLLMWITQV(SEQ ID NO：27)、ILAKFLHWL(SEQ ID NO：28)、STAPPVHNV(SEQ ID NO：29)、FLWGPRALV(SEQ ID NO：30)、FMWGNLTLA(SEQ ID NO：31)、RLVDDFLLV(SEQ ID NO：32)、HLSTAFARV(SEQ ID NO：33)、QLSLLMWIT(SEQ ID NO：34)、ELWTHSYKV(SEQ ID NO：35)、KVAELVHFL(SEQ ID NO：36)、YIFATCLGL(SEQ ID NO：37)、HLYIFATCL(SEQ ID NO：38)、MLMAQEALAFL(SEQ ID NO：39)、STLEKINKT(SEQ ID NO：40)、KASEKIFYV(SEQ ID NO：41)、SLLMWITQCFL(SEQ ID NO：42)、ELTLGEFLKL(SEQ ID NO：43)、LTLGEFLKL(SEQ ID NO：44)、SLLEKREKT(SEQ ID NO：45)、TLGEDDPWL(SEQ ID NO：46)、KLGLKPLEV(SEQ ID NO：47)、YLWTSAKNT(SEQ ID NO：48)、STAPPAHGV(SEQ ID NO：49)、GMGSEELRL(SEQ ID NO：50)、SLGSPVLGL(SEQ ID NO：51)、YLFFYRKSV(SEQ ID NO：52)、CQQEETFLL(SEQ ID NO：53)、TLAKFSPYL(SEQ ID NO：54)、NLTHVLYPV(SEQ ID NO：55)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：56)、SLLQHLIGL(SEQ ID NO：57)、FLDQRVFFV(SEQ ID NO：58)、FLDQRVFVV(SEQ ID NO：59)、FLDQVAFVV(SEQ ID NO：60)、GLDREQLYL(SEQ ID NO：61)、VMQHLLSPL(SEQ ID NO：62)、QQTHGITRL(SEQ ID NO：63)、LQPLSGPGL(SEQ ID NO：64)、TLDRDSLYV(SEQ ID NO：65)、QLYLELSQL(SEQ ID NO：66)、KVLEYVIKV(SEQ ID NO：67)、KVADLVGFL(SEQ ID NO：68)、KTWGQYWQV(SEQ ID NO：70)和VLDGLDVLL(SEQ ID NO：71)。
用于本发明方法的优选肽混合物包括至少一种选自以下的肽：YMNGTMSQV(SEQ ID NO：5)、ITDQVPFSV(SEQ ID NO：7)、AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)、ELAGIGILTV(SEQ ID NO：10)、SLLMWITQV(SEQ ID NO：27)、FLWGPRALV(SEQ ID NO：30)、TLAKFSPYL(PRAME；SEQ ID NO：54)和VLDGLDVLL(SEQ IDNO：71)。
在该实施方案的进一步优选的方法中，所述方法包括由患者的白细胞单采样品(a leukopheresis sample)(也称为单采样品(a pheresissample))分离T细胞，用于所述接触步骤；并给予所述患者有效量的、所述收集步骤收集的T淋巴细胞。而且，该方法还可以包括再刺激所述活化的T淋巴细胞，然后实施所述给予步骤，所述再刺激程序包括：使活化的T淋巴细胞接触至少一种细胞因子，由此促进活化的T细胞增殖；将活化的T细胞与照射后的自体非CD8+细胞、粘附非CD8+细胞或补骨脂素/UVA处理的人工抗原提呈细胞(aAPC)接触，由此产生再刺激的活化T淋巴细胞。优选的细胞因子包括选自IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IFN-γ和TNF-α的那些，其中所述活化的T淋巴细胞包括活化的细胞毒性T淋巴细胞。活化的T淋巴细胞可额外经受至少一次重复的再刺激程序，然后实施所述产生步骤，所述再刺激程序包括：使活化的T淋巴细胞接触IL-2和选自以下的至少一种其它细胞因子的组合：IL-7、IL-15或IL-21，由此促进活化的T细胞生长、增殖或分化；并将活化的T细胞与照射后的自体非CD8+细胞或粘附非CD8+细胞或补骨脂素/UVA处理的aAPC温育，以产生再刺激的T淋巴细胞。优选地，再刺激程序包括在1-100U/ml浓度的IL-2、1-100U/ml的IL-7、1-100ng/ml的IL-15和1-100ng/ml的IL-21存在下使活化的T淋巴细胞接触果蝇aAPC。在该方法的一个方面，照射后的自体粘附非CD8+细胞包括照射后的自体粘附CD14+细胞，在该实施方案的又一方面，照射后的自体非CD8+细胞包括照射后的自体CD4+T细胞。
在该方法的又一方面，该方法进一步包括在所述失活步骤之前、之后或同时并在所述接触步骤之前冷冻和融化所述人工抗原提呈细胞。优选地，在这些方法的所有方面，失活的人工抗原提呈细胞不能增殖，并且基本上没有污染。
在本发明的优选方法中，人工抗原提呈细胞表达人白细胞MHC抗原分子、β-2微球蛋白和辅助分子，所述辅助分子包含选自人CD80(B7-1)、LFA-3(CD58)、CD83、CD86(B7-2)的共刺激分子，或选自CD70、TNFα、LT、4-1BBL和OX40L的TNF家族成员，或选自ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和LFA-3的粘附分子。还更优选地，人工抗原提呈细胞表达人HLA I类MHC抗原分子HLA2.1。在I类MHC分子为HLA-A2.1的情况下，辅助分子优选为B7-1(CD80)、LFA-3(CD58)、CD70和ICAM-1(CD54)。还优选人工抗原提呈细胞为补骨脂素/UVA处理的、用HLA分子和共刺激分子转染的果蝇细胞。
如上所述，该方法的优选用途涉及多种癌症，包括恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt淋巴瘤、甲状腺癌、子宫癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、神经胶质瘤和脑癌。
在本发明的又一个实施方案中，本发明涉及人工抗原提呈细胞。优选的补骨脂素-失活的人工抗原提呈细胞是表达HLA-A2.1、B7-1(CD80)、LFA-3(CD58)、CD70和ICAM-1(CD54)细胞表面蛋白的那些。与人工抗原提呈细胞组合的一组优选的肽混合物包括：YMNGTMSQV(SEQ ID NO：5)、ITDQVPFSV(SEQ ID NO：7)、AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)、ELAGIGILTV(SEQ ID NO：10)、SLLMWITQV(SEQ ID NO：27)、FLWGPRALV(SEQ ID NO：30)、TLAKFSPYL(PRAME；SEQ ID NO：54)和VLDGLDVLL(SEQ IDNO：71)。在与人工抗原提呈细胞组合时，这些肽与MHC蛋白结合，被说成是“载荷的”人工抗原提呈细胞，其随后提呈优选的肽组合。
其它人工抗原提呈细胞包括表达表面蛋白HLA-A2.1、B7-1和ICAM-1的那些。其它人工抗原提呈细胞包括表达HLA-A2.1、B&-1、FLA-3、CD70和ICAM-1的细胞；表达HLA-A2.1、B&-1、B&-2、FLA-3和ICAM-1的那些细胞。
附图简述
图1图示了在UVADEX/UVA处理杆状病毒感染的Sf9细胞后的杆状病毒滴度。用递增剂量的杆状病毒感染Sf9细胞，用5μg/mlUVADEX于4℃处理感染的细胞30分钟，接着如所示分别UVA处理0、2、10或20分钟。然后将处理过的细胞于28℃培养4天。收集培养上清液，并用于感染在96孔板中接种的新鲜未感染的Sf9细胞培养物。在这些Sf9培养物中存在的杆状病毒通过使用gp64特异性抗体的快速微量滴定测定(Invitrogen)检测，并计算杆状病毒滴度。
图2图示了未处理的异种APC(xAPC)对UVADEX/UVA处理的果蝇xAPC的细胞增殖分析。果蝇xAPC或者未被处理，或者用UVADEX(5μg/ml)于4℃处理30分钟，接着如所示分别UVA处理0、2、10或20分钟。彻底洗涤处理的细胞，以除去残余的UVADEX，然后将处理的细胞以1×106个细胞/ml接种在6孔板中，并连续培养16天。于处理后的第1天、第5天、第9天、第14天和第16天通过锥虫蓝染色每个培养物计数存活的(即活的)xAPC。
图3显示了与果蝇aAPC(克隆B)结合的异种核酸的转录程度的分析，所述果蝇aAPC或者未被处理，或者被γ-辐射处理，或者被UVADEX/UVA处理。果蝇xAPC(克隆B)的培养物者或者未被处理，或者被γ-辐射处理50分钟(递送约16,000拉德)，或者用UVADEX(5μg/ml)/UVA处理。洗涤xAPC的每种培养物，并与不含编码异种核酸的HLA A2.1、B7-1、B7-2或β2m的饲养果蝇细胞系(克隆D)共培养10周。然后对指示细胞系的提取物进行逆转录酶(RT-PCR)反应，该反应使用对HLA A2.1、B7-1、B7-2和β2m转录物特异性的引物，所述指示细胞系与未处理的、UVADEX(5μg/ml)/UVA处理的和γ辐射过的xAPC中的每一种共培养。然后通过琼脂糖凝胶电泳显现RT-PCR产物。泳道1，分子量标记；泳道2，未处理的克隆B xAPC(阳性对照)的RT-PCR产物；泳道3，γ-辐射过的克隆B xAPC的RT-PCR产物；泳道4、5和6，UVADEX/UVA处理的克隆B xAPC的RT-PCR产物，所述克隆B xAPC如所示分别UVA辐射5、15或30分钟。
图4A-4C显示与未被处理或进行了UVADEX/UVA处理的果蝇xAPC和结合的异种核酸相关的裂解病毒感染力与微生物活性的分析。(图4A，与等份的未处理xAPC病毒母液温育的克隆D指示细胞裂解的显微镜分析；图4B，与等份UVADEX/UVA处理的xAPC病毒母液温育的克隆D指示细胞裂解的显微镜分析；图4C，与未处理的xAPC病毒母液或UVADEX/UVA xAPC病毒母液的所示连续稀释液温育的克隆D指示细胞的细胞存活分析。实心圆，与未处理的病毒母液温育的克隆D细胞；空心圆，与UVADEX/UVA处理的病毒母液温育的克隆D细胞。
图5显示了果蝇xAPC/果蝇克隆D指示共培养物细胞上的外源分子表面表达的FACS分析，所述细胞未被处理、以γ-辐射处理或UVADEX/UVA处理。FACS分析如所示通过独立使用对人HLA、人B7.1和ICAM-1特异性的抗体进行。
图6显示了未处理的和UVADEX处理的果蝇xAPC上的外源分子表面表达的FACS分析，所述果蝇xAPC如所示暴露于UVA5或15分钟。FACS分析如所示通过独立使用对人HLA、人B7.1和ICAM-1特异性的抗体进行。
图7显示了用未处理的、UVADEX/UVA处理的或UVADEX/UVA加冻-融处理的xAPC产生MART-1特异性CTL。实心圆，未处理；空心圆，UVADEX/UVA；实心三角形，UVADEX/UVA加冻-融处理。
图8A和8B显示了UVADEX/UVA处理的xAPC对抗原特异性CTL的活化相比于未处理的xAPC的MyD88-依赖性增强。图8A显示了在用UVADEX/UVA处理的xAPC或未处理的xAPC活化后，用结合OVA8肽(SIINFEKL；SEQ ID NO：70)的MHC四聚体染色的、分离自C57BL/6(野生型)小鼠的CD8+T细胞的百分率的比较，UVADEX/UVA处理的xAPC表达载有OVA8肽的Kb、B7-1和ICAM-1分子，未处理的xAPC表达相同分子(泳道2对泳道1)。图8B显示了在用如图8A所述的UVADEX/UVA处理的xAPC或未处理的xAPC活化后，用结合OVA8肽(SIINFEKL；SEQ ID NO：70)的MHC四聚体染色的、分离自MyD88敲除(MyD88-/-)小鼠的CD8+T细胞的百分率的比较(泳道4对泳道3)。泳道1和2，由野生型小鼠(B6)分离并活化的染色CD8+T细胞的百分率，如在图8A中所述(作为阳性对照进行)。
图9A-9F提供了流程图，描述了依据本发明的细胞治疗方法的特别优选的实施方案的步骤。
图10显示了在补骨脂素/UVA处理之前和之后，在用HLA-A2、B7-1、ICAM-1、LFA-3和CD70转染的果蝇xAPC(1120)上的外源分子表面表达的FACS分析。果蝇xAPC与CuSO4(1mM)一起于室温培养48小时，以诱导外源分子表达。诱导的果蝇xAPC首先与UVADEX(5μg/ml，于4℃达30分钟)一起培养，然后暴露于UVA达10分钟。用培养基彻底洗涤细胞，分别用对人HLA-ABC、B7-1、ICAM-1、LFA-3和CD70特异性的抗体染色，并用FACscan分析。
图11显示了用补骨脂素处理的果蝇xAPC(FFF)或用相同供体的PBMC的非CD8粘附细胞(FAA)再刺激的、离体产生的黑素瘤特异性CTL的CTL活性比较。HLA-A2阳性供体的纯化的人CD8T细胞与预载荷6种黑素瘤肽(689、792、817、818、819、853)的混合物的补骨脂素/UVA处理的果蝇xAPC于37℃培养。在第4天时，加入人IL-2(20U/ml)和IL-7(30U/ml)。在以上具有额外的肽952(mMART-1)的抗原性肽存在下，用相同供体的PBMC的非CD8粘附细胞(FAA)或补骨脂素/UVA处理的果蝇APC(FFF)于第6天和第14天再刺激活化的CD8T细胞2次。通过51Cr测定评价抗原特异性CD8T细胞。简而言之，51Cr标记的M14细胞或载荷肽的T2细胞用作靶，CTL以0.4、2、10、50的效应子/靶比率加入。在培养4小时后收集上清液，用γ-计数器测量由靶释放的51Cr。
图12显示了用补骨脂素处理的果蝇xAPC(FFF)或用PBMC非CD8粘附细胞(FAA)再刺激的、离体产生的黑素瘤特异性CTL的CTL效力比较(扩增×裂解单位)。首先，将HLA-A2阳性供体的纯化的人CD8T细胞与预载荷6种黑素瘤肽的混合物的补骨脂素/UV处理的果蝇APC于37℃培养。在第4天，加入人IL-2(20U/ml)和IL-7(30U/ml)。在抗原性肽存在下，用在相同供体的PBMC中的非CD8粘附细胞(FAA)或果蝇xAPC(FFF)于第6天和第14天再刺激活化的CD8T细胞2次。在第22天，收获CTL，计算CD8T细胞扩增的倍数。通过51Cr测定评价抗原特异性CD8T细胞。简而言之，51Cr标记的M14(黑素瘤细胞系)细胞或载荷肽的T2细胞用作靶。裂解单位(LU)以100除以E/T比率计算，在该比率有30％裂解，功效以LU乘以扩增倍数计算。
图13显示了采用HLA-A2/Mart-1四聚体的抗原特异性CTL的FACS分析。首先将HLA-A2阳性供体的纯化的人CD8T细胞与补骨脂素/UVA处理的、预载荷6种黑素瘤肽的混合物的果蝇xAPC于37℃培养(F)。在第4天，加入人IL-2(20u/ml)和IL-7(30u/ml)。在第6天和第14天，用补骨脂素/UVA处理的果蝇xAPC再刺激CD8T细胞1次(FF)或2次(FFF)，或者用来自相同供体的PBMC的非CD8粘附细胞再刺激CD8T细胞1次(FA)或2次(FAA)。通过用抗CD8抗体(X轴)和Mart-1/A2四聚体(Y-轴)染色细胞评价抗原特异性CD8T细胞，并通过FACSCanto分析。
图14显示了在不同的细胞因子组合存在下用果蝇xAPC离体产生的CTL的特异性和表型的比较。得自两个HLA-A2阳性供体的纯化的人CD8T细胞与补骨脂素/UV处理的、预载荷6种黑素瘤肽的混合物的果蝇xAPC于37℃培养。在第4天，加入人IL-7(30U/ml)加IL-2(20U/ml)或IL-7、IL-2加IL-15(25ng/ml)或IL-7、IL-2加IL-21(25ng/ml)或IL-7、IL-15加IL-21。在抗原性肽和所示细胞因子存在下，用果蝇APC(FFF)在第6天和第14天再刺激活化的CD8T细胞2次。通过用抗CD8抗体和四聚体或所示的抗体染色细胞评价抗原特异性CTL和CD8T细胞的表面标记。通过FACSCanto分析数据。显示的数字是两个供体的数据平均值。
本发明及其优选实施方案的详述
术语“包括”、“包含”和“含有”在本文以其开放的非限制性含义使用。
按照本发明的一般方面，使人工抗原提呈细胞(aAPC)接触交联剂，由此使aAPC无活力。优选地，还通过交联失活使aAPC基本没有微生物污染物。此类失活的aAPC在载荷选定肽时，仍能够活化原初T细胞，以变成对选定肽特异性的活化T细胞(例如活化的分化簇(CD)CD4+T细胞或活化的CD8+T细胞，它们分别是活化的辅助T细胞或CTL)。失活的aAPC可用于制备含有活化的T细胞的治疗性组合物和细胞治疗产品，所述活化的T细胞已通过接触载荷肽的失活aAPC产生。有关抗原提呈系统(包括基于异种的那些)制备的一般指引，参见例如：美国专利号5,962,320；美国专利申请号2003/0072796、2003/0077248、2004/0071671、2005/0152916和2006/0134125；国际公布号WO 00/63690、WO 02/065992和WO 02/092773；Oelke等人，TRENDS in Molecular Medicine，11(9)卷，412-420页(2005)；Sun等人，Immunity，第4卷，555-564页(1996)；和Kim等人，Nature Biotechnology，22(4)卷，403-410页(2004)。
通过失活的aAPC活化的特定原初T细胞谱系取决于在aAPC表面上表达的MHC分子的性质。因此，仅表达MHC I类分子的aAPC可提呈选定肽至原初CD8+T细胞并活化该细胞，表达MHC II类分子的aAPC可提呈选定肽至原初CD4+ T细胞并活化该细胞。类似地，表达MHC I类分子和MHC II类分子这二者的aAPC可提呈选定肽至原初CD8+ T细胞和原初CD4+ T细胞，并活化这两种细胞。
为生产细胞治疗产品，使得自由患者取出的单采样品的自体原初T细胞与已载荷选定肽的失活aAPC接触，所述选定肽例如为包含人AML蛋白的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸的肽。结果，接触的原初T细胞被活化，即它们对表达至少一个表位的靶细胞致敏，所述表位对应于活化原初T细胞的选定肽。在遭遇活化的T细胞时，这些被靶向的细胞可由于活化的T细胞能够表现出特异性的靶细胞细胞毒性(即特异性细胞杀死)而被活化的T细胞杀死。
可通过本领域现在已知的或可用的众多适宜的淋巴细胞单采(lymphocytapheresis)、淋巴单采(lymphapheresis)和白细胞分离(leukaphoresis)程序中的任一种由患者收集单采样品，所述程序由收集的外周血收集外周血白细胞(PBL)，其中的白细胞可与样品的其它血浆组分分离。示例性的程序描述于例如美国专利申请公布号US2004/0173778和US200/40147021，以及美国专利号4,690,915、5,126,132、6,255,073、5,846,827、6,251,385、6,225,044、6,210,963、6,194,207、5,443,983、6,040,177、5,766,920、6,210,662、6,204,058和6,227,368。来自单采样品的原初T细胞基本上与其它PBL(例如非T细胞)分离，所述原初T细胞可以为原初CD4+T细胞、原初CD8+T细胞或原初CD4+T细胞和原初CD8+T细胞。优选地，分离原初CD8+T细胞，然后用其生产含有自体细胞毒性T细胞(CTL)的治疗组合物或细胞治疗产品，所述产品被再输注或灌输回获得单采样品以得到细胞治疗产品的患者中。可使用的再输注程序包括在例如美国专利号4,844,893和4,690,915中公开的那些程序。
可获得含有原初T细胞的单采产物的患者优选为需要治疗的哺乳动物，例如狗、猫、马、大鼠、兔、小鼠、非人灵长类动物或人。更优选地，患者为需要治疗与异常免疫系统功能相关的疾病、障碍或医学病症的人类患者。或者，在适宜的环境中，可使用诸如原初T细胞的免疫细胞按照本发明制备细胞治疗产品，所述免疫细胞不是来源于要治疗的患者，但其来源于另一个相适来源，例如免疫细胞供体，甚至永生化的或转化的免疫细胞系。
用于选择PBL的方法包括使用Ficoll梯度的程序、使用免疫纯化的技术(例如针对细胞表面标记如CD分子的单克隆抗体，和珠子，例如抗体可吸附的缀合Sepharose、A蛋白和G蛋白的珠子，以及抗体可吸附的磁珠)、流式细胞术和荧光活化的细胞分拣仪(FACS)分析。
选定的原初T细胞优选与非选定的单采样品组分大致分离。更优选地，通过磁珠纯化系统，如本领域可用的那些，例如与细胞分拣方法(例如基于FACS的方法)组合的Miltenyi珠(Myltenyi Biotec)和Dynabead系统(Dynal Biotech)，或其它适宜的细胞分拣设备和方法，大致纯化选定的原初T细胞。然后将由此选定的原初T细胞与失活并载荷选定肽的aAPC混合并温育一定时间，该时间足以活化和富集所需的活化的T细胞群，例如活化的辅助T细胞，优选CTL或CD8+记忆T细胞。这样的活化T细胞优选以肽特异性方式活化。
大致分离的原初T细胞对aAPC的比率可针对特定个体优化，例如按照个体特征，如个体淋巴细胞对培养条件的适应性和要治疗的疾病或其它病症的性质和严重性。示例性的分离的原初T细胞对失活的aAPC的比率为约30:1至300:1。例如，可混合3×107个人PBL和1×106个aAPC，并保持在包含RPMI 1640培养基的培养基中。
因此，原初T细胞包含未用载荷选定肽的aAPC致敏的CD4+或CD8+细胞。原初T细胞可基于一种或多种常规选择的适宜特征来鉴别，例如与细胞生长和增殖状态、细胞表型和细胞活性相关的那些特征。对于细胞生长和增殖状态，原初T细胞优选包含静息T细胞群体，即它们倾向于停留在细胞周期的G0部分。活化的T细胞经常处于细胞周期的G1期或S期。记忆T细胞包含曾经是原初的但已被活化的T细胞，其随后再进入静息状态，或者包含由于稳态扩增而获得记忆表型的原初T细胞(参见Opferman等人，Science，第283卷，1745-1748页(1999)；Wherry等人，Nat.Immunol.，第4卷，225-234卷(2003)；Kaech等人，Cell，第111卷，837-851页(2002)；Kieper等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第96卷，13306-13311页(1999)；Goldrath等人，J.Exp.Med.，第192卷，557-564页(2000)；Murali-Krishna等人，J.Immunol.，第165卷，1733-1737页(2000))。这样的记忆T细胞可在例如再接触致敏抗原、CD4+T辅助细胞帮助和/或接触适宜的细胞因子时被再活化。因此，与记忆T细胞和活化的T细胞相比，原初T细胞相对在体内不增殖，除非原初T细胞群缺失(例如在响应于抗原的T细胞强活化过程中发生)需要相对慢的稳态增殖期，以便补充原初T细胞数(参见例如Kieper等人，J.Immunol.，第174卷，3157-3163页(2005)，和Baccala等人，J.Immunol.，第174卷，4606-4612页(2005))。对于表型，可通过原初T细胞相关的CD分子谱表达相比于对非原初T细胞观察到的表达水平的存在情况和相对水平，区分原初T细胞和非原初T细胞(例如CD4+辅助T细胞、记忆T细胞和效应子T细胞(例如CTL))，所述CD分子谱可包括CD11alow/LFA-1low(或dim)、CD25low、CD27+(或hi)、CD44low或CD44int、CD45RA+(或pos)、CD45RO-(或neg)、CD95low(或dim)、CD57-(或neg)和CD62Lhi(或bright)。还可以通过相比于对非原初T细胞观察到的表达水平相对高水平的趋化因子受体CCR7表达(CCR7hi)区分原初T细胞(参见例如McFarland等人，PNAS，第97(8)卷，4215-4220页(2000)；Ishimaru等人，Nature Immunol.，第7(7)卷，763-772页(2006)；和Kern等人，Eur.J.Immunol.，第29卷，2908-2915页(1999))。相比之下，记忆细胞例如可以CD27low、CD44hi、CD45RA-、CD45RO+、CD57+(或hi)、CD62Llow和/或CCR7low表型为特征(参见例如Kern等人，Eur.J.Immunol.，第29卷，2908-2915页(1999)，和Baccala等人，J.Immunol.，第174卷：4606-4612(2005))。对于细胞活性，原初T细胞可表征为不能有效生产或分泌干扰素α、干扰素γ、白介素(IL)1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(参见例如Cerwenka等人，J.Immunol.，第161卷，97-105页(1998)；Walzer等人，Cell.Immunol.，第206卷，16-25页(2000)；Tizard，I.，IMMUNOLOGY：ANINTRODUCTION，第3版，129-143页(1992)；美国专利申请公布号US2002/0119121；和国际公布号WO 2002/022648)。原初T细胞也没有表现出针对预定靶细胞的显著细胞毒性或特异性细胞杀伤活性。
原初T细胞可以包含如上所述被致敏和刺激并由此活化的原初CD8+T细胞、原初CD4+T细胞或CD8+T细胞和CD4+T细胞的组合，并任选地被再刺激和/或扩增，以产生包含所需表型和数量的活化T细胞的治疗性组合物和细胞治疗产品。示例性的再刺激程序包括加入一种或多种促进活化的T细胞生长、增殖和/或分化的选定细胞因子，并将活化的T细胞与载荷选定肽的非CD8+细胞如CD14+细胞温育。适宜细胞因子的选择将取决于最终将包含在治疗组合物或细胞治疗产品中的所需活化T细胞表型。因此，原初CD4+T细胞可被活化，并任选地被再刺激和/或扩增，以变成CD4+T辅助(Th)1细胞或CD4+Th2细胞，原初CD8+T细胞可被活化并任选地被再刺激和/或扩增，以变成具有Tc1-样表型的CTL、具有Tc2-样表型的CTL、记忆T细胞或这些的组合，它们是技术人员考虑到本领域的指引所需要的(参见例如Cerwenka等人，J.Immunol.，第163(10)卷，5535-5543页(1999)；Mosmann等人，Immunol.Today，第17(3)卷，138-146页(1996)；Carter等人，Curr.Opin.Immunol.，第8(3)卷，336-342页(1996)；Croft等人，J.Exp.Med.，第180卷，1715-1728页(1994)；Fujihashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，3613-3618页(1996)；美国专利号6,355,479和国际公布号WO97/46256。优选的细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IFN-γ和TNF-α。示例性的T细胞扩增程序包括在选定的细胞因子和抗CD3抗体制备物如
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存在下温育活化的T细胞与照射过的非CD8+细胞，以促进非特异性活化T细胞扩增。这些要使用的再刺激和扩增方案的数量、次序和组合的选择在技术人员的知识范围内，并可得到本领域指引的帮助。参见例如Cerwenka等人，J.Immunol.，第161卷，97-105页(1998)；Livingston等人，Immunol.Invest.，第24(4)卷，619-629页(1995)；Sad等人，Immunity，第2卷，271-279页(1995)；美国专利申请公布号US2003/0170212；和国际公布号WO 02/092773。
在优选的实施方案中，随后对已刺激的T细胞实施至少1次重复的再刺激程序，包括使已刺激的T细胞与足以促进活化T细胞生长、增殖和/或分化的量的IL-2和IL-7接触，随后将如此接触过的T细胞与照射后的自体粘附非CD8+细胞(例如CD14+细胞)和额外的足量IL-2和IL-7温育。在其中再刺激程序实施1次以上的实施方案中，在再刺激程序的每次重复之间，将活化的T细胞与额外量的IL-2和IL-7接触。在其它优选的实施方案中，对活化的T细胞实施至少1次扩增程序，随后实施至少1次重复的再刺激程序，其中扩增程序包括在足以促进如此接触的T细胞的生长、增殖和/或分化的量的IL-2和抗CD3抗体制备物(优选
Figure A200780044507D0025111722QIETU
)存在下温育活化的T细胞和照射后的非CD8+细胞。
在优选的实施方案中，原初T细胞包含CD8+T细胞，其在被活化和任选地被再刺激和/或扩增时，可表现出例如针对它们所靶向的细胞的细胞毒活性或产生免疫刺激或细胞毒性相关的细胞因子。优选地，它们表现出这些特征的组合。可如上所述对已被致敏并活化的原初CD8+T细胞实施再刺激和/或扩增方案，其驱动如此活化的CD8+T细胞分化和/或极化为特定的CTL细胞谱系表型，例如CD8+ Tc1和CD8+ Tc2表型。还可以用单独或与某些细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-12以及干扰素γ)或抗体(例如针对活化的T细胞表面上的T细胞受体(TCR)和共刺激分子的那些抗体)组合的选定肽，在体内或体外对载荷肽的aAPC活化的CD8+ T细胞进行几轮再刺激。在优选的实施方案中，以此方式进一步再刺激活化的CD8+ T细胞，其保持对靶细胞的免疫原性和细胞毒性达至少约4或5代，产生记忆CD8+ T细胞。用于记忆CD8+ T细胞鉴定、表征、免疫原性维持和扩增的方法可见于例如Cerwenka等人，J.Immunol.，第161卷，97-105页(1998)；Cerwenka等人，J.Immunol.，第163卷，5535-5543页(1999)；专利申请公布号2002/0119121；和国际公布号WO 2002/022648。
在细胞治疗产品制备方法中使用的aAPC可以包含失活的xAPC和xAPC培养基，失活的xAPC是来自非人物种的修饰的宿主细胞，能够在其表面上表达外源分子。aAPC还包含选自MHC I类分子和MHC II类分子的外源MHC分子。aAPC系统任选地进一步包含至少一种外源辅助分子，其帮助活化原初T细胞。优选地，外源分子由已导入到宿主细胞中的异种核酸编码。
优选地，除了MHC I类或II类分子以外，aAPC还包含至少一种共刺激分子。更优选地，除了MHC I类或II类分子以外，aAPC还包含至少一种共刺激分子和至少一种粘附分子(参见Kim等人，2004，Nature，第22(4)卷，403-410页；Cai等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，14736-14741页；Jackson等人，1992，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，第89卷，12117-12121页；Schoenberger等人，1998，Cancer Res.，第58卷，3094-3100页；和Latouche等人，2000，Nat.Biotechnol.，第18卷，405-409页)。可用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂例举于例如美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001。优选的HLA I类MHC抗原分子包括但不限于HLA2.1(HLA-A*0201)以及HLA-A*0101、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3303、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0401、HLA-B*0702、HLA-B*4402、HLA-B*3501。
优选的MHC I类分子包括重链(例如α链)和β2-微球蛋白。该MHCI类分子可以为全长分子或全长分子的胞外部分，此胞外部分没有完整的跨膜结构域或胞质结构域，或者既没有完整的跨膜结构域，也没有完整的胞质结构域。MHC I类分子优选能够结合选定的肽。可用于本发明的示例性MHC I类分子包括例如由人白细胞抗原(HLA)-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G基因座编码的分子。优选地，MHC I类分子选自由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座编码的分子。可用于选择、克隆、制备和表达β2-微球蛋白分子、MHC I类分子如HLA分子及其部分的技术、方法和试剂例举于美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001。
优选的MHC II类分子包括一起缔合形成MHC II类杂二聚体的α链和β链。该MHC II类杂二聚体可以为全长分子或全长α链的胞外部分、或全长β链的胞外部分或全长α链和β链这二者的胞外部分，这样的一个或多个胞外部分没有完整的跨膜或胞质结构域。可用于本发明的示例性MHC II类分子包括由HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DO、HLA-DN或HLA-DZ基因座编码的分子。可用于选择、克隆、制备和表达MHC II类α链、β链和αβ杂二聚体及其胞外部分的技术、方法和试剂例举于美国专利号5,583,031和6,355,479。
当用结合选定肽的MHC I类或II类分子提呈原初T细胞时，辅助分子有利于此原初T细胞的活化，所述选定肽为抗原或免疫原，或者既是抗原又是免疫原。辅助分子可为诸如以下的辅助分子：(i)为抗原提呈细胞表达的蛋白的共刺激分子，例如B7.1(先前称为B7，也称为CD80)和B7.2(也称为CD86)和CD70，它们尤其结合T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子，由此影响例如细胞因子(如白介素(IL)-2)分泌、T细胞扩增、Th1分化和短期T细胞存活(参见Kim等人，2004，Nature，第22(4)卷，403-410页)；和(ii)粘附分子，例如结合糖类的糖蛋白如凝集素、跨膜结合糖蛋白如整联蛋白、钙依赖性蛋白如钙粘蛋白，以及单次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，如胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞间或细胞与基质间的接触。优选的粘附分子包括ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和LFA-3。可以使用任何适宜数目和组合的辅助分子。
可修饰宿主细胞，以变成用于活化原初T细胞的aAPC细胞系。可以选择能够在培养物中连续生长的、可被操作以表达外源分子的任何类型的细胞作为宿主细胞源(参见例如Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1991)关于培养和使用多种细胞系的概述和程序)。因此，宿主细胞可起源于多种物种中的任一种，包括原核物种，如细菌物种，或真核物种，例如酵母、昆虫、植物、支原体和哺乳动物。
在优选的实施方案中，宿主细胞包括由生物体(优选动物)收获并分离的原代细胞，其或者直接用于制备抗原提呈系统，或者在培养或传代原代细胞达有限的代数(例如由1至50)后如此使用。或者，这样的原代细胞系可在允许产生由祖先原代细胞系派生的永生化细胞系的条件下培养，其可常规选择。这样的永生化可使原代细胞培养至足够的代数，使得达到转变期，在该过程中，培养物中的大部分原代细胞死亡，同时相对少数目的快速分裂变体继续存在。存在此持续变体的培养物理论上可传代任意代数，只要细胞以适宜的次数和适宜的稀释因数稀释，并补充合适的营养物和培养基，以允许持续增殖。转化细胞系还可以用作真核宿主细胞源，其可用于制备抗原提呈系统。这样的转化细胞系可来源于肿瘤细胞，该细胞取自带有此肿瘤的动物。可由众多细胞系储库中的任一种获取多种类型的永生化细胞系或转化细胞系，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，或者可以由技术人员使用现在已知的或在本领域可用的常规技术制备。
可操作以获得所需的一组宿主细胞和aAPC生长和培养条件的示例性参数包括温度、通风度、氧饱和百分率、二氧化碳饱和百分率、营养物组成和浓度以及静态生长对搅拌(或振摇)生长。用于选定的宿主细胞(例如Schneider2细胞)的制备、生长和培养的示例性方法提供于美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001；Sambrook等人，
Figure A200780044507D0029111858QIETU
，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；Ausubel等人(编辑)，
Figure A200780044507D0029111922QIETU
，Greene PublishingAssociation and John Wiley Interscience，New York，1992；和Frank，“Perspectives on Baculovirus Expression Systems”，1998年11月，OMRFResearch Technology Forum。
选定用于修饰以变成aAPC的宿主细胞优选缺乏胞内抗原加工、胞内肽运输和/或胞内MHC I类或II类分子-肽加载，或者为冷血动物的(即对温度变化的反应不如哺乳动物细胞系敏感)，或者同时具有缺陷和冷血动物特性(参见例如DeSilva等人，1999，J.Immunol.，第163(8)卷，4413-4420页；Schumacher等人，1990，Cell，第62(3)卷，563-567页；Ljunggren等人，1990，Nature，第346(6283)卷，476-480页)。优选地，选定的宿主细胞还不能表达外源MHC I类或II类分子和导入到类此宿主细胞中的辅助分子组分的至少一种内源对应物(例如上述的内源MHC I类或II类分子和/或内源辅助分子)。而且，aAPC优选保留选定的宿主细胞在它们被修饰而产生该aAPC之前所具有的那些缺陷和冷血动物特性。在优选的实施方案中，选定的宿主细胞构成或者来源于与抗原加工(TAP)缺陷细胞系(例如昆虫细胞系)结合的转运体。
优选的选定宿主细胞为冷血动物昆虫细胞。来自选定宿主细胞的示例性昆虫细胞系包括例如来源于蛾(ATCC CCL 80)、粘虫(ATCCCRL 1711)、蚊幼虫(ATCC细胞系CCL 125、CCL 126、CRL 1660、CRL 1591、CRL 6585、CRL 6586)和蚕(ATCC CRL 8851)的那些。在特别优选的实施方案中，所述细胞系为果蝇细胞系，例如Schneider 2细胞系(参见例如Schneider，1972，J.Embryol.Exp.Morph.，第27卷，353-365页)；来源于甜菜夜蛾(Spodoptera)的细胞系，例如SF-9细胞或SF-21细胞；或者来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia)的细胞系，例如Tn5细胞、H5细胞和High-FiveTM(Invitrogen)细胞。
通过包括将异种核酸导入宿主细胞中的方法修饰选定的宿主细胞，以便表达外源MHC I类或MHC II类分子，优选一种以上的上述外源辅助分子，由此产生aAPC。因此，aAPC一旦通过修饰选定的宿主细胞产生，则除了可表达1-15种以上的选自适于所需细胞疗法的共刺激和粘附分子的外源辅助分子之外，还可以表达选自上述HLA分子的外源MHC I类或外源MHC II类分子。在某些优选的实施方案中，修饰宿主细胞，以表达外源HLA-A2分子连同外源B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。在其它优选的实施方案中，修饰宿主细胞，以表达外源HLA-A2分子连同外源B7.1(CD80)、ICAM-1(CD54)、LFA-3(CD58)和CD70。
异种核酸可以为DNA序列或RNA序列，或者可以包含DNA序列和RNA序列这二者。优选地，异种核酸为DNA序列。
优选地，将异种核酸掺入一个或多个优选通过转染适于导入到选定宿主细胞中的载体。载体可以为包含至少一个异种核酸序列的适宜核苷酸序列，所述异种核酸序列编码至少一部分外源分子，与载体序列有效连接，该载体序列有利于如此连接的异种核酸序列表达。与载体序列有效连接的异种核酸序列编码至少一部分哺乳动物MHC分子。优选地，将该MHC分子的完整蛋白编码序列插入载体中并表达。在其中利用一部分MHC分子(例如胞外部分)的实施方案中，这样的部分可通过例如在编码胞外部分的序列末端插入引导翻译终止的序列(即终止密码子)来制备。在这样的实施方案中，胞外部分优选被改变，使得只要这些细胞表达胞外部分，该胞外部分就可以至少部分地保留在修饰细胞的膜内。在优选的实施方案中，使用的MHC分子为全长MHC I类分子。
在其中使用编码MHC I类分子的载体的优选实施方案中，可以使用第二种载体来表达β2微球蛋白分子或其部分，所述第二种载体编码至少一部分与第二种载体有效连接的哺乳动物β2微球蛋白分子。或者，可以使用包含编码MHC I类分子和β-2微球蛋白的核苷酸序列的单个载体。
在进一步优选的实施方案中，除了编码MHC分子的载体和编码β2-微球蛋白的载体之外，还使用至少一种其它的载体，其编码至少一部分与该载体有效连接的辅助分子。在还更优选的实施方案中，使用大量其它的载体，每个载体编码选自以下的辅助分子：共刺激分子，例如B7-1(先前称为B7，也称为CD80)和B7-2(也称为CD86)，和粘附分子，其包含ICAM分子，例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和LFA-3。共刺激和粘附分子的任何适宜组合均可用于产生aAPC。
另外，在某些优选的实施方案中，β2-微球蛋白分子得自β2-微球蛋白宿主细胞，其与被修饰而变成aAPC的宿主细胞截然不同。在这样的实施方案中，将编码β2-微球蛋白分子的载体导入到β2-微球蛋白宿主细胞中并表达，收集表达β2-微球蛋白分子的样品。或者，β2-微球蛋白分子样品可以来源于表达内源β2-微球蛋白的生物。然后可将表达外源MHC I类分子的aAPC与β2-微球蛋白分子样品温育。
为获得所需核酸序列的表达水平，将核酸序列插入含有引导转录的启动子、转录/翻译终止子以及用于翻译起始的核糖体结合位点(如果针对编码蛋白的核酸序列)的载体中。示例性的细菌启动子描述于Sambrook等人，出处同上；和Ausubel等人，出处同上。用于表达组成型蛋白的例证性细菌表达系统包括大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillussp.)和沙门氏菌(Salmonella)(Palva等人，1983，Gene22：229-235；Mosbach等人，1983，Nature 302：543-545)。用于这类表达系统的试剂盒市售可得。适用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统也是本领域已知的或可得到的。
除了启动子以外，每个载体都优选包含转录单元或表达盒，其包含用于在宿主细胞中表达异种核酸需要的所有其它元件。示例性的载体包含与异种核酸有效连接的启动子以及有效聚腺苷酸化转录物需要的信号、核糖体结合位点和翻译终止子。异种核酸可与可切割的信号肽序列连接，以促进转染细胞分泌编码蛋白。示例性的这类信号肽包括组织纤溶酶原激活物、胰岛素和神经生长因子以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)保幼激素酯酶的信号肽。表达盒或载体中可包含另外的或备选的元件，例如增强子元件、内源启动子元件、有或没有功能性剪接供体和受体位点的内含子、翻译终止元件或聚腺苷酸化信号，它们中的全部或部分可为选定异种核酸的内源元件。
适于在细菌、哺乳动物和/或昆虫宿主细胞中表达异种核酸的示例性载体包括：pRmHa载体，包括pRmHa-1、pRmHa-2和pRmHa-3(参见例如国际公布号WO 96/27392以及美国专利号6,225,042和6,355,479)；基于pBR322的载体、pSKF、pET23D、pCDM8(Seed，1987，Nature，第329卷，840页)和pMT2PC(Kaufinan等人，1987，EMBO J，第6卷，187-195页)、pMAMneo(Clontech)、pcDNA3(Invitrogen)、pMClneo(Stratagene)、pCMVSPORT、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2-neo(ATCC37593)、pBPV-1(8-2)(ATCC37110)、pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)、pRSVgpt(ATCC37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC37460)、pMSCV和lZD35(ATCC37565)、pUC8、pUC9、pUC18、pBR322和pBR329(BioRad Laboratories)、pPL和pKK223(Pharmacia)，以及pBS(Stratagene)和M13mp19(Stratagene)。用于制备aAPC的优选载体包括含有真核病毒的调节元件的载体，例如SV40载体、乳头状瘤病毒载体、痘苗病毒载体、杆状病毒和来源于EB病毒的载体。这样的载体允许插入的异种核酸在下列启动子引导下表达：CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或另一种对在真核细胞中表达有效的启动子。
已开发了多种重组杆状病毒表达载体用于感染入来源于几种昆虫物种的宿主细胞中，例如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蚕(Bombyxmori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(参见例如国际公布号WO 89/046699；Carbonell等人，1985，J.Virol.第56卷，153页；Wright，1986，Nature，第321页，718页；Smith等人，1983，Mol.Cell.Biol.，第3卷，2156页；和Fraser等人，1989，Cell.Dev.Biol.，第25卷，225页)。优选的病毒来源的载体包括基于杆状病毒的载体，例如BaculoGoldTM(BDBiosciences)、BacPAK6(BD Biosciences)、ProEasyTM(BD Biosciences)和pDSVE。
为使用含有编码MHC I类分子、MHC II类分子、共刺激分子或辅助分子或这些的组合的异种核酸的载体，可以利用多种在本领域可获得的宿主表达载体系统。这样的宿主表达系统提供了通过其可生产并随后纯化目标编码序列的载体，而且提供了在用适宜的核苷酸编码序列转化或转染时可表达所述分子的细胞。这些宿主表达系统包括例如微生物，如用含有MHC编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用包含MHC编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如啤酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有MHC编码序列的重组细菌表达载体感染的昆虫细胞系统；用含有MHC编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用含有MHC编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有重组表达载体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、HEK 293、3T3细胞)，所述重组表达载体含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子、Semliki森林病毒启动子)。而且，编码多肽标签的核酸序列还可以插入到选定载体中，使得由其表达的外源多肽包含编码的多肽标签，以便实施便利的分离和/或检测方法。代表性的标签包括c-myc标签、凝血素(HA)-标签、6x-His标签、麦芽糖结合蛋白标签、VSV-G标签、FLAG标签和V5标签。
用于表达外源蛋白的优选表达系统是包括使用pRmHa载体，如pRmHa-1、pRmHa-2和pRmHa-3(Bunch等人，1988，Nucl.Acids Res.，第16卷，1043-1061页)的表达系统，所述载体被导入到宿主细胞中，例如昆虫细胞，优选果蝇细胞。
在特别优选的实施方案中，表达载体是诱导型载体。含有此诱导型表达载体的aAPC首先需要通过诱导剂如CuSO4刺激预定的时间段，以实现可感知的外源蛋白表达。优选地，MHC分子表达由编码此MHC分子的诱导型表达载体驱动。在适宜的诱导期后，例如约12-48小时，选定肽(其可如下所述制备)可以预定浓度(例如约100μg/ml)加入。在又一个温育期(例如于27℃约12小时)后，准备将培养物用于活化CD8+细胞。尽管该额外的温育期可被缩短或者可能省略，但优选在加入原初T细胞之前使培养物温育一段时间，以增强其对温度挑战的顺应性。例如，已向其加入选定肽的培养物即便于37℃温育延长的时间段时，也能够表达显著量的载荷选定肽的I类MHC分子。
用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的示例性程序可用于将异种核酸导入选定宿主细胞中，包括使用诸如Superfect(Qiagen)的试剂、脂质体、磷酸钙转染、凝聚胺、原生质体融合、电穿孔、微注射、质粒载体、病毒载体、轰击粒子加速(例如基因枪)，或任何其它适宜将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、RNA或其它外源基因材料导入宿主细胞中的方法(参见例如Sambrook等人，
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，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989))。关于宿主细胞的稳定转染，将显而易见的是，根据所用的表达载体和转染技术，只有少部分细胞可将外源DNA整合入其基因组中。为鉴定和选择这些整合体，可将编码选择标记(例如对抗生素的抗性)的基因连同目标基因一起导入到宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予对药物抗性的那些，所述药物例如为遗传霉素(G418)、嘌呤霉素、潮霉素和氨甲喋呤。用导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择鉴定(例如已掺入选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。
至少一部分与aAPC结合的异种核酸，而在优选的实施方案中，异种核酸和对aAPC所来自的宿主细胞为内源的核酸，通过交联并随后或同时表达这些外源分子来失活，使得在失活后基本上没有发生细胞生长、核酸复制或表达。优选地，失活尽管使核酸不能进一步可感知地复制或表达，但没有可感知地影响失活前在aAPC表面上表达的外源蛋白的活性。
用某种药剂失活aAPC，以便实现核酸(DNA或RNA)交联。示例性的交联剂描述于美国申请公布号US 2005/0054572；Biodrugs，第17(1)卷，66-68页(2003)(amotosalen和光；INTERCEPT系统)；Schneider等人，Photochem.Photobiol.，第67(3)卷，350-357页(1998)(亚甲基蓝和光)；和美国专利号7,067,251(补骨脂素和UVA)。可以根据技术人员的需要，通过常规实验选择本领域可用或变得可用的交联剂，以按照本发明失活与aAPC结合的核酸。例如，为选择适宜的交联剂，技术人员可以考虑某些与特定交联剂相关的特性，例如由特定交联剂产生的交联性质、其相对毒性、效力、稳定性、反应性和其它相似特性。而且，可以使用多种交联剂失活aAPC。另外，用交联剂治疗可与外源分子表达和提呈至APC细胞表面上同时或在其之后。优选的交联剂对核酸(例如DNA和RNA)或对核酸与多肽这二者具有高亲和性，并与这些分子相互作用，以便可在选定的交联剂与核酸或核酸和多肽之间产生加合物。这样的交联剂可参与链内或链间加合物形成。对于链间加合物形成，加合物的核酸组分包含两条DNA链、两条RNA链、DNA链和RNA链、DNA链和多肽或者RNA链和多肽。对于链内加合物形成，加合物的核酸组分包含一条DNA链或一条RNA链。优选地，加合物的核酸组分包含DNA。
说明性的交联剂包括补骨脂素分子家族的成员及其衍生物(例如Lin等人，Transfusion，第37(4)卷，423-435(1997))；蒽醌和蒽醌衍生物(例如Kang等人，Nucleic Acid Res.，第24(20)卷，3896-3902页(1996))；丝裂霉素，例如丝裂霉素C和丝裂霉素D(例如Tomasz，“Themitomycins：natural cross-linkers of DNA.”载于MOLECULARASPECTS OF ANTICANCER DRUG-DNA INTERACTIONS.第2卷(Neidle S和Waring M编辑)，313-349页(1994)和Warren等人，Environ.Mol.Mutagen.，第31(1)卷，70-81页(1998))；氮芥，例如美法仑和苯丁酸氮芥(例如Dronkert等人，Mutat.Res.，第486(4)卷，217-247页(2001)和Sancar等人，Annu.Rev.Biochem.，第73卷，39-85页(2004))；蒽环类抗生素，例如阿霉素、道诺霉素、表柔比星和伊达比星(参见例如Cutts等人，Mol.Cancer.Ther.，第2(7)卷，661-670页(2003)和Sancar等人，Annu.Rev.Biochem.，第73卷，39-85页(2004))；含铂的配位化合物，例如顺铂、卡波铂、奈达铂和奥克赛铂(参见例如Reedijk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第100(7)卷，3611-3616页(2003)，Frankenberg-Schwager等人，Toxicology，第212卷，175-184页(2005)，和Dronkert等人，Mutat.Res.，第486(4)卷，217-247页(2001))；核黄素；其它芳香族化合物或染料，例如噻唑橙染料、甲基绿染料、溴化乙锭和溴乙非啶二聚体(参见例如Tuite等人，Eur.J.Biochem.，第243(1-2)卷，482-492页(1997)，Faridi等人，J.Biomol.Struct.Dyn.，第15(2)卷，321-332页(1997)，和Sancar等人，Annu.Rev.Biochem.，第73卷，39-85页(2004))；等等。
优选地，交联剂为可光活化的。因此，在优选的实施方案中，如下进行交联：将aAPC与可光活化的交联剂温育，并将温育的aAPC暴露于光活化剂量的适宜波长的辐射足以失活aAPC的时间，例如通过使交联剂与结合aAPC的核酸形成加合物。在优选的实施方案中，交联实现了与aAPC结合的异种核酸和内源核酸这二者的失活，使它们被杀死，或者使它们基本上不能进一步复制或增殖。优选地，交联产生被失活并基本上没有污染微生物(例如细菌和病毒)的aAPC，而不显著降低aAPC的抗原提呈细胞功能。一旦由此失活，aAPC就基本上被代谢失活，但仍保留在其表面上提呈功能性外源分子(其在失活前被表达和提呈)、提呈选定肽至原初T细胞并活化已被提呈肽的原初T细胞的能力。
失活和无菌性可通过例如下列方法证实：感染细胞生存力测定；病毒感染力测定；病毒活性测定；内源病毒蛋白检测测定；内源病毒核酸检测测定；基于PCR的测定或基于逆转录酶(RT)PCR的测定；异种核酸检测测定；流式细胞术；和/或FACS分析(参见例如Belanger等人，2000，Transfusion 40：1503，2000)。例如，可用编码外源分子的异种核酸转染其可能在培养基中含有相关病毒核酸和其它微生物核酸的昆虫细胞，然后进行交联。然后可使用本领域已知的或可获得的方法测定由如此经历的细胞获得的上清液，以确定蚀斑形成单位(PFU)的量，蚀斑形成单位是病毒核酸活性的直接指示。可使用类似的方法来确定其它非病毒微生物核酸的活性。本发明的失活aAPC优选基本上没有显示出PFU。本领域已知的或可获得的适于检测病毒衣壳蛋白存在情况的其它测定，例如免疫测定，也可以用于证实没有病毒复制和病毒蛋白产物的移植。
在尤其优选的实施方案中，aAPC的其它组分(例如培养基、血液或血液制品等)伴有的或来源于其的异种核酸在接触可光活化的交联剂时被失活。光反应能够在温和的物理条件下消毒微生物产品并其安全系数更宽泛。
更优选地，可光活化的交联剂是补骨脂素分子家族的成员，例如在国际公布号WO 91/06665和WO 96/39820、Lin等人，1997，Transfusion，第37(4)卷，423-435页和Belanger等人，Transfusion40：1503，2000中阐述的那些。这样的交联剂可通过使其暴露于光活化剂量的辐射而被光活化。可按照本领域的指引常规选择用于测试、操作和优化参数(例如交联剂的量和浓度，以及辐射强度和时间长度)的方法(参见例如国际公布号WO 96/39820和WO 91/06665)。补骨脂素光反应有利于失活活性产物中的已知的和未知的病毒。补骨脂素失活的病毒已被证实可用作用于免疫测定的非感染性抗原和用作实验性疫苗(Hanson，Blood Cell 18:7，1992)。
可以基于本领域的教导，例如在国际公布号WO 96/39820和WO91/06665中所示例的，选择或设计可用于传递光活化剂量的辐射并由此实现交联的适宜装置。这样的示例性装置可被适宜地修改，以便它们适应本发明的具体实施方案的需要。例如，具有整合入光活化单元中的电磁辐射源的装置可以包含：用于提供适宜波长的电磁辐射以引起至少一种交联剂的光活化的工具；用于支持至少一个含有aAPC的样品、优选多个这类样品的工具，其在光活化过程中与提供辐射的工具呈固定关系；和用于在光活化过程中将样品温度维持在所需温度范围内的工具。因此，在示例性的实施方案中，可通过包含以下的步骤进行交联：支持多个样品容器，每个容器均包含aAPC组合物和可光活化的交联剂，其与电磁辐射的荧光源呈固定关系；同时用电磁辐射照射多个样品容器，以引起交联剂的光活化；并在光活化过程中将各个容器中的组合物温度保持在所需的温度范围内。
在尤其优选的实施方案中，交联剂为补骨脂素衍生物。已在多种应用中使用通过长波长UV照射光活化的补骨脂素衍生物，以失活脱氧核糖核酸和核糖核酸病毒(参见例如Brockstedt等人，Nat.Med.，第11(8)卷，853-860页(2005)；Lubaki等人，AIDS Res.Hum.Retrovirusus，第10(11)卷，1427-1431页(1994))，补骨脂素已被描述为在用UVA灯照射时与DNA和RNA的嘧啶碱基形成共价单加合物和交联(Redfield等人，Infect.Immun.，第32(3)卷，1216-1226页)。另外，Therakos在临床上已对淋巴瘤患者测试了补骨脂素/UV治疗。示例性的补骨脂素衍生物是具有包含补骨脂素核心或基序的化学结构的化合物，如下所示：
Figure A200780044507D00391
补骨脂素             8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)
             
