JP2014509841A - 癌を治療するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、卵巣癌を治療するための組成物および方法を提供する。具体的には、本発明は、卵巣癌を治療するために、α-葉酸受容体(FRα)結合ドメインおよび4-IBB(CD137)共刺激ドメインを有する遺伝子改変T細胞を投与することに関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2011年1月18日に出願された米国仮特許出願第61/433,731号の優先権を主張し、この仮特許出願は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
卵巣癌は、婦人科癌による死亡の大多数の原因である。米国では2004年に、25,580例の新たな症例が診断され、16,090名の女性が卵巣癌で死亡した。
本疾患は、日本を除いた先進工業国でより多く見られる。米国では、女性が卵巣癌を発症する生涯確率は1.4％〜2.5％(40〜60名の女性に1名)である。高齢女性はリスクが最も高い。
腹腔内化学療法は、卵巣癌の一次治療の標準治療として推奨されてきたが、この推奨の根拠に疑念が抱かれている。放射線療法は進行期には有効ではない、というのも、重要臓器が照射野にある場合、高線量を安全に照射することができないからである。手術療法もまた有効ではない。
腫瘍縮小手術およびその後の併用化学療法による集学的療法は最初は成功するものの、進行疾患を有する大部分の患者は最終的に再発し、治療不能となる。そのため、この悪性腫瘍を治療するための新規な治療アプローチが緊急に必要とされている。
卵巣腫瘍は比較的免疫原性があり、内因性T細胞応答を誘導するという事実に基づいて、卵巣癌は特に養子移入アプローチに適していると考えられる。
したがって、抗腫瘍免疫を提供し、それによって卵巣癌およびその他の癌を治療するための改良治療様式の必要性が存在する。
本発明は、α-葉酸受容体(FRα)結合ドメインの核酸配列および4-1BB(CD137)共刺激ドメインの核酸配列を含む、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を提供する。
1つの態様において、前記核酸配列は、CD3ζ結合ドメインの核酸配列をさらに含む。
1つの態様において、CARは、SEQ ID NO: 13またはSEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む。
1つの態様において、CARをコードする単離された核酸配列は、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 20の核酸配列を含む。
1つの態様において、FRα結合ドメインは抗体またはそのFRα結合断片である。好ましくは、FRα結合ドメインはFabまたはscFVである。
1つの態様において、FRα結合ドメインは腫瘍抗原に結合し、この場合、腫瘍抗原はFRαである。1つの態様において、腫瘍抗原は上皮性悪性腫瘍と関連している。別の態様において、腫瘍抗原は固形腫瘍と関連している。
1つの態様において、FRα結合ドメインは、SEQ ID NO: 15またはSEQ ID NO: 23のアミノ酸配列を含む。
1つの態様において、FRα結合ドメインは、SEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 21の核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、4-1BB共刺激ドメインは、SEQ ID NO: 18のアミノ酸配列を含む。
1つの態様において、4-1BB共刺激ドメインは、SEQ ID NO: 6の核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含む。
1つの態様において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 7の核酸配列によってコードされる。
1つの態様において、単離された核酸配列は、膜貫通ドメインの核酸配列をさらに含む。
本発明はまた、FRα結合ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含む単離されたCARを提供する。
本発明はまた、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞を提供する。
本発明はまた、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含むベクターを提供する。
本発明はまた、対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与し、それによって対象において抗腫瘍免疫を提供する段階を含む。1つの態様において、単離された核酸配列は、CD3ζシグナル伝達ドメインの核酸配列をさらに含む。
1つの態様において、共刺激ドメインが存在することで、T細胞生存が増強される。別の態様において、共刺激ドメインが存在することで、対象における抗腫瘍免疫の有効性が増加する。
1つの態様において、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。
本発明はまた、対象において、細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与し、それによって対象においてT細胞媒介性免疫応答を刺激する段階を含む。
本発明はまた、対象において卵巣癌を治療するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与し、それによって対象において卵巣癌を治療する段階を含む。
本発明はまた、対象において癌を治療するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与し、それによって対象において癌を治療する段階を含む。
本発明はまた、卵巣癌と診断された対象において、遺伝子操作T細胞の持続的集団を生成する方法を提供する、1つの態様において、本方法は、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、CARをコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与する段階を含み、遺伝子操作T細胞の持続的集団が、対象において投与後少なくとも1ヵ月間持続する方法を提供する。1つの態様において、遺伝子操作T細胞の持続的集団は、投与後少なくとも3ヵ月間持続する。
以下の、本発明の好ましい態様の詳細な説明は、添付の図面と併せて読んだ場合に、より良く理解されるであろう。本発明を説明するために、現時点で好ましい態様を図面に示してある。しかしながら、本発明が、図面に示された態様の厳密な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
αFR CARの構築およびヒトT細胞へのαFR CARのレンチウイルス遺伝子導入を示す画像である。 CAR+ T細胞がTh1サイトカインを優先的に分泌したことを実証する画像である。 αFR+ヒト卵巣癌の直接的かつ特異的な腫瘍認識および死滅を示す画像である。 4-1BBシグナル伝達ドメインの取り込みが、Winnアッセイにおいて抗腫瘍活性を増強し得ることを示す画像である。 CAR遺伝子療法を用いた、確立された大きなヒト卵巣癌の処置を示す画像である：4-1BB共刺激はT細胞生存の増強を媒介する。 キメラ抗α葉酸受容体免疫受容体α-FR 4-1BB：CD3ζ導入遺伝子およびベクター構築物を表す図を示す画像である。パッケージングシグナル(Ψ)、セントラルポリプリントラクト/セントラル終結配列(cppt/CTS)、および伸長因子1-αプロモーター(ef-1α)を含むpELNS骨格ベクター(下部)に、この構築物をクローニングした。移入ベクターはパッケージング中に5' LTRから駆動され、3' SIN LTRは逆転写の際に5'末端にコピーされる。 PELNS-MOv19-4-1BB-CD3ζのプラスミドマップを示す画像である。 図8Aおよび8Bを含む図8は、抗αFRレンチウイルスベクターで操作されたT細胞の作製および細胞溶解活性を示す一連の画像である。図8Aは、αFR結合キメラ受容体の模式図を示す。切断型TCRζドメインを含む結合対照キメラ受容体、および抗CD19 scFvを含む特異性対照受容体もまた構築した。図8Bは、αFR-CARタンパク質の発現をヒト初代CD4 T細胞において調べたことを示す画像である。形質導入効率は、フローサイトメトリーにより決定する。 AE17、AE17.FR、SKOV3上でのFRの細胞表面発現をフローサイトメトリーによって決定したことを示す画像である(上部)。細胞を、マウス抗ヒトαFR抗体MOV18(薄灰色ヒストグラム)またはアイソタイプ対照(濃灰色ヒストグラム)のいずれかと共にインキュベートした後、FITC結合ヤギ抗マウスIgで染色した。αFRを発現する細胞株を標的化する、初代ヒトT細胞上のキメラ受容体の細胞溶解活性を、4時間の51Cr放出アッセイを用いて測定した(中間部)。FRa+腫瘍標的は、T細胞サイトカイン分泌を直接誘導し得る。結果は、少なくとも3回の別個の実験のうちの1回による、3つ組ウェルの平均値およびSDとして表す(下部)。 インビトロにおける、AE17.FR腫瘍細胞の効率的なαFR特異的死滅を示す画像である。GFPを形質導入されたAE17およびAE17.FR細胞を、表示の比率で、CAR+ T細胞と共に約20時間インキュベートし、その後蛍光顕微鏡下で撮影した。T細胞の各群のCAR形質導入効率は約40％〜50％であった。 インビボにおけるαFRキメラ受容体形質導入T細胞の抗腫瘍活性を示す画像である。NOD/scid/IL2rγ-/-(NOG)マウスに、CAR発現T細胞(1×106個細胞/マウス)と混合したSKOV3 Luc(1×106個細胞/マウス)をs.c.注射した。T細胞と標的の相互作用を最小限に抑えるために、細胞の混合は注射の直前に行った。接種後10日ごとに動物を撮像して、腫瘍成長を評価し、「Living Image」ソフトウェアを用いて、ルシフェラーゼ発現細胞からの光子放出を定量した。 図12A〜12Dを含む図12は、αFR再標的化T細胞が、インビボにおいて、予め確立された大きな腫瘍を根絶すること：共刺激シグナル伝達ドメインおよび投与経路の効果を示す一連の画像である。図12Aおよび12Cは、3×106個のSKOV3細胞を皮下注射されたマウスを、200〜300 mm3の腫瘍体積に到達するまで、腫瘍成長についてモニターしたことを示す。40日目および45日目に、腫瘍保有マウスを20×106個のT細胞(約40％〜50％が導入遺伝子陽性)の腫瘍内注射で処置した。図12Bおよび12Dは、SKOV3保有NOGマウスを、IT、IP、およびIV経路により、BBzキメラ受容体を発現するTリンパ球で処置し、腫瘍成長に及ぼす効果を評価したことを示す。 4-1BBシグナルがインビボにおいてヒトTリンパ球の持続性を増強することを示す画像である。74日目に、後眼窩採血により末梢血を採取し、ヒトCD45、CD4、およびCD8 T細胞の存在について染色した。ヒトCD45+集団にゲートをかけた後、TruCountチューブ(BD Biosciences)を用いて、CD4+およびCD8+サブセットを定量した。持続性は、注射経路と関係なく、BBz群において最も高かった。 図14A〜14Cを含む図14は、SKOV3腫瘍のαFR CAR BBzによる根絶が抗原特異的であることを示す一連の画像である。図14Aおよび14Bは、40日目および45日目に、BBz CAR(αFRまたはCD19に対する)およびGFPを発現するリンパ球で処置したSKOV3保有マウスを示す。図14Cは、2回目のT細胞注射の3週間後に、SKOV3保有NOGマウスから末梢血を採取し、FACS TrucountアッセイによってCD4およびCD8 T細胞の存在について定量したことを示す。 図15A〜15Cを含む図15は、αFR CAR BBz特異的T細胞が、腹膜癌腫症のSKOV3マウスモデルにおいて、腫瘍成長および腹水形成を阻害することを示す一連の画像である。図15Aは、NOGマウスにおけるSKOV3腫瘍のi.p.注射が、CD19 CAR T細胞処置後に、腹部膨張および結節性腹膜腫瘍をもたらすことを示す画像である。マウスは、FR CAR BBz T細胞で処置したマウス(左側)と比較して、腹部の膨張によって明らかな腹水を生じ(中央)、腹膜の死後可視化により、腹腔内の結節性腫瘍塊(矢印)が示される(右側)。図15Bおよび15Cは、αFR CAR BBz T細胞のi.p./i.v.注射が、腫瘍進行および腹水形成を遅らせ、生存を改善することを示す。CD19 CARまたはαFR CAR T細胞のいずれかで処置したNOGマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。 αFR CAR BBz特異的T細胞の養子移入が卵巣癌肺転移の退縮を誘導することを示す画像である。腫瘍はαFR特異的T細胞の注射に応答して退縮したが、CD19特異的T細胞で処置したマウスでは、腫瘍は徐々に成長した。 健常ドナーから単離されたCD4 T細胞に、GFP発現HIV由来レンチウイルスベクターをMOI 20で形質導入し、29日間培養したことを示す画像である。X軸は、拡大倍率(丸印)またはGFP発現の割合(三角印)を示す。形質導入細胞は白記号であり、偽形質導入細胞は黒記号である。 図18A〜18Eを含む図18は、FRα CAR形質導入ヒトT細胞の作製、およびインビトロにおける該T細胞による特異的免疫認識を示す。図18Aは、単独で(MOv19-ζ)またはCD137共刺激モジュールと組み合わせて(MOv19-BBζ)CD3ζサイトゾルドメインを含むMOv19ベースのCAR構築物の模式図を示す。切断型CD3ζドメインを含むFRα特異的CAR(MOv19-Δζ)、および抗CD19-BBζCARを示す。VL、可変L鎖；L、リンカー；VH、可変H鎖；TM、膜貫通領域。図18Bは、対応する非形質導入T細胞(灰色に塗りつぶしたヒストグラム)と比較した、レンチウイルスによる形質導入後にヒトCD3にゲートをかけた細胞におけるMOv19 CAR発現(黒実線)を示す。形質導入の割合を表示する。図18Cは、フローサイトメトリーによる、様々なヒト卵巣癌細胞株による表面FRα発現を示す(黒実線)；アイソタイプ抗体対照(灰色に塗りつぶしたヒストグラム)。図18Dは、FRα+癌細胞株と一晩インキュベートした後の、MOv19-Δζ、抗CD19-BBζ T細胞ではなく、MOv19-ζおよびMOv19-BBζ CAR形質導入T細胞による抗原特異的IFN-γ分泌を示す。3つ組培養物からの平均IFN-γ濃度±SEM(pg/mL)を示す。図18Eは、18時間の生物発光アッセイにおける、表示のE/T比での、FRα CAR+ CD8+ T細胞によるFRα+腫瘍細胞の抗原特異的死滅を示す。非形質導入T細胞(UNT)またはgfp形質導入ヒトCD8+ T細胞を対照とした。 図19A〜19Dを含む図19は、ヒトMOv19-BBζ CAR T細胞が、インビボにおいて、予め確立された大きな腫瘍を根絶することを示し、CD137共刺激シグナル伝達ドメインおよび投与経路の効果を示す。0日目および5日目に、確立されたs.c.腫瘍を保有するNSGマウスを、8×106個のCAR+ T細胞の腫瘍内注射で処置し、2週間ごとに撮像した。図19Aは、ノギス測定により評価した[V＝1/2(長さ×幅2)]、腫瘍成長を示す。図19Bは、最後のT細胞投与の2週間後および4週間後に、MOv19-ζおよび対照処置群と比較して、MOv19-BBζ CAR処置マウスにおいて、SKOV3 fLuc+生物発光シグナルが減少したことを示す。SKOV3 fLuc保有NSGマウスを、i.t.、i.p.、またはi.v.経路により、8×106個のMOv19-BBζ T細胞で処置した。図19Cは、ノギス測定によって評価した腫瘍成長を示す。図19Dは、CD137シグナル伝達が、末梢血中、73日目(最後のT細胞投与の4週間後)に、インビボにおいてヒトCD4+およびCD8+ T細胞の生存を増強することを示す。CD4およびCD8 T細胞は、TruCount法を用いて血液から定量した。各処置群中のすべての評価可能なマウスの平均細胞濃度(細胞/μL)±SDを示す。 図20A〜20Dを含む図20は、CAR T細胞による腫瘍根絶が抗原特異的であることを示す。0日目および5日目に、s.c. SKOV3 fLuc+腫瘍を有するNSGマウスを、i.t.注入により、MOv19-BBζ、抗CD19-BBζ、またはgfpを発現する8×106個のT細胞(40％の形質導入効率)で処置した。図20Aは、2〜3日ごとのノギスによる腫瘍体積の測定値を示す。最後のT細胞注入の3週間後に、末梢血を採取した。図20Bは、ヒトCD4+およびCD8+ T細胞の絶対数/μl血液を示す。平均細胞カウント±SDを示す。図20Cは、ヤギ抗マウスIgG F(ab')2を用いてフローサイトメトリーによって測定した、処置マウスの末梢血由来のヒトCD3+ T細胞上のFRαおよびCD19特異的CAR発現を示す。群ごとの平均CAR+発現頻度±SDを示す。図20Dは、ヒトCD3+ T細胞カウント/μL血液にCAR+の割合をかけたものとして算出された、絶対CAR+ T細胞カウントを示す。平均カウント±SDを決定した。 インビボにおける腫瘍へのCAR T細胞局在化が抗原特異的であることを実証する一連の画像である。0日目および5日目に、s.c. SKOV3 fLuc+腫瘍を有するNSGマウスを、MOv19-BBζ(上部)、抗CD19-BBζ(中間部)、またはgfp(下部)を発現する8×106個のT細胞のi.v.注射で処置した。さらにおよそ40日間成長させたSKOV3腫瘍を、安楽死させたマウスから回収し、ヒトCD3発現について染色した(褐色)。代表的な切片を×100倍率で示す。 図22A〜22Dを含む図22は、Mov19-BBζ T細胞が、腹膜癌腫症のSKOV3マウスモデルにおいて、腫瘍成長および腹水形成を阻害することを示す。図22Aは、5×106個のSKOV3 fLuc+腫瘍細胞のi.p.注射を施し、4群にランダムに割りつけてから、腫瘍接種後の30日目および35日目に、i.p.またはi.v.注入による、MOv19-BBζまたは抗CD19-BBζを発現する9×106個のT細胞での治療を開始したNSGマウスを示す。図22Bは、i.v.(上部)またはi.p.(下部)注入によりMOv19-BBζ T細胞で処置した代表的なNSGマウスを示す(左側)。抗CD19-BBζ T細胞で処置したマウス(右側)は、腹部の膨張によって明らかな腹水を生じた(中央)。腹膜の死後可視化により、結節性腫瘍塊が示される(矢印；最も右側)。図22Cは、i.v.またはi.p.注射により、MOv19-BBζまたは抗CD19-BBζ T細胞のいずれかで処置した腫瘍保有NSGマウスのカプラン・マイヤー腫瘍関連生存曲線を示す。図22Dは、腫瘍保有NSGマウスのカプラン・マイヤー全生存曲線を示す。 図23Aおよび23Bを含む図23は、FRα特異的T細胞の養子移入が卵巣癌肺転移の退縮を誘導することを示す。肺に3日で確立されたSKOV3 fLuc+腫瘍を有するNSGマウスに、3日目および8日目に、MOv19-BBζまたは抗CD19-BBζのいずれかを発現する6×106個のT細胞を尾静脈注射した。図23Aは、BLIによってモニターした腫瘍を示す。図23Bは、fLuc+腫瘍細胞からの、定量化された平均値±SD生物発光シグナル光子放出を示す。 MOv19-BBζまたはMOv19-ζを形質導入された初代ヒトT細胞が、FRα+癌細胞株による刺激後に、Th1サイトカインを優先的に分泌することを示す。形質導入T細胞(1×105個のCAR+ T細胞)を単独で培養するか(なし)、または同数のヒトFRα+ SKOV3または抗原陰性PEO-1卵巣癌細胞で一晩刺激した。約20時間のインキュベーション後に、3つの独立した培養物からの無細胞上清を回収してプールし、細胞数測定ビーズアレイ技術を用いて、表示のヒトTh1/Th2サイトカインを定量した。値は、表示のサイトカインのIFN-γ濃度(pg/ml)を示す。 図25A〜25Cを含む図25は、FRα特異的CARを発現するように操作された初代ヒトT細胞が、インビトロにおいてFRα+細胞株を溶解することを示す。図25Aは、ヒトFRαを発現しない天然マウス悪性中皮腫細胞株AE17が、フローサイトメトリーによって示されるように、高い表面レベルのヒトFRαを発現するように形質導入されたこと示す(AE17.FRα)。MOv19-ζ、MOv19-BBζ、MOv19-Δζ、もしくは抗CD19-BBζ CAR、または緑色蛍光タンパク質(gfp)のいずれかを発現するように形質導入された初代ヒトT細胞を、表示のエフェクター対標的比で、Cr51標識された天然AE17またはAE17.FRα細胞株と4時間共培養した。図25Bは、(実験−自発的放出)÷(最大−自発的放出)かける100として算出された、特異的標的細胞溶解の割合を示す。結果は、標準偏差を示すエラーバーを加えた、3つ組ウェルの平均値として表す。MOv19-ζ、MOv19-BBζ、MOv19-Δζ、または抗CD19-BBζ CARを発現するように形質導入されたヒトT細胞を、gfpを発現するAE17またはAE17.FRα細胞と、様々なエフェクター対標的比で24時間共培養した。図25Cは、蛍光顕微鏡下で撮影された形質導入細胞を示す。標的細胞溶解は、gfp標識接着腫瘍細胞の減少の撮像によって示される。 図26A〜26Dを含む図26は、腫瘍退縮が、インビボにおける操作されたヒトT細胞の安定した持続性と関連しており、CD137共刺激シグナル伝達の供給に依存することを示す。図26Aは、T細胞注入の4週間後の処置群ごとの、平均生物発光シグナルによって測定される腫瘍量を示す。図26Bは、i.v.、i.t.、もしくはi.p.投与経路によって送達される、MOv9-BBζを発現するT細胞の移入、またはMOv19-ζもしくは対照ベクター(MOv19-Δζまたはgfp；対照)を発現するT細胞のi.t.投与の4週間後に、Trucount法により評価した、インビボにおけるTリンパ球の持続性を示す。図26Cは、T細胞療法の4週間後、操作されたヒトT細胞の安定した持続性(x軸)が生物発光シグナル(y軸)と逆相関する(r＝-0.78)ことを示す。培地単独中で(表示せず)、またはSKOV3と共に3日間培養した後に、FR特異的CAR CD8 T細胞によるBcl-XL発現を調べた。Bcl-XL発現は、FRα+腫瘍細胞による刺激後に、MOv19-ζCAR+ T細胞(6.7％)と比較して、MOv19-BBζ CAR T細胞集団(15.4％)において優先的に増加した。培地単独中での培養は、CAR T細胞においてBcl-XL発現を誘導しなかった。図26Dは、3回の独立した共培養のうちの1回の代表的なFACS解析を示す。 T細胞療法後に切除された腫瘍標本の肉眼的評価を示す一連の画像である。生理食塩水、またはgfp、MOv19-Δζ、MOv19-ζ、MOv19-BBζ CARを有するT細胞を腫瘍内(i.t.)注射した；またはMOv19-BBζ T細胞を静脈内(i.v.)もしくは腹腔内(i.p.)注射したNSGマウスから、腫瘍を回収した。「腫瘍なし」は、腫瘍が検出されなかったマウスを示す。最初のT細胞注射のほぼ40日後の安楽死の時点で、マウスから腫瘍を回収した。 本明細書の他所に詳述される臨床試験の研究プロトコール模式図を示す画像である。 ヒト化C4 scFvを含む完全ヒト抗FR CARを発現するように操作された初代ヒトT細胞が、インビトロにおいてFR発現癌細胞株を認識し、これに応答することを示す画像である。scFvは、第1(-z)または第2(-28z) CARを発現するように形質導入されたT細胞の表面上に効率的に発現された(上部；gfp同時発現のために2シストロン製ベクターを使用)。FRを発現する卵巣癌細胞または乳癌細胞と一晩共培養した場合、CAR形質導入T細胞はIFN-gを分泌したが、非形質導入(UNT) T細胞はこれを分泌しなかった。FRをほとんど発現しない細胞株(A2780およびC30)は、認識されなかった(下部)。 SEQ ID NOの同一性を要約する画像である。
発明の詳細な説明
本発明は、上皮癌を含むがこれに限定されない癌を治療するための組成物および方法に関する。本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように形質導入されたT細胞の養子細胞移入の戦略に関する。CARとは、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生じるように、所望の抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体に基づく特異性とT細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせた分子である。
本発明は、一般的に、所望のCARを安定して発現するように遺伝子改変されたT細胞の使用に関する。CARを発現するT細胞は、本明細書において、CAR T細胞またはCAR改変T細胞と称される。好ましくは、細胞は、その表面上に抗体結合ドメインを安定して発現して、MHC非依存的である新規抗原特異性を付与するように、遺伝子改変され得る。場合によっては、T細胞は、特異的抗体の抗原認識ドメインとCD3-ζ鎖またはFcγRIタンパク質の細胞内ドメインを組み合わせて単一のキメラタンパク質にしたCARを安定して発現するように、遺伝子改変される。
1つの態様において、本発明のCARは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。1つの態様では、CAR中のドメインの1つと天然で会合している膜貫通ドメインが用いられる。別の態様では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するように選択され得るか、またはアミノ酸置換によって改変され得る。好ましくは、膜貫通ドメインはCD8αヒンジドメインである。
細胞質ドメインに関して、本発明のCARは、CD28および/または4-1BB(CD137)シグナル伝達ドメインを、単独で、または本発明のCARとの関連で有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように、設計され得る。1つの態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計され得る。例えば、CARの細胞質ドメインには、CD3-ζ、4-1BB、およびCD28シグナル伝達モジュール、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。したがって、本発明は、養子療法のためのCAR T細胞およびそれらを使用する方法を提供する。
1つの態様において、本発明のCAR T細胞は、α-葉酸受容体(αFRまたはFRα)を標的化する所望のCARを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入することによって、生成され得る。例えば、レンチウイルスベクターは、細胞内への、抗FRα、CD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARを含む。本発明のCARの抗FRαドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、およびヒト化抗体を含むがこれらに限定されない、FRαに結合する任意のドメインであってよい。そのため、本明細書で用いられる場合、抗FRα(または抗αFR)とは、FRαに対して標的化される任意の組成物を指す。本発明のCAR T細胞は、インビボで複製して、持続的な腫瘍制御を引き起こし得る長期持続をもたらすことができる。
1つの態様において、本発明は、リンパ球注入を用いて、癌を有するかまたは癌を有するリスクのある患者の治療のために、CARを発現する遺伝子改変T細胞を投与することに関する。好ましくは、治療において、自己リンパ球注入が用いられる。治療を必要とする患者から自己PBMCを回収し、本明細書に記載される、および当技術分野で公知の方法を用いて、T細胞を活性化して拡大し、次に患者に注入して戻す。
本発明は、CD3-ζおよび4-1BB共刺激ドメインの両方を含む抗FRα CARを発現するT細胞(FRα特異的CAR T細胞とも称される)を使用することを含む。本発明のFRα特異的CAR T細胞は、強いインビボT細胞拡大を起こすことができ、血液および骨髄中で長期間にわたって高レベルで持続するFRα特異的記憶細胞を確立し得る。場合によっては、患者に注入された本発明のFRα特異的CAR T細胞は、上皮性卵巣癌を有する患者においてインビボで癌性細胞を除去し得る。しかしながら、本発明は、FRα特異的CAR T細胞に限定されない。むしろ、本発明は、CD137(4-1BB)シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメイン、およびこれらの任意の組み合わせの群より選択される1つまたは複数の細胞内ドメインと融合された任意の抗原結合部分を含む。
定義
別段の規定がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の試験のための実施において用いることができるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されるものである。本発明を説明および主張するにあたり、以下の専門用語が用いられる。
本明細書で用いられる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
冠詞「a」および「an」は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは1つよりも多く(すなわち少なくとも1つ)を指すように用いられる。例として、「（an）要素」は1つの要素または1つよりも多くの要素を意味する。
量、時間的長さ等などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いられる「約」は、特定の値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、一層より好ましくは±0.1％のばらつきを包含することが意図され、これは開示された方法を実施する上でそのようなばらつきが妥当なためである。
本明細書で用いられる場合、「FRα結合ドメイン」という用語は、当業者に公知の任意のFRα特異的結合ドメインを指し得る。1つの態様において、FRα結合ドメインは、FRαに特異的に結合する抗体の重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域を含む一本鎖可変断片(scFv)を含む。抗FRα抗体、抗体断片、およびそれらの変種は当技術分野で周知であり、米国特許出願公開第U.S 20100055034号；第U.S. 20090324594号；第U.S. 20090274697号；第U.S. 20080260812号；第U.S. 20060239910号；第U.S. 20050232919号；第U.S. 20040235108号に十分記載されており、これらはすべて全体として参照により本明細書に組み入れられる。1つの態様において、FRα結合ドメインは、抗FRα抗体の相同体、変種、異性体、または機能的断片である。各々の可能性は、本発明の別個の態様に相当する。
本明細書で用いられる場合、「4-1BB(CD137)共刺激ドメイン」という用語は、例えば4-1BBの刺激性シグナル伝達ドメインを含む、4-1BBの任意の配列を指し得る。4-1BBの刺激性シグナル伝達ドメインおよびそれらの変種は当技術分野で周知であり、米国特許出願公開第20050113564号に十分記載されており、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる。4-1BBの核酸およびアミノ酸配列ならびにそれらの変種は当技術分野で周知であり、米国特許出願公開第U.S. 20060063923号；第U.S. 20060029595号；第U.S. 20030082157号；第U.S. 20020168719号；第U.S. 20040091476号；第U.S. 20050113564号；および第U.S. 20060002904号に十分に記載されており、これらはすべて全体として参照により本明細書に組み入れられる。1つの態様において、4-1BB(CD137)共刺激ドメインは、4-1BB(CD137)の相同体、変種、異性体、または機能的断片である。各々の可能性は、本発明の別個の態様に相当する。
「活性化」とは、本明細書で用いられる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態を指す。活性化はまた、サイトカイン産生の誘導および検出可能なエフェクター機能を伴い得る。「活性化T細胞」という用語は、数ある中でも、細胞分裂しているT細胞を指す。
「抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的に、四量体の免疫グロブリン分子である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab、およびF(ab)2、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在し得る(Harlow et al,, 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指し、また無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
「抗体重鎖」とは、本明細書で用いられる場合、天然高次構造をしているすべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
「抗体軽鎖」とは、本明細書で用いられる場合、天然高次構造をしているすべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。κ軽鎖およびλ軽鎖とは、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
本明細書で用いられる「合成抗体」という用語は、組換えDNA技術を用いて生成される抗体、例えば、本明細書に記載されるようにバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。本用語はまた、抗体をコードし、抗体タンパク質を発現するDNA分子、または抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるべきであり、該DNAまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能であり周知である合成DNAまたはアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
本明細書で用いられる「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘起する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含むいかなる高分子も、抗原として働き得ることを理解するであろう。その上、抗原は組換えDNAまたはゲノムDNAに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それ故に、本明細書でその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。その上、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけによりコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明には、2つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用が含まれるが、これに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するように様々な組み合わせで配置されることは、容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原が合成して生成され得るか、または生体試料に由来し得ることは、容易に明らかである。このような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、または癌の状態に関連する様々な生理的症状の改善によって明らかにされ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、腫瘍の発生を最初の段階で予防する上での、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によっても明らかにされ得る。
「自己抗原」という用語は、本発明に従って、免疫系によって異物であると誤って認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原には、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、細胞表面受容体を含む糖タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答によって生じる障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切でかつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例には、数ある中でも、アジソン病、円形脱毛症(alopecia greata)、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病(I型)、栄養障害型表皮水泡症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「自己の」という用語は、後にそれが再導入される個体と同じ個体に由来する任意の物質を指すことが意図される。
「同種の」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
「異種の」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
本明細書で用いられる「癌」という用語は、異常な細胞の急速でかつ制御不能な増殖を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がり得る。様々な癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌等が含まれるが、これらに限定されない。
「共刺激リガンド」は、本用語が本明細書で用いられる場合、T細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞 (例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞等)上の分子を含む。共刺激リガンドには、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS-L)、細胞内接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、これらに限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどの、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが増殖などの、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。
