JP2023537558A - 目的の抗原にｃａｒ ｔ細胞をリダイレクトするためのアダプター分子 - Google Patents

Abstract

抗原結合ドメインに連結されたＣＡＲ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的化をリダイレクトするために使用することができるＣＡＲ架橋タンパク質が、提供される。この架橋タンパク質は、例えば、腫瘍抗原またはウイルス抗原などの、目的の任意の抗原を標的とする抗原結合ドメインを含み得る。例えば、がんまたは感染性疾患などの、疾患を処置するために、これらの架橋タンパク質をＣＡＲ－Ｔ細胞と組み合わせて使用する方法も提供される。

Description

関連出願の参照
本願は、２０２０年５月２７日に出願した米国特許仮出願第６３／０３０，６５３号の優先権利益を主張するものであり、前記仮出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

配列表への言及
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で提出した配列表を含み、この配列表は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年５月２６日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＮＢＯＰ０００５ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名であり、サイズが１６．４キロバイトである。

背景
１．分野
本開示は、一般に、免疫学、ウイルス学および医学の分野に関する。より詳細には、本開示は、ＣＡＲ発現性免疫エフェクター細胞を目的の任意の抗原にリダイレクトする架橋タンパク質、および疾患を処置するためにそれを使用する方法に関する。

２．関連技術の記載
最近操作された免疫エフェクター細胞は、ウイルス性疾患およびがんの処置のための魅力的な治療薬になった。例えば、目的の任意の特定の抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞を操作することができる。そのような細胞は、がんマーカーを発現する細胞または病原体に感染したいずれかの細胞を標的として死滅させることができる。これらの新しい療法は有望なのだが、処置される対象における操作された細胞のオフターゲット毒性および持続性欠如に関する課題が残る。例えば、腫瘍不均一性、および標的抗原発現の喪失は、有効なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の開発の重要な課題である。腫瘍特異的抗原（すなわち、腫瘍細胞上に排他的に発現されるもの）はほとんど存在せず、その上、大多数が、腫瘍関連抗原である（すなわち、腫瘍細胞上に過剰発現されるが、健康な細胞上にはそれほどではない）。腫瘍もまたＣＡＲ標的抗原の発現を喪失する傾向があるため、多くのグループが、より多様な腫瘍細胞を捕捉するために二重特異性および三重特異性ＣＡＲ Ｔ細胞を開発している。このことは、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２に対する多重特異性ＣＡＲ Ｔ細胞が臨床開発中である、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連して十分に説明されている。固形腫瘍および固形腫瘍微小環境は、腫瘍不均一性がそれよりはるかに高く、克服すべきよりいっそう大きな課題である。それ故、免疫エフェクター細胞の新しい、より進歩した標的化方法が、かなり必要とされている。

概要
単一特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞を代替のまたは複数の標的抗原にリダイレクトするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質が、本明細書で提供される。例えば、一方ではＣＡＲと会合し、他方では選ばれた標的抗原と会合する、融合タンパク質および抗体コンジュゲートが、提供される。したがって、多重特異性ＣＡＲの作製とは対照的に、本明細書で提供される架橋タンパク質は、単一バリアントＣＡＲ－Ｔ細胞を多重特異性ブリッジタンパク質によって多様な抗原に向けてリダイレクトする。単一のまたは複数のブリッジタンパク質を、逐次的に注入することができ、または同時に行われる複数を標的とする手法の一部分として一緒に注入することができる。

一部の実施形態では、本開示は、（１）抗原結合ドメインおよび（２）ＣＡＲ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質であって、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質の少なくとも一部分を含むＣＡＲ架橋タンパク質を提供する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗原結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、抗体Ｆｃドメインをさらに含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＡＲ結合ドメインと抗原結合ドメインの間に位置する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗原結合ドメインとＦｃドメインの間に位置する。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、抗原結合ドメイン（antigen binding domain）とＣＡＲ結合ドメインの間にリンカー配列をさらに含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメイン配列を含む。他の態様では、Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列を含む。さらに他の態様では、Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。さらに他の態様では、Ｆｃドメインは、野生型ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列と比べて、ＦｃｇＲ受容体への結合を妨げる置換を含む。他の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号４により提供される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む。

一部の態様では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合する。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原と相互作用するペプチドを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原を認識する抗体の抗原結合部分を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合できる。他の態様では、抗原結合ドメインは、コロナウイルススパイクタンパク質に結合できる。さらなる態様では、コロナウイルススパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＡＣＥ２細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む。さらなる態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインの一部分は、ＡＣＥ２ｔドメインである。なおさらなる態様では、ＡＣＥ２ｔドメインは、配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む。

一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの各々の間にリンカー配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＳ（配列番号７）の配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、配列番号８により提供される配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ホモ二量体を形成する。

他の実施形態では、本開示は、ＣＡＲ結合ドメインおよび抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質を提供する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗原結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、抗体Ｆｃドメインをさらに含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＡＲ結合ドメインと抗原結合ドメインの間に位置する。他の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗原結合ドメインとＦｃドメインの間に位置する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分と相互作用するペプチドを含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分を認識する抗体の抗原結合部分を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質の少なくとも一部分を含む。さらなる態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列から本質的になる。ある特定の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列からなる。

一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメイン配列を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、野生型ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列と比べて、ＦｃｇＲ受容体への結合を妨げる置換を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号４により提供される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合する。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原と相互作用するペプチドを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原を認識する抗体の抗原結合部分を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合できる。一部の態様では、抗原結合ドメインは、コロナウイルススパイクタンパク質に結合できる。さらなる態様では、コロナウイルススパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。

一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＡＣＥ２細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインの一部分は、ＡＣＥ２ｔドメインである。さらなる態様では、ＡＣＥ２ｔドメインは、配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメインと、抗原結合ドメインと、必要に応じてＦｃドメインとの間にリンカー配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＳ（配列番号７）の配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、配列番号８により提供される配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ホモ二量体を形成する。

さらに他の実施形態では、本開示は、本開示のＣＡＲ架橋タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質をコードする配列は、発現制御配列に動作可能に連結されている。一部の態様では、核酸分子は、発現ベクターとしてさらに定義される。一部の態様では、発現ベクターは、エピソームベクターである。他の態様では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。さらなる態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである。

さらに他の実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体中に本開示のＣＡＲ架橋タンパク質を含む医薬組成物を提供する。一部の態様では、医薬組成物は、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団をさらに含む。

さらなる実施形態では、本開示は、処置することを必要とする対象を処置する方法であって、本開示のＣＡＲ架橋タンパク質の有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、対象は、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団を以前に投与されたことがある。一部の態様では、方法は、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団の有効量を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、細胞は、対象にとって同種異系である。一部の態様では、細胞は、対象にとって自家である。一部の態様では、細胞は、対象とＨＬＡが適合している。一部の態様では、対象は、コロナウイルスに感染している。一部の態様では、対象は、ＳＡＲ－ＣｏＶに感染している。一部の態様では、対象は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２に感染している。一部の態様では、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患している。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、（ｉ）配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）配列番号６で提供される配列である／を含むＣＡＲ結合ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドは、その抗原結合ドメインとしてＣＤ４ドメインを含む。一部の態様では、対象は、がんを有する。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合できる抗原結合ドメインを含む。

なおさらなる実施形態では、本開示は、ＣＡＲ結合ドメインおよび抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質を提供する。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＣＡＲ結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている。一部の態様では、抗原結合ドメインおよびＣＡＲ結合ドメインは、融合タンパク質に含まれている。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、抗体Ｆｃドメインをさらに含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＡＲ結合ドメインと抗原結合ドメインの間に位置する。他の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗原結合ドメインとＦｃドメインの間に位置する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分と相互作用するペプチドを含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分を認識する抗体の抗原結合部分を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの細胞外部分と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの標的に特異的であるＣＡＲの一部分に結合する。一部の態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含み、ＣＡＲ結合ドメインは、ｓｃＦｖの可変領域に結合する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片（antigen binding fragment）を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。

一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質の少なくとも一部分を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲであり、ＣＡＲ結合ドメイン（CAR binding domain）は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲに結合する。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＤ１９タンパク質の少なくとも一部分を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメイン配列を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、野生型ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列と比べて、ＦｃｇＲ受容体への結合を妨げる置換を含む。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号４により提供される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合する。

一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原と相互作用するペプチドを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原を認識する抗体の抗原結合部分を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、目的の抗原と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合する。一部の態様では、抗原結合ドメインは、コロナウイルススパイクタンパク質に結合できる。一部の態様では、コロナウイルススパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ＡＣＥ２細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインの一部分は、ＡＣＥ２ｔドメインである。一部の態様では、ＡＣＥ２ｔドメインは、配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメインと、抗原結合ドメインと、必要に応じてＦｃドメインとの間にリンカー配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、ＧＧＧＳ（配列番号７）の配列を含む。一部の態様では、リンカー配列は、配列番号８により提供される配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ホモ二量体を形成する。

さらに他の実施形態では、本開示は、本開示のＣＡＲ架橋タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質をコードする配列は、発現制御配列に動作可能に連結されている。他の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、発現ベクターとしてさらに定義される。一部の態様では、発現ベクターは、エピソームベクターである。他の態様では、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一部の態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである。

他の実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体中に本開示のＣＡＲ架橋タンパク質を含む医薬組成物を提供する。一部の態様では、医薬組成物は、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団をさらに含む。

さらに他の実施形態では、本開示は、処置することを必要とする対象を処置する方法であって、本開示のＣＡＲ架橋タンパク質の有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、対象は、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団を以前に投与されたことがある。一部の態様では、方法は、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団の有効量を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、細胞は、対象にとって同種異系である。一部の態様では、細胞は、対象にとって自家である。一部の態様では、細胞は、対象とＨＬＡが適合している。一部の態様では、対象は、コロナウイルスに感染している。一部の態様では、対象は、ＳＡＲ－ＣｏＶに感染している。他の態様では、対象は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２に感染している。さらに他の態様では、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患している。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、（ｉ）配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）配列番号６で提供される配列である／を含むＣＡＲ結合ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドは、その抗原結合ドメインとしてＣＤ４ドメインを含む。ある特定の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列から本質的になる。ある特定の態様では、ＣＡＲ結合ドメインは、配列番号６で提供される配列からなる。一部の態様では、対象は、がんを有する。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合できる抗原結合ドメインを含む。一部の態様では、ＣＡＲ架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインは、ＣＤ１９タンパク質の少なくとも一部分を含む。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更形態および修飾形態がこの詳細な説明から当業者には明らかになるので、単に説明のために提供されることを理解されたい。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。これらの図面の１つまたは複数を、本明細書で提示される特異的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をよりよく理解することができる。

ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトする架橋タンパク質の概要図。図１Ａは、架橋タンパク質を使用してＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。図１Ｂは、直接作用する、および架橋タンパク質によって作用する、両方のＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を図示する。図１Ｃは、ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をＣｏＶ感染細胞にリダイレクトする架橋タンパク質を図示する。図１Ｄは、様々な悪性細胞を標的とするために使用することができる、または標的療法から逃れるために腫瘍細胞が用いる抗原欠損を克服するために使用することができる、腫瘍の同時または逐次的標的化を図示する。図１Ｅは、架橋タンパク質を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。 ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトする架橋タンパク質の概要図。図１Ａは、架橋タンパク質を使用してＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。図１Ｂは、直接作用する、および架橋タンパク質によって作用する、両方のＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を図示する。図１Ｃは、ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をＣｏＶ感染細胞にリダイレクトする架橋タンパク質を図示する。図１Ｄは、様々な悪性細胞を標的とするために使用することができる、または標的療法から逃れるために腫瘍細胞が用いる抗原欠損を克服するために使用することができる、腫瘍の同時または逐次的標的化を図示する。図１Ｅは、架橋タンパク質を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。 ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトする架橋タンパク質の概要図。図１Ａは、架橋タンパク質を使用してＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。図１Ｂは、直接作用する、および架橋タンパク質によって作用する、両方のＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を図示する。図１Ｃは、ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をＣｏＶ感染細胞にリダイレクトする架橋タンパク質を図示する。図１Ｄは、様々な悪性細胞を標的とするために使用することができる、または標的療法から逃れるために腫瘍細胞が用いる抗原欠損を克服するために使用することができる、腫瘍の同時または逐次的標的化を図示する。図１Ｅは、架橋タンパク質を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。 ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトする架橋タンパク質の概要図。図１Ａは、架橋タンパク質を使用してＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。図１Ｂは、直接作用する、および架橋タンパク質によって作用する、両方のＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を図示する。図１Ｃは、ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をＣｏＶ感染細胞にリダイレクトする架橋タンパク質を図示する。図１Ｄは、様々な悪性細胞を標的とするために使用することができる、または標的療法から逃れるために腫瘍細胞が用いる抗原欠損を克服するために使用することができる、腫瘍の同時または逐次的標的化を図示する。図１Ｅは、架橋タンパク質を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。 ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトする架橋タンパク質の概要図。図１Ａは、架橋タンパク質を使用してＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。図１Ｂは、直接作用する、および架橋タンパク質によって作用する、両方のＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の特異性を図示する。図１Ｃは、ＣＤ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をＣｏＶ感染細胞にリダイレクトする架橋タンパク質を図示する。図１Ｄは、様々な悪性細胞を標的とするために使用することができる、または標的療法から逃れるために腫瘍細胞が用いる抗原欠損を克服するために使用することができる、腫瘍の同時または逐次的標的化を図示する。図１Ｅは、架橋タンパク質を使用してＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞にリダイレクトする一般概念を図示する。

例示的な架橋タンパク質の概要図である。図２Ａは、抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、ＣＡＲ結合ドメインとを有する二量体架橋タンパク質を図示する。図２Ｂは、ＣＡＲ結合ドメイン（ｇｐ１２０ｔによって代表されるような）をＩｇＧ抗体にコンジュゲートする方法を図示する。図２Ｃは、ＣＡＲ結合ドメイン（ｇｐ１２０ｔによって代表されるような）と、Ｆｃ領域と、抗原結合ドメインとを有する架橋タンパク質の様々な実施形態を図示する。 例示的な架橋タンパク質の概要図である。図２Ａは、抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、ＣＡＲ結合ドメインとを有する二量体架橋タンパク質を図示する。図２Ｂは、ＣＡＲ結合ドメイン（ｇｐ１２０ｔによって代表されるような）をＩｇＧ抗体にコンジュゲートする方法を図示する。図２Ｃは、ＣＡＲ結合ドメイン（ｇｐ１２０ｔによって代表されるような）と、Ｆｃ領域と、抗原結合ドメインとを有する架橋タンパク質の様々な実施形態を図示する。 例示的な架橋タンパク質の概要図である。図２Ａは、抗原結合ドメインと、Ｆｃドメインと、ＣＡＲ結合ドメインとを有する二量体架橋タンパク質を図示する。図２Ｂは、ＣＡＲ結合ドメイン（ｇｐ１２０ｔによって代表されるような）をＩｇＧ抗体にコンジュゲートする方法を図示する。図２Ｃは、ＣＡＲ結合ドメイン（ｇｐ１２０ｔによって代表されるような）と、Ｆｃ領域と、抗原結合ドメインとを有する架橋タンパク質の様々な実施形態を図示する。

