KR20230025804A - Car t 세포를 관심 항원에 대해 재지시하기 위한 어댑터 분자 - Google Patents

Car t 세포를 관심 항원에 대해 재지시하기 위한 어댑터 분자 Download PDF

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KR20230025804A
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car
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antigen
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domain
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마르코 알레산드리니
카를-하인츠 크라우제
레니어 뮈부르크흐
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안티온 바이오사이언시즈 에스에이
제네바 유니버시티 호스피탈스
유니버시티 오브 제네바
유니버시티 오브 취리히
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Abstract

CAR-T 세포의 표적화를 재지시하기 위해 사용될 수 있는, 항원-결합 도메인에 결합된 CAR-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질이 제공된다. 가교 단백질은 예를 들어 종양 항원 또는 바이러스 항원과 같은 임의의 관심 항원을 표적화하는 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어 암 또는 감염성 질환과 같은 질환을 치료하기 위해 CAR-T 세포와 조합하여 가교 단백질을 사용하는 방법 또한 제공된다.

Description

CAR T 세포를 관심 항원에 대해 재지시하기 위한 어댑터 분자
관련 출원에 대한 참고
본 출원은 2020년 5월 27일에 출원한 미국 가출원 번호 63/030,653을 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 대한 참고
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2021년 5월 26일에 생성된 상기 ASCII 사본은 ANBOP0005WO_ST25.txt의 명칭을 갖고, 16.4 킬로바이트의 크기를 갖는다.
배경
1. 기술분야
본 개시내용은 전반적으로 면역학, 바이러스학 및 의약 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 이는 CAR-발현 면역 이펙터 세포를 임의의 관심 항원에 대해 재지시하는 가교 단백질, 및 그를 사용하여 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술에 대한 설명
최근에 조작된 면역 이펙터 세포는 바이러스 질환 및 암을 치료하기 위한 매력적인 치료법이 되기 시작했다. 예를 들어, T 세포는 임의의 특정한 관심 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작될 수 있다. 이러한 세포는 암 마커를 발현하거나 또는 임의의 병원체로 감염된 세포의 표적화된 사멸을 가능하게 한다. 이들 새로운 요법의 유망함에도 불구하고, 치료된 대상체에서 표적을 벗어난 독성 및 조작된 세포의 지속성 부족의 문제가 있다. 예를 들어, 종양 이질성 및 표적 항원 발현 상실은 효과적인 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법을 개발하는데 있어서 중요한 문제이다. 종양-특이적 항원 (즉, 종양 세포에서만 발현되는 것들)이 거의 존재하지 않지만, 대부분은 종양-연관 항원이다 (즉, 종양 세포에서 과발현되지만, 건강한 세포에서는 더 적은 정도로 발현됨). 종양은 또한 CAR-표적화된 항원의 발현을 상실하는 경향이 있으며, 따라서 여러 그룹은 더욱 다양한 종양 세포를 포획하기 위해 이중-특이적 및 삼중-특이적 CAR T 세포를 개발하고 있다. 이는 B-세포 악성족양의 맥락에서 잘 설명되며, CD19, CD20 및 CD22에 대해 다중-특이적 CAR T 세포가 임상 개발 중에 있다. 고형 종양 및 고형 종양 미세환경은 상당히 더 많은 종양 이질성으로 극복해야 할 훨씬 더 큰 도전이다. 따라서, 표적화 면역 이펙터 세포의 새로우며 더욱 진보된 방법이 더욱 요구되고 있다.
단일-특이적 CAR-T 세포를 대안적인 또는 다중 표적 항원에 대해 재지시하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질이 본원에 제공된다. 예를 들어, 한편으로 CAR과 연결되고, 다른 한편으로 선택된 표적 항원과 연결된 융합 단백질 및 항체-접합체가 제공된다. 따라서, 다중-특이적 CAR을 생성하는 것과는 대조적으로, 본원에 제공된 가교 단백질은 다중-특이적 가교 단백질을 통해 단일-변이체 CAR-T 세포를 다양한 항원에 대해 재지시한다. 단일 또는 다중 가교 단백질은 동시 다중-표적화 접근법을 위한 모이어티로서 순차적으로 또는 함께 주입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 항원-결합 도메인 및 (2) HIV-1 gp120 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 CAR-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 항원-결합 도메인에 화학적으로 접합된다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 항체 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 항원-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 항원 결합 도메인과 CAR-결합 도메인 사이에 링커 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 6에 제공된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인 서열을 포함한다. 다른 측면에서, Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열을 포함한다. 추가의 다른 측면에서, Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 추가의 다른 측면에서, Fc 도메인은 야생형 인간 중쇄 Fc 도메인 서열에 비해 FcgR 수용체에 대한 결합을 방지하는 치환을 포함한다. 다른 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에 의해 제공된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원과 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 항원-결합 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합할 수 있다. 추가의 측면에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 ACE2 세포외 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 추가의 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 일부분은 ACE2t 도메인이다. 더욱 추가의 측면에서, ACE2t 도메인은 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 적어도 1개의 링커 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 각각의 CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 링커 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 링커 서열은 GGGS의 서열 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 일부 측면에서, 링커 서열은 서열식별번호: 8에 의해 제공된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 동종이량체를 형성한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 CAR-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 항원-결합 도메인에 화학적으로 접합된다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 항체 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치한다. 다른 측면에서, CAR-결합 도메인은 항원-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 세포외 부분과 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 세포외 부분을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 세포외 부분과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 HIV-1 gp120 단백질의 적어도 일부분을 포함한다. 추가의 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함한다. 특정 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 서열로 본질적으로 이루어진다. 특정 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 서열로 이루어진다.
일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 야생형 인간 중쇄 Fc 도메인 서열에 비해 FcgR 수용체에 대한 결합을 방지하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에 의해 제공된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원과 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합할 수 있다. 추가의 측면에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다.
일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 ACE2 세포외 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 일부분은 ACE2t 도메인이다. 추가의 측면에서, ACE2t 도메인은 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 적어도 1개의 링커 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인, 및 임의적으로, Fc 도메인 사이에 링커 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 링커 서열은 GGGS의 서열 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 일부 측면에서, 링커 서열은 서열식별번호: 8에 의해 제공된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 동종이량체를 형성한다.
추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 CAR 가교 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질을 코딩하는 서열은 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 발현 벡터로서 추가로 정의된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 에피솜 벡터이다. 다른 측면에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 추가의 측면에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다.
추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 제약상 허용가능한 담체 중에 본 개시내용의 CAR 가교 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단을 추가로 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 CAR 가교 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 대상체는 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단을 이전에 투여받은 적이 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에게 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 측면에서, 세포는 대상체에 대해 자가 유래이다. 일부 측면에서, 세포는 대상체에 대해 HLA 매칭되는 것이다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스 감염을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 SAR-CoV 감염을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 SAR-CoV-2 감염을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 COVID-19를 갖는다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 (i) 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 항원-결합 도메인; 및 (ii) 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함하는 CAR-결합 도메인을 포함하며, CAR 폴리펩티드는 그의 항원-결합 도메인으로서 CD4 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 CAR-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 CAR-결합 도메인에 화학적으로 접합된다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인 및 CAR-결합 도메인은 융합 단백질에 포함된다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 항체 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치한다. 다른 측면에서, CAR-결합 도메인은 항원-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 세포외 부분과 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 세포외 부분을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 세포외 부분과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CAR의 표적에 대해 특이적인 CAR의 일부분에 결합한다. 일부 측면에서, CAR은 scFv를 포함하고, CAR-결합 도메인은 scFv의 가변 영역에 결합한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 scFv를 포함한다.
일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 HIV-1 gp120 단백질의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 CD19 특이적 CAR이고, CAR 결합 도메인은 CD19-특이적 CAR에 결합한다. 일부 측면에서, CAR 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, CAR-결합 도메인은 CD19 단백질의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열의 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 야생형 인간 중쇄 Fc 도메인 서열에 비해 FcgR 수용체에 대한 결합을 방지하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에 의해 제공된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합한다.
일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원과 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 관심 항원과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합한다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합할 수 있다. 일부 측면에서, 코로나바이러스 스파이크 단백질은 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이다. 일부 측면에서, 항원-결합 도메인은 ACE2 세포외 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 일부분은 ACE2t 도메인이다. 일부 측면에서, ACE2t 도메인은 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 적어도 1개의 링커 서열을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인, 및 임의적으로, Fc 도메인 사이에 링커 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 링커 서열은 GGGS의 서열 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 일부 측면에서, 링커 서열은 서열식별번호: 8에 의해 제공된 서열을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 동종이량체를 형성한다.
추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 CAR 가교 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질을 코딩하는 서열은 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결된다. 다른 측면에서, CAR 가교 단백질은 발현 벡터로서 추가로 정의된다. 일부 측면에서, 발현 벡터는 에피솜 벡터이다. 다른 측면에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 측면에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 제약상 허용가능한 담체 중에 본 개시내용의 CAR 가교 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단을 추가로 포함한다.
추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 CAR 가교 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 대상체는 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단을 이전에 투여받은 적이 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에게 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 측면에서, 세포는 대상체에 대해 자가 유래이다. 일부 측면에서, 세포는 대상체에 대해 HLA 매칭되는 것이다. 일부 측면에서, 대상체는 코로나바이러스 감염을 갖는다. 일부 측면에서, 대상체는 SAR-CoV 감염을 갖는다. 다른 측면에서, 대상체는 SAR-CoV-2 감염을 갖는다. 추가의 다른 측면에서, 대상체는 COVID-19를 갖는다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 (i) 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 항원-결합 도메인; 및 (ii) 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함하는 CAR-결합 도메인을 포함하며, CAR 폴리펩티드는 그의 항원-결합 도메인으로서 CD4 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 서열로 본질적으로 이루어진다. 특정 측면에서, CAR-결합 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 서열로 이루어진다. 일부 측면에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질은 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인은 CD19 단백질의 적어도 일부분을 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특색 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시양태는 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 단시 예시적으로 제공되는 것임을 이해해야 하며, 이는 본 발명의 취지 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 본원의 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 기술자에게 명백할 것이기 때문이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적인 실시양태의 상세한 설명과 조합되어 이들 도면 중 하나 이상을 참고하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-1e. CAR T 세포를 재지시하는 가교 단백질의 도식적 대표도. 도 1a는 가교 단백질을 사용하여 CD4 CAR T 세포를 표적 세포에 대해 재지시하는 일반적인 개념을 예시한다. 도 1b는 직접적으로 작용하는 및 가교 단백질을 작용하는 CD4 CAR T 세포 둘 다의 특이성을 예시한다. 도 1c는 CD4 CAR T 세포를 CoV 감염된 세포에 대해 재지시하는 가교 단백질을 예시한다. 도 1d는 종양의 동시 또는 순차적 표적화를 예시하며, 이는 다양한 악성 세포를 표적화하기 위해 사용되거나, 또는 표적화된 요법을 회피하기 위해 종양 세포에 의해 이용되는 항원 손실을 극복하기 위해 사용될 수 있다. 도 1e는 가교 단백질을 사용하여 CD19-특이적 CAR T 세포를 표적 세포에 대해 재지시하는 일반적인 개념을 설명한다.
도 2a-2c. 예시적인 가교 단백질의 도식적 대표도. 도 2a는 항원-결합 도메인, Fc 영역, 및 CAR-결합 도메인을 갖는 이량체성 가교 단백질을 예시한다. 도 2b는 CAR-결합 도메인 (gp120t로 표시됨)을 IgG 항체에 접합시키는 방법을 예시한다. 도 2c는 CAR-결합 도메인 (gp120t로 표시됨), 및 Fc 영역, 및 항원-결합 도메인을 갖는 가교 단백질의 다양한 실시양태를 예시한다.
도 3. CD4-특이적 CAR T 세포의 도식적 대표도.
도 4a-4c. 예시적인 가교 단백질의 추가의 도식적 대표도. 도 4a는 CD19-특이적 CAR 세포를 재표적화하기 위한 대표적인 방법을 도시한다. 도 4b는 항원-결합 도메인, Fc 영역, 및 CD-19 CAR-결합 도메인, 예컨대 CD19, 말단절단된 CD19 (CAR에 결합함), 또는 CD19 CAR에 대해 특이적인 항체 도메인을 갖는 이량체성 가교 단백질을 예시한다. 도 4c는 CAR-결합 도메인 (CD19t로 표시됨)을 IgG 항체에 접합시키는 방법을 예시한다.
도 5. HIV env를 표적화하는 CAR-T 세포를 생산하기 위해 사용되는 CAR 구축물의 모든 요소를 도시하는 항-HIV CAR 구축물.
도 6. IgG 항체에 대한 gp120의 CD4 결합 루프의 화학적 접합. gp120 CD4 결합 루프의 서열 (SSGGDPEIVTH)은 서열식별번호: 6으로 제공된다.
도 7a-7d. 가교 단백질 개념의 개발 및 시험. 도 7a는 gp120의 CD4 결합 루프 (gp120t)와 접합된 IgG, 뿐만 아니라 일차 T-세포 상의 CD4 수용체에 대한 가교 단백질의 결합을 입증하는 FACS 등고선 플롯을 예시한다. 도 7b는 CAR4-결합된 가교 단백질의 FACS 히스토그램 및 중간 형광 강도 (MFI)를 제공한다. 도 7c는 CAR4 T 세포가 IgG 및 디아바디 접합된 항체 둘 다를 통해 종양 세포에 대해 재지시되는 것인 실험의 도식적 설명을 제공한다. 도 7d는 CAR4 T 세포 단독, CAR4 T 세포와 IgG, Car4 T 세포와 IgG-gp120t 접합체, 및 CAR4 T 세포와 디아바디-gp120t 접합체와 24-시간 공동-배양한 후에 생존가능한 종양 세포의 백분율을 예시한다.
CAR-T 세포, 예를 들어 HIV-감염된 세포를 인식하고 사멸시키도록 설계된 치료적 CD4-특이적 CAR-T 세포를 재지시하기 위해 사용될 수 있는 가교 단백질이 본원에 제공된다. 해당 예에서, 가교 단백질은 관심 표적 항원에 결합하는 단백질 도메인에 융합된 말단절단된 gp120 세포외 도메인을 포함할 수 있다 (도 1a 및 1b). 예를 들어, 단백질 도메인은 ACE2 세포외 도메인 (인간 세포를 감염시키기 위해 CoV에 의해 사용되는 천연 수용체)일 수 있다. CoV가 세포를 감염시키는 경우, 바이러스 스파이크 단백질이 세포의 표면 상에서 발현된다. 따라서, gp120-ACE2 가교 단백질의 존재 하에, CD4-특이적 CAR-T 세포는 CoV-감염된 세포의 표면 상에 존재하는 바이러스 스파이크 단백질에 결합할 것이다 (도 1c).
가교 단백질은 관심 표적 항원에 결합하는 단백질 도메인에 융합되거나 또는 접합된 말단절단된 gp120 펩티드를 포함할 수 있다. 한 예에서, 가교 단백질은 말단절단된 gp120 펩티드, 인간 Fc 영역, 관심 표적 항원에 결합하는 단백질 도메인, 및 1개 이상의 링커 서열을 포함할 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 가교 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로 ACE2의 ACE2t 부분 (CoV 결합을 위해 필요한 3개의 모든 도메인을 함유하는 ACE2 세포외 도메인의 일부임), 인간 Fc 도메인, 및 말단절단된 gp120 펩티드를 포함할 수 있고, 각각의 도메인은 링커에 의해 분리된다 (도 2a). 또 다른 예시적인 실시양태에서, 가교 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로 ACE2의 ACE2t 부분 (CoV 결합을 위해 필요한 3개의 모든 도메인을 함유하는 ACE2 세포외 도메인의 일부임), 말단절단된 gp120 펩티드, 및 인간 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 각각의 도메인은 링커에 의해 분리된다 (도 2a). 가교 단백질은 Fc 도메인과의 상호작용으로 인해 동종이량체로서 존재할 것이다.