Figure A200780044507D00392
4’-(氨基甲基)-4，5’，8-补骨脂素  amotosalen(S-59)
优选地，使用临床级和类似的高纯度级补骨脂素衍生物交联与aAPC结合的核酸。补骨脂素衍生物以适合的浓度与aAPC接触，例如约0.1μg/ml至约100μg/ml，更优选1μg/ml至55μg/ml(例如1、5、10、15、20、30、40或55μg/ml)。补骨脂素处理的aAPC组合物随后暴露于UVA(用UVA辐射)达足以实现所需失活程度的时间，UVA是长波(约320nm至约400nm)紫外线辐射。例如，可以选择约1分钟至约60分钟(例如1、3、4、5、10、15、20、30、45、60分钟)的UVA暴露。根据选择的暴露时间段选择在此暴露过程中的UVA强度，以实现所需的失活程度，例如约0.1至约100焦耳/cm2(J/cm2)，优选地，约1、5、10、15或20、40、50或100J/cm2。尽管用8-MOP加1焦耳/cm2交联处理2分钟足以失活果蝇细胞，但优选还进行交联，以便失活任何病毒污染物，同时保持或增强APC功能(与未处理的APC相比)。在示例性的实施方案中，补骨脂素衍生物(5μg/ml；8-MOP)和UVA暴露(于320-380nm照射5分钟)的剂量与用于失活HIV-1感染细胞的剂量(参见Watson等人，AIDS Res Hum Retroviruses 6：503，1990)类似。该光反应足以失活由感染后用补骨脂素/UV处理的感染性Sf9细胞分离的杆状病毒。在上清液中获得的病毒母液不含感染性病毒，其中对照病毒感染的Sf9细胞在单轮感染后包含显著量的PFU(8×108PFU/ml)。光反应阻止病毒在指示细胞系中复制，并产生含核酸的感染性颗粒。在另一个示例性实施方案中，使用2μg/ml的临床级(8-MOP)和5焦耳/cm2、10分钟的UVA辐射失活108个pfu的昆虫病毒。
优选对病毒衣壳蛋白的存在情况进行免疫测定，以证实不存在病毒复制和病毒蛋白产物的翻译。可进行测试，以证实补骨脂素/UV处理的、于27℃培养的果蝇细胞不复制，培养14天后的细胞计数可忽略。处理防止随后的果蝇细胞复制，该细胞保持失活，直至它们由于没有生长而裂解。
于320-400nm范围发射紫外线辐射的多种UVA装置是可获得的，或者可易于使用适宜的UVA发射源或较广范围的紫外辐射源连同滤波片或将辐射波长限制在UVA范围内的其它工具构建。这样的装置据说具有低端和高端的波长“截取值”，其不允许低于或高于此波长截取值的波长照射补骨脂素处理的aAPC。这样的装置还优选能够传递大致精确的辐射波长，其具有约10nm的半频宽，更优选约8nm，更优选约6nm，更优选不超过5nm。用于光失活交联剂的优选辐射波长为约365nm，具有5nm半频宽。示例性的装置包括发射源，其含有配备汞灯泡的高强度长波长UV灯。尽管该装置的辐射发射源的位置或方向可适宜地选择，但优选UVA源被定位在要照射的样品之上。其它示例性的UVA装置包括改变的照射系统，例如BaxterBiotech的4R4440型(另参见Lin等人，1997，Transfusion，第37(4)卷，423-435页)和在国际公布号WO 96/39820中公开的那些。
可能需要在光活化过程之前或过程中混合aAPC和交联剂，这可用例如用振荡器进行，适当设置振荡器使得可充分混合aAPC组合物和交联剂。而且，可能需要在基本厌氧的条件下进行光活化。可用于实施基本厌氧的光活化的示例性方法例举于Lin等人，1989，Blood，第74卷，517-525页，和Lin等人，1997，Transfusion，第37卷，423-435页。
在一个优选的实施方案中，在交联之前、过程中或之后进行冻融循环。在示例性的冻融循环中，可以使含有aAPC的适宜容器接触适宜量的液氮、固体二氧化碳(即干冰)或类似的低温材料，使得冷冻快速发生，从而冷冻aAPC。然后通过将aAPC从低温材料处移开并暴露于室温温度条件，或者通过其中利用微温水浴或温手促进较短的融化时间的易化融化方法融化冷冻的aAPC。另外，可冷冻aAPC，并在融化前储存延长的时间段。还可以融化冷冻的aAPC，然后在进一步使用前冻干。优选地，可能有害地影响冻融方法的防腐剂，例如二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)和其它防腐剂，在经历冻融循环的含aAPC的介质中不存在，或基本被除去，例如通过将aAPC转移至基本没有这类防腐剂的介质中。
可通过实施本发明可实现多种不同的优势。例如，补骨脂素/UV处理的细胞以及补骨脂素/UV处理并冷冻和融化2个循环的那些细胞的能力是比存活的活体未处理果蝇细胞好的APC。用补骨脂素/UV和补骨脂素/UV/冷冻/融化方案保持乃至增强果蝇细胞系668的APC功能的能力有助于确保果蝇细胞在接触人CD8细胞之前被失活并裂解。这增加了显著的安全特征，而不削弱aAPC的独特刺激能力。被补骨脂素/UV和补骨脂素/UV/冷冻/融化的细胞特异性刺激的CD8细胞与用存活的活体果蝇细胞刺激的那些细胞等效生长。另外，在离体培养周期结束时产生的CD8 CTL的抗原特异性特征大于用未处理的APC细胞所检测到的。用于病毒和宿主细胞核酸失活的本发明方法阻止被处理细胞的细胞生长和病毒复制。保持果蝇细胞的重要APC功能同时确保细胞治疗产品的安全性的能力是非常合乎需要的结果，应当通过更好地确保其安全性帮助减轻顾虑，使得细胞治疗剂现在可被看作是“死亡(的)”非人细胞，而不是异体移植产品。
在优选的实施方案中，由异种核酸编码的MHC分子由aAPC表达为空分子。这样的空分子基本上没有任何结合的抗原性肽或免疫原性肽或这类肽的片段。因此，aAPC可载荷一种或多种选定用于载荷的肽物质，所述“选定肽”可包含一种或多种抗原性肽物质、免疫原性肽物质或这类肽物质的片段。在某些实施方案中，在aAPC表面上表达的空MHC分子载荷一种肽物质。在其它优选的实施方案中，含有多种物质如2-6种以上物质的选定肽用于载荷空MHC分子。载荷选定肽的MHC分子可在于aAPC表面上已发生外源蛋白表达后的适宜时间进行。载荷选定肽的MHC分子还可在如上所述失活异种核酸之前、同时或之后进行。
如上所述，用选定肽加载aAPC。aAPC接触选定肽可与上述外源分子在修饰细胞表面上的表达同时或之后进行。作为该接触的结果，aAPC载荷选定肽，优选使得选定肽占据在aAPC表面上表达的MHC分子上的抗原或免疫原结合位点，该结合位点在接触选定肽之前没有结合的肽。一旦被载荷，选定肽就能够以激发原初T细胞活化的方式被提呈至原初T细胞。
用于装载空的外源MHC分子的选定肽根据要由aAPC表达的该MHC分子的具体类别选择。因此，在其中需要aAPC表达空MHC I类分子的实施方案中，结合此空MHC I类分子的选定肽接触这类aAPC，使得I类分子载荷该选定肽。在其中需要aAPC表达空MHC II类分子的实施方案中，结合此空MHC II类分子的选定肽接触这类aAPC，使得II类分子载荷该选定肽。在其中要由aAPC表达MHC I类和MHC II类这两种分子的实施方案中，可以使用结合I类的选定肽和接合II类的选定肽接触APC，使得I类和II类分子均载荷选定肽。在其中选择一种肽物质的实施方案中，该选定肽物质含有多个肽分子，每个分子在氨基酸组成和序列方面均与其它分子相同。在其中选择两种或更多种肽物质的实施方案中，两种或更多种选定肽物质的每一种均独立地包含多个肽分子，每个分子在氨基酸组成和序列方面均与其它分子相同。这两种或更多种物质各自同时或于不同场合用于接触aAPC。在这些实施方案的每一个中，多抗原性或多免疫原性MHC-肽复合物均在aAPC上生产。优选地，在近似生物结合条件的条件下发生选定肽加载在空MHC分子上，所述条件可以是在体外、离体(活体外)或体内的近似。
可被选择的示例性肽物质包括以下的(其中得到每种肽的蛋白和指定给每种肽的序列标识在圆括号中指示)：SILSLKEAST(C-凝集素；SEQ ID NO：1)、KMASRSMRL(C-凝集素；SEQ ID NO：2)、ALALAALLVV(Pec60；SEQ ID NO：3)、ALLVVDREV(Pec60；SEQID NO：4)、YMNGTMSQV(酪氨酸酶；SEQ ID NO：5)、YMDGTMSQV(酪氨酸酶；SEQ ID NO：6)、ITDQVPFSV(gp100；SEQ ID NO：7)、YLEPGPVTA(gp100；SEQ ID NO：8)、AAGIGILTV(MART-1；SEQ IDNO：9)、ELAGIGILTV(MART-1；SEQ ID NO：10)、CLTSTVQLV(Her-2/neu；SEQ ID NO：11)、HLYQGCQVV(Her-2/neu；SEQ IDNO：12)、KIFGSLAFL(Her-2/neu；SEQ ID NO：13)、IISAVVGIL(Her-2/neu；SEQ ID NO：14)、PLTSIISAV(Her-2/neu；SEQ ID NO：15)、VMAGVG SPYV(Her-2/neu；SEQ ID NO：16)、VLVKSPNHV(Her-2/neu；SEQ ID NO：17)、ELVSEFSRM(Her-2/neu；SEQ ID NO：18)、YLSGANLNL(CEA；SEQ ID NO：19)、GPLTPLPV(AES；SEQ IDNO：20)、SLLMWITQC(NY-ESO-1；SEQ ID NO：21)、KALFAGPPV(CA-125；SEQ ID NO：22)、YLETFREQV(CA-125；SEQ ID NO：23)、GLQSPKSPL(CA-125；SEQ ID NO：24)、VLLKLRRPV(CA-125；SEQID NO：25)、ELYIPSVDL(CA-125；SEQ ID NO：26)、SLLMWITQV(NY-ESO-1；SEQ ID NO：27)、ILAKFLHWL(端粒酶；SEQ ID NO：28)、STAPPVHNV(MUC-1；SEQ ID NO：29)、FLWGPRALV(MAGE-3；SEQ ID NO：30)、FMWGNLTLA(CA-125；SEQ ID NO：31)、RLVDDFLLV(端粒酶；SEQ ID NO：32)、HLSTAFARV(G250；SEQ IDNO：33)、QLSLLMWIT(NY-ESO-1；SEQ ID NO：34)、ELWTHSYKV(FBP；SEQ ID NO：35)、KVAELVHFL(MAGE-3；SEQ ID NO：36)、YIFATCLGL(MAGE-3；SEQ ID NO：37)、HLYIFATCL(MAGE-3；SEQID NO：38)、MLMAQEALAFL(CAMEL；SEQ ID NO：39)、STLEKINKT(SSX-4；SEQ ID NO：40)、KASEKIFYV(SSX-2；SEQ ID NO：41)、SLLMWITQCFL(NY-ESO-1；SEQ ID NO：42)、ELTLGEFLKL(存活素；SEQ ID NO：43)、LTLGEFLKL(存活素；SEQ ID NO：44)、SLLEKREKT(SP17；SEQ ID NO：45)、TLGEDDPWL(SART-1；SEQ IDNO：46)、KLGLKPLEV(SART-1；SEQ ID NO：47)、YLWTSAKNT(SCP-1；SEQ ID NO：48)、STAPPAHGV(MUC-1；SEQ ID NO：49)、GMGSEELRL(LIVIN；SEQ ID NO：50)、SLGSPVLGL(LIVIN；SEQ IDNO：51)、YLFFYRKSV(hTRT；SEQ ID NO：52)、CQQEETFLL(CA-125；SEQ ID NO：53)、TLAKFSPYL(PRAME；SEQ ID NO：54)、NLTHVLYPV(PRAME；SEQ ID NO：55)、STFKNWPFL(存活素；SEQID NO：56)、SLLQHLIGL(PRAME；SEQ ID NO：57)、FLDQRVFFV(gp100；SEQ ID NO：58)、FLDQRVFVV(gp100；SEQ ID NO：59)、FLDQVAFVV(gp100；SEQ ID NO：60)、GLDREQLYL(MUC-16；SEQID NO：61)、VMQHLLSPL(MUC-16；SEQ ID NO：62)、QQTHGITRL(MUC-16；SEQ ID NO：63)、LQPLSGPGL(MUC-16；SEQ ID NO：64)、TLDRDSLYV(MUC-16；SEQ ID NO：65)、QLYLELSQL(MUC-16；SEQ ID NO：66)、KVLEYVIKV(M[AGE-1；SEQ ID NO：67)、KVADLVGFL(MAGE-1；SEQ ID NO：68)、KTWGQYWQV(SEQ IDNO：70)和VLDGLDVLL(SEQ ID NO：71)。优选的肽包括拓扑异构酶II、整联蛋白β8亚基前体、MUC-1、MAGE-B2、STAT1、γ-连环蛋白和H-RYK(RTK6)。其它适宜的肽可常规选择。参见例如美国专利申请公布号2003/0022820中的某些示例性肽物质。
可经由本领域现在已知或可用的多种方法和技术，将选定的肽物质提呈至细胞，并载荷于aAPC上。所述肽可以允许它们进入胞内肽群的方式被提呈。例如，肽可经由渗透压载荷被提呈。优选地，将肽加至aAPC系统培养基。可将肽以完整的多肽或蛋白的形式加至培养基，所述多肽或蛋白随后经由细胞过程降解，例如酶降解。或者，可经由某些其它方法降解完整的多肽或蛋白，例如化学消化(例如溴化氰)或蛋白酶(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)，之后加入aAPC系统培养基。或者，可将完整的蛋白或多肽序列克隆入适宜的载体中，并插入到原核细胞中，由此细胞产生显著量的抗原性多肽，然后收获、纯化多肽，并将其消化为肽，然后将所述肽加至aAPC系统培养基。蛋白或肽的纯化可通过本领域已知的或可用的多种适宜技术实现，例如免疫亲和层析、亲和层析、蛋白沉淀、缓冲液交换、离子交换层析、疏水作用层析或大小排阻层析。
在优选的实施方案中，在表达外源MHC和辅助分子、将这些分子提呈至aAPC表面上并使提呈的MHC分子载荷选定肽之后的时间点失活aAPC。因此，这些失活的并载荷选定肽的aAPC尽管变得基本不能增殖或复制，但保留选定肽提呈功能，优选还保留原初T细胞活化功能。而且，包含载荷选定肽的MHC和辅助分子的aAPC片段的片段，例如完整细胞膜和细胞膜片段，任选地可用于活化原初T细胞。本领域已知的或可用的任何适宜方法均可用于制备、分离和操作这样的aAPC片段。
由于如上所述制备并失活的aAPC提供外源空MHC分子，所以有利的是，可将足量选定肽加至aAPC，使得在aAPC表面上实现高密度的选定肽-MHC复合物表达，所述高密度显著大于用野生型哺乳动物APC观测到的密度。可将原初T细胞/失活的aAPC培养物保持一段时间，该段时间就长度而言适于活化和富集治疗有效的CTL群体。例如，原初T细胞/失活的aAPC培养时程为约1天至约10天，例如2-9天、3-8天或4-6天。
在优选的实施方案中，如上所述制备和失活的aAPC或aAPC片段相对于还没有如此失活的APC所具有的APC功能具有增强的APC功能。增强的APC功能可反映为通过接触失活aAPC活化的CTL的CTL活性测量相对大于通过接触未失活的APC活化的CTL的CTL活性测量。CTL活性可通过一个或多个CTL活化参数检测，例如利用指示CTL细胞活化的一种或多种蛋白的细胞表面蛋白表达(例如CD69细胞表面表达)程度、分化程度、特异性细胞毒性杀伤能力程度、特异性细胞裂解程度或CTL相关细胞因子产生的程度。而且，可以通过肽-MHC(pMHC)四聚体染色检测或分离活化的T细胞，其中检测的活化T细胞对由aAPC提呈的选定肽是特异性的。在优选的实施方案中，通过使aAPC与补骨脂素衍生物复合，并使复合物暴露于UVA，以便实现增强的CD69表达，从而达到失活。
可使用本领域已知的或可用的适宜技术将活化的T细胞与aAPC分离。例如，可使用对aAPC、aAPC上载荷的肽或活化的T细胞(或其部分)特异性的单克隆抗体结合适宜的互补配体。然后可通过适宜的技术，例如免疫沉淀或免疫测定方法，由aAPC/活化的T细胞混合物提取抗体标记的细胞。或者，可完全省略分离步骤，可将失活的aAPC与活化T细胞一起留在培养物中。
在优选的实施方案中，选择用于活化的原初CD8+T细胞，使用所需量的所获CTL制备细胞治疗产品，用于治疗给药。优选地，在给药之前，对活化的T淋巴细胞或细胞治疗剂进行一项或多项质量保证测试。在优选的实施方案中，质量保证测试包括进行一项或多项测试来证实：患者和T淋巴细胞之间的HLA匹配；流式细胞术分析(CD8+，TCR+)；无菌性(无细菌或真菌生长)；细菌革兰氏染色阴性；PCR/ELISA支原体阴性；没有残余的果蝇DNA；没有昆虫病毒cDNA；存活力(>72％存活)；和依据CTL测定的溶细胞活性。
为治疗患者，将依照本发明的有效量的细胞治疗产品给予罹患或诊断为患有该疾病、障碍或病症的患者。“有效量”是一般足以在需要此治疗的患者中产生所需的治疗或预防利益的量或剂量。本发明的细胞治疗产品的有效量或剂量可通过常规方法并考虑常规因素确定，常规方法例如为建模、剂量扩大研究或临床实验，常规因素例如为给药或产物递送的方式或途径、细胞治疗产品的药代动力学、疾病、障碍或病症的严重性和过程、患者的先前或正在进行的治疗、患者的健康状态和对药物的响应以及主治医师的判断。作为示例性剂量，用于成人的细胞群可以包含约1×106个至约1×1012个活化T细胞，例如1×108至1×1011或1×109至1×1010个活化T细胞。
细胞治疗产品被制备为治疗组合物，其含有活化的T细胞和在活化的T细胞被输注入患者中之前适于维持它们的溶媒，例如药学上可接受的稀释剂或溶剂。在优选的实施方案中，细胞治疗产品在包含乳酸盐化林格式注射溶液USP(76％(v/v)、5％葡萄糖生理盐水(D5NS；4％(v/v))和25％人血清白蛋白(HSA；20％(v/v))的溶液中包含约1×109至约10×109个CTL。
可以使用任何适用于将包含细胞组分的组合物给予患者的技术。例如，可以使用经由静脉内输注给予活化的CTL细胞。可能需要或标示多次输注，这些输注可在几周或更长的时间段内进行。示例性的技术描述于例如美国专利号4,844,893和4,690,915。
任选的是，除了载荷选定肽的aAPC之外，还可对细胞治疗产品或制品补充包含其它免疫调节性组分，优选免疫刺激性组分。这样的附加组分可在原初T细胞接触载荷肽的aAPC之前、同时或之后加入。可按照相关的考虑因素，例如所需的增殖速率、扩增速率、细胞数、寿命或免疫原性，选择加入这样的补充性免疫调节性(优选免疫刺激性)组分的所需时间点以及剂量浓度和频率。补充的或免疫刺激性的组分可以为例如一种或多种非原初T细胞的白细胞、细胞因子、淋巴因子、趋化因子和抗体。可选择的示例性白细胞包括粘附细胞，例如非CD8粘附细胞、CD14+粘附细胞、单核细胞、巨噬细胞、辅助T细胞、记忆T细胞和可赋予免疫调节性，优选免疫刺激性作用或刺激的其它白细胞。这样的白细胞可为自体的或异种来源的。在优选的实施方案中，选定的白细胞为自体来源。示例性的细胞因子包括白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21；干扰素，例如γ-干扰素；和肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF-α(参见例如Tizard I.，IMMUNOLOGY：AN INTRODUCTION，第3版，129-143页，(1992)或CD70(参见例如Gen Bank登录号L08096和NCBI登录号NM_001252)、LT、4-1BBL和OX40L；美国专利申请公布号2002/0119121；和国际公布号WO 2002/022648)。细胞因子可为重组的或天然来源。在优选的实施方案中，选定的细胞因子为重组来源。示例性的抗体包括单克隆抗CD3抗体，例如标记为ORTHOCLONE(muromonab-CD3)的抗体。
在特别优选的实施方案中，自体非CD8的CD14+粘附细胞、IL-2、IL-7和单克隆抗CD3抗体制备物
Figure A200780044507D00482
在细胞治疗剂制备方法中用作额外的免疫刺激组分。在这些实施方案中，对已用载荷选定肽的aAPC进行初始刺激的原初T细胞，通过使它们与有效量的重组IL-2和重组IL-7(例如约1-100单位/ml IL-2，优选1、10、15、20、50或100单位/ml IL-2，和约1-100单位/ml IL-7，优选1、10、15、20或50单位/ml IL-7)接触，然后使它们与有效量的、自体的、载荷选定肽的、非CD8的CD14+粘附细胞(例如对每4个初始刺激的原初T细胞有约1个非CD8的CD14+粘附细胞)接触，对它们进行再刺激。优选地，IL-2/IL-7和CD14+粘附细胞接触的时间长度分别为约2天和约3天至约4天，每种再刺激均按顺序重复至少1次。在至少2次的再刺激方案之后，非特异性T细胞扩增方案包括与IL-2和抗-CD3(例如
Figure A200780044507D00483
)接触约2天至约5天。
在其它优选的实施方案中，在初始刺激或再刺激之前、同时或之后，自体CD4+辅助T细胞和IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17或IL-21与原初T细胞接触。优选地，IL-2与IL-7、IL-15或IL-21中的至少一种组合使用。在使用IL-15的情况下，IL-15的优选有效量为约1-100ng/ml，优选为1、10、20、25、40或50ng/ml IL-15。类似地，在使用IL-21的情况下，IL-21的优选有效量为约1-100ng/ml，优选为1、10、20、25、40或50ng/ml IL-21。在这些优选的实施方案中，原初T细胞可直接变成记忆T细胞。可在上述的任一种再刺激或非特异性T细胞扩增步骤之外或代替这些步骤使用这样的CD4+辅助T细胞方案，使记忆T细胞可适合多轮离体再刺激。另外，包含此记忆T细胞的细胞治疗产品在给予患者时，可随后扩增，并在遭遇选定肽和其它活化信号时在体内被刺激。一般涉及辅助T细胞制备及其掺入到IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17和/或IL-21辅助的原初T细胞刺激或扩增中以变成记忆T细胞或CTL的方法可见于例如美国专利申请公布号2002/0119121和国际公布号WO 2002/022648。
为了治疗患者，优选将细胞治疗产品给予最初由其获得用于制备细胞治疗产品的单采产物的患者。因此，对用细胞治疗产品治疗的患者优选给予含有自体活化T细胞的细胞治疗产品，更优选含有CTL的细胞治疗产品。
可用按照本发明的细胞治疗产品治疗的示例性疾病、障碍或病症包括例如免疫障碍，例如免疫缺陷障碍、自身免疫病和包括受损的、低效的或无效的免疫系统或免疫系统应答的障碍；感染，例如病毒感染、细菌感染、支原体感染、真菌感染和寄生物感染；和癌症，例如恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt淋巴瘤、甲状腺癌、子宫癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、神经胶质瘤和脑肿瘤。
用按照本发明的细胞治疗产品治疗疾病、障碍或病症可在其它治疗产品或方案之前、同时或之后进行。可与本发明的细胞治疗产品给予协同使用的示例性的其它方案、组分或治疗方法或药物包括例如：免疫刺激、免疫抑制和其它免疫治疗方案，例如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、白介素或干扰素给予；淋巴细胞清除和骨髓摧毁性方案，例如denileukin diftitox(DAB-IL2)或克拉屈滨给药；以及传统的化疗和放疗。在优选的实施方案中，淋巴细胞清除治疗方案，例如在美国临时申请号60/778,516中所公开的，与用细胞治疗产品治疗协同使用。
因此，有利的是，可在启动可能干扰、减弱或限制原初T细胞活化的其它处理或治疗之前，由罹患用本发明的细胞治疗产品可治疗的病症或疾病的患者获得原初T细胞。例如，在治疗具有瘤形成或肿瘤的个体时，可在开始化疗或放疗之前获得含有原初T细胞的淋巴单采产物，并保持在培养物中。然后可按照本发明活化原初T细胞，由此提供细胞治疗产品，其可在其它治疗方案之前、同时或之后输注到患者中。
参考以下的实施例进一步阐述本发明的其它实施方案、特征和优势。
实施例
材料
酪氨酸酶肽-YMNGTMSQV(SEQ ID NO：5).
使用GLP相符标准制备和纯化对应于人酪氨酸酶的氨基酸369-377的酪氨酸酶肽(tyr369-377)(Synpep Corporation)。将由生产商(Synpep Corporation)得到的肽粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以获得10mg/mL浓度的肽母液，并在使用前储存于-72℃至-88℃。该肽母液以等份与其它肽母液(也为10mg/ml的浓度)混合，以产生用于载荷xAPC的组合肽溶液。在10,000级洁净室中在无菌环境下在II级生物安全柜中将组合肽溶液等分入无菌小瓶中。
酪氨酸酶肽-YMDGTMSQV(SEQ ID NO：6)
使用GLP相符标准制备和纯化脱酰胺形式的上述tyr 369-377肽(Synpep Corporation)，其在肽的3位含有天冬氨酸残基来代替天冬酰胺残基。该脱酰胺形式叫做tyr 369-377d。将由生产商得到的肽粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以获得10mg/mL浓度的肽母液，其在使用前储存于-72℃至-88℃。
MART-1肽-A AGIGILTV(SEQ ID NO：9)
使用GLP相符标准制备和纯化对应于人MART-1的氨基酸27-35的MART-1肽(MART-1 27-35)(Synpep Corporation)。将肽粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以获得10mg/mL浓度的肽母液，并在使用前储存于-72℃至-88℃。
gp100肽-ITDQVPFSV(SEQ ID NO：7)
使用GLP相符标准制备和纯化对应于人gp-100的氨基酸209-217的gp100肽(gp100 209-217)(Synpep Corporation)。将肽粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以获得10mg/mL浓度的肽母液，并在使用前储存于-72℃至-88℃。
gp100肽-KTWGQYWQV(SEQ ID NO：70)
使用GLP相符标准制备和纯化对应于人gp100的氨基酸154-162的gp100肽(gp100154-162)。将由Synpep Corporation得到的肽粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以获得10mg/mL浓度的肽母液，并在使用前储存于-72℃至-88℃。
gp100肽-YLEPGPVTA(SEQ ID NO：8)
由Synpep Corporation使用GLP相符标准制备和纯化对应于人gp100的氨基酸280-288的gp100肽(gp100 280-288)。将肽粉末溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以获得10mg/mL浓度的肽母液，并在使用前储存于-72℃至-88℃。
每种前述肽以及下述的CD8α链肽(AAEGLDTQRFSG；SEQ IDNO：71)按照Merrifield(Merrifield，J.American Chemical Society，第85卷，2149-2154页(1963))的方法使用BOC-化学在ABI #430(HOBt-DCC化学)或ABI #431(HBTV化学)肽合成仪上产生。用90％氟化氢10％苯甲醚于-4℃对树脂上的受保护肽进行1小时的切割。使用0.1％三氟乙酸(TFA)的H2O溶液和0.1％ TFA的乙腈溶液的混合物通过C18反相HPLC纯化肽。通过分析型HPLC偶联电喷雾质谱分析和氨基酸分析来分析纯化的肽。这些肽作为三氟乙酸盐使用。
Isolex 300i一次性管路套件
Isolex 300i一次性管路套件是单次使用的、无菌的、无热源的、密闭的流路系统(Baxter)，与Isolex300i磁性细胞选择系统一起使用，并在使用前于室温(RT)储存。其包括旋转膜组、转移袋、管路歧管、收集袋以及初级和次级分离容器和管路接头，以允许无菌连接。Isolex一次性管路套件通过γ辐射灭菌。
CD8α链肽-AAEGLDTQRFSG(SEQ ID NO：71)
按照GLP相符标准纯化和制备CD8 α轻链肽(AAEGLDTQRFSG；SEQ ID NO：71)。在CD8+T细胞分离方法中使用CD8 α链肽，以释放使用抗CD8(37B1A)抗体和Isolex 300i磁性细胞选择系统捕获的CD8+T细胞。每批肽都由Synpep Corporation生产，以满足药物级标准，并检验其肽序列、纯度、分子量和外观。进一步加工作为粉末得到的CD8α链肽，以产生10mg/ml母液。该母液用DPBS稀释，通过0.2-μm滤器过滤，等分入无菌小瓶中，并在使用前储存于-72℃至-88℃。在10,000级洁净室中在无菌环境下在II级生物安全柜中将肽试剂装入小瓶。
Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)，1X浓度
无菌无热源的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)溶液(InvitrogenCorporation)在使用前储存于室温。DPBS用于以下步骤：在CD8+T细胞和CD8-T细胞的选择过程中运行Isolex 300i磁性细胞选择系统；在再刺激步骤中洗涤非粘附细胞，并在非特异性扩增过程中洗涤未结合的OKT3单克隆抗体；以及稀释人β2微球蛋白、IL-7、CD8肽和OKT3。
抗凝剂柠檬酸钠溶液
无菌无热源的抗凝剂柠檬酸钠溶液USP(Baxter Fenwal)在使用前储存于室温(RT)。柠檬酸钠溶液用作缓冲添加剂，用于运行选择CD8+T细胞和CD8-T细胞的Isolex 300i磁性细胞选择系统。
不通气的(non-vented)T-75烧瓶
不通气的T-75烧瓶用于培养宿主细胞和xAPC。处理过的细胞培养烧瓶具有75cm2表面积，无菌无热源，由透明聚苯乙烯材料制作。T-75烧瓶通过γ辐射灭菌，确认满足10-5的无菌保证值，存在的热源<0.5EU/mL。T75烧瓶在不使用时储存于室温。
Schneider果蝇培养基(1X浓度)
Schneider果蝇培养基是用于培养果蝇细胞的培养基。每批培养基均由供应商(Invitrogen Corporation)测试摩尔渗透压浓度、pH、无菌性和维持果蝇细胞生长的能力。Schneider果蝇培养基在使用前储存于2℃-6℃。
遗传霉素(G418)(50mg/mL)
遗传霉素(Invitrogen Corporation)是用于培养果蝇细胞的选择性抗生素，用于维持由异种核酸编码的外源分子的表达。遗传霉素作为无菌母液提供，在使用前储存于2℃-6℃。
HYQ SFX昆虫培养基(1X浓度)
Hyclone SFX昆虫培养基(Hyclone Corporation)是在xAPC的肽加载过程中使用的无血清培养基，在使用前储存于2℃-6℃。该培养基不含牛来源的产物。
硫酸铜(II)五水合物(CuSO 4 )
使用硫酸铜五水合物诱导修饰的宿主细胞表达人HLA分子、共刺激分子和粘附分子。该试剂作为晶体粉末得到。通过将CuSO4溶解在无内毒素的无菌水中制备母液，以获得200mM的浓度，在II级生物安全柜中通过0.2-μm滤器将溶液无菌过滤到无菌容器中。在使用前将过滤的母液储存于2℃至6℃。
氯化钙水合物(1M)
氯化钙水合物用于凝结得自淋巴单采产物的自体血浆，以产生用于CD8+T细胞分离或活化过程的自体血清。氯化钙水合物以晶体粉末获得，混合为母液，在使用前储存于2℃至6℃。通过将氯化钙溶解在无内毒素的无菌水中制备母液，在II级生物安全柜中通过0.2-μm滤器将溶液无菌过滤到无菌容器中。
蒸馏水
通过膜过滤和内毒素筛选获得的细胞培养级蒸馏水(InvitrogenCorporation)用作制备硫酸铜、氯化钙和白介素-2(IL-2)母液的溶剂，并在使用前储存于室温。
乙酸(17.4M)
用于制备IL-2母液的乙酸得自Sigma Corporation，在使用前储存于室温。
Plus(1X浓度)
在用Isolex 300i磁性细胞选择系统分离CD8+T细胞和CD8-T细胞之后，使用
Figure A200780044507D00542
Plus由非CD8+级分中进一步分级分离单核细胞，
Figure A200780044507D00543
Plus是没有任何动物组分的Ficoll试剂，得自Amersham Pharmacia Biotech，用于除去死细胞、嗜中性粒细胞和红细胞。该试剂在使用前储存于室温。
Figure A200780044507D00544
(1X浓度)
Figure A200780044507D00545
(B.Braun Medical Inc)是10％五聚淀粉在0.9％氯化钠中的无菌溶液，用于临床用途(NDC0264-1972-10)，在使用前储存于室温。其在冷冻保护分离的CD8-T细胞和CD8+T细胞时用作冷冻保护剂。
二甲基亚砜(DMSO)，1X浓度
DMSO在冷冻保护分离的CD8-T细胞和CD8+T细胞时用作冷冻保护剂。DMSO溶液得自Sigma-Aldrich，在使用前储存于室温。
RPMI培养基(1X浓度)
RPMI培养基(Invitrogen Corporation)为无血清的和无抗生素的培养基，用于培养T细胞。RPMI培养基在使用前储存于2-6℃。
L-谷氨酰胺(200mM；100X浓度)
200mM的L-谷氨酰胺(USP)得自Invitrogen Corporation，用作RPMI培养基补充物，在使用前储存于-80℃。
MEM丙酮酸钠溶液(100mM；100X浓度)
MEM丙酮酸钠溶液(100mM)得自Invitrogen Corporation，用于补充RPMI培养基，在使用前储存于2-6℃。
非必需氨基酸(10mM；100X浓度)
得自Invitrogen Corporation的非必需氨基酸用于补充RPMI培养基，在使用前储存于2-6℃。
HEPES缓冲溶液，(1M；200X浓度)
HEPES缓冲溶液(Invitrogen Corporation)用于补充RPMI培养基，在使用前储存于2℃-6℃。
通气的T-75烧瓶
通气的T-75烧瓶用于刺激和再刺激CD8+T细胞。处理的细胞培养烧瓶具有75cm2的表面积，无菌无热源，由透明聚苯乙烯材料制成。烧瓶在使用前储存于室温。每个烧瓶都具有通气的聚乙烯帽，其带有PTFE 0.2-μm疏水通气孔。T-75烧瓶通过γ辐射灭菌。
X-Vivo 10-细胞培养基(1X浓度)
X-vivo 10-细胞培养基由BioWhittaker提供，在使用前储存于2℃-6℃。该培养基为无血清、无酚红和无抗生素的培养基，在通过与载荷肽的xAPC接触活化的T细胞的非特异性扩增期当中使用。
无谷氨酰胺的Leibovitz氏L-15培养基(1X浓度)
Leibovitz氏L-15培养基(无L-谷氨酰胺)是一种得自Sigma-Aldrich的细胞培养基，在T细胞活化方法的肽加载步骤当中使用之前储存于2℃-6℃。
通气的T-225烧瓶
通气的T-225烧瓶在T细胞的非特异性细胞扩增过程中用于T细胞的
Figure A200780044507D00551
刺激。处理的细胞培养烧瓶具有225cm2表面积，由透明聚苯乙烯材料制作，通过γ辐射灭菌。每个烧瓶都具有通气的聚乙烯帽，其带有PTFE 0.2-μm疏水通气孔。烧瓶在使用前储存于室温。
3升Lifecell组织培养袋
具有3000mL容量的一次性使用的无菌Lifecell袋在使用前储存于室温。
0.9％氯化钠注射液
0.9％氯化钠溶液USP得自Baxter Fenwal Laboratories，在T细胞收获过程中用于细胞洗涤步骤。该溶液是无菌、无热源且无动物组分的溶液，在使用前储存于室温。
5％葡萄糖和0.9％氯化钠溶液
5％葡萄糖和0.9％氯化钠的注射溶液USP(Baxter FenwalLaboratories)作为无菌、无热源、无动物组分的溶液获得。该溶液用作活化的T细胞的储存缓冲液，在使用前储存于室温。
0.9％乳酸盐化林格氏溶液
0.9％乳酸盐化林格氏溶液USP(Baxter Healthcare Laboratories)是无菌、低内毒素的氯化钙、氯化钾、氯化钠和乳酸钠的注射用水溶液(无动物组分)，在用于收获和悬浮T细胞之前储存于室温。
终产品袋
用于容纳活化的和加工的T细胞的终产品袋为具有1000-mL容量的一次性用的无菌输液袋，由生物相容性塑料组成。这些袋在使用前储存于室温，得自Baxter Fenwal Laboratories。
Figure A200780044507D00561
冷冻管
Figure A200780044507D00562
冷冻管(1.8mL)可用于将宿主细胞、xAPC和在活化过程中产生的剩余CD8+T细胞冷冻下来。
人外周血淋巴细胞
淋巴单采产物由诊断患有黑素瘤的人类患者收集，在使用前储存于室温，用于产生自体的、患者特异性的细胞产物。
自体人血清
自体人血清用作培养分离的T细胞的蛋白源。如下由淋巴单采产物制备自体人血浆：加入氯化钙，以实现血纤蛋白凝结，然后收集液体血清相。对于短期储存，收集的液体血清相储存于4℃，对于长期储存，储存于-80℃。
果蝇主细胞库
如下所述获得来源于异种果蝇克隆B的果蝇xAPC细胞系，其用作种子储备，以产生连续的果蝇xAPC培养物。
胎牛血清
胎牛血清(FBS)用作培养宿主细胞或xAPC细胞的蛋白源，储存于-80℃。FBS得自Gemini Bioproducts，由美国来源的动物的胎牛血加工。由其获得血液的母体动物没有感染性疾病和传染性疾病以及有害寄生物。
抗CD8单克隆抗体(37B1A)，10.0mg/mL
抗CD8(37B1A)是针对T细胞的CD8抗原的鼠单克隆抗体(mAb)，其用于采用Isolex 300i磁性细胞选择系统选择CD8+T细胞。以无菌DPBS稀释浓缩溶液，用于CD8+T细胞分离或活化过程。在10,000级洁净室中在无菌环境下在II级生物安全柜中将原液通过0.2-μm滤器过滤，然后等分入一次性使用的小瓶中。等份试样在使用前储存于-80℃。
将用CD8α轻链肽(AAEGLDTQRFSG；SEQ ID NO：71)免疫的无病原体的Harlan Sprague Dawley Balb/c小鼠的脾细胞与非分泌性骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(美国典型培养物保藏中心CRL-1580)融合，产生抗CD8(37B1A)mAb。Anmed/Biosafe，Inc.的报告指出，细胞系CRL-1580不存在固有的鼠病毒和支原体。杂交瘤在补加10％热失活限定胎牛血清(Hyclone SH 30070，批号AJA9530)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长，所述胎牛血清没有细菌、真菌、病毒和支原体。根据其生产染色人CD8+细胞的抗体的能力(通过流式细胞仪评价)选择克隆37B1。之后通过有限稀释技术亚克隆该杂交瘤。扩增、冷冻亚克隆37B1A，并储存于-140℃。
为产生纯化的37B1A mAb，融化等份试样的冷冻细胞，并在补加10％限定的胎牛血清的DMEM培养基中扩增。逐渐减少培养基中的血清百分率，使细胞适于在无血清培养基(Gibco-BRL 12045-076)中培养。以中空纤维装置(Cellmax)按照生产商的说明实现细胞的放大。使用用于适应的相同无血清培养基(Gibco-BRL 12045-076，批号1066388)实现细胞生长。收集条件化培养基，通过在G蛋白Sepharose4快速柱(Pharmacia)上按照生产商的说明层析纯化的单克隆抗体。当用PCR-ELISA方法(Boehringer-Mannheim，目录号1663925)测试时，证实用于放大的细胞为支原体阴性的。用低pH缓冲液(0.1M柠檬酸盐，pH3.0)由G蛋白柱上洗脱抗体，然后通过加入Tris碱中和。然后于56℃热失活G蛋白纯化的抗体30分钟。
通过在Sephacryl S300高分辨率(Pharmacia)上按照生产商的说明进行凝胶过滤除去高分子量杂质，例如聚集的抗体。通过在QSepharose快速柱(Pharmacia)上按照生产商的说明进行离子交换层析进一步纯化37B1A mAb。在离子交换层析后，将纯化的37B1A mAb对Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)透析，通过膜过滤(0.2μm滤器)除菌，通过加入无菌DPBS调整至10.0mg/ml的浓度，并以等份试样冷冻储存于-80℃。
测试原种37B1A杂交瘤细胞，发现其对逆转录病毒物质为阴性。另外，为确保没有支原体、细菌和内毒素，对临床制备中使用的每批鼠抗CD8单克隆抗体进行测试。测试纯化的37B1A mAb批次的纯度(SDS PAGE)、无菌性、内毒素含量(发色的LAL)、支原体污染(PCRELISA)和人CD8+细胞亲和力(流式细胞术)。
Figure A200780044507D00581
M-450绵羊抗小鼠(SAM)IgG
M-450(SAM)IgG是包被多克隆绵羊抗小鼠IgG的无菌顺磁珠，其结合原初小鼠IgG。
Figure A200780044507D00583
得自BaxterOncology Inc.，在使用Isolex 300i磁性细胞选择系统进行T细胞分离前储存于4℃。
重组人β-2微球蛋白(β2M)
人β-2微球蛋白(β2M)是通过重组DNA技术产生的人血浆蛋白，以浓缩物的形式得到，然后稀释到无菌DPBS中，以获得1.0mg/mL的浓度。原液然后通过0.2-μm滤器过滤，等分入无菌小瓶中，并在xAPC的制备和肽加载以及粘附细胞的肽加载过程中使用之前储存于-80℃。
重组人白介素-7(IL-7)，30,000U/mL(1,000X浓度)
重组人白介素-7(IL-7)是在大肠杆菌中产生的淋巴因子，由供应商(PeproTech)使用高效液相层析(HPLC)但不用抗体纯化。将以粉末形式得到的IL-7在含有1％人血清白蛋白的无菌DPBS中稀释。然后原液通过0.2-μm滤器过滤，等分入无菌小瓶中，并在使用前储存于-80℃。
重组人白介素-2(IL-2)
Figure A200780044507D00591
20,000U/mL(1,000X浓度)
重组人白介素-2(IL-2)是通过重组DNA技术产生的批准用于临床用途的淋巴因子，由Chiron Corporation提供。将以粉末形式得到的IL-2稀释在IL-2稀释液(0.5％人血清白蛋白的50mM乙酸溶液)中，通过0.2-μm滤器过滤，等分入无菌小瓶中，然后在使用前储存于-80℃。
Figure A200780044507D00592
无菌溶液，1.0mg/mL(OKT3)
Orthoclone 
Figure A200780044507D00593
是一种对T细胞的CD3抗原特异性的鼠单克隆抗体，其作为无菌溶液在安瓿中提供，已被批准用于临床用途(得自Ortho Biotech)，在无菌环境下将其等分入一次性使用的小瓶中，并在用于活化T细胞之前冷冻储存于-80℃。OKT3产品信息包括剂量和给药以及制备方法的参考，例如在Reinherz等人，Cell，19(4)：821-827(1980)；Chatenoud等人，J.Immunology，137(3)：830-838(1986)；和Physicians′Desk Reference，1553-1554页(1990)中给出。
25％人血清白蛋白(HSA)
25％HAS，USP(Baxter Fenwal Laboratories；每批的血浆源经测试对HIV-1、HIV-2、HCV和HBV为阴性)在以下的T细胞制备和活化步骤当中用作缓冲蛋白源之前储存于室温：CD8+T细胞和CD8-T细胞的纯化；粘附细胞的肽加载；以及活化的T细胞的最终配制。
aAPC的制备
获得aAPC的细胞系
异种APC细胞系由Schneider SC2细胞(SC2细胞)产生，SchneiderSC2细胞最初在1969年由数百个20至24小时龄的Oregon-R(野生型)果蝇(Oregon-R)胚(美国典型培养物保藏中心(ATCC)CRL-1963)按照已公开的程序(Schneider，J.Embryol.Morph.27：353-365，1972)建立，并保藏于ATCC(CRL10974)。为了产生xAPC，用得自质粒载体pRMHa-3(关于pRMHa质粒载体的构建和使用参见美国专利号6,225,042)的载体转染S2细胞。用编码HLA-A2.1I类、B7.1和ICAM-1的载体转染在本文称为克隆A的1个xAPC细胞系。用编码HLA-A2.1I类、B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA-3的载体转染在本文称为克隆B的第二个xAPC细胞系。用编码HLA-A2.1I类、B7.1、ICAM-1、LFA-3和CD70的载体转染在本文称为克隆C的第三个xAPC细胞系。因此，克隆A表达HLA-A2、B7.1和ICAM-1，克隆B表达HLA-A2.1I类、B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA-3，克隆C表达HLA-A2.1I类、B7.1、ICAM-1、LFA-3以及CD70.B7.2和LFA-3。
aAPC细胞系维持、诱导和肽加载
将由克隆A和克隆B遗传的细胞的独立连续培养物保持在补加10％胎牛血清和500μg/ml遗传霉素(G418)的Schneider培养基中，并一周2次拆分传代，在每次拆分传代过程中加入新鲜培养基，以将细胞密度调整至约1×106个细胞/mL。在诱导前约1天(-2至-4天；其中第0天被定义为经测试细胞表达外源分子并载荷肽的那天)，用一定体积的细胞悬浮液接种3×T75烧瓶，所述细胞悬浮液保持在储用培养物中，相当于1.5×107个细胞/烧瓶。加入无G418的完全果蝇-SFM培养基，以使体积上升到15ml/烧瓶。然后将烧瓶在约27℃的室中温育。在约-1至-3天时，通过加入硫酸铜(CuSO4)至终浓度为1.0mM(1:200稀释度的200mM CuSO4母液；对于含15ml细胞悬浮液的每个T75烧瓶为75μl CuSO4)诱导细胞，并返回至27℃室。诱导时间持续约24-72小时。
在第0天，目检和显微镜检查含有诱导的细胞培养物的烧瓶的污染证据。合并未污染的烧瓶，并计数活细胞。使用荧光辅助的细胞分拣仪(FACS)分析通过流式细胞术评价约6×106个细胞的合并细胞培养物的样品，以确定外源分子的表达水平。然后测试细胞培养物(约1×107个细胞/mL)，以在载荷肽之前证实外源HLA-A2.1、B7.1和ICAM-1(对于克隆A细胞)或HLA-A2.1、B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA-3(对于克隆B细胞)的表达。一旦证实了外源分子的表达，将每种培养物拆分入两个无菌的50-ml圆锥管中洗涤每种细胞培养物。然后将HYQ SFX昆虫培养基装入每管，并以1,700rpm(600×g)离心约7分钟，以沉淀细胞。废弃上清液，再以1,700rpm(600×g)离心含细胞沉淀的管约1分钟。用细嘴移液管除去上清液。然后将每个拆分细胞培养物的沉淀合并在一起，然后用8mL SFX昆虫培养基重悬浮至约1×107个细胞/mL的细胞密度。将约40μL的1.0mg/mL β2微球蛋白母液和24μL肽组合母液(每种肽为1.67mg/mL)的1:50稀释液加入每个重悬浮培养物。因此，每种细胞培养物悬浮液都含有终浓度为约5μg/mL的β2微球蛋白，以及终浓度为每种肽约0.1μg/mL的载荷到xAPC上的每种选定肽。细胞培养物在含有β2微球蛋白和肽的悬浮液中于室温温育至少4小时但不超过8小时，每30分钟涡旋1次。在肽温育期后，将约1-mL等份的每种细胞培养物单独分配入8个聚丙烯管(Falcon2006)中。废弃任何残余的细胞培养悬浮液。
程序
实施例1：果蝇aAPC的表征
测试支原体和外来病毒
由BioReliance对支原体和外来病毒污染进行检验。按照在表I中概述的标准安全性测试名单测定果蝇xAPC主细胞库无支原体和外来病毒。本文使用的术语“基本没有污染”是指细胞培养物基本没有污染因子，包括核酸、细菌、病毒和支原体，尤其是活细菌、感染性病毒和支原体。
表I：果蝇xAPC的测试
Figure A200780044507D00621
当将果蝇xAPC细胞系接种在指示细胞上时未检测到外来病毒污染物，观察细胞的细胞病变作用、血细胞吸附和血细胞凝集达14天。延长测定的温育时间至总共42天，以便在下述的细胞治疗产品生产过程中CD8+效应细胞的离体培养时间大于31天。在此延长的测定温育持续时间当中，在果蝇xAPC中未检测到外来病毒污染物。
果蝇xAPC与昆虫指示细胞系(果蝇和白纹伊蚊(Aedes albopictus))的共培养导致在果蝇xAPC中存在的果蝇X和HPS-1-样病毒均转移至果蝇细胞系中，但不转移至使用的蚊细胞系中。用作指示细胞的果蝇和蚊细胞系对野田村病毒均为阳性，使得不可能评价野田村病毒由果蝇xAPC向所用的指示细胞系的转移。
测试逆转录病毒-逆转录酶
在BioReliance对果蝇xAPC进行测试，以证实没有逆转录病毒-逆转录酶(RRT)活性。测试xAPC细胞系的Mn++和Mg++依赖性逆转录病毒逆转录酶的存在情况。未检测到这些逆转录病毒逆转录酶存在的证据。
由服务实验室对果蝇xAPC进行的透射电子显微镜术(TEM)揭示，在细胞的核(20/100细胞，40-45nm直径，类似于乳多泡病毒)和胞质(1/100，约30nm，类似于野田村病毒)中存在病毒样颗粒(VLP)。随后在另一个服务实验室对果蝇xAPC的TEM分析未检测到可识别的逆转录病毒样颗粒；然而，在细胞中观察到具有与呼肠孤病毒一致的特征的VLP，但不能进行阳性鉴定。由于在两个实验室鉴定的病毒颗粒类型有差异，所以使用果蝇xAPC和Schneider S2(SC2)亲代细胞系这二者的样品重复测试。还将细胞送至第三个服务实验室。该第三个评价的结果表明，全部三个细胞系都包含两类或可能三类相同类型的病毒颗粒：
1)在90％的细胞的细胞核中存在的30nm大颗粒，具有的量由<5个颗粒/切片至非常大的颗粒形成晶体排列的累积。颗粒与细小病毒科浓核病毒属的病毒最一致，还已知其感染昆虫细胞系；
2)独有地存在于胞质中的50nm大颗粒。尽管更难于检测，但这些颗粒没有第一种常见。它们是电子致密的，在胞质中也形成晶体排列。它们可能是在胞质中复制的呼肠孤病毒颗粒，已知感染昆虫细胞系；和
3)在某些细胞的胞质中观察到15-20nm电子致密的大颗粒，一般认为其代表病毒蛋白累积的细胞结构，或者可能是野田村病毒样颗粒。
在得自ATCC的亲代细胞系中存在相同的VLP表明，它们在建立xAPC细胞系之前存在。TEM分析揭示，VLP在果蝇细胞系2的细胞核和胞质这二者中。颗粒存在于大部分细胞切片中，尽管观察到的数量由单个颗粒到大聚集体变化，类似于以上对克隆SC2和果蝇xAPC细胞系报告的发现结果。细胞旺盛生长，不管颗粒的存在情况，颗粒与细胞的关系的性质在那时仍是未知的。测试和在分析果蝇亲代细胞系SC2和两个果蝇xAPC细胞系时获得的结果汇总于表II：
表II
SC2、xAPC细胞系A和xAPC细胞系B的分析
 
