CN117203328A

CN117203328A - 重组抗原呈递细胞

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Publication number: CN117203328A
Application number: CN202280031104.1A
Authority: CN
Inventors: N·索柏汉娜; A·博顿; G·贝尼泽; S·巴德卡; R·米什拉; 张慧欣; W·李; M·索尼; 曹澜; 石玺; J·叶; 罗梦瑶; M·古普塔; 中村鉴斗; D·麦; M·R·吴
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-12-08
Also published as: TW202309269A; JP2024515815A; EP4330377A2; AR125461A1; WO2022229884A3; US20240216426A1; WO2022229884A2

Abstract

本公开提供重组抗原呈递细胞及其在离体培养和扩增免疫细胞中的使用方法。在一些方面，将经由本文所公开的重组抗原呈递细胞的共培养扩增的免疫细胞施用于受试者以治疗所述受试者的疾病或疾患，例如治疗癌症。

Description

重组抗原呈递细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年4月27日提交的美国临时申请第63/180,530号的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。

对经由EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用

本申请中提交的以电子方式提交的序列表(名称：3817_085PC01_Seqlisting_ST25.txt，大小：11,031个字节；和创建日期：2022年4月26日)的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及抗原呈递细胞及其在免疫细胞离体培养和扩增中的用途。

背景技术

基于细胞的免疫疗法是一个快速发展的研究领域，用于开发治疗各种疾病(包括癌症)的新颖和改进的方法。为免疫疗法分离和扩增免疫细胞需要用各种因子补充细胞以提高其存活、扩增和最终功效。抗原呈递细胞经常用作将这些因子递送至离体培养的免疫细胞的媒介物。然而，从受试者分离的免疫细胞群体由多种细胞类型组成，包括α/βT细胞、γ/δT细胞、NK细胞和B细胞。某些类型的免疫细胞，例如γ/δT细胞和NK细胞，占总免疫细胞群体的一小部分，因此难以达到适合于基于细胞的免疫疗法的细胞数目。

因此，本领域仍需要扩增免疫细胞群体的方法，并且特别是，扩增占总细胞群体的一小部分的细胞，特别是例如NK细胞和γ/δT细胞的方法。

发明内容

本公开部分地提供了重组抗原呈递细胞，其可用于分离和/或扩增适合于基于细胞的免疫疗法的免疫细胞，特别是，占总细胞群体的一小部分的免疫细胞。本公开的一些方面涉及一种重组抗原呈递细胞(RAPC)，其包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，所述RAPC还包含(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述RAPC还包含(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，所述RAPC表达(i)IL-21和(ii)OX40L。在一些方面，所述RAPC表达(iii)4-1BBL。在一些方面，所述RAPC表达(iv)IL-15。

在一些方面，所述IL-21为包含人类IL-21多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。在一些方面，所述IL-21包含(i)人类IL-21多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区和(iv)跨膜域。在一些方面，所述IL-15为包含人类IL-15多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。在一些方面，所述IL-15包含(i)人类IL-15多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区和(iv)跨膜域。在一些方面，所述Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。在一些方面，所述Fc区为IgG4 Fc区。在一些方面，所述铰链区包含免疫球蛋白铰链区或经修饰的免疫球蛋白铰链区。在一些方面，所述铰链区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或CD8铰链区。在一些方面，所述跨膜域包含CD4或CD8跨膜域。

在一些方面，所述RAPC包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物(包括但不限于例如珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物)或其任何组合。在一些方面，所述RAPC为K562细胞。在一些方面，所述RAPC为经基因修饰的K562细胞。

本公开的一些方面涉及包含本文所公开的RAPC的RAPC群体。

本公开的一些方面涉及包含第一RAPC和第二RAPC的RAPC群体，其中：(a)所述第一RAPC和所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子和一种或多种编码OX40L的核酸分子；或(b)所述第一RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子，并且其中所述第二RAPC表达一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC、所述第二RAPC或两者还包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC、所述第二RAPC或两者还包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，RAPC群体还包含第三RAPC。在一些方面，所述第三RAPC包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述第三RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，所述RAPC群体还包含第四RAPC。在一些方面，所述第四RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。

在一些方面，所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物(包括但不限于例如珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物)或其任何组合。在一些方面，所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合为K562细胞。在一些方面，所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合为经基因修饰的K562细胞。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与本文所公开的RAPC或本文所公开的RAPC群体接触。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与RAPC接触，其中所述RAPC表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。

在一些方面，所述免疫细胞包含αβT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、泛γδT细胞、Vδ1γδT细胞、Vδ2γδT细胞、Vδ3γδT细胞或其任何组合。在一些方面，T细胞选自由以下组成的组：幼稚T细胞、干细胞记忆T细胞(Tscm)、中枢记忆T细胞(Tcm)、效应T细胞、效应记忆T细胞(Tem)、细胞毒性T细胞、辅助T细胞和其任何组合。

在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种经基因修饰的免疫细胞。在一些方面，所述经基因修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)或其组合。在一些方面，所述CAR或所述TCR能够结合肿瘤细胞上存在的一种或多种抗原。在一些方面，所述CAR或所述TCR能够结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原、突变型p53、突变型ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3组合、HER1-HER2组合、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)和其任何组合。

在一些方面，对免疫细胞群体进行扩增，直至免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹²、至少约1×10⁹至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁹至至少约1×10¹¹、至少约1×10¹⁰至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁷至至少约1×10¹⁰、至少约1×10⁸至至少约1×10¹⁰或至少约1×10⁹至至少约1×10¹⁰个免疫细胞。在一些方面，对免疫细胞群体进行扩增，直至免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷、至少约5×10⁷、至少约1×10⁸、至少约5×10⁸、至少约1×10⁹、至少约2×10⁹、至少约3×10⁹、至少约4×10⁹、至少约5×10⁹、至少约6×10⁹、至少约7×10⁹、至少约8×10⁹、至少约9×10⁹、至少约1×10¹⁰、至少约2×10¹⁰、至少约3×10¹⁰、至少约4×10¹⁰、至少约5×10¹⁰、至少约6×10¹⁰、至少约7×10¹⁰、至少约8×10¹⁰、至少约9×10¹⁰、至少约1×10¹¹、至少约2×10¹¹、至少约3×10¹¹、至少约4×10¹¹、至少约5×10¹¹、至少约6×10¹¹、至少约7×10¹¹、至少约8×10¹¹、至少约9×10¹¹或至少约1×10¹²个免疫细胞。

在一些方面，所述免疫细胞群体是从供体受试者获得。在一些方面，所述供体受试者为人类。在一些方面，所述供体受试者患有癌症。

在一些方面，所述方法还包括例如通过使用阳性或阴性选择或任何其他适用于获得基本上纯的经扩增的免疫细胞群体的手段来纯化经扩增的免疫细胞群体，所述细胞随后可用于细胞疗法。在一些方面，所述经扩增的免疫细胞群体包含以下细胞群体：α/βT细胞、γ/δT细胞、NK细胞或其组合。

在一些方面，所述方法还包括向有需要的受试者施用经扩增的免疫细胞群体。

本公开的一些方面涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括(i)通过使免疫细胞群体与本文所公开的RAPC或本文所公开的RAPC群体接触来离体扩增所述免疫细胞群体；(ii)纯化经扩增的免疫细胞群体；以及(iii)向所述受试者施用经纯化的免疫细胞群体。

在一些方面，所述受试者患有癌症。在一些方面，所述癌症包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)或其任何组合。在一些方面，所述癌症包括淋巴瘤或白血病。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与白细胞介素-21(IL-21)和OX40L接触。在一些方面，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与本文所公开的抗原呈递细胞(APC)接触。本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与APC、IL-21和OX40L接触。在一些方面，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与4-1BB配体(4-1BBL)接触。在一些方面，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与白细胞介素-15(IL-15)接触。

在一些方面，所述APC表达IL-21、OX40L、4-1BBL、IL-15或其任何组合。在一些方面，所述APC表达IL-21。在一些方面，所述APC表达OX40L。在一些方面，所述APC表达4-1BBL。在一些方面，所述APC表达IL-15。在一些方面，所述APC表达IL-21和OX40L，其中将免疫细胞群体在培养基中培养并且其中所述培养基包含4-1BBL和IL-15。在一些方面，所述APC表达IL-21、OX40L和4-1BBL，其中将免疫细胞群体在培养基中培养并且其中所述培养基包含IL-15。在一些方面，所述APC表达IL-21、OX40L和IL-15，其中将免疫细胞群体在培养基中培养并且其中所述培养基包含4-1BBL。

在一些方面，所述APC包含重组APC(RAPC)。在一些方面，所述RAPC包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物(包括但不限于例如珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物)或其任何组合。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与IL-21和第一APC接触，其中所述第一APC表达OX40L。在一些方面，将所述免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含IL-21。在一些方面，所述IL-21与固体支撑物，例如珠粒结合。在一些方面，所述IL-21由第二APC表达。在一些方面，所述第一RAPC与所述第二APC不同。在一些方面，所述第一APC与所述第二APC相同。

在一些方面，所述方法还包括使免疫细胞群体与OX40L接触。在一些方面，将所述免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含OX40L。在一些方面，所述OX40L与固体支撑物，例如珠粒结合。在一些方面，所述OX40L由第三APC表达。在一些方面，所述第三APC不同于第一APC和第二APC。在一些方面，所述第三APC与第一APC相同，其中所述第三APC与第二APC相同，或其中所述第三APC与第一APC和第二APC相同。

在一些方面，所述方法还包括使免疫细胞群体与IL-15接触。在一些方面，将所述免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含IL-15。在一些方面，所述IL-15与固体支撑物，例如珠粒结合。在一些方面，所述IL-15由第四APC表达。在一些方面，所述第四APC不同于第一APC、第二APC和第三APC。在一些方面，所述第四APC与第一APC相同；其中所述第四APC与第二APC相同；其中所述第四APC与第三APC相同；其中所述第四APC与第一APC和第二APC相同；其中所述第四APC与第二APC和第三APC相同；其中所述第四APC与第一APC和第三APC相同；或其中所述第四APC与第一APC、第二APC和第三APC相同。在一些方面，所述第一APC、所述第二APC、所述第三APC或所述第四APC中的一者或多者包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物(包括但不限于例如珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物)或其任何组合。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与APC接触，其中所述APC表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。在一些方面，所述APC为RAPC。在一些方面，所述RAPC包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物(包括但不限于例如珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物)或其任何组合。

在一些方面，对所述免疫细胞群体进行扩增，直至所述免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹²、至少约1×10⁹至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁹至至少约1×10¹¹、至少约1×10¹⁰至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁷至至少约1×10¹⁰、至少约1×10⁸至至少约1×10¹⁰或至少约1×10⁹至至少约1×10¹⁰个免疫细胞。在一些方面，对所述免疫细胞群体进行扩增，直至所述免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷、至少约5×10⁷、至少约1×10⁸、至少约5×10⁸、至少约1×10⁹、至少约2×10⁹、至少约3×10⁹、至少约4×10⁹、至少约5×10⁹、至少约6×10⁹、至少约7×10⁹、至少约8×10⁹、至少约9×10⁹、至少约1×10¹⁰、至少约2×10¹⁰、至少约3×10¹⁰、至少约4×10¹⁰、至少约5×10¹⁰、至少约6×10¹⁰、至少约7×10¹⁰、至少约8×10¹⁰、至少约9×10¹⁰、至少约1×10¹¹、至少约2×10¹¹、至少约3×10¹¹、至少约4×10¹¹、至少约5×10¹¹、至少约6×10¹¹、至少约7×10¹¹、至少约8×10¹¹、至少约9×10¹¹或至少约1×10¹²个免疫细胞。

在一些方面，所述免疫细胞群体是从供体受试者获得。在一些方面，所述供体受试者为人类。在一些方面，所述供体受试者患有癌症。在一些方面，所述方法还包括向有需要的受试者施用免疫细胞群体。

附图说明

图1A-1D是用于产生慢病毒的构建体设计的示意图，所述慢病毒包含编码4-1BBL(图1A)、OX40L(图1B)、IL-15-CD8融合蛋白(图1C)和IL-21-CD8融合蛋白(图1D)的转基因。图1E是用于产生重组APC的工艺的流程图描述。