ＣＤ４特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の概要図。

例示的な架橋タンパク質のさらなる概要図。図４Ａは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ細胞を再標的化するための代表的な方法を示す。図４Ｂは、抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域と、ＣＤ－１９ ＣＡＲ結合ドメイン、例えば、ＣＤ１９、短縮型ＣＤ１９（ＣＡＲに結合する）、またはＣＤ１９ ＣＡＲに特異的な抗体ドメインとを有する、二量体架橋タンパク質を図示する。図４Ｃは、ＣＡＲ結合ドメイン（ＣＤ１９ｔによって代表されるような）をＩｇＧ抗体にコンジュゲートする方法を図示する。 例示的な架橋タンパク質のさらなる概要図。図４Ａは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ細胞を再標的化するための代表的な方法を示す。図４Ｂは、抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域と、ＣＤ－１９ ＣＡＲ結合ドメイン、例えば、ＣＤ１９、短縮型ＣＤ１９（ＣＡＲに結合する）、またはＣＤ１９ ＣＡＲに特異的な抗体ドメインとを有する、二量体架橋タンパク質を図示する。図４Ｃは、ＣＡＲ結合ドメイン（ＣＤ１９ｔによって代表されるような）をＩｇＧ抗体にコンジュゲートする方法を図示する。 例示的な架橋タンパク質のさらなる概要図。図４Ａは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ細胞を再標的化するための代表的な方法を示す。図４Ｂは、抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域と、ＣＤ－１９ ＣＡＲ結合ドメイン、例えば、ＣＤ１９、短縮型ＣＤ１９（ＣＡＲに結合する）、またはＣＤ１９ ＣＡＲに特異的な抗体ドメインとを有する、二量体架橋タンパク質を図示する。図４Ｃは、ＣＡＲ結合ドメイン（ＣＤ１９ｔによって代表されるような）をＩｇＧ抗体にコンジュゲートする方法を図示する。

ＨＩＶ ｅｎｖを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するために使用されたＣＡＲ構築物の全てのエレメントを示す、抗ＨＩＶ ＣＡＲ構築物。

ｇｐ１２０のＣＤ４結合ループのＩｇＧ抗体への化学的コンジュゲーション。ｇｐ１２０ ＣＤ４結合ループの配列（ＳＳＧＧＤＰＥＩＶＴＨ）は、配列番号６で提供される。

ブリッジタンパク質概念の開発および試験。図７Ａは、ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｔ）のＣＤ４結合ループとコンジュゲートしたＩｇＧ、ならびに一次Ｔ細胞上のＣＤ４受容体へのブリッジタンパク質の結合を実証するＦＡＣＳ等高線図を図示する。図７Ｂは、ＣＡＲ４結合ブリッジタンパク質のＦＡＣＳヒストグラムおよび蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を提供する。図７Ｃは、ＣＡＲ４ Ｔ細胞をＩｇＧおよびダイアボディコンジュゲート抗体の両方によって腫瘍細胞にリダイレクトした実験の概要説明を提供する。図７Ｄは、単独でのＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧとＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧ－ｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣａｒ４ Ｔ細胞、およびダイアボディｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣＡＲ４ Ｔ細胞との２４時間の共培養後の、生存腫瘍細胞パーセンテージを図示する。 ブリッジタンパク質概念の開発および試験。図７Ａは、ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｔ）のＣＤ４結合ループとコンジュゲートしたＩｇＧ、ならびに一次Ｔ細胞上のＣＤ４受容体へのブリッジタンパク質の結合を実証するＦＡＣＳ等高線図を図示する。図７Ｂは、ＣＡＲ４結合ブリッジタンパク質のＦＡＣＳヒストグラムおよび蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を提供する。図７Ｃは、ＣＡＲ４ Ｔ細胞をＩｇＧおよびダイアボディコンジュゲート抗体の両方によって腫瘍細胞にリダイレクトした実験の概要説明を提供する。図７Ｄは、単独でのＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧとＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧ－ｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣａｒ４ Ｔ細胞、およびダイアボディｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣＡＲ４ Ｔ細胞との２４時間の共培養後の、生存腫瘍細胞パーセンテージを図示する。 ブリッジタンパク質概念の開発および試験。図７Ａは、ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｔ）のＣＤ４結合ループとコンジュゲートしたＩｇＧ、ならびに一次Ｔ細胞上のＣＤ４受容体へのブリッジタンパク質の結合を実証するＦＡＣＳ等高線図を図示する。図７Ｂは、ＣＡＲ４結合ブリッジタンパク質のＦＡＣＳヒストグラムおよび蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を提供する。図７Ｃは、ＣＡＲ４ Ｔ細胞をＩｇＧおよびダイアボディコンジュゲート抗体の両方によって腫瘍細胞にリダイレクトした実験の概要説明を提供する。図７Ｄは、単独でのＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧとＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧ－ｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣａｒ４ Ｔ細胞、およびダイアボディｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣＡＲ４ Ｔ細胞との２４時間の共培養後の、生存腫瘍細胞パーセンテージを図示する。 ブリッジタンパク質概念の開発および試験。図７Ａは、ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｔ）のＣＤ４結合ループとコンジュゲートしたＩｇＧ、ならびに一次Ｔ細胞上のＣＤ４受容体へのブリッジタンパク質の結合を実証するＦＡＣＳ等高線図を図示する。図７Ｂは、ＣＡＲ４結合ブリッジタンパク質のＦＡＣＳヒストグラムおよび蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を提供する。図７Ｃは、ＣＡＲ４ Ｔ細胞をＩｇＧおよびダイアボディコンジュゲート抗体の両方によって腫瘍細胞にリダイレクトした実験の概要説明を提供する。図７Ｄは、単独でのＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧとＣＡＲ４ Ｔ細胞、ＩｇＧ－ｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣａｒ４ Ｔ細胞、およびダイアボディｇｐ１２０ｔコンジュゲートとＣＡＲ４ Ｔ細胞との２４時間の共培養後の、生存腫瘍細胞パーセンテージを図示する。

詳細な説明
例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識し、死滅させるように設計されている治療用ＣＤ４特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞などのＣＡＲ－Ｔ細胞をリダイレクトするために使用することができる架橋タンパク質が、本明細書で提供される。その例では、架橋タンパク質は、目的の標的抗原に結合するタンパク質ドメインに融合された短縮型ｇｐ１２０細胞外ドメインを含み得る（図１Ａおよび１Ｂ）。例えば、タンパク質ドメインは、ＡＣＥ２細胞外ドメイン（ヒト細胞に感染するためにＣｏＶにより使用される天然受容体）であり得る。ＣｏＶが細胞に感染すると、ウイルススパイクタンパク質が細胞の表面に発現される。その結果として、ｇｐ１２０－ＡＣＥ２架橋タンパク質の存在下で、ＣＤ４特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣｏＶ感染細胞の表面に存在するウイルススパイクタンパク質に結合することになる（図１Ｃ）。

架橋タンパク質は、目的の標的抗原に結合するタンパク質ドメインに融合またはコンジュゲートされた短縮型ｇｐ１２０ペプチドを含み得る。一例では、架橋タンパク質は、短縮型ｇｐ１２０ペプチド、ヒトＦｃ領域、目的の標的抗原に結合するタンパク質ドメイン、および１つまたは複数のリンカー配列を含み得る。１つの例示的な実施形態では、架橋タンパク質は、ＣｏＶ結合に必要な３つのドメイン全てを含有するＡＣＥ２細胞外ドメインの一部分であるＡＣＥ２のＡＣＥ２ｔ部分、ヒトＦｃドメイン、および短縮型ｇｐ１２０ペプチドを、Ｎ末端からＣ末端へまたはＣ末端もしくはＮ末端から含み得、各ドメインはリンカーにより隔てられている（図２Ａ）。別の例示的な実施形態では、架橋タンパク質は、ＣｏＶ結合に必要な３つのドメイン全てを含有するＡＣＥ２細胞外ドメインの一部分であるＡＣＥ２のＡＣＥ２ｔ部分、短縮型ｇｐ１２０ペプチド、およびヒトＦｃドメインを、Ｎ末端からＣ末端へまたはＣ末端もしくはＮ末端から含み得、各ドメインはリンカーにより隔てられている（図２Ａ）。架橋タンパク質は、Ｆｃドメイン間の相互作用に起因してホモ二量体として存在することになる。

架橋タンパク質は、目的の抗原、例えばＣｏＶスパイクタンパク質、を発現する細胞を認識し、死滅させるために、ＣＤ４－ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトすることになる（図１Ｃ）。ＣＤ４－ＣＡＲ Ｔ細胞は、同種反応性を防止するためにサイレンシングされたそれらの内在性ＴＣＲおよび／またはＭＨＣ遺伝子を有し得る（図３）。ＣＤ４－ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞が、より長期にわたる治療効果を持続および提供することを可能にするためにサイレンシングされた１つまたは複数の阻害性受容体（例えば、ＰＤ１および／またはＴＩＭ３）をさらに有し得る（図３）。これらのＴ細胞を健康なドナー細胞から調製することができ、そのため、それを（ａ）患者にすぐに提供することができる、（ｂ）基礎疾患により損なわれない（ＣｏＶ感染患者からのＴ細胞は重度に疲弊している）、および（ｃ）対費用効果の高い（単一ドナー単位から調製される＞１００用量）、「既成の」溶液にすることができる（図３）。

さらなる態様では、実施形態の架橋タンパク質を使用して、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞などの他のタイプのＣＡＲ発現性エフェクター細胞を再標的化することができる。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている患者にはＣＤ１９抗原欠損がよく見られ、疾患再発の原因となる。ブリッジタンパク質の同時または逐次投与は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を悪性細胞上の他の抗原にリダイレクトする方法を可能にし得る。結果として、そのような方法によって、別の方法では難治性の疾患の処置が可能になる。
Ｉ．定義

本願で使用される場合、指定成分に関して、「本質的にない」は、指定成分のいずれも、組成物に意図的に配合されたものでないこと、および／または夾雑物としてしか、もしくは微量でしか存在しないことを意味するために、本願では使用される。したがって、組成物の何らかの意図せぬ夾雑の結果として生じる指定成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは、０．０１％未満である。指定成分の量を標準的な分析方法で検出することができない組成物が、最も好ましい。

本願において本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味し得る。本願において特許請求の範囲で使用される場合、語「含む（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるとき、語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは１つより多くを意味し得る。

特許請求の範囲での用語「または」の使用は、代替案のみを指すまたは代替案が相互排他的であることを指すという別段の明確な指示がない限り、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替案のみと「および／または」とを指す定義を支持する。本願で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれより高次を意味し得る。

本願を通して、用語「約」は、値が、デバイスについての誤差の固有変動、値を決定するために用いられる方法の固有変動、研究対象間に存在する変動、または述べられている値の１０％以内である値を含むことを示すために、使用される。

本願で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、または他の文法的等価表現は、共有結合で連結している、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらのアナログのいずれかである、少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、２０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００などを含む、任意の長さのポリマーである。本願に記載されるポリヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合を含有するが、一部の場合には、少なくとも１つの異なる連結、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはＯ－メチルホスホロアミダイト連結、ならびにペプチド核酸骨格および連結を有し得る、核酸アナログが含まれる。天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作製することができ、あるいは異なるポリヌクレオチドアナログの混合物、および天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作製することができる。次のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーを組み立てる前に、または組み立てた後に付与されることがある。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいることもある。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、さらに改変されることもある。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を含む。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される２本の相補的一本鎖形態の各々とを両方とも包含する。ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）と、シトシン（Ｃ）と、グアニン（Ｇ）と、チミン（Ｔ）、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）、という４つのヌクレオチド塩基の特異的配列で構成されている。それ故、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。別段の指示がない限り、特定のポリヌクレオチド配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることにより果たすことができる。

本願で使用される用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、改変残基を含有するもの、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーばかりでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在する対応するアミノ酸の人工的化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。この場合は、用語「ポリペプチド」は、抗体またはその断片を包含する。

本願で使用される場合、「セーフハーバー」プロファイルは、操作された細胞のゲノムの、導入遺伝子発現が維持され（すなわち、サイレンシングされず）、内在性遺伝子の発現を破壊しない部位への、外来遺伝物質の挿入を指す。例えば、「遺伝的セーフハーバープロファイル」は、内在性遺伝子のコード領域および発現制御領域外に位置するトランスジェニック事象を指し得る。一部の態様では、操作された遺伝子がセーフハーバープロファイルを有するかどうかの同定は、全ゲノムシークエンシングまたは組み込み部位の解析を行うことを含み得る。
ＩＩ．架橋タンパク質

架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、および目的の標的抗原に結合するタンパク質ドメインを含む。一部の場合には、ＣＡＲ結合ドメイン、および目的の標的抗原に結合するタンパク質ドメインは、２つのドメインの化学的融合体であり得る。配置は、多量体型のもの、例えば、ダイアボディまたは多量体であり得る。多量体は、軽鎖および重鎖の可変部分を交差対合させてダイアボディにすることにより形成される可能性が最も高い。

一部の実施形態では、架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、抗原結合ドメイン、および必要に応じて１つまたは複数のリンカー配列を含む。一部の場合には、リンカーは、ＣＡＲ結合ドメインと抗原結合ドメインの間に存在する。一部の場合には、ＣＡＲ結合ドメインは、抗原結合ドメインに直接融合されている。

一部の実施形態では、架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメイン、ヒトＦｃ領域、抗原結合ドメイン、および必要に応じて１つまたは複数のリンカー配列を含む。一実施形態では、架橋タンパク質は、抗原結合ドメイン、ヒトＦｃドメイン、およびＣＡＲ結合ドメインを、Ｎ末端からＣ末端へまたはＣ末端もしくはＮ末端から含み得、各ドメインは、リンカーにより隔てられているか、または直接融合されている（図２Ａ～２Ｃ）。別の実施形態では、架橋タンパク質は、抗原結合ドメイン、ＣＡＲ結合ドメイン、およびヒトＦｃドメインを、Ｎ末端からＣ末端へまたはＣ末端もしくはＮ末端から含み得、各ドメインは、リンカーにより隔てられているか、または直接融合されている（図２Ａ～２Ｃ）。架橋タンパク質は、Ｆｃドメイン間に形成されたジスルフィド結合の存在に起因してホモ二量体として存在し得る。しかし、提供される実施形態のいずれにおいても、架橋タンパク質は、単量体であり得る。
Ａ．ＣＡＲ結合ドメイン