「共刺激シグナル」とは、本明細書で用いられる場合、TCR/CD3連結などの一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および/または鍵となる分子の上方制御もしくは下方制御を導くシグナルを指す。
「疾患」とは、動物が恒常性を維持できない動物の健康状態であり、疾患が改善されない場合には、動物の健康は悪化し続ける。対照的に、動物における「障害」とは、動物が恒常性を維持できるが、障害がない場合よりも動物の健康状態が好ましくない健康状態である。治療されないままでも、障害は動物の健康状態を必ずしもさらに悪化させるとは限らない。
本明細書で用いられる「有効量」とは、治療的または予防的な利点を提供する量を意味する。
「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、およびmRNA)または所定のアミノ酸配列のいずれか、およびそこから生じる生物学的特性を有する他のポリマーおよび高分子を生物学的過程において合成するための鋳型として働く、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。よって、遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳により、細胞または他の生体系においてタンパク質が産生されるならば、その遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。
本明細書で用いられる場合の「内因性」とは、生物体、細胞、組織、または系の内部に由来するか、またはそこで産生される任意の物質を指す。
本明細書で用いられる場合、「外因性」という用語は、生物体、細胞、組織、または系の外部から導入されるか、またはそこで産生される任意の物質を指す。
本明細書で用いられる「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列のプロモーターによって駆動されるその配列の転写および/または翻訳と定義される。
「発現ベクター」とは、発現させるべきヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド(例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの)、およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)などの、当技術分野で公知であるすべてのものが含まれる。
「相同な」とは、2つのポリペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。2つの比較配列の両方におけるある位置が、同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットによって占有される場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンによって占有される場合、それらの分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同性の割合は、2つの配列によって共有された一致する位置または相同な位置の数を、比較した位置の数で除したもの×100の関数である。例えば、2つの配列における位置の10のうち6が一致するかまたは相同である場合、この2つの配列は60％相同である。例として、DNA配列ATTGCCとTATGGCは、50％の相同性を共有する。一般的に、比較は、2つの配列が最大の相同性を与えるように整列された場合に行われる。
「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、場合により、BCR(B細胞受容体)または抗原受容体と称される。このクラスのタンパク質に含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgD、およびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な循環抗体である。IgMは、大部分の対象において一次免疫応答で産生される主な免疫グロブリンである。これは凝集、補体結合、および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時に肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
本明細書で用いられる場合、「説明資料」には、本発明の組成物および方法の有用性を伝達するために用いることができる出版物、記録、図表、または任意の他の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチド、および/もしくは組成物を含む容器に添付してもよいし、または核酸、ペプチド、および/もしくは組成物を含む容器と共に発送してもよい。あるいは、説明資料および化合物が受取人によって一体として用いられることを意図して、説明資料を容器と別々に発送にしてもよい。
「単離された」とは、天然状態から変更または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境で存在し得る。
本発明との関連において、通常存在する核酸塩基に関しては以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、および「U」はウリジンを指す。
別段の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質をコードするヌクレオチド配列がある型でイントロンを含み得る限り、タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、イントロンを含み得る。
本明細書で用いられる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中で特有である；それらは宿主細胞のDNA中にかなりの量の遺伝情報を送達することができ、そのため遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、およびFIVはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルス由来のベクターは、インビボで遺伝子導入の顕著なレベルを達成するための手段を提供する。
「調節する」という用語は、本明細書で用いられる場合、治療もしくは化合物の非存在下でのその対象における応答のレベルと比較した、および/またはその他の点では同一であるが未治療の、ある対象の応答のレベルと比較した、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。本用語は、天然のシグナルまたは応答を撹乱しおよび/またはそれらに影響を及ぼし、それによって対象、好ましくはヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
別段の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
「機能的に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現をもたらす機能的連結を指す。例えば、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的関係下に配置されている場合、第1核酸配列は第2核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列と機能的に連結されている。一般的に、機能的に連結されたDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、同じリーディングフレーム内にある。
「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、組織または器官に由来する正常細胞における発現レベルに対する、患者の特定の組織または器官内の固形腫瘍のような疾患領域に由来する細胞における腫瘍抗原の異常な発現レベルを示すことが意図される。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で公知の標準的なアッセイによって判定することができる。
免疫原性組成物の「非経口的」投与には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、または胸骨内の注射または注入技法が含まれる。
「患者」、「対象」、「個体」等という用語は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書に記載される方法に適している任意の動物、またはインビトロかインサイチューかにかかわらずその細胞を指す。特定の非限定的な態様において、患者、対象、または個体はヒトである。
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。その上、核酸はヌクレオチドのポリマーである。よって、本明細書で用いられる核酸とポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらが単量体「ヌクレオチド」に加水分解され得るという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で用いられる場合のポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR(商標)等を用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすること、ならびに合成手段を非限定的に含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いられる場合、本用語は、例えば、当技術分野において一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般的にタンパク質と称される長鎖の両方を指し、それらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、数ある中でも、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で用いられる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
本明細書で用いられる場合、「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列は遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであってもよい。
「構成性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的にはそのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子によってコードされるかまたは特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的には細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列である。
「特異的に結合する」という用語は、抗体に関して本明細書で用いられる場合、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず、またはそれと結合しない抗体を意味する。例えば、ある種に由来する抗原に特異的に結合する抗体は、1つまたは複数の種に由来する抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性は、特異的であるとして、それ自体、抗体の分類を変更しない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体はまた、抗原の異なる対立遺伝子形態にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性は、特異的であるとして、それ自体、抗体の分類を変更しない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第2化学種との相互作用に関して用いられて、相互作用が化学種上の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味し得る；例えば、抗体は、一般的にタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識「A」および抗体を含む反応においてエピトープAを含む分子(または遊離の非標識A)が存在すると、抗体に結合する標識Aの量が減少する。
「刺激」という用語は、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによって、これに限定されないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を意味する。刺激は、TGF-βの下方制御および/または細胞骨格構造の再構築等などの、ある種の分子の発現の変化を媒介し得る。
「刺激分子」とは、本用語が本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子を意味する。
「刺激リガンド」とは、本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞等)上に存在する場合に、T細胞上の同族結合パートナー(本明細書では「刺激分子」と称される)と特異的に結合し、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖等を含むがこれらに限定されない、T細胞による一次応答を媒介し得るリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る、生きている生物体(例えば、哺乳動物)を含むことが意図される。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞とはまた、これがその天然状態で通常会合している他の細胞型から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団を指す。別の場合には、本用語は、単に、それらがその天然状態において天然で会合している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。
本明細書で用いられる「治療的」という用語は、治療および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって探求されている組織、系、または対象の生物学的または医学的応答を誘発する対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与された場合に、治療されている障害または疾患の徴候または症状の1つまたは複数の出現を予防するのに、またはそのような徴候または症状の1つまたは複数をある程度まで軽減するのに十分である化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療を受ける対象の年齢、体重等に応じて異なる。
本用語が本明細書で用いられる場合の疾患を「治療する」こととは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を減少させることを意味する。
本明細書で用いられる「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程を指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外因性核酸をトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。この細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
本明細書で用いられる「転写制御下」または「機能的に連結された」という語句は、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに関して正しい位置および方向にあることを意味する。
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、この単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いることができる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多くのベクターが、当技術分野で公知である。よって、「ベクター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソーム等などの、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されない。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜および簡潔のためであり、本発明の範囲への確固たる限定として解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能な部分的範囲のすべて、およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等などの部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したと見なされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。
説明
本発明は、いくつかある疾患の中でも特に癌を治療するための組成物および方法を提供する。癌は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発または転移性腫瘍であってよい。好ましくは、癌は上皮癌、言い換えれば癌腫である。より好ましくは、癌は上皮性卵巣癌である。本発明の組成物および方法を用いて治療可能な他の疾患には、ウイルス、細菌、および寄生虫感染症、ならびに自己免疫疾患が含まれる。
1つの態様において、本発明は、CARを発現するように操作された細胞(例えば、T細胞)を提供し、この場合CAR T細胞は抗腫瘍特性を示す。本発明のCARは、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖(例えば、CD3ζ)の細胞内シグナル伝達ドメインに融合された、抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作され得る。本発明のCARは、T細胞において発現された場合に、抗原結合特異性に基づいて抗原認識を再方向づけることができる。例示的な抗原は、この抗原が悪性上皮細胞上に発現されるという理由で、FRαである。しかしながら、本発明はFRαの標的化に限定されない。むしろ、本発明は、その同族抗原に結合した場合に、腫瘍細胞に影響を及ぼし、その結果として腫瘍細胞が増殖できなくなる、腫瘍細胞の死滅が促される、またはさもなければ患者における腫瘍量が減少するかもしくは除去される、任意の抗原結合部分を含む。抗原結合部分は、好ましくは、共刺激分子およびζ鎖の1つまたは複数に由来する細胞内ドメインと融合される。好ましくは、抗原結合部分は、CD137(4-1BB)シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメイン、およびこれらの任意の組み合わせの群より選択される1つまたは複数の細胞内ドメインと融合される。
1つの態様において、本発明のCARはCD137(4-1BB)シグナル伝達ドメインを含む。これは、本発明が、共刺激ドメインの付加により、CAR媒介性T細胞応答がさらに増強され得るという発見に一部基づいているためである。例えば、CD137(4-1BB)シグナル伝達ドメインを含めることで、CAR T細胞の抗腫瘍活性およびインビボ持続性は、CD137(4-1BB)を発現するように操作されていない、その他の点では同一であるCAR T細胞と比較して有意に増加した。
組成物
本発明は、細胞外および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。細胞外ドメインは、さもなければ抗原結合部分と称される標的特異的結合エレメントを含む。細胞内ドメインまたはさもなければ細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの部分を指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。
CARの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはCARの細胞質ドメインと膜貫通ドメインの間には、スペーサードメインが組み込まれ得る。本明細書で用いられる場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般的に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖内の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大300アミノ酸まで、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含み得る。
抗原結合部分
1つの態様において、本発明のCARは、さもなければ抗原結合部分と称される標的特異的結合エレメントを含む。その部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。よって、本発明のCAR中の抗原部分ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫感染症、自己免疫疾患、ならびに癌細胞と関連したものが含まれる。
1つの態様において、本発明のCARは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合部分を操作することによって、関心対象の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。本発明との関連において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」とは、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通している抗原を指す。本明細書で考察される抗原は、単に例として含まれるにすぎない。そのリストは排他的であることを意図するものではなく、さらなる例が当業者には容易に明らかであろう。
腫瘍抗原とは、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を誘発する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、治療すべき癌の特定の種類に依存する。腫瘍抗原は当技術分野で周知であり、これには、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸管カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、プロステイン、PSMA、Her2/neu、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体、ならびにメソテリンが含まれる。
1つの態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する1つまたは複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として働き得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるMART-1、チロシナーゼ、およびGP 100、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)および前立腺特異的抗原(PSA)などの組織特異的抗原が含まれるが、これらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子HER-2/Neu/ErbB-2などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原(CEA)などの癌胎児抗原である。B細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有である真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。CD19、CD20、およびCD37などのB細胞分化抗原は、B細胞リンパ腫における標的抗原のその他の候補である。これらの抗原のうちのいくつか(CEA、HER-2、CD19、CD20、イディオタイプ)は、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として用いられてきたが、その成功は限られていた。
本発明で言及される腫瘍抗原の型はまた、腫瘍特異的抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)であってもよい。TSAは腫瘍細胞に特有であり、体内のその他の細胞上には存在しない。TAA関連抗原は腫瘍細胞に特有ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない状況下では、正常細胞上にも発現される。腫瘍における抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で起こり得る。TAAは、免疫系が未熟であり、応答できない胎児発生期の正常細胞上に発現される抗原であってよく、またはTAAは、正常細胞上では通常極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現される抗原であってもよい。
TSAまたはTAA抗原の非限定的な例には、以下のものが含まれる：分化抗原、例えば、MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2など、および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15など；過剰発現胎児性抗原、例えばCEAなど；過剰発現癌遺伝子および突然変異腫瘍抑制遺伝子、例えば、p53、Ras、HER-2/neuなど；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原；例えば、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RARなど；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原EBVAならびにヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7など。タンパク質ベースのその他の大きな抗原には、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68＼P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733＼EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB＼70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90＼Mac-2結合タンパク質＼シクロフィリンC会合タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、およびTPSが含まれる。
好ましい態様において、CARの抗原結合部分の部分は、FRα、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Ova1、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、HER-2/neu、uPA、PAI-1等を含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。
標的化すべき所望の抗原に応じて、本発明のCARは、所望の抗原標的に特異的である適切な抗原結合部分を含むように操作され得る。例えば、FRαが、標的化すべき所望の抗原である場合には、本発明のCARに組み込むための抗原結合部分として、FRαに対する抗体を使用することができる。
1つの態様において、本発明のCARの抗原結合部分の部分はFRαを標的化する。好ましくは、本発明のCAR中の抗原結合部分の部分は抗FRα scFVであり、抗FRα scFVの核酸配列は、SEQ ID: 3に記載される配列を含む。1つの態様において、抗FRα scFVは、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、本発明のCARの抗FRα scFV部分は、SEQ ID NO: 15に記載されるアミノ酸配列を含む。
1つの態様において、本発明のCAR中の抗原結合部分の部分はヒト化抗FRα scFVであり、ヒト化抗FRα scFVの核酸配列は、SEQ ID: 21に記載される配列を含む。1つの態様において、ヒト化抗FRα scFVは、SEQ ID NO: 23のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、本発明のCARのヒト化抗FRα scFV部分は、SEQ ID NO: 23に記載されるアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、CARは、CARの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計され得る。1つの態様では、CAR中のドメインの1つと天然で会合している膜貫通ドメインが用いられる。場合によっては、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するように選択され得るか、またはアミノ酸置換によって改変され得る。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明おいて特に有用である膜貫通領域は、T細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来し得る(すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む)。あるいは、膜貫通領域は合成されたものであってよく、この場合、それは主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。好ましくは、合成膜貫通ドメインの各末端に、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの3つ組が見出される。任意で、好ましくはアミノ酸長2〜10の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成し得る。グリシン-セリン2つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
好ましくは、本発明のCAR中の膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインである。1つの態様において、CD8膜貫通ドメインは、SEQ ID NO: 5の核酸配列を含む。1つの態様において、CD8膜貫通ドメインは、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、CD8膜貫通ドメインは、SEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を含む。
場合によって、本発明のCARの膜貫通ドメインはCD8ヒンジドメインを含む。1つの態様において、CD8ヒンジドメインは、SEQ ID NO: 4の核酸配列を含む。1つの態様において、CD8ヒンジドメインは、SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、CD8ヒンジドメインは、SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を含む。
細胞質ドメイン
本発明のCARの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが挿入された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化した機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってよい。よって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を行うよう指示するタンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる範囲では、そのような切断部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、これは無傷の鎖の代わりに使用され得る。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる切断部分も含むことが意図される。
本発明のCARにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原と受容体の結合に続くシグナル伝達を開始するために共同して作用するT細胞受容体(TCR)および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変種、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
TCRのみを介して生じたシグナルは、T細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要であることが知られている。よって、T細胞活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：TCRを介して抗原依存的な一次活性化を開始させる配列(一次細胞質シグナル伝達配列)、および抗原非依存的な様式で作用して、二次または共刺激シグナルを提供する配列(二次細胞質シグナル伝達配列)によって媒介され得る。
一次細胞質シグナル伝達配列は、促進的方法または抑制的方法のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を調節する。促進的様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用であるITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例には、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれる。本発明のCAR中の細胞質シグナル伝達分子が、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが、特に好ましい。
好ましい態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζシグナル伝達ドメインを、単独で、または本発明のCARとの関連で有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように、設計され得る。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの部分を指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例には、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンド等が含まれる。よって、本発明は共刺激シグナル伝達エレメントとして主に4-1BBを用いて例証されるが、その他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。
本発明のCARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムなまたは特定の順序で相互に連結され得る。任意で、好ましくはアミノ酸長2〜10の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーが、連結を形成し得る。グリシン-セリン2つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインならびにCD28および4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
1つの態様において、本発明のCAR中の細胞質ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 6に記載される核酸配列を含み、CD3-ζのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 7に記載される核酸配列を含む。
1つの態様において、本発明のCAR中の細胞質ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 18のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、CD3-ζのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
1つの態様において、本発明のCAR中の細胞質ドメインは、4-1BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 18に記載されるアミノ酸配列を含み、CD3-ζのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 19に記載されるアミノ酸配列を含む。
ベクター
本発明は、細胞内ドメインの核酸配列に機能的に連結された抗原結合部分の核酸配列を含む、CARの配列を含むDNA構築物を包含する。本発明のCARにおいて使用され得る例示的な細胞内ドメインには、CD3-ζ、CD28、4-1BB等の細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。場合によって、CARは、CD3-ζ、CD28、4-1BB等の任意の組み合わせを含み得る。