图2A-2B是显示RAPC2与RAPC4共温育对脐带血(CB)和外周血(PB)来源的NK细胞的细胞扩增、表型和针对Nalm6和Raji肿瘤细胞的细胞毒性的影响的条形图。NK细胞经由将免疫磁珠与脐带血或白细胞单采术收集物分离来阴性选择，并且在IL-2(Prometheus)存在下，与经丝裂霉素C预处理的RAPC2或RAPC4细胞在含有10％FBS(Corning)的RPMI(Gibco)中共温育。每两天用补充有IL-2的半体积培养基更换物对细胞培养物进行更新。将细胞在G-Rex 6M孔板(Wilson Wolf)中培养4周。在每一轮活化期间，通过NC-200(ChemoMetec)监测细胞生长和生存力。图2A提供了在培养第28天通过流式细胞术分析的NK细胞的细胞表面表型(CD3-CD56+)比较。图2B显示了与Nalm6或Raji肿瘤细胞共温育24小时的CB-NK或PB-NK细胞在多个E:T比率(从5:1起始至0.15:1)下的死亡靶细胞的总百分比。

图3显示了通过与RAPC2和RAPC4饲养细胞共温育的脐带血(CB)和外周血(PB)来源的γ/δT(gdT)细胞的细胞毒性。gdT细胞经由将免疫磁珠与脐带血或白细胞单采术收集物分离来进行阳性选择。在IL-2(Peprotech)和IL-21(Peprotech)存在下，将细胞与经丝裂霉素C预处理的RAPC2或RAPC4饲养细胞在含有10％ FBS(Corning)的RPMI(Gibco)中共温育。每两天用补充有IL-2和IL-21的半体积培养基更换物来对细胞培养物进行更新。将细胞在G-Rex 6M孔板(Wilson Wolf)中培养4周。在每一轮7天活化期间，通过NC-200(ChemoMetec)监测细胞生长和生存力。由RAPC4扩增的CB-gdT显示出对多种肿瘤细胞系的内在溶细胞能力。将CB-gdT细胞与肿瘤细胞以不同的E:T比率(从10:1起始至0.3:1)共温育24小时。

图4为RAPC1和RAPC4饲养细胞系对人类NK细胞的细胞扩增的影响的图示。将RAPC1和RAPC4细胞与NK细胞在含有15％ FBS(Gibco)的IMDM(Gibco)中共温育之前立即进行X射线照射(100Gy)。用IL-2、IL-7和IL-15补充RAPC1共培养物；用IL-2和IL-7补充RAPC4共培养物。将饲养细胞以2:1(饲养细胞:NK)的比率添加，活化三天，接着在G-Rex 24孔板中扩增四天，第5天更换60％的培养基并且补充细胞因子。每7天重复一次活化。在每一轮7天活化期间，通过NC-200(ChemoMetec)监测细胞生长和生存力。

图5为说明与RAPC4共培养7天和11天后NK细胞表面标志物表达的条形图。将RAPC4细胞与NK细胞在含有15％ FBS(Gibco)的补充有IL-2和IL-7的IMDM(Gibco)中共温育之前立即进行X射线照射(100Gy)。将饲养细胞以2:1(饲养细胞:NK)的比率添加，活化三天，接着将培养物转移至G-Rex 24孔板中扩增四天，第5天更换60％的培养基并且补充细胞因子。在培养7天和11天后收获NK细胞，并且通过流式细胞术分析CD3、CD56、CD30、CD16、CD94、NKG2D和NKp46的表面表达。数值代表对相应标志物呈阳性染色的所有活细胞的百分比。

图6A-6E是说明RAPC4活化的NK细胞扩增和肿瘤细胞杀伤的线图。将RAPC4细胞经X射线照射(100Gy)，之后立即与NK细胞以2:1的比率共温育。随后将用经照射的RAPC4活化的NK细胞用7种不同的CAR慢病毒载体转导或不转导(UTD)，以检查转导后的扩增。在第二轮活化的第6天，收获NK细胞并与四种肿瘤细胞系(Capan2(图6A)、GSU(图6B)、HCT116(图6C)和RAJI(图6E)(ATCC))和一种正常内皮细胞系对照(HUVEC；图6D)以3:1、1:1、0.3:1和0.1:1的E:T比率一起温育。在共培养之后24小时，使用Cell Titer Glo测定(Promega)评价细胞溶解百分比。

具体实施方式

本公开的一些方面涉及重组抗原呈递细胞(RAPC)。在一些方面，所述RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，所述RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，所述RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，和(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子。

本公开的其他方面涉及离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使免疫细胞群体与本文所公开的RAPC或其群体接触。在一些方面，所述免疫细胞包含αβT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、泛γδT细胞、Vδ1γδT细胞、Vδ2γδT细胞、Vδ3γδT细胞或其任何组合。在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种经基因修饰的免疫细胞。在一些方面，所述经基因修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)或其组合。

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定组合物或工艺步骤，因而本公开当然可变化。对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易知，本文所描述和说明的个别方面的每一者都具有分立的组分和特征，在不偏离本公开的范围或精神的情况下，这些组分和特征可容易地与任何其他若干方面的特征分离或组合。任何所叙述的方法可按照叙述事件的次序或在逻辑上可行的任何其他次序进行。

本文所提供的标题并不限制本公开的各种方面，所述方面可通过参考整个说明书定义。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且不旨在具限制性。

I.术语

为使本公开可更容易地理解，首先定义某些术语。如本申请中所用，除了如本文另外明确提供以外，以下术语中的每一者应具有下文所阐述的含义。在整个申请书中阐述了额外定义。

除非另外指示，否则如本文所描述的任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围均应理解为包括在所叙述的范围内的任何整数的值并且当适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。

在本公开通篇，术语“一个(a/an)”实体是指一个或多个所述实体；例如，“一个嵌合多肽”应理解为表示一个或多个嵌合多肽。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换地使用。

此外，“和/或”在本文中使用时应视为对两个指定特征或组分中的每一者在存在或不存在另一者的情况下的具体公开。因此，如在本文于短语例如“A和/或B”中所用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)以及“B”(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。另外，使用“或”意指列表中组分的开放列表。例如，“其中X包含A或B”意指X包含A、X包含B、X包含A和B，或者X包含A或B以及任何其他组分。

术语“约”或“基本上包含”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域中的实践在1个或超过1个标准偏差内。或者，“约”或“基本上包含”可意指至多10％的范围。此外，特别是对于生物系统或工艺，所述术语可意指至多一个量级或值的至多5倍。当在本申请和权利要求书中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“基本上包含”的含义应假定为在所述特定值或组成的可接受的误差范围内。

术语“活化的免疫细胞”、“活化的T细胞”和“活化的NK细胞”尤其是指正经历细胞分裂的免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞。

“抗原”是指引发免疫反应或能够由TCR结合的任何分子，例如肽。免疫反应可涉及抗体产生、特定免疫感受态细胞的活化或其组合。本领域技术人员将容易地理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可充当抗原。抗原可内源地表达，即由基因组DNA表达，或者可重组表达。抗原和/或表位可对某些组织，如癌细胞具有特异性，或者其可广泛表达。另外，较大分子的片段可充当抗原。在一个方面，抗原为肿瘤抗原。

如本文所用，“抗原呈递细胞”或“APC”是指表达一种或多种抗原的细胞或细胞样抗原呈递表面。在一些方面，抗原呈现于APC的表面上。APC的非限制性实例包括树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系或其任何组合。细胞样抗原呈递表面的非限制性实例包括基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物(包括但不限于例如珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物)或其任何组合。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为K562细胞。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为K562细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为K562细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为721.221细胞。参见例如Yang等人,Mol.Ther.:Methods&Clinical Development 18:428(2020)。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为721.221细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为721.221细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为Hut78细胞。参见例如Min等人,Cellular&Molecular Immunology19:296-98(2022)。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为Hut78细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为Hut78细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。

如本文所用的“抗肿瘤作用”是指可呈现为肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少、转移瘤数目减少、总体或无进展存活增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状的改善的生物学作用。抗肿瘤作用还可指预防肿瘤发生，例如疫苗。

如本文所用，如应用于一个或多个感兴趣的值的术语“大约”是指与规定参照值相似的值。在某些方面，术语“大约”是指在任一方向(大于或小于)上落于规定参照值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围，除非另外规定或另外从上下文中显而易见(除此类数字超过可能值的100％的情形以外)。

术语“自体”是指来源于同一个体的任何物质，例如免疫细胞，稍后将所述物质再引入所述个体中。例如，自体T细胞疗法包括向受试者施用从同一受试者分离的T细胞。术语“同种异体”是指来源于一个个体的任何物质，随后将其引入同一物种的另一个体。例如，同种异体T细胞移植包括向受试者施用从除了所述受试者以外的供体获得的T细胞。

“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的一组广泛的各种疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致侵入邻近组织的恶性肿瘤的形成，并且可经由淋巴系统或血流转移至身体的远端部位。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。可通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病和其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本发明的方法可用于减小来源于例如癌症的肿瘤的肿瘤大小，所述癌症包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC))、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)或其任何组合。特定癌症可对化学疗法或放射疗法有反应，或者癌症可为难治性的。难治性癌症是指不受手术干预影响的癌症，并且癌症最初对化学疗法或放射疗法无反应或随着时间推移癌症变得无反应。

应理解，当在本文中用语言“包含”描述各方面时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的其他类似方面。

如本文所用，术语“共刺激配体”包括在抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)上的同源共刺激分子，从而提供一个信号，除了通过例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子结合提供的主要信号之外，所述信号还介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导性共刺激配体(ICOS-L)、细胞内粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其涵盖与免疫细胞例如T细胞和/或NK细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，共刺激分子包括IL-21(例如，膜结合的IL-21)、4-1BBL、OX40L和IL-15(例如，膜结合的IL-15)或其任何组合中的一者或多者。在一个特定实施方案中，本文所描述的RAPC包括膜结合的IL-21、膜结合的IL-15、OX40L和4-1BBL中的每一者。

“共刺激分子”是指免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

如本文所用的“细胞因子”是指由一种细胞响应于与特定抗原接触所释放的非抗体蛋白，其中细胞因子与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的反应。细胞因子可由细胞内源性表达、添加至培养中的细胞中、向受试者施用或其任何组合。细胞因子可由包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞的免疫细胞释放以传播免疫反应。细胞因子可在接受者细胞中诱导各种反应。细胞因子可包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎性细胞因子、效应子和急性期蛋白。例如，稳态细胞因子(包括白细胞介素(IL)7和IL-15)促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎性细胞因子可促进炎性反应。稳态细胞因子的实例包括但不限于：IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-21和干扰素(IFN)γ。促炎性细胞因子的实例包括但不限于：IL-la、IL-lb、IL-6、IL-13、IL-17a、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、纤维母细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)、可溶性血管粘附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。效应子的实例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)和穿孔蛋白。急性期蛋白的实例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。

“趋化因子”是介导细胞趋化性或定向移动的一类细胞因子。趋化因子的实例包括但不限于：IL-8、IL-16、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC或CCL22)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬细胞炎性蛋白la(MIP-la，MIP-la)、MIP-Ib(MIP-lb)、γ诱导蛋白10(IP-10)以及胸腺和活化调控的趋化因子(TARC或CCL17)。

细胞因子的其他实例包括但不限于：趋化因子(C-C基序)配体(CCL)1、CCL5、单核细胞特异性趋化因子3(MCP3或CCL7)、单核细胞化学吸引蛋白2(MCP-2或CCL8)、CCL13、IL-1、IL-3、IL-9、IL-11、IL-12、IL-14、IL-17、IL-20、IL-21、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、抑癌蛋白M(OSM)、CD 154、淋巴毒素(LT)β、4-IBB配体(4-1BBL)、增殖诱导的配体(APRIL)、CD70、CD153、CD178、糖皮质素诱导的TNFR相关配体(GITRL)、肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)、OX40L、TNF相关和ApoL相关白细胞表达配体1(TALL-1)或TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。

术语“工程化自体细胞疗法”，可缩写为“eACT^TM”，也称为过继性细胞转移，是一种过程，通过所述过程收集患者自身的免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)并且随后基因改变以识别并靶向一种或多种特定肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原。免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞，可经工程化以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。CAR阳性(+)免疫细胞，例如T细胞或免疫细胞，经工程化以表达对特定肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变片段(scFv)，所述特定肿瘤抗原与包含共刺激域和活化域的细胞内信号传导部分连接。共刺激域可来源于例如CD28，并且活化域可来源于例如CD3-ζ(图1)。在某些实施方案中，CAR经设计为具有两个、三个、四个或更多个共刺激域。CAR scFv可经设计以靶向例如CD19，所述CD19为由B细胞谱系中的细胞表达的跨膜蛋白，所述B细胞谱系包括所有正常B细胞和B细胞恶性肿瘤，包括但不限于NHL、CLL和非T细胞ALL。示例性CAR+T细胞疗法和构建体描述于美国专利公开第2013/0287748号、第2014/0227237号、第2014/0099309号和第2014/0050708号中，并且这些参考文献通过引用整体并入。