架橋タンパク質は、ＣＡＲ結合ドメインを含む。ＣＡＲ結合ドメインは、エフェクター機能をリダイレクトすることが模索されるＣＡＲ－Ｔ細胞により発現されるＣＡＲと相互作用するのに十分なものである、タンパク質ドメインである。ＣＡＲ結合ドメインは、Ｆｃドメインと抗原結合ドメインの間に位置することもあり、またはＣＡＲ結合ドメインは、架橋タンパク質のどちらかの末端に位置することもある。ＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲを特異的に認識する抗体または抗体断片の抗原結合部分を含み得る。ＣＡＲが、リガンドをその標的化ドメインとして含む場合、架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインは、リガンドに結合する受容体の一部分を含み得る。ＣＡＲが、受容体をその標的化ドメインとして含む場合、架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインは、受容体に結合するリガンドの一部分を含み得る。例えば、ＣＡＲが、ＣＤ４ドメインをその標的化ドメインとして含む場合、架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインは、ｇｐ１２０ドメインを含み得る。例えば、ｇｐ１２０ドメインは、ＣＤ４に効率的に結合するｇｐ１２０細胞外ドメインの１１アミノ酸セグメントである、配列番号６で示されるような短縮型ｇｐ１２０ドメインであり得る。別の例として、ＣＡＲが、抗ＣＤ１９ドメインをその標的化ドメインとして含む場合、架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインは、ＣＡＲの抗ＣＤ１９ドメインが結合するのに十分なＣＤ１９の一部分を少なくとも含み得る（図１Ｅ）。
Ｂ．Ｆｃドメイン

架橋タンパク質は、Ｆｃドメインを含み得る。Ｆｃドメインは、ＣＡＲ結合ドメインと抗原結合ドメインの間のいずれかに位置することもあり、またはＦｃドメインは、架橋タンパク質のどちらかの末端に位置することもある。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメイン配列であり得る。Ｆｃドメインは、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列であり得る。Ｆｃドメインは、ヒト重鎖ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３領域のみを含有し得る。Ｆｃドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能の非特異的標的化のリスクを低下させるために、ＦｃｇＲ受容体へのＦｃの結合を妨げる置換を含有し得る。例えば、Ｆｃドメインは、配列番号４の４６および７８位にそれぞれ対応する、Ｄ２６５Ａおよび／またはＮ２９７Ａ置換を含み得る。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号４で提供される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号４で提供される配列と約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号４で提供される配列と同一である配列を有する。一部の態様では、Ｆｃドメインは、コドン最適化された核酸によりコードされる。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号３で提供される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列よりコードされる。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号３で提供される配列と約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列によりコードされる。一部の態様では、Ｆｃドメインは、配列番号３で提供される配列と同一である配列によりコードされる。
Ｃ．抗原結合ドメイン

架橋タンパク質は、目的の任意の抗原に結合できる抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、ＣＡＲ結合ドメインとＦｃドメインの間のいずれかに位置することもあり、または抗原結合ドメインは、架橋タンパク質のどちらかの末端に位置することもある。抗原結合ドメインは、抗原を特異的に認識する抗体または抗体断片の抗原結合部分を含み得る。抗体の抗原結合断片は、抗原に特異的に結合できるタンパク質の一部分を指す。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、１つもしくは複数のＣＤＲを含む抗体に由来するか、または抗原に結合するが無傷の自然抗体構造を含まない任意の他の抗体断片に由来する。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、抗体に由来せず、むしろ受容体に由来する。抗原結合断片の例としては、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ラクダ化抗体またはナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

抗原がリガンドである場合、架橋タンパク質の抗原結合ドメインは、リガンドに結合する受容体の一部分を含み得る（図２Ｃ）。抗原が受容体である場合、架橋タンパク質の抗原結合ドメインは、受容体に結合するリガンドの一部分を含み得る。例えば、抗原がＣｏＶスパイクタンパク質である場合、架橋タンパク質の抗原結合ドメインは、ＡＣＥ２細胞外ドメインを含み得る。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインは、ＡＣＥ２細胞外ドメインの短縮された部分（ＡＣＥ２ｔ）であり得る。ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、可溶性形態のＡＣＥ２の作出およびＣｏＶ感染の助長に使用されるＡＤＡＭ１７、ＴＭＰＲＳＳ１１ｄおよびＴＭＰＲＳＳ２切断部位を含有する、ネイティブＡＣＥ２細胞外ドメインの近位端を含まない場合がある。プロテアーゼ切断部位を含まないことは、架橋タンパク質の意図せぬ切断を防止する。

ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、受容体（例えば、コロナウイルススパイクタンパク質）に結合するペプチド（例えば、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン）を含み得る。標的結合ドメイン（target binding domain）は、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分を含み得る。ＡＣＥ２ｔ部分は、ＣｏＶ結合に必要とされる３つのドメイン全てを含有する。ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、可溶性形態のＡＣＥ２の作出およびＣｏＶ感染の助長に重要な２つの切断部位を含有する、ネイティブＡＣＥ２細胞外ドメインの近位端を含まない。

一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、配列番号２で提供される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、配列番号２で提供される配列と約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有する。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、配列番号２で提供される配列と同一である配列を有する。

一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、コドン最適化された核酸によりコードされる。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、配列番号１で提供される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列によりコードされる。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、配列番号１で提供される配列と約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列によりコードされる。一部の態様では、ＡＣＥ２細胞外ドメインのＡＣＥ２ｔ部分は、配列番号１で提供される配列と同一である配列によりコードされる。

他の例示的な抗原としては、がん細胞上の表面抗原（図１Ｄ）および感染細胞上の表面抗原が挙げられる。がん細胞上の表面抗原は、腫瘍特異的抗原、すなわち、腫瘍細胞上に排他的に発現される抗原であり得る。がん細胞上の表面抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち、健康な細胞上に発現されるが腫瘍細胞上には過剰発現される抗原であり得る。がん細胞上の表面抗原の例としては、以下のものが挙げられる：ＨＥＲ－３、Ｈｅｒ１／ＨＥＲ－３融合体；ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも呼ばれる）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胚抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）とエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）とからなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化型リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐ上に位置するＥＴＳ転座バリアント遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン（surviving）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原－１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴＩ）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫由来アポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；チトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはインプリント部位調節因子同類）、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。感染細胞上の表面抗原の例としては、ウイルススパイクまたはエンベロープタンパク質（例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１、ＨＩＶ－１ ｇｐ１６０、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、ＭＥＲＳ Ｓタンパク質、エボラウイルス糖タンパク質、インフルエンザの血液凝集素（haemaglutinin）、インフルエンザノイラミニダーゼ、Ｃ型肝炎Ｅ１、Ｃ型肝炎Ｅ２、デングウイルスＥ二量体、チクングニアウイルスＥ１、チクングニアウイルスＥ１、サイトメガロウイルス糖タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、単純ヘルペスウイルスｇＨ、単純ヘルペスウイルスｇＬ、単純ヘルペスウイルスｇＭ、エプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０、およびエプスタイン・バーウイルスｇｐ４２）が挙げられる。
Ｄ．リンカー

架橋タンパク質は、正しいフォールディングを可能にするために、および／または融合ドメインの立体障害を防止するために、融合ポリペプチド配列間に位置する少なくとも１つのペプチドリンカー（またはスペーサー）を含み得る。ペプチドリンカーは、柔軟なリンカーであり得る。一部の態様では、リンカーは、２～２０ペプチドの間の長さ、２～１８ペプチドの間の長さ、２～１６ペプチドの間の長さ、２～１４ペプチドの間の長さ、２～１２ペプチドの間の長さ、２～１０ペプチドの間の長さ、４～２０ペプチドの間の長さ、４～１８ペプチドの間の長さ、４～１６ペプチドの間の長さ、４～１４ペプチドの間の長さ、４～１２ペプチドの間の長さ、または４～１０ペプチドの間の長さである。一部の態様では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号７）のコア配列を含む。一部の態様では、リンカーは、配列ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳ（配列番号９）または配列ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号１０）を含む。好ましくは、リンカーは、配列ＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号８）を含む。架橋タンパク質が１つより多くのリンカーを含有する場合、架橋タンパク質中の各リンカーが同じ配列を有することもあり、各リンカーが異なる配列を有することもある。

あるいは、架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメインおよび抗原結合ドメインを化学的にコンジュゲートすることができる。例えば、抗原結合ドメインのシステイン残基を、チオール反応性試薬と、部位特異的かつ効率的にカップリングさせることができる。チオール反応性試薬は、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、または他のチオール反応性コンジュゲーションパートナーであり得る。しかるが故に、架橋タンパク質のＣＡＲ結合ドメイン部分は、例えば、マレイミドループを含み得る。その場合、化学的コンジュゲーションを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元およびＣＡＲ結合ドメイン－マレイミドの付加で開始することができる。
ＩＩＩ．キメラ抗原受容体

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子は、組換え融合タンパク質であり、それらが、標的（例えば、コロナウイルススパイクタンパク質）に結合することもでき、死滅、増殖およびサイトカイン産生のために、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を活性化するための活性化シグナルを、それらの細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して伝達することもできることで、区別される。

実施形態によるキメラ抗原受容体は、当技術分野において公知の任意の手段により産生することができるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技法を使用して産生される。キメラ抗原受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列を調製し、標準的な分子クローニング技法（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー利用ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）により完全コード配列に組み立てることができる。得られたコード領域を、発現ベクターに挿入し、使用して、好適な宿主同種異形または自家免疫エフェクター細胞を形質転換することができる。

本明細書に記載されるＣＡＲの実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、標的結合ドメインを含む細胞外ドメインとを含む標的特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸を含む。必要に応じて、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと標的結合ドメインの間に位置するヒンジドメインを含み得る。ある特定の態様では、実施形態のＣＡＲは、ＣＡＲの発現を細胞表面に指向させるシグナルペプチドをさらに含む。例えば、一部の態様では、ＣＡＲは、ＧＭ－ＣＳＦからのシグナルペプチドを含み得る。

ある特定の実施形態では、少ない量の標的が存在する場合、持続性を改善するためにＣＡＲを膜結合型サイトカインと共発現させることもできる。例えば、ＣＡＲを膜結合型ＩＬ－１５と共発現させることができる。

ＣＡＲのドメインの配置、およびドメインに使用される特異的配列に依存して、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対して異なるレベルの活性を有し得る。一部の態様では、異なるＣＡＲ配列を免疫エフェクター細胞に導入して、操作された細胞を生成し、操作された細胞を向上したＳＲＣについて選択し、選択された細胞を活性について試験して、最も高い治療有効性を有すると予測されるＣＡＲ構築物を同定することができる。

キメラ構築物を裸のＤＮＡとして、または好適なベクターで、免疫エフェクター細胞に導入することができる。裸のＤＮＡを使用して電気穿孔によって細胞に安定的にトランスフェクトする方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照されたい。裸のＤＮＡは、一般に、発現に適した方向でプラスミド発現ベクター内に含有されているキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、キメラ構築物を免疫エフェクター細胞に導入することができる。本発明の方法による使用に好適なベクターは、免疫エフェクター細胞において複製しない。細胞内に維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存を維持するできるほど少ない、ウイルスに基づく多数のベクター、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターなどが、公知である。
Ａ．抗原結合ドメイン

ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはそれらの抗原結合断片を含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する抗体の相補性決定領域を含み得る。「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原を補足する抗原受容体（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見られる短いアミノ酸配列であり、したがって、その特定の抗原に対するその特異性を有する受容体を提供する。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含有する。抗原受容体は、典型的に２本のポリペプチド鎖で構成されているので、抗原と接触することができる６つのＣＤＲが抗原受容体ごとに存在する－－重鎖および軽鎖各々が３つのＣＤＲを含有する。免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体に関連するほとんどの配列変異がＣＤＲに見られるため、これらの領域は、超可変ドメインと呼ばれることもある。これらの中で、ＣＤＲ３は、ＶＪ（重鎖およびＴＣＲ αβ鎖の場合はＶＤＪ）領域の組換えによりコードされるので、最も高い可変性を示す。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。別の実施形態では、その特異性は、ウイルス糖タンパク質に結合する受容体（例えば、ＣＤ４の細胞外ドメイン、例えば、ＣＤ４のＤ１およびＤ２ドメイン）に由来する。抗原結合ドメインがＣＤ４に由来する態様では、抗原結合ドメインを形成するＣＤ４の部分を、ＭＨＣクラスＩＩへの結合を制限するように突然変異させることができる。

ＣＡＲ核酸、特に、ｓｃＦｖ配列は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を強化するためのヒト遺伝子であると考えられる。特異的な実施形態では、完全長ＣＡＲ ｃＤＮＡまたはコード領域が提供される。抗原結合領域またはドメインは、特定のマウス、またはヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨおよびＶＬ鎖の断片を含み得る。この断片もまた、抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインを含み得る。より特異的な実施形態では、断片は、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用のために最適化される配列によりコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。ある特定の態様では、ＣＡＲのＶＨおよびＶＬドメインは、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーなどのリンカー配列により隔てられている。実施形態に従って改変または使用され得るＣＡＲ構築物は、参照により本明細書に組み込まれる国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ２０１５／１２３６４２においても提供されている。

前述のように、原型ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメイン）とカップリングされた１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来するＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖをコードする。したがって、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原などの目的の抗原に結合する抗体のＬＣＤＲ１～３配列およびＨＣＤＲ１～３配列を含み得る。しかし、さらなる態様では、目的の抗原に結合するより多くの抗体のうちの２つは同一であり、ＣＡＲは、（１）抗原に結合する第１の抗体のＨＣＤＲ１～３配列、および（２）抗原に結合する第２の抗体のＬＣＤＲ１～３配列を含む、構築物である。２つの異なる抗原結合抗体からのＨＣＤＲおよびＬＣＤＲ配列を含むそのようなＣＡＲは、抗原の特定の高次構造（例えば、正常な組織と比べて優先的にがん細胞と会合する高次構造）に優先的に結合するという利点を有し得る。

あるいは、異なるｍＡｂに由来するＶＨおよびＶＬ鎖を使用してＣＡＲを操作して、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のパネルを生成することができることが示されている。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、第１の抗体のＬＣＤＲ１～３配列と第２の抗体のＨＣＤＲ１～３配列との任意の組合せを含有し得る。
Ｂ．ヒンジドメイン