1つの態様において、本発明のCARは、抗FRα scFv、ヒトCD8ヒンジおよび膜結合ドメイン、ならびにヒト4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO: 1に記載される核酸配列を含む。別の態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO: 13のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO: 13に記載されるアミノ酸配列を含む。
1つの態様において、本発明のCARは、ヒト化抗FRα scFv、ヒトCD8ヒンジおよび膜結合ドメイン、ならびにヒト4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO: 20に記載される核酸配列を含む。別の態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO: 22のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の態様において、本発明のCARは、SEQ ID NO: 22に記載されるアミノ酸配列を含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、標準的な技法を用いて、その遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによる、その遺伝子を含むことが知られているベクターから該遺伝子を導出することによる、またはその遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによるなど、当技術分野で公知の組換え法を用いて得ることができる。あるいは、関心対象の遺伝子は、クローニングではなく、合成によって生成することもできる。
本発明はまた、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的な安定した組込みおよび娘細胞でのその増殖を可能にするため、長期的遺伝子導入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入し得るという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに勝る付加的な利点を有する。このベクターは、免疫原性が低いという付加的な利点も有する。
簡潔にまとめると、CARをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、その構築物を発現ベクター中に組み入れることによって達成される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに適切であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳のターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸の発現を調節するのに有用なプロモーターを含む。
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いて、核酸免疫化および遺伝子療法に使用することもできる。遺伝子送達のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号を参照されたい。別の態様において、本発明は遺伝子療法ベクターを提供する。
核酸をいくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に関心の高いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクターの技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.(2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、ならびに他のウイルス学および分子生物学の手引書に記載されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物体において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択可能マーカーを含む(例えば、WO 01/96584；WO 01/29058；および米国特許第6,326,193号)。
ウイルスベースのいくつかの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技法を用いて、選択された遺伝子をベクター中に挿入し、レトロウイルス粒子中にパッケージすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエキソビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。いくつかのレトロウイルス系が、当技術分野で公知である。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターが用いられる。いくつかのアデノウイルスベクターが、当技術分野で公知である。1つの態様では、レンチウイルスベクターが用いられる。
付加的なプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが最近示された。プロモーターエレメント間の間隔にはしばしば柔軟性があり、その結果、エレメントが互いに対して反転または移動されても、プロモーター機能は保存される。チミヂンキナーゼ(tk)プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前の50 bp離れたところまで増加され得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同してまたは独立して機能し得ると考えられる。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、これに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子-1α(EF-1α)である。しかしながら、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイル前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに非限定的に、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列もまた使用することができる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、このような発現が所望される場合にオンにし、または発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
CARポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含んで、ウイルスベクターによりトランスフェクトまたは感染されるように試みられた細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることができる。他の局面において、選択可能マーカーは、DNAの別個の断片上で運搬され、同時トランスフェクション手順で使用され得る。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて、宿主細胞内での発現を可能にすることができる。有用な選択可能マーカーには、例えばneo等などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために、レポーター遺伝子が用いられる。一般に、レポーター遺伝子とは、レシピエント生物または組織内に存在しないかまたはそこで発現されず、かつその発現が例えば酵素活性などの、いくつかの容易に検出可能な特性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、レシピエント細胞にDNAが導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれる(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479:79-82)。適切な発現系は周知であり、公知の技法を用いて調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す最小5'隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動性の転写を調節する能力について薬剤を評価するために用いることができる。
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターとの関連において、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって、宿主細胞に移入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーション等が含まれる。ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al.(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス等から導出することができる。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
非ウイルス性送達系が使用される場合、例示的な送達媒体はリポソームである。宿主細胞内への核酸の導入(インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)に、脂質製剤の使用が企図される。別の局面において、核酸を脂質と会合させることができる。脂質と会合される核酸は、リポソームの水性内部に封入すること、リポソームの脂質二重層内に散在させること、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着させること、リポソーム内に捕捉すること、リポソームと複合体形成させること、脂質を含む溶液中に分散させること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、脂質中に懸濁液として含めること、ミセルと共に含めるかもしくはミセルと複合体形成させること、または別の方法で脂質と会合させることができる。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクターと関連した組成物は、溶液中での任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造を有して存在し得る。それらはまた、溶液中に単に散在されてもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集物を形成する可能性がある。脂質とは、天然脂質または合成脂質であってよい脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質内で天然に生じる脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma、St. Louis, MOから入手することができ；リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories(Plainview, NY)から入手することができ；コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)およびその他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質保存液は、約-20℃で貯蔵することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸散するため、クロロホルムが唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」とは、閉鎖した脂質二重層または凝集物の生成によって形成される種々の単層性および多層性の脂質媒体を包含する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造を有すると特徴づけられ得る。多重膜リポソームは、水性媒質によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁された場合に、自発的に生じる。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成を起こし、脂質二重層間に水および溶解された溶質を捕捉する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物もまた包含される。例えば、脂質はミセル構造を想定してもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集物として存在してもよい。リポフェクタミン-核酸複合体もまた企図される
外因性核酸を宿主細胞に導入するため、またはさもなければ細胞を本発明の阻害剤に曝露するために用いられた方法にかかわらず、宿主細胞中の組換えDNA配列の存在を確認するためには、種々のアッセイを行うことができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRなど；「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無の、例えば免疫学的手段(ELISAおよびウエスタンブロット)または本発明の範囲内に入る薬剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによる検出などが含まれる。
T細胞の活性化および拡大
望ましいCARを発現するようにT細胞を遺伝子改変する前であるか改変した後であるかにかかわらず、一般的に、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005に記載されている方法を用いて、T細胞を活性化して拡大することができる。
一般的に、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが付着している表面との接触によって、拡大される。具体的には、T細胞集団は、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体との接触によるか、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼC活性化因子(例えば、ブリオスタチン)との接触によるなど、本明細書に記載されるように刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、そのアクセサリー分子と結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のいずれかの増殖を刺激するには、抗CD3抗体および抗CD28抗体、抗CD28抗体の例としては、9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone、Besancon, France)を使用することができ、当技術分野で一般に知られている他の方法(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)のように使用することができる。
ある種の態様において、T細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在してもよく、または表面に結合していてもよい。表面に結合している場合、それらの薬剤は同じ表面に(すなわち、「シス」構成で)、または別個の表面に(すなわち、「トランス」構成で)結合していてよい。あるいは、一方の薬剤は表面に結合していてよく、他方の薬剤は溶液中に存在してよい。1つの態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在するか、または表面に結合している。ある種の態様では、両方の薬剤が溶液中に存在し得る。別の態様において、薬剤は可溶型であり、Fc受容体を発現する細胞、または該薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面に架橋することができる。これに関しては、例えば、本発明においてT細胞の活性化および拡大における使用が企図される人工的抗原提示細胞(aAPC)に関する米国特許出願公開第20040101519号および第20060034810号を参照されたい。
1つの態様において、2つの薬剤は、同じビーズ上に、すなわち「シス」、または別個のビーズに、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズ上に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗CD3抗体またはその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗CD28抗体またはその抗原結合断片であり；両薬剤は、同じビーズに等モル量で同時に固定化される。1つの態様では、CD4+ T細胞拡大およびT細胞成長のために、ビーズに結合している1：1比の各抗体が用いられる。本発明のある種の局面では、1：1の比率を用いた場合に観察される拡大と比較してT細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合している抗CD3抗体：抗CD28抗体の比率が用いられる。1つの特定の態様では、1：1の比率を用いた場合に観察される拡大と比較して、約1〜約3倍の増加が観察される。1つの態様において、ビーズに結合しているCD3抗体：CD28抗体の比率は、100：1〜1：100およびその間のあらゆる整数値の範囲である。本発明の1つの局面では、抗CD3抗体よりも多くの抗CD28抗体を粒子に結合させる、すなわちCD3：CD28の比率は1未満である。本発明のある種の態様では、ビーズに結合している抗CD28抗体と抗CD3抗体の比率は、2：1よりも大きい。1つの特定の態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が1：100の抗体が用いられる。別の態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が1：75の抗体が用いられる。さらなる態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が1：50の抗体が用いられる。別の態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が1：30の抗体が用いられる。1つの好ましい態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が1：10の抗体が用いられる。別の態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が1：3の抗体が用いられる。さらに別の態様では、ビーズに結合しているCD3：CD28比が3：1の抗体が用いられる。
T細胞または他の標的細胞を刺激するには、1：500〜500：1およびその間の任意の整数値の粒子対細胞の比率を用いることができる。当業者が容易に認識し得るように、粒子対細胞の比率は、標的細胞に対する粒径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは数個の細胞としか結合することができないのに対して、大きいビーズは多くの細胞と結合できる。ある種の態様では、細胞対粒子の比率は、1：100〜100：1およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる態様では、比率は1：9〜9：1およびその間の任意の整数値を含み、これをT細胞の刺激に使用することもできる。T細胞刺激をもたらす抗CD3および抗CD28結合粒子とT細胞の比率は、上記のように変動し得るが、ある種の好ましい値には、1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、および15：1が含まれ、1つの好ましい比率は、T細胞当たりの粒子が少なくとも1：1である。1つの態様では、1：1またはそれ未満の粒子対細胞の比率が用いられる。1つの特定の態様において、好ましい粒子：細胞比は1：5である。さらなる態様において、粒子対細胞の比率を刺激の日に応じて変化させることができる。例えば、1つの態様において、粒子対細胞の比率は1日目は1：1〜10：1であり、その後10日目までは毎日または1日おきに、1：1〜1：10の最終比で(添加日の細胞数に基づく)付加的な粒子が細胞に添加される。1つの特定の態様において、粒子対細胞の比率は刺激の1日目は1：1であり、刺激の3日目および5日目は1：5に調整される。別の態様では、刺激の1日目は1：1、ならびに3日目および5日目は1：5の最終比になるように、粒子が毎日または一日おきに添加される。別の態様において、粒子対細胞の比率は刺激の1日目は2：1であり、刺激の3日目および5日目は1：10に調整される。別の態様では、刺激の1日目は1：1、ならびに3日目および5日目は1：10の最終比になるように、粒子が毎日または一日おきに添加される。種々の他の比率も本発明での使用に適切であり得ることを、当業者は認識するであろう。具体的には、比率は、粒径ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて異なる。
本発明のさらなる態様では、T細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと混合した後、ビーズと細胞を分離し、次に細胞を培養する。代替的態様では、培養に先だって、薬剤被覆ビーズと細胞を分離せずに、共に培養する。さらなる態様では、まず、磁力などの力を加えることによってビーズおよび細胞を濃縮して、細胞表面マーカーの結合増加をもたらし、それによって細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質は、抗CD3および抗CD28が付着している常磁性ビーズ(3x28ビーズ)がT細胞に接触することを可能にすることによって、結合させることができる。1つの態様では、細胞(例えば、104〜109個のT細胞)およびビーズ(例えば、1：1の比率のDYNABEADS(登録商標) M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ)を、緩衝液、好ましくはPBS(カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない)中で混合する。この場合も同様に、当業者は、いかなる細胞濃度も使用できることを容易に認識し得る。例えば、標的細胞は試料中に非常に稀であり、試料のわずかに0.01％を構成してもよく、または試料全体(すなわち、100％)が関心対象の標的細胞を構成してもよい。したがって、いかなる細胞数も本発明の状況内である。ある種の態様では、粒子および細胞が共に混合される容積を顕著に減少させて(すなわち、細胞の濃度が増加する)、細胞と粒子の最大接触を確実にすることが望ましいと考えられる。例えば、1つの態様では、約20億個細胞/mlの濃度が用いられる。別の態様では、1億個超の細胞/mlが用いられる。さらなる態様では、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、または5000万個細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらに別の態様では、7500、8000、8500、9000、9500万個、または1億個細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらなる態様では、1億2500万〜1億5000万個細胞/mlの濃度が用いられる。高濃度を用いることで、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大が増加し得る。さらに、高い細胞濃度の使用により、CD28陰性T細胞などの、関心対象の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲が可能になる。このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、ある種の態様において得ることが望ましい。例えば、高濃度の細胞を用いることで、通常比較的弱いCD28発現を有するCD8+ T細胞のより効率的な選択が可能になる。
本発明の1つの態様では、混合物を数時間(約3時間)〜約14日間、またはその間の任意の時間単位での整数値にわたって培養することができる。別の態様では、混合物を21日間培養することができる。本発明の1つの態様では、ビーズとT細胞を約8日間共に培養する。別の態様では、ビーズとT細胞を2〜3日間共に培養する。T細胞の培養時間が60日間またはそれ以上になり得るように、数サイクルの刺激が所望される場合もある。T細胞培養に適した条件には、血清(例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、およびTNF-α、または当業者に公知の任意の他の細胞成長用添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含み得る適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 15(Lonza))が含まれる。他の細胞成長用添加物には、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチルシステインおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定さない。培地には、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加したものであって、無血清であるか、または適量の血清(または血漿)もしくは所定のホルモン、ならびに/またはT細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインを補充したものが含まれ得る。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含め、対象に注入しようとする細胞の培養物には含めない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気＋5％ CO2)の下で維持される。
様々な刺激時間曝露されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的血液またはアフェレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性または抑制性T細胞集団(TC, CD8+)よりもより多くのヘルパーT細胞集団(TH, CD4+)を有する。CD3およびCD28受容体を刺激することによるT細胞のエキソビボ拡大は、約8〜9日目よりも前に、主にTH細胞からなるT細胞集団を生じ、約8〜9日目以降、このT細胞集団は、次第により多くのTC細胞集団を含むようになる。したがって、治療目的に応じて、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することは、有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離された場合、このサブセットをより大きく拡大することは有益であり得る。
さらに、CD4およびCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、細胞拡大過程中に著しく、しかし大部分は再現性よく変動する。よって、このような再現性により、具体的な目的のために活性化T細胞生成物を調整する能力が可能になる。
治療適用
本発明は、レンチウイルスベクター(LV)が形質導入された細胞(例えば、T細胞)を包含する。例えば、LVは、特異的抗体の抗原認識ドメインと、CD3-ζ、CD28、4-1BB、またはこれらの任意の組み合わせの細胞内ドメインを組み合わせたCARをコードする。そのため、場合によって、形質導入されたT細胞はCAR媒介性T細胞応答を誘発し得る。
本発明は、初代T細胞の特異性を腫瘍抗原へと再方向づけるための、CARの使用を提供する。よって、本発明はまた、所定の標的と特異的に相互作用する結合部分、例えばヒトCD3ζの細胞内ドメインを含むζ鎖部分、および共刺激シグナル伝達領域を含むCARを発現するT細胞を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、CARを発現するようにT細胞を遺伝子改変し、CAR T細胞をそれを必要とするレシピエントに注入する、ある種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエント内で腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、CAR T細胞はインビボで複製して、持続的な腫瘍制御を引き起こし得る長期持続をもたらすことができる。
1つの態様において、本発明のCAR T細胞は強いインビボT細胞拡大を起こすことができ、長期間にわたって持続し得る。別の態様において、本発明のCAR T細胞は、任意のさらなる腫瘍の形成または成長を阻害するために再活性化され得る特異的記憶T細胞に転じる。例えば、本発明のFRα特異的CAR T細胞が強いインビボT細胞拡大を起こし、血液および骨髄中で長期間にわたって高レベルで持続し、特異的記憶T細胞を形成し得ることは、予想外であった。いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、CAR T細胞は、代替抗原を発現する標的細胞との遭遇およびその後の除去に際して、インビボでセントラル記憶様状態に分化し得る。
いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、CAR改変T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得る。加えて、CAR媒介性の免疫応答は、CAR改変T細胞がCAR中の抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部であり得る。例えば、FRα特異的CAR T細胞は、FRαを発現する細胞に対して特異的な免疫応答を誘発する。
本明細書に開示されるデータは、具体的には、抗FRα scFv、ヒトCD8αヒンジおよび膜結合ドメイン、ならびにヒト4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを開示しているが、本発明は、本明細書の他所に記載される構築物の成分のそれぞれに対するいくつもの変化形を含むと解釈されるべきである。すなわち、本発明は、抗原結合部分に特異的なCAR媒介性T細胞応答を生じるための、CARにおける任意の抗原結合部分の使用を含む。例えば、本発明のCAR中の抗原結合部分は、癌を治療する目的で腫瘍抗原を標的化し得る。
治療され得る癌には、血管新生されていないか、または実質的にまだ血管新生されていない腫瘍、および血管新生された腫瘍が含まれる。癌は、非固形腫瘍(例えば白血病およびリンパ腫といった血管腫瘍など)を含んでもよいし、または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のCARで治療される癌の種類には、癌種、芽細胞腫、および肉腫、およびある種の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性の腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌種、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍/癌または小児腫瘍/癌もまた含まれる。
1つの態様において、本発明のCARの抗原結合部分の部分は、特定の癌を治療するように設計される。FRαとは、一連の上皮性悪性腫瘍における癌細胞の表面上で過剰発現されるが、正常組織では限定されるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質である。したがって、FRαを標的化するように設計されたCARを用いて、FRαの過剰発現を示す細胞および/または組織によって特徴づけられる、上皮癌を含むがこれに限定されない任意の疾患または障害を治療することができる。例えば、FRαを標的化するように設計されたCARを用いて、卵巣癌、肺癌、乳癌、腎癌、結腸直腸癌、他の固形癌等を含むがこれらに限定されない癌および障害を治療することができる。
しかしながら、本発明は、本明細書に開示される抗原標的および疾患に単に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、疾患を治療するためにCARを使用することができる場合の、該疾患と関連したいかなる抗原性標的も含むと解釈されるべきである。
本発明のCAR改変T細胞はまた、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および/またはインビボ療法のためのある種のワクチンとして機能し得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
エクスビボ免疫化に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、以下のうちの少なくとも1つをインビトロで行う：i) 細胞の拡大、ii) CARをコードする核酸の細胞への導入、および/またはiii) 細胞の凍結保存。
エクスビボ手順は当技術分野で周知であり、以下にさらに詳述される。簡潔に説明すると、哺乳動物(好ましくはヒト)から細胞を単離し、本明細書に開示されるCARを発現するベクターで遺伝子改変する(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする)。CAR改変細胞を哺乳動物レシピエントに投与して、治療利点を提供することができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、CAR改変細胞はレシピエントに関して自己であってよい。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種、同系、または異種であってもよい。
造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ拡大のための手順は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,199,942号に記載されており、これを本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法も当技術分野で公知であり、そのため、本発明は、細胞のエクスビボ拡大の任意の特定の方法に限定されない。簡潔に説明すると、T細胞のエクスビボ培養および拡大は、(1) 哺乳動物の末梢血採取物または骨髄外植片からCD34+造血幹細胞および前駆細胞を回収する段階；ならびに(2) そのような細胞をエクスビボで拡大する段階を含む。米国特許第5,199,942号に記載される細胞増殖因子に加えて、flt3-L、IL-1、IL-3、およびc-kitリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および拡大に使用することができる。
エクスビボ免疫化に関する細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するインビボ免疫化のための組成物および方法を提供する。
一般的に、本明細書に記載されるように活性化および拡大された細胞を、免疫不全症の個体で生じる疾患の治療および予防に使用することができる。具体的には、卵巣癌の治療において本発明のCAR改変T細胞が用いられる。ある種の態様にでは、卵巣癌を発症するリスクのある患者の治療において、本発明の細胞が用いられる。よって、本発明は、本発明のCAR改変T細胞の治療有効量をそれと必要とする対象に投与する段階を含む、卵巣癌の治療または予防のための方法を提供する。
本発明のCAR改変T細胞は、単独で、または希釈剤および/もしくは他の成分、例えばIL-2もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などと組み合わせて、薬学的組成物として投与することができる。簡潔に説明すると、本発明の薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される標的細胞集団を含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等など；糖質、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシンなど；抗酸化剤；キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオンなど；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは静脈内投与用に製剤化される。
本発明の薬学的組成物は、治療(または予防)すべき疾患に適した様式で投与することができる。適切な投与量は臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定される。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個々の違いを考慮して、医師により決定され得る。一般的に、本明細書に記載されるT細胞を含む薬学的組成物は、この範囲内のあらゆる整数値も含め、104〜109個細胞/kg体重、好ましくは105〜106個細胞/kg体重の投与量で投与してよいと述べることができる。T細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法で一般に知られている注入技法を用いて投与することができる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい)。特定の患者に対する最適な投与量および治療計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
ある種の態様では、活性化T細胞を対象に投与した後に再度採血し(またはアフェレーシスを行い)、これに由来するT細胞を本発明に従って活性化し、これらの活性化され拡大されたT細胞を患者に再度注入することが望ましい場合がある。この過程は、数週間ごとに複数回行うことができる。ある種の態様において、T細胞は、10 cc〜400 ccの採血物から活性化することができる。ある種の態様において、T細胞は、20 cc、30 cc、40 cc、50 cc、60 cc、70 cc、80 cc、90 cc、または100 ccの採血物から活性化される。理論によって拘束されないが、この複数回の採血/複数回の再注入プロトコールの使用は、ある種のT細胞集団を選び出すのに役立ち得る。