“免疫反应”如本领域中所理解并且通常是指脊椎动物体内针对外来剂或异常(例如癌性细胞)的生物反应，所述反应保护生物体免于这些剂和由其所致的疾病。免疫反应系由免疫系统的一种或多种细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一者或肝脏产生的可溶性巨分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用来介导，从而导致选择性靶向、结合、损伤、破坏、和/或从脊椎动物体内清除：入侵病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或在自身免疫性或病理炎症的情况下，正常人类细胞或组织。免疫反应包括例如T细胞(例如效应T细胞、Th细胞、CD4⁺细胞、CD8⁺T细胞或Treg细胞)的活化或抑制，或免疫系统的任何其他细胞(例如NK细胞)的活化或抑制。

“免疫调节剂”或“免疫调控剂”是指一种剂，例如靶向可参与调节、调控或修饰免疫反应的信号通路的组分的剂。“调节”、“调控”或“修饰”免疫反应是指免疫系统的细胞或此类细胞(例如，效应T细胞，如Th1细胞)的活性的任何改变。此类调节包括免疫系统的刺激或抑制，其可通过各种细胞类型的数目的增加或减少、这些细胞的活性的增加或减少、或免疫系统内可发生的任何其他变化来表现。抑制性和刺激性免疫调节剂都已经鉴定，其中一些可在肿瘤微环境中具有增强的功能。在一些实施方案中，免疫调节剂靶向免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)表面上的分子。“免疫调节靶标”或“免疫调控靶标”为一种分子，例如细胞表面分子，其由一种物质、剂、部分、化合物或分子靶向结合，并且其活性因所述物质、剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。

“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、遏制或以其他方式修饰免疫系统或免疫反应的方法来治疗患有疾病或处于感染疾病或遭受疾病复发的风险下的受试者。

“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”是指导致增加(诱导或增强)受试者的免疫反应以用于例如治疗癌症的疗法。

如本文所用的“负载”肽是指在MHC分子的情况下呈递抗原。如本文所用的“负载”还意指抗体与细胞上的Fc结合受体如CD32和/或CD64的结合。

如本文所用，术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞为一类细胞毒性(细胞中毒)淋巴细胞，其代表了固有免疫系统的主要组分。NK细胞通过在靶细胞中诱导细胞凋亡或程序性细胞死亡来排斥肿瘤和受病毒感染的细胞。NK细胞被称为“自然杀手”，因为其不需要活化以杀死靶细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起主要作用。T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)将T细胞与其他淋巴细胞类型区分。胸腺，即免疫系统的专门器官，主要负责T细胞成熟。有六种类型的T细胞，即：辅助T细胞(例如CD4+细胞)；细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞溶解性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)；记忆T细胞((i)干记忆TSCM细胞，如幼稚细胞，为CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择蛋白)、CD27+、CD28+和IL-7Ra+，但其也表达大量CD95、IL-2R.p、CXCR3和LFA-1，并且显示许多与记忆细胞不同的功能属性)；(ii)中枢记忆TCM细胞表达L-选择蛋白和CCR7，其分泌IL-2但不分泌IFNy或IL-4，以及(iii)效应记忆TEM细胞则不表达L-选择蛋白或CCR7，但产生效应细胞因子如IFNy和IL-4)；调控性T细胞(Treg，抑制性T细胞或CD4+CD25+调控性T细胞)；自然杀伤T细胞(NKT)；以及γδT细胞。

B细胞在体液免疫(抗体参与)中发挥主要作用。B细胞制造抗体和抗原，并发挥抗原呈递细胞(APC)的作用，并且在通过抗原相互作用的活化后变成记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟B细胞在骨髓中形成，其名称来自骨髓。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物，如氯化钠、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)等)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，如油酸乙酯)、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，如本领域普通技术人员已知的类似材料和其组合。药物组合物中的各种组分的pH和确切浓度根据众所周知的参数进行调整。

“增强内源性免疫反应”意指提高受试者中现有免疫反应的有效性或效力。可例如通过克服遏制内源宿主免疫反应的机制或通过刺激增强内源宿主免疫反应的机制来达到此有效性和效力的提高。

如本文所用，术语“重组”细胞，例如重组抗原呈递细胞(或“RAPC”)意在指代包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，例如抗原呈递细胞，并且可为已引入重组表达载体的细胞。应理解，此类术语意在不仅指代特定受试者细胞，而且还指代此种细胞的子代。尽管由于突变或环境影响，后代中可能发生某些修饰，但此类子代仍包括于如本文所用的术语“重组”的范围内。在一些方面，RAPC是基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物或其任何组合。固体支撑物的非限制性实例包括珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物或其任何组合。在RAPC包含基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物或其任何组合的情况下，RAPC可包含一种或多种与RAPC表面结合的重组蛋白(例如，本文所公开的IL-21、IL-15、4-1BBL和/或OX40L中的一者或多者)。

如本文所用的“刺激配体”意指当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上时可与免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)上的同源结合伴侣(本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导免疫细胞的初级反应的配体，所述初级反应包括但不限于活化、免疫反应的启动、增殖等。刺激配体是本领域中众所周知的并且尤其涵盖负载有肽、抗CD3抗体、超激动抗CD28抗体和超激动抗CD2抗体的MHC I类分子。

如本文所用的术语“刺激分子”意指免疫细胞例如T细胞或NK细胞上的分子，其与抗原呈递细胞(例如本发明的aAPC等)上存在的同源刺激配体特异性结合。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换地使用并且是指人类或非人类，例如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定方面，受试者为人类。

如本文所用，术语“T细胞受体”(TCR)是指能够与靶抗原特异性相互作用的异质细胞表面受体。如本文所用，“TCR”包括但不限于天然存在和非天然存在的TCR；全长TCR和其抗原结合部分；嵌合TCR；TCR融合构建体；和合成TCR。在人类中，TCR在T细胞的表面上表达，并且其负责T细胞识别和抗原呈递细胞的靶向。抗原呈递细胞(APC)显示与主要组织相容性复合物(MHC)复合(在本文中也称为与HLA分子，例如，HLA1类分子复合)的外来蛋白(抗原)的片段。TCR识别并结合至抗原-HLA复合物，并且募集CD3(由T细胞表达)，从而活化TCR。活化的TCR起始下游信号传导和免疫反应，包括破坏抗原呈递细胞。

一般来说，TCR可包含两条链，(i)α-βT细胞的α链和β链，或(ii)γ-δT细胞的γ链和δ链，其通过二硫键来互连。每个链包含可变域(α链可变域、β链可变域、γ链可变域和δ链可变域)和恒定区(α链恒定区、β链恒定区、γ链恒定区和δ链恒定区)。可变域定位于细胞膜的远端，并且可变域与抗原相互作用。恒定区定位于细胞膜的近端。TCR还可包含跨膜区和短胞质尾。如本文所用，术语“恒定区”涵盖跨膜区和胞质尾(当存在时)，以及传统的“恒定区”。

可变域可进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有称为框架区(FR)的更保守区。每个α链可变域和β链可变域包含三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个可变域含有与抗原相互作用的结合域。尽管每条链上的全部三个CDR都涉及抗原结合，但据认为CDR3是主要抗原结合区。CDR1也与抗原相互作用，而据认为CD2主要识别ELLA复合物。

在未明确说明时，并且除非上下文另外指示，否则术语“TCR”还包括本文所公开的任何TCR的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分和单链TCR。术语“TCR”不限于结合至T细胞表面的天然存在的TCR。如本文所用，术语“TCR”进一步指代在除了T细胞以外的细胞(例如，天然地表达或经修饰以表达CD3的细胞，如本文所描述)的表面上表达的本文所描述的TCR，或不含细胞膜的本文所描述的TCR(例如，经分离的TCR或可溶性TCR)。

“TCR片段”、“抗原结合分子”或“TCR的一部分”是指TCR中小于整体的任何部分。抗原结合分子可包括抗原性互补决定区(CDR)。

如本文所用，术语“治疗益处”或“治疗有效”是指促进或增强受试者在此疾患的医学治疗方面健康的任何事物。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。

如本文所用，术语疾病或疾患的“治疗(treating/treatment)”是指执行方案，其可包括向患者施用一种或多种疗法，以试图减轻疾病的体征或症状。在一些方面，治疗降低疾病进展率、改善或减轻疾病状态和/或促进缓解或改进预后。缓解可在疾病或疾患的体征或症状出现之前以及所述体征或症状出现之后发生。因此，在一些方面，“治疗(treating/treatment)”包括“预防(preventing/prevention)”疾病或非所需疾患。然而，“治疗(treating/treatment)”不需要完全缓解所有体征和/或症状，不需要治愈，并且特别包括对患者仅具有边际效应的方案。

如本文所用，术语“ug”和“uM”可分别与“μg”和“μM”互换使用。

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本公开相关领域的本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，以下出版物为本领域技术人员提供本公开中所用的许多术语的综合词典：the Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和the Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press。

单位、前缀和符号都以其国际单位制(Système International de Unites，(SI))公认形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。除非另外指示，否则如本文所描述的任何浓度范围、百分率范围、比率范围或整数范围都应理解为包括在所陈述的范围内的任何整数的值并且当适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和一百分之一)。

本文所用的缩写在整个本公开中定义。本公开的各个方面更详细地描述于以下小节中。

本文所描述的各个方面更详细地描述于以下小节中。

II.本公开的组合物

本公开的一些方面涉及一种包含第一RAPC和第二RAPC的RAPC群体。在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，和(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子。

在一些方面，(a)所述第一RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码OX40L的核酸分子。

在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子。

在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码IL-15的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-15的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子。

在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子和(ii)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码OX40L的核酸分子和(ii)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码IL-15的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子。

在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子。在一些方面，(a)所述第一RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子；并且(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码OX40L的核酸分子。

在一些方面，所述RAPC群体包含第三RAPC，其中所述第三RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子，或(v)(i)-(iv)的任何组合。在一些方面，RAPC群体包含第四RAPC，其中所述第四RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子，或(v)(i)-(iv)的任何组合。在一些方面，所述RAPC群体包含第一RAPC、第二RAPC、第三RAPC和第四RAPC；其中(a)所述第一RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子，(b)所述第二RAPC包含一种或多种编码OX40L的核酸分子，(c)所述第三RAPC包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，和(d)所述第四RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。

在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，所述第一RAPC和所述第二RAPC包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，和(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子。

在一些方面，所述一种或多种编码IL-21的核酸分子对于细胞为异源的。在一些方面，所述一种或多种编码OX40L的核酸分子对于细胞为异源的。在一些方面，所述一种或多种编码4-1BBL的核酸分子对于细胞为异源的。在一些方面，所述一种或多种编码IL-15的核酸分子对于细胞为异源的。

在一些方面，所述RAPC表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，所述RAPC表达IL-21和OX40L。在一些方面，所述RAPC表达IL-21、OX40L和4-1BBL。在一些方面，所述RAPC表达IL-21、OX40L和IL-15。在一些方面，所述RAPC表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。

在一些方面，IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者表达于RAPC的表面上。在一些方面，IL-21和OX40L表达于RAPC的表面上。在一些方面，IL-21、OX40L和4-1BBL表达于RAPC的表面上。在一些方面，IL-21、OX40L和IL-15表达于RAPC的表面上。在一些方面，IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15表达于RAPC的表面上。

II.A.重组抗原呈递细胞

本公开的某些方面涉及重组抗原呈递细胞(RAPC)。任何抗原呈递细胞(APC)均可用于本文所公开的组合物和方法中。在一些方面，APC包含例如哺乳动物细胞的细胞，例如人类细胞。在一些方面，细胞为肿瘤细胞。在一些方面，细胞源自肿瘤细胞。在一些方面，细胞为K562细胞。在一些方面，细胞为经基因修饰的K562细胞。K562细胞系为来源于自患有慢性粒细胞白血病(CML)的人类患者获得的骨髓样品的稳定细胞系。将K562细胞在悬浮液中培养，并且所述细胞具有淋巴母细胞形态。

在某些方面，所述RAPC包含K562细胞，其包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子。在一些方面，所述RAPC包含K562细胞，其包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。在一些方面，所述RAPC包含K562细胞，其包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，和(iii)一种或多种编码IL-15的核酸分子。在一些方面，所述RAPC包含K562细胞，其包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子，(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子，(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子，和(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子。

在一些方面，本文所公开的RAPC群体包含第一RAPC、第二RAPC、第三RAPC和第四RAPC；其中所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合为K562细胞。在一些方面，本文所公开的RAPC群体包含第一RAPC、第二RAPC、第三RAPC和第四RAPC；其中所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合为经修饰的K562细胞。