测试 SC2 果蝇xAPC细胞系A 果蝇xAPC细胞系A
支原体 ND1 阴性 阴性
TEM2 对VLP阳性3 对VLP阳性 对VLP阳性
RPT活性4 ND ND 阴性
病毒污染物(在体外)514天测定 ND 阴性 阴性
病毒污染物(在体外)542天测定 ND 阴性 ND
病毒污染物(在体外)6 ND ND 阴性
1未测定
2透射电子显微镜术
3病毒样颗粒(通过结构、大小和位置鉴定为浓核病毒和呼肠孤病毒)
4逆转录病毒逆转录酶活性
5当测试颗粒接种在指示细胞系上时检测外来病毒污染物的测定
6检测病毒的测定，其在细胞培养系统不产生可辨别作用
选择果蝇xAPC细胞系A进行进一步的表征，并在实施例的剩余部分中用作xAPC。因此，果蝇xAPC细胞系A在以下被称为果蝇xAPC或xAPC。
果蝇xAPC细胞系A的病毒样颗粒的分离和表征
VLP由果蝇xAPC裂解物沉淀，并通过平衡CsCl密度梯度离心纯化。VLP于密度1.30g/mL、1.36g/mL和1.41g/mL形成区带。纯化的颗粒通过电子显微镜、SDS/PAGE、核酸提取和测序分析。这些级分的负染色继之以透射电子显微镜术导致在这些级分中观察到3类颗粒：
1)于密度1.41的级分由约42nm直径的非包膜二十面体颗粒组成。这些颗粒与在细胞核中观察到的颗粒一致，被认为是浓核病毒样的；
2)于密度1.36的级分由约30nm直径的非包膜颗粒组成，证实在某些细胞的胞质中观察到的结构不是病毒蛋白累积的结果，而是最有可能来自野田村病毒科(Nodaviridae)的颗粒累积的结果；和
3)于密度1.30的级分由与密度1.41的颗粒相同的约42nm直径的非包膜二十面体颗粒组成。另外，在该级分中发现一些较大尺寸(60nm)的二十面体颗粒，其与在细胞胞质中观察到的颗粒相一致，被认为是呼肠孤病毒样的。
VLP分析的结果概述于表III：
表III
由果蝇xAPC纯化的病毒颗粒的表征
 