本組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、植込み、または移植を含む、任意の簡便な様式で行うことができる。本発明に記載される組成物は、患者に皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、結節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内(i.v.)注射によって投与、または腹腔内投与することができる。1つの態様において、本発明のT細胞組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。別の態様では、本発明のT細胞組成物は、好ましくはi.v.注射によって投与される。T細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染の部位に直接注射してもよい。
本発明のある種の態様において、本明細書に記載される方法、またはT細胞が治療レベルまで拡大される、当技術分野で公知の他の方法を用いて活性化され拡大された細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン-2などの薬剤による治療、MS患者のためのシタラビン(ARA-Cとしても知られる)もしくはナタリズマブ治療、または乾癬患者のためのエファリズマブ治療、またはPML患者のための他の治療を含むがこれらに限定されない、いくつもの関連治療様式と共に(例えば、これよりも前に、これと同時に、またはこの後に)、患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびFK506など、抗体、またはCAM PATHなどの他の免疫除去剤、抗CD3抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン(cytoxin)、フルダリビン(fludaribine)、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と併用することができる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼ、カルシニューリンを阻害するか(シクロスポリンおよびFK506)、または増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体を用いたT細胞除去療法と共に(例えば、これよりも前に、これと同時に、またはこの後に)、患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、B細胞除去療法、例えばCD20と反応するRituxanなどの薬剤に続いて投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量の化学療法による標準治療と、その後の末梢血幹細胞移植を受け得る。ある種の態様では、移植後に、対象は、本発明の拡大された免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、拡大された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に投与すべき上記治療の投与量は、治療される状態および治療のレシピエントの明確な性質によって異なる。ヒト投与のための投与量の増減調整は、当技術分野で認められている慣例に従って行うことができる。例えばCAMPATHの用量は、成人患者の場合一般的に1〜約100 mgの範囲であり、通常は1〜30日間、毎日投与される。好ましい1日用量は1日当たり1〜10 mgであるが、場合によっては1日当たり40 mgまでのより高い用量を使用することもできる(米国特許第6,120,766号に記載される)。
以下の実験例を参照して、本発明をさらに詳述する。これらの実施例は説明のためだけに提供され、別段の規定がない限り、限定を意図するものではない。よって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなるありとあらゆる変化形を包含すると解釈されるべきである。
さらなる記載なしに、当業者は、前述の記載および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および使用し、主張される方法を実施することができると考えられる。そのため、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指摘するものであり、本開示の残りの部分をいかなる方法でも限定すると解釈されるべきではない。
これらの実験において使用される材料および方法をこれより記載する。
抗α葉酸受容体(αFR)Tボディ分子の作製
抗αFR scFv(MOv19)を、以下のプライマー：
Figure 2014509841
(BamHIを下線表示)および
Figure 2014509841
(NheIを下線表示)
を用いる780-bp MOv19断片のPCR増幅のための鋳型として使用した。
得られたPCR産物は、5α末端にBamHI部位および3α末端にNheI部位を含んだ。CD8αヒンジ、膜貫通、およびサイトゾル領域を、以前に構築された鋳型ならびに以下のプライマー：
Figure 2014509841
(NheIを下線表示)および
Figure 2014509841
(機能的TCRζ含有分子用、SalIを下線表示)
を用いてPCRにより増幅した。
重複伸長による遺伝子スプライシングにより、キメラ免疫受容体構築物を作製した。等モル量のMOv19 PCR産物、ならびにCD8ヒンジ、膜貫通、およびサイトゾルPCR産物を、
Figure 2014509841
(XbaIを下線表示)および
Figure 2014509841
(機能的TCRζ含有分子用、SalIを下線表示)と混合した。
次に最終PCR産物をXbaIおよびSalIで消化し、CMVプロモーターと置き換えられたEF-1αプロモーターによって導入遺伝子発現が駆動される、pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPREに基づく第3世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクターであるpELNSに連結した。高力価で研究等級の複製欠損レンチウイルスベクターを生成し、濃縮した。
本プロトコールにおける研究薬剤は、α-FR-CARを形質導入された自己T細胞である(図6)。自己T細胞に、α-FR CARを発現するレンチウイルスベクターを形質導入する。これは形質導入されたT細胞の特異性を、上皮性卵巣癌(EOC)の90％において高レベルで発現されるが正常ではほとんど存在しないαFRを発現する腫瘍へと再方向づけする。α-FR CARを、TCRζ、4-1BBからなる細胞内シグナル伝達分子に連結する。scFv MOv19は、マウスモノクローナル抗体に由来し、よって免疫原性であるマウス配列を含む。臨床的な実行可能性および有効性を早く確立するのであれば、後期臨床開発のためにこのscFvをヒト化する。導入遺伝子の細胞質シグナル伝達ドメインは、完全に天然ヒト配列のものである。これらの受容体は、MHC非依存的様式で抗原と結合するという点で「普遍的」であり、よって1つの受容体構築物を用いて、α葉酸受容体抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療することができる。最終導入遺伝子構築物を、pELNSレンチウイルスベクターにクローニングした(図6および7)。
α葉酸受容体(αFR)キメラ免疫受容体遺伝子送達に用いられるプラスミドを、図8Aに模式的に示す。移入ベクターは、5' LTRおよび3' U3欠失LTRを含む、HIV由来の自己不活性化(SIN)ベクターである。導入遺伝子の転写は、哺乳動物ef-1αプロモーターから駆動される。導入遺伝子は、細胞外ドメインMOv19(αFR scFv)ならびにシグナル伝達ドメイン4-1BBおよびCD3ζ鎖から構成される。ベクターはまた、形質導入効率改善のためのセントラルポリプリントラクトおよびセントラル終結配列(cppt/CTS)、RNA輸送のためのrev応答エレメント(RRE)、RNA翻訳改善のためのWPREエレメント、ならびにパッケージング配列を含む。
不活性型のCD3-ζ細胞内ドメイン(MOv19-Δζ)、CD3ζ鎖シグナル伝達モジュール(MOv19-ζ)、またはCD137(4-1BB)共刺激モチーフと組み合わせたCD3ζ鎖シグナル伝達モジュール(MOv19-BB-ζ)のいずれかに結合しているFRα特異scFv(MOv19)を含む新規CARを構築した(図6)。レンチウイルスベクターを用いて、ヒトT細胞にCARを形質導入した。共培養アッセイにおいて、IFN-g ELISAおよびサイトカインビーズアッセイにより、FRαを発現する卵巣癌細胞に対するCAR形質導入T細胞の反応性を測定した。インビトロにおいて生物発光系を用いて、細胞傷害性を測定した。WinnアッセイおよびNOGマウスにおける異種移植モデルにおいて、αFR CARの潜在的抗腫瘍有効性を探索した。
患者に付与され得る、または患者の細胞を処置するために使用され得る材料の調製、構造、および組成
CAR構築物はUniversity of Pennsylvaniaで開発され、臨床等級のベクターは、Dr. Larry Coutureの指示の下でCity of Hopeにおいてクローニングされ、製造される。臨床等級の操作されたT細胞は、University of PennsylvaniaのClinical Cell and Vaccine Production Facilityで製造される。培養の終了時に、細胞をバッグ中の注入用凍結媒質中で凍結保存する。各バッグは、注入等級の試薬を含む凍結媒質の一定分量(容積は用量に依存する)を含む。第1層の対象は、用量漸増アプローチを用いて、超音波ガイド下または手術中のいずれかでの直接的な腫瘍内注射により、α-FR CAR形質導入T細胞の単一用量を受けることができる。第2層の対象は、用量漸増アプローチを用いて、形質導入T細胞の分割用量静脈内注入(0日目、1日目、および2日目にそれぞれ10％、30％、および60％)を受ける。
DNA純度の測定
ベクターを製造するために用いられるDNAは、アンピシリン選択下でLB培地中で増殖した大腸菌(E. coli)細胞から単離する。DNAは、その同一性および純度を保証するために、品質管理(QC)出荷試験を受ける。DNAを、外観(清澄および無臭)、260/280比(1.7〜2.0)、アガロースゲル電気泳動(≧90％スーパーコイル)、残存RNA(非検出/μg)、直鎖状プラスミドDNAまたは染色体DNA(非検出/μg)、制限酵素マッピング、エンドトキシン(＜30 EU/mg)、および無菌性について試験する。
ウイルス生成
レンチウイルスベクターは、City of Hopeによって生成される。City of Hopeは、一方向性のGMP支持区域内部の2つの独立したクラス10,000製造室(AおよびB)からなる第I相/第II相cGMP製造施設を建設した。各部屋は、入口/更衣室エアロック、細胞拡大研究室、生産研究室、精製/緩衝液調製研究室、および出口/脱衣室エアロックからなる。各部屋は、HEPA供給および制御排気を備えた独立した空気処理装置を有する。部屋間および部屋内の圧力差は、温度および湿度と同様に調節される。環境状態およびGMP設備は、集中建物モニターシステムによりモニターされ、記録され、かつ警告される。あらゆる移行およびいかなる開放容器操作も、これらの部屋において一方向流動のクラス100フード内で行われる。
支持GMP区域は、GMP制御貯蔵所、-80℃制御貯蔵所、+4℃制御貯蔵所、USP水システム、USPガス供給システム、材料用エアロック、個別のロッカー室、更衣室エアロック、入口廊下、オートクレーブ/洗浄室、および出口廊下を含む。全体的分類が100,000である空間を支持するために、エアロック、廊下、および直接アクセス支持区域にはすべて、複数のGMP空気処理装置によってHEPAフィルター供給空気が供給される。
293T細胞におけるウイルス生成
(Zufferey et al, 1997)に類似した系において、gag/pol、tat、rev、およびVSV-Gを提供する3種プラスミド生成系を用いて、一過性トランスフェクションによりウイルスベクターを生成する。唯一の重複領域は、パッケージングおよびgagおよびcppt/CTS配列内にある。後述するFDA指針に従って、RCL試験を行う。
この過程は、GMP確証マスター細胞バンク由来の凍結293T細胞の単一バイアルから開始する。細胞を融解し、いくつかのサイズの培養フラスコ中で、何世代か継代することにより拡大して、細胞数および細胞容積を増加させる。City of Hopeは、接着細胞株および懸濁細胞株の両方を有する。これは、接着細胞株生成過程の一般的記述である。
融解した細胞を遠心分離してペレットにし、細胞培養液中に再懸濁し、細胞計数を行う。培地を含む複数のフラスコに、細胞を特定の細胞密度になるよう播種する。フラスコを、インキュベーター中で37℃および5％ CO2濃度にて約24時間インキュベートする。24時間後、細胞を含むフラスコから培地を除去し、増殖培地をフラスコおよび細胞に添加する。フラスコを、同じ温度およびCO2にてさらに24時間再度インキュベートする。インキュベーターからフラスコを取り出し、培地を除去し、トリプシン溶液を用いて細胞を表面から解離させ、細胞を計数し、フラスコ中、増殖培地で特定の播種密度になるよう、5倍多くのフラスコに拡大する。フラスコを37℃および5％ CO2にて48時間インキュベートする。この時間の終了時点で、フラスコから培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、細胞を計数し、最大10個の細胞ファクトリー(4層)に、特定の細胞密度および細胞ファクトリー当たり800 mLの増殖培地になるよう播種する。細胞ファクトリーを、37℃および5％ CO2にておよそ72時間インキュベートする。次いで細胞ファクトリーから培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、計数し、これを用いておよそ1.5 Lの増殖培地で10個の細胞ファクトリー(10層)に播種する。これら10個の細胞ファクトリーを、37℃および5％ CO2にて約24時間インキュベートする。細胞ファクトリーから培地を除去し、細胞に、培地、トランスフェクション試薬、および3種のGMPプラスミドを含むトランスフェクション試薬をトランスフェクトする。
トランスフェクション試薬は、リン酸カルシウム溶液中の3種のGMP生成プラスミド；有効な遺伝子を含むDNAプラスミド、および2種類のDNAヘルパープラスミド、p93およびpVSV-Gからなる。GMPプラスミドは、DNAプラスミドを十分に配列決定し、このDNAを大腸菌株にトランスフェクトし、大腸菌を増殖させてマスター細胞バンクを作製することによって調製する。マスター細胞バンク由来のバイアルを用いてDNAプラスミドを発現させ、これを精製し、分注し、配列、純度、および無菌性について試験する。
細胞ファクトリーにトランスフェクション試薬をトランスフェクトした後、それらをおよそ20時間インキュベートする。トランスフェクション試薬を除去し、増殖培地を細胞ファクトリーに添加する。次いで、これらをさらに24時間インキュベートしてから回収する。
ベクター精製および出荷試験
医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準(GMP)に従って、ウイルスベクターを精製する。ベクターを含む液体を細胞ファクトリーから注ぎ出し、プールし、次いで0.8/0.45ミクロン清澄フィルターを通して濾過清澄化する。清澄化された回収物を、クロマトグラフィーカラム中の陰イオン交換樹脂上に負荷する。イオン交換カラムを低塩濃度緩衝液で洗浄した後、半精製ベクターを0.7 M NaCl緩衝液で溶出する。
次に、500 kD接線流フィルター(TFF)膜を用いて溶出緩衝液を濃縮し、10×濃度になるように低塩濃度緩衝液で透析濾過する。残存DNAを除去するためにbenzonaseエンドヌクレアーゼを溶液に添加し、およそ1時間インキュベートする。処理した溶液を500 kD TFF膜を用いてさらに10×になるようさらに濃縮した後、およそ10倍容積の製剤化緩衝液で透析濾過する。透析濾過後、精製ベクター溶液を、必要に応じて10×〜20×にさらに濃縮する。最終濃縮物を所望の容積で滅菌血漿バッグに充填し、サンプリングし、その後-80℃で凍結する。
試料を試験し、証拠書類をすべて再調査し、承認されてから材料を出荷する。ベクター出荷試験は、以下のように行う：純度は、目視検査(透明かつ無色)、pH(7.0〜7.4)、伝導率(4〜7 mS/cm)、充填容積(≧40 ml)、総タンパク質量≦0.70 mg/ml、およびbenzonase(≦100 ng/mlまたは0.1 ppm)によって試験する；同一性は、銀染色したSDS-page、および構築物/導入遺伝子に特異的なRT-PCRによって試験する；効力は、293細胞における力価(≧2.5×107 TU/ml)によって試験する；安全性に関しては、ベクターを、gag DNAについてqPCR(検出不能)により、ならびにRCLについてVSV-G DNAおよび生物学的RCL試験(以下に記載)により試験する；無菌性試験には、エンドトキシン(＜100 EU/ml)、無菌性(増殖なし)、外来性ウイルス(検出不能)、およびマイコプラズマ(検出不能)が含まれる；ベクターはまた、p24 ELISA(0.1〜10μg/ml)によって試験する。各ベクターに対して、個別の分析証明書(C of A)が提供され得る。
RCLアッセイ
組換えまたは複製能を有するレンチウイルス(RCL)についての試験は、RCRの試験に関するFDA指針に従って行う。C8166細胞をベクター上清に曝露し、3週間継代する。培養上清を、ELISAによりp24産生について、およびPCRによって測定されるパッケージングDNAの持続または増殖数についてモニターする。指針に従うこれらのアッセイの試験物品は、培養上清の5％または300 mlのいずれか少ない方、および10×108個の生成終了(EOP)細胞である。試験は、Indiana UniversityのNational Gene Vector Laboratoriesで行われる。
ベクターの包装、輸送、および貯蔵
Lentigen DMFに記載されているCity of Hope輸送SOPに従って、ベクターの第1ロットがUPENNに輸送される。その後のベクターロットの輸送は、どこでGMPロットが製造されるかに応じて、Omnia Biologics、Indiana University、またはLentigen Corporationから行われ得る。
ベクター安定性モニタリング計画
ベクターの効力は、コピー数および/または導入遺伝子発現レベルによって測定される形質導入効率により、各細胞生成物において決定される。各ベクターロットは個別でありサイズが小さいため、この段階のこの研究のベクターについては、安定性モニタリング計画は導入されない。加えて、安定性試験計画は、CVPFが、それらの標準的なアッセイを用いた力価測定のために製造施設にベクターを送り返すことを必要とする。安定性試験への輸送段階の導入により、可変項目が導入される。
組換えDNAの意図される標的細胞、エクスビボで処理され、患者に戻されるべき細胞、処理前および処理後の細胞の特徴づけ、ならびに標的細胞のDNAの取り込み
標的細胞生成物は、自己のCD3+自己Tリンパ球である。単回使用の閉鎖系使い捨てセットを使用する、Gambro Elutra上での向流遠心分離水簸による単球の枯渇により、白血球除去生成物からTリンパ球を濃縮する。0日目に、抗CD3/CD28 mAb被覆磁気ビーズによるTリンパ球の活性化により、αFR Tボディ製造過程を開始する。0日目に50％および1日目に50％という分割用量で、αFRベクターを添加する。ベクターの形質導入は、0日目〜3日目に起こる。3日目に、細胞を洗浄し、培地を交換する。培養物を、典型的には9〜12日間かけて拡大する。培養物の回収時に、細胞から磁気ビーズを枯渇させ、細胞を洗浄し、濃縮し、凍結保存する。
培養の開始時に、濃縮されたCD3+ T細胞培養物は、一般的にいくらかの量の残存するαFR CAR+細胞(B細胞約5〜10％)、CD16+細胞(NK細胞約5〜10％)、およびCD14+細胞(マクロファージ約＜5％)を含む。そのため、これらの細胞は形質導入中にベクターに曝露され、組換え転写物を取り込む。インビトロでの拡大後、最終細胞生成物は、典型的には＞90％がCD3+リンパ球である。培養条件はマクロファージまたはB細胞の増殖を支持せず、培養期の終了時までに、B細胞は全培養物の約＜2％を構成し、マクロファージは約＜1％を構成する。
エクスビボ形質導入の方法は、リンパ球について濃縮された末梢白血球細胞のみがベクターに曝露されることを確実にする。拡大中の3日目に、ならびに最終細胞生成物の製剤化の前の回収および濃縮中に再度、取り込まれなかったいかなる残存ベクターも洗浄除去される。ベクターは、HIVの存在下でさえ動員され得ず、したがってベクターの垂直感染もしくは水平感染、または開始培養物中に存在しない細胞への感染に関する心配はない。
以下は、製造過程の詳細な説明である。
細胞の回収および精製
T細胞製造過程の0日目に、白血球除去回収により非動員末梢血白血球を得る。およそ10 Lを回収し、Baxter Amicus細胞分離装置またはその同等物において処理して、およそ5〜15×109個の白血球細胞の集団を得る。この生成物はCVPFに搬送し、そこで細菌および真菌培養ならびにフローサイトメトリーによる表現型検査のために試料を採取する。細胞数をCoulter Multisizer IIIで決定し、生存率をトリパンブルー排除アッセイにより試験する。次に、アフェレーシス生成物を、向流遠心力を使用してサイズおよび密度に基づいて細胞集団を分離するGambro Elutraで処理する。Elutraは閉鎖系で作動し、使い捨てのチューブセットの使用により、汚染のリスクがさらに最小限に抑えられる。Elutra分離後に回収されたリンパ球画分を、Baxter Cytomate、Cell Saver 5、またはCOBE 2991細胞処理装置を用いて混合し、洗浄する。Elutra後のリンパ球画分および単球画分において行うフローサイトメトリーにより、細胞生成物の組成(CD4+、CD8+、B細胞、およびマクロファージ等)を評価する。
細胞濃縮過程の後(0日目)、濃縮されたリンパ球を、ビーズ対細胞比3：1の抗CD3/抗CD28 mAb被覆磁気マイクロビーズで活性化する。この最適なビーズ：細胞比は以前に決定された(IND#6675、およびLevine et al., 1997)。濃縮されたリンパ球(水簸または陽性選択による)を、静止した組織培養フラスコ中で、マウス抗ヒトCD3およびCD28結合Dynabeadで刺激する。培養の0日目および1日目に、1日当たり全形質導入MOIの50％のαFR CARレンチウイルスベクターを添加することにより、所定のMOI(例えば、25 TU/細胞のFRベクター)で形質導入を行う。培養の3日目に、Baxter Cytomate細胞処理システムまたはCell Saver 5装置での培地交換により、ベクターを洗浄除去する。ベクターを洗浄除去した後、細胞とビーズの混合物を、新鮮培地でガス透過性組織培養フラスコに播種し直し、培養およびさらなる拡大のために、5％ CO2および＞90％湿度の37℃インキュベーターに置く。細胞培養物は閉鎖系で維持する。組織培養フラスコ上のチューブひもは、汚染のリスクを妨ぐために、種々の無菌チューブ接合装置および熱シーラー(例えば、スパイク接合装置、Terumo無菌接合装置によるチューブ溶接、Sebra熱シーラーによる熱シール)によって接合するかまたは接合を切る。培養の3日目〜5日間に毎日、細胞を計数する。培養の5日後からは、1日おきに細胞を計数してよい。適切な密度で細胞を維持するために、新鮮な培地を培養物に添加する。必要であれば細胞増殖の対数期に、培養物をWAVEバイオリアクターに移すが、そこで細胞濃度は1×107個細胞/mlまたはそれ以上に達し得る。WAVEバイオリアクター2/10および20/50の両者における最適な細胞培養条件は、以前に確立されている(June IND 12799、およびHami et al., 2003, 2004)。WAVEの利点は、T細胞が高密度で増殖し、そのため処理におけるおよび細胞回収中の手間が省けるという点である。1×1010個までの細胞用量については、WAVEバイオリアクターは必要ではない。
培養物の回収および最終的製剤化、凍結保存
培養の最終日に、Baxter Fenwal回収装置または同等のシステムを用いて、細胞を回収し濃縮する。回収装置によって細胞を処理する前および後に、抗CD3/CD28磁気マイクロビーズを除去するために、細胞生成物をBaxter MaxSepにかける。αFR CAR T細胞を凍結保存培地中に再懸濁する。速度制御冷凍庫を用いて、細胞をバッグ中で凍結する。凍結保存されたαFR CAR T細胞生成物を、≦-130℃のモニター付き冷凍庫中に貯蔵する。各注入バッグは、用量のサイズに応じて約10〜50 mLの細胞を含み得る。
細胞純度および出荷試験
αFR-CAR T細胞の出荷試験は、Clinical Cell and Vaccine Production Facilityにおける臨床試験のために製造された以前の類似の遺伝子療法細胞生成物と類似している(参照、June IND #6675、8568、12799、13911)。αFR-CAR T細胞は、細胞生存率(センチネルチューブ、≧70％)、％CD3+細胞(≧80％)、残存ビーズ数(≦100個ビーズ/300万個細胞)、エンドトキシン(＜3.5 EU/ml；3.5 EU/mlという限界は以下の様式で導き出された：100 mlの最大容積において、100×106個/mlの凍結保存細胞濃度は1×1010個細胞の細胞用量に等しい。3.5×100＝350 EU、平均的なヒト＝70 kg、そのため限界は5 EU/kgである)、ベクターコピー数(≧0.2コピー/細胞)、αFR CAR発現(フローサイトメトリーにより≧20％発現)、VSV-G DNA(検出不能)、HIVgag DNAおよびp24タンパク質によるRCL(陰性)、マイコプラズマ(陰性)、ならびに細菌/真菌培養物(増殖なし)に基づいて試験し、出荷する。
モニターされる付加DNA配列の構造および解析の感度
レンチウイルスベクターは、それらのウイルスゲノムのDNAコピーを細胞DNAに組み込むことによって、細胞のDNAを永久的に変更する。よって、PBMCから単離されたDNAのPCRにより、これらの配列をインビボでモニターすることができる。CARキメラシグナル伝達ドメインとの間の接合領域を検出するPCRアッセイが開発され、その結果、遺伝子構築物を、天然に存在する内因性シグナル伝達鎖と識別することができる。これにより、各患者においてベクター改変細胞の持続性をモニターすることが可能になる。
その持続的存在およびその構造安定性の観点から見た付加DNAの安定性
安全目的のために、細胞当たりの平均培養コピー数は0.2〜5の範囲に限定される。ベクターは細胞のDNA中に安定に組み込まれるため、拡大後のコピー数は安定している。投薬後のインビボでのベクターコピーの検出は、ベクター改変細胞の拡大、輸送、および持続の結果として、時間と共に増加または減少し得る。
実験の結果をこれより記載する。
実施例1：遺伝子改変されたα-葉酸受容体特異的T細胞の養子移入後のヒト卵巣癌の根絶
ヒトT細胞は、レンチウイルス形質導入後に、40〜50％が細胞表面scFv Mov19を発現した(図3)。MOv19-ζおよびBB-ζ形質導入T細胞は、FRα+腫瘍細胞と共培養した場合に、IFN-g、TNF-α、およびIL-2サイトカインの標的特異的放出ならびに細胞傷害性機能を示したのに対し、MOv19-ΔζまたはGFPを形質導入されたT細胞はそれらを示さなかった(図4)。インビボWinnアッセイにおいて、MOv19-ζ形質導入T細胞は、FRα+卵巣癌の増生を阻害することができた(図5および6)。対照的に、MOv19-ΔζまたはGFPを形質導入されたT細胞は、腫瘍成長に影響を及ぼさなかった(図5および6)。顕著なことには、MOv19 CARのインビボ抗腫瘍活性は、4-1BB(CD137)シグナル伝達の供給によって改善された(図6)。さらに、共刺激ドメインの取り込みにより、T細胞の持続性が増強され、この取り込みがインビボでの抗腫瘍有効性の改善と関連することが実証される(図7)。
実施例2：DNA送達の効率およびDNAを含む標的細胞の割合
記載されるレンチウイルスベクター送達系は、Tリンパ球に遺伝子を送達する上で非常に効率的である。本試験に提案されたTボディ構築物を使用する前臨床実験では、αFR CARとCD3ζおよび4-1BBシグナル伝達ドメインを発現するように形質導入されたCD4+ T細胞において、α-FR-CARタンパク質の＞60％の形質導入効率が日常的に示された(図8B)。レンチウイルスベクターは、マウスレトロウイルスベクター形質導入効率と比較した場合の、それらの優れた遺伝子導入効率が周知である。
実施例3：機能のインビトロ評価
遺伝子導入系およびその搭載物のインビトロおよびインビボ有効性を実証するために、いくつかの前臨床研究を行った(図9)。形質導入T細胞の抗腫瘍能を調べるため、αFR陰性AE17細胞、AE17.FR(αFRを発現するように操作された誘導体)、および樹立されたヒト卵巣癌細胞株を用いて、標準的なクロム放出アッセイでエフェクター機能を測定した。αFR CARを形質導入されたT細胞は、AE17.FRを効率的に溶解させたが、親AE17細胞は死滅させなかった。重要なことには、αFR CAR形質導入T細胞は、αFRを発現する癌細胞に対しても高度に細胞傷害性を示し、ヒト卵巣癌SKOV3細胞株を死滅させた。TCR-ζと共に4-1BB(CD137)共刺激ドメインをタンデムでまたは3つ組で含めても、一般的に、αFR CAR TCR-ζのみを発現するT細胞を上回ってインビトロ細胞傷害性は増加しなかった。死滅は効率的であり、20時間の培養中に10：1のE：T比でプラトーの溶解が起こり(図10)、再方向づけられたT細胞が連続して死滅させる能力があることが示唆された。さらに、GFPまたは非関連のCD19-CARを形質導入されたT細胞は、同じ標的細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったため、溶解は特異的であり、アロ反応性または非特異的溶解が排除された。その上、切断型TCR-ζ細胞内ドメインを発現するT細胞(αFR-Δz)もまた、αFR発現標的を死滅させることができず、無傷のTCR-ζシグナル伝達ドメインの必要性が実証された。CAR+ T細胞を一連の腫瘍細胞株と同時インキュベートし、分泌されたエフェクターサイトカインIFN-gの量を測定した。CAR+ T細胞はFRa+腫瘍株SKOV3およびA1847を認識し、非常に高レベルのIFN-gを分泌した。中程度レベルでFRaを発現するOVCAR3およびA2780と同時インキュベートした場合には、中程度レベルのIFN-gが観察された。FACS解析によりαFR発現について陰性であるC30およびPEO-1細胞株と同時インキュベートした場合には、低レベルのIFN-gが観察された(図9下部)。
実施例4：機能Winnアッセイのインビボ評価
αFR CAR構築物のインビボ抗腫瘍活性の最初の試験として、CAR発現T細胞(1×106個細胞/マウス)と混合した、ルシフェラーゼを発現するαFR+ヒト卵巣癌細胞株SKOV3(1×106個細胞/マウス)のs.c.注射により、Winnアッセイを行った。接種後10日ごとに動物を撮像して、腫瘍成長を評価し、「Living Image」ソフトウェア(Xenogen)を用いて、ルシフェラーゼ発現細胞からの光子放出を定量した。GFPまたはαFRCAR dz形質導入T細胞のいずれかで処置したマウスにおいて、腫瘍成長に対する影響は認められなかった(図11A)。これらの対照群では、動物は接種後およそ30日目に腫瘍を生じ始め、40日目までにすべての動物が腫瘍を生じた(図11B)。対照的に、αFR CAR-zまたはBBz保有T細胞を注射したマウスは、接種後30日目までに腫瘍増生を同等に阻害し、Winnアッセイにおいて無傷のTCR CD3ζシグナル伝達ドメインの必要性が実証された。しかしながら、さらなる10日後には、αFR CAR CD3ζ群のすべてのマウスが検出可能な腫瘍を有したのに対し(4/4)、BBz群の3/5のマウスのみが腫瘍を有した。これらの腫瘍は、CD3ζ群の腫瘍よりも実質的に小さい。これらのデータから、4-1BB(CD137)をFRα CARに含めることで、インビボでの抗腫瘍活性が増強され得たことが示される。
実施例5：異種移植モデル
αFR-CAR構築物の潜在的抗腫瘍有効性をさらに探索するため、SKOV3 Luc腫瘍細胞を用いる異種移植モデルを開発した。0日目に、6〜12週齢の雌NOGマウスの腹側部に3×106個のSKOV3 Luc細胞をs.c.接種した。約1ヵ月して腫瘍が触知可能となった後、ヒト初代T細胞(使用されるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を1：1比で混合した)を活性化し、上記のように形質導入した。T細胞拡大の2週間後、腫瘍量が200〜300 mm3となった時点で、マウスをT細胞(約40％〜50％が導入遺伝子陽性)で処置した。T細胞注射の経路、用量、およびタイミングは、個々の図の説明文に示してある。ノギスで腫瘍の寸法を測定し、式V＝1/2(長さ×幅2)、式中、長さは最大縦径であり、幅は最大横径である、を用いて腫瘍体積を算出した。腫瘍接種後40日目および45日目に、腫瘍保有マウスを20×106個のT細胞(約40％〜50％が導入遺伝子陽性)の腫瘍内注射で処置した。ヒトドナーを用いて、形質導入T細胞を作製した。細胞ベースの療法を受けなかった生理食塩水群のマウスはすべて、継続した腫瘍成長を示した。同様に、シグナル伝達欠損αFR CAR dzまたはGFP形質導入T細胞を受容したマウスも、T細胞移入時を超える、継続した腫瘍成長を示した。αFR CAR-z T細胞を受容したマウスは、3つの対照群すべてと比較して有意に異ならない緩徐な腫瘍成長を示した(図12 A、C)。αFR CAR BBz T細胞を受容したマウスは、他のすべての群と比較して迅速な腫瘍退縮を示し、4-1BBシグナル伝達がインビボで抗腫瘍反応の増強を媒介することが示唆された。
異なる投与経路の効果を評価するために、腫瘍保有マウスをまた、静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)注射および腫瘍内(i.t.)注射により、αFR CAR BBz形質導入T細胞を用いて処置した。i.v.およびi.p.注射の後、強力な抗腫瘍効果がやはり観察されたが(図12 B、D)、腫瘍内投与経路と比較して約7日間遅れの腫瘍量の減少を示した(図12 B)。腫瘍内注射は、i.v.およびi.p.よりもわずかに早い、優れた投与経路であると考えられる。
実施例6：移入後のヒトTリンパ球の持続性
次に、全マウスにおいて、操作されたT細胞の持続性を判定した。最後の養子T細胞移入の4週間後である74日目に末梢血を採取し、CD4およびCD8 T細胞の存在について定量した。CD4+およびCD8+ T細胞カウントは、gfp、αFR CAR dz、およびCD3ζ群と比較して、IT、IP、およびIV経路によってBBz CAR+ T細胞を注射した後のマウスにおいて最も多かった(図13)。顕著なことには、BBz群におけるCD4+およびCD8+ T細胞のカウントはz群よりも有意に多かったのに対して(P＜0.01)、z群における全T細胞カウントは、T細胞注射なしの生理食塩水群を含む他の対照群と類似している(p＞0.05)。
実施例7：抗原特異的モデル
4-1BBを含むαFR CARが、インビボにおいてT細胞の生存増強および抗腫瘍活性の増加を媒介することが示されたため、次に、αFR CAR抗腫瘍活性が抗原特異的であるかどうかを判定しようとした。同様に4-1BBシグナル伝達ドメインを含むCD19特異的CARを、異種移植モデルにおいて評価した。腫瘍確立後6週目、40日目および45日目に、腫瘍保有マウスを20×106個のT細胞(約40％〜50％が導入遺伝子陽性)の腫瘍内注射で処置した。処置後、αFR CAR BBz群において、腫瘍量の迅速な減少が観察された(図14A)。対照的に、GFPまたはCD19 CARを発現するT細胞で処置したマウスでは、腫瘍は徐々に成長した。よって、同様に4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインを含むCD19 CARは抗腫瘍活性を示さなかったため(図14 A、B)、SKOV3腫瘍のαFR CAR BBzによる根絶は抗原特異的である。腫瘍内αFR CAR BBzで処置したマウスは、腫瘍内抗CD19群よりも有意により多くの(P＜0.05)T細胞カウントを有し、腫瘍抗原がインビボにおいて、養子移入されたT細胞の拡大を駆動することが示唆された(図14.C)。
実施例8：ヒト卵巣癌の腹腔内モデル
以前の実験において、CAR T細胞の局所注射が、インビボにおいて、確立された腫瘍の根絶をもたらすことが実証された。卵巣癌は、通常、腹膜腔に限局する疾患であるため、腹腔内モデルにおけるαFR特異的T細胞の抗腫瘍活性をさらに判定した。5×106個のSKOV3Luc細胞のIP接種は、30日後に、腹膜癌腫症を効率的に生じた(図15.C)。IVまたはIP経路による、CD19 CAR BBzを発現するT細胞の移入後1〜3週間以内に、腹水形成および重度腹膜癌腫症を示す腹部腫脹が観察された(図15.A)。これらのマウスは著しい血性腹水(5〜8 ml)および複数の結節性腹膜腫瘍を生じ、腹部膨張のために、T細胞注射後1〜3週間以内に安楽死させなければならなかった。αFR CAR BBzで処置したマウスはすべて、腹水を形成せず、生存増強を示した(図15B.)。SKOV3腫瘍を保有するマウスの60％(3/5)および40％(2/5)は、それぞれIPおよびIV経路によるαFR CAR BBz T細胞の移入後10週間まで生存し続ける。よって、αFR CAR BBz特異的T細胞は、腹膜癌腫症のSKOV3マウスモデルにおいて、腫瘍成長および腹水形成を阻害する。重要なことには、αFR CAR BBz特異的T細胞は生存時間を改善する。
実施例9：ヒト卵巣癌の肺転移モデル
時折、卵巣癌患者は、疾患進行中に、実質性肝転移もしくは肺転移によって明らかにされる侵攻性疾患を呈するか、または脳などの遠位部位への転移を起こす。卵巣癌の肺転移モデルを作製するため、0日目に、8〜12週齢のNOGマウスに2×106個のSKOV3 Luc細胞(200μl PBS中)をi.v.注射した。3日目に肺において腫瘍確立が証明された後、動物を3日目および8日目に、15×106個のαFR CAR BBz T細胞またはCD19 CAR BBz T細胞のいずれかの尾静脈注射で処置した(200μl PBS中)。この経路の腫瘍接種は、生物発光イメージングにより判断して、マウスの100％で進行性肺転移を確立した(図16.上部)。CD19 CAR T細胞処置マウスでは、すべての動物において腫瘍が徐々に成長した。対照的に、αFR CAR BBz特異的T細胞を注射すると、すべての処置動物(n＝5)において肺転移の迅速な退縮が起こった(図16.14日目)。＞2ヵ月の経過観察後、マウスの80％(4/5)は腫瘍再発の証拠がなかった。動物1匹は再発性肺転移を有し、70日目に安楽死させた。よって、αFR特異的T細胞の養子移入は、肺転移の退縮の可能性を提供する。