在一些方面，所述APC包含例如哺乳动物免疫细胞的免疫细胞，例如人类免疫细胞。能够呈递抗原的任何免疫细胞均可用于本文所公开的组合物和方法中。在一些方面，免疫细胞包含树突状细胞。在一些方面，细胞为工程化克隆细胞。

在一些方面，所述APC是表达一种或多种抗原的细胞样抗原呈递表面。在一些方面，所述APC包含基于珠粒的人工抗原呈递细胞。在一些方面，所述APC包含乳胶珠粒，在所述乳胶珠粒表面上包含IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，所述APC包含聚苯乙烯珠粒，在所述聚苯乙烯珠粒表面上包含IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，所述APC包含金属珠粒，在所述金属珠粒表面上包含IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。

在一些方面，所述APC包含含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统。在一些方面，所述APC包含核内体。在一些方面，所述APC包含外泌体。在一些方面，所述APC包含微囊泡。在一些方面，所述APC包含纳米囊泡。在一些方面，所述APC包含脂质体。在一些方面，所述APC包含固体支撑物。在一些方面，所述APC包含珠粒。在一些方面，所述APC包含球形或非球形纳米粒子支撑物。在一些方面，所述APC包含碳纳米管支撑物。在一些方面，所述APC包含磁性粒子支撑物。在一些方面，所述APC包含丝状聚合物支撑物。在一些方面，所述APC包含二维支撑物。

本文所公开的RAPC可使用任何方法产生。在一些方面，RAPC是通过对APC进行基因工程化以包含本文所公开的核酸分子中的一者或多者(例如编码IL-21、IL-15、4-1BBL和/或OX40L)来产生。在一些方面，K562细胞是通过慢病毒转导来工程化，例如用包含编码IL-21(例如本文所公开的IL-21-Fc或IL-21-CD8融合构建体)、IL-15(例如本文所公开的IL-15-Fc或IL-15-CD8融合构建体)、4-1BBL和/或OX40L的核酸分子的慢病毒载体。

在一些方面，所述APC经照射。照射APC已显示可改进在经照射APC上培养的免疫细胞的特性，包括增加APC中CD70的表达，认为其有助于免疫细胞的活化和/或扩增。参见例如Huang等人,J.Immunother.34(4):327(2011)，所述文献通过引用整体并入本文。在一些方面，与在未经照射的APC例如RAPC的存在下培养的免疫细胞相比，在经照射的APC例如RAPC的存在下培养的免疫细胞具有增加的增殖和/或增加的IFNg产生。在一些方面，照射APC，例如RAPC，以使其不能生长或分裂。在一些方面，以至少约10Gy、至少约20Gy、至少约30Gy、至少约40Gy、至少约50Gy、至少约60Gy、在至少约70Gy、至少约80Gy、至少约90Gy、至少约100Gy、至少约125Gy、至少约150Gy、至少约175Gy或至少约200Gy照射APC，例如RAPC。在一些方面，以约100Gy照射APC，例如RAPC。在一些方面，将APC例如RAPC与丝裂霉素C接触。在一些方面，将APC例如RAPC与至少约25μg/mL丝裂霉素C接触。

在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为721.221细胞。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为721.221细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为721.221细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为Hut78细胞。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为Hut78细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15中的一者或多者。在一些方面，本文所描述的抗原呈递细胞为Hut78细胞，其经修饰以表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。

II.B.IL-21

本公开的一些方面涉及包含一种或多种编码IL-21的核酸分子的RAPC。如本文所用，IL-21是指白细胞介素-21、其功能片段、其功能变体、或包含IL-21或其功能片段或功能变体的融合多肽。在一些方面，IL-21为具有野生型IL-21的至少一种功能的任何多肽。在一些方面，IL-21包含哺乳动物IL-21。在一些方面，IL-21包含人类IL-21(UniProtKB–Q9HBE4)。

人类IL-21是一种具有免疫调控活性的细胞因子，据认为其可促进先天免疫与后天免疫之间的过渡。IL-21诱导B细胞中IgG1和IgG3的产生，并且与T滤泡辅助(Tfh)细胞的产生和维持以及生发中心的形成有关。IL-21与IL-6一起控制Tfh细胞的早期生成，并且对于对急性病毒感染的有效抗体反应是至关重要的。IL-21也可与IL-15协同作用在自然杀伤(NK)细胞的增殖和成熟中发挥作用，并且可调控成熟B细胞和T细胞响应于活化刺激的增殖。与IL-15和IL-18协同作用，IL-21刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ的产生。IL-21也可在T细胞介导的免疫反应期间抑制树突状细胞(DC)活化和成熟。典型序列提供于表1A中。

表1A：人类IL-21典型氨基酸和核酸序列。

在一些方面，编码IL-21的核酸分子编码包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有IL-21活性。在一些方面，编码IL-21的核酸分子编码包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，编码IL-21的核酸分子包含与SEQ ID NO:5中所示的核酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列，其中所述核酸分子编码具有IL-21活性的多肽。在一些方面，编码IL-21的核酸分子包含SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。

在一些方面，所述IL-21为融合蛋白。在一些方面，所述IL-21为包含人类IL-21多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。在一些方面，所述IL-21包含(i)人类IL-21多肽、(ii)免疫球蛋白的Fc区、和(iii)跨膜域。在一些方面，所述IL-21包含(i)人类IL-21多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区、和(iv)跨膜域。在一些方面，所述IL-21包含(i)人类IL-21多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区、(iv)跨膜域、和(v)信号传导肽。

任何Fc区都可用于本文所公开的IL-21融合多肽中。在一些方面，所述Fc区为IgGFc区、IgA Fc区或IgD Fc区。在一些方面，所述Fc区为IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG3 Fc区、IgG4 Fc区或其组合。在一些方面，所述IL-21融合蛋白包含IgG1 Fc区。在一些方面，所述IL-21融合蛋白包含IgG4 Fc区。

任何铰链区均可用于本文所公开的IL-21融合多肽中。在一些方面，所述铰链区包含Fc铰链区。在一些方面，所述铰链区包含IgG Fc铰链区、IgAFc铰链区或IgD Fc铰链区。在一些方面，所述铰链区包含IgG1 Fc铰链区、IgG2 Fc铰链区和IgG3 Fc铰链区、IgG4 Fc铰链区或其组合。在一些方面，所述IL-21融合蛋白包含IgG1 Fc铰链区。在一些方面，所述IL-21融合蛋白包含IgG4 Fc铰链区。在一些方面，所述IL-21融合蛋白包含经修饰的IgG4 Fc铰链区。在一些方面，所述铰链区包含CD8铰链区。

任何跨膜域都可用于本文所公开的IL-21融合多肽中。在一些方面，所述跨膜域包含CD4跨膜域。在一些方面，所述跨膜域包含CD8跨膜域。

任何信号传导肽都可用于本文所公开的IL-21融合多肽中。在一些方面，所述信号传导肽包含GMSCF信号传导肽。在一些方面，所述信号传导肽包含GMSCFR信号传导肽。在一些方面，所述信号传导肽包含CD8信号传导肽。

在一些方面，所述IL-21包含(i)CD8信号传导肽、(ii)人类IL-21多肽、(iii)CD8铰链区、和(iii)CD8跨膜域。

II.C.IL-15

本公开的一些方面涉及包含一种或多种编码IL-15的核酸分子的RAPC。如本文所用，IL-15是指白细胞介素-15、其功能片段、其功能变体、或包含IL-15或其功能片段或功能变体的融合多肽。在一些方面，所述IL-15是具有野生型IL-15的至少一种功能的任何多肽。在一些方面，所述IL-15包含哺乳动物IL-15。在一些方面，所述IL-15包含人类IL-15(UniProtKB–P40933)。

人类IL-15是一种刺激T淋巴细胞增殖的细胞因子。IL-15的刺激需要IL-15与IL-2受体的的组分的相互作用，所述组分包括IL-2RB和可能的IL-2RG，但不为IL-2RA。在嗜中性粒细胞中，IL-15可能通过IL-15受体信号传导来刺激吞噬作用，导致激酶SYK活化，所述IL-15受体由亚基IL-15RA、IL-2RB和IL-2RG构成。典型序列提供于表1B中。

表1B：人类IL-15典型氨基酸和核酸序列。

在一些方面，编码IL-15的核酸分子编码包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有IL-15活性。在一些方面，编码IL-15的核酸分子编码包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，编码IL-15的核酸分子包含与SEQ ID NO:6中所示的核酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列，其中所述核酸分子编码具有IL-15活性的多肽。在一些方面，编码IL-15的核酸分子包含SEQ ID NO:6中所示的核酸序列。

在一些方面，IL-15为融合蛋白。在一些方面，所述IL-15为包含人类IL-15多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。在一些方面，所述IL-15包含(i)人类IL-15多肽、(ii)免疫球蛋白的Fc区、和(iii)跨膜域。在一些方面，所述IL-15包含(i)人类IL-15多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区、和(iv)跨膜域。在一些方面，所述IL-15包含(i)人类IL-15多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区、(iv)跨膜域、和(v)信号传导肽。

任何Fc区都可用于本文所公开的IL-15融合多肽中。在一些方面，所述Fc区为IgGFc区、IgAFc区或IgD Fc区。在一些方面，所述Fc区为IgG1 Fc区、IgG2 Fc区和IgG3 Fc区、IgG4 Fc区或其组合。在一些方面，所述IL-15融合蛋白包含IgG1 Fc区。在一些方面，所述IL-15融合蛋白包含IgG4 Fc区。

任何铰链区都可用于本文所公开的IL-15融合多肽中。在一些方面，所述铰链区包含Fc铰链区。在一些方面，所述铰链区包含IgG Fc铰链区、IgAFc铰链区或IgD Fc铰链区。在一些方面，铰链区包含IgG1 Fc铰链区、IgG2 Fc铰链区和IgG3 Fc铰链区、IgG4 Fc铰链区或其组合。在一些方面，所述IL-15融合蛋白包含IgG1 Fc铰链区。在一些方面，所述IL-15融合蛋白包含IgG4 Fc铰链区。在一些方面，所述IL-15融合蛋白包含经修饰的IgG4 Fc铰链区。在一些方面，所述铰链区包含CD8铰链区。

任何跨膜域都可用于本文所公开的IL-15融合多肽中。在一些方面，所述跨膜域包含CD4跨膜域。在一些方面，所述跨膜域包含CD8跨膜域。

任何信号传导肽都可用于本文所公开的IL-15融合多肽中。在一些方面，信号传导肽包含GMSCF信号传导肽。在一些方面，所述信号传导肽包含GMSCFR信号传导肽。在一些方面，所述信号传导肽包含CD8信号传导肽。

在一些方面，所述IL-15包含(i)CD8信号传导肽、(ii)人类IL-15多肽、(iii)CD8铰链区、和(iii)CD8跨膜域。

II.D.4-1BBL

本公开的一些方面涉及包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子的RAPC。4-1BBL也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员9(或TNFSF9)。如本文所用，4-1BBL是指全长4-1BBL、其功能片段、其功能变体、或包含4-1BBL或其功能片段或功能变体的融合多肽。在一些方面，4-1BBL为具有野生型4-1BBL的至少一种功能的任何多肽。在一些方面，4-1BBL包含哺乳动物4-1BBL。在一些方面，4-1BBL包含人类4-1BBL(UniProtKB–P41273)。

人类4-1BB是与TNFRSF9(4-1BBL)受体结合的配体。这种相互作用诱导经活化的外周血T细胞增殖。4-1BBL进一步在活化诱导的细胞死亡(AICD)以及T细胞和B细胞/巨噬细胞之间的同源相互作用中发挥作用。典型序列提供于表1C中。

表1C：人类4-1BBL典型氨基酸和核酸序列。

在一些方面，编码4-1BBL的核酸分子编码包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有4-1BBL活性。在一些方面，编码4-1BBL的核酸分子编码包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，编码4-1BBL的核酸分子包含与SEQ ID NO:7中所示的核酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列，其中所述核酸分子编码具有4-1BBL活性的多肽。在一些方面，编码4-1BBL的核酸分子包含SEQ ID NO:7中所示的核酸序列。

II.E.OX40L

本公开的一些方面涉及包含一种或多种编码OX40L的核酸分子的RAPC。OX40L也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员4(或TNFSF4)。如本文所用，OX40L是指全长OX40L、其功能片段、其功能变体、或包含OX40L或其功能片段或功能变体的融合多肽。在一些方面，所述OX40L是具有野生型OX40L的至少一种功能的任何多肽。在一些方面，所述OX40L包含哺乳动物OX40L。在一些方面，所述OX40L包含人类OX40L(UniProtKB–P23510)。