密度(g/mL) 病毒候选物 尺寸 蛋白 核酸 DNA序列分析
1.41 HPS-1样 42nm ～100kD dsRNA(6kb) 与RNA依赖性RNA聚合酶28％同源
1.36 果蝇野田村病毒科 30nm 43kD ssRNA(3.0kb+1.2kb) 与FHV1、BBV2和BV388％同源
1.304 空HPS-1样果蝇X病毒 42nm60nm ～100kD 无核酸 N/AND
1FHV＝兽棚病毒(昆虫野田村病毒)
2BB＝黑甲虫病毒(昆虫野田村病毒)
3BV＝布拉拉病毒(Boolarra virus)(昆虫野田村病毒)
4鉴定出两类颗粒；60nm颗粒占纯化制备物的1:100
ND＝未测定；N/A＝不适用
密度1.41的颗粒
基于蛋白和核酸的分析，密度1.41的颗粒似乎不属于浓核病毒科(Densoviridae)属，其特征在于4-6kb的dsDNA和40-90kd范围的至少3种结构蛋白。进行100kd多肽的N-末端测序，氨基酸序列用于克隆病毒基因组的同源N-末端序列。序列分析表明该蛋白是新的，与病毒RNA依赖性RNA聚合酶28％同源。质谱分光光度(MALDI-MS)分析也证实了该蛋白的新颖性。胰蛋白酶消化和Edman测序由100kd蛋白纯化的肽证实核酸数据。基于纯化的病毒核酸的RNA酶和DNA酶分析证实，基因组实际上是dsRNA，而不是dsDNA，由此排除了浓核病毒为3种昆虫病毒之一。这些观察结果与Scott等(参见例如Scott等人，Cell，33(3)卷，929-941(1980))描述的果蝇SC2细胞的HPS-1病毒最一致。该病毒被描述为主要在感染细胞的细胞核中存在的36-nm直径的非包膜病毒体。纯化的颗粒以1.41密度存在，并含有约6kb长度的dsRNA的单个区段，与次要蛋白(200kd)一起和被认为是病毒衣壳蛋白的主蛋白(120kd)结合。
开发实时定量RT/PCR测定，以检测细胞中HPS-1样病毒的存在情况。所述程序导致长241个碱基的病毒特异性序列扩增。HPS-1样特异性病毒模板掺入由CD8+细胞制备的cDNA中的实验证实了病毒检测的灵敏度为10-100个拷贝/μgDNA。
密度1.36的颗粒
由纯化的密度1.36的颗粒的蛋白和核酸分析证实，该病毒来自野田村病毒科属。完成了代表RNA1(3.0kb)的DNA测序，发现与兽棚病毒约90％同源，兽棚病毒是野田村病毒科的一种昆虫病毒。还完成了RNA2区段的全长克隆和测序，43-kd衣壳蛋白的N-末端氨基酸序列与果蝇野田村病毒科病毒(DrNV)分离的衣壳蛋白DNA和兽棚病毒同源，如下所示：
DrNV DNA：MVNNIKPRRQRSQRV(SEQ ID NO：80)
43kd蛋白：VNNIKPKRQRPQ-V(SEQ ID NO：81)
兽棚病毒DNA：MVNNIKPRRQRAQRV(SEQ ID NO：82)
开发实时定量RT/PCR测定，以检测细胞中果蝇野田村病毒科病毒的存在情况。所述程序导致长133个碱基的病毒特异性序列扩增。野田村病毒科特异性病毒模板掺入由CD8+细胞制备的cDNA中的实验证实了病毒检测的灵敏度为10-100个拷贝/μg DNA。
密度1.30的颗粒
由密度1.30的颗粒进行核酸提取不能产生DNA或RNA。该制备物的SDS/page谱与对密度1.41的制备物所获得的谱相同。这些结果和电子显微镜观测结果一起提示，该制备物主要包含空HPS-1病毒颗粒，某些较大的颗粒(60nm)的数目不足以进一步表征。
业已报道，具有与该第三种病毒相适的特征(定位、形成晶体阵列和大小)、来自呼肠孤病毒属的许多病毒感染昆虫细胞，包括果蝇(参见例如Haars等人，Virology，101(1)卷，124-130页(1980))。基于在昆虫呼肠孤病毒中保守的序列，产生大量PCR引物，使用其筛选由果蝇xAPC制备的cDNA。由这些细胞制备的cDNA没有扩增出呼肠孤病毒序列。
果蝇X病毒(DXV)是双RNA病毒科(Birnaviridae)的dsRNA病毒，已知感染某些果蝇细胞系(参见例如Shwed等人，Virology，296(2)卷，241-250页(2002))。60-nm的病毒体具有1.34的浮力密度，空壳体于1.29密度沉降。基因组由两个区段组成：区段A(3360bp)和区段B(3100bp)。设计对DXV特异性的PCR引物组，并用于探测DXV在果蝇xAPC中的存在情况。获得预期分子量的PCR扩增条带，扩增片段(682bp)序列与公开的DXV序列相同。
另外，由密度1.36的纯化级分克隆某些DXV序列连同大部分野田村病毒科序列。这些结果与公开的文献相一致，所述公开的文献描述了浮力密度1.33-1.34的感染性颗粒和1.29的空颗粒。因此，通过TEM观察到的于密度1.30级分的60-nm颗粒基于大小和形状被认为不是呼肠孤病毒科，而是空DXV颗粒。这解释了不能由这些VLP提取DNA或RNA。
开发实时定量RT/PCR测定，以检测细胞中果蝇X病毒的存在情况。该程序导致起源于长178个碱基的病毒聚合蛋白质的病毒特异性序列扩增。DXV特异性病毒模板掺入由CD8+细胞制备的cDNA中的实验证实了病毒检测的灵敏度为10-100个拷贝/μg DNA。
实施例2：xAPC的失活
戊二醛固定
最初在没有防腐剂的情况下用戊二醛固定尝试失活果蝇细胞。用0.3％戊二醛固定的果蝇xAPC能够抗原特异性增殖CD8+T细胞(比未固定细胞低2.5倍至6倍)、CD8+T细胞活化(比未固定细胞低2倍)和产生能够裂解靶细胞的CD8+T细胞(一定程度上低于未固定细胞)。因此，发现该失活方法产生的果蝇xAPC相对于未通过戊二醛固定方案失活的细胞减弱了APC功能。
冻融循环
在第二次尝试失活果蝇xAPC而不减弱xAPC功能时，实施一系列冻融循环。冷冻循环使xAPC置于液氮或干冰(固体CO2)中，直至xAPC完全被冷冻(例如约1分钟)，然后由液氮或干冰中取出xAPC，并使xAPC达到室温。用在没有防腐剂二甲基亚砜(DMSO)的介质中的xAPC进行冻融循环。根据锥虫蓝染色评价，该方法在两个冻融周期后产生100％的非存活(即死亡)细胞。这些非存活细胞能够刺激CD8+T细胞，产生的CTL具有的抗原特异性细胞裂解活性与采用未进行冻融循环的果蝇xAPC刺激的CD8+T细胞观察到的细胞裂解活性相当。另外，冻融研究证实，果蝇xAPC可被诱导、载荷肽和冻融，然后用于刺激原初T细胞；因此，果蝇xAPC不需要连续进行培养，以便保持xAPC功能。
补骨脂素/UVA处理
冻融方法证实，变得基本上非存活的果蝇xAPC保留了活化原初T细胞的能力。然而，仍担心与xAPC结合的异种核酸在冻融循环后可能保留一定活性或一定程度的细菌或病毒污染。由于希望失活与xAPC结合的异种核酸，以产生高度功能性的、基本没有DNA、RNA、细菌或病毒污染的抗原提呈系统，所以测试了一种失活方案，其包括使xAPC接触补骨脂素家族分子成员，之后暴露于长波紫外线辐射(UVA)。使用不同的补骨脂素家族成员进行了几个研究，这些成员包括：补骨脂素(7-H-呋[3，2-g]-苯并吡喃-7-酮，得自Sigma)和临床级的补骨脂素衍生物9-甲氧基-7H-呋[3，2-g]-1-苯并吡喃-7-酮(也称为甲氧补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)，并以商标名UVADEXTM售卖)。
杆状病毒/Sf9感染性测定用于确定补骨脂素衍生物/UVA处理是否足以失活与病毒感染的昆虫细胞结合的病毒。用BacPAK6病毒母液感染Sf9昆虫细胞，并于室温温育1小时(BacPAK6杆状病毒快速滴定试剂盒；BD Biosciences Clontech)。感染的细胞未被处理或用(5μg/ml)UVADEXTM处理，并用来自容器上的光源和容器下的光源的长波紫外线辐射(320nm-380nm，UVA)照射约5分钟(10-15mW/cm2)。在照射后第5天，收集培养上清液。由这些上清液分别经10-3、10-4和10-5的连续稀释制备新病毒母液。这些连续稀释的病毒母液各自用于感染第二组新鲜的(即先前未感染的)Sf9细胞培养物。该第二组培养物用甲基纤维素覆盖，并培养约48小时。废弃该第二组培养物的培养上清液，加入小鼠单克隆抗gp64(杆状病毒特异性的)蛋白抗体(Invitrogen)。在温育期和几次洗涤以除去未结合的抗-gp64抗体之后，加入缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠多克隆抗体(即得自Invitrogen的二抗)。用几次洗涤除去未结合的二抗，并加入过氧化物酶。计数染色病灶的数目，按照生产商的说明计算病毒滴度(pfu/ml)。
如在下表IV中所示，5分钟UVA(350-400nm)照射时间段足以防止杆状病毒在Sf9指示细胞培养物中复制，而对照的未处理细胞含有的杆状病毒病毒滴度为8×108个蚀斑形成单位(PFU)/ml。
表IV：UVADEXTM/UVA处理抑制
在杆状病毒感染的Sf9细胞中的病毒复制
Figure A200780044507D00701
在相似的实验中，用如上所述的渐增剂量的杆状病毒感染Sf9细胞。然后用5μg/ml UVADEXTM于4℃处理感染的细胞30分钟，之后分别UVA照射0分钟、2分钟、10分钟或20分钟。然后将处理的细胞于28℃培养4天。收集培养上清液，并用于感染在96孔板中接种的新的Sf9细胞培养物。通过快速微量滴定测定(Invitrogen)检测在Sf9细胞中的杆状病毒。用甲基纤维素覆盖培养板，并培养48小时。通过采用gp64特异性抗体(Invitrogen)的免疫测定检测杆状病毒。计数每个孔中的焦点数，并按照生产商的说明计算感染细胞上清液的病毒滴度(pfu/ml)。在图1中所示的结果证实，UVADEXTM处理继之以2分钟的UVA暴露将收集的培养物上清液的杆状病毒滴度降低至不足在未处理/暴露的细胞中观察到的杆状病毒滴度的10％。UVADEX处理继之以10和20分钟的UVA暴露时间分别产生不可检测的杆状病毒滴度。
为了确定补骨脂素/UVA处理是否可以抑制xAPC的增殖，果蝇克隆B xAPC未被处理，或用5μg/ml UVADEXTM于4℃处理30分钟，之后UVA处理0、2、10或20分钟。洗涤处理的xAPC，以完全去除残余的UVADEX，然后将未处理的和处理的xAPC均以1×106个细胞/ml接种在6孔板中，并连续培养16天。在处理后的第1天、第5天、第9天、第14天和第16天，通过锥虫蓝染色每种培养物计数存活的(即活的)xAPC。
如在图2中所示，果蝇xAPC增殖被所测试的每个UVA暴露时程有效抑制，所有UVADEX/UVA处理的培养物的存活力在UVADEX/UVA处理后约9天被抑制约50％。而且，至UVADEX/UVA处理后2周时在任何处理的培养物中都几乎没有检测到存活的细胞。相反，非UVADEX/UVA处理的xAPC显示出强壮的存活力，在14天内培养物中的细胞计数几乎增加2倍。因此，推断UVADEX/UVA处理有效减弱xAPC增殖，即便在所测试的最低的UVA时程(2分钟)。
导入到xAPC中的异种核酸有可能保持活性，即使xAPC自身变得不可增殖。为了确定补骨脂素/UVA处理是否失活导入到xAPC中的异种核酸，在γ-辐射或UVADEX/UVA处理后进行果蝇克隆B xAPC的异种核酸转录的分析。果蝇克隆B xAPC或者未被处理，用UVADEXTM(5μg/ml)/UVA处理，或者用γ辐射处理50分钟(传递约16,000拉德)。洗涤每个xAPC培养物，并与本文称为克隆D的指示果蝇细胞系共培养10周，该细胞系是还没有通过导入异种核酸而修饰的细胞系。然后使用对异种HLA A2.1、B7-1、B7-2和β2m转录物特异性的引物对共培养物的提取物进行逆转录酶(RT)-PCR反应。结果示于图3，表明未处理的和γ辐射处理的xAPC含有活化的异种核酸，以检测到异种HLA A2.1、B7-1、B7-2和β2m转录物(分别为泳道2和3)为证。相反，不管UVA处理持续时间，用UVADEXTM(5μg/ml)和UVA处理的xAPC没有一个含有活化的异种核酸，以没有可检测水平的异种HLA A2.1、B7-1、B7-2和β2m转录物为证。因此，推断UVADEX(5μg/ml)/UVA处理xAPC失活导入到xAPC中的异种核酸。
由于除了导入到xAPC中的异种核酸之外还有某些外来的细胞裂解病毒、支原体和其它微生物可能与xAPC结合，因此需要确定UVADEX/UVA处理方案是否失活这些潜在的xAPC污染物。因此，收集含有约6×108个果蝇xAPC的xAPC培养物(克隆B)，悬浮在处于冰上的0.6ml Schneider培养基中，并超声30秒。通过离心沉淀细胞碎片，收集上清液，并以3体积上清液对1体积CsCl的比率分层加在密度1.2(20％w/w CsCl)的氯化铯(CsCl)垫上。然后以25,000rpm超离心载荷上清液的CsCl垫4小时。收集病毒级分，并检测级分密度。合并密度1.0-1.2的3ml级分，并对磷酸缓冲盐水(PBS)透析，产生病毒母液，将病毒母液储存于-80℃，直至使用。对相当于约1×108个xAPC的裂解物的等份病毒母液进行UVADEXTM/UVA处理(5μg/ml，10分钟)，或未处理。将果蝇克隆D指示细胞系的独立培养物(1×106个细胞/培养物)于28℃与处理的或未处理的病毒等份试样温育。在3天温育期后，收获指示细胞系，并用碘化丙锭(PI)(1μg/1×106个细胞)于4℃染色10分钟。通过FACS分析活细胞和裂解细胞，结果示于图4A-4C。
分离自xAPC的未处理的病毒母液等份试样感染相当于约1×108个噬斑形成单位(pfu)的指示细胞系，导致指示细胞系培养物中基本上所有细胞都裂解，如通过显微镜检查培养物样品所观测到的(代表性的显微镜视野的图片，图4A)。相反，分离自经受UVADEXTM/UVA(5μg/ml，10分钟)的xAPC的病毒母液等份试样不能产生任何可观测的指示细胞感染或裂解(代表性的显微镜视野的图片，图4B)。
在相似的实验中，一组由10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9稀释度组成的xAPC病毒母液的连续稀释液在与果蝇克隆D指示细胞培养物温育前或者未被处理，或者用UVADEX/UVA(5μg/ml，10分钟)处理。在3天的温育期后，定量每个指示细胞培养物中的存活细胞的百分率。反映在图4C中的结果表明，处理的病毒级分于最低测试稀释度之外的所有稀释度几乎完全不能感染和裂解指示细胞培养物。然而，未处理的病毒级分于10-5病毒级分稀释度能够有效裂解约80％的指示细胞培养物。
为证实与UVADEXTM/UVA处理的xAPC结合的异种核酸对克隆D指示细胞不是瞬时感染性的，且不在克隆D指示细胞中瞬时表达，进行果蝇xAPC克隆B/克隆D共培养物的荧光活化的细胞分拣仪(FACS)分析。为了比较，同样通过FACS分析γ辐射处理的xAPC克隆B/克隆D共培养物和未处理的xAPC克隆B/克隆D共培养物。
果蝇xAPC培养物(克隆B)未被处理，用UVADEX/UVA(5μg/ml)处理，或者γ辐射处理50分钟(传递约16,000拉德)。洗涤每种培养物的细胞，然后与克隆D指示细胞共培养10周。收集共培养的细胞并等分，每等份试样分别用HLA-A2、B7-1和ICAM-1异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的单克隆抗体(mAb)之一染色。然后通过FACS分析染色的共培养物。如在图5中所示，含有未处理的xAPC的共培养物表达HLA-A2、B7-1和ICAM-1；含有γ辐射处理的xAPC的共培养物表现出适度但显著的HLA-A2、B7-1和ICAM-1表达；含有UVADEXTM/UVA处理的xAPC的共培养物表现出不可检测水平的HLA-A2、B7-1和ICAM-1。
在相似的实验中，诱导果蝇xAPC培养物，以表达由重组载体编码的外源分子，然后与UVADEXTM(5μg/ml)温育，并用UVA处理0、5或15分钟。洗涤xAPC培养物，用对HLA-A2、B7-1或ICAM-1特异性的单克隆抗体染色，并通过FACS分析。如在图6中所示，对于所测试的所有UVA时程，3种外源分子中每一种的表面表达水平基本相同。
总之，这些结果证实，通过补骨脂素/UVA处理失活的果蝇xAPC变得基本上无活力和基本上无感染性。另外，xAPC诱导表达外源核酸，使得编码蛋白在补骨脂素/UVA介导的失活之前在xAPC细胞表面上表达，在失活后保留外源蛋白失活前的表达水平。
原初T细胞在与失活的果蝇xAPC温育时的选定肽特异性扩增和活化
由HLA-A2阳性供体的外周血单核白细胞(PBMC)纯化原初CD8+T细胞，并在对应于人MART-1的氨基酸27-35(AAGIGILTV；SEQ IDNO：9)的10μg/ml MART-1肽存在下，于37℃与UVADEX TM/UVA处理的xAPC或
Figure A200780044507D0074114034QIETU
/UVA加冻融处理的xAPC培养。在培养期的第5天之后各自加入人重组(r)IL-2(20单位/ml)和rIL-7(30单位/ml)。在存在MART-1肽的情况下，在培养期的第7天和第15天用来自相同供体的PBMC中的非CD8粘附细胞再刺激CD8+T细胞2次。在培养21天后通过锥虫蓝染色计数扩增的CD8+T细胞。结果概述于以下的表V，表明当xAPC未被处理、UVADEXTM/UVA处理或UVADEXTM/UVA加冻融处理时，被刺激的CD8+T细胞以相似速率增殖(即扩增)。
表V：在与载荷肽的xAPC培养后的CD8+T细胞数
 