가교 단백질은 관심 항원, 예를 들어 CoV 스파이크 단백질을 발현하는 세포를 인식하고 사멸시키도록 CD4-CAR T 세포를 재지시할 것이다 (도 1c). CD4-CAR T 세포는 동종-반응성을 방지하기 위해 침묵된 그들의 내인성 TCR 및/또는 MHC 유전자를 가질 수 있다 (도 3). CD4-CAR T 세포는 T 세포가 더 오래 지속되는 치료 효과를 계속해서 제공하도록 침묵된 하나 이상의 억제성 수용체 (예를 들어, PD1 및/또는 TIM3)를 추가로 가질 수 있다 (도 3). 이들 T 세포는 건강한 공여자 세포로부터 제조될 수 있고, 이는 (a) 환자에게 신속하게 제공될 수 있고, (b) 기저 질환 (CoV-감염된 환자로부터의 T 세포가 심각하게 소진됨)에 의해 손상되지 않으며, (c) 비용-효율적인 (단일 공여자 단위로부터 제조된 >100회 용량) "규격" 해결책이 된다 (도 3).
추가의 측면에서, 실시양태의 가교 단백질은 다른 유형의 CAR-발현 이펙터 세포, 예컨대 CD19 CAR T-세포를 재표적화하기 위해 사용될 수 있다. CD19 항원 손실은 종종 항-CD19 CAR T-세포 요법을 제공받는 환자에서 직면하게 되어, 질환 재발을 유발한다. 가교 단백질의 동시 또는 순차적 투여는 항-CD19 CAR T 세포를 악성 세포 상의 다른 항원에 대해 재지시하는 방법을 가능하게 한다. 따라서, 이러한 방법은 다른 불응성 질환의 치료를 가능하게 한다.
I. 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 특정 성분 중 어떠한 것도 고의적으로 조성물로 제형화되지 않았고/거나 단지 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도되지 않은 오염으로 인한 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만일 것이다. 특정 성분의 양이 표준 분석 방법에 의해 검출될 수 없는 것인 조성물이 가장 바람직하다.
명세서에서 사용된 바와 같이, 단수는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 단수 단어는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
청구항에서 용어 "또는"의 사용은 명시적으로 대안만을 지칭하는 것으로 나타내지 않거나 또는 대안이 상호 배타적이지 않다면 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본 개시내용은 대안만을 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두번째 이상을 의미할 수 있다.
본원에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 기기에 대한 고유의 오차 변동, 값을 결정하기 위해 이용된 방법에서의 고유의 변동, 연구 대상체 사이에 존재하는 변동, 또는 명시된 값의 10% 내의 값을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 "핵산", "핵산 서열", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 또는 다른 문법적 등가물은 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 20, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000개 등을 비롯한 임의의 길이의 중합체이다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하지만, 일부 경우에, 적어도 1가지 상이한 연결, 예를 들어 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결, 및 펩티드 핵산 백본 및 연결을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 천연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있으며; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 및 천연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, cRNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상기 용어에는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자 둘 다 포함된다. 달리 명시되거나 또는 요구되지 않는다면, 용어 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 또는 예측되는 각각의 2가지 상보성 단일-가닥 형태 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 4가지 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민 대신에 우라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표현이다. 달리 나타내지 않는다면, 특정한 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보성 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 것인 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체, 변형된 잔기를 함유하는 것들, 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 본 발명의 경우에, 용어 "폴리펩티드"는 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세이프 하버" 프로파일은 트랜스진 발현이 지속되고 (즉, 침묵되지 않고) 내인성 유전자 발현이 방해되지 않는 부위에서 조작된 세포의 게놈에 외래 유전 물질을 삽입하는 것을 지칭한다. 예를 들어, "유전적으로 세이프 하버 프로파일"은 내인성 유전자의 코딩 및 발현 제어 영역 외부에 위치하는 트랜스제닉 사건을 지칭할 수 있다. 일부 측면에서, 조작된 세포가 세이프 하버 프로파일을 갖는지 여부를 확인하는 것은 전체 게놈 시퀀싱 또는 통합 부위 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
II. 가교 단백질
가교 단백질은 CAR-결합 도메인, 및 관심 표적 항원에 결합하는 단백질 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CAR-결합 도메인, 및 관심 표적 항원에 결합하는 단백질 도메인은 두 도메인의 화학적 융합일 수 있다. 배열은 다량체성, 예컨대 디아바디 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변 부분을 디아바디에 교차 쌍 형성함으로써 형성될 가능성이 가장 높다.
일부 실시양태에서, 가교 단백질은 CAR-결합 도메인, 항원-결합 도메인, 및 임의적으로, 1개 이상의 링커 서열을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 경우에, CAR-결합 도메인은 항원-결합 도메인에 직접적으로 융합된다.
일부 실시양태에서, 가교 단백질은 CAR-결합 도메인, 인간 Fc 영역, 항원-결합 도메인, 및 임의적으로, 1개 이상의 링커 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 가교 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로 항원-결합 도메인, 인간 Fc 도메인, 및 CAR-결합 도메인을 포함할 수 있고, 각각의 도메인은 링커에 의해 분리되거나 또는 직접적으로 융합된다 (도 2a-2c). 또 다른 실시양태에서, 가교 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로 항원-결합 도메인, CAR-결합 도메인, 및 인간 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 각각의 도메인은 링커에 의해 분리되거나 또는 직접적으로 융합된다 (도 2a-2c). 가교 단백질은 Fc 도메인 사이에 형성된 디술피드 결합의 존재로 인해 동종이량체로서 존재할 수 있다. 그러나, 제공된 임의의 실시양태에서, 가교 단백질은 단량체일 수 있다.
A. CAR-결합 도메인
가교 단백질은 CAR-결합 도메인을 포함한다. CAR-결합 도메인은 이펙터 기능이 재지시되어야 하는 CAR-T 세포에 의해 발현되는 CAR과 상호작용하는데 충분한 단백질 도메인이다. CAR-결합 도메인은 Fc 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치할 수 있거나, 또는 CAR-결합 도메인은 가교 단백질의 말단에 위치할 수 있다. CAR-결합 도메인은 CAR을 특이적으로 인식하는 항체의 항원-결합 부분, 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. CAR이 그의 표적화 도메인으로서 리간드를 포함하는 경우에, 가교 단백질의 CAR-결합 도메인은 리간드에 결합하는 수용체의 일부를 포함할 수 있다. CAR이 그의 표적화 도메인으로서 수용체를 포함하는 경우에, 가교 단백질의 CAR-결합 도메인은 수용체에 결합하는 리간드의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR이 그의 표적화 도메인으로서 CD4 도메인을 포함하는 경우, 가교 단백질의 CAR-결합 도메인은 gp120 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, gp120 도메인은 서열식별번호: 6에 제시된 말단절단된 gp120 도메인일 수 있으며, 이는 CD4에 효율적으로 결합하는 gp120 세포외 도메인의 11개 아미노산 세그먼트이다. 또 다른 예로서, CAR이 그의 표적화 도메인으로서 항-CD19 도메인을 포함하는 경우, 가교 단백질의 CAR-결합 도메인은 CD19의 적어도 일부분을 포함할 수 있으며, 이는 CAR의 항-CD19 도메인에 의해 결합되기에 충분하다 (도 1e).
B. Fc 도메인
가교 단백질은 Fc 도메인을 포함할 수 있다. Fc 도메인은 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치할 수 있거나, 또는 Fc 도메인은 가교 단백질의 말단에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인 서열일 수 있다. Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인 서열일 수 있다. Fc 도메인은 인간 중쇄 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 영역만을 함유할 수 있다. Fc 도메인은 CAR T 세포의 이펙터 기능의 비-특이적 표적화의 위험을 감소시키기 위해 FcgR 수용체에 대한 Fc 결합을 방지하는 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에서 위치 46 및 78에 각각 상응하는 D265A 및/또는 N297A 치환을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에 제공된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에 제공된 서열과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4에 제공된 서열과 동일한 서열을 갖는다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 코돈-최적화된 핵산에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 3에 제공된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 3에 제공된 서열과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 3에 제공된 서열과 동일한 서열에 의해 코딩된다.
C. 항원-결합 도메인
가교 단백질은 임의의 관심 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함한다. 항원-결합 도메인은 CAR-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치할 수 있거나, 또는 항원-결합 도메인은 가교 단백질의 말단에 위치할 수 있다. 항원-결합 도메인은 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 항원-결합 부분, 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 일부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체, 또는 항원에 결합하지만 온전한 본래의 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 항체로부터 유래되지 않고, 오히려 수용체로부터 유래된다. 항원-결합 단편의 예에는 비제한적으로 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 디술피드 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단일-쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (2가 디아바디), 다중특이적 항체, 단일 도메인 항체 (sdAb), 낙타과 항체 또는 나노바디, 도메인 항체, 및 2가 도메인 항체가 포함된다.
항원이 리간드인 경우, 가교 단백질의 항원-결합 도메인은 리간드에 결합하는 수용체의 일부분을 포함할 수 있다 (도 2c). 항원이 수용체인 경우, 가교 단백질의 항원-결합 도메인은 수용체에 결합하는 리간드의 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원이 CoV 스파이크 단백질인 경우, 가교 단백질의 항원-결합 도메인은 ACE2 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인은 ACE2 세포외 도메인의 말단절단된 부분 (ACE2t)일 수 있다. ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 ACE2의 가용성 형태를 생성하고 CoV 감염을 용이하게 하기 위해 사용되는 ADAM17, TMPRSS11d, 및 TMPRSS2 절단 부위를 함유하는 본래의 ACE2 세포외 도메인의 근위 말단을 포함하지 않을 수 있다. 프로테아제 절단 부위를 제외하면 가교 단백질의 의도되지 않은 절단이 방지된다.
특정 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 수용체 (예를 들어, 코로나바이러스 스파이크 단백질)에 결합하는 펩티드 (예를 들어, ACE2의 세포외 도메인)를 포함할 수 있다. 표적 결합 도메인은 ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분을 포함할 수 있다. ACE2t 부분은 CoV 결합에 필요한 3가지 모든 도메인을 함유한다. ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 ACE2의 가용성 형태를 생성하고 CoV 감염을 용이하게 하는데 중요한 2가지 절단 부위를 함유하는 본래의 ACE2 세포외 도메인의 근위 말단을 포함하지 않는다.
일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 서열식별번호: 2에 제공된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 서열식별번호: 2에 제공된 서열과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 서열식별번호: 2에 제공된 서열과 동일한 서열을 갖는다.
일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 코돈-최적화된 핵산에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 서열식별번호: 1에 제공된 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 서열식별번호: 1에 제공된 서열과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열에 의해 코딩된다. 일부 측면에서, ACE2 세포외 도메인의 ACE2t 부분은 서열식별번호: 1에 제공된 서열과 동일한 서열에 의해 코딩된다.
다른 예시적인 항원에는 암 세포 상의 표면 항원 (도 1d) 및 감염된 세포 상의 표면 항원이 포함된다. 암 세포 상의 표면 항원은 종양-특이적 항원, 즉, 종양 세포에서만 발현되는 항원일 수 있다. 암 세포 상의 표면 항원은 종양-연관 항원, 즉, 건강한 세포 상에서 발현되지만 종양 세포 상에서 과발현되는 항원일 수 있다. 암 세포 상의 표면 항원의 예에는 HER-3, Her1/HER-3 융합; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C-유형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 강글리오시드 G2 (GD2); 강글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 암배아 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메조텔린; 인터류킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스테신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 스테이지-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 엽산염 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 회합 (MUC1); 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립선산 포스파타제 (PAP); 돌연변이된 신장 인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 탄산 탈수 효소 IX (CAIX); 프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gp100); 중단점 클러스터 영역 (BCR) 및 아벨손 뮤린 백혈병 바이러스 종양 유전자 동족체 1 (Abl)로 이루어진 종양 유전자 융합 단백질 (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5 (TGS5); 고분자량-흑색종-연관 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 엽산염 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라미드 (GloboH)의 육당류 부분; 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 로커스 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름스 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ESO-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-연관 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치하는 ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정액 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 중단점; 아폽토시스의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막횡단 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 페어링된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 시클린 B1; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양 유전자 신경모세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2 (TRP-2); 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인된 부위의 조절인자의 형제(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)), T 세포에 의해 인식되는 편평상피 세포 암종 항원 3 (SART3); 페어링된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 윤활막 육종, X 중단점 2 (SSX2); 고급 당화 최종 산물에 대한 수용체 (RAGE-1); 신장 편재성 1 (RU1); 신장 편재성 2 (RU2); 레구마인; 인간 유두종 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7 (HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 열 쇼크 단백질 70-2 돌연변이된 (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관 이뮤노글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 이뮤노글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1)이 포함된다. 감염된 세포 상의 표면 항원의 예에는 바이러스 스파이크 또는 외피 단백질 (예를 들어, HIV-1 gp120, HIV-1 gp41, HIV-1 gp160, SARS-CoV S 단백질, SARS-CoV-2 S 단백질, MERS S 단백질, 에볼라바이러스 당단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 뉴라미니다제, C형 간염 E1, C형 간염 E2, 뎅기열 바이러스 E 이량체, 치쿤군야 바이러스 E1, 치쿤군야 바이러스 E1, 시토메갈로바이러스 당단백질, 단순 헤르페스 바이러스 gB, 단순 헤르페스 바이러스 gH, 단순 헤르페스 바이러스 gL, 단순 헤르페스 바이러스 gM, 엡스타인-바르 바이러스 gp350, 및 엡스타인-바르 바이러스 gp42)이 포함된다.
D. 링커
가교 단백질은 정확한 폴딩을 가능하게 하고/거나, 융합된 도메인의 입체 장애를 방지하기 위해 융합된 폴리펩티드 서열 사이에 위치하는 적어도 1개의 펩티드 링커 (또는 스페이서)를 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 가요성 링커일 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 2 내지 20개 펩티드 길이, 2 내지 18개 펩티드 길이, 2 내지 16개 펩티드 길이, 2 내지 14개 펩티드 길이, 2 내지 12개 펩티드 길이, 2 내지 10개 펩티드 길이, 4 내지 20개 펩티드 길이, 4 내지 18개 펩티드 길이, 4 내지 16개 펩티드 길이, 4 내지 14개 펩티드 길이, 4 내지 12개 펩티드 길이, 또는 4 내지 10개 펩티드 길이이다. 일부 측면에서, 링커는 GGGS의 코어 서열 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 일부 측면에서, 링커는 서열 SSGGGGSGGGGGGSS (서열식별번호: 9) 또는 서열 SSGGGGSGGGGGGSSRSS (서열식별번호: 10)를 포함한다. 바람직하게는, 링커는 서열 SSGGGGS (서열식별번호: 8)를 포함한다. 가교 단백질이 1개 초과의 링커를 함유하는 경우, 가교 단백질에서 각각의 링커는 동일한 서열을 가질 수 있거나, 또는 각각의 링커는 상이한 서열을 가질 수 있다.