人类OX40是与TNFRSF4(OX40L)受体结合的配体。OX40L共刺激T细胞增殖和细胞因子产生。典型序列提供于表1D中。

表1D：人类OX40L典型氨基酸和核酸序列。

在一些方面，编码OX40L的核酸分子编码包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有OX-40L活性。在一些方面，编码OX40L的核酸分子编码包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的多肽。

在一些方面，编码OX40L的核酸分子包含与SEQ ID NO:8中所示的核酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列，其中所述核酸分子编码具有OX40L活性的多肽。在一些方面，编码OX40L的核酸分子包含SEQ ID NO:8中所示的核酸序列。

II.F.其他核酸分子

在一些方面，所述RAPC包含一种或多种额外的核酸分子，其中所述一种或多种额外的核酸分子编码IL-2。在一些方面，所述RAPC进一步表达IL-2。

在一些方面，所述RAPC表达一种或多种共刺激分子。在一些方面，所述共刺激分子包含CD86、B7.1或其片段或变体。在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码CD86的核酸分子。在一些方面，所述RAPC进一步表达CD86。在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码B7.1的核酸分子。在一些方面，所述RAPC进一步表达B7.1。在一些方面，所述RAPC包含(i)一种或多种编码CD86的核酸分子和(ii)一种或多种编码B7.1的核酸分子。在一些方面，所述RAPC表达CD86和B7.1。

在一些方面，所述RAPC表达一种或多种SLAM家族抗原。在一些方面，所述SLAM家族抗原选自CD2、CD48、CD58(LFA-3)、CD244(2B4)、CD229(Ly9)、CD319(CS1(CD2亚群1)；CRACC(CD2样受体活化细胞毒性细胞))和CD352(NTB-A(NK-T-B抗原))。在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码CD48的核酸分子。在一些方面，所述RAPC进一步表达CD48。在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码CS1(CD319)的核酸分子。在一些方面，所述RAPC进一步表达CS1(CD319)。在一些方面，所述RAPC进一步表达CD48和CS1(CD319)。

在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码粘附多肽的核酸分子。在一些方面，所述粘附多肽包含ICAM-1(CD54)、LFA-3或其片段或变体。在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码ICAM-1(CD54)的核酸分子。在一些方面，所述RAPC进一步表达ICAM-1(CD54)。在一些方面，所述RAPC包含一种或多种编码LFA-3(CD58)的核酸分子。在一些方面，所述RAPC进一步表达LFA-3(CD58)。在一些方面，所述RAPC包含(i)一种或多种编码ICAM-1(CD54)的核酸分子和(ii)一种或多种编码LFA-3(CD58)的核酸分子。在一些方面，所述RAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。

在一些方面，所述RAPC并不表达内源HLA I类分子。在一些方面，所述RAPC并不表达内源HLAII类分子。在一些方面，所述RAPC并不表达内源MHC CD1d分子。在一些方面，所述RAPC并不表达内源HLAI类、II类和/或CD1d分子。

III.本公开的方法

本公开的一些方面涉及离体扩增免疫细胞群体的方法。在一些方面，所述方法包括使所述免疫细胞群体与本文所公开的RAPC接触。在一些方面，所述RAPC表达IL-21(例如本文所公开的IL-21-Fc或IL-21-CD8融合构建体)和OX40L。在一些方面，所述RAPC表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)、OX40L和IL-15(例如本文所公开的IL-15-Fc或IL-15-CD8融合构建体)。在一些方面，所述RAPC表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)、OX40L和4-1BBL。在一些方面，所述RAPC表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)、OX40L、IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)和4-1BBL。

在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和OX40L的RAPC和(ii)IL-15接触，其中所述RAPC并不表达IL-15。在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和OX40L的RAPC和(ii)4-1BBL接触，其中所述RAPC并不表达4-1BBL。在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和OX40L的RAPC、(ii)IL-15和(iii)4-1BBL接触；其中所述RAPC并不表达IL-15或4-1BBL。

在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21和IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)的RAPC和(ii)OX40L接触，其中所述RAPC并不表达OX40L。在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21和IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)的RAPC和(ii)4-1BBL接触，其中所述RAPC并不表达4-1BBL。在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21和IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)的RAPC、(ii)OX40L和(iii)4-1BBL接触；其中所述RAPC并不表达OX40L或4-1BBL。

在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL的RAPC和(ii)IL-15接触，其中所述RAPC并不表达IL-15。在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL的RAPC和(ii)OX40L接触，其中所述RAPC并不表达OC-40L。在一些方面，所述方法包括使免疫细胞与(i)表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL的RAPC、(ii)IL-15和(iii)OX40L接触；其中所述RAPC并不表达IL-15或OX40L。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与IL-21(例如可溶性IL-21、IL-21-Fc或IL-21-CD8)和OX40L接触。在一些方面，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与例如本文所公开的RAPC的APC接触。在一些方面，所述方法还包括使免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体与4-1BBL接触。在一些方面，所述方法还包括使免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体与IL-15(例如可溶性IL-15、IL-15-Fc或IL-15-CD8)接触。在一些方面，例如RAPC的APC表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)、OX40L和4-1BBL，并且将例如T细胞和/或NK细胞的免疫细胞群体在包含IL-15(例如可溶性IL-15、IL-15-Fc或IL-15-CD8)的培养基中培养。在一些方面，例如RAPC的APC表达IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)、OX40L和IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)，并且将例如T细胞和/或NK细胞的免疫细胞群体在包含4-1BBL的培养基中培养。

本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与IL-21(例如可溶性IL-21、IL-21-Fc或IL-21-CD8)和第一APC接触，其中所述第一APC表达OX40L。在一些方面，将例如T细胞和/或NK细胞的免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含IL-21(例如可溶性IL-21)。在一些方面，所述IL-21与珠粒结合。在一些方面，所述IL-21(例如可溶性IL-21、IL-21-Fc和/或IL-21-CD8)由第二APC表达。在一些方面，所述第一RAPC与所述第二APC不同。在一些方面，所述第一APC与所述第二APC相同。

在一些方面，所述方法还包括使免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体与OX40L接触。在一些方面，将例如T细胞和/或NK细胞的免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含OX40L。在一些方面，所述OX40L与珠粒结合。在一些方面，所述OX40L由第三APC表达。在一些方面，所述第三APC不同于第一APC和第二APC。在一些方面，所述第三APC与第一APC相同，其中所述第三APC与第二APC相同，或其中所述第三APC与第一APC和第二APC相同。

在一些方面，所述方法还包括使免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)群体与IL-15(例如可溶性IL-15、IL-15-Fc或IL-15-CD8)接触。在一些方面，将例如T细胞和/或NK细胞的免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含IL-15(例如可溶性IL-15)。在一些方面，所述IL-15与珠粒结合。在一些方面，所述IL-15由第四APC表达。在一些方面，所述第四APC不同于第一APC、第二APC和第三APC。在一些方面，所述第四APC与第一APC相同；其中所述第四APC与第二APC相同；其中所述第四APC与第三APC相同；其中所述第四APC与第一APC和第二APC相同；其中所述第四APC与第二APC和第三APC相同；其中所述第四APC与第一APC和第三APC相同；或其中所述第四APC与第一APC、第二APC和第三APC相同。

在一些方面，所述免疫细胞群体在使免疫细胞与RAPC接触后扩增。在一些方面，所述免疫细胞群体与表达(i)IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL以及(ii)IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)和/或OX40L的RAPC的接触导致免疫细胞群体的扩增相对于未与RAPC接触或与不表达(i)IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL以及(ii)IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)和/或OX40L的APC接触的免疫细胞群体的扩增有所增加。在一些方面，对免疫细胞群体进行扩增，直至免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹²、至少约1×10⁹至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁹至至少约1×10¹¹、至少约1×10¹⁰至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁷至至少约1×10¹⁰、至少约1×10⁸至至少约1×10¹⁰、或至少约1×10⁹至至少约1×10¹⁰个免疫细胞。在一些方面，对所述免疫细胞群体进行扩增，直至免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷、至少约5×10⁷、至少约1×10⁸、至少约5×10⁸、至少约1×10⁹、至少约2×10⁹、至少约3×10⁹、至少约4×10⁹、至少约5×10⁹、至少约6×10⁹、至少约7×10⁹、至少约8×10⁹、至少约9×10⁹、至少约1×10¹⁰、至少约2×10¹⁰、至少约3×10¹⁰、至少约4×10¹⁰、至少约5×10¹⁰、至少约6×10¹⁰、至少约7×10¹⁰、至少约8×10¹⁰、至少约9×10¹⁰、至少约1×10¹¹、至少约2×10¹¹、至少约3×10¹¹、至少约4×10¹¹、至少约5×10¹¹、至少约6×10¹¹、至少约7×10¹¹、至少约8×10¹¹、至少约9×10¹¹或至少约1×10¹²个免疫细胞。

在一些方面，所述方法还包括纯化经扩增的免疫细胞群体。在一些方面，将扩增后纯化的免疫细胞群体冷冻保存。冷冻保存免疫细胞的任何方法都可用于本文所公开的方法中。在一些方面，将免疫细胞冷冻保存于包含DMSO(例如5％-10％ DMSO)的溶液(例如培养基)中。在一些方面，将免疫细胞解冻并施用于有需要的受试者。

III.A.免疫细胞

本文所公开的方法可用于任何免疫细胞群体的培养(例如扩增)。因而，本公开的一些方面涉及一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与本文所公开的RAPC接触。可根据本文所公开的方法培养任何免疫细胞。在一些方面，免疫细胞群体包含一种或多种选自以下的免疫细胞：αβT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、泛γδT细胞、Vδ1γδT细胞、Vδ2γδT细胞、Vδ3γδT细胞和其任何组合。在一些方面，所述T细胞选自由以下组成的组：幼稚T细胞、干细胞记忆T细胞(Tscm)、中枢记忆T细胞(Tcm)、效应T细胞、效应记忆T细胞(Tem)、细胞毒性T细胞、辅助T细胞和其任何组合。

在一些方面，所述免疫细胞群体包含从供体受试者获得的一种或多种免疫细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从供体人类受试者获得的一种或多种免疫细胞。在一些方面，所述供体受试者患有疾病或疾患。在一些方面，所述供体受试者患有癌症。在一些方面，所述供体受试者患有选自以下的癌症：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)和其任何组合。在某些方面，所述癌症包括淋巴瘤。在某些方面，所述癌症包括白血病。

在一些方面，所述免疫细胞是从受试者获得的脐带血分离。在一些方面，所述免疫细胞是从受试者获得的外周血分离。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从受试者的脐带血获得的一种或多种γ/δT细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从受试者的脐带血获得的一种或多种NK细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从受试者的脐带血获得的一种或多种γ/δT细胞和一种或多种NK细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从受试者的外周血获得的一种或多种γ/δT细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从受试者的外周血获得的一种或多种NK细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含从受试者的外周血获得的一种或多种γ/δT细胞和一种或多种NK细胞。

在一些方面，所述免疫细胞是从受试者获得的肿瘤样品分离。肿瘤活检通常包含免疫细胞群体，其包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和/或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。可使用任何方法以从肿瘤样品获得TIL和/或TAM，所述方法包括例如美国专利第10,166,257号中所公开的方法，所述专利通过引用整体并入本文。

在一些方面，所述供体受试者是健康供体。在某些方面，所述供体受试者不患有癌症。

在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种T细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种α/βT细胞、γ/δT细胞、NK细胞群体或其组合。

在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种源自干细胞的免疫细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种源自诱导性多能干细胞(iPSC)的免疫细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种源自造血干细胞的免疫细胞。在一些方面，所述免疫细胞群体包含一种或多种源自胚胎干细胞的免疫细胞。

在一些方面，本文所公开的方法扩增了免疫细胞群体中免疫细胞的数目。在一些方面，本文所公开的方法在共培养至少约第8天时使免疫细胞群体中免疫细胞的数目扩增了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，本文所公开的方法在共培养至少约第15天时使免疫细胞群体中免疫细胞的数目扩增了至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约125倍、至少约150倍、至少约175倍、至少约200倍、至少约225倍、至少约250倍、至少约275倍、至少约300倍或至少约325倍。在一些方面，本文所公开的方法在共培养至少约第23天时使免疫细胞群体中免疫细胞的数目扩增了至少约200倍、至少约225倍、至少约250倍、至少约275倍、至少约300倍、至少约325倍、至少约350倍、至少约375倍、至少约400倍、至少约450倍、至少约500倍、至少约550倍、至少约600倍、至少约650倍、至少约700倍、至少约750倍、至少约800倍、至少约850倍、至少约900倍、至少约950倍、至少约1000倍、至少约1050倍、至少约1100倍或至少约1150倍。在一些方面，本文所公开的方法在共培养至少约第27天时使免疫细胞群体中免疫细胞的数目扩增了至少约900倍、至少约1000倍、至少约1500倍、至少约2000倍、至少约2500倍、至少约3000倍、至少约3500倍、至少约4000倍、至少约4500倍、至少约5000倍、至少约5500倍、至少约6000倍、至少约6500倍或至少约7000倍。