实验(21天) 未处理(CD8+×106) UVADEX/UVA(CD8+×106) UVADEX/UVA+冷冻(CD8+×106)
供体1 38.20 42.60 52.90
供体2 11.96 9.94 13.44
供体3 26.04 24.24 35.04
供体4 16.74 15.66 17.80
由HLA-A2阳性供体的PBMC纯化原初CD8+T细胞，并在10μg/ml MART-1肽(氨基酸序列AAGIGILTV(SEQ ID NO：9))存在下，与UVADEXTM/UVA处理的xAPC或冻融的和UVADEXTM/UVA处理的xAPC于37℃培养。在第5天将人rIL-2(20单位/ml)和rIL-7(30单位/ml)各自加入培养物。在MART-1肽存在下，在培养期的第7天和第15天用来自相同供体的PBMC中的非CD8粘附细胞再刺激CD8+T细胞2次。然后用MART-1四聚体(Beckman Coulter)染色扩增的CD8+T细胞，所述四聚体由4个结合缀合至荧光蛋白的MART-1肽的MHC分子组成，并通过FACS分析。结果概述于下表V，表明原初CD8+T细胞与处理的xAPC的温育导致来源于所有测试供体的肽/MHC四聚体(pMHC)阳性CTL的百分率更大。此外，原初CD8+T细胞与UVADEX/UVA加冻融处理的xAPC的温育导致在4个供体中的3个(供体1、2和3)当中，pMHC四聚体阳性CTL的百分率比单独的UVADEX/UVA处理的xAPC更大。
表VI
在与载荷肽的xAPC培养后CD8+T细胞的p/MHC四聚体百分率
 