대안적으로, 가교 단백질의 CAR-결합 도메인 및 항원-결합 도메인은 화학적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 도메인의 시스테인 잔기는 부위-특이적으로 및 효율적으로 티올-반응성 시약과 커플링될 수 있다. 티올-반응성 작용제는 예를 들어 말레이미드, 아이오도아세트아미드, 피리딜 디술피드, 또는 다른 티올-반응성 접합 파트너일 수 있다. 따라서, 가교 단백질의 CAR-결합 도메인 부분은 예를 들어 말레이미드 루프를 포함할 수 있다. 이어서, 화학적 접합은 디티오트레이톨 (DTT) 환원 및 CAR-결합 도메인-말레이미드 첨가에 의해 개시될 수 있다.
III. 키메라 항원 수용체
키메라 항원 수용체 (CAR) 분자는 재조합 융합 단백질이며, 표적 (예를 들어, 코로나바이러스 스파이크 단백질)에 결합하고, 사멸, 증식, 및 시토카인 생산을 위해 유전자 변형된 면역 이펙터 세포를 활성화시키기 위해 그들의 세포질 꼬리에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프 (ITAM)를 통해 활성화 신호를 변환하는 그들의 능력 둘 다에 의해 구별된다.
실시양태에 따른 키메라 항원 수용체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있지만, 바람직하게는 이는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산된다. 키메라 항원 수용체의 몇몇 영역을 코딩하는 핵산 서열은 분자 클로닝의 표준 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-보조된 라이게이션, 부위-지정 돌연변이 유발 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 제조되고 조립될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 적합한 숙조 동종이계 또는 자가 유래 면역 이펙터 세포를 형질변환시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 CAR의 실시양태는 세포내 신호전달 도메인, 막횡단 도메인, 및 표적-결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 표적-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 임의적으로, CAR은 막횡단 도메인과 표적-결합 도메인 사이에 위치하는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 실시양태의 CAR은 세포 표면에 대해 CAR의 발현을 지시하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR은 GM-CSF로부터의 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR은 또한 적은 양의 표적이 있을 때 지속성을 개선시키기 위해 막-결합된 시토카인과 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, CAR은 막-결합된 IL-15와 공동-발현될 수 있다.
CAR의 도메인의 배열 및 도메인에서 사용되는 특이적 서열에 따라, CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 표적 세포에 대해 상이한 수준 활성을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 CAR 서열은 면역 이펙터 세포에 도입되어 조작된 세포를 생성할 수 있고, 조작된 세포는 상승된 SRC를 위해 선택되고, 선택된 세포는 가장 큰 치료 효능을 가진 것으로 예측되는 CAR 구축물을 확인하기 위해 활성에 대해 시험된다.
키메라 구축물은 네이키드 DNA로서 또는 적합한 벡터에서 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 네이키드 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 세포를 안정하게 형질감염시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,410,319를 참고한다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 키메라 수용체를 코딩하는 DNA를 지칭한다. 대안적으로, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 키메라 구축물을 면역 이펙터 세포에 도입시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용하는데 적합한 벡터는 면역 이펙터 세포에서 복제되지 않는다. 바이러스를 기반으로 하는 수많은 벡터가 공지되어 있고, 예를 들어 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터와 같이 세포에서 유지되는 바이러스의 카피 수는 세포의 생존력을 유지하기에 충분히 낮다.
A. 항원-결합 도메인
특정 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역, 및/또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하는 항체 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다. "상보성 결정 영역 (CDR)"은 항원을 보완하여 수용체에 해당 특정한 항원에 대한 그의 특이성을 제공하는 항원 수용체 (예를 들어, 이뮤노글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩티드 쇄는 3개의 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체가 전형적으로 2개의 폴리펩티드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉할 수 있는 각각의 항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 있으며, 각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 이뮤노글로불린 및 T-세포 수용체와 연관된 대부분의 서열 변이가 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 때때로 초가변 도메인으로 지칭된다. 이들 중에서, CDR3은 VJ (중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우에는 VDJ) 영역의 재조합에 의해 코딩되기 때문에 가장 큰 변이성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 해당 특이성은 수용체에 결합하는 펩티드 (예를 들어, 시토카인)로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 해당 특이성은 바이러스 당단백질에 결합하는 수용체 (예를 들어, CD4의 세포외 도메인, 예컨대 CD4의 D1 및 D2 도메인)로부터 유래된다. 항원-결합 도메인이 CD4로부터 유래되는 것인 측면에서, 항원-결합 도메인을 형성하는 CD4의 일부분은 MHC 부류 II에 대한 결합을 제한하도록 돌연변이될 수 있다.
CAR 핵산, 특히 scFv 서열은 인간 환자에 대한 세포 면역요법을 증강시키기 위한 인간 유전자인 것으로 고려된다. 구체적인 실시양태에서, 전장 CAR cDNA 또는 코딩 영역이 제공된다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 특정한 마우스, 또는 인간 또는 인간화 모노클로날 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 단편은 또한 항원-특이적 항체의 임의의 개수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 단편은 인간 세포에서 발현을 위한 인간 코돈 사용을 위해 최적화된 서열에 의해 코딩된 항원-특이적 scFv이다. 특정 측면에서, CAR의 VH 및 VL 도메인은 링커 서열, 예컨대 위트로우(Whitlow) 링커에 의해 분리된다. 실시양태에 따라 변형되거나 또는 사용될 수 있는 CAR 구축물은 국제 (PCT) 특허 공개 번호 WO2015/123642 (본원에 참고로 포함됨)에 또한 제공된다.
이전에 기재된 바와 같이, 프로토타입 CAR은 하나의 모노클로날 항체 (mAb)로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인 (예를 들어 공동 자극 도메인 및 신호전달 도메인)에 커플링된 scFv를 코딩한다. 따라서, CAR은 관심 항원, 예컨대 종양 연관된 항원에 결합하는 항체의 LCDR1-3 서열 및 HCDR1-3 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 추가의 측면에서, 관심 항원에 결합하는 더 많은 항체 중 2가지가 확인되었고, (1) 항원에 결합하는 제1 항체의 HCDR1-3 서열; 및 (2) 항원에 결합하는 제2 항체의 LCDR1-3 서열을 포함하는 CAR이 구축된다. 2가지 상이한 항원 결합 항체로부터의 HCDR 및 LCDR 서열을 포함하는 이러한 CAR은 항원의 특정한 입체형태 (예를 들어, 정상 조직에 비해 암 세포와 우선적으로 연관된 입체형태)에 대한 우선적인 결합의 이점을 가질 수 있다.
대안적으로, CAR이 상이한 mAb로부터 유래된 VH 및 VL 쇄를 사용하여 조작되어 CAR+ T 세포의 패널을 생성할 수 있음을 나타낸다. CAR의 항원 결합 도메인은 제1 항체의 LCDR1-3 서열 및 제2 항체의 HCDR1-3 서열의 임의의 조합물을 함유할 수 있다.
B. 힌지 도메인
특정 측면에서, 실시양태의 CAR 폴리펩티드는 표적-결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 힌지 도메인은 표적-결합 도메인과 세포 표면 사이에 적절한 거리를 제공하기 위해 또는 CAR-변형된 T 세포의 표적 결합 또는 이펙터 기능에 불리한 영향을 미칠 수 있는 가능한 입체 장애를 완화시키기 위해 CAR 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 힌지 도메인은 Fc 수용체, 예컨대 FcγR2a 또는 FcγR1a에 결합하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 힌지 서열은 Fc 수용체에 결합하는 인간 이뮤노글로불린으로부터의 Fc 도메인 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 또는 IgE)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, CAR 힌지 도메인은 인간 이뮤노글로불린 (Ig) 불변 영역 또는 Ig 힌지를 포함하는 그의 일부분으로부터, 또는 인간 CD8a 막횡단 도메인 (FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN; 서열식별번호: 11) 및 CD8a-힌지 영역 (KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD; 서열식별번호: 12)으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, CAR 힌지 도메인은 항체 이소타입 IgG4의 힌지-CH2-CH3 영역 (ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM; 서열식별번호: 13)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 점 돌연변이가 항체 중쇄 CH2 도메인에 도입되어, CAR-변형된 면역 이펙터 세포의 글리코실화 및 비-특이적 Fc 감마 수용체 결합을 감소시킬 수 있다.
특정 측면에서, 실시양태의 CAR 힌지 도메인은 야생형 Ig Fc 도메인에 비해 Fc-수용체 결합을 감소시키는 적어도 1개의 돌연변이를 포함하는 Ig Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 도메인에 비해 Fc-수용체 결합을 감소시키는 적어도 1개의 돌연변이를 포함하는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 서열에 비해 L235 및/또는 N297에 상응하는 위치에서 돌연변이 (예컨대 아미노산 결실 또는 치환)를 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 서열에 비해 L235E 및/또는 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG4-Fc 도메인를 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, CAR 힌지 도메인은 위치 L235에서 친수성인 아미노산, 예컨대 R, H, K, D, E, S, T, N 또는 Q 또는 "E"와 유사한 성질을 갖는 것, 예컨대 D에 대한 아미노산 치환을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, CAR 힌지 도메인은 위치 N297에서 "Q"와 유사한 성질을 갖는 아미노산, 예컨대 S 또는 T에 대한 아미노산 치환을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다.
C. 막횡단 도메인
표적-특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달-도메인은 막횡단 도메인에 의해 연결될 수 있다. 막횡단 도메인의 일부로서 사용될 수 있는 폴리펩티드 서열에는 비제한적으로 인간 CD4 막횡단 도메인, 인간 CD28 막횡단 도메인, 막횡단 인간 CD3ζ 도메인, 또는 시스테인 돌연변이된 인간 CD3ζ 도메인, 또는 다른 인간 막횡단 신호전달 단백질로부터의 다른 막횡단 도메인, 예컨대 CD16, CD8, 및 에리트로포이에틴 수용체가 포함된다. 일부 측면에서, 예를 들어, 막횡단 도메인은 미국 특허 공개 번호 2014/0274909 (예를 들어 CD8 및/또는 CD28 막횡단 도메인) 또는 미국 특허 번호 8,906,682 (예를 들어 CD8α 막횡단 도메인) (둘 다 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 제공된 것들 중 하나와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 특정 구체적인 측면에서, 막횡단 영역은 T-세포 수용체, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 이들의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있음). 특정 구체적인 측면에서, 막횡단 도메인은 CD8a 막횡단 도메인 또는 CD28 막횡단 도메인과 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
D. 세포내 신호전달 도메인
실시양태의 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CAR을 발현하도록 조작된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능"은 분화된 세포의 특수한 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어 시토카인의 분비를 비롯한 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 나이브, 기억 또는 기억-유형 T 세포에서 이펙터 기능에는 항원-의존성 증식이 포함된다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 변환시키고, 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 천연 수용체의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래된다. 이러한 천연 수용체의 예에는 T-세포 수용체의 제타 쇄 또는 임의의 그의 동족체 (예를 들어, 에타, 델타, 감마, 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호전달 분자의 조합물, 예컨대 CD3ζ 및 CD28, CD27, 4-1BB/CD137, ICOS/CD278, IL-2Rβ/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12, CD40, OX40/CD134, 및 이들의 조합물, 뿐만 아니라 다른 유사한 분자 및 단편이 포함된다. 단백질을 활성화시키는 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분, 예컨대 FcγRIII 및 FcεRI가 사용될 수 있다.
일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 것이지만, 여러 경우에 전체 세포내 폴리펩티드를 사용할 필요는 없을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용될 수 있는 정도까지, 이러한 말단절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 여전히 변환시키는 한, 이는 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 CAR이 표적에 결합시 이펙터 기능 신호를 변환시키는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분을 포함한다는 것을 의미한다. 소위 3세대 CAR이 예를 들어 상가적 또는 상승작용적 효과를 위해 함께 융합된 적어도 2 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖기 때문에, 하나의 또는 다중 세포질 도메인이 이용될 수 있으며, CD28 및 4-1BB는 CAR 구축물에서 조합될 수 있다. 특정 구체적인 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 도메인 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR; 서열식별번호: 14), CD28 세포내 도메인, CD137 세포내 도메인, 또는 4-1BB 세포내 도메인에 융합된 CD28 세포내 도메인을 포함하는 도메인과 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 CD3ζ 세포내 도메인은 실시양태의 CAR을 위해 세포내 신호전달 도메인으로서 사용된다.
구체적인 실시양태에서, CAR에서 세포내 수용체 신호전달 도메인은 예를 들어 T 세포 항원 수용체 복합체의 것들, 예컨대 CD3의 ζ 쇄, 또한 Fcγ RIII 공동 자극 신호전달 도메인, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2를 단독으로 또는 CD3ζ와 함께 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 세포내 도메인 (세포질 도메인으로 지칭될 수 있음)은 TCRζ 쇄, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2Rβ/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12, 및 CD40 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인에서 내인성 T-세포 수용체 복합체의 임의의 부분을 이용한다. 소위 3세대 CAR이 예를 들어 상가적 또는 상승작용적 효과를 위해 함께 융합된 적어도 2 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖기 때문에, 하나의 또는 다중 세포질 도메인을 이용할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR은 추가의 다른 공동 자극 도메인을 포함한다. 다른 공동 자극 도메인에는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. CD3ζ에 의해 개시되는 일차 신호 외에도, 인간 CAR에서 삽입된 인간 공동 자극 수용체에 의해 제공되는 추가의 신호가 T 세포의 전체 활성화를 위해 중요하고, 입양 면역요법의 생체내 지속성 및 치료적 성공을 개선시키는데 도움이 될 수 있다.
IV. 내인성 유전자 발현의 변형
일부 측면에서, 조작된 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 제거하도록 변형된다. 예를 들어, 조작된 면역 이펙터 세포는 적어도 하나의 면역 체크포인트 단백질을 녹다운시키거나 또는 녹아웃시키도록 변형될 수 있다. 적어도 하나의 면역 체크포인트 유전자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, TIGIT, CD96, BTLA, KIR, 아데노신 A2a 수용체, Vista, IDO, FAS, SIRP 알파, CISH, SHP-1, FOXP3, LAIR1, PVRIG, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD160, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3.
일부 측면에서, 조작된 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 HIV 공동-수용체의 발현을 감소시키거나 또는 제거하도록 변형된다. 예를 들어, 조작된 면역 이펙터 세포는 CCR5 발현이 침묵되도록 변형된다.
또 다른 예로서, 조작된 면역 이펙터 세포에서 HLA 유전자는 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 조작된 면역 이펙터 세포는 그들의 표면 상에서 기능성 HLA-A, HLA-B, 및/또는 HLA-C를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. HLA-A 음성 조작된 면역 이펙터 세포는 HLA-동형접합성 개체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 조작된 면역 이펙터 세포는 HLA-A 동형접합성일 수 있다. 추가로, 조작된 면역 이펙터 세포는 이들이 HLA-A 음성인지 또는 HLA-A 동형접합성인지 여부와 무관하게 HLA-B, HLA-C 및/또는 HLA-DRB1 대립 형질에서 HLA-동형접합성일 수 있다.
일부 측면에서, 조작된 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 T-세포 수용체 성분의 발현을 녹다운시키거나 또는 녹아웃시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 TCRα, TCRβ, TCRα 및 TCRβ, TCRγ, TCRδ, TCRγ 및 TCRδ, 또는 이들의 임의의 조합물의 발현이 결여되거나 또는 감소된 발현을 가질 수 있다. 이는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 도입시킴으로써, 예를 들어 TCR 수용체 성분 중 하나 이상의 불변 영역을 표적화함으로써 임의의 적합한 방식으로 발생할 수 있다.