ある特定の態様では、実施形態のＣＡＲポリペプチドは、標的結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するヒンジドメインを含み得る。一部の場合には、ヒンジドメインをＣＡＲポリペプチドに含めて、標的結合ドメインと細胞表面の間の適切な距離を提供すること、またはＣＡＲ改変Ｔ細胞の標的結合またはエフェクター機能に悪影響を及ぼす可能性のある立体障害を軽減することができる。ヒンジドメインは、ＦｃγＲ２ａまたはＦｃγＲ１ａなどのＦｃ受容体に結合する配列を含み得る。例えば、ヒンジ配列は、Ｆｃ受容体に結合するヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）からのＦｃドメインを含み得る。

一部の場合には、ＣＡＲヒンジドメインは、Ｉｇヒンジを含むヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその一部分に由来する可能性があり、またはヒトＣＤ８ａ膜貫通ドメイン（ＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ；配列番号１１）およびＣＤ８ａ－ヒンジ領域（ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤ；配列番号１２）に由来する可能性がある。一態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、抗体アイソタイプＩｇＧ_４（ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM；配列番号１３）のヒンジ－ＣＨ_２－ＣＨ_３領域を含み得る。一部の態様では、点突然変異を抗体重鎖ＣＨ_２ドメインに導入して、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞のグリコシル化および非特異的Ｆｃガンマ受容体結合を低減させることができるだろう。

ある特定の態様では、実施形態のＣＡＲヒンジドメインは、野生型Ｉｇ Ｆｃドメインと比べてＦｃ－受容体結合を低減させる少なくとも１つの突然変異を含むＩｇ Ｆｃドメインを含む。例えば、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４－Ｆｃドメインと比べてＦｃ－受容体結合を低減させる少なくとも１つの突然変異を含むＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含み得る。一部の態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４－Ｆｃ配列と比べてＬ２３５および／またはＮ２９７に対応する位置に突然変異（例えば、アミノ酸欠失または置換）を有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含む。例えば、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４－Ｆｃ配列と比べてＬ２３５Ｅおよび／またはＮ２９７Ｑ突然変異を有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含み得る。さらなる態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱなどの、親水性であるアミノ酸、またはＤなどの、「Ｅ」と同様の特性を有するアミノ酸によるアミノ酸置換をＬ２３５位に有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含み得る。ある特定の態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、ＳまたはＴなどの、「Ｑ」と同様の特性を有するアミノ酸によるアミノ酸置換をＮ２９７位に有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含み得る。
Ｃ．膜貫通ドメイン

標的特異的細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを膜貫通ドメインにより連結させることができる。膜貫通ドメインの一部として使用することができるポリペプチド配列は、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン；ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン；膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン；もしくはシステイン突然変異型ヒトＣＤ３ζドメイン；または他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ８、およびエリスロポエチン受容体からの、他の膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。一部の態様では、例えば、膜貫通ドメインは、米国特許出願公開第２０１４／０２７４９０９号において提供されているもの（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ２８膜貫通ドメイン）または米国特許第８，９０６，６８２号において提供されているもの（例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン）のうちの１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含み得、これらの特許文献は、両方とも、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の特異的な態様では、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、これらの膜貫通領域を少なくとも含む）。ある特定の特異的な態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインと８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
Ｄ．細胞内シグナル伝達ドメイン

実施形態のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担当する。用語「エフェクター機能」は、分化細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌をはじめとするヘルパー活性であり得る。ナイーブ、メモリー、またはメモリー型Ｔ細胞におけるエフェクター機能は、抗原依存性の増殖を含む。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を実行するように指示する、タンパク質の部分を指す。一部の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ネイティブ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。そのようなネイティブ受容体の例としては、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはそのホモログの任意のもの（例えば、イータ、デルタ、ガンマまたはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ ＲＩＩＩ、Ｆｃ ＲＩ、およびシグナル伝達分子の組合せ、例えば、ＣＤ３ζとＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ４０、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ならびにこれらの組合せ、ならびに他の同様の分子および断片が挙げられる。活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えば、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃεＲＩを、使用することができる。

通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が利用されるであろうが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全部を使用する必要はないであろう。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用され得る範囲内で、そのような短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルをなお伝達するのであれば、無傷の鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的へのＣＡＲの結合時にエフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分を含むように意図されている。いわゆる第三世代ＣＡＲは、相加または相乗効果のために互いに融合している少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するので、例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢをＣＡＲ構築物と組み合わせることができるので、１つまたは複数の細胞質ドメインを利用することができる。ある特定の特異的な態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ；配列番号１４）と、ＣＤ２８細胞内ドメインと、ＣＤ１３７細胞内ドメインと、または４－１ＢＢ細胞内ドメインに融合しているＣＤ２８細胞内ドメインを含むドメインと、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む。好ましい実施形態では、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインは、実施形態のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとして使用される。

特異的な実施形態では、ＣＡＲにおける細胞内受容体シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３のζ鎖などのＴ細胞抗原受容体複合体のものを含み、Ｆｃγ ＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメインも、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２を単独で、または例えばＣＤ３ζと直列に含む。特異的な実施形態では、細胞内ドメイン（これは、細胞質ドメインと呼ばれることもある）は、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ４０のうちの１つまたは複数の一部または全てを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインにおける内在性Ｔ細胞受容体複合体の任意の部分を利用する。いわゆる第三世代ＣＡＲは、例えば、相加または相乗効果のために互いに融合している少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するので、１つまたは複数の細胞質ドメインを利用することができる。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらなる他の共刺激ドメインを含む。他の共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つまたは複数を、これらに限定されないが、含み得る。ＣＤ３ζにより開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体により提供されるさらなるシグナルは、Ｔ細胞の完全活性化にとって重要であり、養子免疫療法のｉｎ ｖｉｖｏ持続性および治療成功を向上させるのに役立つ可能性がある。
ＩＶ．内因性遺伝子発現の改変

一部の態様では、操作された免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を減少または消失させるように改変される。例えば、操作された免疫エフェクター細胞は、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質をノックダウンまたはノックアウトするように改変され得る。少なくとも１つの免疫チェックポイント遺伝子は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡ、ＫＩＲｓ、アデノシンＡ２ａ受容体、Ｖｉｓｔａ、ＩＤＯ、ＦＡＳ、ＳＩＲＰアルファ、ＣＩＳＨ、ＳＨＰ－１、ＦＯＸＰ３、ＬＡＩＲ１、ＰＶＲＩＧ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ１６０、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３からなる群から選択することができる。

一部の態様では、操作された免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数のＨＩＶ共受容体の発現を減少または消失させるように改変される。例えば、操作された免疫エフェクター細胞は、ＣＣＲ５発現がサイレンシングされるように改変される。

別の例では、操作された免疫エフェクター細胞におけるＨＬＡ遺伝子は、様々な方法で改変され得る。例えば、操作された免疫エフェクター細胞は、それらがそれらの表面に機能的ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、および／またはＨＬＡ－Ｃを発現しないように操作され得る。ＨＬＡ－Ａ陰性の操作された免疫エフェクター細胞は、ＨＬＡホモ接合性の個体に由来し得る。あるいは、操作された免疫エフェクター細胞は、ＨＬＡ－Ａホモ接合性であり得る。さらに、操作された免疫エフェクター細胞は、それらがＨＬＡ－Ａ陰性であるか、ＨＬＡ－Ａホモ接合性であるかを問わず、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、および／またはＨＬＡ－ＤＲＢ１対立遺伝子がＨＬＡホモ接合性であり得る。

一部の態様では、操作された免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数のＴ細胞受容体成分の発現をノックダウンまたはノックアウトするように改変され得る。例えば、一部の態様では、細胞は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ、もしくは前述のものの任意の組合せについての発現を欠いていることもあり、または低減されたその発現を有することもある。そのような改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を、例えば、ＴＣＲ受容体成分のうちの１つまたは複数の定常領域を標的として、導入することを含む、任意の好適な方法により、行われ得る。

内在性遺伝子をノックアウトすることは、内在性遺伝子の座位を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを細胞に導入することを含み得る。様々な態様では、人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得る。様々な態様では、細胞に人工ヌクレアーゼを導入することは、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含み得る。

例えば、一部の態様では、標的内在性遺伝子は、遺伝子または遺伝子産物を非機能性にする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生じる欠失または突然変異を含む。そのような欠失または突然変異は、標的内在性遺伝子の両方の対立遺伝子に起こり得る。

内在性遺伝子の発現をノックダウンすることは、ｍｉＲＮＡをコードする構築物などの阻害性核酸を細胞に導入することを含み得る。阻害性核酸は、遺伝子の転写を阻害し得るか、または細胞内での遺伝子転写物の翻訳を防止し得る。阻害性核酸は、１６～１０００ヌクレオチド長、ある特定の実施形態では、１８～１００ヌクレオチド長であり得る。ある特定の実施形態では、阻害性核酸は、目的の遺伝子に結合またはハイブリダイズする単離された核酸である。阻害性核酸は、標的遺伝子の発現を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは少なくとも７５％サイレンシングすることができる。

阻害性核酸は、当技術分野において周知である。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号、および同第２００４／００６４８４２号に記載されており、これらの参考特許文献の全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な態様では、内在性遺伝子の発現をノックダウンすることは、ｍｉＲＮＡ発現構築物の使用、複数のｍｉＲＮＡの使用、および標的遺伝子の発現をノックダウンするためのそれらの使用を含み得る。一部の態様では、発現構築物は、プロモーターエレメント、スペーサー配列およびｍｉＲＮＡコード配列を含む。そのようなｍｉＲＮＡ発現構築物の例は、ＷＯ２０１９／１８６２７４および米国特許第９，５５６，４３３号で見つけることができ、これらの参考特許文献は、各々、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ある特定の態様の中で、発現ベクターは、目的の核酸、例えば、特定の遺伝子発現を阻害する核酸、を発現させるために利用される。発現は、適切なシグナルがベクターに備えられていること、およびそれらが様々な調節エレメント、例えば、宿主細胞における目的の遺伝子の発現を駆動するウイルス源および哺乳動物源両方からのエンハンサー／プロモーターを含むことを必要とする。宿主細胞におけるＲＮＡ安定性を最適化するように設計されたエレメントも定義される。産物を発現する永続的な安定した細胞クローンを樹立するためのいくつかの優性薬物選択マーカーの使用条件も提供され、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と結びつけるエレメントも提供される。
Ａ．調節エレメント

本願を通して、用語「発現構築物」または「発現ベクター」は、核酸コード配列の一部または全てを転写できる、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築物を含むように意図されている。転写物をタンパク質に翻訳することができるが、する必要はない。ある特定の実施形態では、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを、すなわち、実施形態のＲＮＡ分子と同様に、含む。

ある特定の実施形態では、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始させるために必要とされる細胞の合成機構、または導入された合成機構、により認識されるＤＮＡ配列を指す。句「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために核酸に対して正しい位置および方向で存在することを意味する。

プロモーターという用語は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの開始部位の周囲にクラスター化される転写制御モジュールの一群を指すために本明細書では使用されることになる。プロモーターがどのように組織化されているのかについての考えの大半は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位についてのものを含むいくつかのウイルスＰｏｌ ＩＩプロモーターの分析から来ている。つい最近の研究により増加されたこれらの研究論文は、各々がおおよそ７～２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子またはリプレッサータンパク質のための１つまたは複数の認識部位を含有する、別個の機能性モジュールで、プロモーターが構成されていることを示した。

各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールが機能して、ＲＮＡ合成のための開始部位を配置する。これについての最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠いている一部のプロモーター、例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーター、およびＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーターでは、開始部位自体を覆っている別個のエレメントが、開始の場所を固定するのに役立つ。

さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流に位置するが、いくつかのプロモーターが開始部位の下流にも機能性エレメントを含有することが最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、多くの場合、自由度が高く、したがって、エレメントを互いに相対的に反転または移動させてもプロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターの場合、活性が低下し始める前にプロモーターエレメント間の間隔を増加させて５０ｂｐ離すことができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協調的に機能することもあり、または独立して機能することもあるようである。

一部の実施形態では、プロモーターは、短い伸長因子１（ＥＦ１ｓ）プロモーターを含む。他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピート、ラットインスリンプロモーターおよびグリセロアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、目的のコード配列の高レベル発現を達成することができる。目的のコード配列の発現を果たすための、当技術分野において周知である他のウイルスもしくは哺乳動物細胞またはバクテリオファージプロモーターの使用も、発現レベルが所与の目的に十分であることを条件に、企図される。

特性が周知であるプロモーターを利用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現レベルおよび発現パターンを最適化することができる。さらに、特異的な生理的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択により、遺伝子産物の誘導性発現が可能になり得る。表１および２は、目的の遺伝子の発現を調節するために本発明に関連して用いることができるいくつかの調節エレメントを収載する。このリストは、遺伝子発現の促進に関与する可能性のあるエレメント全てについて網羅的であることを目的とするものではなく、単にそれらの例となることを目的とするものである。一部の態様では、本実施形態に従って使用するためのプロモーターは、非組織特異的プロモーター、例えば、構成的プロモーターである。

エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置にあるプロモーターからの転写を増加させる遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターとほとんど同じように組織化されている。すなわち、それらは、１つまたは複数の転写タンパク質に各々が結合する、多くの個々のエレメントで構成されている。

エンハンサーとプロモーターの基本的な差異を使用できる。エンハンサー領域は全体として、少し離れて転写を刺激することができなければならず、これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには当てはまらない。その一方で、プロモーターは、特定の部位において特定の方向でＲＮＡ合成の開始を指示する１つまたは複数のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーは、これらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、多くの場合、オーバーラップしており、かつ連続しており、多くの場合、非常によく似たモジュール構成を有するようである。

以下は、発現構築物において目的の遺伝子またはｍｉＲＮＡをコードする核酸と組み合わせて使用される可能性があるウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーおよび誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである（表１および表２）。加えて、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢのとおり）も、目的の遺伝子またはｍｉＲＮＡの発現を駆動するために使用される可能性がある。短縮型プロモーターも、発現を駆動するために使用され得る。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物として、どちらかで提供された場合、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質における転写を支持することができる。

いずれかのｃＤＮＡ挿入を利用する場合、通常は、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を果たすためにポリアデニル化シグナルを含めることになる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施成功に極めて重要であるとは考えられないので、ヒト成長ホルモン子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの、任意のそのような配列を利用することができる。しかし、一部の態様では、ポリアデニル化シグナル配列は、実施形態のベクターに含まれない。例えば、レンチウイルスベクター内（３’ＬＴＲの前）へのそのようなシグナル配列の組み込みは、得られるレンチウイルスの力価を低下させ得る。

スペーサー配列を核酸構築物に含めることができる。スペーサーの存在は、ｍｉＲＮＡのノックダウン効率を向上させるようである（Stegmeier et al., 2005）。スペーサーは、いずれのヌクレオチド配列であってもよい。一部の態様では、スペーサーは、ＧＦＰである。