实验 未处理(％四聚体+CD8+) UVADEXTM(％四聚体+CD8+) UVADEXTM/冷冻(％四聚体+CD8+)
供体1 0.81 0.95 1.52
供体2 9.94 11.55 14.50
供体3 8.71 15.07 21.35
供体4 20.06 43.33 21.88
为进一步研究失活的xAPC在载荷选定肽时活化原初T细胞以变成CTL所达到的程度，由HLA-A2阳性供体的外周血单核细胞(PBMC)纯化原初CD8+T细胞，并在对应于人MART-1蛋白的氨基酸27-35(AAGIGILTV(SEQ ID NO：9))的10μg/ml MART-1肽存在下，与未处理的果蝇xAPC、UVADEXTM/UVA处理的果蝇xAPC或UVADEX/UVA加冻融处理的果蝇xAPC于37℃培养。在培养期的第5天将人重组白介素(rIL)-2(20单位/ml)和rIL-7(30单位/ml)加入每个培养物。在MART-1肽(SEQ ID NO：9)存在下，在培养期的第7天和第15天用来自相同供体的PBMC中的非CD8粘附细胞再刺激CD8+T细胞2次。在培养期的第21天收集培养的CD8+T细胞，通过标准51Cr释放测定检测CTL活性，该测定提供了特异性细胞杀伤(即细胞裂解活性)的直接检测。
结果示于图7，表明来自4个供体中的3个(供体1、3和4)的CTL在被UVADEX/UVA处理的xAPC或UVADEX/UVA加冻融处理的xAPC活化时，相对于被未处理的xAPC活化的CTL，表现出更大的特异性杀伤％。相对于未处理的xAPC，供体2的CTL在被UVADEX/UVA处理的xAPC活化时表现出较低的特异性杀伤％，但被UVADEX/UVA加冻融处理的xAPC活化时表现出较大的特异性杀伤％。而且，在4个供体中的3个(供体1、2和3)当中，被UVADEX/UVA加冻融处理的xAPC活化的CTL比通过单独的UVADEX/UVA活化的CTL表现出更大的特异性杀伤％。
总之，这些实验证实，经受补骨脂素/UVA或补骨脂素/UVA加冻融方案的xAPC变得基本上无活力和基本上无感染性，并相对于未经受这些失活方案的xAPC所具有的那些，具有基本相等或增强的外源蛋白表达、选定肽加载和提呈以及原初CD8+T细胞活化特性。
为了研究用补骨脂素/UVA处理的xAPC观测到的增强的APC功能的分子基础，使表达Kb、B7-1和ICAM-1分子的果蝇xAPC载荷OVA8肽(SIINFEKL；SEQ ID NO：69)，然后用或不用UVADEX/UVA处理。由C57BL/6(B6)小鼠或MyD88敲除(MyD88-/-)小鼠纯化原初CD8+T细胞，并与UVADEX/UVA处理的或未处理的、已载荷OVA8肽的果蝇xAPC培养。在xAPC/原初CD8+T细胞共培养的第3天和第5天加入IL-2。在共培养期的第7天拆分共培养物，在第9天收集培养的CD8+T细胞。制备OVA8/MHC四聚体(Beckman Coulter)制备物，10μl与1×106个CD8+T细胞/100μl FACS缓冲液(0.5％BSA，0.2％NaN3的PBS溶液)混合。Kb/OVA8四聚体由4个结合OVA8肽的MHC分子组成，所述OVA8肽缀合荧光蛋白。混合物于室温温育30分钟，并用PBS洗涤，然后以400xg离心沉降5分钟。将细胞沉淀重悬浮在FACS缓冲液(500μl)中，并立即在FACScan流式细胞仪上以486nm-580nm的激发波长和586nm-590nm的发射波长读取。结果表明，当用UVADEX/UVA处理的果蝇xAPC活化时，用Kb/OVA四聚体染色的、分离自野生型(C57BL/6(B6))小鼠的CD8+T细胞的百分率比在用未处理的细胞果蝇xAPC活化时染色的CD8+T细胞的百分率高(图8A，泳道2对泳道1)。然而，当用UVADEX/UVA处理的果蝇xAPC活化时，就分离自MyD88敲除(MyD88-/-)小鼠的、用Kb/OVA四聚体染色的CD8+T细胞的百分率而言，相比于用未处理的细胞果蝇xAPC活化时染色的CD8+T细胞的百分率，没有观测到增加(图8B，泳道4对泳道3)。因此结论是：当T细胞与UVADEX/UVA处理的xAPC温育时观测到的活化增强取决于MyD88蛋白的存在情况。
实施例3：用于细胞疗法的针对人黑素瘤抗原的细胞毒性T-淋巴细胞 的制备
以上实施例描述了在离体活化自体原初T细胞的方法中载荷选定肽的xAPC的表征、失活和随后的应用。产生的活化T细胞以选定抗原特异性方式对靶细胞有细胞毒性。本实施例描述了优选的CTL治疗产品的制备，该产品设计用于在临床环境中治疗黑素瘤癌症患者的细胞治疗方案。图9A-9F提供了该过程中的流程图概要步骤，包括xAPC和CTL表征步骤以及产品质量控制步骤。
果蝇xAPC的培养、诱导和肽加载
在补加10％胎牛血清和G418(遗传霉素)的Schneider果蝇培养基中于27℃连续培养果蝇细胞。1周2次传代拆分果蝇细胞的连续培养物，并加入新鲜培养基，以调整细胞密度至1×106/mL。在-3或-2天，将果蝇细胞拆分至1×106/mL，并在无G418的培养基中生长。在-2或-1天，通过加入1mM CuSO4诱导果蝇细胞变成xAPC，并在第0天测试，以在肽加载之前通过FACS分析确认HLA-A2、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD54(ICAM-1)和CD58(LFA-3)的表达。优选地，≥80％的xAPC于任何给定的时间点表达共刺激分子CD54(ICAM1)、CD58(LFA3)、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)和HLA-A2.1(I类)。当HLA-A2.1或其它人分子的表达下降至≤30％时，停止使用细胞。
然后如上所述用补骨脂素/UVA方案失活果蝇xAPC和结合的病毒。xAPC的失活和无菌性可通过实施如上所述的任何或全部xAPC表征程序来评价。在第0天，诱导的失活果蝇xAPC(1×107个/mL)以每种肽0.1μg/mL载荷以下的黑素瘤相关肽：YMNGTMSQV(SEQ IDNO：5)；YTMDGTMSQV(SEQ ID NO：6)；AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)；ITDQVPFSV(SEQ ID NO：7)；KTWGQYWQV(SEQ ID NO：70)；和YLEPGPVTA(SEQ ID NO：8)。在补加5μg/mL β-2微球蛋白的HYQSFX昆虫培养基中于室温进行至少4小时的肽加载。然后如下所述将载荷肽的果蝇细胞与纯化的CD8+细胞混合。
单采样品的收集和处理
由临床场所的患者收集淋巴单采产物，其含有得自患者的白细胞。在收集后，淋巴单采产物和抽出的血(分别为1个可透气袋的细胞，其重悬浮在自体血浆中，和5个10-ml红帽管的血液)在同一天于环境温度在包含温度数据记录器的标准血液运输容器中运输。跟踪运输，并在第二天接收。淋巴单采产物在采集后保持于环境温度至多48小时。
为了由红帽管的血液产生热失活的血清制备物，用酒精擦拭管，并转移至生物安全柜。用5-ml移液管将液体级分转移至15-ml圆锥管，并以3,000rpm(1,800xg)离心10分钟。然后将上清液(血清)转移至50-ml圆锥管，废弃红细胞沉淀，将上清液在56℃水浴中温育30分钟从而热失活上清液。然后将热失活的血清等分入15-ml圆锥管中，并储存于4℃。该热失活的血清用于启动CD8细胞培养。
为了由自淋巴单采产物收集的血浆产生热失活的血清制备物，测定足以中和淋巴单采产物的血浆部分中存在的柠檬酸钠的CaCl2量。该测定通过将6个1ml等份的、来自淋巴单采产物的血浆分配入6个聚苯乙烯管中进行。独立地向6个管的每个加入10、15、20、25、30或35μl无菌的1M CaCl2，使得每管含有10、15、20、25、30或35mlCaCl2。这些管和放置在500ml Nalgene瓶中的余下血浆放置于37℃水浴中，并温育30分钟。如果在于37℃温育后凝块软化，则将温育于室温再延长15分钟，以实现完全凝结。产生完全凝结所必需的CaCl2的最低量用于确定在Nalgene瓶中的剩余血浆中产生完全凝结所必需的CaCl2的最低浓度。然后将加至Nalgene瓶中的血浆体积时足以实现该浓度的CaCl2的量加至该Nalgene瓶。然后用螺丝夹夹住从600ml转移袋出来的管道。然后通过用血浆转移装置(Charter Medical)刺穿转移袋将血浆转移至600ml转移袋，并连接至60ml无螺纹尖头注射器(slip-tip syringe)。然后在已将血浆转移至袋中后夹住连接至注射器的管道。
将重配的血浆在水浴中于37℃温育30分钟，让袋的管道在水浴外部，然后使其在室温静置，直至凝块开始收缩。然后使用连接至袋的管道将来自凝结血浆袋的血清引流到2个250ml瓶(Nalgene；目录号2019-250)中。
在热失活前，等分该血清的两个1.5ml样品，置于Wheaton管中，并于-80℃保存。然后将2个250ml Nalgene瓶中的余下的血清于56℃水浴中温育40分钟从而热失活。在热失活后，将血清分配在50ml无菌离心管中，并以3,000rpm(1,800xg)离心10分钟，以沉淀不溶性材料。将余下的不溶性材料在0.45μm滤器上过滤将其由上清液中除去。然后将滤过液分配在125ml无菌瓶(Nalgene；目录号2019-125)中，并储存于-80℃。废弃含有不溶性沉淀的管。
正选择CD8+细胞和分离非CD8细胞
在第0天，使用Isolex300i磁性细胞选择系统，采用一次性管道装置、抗CD8单克隆抗体、免疫磁珠(
Figure A200780044507D0079114337QIETU
)和CD8洗脱肽AAEGLDTQRFSG(SEQ ID NO：71)，分离CD8+和非CD8细胞。CD8+细胞选择程序是自动化的，由以下步骤组成：细胞浓缩和血小板洗涤；与抗-CD8抗体温育；使用缀合绵羊抗小鼠(SAM)IgG的
Figure A200780044507D0079114337QIETU
的花结(rosetting)步骤；捕获CD8+细胞；并除去非CD8+细胞。
为了进行CD8+细胞正选择程序的细胞浓缩和血小板洗涤步骤，获得2升转移袋(Fenwal；目录号4R2041)，通过用血浆转移装置(Charter Medical)刺穿袋并连接至60-ml无螺纹尖头注射器，将约1740ml DPBS/HSA/柠檬酸盐洗涤缓冲液转移入该转移袋中。在转移后密封管道。
Isolex设置
至预计患者的细胞到达之前1小时进行Isolex 300i磁性细胞选择系统设置和测试程序。开启Isolex 300i的主开关，确认已进行了内部自检，之后显示出Nexell识别软件版本屏显。在出现“系统停止确认”屏显后，按下“停止”按钮，然后记录“设备状态”屏显的称重和压力值。为了进行系统初始化，按照屏幕上的说明清除设备组件。在完成初始化测试后，记录细胞处理和质控日志上“设备状态”屏显的称重和压力值(“在初始化之后”)。在“选择程序”屏显上，选择“仅正选择”。
Isolex一次性组件安装
由包装中取出含有一次性装置的碟。通过打开泵门，并将两个相连的2000ml废料袋(分别为袋B和C)悬挂在设备右侧的托架上，安装Isolex 300i一次性装置。管道披在显示器之下的旋转器外壳上。将单个2000ml袋(袋A)放置在台面上。由腔室管道取下纸带，将腔室安装在摇动模块上。将两个再循环的洗涤袋(第5号)悬挂在计重器5上，过滤的洗涤袋置于前方。终产品袋(第4号)悬挂在计重器4上。抗体袋(第3号)悬挂在计重器3上。最后，将脱离剂袋(第2号)悬挂在计重器2上。松开仍在碟中的所有一次性装置部件，取下碟。接着，随后将旋转膜包安装到旋转模块中，确保支持臂在适当位置，且旋转装置位置正确。然后确认在每个歧管之后的正确管道布置，上方的两个歧管夹和下方的3个歧管夹被锁在适宜位置，泵体被吸在适宜的位置。然后确认泵体中的所有管路集中于泵滚轮上或泵模件外壳的有槽表面中。然后关闭泵门。确认P1管路和旋转装置管路没有被门夹住，使用引流管将副磁铁分离袋安装在副磁铁上。然后关闭磁铁门。
匹配蓝点，安装液体检测器1和2中的管路，在“设备状态”显示屏中证实管路布置。Luer配件被牢固地系于压力传感器1和2。匹配蓝点，然后将管路安装在液体检测器3中。然后将腔室管路安装在摇臂底部上的摇动引流管中。取下保持缓冲袋和计重器5袋管路的纸带，悬挂细胞源袋和缓冲液袋管路，使得它们不干扰秤上由袋出来的管路。检查袋，以确保它们垂直悬挂在计重器上，检查一次性装置管路的结和夹钳。接着，关闭通向单个2000ml袋(袋A)的管路的夹子；确认打开通向袋B和C的管路。在正确安装一次性装置后，在“安装设置”显示屏上选择“OK”。内部进行20次测试，以确认正确的一次性装置安装。
一次性装置的缓冲液安装和灌注
将DPBS/HSA/柠檬酸盐缓冲液袋连接至一次性装置缓冲液管路接头。在保持缓冲液袋垂直的同时，拍击袋，以由端口连接管路除去空气。将1kg砝码放在计重器6上，并将缓冲液袋悬挂在1kg砝码上。组合砝码在3250g-7000g之间。记录“装置状态”显示屏的称重和压力值，并选择“OK”。然后，Isolex 300i磁性细胞选择系统用缓冲液灌注一次性装置。在完成灌注设置后，记录“装置状态”显示屏的称重和压力值。Isolex 300i保持于保留位，直至已收到了患者细胞并准备添加。至预期患者细胞到达前1小时启动一次性装置安装和灌注，使得在接收时可立即开始细胞加工。
在接收患者淋巴单采运输袋后，用无菌布和70％异丙醇擦干净运输袋上的端口，然后转移至洁净的生物安全柜。使用接头-接头间转移管路，将袋的内容物转移至500ml无菌瓶(Nalgene；目录号2019-0500)中。然后通过混合0.02ml细胞悬浮液和0.98ml 2％乙酸制备细胞的1:50稀释液。然后计数细胞，以确定PBMC细胞计数。
淋巴单采产物的细胞计数
使用50ml移液管将悬浮在血浆中的细胞分配入50ml圆锥离心管中(45ml/管)。以1,000rpm(200xg)离心10分钟并刹车停止沉淀细胞。将细胞浓度乘以总体积计算PBMC数。然后将血浆上清液(40ml/管)合并入500ml无菌管(Nalgene；目录号2019-0500)中，以用于如下所述的血浆处理。将沉淀重悬浮在50ml管中余下的血浆中，并合并入无菌的250ml瓶(Nalgene；目录号2019-0250)中。然后测量体积。然后加入约150ml DPBS/HSA/柠檬酸盐，通过将总细胞数除以新的细胞体积计算总体积。
CD8+细胞的分离
通过用荧光标记的单克隆抗体染色细胞表面和通过流式细胞术进行分析确定表型和CD8纯度测试。按照以下列出的单克隆抗体组在FACScan流式细胞仪上进行双色分析。用于产物表征的标记包括：CD3(T淋巴细胞)、CD4(T辅助细胞)、CD8(T细胞毒性细胞)、CD14(单核细胞)、CD19(B细胞)、CD16(NK细胞)和CD15(粒细胞)。用FACS缓冲液(含有BSA和叠氮化钠的PBS)洗涤用于流式细胞仪测试的细胞，并与适宜的荧光标记的单克隆抗体于4℃避光温育15-30分钟。在温育后，洗涤染色的细胞，并重悬浮在FACS缓冲液中。将染色的细胞储存在冰上，避光，并于染色的2小时内在流式细胞仪上操作，或者，如果样品不能在2小时内分析，则使用0.5％多聚甲醛的DPBS溶液固定样品，并在黑暗中于4℃储存1周。每个样品总共收集10,000个结果。分析数据，报告对每个标记为阳性的细胞百分率。
将用于HLA分型/FACS分析的总共1×108个细胞吸打入无菌的50ml圆锥管中。在管上记录细胞浓度(细胞/ml)。在无菌的15ml管中留出约6×107个细胞进行冷冻，以保存患者淋巴细胞。离心细胞，并在冷冻非CD8细胞的同时冷冻(参见下文的非CD8细胞的分离和加工)。在无菌15ml管中留出约1×107个细胞用于FACS分析，之后进行Isolex 300i介导的CD8+细胞正选择。
将试剂加入Isolex 300i，按照以下步骤记录数据，试剂可在离心患者细胞的同时加入。一出现“加入脱离剂”的屏显，就用无菌的酒精抹布擦拭2号袋的隔膜。使用针头和注射器将20ml DPBS/HSA/柠檬酸盐缓冲液加至2号袋。用DPBS/HSA/柠檬酸盐缓冲液替换脱离剂，然后按“OK”。一出现“加入抗体”的屏显，就用无菌的酒精抹布擦拭3号袋的隔膜。将0.200ml的10mg/ml的37B1A母液与2.30mlDPBS/HSA/柠檬酸盐混合，从而制备抗-CD8单克隆抗体37B1A溶液。使用针头和注射器，将稀释的37B1A抗-CD8mAb加至3号袋，并按“OK”。一出现“加入珠”的屏显，就用无菌的酒精抹布擦拭腔室的隔膜。将一瓶(10ml)内容物转移至50ml管中，并加入10mlDPBS/HSA/柠檬酸盐，洗涤磁珠(Nexell 4R9950，或等同的)。将管放在磁铁上，将珠子在MPC-1磁铁上分离2分钟。用移液管取出上清液，同时使珠子被吸在管侧。将珠子管由磁铁上移开，将珠子轻轻地重悬浮在10ml DPBS/HSA/柠檬酸盐中，以避免起泡。使用针头和20ml注射器，将珠子加至腔室，然后按“OK”。
然后密封300mL转移袋容器(Baxter-Fenwal；目录号4R2014)的管道。在生物安全柜中，使用连接血液组分灌输装置的60ml注射器(去掉推杆)将250mL瓶中的细胞悬浮液转移至300mL转移袋。然后密封灌输组件管路。然后使用接头和在线血液滤器将细胞悬浮液由转移袋容器转移到在一次性装置(Nexell；目录号4R9850)中的1000mlIsolex 300i袋中，以排除细胞团块。然后密封含有细胞悬浮液的袋的管路。
CD8+细胞的选择
使用在Isolex一次性装置上的接头连接Isolex 300i细胞袋，并悬挂至1号计重器，记录细胞处理器上‘设备状态’屏幕的称重和压力值。按‘OK’，确认废料袋A(非CD8收集袋)的夹钳被关闭。打开废料袋B和C的夹钳，然后开始正选择程序。使Isolex继续洗除血小板15分钟，之后将细胞与抗-CD8 mAb(37B1A)温育。在完成血小板洗涤后和抗体温育过程中，记录细胞袋的质量(5号计重器)。在抗体温育后，使Isolex继续洗除过量的抗体，然后将细胞转移入含有磁珠的腔室中，在腔室中进行30分钟的混合，以使细胞花结。在细胞花结的过程中(在Isolex完成所有管道的冲洗之后)，打开废料袋A的夹钳，并关闭废料袋B和C的夹钳。在花结过程中记录腔室体积。在完成花结后，靠着腔室边经磁力收集花结，并将非CD8细胞引流入废料袋A中。使Isolex系统继续用约100ml DPBS/HSA/柠檬酸盐缓冲液洗涤花结3次。在第三次即最后一次洗涤之后，按Isolex键盘上的“停止”，并密封腔室。由Isolex设备取出含有花结的CD8+细胞的腔室。然后用无菌酒精喷雾腔室和管路，并放置在生物安全柜(例如超净台)中，通过用无菌酒精抹布清洁的腔室隔膜加入15ml DPBS/HSA/柠檬酸盐。然后来回倾斜腔室，以重悬浮花结，使用配有16号针头的30ml注射器将悬浮液转移至50ml管中。重复转移2次，并合并转移的悬浮液。然后在MPC-1磁铁上分离花结5分钟，并废弃上清液。
用CD8洗脱肽洗脱CD8+细胞
用6ml DPBS/HSA/柠檬酸盐重悬浮洗涤的花结，并转移至15ml无菌圆锥管，向该圆锥管加入0.9ml的10.0mg/ml的CD8洗脱肽(AAEGLDTQRFSG；SEQ ID NO：71)(肽终浓度：1.5mg/ml)。花结/肽溶液在以20rpm旋转的Dynal上于37℃温育30分钟。用5ml移液管剧烈混合温育的溶液。用2ml DPBS/HSA/柠檬酸盐冲洗移液管2次，将冲洗体积加至15ml管。在MPC-6磁铁上将珠子与细胞分离3分钟，并将含有CD8+细胞的上清液收集在50ml圆锥管中。用10mlDPBS/HSA/柠檬酸盐洗涤珠子3次，重复在磁铁上的分离步骤。将含有脱离的CD8+细胞的上清液与第一个上清液合并在一起。通过在MPC-1磁铁上分离5分钟由合并的细胞上清液中取出分散的珠子。将合并的上清液转移至50ml圆锥管，测量其体积。在用锥虫蓝1:20稀释(20μl细胞悬浮液+380μl锥虫蓝)后，使用血细胞计数器计数细胞(存活的和死亡的)。以百分率计算的活细胞(未被锥虫蓝染色)对总细胞(染色的加未染色的细胞)的比率定义为细胞存活力。取出约4.0×107个细胞，通过FACS分析、细胞表征和病毒测试即时检验，相等拆分入两个无菌的15ml圆锥管中。余下的CD8+通过以1,700rpm(600xg)离心7分钟沉淀。上清液用25ml移液管吸出，然后以1,700rpm(600xg)再离心1分钟，以沉淀细胞。使用细尖移液管去除过量的上清液。用14ml DPBS/HSA/柠檬酸盐重悬浮细胞沉淀，并转移至15ml无菌圆锥管，再以1,700rpm(600xg)离心7分钟。然后再用10ml移液管吸出上清液，以1,700rpm(600xg)再离心1分钟，以沉淀细胞，使用细尖移液管除去过量的上清液。然后使用如上所述制备的补加10％热失活的自体血清(HIAS)的完全RPMI培养基，在T75烧瓶中将细胞沉淀重悬浮至3.3×106个细胞/ml的浓度。进行细胞样品的FACS分析，并记录结果。
非CD8细胞的收集
在如上所述完成花结清洗后，密封废料袋A，用无菌酒精擦拭，并转移到生物安全柜(例如超净台中)。用无菌的接头和接头间连接器插入废料袋，细胞悬浮液收集在预称重的无菌500ml瓶(Nalgene；目录号2019-0500)中。在收集后，再称重瓶子，以基于1g＝1ml的近似值评估非CD8细胞悬浮液的体积。然后废弃Isolex套件的剩余的袋和管路。然后加入DPBS，使非CD8细胞悬浮液的体积达到480ml，并混合。参见下文，条件是在加入DPBS之前非CD8细胞悬浮液的体积大于480ml。
非CD8细胞的分离和收获
为了分离非CD8细胞，将15ml Ficoll-Paque PLUS(Phamacia；目录号17-1440-03)吸取入16个50ml离心管的每一个当中。如果如上所述收集的非CD8细胞悬浮液的体积大于480ml，则将非CD8悬浮液体积除以16，以便计算传递至每个50ml离心管中的体积。将约30ml(或如上所述的总体积的1/16)非CD8细胞悬浮液小心覆盖在Ficoll-Paque PLUS上面。将管置于离心杯中，通过将水加至杯中小心平衡。平衡的杯于室温以2,000rpm(800xg)离心20分钟，刹车停止。用10ml移液管由Ficoll-Paque PLUS层的上面收集非CD8细胞(例如13-15ml/界面)，将材料转移至12个50ml圆锥管中，每管最大值约20ml细胞悬浮液。用DPBS将每管装填至50ml。然后以1,700rpm(600xg)离心各管10分钟，对其刹车。然后吸出上清液并废弃，细胞沉淀重悬浮在总共200ml DPBS/HSA/柠檬酸盐缓冲液中，将重悬浮的细胞转移入4×50ml无菌管中，并以1,700rpm(600xg)离心7分钟。再吸出上清液并废弃。然后将细胞沉淀重悬浮于50ml DPBS/HSA/柠檬酸盐缓冲液中，并匀浆。然后将匀浆物通过无菌Falcon 2350细胞过滤网，以除去任何细胞团块。
细胞样品的制备
将如上所述制备的非CD8细胞匀浆物以1:100的比率稀释在2％乙酸中(10μL细胞悬浮液+990μL乙酸)，以便裂解剩余的红细胞。然后用血细胞计数器计数细胞。约2×106个细胞用于FACS分析。该分析在2小时内进行，或固定细胞。一旦对细胞样品进行了FACS分析，就记录数据。以1,700rpm(600x g)离心7分钟沉淀余下的非CD8细胞，吸出上清液，将沉淀以1×108个细胞/ml的密度重悬浮在冷冻培养基中，该冷冻培养基为5％ DMSO、47％五聚淀粉和48％热失活的自体血清(如上所述制备)。制备约2ml特冷培养基用作温度探测器。然后将冷冻培养基放置在冰上，直至准备使用。然后将细胞悬浮液以约1.0ml等份试样分配入Nunc冷冻管中(约等于10瓶)，余下的细胞分配成4.0ml等份试样。制备含有1.0ml冷冻培养基的额外管，用作冷冻系统的温度探测器。然后将包括温度探测器瓶在内的所有瓶都放置在冰上。以1,700rpm(600xg)离心7分钟沉淀如上所述留下的6×107个淋巴细胞，吸出上清液。然后将细胞沉淀重悬浮在6ml冷冻培养基中。用方案编号和患者信息标记Nunc冷冻管，将细胞悬浮液以约1.0ml等份试样分配在管中(约等于6瓶)。然后将各瓶放置在冰上。
用果蝇xAPC初次刺激CD8+细胞
在完成上述的CD8+细胞选择程序后立即进行CD8+细胞刺激。将如上所述制备的CD8+细胞悬浮液在RPMI 1640培养基中以3.3×106个细胞/ml与载荷肽的果蝇xAPC悬浮液混合，所述培养基补加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠和HEPES溶液，含有10％自体血清，所述果蝇xAPC悬浮液如上所述制备和载荷肽，为1个xAPC对10个CD8+细胞的比率。这相当于约0.1ml xAPC悬浮液对每3.0mlCD8+细胞悬浮液(1:30稀释因子)。然后，通过将xAPC-CD8+细胞混合悬浮液的体积(ml)除以15ml确定需要的烧瓶数。将色标粘贴至T75烧瓶(Costar 3376)，并用患者编号、日期和体积标记。然后通过涡旋使含有xAPC和CD8+细胞的xAPC-CD8+细胞混合悬浮液均质化，并将均质物等分在烧瓶中。将不超过15ml的细胞悬浮液加至每个烧瓶。然后将烧瓶垂直放置在专用的湿润的37℃、5％CO2温育箱中，并温育4天。
在该过程的第4天，取样细胞培养物用于γIFN生产，分别以20IU/ml和30U/ml终浓度加入IL-2和IL-7。首先，由3个烧瓶中取出3ml细胞悬浮液上清液(共0.9ml)，并置于Eppendorf管中。在微离心机中离心Eppendorf管2分钟。将上清液转移至新的Eppendorf管，并储存于-80℃。然后计算所需的每种母液细胞因子的量:将细胞因子稀释至1:1,000的母液浓度，将适宜体积的该稀释母液加至在无血清的RPMI中的细胞(0.5ml/瓶)。一旦完成该计算，由-80℃冰箱中取出细胞因子母液，并于37℃快速融化。一融化就将细胞因子保持在冰上，并在开始融化的2小时内使用。将余下的细胞因子管放置于-80℃。在1个冷冻/融化循环后废弃细胞因子。将在培养基中稀释的细胞因子分配至每个烧瓶，将每个烧瓶返回至温育箱。
用非CD8粘附细胞首次再刺激致敏的CD8+细胞
在第6天或第7天用载荷肽的粘附细胞(非CD8细胞)以1-2个粘附细胞对10个效应细胞的比率再刺激载荷肽的xAPC致敏的CD8+细胞(其为效应细胞)。首先，合并细胞，用于在过程的第6天再刺激。由温育箱中取出效应细胞T75烧瓶，并目测和显微镜检查可能的污染。在合并细胞用于再刺激之前，废弃任何已鉴定的污染烧瓶。将未被污染的效应细胞移取入带通风帽的T225烧瓶，在将它们以锥虫蓝1:4稀释后(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)，用血细胞计数器计数细胞。使用相当于约15×106个效应细胞的细胞悬浮液体积进行支原体测试(28天培养法；下文描述)。将带有剩余细胞的烧瓶垂直返回到温育箱中，直至准备进一步处理。
用于再刺激的致敏效应细胞的制备
再刺激至多4×108个CD8+致敏效应细胞。计算悬浮要以2×106个细胞/ml再刺激的一定量的致敏效应细胞所需的体积。计算的细胞悬浮体积除以代表15ml-18ml等份试样的15-18，以便确定应准备多少个带有粘附细胞的T75烧瓶用于再刺激步骤。如下所述在用于粘附细胞的粘附或肽脉冲程序中收获CD8+致敏效应细胞。以1,700rpm离心7分钟，除去上清液，并用冷冻溶液(含有10％ DMSO和5％HAS的DPBS)将细胞沉淀重悬浮至1×108个细胞/ml的浓度，可将过量的效应细胞悬浮液冷冻，用于进一步的用途，所述冷冻溶液在加入细胞沉淀之前已在冰上预冷。细胞一被预冷的冷冻溶液重悬浮，就将重悬浮液等分入适宜数目的冷冻管中，然后将冷冻管置于已预冷至的4℃的StratCooler冷冻保护模块中。然后将StratCooler冷冻保护模块转移至-80℃冰箱放置过夜。第二天，将瓶子转移至-140℃冰箱。
用于再刺激的CD14+非CD8细胞的制备
将要再刺激的CD8+致敏效应细胞的数目乘以0.1和0.2，使得达到约1-2个CD14+非CD8细胞对10个CD8+致敏效应细胞的比率，从而确定再刺激程序所需要的CD14+非-CD8细胞的数目范围。然后，将需要的两种CD14+非CD8细胞的数目除以如上所述通过流式细胞术确定的在非CD8级分中存在的CD14+非CD8细胞的百分率，计算要融化的非CD8细胞数的范围。该数目四舍五入最接近1×108个细胞。然后将早前以1×108个细胞/瓶(参见上文)冷冻的自体非CD8细胞于37℃水浴快速融化。将至多5瓶转移至50ml圆锥管中，并缓慢加入9.0ml完全RPMI/ml冷冻细胞，从而洗涤融化的细胞。其中1支管的20μl细胞悬浮液样品用180μl锥虫蓝稀释(即1:10稀释度)，并确定存活细胞数。然后通过将融化的非-CD8细胞悬浮液的总体积乘以对20μl样品确定的细胞数，确定融化的存活非CD8细胞的总数。还通过将存活细胞数除以理论融化细胞数确定回收百分率。该回收率％用于随后的再刺激和下述的非特异性扩增程序。回收的存活的非CD8细胞数被证实在如上确定的所需非D8细胞的范围内。如果需要，融化另一瓶非CD8细胞，并计数，以便达到该需要量。将细胞悬浮液转移至无菌的50ml圆锥管中，以1,500rpm(450xg)离心7分钟从而沉淀。吸出丢弃上清液。制备一定体积的补加10％热失活的自体血清(HIAS)和5.0μg/ml的β2微球蛋白(1:200稀释度的1.0mg/ml母液)的完全RPMI，该体积足以以每烧瓶要再刺激的CD8+效应细胞3.5ml加入，加上额外的1.0-1.5ml。用该培养基重悬浮非CD8细胞沉淀，并合并入单个无菌的50ml圆锥管中。
将含有非CD8细胞悬浮液的50ml圆锥管放置在拉链袋中，并以5,000拉德γ辐射。在照射后，将非CD8细胞返回到生物安全柜中。
用黑素瘤肽粘附并加载非CD8细胞
将用于初次刺激CD8+细胞的黑素瘤肽以30μg/ml终浓度(1:333稀释度的10.0mg/ml在DMSO中的母液)加至照射后的细胞。然后将细胞悬浮液-肽混合物(3.5ml/烧瓶)分配在带通气帽的T75烧瓶(Costar3376)中，并于37℃在5％CO2中垂直温育2小时，以允许粘附细胞附着至塑料表面。
用5.0ml移液管对着粘附细胞层轻轻地吸取上清液以移出非粘附细胞，并废弃移出的细胞。
吸取5ml DPBS放入每个烧瓶洗涤余下的粘附细胞，然后废弃洗涤液。制备一定体积的Leibovitz L15培养基，其补加1％ HSA(1:25稀释度的母液，25％)、5.0μg/ml β2微球蛋白(1:200稀释度的母液，1.0mg/ml)和30.0μg/ml黑素瘤肽组合混合物(1:333稀释度的母液，10.0mg/ml)，该体积足以传递每烧瓶3.5ml粘附细胞。然后向每个烧瓶加入3.5ml培养基，随后将烧瓶在生物安全柜中于室温垂直温育90分钟。
温育致敏的CD8+效应细胞和粘附的载荷肽的非CD8细胞
首先计算在T225烧瓶中将余下的CD8+效应细胞调节至2.0×106个细胞/ml所需的总体积，收获如上所述制备的初始刺激的CD8+效应细胞，用于以非CD8+粘附细胞再刺激。然后由温育箱取出含有CD8+效应细胞的T225烧瓶，并放置在生物安全柜(例如超净台)中。用移液管移取T225烧瓶中合并细胞的足量细胞悬浮液，留下调节至2.0×106个细胞/ml的总体积的1/3。余下的细胞悬浮液置于适宜数量的50ml圆锥离心管中。以1,700rpm(600xg)离心50ml圆锥管中的细胞悬浮液7分钟，用移液管移取上清液。该上清液为条件培养基，保留用于以下描述的支原体测试。通过以1,700rpm离心7分钟，除去上清液，并用冷冻溶液(含有10％ DMSO和5％HAS的DPBS)将细胞沉淀重悬浮至1×108个细胞/ml的浓度，可将过量的效应细胞悬浮液冷冻，用于进一步的用途，所述冷冻溶液在加入细胞沉淀之前在冰上预冷。细胞一旦被预冷的冷冻溶液重悬浮，就将重悬浮液等分入适宜数目的冷冻管中，然后将冷冻管置于已预冷至的4℃的StratCooler冷冻保护模块中。然后将StratCooler冷冻保护模块转移至-80℃冰箱并放置过夜。第二天，将瓶子转移至-140℃冰箱。
使用等于2/3终体积的培养基体积，将沉淀的效应细胞重悬浮在补加10％HIAS、20U/ml的IL-2和30U/ml的IL-7的新鲜完全10％RPMI，并加至留在T225烧瓶中的条件培养基的细胞中。在生物安全柜(例如超净台)中吸出用肽脉冲的自体粘附细胞包被的T75烧瓶中的培养基。然后如上文所计算的以15-18ml/烧瓶将效应细胞悬浮液移取入包被的烧瓶中。然后将烧瓶返回到温育箱中，并于37℃、5％ CO2温育3或4天，这取决于是否分别于周三或周二进行xAPC刺激。
然后通过加回为条件培养基、保存用于支原体测试的上清液，首先调节支原体测试样品至0.5×106个细胞/ml(30ml终体积)，制备如上所述留下用于支原体测试的样品。然后将混合物等分为2ml的2等份和26ml的1等份。每个等份试样通过置于干冰/异丙醇或液氮中冷冻，用密封，置于拉链袋中，储存于-80℃，直至在干冰上运输至BioReliance进行支原体测试。
在首次再刺激后针对效应细胞的细胞密度调节和培养基更换
在细胞治疗剂产生过程中的第9±1和12±1天，进行细胞密度调节和培养基更换。进行这些调节和培养基更换的程序每天都相同，在下文提供。首先，将粘附细胞包被的、含有效应细胞的T75烧瓶由温育箱中取出，用锥虫蓝制备1:4稀释液(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)由1个烧瓶进行细胞计数，以确定存活细胞数。由获得的活细胞计数，计算调节细胞密度至2×106个细胞/ml需要的总体积。用移液管取出足够的细胞悬浮液，以便在烧瓶中留下总体积的1/3。取出的悬浮液置于15ml圆锥离心管(每个T75烧瓶1管)中，以1,700rpm(600xg)离心7分钟，并取出上清液。然后用一定体积的、补加10％自体血清和细胞因子的新鲜完全RPMI重悬浮细胞沉淀，所述RPMI相当于总体积的2/3。然后将重悬浮的细胞加回至留在T75烧瓶中的条件培养基的细胞中。然后将T75烧瓶返回至温育箱，并于37℃、5％ CO2温育3天。
用粘附的载荷肽的非CD8细胞第二次再刺激致敏的CD8+效应细胞
制备已用非CD8粘附细胞进行了首次再刺激的致敏的CD8+效应细胞，用于在细胞治疗剂产生过程的第15±1天进行第二次再刺激。用于第二次效应细胞再刺激的非CD8粘附细胞的计数、制备、照射、粘附和黑素瘤肽加载的程序与以上对首次再刺激所描述的相同。如果在细胞粘附温育期中还未收获，则在90分钟的肽加载温育期中进行CD8+效应子的收获。由温育箱中取出合并的CD8+效应细胞的T225烧瓶，并置于生物安全柜(例如超净台)中。用移液管由合并的细胞中取出等于至多5×108个细胞的细胞悬浮体积。将取出的体积置于适宜量的50ml圆锥离心管中。然后将管中的细胞悬浮液以1,700rpm(600xg)离心7分钟，取出上清液并废弃。接着，用新鲜完全的RPMI(补加10％ HIAS、20U/ml的IL-2和30U/ml的IL-7)重悬浮沉淀的效应细胞至2.0×106个细胞/ml所需要的总体积。在首次再刺激程序中在如上所述的冷冻溶液中冷冻过量的细胞。在生物安全柜(例如超净台)中由包被载荷肽的自体粘附细胞的T75烧瓶中吸出培养基。将效应细胞重悬浮液以15ml-18ml/烧瓶移取入T75烧瓶中。然后将T75烧瓶返回到温育箱中，并于37℃、5％ CO2温育2天。
在第二次再刺激后用于效应细胞的细胞密度调节和培养基更换
在细胞治疗剂产生过程中的第17±1和20±1天，进行细胞密度调节和培养基更换。对于在第17±1天的细胞密度调节和培养基更换，将粘附细胞包被的、含有效应细胞的T75烧瓶由温育箱中取出，用锥虫蓝制备1:4稀释液(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)由1个烧瓶进行细胞计数，以确定存活细胞数。由获得的活细胞计数，计算调节细胞密度至1.5×106个细胞/ml需要的总体积。用移液管取出足够的细胞悬浮液，以便在烧瓶中留下总体积的1/3。取出的悬浮液置于15ml圆锥离心管(每个T75烧瓶1管)中，以1,700rpm(600xg)离心7分钟，并取出上清液。然后用相当于总体积的2/3体积的、补加10％自体血清和细胞因子的新鲜完全的RPMI重悬浮细胞沉淀。然后将重悬浮的细胞加回至留在烧瓶T75中的条件培养基的细胞中。然后将T75烧瓶返回至温育箱，并于37℃、5％ CO2温育3天。用于第20±1天的细胞密度调节和培养基更换的程序与在第17±1天使用的相同，只是对最终细胞密度2×106个细胞/ml而不是1.5×106个细胞/ml计算调节细胞密度所需要的总体积。
通过OKT3刺激进行非特异性CD8+效应细胞扩增
在细胞治疗剂产生过程的第21±1天(非特异性细胞扩增的前一天)，向每个烧瓶加入用DPBS稀释至4.0μg/ml的30ml OKT3 mAb(1.0mg/ml的120μl OKT3无菌溶液母液，在30ml DPBS中)，用OKT3包被4个T225烧瓶。然后用Parafilm密封烧瓶的排气口，并于4℃水平储存过夜。每个T225烧瓶都将用于刺激总共8-10×107个效应细胞。
第二天(第22±1天)，制备CD8+效应细胞用于以OKT3 mAb再刺激。由温育箱中取出含有CD8+效应细胞的烧瓶，并目测和显微镜检测可能的污染。废弃已鉴定的污染烧瓶。将未被污染的细胞在无菌的500ml Nalgene瓶中合并，并在用锥虫蓝1:4稀释(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)后计数。然后确定存活的细胞数。留下约5-10×106个存活细胞用于四聚体染色，留下另40-60×106个存活细胞进行果蝇病毒测试。然后基于用抗CD3抗体包被的烧瓶数和每个OKT3包被烧瓶8-10×107个效应细胞的目标活细胞数，计算收集用于以OKT3刺激的效应细胞悬浮液的体积。使用上述冷冻程序冷冻任何额外的细胞。然后将Nalgene瓶返回温育箱。
使用4个非CD8饲养细胞刺激1个CD8+效应细胞的比率计算在非特异性细胞扩增过程中融化用作饲养细胞的非CD8细胞的数目。假定每个冷冻的非CD8管的存活细胞回收率与对以上首次再刺激程序所确定的相同，将需要的非CD8细胞数除以存活细胞的回收百分率。该数目四舍五入最接近4×108个细胞，因为每管冷冻的非CD8细胞含有约4×108个细胞。一旦确定了需要的非CD8细胞数，就在37℃水浴中快速溶解自体非CD8细胞。然后将融化的细胞转移到适宜数目的无菌50ml圆锥管中，对于每1ml融化的细胞，加入9ml无血清的完全RPMI培养基。通过以1,500rpm(450xg)离心7分钟沉淀融化的细胞，吸出上清液并废弃。然后用补加10％热失活的自体血清(HIAS)的完全RPMI将沉淀重悬浮至约1.5×107个细胞/ml，并将细胞悬浮液转移至无菌的250ml离心管中。将含有非CD8细胞悬浮液的离心管置于拉链袋中，并以3,500拉德γ辐射。在照射后，将非CD8细胞返回到生物安全柜中。然后将照射后的非CD8细胞加至500ml Nalgene瓶中的CD8+效应细胞合并液中。
确定将125ml非CD8/CD8+细胞悬浮液加入每个OKT3包被烧瓶所需要的总体积，该总体积与非CD8/CD8+细胞悬浮液Nalgene瓶的当前体积的差通过向Nalgene瓶加入新鲜培养基(补加10％热失活和自体血清的完全RPMI)补足。然后将新鲜的IL-2加至20IU/ml(1:5,000稀释度的母液，100IU/μl)。由该时刻开始，不再向培养物加入IL-7。
然后由冰箱中取出OKT3包被的烧瓶，用移液管由烧瓶中取出OKT3溶液，每个烧瓶洗涤4次，每次洗涤用30ml DPBS。然后将非CD8/CD8+细胞悬浮液分配在OKT3包被的烧瓶当中(125ml/烧瓶)，并于37℃、5％ CO2水平地温育2天。2天后(第24±1天)，由温育箱中取出烧瓶，使用长柄的无菌细胞刮铲由每个烧瓶收集细胞悬浮液，每个烧瓶单独处理。每个烧瓶均含有125ml细胞悬浮液。
将3L 
Figure A200780044507D0095114813QIETU
袋(Nexell；目录号R4R2113)的luer适配口连接至60ml无菌注射器(无推杆)，关闭在其它口上的夹钳。将每个烧瓶的内容物转移至单独的袋中，以便充填细胞悬浮液的Lifecell袋的数量等于由其得到细胞的OKT3包被烧瓶的数量。然后向每个Lifecell袋加入375ml X-Vivo10培养基(BioWhittaker；目录号04-743Q)和100μl的100IU/μl新鲜IL-2母液(以达到20IU/ml终浓度)。在每个Lifecell袋中的每种细胞悬浮液的总体积现在约为500ml。然后将
Figure A200780044507D0095114813QIETU
袋返回至温育箱，并放置在金属丝架上，以允许有效的气体交换。所述袋于37℃、5％CO2温育3天。
在3天温育期结束时(第27±1天)，将500ml X-Vivo10培养基(BioWhittaker；目录号04-743Q)加至每个
Figure A200780044507D0095114813QIETU
袋。将新鲜的IL-2加至20IU/ml(1:5,000稀释度的母液，100IU/μl)。在加入新鲜培养基后，关闭每个袋的luer口上的夹钳，涡旋袋，以匀化细胞悬浮液，用注射器吸出5ml细胞悬浮液样品进行下述的无菌测试。每个样品都单独测试。在取出的2小时内测试样品。在取样后，再关闭luer口上的夹钳，用3ml注射器给luer连接处盖帽。然后将
Figure A200780044507D0095114813QIETU
袋返回到温育箱中，并放置在金属丝架上，以允许有效的气体交换。将所述袋于37℃、5％ CO2温育3天。在3天温育期结束时(第30±1天)，将500ml的X-Vivo10培养基(BioWhittaker；目录号04-743Q)加至每个
Figure A200780044507D0095114813QIETU
袋。将新鲜的IL-2加至20IU/ml(1:5,000稀释度的母液，100IU/μl)。现在每个袋的体积为约1,500ml。在加入新鲜培养基后，涡旋每个袋，以匀化细胞悬浮液，并用注射器由其中1个袋吸出2ml样品，以测定存活细胞数。在用锥虫蓝1:4稀释后(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)，确定2ml样品中的存活细胞数。
在收获和放行细胞治疗产品之前的样品检验
在细胞治疗产品收获和放行之前，取样细胞治疗产品，用于BacT/Alert无菌性测试、HLA分型、通过PCR进行的支原体测试、内毒素测试、革兰氏染色测试、果蝇DNA检测、通过PCR进行的病毒RNA检测以及细胞治疗产品表型和活性测试(包括细胞数和活力测定、表型测定和CD8+纯度)。这些测试以如上述及和在图9A-9F中所示的细胞治疗剂生产过程中的多种其它的过程中步骤进行。
使用在第30±1天测定的存活细胞数，计算相当于由每个
Figure A200780044507D0095114813QIETU
袋取样的5×107个细胞的细胞悬浮液体积。对每个袋使用单独的注射器，取出相当于5×107个细胞的计算体积，并置于单独的T75烧瓶中。目测检查烧瓶中的细胞的不寻常颜色或浊度，并显微镜检查可能污染的指示。废弃检测到污染细胞的任何Lifecell袋。由每个T75烧瓶取出5ml样品，以通过如下所述的BacT/Alert开始无菌性测试。每个样品单独测试。样品在取出的2小时内接种。将余下的细胞悬浮液合并入T75烧瓶中。在以锥虫蓝1:4稀释(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)后确定合并样品中的存活细胞数。对应于总共1×108个细胞的计算体积用于DNA和RNA制备以及如下所述的支原体PCR ELISA。对应于总共1.95×107个细胞的计算体积用于如下所述的CTL测定。留下对应于总共5-10×107个细胞的计算体积用于如下所述的四聚体染色。在取样后，将Lifecell袋返回温育箱中温育，直至准备收获细胞。
用于细胞治疗产品无菌性的BacT/Alert测试
在大约第27天(细胞收获前1周)和大约第30天(在最后一次向培养物加入培养基之后)开始过程中或工艺中的
Figure A200780044507D0096110555QIETU
(bioMerieux，Inc.)无菌性测试。如上所述在最后一次向培养物加入培养基之后于第30天还进行放行测试的取样。
Figure A200780044507D00971
快速无菌性测试方法用于测试过程中的中间产品和终产品无菌性。
Figure A200780044507D00972
是FDA批准的诊断设备。其是完全自动化的非侵入性微生物检测系统，利用二氧化碳产生的比色检测来检测微生物生长。
Figure A200780044507D00973
系统连续地温育、搅拌和监测培养物。BacT/Alert按照生产商的说明使用。一旦包含测试样品的样品瓶进入仪器中，就不再需要操作者干涉，直至检测到阳性，或者完成7天的温育期。该系统由检测仪器、计算机系统以及内置比色传感器的需氧和厌氧培养瓶组成。
当含有测试样品的瓶置于仪器池中时，小发光二极管(LED)使位于每个瓶底部的传感器暴露于红光束。每10分钟通过每个池内置的光敏二极管收集反射的光，在池中光被转换、放大并传送至计算机系统，用于解释。计算机软件产生每瓶的生长曲线，并通过使用检测算法，辨识恒定CO2产生和由于生长的微生物引起的CO2生产速率加速。当将瓶首先装入仪器时，软件算法可以检测高CO2水平，或者其可以感知高CO2生产速率，或者其可以检测CO2生产速率的加速。前2个测量检测在进入仪器前已生长或正在生长的生物体。由于在培养瓶中产生额外的CO2，所以内置传感器由暗灰色变为黄色。因为每个样品与其自身过去的性状而不是预设的阈值相比较，所以快速检测到真阳性，而不增加假阳性。
如果在细胞输注当日所有的过程中BacT/Alert测试都是阴性的，则有条件放行细胞治疗产品。细胞治疗产品在配制后42小时是稳定的，其必须在获得无菌测试的最终测试结果前被立即运到临床场所。BacT/Alert在接种成品后18±2小时读取。注意，成品的18±2小时无菌性读取结果为阴性的通告将被提供给临床场所。该通告在细胞输注前收到，以签发细胞治疗产品的临时放行文件。在完整的7天温育之后细胞治疗产品样品被确认为阴性之后，签发完全放行文件。
细胞治疗产品的HLA分型
对淋巴单采产物(PBMC)的样品进行基于PCR的HLA分型，并在细胞治疗产品收获前4天由细胞治疗产品获得CD8+效应细胞样品。使用Qiagen Blood AmpDNA试剂盒(Qiagen)按照生产商的说明由PBMC或CD8+效应细胞制备基因组DNA。由Genovision分型试剂盒(GenoVision)制备用于PCR的HLA-A、HLA-A2和HLA-DR的模板。将包含在试剂盒中的PCR主混合物连同纯化的基因组DNA一起加入每个模板孔。每个孔都加帽，将模板加载到热循环仪上。PCR参数包括组合10/20个循环的程序。样品在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用UV光记录工作站成像获得结果。使用Genovision试剂盒提供的批特异性解释和特异性表确定HLA分型结果。在放行前，检验细胞治疗产品的HLA分型结果与初始的淋巴单采产物的该结果的一致性。在放行细胞治疗产品之前，证实与将输入的患者细胞的HLA匹配性。
细胞治疗产品的支原体测试
使用Roche支原体PCR-ELISA试剂盒(Roche)测试细胞治疗产品样品的支原体。在该测定中测试CD8+培养上清液和由细胞治疗产品制备的基因组DNA。如上所述取样细胞治疗产品，通过低速离心沉淀细胞和/或碎片。按照生产商的说明进行测试。取出上清液，并以高速离心，以沉淀支原体。除去上清液，将每个沉淀重悬浮在10μl裂解缓冲液和10μl无菌水中。将阳性对照DNA(10μl)加至含10μl裂解缓冲液的微离心管。对于一式两份的阴性对照，向两个微离心管中的每一个加入10μl水和10μl裂解缓冲液。所有样品都于37℃温育1小时。在将中和缓冲液加入每个样品后，将各10μl加至40μl的PCR混合物。按照生产商的方案对一式两份的CD8+上清液样品连同阳性和阴性对照一起进行PCR。变性试剂(40μl)与10μl的每种PCR反应产物于室温温育10分钟。将含有生物素标记的捕获探针的杂交反应物加至每个样品，将混合物转移至含有包被链霉抗生物素蛋白的MTP的微量滴定板的适宜孔中。用300rpm的轨道摇床将平板于37℃温育3小时。在洗涤后，加入抗DIG-POD工作溶液，并将平板于室温以300rpm温育30分钟。然后洗涤平板5次，TMB底物在平板上于室温以300rpm温育20分钟。加入终止溶液，使用微量滴定板读板器于450nm检测吸光度。如果于450nm检测的吸光度为阴性对照的2倍，则测试样品被认为是阳性的。如果阴性对照的光密度低于0.25且阳性对照的光密度>1.2，则该测定被视为有效的。如果阴性对照和测试样品之间的吸光度差值小于0.2，则测试样品被认为是阴性的。对于放行，细胞治疗产品对支原体是PCR-ELISA测试阴性的。
内毒素测试
使用BioWhittaker的QCL-1000内毒素测定试剂盒按照生产商的说明通过动力学光度技术进行内毒素测试。在样品中存在的内毒素活化鲎(Limulus)变形细胞溶解物(LAL)制备物中存在的酶。酶活性通过加入肽底物检测。该肽底物的切割导致释放出有色片段，其经比色定量。
通过静脉内途径给予的产品的内毒素含量要求≤5.0EU/kg/h。对于平均70kg的个体，应当等于350EU的总最大剂量。细胞治疗产品配制在300mL终体积的乳酸盐化林格氏注射液USP/5％葡萄糖的0.9％氯化钠溶液/25％人血清白蛋白中，在30分钟内给药。因此，内毒素上限对应于1.17EU/mL细胞治疗产品。用于产品放行的细胞治疗产品中的内毒素水平低于1.0EU/mL。
革兰氏染色测试
使用该测定的标准测试试剂盒进行革兰氏染色。除了细胞治疗产品测试样品之外，每个测试(3个载玻片)还含有预固定的革兰氏阳性和革兰氏阴性生物作为对照。对于放行，通过革兰氏染色在含有细胞治疗产品测试样品的载玻片上未检测到微生物。
果蝇xAPC DNA筛选xAPC和细胞治疗产品
使来源于淋巴单采产物的CD8+细胞在生产程序开始时接触果蝇xAPC。果蝇xAPC是温度敏感性的(保持在25-27℃的培养物中)，当于37℃培养时将在48小时内死亡。PCR方法用于证实在放行前在最终的细胞治疗产品中没有果蝇xAPC DNA。如上所述，使用对pRMHa-3质粒载体特异性的引物通过PCR检测果蝇xAPC DNA，所述质粒载体用于转染果蝇细胞，以便产生果蝇xAPC。
质粒pRMHa-3载体序列以高拷贝数存在于果蝇xAPC中，并在细胞中保持稳定，为细胞治疗产品中存在的果蝇xAPC DNA提供适宜的标记。没有该载体导致失去重组抗原表达，该表达在初始刺激日一直通过流式细胞术评价。质粒pRMHa-3质粒载体存在于表达转染的异种核酸(例如人共刺激分子和粘附分子)的果蝇xAPC中。用于检测pRMHa-3的引物序列如下：
pRMHa-35’引物：5’-CAGCAGCAAAATCAAGT-3’(SEQ IDNO：72)
pRMHa-33’引物：5’-GAAGAATGTGAGTGTGC-3’(SEQ IDNO：73)
用于检测果蝇载体特异性DNA序列的PCR方法是一段式聚合酶链式反应，其通过将PCR扩增限于25轮降低了双链DNA中的假阳性发生率。将在5μL体积中含有400ng测试细胞治疗产品样品DNA的单个PCR管与45μL含有铂Taq聚合酶(Invitrogen)和250ng每种载体特异性引物的PCR主混合物混合。将测试样品和对照样品置于GeneAmp PCR系统9700热循环仪(Applied Biosystems)中，进行25轮PCR反应。阳性对照为总果蝇xAPC DNA，阴性对照为得自纯化的原初CD8+细胞的总DNA，所述原初CD8+细胞来源于果蝇xAPC刺激前的淋巴单采产物。阳性对照PCR片段的大小如下：人p-2-微球蛋白(479个碱基对)、人LFA-3(817bp)、人B7.1(CD80，965bp)、人B7.2(CD86，1098bp)、人A2.1(1207bp)和人ICAM-I(CD54，1696bp)(图10A，泳道2)。在完成PCR反应时，样品在2％琼脂糖凝胶上电泳，使用UV照片记录工作站成像获得结果。如果观察到对应于载体插入片段的果蝇xAPC DNA特异性条带(参见例如图10A，泳道2)，则细胞治疗产品测试样品被认为是阳性。细胞治疗产品的标准是没有检测到果蝇特异性DNA条带，结果与该测定中的阴性对照相似。
通过将已知量的总果蝇xAPC DNA的两倍连续稀释液掺入400ng CD8+ DNA中，确定果蝇xAPC DNA的检测灵敏度。加入质粒pRMHa-3载体特异性引物(各250ng)和铂Taq聚合酶(Invitrogen)，用无菌水将体积调节至50μL。在进行25个循环的PCR反应后，将5μL10X凝胶载荷缓冲液加入25μl每种反应物中，并在1％低熔点琼脂糖/TAE凝胶上于50V进行1小时电泳。低于果蝇DNA检测限度的水平被确定为<50pg(图10B，泳道2-15)；因此检测灵敏度在pg范围内。
在细胞治疗产品中筛选果蝇xAPC结合的病毒
如在实施例1中所述，经测定3种内源昆虫特异性RNA病毒与果蝇xAPC结合：1)果蝇野田村病毒(DrNV)，2)果蝇X病毒(DXV)和3)果蝇HPS-1-样病毒。果蝇xAPC在离体培养周期开始时用于刺激CD8+细胞。因此，测试样品CD8+细胞，以证实在最终的细胞治疗产品中没有这些病毒。用寡dT致敏(primed)使用Qiagen RNAeasy试剂盒(Qiagen)由细胞治疗产品细胞样品纯化的总RNA，并使用Superscript逆转录酶于42℃逆转录50分钟。在酶失活后，用RNaseH于37℃处理产生的细胞样品cDNA产物20分钟。反应产物被放置在冰上。CD8+ cDNA的浓度通过260nm的光密度测定。对于阳性对照，将病毒特异性序列克隆入质粒pCR2.1中，并线性化质粒DNA，以产生备用于PCR的病毒特异性模板。含有已知拷贝数(20和100个病毒拷贝)的病毒模板的这些质粒也用于掺加细胞治疗产品样品的CD8+cDNA，所述样品用作阳性对照(参见下文)。用于检测病毒序列的引物序列如下：
DXV：正向5’-ATCGGTGCTGCCGATGGG-3’(SEQ ID NO：74)
反向5’-TGAAGTTCTCATTCTCGTTTGGC-3’(SEQ ID NO：75)
扩增子：178bp
DrNV：正向5’-GAGCCGTACGTGATGCCG-3’(SEQ ID NO：76)
反向：5’TCATTGACGGCGAAGTGG3’(SEQ ID NO：77)
扩增子：133bp
HPS-1正向：5’-ATCTTCTGCCCTCCTGGTTT-3’(SEQ IDNO：78)
反向：5’-ATTTGCAACCGCATACCTTC-3’(SEQ ID NO：79)
扩增子：241bp
首先如下确定检测CD8+样品的cDNA制备物中的病毒序列的灵敏度水平(掺加实验)。由CD8+ T细胞纯化总RNA。用寡dT和Superscript III逆转录酶逆转录RNA，以产生CD8特异性cDNA。线性化含有病毒模板(DXV、HPS-1和DrNV)的质粒，并通过260nm的光密度定量。测定每种病毒的每1μg含病毒模板的质粒的病毒拷贝数。在采用Green　1、热启动Takara DNA聚合酶和1μg CD8+cDNA的标准SMART PCR测定中使用上述病毒特异性引物。将10、100或1000个拷贝范围的病毒模板以一式双份掺加入反应混合物中。病毒特异性模板的稀释液(由20,000个拷贝至2个拷贝)用于产生实时定量PCR的标准曲线。病毒特异性PCR引物在具有
Figure A200780044507D01022
 Green　1和热启动Takara DNA聚合酶(Takara)的SMART PCR测定混合物中制备。阴性对照仅包括CD8+ cDNA和仅包括引物混合物。样品在CepheidSmartCycler PCR系统中操作。进行解链曲线分析和扩增曲线分析，结果以检测到的
Figure A200780044507D01023
Green　1(SyG)单元记录。SyG单元基于每个病毒滴度的标准曲线(表VII)。
表VII：CD8+ DNA掺加物：检测1μg CD8 cDNA1中的病毒特异性序列水平
 