在一些方面，本文所公开的方法扩增了从受试者获得的混合免疫细胞群体中的γ/δT细胞的数目。在一些方面，经扩增的免疫细胞群体中γ/δT细胞的百分比为经扩增的免疫细胞群体的总群体的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约85％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。在一些方面，本文所公开的方法扩增了从受试者获得的混合免疫细胞群体中的NK细胞的数目。在一些方面，经扩增的免疫细胞群体中NK细胞的百分比为经扩增的免疫细胞群体的总群体的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约85％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。

在一些方面，根据本文所公开的方法扩增的细胞产生包含增加百分比的具有NK细胞表面表型的免疫细胞的经扩增的细胞群体。在一些方面，所述NK细胞表面表型包含CD56，CD16、CD30、CD94和NKG2D中的一者或多者的表达。在一些方面，所述NK细胞表面表型包含经扩增的NK细胞的CD3-和CD56+表达。在一些方面，相比于在与不表达(i)IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL以及(ii)IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)和/或OX40L的APC共温育之后具有NK细胞表面表型的经扩增的细胞的百分比，在与一种或多种表达(i)IL-21(例如IL-21-Fc或IL-21-CD8)和4-1BBL以及(ii)IL-15(例如IL-15-Fc或IL-15-CD8)和/或OX40L的RAPC共温育之后更高百分比的经扩增的细胞具有NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约50％。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约60％。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约70％。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约75％。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约80％。在一些方面，在共温育之后表达NK细胞表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约85％。

在一些方面，在共温育之后表达γ/δT细胞表面表型(例如CD3+CD56-)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在一些方面，在共温育之后表达γ/δT细胞表面表型(例如CD3+CD56-)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约50％。在一些方面，在共温育之后表达γ/δT表面表型(例如CD3+CD56-)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约60％。在一些方面，在共温育之后表达γ/δT表型(例如CD3+CD56-)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约70％。在一些方面，在共温育之后表达γ/δT表面表型(例如CD3-CD56+)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约75％。在一些方面，在共温育之后表达γ/δT细胞表面表型(例如CD3+CD56-)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约80％。在一些方面，在共温育之后表达γ/δT表面表型(例如CD3+CD56-)的总的经扩增的细胞的百分比为至少约85％。

在一些方面，所述免疫细胞是经基因修饰的。在一些方面，所述免疫细胞在使用本文所描述的RAPC(例如在原代免疫细胞的情况下)进行扩增之前经基因修饰(例如以引入CAR)。在其他方面，所述免疫细胞在使用本文所描述的RAPC(例如在iPSC来源的免疫细胞的情况下)进行扩增之后经基因修饰(例如以引入CAR)。因而，本公开的一些方面涉及一种扩增经基因修饰的免疫细胞群体的方法，所述方法包括基因修饰免疫细胞和使经基因修饰的免疫细胞与本文所公开的RAPC接触，由此扩增细胞。本公开的其他方面涉及一种扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括(i)使免疫细胞群体与本文所公开的RAPC接触以产生经扩增的免疫细胞群体，和(ii)基因修饰经扩增的免疫细胞群体中的一种或多种细胞。

任何基因修饰方式都可用于本文所公开的组合物和方法中。在一些方面，所述免疫细胞，例如经扩增的免疫细胞(例如经扩增的γ/δT细胞和/或经扩增的NK细胞)经基因修饰以包含嵌合抗原受体。嵌合抗原受体或CAR是异源重组受体，其可以赋予宿主细胞，例如免疫细胞以靶向特定抗原的能力。CAR可包括但不限于人工T细胞受体、T体、单链免疫受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体或其任何组合。在一些方面，CAR包含细胞内活化域、跨膜域和胞外域，其中所述胞外域包含抗原结合域。

在一些方面，所述CAR的抗原结合域包含抗体或抗体的抗原结合部分。在一些方面，所述CAR的抗原结合域包含scFv、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2、dAb或其任何片段或组合。在一些方面，所述CAR的抗原结合域特异性结合抗原。在一些方面，所述CAR的抗原结合域特异性结合肿瘤细胞上的一种或多种抗原。在一些方面，所述CAR的抗原结合域特异性结合一种或多种选自以下的抗原：CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原、突变型p53、突变型ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3组合、HER1-HER2组合、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)和其任何组合。

在一些方面，所述CAR包含跨膜域。任何跨膜域都可用于本文所公开的方法和组合物中。在一些方面，所述CAR包含来源于作为免疫细胞上的共受体的跨膜分子的跨膜域或免疫球蛋白超家族成员的跨膜域。在一些方面，所述CAR包含来源于CD28、CD8α、CD4或CD19的跨膜域的跨膜域。

在一些方面，所述CAR包含一个或多个共刺激信号传导区。在一些方面，所述共刺激信号传导区包含以下的信号传导区：CD28、OX-40、41BB、CD27、诱导型T细胞共刺激子(ICOS)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、Igα(CD79a)、Fcγ受体、FcR、CD137、DAP10或其任何组合。在一些方面，所述CAR还包含CD3ζ信号传导域。

在一些方面，所述CAR还包含铰链区。在一些方面，所述CAR包含源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28、CD8α或其任何组合的铰链区的铰链区。在一些方面，所述CAR包含IgG4铰链区。

在一些方面，所述免疫细胞，例如经扩增的免疫细胞(例如经扩增的γ/δT细胞和/或经扩增的NK细胞)经基因修饰以表达异源T细胞受体(TCR)。在一些方面，所述异源TCR能够结合肿瘤细胞上存在的一种或多种抗原。在一些方面，所述异源TCR能够结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原、突变型p53、突变型ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3组合、HER1-HER2组合、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)和其任何组合。

在一些方面，从细胞培养物中收获(例如分离和/或纯化)经扩增的免疫细胞。可使用任何方法收获经扩增的免疫细胞。在一些方面，经扩增的免疫细胞通过阳性或阴性选择来收获，包括但不限于使用抗体。在一些方面，使用针对CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD14、CD16、CD19和/或CD25的抗体收获经扩增的T细胞。在一些方面，使用细胞分选，例如流式细胞术来收获经扩增的免疫细胞。在一些方面，所述经扩增的免疫细胞与经照射的RAPC一起收获。

III.B.治疗方法

本公开的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括通过使免疫细胞群体与本文所公开的RAPC或RAPC群体接触来离体扩增所述免疫细胞群体；以及向所述受试者施用经扩增的免疫细胞群体。在一些方面，所述方法还包括在向所述受试者施用细胞之前分离经扩增的细胞群体。在一些方面，如本文所公开的，在向受试者施用之前将经扩增的细胞群体冷冻保存。

在一些方面，所述疾病或疾患包括癌症。在一些方面，所述癌症包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)或其任何组合。在一些方面，所述癌症包括淋巴瘤。在一些方面，所述癌症包括白血病。

在一些方面，所述方法还包括在施用免疫细胞群体之前预治疗受试者。在一些方面，在施用免疫细胞群体之前，向受试者施用化学疗法。在一些方面，在施用免疫细胞群体之前，向受试者施用免疫耗尽化学疗法。在一些方面，所述免疫耗尽化学疗法包含环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)或两者。

在一些方面，所述方法包括向所述受试者施用(i)经扩增的细胞群体和(ii)细胞因子。在一些方面，所述细胞因子包含IL-2、其类似物、其变体或其片段。

除非另外指示，否则本公开的实践将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook等人编(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编(1992)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编,(1985)DNA Cloning,第I卷和第II卷；Gait编(1984)OligonucleotideSynthesis；Mullis等人.美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins编(1984)Nucleic AcidHybridization；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)APractical Guide To Molecular Cloning；thetreatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring HarborLaboratory)；Wu等人编,Methods In Enzymology,第154卷和第155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1986))；Crooke,Antisense drug Technology:Principles,Strategiesand Applications,第2版CRC Press(2007)以及Ausubel等人(1989)Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。

上文所引用的所有参考文献以及本文所引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文。

以下实施例是以说明而非限制的方式提供。

实施例

实施例1.重组抗原呈递细胞的生成

将K562细胞(ATCC)在含有10％ FBS(Hyclone)的RPMI(Gibco)中培养。将人类4-1BB配体(4-1BBL)、OX40配体(OX40L)、膜结合的IL-15(mIL-15)和膜结合的IL-21(mIL-21)序列从头合成并克隆至具有EF1A启动子的慢病毒质粒中用于包装至LentiOne慢病毒载体(GegTech)中(图1A-1D)。RAPC1是通过将4-1BBL转导至K562细胞中生成；RAPC2是通过将4-1BBL和mIL-15转导至K562细胞中生成；RAPC3是通过将4-1BBL和mIL-21转导至K562细胞中生成；并且RAPC4是通过将4-1BBL、mIL-15、mIL-21和OX40L转导至K562细胞中生成。随后根据制造商的建议，通过用APC缀合的抗体和抗APC微珠进行标记，使用基于MACS磁珠的细胞分选来纯化细胞(图1E)。用抗4-1BBL抗体对于表达4-1BBL的细胞选择所有四个细胞系。恢复培养后，随后使用抗IL-15抗体对于表达IL-15的细胞选择RAPC2和RAPC4，并且使用抗IL-21抗体对于表达IL-21的细胞选择RAPC3和RAPC4。最后，使用抗OX40L抗体对于表达OX40L的细胞选择RAPC4。在每个连续选择轮次之后，使RAPC细胞在培养物中恢复。最初，RAPC用15μg/mL丝裂霉素C处理四小时并洗涤两次，随后与外周血(PB)来源和脐带血(CB)来源的γδT(gdT)和自然杀伤(NK)细胞共温育。或者，对于一些实验，RAPC在与NK细胞共温育之前通过在XRAD-iR160(Precision)上以100Gy进行X射线照射，以四个循环给予，每个循环25Gy。

外周血和脐带血来源的gdT和NK细胞的分离和扩增

经由将免疫磁珠与冷冻外周血(PB)或脐带血(CB)分离(STEMCELLTechnologies)，阳性选择γδ(gd)T细胞并且阴性选择NK细胞。将所选gdT和NK细胞与经丝裂霉素C预处理的RAPC2或RAPC4饲养细胞在含有10％ FBS(Corning)的RPMI(Gibco)中共温育。gdT培养物补充有IL-2(Peprotech，100IU/mL)和IL-21(Peprotech，30ng/mL)，并且NK培养物补充有IL-2(Peprotech，100IU/mL)。每两天用补充有IL-2和/或IL-21的半体积培养基更换物对细胞培养物进行更新。将细胞在G-Rex 6M孔板(Wilson Wolf)中培养四周，并且每7天重复通过共温育来活化饲养细胞。

额外实验中NK细胞的扩增

NK细胞是通过在含有15％ FBS(Gibco)的IMDM(Gibco)中以2:1的比率(RAPC:NK)用经照射的RAPC1或RAPC4饲养细胞来活化。RAPC1饲养细胞的培养基补充有IL-2(Peprotech，10ng/ml)、IL-7(Peprotech,，10ng/ml)和IL-15(Peprotech，10ng/ml)；RAPC4共温育的培养基补充有IL-2(10ng/ml)和IL-7(10ng/ml)。将细胞培养三天，并且随后在G-Rex 24孔板中再扩增四天，其中在培养第五天更换60％的培养基。将此活化和扩增循环重复三次，总共活化四轮。

流式细胞术

将用经丝裂霉素C处理的RAPC活化的CB源性和PB源性NK细胞用抗CD3和抗CD56染色，并在FACS Canto(BD)上运行。将额外实验中的NK细胞用抗CD3、抗CD56、抗CD16、抗CD30、抗CD94、抗NKG2D或抗NKp46染色，并通过流式细胞术分析以确定所有标志物的细胞表面表达。