発現カセットのエレメントとしてターミネーターも企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを向上させるために、およびカセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるために役立ち得る。
Ｂ．選択可能なマーカー

本発明のある特定の実施形態では、細胞は、本発明の核酸構築物を含有し、発現構築物にマーカーを含めることによりｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞を同定することができる。そのようなマーカーは、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞に付与することになる。通常は、薬物選択マーカーに含めることは、クローニングにおよび形質転換体の選択に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択可能なマーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を利用することができる。免疫学的マーカーも利用することができる。利用される選択可能なマーカーは、それが、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要であるとは考えられない。選択可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
Ｖ．核酸分子および発現ベクターの送達

ある特定の態様では、実施形態の核酸の送達のためのベクターを、細胞においてこれらの因子を発現するように構築することができた。特定の態様では、以下の系および方法を所望の細胞型への核酸の送達に使用することができる。
Ａ．相同組換え

実施形態のある特定の態様では、実施形態の核酸分子をコードするベクターを、特異的な方法で、例えば相同組換えによって、細胞に導入することができる。幹細胞において遺伝子を発現させるための現行の手法は、ゲノム内にランダムに組み込むウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）または導入遺伝子の使用を必要としている。これらの手法は、ひとつには、ランダムに組み込まれたベクターが内因性遺伝子発現、および／または導入遺伝子発現のサイレンシングを活性化または抑制し得るため、成功していない。ランダムな組み込みに関連する問題は、標的ゲノムの特異的遺伝子座への相同組換えによって一部は克服することができた。

普遍的組換えとしても公知の相同組換え（ＨＲ）は、ヌクレオチド配列が２つの類似したまたは同一のＤＮＡ鎖間で交換される、あらゆる種類の生き物において使用される普遍的組換えの一種である。この技法は、１９８０年代半ば以来、哺乳動物細胞における標準的なゲノム操作方法となっている。プロセスは、いくつかの物理的破壊ステップおよび最終的なＤＮＡ再結合を含む。このプロセスは、ＤＮＡの潜在的に致命的な二本鎖切断の修復に、事実上、最も広く使用される。加えて、相同組換えは、真核生物が精子および卵子のような胚細胞を作るプロセスである減数分裂中に、ＤＮＡ配列の新しい組合せを生じさせる。ＤＮＡのこれらの新しい組合せは、子孫における遺伝的変異を意味し、これによって集団は経時的な環境条件の変化に進化的に適応することが可能になる。相同組換えは、細菌およびウイルスの異なる株および種間で遺伝物質を交換するための遺伝子水平伝播にも使用される。相同組換えは、分子生物学において遺伝子変化を標的生物に導入するための技法としても使用される。

相同組換えは、標的ゲノム改変として使用することができる。哺乳動物細胞における標準的なＨＲの効率は、処置される細胞の１０^－６～１０^－９に過ぎない（Capecchi, 1990）。メガヌクレアーゼ、すなわちホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばＩ－ＳｃｅＩ、の使用は、ＨＲの効率を上昇させるために使用されている。天然メガヌクレアーゼと、改変された標的化特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼの両方が、ＨＲ効率を上昇させるために利用されている（Pingoud and Silva, 2007；Chevalier et al., 2002）。ＨＲの効率上昇への別の道は、プログラム可能なＤＮＡ特異性ドメインを用いてキメラエンドヌクレアーゼを操作することであった（Silva et al., 2011）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合されている（Durai et al., 2005；ＷＯ２００５０２８６３０において概説されているとおり）、そのようなキメラ分子の一例である。そのような特異性分子の別のクラスは、ＦｏｋＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメイン（Miller et al., 2011：ＷＯ２０１００７９４３０）を含む。
Ｂ．核酸送達系

当業者は、標準的な組換え技法によってベクターを構築する力を十分に備えているであろう（例えば、Sambrook et al., 2001およびAusubel et al., 1996を参照されたく、これらの参考文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来する）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来する）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（これらの複製可能、複製欠損性およびガットレス形態を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳がんウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
１．エピソームベクター

プラスミドに基づくまたはリポソームに基づく染色体外（すなわち、エピソーム）ベクターの使用も、本発明のある特定の実施形態では、例えば、体細胞の再プログラム化のために提供される。そのようなエピソームベクターとしては、例えば、ｏｒｉＰに基づくベクター、および／またはＥＢＶ－タンパク質の誘導体ＥＢＮＡ－１をコードするベクターを挙げることができる。これらのベクターは、ＤＮＡの大きい断片を細胞に導入し、染色体外に維持し、１細胞周期に１回複製し、娘細胞に効率的に分配することを可能にし得、免疫応答を実質的に惹起しない。

特に、ｏｒｉＰに基づく発現ベクターの複製に必要とされる唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ－１は、ＭＨＣクラスＩ分子上のその抗原の提示に必要とされるプロセシングを迂回するための効率的なメカニズムを発達させたため、細胞免疫応答を惹起しない（Levitskaya et al., 1997）。さらに、ＥＢＮＡ－１は、トランスで作用してクローン遺伝子の発現を増強することができ、この発現増強は、一部の細胞系での最大１００倍のクローン遺伝子の発現を誘導する（Langle-Rouault et al., 1998；Evans et al., 1997）。最後に、このようなｏｒｉＰに基づく発現ベクターの製造は、安価である。

他の染色体外ベクターとしては、他のリンパ向性ヘルペスウイルスに基づくベクターが挙げられる。リンパ向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）において複製してその天然周期の一部の間にプラスミドになる、ヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ向性ヘルペスウイルスとしては、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイスルサイミリ（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶなどの、エピソームに基づくベクターの他の供給源も企図される。

当業者は、標準的な組換え技法によってベクターを構築する力を十分に備えているであろう（例えば、Maniatis et al., 1988およびAusubel et al., 1994を参照されたく、これらの参考文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。

ベクターは、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらにモジュレートする、または標的細胞に有益な特性を別様に提供する、他の成分または機能性も含み得る。そのような他の成分としては、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす成分（細胞型または組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（例えば、核局在化を媒介する作用因子）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分が挙げられる。

そのような成分は、ベクターにより送達された核酸を取り込んだ細胞およびそれを発現している細胞の検出または選択に使用され得るマーカー、例えば、検出可能なマーカーおよび／または選択マーカーも含み得る。そのような成分がベクターの天然の特徴として備えられていることもあり（例えば、結合および取り込みを媒介する成分または機能性を有する、ある特定のウイルスベクターの使用）、またはベクターがそのような機能性を備えるように改変されることもある。非常に様々なそのようなベクターが、当技術分野において公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞内で維持される場合、ベクターは、自律構造として有糸分裂中に細胞によって安定的に複製され得るか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか、または宿主細胞の核もしくは細胞質内に維持され得る。
２．トランスポゾンに基づく系

特定の実施形態によれば、核酸の導入は、トランスポゾン－トランスポザーゼ系を使用し得る。使用されるトランスポゾン－トランスポザーゼ系は、周知のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン－トランスポザーゼ系（後者の説明については、例えば、ＥＰ１５０７８６５を参照されたい）、またはＴＴＡＡ特異的トランスポゾンピギーバック系であり得る。

トランスポゾンは、転置と呼ばれるプロセスである、単一の細胞のゲノム内の異なる位置を動き回ることができる、ＤＮＡの配列である。そのプロプロセスで、それらは、ゲノム内のＤＮＡの変異およびその量の変化を生じさせ得る。トランスポゾンは、かつてはジャンピング遺伝子とも呼ばれており、可動性遺伝子エレメントの例である。

様々な可動性遺伝子エレメントがあり、それらをそれらの転置メカニズムに基づいて分類することができる。クラスＩ可動性遺伝子エレメント、またはレトロトランスポゾンは、先ず、ＲＮＡに転写され、次いで、逆転写酵素により逆転写されてＤＮＡに戻り、次いで、ゲノム内の別の位置に挿入されることにより、自体をコピーする。クラスＩＩ可動性遺伝子エレメントは、トランスポザーゼを使用してゲノム内で自体を「カットアンドペースト」することによって１つの位置から別の位置に直接移動する。
３．ウイルスベクター

組換えウイルスベクターを生成する際、典型的には、非必須遺伝子が、異種（または非ネイティブ）タンパク質または核酸の遺伝子またはコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して核酸および可能性的にはタンパク質を細胞に導入する、一種の発現構築物である。ある特定のウイルスは、ｐＨ依存性またはｐＨ非依存性メカニズムによって細胞に感染するまたは細胞に侵入することができること、それらの遺伝子カーゴを宿主細胞ゲノムに組み込むことができること、およびウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現することができることから、外来核酸の細胞（例えば、哺乳動物細胞）への移入のための魅力的な候補とされている。本発明のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例が下で説明される。

レトロウイルスは、それらがそれらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込むことができること、ひいては、大量の外来遺伝物質を移入すること、広範囲の種および細胞型に感染すること、および特殊な細胞系にパッケージングされることから、遺伝子送達ベクターとして有望である（Miller, 1992）。

レトロウイルスベクターを構築するために、核酸が、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損性であるウイルスが産生される。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲおよびパッケージング成分のない、パッケージング細胞系が構築される（Mann et al., 1983）。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と一緒に、特殊な細胞系に（例えば、例えばリン酸カルシウム沈殿により）導入された場合、パッケージング配列によって、組換えプラスミド（すなわち、ベクターゲノム）のＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能になり、これらのウイルス粒子は、その後、培養培地に分泌される（Nicolas and Rubenstein, 1988；Temin, 1986；Mann et al., 1983）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地が回収され、必要に応じて、濃縮され、遺伝子移入に使用される。ベクター粒子表面を覆うために使用されるエンベロープタンパク質の指向性に依存して、レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定的発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskind et al., 1975）。

レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節および構造機能を有する他の遺伝子を含有する、複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である（例えば、Naldini et al., 1996；Zufferey et al., 1997；Blomer et al., 1997；Giry-Laterriere et al., 2011；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染でき、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ両方の遺伝子移入および核酸配列の発現に使用され得る。例えば、非分裂細胞に感染できる組換えレンチウイルス、この場合、パッケージング機能を有する、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよび参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されているものを有する、２つまたはそれより多くのベクターが好適な宿主細胞にトランスフェクトされる。
Ｃ．核酸送達

本発明でプログラムされることになる細胞への核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、の導入は、本明細書に記載されるような、または当業者に公知であろうような、細胞の形質転換のための核酸送達に好適な任意の方法を使用することができる。そのような方法としては、ＤＮＡの直接送達、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションによる方法（Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989）；注射による方法（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号、各々が参照により本明細書に組み込まれる）（これには、マイクロインジェクションによる方法（Harland and Weintraub, 1985；参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７８９，２１５号）が含まれる）；電気穿孔による方法（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号；Tur-Kaspa et al., 1986；Potter et al., 1984）；リン酸カルシウム沈殿による方法（Graham and Van Der Eb, 1973；Chen and Okayama, 1987；Rippe et al., 1990）；ＤＥＡＥ－デキストラン、続いてポリエチレングリコールを使用することによる方法（Gopal, 1985）；直接音響負荷による方法（Fechheimer et al., 1987）；リポソーム媒介トランスフェクション（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolau et al., 1987；Wong et al., 1980；Kaneda et al., 1989；Kato et al., 1991）および受容体媒介トランスフェクション（Wu and Wu, 1987；Wu and Wu, 1988）による方法；マイクロプロジェクタイルボンバードメントによる方法（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号および同第５，５３８，８８０号、各々が参照により本明細書に組み込まれる）；炭化ケイ素繊維との攪拌による方法（Kaeppler et al., 1990；米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号、各々が参照により本明細書に組み込まれる）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換による方法（米国特許第５，５９１，６１６号および同第５，５６３，０５５号、各々が参照により本明細書に組み込まれる）；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みによる方法（Potrykus et al., 1985）；および前記の方法の任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。これらなどの技法の適用によって、オルガネラ、細胞、組織または生物を安定的にまたは一過的に形質転換することができる。
２．リポソーム媒介トランスフェクション

本発明のある特定の実施形態では、核酸は、例えばリポソームなどの、脂質複合体に封入され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が、過剰な水溶液に懸濁されると、自発的に形成される。脂質成分は、自己再構成を経た後、閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水および溶解した溶質を捕捉する（Ghosh and Bachhawat, 1991）。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化した核酸も企図される。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質はもちろん使用される細胞によっても様々であり得、例えば、細胞１，０００，０００～１０，０００，０００個あたり約５～約２０μｇのベクターＤＮＡが企図され得る。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリポソーム媒介核酸送達および異種ＤＮＡの発現は、大きな成功を収めている（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolau et al., 1987）。培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａおよびヘパトーマ細胞におけるリポソーム媒介送達および異種ＤＮＡの発現の実行可能性も、実証されている（Wong et al., 1980）。

本発明のある特定の実施形態では、リポソームは、血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化され得る。これは、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞膜との融合を助長し、細胞へのこのＤＮＡの侵入を促進することが示されている（Kaneda et al., 1989）。他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色タンパク質（ＨＭＧ－１）と複合体化または併用され得る（Kato et al., 1991）。さらに他の実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ－１の両方と複合体化または併用され得る。他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。
３．電気穿孔

本発明のある特定の実施形態では、核酸は、電気穿孔によってオルガネラ、細胞、組織または生物に導入される。電気穿孔は、高電圧放電への細胞およびＤＮＡの懸濁液の曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的損傷により形質転換を受けやすくされ得る。また、使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質によって様々であり得、例えば、細胞１，０００，０００～１０，０００，０００個あたり約５～約２０μｇのベクターＤＮＡが企図され得る。

電気穿孔を使用する真核細胞のトランスフェクションは、極めて成功している。この方法で、マウス前Ｂリンパ球にヒトカッパ－免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクトされており（Potter et al., 1984）、ラット肝細胞にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Tur-Kaspa et al., 1986）。
４．リン酸カルシウム

本発明の他の実施形態では、核酸は、リン酸カルシウム沈降を使用して細胞に導入される。この技法を使用して、ヒトＫＢ細胞にアデノウイルス ５ ＤＮＡがトランスフェクトされている（Graham and Van Der Eb, 1973）。また、この方法で、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ－１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞に、ネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされており（Chen and Okayama, 1987）、ラット肝細胞に様々なマーカー遺伝子がトランスフェクトされている（Rippe et al., 1990）。
５．ＤＥＡＥ－デキストラン

別の実施形態では、核酸は、ＤＥＡＥ－デキストラン、続いて、ポリエチレングリコールを使用して、細胞に送達される。この方法で、レポータープラスミドがマウス骨髄腫および赤白血病細胞に導入された（Gopal, 1985）。
Ｄ．細胞培養