方案 样品ID SyG单元(10-18g)
DXV+CD8+掺加物 CD8++10个拷贝 37
CD8++100个拷贝 256
CD8++1000个拷贝 4555
仅CD8+ 9
仅水 22
DrNV+CD8+掺加物 CD8++10个拷贝 58
CD8++100个拷贝 333
CD8++1000个拷贝 4919
仅CD8+ 40
仅水 54
HPS+CD8+掺加物 CD8++10个拷贝 23
CD8++100个拷贝 604
CD8++1000个拷贝 7969
仅CD8+ 0(低于10ag标准)
仅水 0(低于10ag标准)
1向1μg CD8+ cDNA(CD8+)加入已知量的病毒模板。对全部3种病毒都可以得到每μgCD8+ cDNA的10-100个拷贝的每种病毒模板的检测结果。
对于细胞治疗产品放行测定，测试样品一式三份，包括天数＝0时的200ng CD8+ cDNA和来源于细胞治疗产品测试样品的200ngCD8+ cDNA。阳性对照样品(一式三份)包括掺加20和100个拷贝的病毒模板的200ng CD8+ cDNA。阴性对照样品仅含有PCR混合物(无模板)。所有的样品都在Cepheid SMART循环系统上运行。对3种病毒PCR测定中的每一种进行解链曲线分析和扩增曲线分析。阳性对照将产生特异性解链曲线和背景之上的
Figure A200780044507D01041
 Green 1值(在天数＝0时的CD8+ cDNA)。细胞治疗产品放行的标准是没有检测到果蝇病毒特异性扩增高于在阴性对照中所观测到的扩增。
表VIII图示了一式三份进行的测定的代表性结果，其得自实时定量PCR测定，该测定用于鉴定4名患者供体(PD1、PD2、PD3和PD4)的原初(即如上所述用xAPC活化之前)和细胞治疗产品样品中的外来病毒。结果表明，每个测试的细胞治疗产品(最终剂量(Final Dose))对每个所测定的病毒均测试为阴性(即每个最终剂量的SyG单元低于每个相应的原初样品的SyG单元)。
表VIII：用实时定量PCR(SyG单元)评价多个原初样品(未活化)和细胞治疗产品样品1
 
样品 PD1 PD2 PD3 PD4
HPS-1
H2O 0 0 0 0
原初样品 0 0 0 0
最终剂量 0 0 0 0
最终剂量-20个拷贝 35 73 88 49
最终剂量-10个拷贝 230 263 314 443
DrNV
H2O 0 0 0 0
原初样品 4 31 7 4
最终剂量 5 3 5 6
最终剂量-20个拷贝 94 112 63 120
最终剂量-10个拷贝 566 349 450 431
DXV
 
H2O 0 0 0 0
原初样品 0 0 0 0
最终剂量 0 0 0 0
最终剂量-20个拷贝 87 64 91 96
最终剂量-10个拷贝 344 319 320 381
1向0.2μg CD8 cDNA加入已知量的病毒模板。对全部3种病毒都可以得到每μg CD8 cDNA的20-100个拷贝的每种病毒模板的检测结果。
表IX和X显示一式两份得自正常供体1(ND1)的样品进行的测定的代表性结果。在表IX中，测定0.2μg CD8+cDNA。在表X中，测定3.0μg CD8+ cDNA。示于表IX和X的结果表明，每个测试的细胞治疗产品(ND1的给药CD8+)对测定的每个病毒均测试为阴性(即每个最终剂量的SyG单元低于每个相应的原初样品的SyG单元)。HPS数据仅在示于表X的测定中显示，因为提供的CD8+ cDNA在该单一测定中就耗尽了。然而，以该浓度常规筛选细胞治疗产品cDNA样品会消耗掉所有的样品，有可能妨碍完成所有需要的测试，且不允许重复测定。
表IX.采用病毒特异性引物的正常供体1(ND1)的原初细胞和给药的CD8+细胞的定量RT/PCR1
 