体外细胞毒性测定

将用RAPC活化的CB源性和PB源性gdT和NK细胞与Capan2(胰腺腺癌细胞)、GSU(胃癌细胞)、HCT116(结肠直肠癌细胞)、HT55(结肠直肠癌细胞)、K562(慢性粒细胞白血病细胞)、Mia Paca2(胰腺腺癌细胞)、Nalm6(急性淋巴母细胞性白血病细胞)、OvCar3(卵巢腺癌细胞)、Raji(伯基特氏淋巴瘤细胞)或HT29VEC(结肠直肠癌细胞)(ATCC)以10:1、3:1、1:1或0.3:1的效应子与靶标的比率共温育24小时。通过基于流式细胞术的测定确定每个细胞系的杀伤百分比。对于额外的NK细胞实验，在第二轮RAPC4活化的第6天收获NK细胞，并且与Capan2、GSU、HCT116、Raji或HUVEC细胞(ATCC)以3:1、1:1、0.3:1或0.1:1的效应子与靶标的比率共温育24小时。杀伤百分比是通过Cell Titer Glo测定(Promega)确定。

实施例2.与RAPC共温育的免疫细胞具有改进的特性

使用上文所描述的方法成功生成RAPC系，即RAPC1、RAPC2、RAPC3和RAPC4，以便用慢病毒载体转导K562细胞并且依序纯化41BBL、OX40L、mIL-15和/或mIL-21(图1A-1E)。PB源性或CB源性NK细胞与经丝裂霉素C处理的RAPC2或RAPC4细胞共温育导致细胞从四轮连续活化和扩增中扩增>100倍(表2)；与RAPC4共温育的CB源性NK细胞在所有测试细胞中具有6830倍扩增的最高累积扩增。与同RAPC2细胞共温育的细胞相比，与RAPC4共温育的CB源性和PB源性NK细胞除了更高的总细胞扩增外还导致具有NK细胞表面表型(CD3-CD56+)的细胞百分比更高(图2A)，并且在24小时后对Nalm6和Raji具有更高的平均细胞杀伤功效(图2B)。

表2：与RAPC2和RAPC4共温育的CB-NK和PB-NK的总细胞生长(扩增倍数)。

PB源性或CB源性gdT细胞与经丝裂霉素C处理的RAPC2或RAPC4细胞共温育导致细胞从四轮连续活化和扩增中扩增>1,000倍，并且经由四轮活化和扩增持续扩增(表3)。用经丝裂霉素C处理的RAPC4活化的CB源性gdT细胞展示出对多种细胞系的内在细胞溶解性活性(图3)。

表3：通过与RAPC2和RAPC4饲养细胞共温育的脐带血(CB)和外周血(PB)源性gdT细胞的细胞扩增。

在额外实验中，将NK细胞与RAPC1和RAPC4细胞共温育，所述RAPC1和RAPC4细胞经100Gy总暴露量照射，以4个循环的25Gy照射给予。在这些培养条件下，与2:1的RAPC4:NK细胞比率共温育的NK细胞在四轮连续活化和扩增中扩增>15,000倍，高于与RAPC1饲养细胞共温育的NK细胞所实现的扩增(图4)。在通过与经照射的RAPC4细胞共温育而活化的NK细胞中评估细胞表面标志物，并且在活化后第7天和第11天评估时，群体具有低CD3和NKp46表达，其中NK细胞标志物CD56、CD16、CD30、CD94和NKG2D表达较高(图5)。用RAPC4饲养细胞活化的NK细胞随后用七种不同的CAR慢病毒载体转导，并且在转导与未转导(UTD)细胞之间的细胞扩增相似(表4)。此外，与经照射的RAPC4共温育的NK细胞展示出CAR介导的对多种癌细胞系的杀伤，包括Capan2(图6A)、GSU(图6B)和HCT116(图6C)细胞，取决于所包括的CAR。

表4：与经照射的RAPC4共温育的CAR-NK细胞的总细胞生长(扩增倍数)。

RAPC饲养细胞活化并支持从多个来源分离的gdT和NK细胞的稳健扩增。在使用丝裂霉素C处理或X射线照射阻断细胞增殖后并在多种培养条件下使用时，RAPC是有效的。gdT和NK细胞都展示出预期的细胞表面表型，并且在细胞杀伤测定中是有效的。

应了解，具体实施方式部分而非发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可阐述如发明人所预期的本公开的一个或多个但并非所有示例性实施方案，并且因此，不旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。

具体实施方案的前文描述将充分地揭示本公开的一般性质，以使得其他人通过应用本领域中的知识，在无过度实验并且不偏离本公开的一般范围的情况下，可轻易地针对各种应用对此类具体实施方案进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教导和指导，此类改变和修改旨在处于所公开实施方案的等同物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根据教导和指导进行解释。

本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据所附权利要求书和其等同物来定义。

在整个本申请中所引用的所有引用参考文献(包括文献参考文献、美国或外国专利或专利申请和网站)的内容特此通过引用明确并入，就如同出于任何目的将其全部写入本文一样，其中所引用的参考文献也是如此。当任何不一致出现时，以本文在字面上公开的材料为准。

尽管已说明并描述各种具体方面，但以上说明不具有限制性。应了解，各种改变可在不偏离本发明的精神和范围的情况下作出。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。

序列表

<110> 武田药品工业株式会社(TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED)

<120> 重组抗原呈递细胞

<130> 3817.085PC01

<150> US 63/180,530

<151> 2021-04-27

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类IL-21典型氨基酸序列

<400> 1

Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met

1 5 10 15

Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln

20 25 30

Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln

35 40 45

Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro

50 55 60

Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln

65 70 75 80

Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile

85 90 95

Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala

100 105 110

Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr

115 120 125

Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu

130 135 140

Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu

145 150 155 160

Asp Ser

<210> 2

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类IL-15典型氨基酸序列

<400> 2

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类4-1BBL典型氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 4

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类OX40L典型氨基酸序列

<400> 4

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

115 120 125

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 5

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类IL-21典型核酸序列

<400> 5

atgcgcagca gcccgggcaa catggaacgc attgtgattt gcctgatggt gatttttctg 60

ggcaccctgg tgcataaaag cagcagccag ggccaggatc gccatatgat tcgcatgcgc 120

cagctgattg atattgtgga tcagctgaaa aactatgtga acgatctggt gccggaattt 180

ctgccggcgc cggaagatgt ggaaaccaac tgcgaatgga gcgcgtttag ctgctttcag 240

aaagcgcagc tgaaaagcgc gaacaccggc aacaacgaac gcattattaa cgtgagcatt 300

aaaaaactga aacgcaaacc gccgagcacc aacgcgggcc gccgccagaa acatcgcctg 360

acctgcccga gctgcgatag ctatgaaaaa aaaccgccga aagaatttct ggaacgcttt 420

aaaagcctgc tgcagaaaat gattcatcag catctgagca gccgcaccca tggcagcgaa 480

gatagc 486

<210> 6

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类IL-15典型核酸序列

<400> 6

atgcgcatta gcaaaccgca tctgcgcagc attagcattc agtgctatct gtgcctgctg 60

ctgaacagcc attttctgac cgaagcgggc attcatgtgt ttattctggg ctgctttagc 120

gcgggcctgc cgaaaaccga agcgaactgg gtgaacgtga ttagcgatct gaaaaaaatt 180

gaagatctga ttcagagcat gcatattgat gcgaccctgt ataccgaaag cgatgtgcat 240

ccgagctgca aagtgaccgc gatgaaatgc tttctgctgg aactgcaggt gattagcctg 300

gaaagcggcg atgcgagcat tcatgatacc gtggaaaacc tgattattct ggcgaacaac 360

agcctgagca gcaacggcaa cgtgaccgaa agcggctgca aagaatgcga agaactggaa 420

gaaaaaaaca ttaaagaatt tctgcagagc tttgtgcata ttgtgcagat gtttattaac 480

accagc 486

<210> 7

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类4-1BBL典型核酸序列

<400> 7

atggaatatg cgagcgatgc gagcctggat ccggaagcgc cgtggccgcc ggcgccgcgc 60

gcgcgcgcgt gccgcgtgct gccgtgggcg ctggtggcgg gcctgctgct gctgctgctg 120

ctggcggcgg cgtgcgcggt gtttctggcg tgcccgtggg cggtgagcgg cgcgcgcgcg 180

agcccgggca gcgcggcgag cccgcgcctg cgcgaaggcc cggaactgag cccggatgat 240

ccggcgggcc tgctggatct gcgccagggc atgtttgcgc agctggtggc gcagaacgtg 300

ctgctgattg atggcccgct gagctggtat agcgatccgg gcctggcggg cgtgagcctg 360

accggcggcc tgagctataa agaagatacc aaagaactgg tggtggcgaa agcgggcgtg 420

tattatgtgt tttttcagct ggaactgcgc cgcgtggtgg cgggcgaagg cagcggcagc 480

gtgagcctgg cgctgcatct gcagccgctg cgcagcgcgg cgggcgcggc ggcgctggcg 540

ctgaccgtgg atctgccgcc ggcgagcagc gaagcgcgca acagcgcgtt tggctttcag 600

ggccgcctgc tgcatctgag cgcgggccag cgcctgggcg tgcatctgca taccgaagcg 660

cgcgcgcgcc atgcgtggca gctgacccag ggcgcgaccg tgctgggcct gtttcgcgtg 720

accccggaaa ttccggcggg cctgccgagc ccgcgcagcg aa 762

<210> 8

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人类OX40L典型核酸序列

<400> 8

atggaacgcg tgcagccgct ggaagaaaac gtgggcaacg cggcgcgccc gcgctttgaa 60

cgcaacaaac tgctgctggt ggcgagcgtg attcagggcc tgggcctgct gctgtgcttt 120

acctatattt gcctgcattt tagcgcgctg caggtgagcc atcgctatcc gcgcattcag 180

agcattaaag tgcagtttac cgaatataaa aaagaaaaag gctttattct gaccagccag 240

aaagaagatg aaattatgaa agtgcagaac aacagcgtga ttattaactg cgatggcttt 300

tatctgatta gcctgaaagg ctattttagc caggaagtga acattagcct gcattatcag 360

aaagatgaag aaccgctgtt tcagctgaaa aaagtgcgca gcgtgaacag cctgatggtg 420

gcgagcctga cctataaaga taaagtgtat ctgaacgtga ccaccgataa caccagcctg 480

gatgattttc atgtgaacgg cggcgaactg attctgattc atcagaaccc gggcgaattt 540

tgcgtgctg 549

Claims

1.一种重组抗原呈递细胞(RAPC)，所述重组抗原呈递细胞(RAPC)包含(i)一种或多种编码IL-21的核酸分子和(ii)一种或多种编码OX40L的核酸分子。

2.如权利要求1所述的RAPC，所述RAPC还包含(iii)一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。

3.如权利要求1或2所述的RAPC，所述RAPC还包含(iv)一种或多种编码IL-15的核酸分子。

4.如权利要求1至3中任一项所述的RAPC，所述RAPC表达(i)IL-21和(ii)OX40L。

5.如权利要求1至4中任一项所述的RAPC，所述RAPC表达(iii)4-1BBL。

6.如权利要求1至5中任一项所述的RAPC，所述RAPC表达(iv)IL-15。

7.如权利要求1至6中任一项所述的RAPC，其中所述IL-21是膜结合的IL-21。

8.如权利要求7所述的RAPC，其中所述膜结合的IL-21是包含人类IL-21多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。

9.如权利要求7或8所述的RAPC，其中所述膜结合的IL-21包含(i)所述人类IL-21多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区和(iv)跨膜域。

10.如权利要求6至9中任一项所述的RAPC，其中所述IL-15是膜结合的IL-15。

11.如权利要求10所述的RAPC，其中所述膜结合的IL-15是包含人类IL-15多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。

12.如权利要求10或11所述的RAPC，其中所述膜结合的IL-15包含(i)所述人类IL-15多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区和(iv)跨膜域。

13.如权利要求8至12中任一项所述的RAPC，其中所述Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。

14.如权利要求8至13中任一项所述的RAPC，其中所述Fc区是IgG4 Fc区。

15.如权利要求12至14中任一项所述的RAPC，其中所述铰链区包含免疫球蛋白铰链区或经修饰的免疫球蛋白铰链区。

16.如权利要求12至15中任一项所述的RAPC，其中所述铰链区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或CD8铰链区。

17.如权利要求12至16中任一项所述的RAPC，其中所述跨膜域包含CD4或CD8跨膜域。

18.如权利要求12至17中任一项所述的RAPC，所述RAPC包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体或具有附着于其上的IL-21、IL-15、OX-40L和4-1BBL中的一者或多者的固体支撑物。

19.如权利要求18所述的RAPC，其中所述固体支撑物选自珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物或其任何组合。

20.如权利要求1至19中任一项所述的RAPC，所述RAPC是K562细胞。

21.如权利要求1至20中任一项所述的RAPC，所述RAPC是经基因修饰的K562细胞。

22.一种RAPC群体，所述RAPC群体包含权利要求1至21中任一项所述的RAPC。

23.一种RAPC群体，所述RAPC群体包含第一RAPC和第二RAPC，其中：

(a)所述第一RAPC和所述第二RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子和一种或多种编码OX40L的核酸分子；或