내인성 유전자의 녹아웃은 내인성 유전자의 로커스를 특이적으로 표적화하는 인공 뉴클레아제를 세포에 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 다양한 측면에서, 인공 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9일 수 있다. 다양한 측면에서, 인공 뉴클레아제를 세포에 도입시키는 것은 인공 뉴클레아제를 코딩하는 mRNA를 세포에 도입시키는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 표적 내인성 유전자는 유전자 또는 유전자 산물이 비기능성이게 만드는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성되는 결실 또는 돌연변이를 포함한다. 이러한 결실 또는 돌연변이는 표적 내인성 유전자의 두 대립 형질 모두에서 발생할 수 있다.
내인성 유전자의 발현의 녹다운은 억제성 핵산, 예컨대 miRNA를 코딩하는 구축물을 세포에 도입시키는 것을 포함할 수 있다. 억제성 핵산은 세포에서 유전자의 전사를 억제할 수 있거나 또는 유전자 전사체의 번역을 방지할 수 있다. 억제성 핵산은 16 내지 1000개 뉴클레오티드 길이, 특정 실시양태에서 18 내지 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제성 핵산은 관심 유전자에 결합하거나 또는 혼성화하는 단리된 핵산이다. 억제성 핵산은 표적 유전자의 발현을 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%만큼, 바람직하게는 적어도 75%만큼 침묵시킬 수 있다.
억제성 핵산은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA 및 이중 가닥 RNA는 미국 특허 6,506,559 및 6,573,099, 뿐만 아니라 미국 특허 공보 2003/0051263, 2003/0055020, 2004/0265839, 2002/0168707, 2003/0159161, 및 2004/0064842에 기재되어 있으며, 이들 모두 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 다양한 측면에서, 내인성 유전자의 발현의 녹다운은 표적 유전자 발현를 녹다운시키기 위해 miRNA 발현 구축물, 다중 miRNA 및 이들의 사용을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 발현 구축물은 프로모터 요소, 스페이서 서열 및 miRNA 코딩 서열을 포함한다. 이러한 miRNA 발현 구축물의 예는 WO 2019/186274 및 미국 특허 9,556,433에서 확인될 수 있으며, 이들 각각은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 측면 내에서 발현 벡터는 관심 핵산, 예컨대 특정한 유전자의 발현을 억제하는 핵산을 발현하기 위해 이용된다. 발현은 적절한 신호가 벡터에서 제공되고, 숙주 세포에서 관심 유전자의 발현을 유도하는 바이러스 및 포유동물 공급원 둘 다로부터의 다양한 조절 요소, 예컨대 인핸서/프로모터를 포함하는 것을 필요로 한다. 숙주 세포에서 RNA 안정성을 최적화하도록 설계된 요소 또한 정의된다. 산물을 발현하는 영구적이고 안정한 세포 클론을 확립하기 위해 수많은 우세한 약물 선택 마커의 사용을 위한 조건 또한 제공되며, 이는 약물 선택 마커의 발현을 폴리펩티드의 발현에 연결시키는 요소이기 때문이다.
A. 조절 요소
본원 전반에 걸쳐, 용어 "발현 구축물" 또는 "발현 벡터"는 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 구축물을 포함하는 것을 의미한다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 특정 실시양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA에서 유전자 산물로의 번역 둘 다를 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현은 관심 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함하며, 즉, 실시양태의 RNA 분자의 경우와 같다.
특정 실시양태에서, 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 프로모터의 전사 제어 하에 있다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하기 위해 필요한 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 문구 "전사 제어 하에"는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 있음을 의미한다.
용어 프로모터는 진핵생물 RNA 폴리머라제 (Pol) I, II 또는 III에 대한 개시 부위 주변에 클러스터화된 전사 제어 모듈의 그룹을 지칭하기 위해 본원에서 사용될 것이다. 프로모터가 어떻게 조직화되는지에 대한 여러 생각은 HSV 티미딘 키나제 (tk) 및 SV40 초기 전사 단위에 대한 것들을 비롯하여 몇몇 바이러스 Pol II 프로모터의 분석으로부터 유래한다. 보다 최근의 작업에 의해 강화된 이들 연구는 프로모터가 별개의 기능성 모듈로 구성되며, 이들 각각이 대략 7-20 bp의 DNA로 구성되고, 전사 활성화제 또는 억제제 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 함유함을 나타내었다.
각각의 프로모터에서 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위를 위치시키는 기능을 한다. 이에 대해 가장 잘 공지된 예는 TATA 박스이지만, TATA 박스가 결여된 일부 프로모터, 예컨대 포유동물 말단 데옥시 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터에서, 시작 부위 자체 위에 있는 별개의 요소가 개시 위치를 정하는 것을 돕는다.
추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 영역 30-110 bp 상류에 위치하지만, 수많은 프로모터는 최근에 시작 부위의 하류에도 기능성 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소들 사이의 이격은 빈번히 가요성이어서, 프로모터 기능은 요소들이 반전되거나 또는 서로 상대적으로 이동할 때 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 이격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격으로 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것을 보인다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 신장 인자 1 짧은 (EF1) 프로모터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부, 래트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 사용하여 관심 코딩 서열을 높은 수준으로 발현할 수 있다. 발현 수준이 주어진 목적을 위해 충분하다면, 관심 코딩 서열의 발혈을 달성하기 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용 또한 고려된다.
널리 공지된 성질을 갖는 프로모터를 이용함으로써, 형질감염 또는 형질전환 후에 관심 단백질의 발현의 수준 및 패턴이 최적화될 수 있다. 추가로, 특이적 생리학적 신호에 대한 반응으로 조절되는 프로모터의 선택은 유전자 산물의 유도성 발현을 허용할 수 있다. 표 1 및 2는 본 발명의 맥락에서 관심 유전자의 발현을 조절하기 위해 이용될 수 있는 몇몇 조절 요소를 나열한다. 이 목록은 유전자 발현의 촉진에 관여하는 가능한 모든 요소를 망라한 것이 아니라, 단지 그의 예시를 위한 것으로 의도된다. 일부 측면에서, 본 실시양태에 따라 사용하기 위한 프로모터는 비-조직 특이적 프로모터, 예컨대 구성적 프로모터이다.
인핸서는 DNA의 동일한 분자 상에서 멀리 위치하는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적 요소이다. 인핸서는 프로모터와 매우 유사하게 조직화된다. 즉, 이들은 여러 개별 요소로 구성되며, 이들 각각은 하나 이상의 전사 단백질에 결합한다.
인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 구별은 작동적이다. 인핸서 영역은 전체적으로 원거리에서 전사를 자극할 수 있어야 하며; 이것이 프로모터 영역 또는 그의 성분 요소에서는 참일 필요가 없다. 다른 한편으로, 프로모터는 특정한 부위에서 및 특정한 배향으로 RNA 합성의 개시를 지시하는 하나 이상의 요소를 가져야 하는 반면에, 인핸서는 이들 특이성이 결여되어 있다. 프로모터 및 인핸서는 종종 중첩되고 연속적이며, 종종 매우 유사한 모듈 조직화를 갖는 것처럼 보인다.
하기는 발현 구축물에서 관심 유전자 또는 miRNA를 코딩하는 핵산과 조합되어 사용될 수 있는 바이러스 프로모터, 세포 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서이다 (표 1 및 표 2). 추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합물 (진핵생물 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라)을 사용하여 관심 유전자 또는 miRNA의 발현을 유도할 수 있다. 말단절단된 프로모터 또한 사용하여 발현을 유도할 수 있다. 적절한 박테리아 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 구축물로서 제공되는 경우, 진핵생물 세포는 특정 박테리아 프로모터로부터 세포질 전사를 지원할 수 있다.
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임의의 cDNA 삽입체를 이용하는 경우, 전형적으로 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위한 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실행에 중요한 것으로 여겨지지 않으며, 임의의 이러한 서열, 예컨대 인간 성장 호르몬 및 SV40 폴리아데닐화 신호가 이용될 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 실시양태의 벡터에 포함되지 않는다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터에서 (3' LTR 앞에) 이러한 신호 서열의 통합은 생성된 렌티바이러스 역가를 감소시킬 수 있다.
스페이서 서열이 핵산 구축물에 포함될 수 있다. 스페이서의 존재는 miRNA의 녹다운 효율을 증강시키는 것으로 보인다 (Stegmeier et al., 2005). 스페이서는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 측면에서, 스페이서는 GFP이다.
발현 카세트의 요소로서 종결자 또한 고려된다. 이들 요소는 메세지 수준을 증강시키고, 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 역할을 할 수 있다.
B. 선택가능한 마커
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 본 발명의 핵산 구축물을 함유하고, 세포는 발현 구축물에서 마커를 포함시킴으로써 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 발현 구축물을 함유하는 세포의 용이한 확인을 허용하도록 세포에 확인가능한 변화를 부여한다. 일반적으로, 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝에서 및 선택에서 도움이 되며, 예를 들어 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택가능한 마커이다. 대안적으로, 효소, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)가 이용될 수 있다. 면역학적 마커 또한 이용될 수 있다. 이용되는 선택가능한 마커는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택가능한 마커의 추가의 예는 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
V. 핵산 분자 및 발현 벡터의 전달
특정 측면에서, 실시양태의 핵산의 전달을 위한 벡터는 세포에서 이들 인자를 발현하도록 구축될 수 있다. 특정한 측면에서, 하기 시스템 및 방법은 핵산을 원하는 세포 유형에 전달하는데 사용될 수 있다.
A. 상동성 재조합
실시양태의 특정 측면에서, 실시양태의 핵산 분자를 코딩하는 벡터는 특이적 방식으로, 예를 들어 상동성 재조합을 통해 세포에 도입될 수 있다. 줄기 세포에서 유전자를 발현하기 위한 현재의 접근법은 게놈에서 무작위로 통합된 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터) 또는 트랜스진의 사용을 수반하였다. 이들 접근법은 무작위로 통합된 벡터가 내인성 유전자 발현 및/또는 트랜스진 발현 침묵을 활성화시키거나 또는 억제할 수 있기 때문에 부분적으로 성공적이지 않았다. 무작위 통합과 연관된 문제는 표적 게놈에서 특이적 로커스에 대한 상동성 재조합에 의해 부분적으로 극복될 수 있다.
일반적인 재조합으로도 공지된 상동성 재조합 (HR)은 뉴클레오티드 서열이 DNA의 두 유사한 또는 동일한 가닥 사이에서 교환되는 모든 형태의 생명체에서 사용되는 유전자 재조합의 유형이다. 상기 기술은 1980년대 중반 이래로 포유동물 세포에서 게놈 조작을 위한 표준 방법이었다. 상기 과정은 DNA의 물리적 파괴 및 궁극적인 재결합의 몇몇 단계를 수반한다. 이 과정은 DNA에서 잠재적으로 치명적인 이중 가닥 절단을 복구하기 위해 천연에서 가장 널리 사용된다. 추가로, 상동성 재조합은 진핵생물이 정자 및 난자와 같은 생식 세포를 만드는 과정인 감수분열 동안에 DNA 서열의 새로운 조합물을 생산한다. DNA의 이들 새로운 조합물은 집단이 시간에 걸쳐 변화하는 환경 조건에 진화적으로 적응할 수 있도록 하는 자손의 유전자 변이를 나타낸다. 상동성 재조합은 또한 박테리아 및 바이러스의 상이한 균주 및 종 사이에서 유전 물질을 교환하기 위해 수평적 유전자 전달에서 이용된다. 상동성 재조합은 또한 표적 유기체에 유전자 변화를 도입시키기 위한 분자 생물학의 기술로서 이용될 수 있다.
상동성 재조합은 표적화된 게놈 변형으로서 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서 표준 HR의 효율은 처리된 세포 중 10-6 내지 10-9에 불과한다 (Capecchi, 1990). 메가뉴클레아제, 또는 귀소 엔도뉴클레아제, 예컨대 I-SceI의 사용은 HR의 효율을 증가시키기 위해 사용되었다. 천연 메가뉴클레아제 뿐만 아니라 변형된 표적화 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제를 사용하여 HR 효율을 증가시켰다 (Pingoud and Silva, 2007; Chevalier et al., 2002). HR 효율을 증가시키기 위한 또 다른 경로는 프로그래밍가능한 DNA 특이성 도메인을 사용하여 키메라 엔도뉴클레아제를 조작하는 것이었다 (Silva et al., 2011). 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)는 이러한 키메라 분자의 한 예이며, 아연-핑거 DNA 결합 도메인은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제, 예컨대 FokI의 촉매적 도메인과 융합된다 (Durai et al., 2005; WO2005028630에서 검토됨). 이러한 특이성 분자의 또 다른 부류에는 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제, 예컨대 FokI의 촉매적 도메인에 융합된 전사 활성화제 유사 이펙터 (TALE) DNA 결합 도메인이 포함된다 (Miller et al., 2011: WO2010079430).
B. 핵산 전달 시스템
관련 기술분야의 기술자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 잘 구축할 것이다 (예를 들어, [Sambrook et al., 2001 및 Ausubel et al., 1996]을 참고하며, 둘 다 본원에 참고로 포함됨). 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC), 예컨대 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유래됨), 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유래됨), 복제 적격성, 복제 결함성 및 이들의 실질이 없는 형태를 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 유인원 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바르 바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 우두증 바이러스 벡터, 하비 뮤린 육종 바이러스 벡터, 뮤린 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
1. 에피솜 벡터
본 발명의 특정 측면에서 예를 들어 체세포의 재프로그래밍을 위해 플라스미드- 또는 리포솜-기반 염색체외 (즉, 에피솜) 벡터의 사용 또한 제공될 수 있다. 이러한 에피솜 벡터에는 예를 들어 oriP-기반 벡터, 및/또는 EBV-단백질 EBNA-1의 유도체를 코딩하는 벡터가 포함될 수 있다. 이들 벡터는 DNA의 큰 단편이 세포에 도입되고 염색체외에서 유지되고, 세포 주기당 1회 복제되고, 딸 세포로 효율적으로 분할되고, 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않도록 허용할 수 있다.
특히, oriP-기반 발현 벡터의 복제에 필요한 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은 MHC 부류 I 분자 상에 그의 항원을 제시하기 위해 필요한 과정을 우회하는 효율적인 메카니즘을 개발하였기 때문에, 이는 세포 면역 반응을 유발하지 않는다 (Levitskaya et al., 1997). 추가로, EBNA-1은 클로닝된 유전자의 발현을 증강시키기 위해 트랜스로 작용하여, 일부 세포주에서 클로닝된 유전자의 발현을 100 배까지 유도할 수 있다 (Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). 최종적으로, 이러한 oriP-기반 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
다른 염색체외 벡터에는 다른 림프영양성 헤르페스 바이러스-기반 벡터가 포함된다. 림프영양성 헤르페스 바이러스는 림프모구 (예를 들어, 인간 B 림프모구)에서 복제하고 그의 천연 수명 주기의 일부 동안에 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)는 "림프영양성" 헤르페스 바이러스가 아니다. 예시적인 림프영양성 헤르페스 바이러스에는 EBV, 카포시 육종 헤르페스 바이러스 (KSHV); 헤르페스 바이러스 사이미리 (HS) 및 마렉 질환 바이러스 (MDV)가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 에피솜-기반 벡터의 다른 공급원, 예컨대 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40, 또는 BPV 또한 고려된다.