样品 HPS(SyBr) DXV(SyBr) DrNV(SyBr)
ND1原初CD8+ 0 9 0
ND1的给药CD8+ 0 0 0
ND1的给药CD8++20个拷贝 115 77 67
ND1的给药CD8++100个拷贝 547 286 466
仅引物混合物 0 0 0
1每个样品(0.2μg)均以一式两份采用病毒特异性引物的标准SMARTPCR测定进行。
表X.采用HPS病毒特异性引物的正常供体1(ND1)的原初细胞和给药的CD8+细胞的定量RT/PCR1
 
样品 HPS(SyBr) DXV(SyBr) DrNV(SyBr)
ND1原初CD8+ 0 ND* ND*
ND1的给药CD8+ 0 ND* ND*
ND1的给药CD8++20个拷贝 89 ND* ND*
ND1的给药CD8++100个拷贝 361 ND* ND*
仅引物混合物 0 ND* ND*
1每个样品(3μg)均以一式两份采用HPS病毒特异性引物的标准SMART PCR测定进行。
*ND：未测定(参见上文)。
使用上述的PCR反应，在离体培养过程结束时使用果蝇病毒特异性引物由细胞治疗产品样品筛选CD8+制备物，用于放行以后批次的细胞治疗产品。对分离自新鲜果蝇细胞的cDNA(阳性对照)、由从没有接触果蝇细胞的CD8+样品制备的cDNA(阴性对照)和在细胞治疗产品剂量的放行测试过程中评价的最终CD8+产品进行每个病毒PCR反应。为了放行细胞治疗产品，在接触果蝇细胞之前收集的CD8+样品和细胞治疗产品中没有在阳性对照中可检测的病毒特异性产物。
细胞治疗产品表型和活性测定
通过检测总细胞数、存活力、表型和效力评价细胞治疗产品的生物学特征。另外，在整个细胞治疗产品生产过程中对存活细胞数、表型、CD8+和非CD8+选定细胞组合物进行过程中评价。
存活的有核细胞数
在细胞治疗产品生产过程中的几个时间点监测存活细胞数，包括细胞治疗产品放行前的时间点。通过计数锥虫蓝稀释并载荷在血细胞计数器上的细胞确定存活细胞数(参见例如上文)。在显微镜下计数最少100个细胞。表XI汇总了对得自称为PD5、PD6和PD7的3个黑素瘤患者供体的淋巴单采产物记录的细胞数，以及在细胞治疗产品生产和放行测试过程中的不同步骤的相关细胞材料。
Figure A200780044507D01071
Figure A200780044507D01081
(a)再刺激仅300×106个细胞。
放行的细胞治疗产品中的有核细胞总数为99至1010个细胞。
细胞存活力
如上所述通过在血细胞计数器上计数锥虫蓝溶液稀释的细胞评价细胞存活力。基于活细胞对存在的总细胞的比率计算活细胞百分率。表XII提供了由得自称为PD8、PD6、PD9、PD5、PD7和PD10的6名黑素瘤患者供体的淋巴单采产物制备的6批细胞治疗产品的存活力。平均存活力为76.2％，标准偏差为±2.6(n＝6)。细胞治疗产品的当前生产方法常规产生≥70％。为了放行细胞治疗产品，基于该测定方法细胞治疗产品具有70％以上的存活力。
表XII：6批细胞治疗产品的细胞存活力
 
批次 存活力
PD8 76％
PD6 72％
PD9 80％
PD5 74％
PD7 78％
PD10 77％
细胞治疗产品表型
用荧光标记的单克隆抗体进行细胞表面染色确定细胞表型和CD8+纯度，并通过流式细胞术分析。按照以下列出的单克隆抗体组在FACScan流式细胞仪上进行双色分析。产品特征标记包括：CD3(T淋巴细胞)、CD4(T辅助细胞)、CD8(T细胞毒性细胞)、CD14(单核细胞)、CD19(B细胞)、CD16(NK细胞)和CD15(粒细胞)。用FACS缓冲液(含有BSA和叠氮化钠的PBS)洗涤用于流式细胞术测试的细胞，并与适宜的荧光标记的单克隆抗体于4℃避光温育15-30分钟。在温育后，洗涤染色的细胞，并重悬浮在FACS缓冲液中。将染色的细胞储存在冰上，避光保护，并在染色的2小时内在流式细胞仪上运行。或者，如果样品不能在2小时内分析，则使用0.5％多聚甲醛的DPBS溶液固定样品，并于4℃在黑暗中储存1周。每个样品收集共10,000个结果。分析数据，测定对每个标记为阳性的细胞百分率。表XIII显示了在6批细胞治疗产品中存在的CD3+和CD8+细胞百分率，这6批细胞治疗产品得自黑素瘤患者供体PD8、PD6、PD9、PD5、PD7和PD10的淋巴单采产物。未被CD3+和CD8+染色的细胞部分被认为是非存活细胞。这些数据提示，CD3+和CD8+表型在不同细胞治疗产品批次中的相对百分率保持相对恒定(参见例如在表XIII中的平均百分率和标准偏差)。
表XIII：对黑素瘤患者供体的细胞治疗产品批次的表型分析
 
患者供体 ％CD3+ ％CD8+
PD8 81 89
PD6 75 86
PD9 77 76
PD5 77 82
PD7 80 82
PD10 78 80
平均值 78 82.5
标准偏差 2.0 4.2
为了在Isolex-300i选择程序之前和之后评价CD8+细胞的纯度，用荧光标记的单克隆抗体进行细胞表面染色，并通过如上所述的流式细胞仪分析。表XIV显示了来源于黑素瘤患者供体DP8、PD6和PD9的淋巴单采产物和相应治疗产品批次的表型分布。基于用抗CD8单克隆抗体37B1A染色，使用Isolex细胞分离器分离CD8+细胞产生82±9％(平均值±SD，n＝3)的纯度。存在可检测水平的CD4+(3±1.4％)、CD14+(2±1.5％)和CD16+(5±2％)细胞。该细胞群似乎没有CD15+细胞。
表XIV：来源于黑素瘤者供体PD8、PD6和PD9的淋巴单采产品和相应细胞治疗产品批次的细胞表型分布
Figure A200780044507D01101
Figure A200780044507D01111
细胞治疗产品效力
进行细胞治疗剂效力测定，以细胞治疗产品对已载荷选定肽(例如，如上所述依据SEQ ID NO：5、6、7、8、9和70的肽)的靶细胞的效力检测证实特异性裂解活性。细胞治疗剂效力测定方法为51Cr-释放测定(参见例如Thom等人，J.Immunol.Methods.，4(2)，301-315页(1974))。靶细胞(T2细胞-HLA-A2.1+)与放射性同位素51Cr温育1小时。用洗涤培养基洗涤2次靶细胞中过量的未标记51Cr。然后于室温用6种黑素瘤肽(使得使用单独的载荷铬的T2细胞样品单独地测试每种目标肽)之一、载荷肽的阴性对照肽对单个载荷铬的T2细胞样品进行30分钟的肽加载(每种肽20μg/mL)，或者不进行肽加载。然后将细胞治疗产品细胞(即载荷肽的xAPC诱导的CD8+效应细胞(E))与标记的靶细胞(T)以0.4-50的E:T比率连同用于中和非HLA限制的细胞毒性的过量未标记K562细胞一起混合。细胞悬浮液在温育箱中于37℃/5％CO2温育4小时。利用细胞治疗产品细胞(E)裂解标记的靶细胞导致51Cr释放入上清液中。在温育后，由每个孔中取出100μL细胞上清液，并转移至γ计数器。在每种单独的肽存在下的裂解活性(E)表示为特异性裂解百分率，以下式确定(称为等式)：
特异性裂解百分率＝100×(每分钟的样品计数-每分钟的自发计数)/(每分钟的最大计数-每分钟的自发计数)。
除了载荷肽的T2细胞以外，还在用铬载荷后将黑素瘤和阴性对照细胞系用作标靶。测定程序与使用T2靶细胞的程序保持相同。在用于产品放行的T2和/或黑素瘤细胞系中检测特异性裂解。
在表XV中汇总了得自黑素瘤患者供体PD8、PD6、PD9、PD5、PD7和PD10的淋巴单采产品的6批次细胞治疗产品对SEQ ID NO：5、6、7、9和70中的每一个的效力结果(以10:1 E:T比率的特异性裂解百分率)。
表XV：细胞治疗产品效力(51Cr-释放测定；n＝6)
 
剂量 SEQ IDNO：5 SEQ IDNO：6 SEQ IDNO：7 SEQ IDNO：9 SEQ IDNO：70 阴性对照
PD8 15.8％ 9.6％ 45.7％ 18.1％ 25.8％ 3.8％
PD6 30.7％ 3.5％ 14.6％ 26.6％ 18.0％ 0.0％
PD9 7.0％ 5.7％ 10.9％ 75.4％ 11.9％ 4.7％
PD5 29.0％ 8.5％ 20.6％ 21.1％ 21.3％ 0.2％
PD7 39.4％ 25.5％ 85.6％ 16.5％ 47.2％ 9.6％
PD10 26.6％ 17.9％ 78.7％ 50.1％ 33.3％ 0.9％
平均值 24.8％ 11.8％ 42.7％ 34.6％ 26.3％ 3.2％
标准偏差 10.5％ 7.6％ 30.1％ 21.4％ 11.5％ 3.4％
在相似的分析中，将1种肽(SEQ ID NO：8；YLEPGPVTA)加入已用于在细胞治疗产品中产生杀伤活性的5种肽中。单独使用或与其它黑素瘤肽组合使用的SEQ ID NO：8产生特异性裂解活性的能力在3名正常供体中证实，如在表XVI中所述。
表XVI：3名正常供体(ND2、ND3和ND4)的效应细胞对黑素瘤肽的效力(以裂解单位检测)
 
T2+肽(SEQ ID NO：) ND2 ND3 ND4
5 16.8 12.9 17.2
6 7.5 18.3 2
7 5.2 14.1 39.4
8 1.6 15.7 18.3
 
70 23.3 13.5 24.7
9 31.8 59.3 37.9
5+6+7+8+9+70 93.8 122.4 103.4
8* 75.2 61.5 72.1
*对单独的SEQ ID NO：8产生的细胞治疗产品
用于输注的产品制备
为了收获细胞治疗产品细胞和制备细胞治疗产品制剂，临收获前通过每个袋匀化以上制备的细胞悬浮液。然后将两个Fenwal接头/接头血浆转移装置(关闭夹钳)插入每个
Figure A200780044507D01131
袋的未用插口。将每个袋悬挂在由生物安全柜表面架起的挂钩上。打开在血浆转移装置上的夹钳，将细胞悬浮液引流入两个无菌的Nalgene瓶(1000ml和500ml)中。每个袋单独操作。在转移细胞悬浮液后，由每个1000ml Nalgene瓶取5ml每个Lifecell袋的每种细胞悬浮液样品，并置于单独的T25烧瓶中。目测检查在4个T25烧瓶的每一个中的细胞的不常见颜色或浊度，并经显微镜检查可能的污染。废弃任何污染样品的相应袋的细胞。合并4个T25烧瓶中的未污染细胞，并在用锥虫蓝以1:4稀释(50μl细胞样品+150μl锥虫蓝)后计数。然后测定存活细胞数。留下约10×106个细胞，以用于FACS分析。将余下的细胞悬浮液倾入无菌的500ml圆锥管中。然后称重管，并通过在生物安全柜(超净台)中加入或除去细胞悬浮液平衡，然后以1,700rpm(600xg)离心10分钟沉淀细胞。倾析并废弃上清液，将沉淀再以2,000rpm(800xg)离心2分钟。用5ml移液管取出任何余留的上清液。
然后用在无菌的250ml瓶中混合的以下洗涤缓冲液洗涤沉淀的细胞：192ml注射用USP 0.9％氯化钠(NaCl)和8ml HSA(25％溶液)
Figure A200780044507D01133
所有的细胞沉淀都合并在总共100ml洗涤缓冲液中，分配在4个50ml圆锥管(25ml/管)中，并以1,000rpm(200xg)离心10分钟。吸出并废弃上清液，再以2,000rpm(800xg)离心细胞沉淀2分钟。使用细尖移液管除去任何余留的上清液。然后将每个细胞沉淀重悬浮在25ml洗涤缓冲液中，并以1,000rpm(200xg)离心10分钟。吸出并废弃上清液，再以2,000rpm(800xg)离心细胞沉淀2分钟。使用细尖移液管除去任何余留的上清液。在此第二次低速离心中，密封1,000ml转移包(Baxter；目录号4R2032)，并废弃管道。然后将转移袋配上血浆转移装置(Charter Medical；目录号03-220-90)，并将患者识别信息贴在转移袋上。然后用25ml在无菌瓶中制备的以下重悬浮缓冲液(100ml总体积)重悬浮每一细胞沉淀：282ml林格氏乳酸盐化培养基、12ml注射用5％葡萄糖和0.9％氯化钠以及6ml HSA(25％溶液)
Figure A200780044507D01141
彻底吸打重悬浮缓冲液，以分离聚集细胞。然后将70μm尼龙无菌细胞过滤网(Falcon 2350)放置在无菌的100ml Nalgene瓶的开口上面。使其通过细胞过滤网由细胞悬浮液除去细胞聚集物。然后废弃细胞过滤网。然后在用锥虫蓝以1:50稀释(20μl细胞+980μl锥虫蓝)后计数活的和死亡的细胞。
60-mlluer锁将注射器连接至血浆转移装置，该血浆转移装置连接至1000ml转移袋，将等于最大1×1010个细胞的细胞悬浮液体积转移至转移袋。然后向转移袋加入重悬浮缓冲液至总体积246ml。废弃所有未用的重悬浮缓冲液部分。
接着，通过涡旋袋匀化细胞悬浮液，并使用连接至血浆转移装置的3ml注射器由袋中吸出0.5ml细胞悬浮液。将该0.5ml样品放置在无菌的Eppendorf管中，如上所述用于内毒素测试(需要0.15ml)。使用60ml注射器，将54ml HSA(25％溶液)
Figure A200780044507D01142
通过血浆转移装置加至袋。然后将总细胞数除以新的细胞体积计算新的细胞浓度。再通过涡旋袋匀化细胞悬浮液。使用连接至血浆转移装置的10ml注射器由袋中吸出6.5ml细胞悬浮液。该样品要用于放行测试和细胞冷冻保护。将6.5ml样品的约0.1ml(2-3滴)细胞悬浮液放置在无菌Eppendorf管中，如上所述用于革兰氏染色。将0.5ml等份的细胞悬浮液放置在无菌的15ml圆锥管中，用于FACS分析。将余下的细胞样品转移至15ml圆锥管，并以1,700rpm(600xg)离心7分钟。将上清液立即用于BacT/Alert无菌性测试，保存沉淀用于FACS分析和冷冻保护。计算沉淀中存在的细胞数，将细胞沉淀重悬浮在6.0ml冷冻溶液(90％自体血清[HIAS]+10％ DMSO)中。然后将沉淀中的细胞数除以6.0ml计算细胞浓度。然后适宜地标记冷冻管，并冷冻。然后将冷冻管置于Stratacooler中的-80℃冷却器中，然后于第二天转移至-140℃储存室。将含有余下的细胞悬浮液的袋置于4℃，直至准备放行(运输)。
用于输注的细胞治疗产品制剂含有在300mL乳酸盐化林格氏注射液，USP(76％v/v)、5％葡萄糖的0.9％氯化钠溶液(4％v/v)和25％人血清白蛋白(20％v/v)中的自体CTL(针对选定肽的CD8+效应细胞)。在运输时，将Dickson温度记录装置放置在运输容器中。将含有细胞治疗产品的输液袋放置在运输容器中。然后准备运输用的运输容器。在临床场所接受输液袋后，下载并作图Dickson温度记录装置的温度数据。成品有效期为42小时。
讨论
交联提供了消除病毒和维持aAPC中的抗原提呈功能的有效方法。使用补骨脂素继之以长波UV曝光交联DNA和RNA，并防止复制。这通过潜在地失活可存在于aAPC细胞系中的所有已知的和未知的病毒，并失活果蝇细胞系，而不影响其有效的APC功能，增加了对基于细胞的产品的额外保护水平，所述产品用于制备传递给患者的药物。补骨脂素/UV处理失活APC中存在的核酸，额外的冷冻/融化处理产生“死”细胞，以锥虫蓝染色证实。此失活/裂解方案确保了果蝇细胞作为APC的安全性，不破坏且在某些情况下增强其APC功能。
尽管上文已参考说明性性实施例和优选的实施方案详细描述了本发明，但技术人员会理解，发明的范围不是由前述描述限定，而是由依照专利法的原则适当解释的随附权利要求限定。

Claims (24)

1.一种离体产生用于给予患者的活化T淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤：
用核酸交联剂失活人工抗原提呈细胞(aAPC)；
使分离自诊断患有疾病或障碍的患者的T淋巴细胞接触所述失活的人工抗原提呈细胞；和
收集T淋巴细胞，用于返回所述患者。
2.权利要求1定义的方法，其中所述交联剂为补骨脂素衍生物，所述失活步骤包括使以补骨脂素衍生物处理的人工抗原提呈细胞暴露于光活化剂量的UVA辐射。
3.权利要求2定义的方法，其中所述补骨脂素衍生物为补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)、4’-(氨基甲基)-4，5’，8-补骨脂素(AMT)或amotosalen(S59)。
4.权利要求1定义的方法，其中所述交联剂为补骨脂素衍生物，所述失活步骤包括使以1-100μg/ml浓度的补骨脂素衍生物处理后的人工抗原提呈细胞暴露于1-100焦耳/cm2UVA照射剂量的UVA辐射1-60分钟。
5.权利要求1定义的方法，其中所述疾病或障碍为癌症，所述方法在所述接触步骤之前或同时进一步包括：
使人工抗原提呈细胞加载至少一种癌症相关肽抗原。
6.权利要求5定义的方法，其中所述活化T淋巴细胞对表达所述肽的靶细胞有细胞毒性，所述肽选自黑素瘤癌症相关肽抗原、卵巢癌相关肽抗原、乳癌相关肽抗原、肺癌相关肽抗原、白血病-、多发性骨髓瘤-和淋巴瘤-相关肽抗原以及前列腺癌相关肽抗原。
7.权利要求6定义的方法，其中所述肽包含MART-1、酪氨酸酶、gp100、NY-ESO-1、MUC-1、CA-125、Her-2、存活素、端粒酶、CAMEL、CEA、livin、SART-1、SCP-1、SSX-2、PRAME、C-凝集素、Pec60、AES、MAGE-3、G250、FBP、SSX-4、SP17、hTRT、MUC-16、MAGE-1、拓扑异构酶II、整联蛋白β8亚基前体、MUC-1、MAGE-B2、STAT1、γ-连环蛋白或H-RYK的氨基酸序列的至少8个连续的抗原性氨基酸。
8.权利要求7定义的方法，其中所述肽包含选自以下的氨基酸序列：SILSLKEAST(SEQ ID NO：1)、KMASRSMRL(SEQ ID NO：2)、ALALAALLVV(SEQ ID NO：3)、ALLVVDREV(SEQ ID NO：4)、YMNGTMSQV(SEQ ID NO：5)、YMDGTMSQV(SEQ ID NO：6)、ITDQVPFSV(SEQ ID NO：7)、YLEPGPVTA(SEQ ID NO：8)、AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)、ELAGIGILTV(SEQ ID NO：10)、CLTSTVQLV(SEQ ID NO：11)、HLYQGCQVV(SEQ ID NO：12)、KIFGSLAFL(SEQ ID NO：13)、IISAVVGIL(SEQ ID NO：14)、PLTSIISAV(SEQ ID NO：15)、VMAGVGSPYV(SEQ I DNO：16)、VLVKSPNHV(SEQ ID NO：17)、ELVSEFSRM(SEQ ID NO：18)、YLSGANLNL(SEQ ID NO：19)、GPLTPLPV(SEQ ID NO：20)、SLLMWITQC(SEQ ID NO：21)、KALFAGPPV(SEQ ID NO：22)、YLETFREQV(SEQ ID NO：23)、GLQSPKSPL(SEQ ID NO：24)、VLLKLRRPV(SEQ ID NO：25)、ELYIPSVDL(SEQ ID NO：26)、SLLMWITQV(SEQ ID NO：27)、ILAKFLHWL(SEQ ID NO：28)、STAPPVHNV(SEQ ID NO：29)、FLWGPRALV(SEQ ID NO：30)、FMWGNLTLA(SEQ ID NO：31)、RLVDDFLLV(SEQ ID NO：32)、HLSTAFARV(SEQ ID NO：33)、QLSLLMWIT(SEQ ID NO：34)、ELWTHSYKV(SEQ ID NO：35)、KVAELVHFL(SEQ ID NO：36)、YIFATCLGL(SEQ ID NO：37)、HLYIFATCL(SEQ ID NO：38)、MLMAQEALAFL(SEQ ID NO：39)、STLEKINKT(SEQ ID NO：40)、KASEKIFYV(SEQ ID NO：41)、SLLMWITQCFL(SEQ ID NO：42)、ELTLGEFLKL(SEQ ID NO：43)、LTLGEFLKL(SEQ ID NO：44)、SLLEKREKT(SEQ ID NO：45)、TLGEDDPWL(SEQ ID NO：46)、KLGLKPLEV(SEQ ID NO：47)、YLWTSAKNT(SEQ ID NO：48)、STAPPAHGV(SEQ ID NO：49)、GMGSEELRL(SEQ ID NO：50)、SLGSPVLGL(SEQ ID NO：51)、YLFFYRKSV(SEQ ID NO：52)、CQQEETFLL(SEQ ID NO：53)、TLAKFSPYL(SEQ ID NO：54)、NLTHVLYPV(SEQ ID NO：55)、STFKNWPFL(SEQ ID NO：56)、SLLQHLIGL(SEQ ID NO：57)、FLDQRVFFV(SEQ ID NO：58)、FLDQRVFVV(SEQ ID NO：59)、FLDQVAFVV(SEQ ID NO：60)、GLDREQLYL(SEQ ID NO：61)、VMQHLLSPL(SEQ ID NO：62)、QQTHGITRL(SEQ ID NO：63)、LQPLSGPGL(SEQ ID NO：64)、TLDRDSLYV(SEQ ID NO：65)、QLYLELSQL(SEQ ID NO：66)、KVLEYVIKV(SEQ ID NO：67)、KVADLVGFL(SEQ ID NO：68)、KTWGQYWQV(SEQ ID NO：70)和VLDGLDVLL(SEQ ID NO：71)。
9.权利要求8定义的方法，其中所述至少一种肽是肽的混合物，所述混合物包含：YMNGTMSQV(SEQ ID NO：5)、ITDQVPFSV(SEQID NO：7)、AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)、ELAGIGILTV(SEQ IDNO：10)、SLLMWITQV(SEQ ID NO：27)、FLWGPRALV(SEQ IDNO：30)、TLAKFSPYL(PRAME；SEQ ID NO：54)和VLDGLDVLL(SEQID NO：71)。
10.权利要求2定义的方法，所述方法还包括：
由患者的单采样品分离T细胞，然后将其用于所述接触步骤；和
给予所述患者有效量的、所述收集步骤收集的T淋巴细胞。
11.权利要求10定义的方法，所述方法还包括在实施所述给予步骤之前再刺激所述活化的T淋巴细胞，所述再刺激程序包括：
使所述活化的T淋巴细胞接触至少一种细胞因子，由此促进活化的T细胞增殖；和
温育所述活化的T细胞和照射后的自体非-CD8+细胞、粘附非CD8+细胞或补骨脂素/UVA处理后的人工抗原提呈细胞(aAPC)，由此产生再刺激的活化T淋巴细胞。
12.权利要求11定义的方法，其中所述至少一种细胞因子选自IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IFN-γ和TNF-α，其中所述活化的T淋巴细胞包括活化的细胞毒性T淋巴细胞。
13.权利要求11定义的方法，所述方法进一步包括在进行所述产生步骤之前，使所述活化的T淋巴细胞经受至少一次重复的再刺激程序，所述再刺激程序包括：
使所述活化的T淋巴细胞接触IL-2和选自以下的至少一种其它细胞因子的组合物：IL-7、IL-15或IL-21，由此促进活化的T细胞生长、增殖或分化；和
使所述活化的T细胞和照射后的自体非CD8+细胞或粘附非CD8+细胞或补骨脂素/UVA处理后的aAPC温育，以产生再刺激的T淋巴细胞。
14.权利要求13定义的方法，其中所述再刺激程序包括在1-100U/ml浓度的IL-2、1-100U/ml浓度的IL-7、1-100ng/ml的IL-15和1-100ng/ml的IL-21存在下使所述活化的T淋巴细胞与果蝇(Drosophila)aAPC接触。
15.权利要求13定义的方法，其中所述照射后的自体粘附非CD8+细胞包括照射后的自体粘附CD14+细胞。
16.权利要求13定义的方法，其中所述照射后的自体非CD8+细胞包括照射后的自体CD4+T细胞。
17.权利要求2定义的方法，所述方法进一步包括：
在所述失活步骤之前、之后或同时以及在所述接触步骤之前冷冻和融化所述人工抗原提呈细胞。
18.权利要求2定义的方法，其中所述失活的人工抗原提呈细胞不能增殖，且基本上没有污染。
19.权利要求2定义的方法，其中所述人工抗原提呈细胞表达人白细胞MHC抗原分子、β-2微球蛋白以及辅助分子，所述辅助分子包括选自人CD80(B7-1)、LFA-3(CD58)、CD83、CD86(B7-2)或TNF家族成员的共刺激分子，所述TNF家族成员选自CD70、TNFα、LT、4-1BBL和OX40L，或者所述辅助分子包括选自ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和LFA-3的粘附分子。
20.权利要求19定义的方法，其中所述人工抗原提呈细胞表达人HLAI类MHC抗原分子HLA2.1。
21.权利要求20定义的方法，其中所述I类MHC分子为HLA-A2.1，并且所述辅助分子为B7-1(CD80)、LFA-3(CD58)、CD70和ICAM-1(CD54)。
22.权利要求19定义的方法，其中所述补骨脂素/UVA处理的aAPC包括用HLA分子和共刺激分子转染的果蝇(Drosophila)细胞。
23.权利要求1定义的方法，其中所述疾病、障碍或医学病症为选自以下的癌症：恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt氏淋巴瘤、甲状腺癌、子宫癌、肾癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、皮肤癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、神经胶质瘤和脑癌。
24.一种补骨脂素失活的人工抗原提呈细胞，所述人工抗原提呈细胞表达HLA-A2.1、B7-1(CD80)、LFA-3(CD58)、CD70和ICAM-1(CD54)细胞表面蛋白，并提呈以下的肽：YMNGTMSQV(SEQID NO：5)、ITDQVPFSV(SEQ ID NO：7)、AAGIGILTV(SEQ ID NO：9)、ELAGIGILTV(SEQ ID NO：10)、SLLMWITQV(SEQ ID NO：27)、FLWGPRALV(SEQ ID NO：30)、TLAKFSPYL(PRAME；SEQ IDNO：54)和VLDGLDVLL(SEQ ID NO：71)。
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