実施例10：ヒト適用との関連性
上記の研究により、インビボおよびインビトロで前記構築物の機能性が実証される。SKOV3、A1847、OVCAR3、C30、A2780、およびPEO-1などの複数のヒト卵巣癌細胞株が、インビトロ実験で用いられた(図9下部を参照されたい)。このアプローチはまた、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3 Lucを用いる前臨床異種移植モデルにおいても行われた。インビトロ系と提案されるヒト治療との間の考えられる違いは、インビトロ実験が細胞株で行われ、細胞株がインビボでの腫瘍細胞を反映していない可能性があることである。
用いられた卵巣癌モデルは同所性ヒト異種移植であり、よって腹腔内に広がるヒト卵巣癌疾患と類似している。ヒト疾患との考えられる違いは、このモデルが極めて侵攻性であることである。別の明白な違いは、このモデルが免疫不全宿主で生じるのに対して、卵巣癌患者は細胞性免疫の抑制の要素を示すものの、ヒト卵巣癌は免疫正常個体で発症することである。
実施例11：ヒトにおいて成功するための遺伝子導入プロコールに必要と推定される遺伝子導入および/または発現の最小レベル、ならびに最小レベルの決定
最終細胞生成物の0.2〜5というコピー数出荷規格が達成された。この規格は、レンチウイルスベクターで日常的に達成されるものを超えており、この数字は、大規模な挿入による不必要なリスクを最小限に抑えつつ、活性を示すと予測される範囲を示す。第1層については、最低用量として3×107個CAR T細胞/m2のI.T.単回注入を施行することができるに対して、第2層については、最低用量として3×108個CAR T細胞/m2の「分割用量」を用いて、I.V.注入によりCAR T細胞を投与することができる。フローサイトメトリーにより最終生成物を形質導入の割合について試験することができ、回収後および注入直後のベースラインで、形質導入細胞の数を記録することができる。
臨床試験の主要な目的は、αFR-CAR T細胞の最適生物学的用量を確立することである。この予備試験の目的は、αFR-CARで改変された細胞の安全性、認容性、ならびに差次的生存および輸送を評価することである。提案される患者数は、プロトコール中の統計解析計画により裏付けられて、このエンドポイントに到達するのに十分であり得る。
実施例12：遺伝子導入および発現の最小必要レベルを達成する上での送達系の有効性
αFR構築物の形質導入のインビトロ効率を実証するデータに関しては、図8を参照されたく、動物データに関しては、図11、12、13、14を参照されたい。予備臨床試験における、レンチウイルスベクターを用いた、臨床規模での、レンチウイルスベクター技術を用いたCD3/28刺激自己T細胞の効率的な形質導入が実証された。提案される研究には、類似の方法を用いることもできる。
実施例13：遺伝子特異的発現
本研究に用いられるレンチウイルスベクターは、関心対象の導入遺伝子である単一タンパク質のみをコードする。そのため、導入遺伝子以外の他の遺伝子は、ベクターによって発現されない。以前のレンチウイルスベクター研究では、プロモーターとして天然LTRを用いる、条件的に複製するウイルスベクターを使用した。tatが存在しない場合、これらのプロモーターには非常に低い基礎活性があり、そのためHIV感染の状況以外では、隣接遺伝子へのリードスルーはほとんど予測されなかった。最初の形質導入細胞生成物に関して、処置された5名の患者において、挿入部位パターンの解析を行った。このベクターが、SINベクターを含む他のレンチウイルスベクターで観察されるのと類似のパターンで遺伝子に挿入されることが判明した。挿入位置は、レンチウイルスについて予測される通りであり、これは主に遺伝子リッチ領域に存在する(Levine et al, 2006の図3b)。転写活性のある遺伝子中に挿入されたベクターは、コード領域中に分布した。これらの知見は、レンチウイルスベクター形質導入T細胞を受容した患者において長期的に挿入部位パターンを評価する、より最近の出版物において確認された。組込み部位の選択は検出されず、癌または腫瘍抑制遺伝子の機能的修飾が存在しないことが示された。
提案される研究に用いられるベクターは、図6および7に記載されるような、構成的活性内部プロモーターを伴うSINベクターであり得る。最近の研究では、腫瘍易発性マウスモデルの状況において、無傷のLTRを伴うマウスレトロウイルスベクターと直接比較して、SINベクターの転写活性および癌遺伝子の活性化に及ぼすそれらの影響を評価した。マウスで生じた腫瘍における遺伝子の分子解析は、SINベクターによる癌遺伝子転写活性化を支持しなかったが、マウスレトロウイルスベクターは骨髄腫瘍サブセットにおいて癌遺伝子活性化を誘導した。これは、MLV LTRからのより大きなエンハンサー効果、および遺伝子発現を調節する可能性がより高い、遺伝子の5'制御領域を支配するという、MLVベクターの挿入パターンの結果である。
SINレンチウイルスベクターが形質導入された細胞において、隣接遺伝子の転写活性化の可能性があるが、この事象の頻度はMLVベクターよりもはるかに低いと考えられる。HIV感染において自然実験が行われており、この場合、T細胞白血病は野生型レンチウイルスによる感染の公知の副作用ではないことに留意することには価値がある。
実施例14：DNA挿入物の細胞発現および正常活性の割合
導入遺伝子の発現は、T細胞において最適な導入遺伝子発現を有することが以前に示された遍在性哺乳動物ef-1αプロモーターの制御下にあり、そのためすべての形質導入細胞において発現が観察された。
注入用に準備された形質導入T細胞は、生物学的に活性がある。NOGマウスでの前臨床データにおいて、形質導入細胞におけるαFR構築物の発現は、マウスモデルにおいて74日目まで持続した(図13を参照されたい)。患者においては、PCRおよびフローサイトメトリーによって末梢血をモニターすることにより、形質導入T細胞の持続性を試験期間を通して試験することができる。
実施例15：遺伝子異所性発現
エクスビボ製造過程の利点は、ベクターに曝露させる細胞を注意深く制御できる点である。結果として、αFR CAR構築物は、細胞処理中にベクターによって標的化された細胞においてのみ発現され得る。Tリンパ球は陰性選択によって単離されるため、形質導入中に、わずかな割合の単球およびB細胞が培養物中に存在し得る。単球は最終生成物中に存在しないが、わずかな割合のB細胞は残存し得る(＜2％)。
最初のレンチウイルスベクター試験において、最終生成物の表現型は、平均して93.4%(範囲80〜＞99％)がCD3+ T細胞であった。本プロトコールにおける同様の標的集団が予測される。
実施例16：レトロウイルス粒子の産生
293細胞および初代T細胞に、レンチウイルスベクター調製物を形質導入した。本ベクターは第3世代自己不活性化(SIN)ベクターであり、いかなるウイルスタンパク質も含まず、複製不能である。そのため、本ベクターを形質導入された細胞により、感染粒子は産生されない。
一過性トランスフェクションにより、293T細胞においてベクターを生成した。レンチウイルスベクター調製物の出荷試験には、複製能を有するレンチウイルス(RCL)についての高感度生物学的アッセイが含まれる。生成系においてアクセサリータンパク質および相同領域が欠如しているため、RCLが生じる確率は無視できるが、最終的なこの生物学的アッセイにより、ベクター調製物中にいかなる複製部分も欠けていることの機能的証拠が提供される。
今日までに、以前のおよび進行中の臨床試験によるいかなるGMPベクターロットにおいても、RCLは検出されていない。より重要なことには、これまでにレンチウイルスベクター改変細胞で処置された23名の患者の誰にも、RCLの証拠は存在しない。提案される研究のためのベクターの開発ロットおよびGMPロットは進行中であり、FDA指針に従ってRCLについて試験することができる。
条件的に複製するウイルスベクターを用いる以前の臨床研究では、初代CD4 T細胞中のベクターの安定性を調べ、ベクターコピー数が実験期間中安定していることが実証された(図17)。ベクターの顕著な再編成が起こったのであれば、これはベクターコピー数の変化に反映された。これらの実験は、TaqMan PCRにより測定して(10,000〜30,000個の細胞を含む反応につき1コピーの感度)、ベクターコピー数の減少を示さなかったため、実験中のベクターコピー数は、細胞が1000倍を超えて拡大された場合でさえ、安定したままであったことに留意することは、重要である。
本ベクターの安定性研究もまた、生成から形質導入まで(すなわち、単一の逆転写段階)のベクターの安定性を評価するために、初代T細胞において行った。ベクターゲノム全体の配列決定により、生成ベクターと形質導入細胞におけるプロウイルスとの間の100％の忠実度が示された。逆転写のエラー率は10,000分の約1であり、形質導入細胞集団が共に採取された場合、2つのプロウイルスごとに平均しておよそ1エラーを生じるが、そのような突然変異はノイズとしてバックグラウンドに入る可能性があり、よって100％忠実度の全体像が提供される。各ベクターについて逆転写は単一ラウンドしか存在しないため、転写物の機能に及ぼす突然変異率の影響は無視すべきである。ベクターの不安定性を最小にするために、αFR-CARベクターは、それらが直列または逆方向反復エレメントを有さないように設計されている。
これらのベクターが、ヒト細胞中に存在する内因性レトロエレメントと組換えを起こし得るかどうかに関する情報は存在しない。しかしながら、親wt-HIVゲノム、およびヒト細胞中でこれがどのように複製するかについてのかなりの知識が存在する。今日まで、4千万人の人がこのウイルスに感染しているにもかかわらず、wt-HIVと内因性レトロウイルスエレメントとの間の生産的組換え事象の記載は存在しない。この仮定上の組換え事象の発生を考えると、問題は、これによって、wt-HIVよりも病原性が高い組換え体が生じるかどうかということになる。これが起こるのであれば、それは感染集団において既に起こっている可能性が高い。そのような事象は世界中の感染集団において記載されていないという事実から、wt-HIVと内因性配列との間で組換え事象が起こるのであれば、得られる組換え体は稀であるか、またはヒトにおいて病原性がないということが示唆される。
実施例17：移入の潜在的悪影響(例えば、新生物、有害な突然変異、感染粒子の再生、または免疫応答の発生)に関する実験証拠
今日まで、HIV由来レンチウイルスベクターによって起こった腫瘍形成の報告はない。Montiniら(Montini et al., 2006)による最近の報告は、遺伝毒性に関して、SINレンチウイルスベクターの相対的生物安全性を支持する証拠を提供している。理論上、HIV由来レンチウイルスベクターが挿入性発癌を引き起こし得る可能性はあるが、今日まで、この理論を支持するデータは存在しない。
提案される研究で用いられるベクターはSINベクターであり、これは最大バイオセイフティーのために、機能に必要な最小の遺伝要素のみを含み、ベクタータンパク質を含まないように注意深く設計されている(Dull et al., 1998)。ベクターは、RCR試験に関する2006 FDAガイダンス(2006 FDA Guidance on RCR testing)、細胞および遺伝子療法生成物に関する米国薬局方ガイダンス(US Pharmacopeia Guidance on Cell and Gene Therapy Products)、ならびに薬剤および原体化学物質GMPに関するCFR規制(CFR regulations on Pharmaceutical and Bulk Chemical GMPs)に規定されているように、純度についてFDA要件と一致する様式で、適正な製造条件下で製造および精製される。
本出願において、ベクターはエクスビボで用いられ、そのため免疫応答を誘導する可能性は低い。しかしながら、進行中の第I相/第II相臨床試験では、ベクター改変細胞の3回目の投与後に、患者の50％においてベクター外被タンパク質に対する抗体の産生が認められた。投薬計画は隔週であるため、一部またはすべての患者において、早ければ2回目の注入までに免疫応答が生じた可能性がある。単一用量第I相臨床研究における患者はいずれも、VSV-G Abに関して陽性とはならなかったため(Levine et al., 2006)、単回注入が抗体応答を生じるとは考えられなかった。VSV-Gに対する抗体の産生は、患者におけるベクター改変細胞の持続性に影響せず、また患者における有害事象とも一致しなかった。そのため、VSV-G抗体の発生には、検出可能な臨床的影響はほとんどない。提案される臨床研究では、患者につき2回の注入が施行される。そのため、この試験では、VSV-Gに対する抗体応答が観察される可能性がある。
実施例18：病原性に関する動物試験
最初のレンチウイルスベクター臨床試験のために、広範な体内分布および生物毒性研究を行った。体内分布研究のため、合計192匹のマウスを、以下：注入媒質のみ(群1)、2千万個の偽形質導入ヒトT細胞(群2)、300,000個のベクター形質導入ヒトT細胞(群3)、または2千万個のベクター形質導入ヒトT細胞(群4)の0.3 ml尾静脈注射を受けるマウス48匹の4群に分割した。雄と雌のマウスは別々に試験した。2、15、30、91、および123日目にマウスを解析し、死亡率、臨床所見/身体検査、および体重を含む生存中パラメータについてマウスを評価した。この研究から、ベクター形質導入ヒトT細胞が、死亡率、臨床所見、または体重に影響を及ぼさないことが示された。いずれのマウスもT細胞腫瘍を生じなかった。ベクター配列の存在をPCRにより解析した。2日目および30日目には、群3および4からの試験したすべての組織において、ベクター配列が存在した。91日目では、4匹のマウスからの肺、肝臓、脾臓、および尾のみがベクターについて陽性であり、123日目では、ベクターは検出されなかった(表1)。
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 免疫不全マウスにおいてレンチウイルスベクター形質導入ヒトT細胞を評価する体内分布研究の結果。本文中に記載されるように最高用量の形質導入細胞を投与されたマウス(i.v.でマウスにつき2千万個のヒトCD4細胞)の結果を示す。雄と雌のマウスを組み合わせて、1時点につきn＝10とする。*、ベクター非検出。
他の実験において、上記と同様の群に分割された0.3 mlの尾静脈注射を受ける、1群当たりマウス36匹の4群に分割された合計144匹のマウスで、レンチウイルスベクター改変T細胞の生物毒性を評価した。雄と雌のマウスは別々に試験した。マウスを、死亡率、臨床所見/身体検査、体重、臨床病理学的結果、肉眼的病理所見、器官重量データ、骨髄評価、および組織病理学的結果について評価した。この研究の結果は、ベクター形質導入ヒトT細胞はいかなる毒性とも関連しておらず、評価したパラメータのいずれにも影響を及ぼさないというものであった。
提案される研究に用いられるベクターは構造および搭載物が異なるが、レンチウイルス形質導入細胞媒体(ヒトT細胞)は、マウスモデルと同様の様式で挙動すると予測される。
SINベクターの遺伝毒性が腫瘍易発性マウスモデルにおいて最近試験され、このモデルの感度内で毒性は検出され得なかったが、マウスレトロウイルスベクターによる毒性は検出された。ヒト化マウスモデルにおいてさえ、抗原、T細胞輸送、および様々な組織にわたる腫瘍抗原発現は動物モデルでは異なり得るため、αFR-CAR細胞の認容性に関する研究は、早期臨床試験においてのみ正確に判定することができる。
未処置の細胞に動員または進入するベクターDNAを支持する証拠は存在しない。上記の体内分布研究において、ベクター配列はヒト細胞マーカーと共にマウスにおいてインビボで検出されるにすぎず、このことからベクターが非標的化細胞に動員されなかったことが示される。91日目または123日目(研究終了時)には、マウスの生殖腺は検出可能なベクター配列を有さなかった(表1)。これは、αFR CARについて計画される生物毒性および体内分布研究においても同様に評価することができる。
前臨床動物試験はすべて、免疫不全NOD/SCIDγ-/-(NSG)ヒト異種移植動物モデルにおいて行った。
実施例19：CD137(4-1BB)を介する共刺激シグナル伝達によって増強される、CARで操作されたT細胞のインビボ持続性、腫瘍局在化、および抗腫瘍活性
葉酸受容体-α(FRα)に特異的なキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作されたヒトT細胞は、インビトロで上皮癌に対する強い抗腫瘍活性を示したが、インビボでは持続できず、腫瘍にホーミングできないという理由で、診療所ではそのような活性を示さなかった。本研究では、単独の(MOv19-ζ)、またはCD137(4-1BB)共刺激モチーフとタンデムで組み合わせた(MOv19-BBζ)T細胞受容体CD3ζ鎖シグナル伝達モジュールに結合しているFRα特異的scFv(MOv19)を含むCARを構築した。従来のMOv19-ζ CARまたは共刺激MOv19-BBζ CARを発現するように形質導入された初代ヒトT細胞は、インビトロでFRα+腫瘍細胞と共培養した場合に、様々な炎症性サイトカインを分泌し、細胞傷害機能を発揮した。しかしながら、確立された大きなFRα+ヒト癌を保有する免疫不全マウスにおいては、共刺激MOv19-BBζ CARを発現するヒトT細胞の移入のみが腫瘍退縮を媒介した。MOv19-BBζ CAR T細胞の注入は、転移性腹腔内、皮下、および肺関与ヒト卵巣癌のモデルにおいて、腫瘍退縮を媒介した。重要なことには、腫瘍反応はインビボにおけるヒトT細胞の選択的生存および腫瘍局在化と関連しており、共刺激MOv19-BBζ CAR T細胞を受容したマウスにおいてのみ観察された。T細胞の持続および抗腫瘍活性は主に抗原駆動性であった；しかしながら、CARによる抗原非依存的CD137シグナル伝達は、インビボにおいてT細胞の持続性を改善し、しかし抗腫瘍活性は改善しなかった。本明細書に記載される結果から、CD137共刺激シグナル伝達をタンデムに装備された抗FRα CARは、インビボで強力な抗腫瘍活性を提供するための従来のFRα T細胞標的化戦略を限定するT細胞の持続性および腫瘍局在化の問題を克服することが示される。
本明細書に記載されるように、インビボにおけるFRα特異的T細胞の限定された持続性および腫瘍活性は、FRα特異的CARにCD137共刺激シグナル伝達ドメインを導入することによって対処され、ヒト癌のFRα指向性CAR T細胞療法におけるCD137シグナル伝達の役割が研究される。T細胞に対してCD3ζシグナル伝達を提供するが、シス共刺激シグナル伝達能を欠く「第1世代」CARと比較して、CD137シグナル伝達ドメインとタンデムでFRα特異的CARを発現するT細胞は、インビトロでは最小限に改善された抗腫瘍活性を示したが、確立されたヒト卵巣癌異種移植モデルでは顕著に優れた腫瘍退縮能を示し、これはインビボにおけるT細胞の持続性および腫瘍局在化の増強と関連していた。腫瘍退縮およびT細胞持続はいずれも、様々な経路のT細胞注入によって達成可能であり、静脈内(i.v.)細胞注入は、進行性の腹腔内(i.p.)、皮下(s.c.)、および肺関与転移性疾患の異種移植モデルにおいて、ヒト癌の退縮を媒介する。インビボにおけるT細胞の持続および腫瘍活性は主として抗原駆動性であった；しかしながら、CARによる特異的抗原認識の非存在下におけるCD137シグナル伝達の供給は、インビボにおいてT細胞の持続性を改善することができ、しかし抗腫瘍活性を改善することはできなかった。よって、FRα特異的CARにCD137シグナル伝達ドメインを含めることは、インビボにおける形質導入T細胞の持続性を改善し、腫瘍内へのそれらの蓄積および抗腫瘍効力を強化することによって、過去のCARアプローチの限界を克服する。
これらの実験において使用される材料および方法をこれより記載する。
材料および方法
抗FRαキメラ免疫受容体の構築
キメラ免疫受容体骨格構築物は、以前に記載されているように作製した(Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:3360-65)。抗FRα scFv配列は、FRαに対するモノクローナル抗体であるMOv19(Miotti et al., 1987, Int J Cancer 39: 297-303；Figini et al., 1998, Cancer Res 58(5):991-6)から導出された。MOv19 scFvは十分に特徴づけされており(Figini et al., 2009, Cancer Immunol Immunother 58(4):531-46；Melani et al., 1998, Cancer Res 58: 4146-54)、以下のプライマー：
Figure 2014509841
(Bam-HIを下線表示)および
Figure 2014509841
(Nhe-Iを下線表示)を用いて増幅し、その後CAR骨格ベクターにクローニングした。scFv PCR産物をBamHIおよびNheIエンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製してから、pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE(Dull et al., 1998, J Virol 72(11):8463-71)に基づく、CMVプロモーターベースの第3世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクターであるpCLPSベクターに連結した。抗CD19-BBζ CAR構築物は以前に記載されている(Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)。高力価レンチウイルスベクターを生成し、以前に記載されているように26,000 rpmでの3時間の超遠心により10倍濃縮した(Parry et al., 2003, J Immunol 171:166-74)。
細胞株
レンチウイルスパッケージングは、ATCCから購入した不死化正常胎児腎臓293T細胞株において行った。免疫ベースのアッセイに使用されるヒト細胞株には、樹立されたヒト卵巣癌細胞株、SKOV3、A1847、OVCAR3、C30、およびPEO-1が含まれる。生物発光アッセイ用に、標的癌細胞株をホタルルシフェラーゼ(fLuc)を発現するようにトランスフェクトし、生物発光イメージングによる抗生物質選択陽性発現により濃縮した。特異性対照については、マウス悪性中皮腫細胞株、AE17を、FRαを発現するようレンチウイルスで形質導入した(AE17.FRα)。ヒト赤白血病細胞株であるCD19発現K562(CD19+ K562)細胞を入手した(Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)。293T細胞および腫瘍細胞株は、10％(v/v)加熱非働化FBS、2 mM L-グルタミン、100μg/mLペニシリン、および100 U/mLストレプトマイシンを補充したRPMI-1640(Invitrogen)中で維持した。すべての細胞株を、マイコプラズマ汚染について日常的に試験した。
ヒトT細胞
University of PennsylvaniaのHuman Immunology Coreから購入した初代ヒトCD4+およびCD8+ T細胞は、健常ボランティアドナーから白血球除去後に陰性選択によって単離された。標本はすべて、大学施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールの下で回収され、各ドナーから書面によるインフォームドコンセントが得られた。T細胞は、完全培地(10％加熱非働化FBS、100 U/mLペニシリン、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、10 mmol/L HEPES補充したRPMI 1640)中で培養し、以前に記載されたように(Levine et al., 1997, J Immunol 159:5921-30)、抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体(mAb)被覆ビーズ(Invitrogen)で刺激した。活性化の12〜24時間後、T細胞におよそ5〜10の感染効率でレンチウイルスベクターを形質導入した。インビボ実験に使用されるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を1：1比で混合し、活性化し、形質導入した。ヒト組換えインターロイキン-2(IL-2；Novartis)を50 IU/mLの最終濃度になるよう1日おきに添加し、0.5×106〜1×106個細胞/mLの細胞密度を維持した。増殖動態学、およびMultisizer 3 Coulter Counter(Beckman Coulter)の使用による細胞サイズ測定の両方により判定して、T細胞が静止するようであった場合には、機能アッセイの前に、導入遺伝子発現細胞の頻度が等しくなるように、操作されたT細胞培養物を調整した。
フローサイトメトリー解析
以下のMAbを表現型解析に使用した： APC-Cy7マウス抗ヒトCD3；FITC抗ヒトCD4；APC抗ヒトCD8；PE抗ヒトCD45。いずれのmAbもBD Biosciences PharMingenから購入した。T細胞移入実験において、後眼窩採血により末梢血を採取し、ヒトCD45、CD4、およびCD8 T細胞の存在について染色した。ヒトCD45+集団にゲートをかけた後、製造業者の説明書に記載されているように、既知数の蛍光ビーズを含むTruCountチューブ(BD Biosciences)を用いて、CD4+およびCD8+サブセットを定量した。FRαの細胞表面発現は、Mov18/ZEL抗体(Enzo Life Sciences)により検出した。FRα特異的CAR発現は、Jackson ImmunoResearchから購入したPE結合ヤギ抗マウスIgG F(ab')2(マウス起源のscFvに特異的)により検出した。細胞内染色については、細胞を固定し、透過処理し、PE結合抗Bcl-XL抗体(Southern Biotech)で染色した。すべての解析において、アイソタイプ一致対照Abを使用した。フローサイトメトリーデータは、FlowJoソフトウェアによって解析した。
サイトカイン放出アッセイ
96ウェル丸底プレートにおいて3つ組で、最終容積200μlのT細胞培地中、ウェル当たり1×105個のT細胞と1×105個の標的細胞を共培養することにより、サイトカイン放出アッセイを行った。20〜24時間後、製造業者の説明書(Biolegend)に従ってELISAキットを用いて、共培養上清をIFN-γの存在についてアッセイした。値は3つ組ウェルの平均値を表す。IL-2、IL-4、IL-10、TNF-αサイトカインは、製造業者の説明書(BD Biosciences)に従って、サイトカインビーズアレイを用いてフローサイトメトリーにより測定した。
細胞傷害性アッセイ
細胞ベースの生物発光アッセイのため、96ウェルマイクロプレート(BD Biosciences)を用いて、5×104個のホタルルシフェラーゼ発現(fLuc+)腫瘍細胞を、異なる比率の形質導入T細胞の存在下において完全培地で培養した。37℃で18〜20時間インキュベートした後、各ウェルに、1μl D-ルシフェリンを再懸濁した50μl DPBS(0.015 g/ml)を満たし、Xenogen IVIS Spectrumを用いて撮像した。腫瘍細胞生存率の割合を、実験試料の平均発光からバックグラウンドを差し引いたものを、アッセイに使用したインプット数の標的細胞の平均発光からバックグラウンドを差し引いたもので除し、これに100をかけたものとして算出した。データはすべて、3つ組ウェルの平均値として表す。51Cr放出アッセイは、記載されている通りに行った(Johnson et al., 2006, J Immunol 177(9):6548-59)。標的細胞を、100μCi 51Crで37℃にて1.5時間標識した。標的細胞をPBSで3回洗浄し、105個生細胞/mLでCM中に再懸濁し、96ウェルV底プレートの各ウェルに100μLを添加した。エフェクター細胞をCMで2回洗浄し、所与の比率でウェルに添加した。プレートを速やかに遠心分離して細胞を定着させ、5％ CO2インキュベーター中で37℃にて4または8時間インキュベートし、その後上清を回収し、1450 Microbeta液体シンチレーションカウンター(Perkin-Elmer)を用いてカウントした。特異的溶解の割合を、(実験−自発的溶解/最大−自発的溶解)かける100として算出した。gfp標的細胞溶解アッセイのため、形質導入T細胞を5×104個のgfp発現AE17またはAE17.FRα細胞と様々なエフェクター対標的比で24時間共培養し、蛍光顕微鏡下で撮影した。標的細胞溶解は、gfp標識接着腫瘍細胞の減少を撮像することによって示された。
卵巣癌の異種移植モデル
マウス試験は、本明細書に詳述される変更を加えて、以前に記載された通りに(Catpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:3360-5、Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)行った。動物はすべて、Stem Cell and Xenograft Core of the Abramson Cancer Center、University of Pennsylvaniaから入手した。8〜12週齢のNOD/SCIDγ鎖-/-(NSG)マウスを、University of Pennsylvania IACUC承認プロトコールの下で、組織内で無病原体条件下で飼育し、取り扱い、維持した。卵巣癌モデルの確立のために、0日目に、6〜12週齢の雌NSGマウスの腹側部に3×106個のSKOV3 fLuc+細胞をs.c.接種した。約1ヵ月して腫瘍が触知可能となった後、ヒト初代T細胞(使用されるCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を1：1比で混合した)を活性化し、本明細書の他所に記載されるように形質導入した。T細胞拡大の2週間後、腫瘍量が約200〜300 mm3となった時点で、マウスをT細胞で処置した。T細胞注射の経路、用量、およびタイミングは、本明細書の他所に示してある。ノギスで腫瘍の寸法を測定し、式V＝1/2(長さ×幅2)、式中、長さは最大縦径であり、幅は最大横径である、を用いて腫瘍体積を算出した。腫瘍成長を評価するため、T細胞移入の前およびその後ほぼ毎週、動物を撮像した。すべてのインビボ実験について、「Living Image」ソフトウェア(Xenogen)を用いて、fLuc+細胞からの光子放出を定量した。サイズ測定および免疫組織化学的検査のため、最初のT細胞投与のおよそ40日後に、安楽死させた後直ちに腫瘍を切除した。卵巣癌の腹腔内モデルのため、8〜12週齢のNSGマウスに5×106個のSKOV3 fLuc+細胞をi.p.注射した。腹腔接種の30日後に、十分に確立されたSKOV3腫瘍を保有するマウスを群に分割し、処置した。マウスが苦痛を感じ、瀕死となった時点で、マウスを屠殺し剖検した。肺転移は、雌NSGマウスの尾静脈に2×106個のSKOV3 fLuc+細胞を注射することにより確立した。3日目に肺において腫瘍確立が証明された後、動物を3日目および8日目に、操作されたT細胞の尾静脈注射で処置した。腫瘍進行の程度をモニターするため、マウスを毎週または隔週で撮像し、マウスの体重を測定した。いずれのモデルにおいても、処置前に4〜5匹のマウスを群ごとにランダムに割り付けた。
生物発光イメージング
腫瘍成長はまた、生物発光イメージング(BLI)によりモニターした。BLIはXenogen IVIS画像システムを用いて行い、動物体内のfLuc発現細胞から放出された光子を、Living Imageソフトウェア(Xenogen)を用いて定量した。簡潔に説明すると、SKOV3 fLuc+腫瘍細胞を保有するマウスに、PBS中に懸濁したD-ルシフェリン(150 mg/kg保存液、マウス体重10グラムにつき100μLのD-ルシフェリン)を腹腔内注射し、5〜10分後、イソフルラン麻酔下で撮像した。Living Imageを用いて、光強度を表す擬似カラー画像(青色、最も弱い；赤色、最も強い)を作成した。BLI知見は、剖検で確認した。
免疫組織化学的検査
マウスをCO2吸入によって安楽死させ、腫瘍をTissue-Tek O.C.T.コンパウンド中に回収し、-80℃で凍結した。ヒトCD3染色には、標準的なストレプトアビジン西洋ワサビ免疫ペルオキシダーゼ法を使用した。一次抗体および二次抗体は、10％正常ヤギ血清を含む緩衝液中に希釈した。7μm凍結切片を、冷アセトン中で4℃にて5分間固定し、Dako(Carpentaria, CA)のペルオキシダーゼブロッキングシステムで10分間ブロッキングした。連続したインキュベーションは、以下を含んだ：10％正常ヤギ血清(室温(RT)で30分);1：100希釈の一次ウサギ抗ヒトCD3モノクローナル抗体(Thermo Scientific RM-9107)(RTで45分)；1：200希釈の二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体(RTで30分)；ストレプトアビジン-ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体試薬(Dako)(RTで30分)；および各インキュベーション後の緩衝液中での3回の5分間洗浄。次に切片をDakoからの色素原DAB plusにRTで5分間曝露し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、清澄化し、封入した。
統計解析
腫瘍量(腫瘍体積、光子カウント)については、二元配置反復測定ANOVAにより統計解析を行った。形質導入T細胞の絶対数、サイトカイン分泌、および特異的細胞溶解の差を評価するには、スチューデントのt検定を使用した。ログランク検定を用いることにより、カプラン・マイヤー生存曲線を比較した。統計的計算には、GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software)を使用した。P＜0.05を有意とみなした。
実験の結果をこれより記載する。
CARの構築
マウス抗ヒトFRα特異的scFv MOv19は、FRαに対するその高い結合親和性に基づいて選択された(108〜109 M-1；参照、Miotti et al., 1987, Int J Cancer 39:297-303；Melani et al., 1998, Cancer Res 58:4146-54；Figini et al., 1998, Cancer Res 58:991-6)。FRα CAR構築物は、MOv19 scFv、これに連結されたCD8αヒンジおよび膜貫通領域、それに続く単独の(MOv19-ζ)、またはCD137細胞内シグナル伝達モチーフとタンデムに並んだ(MOv19-BBζ)CD3ζシグナル伝達部分からなった(図18A)。CD3ζシグナル伝達の寄与を評価するために、切断型CD3ζ細胞内ドメインを含むシグナル欠損FRα特異的CAR(MOv19-Δζ)を設計した。タンデムに並んだCD3ζおよびCD137シグナル伝達モチーフを含む抗CD19 CAR(抗CD19-BBζ)を、抗原特異的対照として使用した(Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)。CAR構築物を、導入遺伝子発現がサイトメガロウイルスプロモーターから駆動されるpCLPSレンチウイルスベクターにサブクローニングした。臨床適用のために確立された遺伝子導入技術を用いて、レンチウイルスベクターを初代ヒトT細胞に効率的に形質導入して、抗FRα CARを発現させた(図18B)。すべてのアッセイにおいて、フローサイトメトリーにより評価されるT細胞形質導入効率を、すべての構築物についておよそ50％に平衡化した。
インビトロで抗原特異的機能を発揮する初代ヒトFRα CAR T細胞
卵巣癌は高頻度でFRαを発現するため(Miotti et al., 1987, Int J Cancer 39:297-303)、様々なレベルで表面FRαを発現する一連の樹立されたヒト卵巣癌細胞株(SKOV3、A1847、およびOVCAR3)をアッセイに選択した(図18C)。2つの卵巣癌株、C30およびPEO-1は、FRαについて陰性であった。MOv19-BBζ CARまたはMOv19-ζ CARを発現する形質導入T細胞は、FRα+腫瘍株を認識し、高レベルのIFN-γを分泌したが、FRα-株で刺激した場合にはそのようなことはなかった(図18D)。FRα特異的CAR T細胞はまた、FRα+癌細胞で刺激した場合に、高レベルのIL-2およびTNF-α、ならびに低レベルではあるが検出可能なレベルのIL-4およびIL-10を分泌した(図24)。MOv19 CARは、初代ヒトCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の両方で機能した。いずれの場合にも、特異的刺激後に、MOv19-BBζ T細胞はMOv19-ζ T細胞よりも多くのIFN-γを分泌した。CD19-BBζ CARは、表面CD19抗原を発現するように操作されたK562細胞と同時インキュベートした場合を除き、IFN-γを産生せず、MOv19-Δζ CARを発現するヒトT細胞は、FRα+癌細胞で刺激した場合にサイトカインを分泌せず(図18D)、抗原特異性およびCD3ζシグナル伝達が、T細胞におけるCAR活性に必要であることが示された。
抗原特異的な細胞溶解能を調べるため、抗FRα CAR CD8+ T細胞を、マウス悪性中皮腫細胞株であるFRα- AE17(Jackaman et al., 2003, J Immunol 171:5051-63)、またはAE17.FRα(高い表面レベルのヒトFRαを発現するように形質導入されたAE17株誘導体)と共培養した。標準的な4時間のクロム放出アッセイおよび24時間の生物発光アッセイにおいて、FRα特異的CAR T細胞(MOv19-ζおよびMOv19-BBζ)は、AE17.FRα細胞を特異的に溶解させたが、親AE17株は溶解させなかった(図25)。抗CD19-BBζ、MOv19-Δζ、または緑色蛍光タンパク質(gfp)を発現するT細胞は、AE17.FRα細胞もAE17細胞も溶解させなかった。サイトカイン産生の結果と一致して、MOv19-ζまたはMOv19-BBζ CARを発現する初代ヒトCD8+ T細胞は、FRα+ヒト卵巣癌細胞株SKOV3およびA1847を直接的かつ効率的に溶解させたが、FRα-株であるC30およびメラノーマ細胞株624melは溶解させなかった(図18E)。MOv19-BBζ CAR T細胞は、MOv19-ζ CAR T細胞と比較して細胞傷害性の増加を示したが、統計的に有意なレベルではなかった。よって、FRα特異的CARを形質導入されたヒトT細胞は、インビトロでFRα+ヒトおよびマウス癌細胞を特異的に認識し、MHC非拘束性細胞傷害活性を発揮する。
インビボにおける初代ヒトFRα CAR T細胞の抗腫瘍活性