관련 기술분야의 기술자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 잘 구축할 것이다 (예를 들어, [Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994]를 참고하며, 둘 다 본원에 참고로 포함됨).
벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나, 또는 달리 표적화된 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분에는 예를 들어 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분 (예컨대 세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후에 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 국재화에 영향을 미치는 성분 (예컨대 핵 국재화를 매개하는 작용제); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치는 성분이 포함된다.
이러한 성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현 중인 세포를 검출하거나 또는 선택하기 위해 사용될 수 있는 마커, 예컨대 검출가능한 및/또는 선택 마커가 포함될 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 천연 특색으로서 제공될 수 있거나 (예컨대 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능을 갖는 특정 바이러스 벡터의 사용), 또는 벡터는 이러한 기능을 제공하도록 변형될 수 있다. 매우 다양한 이러한 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 이용가능하다. 벡터가 숙주 세포에서 유지되는 경우, 벡터는 자율적 구조로서 유사분열 동안에 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나, 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있거나, 또는 숙주 세포의 핵 또는 세포질에서 유지될 수 있다.
2. 트랜스포손-기반 시스템
특정한 실시양태에 따라, 핵산의 도입은 트랜스포손 - 트랜스포사제 시스템을 이용할 수 있다. 사용된 트랜스포손 - 트랜스포사제 시스템은 널리 공지된 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 프로그 프린스(Frog Prince) 트랜스포손 - 트랜스포사제 시스템 (후자의 설명에 대해서는 예를 들어 EP1507865 참고), 또는 TTAA-특이적 트랜스포손 피기백 시스템일 수 있다.
트랜스포손은 전위로 지칭되는 과정인 단일 세포의 게놈 내의 상이한 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열이다. 상기 과정에서, 이들은 돌연변이를 유발할 수 있고, 게놈에서 DNA의 양을 변화시킬 수 있다. 트랜스포손은 또한 한때 점핑 유전자로도 지칭되었고, 이동성 유전적 요소의 예이다.
다양한 이동성 유전적 요소가 있으며, 이들은 그들의 전위 메카니즘을 기반으로 하여 그룹화될 수 있다. 부류 I 이동성 유전적 요소, 또는 레트로트랜스포손은 먼저 RNA로 전사된 다음, 역전사효소에 의해 DNA로 다시 역전사된 다음, 게놈의 또 다른 위치에서 삽입됨으로써 스스로 복제한다. 부류 II 이동성 유전적 요소는 게놈 내에서 "잘라내기 및 붙여넣기"를 위해 트랜스포사제를 사용하여 한 위치에서 또 다른 위치로 직접적으로 이동한다.
3. 바이러스 벡터
재조합 바이러스 벡터를 생성하는데 있어서, 비-필수 유전자는 전형적으로 이종성 (또는 비-천연) 단백질 또는 핵산에 대한 유전자 또는 코딩 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 핵산 및 가능하게는 단백질을 세포에 도입시키기 위해 바이러스 서열을 이용하는 발현 구축물의 일종이다. 세포를 감염시키거나 또는 pH-의존성 또는 pH-비의존성 메카니즘을 통해 세포에 진입하고, 그들의 유전자 적재물을 숙주 세포 게놈에 통합시키고, 바이러스 유전자를 안정하게 및 효율적으로 발현하는 특정 바이러스의 능력은 이들이 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)에 외래 핵산을 전달하기 위한 매력적인 후보로 만들었다. 본 발명의 특정 측면의 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재된다.
레트로바이러스는 숙주 게놈에 그들의 유전자를 통합시켜, 다량의 외래 유전 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특수한 세포주에 패키징되는 그들의 능력으로 인해 유전자 전달 벡터로서 유망성을 갖는다 (Miller, 1992).
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 핵산은 복제-결함성인 바이러스를 생산하기 위해 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 삽입된다. 비리온을 생산하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 패키징 성분을 갖지 않는 패키징 세포주가 구축된다 (Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 특수한 세포주에 (예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해) 도입시킬 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드 (즉, 벡터 게놈)의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징되게 한 다음, 배양 배지로 분비된다 (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의적으로 농축시키고, 유전자 전달을 위해 사용한다. 벡터 입자 표면을 덮기 위해 사용되는 외피 단백질의 향성에 따라, 레트로바이러스 벡터는 광범위하게 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다 (Paskind et al., 1975).
렌티바이러스는 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 외에도 조절성 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복잡한 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어있다 (예를 들어, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; Giry-Laterriere et al., 2011; 미국 특허 6,013,516 및 5,994,136 참고).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 핵산 서열의 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 발현 모두를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 적합한 숙주 세포는 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env, 뿐만 아니라 rev를 운반하는 2개 이상의 벡터로 형질감염되고, 이는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,994,136에 기재되어 있다.
C. 핵산 전달
핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA를 본 발명에 의해 재프로그래밍되는 세포에 도입시키는 것은 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 세포의 형질전환을 위한 임의의 적합한 핵산 전달 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법에는 예컨대 생체외 형질감염 (Wilson et al., 1989, Nabel et al., 1989)에 의한, 주사 (미국 특허 번호 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 각각은 본원에 참고로 포함됨), 예컨대 미량주사 (Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 번호 5,789,215, 본원에 참고로 포함됨)에 의한; 전기천공 (미국 특허 번호 5,384,253, 본원에 참고로 포함됨; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984)에 의한; 인산칼슘 침전 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)에 의한; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜 (Gopal, 1985)을 사용하여; 직접적인 음파 로딩 (Fechheimer et al., 1987)에 의한; 리포솜 매개된 형질감염 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) 및 수용체-매개된 형질감염 (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)에 의한; 미세발사체 폭격 (PCT 출원 번호 WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 번호 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880, 각각은 본원에 참고로 포함됨)에 의한; 탄화규소 섬유와의 진탕 (Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 번호 5,302,523 및 5,464,765, 각각은 본원에 참고로 포함됨)에 의한; 아그로박테리움-매개된 형질전환 (미국 특허 번호 5,591,616 및 5,563,055, 각각은 본원에 참고로 포함됨)에 의한; 건조/억제-매개된 DNA 흡수 (Potrykus et al., 1985)에 의한 및 이들 방법의 임의의 조합에 의한 DNA의 직접적인 전달이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예컨대 이들 기술의 적용을 통해, 세포 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)이 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될수 있다.
2. 리포솜-매개된 형질감염
본 발명의 특정 실시양태에서, 핵산은 예를 들어 리포솜과 같은 지질 복합체에 포획될 수 있다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포 구조이다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 인지질이 과량의 수성 용액에 현탁될 때, 이들이 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐된 구조가 형성되기 전에 자자 재배열을 겪고, 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh and Bachhawat, 1991). 리포펙타민 (깁코 비알엘(Gibco BRL)) 또는 수퍼펙트 (퀴아젠(Qiagen))와 복합체화된 핵산 또한 고려된다. 사용된 리포솜의 양은 사용된 리포솜 뿐만 아니라 세포의 성질에 따라 달라질 수 있고, 예를 들어 100만 내지 1000만개의 세포당 약 5 내지 약 20 ㎍ 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
시험관내에서 외래 DNA의 리포솜-매개된 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). 배양된 병아리 배아, HeLa 및 간암 세포에서 외래 DNA의 리포솜-매개된 전달 및 발현의 가능성 또한 입증되었다 (Wong et al., 1980).
본 발명의 특정 실시양태에서, 리포솜은 혈구응집 바이러스 (HVJ)와 복합체화될 수 있다. 이는 세포 막과의 융합을 용이하게 하고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 진입을 촉진시키는 것으로 나타났다 (Kaneda et al., 1989). 다른 실시양태에서, 리포솜은 핵 비-히스톤 염색체 단백질 (HMG-1)과 복합화되거나 또는 함께 이용될 수 있다 (Kato et al., 1991). 또 다른 추가의 실시양태에서, 리포솜은 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 복합화되거나 또는 함께 이용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다.
3. 전기천공
본 발명의 특정 실시양태에서, 핵산은 전기천공을 통해 세포 소기관, 세포, 조직 또는 유기체에 도입된다. 전기천공은 세포 및 DNA의 현탁액을 고전압 전기 방전에 노출시키는 것을 수반한다. 수용자 세포를 기계적 창상에 의한 형질전환에 더욱 민감하게 만들 수 있다. 또한, 사용되는 벡터의 양은 사용되는 세포의 성질에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 100만 내지 1000만개의 세포당 약 5 내지 약 20 ㎍ 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
전기천공을 이용하는 진핵생물 세포의 형질감염은 매우 성공적이었다. 이러한 방식으로 마우스 pre-B 림프구를 인간 카파-이뮤노글로불린 유전자로 형질감염시켰고 (Potter et al., 1984), 래트 간세포를 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 형질감염시켰다 (Tur-Kaspa et al., 1986).
4. 인산칼슘
본 발명의 다른 실시양태에서, 핵산은 인산칼슘 침전을 이용하여 세포에 도입된다. 이 기술을 이용하여 인간 KB 세포를 아데노바이러스 5 DNA로 형질감염시켰다 (Graham and Van Der Eb, 1973). 또한, 이러한 방식으로, 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포를 네오마이신 마커 유전자로 형질감염시켰고 (Chen and Okayama, 1987), 래트 간세포를 다양한 마커 유전자로 형질감염시켰다 (Rippe et al., 1990).
5. DEAE-덱스트란
또 다른 실시양태에서, 핵산은 DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포에 전달된다. 이러한 방식으로, 리포터 플라스미드를 마우스 골수종 및 적백혈병 세포에 도입하였다 (Gopal, 1985).
D. 세포 배양
일반적으로, 본 발명의 세포를 세포 성장을 지속시킬 수 있는 영양분-풍부 완충된 용액인 배양 배지에서 배양한다.
본원에 기재된 방법에 따라 줄기 세포를 단리하고, 확장시키고, 분화시키는데 적합한 배양 배지에는 고글루코스 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지 (DMEM), DMEM/F-12, 리보비츠 L-15, RPMI 1640, 이스코베 변형된 둘베코 배지 (IMDM), 및 옵티-멤(Opti-MEM) SFM (인비트로겐 인크.(Invitrogen Inc.))이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 화학적으로 정의된 배지는 인간 혈청 알부민, 인간 Ex Cyte 지단백질, 트랜스페린, 인슐린, 비타민, 필수 및 비-필수 아미노산, 피루브산나트륨, 글루타민으로 보충된 최소 필수 배지, 예컨대 이스코베 변형된 둘베코 배지 (IMDM) (깁코)를 포함하며, 미토겐 또한 적합하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 미토겐은 세포의 세포 분열을 자극하는 작용제를 지칭한다. 작용제는 일반적으로 세포 분열을 시작하도록 하여 유사분열을 촉발시키는 일부 형태의 단백질인 화학물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 무혈청 배지, 예컨대 미국 특허 번호 5,908,782 및 WO96/39487에 기재된 것들, 및 미국 특허 번호 5,486,359에 기재된 "완전 배지"는 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 10% 태아 소 혈청 (FBS), 인간 자가 유래 혈청, 인간 AB 혈청, 또는 헤파린 (2 U/mL)으로 보충된 혈소판 풍부 혈장으로 보충된다. 세포 배양물은 배양물 유체의 pH를 유지하기 위해 CO2 분위기, 예를 들어 5% 내지 12%에서 유지되고, 습한 분위기에서 37℃에서 인큐베이션하고, 85% 미만의 전면생장을 유지하도록 계대시킬 수 있다.
VI. 면역 이펙터 세포
면역 이펙터 세포는 T 세포 (예를 들어, 조절성 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), 천연 킬러 (NK) 세포, 불변 NK 세포, 또는 NKT 세포일 수 있다. 면역 이펙터 세포를 생산하고 조작하는 방법, 뿐만 아니라 입양 세포 요법을 위해 세포를 사용하고 투여하는 방법 또한 본원에서 제공되며, 이 경우에 세포는 자가 유래 또는 동종이계일 수 있다. 따라서, 면역 이펙터 세포는 면역요법으로서, 예컨대 암 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
면역 이펙터 세포는 대상체, 특히 인간 대상체로부터 단리될 수 있다. 면역 이펙터 세포는 관심 대상체, 예컨대 특정한 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심되는 대상체, 특정한 질환 또는 상태에 대한 소인을 가진 것으로 의심되는 대상체, 특정한 질환 또는 상태에 대한 요법을 진행중인 대상체, 건강한 지원자 또는 건강한 공여자인 대상체, 또는 혈액 은행으로부터 수득될 수 있다. 면역 이펙터 세포는 임의의 조직 또는 장기로부터 수집되고, 농축되고/거나, 정제될 수 있으며, 이들은 혈액, 재대혈, 비장, 흉선, 림프절, 골수, 수술 절차 동안에 제거 및/또는 노출된 조직, 및 생검 절차를 통해 수득된 조직을 비롯하여 이로 제한되지 않는 대상체에서 잔류한다. 단리된 면역 이펙터 세포는 직접적으로 사용될 수 있거나, 또는 이들은 예컨대 냉동에 의해 소정 기간 동안 보관될 수 있다.
면역 이펙터 세포가 농축되고, 단리되고/거나, 정제되는 조직/장기는 살아있는 및 살아있지 않은 대상체 둘 다로부터 단리될 수 있으며, 살아있지 않은 대상체는 장기 공여자이다. 제대혈로부터 단리된 면역 이펙터 세포는 예컨대 CD4- 또는 CD8-양성 T 세포 현탁액에 의해 측정되는 증강된 면역조절 능력을 가질 수 있다. 면역 이펙터 세포는 증강된 면역조절 능력을 위해 풀링된 혈액, 특히 풀링된 제대혈로부터 단리될 수 있다. 풀링된 혈액은 2가지 이상의 공급원, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지 또는 그 초과의 공급원 (예를 들어, 공여자 대상체)으로부터의 것일 수 있다.
면역 세포의 집단은 치료를 필요로 하거나 또는 감소된 면역 이펙터 세포 활성과 연관된 질환을 앓고 있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 따라서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에 대해 자가 유래일 것이다. 대안적으로, 면역 이펙터 세포의 집단은 공여자, 바람직하게는 동종이계 공여자로부터 수득될 수 있다. 동종이계 공여자 세포는 인간-백혈구-항원 (HLA)-적합성일 수 있거나 또는 아닐 수 있다. 대상체-적합성이 되게 하도록, 동종이계 세포는 면역원성을 감소시키기 위해 처리될 수 있다.