一般に、本発明の細胞は、細胞成長を持続できる栄養分に富んだ緩衝溶液である培養培地で培養される。

本明細書に記載される方法による幹細胞の単離、拡大および分化に好適な培養培地としては、高グルコースダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５、ＲＰＭＩ １６４０、イスコフ変性ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＯｐｔｉ－ＭＥＭ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンおよびマイトジェンを補充したイスコフ変性ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）などの最少必須培地を含む既知組成培地も、好適である。本明細書で使用される場合、マイトジェンは、細胞の細胞分裂を刺激する薬剤を指す。薬剤は、化学物質であり、通常は、細胞分裂を開始するように細胞を促し、ひいては有糸分裂を誘発する、何らかの形態のタンパク質である。一実施形態では、米国特許第５，９０８，７８２号およびＷＯ９６／３９４８７に記載されているものなどの無血清培地、ならびに米国特許第５，４８６，３５９号に記載されているような「完全培地」が、本明細書に記載される方法での使用に企図される。一部の実施形態では、培養培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト自家血清、ヒトＡＢ血清、またはヘパリン（２Ｕ／ｍＬ）が補充された多血小板血漿が、補充される。細胞培養物は、培養液のｐＨを維持するためにＣＯ_２雰囲気、例えば５％～１２％で維持され、高湿度雰囲気で、３７℃でインキュベートされ、８５％未満の集密度を維持するように継代され得る。
ＶＩ．免疫エフェクター細胞

免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、もしくはガンマ－デルタＴ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、インバリアントＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞であり得る。免疫エフェクター細胞を産生および操作する方法、ならびに養子細胞療法のために細胞を使用および投与する方法（この場合、細胞は、自家または同種異系であり得る）も、本明細書で提供される。したがって、免疫エフェクター細胞を、免疫療法、例えば、がん細胞を標的とする免疫療法として、使用することができる。

免疫エフェクター細胞は、対象、特にヒト対象、から単離され得る。免疫エフェクター細胞は、目的の対象、例えば、特定の疾患もしくは状態に罹患している疑いがある対象、特定の疾患もしくは状態にかかりやすい素因を有する疑いがある対象、特定の疾患もしくは状態の治療を受けている対象、健康なボランティアもしくは健康なドナーである対象から、または血液バンクから得ることができる。免疫エフェクター細胞を、外科手順中に除去および／または露出された血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、組織、ならびに生検手順によって得られた組織を含むがこれらに限定されない、対象体内のそれらが存在する任意の組織または臓器から、収集、富化および／または精製することができる。単離された免疫エフェクター細胞は、直接使用されることもあり、またはしばらくの間、例えば凍結することにより、保管されることもある。

免疫エフェクター細胞が富化、単離および／または精製される組織／臓器は、生きている対象および生きていない対象の両方から単離され得、生きていない対象は、臓器ドナーである。臍帯血から単離された免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞抑制により測定されるものなどの、免疫調節能力向上を有し得る。免疫エフェクター細胞は、免疫調節能力向上のためにプール血液、特にプール臍帯血、から単離され得る。プール血液は、２名またはそれより多くの供給源、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０名またはそれより多くの供給源（例えば、ドナー対象）からのものであり得る。

免疫細胞の集団を、治療を必要とする対象、または免疫エフェクター細胞活性の低下に関連する疾患を患っている対象から得ることができる。したがって、細胞は、治療を必要とする対象にとって自家であることになる。あるいは、免疫エフェクター細胞の集団を、ドナー、好ましくは同種異系ドナー、から得ることができる。同種異系ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性であることもあり、またはないこともある。対象適合性にするために、免疫原性を低下させるように同種異形細胞を処置することができる。

免疫エフェクター細胞の供給源は、同種異系供給源と自家供給源の両方を含む。一部の場合には、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化され得る。したがって、実施形態に従って操作するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離され得る。例えば、同種異形Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（および必要に応じて、機能的ＴＣＲおよび／またはＭＨＣを欠いているように）改変され得る。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、初代ヒトＴ細胞、例えば、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｇ－ＣＳＦでの刺激後に収集したＰＢＭＣ、骨髄、または臍帯血から採取されたＴ細胞である。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲ発現構築物での）の後に、細胞は、直ぐに注入されることもあり、または保管されることもある。ある特定の態様では、トランスフェクションの後、細胞は、細胞への遺伝子移入後約１、２、３、４、５日またはそれを超える日数以内に混合集団としてｅｘ ｖｉｖｏで数日、数週間または数カ月間、増殖され得る。さらなる態様では、トランスフェクション後、トランスフェクタントは、クローニングされ、単一の組み込まれたまたはエピソームに保持された発現カセットまたはプラスミドの存在、およびキメラ抗原受容体の発現を明示するクローンが、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大される。拡大に選択されるクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識して溶解する能力を明示する。組換えＴ細胞は、ＩＬ－２、または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１など）での刺激により、拡大され得る。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞での刺激により拡大され得る。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞で拡大されることもあり、またはＴ細胞表面のＣＤ３を架橋する抗体、例えばＯＫＴ３を用いて拡大されることもある。組換えＴ細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞から欠失されることもあり、またはＴ細胞表面のＣＤ５２に結合する抗体、例えばＣａｍｐａｔｈを用いて欠失されることもある。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存され得る。

さらなる態様では、実施形態の免疫エフェクター細胞は、高いミトコンドリア予備呼吸能（ＳＲＣ）について選択されたものである。本明細書で使用される場合、「高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞」は、対応する平均的な免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）よりも高いミトコンドリア活性または多いミトコンドリア数を有する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。したがって、一部の態様では、実施形態の細胞組成物は、高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞の集団、例えば、高いミトコンドリアＳＲＣを有するＣＡＲ発現性Ｔ細胞の集団を含む。

高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、高い腫瘍負荷、低酸素状態、解糖のための栄養素の欠如、または抑制的サイトカイン環境などの、ストレス条件中に、より低いＳＲＣを有する細胞と比べて生存率向上を提示し得る。さらに、高いミトコンドリアＳＲＣについて選択された免疫エフェクター細胞は、ストレス条件下であっても、細胞傷害活性を保持し得る。したがって、高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を選択することにより、治療用とＣＡＲ構築物の試験用の両方の改善された細胞組成物を産生することができる。

一態様では、トランスジェニックエフェクター細胞のミトコンドリアＳＲＣを決定するために使用され得るレポーターを含むトランスジェニック免疫エフェクター細胞が、提供される。例えば、トランスジェニック細胞は、ミトコンドリア局在シグナルに関連付けられるレポーターポリペプチドを含み得る。例えば、レポーターは、蛍光ポリペプチド、例えば、高感度黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）または高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）であり得、ミトコンドリア局在シグナルは、グルタレドキシン（Ｇｒｘ２）からのものであり得る。これに関連して、蛍光レポーターによって、高いミトコンドリアＳＲＣを有するＣＡＲ^＋Ｔ細胞が同定される。例えば、レポーターを発現するトランスジェニック細胞を、蛍光強度に基づいて選別し、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を死滅させるために注入することができる。同様に、トランスジェニック細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞を死滅させることについて試験して、例えば、候補ＣＡＲポリペプチドの治療有効性を判定することができるだろう。

一部の態様では、実施形態に従って使用するためのミトコンドリアレポーター遺伝子は、内在性遺伝子であり得る。さらなる態様では、ミトコンドリアレポーター遺伝子は、外来性遺伝子、例えば、蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子であり得る。一部の態様では、蛍光レポータータンパク質は、ミトコンドリア局在配列を含み得る。ある特定の態様では、高いＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を選択するための方法は、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳを含み得る。

ある特定の態様では、ＳＲＣを用いて免疫エフェクター細胞を同定するためのレポーター遺伝子の発現は、核プロモーター（例えば、ｈＥＦ１ａ）の制御下にあり得る。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアプロモーターの制御下にあり得る。ある特定の態様では、発現されるレポータータンパク質は、ミトコンドリア局在配列を含み得る。ある特定の態様では、発現されるレポータータンパク質は、細胞表面に方向付けられ得る。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアプロモーターの制御下にあり得、発現されるレポータータンパク質は、細胞表面に方向付けられ得る。一部の態様では、外来性レポーター遺伝子は、トランスポゾンリピートまたはウイルスＬＴＲと隣接していることがある。一部の態様では、外来性レポーター遺伝子は、染色体外核酸、例えば、ｍＲＮＡまたはエピソームベクターに含まれていることがある。
ＶＩＩ．免疫エフェクター細胞を増殖させるための方法

一部の場合には、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、細胞の拡大に役立つように、活性化・増殖細胞（ＡａＰＣ）と共培養される。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物および細胞療法製品の調製に有用である。抗原提示系の調製および使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、および同第６，７９０，６６２号、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号および同第２００９／０００４１４２号、ならびに国際公開番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照されたく、これらの参考特許文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。

一部の場合には、ＡａＰＣは、目的の抗原（例えば、ＣｏＶスパイクタンパク質）を発現する。さらに、一部の場合には、ＡＰＣは、特異的ＣＡＲポリペプチドに結合する抗体を発現することができ、またはＣＡＲポリペプチド全般に結合する抗体を発現することができる（例えば、ユニバーサル活性化・増殖細胞（ｕＡＰＣ））。そのような方法は、国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ／２０１４／１９０２７３において開示されており、この参考特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。目的の抗原に加えて、ＡａＰＣ系は、少なくとも１つの外来性補助分子も含み得る。補助分子の任意の好適な数および組合せを用いることができる。これらの補助分子は、共刺激分子および接着分子などの、補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ７０およびＢ７．１（Ｂ７．１は、以前はＢ７として知られていたものであり、ＣＤ８０としても公知である）が挙げられ、これらは、数ある中でも、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ－４分子に結合することによって、例えば、Ｔ細胞拡大、Ｔｈ１分化、短期Ｔ細胞生存、およびインターロイキン（ＩＬ）－２などのサイトカイン分泌に影響を与える（Kim et al., 2004を参照されたい）。接着分子は、炭水化物結合糖タンパク質、例えばセレクチン；膜貫通型結合糖タンパク質、例えばインテグリン；カルシウム依存性タンパク質、例えばカドヘリン；および例えば、細胞と細胞の接触のまたは細胞とマトリックスの接触を促進する、１回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質、例えば細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）を含み得る。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ－３、およびＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ－１が挙げられる。共刺激分子および接着分子をはじめとする例示的な補助分子の選択、クローニング、調製および発現に有用な技法、方法および試薬は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号に実例が示されている。

ＡａＰＣになるのに選ばれる細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、および／または細胞内ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子－ペプチド負荷の欠損を有するか、または変温性である（すなわち、哺乳動物細胞系より温度チャレンジ対する感受性が低い）か、または欠損と変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣになるのに選ばれる細胞は、内在性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子および細胞に導入される補助分子成分に対する少なくとも１つの内在性対応物（例えば、内在性ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子および／または上記の内在性補助分子）を発現する能力も欠如している。さらに、ＡａＰＣは、好ましくは、ＡａＰＣを生成するためのそれらの改変の前に細胞が有していた欠損および変温特性を保持する。例示的なＡａＰＣは、昆虫細胞系などの、抗原プロセシング（ＴＡＰ）欠損細胞系に関連する輸送体を構成するか、またはそれに由来する。例示的な変温昆虫細胞系は、ショウジョウバエ細胞系、例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞系（例えば、Schneider 1972を参照されたい）である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞の調製、成長および培養のための説明に役立つ方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号において提供されている。

一実施形態では、ＡａＰＣは、凍結融解サイクルにも付される。例示的な凍結融解サイクルでは、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを含有する好適な容器を、凍結が迅速に起こるように適切な量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）または類似の低温材料と接触させることにより、凍結され得る。次いで、凍結されたＡＰＣは、低温材料からのＡａＰＣの除去および周囲の室温条件への曝露、または微温湯浴または温かい手がより短い融解時間を促進するために用いられる促進融解プロセスのどちらかにより融解される。加えて、ＡａＰＣは、凍結され、融解の前に長期間、保管されることがある。凍結されたＡａＰＣは、将来の使用の前に、融解され、次いで凍結乾燥されることもある。好ましくは、凍結融解手順に悪影響を及ぼす可能性がある保存剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および他の保存剤は、凍結融解サイクルを受けるＡａＰＣを含有する培地には非存在であるか、またはそのような保存剤が本質的にない培地にＡａＰＣを移すことなどにより、本質的に除去される。

さらなる実施形態では、異種核酸、およびＡａＰＣに内在する核酸は、架橋により不活性化され得、したがって、不活性化後には細胞の成長も、複製も、核酸の発現も本質的に起こらない。一実施形態では、ＡａＰＣは、外来性ＭＨＣおよび補助分子の発現、ＡａＰＣの表面でのそのような分子の提示、および提示されたＭＨＣ分子と選択されたペプチド（単数または複数）の負荷より後の時点で、不活性化される。したがって、選択されたペプチドが負荷され、不活性化されたそのようなＡａＰＣは、本質的に増殖も複製もできないようにされているが、選択されたペプチドを提示する機能を保持する。好ましくは、架橋によって、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌およびウイルスなどの夾雑微生物が本質的にないＡａＰＣも得られる。したがって、架橋は、ＡａＰＣを使用して開発される細胞療法製品の重要なＡａＰＣ機能を維持し、その上、その安全性についての懸念を軽減するのに役立つ。架橋およびＡａＰＣに関する方法については、例えば、米国特許出願公開第２００９００１７０００号を参照されたく、この参考特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩＩＩ．治療応用

一部の態様では、実施形態のＣＡＲ架橋タンパク質およびキメラ抗原受容体構築物および細胞は、コロナウイルスに感染している対象または罹患している疑いがある対象に応用される。使用され得る好適な免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を含む。当業者には周知であるように、様々な方法を、対象からこれらの細胞を単離するために容易に利用できる。例えば、細胞表面マーカー発現を使用して、または市販のキット（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩｌｌからのＩＳＯＣＥＬＬ（商標））を使用して。

トランスフェクトまたは形質導入された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）がキメラ抗原受容体を表面膜タンパク質として所望どおりに調節して所望のレベルで発現できることが確証されると、キメラ抗原受容体が、宿主細胞が所望のシグナル伝達を提供する点で機能的であるかどうかを判定することができる。その後、形質導入免疫エフェクター細胞は、対象における抗腫瘍応答を活性化するために対象に再導入または投与される。投与を容易にするために、実施形態による形質導入Ｔ細胞は、さらに薬学的に許容され得る適切な担体または希釈剤を用いて、医薬組成物にされ得るかまたはｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適している移植片にされ得る。そのような組成物または移植片を作製する手段は、当技術分野において説明されている（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed., 1980を参照されたい）。必要に応じて、形質導入Ｔ細胞は、半固体または液体形態の調製物、例えば、カプセル、溶液、注射剤、吸入剤またはエアロゾルに、それらのそれぞれの投与経路のための通常の方法で製剤化され得る。組成物の放出および吸収をそれが標的組織もしくは臓器に達するまで防止するもしくは最小限に抑えるために、または組成物の持続放出を確実にするために、当技術分野において公知の手段が利用され得る。しかし、望ましくは、キメラ抗原受容体を発現する細胞を無効にしない、薬学的に許容される形態が、利用される。したがって、望ましくは、形質導入Ｔ細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、または生理食塩水を含有する医薬組成物にされ得る。