インビトロにおけるCAR機能活性は、インビボにおける形質導入ヒトT細胞の抗腫瘍能を適切に予測することはできない。確立された大きな癌の異種移植モデルにおいて、FRα CAR構築物の抗腫瘍有効性を評価した。免疫不全NOD/SCID/IL-2Rγcnull(NSG)マウスの腹側部に、ホタルルシフェラーゼ(fLuc)がトランスフェクトされたFRα+ SKOV3ヒト卵巣癌細胞をs.c.接種し、腫瘍接種後(p.i.)40日目および45日目に、腫瘍のサイズが250 mm3またはそれ以上となった時点で、CAR+ T細胞の腫瘍内(i.t.)注射を行った。生理食塩水、MOv19-Δζ CAR T細胞、またはgfp T細胞を受容したマウスの腫瘍は、ノギスベースのサイズ測定および生物発光イメージング(BLI)により測定して、T細胞移入時を超えて進行した(図19Aおよび図19B)。MOv19-ζ T細胞を受容したマウスでは、最後の評価時点(最初のT細胞投与の38日後)において、3つの全対照群と比較して腫瘍成長は緩やかに遅れた(P＝0.027)。対照的に、MOv19-BBζ T細胞のi.t.注射を受けたマウスは、MOv19-ζ T細胞よりも有意に優れた(P＜0.001)迅速な腫瘍退縮を経験し、CD137シグナルの取り込みによって、インビボでの全体的な抗腫瘍活性が増強されることが示された。i.v.、i.p.注射またはi.t.経路によって送達されるMOv19-BBζ形質導入T細胞で処置した腫瘍保有マウスは、腫瘍退縮を経験した(図19C)。MOv19-BBζ T細胞のi.v.またはi.p.注入後、抗腫瘍活性はやはり観察されたが、i.t.送達と比較して退縮はおよそ7日間遅れ、このことから、局所注射が最適であるが、全身注入されるCAR T細胞も、養子移入においてインビボで強力な抗腫瘍効果を媒介するのに二義的に使用（marginalize）できることが示された。
4-1BBシグナルによって延長する、インビボにおける初代ヒトFRα CAR T細胞の持続性
いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、養子T細胞療法後の、移入された腫瘍反応性T細胞の持続性は、腫瘍退縮と高度に相関すると考えられる(Robbins et al., 2004, J Immunol 173:7125-30)。本明細書の他所に記載される実験において、最後のT細胞投与の3週間後に腫瘍保有マウスから末梢血を採取し、持続性ヒトCD4+およびCD8+ T細胞について定量した(図19D)。CD4+およびCD8+ T細胞カウントは、gfp、MOv19-Δζ、およびMOv19-ζ処置群と比較して、i.t.、i.p.、またはi.v.投与経路によって送達されるかにかかわらず、MOv19-BBζ CAR T細胞を受容したマウスにおいて最も多かった。顕著なことには、i.v.注射によってMOv19-BBζ CAR T細胞を受容したマウスにおけるヒトT細胞カウントは、対応するMOv19-ζ CAR群におけるヒトT細胞カウントよりも有意に多く(P＜0.01)、インビボでのT細胞生存におけるCD137の役割が示された。i.v.、i.t.、またはi.p.注射によりMOv19-BBζ CAR T細胞を受容したマウス間では、i.v.注射群において細胞が少ない傾向があったにもかかわらず、T細胞持続性のレベルに有意差はなかった(P＝0.2)。MOv19-ζ処置群における全T細胞カウントは、ヒトT細胞注射の非存在下において生理食塩水を受容したマウスを含む他の対照群と統計的に類似しており(図26；P＞0.05)、抗原特異性単独ではインビボにおけるT細胞維持に十分ではないことが示唆された。循環MOv19-ζ CAR CD8+ T細胞は、MOv19-Δζ CAR細胞(P＝0.026)またはgfp細胞(P＝0.013)よりもより多くの数で持続したため、これは主に不十分なCD4+ T細胞持続性に起因した。最後のMOv19-BBζ CAR T細胞投与の4週間後、血中で持続しているヒトT細胞の絶対数は、各群の腫瘍量と逆相関した(図26；r＝-0.78)。腫瘍BLIの結果は、切除された残存腫瘍のサイズと一致した(図27)。いかなる理論によって拘束されることも望まないが、MOv19-ζと比較したMOv19-BBζ CAR T細胞の持続性の増強は、一部には、抗原刺激後の抗アポトーシスBcl-XLタンパク質発現の上方制御増加に起因するようであった(図26)。よって、腫瘍退縮は、インビボにおける操作されたヒトT細胞の安定した持続性と関連し、CD137共刺激の供給によって支持された。
インビボにおいて抗原駆動性である腫瘍退縮およびT細胞持続
MOv19-BBζ CAR抗腫瘍活性が抗原特異的であるかどうかを判定するため、同様にCD137シグナル伝達ドメインを含む抗CD19特異的CAR(Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)を用いて比較実験を行った。2回のi.t. T細胞注射を受けた、確立されたs.c. SKOV3 fLuc+腫瘍を有するNSGマウスは、迅速な腫瘍退縮を経験したのに対して、gfpまたはCD19-BBζ CARを発現するT細胞で処置したマウスでは腫瘍は徐々に成長し(図20A)、腫瘍退縮の機構としてアロ反応性が排除された。MOv19-BBζ T細胞を受容したマウスは、抗CD19 CARまたはgfp群のマウスよりも有意により多くのヒトCD4+およびCD8+ T細胞カウントを有し(図20B；P＝0.009)、これにより、腫瘍抗原認識が、養子移入されたT細胞の生存をインビボにおいて駆動することが示された。興味深いことに、T細胞の持続性は、gfp T細胞よりも抗CD19-BBζ CAR T細胞を受容したマウスにおいて再現性よく高く(P＝0.012)、CAR T細胞の持続が、一部には、scFvと抗原との結合を必要としないCD137駆動性の過程を介して促進され得ることが示唆された。それにもかかわらず、試験した最後の時点でさえ(73日目)、抗CD19-BBζ CAR群とgfp群との間で腫瘍対照において統計的差異はなく(P＝0.065)、抗原特異性の非存在下における持続性は、腫瘍反応を媒介するには不十分であることが示される。この方向で、MOv19-BBζ T細胞を投与された腫瘍保有マウスの血中のCAR発現T細胞の頻度は、CD19-BBζ CAR T細胞を受容したマウスにおいて観察される頻度よりも、統計的に有意ではないものの高かった(図20C；P＝0.08)。しかしながら、T細胞カウントの増加と相まって、注入1ヵ月後に持続している循環CAR+ T細胞の総数は、MOv19-BBζ T細胞を受容したマウスにおいて有意により多かった(76±13個細胞/μL；P＝0.013)；CD19-BBζ CARおよびgfp群のマウスは、それぞれ12±4個細胞/μLおよび0±0個細胞/μLというカウントの、わずかな〜検出不可能なCAR+ T細胞の持続性を有した(図20D)。処置動物の血中のMOv19-BBζ T細胞の持続性が増加したことと一致して、免疫組織化学的解析から、i.v. T細胞投与の6週間後の、退行性SKOV3病変におけるヒトCD3+ T細胞の強い蓄積が明らかになった(図21)。抗CD19-BBζ CARまたはgfp形質導入T細胞を受容したマウスから同じ時点で切除された腫瘍では、CD3+ T細胞はほとんど検出されなかった。
転移性疾患設定における腫瘍退縮
進行卵巣癌は、時には胸膜区画に転移拡散する、通常は腹膜腔に限局する疾患である。より生理学的に関連した区画に局在化する腫瘍に対するFRα特異的T細胞の機能活性を評価するため、進行性のi.p.転移性癌の異種モデルを確立した。SKOV3 fLuc+細胞をi.p.接種されたNSGマウスは、p.i. 30日目に容易に明白である腹膜癌腫症を効率的に発症し、この時点でMOv19-BBζまたは対照抗CD19-BBζ CAR T細胞療法を施行した(図22A)。T細胞移入の3週間以内に、対照抗CD19-BBζ CAR T細胞を受容したすべてのマウスが、腹部の膨張、およそ5〜8 mL量の著しい血性腹水、および複数の結節性腹膜腫瘍を生じ、腫瘍に関連した腹部膨張のために安楽死させなければならなかった(図22Bおよび図22C)。これと比較して、MOv19-BBζ CAR T細胞で処置したマウスは、腹部の膨張も腹水も生じず、腫瘍関連生存の著明な増強を示し(P＝0.0002)、MOv19-BBζ CAR群では腫瘍関連死亡の事例はなかった(図22C)。MOv19-BBζで処置したマウスを安楽死させた時点で、腫瘍量は最小〜なしであったが、活性化ヒトリンパ球の異種移入後にNSGマウスで発生するGVHD(King et al., 2009, Clin Exp Immunol 157:104-18)と適合する苦痛の徴候のために、マウスは安楽死を必要とした。それでもなお、MOv19-BBζ CARで処置したマウスでは、i.v.注射による最後のT細胞注入後52日およびi.p.経路では68日という生存期間中央値が観察され、これに対して抗CD19-BBζ CAR T細胞群ではそれぞれ9日および12日であった(MOv19-BBζ i.p.対抗CD19-BBζ i.p.、P＝0.0023；MOv19-BBζ i.v.対抗CD19-BBζ i.v.、P＝0.0025；図22D)。i.p.またはi.v.経路によるMOv19-BBζ CAR細胞での処置の2ヵ月後、腫瘍接種されたマウスのそれぞれ60％(5匹のうち3匹)および40％(5匹のうち2匹)が生存し続けた。
時折、卵巣癌患者は、疾患進行中に、肺転移、および胸腔穿刺または他の補助的管理手技を必要とする胸膜腹水(pleural ascites)形成を起こす(Sood et al., 1999, Clin Cancer Res 5:2485-90)。NSGマウスに尾静脈注射によりSKOV3 fLuc+細胞を接種して、肺の転移性卵巣癌のモデルを作製したところ、p.i. 3日目にマウスの100％で進行性肺転移が生じた(図23)。MOv19-BBζ T細胞の2回のi.v.注射により、p.i. 14日目にすべての処置動物において肺転移の迅速な退縮が起こり、1ヵ月後、マウスの80％(5匹のうち4匹)に再発の証拠は見られなかった。対照的に、抗CD19-BBζ T細胞を受容したすべてのマウスにおいて、疾患進行が起こった。
抗FRα CAR T細胞へのCD137共刺激シグナルの供給によって誘起される腫瘍反応およびT細胞持続
CARは、非MHC拘束性様式で細胞表面決定基と結合する抗原特異的抗体の高い親和性および特異性と、Tリンパ球の強力なエフェクター機能を兼ね備える(Gross et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:10024-8)。腫瘍関連抗原を認識するCARを用いた初代ヒトリンパ球の遺伝的再標的化は、治療のための腫瘍反応性T細胞の作製を目指した頑強でかつ迅速な手段を提供する。今日まで、CARベースの治療法は、インビトロでは強力なエフェクター活性が再現性よく実証されるにもかかわらず、有望であるが多くの場合に限界のある臨床活性を示してきた(Park et al., 2007, Mol Ther 15:825-33；Pule et al., 2005, Mol Ther 12:933-41；Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:4099-102；Till et al., 2008, Blood 112:2261-71；Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-15)。有効な養子T細胞療法は、抗腫瘍活性のみならず、注入された腫瘍反応性T細胞のインビボでの拡大および持続を必要とする(Robbins et al., 2004, J Immunol 173:7125-30)。本明細書に記載される実験は、Mov19-scFvベースのCARにCD137(4-1BB)共刺激シグナル伝達ドメインを導入することにより、インビボにおける限定されたCAR T細胞持続性および腫瘍活性の主要な問題(Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-15)に対処した。
CD137は、特に記憶T細胞プール内のT細胞に関して、T細胞の増殖および生存において重要な役割を果たすTNF受容体ファミリーメンバーである(Shuford et al., 1997, J Exp Med 186:47-55；Takahashi et al., 1999, J Immunol 162:5037-40；Suhoski et al., 2007, Mol Ther 15:981-8)。CD137は、CD8 T細胞拡大を支持する(Suhoski et al., 2007, Mol Ther 15:981-8)、および重要な抗アポトーシスタンパク質Bcl-XL発現を上方制御する(Lee et al., 2002, Eur J Immunogenet 29:449-52)その実証された能力、ならびにエクスビボで4-1BBLで共刺激された腫瘍特異的T細胞の養子移入が、インビボで持続および抗腫瘍活性を支持することを示す結果(Yi et al., 2007, Cancer Res 67:10027-37)に基づいて選択された。CD3ζシグナル伝達のみを発現する「第1世代」Mov19-ζ CARと同様に、タンデムに並んだCD3ζシグナル伝達およびCD137シグナル伝達ドメインを含む「第2世代」Mov19-BBζ CARを発現するように操作されたT細胞は、インビトロにおいて、腫瘍との遭遇に際して、IFN-γ、TNF-α、およびIL-2を含む、高レベルのTh1サイトカインを優先的に分泌し、強力な抗腫瘍活性を発揮する。ここで、IFN-γサイトカイン産生レベルは一般的に、腫瘍細胞標的によって発現されるFRαのレベルと関連し、Mov19-ζ CARおよびMov19-BBζ CAR T細胞による腫瘍細胞の細胞溶解は、インビトロでは3：1のエフェクター対標的細胞(E/T)比でさえ効率的であった。すべてのインビトロ抗腫瘍アッセイにおいて、Mov19-BBζ CARを発現する操作されたT細胞は、必ずしも統計的に有意なレベルとは限らないが、Mov19-ζ CAR T細胞よりも優れていた。興味深いことに、唯一の例外は、腫瘍刺激によって誘導されるTh2サイトカイン分泌のレベルであり、Mov19-ζCAR T細胞がFRαに結合すると、より多くのIL-4およびIL-10産生が誘導され、このことから、CD3ζとCD137を組み合わせたシグナル伝達がTh1の歪んだ応答を強化することが示唆された。
第1世代CARベクターと第2世代CARベクターの二分はインビボ研究において最も明らかであり、この場合、CD137保有Mov19-BBζ CAR T細胞は、確立されたヒト卵巣癌異種移植モデルにおいて、大きな血管新生化腫瘍の優れた退縮を促進したのに対して、腫瘍進行はMov19-ζ CAR T細胞によってほとんど弱まることはなかった。合計16×106個のMov19-BBζ CAR T細胞を移入すると、推定2.5×108個の腫瘍細胞(腫瘍量250 mm3はおよそ2.5×108個の細胞を含むと仮定)が除去された；事実上、およそ1：15のE/T比。以前の臨床的知見(Dudley et al., 2002, Science 298:850-4；Robbins et al., 2008, J Immunol 180:6116-31)と一致して、腫瘍反応は、インビボにおけるMov19-BBζ CAR T細胞のT細胞持続性および腫瘍局在化の増強と関連し、いかなる特定の理論にもとらわれないが、これは一部には、腫瘍による刺激後のBcl-XLの発現上方制御に起因するようであった。抗CD19-BBζ T細胞の移入が腫瘍進行に影響しなかったため、腫瘍退縮は抗原特異的であった。腫瘍退縮およびT細胞持続は、全身的または局所的なT細胞送達により達成可能であり、このことから、移入されたT細胞が循環し、腫瘍にホーミングし、抗腫瘍機能を果たす能力が示された。いかなる特定の理論にもとらわれないが、i.v.注射は、投与が容易であり、かつモデルにおいて有効であるために、臨床適用において好ましいものの、本明細書に提供されるデータから、T細胞の局所投与が、腫瘍へのT細胞輸送の増加および好ましいE/T比の提供に一部起因し得る最適な治療効果を提供し得ることが示唆される。しかしながら、このような送達は、複数の大規模な転移部位または微小転移を有する腫瘍には適用可能ではないと考えられる。
Mov19-BBζおよび抗CD19-BBζ T細胞はT細胞注入の3週間後に末梢血中で検出され得たが、FRα+腫瘍病変においてMov19-BBζ T細胞は蓄積したが抗CD19-BBζ T細胞は蓄積しなかったことから、腫瘍におけるCAR保有T細胞の抗原選択的保持が起こり、これが腫瘍退縮に一部必要であり得ることが示唆される(Mukai et al., 1999, Cancer Res 59:5245-9)。以前の研究において、移入されたTCR遺伝子導入T細胞は、養子移入後早期に無差別に遊走したが、もっぱら抗原陽性腫瘍において抗原依存的活性化を経験し、腫瘍破壊をもたらした(Palmer et al., 2004, J Immunol 173:7209-16)。ケモカイン受容体を発現するCAR T細胞の移入は、インビボにおいて、腫瘍部位への優先的遊走を強化して、抗腫瘍活性を高め得る(Craddock et al., 2010, J Immunother 33:780-8)。本明細書に提供される結果から、インビボにおけるT細胞の持続、局在化、および腫瘍活性は、大部分は抗原依存的な、関連している可能性の高い過程であるという仮説が支持される。顕著なことには、しかしながら、特異性対照としての抗CD19-BBζ T細胞のアッセイにおける使用により、CARによるCD137シグナル伝達の供給が、scFvと抗原との結合に非依存的な機構を介して、インビボでT細胞持続性を改善することができ、しかし抗腫瘍活性を改善することはできなかったことが示され、以前のデータ(Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-64)と一致して、CD137モジュールによる低レベルの構成的活性化が示唆される。いかなる特定の理論にもとらわれないが、CD137で共刺激された非特異的なヒトT細胞の持続は、使用した異種NSGマウスモデルの固有の限界である移植片対宿主徴候の発現によって示されるように、CARによる構成的CD137シグナル伝達と組み合わせた、マウス中の異種抗原の低レベルのTCR認識によって駆動された可能性もある。
早期臨床研究において、前もって活性化されたT細胞に、Tリンパ球上のCD3分子およびEOC細胞上のFRαに対する二重特異性マウスmAb OC/TRを負荷することによって、再標的化T細胞が治療のために作製された(Canevari et al., 1988, Int J Cancer Suppl 2:18-21)。微小残存卵巣癌を有する女性に、FRαに再方向づけられたT細胞を投与することにより、軽度から中等度の免疫療法関連毒性を伴って、患者の27％において抗腫瘍反応が起こった；しかしながら、治療法は、安定した抗FRα特異的T細胞記憶を生成できないこと、および処置された患者のおよそ90％において、二重特異性mAbに対するヒト抗マウス抗体が誘導されることによって限定された(Canevari et al., 1995, J Natl Cancer Inst 87:1463-9)。癌に関する抗FRα CAR療法の第I相研究において、Kershawおよびその同僚ら(Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12:6106-15)は、第1世代のMOv18 scFvベースのCARによってFRαに再標的化されたT細胞を、進行卵巣癌を有する免疫正常患者に移入した。親MOv18抗体は、本CAR構築物に使用されるMOv19と類似の、FRαに対する親和性(108〜109 M-1)を有するが(Miotti et al., 1987, Int J Cancer 39:297-303；Figini et al., 1998, Cancer Res 58:991-6)、CARにおけるそれらのscFv生成物の相対的親和性は不明である。MOv18およびMOv19はまた、非交差反応性エピトープと結合し(Miotti et al., 1987, Int J Cancer 39:297-303)、これは表面抗原にアクセスするそれらの相対的能力に影響を及ぼし得る。MOv18-ζ CARを用いる治療法は、安全でかつ実行可能であった；しかしながら、いずれの患者も、注入後の移入T細胞の持続性の欠如、不十分な腫瘍局在化、およびインビボ研究においてCAR T細胞活性を低下させる血清抑制因子の発生に起因して、腫瘍反応を経験しなかった(Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-15)。本明細書に示される研究は、これらの問題に対処する。Kershawおよびその同僚らの研究(Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-1)と同様に、インビトロでT細胞細胞傷害性を再方向づけた第1世代MOv19-ζ CARは、インビボでは腫瘍進行を遅らせるにすぎず、CARはインビボにおいて長期間持続しなかった。腫瘍反応およびT細胞持続が、抗FRαCAR T細胞へのCD137共刺激シグナルの供給によって誘起され得、これが主にそれらのCARと腫瘍抗原との結合によって促進されることが、本明細書において示される。さらに、MOv19-BBζ T細胞の移入は、退行性卵巣癌病変におけるヒトT細胞の蓄積増加をもたらす。MOv19-BBζ CARの構築において用いられたマウス抗ヒト MOv19 scFvは、MOv18 scFvを用いる過去のCAR研究および試験(Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12: 6106-15；Canevari et al., 1995, J Natl Cancer Inst 87:1463-9；Lamers et al., 2011, Blood 117:72-82)において見られるように、免疫正常レシピエントにおいて抗マウス体液性応答を誘発する可能性が高いが、骨髄非破壊的免疫抑制前処置は、宿主の内因性免疫を無効にして、マウス起源のCARおよびTCRを発現するT細胞のインビボ持続を促進し、腫瘍退縮を促進することができる(Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:4099-102；Berger et al., 2001, J Virol 75:799-808；Johnson et al., 2009, Blood 114:535-46)。免疫不全NSGマウスの使用は、ヒト誘導体および内因性免疫再構築は存在しないものの、宿主リンパ枯渇の設定におけるT細胞移入をモデル化する。本明細書に示される結果に基づき、次世代のCAR再方向づけ療法のための完全ヒト抗FRα scFv候補の使用は、研究する価値がある(Figini et al., 1998, Cancer Res 58:991-6；Figini et al., 2009, Cancer Immunol Immunother 58:531-46)。本明細書に示される結果は、FRα特異的CARへのCD137シグナル伝達ドメインの取り込みが、インビボにおける移入T細胞の持続性を改善し、それにより腫瘍内でのそれらの保持を増加させ、抗腫瘍効力を強化することによって、過去のCARアプローチの限界を克服するという概念を支持する。重篤な有害事象を媒介する可能性があるCARまたは外因性TCRによる自己/腫瘍抗原の標的化に際しては、注意深く考慮しなければならない(Johnson et al., 2009, Blood 114:535-46；Morgan et al., 2010, Mol Ther 18:843-51)；しかしながら、正常組織上に存在するFRαは主に極性化上皮の頂端表面に局在し、そこでFRαは、非経口投与された葉酸複合物および再方向づけT細胞にアクセスすることはできないと考えられる(Low et al., 2004, Adv Drug Deliv Rev 56:1055-8)。
実施例20：再発性卵巣癌患者における、自己葉酸受容体(α-FR)-αに再方向づけられたT細胞の静脈内投与の概念の安全性および実証を確立するための予備的第I相用量漸増研究
癌治療のためのCAR T細胞を開発する上での主要な課題は、注入後の細胞の持続性を増強して、腫瘍部位へのCAR T細胞の輸送を最適化するベクター設計を同定することである。本研究設計は、ベクター設計の変化が、卵巣癌の以前の研究(Hwu et al., 2006, Clinical Cancer Research, 12(20): 6106-6115)と比較して、CAR T細胞の生存を改善するという仮説を試験する。抗α-FRキメラ抗原受容体(CAR) T細胞を受容する、卵巣癌を有する対象における、抗α-FR CARを形質導入された(CAR) T細胞の投与の安全性、認容性、および実行可能性を判定するための第I相研究を、本明細書に記載する。プロトコール模式図を図28に示す。参加の時点で対象をスクリーニングし、対象の適格性を判定する。スクリーニングの4〜6週間以内に、すべての適格性基準を満たす対象に対してアフェレーシスを行い、CAR T細胞を製造するための末梢血単核細胞(PBMC)を得る。PBMCからT細胞を精製し、抗αFR scFvを形質導入し、インビトロで拡大し、次にその後の投与のために凍結する。
研究薬剤および用量
研究薬物は、α-FRに対する特異性を有する細胞外一本鎖抗体(scFv)と、細胞内TCRz鎖および4---1BBシグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作された自己T細胞である。CAR構築物が開発され、MOv19---BBζ CARを保有する臨床等級のpELNSレンチウイルスベクターが既に製造されている。CAR T細胞を注入用凍結媒質中で凍結保存し、バッグ1つまたは2つのいずれかで投与する。各バッグは、バッグ当たり、適正な数の自己T細胞と共に、以下の注入等級の試薬(％ v/v)：31.25 plasmalyte-A、31.25デキストロース(5％)、0.45 NaCl、7.50までのDMSO、1.00デキストラン40、5.00ヒト血清アルブミンを含む凍結媒質の一定分量(容積は用量に依存する)を含む。
約3×107個CAR+ T細胞/m2の「推定最小薬理作用量」(MABEL)用量から開始して、約3×108個CAR+ T細胞/m2の「無有害作用量」(NOAEL)用量に到達するまでの、3つのT細胞用量レベルを試験する。さらなる安全性のために、3日間にわたって投与のための「分割用量」アプローチに従い、0日目に意図される全量の10％、1日目に30％、および2日目に60％を用いて、静脈内注入によってCAR形質導入T細胞を投与する。
「分割用量」投与計画を用いて、急速i.v.注入により、0、1、および2日目に、患者に単一用量のCAR T細胞を静脈内投与する。注入は、化学療法の2日後に行うように予定される。
コホート1
3×107個のCAR T細胞/m2(2.5×107個の最小許容用量および3.5×107個の最大許容用量)
コホート2
1×108個のCAR T細胞/m2(8×107個の最小許容用量および1.2×108個の最大許容用量)
コホート3
3×108個のCAR T細胞/m2(2.6×108個の最小許容用量および3.4×108個の最大許容用量)
調製
CAR T細胞は生産施設で調製され、注入細胞の出荷基準(例えば、細胞純度、無菌性、ベクターの平均コピー数/細胞等)が満たされるまで、生産施設から出荷されない。出荷され次第、細胞は診療所に搬送される。CAR形質導入T細胞を含むバッグ(50〜100 ml容量)は、University of Pennsylvaniaでモニター付きの-150℃冷凍庫中に血液バンク条件下で貯蔵する。注入バッグは、必要時まで冷凍庫中で貯蔵する。
細胞融解
形質導入T細胞は、生産施設から診療所の幹細胞ユニットへドライアイス上で輸送され、そこで生成物の封が切られる。形質導入T細胞は、研究看護師/コーディネーターによって、診療所の患者のベッドサイドまで輸送される。注入は、診療所の個室で行う。細胞は、36℃〜38℃に維持した水浴を用いて、バッグ1つずつとしてベッドサイドで融解する。細胞がちょうど融解するまで、バッグをやさしく揉む。凍結した凝集塊が容器中に残っていないことを確認する。CAR T細胞生成物が、損傷したもしくは漏出しているバッグを有すると思われるか、または別の方法で損なわれていると思われる場合には、これは注入せずに、生産施設に戻す。
研究薬物の返却または破壊
CAR T細胞は、1) 生成物の誤ったラベル付け；2) 患者の状態により注入/注射が禁止される、および3) 対象が注入/注射を拒絶するを含むがこれらに限定されない種々の理由で、生産施設に戻す必要がある場合がある；いかなる未使用の生成物も、処分のために生産施設に戻す。
前投薬
T細胞注入後の副作用には、一過性の発熱、悪寒、倦怠感、および/または嘔気が含まれる。CAR T細胞の注入前に、対象に、経口によりアセトアミノフェン650 mgおよび経口またはIVにより塩酸ジフェンヒドラミン25〜50 mgを前投薬することが推奨される。これらの投薬は、必要に応じて6時間ごとに繰り返すことができる。アセトアミノフェンによって軽減されない患者の発熱が続く場合には、一連の非ステロイド性抗炎症薬を処方してもよい。ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン(Solu-Medrol)、またはデキサメタゾン(Decadron)などの全身性糖質コルチコイドはT細胞に有害作用を及ぼす可能性があるため、生命を脅かす緊急事態の場合を除き、いかなる時にも、患者にこれを投与しないことが推奨される。急性注入反応にコルチコステロイドが必要とされる場合には、ヒドロコルチゾン100 mgの初回用量が推奨される。
研究薬物の投与
融解後およそ10〜40分以内に、細胞を注入する。形質導入T細胞は、三方活栓を備えた18ゲージのラテックスフリーY型輸血セットを通して、1分当たりおよそ10 mL〜20 mlの流速で急速静脈内注入により3日間連続して投与する。投薬は重力注入によって行う。重力による注入速度が遅すぎる場合には、活栓を通して50 mLシリンジ中に形質導入T細胞薬物生成物を引き出し、必要な速度で手動で注入する。注入期間はおよそ15分である。CAR T細胞の1つまたは2つのバッグを氷上でベッドサイドに運び、細胞を冷却しながら対象に投与する。各注入バッグには、以下：「自己使用に限る」を含むラベルが添付されている。加えて、ラベルは、対象の頭文字、生年月日、および研究番号などの、少なくとも2つの特有の識別子を有する。注入前に、2名の個体が、対象の存在下でこの情報すべてを独立して検証し、そこでその情報が参加者と正確に一致することを確認する。
注入中、万一、対象がアレルギー反応もしくは重篤な低血圧緊急症、または注入に対する任意の他の反応を有した場合には、救急医療機器(すなわち、救急用車輪付き担架)を利用することができる。注入の前後、その後バイタルサイン(体温、呼吸速度、脈拍、および血圧)が良好でかつ安定するまでの少なくとも2時間の間15分ごとに、これらのバイタルサインをとる。対象は、退出しても安全であると医師が見なすまで、そうしないよう求められる。
形質導入T細胞の投薬の完了後15分(±5分)以内に、形質導入T細胞の数のベースライン決定のために、血液試料を採取する。
スクリーニングおよびベースライン評価：
試験の開始前に、患者はインフォームドコンセントに署名する。スクリーニング手順はアフェレーシスの4〜6週間以内に行い、これには以下のものが含まれる：
・組み入れ/除外基準の審査
・ECOG一般状態＜2の確認
・腫瘍量の評価：胸部、腹部、および骨盤のCTスキャンを含め、診療の基準通りに実施。来診前の4週間以内に行われている場合には、繰り返す必要はない。
・身体検査(バイタルサイン、身長および体重、病歴および薬歴を含む)
・併用薬の審査
・血液学的検査：全血球計算(CBC)、分画、血小板、プロトロンビン時間(PT)、および部分トロンボプラスチン時間(PTT)
・血清生化学検査：BUN、クレアチニン、電解質、およびグルコース；カルシウム、マグネシウム、リン酸、SGOT、SGPT、アルカリホスファターゼ、LDH、総ビリルビン、尿酸、総タンパク質量、およびアルブミン
・ウイルス学的検査(スクリーニング)；HIV-1、2、HTLV-1/2、B型肝炎(HbsAg、α-HBc)、C型肝炎(αHCV)
・血清CA-125
・尿検査
・EKG(生後6週まで、施設の外部で実施可能)
・VSV-G抗体応答およびヒト抗マウス抗体(HAMA)
・CT/MRI(生後6週まで、施設の外部で実施可能)
・研究用採血
アフェレーシス
アフェレーシスセンターにおいて、約10〜15リットルのアフェレーシス手順を実施する。この手順中に、CAR T細胞用のPBMCを得る。1回の白血球除去から、CAR T細胞を製造するための少なくとも50×109個の白血球細胞を回収することが目的である。FDA遡及要件および研究のためのベースライン血液白血球も同様に得て、凍結保存する。いかなる特定の理論にもとらわれないが、細胞生成物は、およそ4週間後に出荷の準備ができると予測される。T細胞の目標数に達しない場合には、研究過程中に反復アフェレーシスが勧められ得る。
一過性リンパ枯渇投与計画(-5〜-3日目)
対象は、-5日目〜-3日目に、静脈内シクロホスファミド(300 mg/m2/dを3日間)および静脈内フルダラビン(30 mg/m2/dを3日間)による外来患者前処置リンパ枯渇化学療法を1過程受ける。これは、十分に許容される外来患者投与計画である。処置する医師の判断で、シクロホスファミド250 mg/m2/dおよびフルダラビン25 mg/m2/dまでの用量低下が可能である。
以下は、-5日目〜-3日目の治療法の過程を含む。
対象にアセトアミノフェン(Tylenol) 650 mgを前投薬し、2.6 ml/kg/時間にて0.9％塩化ナトリウムおよび10 meq/l KCLで水分補給する(水分補給は、研究者の判断による)。
対象に、250 ml D5W中のシクロホスファミド300 mg/m2/dを1時間かけて、3日間毎日IV投与する。最大用量は、最大理想体重の140％を超える体重に基づいて算出された用量を超えてはならない。
対象に、フルダラビン30 mg/m2/日を15〜30分かけて、3日間毎日IVPB投与する。最大用量は、最大理想体重の140％を超える体重に基づいて算出された用量を超えてはならない(Metropolitan Life Insurance Company)。フルダラビンは、シクロホスファミドのおよそ1〜2時間後に開始する。
予防として、抗生物質、抗真菌剤、および抗ウイルス剤を対象に投与する：典型的な予防用量は以下の通りである：Altrex 500 mgを毎日、q M W FにBactrium DSを1錠、およびフルコナゾール200 mgを毎日。投薬期間は、リンパ球絶対数(ALC)および好中球絶対数(ANC)が投薬前のベースラインに戻るまでである。
患者は、化学療法の前日、化学療法の期間中、および化学療法後の翌日に、2〜3リットル/日の液体を経口摂取するよう推奨される。臨床的に指示されるとおりに造血成長因子が与えられる。
第1治療サイクルのためのCAR T細胞投与(0、1、および2日目)
対象は個室で注入を受ける。本明細書の他所に記載されるように、細胞を患者のベッドサイドで融解する。各注入の期間がおよそ10〜15分となるように、融解された細胞を、許容される速さの注入速度で投与する。混合を促進するために、Yアダプターを用いて細胞を同時に投与する。注入前および注入20分後に、ベースラインCAR T細胞レベルを測定するための血液試料を採取する。本明細書の他所に記載されるように、対象に注入および前投薬する。バイタルサイン(体温、呼吸速度、脈拍、および血圧)が良好でかつ安定するまでの少なくとも2時間の間15分ごとに、これらのバイタルサインをモニターして、注入後少なくとも2時間の間、対象を観察する。T細胞注入の前および15分後、ならびにその後観察期間が完了するまで15分ごとに、肺評価の手段として、血中酸素のパルス酸素測定を使用する。
対象の評価
T細胞注入前の0、1、および2日目に、対象に対して以下のことを行う：
・ECOG一般状態
・身体検査(バイタルサイン、体重、ConMedおよび有害事象評価を含む)。
・血液学的検査：CBC、分画および血小板、プロトロンビン時間(PT)、ならびに部分トロンボプラスチン時間(PTT)。
・血清生化学検査：BUN、クレアチニン、電解質、グルコース、カルシウム、SGOT、SGPT、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、総タンパク質量、アルブミン。
・尿検査：尿タンパク：クレアチニン(UPC)比を測定するための、ランダム尿タンパク、ランダム尿クレアチニン。UTIの非存在下で+1を超えるタンパク尿を有する対象において、24時間尿タンパクを測定する。
・血清CA-125
・血清HAMAおよびVSV-Gレベル
・研究用採血
T細胞注入後の7、14、25、および39日目に、対象に対して以下のことを行う：
・ECOG一般状態
・身体検査(バイタルサイン、体重、ConMedおよび有害事象評価を含む)。
・血液学的検査：CBC、分画および血小板、プロトロンビン時間(PT)、ならびに部分トロンボプラスチン時間(PTT)。
・血清生化学検査：BUN、クレアチニン、電解質、グルコース、カルシウム、SGOT、SGPT、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、総タンパク質量、アルブミン。
・尿検査：尿タンパク：クレアチニン(UPC)比を測定するための、ランダム尿タンパク、ランダム尿クレアチニン。UTIの非存在下で+1を超えるタンパク尿を有する対象において、24時間尿タンパクを測定する。
・EKG
・血清HAMAおよびVSV-Gレベル
・研究用採血
対象は、およそ39日目にCTガイド下の腫瘍生検を受ける。
安全性および生着を評価するための注入前および注入後実験
対象は、第1治療サイクル中の以下の時点：-5日目(リンパ枯渇前)、0日目(T細胞注入前)、各T細胞注入の15分後および2時間後、次に7日目まで毎日、次に再度9、11、14、18、25日目に、次にEOSまで2週間ごとに1回において、CAR T細胞の存在および安全性を評価するため、ならびに免疫学的データの収集のために、約100 mlの瀉血(赤キャップ2本および緑キャップ3本)を受けるよう求められる。
EOS(58日目)の時点で、さらなる約200 mlの瀉血(緑キャップ5本および赤キャップ3本)を回収する。対象は全員、化学療法注入前のシクロホスファミド化学療法の1日目および3日目；ならびにT細胞注入前；その後ANCおよびALCが処置前のベースラインまたはそれぞれ1500および1000に到達するまで週に2回、約6 mlの瀉血を受ける。研究中少なくとも月に1度、血清CA-125レベルを記録するが、これは臨床決定判断には含めない。
研究終了時の評価(EOS、約58日目)
以下のように、約58日目に特定のモニタリング試験および手順を完了する：
・ECOG一般状態
・身体検査(バイタルサイン、体重、ConMedおよび有害事象評価を含む)。
・血液学的検査：CBC、分画および血小板、プロトロンビン時間(PT)、ならびに部分トロンボプラスチン時間(PTT)。
・血清生化学検査：BUN、クレアチニン、電解質、グルコース、カルシウム、SGOT、SGPT、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、総タンパク質量、アルブミン、LDH、マグネシウム、リン酸、尿酸。
・血清CA-125