면역 이펙터 세포의 공급원은 동종이계 및 자가 유래 공급원 둘 다를 포함한다. 일부 경우에, 면역 이펙터 세포는 줄기 세포 또는 유도된 전능성 줄기 세포 (iPSC)로부터 분화될 수 있다. 따라서, 실시양태에 따라 조작하기 위한 세포는 제대혈, 말초 혈액, 인간 배아 줄기 세포, 또는 iPSC로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 동종이계 T 세포는 키메라 항원 수용체를 포함하도록 (그리고 임의적으로, 기능성 TCR 및/또는 MHC가 결여되도록) 변형될 수 있다. 일부 측면에서, 면역 이펙터 세포는 일차 인간 T 세포, 예컨대 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), G-CSF로 자극 후에 수집된 PBMC, 골수, 또는 제대혈로부터 유래된 T 세포이다. 형질감염 또는 형질도입 후에 (예를 들어, CAR 발현 구축물에 의해), 세포는 즉시 주입될 수 있거나 또는 보관될 수 있다. 특정 측면에서, 형질감염 후에, 세포로 유전자를 전달한 후 약 1, 2, 3, 4, 5일 또는 그 초과 내에 세포는 벌크 집단으로서 생체외에서 수일, 수주 또는 수개월 동안 전파될 수 있다. 추가의 측면에서, 형질감염 후에, 형질감염체를 클로닝하고, 단일 통합된 또는 에피솜으로 유지된 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재, 및 키메라 항원 수용체의 발현을 입증하는 클론은 생체외에서 확장된다. 확장을 위해 선택된 클론은 항원-발현 표적 세포를 특이적으로 인식하고 용해시키는 능력을 입증한다. 재조합 T 세포는 IL-2, 또는 공통 감마-쇄에 결합하는 다른 시토카인 (예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 등)으로 자극시킴으로써 확장될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포로 자극시킴으로써 확장될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD3을 가교하는 항체, 예컨대 OKT3에 의해 확장될 수 있다. 재조합 T 세포의 서브세트는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD52에 결합하는 항체, 예컨대 캄파트(Campath)에 의해 제거될 수 있다. 추가의 측면에서, 유전자 변형된 세포는 동결보존될 수 있다.
추가의 측면에서, 실시양태의 면역 이펙터 세포는 높은 미토콘드리아 예비 호흡 용량 (SRC)을 위해 선택되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, "높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 이펙터 세포"는 상응하는 평균 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T-세포)에 비해 더 높은 미토콘드리아 활성 또는 미토콘드리아 수를 갖는 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T-세포)를 지칭한다. 따라서, 일부 측면에서, 실시양태의 세포 조성물은 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 CAR-발현 T-세포의 집단을 포함한다.
높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 이펙터 세포, 예컨대 CD8+ T 세포는 스트레스 조건, 예컨대 높은 종양 부담, 저산소, 당분해를 위한 영양분의 부족, 또는 억제성 시토카인 환경 동안에 낮은 SRC를 갖는 세포에 비해 증강된 생존을 나타낼 수 있다. 더욱이, 높은 미토콘드리아 SRC를 위해 선택된 면역 이펙터 세포는 심지어 스트레스 조건 하에서도 세포독성 활성을 유지할 수 있다. 따라서, 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 이펙터 세포를 선택함으로써 요법 및 CAR 구축물의 시험 둘 다를 위해 개선된 세포 조성물이 생산될 수 있다.
한 측면에서, 트랜스제닉 이펙터 세포의 미토콘드리아 SRC를 결정하기 위해 사용될 수 있는 리포터를 포함하는 트랜스제닉 면역 이펙터 세포가 제공된다. 예를 들어, 트랜스제닉 세포는 미토콘드리아 국재화 신호에 연결된 리포터 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터는 형광 폴리펩티드, 예컨대 증강된 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)일 수 있고, 미토콘드리아 국재화 신호는 글루타레독신 (Grx2)으로부터의 것일 수 있다. 이러한 맥락에서, 형광 리포터는 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 CAR+ T 세포를 확인한다. 예를 들어, 리포터를 발현하는 트랜스제닉 세포는 강도 형광을 기반으로 하여 분류될 수 있고, 생체내 종양 사멸을 위해 주입될 수 있다. 마찬가지로, 트랜스제닉 세포는 예를 들어 후보 CAR 폴리펩티드의 치료적 효과를 결정하기 위해 표적 세포의 생체외 사멸에 대해 시험할 수 있다.
일부 측면에서, 실시양태에 따라 사용하기 위한 미토콘드리아 리포터 유전자는 내인성 유전자일 수 있다. 추가의 측면에서, 미토콘드리아 리포터 유전자는 외인성 유전자, 예컨대 형광 리포터 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 일부 측면에서, 형광 리포터 단백질은 미토콘드리아 국재화 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 높은 SRC를 갖는 면역 이펙터 세포를 선택하는 방법은 유세포 분석 또는 FACS를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, SRC를 갖는 면역 이펙터 세포를 확인하기 위한 리포터 유전자의 발현은 핵 프로모터 (예를 들어, hEF1a)의 제어 하에 있을 수 있다. 특정 측면에서, 리포터 유전자의 발현은 미토콘드리아 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 특정 측면에서, 발현된 리포터 단백질은 미토콘드리아 국재화 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 발현된 리포터 단백질은 세포 표면으로 지시될 수 있다. 특정 측면에서, 리포터 유전자의 발현은 미토콘드리아 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 발현된 리포터 단백질은 세포 표면으로 지시될 수 있다. 일부 측면에서, 외인성 리포터 유전자는 트랜스포손 반복부 또는 바이러스 LTR에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 측면에서, 외인성 리포터 유전자는 염색체외 핵산, 예컨대 mRNA 또는 에피솜 벡터에 포함될 수 있다.
VII. 면역 이펙터 세포를 전파시키는 방법
일부 경우에, 실시양태의 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T-세포)는 세포 확장을 보조하기 위해 활성화 및 전파 세포 (AaPC)와 함께 공동-배양된다. 예를 들어, 항원 제시 세포 (APC)는 실시양태의 치료적 조성물 및 세포 요법 산물을 제조하는데 유용하다. 항원-제시 시스템의 제조 및 사용과 관련한 일반적인 지침에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 6,362,001 및 6,790,662; 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0017000 및 2009/0004142; 및 국제 공개 번호 WO2007/103009를 참고하며, 이들 각각은 참고로 포함된다.
일부 경우에, AaPC는 관심 항원 (예를 들어, CoV 스파이크 단백질)을 발현한다. 추가로, 일부 경우에, APC는 특이적 CAR 폴리펩티드 또는 일반적으로 CAR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 발현할 수 있다 (예를 들어, 범용 활성화 및 전파 세포 (uAPC). 이러한 방법은 국제 (PCT) 특허 공개 번호 WO/2014/190273에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 관심 항원 외에도, AaPC 시스템 또한 적어도 하나의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 이용될 수 있다. 보조 분자는 보조 분자, 예컨대 공동-자극 분자 및 부착 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공동-자극 분자에는 CD70 및 B7.1 (B7.1은 이전에는 B7로 공지되었고, CD80으로도 공지됨)이 포함되고, 이들은 다른 것들 중에서 T 세포 표면 상의 CD28 및/또는 CTLA-4 분자에 결합하여, 예를 들어 T-세포 확장, Th1 분화, 단기간 T-세포 생존, 및 시토카인 분비, 예컨대 인터류킨 (IL)-2에 영향을 미친다 (Kim et al., 2004 참고). 부착 분자에는 탄수화물-결합 당단백질, 예컨대 셀렉틴, 막횡단 결합 당단백질, 예컨대 인테그린, 칼슘-의존성 단백질, 예컨대 카드헤린, 및 단일-통과 막횡단 이뮤노글로불린 (Ig) 수퍼패밀리 단백질, 예를 들어 세포-대-세포 또는 세포-대-매트릭스 접촉을 촉진시키는 세포내 부착 분자 (ICAM)가 포함될 수 있다. 예시적인 부착 분자에는 LFA-3 및 ICAM, 예컨대 ICAM-1이 포함된다. 공동-자극 분자 및 부착 분자를 비롯하여 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기술, 방법 및 시약은 예를 들어 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 및 6,362,001에 예시되며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
AaPC가 되도록 선택된 세포는 바람직하게는 세포내 항원-프로세싱, 세포내 펩티드 트래피킹, 및/또는 세포내 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자-펩티드 로딩에 결함이 있거나, 또는 변온성이거나 (즉, 포유동물 세포주보다 온도 문제에 덜 민감함), 또는 결함 및 변온성 성질 둘 다를 갖는다. 바람직하게는, AaPC가 되도록 선택된 세포 또한 외인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및 세포에 도입된 보조 분자 성분에 대한 적어도 하나의 내인성 대응물 (예를 들어, 내인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및/또는 상기 기재된 내인성 보조 분자)을 발현하는 능력이 부족하다. 추가로, AaPC는 바람직하게는 AaPC를 생성하기 위한 그들의 변형 이전에 세포가 갖고 있던 결함 및 변온성 성질을 유지한다. 예시적인 AaPC는 항원 프로세싱 (TAP)-결핍 세포주, 예컨대 곤충 세포주와 연관된 수송체 구성하거나 또는 그로부터 유래된다. 예시적인 변온성 곤충 세포주는 초파리 세포주, 예컨대 슈나이더(Schneider) 2 세포주이며 (예를 들어, Schneider 1972 참고), 슈나이더 2 세포의 제조, 성장 및 배양에 대한 예시적인 방법은 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 및 6,362,001에서 제공된다.
한 실시양태에서, AaPC는 또한 냉동-해동 주기에 적용된다. 예시적인 냉동-해동 주기에서, 냉동이 급속하게 발생하도록 AaPC를 함유하는 적합한 용기를 적절한 양의 액체 질소, 고체 이산화탄소 (즉, 드라이 아이스), 또는 유사한 저온 물질과 접촉시킴으로써 AaPC를 냉동시킬 수 있다. 이어서, 냉동된 APC를 저온 물질로부터 AaPC를 제거하고, 주위 실온 조건에 노출시킴으로써, 또는 해동 시간을 더 단축시키기 위해 미지근한 수조 또는 따뜻한 손이 이용되는 촉진된 해동 과정에 의해 해동된다. 추가로, AaPC는 냉동될 수 있고, 해동하기 전에 장기간 동안 보관될 수 있다. 냉동된 AaPC를 해동시킨 다음, 추가로 사용하기 전에 동결건조시킬 수 있다. 바람직하게는, 냉동-해동 절차에 유해한 영향을 미칠 수 있는 보존제, 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 다른 보존제는 냉동-해동 주기를 겪는 AaPC를 함유하는 배지에 부재하거나, 또는 예컨대 이러한 보존제가 본질적으로 없는 배지로 AaPC를 전달함으로써 본질적으로 제거된다.
추가의 실시양태에서, 외인성 핵산 및 AaPC에 대한 내인성 핵산은 가교에 의해 불활성화될 수 있으며, 따라서 불활성화 후에 핵산의 세포 성장, 복제 또는 발현이 본질적으로 일어나지 않는다. 한 실시양태에서, AaPC는 외인성 MHC 및 보조 분자의 발현, AaPC의 표면 상에서 이러한 분자의 제시 및 선택된 펩티드 또는 펩티드들과 함께 제시된 MHC 분자의 로딩 이후 시점에서 불활성화된다. 따라서, 이러한 불활성화되고 선택된 펩티드 로딩된 AaPC는 본질적으로 증식 또는 복제할 수 없게 되지만, 선택된 펩티드 제시 기능을 유지한다. 바람직하게는, 가교는 또한 AaPC의 항원-제시 세포 기능을 실질적으로 감소시키지 않으면서 오염 미생물, 예컨대 박테리아 및 바이러스를 본질적으로 갖지 않는 AaPC를 생성한다. 따라서, 가교는 AaPC를 사용하여 개발된 세포 요법 산물의 안전성에 대한 우려를 완화시키는데 도움을 주면서 중요한 AaPC 기능을 유지시킨다. 가교 및 AaPC와 관련된 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20090017000을 참고하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
VIII. 치료적 적용
일부 측면에서, 실시양태의 CAR 가교 단백질 및 키메라 항원 수용체 구축물 및 세포는 코로나바이러스 감염을 가졌거나 또는 가진 것으로 의심되는 대상체에서 적용된다. 사용될 수 있는 적합한 면역 이펙터 세포에는 세포독성 림프구 (CTL)가 포함된다. 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 대상체로부터 이들 세포를 단리하기 위해 다양한 방법이 용이하게 이용가능하다. 예를 들어, 세포 표면 마커 발현을 이용하거나 또는 상업적으로 입수가능한 키트 (예를 들어, 이소셀(ISOCELL)™, 피어스(Pierce, 일리노이주 록포드)를 사용한다.
형질감염된 또는 형질도입된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)가 원하는 조절에 의해 및 원하는 수준으로 표면 막 단백질로서 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있다는 것이 확립되면, 키메라 항원 수용체가 원하는 신호 유도를 제공하기 위해 숙주 세포에서 기능성인지 여부를 결정할 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 면역 이펙터 세포는 대상체에서 항종양 반응을 활성화시키기 위해 대상체에게 재도입되거나 또는 투여된다. 투여를 용이하게 하기 위해, 실시양태에 따른 형질도입된 T 세포는 추가로 제약상 허용가능할 수 있는 적절한 담체 또는 희석제와 함께 제약 조성물로 제조될 수 있거나 또는 생체내 투여에 적절한 이식편으로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 또는 이식편을 제조하는 수단은 관련 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed., 1980] 참고). 적절한 경우, 형질도입된 T 세포는 반고체 또는 액체 형태의 제제, 예컨대 캡슐, 용액, 주사, 흡입제 또는 에어로졸로 그들 각각의 투여 경로에 대해 일반적인 방식으로 제형화될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 수단을 이용하여, 표적 조직 또는 장기에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지하거나 또는 최소화할 수 있거나, 또는 조성물의 적시 방출을 보장할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 무력화시키지 않는 제약상 허용가능한 형태가 이용된다. 따라서, 바람직하게는 형질도입된 T 세포는 균형 염 용액, 바람직하게는 행크스 균형 염 용액, 또는 일반 식염수를 함유하는 제약 조성물로 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 실시양태의 CAR-발현 세포는 그를 필요로 하는 개체, 예컨대 암 또는 감염을 가진 개체에게 전달된다. 이어서, 세포는 각각의 암 또는 병원체-감염된 세포를 공격하기 위해 개체의 면역계를 증강시킨다. 일부 경우에, 개체는 항원-특이적 CAR 세포의 하나 이상의 용량을 제공받는다. 개체가 항원-특이적 CAR 세포의 2회 이상의 용량을 제공받는 경우, 투여 사이의 기간은 개체에서 증식을 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하고, 구체적인 실시양태에서 투여 사이의 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과이다. 치료 효과에 적합한 용량은 예를 들어 바람직하게는 일련의 투약 주기에서 용량당 적어도 105 또는 약 105 내지 약 1010개 세포이다. 예시적인 투약 레지멘은 0일째에 적어도 약 105개 세포에서 시작하여, 예를 들어 환자내 용량 상승 방식을 개시한지 몇주 내에 약 1010개 세포의 목료 용량으로 점진적으로 증가시키는, 상승 용량의 4회의 1주 투약 주기로 구성된다. 적합한 투여 방법에는 정맥내, 피하, 강내 (예를 들어 저장소-접근 기기에 의해), 복강내, 및 종양 덩어리로의 직접적인 주사가 포함된다.