ある特定の実施形態では、実施形態のＣＡＲ発現性細胞は、実施形態のＣＡＲ発現性細胞の送達を必要とする個体、例えば、がんを有するかまたは感染している個体に送達される。すると、細胞は、それぞれのがんまたは病原体感染細胞を攻撃するための個体の免疫系を強化する。一部の場合には、個体に１または複数用量の抗原特異的ＣＡＲ細胞が提供される。個体に２またはそれより多くの用量の抗原特異的ＣＡＲ細胞が提供される場合、投与間の期間は、個体内での増殖時間を確保するのに十分なものでなければならず、特異的な実施形態では、用量間の期間は、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれを超える日数である。治療効果に好適な用量は、例えば、好ましくは一連の投薬サイクルで、１用量あたり少なくとも１０^５細胞、または約１０^５～約１０^１０細胞の間であろう。例示的な投薬レジメンは、０日目に少なくとも約１０^５細胞で出発する、例えば、患者内用量漸増スキームを開始して数週間以内に約１０^１０細胞の標的用量まで徐々に増加させる、漸増用量の４サイクルの１週間投薬サイクルからなる。好適な投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、腔内（例えば、リザーバアクセスデバイスによる）投与、腹腔内投与、および腫瘍塊への直接注射が挙げられる。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ発現性細胞は、架橋タンパク質への送達の前に、ＣＡＲ発現性細胞の送達を必要とする個体に送達される。一部の場合には、ＣＡＲ発現性細胞の投与と架橋タンパク質の投与の間の期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、またはそれを超える期間であり得る。一部の場合には、個体に１または複数用量のＣＡＲ発現性細胞および／または架橋タンパク質が提供される。個体に２またはそれより多くの用量のＣＡＲ発現性細胞および／または架橋タンパク質が提供される場合、用量間の投与間の期間は、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれを超える日数であり得る。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ発現性細胞は、架橋タンパク質への送達後に、ＣＡＲ発現性細胞の送達を必要とする個体に送達される。一部の場合には、架橋タンパク質とＣＡＲ発現性細胞の投与間の期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、またはそれを超える期間であり得る。一部の場合には、個体に１または複数用量のＣＡＲ発現性細胞および／または架橋タンパク質が提供される。個体に２またはそれより多くの用量のＣＡＲ発現性細胞および／または架橋タンパク質が提供される場合、用量間の投与間の期間は、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれを超える日数であり得る。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ発現性細胞は、架橋タンパク質の送達と同時に、ＣＡＲ発現性細胞の送達を必要とする個体に送達される。一部の場合には、個体に１または複数用量のＣＡＲ発現性細胞および／または架橋タンパク質が提供される。第２のまたはそれより後の送達は、ＣＡＲ発現性細胞のみの送達であることもあり、架橋タンパク質のみの送達であることもあり、または２つの組合せの送達であることもある。個体に２またはそれより多くの用量のＣＡＲ発現性細胞および／または架橋タンパク質が提供される場合、用量間の投与間の期間は、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれを超える日数であり得る。

一部の場合には、ＣＡＲ発現性細胞で以前に処置されたことがある患者は、ＣＡＲ発現性細胞のエフェクター機能をリダイレクトするために架橋タンパク質で処置され得る。一部の場合には、ＣＡＲ発現性細胞および架橋タンパク質で以前に処置されたことがある患者は、ＣＡＲ発現性細胞のエフェクター機能をリダイレクトするために異なる架橋タンパク質で処置され得る。これは、患者における新たな腫瘍または新たな感染症を処置するために行わることがある。これは、抗原欠損の場合に行われることもある。

提供される実施形態のいずれにおいても、患者は、ＣＡＲ発現性細胞のエフェクター機能を複数の標的に方向付けるために１つより多くの架橋タンパク質で処理され得る。

実施形態の医薬組成物（例えば、ＣＡＲ発現性Ｔ細胞を含む）は、単独で、またはがんの処置に有用な他の十分に確立されている薬剤と組み合わせて、使用され得る。単独で送達されるのか、他の薬剤と組み合わせて送達されるのかを問わず、実施形態の医薬組成物は、特定の効果を達成するために、様々な経路によって、および哺乳動物の、特にヒトの、体内の様々な部位に、送達され得る。１つより多くの経路が投与に使用され得るが、特定の経路が別の経路よりも即時のかつ有効な反応をもたらし得ることは、当業者には分かるであろう。例えば、皮内送達は、黒色腫の処置に使用され得る。局所または全身送達は、体腔への製剤の適用もしくは点滴注入、またはエアロゾルの吸入もしくは吸送を含む投与により、あるいは筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹膜、皮下または皮内投与を含む非経口投与により、遂行され得る。

実施形態の組成物は、各投薬単位、例えば注射剤が、組成物の所定量を単独でまたは他の活性薬剤との適切な組合せで含有する、単位剤形で投与され得る。本明細書で使用される場合の単位剤形という用語は、各々の単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルを必要に応じて伴って、所望の効果を生じさせるのに十分な量に関して計算された実施形態の組成物の所定量を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて含有する、ヒトまたは動物対象のための単位投薬量として好適な物理的に個別の単位を指す。実施形態の単位剤形についての明細は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学特性に依存する。

望ましくは、単離された形質導入Ｔ細胞の有効量または効率的な数が、組成物中に存在し、対象に導入され、その結果、そのような処置の非存在下で別様に得られることになるものに比べて腫瘍サイズを低減させるかまたは腫瘍成長もしくは再成長を消失させるような、長期にわたる特異的な抗腫瘍応答が、確立される。望ましくは、対象に再導入される形質導入Ｔ細胞の量は、形質導入Ｔ細胞が存在しない他の点では同じ条件と比較して、腫瘍サイズの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％減少を生じさせる。本明細書で使用される場合、用語「抗腫瘍有効量」は、対象におけるがん細胞または腫瘍成長を低減させるためのＣＡＲ発現性免疫エフェクター細胞の有効量を指す。

したがって、投与される形質導入免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の量は、投与経路を考慮に入れるべきであり、所望の治療応答を達成するために十分な数の形質導入免疫エフェクター細胞が導入されることになるような量であるべきである。さらに、本明細書に記載される組成物に含まれる各活性薬剤の量（例えば、接触することになる各細胞あたりの量、またはある特定の体重あたりの量）は、様々な応用によって異なり得る。一般に、形質導入Ｔ細胞の濃度は、望ましくは、処置されることになる対象において少なくとも約１×１０^６～約１×１０^９の形質導入Ｔ細胞、よりいっそう望ましくは、約１×１０^７～約５×１０^８の形質導入Ｔ細胞を提供するのに十分な濃度であるべきであるが、任意の好適な量、より多い量、例えば５×１０^８細胞を超える量、またはより少ない量、例えば１×１０^７細胞未満の量のいずれか、を利用してもよい。投薬スケジュールは、十分に確立されている細胞ベースの治療（例えば、Topalian and Rosenberg, 1987；米国特許第４，６９０，９１５号）に基づき得るか、または代替連続注入戦略を利用してもよい。

これらの値は、実施形態の方法の最適化に基づいて実行者により利用される形質導入Ｔ細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供する。そのような範囲についての本明細書における記述は、特定の応用に望まれる可能性があるような、成分のより多いまたはより少ない量の使用を除外するものでは決してない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかによって、または薬力学特性、薬物沈着および代謝の個体間差によって、異なり得る。当業者は、特定の状況の要件に従って任意の必要な調整を容易に行うことができる。
ＩＸ．実施形態のキット

本明細書に記載される組成物のいずれも、キットに含まれていることがある。一部の実施形態では、ＣＡＲ架橋タンパク質および／またはＣＡＲ発現性免疫エフェクター細胞はキットで提供され、このキットは、細胞の拡大に好適な試薬、例えば、培地、ＡＰＣ、操作されたＡＰＣ、増殖因子、抗体（例えば、ＣＡＲ発現性細胞を選別するまたは特徴付けるために）、および／または導入遺伝子をコードするプラスミドも含み得る。

非限定的な例では、キメラ抗原受容体発現構築物、キメラ抗原受容体発現構築物を生成するための１つもしくは複数の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、および／または発現構築物のトランスフェクションのための同種異形細胞を得るための１つもしくは複数の装置（そのような装置は、例えば、注射器、ピペット、鉗子、および／または任意のそのような医学的に承認された器具であり得る）。

一部の実施形態では、内在性ＴＣＲ α／β発現および／もしくはＭＨＣ発現（例えば、ベータ－２ミクログロブリン）を消失させるための発現構築物、構築物を生成するための１つもしくは複数の試薬、ならびに／またはＣＡＲ^＋細胞が、キットに備えられている。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする発現構築物がそこに含まれる。

一部の態様では、キットは、細胞の電気穿孔のための試薬または器具を含む。

キットは、実施形態の１つもしくは複数の適切に小分けされた組成物、または実施形態の組成物を生成するための試薬を含み得る。キットの成分は、水性培地に入れて包装され得るか、凍結乾燥形態で包装され得るか、どちらかである。キットの容器手段は、成分を入れることができる、好ましくは、成分を適切に小分けすることができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器手段を含み得る。キット内に１つより多くの成分が存在する場合、キットは、追加の成分を別々に入れることができる第２の、第３のまたは他の追加の容器も、一般に含むことになる。しかし、成分の様々な組合せが１つのバイアルに含まれていることもある。実施形態のキットはまた、キメラ抗原受容体構築物を収容するための手段、および任意の他の試薬容器を、商業販売のために厳重に密封された状態で通常は含むことになる。そのような容器としては、例えば、所望のバイアルが内部に保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器を挙げることができる。

Ｘ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含めるものである。以下の実施例で開示する技法が、本発明の実施の際によく機能することを本発明者らが見出した技法の代表であること、したがって、その実施の好ましい様式を構成すると考えることができるものであることは、当業者には理解されるはずである。しかし、本開示に鑑みて、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示する特定の実施形態に多くの変更を加え、なお同様のまたは類似の結果を得ることができることは、当業者には理解されるはずである。
（実施例１）
ＣＡＲ－抗原架橋タンパク質の構築

本発明者らは、腫瘍細胞上に発現される抗原にＨＩＶ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞をリダイレクトするためのブリッジタンパク質を開発すること、およびそれによってこれらの標的細胞の死滅を実証することを模索した。この目的のために、目的の標的抗原に結合する抗体などの抗原結合ドメインにｇｐ１２０ｔをコンジュゲートまたは融合させることにより、架橋タンパク質を作出した。
Ａ．方法論

構築物設計および分子クローニング。抗ＨＩＶ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＨＩＶエンベロープ（ｅｎｖ、ｇｐ１２０）タンパク質を認識する短縮型ＣＤ４（ＣＤ４ｔ）細胞外ドメイン（ＣＡＲ４）の使用に基づいて、以前に開発した。４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１～Ｄ４）を含有する完全長ＣＤ４糖タンパク質とは異なり、ＣＤ４ｔは、Ｄ１およびＤ２ドメインからなる短縮型ＣＤ４タンパク質を使用する。したがって、ＣＡＲ改変細胞は、感染細胞上のＨＩＶ ｅｎｖに結合することになる。本質的なＣＡＲ４設計を図５に提示する。

レンチウイルスベクター産生。ＣＡＲを担持しているプラスミド、ならびにレンチウイルスパッケージングプラスミドＰＡＸ２およびＶＳＶｇを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより、レンチウイルスベクターを産生した。細胞培養培地を４～６時間の時点で補給し、その後、１２－２４－４８時間の時点でウイルス粒子収集のために回収した。培養培地を収集し、濾過して細胞デブリを除去し、超遠心分離（１９，５００ｒｐｍ、２時間）を使用してウイルス粒子を富化した。濃縮されたレンチウイルスベクターの最終アリコートを－８０℃で保管した。様々な希釈度でＨＴ１０８０細胞に形質導入し、ＲＱＲ８を発現する細胞のパーセンテージを測定することにより、機能性ウイルスベクター力価を評定した。

細胞および細胞系。初代Ｔ細胞を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＧｅｎｅｖａのＢｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅから入手した匿名化されたバフィーコート血液ユニットから調製した。フィコールを使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ４／ＣＤ８マイクロビーズを使用してＴ細胞を分離し、小分けして液体窒素中で凍結保存した。これらの原理証明研究では、ＣＤ１１７を発現するように形質導入したＨＬ－６０細胞を標的細胞として使用した。

ＣＡＲ Ｔ細胞の製造。凍結保存Ｔ細胞を融解し、ＴｅｘＭＡＣＳ培地で一晩培養し、翌日、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（比率１：１）またはＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）のどちらかを使用して活性化し、ＣＡＲ構築物を用いて３～７の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス形質導入を行った。形質導入を高密度体積（ｃｍ^２あたりｍｌあたり２，０００，０００細胞）で行い、Ｔ細胞の細胞密度をｍＬあたり１，０００，０００で維持するために、１８～２４時間後に、そしてその後は１日置きに培地を補給した。

フローサイトメトリーをＴ細胞の形質導入の５～７日後に行った。細胞を回収し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ／Ｍｇ^２＋不含ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）に再浮遊させ、レポーター遺伝子（ＲＱＲ８）発現細胞の頻度を評定するために２０～３０分間、ＣＤ３４抗体（ＱＢＥｎｄ１０）で染色した。染色後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させ、細胞表面発現をフローサイトメトリーによって評定した。

ブリッジタンパク質の設計および産生。ブリッジタンパク質構築物を、ＩｇＧおよびダイアボディ抗体フォーマットへの短縮型糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０ｔ）の化学的コンジュゲーションに基づいて設計した。１１アミノ酸の短縮型ｇｐ１２０断片を、マレイミドループを用いて化学合成した（ＳＳＧＧＤＰＥＩＶＴＨ；配列番号６）。コンジュゲーションを可能にするために、システイン残基を伴うＩｇＧおよびダイアボディタンパク質を産生した。化学的コンジュゲーションを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元、およびｇｐ１２０ｔ－マレイミドの付加で開始させた（図６）。

細胞傷害性アッセイ。ＣＡＲ４ Ｔ細胞を、標的細胞と１８～２４時間、１：１のエフェクター対標的比で共培養した。コンジュゲート抗体も５００ｎＭの最終濃度で添加した。ＨＬ－６０細胞上の腫瘍関連抗原（この場合はＣＤ１１７）に結合するＣＡＲ４ Ｔ細胞の能力を、共培養物中に残存する生存標的細胞のパーセンテージの比例的低下を測定することにより評定した。
Ｂ．結果