(b)所述第一RAPC包含一种或多种编码IL-21的核酸分子，并且其中所述第二RAPC表达一种或多种编码OX40L的核酸分子。

24.如权利要求23所述的RAPC群体，其中所述第一RAPC、所述第二RAPC或两者还包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。

25.如权利要求23或21所述的RAPC群体，其中所述第一RAPC、所述第二RAPC或两者还包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。

26.如权利要求23至25中任一项所述的RAPC群体，所述RAPC群体还包含第三RAPC。

27.如权利要求26所述的RAPC群体，其中所述第三RAPC包含一种或多种编码4-1BBL的核酸分子。

28.如权利要求26或27所述的RAPC群体，其中所述第三RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。

29.如权利要求23至28中任一项所述的RAPC群体，所述RAPC群体还包含第四RAPC。

30.如权利要求29所述的RAPC群体，其中所述第四RAPC包含一种或多种编码IL-15的核酸分子。

31.如权利要求29或30所述的RAPC群体，其中所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物或其任何组合。

32.如权利要求31所述的RAPC群体，其中所述固体支撑物包含珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物或其任何组合。

33.如权利要求29至32中任一项所述的RAPC群体，其中所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合为K562细胞。

34.如权利要求29至33中任一项所述的RAPC群体，其中所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC、所述第四RAPC或其任何组合为经基因修饰的K562细胞。

35.一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与权利要求1至21中任一项所述的RAPC或权利要求22至34中任一项所述的RAPC群体接触。

36.一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与RAPC接触，其中所述RAPC表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述免疫细胞包含αβT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、泛γδT细胞、Vδ1γδT细胞、Vδ2γδT细胞、Vδ3γδT细胞或其任何组合。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述免疫细胞选自由以下组成的组：幼稚T细胞、干细胞记忆T细胞(Tscm)、中枢记忆T细胞(Tcm)、效应T细胞、效应记忆T细胞(Tem)、细胞毒性T细胞、辅助T细胞和其任何组合。

39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群体包含一种或多种经基因修饰的免疫细胞。

40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中在所述免疫细胞群体与所述RAPC接触之前对所述免疫细胞群体进行基因修饰。

41.如权利要求35至40中任一项所述的方法，其中在所述免疫细胞群体与所述RAPC接触之后对所述免疫细胞群体进行基因修饰。

42.如权利要求35至41中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群体包含一种或多种源自诱导性多能干细胞(iPSC)的免疫细胞。

43.如权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)或其组合。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述CAR或所述TCR能够结合肿瘤细胞上存在的一种或多种抗原。

45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述CAR或所述TCR能够结合选自由以下组成的组的抗原：CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原、突变型p53、突变型ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3组合、HER1-HER2组合、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)和其任何组合。

46.如权利要求35至45中任一项所述的方法，其中对所述免疫细胞群体进行扩增，直至所述免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹²、至少约1×10⁹至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁹至至少约1×10¹¹、至少约1×10¹⁰至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁷至至少约1×10¹⁰、至少约1×10⁸至至少约1×10¹⁰、或至少约1×10⁹至至少约1×10¹⁰个免疫细胞。

47.如权利要求35至46中任一项所述的方法，其中对所述免疫细胞群体进行扩增，直至所述免疫细胞群体中的免疫细胞的总数目为至少约1×10⁷、至少约5×10⁷、至少约1×10⁸、至少约5×10⁸、至少约1×10⁹、至少约2×10⁹、至少约3×10⁹、至少约4×10⁹、至少约5×10⁹、至少约6×10⁹、至少约7×10⁹、至少约8×10⁹、至少约9×10⁹、至少约1×10¹⁰、至少约2×10¹⁰、至少约3×10¹⁰、至少约4×10¹⁰、至少约5×10¹⁰、至少约6×10¹⁰、至少约7×10¹⁰、至少约8×10¹⁰、至少约9×10¹⁰、至少约1×10¹¹、至少约2×10¹¹、至少约3×10¹¹、至少约4×10¹¹、至少约5×10¹¹、至少约6×10¹¹、至少约7×10¹¹、至少约8×10¹¹、至少约9×10¹¹或至少约1×10¹²个免疫细胞。

48.如权利要求35至47中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群体是从供体受试者分离的。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述供体受试者为人类。

50.如权利要求48或49所述的方法，其中所述供体受试者患有癌症。

51.如权利要求35至50中任一项所述的方法，所述方法还包括纯化经扩增的免疫细胞群体。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述经扩增的免疫细胞群体包含α/βT细胞、γ/δT细胞、NK细胞或其组合的群体。

53.如权利要求51或52所述的方法，所述方法还包括向有需要的受试者施用所述经扩增的免疫细胞群体。

54.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括(i)通过使免疫细胞群体与权利要求1至21中任一项所述的RAPC或权利要求22至34中任一项所述的RAPC群体接触来离体扩增所述免疫细胞群体；(ii)纯化经扩增的免疫细胞群体；以及(iii)向所述受试者施用所述经扩增的免疫细胞群体。

55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

56.如权利要求50或55所述的方法，其中所述癌症包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)或其任何组合。

57.如权利要求50、55和56中任一项所述的方法，其中所述癌症包括淋巴瘤或白血病。

58.一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群体与白细胞介素-21(IL-21)和OX40L接触。

59.如权利要求58所述的方法，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与重组抗原呈递细胞(RAPC)接触。

60.一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使T细胞群体与RAPC、IL-21和OX40L接触。

61.如权利要求58至60中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与4-1BB配体(4-1BBL)接触。

62.如权利要求58至61中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与白细胞介素-15(IL-15)接触。

63.如权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达IL-21、OX40L、4-1BBL、IL-15或其任何组合。

64.如权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达IL-21。

65.如权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达OX40L。

66.如权利要求59至65中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达4-1BBL。

67.如权利要求59至66中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达IL-15。

68.如权利要求59至67中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达IL-21和OX40L，其中将所述免疫细胞群体在培养基中培养，并且其中所述培养基包含4-1BBL和IL-15。

69.如权利要求59至68中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达IL-21、OX40L和4-1BBL，其中将所述免疫细胞群体在培养基中培养，并且其中所述培养基包含IL-15。

70.如权利要求59至68中任一项所述的方法，其中所述RAPC表达IL-21、OX40L和IL-15，其中将所述免疫细胞群体在培养基中培养，并且其中所述培养基包含4-1BBL。

71.如权利要求59至70中任一项所述的方法，其中所述RAPC包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物或其任何组合。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述固体支撑物包含珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物或其任何组合。

73.如权利要求59至71中任一项所述的方法，其中所述RAPC是经基因修饰的K562细胞。

74.一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使T细胞群体与IL-21和第一RAPC接触，其中所述第一RAPC表达OX40L。

75.如权利要求74所述的方法，其中将所述免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含所述IL-21。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述IL-21与珠粒结合。

77.如权利要求74所述的方法，其中所述IL-21由第二RAPC表达。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述第一RAPC与所述第二RAPC不同。

79.如权利要求77或78所述的方法，其中所述第一RAPC与所述第二RAPC相同。

80.如权利要求74至79中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与OX40L接触。

81.如权利要求80所述的方法，其中将所述免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含所述OX40L。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述OX40L与珠粒结合。

83.如权利要求80所述的方法，其中所述OX40L由第三RAPC表达。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述第三RAPC不同于所述第一RAPC和所述第二RAPC。

85.如权利要求83所述的方法，其中所述第三RAPC与所述第一RAPC相同，其中所述第三RAPC与所述第二RAPC相同，或其中所述第三RAPC与所述第一RAPC和所述第二RAPC相同。

86.如权利要求74至85中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述免疫细胞群体与IL-15接触。

87.如权利要求86所述的方法，其中将所述免疫细胞群体在培养基中培养，其中所述培养基包含所述IL-15。

88.如权利要求87所述的方法，其中所述IL-15与珠粒结合。

89.如权利要求86所述的方法，其中所述IL-15由第四RAPC表达。

90.如权利要求89所述的方法，其中所述第四APC不同于所述第一RAPC、所述第二RAPC和所述第三RAPC。

91.如权利要求89所述的方法，其中所述第四RAPC与所述第一RAPC相同；其中所述第四RAPC与所述第二RAPC相同；其中所述第四RAPC与所述第三RAPC相同；其中所述第四RAPC与所述第一RAPC和所述第二RAPC相同；其中所述第四RAPC与所述第二RAPC和所述第三RAPC相同；其中所述第四RAPC与所述第一RAPC和所述第三RAPC相同；或其中所述第四RAPC与所述第一RAPC、所述第二RAPC和所述第三RAPC相同。

92.一种离体扩增免疫细胞群体的方法，所述方法包括使T细胞群体与RAPC接触，其中所述RAPC表达IL-21、OX40L、4-1BBL和IL-15。

93.如权利要求74至92中任一项所述的方法，其中所述第一RAPC、所述第二RAPC、所述第三RAPC或所述第四RAPC中的一者或多者包含树突状细胞、工程化的克隆细胞系、天然来源的癌细胞系、基于珠粒的人工抗原呈递细胞、含有人工脂质囊泡或其他脂质双层的系统、外泌体、固体支撑物或其任何组合。

94.如权利要求93所述的方法，其中所述固体支撑物包含珠粒、球形或非球形纳米粒子支撑物、碳纳米管支撑物、磁性粒子支撑物、丝状聚合物支撑物、二维支撑物或其任何组合。

95.如权利要求74至94中任一项所述的方法，其中所述RAPC是经基因修饰的K562细胞。

96.如权利要求58至95中任一项所述的方法，其中所述IL-21是包含人类IL-21多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。

97.如权利要求96所述的方法，其中所述IL-21包含(i)所述人类IL-21多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区和(iv)跨膜域。

98.如权利要求63至73和86至97中任一项所述的方法，其中所述IL-15是包含人类IL-15多肽和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。

99.如权利要求98所述的方法，其中所述IL-15包含(i)所述人类IL-15多肽、(ii)铰链区、(iii)免疫球蛋白的Fc区和(iv)跨膜域。

100.如权利要求96至99中任一项所述的方法，其中所述Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。

101.如权利要求96至100中任一项所述的方法，其中所述Fc区是IgG4 Fc区。

102.如权利要求97至101中任一项所述的方法，其中所述铰链区包含免疫球蛋白铰链区或经修饰的免疫球蛋白铰链区。

103.如权利要求97至102中任一项所述的方法，其中所述铰链区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或CD8铰链区。

104.如权利要求97至103中任一项所述的方法，其中所述跨膜域包含CD4或CD8跨膜域。

105.如权利要求58至104中任一项所述的方法，其中对所述免疫细胞群体进行扩增，直至所述T细胞群体中的T细胞的总数目为至少约1×10⁷至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹²、至少约1×10⁹至至少约1×10¹²、至少约1×10⁸至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁹至至少约1×10¹¹、至少约1×10¹⁰至至少约1×10¹¹、至少约1×10⁷至至少约1×10¹⁰、至少约1×10⁸至至少约1×10¹⁰、或至少约1×10⁹至至少约1×10¹⁰个T细胞。

106.如权利要求58至104中任一项所述的方法，其中对所述免疫细胞群体进行扩增，直至所述T细胞群体中的T细胞的总数目为至少约1×10⁷、至少约5×10⁷、至少约1×10⁸、至少约5×10⁸、至少约1×10⁹、至少约2×10⁹、至少约3×10⁹、至少约4×10⁹、至少约5×10⁹、至少约6×10⁹、至少约7×10⁹、至少约8×10⁹、至少约9×10⁹、至少约1×10¹⁰、至少约2×10¹⁰、至少约3×10¹⁰、至少约4×10¹⁰、至少约5×10¹⁰、至少约6×10¹⁰、至少约7×10¹⁰、至少约8×10¹⁰、至少约9×10¹⁰、至少约1×10¹¹、至少约2×10¹¹、至少约3×10¹¹、至少约4×10¹¹、至少约5×10¹¹、至少约6×10¹¹、至少约7×10¹¹、至少约8×10¹¹、至少约9×10¹¹或至少约1×10¹²个T细胞。

107.如权利要求58至106中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群体是从供体受试者获得。

108.如权利要求107所述的方法，其中所述供体受试者为人类。

109.如权利要求107或108所述的方法，其中所述供体受试者患有癌症。

110.如权利要求58至109中任一项所述的方法，所述方法还包括向有需要的受试者施用所述免疫细胞群体。

111.如权利要求58至110中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含αβT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、泛γδT细胞、Vδ1γδT细胞、Vδ2γδT细胞、Vδ3γδT细胞或其任何组合。