특정 실시양태에서, CAR-발현 세포는 그를 필요로 하는 개체에게 가교 단백질의 전달 전에 전달된다. 일부 경우에, CAR-발현 세포 및 가교 단백질의 투여 사이의 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월 또는 그 초과일 수 있다. 일부 경우에, 개체는 CAR-발현 세포 및/또는 가교 단백질의 1회 이상의 용량을 제공받는다. 개체가 CAR-발현 세포 및/또는 가교 단백질의 2회 이상의 용량을 제공받는 경우, 용량의 투여 사이의 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과일 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR-발현 세포는 그를 필요로 하는 개체에게 가교 단백질의 전달 후에 전달된다. 일부 경우에, 가교 단백질 및 CAR-발현 세포의 투여 사이의 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월 또는 그 초과일 수 있다. 일부 경우에, 개체는 CAR-발현 세포 및/또는 가교 단백질의 1회 이상의 용량을 제공받는다. 개체가 CAR-발현 세포 및/또는 가교 단백질의 2회 이상의 용량을 제공받는 경우, 용량의 투여 사이의 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과일 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR-발현 세포는 그를 필요로 하는 개체에게 가교 단백질의 전달과 동시에 전달된다. 일부 경우에, 개체는 CAR-발현 세포 및/또는 가교 단백질의 1회 이상의 용량을 제공받는다. 두번째 이상의 전달은 CAR-발현 세포 단독, 가교 단백질 단독, 또는 이들 둘의 조합일 수 있다. 개체가 CAR-발현 세포 및/또는 가교 단백질의 2회 이상의 용량을 제공받는 경우, 용량의 투여 사이의 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과일 수 있다.
일부 경우에, CAR-발현 세포로 이전에 치료된 적이 있는 환자는 CAR-발현 세포의 이펙터 기능을 재지시하기 위해 가교 단백질로 치료될 수 있다. 일부 경우에, CAR-발현 세포 및 가교 단백질로 이전에 치료된 적이 있는 환자는 CAR-발현 세포의 이펙터 기능을 재지시하기 위해 상이한 가교 단백질로 치료될 수 있다. 이는 환자에서 새로운 종양 또는 새로운 감염을 치료하기 위해 수행될 수 있다. 이는 항원 소실의 경우에 수행될 수 있다.
임의의 제공된 실시양태에서, 환자는 CAR-발현 세포의 이펙터 기능을 다중 표적에 대해 지시하기 위해 1개 초과의 가교 단백질로 치료될 수 있다.
실시양태의 제약 조성물 (예를 들어, CAR-발현 T-세포를 포함함)은 단독으로 또는 암을 치료하는데 유용한 다른 널리 확립된 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 단독으로 전달되든지 또는 다른 작용제와 조합되어 전달되든지, 실시양태의 제약 조성물은 포유동물, 특히 인간 신체에서 다양한 경로를 통해 및 다양한 부위로 전달되어, 특정한 효과를 달성할 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 비록 1가지 초과의 경로가 투여를 위해 이용될 수 있지만, 특정한 경로가 또 다른 경로에 비해 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 흑색종의 치료를 위해 피내 전달이 이용될 수 있다. 국소 또는 전신 전달은 체강으로 제형의 적용 또는 적하, 에어로졸의 흡입 또는 취입을 포함하는 투여에 의해, 또는 근육내, 정맥내, 문맥내, 간내, 복막, 피하 또는 피내 투여를 포함하는 비경구 적용에 의해 달성될 수 있다.
실시양태의 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 각각의 투여 단위, 예를 들어 주사는 예정된 양의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성 작용제와의 적절한 조합물로 함유한다. 본원에서 사용된 용어 단위 투여 형태는 인간 및 동물 대상체에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 원하는 효과를 생성하는데 충분한 양으로 계산된 예정된 양의 실시양태의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성 작용제와의 조합물로 적절한 경우 제약상 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 함유한다. 실시양태의 단위 투여 형태에 대한 사양은 특정한 대상체에서 제약 조성물과 연관된 특정한 약력학에 따라 좌우된다.
바람직하게는, 유효량 또는 충분한 수의 단리된 형질도입된 T 세포가 조성물에 존재하며, 대상체에게 투여되어, 장기간 특이적 항종양 반응이 확립되어, 이러한 치료의 부재시에 발생하는 것보다 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양 성장 또는 재성장을 제거하도록 한다. 바람직하게는, 대상체에게 재도입되는 형질도입된 T 세포의 양은 형질도입된 T 세포가 존재하지 않는 달리 동일한 조건과 비교할 때 종양 크기에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 감소를 유발한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항종양 유효량"은 대상체에서 암 세포 또는 종양 성장을 감소시키기 위한 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 유효량을 지칭한다.
따라서, 투여되는 형질도입된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포)의 양은 투여 경로를 고려해야 하고, 충분한 수의 형질도입된 면역 이펙터 세포가 원하는 치료적 반응을 달성하도록 도입되게 해야 한다. 추가로, 본원에 기재된 조성물에 포함되는 각각의 활성 작용제의 양 (예를 들어, 접촉하는 각각의 세포당 양 또는 특정 체중당 양)은 상이한 적용에서 달라질 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농도는 바람직하게는 치료할 대상체에서 적어도 약 1 x 106 내지 약 1 x 109개의 형질도입된 T 세포, 훨씬 더 바람직하게는 약 1 x 107 내지 약 5 x 108개의 형질도입된 T 세포를 제공하는데 충분해야 하지만, 임의의 적합한 양이 높게, 예를 들어 5 x 108개의 세포 초과로, 또는 낮게, 예를 들어 1 x 107개의 세포 미만으로 사용될 수 있다. 투약 스케줄은 널리 확립된 세포-기반 요법을 기반으로 할 수 있거나 (예를 들어, Topalian and Rosenberg, 1987; 미국 특허 번호 4,690,915 참고), 또는 대안적인 연속 주입 전략이 이용될 수 있다.
이들 값은 실시양태의 방법을 최적화할 때 의사에 의해 사용되는 형질도입된 T 세포의 범위의 일반적인 지침을 제공한다. 본원에서 이러한 범위의 인용은 특정한 적용에서 보증될 수 있는 바와 같이 더 높은 또는 적은 양의 성분의 사용을 결코 배제하지 않는다. 예를 들어, 실제 용량 및 스케줄은 조성물이 다른 제약 조성물과 조합되어 투여되는지 여부에 따라, 또는 약동학, 약물 배치 및 대사에서 개체간 차이에 따라 달라질 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 특정한 상황의 긴급성에 따라 임의의 필요한 조정을 용이하게 수행할 수 있다.
IX. 실시양태의 키트
본원에 기재된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR 가교 단백질 및/또는 CAR-발현 면역 이펙터 세포는 세포를 확장시키는데 적합한 시약, 예컨대 배지, APC, 조작된 APC, 성장 인자, 항체 (예를 들어, CAR-발현 세포의 분류 또는 특징분석을 위해) 및/또는 트랜스진을 코딩하는 플라스미드를 또한 포함할 수 있는 키트에 제공된다.
비제한적인 예에서, 키메라 항원 수용체 발현 구축물, 키메라 항원 수용체 발현 구축물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 발현 구축물의 형질감염을 위한 세포, 및/또는 발현 구축물의 형질감염을 위해 동종이계 세포를 수득하기 위한 하나 이상의 장비 (이러한 장비는 시린지, 피펫, 겸자, 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 장치일 수 있음).
일부 실시양태에서, 내인성 TCR α/β 발현 및/또는 MHC 발현을 제거하기 위한 발현 구축물 (예를 들어, 베타-2 마이크로글로불린), 구축물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 및/또는 CAR+ 세포가 키트에 제공된다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)을 코딩하는 발현 구축물이 포함된다.
일부 측면에서, 키트는 세포의 전기천공을 위한 시약 또는 장치를 포함한다.
키트는 실시양태의 하나 이상의 적합하게 분취된 조성물 또는 실시양태의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질에서 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 컨테이너 수단은 적어도 하나의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 보틀, 시린지, 또는 다른 컨테이너 수단을 포함할 수 있고, 여기에 성분이 배치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있다. 키트에 1종 초과의 성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 제2, 제3 또는 다른 추가의 컨테이너를 함유할 것이고, 여기에 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있다. 그러나, 성분들의 다양한 조합물이 바이알에 포함될 수 있다. 실시양태의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 밀폐된 구획에서 키메라 항원 수용체 구축물을 함유하기 위한 수단 및 임의의 다른 시약 컨테이너를 포함할 것이다. 이러한 컨테이너는 예를 들어 원하는 바이알이 보유되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다.
X. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 그의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 관련 기술분야의 기술자가 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 기술자는 본 개시내용에 비추어 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 개시된 특정 실시양태에서 여러 변화가 이루어질 수 있고, 여전히 비슷한 또는 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1 - CAR-항원 가교 단백질의 구축
본 발명자들은 HIV-특이적 CAR T 세포를 종양 세포 상에서 발현된 항원에 대해 재지시하여, 이들 표적 세포의 사멸을 입증하기 위해 가교 단백질을 개발하고자 하였다. 이를 위해, 가교 단백질은 gp120t를 항원 결합 도메인, 예컨대 관심 표적 항원에 결합하는 항체에 접합시키거나 또는 융합시킴으로써 생성되었다.
A. 방법론
구축물 설계 및 분자 클로닝. 항-HIV CAR T 세포는 HIV 외피 (env, gp120) 단백질을 인식하는 말단절단된 CD4 (CD4t) 세포외 도메인 (CAR4)의 사용을 기반으로 하여 이전에 개발되었다. 4개의 이뮤노글로불린 도메인 (D1 내지 D4)을 함유하는 전장 CD4 당단백질과는 달리, CD4t는 D1 및 D2 도메인으로 이루어진 말단절단된 CD4 단백질을 사용한다. 따라서, CAR-변형된 세포는 감염된 세포 상의 HIV env에 결합할 것이다. 본질적인 CAR4 설계는 도 5에 제시된다.
렌티바이러스 벡터 생산. 렌티바이러스 벡터는 HEK293T 세포를 CAR-운반 플라스미드, 뿐만 아니라 렌티바이러스 패키징 플라스미드 PAX2 및 VSVg로 형질감염시킴으로써 생산되었다. 세포 배양 배지를 4-6시간에 보충하고, 후속적으로 바이러스 입자 수집을 위해 12-24-48시간에 수확하였다. 배양 배지를 수집하고, 여과하여 세포 잔해를 제거하고, 초원심분리 (19,500 rpm, 2시간)를 이용하여 바이러스 입자를 농축시켰다. 농축된 렌티바이러스 벡터의 최종 분취액을 -80℃에서 보관하였다. 기능적 바이러스 벡터 역가는 희석 범위에 걸쳐 HT1080 세포를 형질도입시키고, RQR8을 발현하는 세포의 백분율을 측정함으로써 평가되었다.
세포 및 세포주. 일차 T 세포를 제네바 대학 병원 수혈 센터(Blood Transfusion Centre of the University Hospital of Geneva)로부터 입수한 익명화된 버피 코트 혈액 단위로부터 준비하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 피콜(Ficoll)을 사용하여 단리하였고, T 세포는 밀테니(Miltenyi) CD4/CD8 마이크로비드를 사용하여 분리하고, 액체 질소에서 분취액으로 동결보존하였다. 이들 원리 증명 연구에서, CD117을 발현하도록 형질도입된 HL-60 세포를 표적 세포로서 사용하였다.
CAR T 세포 제조. 동결보존된 T 세포를 해동시키고, 밤새 TexMACS 배지에서 배양하고, 다음 날 CD3/CD28 마이크로비드 (1:1 비) 또는 트랜스액트(TransAct, 밀테니)를 사용하여 활성화시키고, 3-7의 감염 다중도 (MOI)에서 CAR 구축물로 바이러스 형질도입시켰다. 형질도입은 높은 밀도 부피 (cm2당 ml당 200만개의 세포)에서 수행되었고, 배지를 18-24시간 후에 보충하였고, 그 후에 격일로 mL당 100만개의 세포 밀도에서 T-세포를 유지시켰다.
유세포 분석은 T 세포의 형질도입 후 5-7일째에 수행하였다. 세포를 수확하고, 세척하고, FACS 완충제 (Ca/Mg2+ 무함유 PBS, 2 mM EDTA, 0.5% BSA)에서 재현탁시키고, CD34 항체 (QBEnd10)로 20-30분 동안 염색하여, 리포터 유전자 (RQR8) 발현 세포의 빈도를 평가하였다. 염색 후에, 세포를 PBS로 세척하고, FACS 완충제에서 재현탁시키고, 세포 표면 발현을 유세포 분석을 통해 평가하였다.
가교 단백질 설계 및 생산. 가교 단백질 구축물은 말단절단된 당단백질 120 (gp120t)을 IgG 및 디아바디 항체 포맷에 화학적으로 접합시키는 것을 기반으로 하여 설계되었다. 11 개 아미노산의 말단절단된 gp120 단편을 말레이미드 루프와 함께 화학적으로 합성하였다 (SSGGDPEIVTH; 서열식별번호: 6). 접합을 가능하게 하기 위해, IgG 및 디아바디 단백질을 시스테인 잔기에 의해 생산하였다. 화학적 접합은 디티오트레이톨 (DTT) 환원 및 gp120t-말레이미드 첨가에 의해 개시되었다 (도 6).
세포독성 검정. CAR4 T 세포를 1:1의 이펙터 대 표적 비에서 표적 세포와 함께 18-24시간 동안 공동-배양하였다. 접합된 항체 또한 500 nM의 최종 농도로 첨가하였다. CAR4 T 세포가 HL-60 세포 상의 종양-연관 항원 (이 경우에는 CD117)에 결합하는 능력은 공동-배양물에 남아있는 생존가능한 표적 세포의 백분율에서 비율 감소를 측정함으로써 평가되었다.
B. 결과
가교 단백질은 CD4에 결합하고, 종양 세포를 사멸시키도록 재지시된다. 본 발명자들은 먼저 gp120t의 IgG에 대한 성공적인 접합, 및 T 세포 상에서 발현된 CD4 단백질에 대한 결합을 입증하기 위해 착수하였다 (도 7a). 이를 시험하기 위해, 일차 T 세포를 다양한 농도의 IgG-접합체에 30분 동안 노출시킨 후, 미결합 IgG를 제거하기 위해 2회 세척하고, CD4-결합된 IgG 단백질의 검출을 위해 FITC-표지된 단백질 A로 염색하였다. IgG-접합체 단백질은 일차 T 세포 상에서 천연 CD4에 결합할 수 있었고, 중요하게는 항-CD4 항체를 사용하는 것과 비교할 때 CD4 양성 세포의 동등한 백분율 (각각 58.5% 및 56.9%)을 재현할 수 있었다.
다음으로, CAR4 수용체에 대한 IgG-접합체의 결합을 확증하기 위해 유사한 실험을 수행하였다 (도 7b). 이를 위해, HT1080 세포를 CAR4 구축물을 운반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고, 세포를 다양한 농도의 IgG 또는 IgG-접합된 단백질에 노출시켰다. 도 7b의 유세포 분석 히스토그램에서 나타난 바와 같이, IgG-접합된 가교 단백질을 사용할 때 FITC-표지된 단백질-A의 중간 형광 강도 (MFI)에서 명백하고 비례적인 증가가 있었지만, IgG 단독을 사용하였을 때는 관찰되지 않았다.
최종적으로, 본 발명자들은 가교 단백질이 종양 세포를 표적화하고 사멸시키도록 CAR4 T 세포를 재지시할 수 있는지를 입증하고자 하였다 (도 7c 및 7d). 이 실험에서, CD117-발현 HL-60 종양 세포를 CAR4 T-세포 (1:1 비) 및 다양한 가교 단백질 형태 (500 nM)와 공동-배양하였다. 본 발명자들은 또한 이 평가에서 gp120t와 접합된 항-CD117 디아바디를 생성하였다. 24 공동-배양 후, 대조군 (CAR4 T 세포 단독, 가교 단백질 없음)에 대해 정규화되었을 때 IgG-접합된 (65%) 및 디아바디-접합된 (90%) 가교 단백질을 사용할 때 표적 세포의 유의하게 증가된 세포독성이 관찰되었다. 이를 통해 가교 단백질이 CAR4 T-세포에 효과적으로 결합하고, 특이적 세포독성을 유발하도록 이들을 종양 세포에 대해 재지시할 수 있음이 확증되었다.