・腫瘍量の評価：胸部、腹部、および骨盤のCT/MRIスキャン
・EKG
・対象は、免疫モニタリングのために約200 mlの瀉血を受ける(緑キャップ5本および赤キャップ2本)。C
・CT/MRI
58日目(研究終了(EOS)時)に、対象は第1治療サイクルを完了し、免疫および臨床評価(免疫関連応答基準によって測定される)を受けた。免疫関連完全寛解(ir-CR)を達成した対象は、疾患の進行に際して、別のサイクルを受ける選択肢を有する。ir-部分寛解(ir-PR)、ir-安定疾患(ir-SD)、またはir-疾患進行(ir-PD)を経験した対象は、リンパ枯渇後に別の治療サイクルを受ける選択肢を有する。すべての安全性パラメータが満たされ、次のサイクルへの移行が安全である場合に限り、対象は2回以上のサイクルを受ける。対象はまた、遺伝子組み換えT細胞を用意しておかなければならない。
一次エンドポイント
本研究の一次エンドポイントには、以下のものが含まれる：
・安全性：研究処置の第1日目からEOSまでのいずれかの時点における、研究処置に「もしかしたら」、「おそらく」、または「明確に」関連する研究関連有害事象(前述のいくらかの例外はあるが、≧グレード3の徴候/症状、実験毒性、および臨床事象と定義される)の発生をモニターする。
・実行可能性：実行可能性は、ベクター形質導入効率に関する出荷基準を満たしていない、製造された生成物の数と定義される。T細胞の純度、生存率、および無菌性を判定する(「製造不良」と定義される)。
二次エンドポイント
本研究の主要な二次エンドポイントには、以下のものが含まれる：
・CAR T細胞の持続性および生着：投薬後、CAR T細胞の生着を、PBMC中のベクターコピー数に関するDNA PCRによって評価する。血中の抗α-葉酸受容体CAR T細胞の数を、各T細胞注入の約15分後、2時間後、次に7日目まで毎日、次に再度9、11、14、18、25日目に、次に研究終了時まで2週間ごとに1回行うRT-PCRによって測定する。安全性プロファイル、ならびに循環および腫瘍生検標本におけるCAR T細胞の生着について用量レベルを比較することにより、最適生物学的用量(OBD)を規定する；OBDは、許容可能な毒性プロファイルを有して、28日目に最も高い生着を有する。
・臨床的有効性：シクロホスファミド/フルダラミンによるリンパ枯渇後にCAR T細胞で処置した患者の免疫関連応答、無進行生存、全生存、および無進行期間の分布を判定する。
・腫瘍免疫およびα-葉酸受容体発現に及ぼすCAR T細胞の効果を、研究所アッセイを用いて判定する。
・CAR+ T細胞の持続性、生着、表現型、および機能：FRα CAR+ T細胞は、PE結合ヤギ抗マウスIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch)を用いたフローサイトメトリーによって、容易に同定される。末梢血中のCAR+ T細胞を長期的に定量する(投薬後約15分、24時間、48時間、72時間、7、14、21、および28日目、ならびに6、8、12、16週目、および6ヵ月ごと。加えて、CAR+ T細胞の持続性について試験するための獲得的高感度法である、PBMC中のベクターコピー数に関するDNA定量的(q)PCRによって、CAR+ T細胞を検出する。CAR+ T細胞の表現型解析には、記憶細胞マーカー(CCR7、CD62L、CD45RA、CD27、CD28、Fas等)対エフェクター細胞マーカー(CD45R0、CCR6、CD25、CD38、HLADR、GITR、PD1等)の詳細な調査が含まれる。CAR+ T細胞はまた、IL-7受容体CD127およびIL-15受容体α発現についても表現型判定する。PHA-イオノマイシンまたは同族抗原によるエクスビボ刺激後の、細胞内サイトカイン(INFγ、TNFα、IL-2、IL-17、IL-4、TGFβ、IL-10)、グランザイム、CD137、およびCD107aの調査は、移入後のインビボ極性化および機能の詳細かつ長期的な特徴づけを提供する。腫瘍生検標本中のCAR+ T細胞の存在をDNA qPCRによって定量し、ベースラインおよび研究終了時のFRαタンパク質発現と相関させる。
・CAR免疫原性：HAMAによるCAR T細胞に対する宿主免疫応答の発生およびVSV-G ELISAを評価し、CAR+ T細胞の生着と相関させる。
・腫瘍微小環境に及ぼすCAR+ T細胞の効果：免疫組織化学的検査により、詳細な白血球サブセット浸潤物解析を行い、多重qPCRおよび/またはAffymetrixアレイにより、腫瘍微小環境の包括的免疫解析を行う。
・用量最適化：安全性プロファイル、ならびに循環および腫瘍生検標本におけるCAR+ T細胞の生着について用量レベルを比較することにより、OBDを規定する；OBDは、許容可能な毒性プロファイルを有して、28日目に最も高い生着を有する。
血清中の改変T細胞の数、HAMAレベル、抗α-葉酸受容体に対する宿主免疫の血清ELISPOT測定値、および免疫機能、ならびにVSV-G抗体応答を時間の関数としてグラフで表示する。組織生検を受けた患者について、腫瘍内抗α-葉酸形質導入細胞を有する腫瘍と有さない腫瘍のα-葉酸受容体発現の平均レベルを計算する。割合および平均値の95％信頼区間を計算する。
Luminexを用いてサイトカイン測定を行い、処置によって調節される可能性のある一連のサイトカイン/ケモカイン/免疫性因子を評価する。この一連は、以下の因子：IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40/p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSFのすべてまたはサブセットから構成される。これらの測定は、-5日目(リンパ枯渇前)、0日目(T細胞注入前)、各T細胞注入の15分後および2時間後、次に7日目まで毎日、次に再度9、11、14、18、25日目に、次にEOSまで2週間ごとに1回採取された血清試料で行う。これは、最初の3つのコホートにおけるIL-7のプロファイルを決定するのに役立ち、その後のコホートにおけるrhIL-7の投与予定のより良い決定に役立つ。
臨床的有効性
抗腫瘍活性は、二次試験エンドポイントして報告される。本試験の目的は、CAR T細胞の臨床開発の早期に、IV投与経路を用いたこれらの細胞の持続性および生着を判定することである。応答および進行は、本研究において、新規な免疫関連応答基準を用いて評価する。
irRCを用いた腫瘍応答の定義
進行性疾患の免疫関連応答基準(irRC)を用いた腫瘍評価における直径の積和は、新たな測定可能病変の寄与を組み入れる。irRC基準を用いた評価ごとの腫瘍量の各純変化率は、古い病変と、出現した場合には新たな病変の両方のサイズおよび増殖動態学を説明する(Wolchok et al., 2009, Clinical Cancer Research, 15(23): 7412-7420；Hoos et al,, 2010, Journal of the National Cancer Institute, 102(18): 1388-1397；Hodi, 2010, New England Journal of Medicine, 363(13): 1290)。
irRCを用いた指標病変応答の定義
・ir完全寛解(irCR)：すべての指標病変の完全な消失。
・ir部分寛解(irPR)：すべての指標病変およびすべての新たな測定可能病変の2つの最大垂直直径の積和の、ベースラインに対する50％またはそれ以上の減少(すなわち、腫瘍量の変化率)。注記：新たな測定可能病変の出現は、全腫瘍量に組み入れるが、SPDが最下点時のSPDと比較して≧25％増加するまで、自動的に進行性疾患と見なされない。
・ir安定疾患(irSD)：進行性疾患の非存在下で、irCRおよびirPRの基準を満たさない。
・ir進行性疾患(irPD)：最下点時のSPDと比較した場合の、腫瘍量の変化率の少なくとも25％の増加(すなわち、すべての指標病変およびあらゆる新規病変の積和をとる)。
irRCを用いた非指標病変応答の定義
・ir完全寛解(irCR)：すべての非指標病変の完全な消失。
・ir部分寛解(irPR)またはir安定疾患(irSD)：非指標病変はPRの定義において考慮されず、これらの用語は当てはまらない。
・ir進行性疾患(irPD)：腫瘍量の変化率が25％増加しない限り/増加するまで、非指標病変の数またはサイズの増加は進行性疾患を構成しない(すなわち、指標病変の最下点時のSPDは必要量だけ増加する)。
irRCに及ぼす新規病変の影響
新規病変は、それ自体およびそれだけでは進行性疾患と見なされない。しかしながら、全腫瘍量へのそれらの寄与はSPDに含まれ、これは次に腫瘍応答のirRC基準に送り込まれる。よって、新たな非測定可能病変によって、いかなる対象も本研究から打ち切られることはない。
irRCを用いた全体応答の定義
irRCを用いた全体応答は、これらの基準に基づく：
・免疫関連完全寛解(irCR)：完全寛解の文書化の日から少なくとも4週間にわたる、すべての腫瘍病変(新たな測定可能/非測定可能病変を伴わない、指標および非指標)の完全な消失。
・免疫関連部分寛解(irPR)：すべての指標病変の2つの最大垂直直径の積和を測定し、SPDベースラインとして記録する。その後の各腫瘍評価時点で、すべての指標病変および新たな測定可能病変の2つの最大垂直直径の積和を合計して、免疫応答直径積和(irSPD)を提供する。以前のSPDベースラインと比較した、irSPDのベースラインに対する50％またはそれ以上の減少を、免疫部分寛解(irPR)と見なす。
・免疫関連安定疾患(irSD)：irSDは、進行性疾患の非存在下で、免疫完全寛解および免疫部分寛解の基準を満たすことができないことと定義される。
・免疫関連進行性疾患(irPD)：難しい症例では、連続した画像診断によってPDを確認することが推奨される。以下のうちのいずれかが進行性疾患を構成する：
○指標病変について算出されたベースラインSPDを上回る、すべての指標病変の積和の少なくとも25％の増加。
○指標病変について算出されたベースラインSPDを上回る、すべての指標病変および新たな測定可能病変の積和(irSPD)の少なくとも25％の増加。
注入の1〜15年後の年1回の評価
研究が終了した時点で、患者は、ASGTおよびFDAによって示される長期経過観察(LTFU)の最近の指針に従って、最長15年間まで長期経過観察を受ける。LTFUは、注入後の最初の5年間は6ヵ月に1回の来診、およびその後は、血中にベクター改変細胞がもはや検出されない場合には、1年に1回の来診を必要とする。来診は、採血および身体検査を含む。
離脱対象のデータ収集および経過観察
研究薬剤を受容した対象の、細胞療法臨床試験後の経過観察データ収集は、FDA指針に従って最長15年までである。患者が、scFvキメラ受容体を形質導入された、検出可能な細胞を有する限り、毒性、免疫応答、および任意の長期有害事象について、患者を追跡する。細胞療法に応答した多くの患者はまた、DFSの延長を有し得るが、遅発性再発のリスクもある。目的は、CAR T細胞で処置されたすべての患者を、少なくとも、疾患のために代替治療が必要となる、および/または患者に注入細胞による毒性のリスクがもはやなくなる(すなわち、生着の喪失)まで、無期限に追跡することである。よって、1) 患者にリスクのある限り(検出可能な形質導入T細胞の喪失が証明されるまで)、生着に関して；2) 疾患進行が起こるまで、DFSに関して；3) 死亡時まで、生存に関して、または4) 患者が臨床データ収集に関する同意を取り下げるまで、データ収集を継続する。
他の施設または診療において追跡を受けている患者は、好みまたは地理的な問題から、定期的な研究評価を伴う、患者の現地の医師による手紙および/または電話面接によって経過観察を受ける。一例は、州外から紹介されたが、別のセンターでケアを受けている患者である。毒性および他の臨床評価は、処置している医師から得る。少なくとも生存データを得るために、経過観察から逃れると考えられる対象と連絡をとるよう極力努める。万一、対象が経過観察要件を完了できない場合、対象と連絡を取るための全試みの証拠書類は、電話による少なくとも3回の接触(異なる日および1日の異なる時間における)、および配達証明書付きの手紙を含む。1) 6ヵ月の経過観察後に、応答の欠如、再発、もしくは進行性疾患の証拠がある場合、または2) いずれかの時点で、疾患のために新たな治療(すなわち、従来の化学療法)が必要となる場合に、対象はDFS評価から除かれる。対象は、死亡時に生存評価から除かれる。
実施例21： FR発現癌細胞株を認識し、これに応答するヒト化抗FR CAR
ヒト化C4 scFVを含む完全ヒト抗FR CARを構築した。ヒト化抗FR CARを発現するように初代ヒトT細胞を形質導入したところ、ヒト化抗FR CARは形質導入T細胞の表面上に効率的に発現された(図29)。形質導入および非形質導入T細胞を、卵巣癌細胞または乳癌細胞と一晩共培養した。形質導入T細胞は、FR発現細胞株と共培養した場合にIFN-γを分泌したが、非形質導入T細胞は分泌しなかったため、ヒト化抗FR CAR形質導入T細胞はインビトロでFR発現細胞株を認識した。FRをほとんど発現しない細胞株(A2780およびC30)は、形質導入T細胞によって認識されなかった(図29)。
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願、および出版物の開示内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変化形が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および同等の変化形をすべて含むと解釈されるように意図される。

Claims (41)

  1. α-葉酸受容体(FRα)結合ドメインの核酸配列および4-1BB(CD137)共刺激ドメインの核酸配列を含む、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列。
  2. CD3ζシグナル伝達ドメインの核酸配列をさらに含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  3. CARがSEQ ID NO: 13またはSEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  4. SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 20の核酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  5. FRα結合ドメインが抗体またはそのFRα結合断片である、請求項1記載の単離された核酸配列。
  6. FRα結合断片がFabまたはscFvである、請求項5記載の単離された核酸配列。
  7. FRα結合ドメインが腫瘍抗原に結合し、腫瘍抗原がFRαである、請求項1記載の単離された核酸配列。
  8. 腫瘍抗原が上皮性悪性腫瘍と関連している、請求項7記載の単離された核酸配列。
  9. 腫瘍抗原が固形腫瘍と関連している、請求項7記載の単離された核酸配列。
  10. FRα結合ドメインがSEQ ID NO: 15またはSEQ ID NO: 23のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  11. FRα結合ドメインがSEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 21の核酸配列によってコードされる、請求項1記載の単離された核酸配列。
  12. 4-1BB共刺激ドメインがSEQ ID NO: 18のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  13. 4-1BB共刺激ドメインがSEQ ID NO: 6の核酸配列によってコードされる、請求項1記載の単離された核酸配列。
  14. CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含む、請求項2記載の単離された核酸配列。
  15. CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQ ID NO: 7の核酸配列によってコードされる、請求項2記載の単離された核酸配列。
  16. 膜貫通ドメインの核酸配列をさらに含む、請求項1記載の単離された核酸配列。
  17. FRα結合ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含む、単離されたキメラ抗原受容体(CAR)。
  18. CD3ζシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項17記載の単離されたCAR。
  19. SEQ ID NO: 13またはSEQ ID NO: 22のアミノ酸配列を含む、請求項17記載の単離されたCAR。
  20. FRα結合ドメインが抗体またはそのFRα結合断片である、請求項17記載の単離されたCAR。
  21. FRα結合断片がFabまたはscFvである、請求項20記載の単離されたCAR。
  22. FRα結合ドメインが腫瘍抗原に結合し、腫瘍抗原がFRαである、請求項17記載の単離されたCAR。
  23. 腫瘍抗原が上皮性悪性腫瘍と関連している、請求項22記載の単離されたCAR。
  24. 腫瘍抗原が固形腫瘍と関連している、請求項22記載の単離されたCAR。
  25. FRα結合ドメインがSEQ ID NO: 15またはSEQ ID NO: 23のアミノ酸配列を含む、請求項17記載の単離されたCAR。
  26. 4-1BB共刺激ドメインがSEQ ID NO: 18のアミノ酸配列を含む、請求項17記載の単離されたCAR。
  27. CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含む、請求項18記載の単離されたCAR。
  28. 膜貫通ドメインをさらに含む、請求項17記載の単離されたCAR。
  29. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞であって、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、遺伝子改変T細胞。
  30. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含むベクターであって、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含む、ベクター。
  31. 以下の段階を含む、対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法：キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与する段階であって、ここで、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含み、それによって対象において抗腫瘍免疫を提供する、段階。
  32. 単離された核酸配列がCD3ζシグナル伝達ドメインの核酸配列をさらに含む、請求項31記載の方法。
  33. 共刺激ドメインが存在することでT細胞生存が増強される、請求項31記載の方法。
  34. 共刺激ドメインが存在することで対象における抗腫瘍免疫の有効性が増加する、請求項31記載の方法。
  35. 対象が哺乳動物である、請求項31記載の方法。
  36. 対象がヒトである、請求項31記載の方法。
  37. 以下の段階を含む、対象において細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法：キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与する段階であって、ここで、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含み、それによって対象においてT細胞媒介性免疫応答を刺激する、段階。
  38. 以下の段階を含む、対象において卵巣癌を治療するための方法：キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与する段階であって、ここで、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含み、それによって対象において卵巣癌を治療する、段階。
  39. 以下の段階を含む、対象において癌を治療するための方法：キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与する段階であって、ここで、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含み、それによって対象において癌を治療する、段階。
  40. 以下の段階を含む、卵巣癌と診断された対象において遺伝子操作T細胞の持続的集団を生成する方法：キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を含む遺伝子改変T細胞の有効量を対象に投与する段階であって、ここで、該単離された核酸配列が、FRα結合ドメインの核酸配列および4-1BB共刺激ドメインの核酸配列を含み、遺伝子操作T細胞の持続的集団が、対象において投与後少なくとも1ヵ月間持続する、段階。
  41. 遺伝子操作T細胞の持続的集団が、ヒトにおいて投与後少なくとも3ヵ月間持続する、請求項40記載の方法。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018516915A (ja) * 2015-05-28 2018-06-28 カイト ファーマ インコーポレイテッドＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
JP2018531618A (ja) * 2015-10-30 2018-11-01 チルドレンズ ナショナル メディカル センターＣｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ナイーブｔ細胞集団からのｈｐｖ抗原特異的ｔ細胞の生成
JP2018534327A (ja) * 2015-11-19 2018-11-22 ノバルティス アーゲー レンチウイルス調製物の安定化のための緩衝液
JP2020532954A (ja) * 2017-08-09 2020-11-19 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子操作された細胞の組成物および関連組成物を産生するための方法
JP2021507716A (ja) * 2017-12-22 2021-02-25 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド 融合タンパク質
JP2021531825A (ja) * 2018-07-09 2021-11-25 マルチチュード インコーポレーテッドMultitude Inc. 葉酸受容体アルファに特異的な抗体
JP2022504826A (ja) * 2018-10-10 2022-01-13 ザイムワークス，インコーポレイテッド ４－１ｂｂ及び腫瘍関連抗原に結合する抗体構築物ならびにその使用
US11779601B2 (en) 2015-05-28 2023-10-10 Kite Pharma, Inc. Diagnostic methods for T cell therapy

Families Citing this family (195)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9833480B2 (en) 2010-04-14 2017-12-05 Prospect Chartercare, Llc Methods and compositions for treating HIV
US10426740B1 (en) 2010-08-18 2019-10-01 Avm Biotechnology, Llc Compositions and methods to inhibit stem cell and progenitor cell binding to lymphoid tissue and for regenerating germinal centers in lymphatic tissues
WO2012099973A2 (en) * 2011-01-18 2012-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
EA201492222A1 (ru) 2012-05-25 2015-05-29 Селлектис Способы конструирования неаллореактивной и устойчивой к иммуносупрессии т-клетки для иммунотерапии
US9365641B2 (en) 2012-10-01 2016-06-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
WO2014055771A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
WO2014055657A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
US9597357B2 (en) 2012-10-10 2017-03-21 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
JO3529B1 (ar) * 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
WO2014127261A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptor and methods of use thereof
CN105358576B (zh) 2013-02-20 2020-05-05 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US10238690B2 (en) 2013-03-15 2019-03-26 Celgene Corporation Modified T lymphocytes comprising an inducible caspase and methods of apoptosis
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
FI3546572T3 (fi) * 2013-05-13 2024-05-06 Cellectis Cd19-spesifinen kimeerinen antigeenireseptori ja sen käyttötapoja
US11077144B2 (en) 2013-05-13 2021-08-03 Cellectis CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
JP2016530895A (ja) * 2013-09-23 2016-10-06 ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイションＷｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 動物細胞を遺伝子改変する改良された方法
CN103589742A (zh) * 2013-11-07 2014-02-19 申峰 嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白
CN116478927A (zh) 2013-12-19 2023-07-25 诺华股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
JP2017504601A (ja) * 2013-12-20 2017-02-09 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 免疫療法のためにマルチインプットシグナル感受性ｔ細胞を操作する方法
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
EP3097117B1 (en) * 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
CA3190002A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors and methods of making
GB201405845D0 (en) 2014-04-01 2014-05-14 Ucl Business Plc Signalling system
EP3129470B1 (en) * 2014-04-07 2021-04-07 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
JP6765968B2 (ja) * 2014-04-10 2020-10-07 シアトル チルドレンズ ホスピタル， ディービーエー シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート 薬物制御による導入遺伝子の発現
US20170158749A1 (en) * 2014-04-23 2017-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) and methods for making and using the same
US10774343B2 (en) 2014-04-25 2020-09-15 Bluebird Bio, Inc. MND promoter chimeric antigen receptors
CN107074929B (zh) * 2014-05-02 2021-09-03 宾夕法尼亚大学董事会 嵌合自身抗体受体t细胞的组合物和方法
JP6663359B2 (ja) 2014-06-06 2020-03-11 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド 改善されたｔ細胞組成物
AU2015292755B2 (en) 2014-07-21 2020-11-12 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
KR20170037625A (ko) 2014-07-21 2017-04-04 노파르티스 아게 Cll-1 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
TWI750110B (zh) 2014-07-21 2021-12-21 瑞士商諾華公司 使用人類化抗-ｂｃｍａ嵌合抗原受體治療癌症
AU2015292590B2 (en) 2014-07-24 2020-01-16 2Seventy Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors
CN107074973A (zh) * 2014-07-29 2017-08-18 辉瑞大药厂 用于癌症免疫疗法的EGFRvIII特异性嵌合抗原受体
HUE049218T2 (hu) 2014-08-19 2020-10-28 Novartis Ag Anti-CD123 kiméra antigénreceptor (CAR) rák kezelésében történõ alkalmazásra
US11111288B2 (en) 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
KR20230172625A (ko) * 2014-08-28 2023-12-22 바이오아트라, 인코퍼레이티드 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
CA2961636A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Boris ENGELS Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
KR20170068504A (ko) 2014-10-08 2017-06-19 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도
DK3215601T3 (da) * 2014-11-05 2020-06-15 Juno Therapeutics Inc Fremgangsmåder til transduktion og celleforarbejdning
LT3230321T (lt) 2014-12-12 2019-12-10 Bluebird Bio Inc Bcma chimeriniai antigeno receptoriai
EP3240803B1 (en) 2014-12-29 2021-11-24 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
EP3250602A1 (en) 2015-01-26 2017-12-06 Cellectis T cell receptor knock out engineered immune cells, endowed with chimeric antigen receptors binding to cd123 for the treatment of relapsed/refractory acute myeloid lymphoma or blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm
WO2016126608A1 (en) * 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
BR112017017884A2 (pt) 2015-02-24 2018-04-10 Univ California switches transcricionais desencadeados por ligação e métodos de uso dos mesmos
CA2984237A1 (en) 2015-03-27 2016-10-06 President And Fellows Of Harvard College Modified t cells and methods of making and using the same
PL3280729T3 (pl) 2015-04-08 2022-08-22 Novartis Ag Terapie cd20, terapie cd22 i terapie skojarzone komórką eksprymującą chimeryczny receptor antygenowy (car) cd19
CN108473957A (zh) 2015-04-17 2018-08-31 诺华股份有限公司 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
ES2973118T3 (es) * 2015-05-13 2024-06-18 Csl Behring Gene Therapy Inc Bio-producción de vectores lentivirales
CA2986254A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EP3322439A4 (en) * 2015-07-16 2019-03-20 Prospect Chartercare RWMC LLC D/B/A Roger Williams Medical Center COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PERITONEAL CANCERS
US10829735B2 (en) 2015-07-21 2020-11-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
CA2994829A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific car t-cells for solid tumor targeting
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
US11747346B2 (en) 2015-09-03 2023-09-05 Novartis Ag Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
IL305306A (en) 2015-10-20 2023-10-01 Us Health Methods of preparing T cells for T cell therapy
CN105331585A (zh) * 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
EP3377523A4 (en) * 2015-11-19 2019-06-19 The Regents of The University of California IMMUNITY CELL RECEIVERS REPRESSIBLE UNDER CONDITIONS AND METHODS OF USING THE SAME
US11400145B2 (en) 2015-11-27 2022-08-02 Cartherics Pty. Ltd. Genetically modified cells and uses thereof
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
JP7082055B2 (ja) 2015-12-22 2022-06-07 ノバルティス アーゲー 抗癌治療における組み合わせ使用のためのメソテリンキメラ抗原受容体（ｃａｒ）およびｐｄ－ｌ１阻害剤に対する抗体
CA3004491A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 The Regents Of The University Of California Conditionally active heterodimeric polypeptides and methods of use thereof
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
NZ746700A (en) 2016-04-01 2023-04-28 Kite Pharma Inc Bcma binding molecules and methods of use thereof
MX2018012017A (es) 2016-04-01 2019-07-04 Kite Pharma Inc Antigeno quimerico y receptores de celulas t y metodos de uso.