ブリッジタンパク質はＣＤ４に結合し、腫瘍細胞を死滅させるようにリダイレクトされる。本発明者らは、先ず、ｇｐ１２０ｔのＩｇＧへのコンジュゲーションの成功およびＴ細胞上に発現されたＣＤ４タンパク質への結合を実証しようと試みた（図７Ａ）。このことを試験するために、初代Ｔ細胞を様々な濃度のＩｇＧコンジュゲートに３０分間曝露し、続いて、２回洗浄して未結合ＩｇＧを除去し、ＣＤ４に結合したＩｇＧタンパク質の検出のためにＦＩＴＣ標識プロテインＡで染色した。ＩｇＧコンジュゲートタンパク質は、初代Ｔ細胞上の天然ＣＤ４に結合することができ、重要なこととして、ＣＤ４陽性細胞の同等のパーセンテージを、抗ＣＤ４抗体の使用と比較して繰り返すことができた（それぞれ、５８．５％および５６．９％）。

次に、類似の実験を、ＩｇＧコンジュゲートのＣＡＲ４受容体への結合を確認するために行った（図７Ｂ）。このために、ＨＴ１０８０細胞に、ＣＡＲ４構築物を有するレンチウイルスベクターで形質導入し、それらの細胞を、様々な濃度のＩｇＧまたはＩｇＧコンジュゲートタンパク質のどちらかに曝露した。図７Ｂにおけるフローサイトメトリーのヒストグラムで明らかなように、ＩｇＧとコンジュゲートしたブリッジタンパク質を使用したときにＦＩＴＣ標識プロテインＡの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の明らかな比例的増加があったが、単独でのＩｇＧを使用したときにはそれが観察されなかった。

最後に、本発明者らは、ブリッジタンパク質が、腫瘍細胞を標的として死滅させるようにＣＡＲ４ Ｔ細胞をリダイレクトすることができることを実証することを模索した（図７Ｃおよび７Ｄ）。この実験では、ＣＤ１１７発現性ＨＬ－６０腫瘍細胞をＣＡＲ４ Ｔ細胞（比率１：１）および様々な立体配置のブリッジタンパク質（５００ｎＭ）と共培養した。本発明者らは、抗ＣＤ１１７ダイアボディも作出し、それをこの評定ではｇｐ１２０ｔとコンジュゲートした。２４共培養後、ＩｇＧコンジュゲート型（６５％）およびダイアボディコンジュゲート型（９０％）ブリッジタンパク質を使用したときに、対照（ＣＡＲ４ Ｔ細胞のみ、ブリッジタンパク質なし）に正規化して、標的細胞の細胞傷害性の有意な増加が観察された。これにより、ブリッジタンパク質が、ＣＡＲ４ Ｔ細胞に有効に結合することができること、およびそれらを腫瘍細胞に、それらが特異的な細胞傷害性を惹起するように、リダイレクトすることができることが確証された。
Ｃ．要約および結論

これは、目的の抗原を発現する腫瘍細胞にＨＩＶ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を架橋できる抗体コンジュゲートが、ＨＩＶ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性をリダイレクトするのに役立つことを確証する。会合すると、ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞を有効に死滅させること、ダイアボディｇｐ１２０ｔコンジュゲートを使用するとそれがより顕著であることを明示した。さらなる実験は、Ｂ細胞悪性腫瘍についてのＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２をはじめとする他の適切な腫瘍関連抗原、ならびに固形腫瘍上に発現される抗原に、ＣＡＲ４ Ｔ細胞をリダイレクトすることを含む。
＊ ＊ ＊

本願において開示し、特許請求の範囲に記載する方法の全ては、本開示に鑑みて過度の実験なしに行うことおよび実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明したが、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、本願に記載の方法におよび方法のステップもしくは一連のステップに変化を加えることができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連している特定の薬剤を本明細書に記載の薬剤の代わりに用いることができ、さらに同じまたは同様の結果が達成されることになることは、明らかであろう。当業者には明らかなそのような同様の代用品および変更形態の全てが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書に示されるものを補足する例示的手順または他の詳細を提供する範囲内で、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
米国特許出願公開第２００２／０１６８７０７号
米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号
米国特許出願公開第２００３／００５５０２０号
米国特許出願公開第２００３／０１５９１６１号
米国特許出願公開第２００４／００６４８４２号
米国特許出願公開第２００４／０２６５８３９号
米国特許出願公開第２００９／０００４１４２号
米国特許出願公開第２００９／００１７０００号
米国特許第４，６９０，９１５号
米国特許第５，３０２，５２３号
米国特許第５，３２２，７８３号
米国特許第５，３８４，２５３号
米国特許第５，４６４，７６５号
米国特許第５，４８６，３５９号
米国特許第５，５３８，８７７号
米国特許第５，５３８，８８０号
米国特許第５，５５０，３１８号
米国特許第５，５６３，０５５号
米国特許第５，５８０，８５９号
米国特許第５，５８９，４６６号
米国特許第５，５９１，６１６号
米国特許第５，６１０，０４２号
米国特許第５，６５６，６１０号
米国特許第５，７０２，９３２号
米国特許第５，７３６，５２４号
米国特許第５，７８０，４４８号
米国特許第５，７８９，２１５号
米国特許第５，９０８，７８２号
米国特許第５，９４５，１００号
米国特許第５，９８１，２７４号
米国特許第５，９９４，１３６号
米国特許第５，９９４，６２４号
米国特許第６，０１３，５１６号
米国特許第６，２２５，０４２号
米国特許第６，３５５，４７９号
米国特許第６，３６２，００１号
米国特許第６，４１０，３１９号
米国特許第６，５０６，５５９号
米国特許第６，５７３，０９９号
米国特許第６，７９０，６６２号
ＥＰ１５０７８６５
ＷＯ９４／０９６９９
ＷＯ９５／０６１２８
ＷＯ９６／３９４８７
ＷＯ２００５／０２８６３０
ＷＯ２００７／１０３００９
ＷＯ２０１０／０７９４３０
ＷＯ２０１４／１９０２７３
ＷＯ２０１５／１２３６４２
ＷＯ２０１９／１８６２７４

Claims (91)

1. （１）抗原結合ドメインおよび（２）ＣＡＲ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質であって、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質の少なくとも一部分を含むＣＡＲ架橋タンパク質。
2. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記抗原結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている、請求項１に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
3. 前記抗原結合ドメインが、前記ＣＡＲ結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている、請求項１に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
4. 前記抗原結合ドメインおよび前記ＣＡＲ結合ドメインが、融合タンパク質に含まれている、請求項１に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
5. 抗体Ｆｃドメインをさらに含む、請求項４に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
6. 前記Ｆｃドメインが、前記ＣＡＲ結合ドメインと前記抗原結合ドメインの間に位置する、請求項５に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
7. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記抗原結合ドメインと前記Ｆｃドメインの間に位置する、請求項５に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
8. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメイン配列を含む、請求項５に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
9. 前記Ｆｃドメインが、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
10. 前記Ｆｃドメインが、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、請求項８に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
11. 前記Ｆｃドメインが、野生型ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列と比べて、ＦｃｇＲ受容体への結合を妨げる置換を含む、請求項８に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
12. 前記Ｆｃドメインが、配列番号４により提供される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
13. 前記抗原結合ドメインと前記ＣＡＲ結合ドメインの間にリンカー配列をさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
14. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、配列番号６で提供される配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
15. 前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
16. 前記抗原結合ドメインが、目的の抗原と相互作用するペプチドを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
17. 前記抗原結合ドメインが、目的の前記抗原を認識する抗体の抗原結合部分を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
18. 前記抗原結合ドメインが、目的の前記抗原と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
19. 前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合できる、請求項１から１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
20. 前記抗原結合ドメインが、コロナウイルススパイクタンパク質に結合できる、請求項１から１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
21. 前記コロナウイルススパイクタンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項２０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
22. 前記抗原結合ドメインが、ＡＣＥ２細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
23. ＡＣＥ２細胞外ドメインの前記一部分が、ＡＣＥ２ｔドメインである、請求項２２に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
24. 前記ＡＣＥ２ｔドメインが、配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む、請求項２３に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
25. 前記ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
26. 前記ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの各々の間にリンカー配列を含む、請求項２５に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
27. 前記リンカー配列が、ＧＧＧＳの配列を含む、請求項２５または２６に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
28. 前記リンカー配列が、配列番号６により提供される配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
29. ホモ二量体を形成する、請求項１から２８のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
30. ＣＡＲ結合ドメインおよび抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）架橋タンパク質。
31. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記抗原結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている、請求項３０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
32. 前記抗原結合ドメインが、前記ＣＡＲ結合ドメインに化学的にコンジュゲートされている、請求項３０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
33. 前記抗原結合ドメインおよび前記ＣＡＲ結合ドメインが、融合タンパク質に含まれている、請求項１に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
34. 抗体Ｆｃドメインをさらに含む、請求項３０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
35. 前記Ｆｃドメインが、前記ＣＡＲ結合ドメインと前記抗原結合ドメインの間に位置する、請求項３４に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
36. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記抗原結合ドメインと前記Ｆｃドメインの間に位置する、請求項３４に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
37. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ＣＡＲの細胞外部分と相互作用するペプチドを含む、請求項３０から３６のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
38. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ＣＡＲの前記細胞外部分を認識する抗体の抗原結合部分を含む、請求項３０から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
39. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ＣＡＲの前記細胞外部分と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む、請求項３０から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
40. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記ＣＡＲの標的に特異的である前記ＣＡＲの一部分に結合する、請求項３０から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
41. 前記ＣＡＲが、ｓｃＦｖを含み、前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記ｓｃＦｖの可変領域に結合する、請求項４０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
42. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３０から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
43. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項４２に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
44. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質の少なくとも一部分を含む、請求項３０から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
45. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、配列番号６で提供される配列を含む、請求項４４に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
46. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９特異的ＣＡＲであり、前記ＣＡＲ結合ドメインが、前記ＣＤ１９特異的ＣＡＲに結合する、請求項３０から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
47. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項４６に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
48. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項４７に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
49. 前記ＣＡＲ結合ドメインが、ＣＤ１９タンパク質の少なくとも一部分を含む、請求項４６に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
50. 前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメイン配列を含む、請求項３４から４９のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
51. 前記Ｆｃドメインが、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列を含む、請求項３４から５０のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
52. 前記Ｆｃドメインが、ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、請求項３４から５１のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
53. 前記Ｆｃドメインが、野生型ヒト重鎖Ｆｃドメイン配列と比べて、ＦｃｇＲ受容体への結合を妨げる置換を含む、請求項３４から５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
54. 前記Ｆｃドメインが、配列番号４により提供される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む、請求項３４から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
55. 前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合する、請求項３０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
56. 前記抗原結合ドメインが、目的の前記抗原と相互作用するペプチドを含む、請求項３０から５５のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
57. 前記抗原結合ドメインが、目的の前記抗原を認識する抗体の抗原結合部分を含む、請求項３０から５６のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
58. 前記抗原結合ドメインが、目的の抗原と相互作用するリガンドの少なくとも一部分を含む、請求項３０から５７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
59. 前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合する、請求項３０から５８のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
60. 前記抗原結合ドメインが、コロナウイルススパイクタンパク質に結合できる、請求項３０から５８のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
61. 前記コロナウイルススパイクタンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項６０に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
62. 前記抗原結合ドメインが、ＡＣＥ２細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、請求項３０から６１のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
63. ＡＣＥ２細胞外ドメインの前記一部分が、ＡＣＥ２ｔドメインである、請求項６２に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
64. 前記ＡＣＥ２ｔドメインが、配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である配列を含む、請求項６３に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
65. 前記ＣＡＲ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、および／または抗原結合ドメインの間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む、請求項３４から６４のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
66. 前記ＣＡＲ結合ドメインと、前記抗原結合ドメインと、必要に応じて前記Ｆｃドメインとの間にリンカー配列を含む、請求項３４から６５のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
67. 前記リンカー配列が、ＧＧＧＳの配列を含む、請求項６５または６６に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
68. 前記リンカー配列が、配列番号６により提供される配列を含む、請求項６５から６７のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
69. ホモ二量体を形成する、請求項３０から６８のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質。
70. 請求項１から６９のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質をコードする核酸分子。
71. 前記ＣＡＲ架橋タンパク質をコードする配列が、発現制御配列に動作可能に連結されている、請求項７０に記載の核酸分子。
72. 発現ベクターとしてさらに定義される、請求項７０に記載の核酸分子。
73. 前記発現ベクターが、エピソームベクターである、請求項７２に記載の核酸分子。
74. 前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７２に記載の核酸分子。
75. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである、請求項７４に記載の核酸分子。
76. 薬学的に許容される担体中に請求項１から６９のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質を含む医薬組成物。
77. 前記ＣＡＲ架橋タンパク質の前記ＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団をさらに含む、請求項７６に記載の医薬組成物。
78. 処置することを必要とする対象を処置する方法であって、請求項１から６９のいずれか一項に記載のＣＡＲ架橋タンパク質の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
79. 前記対象が、前記ＣＡＲ架橋タンパク質の前記ＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団を以前に投与されたことがある、請求項７８に記載の方法。
80. 前記ＣＡＲ架橋タンパク質の前記ＣＡＲ結合ドメインが結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞の集団の有効量を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
81. 前記細胞が、前記対象にとって同種異系である、請求項８０に記載の方法。
82. 前記細胞が、前記対象にとって自家である、請求項８０に記載の方法。
83. 前記細胞が、前記対象とＨＬＡが適合している、請求項８０に記載の方法。
84. 前記対象が、コロナウイルスに感染している、請求項７８から８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 前記対象が、ＳＡＲ－ＣｏＶに感染している、請求項７８から８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 前記対象が、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２に感染している、請求項７８から８４のいずれか一項に記載の方法。
87. 前記対象が、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患している、請求項７８から８４のいずれか一項に記載の方法。
88. 前記ＣＡＲ架橋タンパク質が、（ｉ）配列番号２の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）配列番号６で提供される配列である／を含むＣＡＲ結合ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドが、その抗原結合ドメインとしてＣＤ４ドメインを含む、請求項８６または８７に記載の方法。
89. 前記対象が、がんを有する、請求項７８から８３のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記ＣＡＲ架橋タンパク質が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２に結合できる抗原結合ドメインを含む、請求項８９に記載の方法。
91. 前記ＣＡＲ架橋タンパク質の前記ＣＡＲ結合ドメインが、ＣＤ１９タンパク質の少なくとも一部分を含む、請求項７８に記載の方法。