C. 요약 및 결론
이는 HIV-특이적 CAR T 세포를 관심 항원을 발현하는 종양 세포에 가교시킬 수 있는 항체 접합체가 HIV-특이적 CAR T 세포의 세포독성을 재지시하는 역할을 한다는 것을 확증한다. 결합시, CAR T 세포는 종양 세포의 효과적인 사멸을 입증하였고, 이는 디아바디-gp120t 접합체의 사용에 의해 더욱 현저하였다. 향후 실험은 B-세포 악성종양에 대한 CD19, CD20 및 CD22, 뿐만 아니라 고체 종양 상에서 발현된 항원을 비롯하여 다른 관련 종양-연관 항원에 대해 CAR4 T-세포를 재지시하는 것을 포함한다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험이 없이도 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태의 측면에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법에서 및 그의 단계에서 또는 단계의 순서에서 변동이 적용될 수 있음이 관련 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련이 있는 특정 작용제가 동일한 또는 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 작용제로 대체될 수 있음이 명백할 것이다. 관련 기술분야의 기술자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 고려된다.
참고문헌
하기 참고문헌은 본원에 제시된 것들을 보충하는 예시적인 절차 또는 다른 세부사항을 제공하는 정도로 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
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Figure pct00018
SEQUENCE LISTING <110> Antion Biosciences SA Geneva University Hospitals University of Geneva University of Zurich <120> ADAPTER MOLECULES TO RE-DIRECT CAR T CELLS TO AN ANTIGEN OF INTEREST <130> ANBO.P0005WO <140> not yet known <141> 2021-05-27 <150> US 63/030,653 <151> 2020-05-27 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1764 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2t DNA sequence (codon optimized) <400> 1 cagagcacaa ttgaggaaca ggccaagacc ttcctggaca agttcaacca cgaggccgag 60 gacctgttct accagtctag cctggccagc tggaactaca acaccaacat caccgaagag 120 aacgtgcaga acatgaacaa cgccggcgac aagtggagcg ccttcctgaa agagcagagc 180 acactggccc agatgtaccc tctgcaagag atccagaacc tgaccgtgaa gctccagctg 240 caggccctcc agcagaatgg aagctctgtg ctgagcgagg acaagagcaa gcggctgaac 300 accatcctga ataccatgag caccatctac agcaccggca aagtgtgcaa ccccgacaat 360 ccccaagagt gcctgctgct ggaacccggc ctgaatgaga tcatggccaa cagcctggac 420 tacaacgaga gactgtgggc ctgggagtct tggagaagcg aagtgggaaa gcagctgcgg 480 cccctgtacg aggaatacgt ggtgctgaag aacgagatgg ccagagccaa ccactacgag 540 gactacggcg actattggag aggcgactac gaagtgaatg gcgtggacgg ctacgactac 600 agcagaggcc agctgatcga ggacgtggaa cacaccttcg aggaaatcaa gcctctgtac 660 gagcatctgc acgcctacgt gcgggccaag ctgatgaatg cttaccccag ctacatcagc 720 cccatcggct gtctgcctgc tcatctgctg ggagacatgt ggggcagatt ctggaccaac 780 ctgtacagcc tgacagtgcc cttcggccag aaacctaaca tcgacgtgac cgacgctatg 840 gtggatcagg cctgggatgc ccagcggatc ttcaaagagg ccgagaagtt cttcgtgtcc 900 gtgggcctgc ctaatatgac ccaaggcttc tgggagaact ccatgctgac agaccccggc 960 aatgtgcaga aagccgtgtg tcatcctacc gcctgggatc tcggcaaggg cgacttcaga 1020 atcctgatgt gcaccaaagt gacgatggac gacttcctga cagcccacca cgagatgggc 1080 cacatccagt acgatatggc ctacgccgct cagcccttcc tgctgagaaa tggcgccaat 1140 gagggcttcc acgaagccgt gggagagatc atgagcctgt ctgccgccac acctaagcac 1200 ctgaagtcta tcggactgct gagccccgac ttccaagagg acaacgagac agagatcaac 1260 ttcctgctca agcaggccct gaccatcgtg ggcacactgc ccttcaccta catgctggaa 1320 aagtggcggt ggatggtctt taagggcgag atccccaagg accagtggat gaagaaatgg 1380 tgggagatga agcgcgagat cgtgggcgtt gtggaacctg tgcctcacga cgagacatac 1440 tgcgatcctg ccagcctgtt tcacgtgtcc aacgactact ccttcatccg gtactacacc 1500 cggacactgt accagttcca gtttcaagag gctctgtgcc aggccgccaa gcacgaagga 1560 cctctgcaca agtgcgacat cagcaactct acagaggccg gacagaaact gttcaacatg 1620 ctgcggctgg gcaagagcga gccttggaca ctggctctgg aaaatgtcgt gggcgccaag 1680 aatatgaacg tgcggccact gctgaactac ttcgagcccc tgttcacctg gctgaaggac 1740 cagaacaaga acagctttgt cggc 1764 <210> 2 <211> 588 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2t protein sequence <400> 2 Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn 1 5 10 15 His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn 20 25 30 Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala 35 40 45 Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln 50 55 60 Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu 65 70 75 80 Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser 85 90 95 Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr 100 105 110 Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu 115 120 125 Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg 130 135 140 Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg 145 150 155 160 Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala 165 170 175 Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val 180 185 190 Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp 195 200 205 Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His 210 215 220 Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser 225 230 235 240 Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg 245 250 255 Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro 260 265 270 Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln 275 280 285 Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro 290 295 300 Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly 305 310 315 320 Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys 325 330 335 Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe 340 345 350 Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr 355 360 365 Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His 370 375 380 Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His 385 390 395 400 Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu 405 410 415 Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr 420 425 430 Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys 435 440 445 Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys 450 455 460 Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr 465 470 475 480 Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile 485 490 495 Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu 500 505 510 Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser 515 520 525 Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly 530 535 540 Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys 545 550 555 560 Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr 565 570 575 Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly 580 585 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Fc DNA sequence <400> 3 tctgataaga cccacacctg tcctccatgt cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc 60 gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg 120 acctgcgtgg tggtggccgt gtctcacgaa gatcccgaag tgaagttcaa ttggtacgtc 180 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta cgccagcacc 240 tacagagtgg tgtccgtgct gactgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300 aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcca gctcctatcg agaaaaccat cagcaaggcc 360 aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac acactgcctc caagcaggga cgagctgacc 420 aagaatcagg tgtccctgac ctgcctggtc aagggctttt acccctccga cattgccgtg 480 gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540 agcgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 600 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 660 tccctgtctc tgagccctgg caaa 684 <210> 4 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Fc amino acid sequence <400> 4 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp120t nucleotide sequence <400> 5 tcctcaggag gggacccaga aattgtaacg cac 33 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gp120t amino acid sequence <400> 6 Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His 1 5 10 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 7 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 8 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 9 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 10 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Ser <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a transmembrane domain <400> 11 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 1 5 10 15 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn 20 25 30 <210> 12 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a hinge region <400> 12 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 20 25 30 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 35 40 <210> 13 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge-CH2-CH3 region of antibody isotype IgG4 <400> 13 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Met 225 230 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta intracellular domain <400> 14 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110

Claims (91)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질로서, (1) 항원-결합 도메인 및 (2) HIV-1 gp120 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 CAR-결합 도메인을 포함하는 CAR 가교 단백질.
  2. 제1항에 있어서, CAR-결합 도메인이 항원-결합 도메인에 화학적으로 접합되는 것인 CAR 가교 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 항원-결합 도메인이 CAR-결합 도메인에 화학적으로 접합되는 것인 CAR 가교 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 항원-결합 도메인 및 CAR-결합 도메인이 융합 단백질에 포함되는 것인 CAR 가교 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 항체 Fc 도메인을 추가로 포함하는 CAR 가교 단백질.
  6. 제5항에 있어서, Fc 도메인이 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR 가교 단백질.
  7. 제5항에 있어서, CAR-결합 도메인이 항원-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR 가교 단백질.
  8. 제5항에 있어서, Fc 도메인이 인간 Fc 도메인 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  9. 제8항에 있어서, Fc 도메인이 인간 중쇄 Fc 도메인 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  10. 제8항에 있어서, Fc 도메인이 인간 중쇄 Fc 도메인 서열의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  11. 제8항에 있어서, Fc 도메인이 야생형 인간 중쇄 Fc 도메인 서열에 비해 FcgR 수용체에 대한 결합을 방지하는 치환을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  12. 제8항에 있어서, Fc 도메인이 서열식별번호: 4에 의해 제공된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 항원 결합 도메인과 CAR-결합 도메인 사이에 링커 서열을 추가로 포함하는 CAR 가교 단백질.
  14. 제1항에 있어서, CAR-결합 도메인이 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 것인 CAR 가교 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 관심 항원과 상호작용하는 펩티드를 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 관심 항원을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 관심 항원과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합할 수 있는 것인 CAR 가교 단백질.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합할 수 있는 것인 CAR 가교 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 코로나바이러스 스파이크 단백질이 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인 CAR 가교 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 ACE2 세포외 도메인의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  23. 제22항에 있어서, ACE2 세포외 도메인의 일부분이 ACE2t 도메인인 CAR 가교 단백질.
  24. 제23항에 있어서, ACE2t 도메인이 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 적어도 1개의 링커 서열을 추가로 포함하는 CAR 가교 단백질.
  26. 제25항에 있어서, CAR 가교 단백질이 각각의 CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 링커 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 링커 서열이 GGGS의 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 6에 의해 제공된 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 가교 단백질이 동종이량체를 형성하는 것인 CAR 가교 단백질.
  30. 키메라 항원 수용체 (CAR) 가교 단백질로서, CAR-결합 도메인 및 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR 가교 단백질.
  31. 제30항에 있어서, CAR-결합 도메인이 항원-결합 도메인에 화학적으로 접합되는 것인 CAR 가교 단백질.
  32. 제30항에 있어서, 항원-결합 도메인이 CAR-결합 도메인에 화학적으로 접합되는 것인 CAR 가교 단백질.
  33. 제1항에 있어서, 항원-결합 도메인 및 CAR-결합 도메인이 융합 단백질에 포함되는 것인 CAR 가교 단백질.
  34. 제30항에 있어서, 항체 Fc 도메인을 추가로 포함하는 CAR 가교 단백질.
  35. 제34항에 있어서, Fc 도메인이 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR 가교 단백질.
  36. 제34항에 있어서, CAR-결합 도메인이 항원-결합 도메인과 Fc 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR 가교 단백질.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인이 CAR의 세포외 부분과 상호작용하는 펩티드를 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인이 CAR의 세포외 부분을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  39. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인이 CAR의 세포외 부분과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  40. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인이 CAR의 표적에 대해 특이적인 CAR의 일부분에 결합하는 것인 CAR 가교 단백질.
  41. 제40항에 있어서, CAR이 scFv를 포함하고, CAR-결합 도메인이 scFv의 가변 영역에 결합하는 것인 CAR 가교 단백질.
  42. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인이 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  43. 제42항에 있어서, CAR-결합 도메인이 scFv를 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  44. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인이 HIV-1 gp120 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  45. 제44항에 있어서, CAR-결합 도메인이 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  46. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, CAR이 CD19 특이적 CAR이고, CAR 결합 도메인이 CD19-특이적 CAR에 결합하는 것인 CAR 가교 단백질.
  47. 제46항에 있어서, CAR 결합 도메인이 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  48. 제47항에 있어서, CAR 결합 도메인이 scFv를 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  49. 제46항에 있어서, CAR-결합 도메인이 CD19 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  50. 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 인간 Fc 도메인 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  51. 제34항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 인간 중쇄 Fc 도메인 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  52. 제34항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 인간 중쇄 Fc 도메인 서열의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  53. 제34항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 야생형 인간 중쇄 Fc 도메인 서열에 비해 FcgR 수용체에 대한 결합을 방지하는 치환을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  54. 제34항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인이 서열식별번호: 4에 의해 제공된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  55. 제30항에 있어서, 항원-결합 도메인이 종양 항원 또는 바이러스 항원에 결합하는 것인 CAR 가교 단백질.
  56. 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 관심 항원과 상호작용하는 펩티드를 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  57. 제30항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 관심 항원을 인식하는 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  58. 제30항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 관심 항원과 상호작용하는 리간드의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  59. 제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합하는 것인 CAR 가교 단백질.
  60. 제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 코로나바이러스 스파이크 단백질에 결합할 수 있는 것인 CAR 가교 단백질.
  61. 제60항에 있어서, 코로나바이러스 스파이크 단백질이 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질인 CAR 가교 단백질.
  62. 제30항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 도메인이 ACE2 세포외 도메인의 적어도 일부분을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  63. 제62항에 있어서, ACE2 세포외 도메인의 일부분이 ACE2t 도메인인 CAR 가교 단백질.
  64. 제63항에 있어서, ACE2t 도메인이 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  65. 제34항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-결합 도메인, Fc 도메인 및/또는 항원-결합 도메인 사이에 적어도 1개의 링커 서열을 추가로 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  66. 제34항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 가교 단백질이 CAR-결합 도메인과 항원-결합 도메인, 및 임의적으로, Fc 도메인 사이에 링커 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 링커 서열이 GGGS의 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서열이 서열식별번호: 6에 의해 제공된 서열을 포함하는 것인 CAR 가교 단백질.
  69. 제30항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 가교 단백질이 동종이량체를 형성하는 것인 CAR 가교 단백질.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 CAR 가교 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  71. 제70항에 있어서, CAR 가교 단백질을 코딩하는 서열이 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 핵산 분자.
  72. 제70항에 있어서, 발현 벡터로서 추가로 정의되는 핵산 분자.
  73. 제72항에 있어서, 발현 벡터가 에피솜 벡터인 핵산 분자.
  74. 제72항에 있어서, 발현 벡터가 바이러스 벡터인 핵산 분자.
  75. 제74항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터인 핵산 분자.
  76. 제약상 허용가능한 담체 중에 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 CAR 가교 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  77. 제76항에 있어서, CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  78. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 CAR 가교 단백질의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 대상체가 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단을 이전에 투여받은 적이 있는 것인 방법.
  80. 제78항에 있어서, 대상체에게 CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 결합하는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 동종이계인 방법.
  82. 제80항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가 유래인 방법.
  83. 제80항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 HLA 매칭되는 것인 방법.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 코로나바이러스 감염을 갖는 것인 방법.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SAR-CoV 감염을 갖는 것인 방법.
  86. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SAR-CoV-2 감염을 갖는 것인 방법.
  87. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 COVID-19를 갖는 것인 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, CAR 가교 단백질이 (i) 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 항원-결합 도메인; 및 (ii) 서열식별번호: 6에 제공된 서열을 포함하는 CAR-결합 도메인을 포함하고, CAR 폴리펩티드가 그의 항원-결합 도메인으로서 CD4 도메인을 포함하는 것인 방법.
  89. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암을 갖는 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, CAR 가교 단백질이 CD19, CD20, 또는 CD22에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 것인 방법.
  91. 제78항에 있어서, CAR 가교 단백질의 CAR-결합 도메인이 CD19 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 것인 방법.
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