CA3019650C (en) 2016-04-01 2023-07-25 Kite Pharma, Inc. Chimeric receptors and methods of use thereof
EP3443001A4 (en) 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
WO2018018958A1 (en) 2016-04-22 2018-02-01 Carsgen Therapeutics Co., Ltd. Compositions and methods of cellular immunotherapy
KR20230044567A (ko) 2016-05-13 2023-04-04 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 ror2 항체, 항체 단편 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3032120A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3032498A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
JP6908710B2 (ja) 2016-09-21 2021-07-28 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ケモカイン受容体ｃｃｒ４を標的にするキメラ抗原受容体（ｃａｒ）およびその使用
SG10201913823VA (en) 2016-10-07 2020-03-30 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
CN109689686B (zh) 2016-10-07 2020-08-25 T细胞受体治疗公司 使用融合蛋白进行t细胞受体重编程的组合物和方法
ES2916335T3 (es) 2016-10-20 2022-06-30 Celgene Corp Receptores de antígeno quimérico heterodimerizable basados en cereblon
WO2018075978A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2018111763A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
CN106749681A (zh) * 2017-02-10 2017-05-31 河南大学淮河医院 靶向人FRα的基因工程化NKT细胞及其制备方法和应用
ES2900233T3 (es) 2017-02-14 2022-03-16 Kite Pharma Inc Moléculas que se unen a CD70 y métodos de uso de las mismas
EP3589295A4 (en) 2017-02-28 2020-11-04 Endocyte, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY
WO2018169922A2 (en) 2017-03-13 2018-09-20 Kite Pharma, Inc. Chimeric antigen receptors for melanoma and uses thereof
JP7386083B2 (ja) 2017-03-16 2023-11-24 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ８０バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
PL3596116T3 (pl) 2017-03-16 2024-05-13 Alpine Immune Sciences, Inc. Białka immunomodulujące wariant Pd-l1 i ich zastosowania
WO2018170023A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
BR112019018124A2 (pt) 2017-03-22 2020-04-07 Intellia Therapeutics Inc composições e métodos para imunooncologia
MX2019011656A (es) * 2017-03-27 2019-12-02 Hoffmann La Roche Formatos mejorados de receptor de union a antigeno.
MX2019011679A (es) 2017-04-01 2019-11-01 Avm Biotechnology Llc Reemplazo de un pre-acondicionamiento citotoxico antes de una inmunoterapia celular.
AR111360A1 (es) 2017-04-03 2019-07-03 Kite Pharma Inc Tratamiento usando células t de receptor quimérico incorporando células t polifuncionales optimizadas
US11344578B2 (en) 2017-04-19 2022-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Immune cells expressing engineered antigen receptors
JOP20180042A1 (ar) 2017-04-24 2019-01-30 Kite Pharma Inc نطاقات ربط مولد ضد متوافقة مع البشر وطرق الاستخدام
JP7129426B2 (ja) * 2017-05-12 2022-09-01 ザ ジャクソン ラボラトリー Ｍｈｃクラスｉおよびｍｈｃクラスｉｉを欠損しているｎｓｇマウス
CA3067914A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Cellectis Cellular immunotherapy for repetitive administration
KR102521245B1 (ko) * 2017-09-15 2023-04-17 카이트 파마 인코포레이티드 관리 연속성 및 신원 연속성 생물학적 샘플 추적으로 환자-특이적 면역요법 절차를 수행하기 위한 방법 및 시스템
CA3076337A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Massachusetts Institute Of Technology Compositions for chimeric antigen receptor t cell therapy and uses thereof
SG11202002533QA (en) 2017-09-22 2020-04-29 Kite Pharma Inc Chimeric polypeptides and uses thereof
KR20200074137A (ko) 2017-10-10 2020-06-24 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
US11712026B2 (en) 2017-10-18 2023-08-01 The Jackson Laboratory Murine-MHC-deficient HLA-transgenic nod-mouse models for T1D therapy development
CN111629749A (zh) 2017-10-18 2020-09-04 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质降解的组合物和方法
CA3078517A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
US20190151361A1 (en) 2017-10-18 2019-05-23 Kite Pharma, Inc. Methods of administering chimeric antigen receptor immunotherapy
WO2019094482A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting tumor antigens
WO2019099707A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Kite Pharma, Inc Modified chimeric antigen receptors and methods of use
CA3087481A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Pfizer Inc. Methods of administering chimeric antigen receptor immunotherapy in combination with 4-1bb agonist
JP2021512147A (ja) 2018-01-22 2021-05-13 エンドサイト・インコーポレイテッドＥｎｄｏｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． Ｃａｒ ｔ細胞の使用方法
SG11202007513PA (en) 2018-02-16 2020-09-29 Kite Pharma Inc Modified pluripotent stem cells and methods of making and use
CA3093078A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Prostate-specific membrane antigen cars and methods of use thereof
KR20200132900A (ko) 2018-03-13 2020-11-25 페인스 테라퓨틱스 인코포레이티드 항-폴레이트 수용체 1 항체 및 이의 용도
DE102018108612A1 (de) 2018-03-21 2019-09-26 Immatics US, Inc. Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen
IL310416A (en) 2018-04-12 2024-03-01 Kite Pharma Inc Chimeric T cell receptor therapy using tumor microenvironmental characteristics
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
TW202003021A (zh) 2018-06-01 2020-01-16 美商凱特製藥公司 嵌合抗原受體t細胞療法
MX2020013239A (es) 2018-06-05 2021-02-22 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos de celulas del receptor de autoanticuerpos quimericos de quinasa especifica del musculo.
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US20210269501A1 (en) * 2018-06-25 2021-09-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of nkg2d chimeric antigen receptor t cells for controlling triple-negative breast cancer
KR20210038922A (ko) 2018-08-02 2021-04-08 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 수용체 요법 t 세포 확장 동역학 및 그의 용도
CN110819703A (zh) * 2018-08-07 2020-02-21 上海恒润达生生物科技有限公司 一种评估cart细胞安全性的方法
US20220348682A1 (en) 2018-08-30 2022-11-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
US11866494B2 (en) * 2018-08-31 2024-01-09 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. CAR T therapy through uses of co-stimulation
SG11202102644XA (en) 2018-09-19 2021-04-29 Alpine Immune Sciences Inc Methods and uses of variant cd80 fusion proteins and related constructs
WO2020068261A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Collagen-localized immunomodulatory molecules and methods thereof
EP3488851A1 (en) 2018-10-03 2019-05-29 AVM Biotechnology, LLC Immunoablative therapies
CN111197032A (zh) * 2018-11-16 2020-05-26 上海斯丹赛生物技术有限公司 嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
WO2020106843A1 (en) * 2018-11-20 2020-05-28 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
WO2020113098A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 Vineti Inc. Centralized and decentralized individualized medicine platform
WO2020123716A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Obsidian Therapeutics, Inc. Membrane bound il12 compositions and methods for tunable regulation
WO2020123691A2 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Kite Pharma, Inc Chimeric antigen and t cell receptors and methods of use
CN109796535B (zh) * 2019-01-30 2022-11-15 重庆福美干细胞生物科技发展有限公司 靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体及其在制备预防或治疗恶性肿瘤药物中的用途
US11321652B1 (en) 2019-02-20 2022-05-03 Vineti Inc. Smart label devices, systems, and methods
CA3132840A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
JP2022527297A (ja) * 2019-03-27 2022-06-01 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｔｎ－ＭＵＣ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法
TW202108150A (zh) 2019-05-03 2021-03-01 美商凱特製藥公司 投與嵌合抗原受體免疫療法之方法
EP3969587A4 (en) * 2019-05-13 2023-02-15 The Trustees of The University of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS OF CHIMERIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR-AUTOANTIBODY RECEPTOR CELLS
US20220251538A1 (en) 2019-05-23 2022-08-11 Matjaz Vogelsang Method for removal of nucleic acids impurities from liquid composition comprising genetically engineered particles or proteins
MX2021015097A (es) 2019-06-12 2022-04-01 Obsidian Therapeutics Inc Composiciones de ca2 y metodos para regulación ajustable.
EP3983537A1 (en) 2019-06-12 2022-04-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
WO2020257823A2 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Kite Pharma, Inc. TGF-β RECEPTORS AND METHODS OF USE
US11642409B2 (en) 2019-06-26 2023-05-09 Massachusetts Insttute of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
GB201909573D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 Cancer Research Tech Ltd Modulation of T cell cytotoxicity and related therapy
US20210062150A1 (en) 2019-09-03 2021-03-04 Allogene Therapeutics, Inc. Methods of preparing t cells for t cell therapy
WO2021061648A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for stimulation of endogenous t cell responses
WO2021072312A1 (en) * 2019-10-11 2021-04-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting cd13 and tim-3 with car t cells to treat acute myeloid leukemia
TW202134285A (zh) 2019-11-26 2021-09-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
JP2023507432A (ja) 2019-12-20 2023-02-22 インスティル バイオ （ユーケイ） リミテッド 腫瘍浸潤リンパ球を単離するためのデバイスおよび方法ならびにそれらの使用
EP4118112A1 (en) 2020-03-10 2023-01-18 Massachusetts Institute of Technology Compositions and methods for immunotherapy of npm1c-positive cancer
BR112022018105A2 (pt) 2020-03-10 2022-11-22 Massachusetts Inst Technology Métodos para gerar células nk tipo-memória modificadas e composições das mesmas
GB202005599D0 (en) 2020-04-17 2020-06-03 Univ London Modulation of t cell cytotoxicity and related therapy
GB202006254D0 (en) 2020-04-28 2020-06-10 Institute Of Cancer Res Anti-cancer vaccines and related therapy
US20210340524A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
US20210338833A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
US20230293530A1 (en) 2020-06-24 2023-09-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Agents for sensitizing solid tumors to treatment
WO2022036041A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Kite Pharma, Inc Improving immune cell function
US20230304098A1 (en) * 2020-08-18 2023-09-28 Delfi Diagnostics, Inc. Methods and systems for cell-free dna fragment size densities to assess cancer
EP4204545A2 (en) 2020-08-25 2023-07-05 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
AU2021401052A1 (en) 2020-12-18 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
US20220204930A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Kite Pharma, Inc. Prostate cancer chimeric antigen receptors
JP2024502599A (ja) 2021-01-10 2024-01-22 カイト ファーマ インコーポレイテッド Ｔ細胞療法
JP2024507199A (ja) 2021-02-20 2024-02-16 カイト ファーマ インコーポレイテッド 免疫療法を選択するための遺伝子マーカー
JP2024510162A (ja) 2021-03-11 2024-03-06 カイト ファーマ インコーポレイテッド 免疫細胞機能の改善
CN112794911B (zh) * 2021-04-14 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用
WO2022221028A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Kite Pharma, Inc. Taci/bcma dual binding molecules
CN117203328A (zh) 2021-04-27 2023-12-08 武田药品工业株式会社 重组抗原呈递细胞
AU2022274608A1 (en) 2021-05-14 2023-11-09 Kite Pharma, Inc. Chimeric antigen receptor t cell therapy
CN117677633A (zh) 2021-05-24 2024-03-08 凯德药业股份有限公司 基于nkg2d的嵌合抗原受体
CA3218590A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Providence Health & Services - Oregon Cxcr5, pd-1, and icos expressing tumor reactive cd4 t cells and their use
AU2022291365A1 (en) 2021-06-08 2024-01-18 Kite Pharma, Inc. Gpc3 binding molecules
TW202306997A (zh) 2021-06-16 2023-02-16 英商英斯特生物科技有限公司 用於在過繼細胞療法中提供標靶共刺激之受體
EP4363558A1 (en) 2021-07-01 2024-05-08 Kite Pharma, Inc. Closed-system and method for autologous and allogeneic cell therapy manufacturing
EP4364151A1 (en) 2021-07-02 2024-05-08 Kite Pharma, Inc. A method for identifying variants in gene products from gene constructs used in cell therapy applications
EP4370213A1 (en) 2021-07-16 2024-05-22 Instil Bio (Uk) Limited Chimeric molecules providing targeted costimulation for adoptive cell therapy
US11615874B1 (en) 2021-09-30 2023-03-28 Vineti Inc. Personalized medicine and therapies platform
WO2023081715A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
WO2023129929A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Tr1X, Inc. Cd4+ t cells expressing il-10 and chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2023137472A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023137471A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
WO2023159001A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 Kite Pharma, Inc. Predicting adverse events from immunotherapy
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
US20230399614A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Kite Pharma, Inc. Methods of preparing lymphocytes for cell therapy
WO2024033879A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Hypoimmunogenic modified cells
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024092152A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Kite Pharma, Inc. Improving efficacy and durable response of immunotherapy
US20240158869A1 (en) 2022-10-28 2024-05-16 Kite Pharma, Inc. Factors for optimizing immunotherapy

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040043401A1 (en) * 2002-05-28 2004-03-04 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Chimeric T cell receotors
JP2004511246A (ja) * 2000-10-16 2004-04-15 セルテック　アール　アンド　ディ　リミテッド Ｃｄ１３７由来キメラ細胞質シグナリング分子
US20050113564A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
JP2007537709A (ja) * 2003-05-23 2007-12-27 モーフオテク・インコーポレーテツド 腫瘍抗原を特異的に結合するモノクローナル抗体
JP2008500025A (ja) * 2004-02-12 2008-01-10 モルフォテック、インク． 腫瘍抗原の生物活性を特異的に阻止するモノクローナル抗体
JP2009521206A (ja) * 2005-04-22 2009-06-04 モルフォテック、インク． 免疫エフェクター活性を有する葉酸受容体アルファ陽性細胞に内部移行する抗体
WO2010025177A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 City Of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US20060002904A9 (en) 1988-11-07 2006-01-05 Kwon Byoung S Receptor and related products and methods
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
US20060063923A1 (en) 1992-07-30 2006-03-23 Kwon Byoung S 4-1BB peptides and methods for use
US5580849A (en) 1992-09-01 1996-12-03 The Procter & Gamble Company Liquid or gel detergent compositions containing calcium and stabilizing agent thereof
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5326193A (en) 1993-02-25 1994-07-05 Peterson Daryl L Interlocking retaining wall apparatus
CA2429027C (en) 1993-09-16 2011-04-05 Indiana University Foundation Antibodies against human receptor h4-1bb
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
DE19946142A1 (de) * 1999-09-27 2001-03-29 Bundesrepublik Deutschland Let Gentransfer in humane Lymphocyten mittels retroviraler scFv-Zelltargeting Vektoren
JP2003516124A (ja) 1999-10-15 2003-05-13 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 標的とした遺伝的干渉の手段としてのｒｎａ干渉経路遺伝子
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
ATE373078T1 (de) 2000-02-24 2007-09-15 Xcyte Therapies Inc Gleichzeitige stimulation und konzentration von zellen
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
KR101155294B1 (ko) * 2000-06-16 2013-03-07 캠브리지 안티바디 테크놀로지 리미티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
US7723111B2 (en) 2001-03-09 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use
DK1410011T3 (da) * 2001-06-18 2011-07-18 Netherlands Cancer Inst Diagnose og prognose for brystcancerpatienter
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
JP4943144B2 (ja) 2004-04-26 2012-05-30 松山 隆美 葉酸リセプターベータ（ＦＲ−β）に対する単クローン抗体を含有する治療薬
AU2005250408B2 (en) 2004-05-27 2010-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
US20090297530A1 (en) * 2006-05-22 2009-12-03 Feng Wang-Johanning Herv-k antigens, antibodies, and methods
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
WO2008045437A2 (en) * 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
EP2248889A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-10 Sanofi-Aventis Reversibly immortalized cells as well as methods relating hetero
WO2012099973A2 (en) * 2011-01-18 2012-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004511246A (ja) * 2000-10-16 2004-04-15 セルテック　アール　アンド　ディ　リミテッド Ｃｄ１３７由来キメラ細胞質シグナリング分子
US20040043401A1 (en) * 2002-05-28 2004-03-04 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Chimeric T cell receotors
JP2007537709A (ja) * 2003-05-23 2007-12-27 モーフオテク・インコーポレーテツド 腫瘍抗原を特異的に結合するモノクローナル抗体
US20050113564A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
JP2008500025A (ja) * 2004-02-12 2008-01-10 モルフォテック、インク． 腫瘍抗原の生物活性を特異的に阻止するモノクローナル抗体
JP2009521206A (ja) * 2005-04-22 2009-06-04 モルフォテック、インク． 免疫エフェクター活性を有する葉酸受容体アルファ陽性細胞に内部移行する抗体
WO2010025177A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-04 City Of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
JP2012501180A (ja) * 2008-08-26 2012-01-19 シティ・オブ・ホープ Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター機能増進のための方法および組成物

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANCER RES., vol. 71, no. 13, JPN6015050021, July 2011 (2011-07-01), pages 4617 - 27, ISSN: 0003216423 *
CLIN CANCER RES., vol. vol.12, no.20 Pt1, JPN6015050018, 2006, pages 6106 - 15, ISSN: 0003216420 *
HUM GENE THER., vol. 20, no. 11, JPN6015050019, 2009, pages 1229 - 39, ISSN: 0003216421 *
J. EXP. MED., vol. 178, no. 1, JPN6015050017, 1993, pages 361 - 6, ISSN: 0003216419 *
MOL. THER., vol. 17, no. 8, JPN6015050020, 2009, pages 1453 - 64, ISSN: 0003216422 *
SONG D. ET AL., J. IMMUNOTHER., vol. 33, no. 8, JPN6015050016, 2010, pages 865, ISSN: 0003216418 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7197979B2 (ja) 2015-05-28 2022-12-28 カイト ファーマ インコーポレイテッド Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
JP2018516915A (ja) * 2015-05-28 2018-06-28 カイト ファーマ インコーポレイテッドＫｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
US11779601B2 (en) 2015-05-28 2023-10-10 Kite Pharma, Inc. Diagnostic methods for T cell therapy
JP2021165291A (ja) * 2015-05-28 2021-10-14 カイト ファーマ インコーポレイテッドKite Pharma, Inc Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
JP7238030B2 (ja) 2015-05-28 2023-03-13 カイト ファーマ インコーポレイテッド Ｔ細胞療法のために患者をコンディショニングする方法
US11491187B2 (en) 2015-05-28 2022-11-08 Kite Pharma, Inc. Methods of conditioning patients for T cell therapy
JP2018531618A (ja) * 2015-10-30 2018-11-01 チルドレンズ ナショナル メディカル センターＣｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ナイーブｔ細胞集団からのｈｐｖ抗原特異的ｔ細胞の生成
JP7092662B2 (ja) 2015-10-30 2022-06-28 チルドレンズ ナショナル メディカル センター ナイーブｔ細胞集団からのｈｐｖ抗原特異的ｔ細胞の生成
JP2018534327A (ja) * 2015-11-19 2018-11-22 ノバルティス アーゲー レンチウイルス調製物の安定化のための緩衝液
JP7221049B2 (ja) 2015-11-19 2023-02-13 ノバルティス アーゲー レンチウイルス調製物の安定化のための緩衝液
JP2020532954A (ja) * 2017-08-09 2020-11-19 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子操作された細胞の組成物および関連組成物を産生するための方法
JP7275104B2 (ja) 2017-08-09 2023-05-17 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子操作された細胞の組成物および関連組成物を産生するための方法
JP2021507716A (ja) * 2017-12-22 2021-02-25 キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド 融合タンパク質
JP2021531825A (ja) * 2018-07-09 2021-11-25 マルチチュード インコーポレーテッドMultitude Inc. 葉酸受容体アルファに特異的な抗体
JP2022504826A (ja) * 2018-10-10 2022-01-13 ザイムワークス，インコーポレイテッド ４－１ｂｂ及び腫瘍関連抗原に結合する抗体構築物ならびにその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2665521A4 (en) 2014-09-03
SG192010A1 (en) 2013-08-30
CA2824997A1 (en) 2012-07-26
MX2013008376A (es) 2013-08-12
CN103442768A (zh) 2013-12-11
CA2824997C (en) 2023-01-17
CA3179835A1 (en) 2012-07-26
WO2012099973A3 (en) 2012-09-27
AU2012207356A1 (en) 2013-08-01
US20220324963A1 (en) 2022-10-13
US10457729B2 (en) 2019-10-29
EP2665521A2 (en) 2013-11-27
US20140050708A1 (en) 2014-02-20
US9402865B2 (en) 2016-08-02
BR112013018311A2 (pt) 2017-03-21
US20170002072A1 (en) 2017-01-05
EA201391059A1 (ru) 2014-05-30
IL227429A0 (en) 2013-09-30
US20200270341A1 (en) 2020-08-27
KR20140004174A (ko) 2014-01-10
US11180550B2 (en) 2021-11-23
WO2012099973A2 (en) 2012-07-26

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