JP2022513148A - Ｔ細胞の改変 - Google Patents

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Abstract

本発明は、異種組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び異種組換え補助受容体を含む改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を提供し、さらに、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を作製する方法及び癌の治療におけるそれらの使用が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞傷害活性を増すためのＴ細胞の改変、及び例えば癌の治療に対する免疫療法における改変Ｔ細胞の使用に関する。
免疫療法は、長期生存の見込みを伴ってまさに癌治療の展望を変えようとしている（非特許文献１）。患者集団及び腫瘍型の範囲を拡張する新しい免疫調節薬には、明確な未だ満たされていない医療ニーズが存在する。さらに、抗腫瘍応答の大きさ及び持続時間を高めるには新しい作用物質が必要とされる。これらの作用物質の開発は、過去２０年間にわたるＴ細胞免疫を制御する基本原理の掘り下げた理解のおかげで可能となった（非特許文献２）。これには典型的には、ＭＨＣ分子によって提示された腫瘍関連ペプチド抗原を認識する腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が必要とされる。種々のワクチン接種方略及びｅｘ ｖｉｖｏで拡大させた腫瘍浸潤リンパ球の養子移植により、幾つかの場合には、腫瘍特異的Ｔ細胞が後期癌を治療する能力が実証された（非特許文献３）。しかしながら、腫瘍抗原に対する高い寛容と腫瘍部位にしばしば存在する強力な免疫抑制微小環境とが組み合わさると、Ｔ細胞抗腫瘍活性の最適には及ばない活性化で現れる。したがって、高親和性Ｔ細胞を欠く個体は、自己抗原に対するＴ細胞寛容のために、抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４等の免疫チェックポイント遮断療法に奏効を示さない場合がある。
遺伝子工学は、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の作製によって、腫瘍抗原に対する内因性の高親和性Ｔ細胞の存在比率が低いという問題を克服し、チェックポイント阻害剤による治療に奏効を示さない患者に臨床的利益をもたらすのに役立つことができる。このアプローチは、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－Ａ３及びＮＹ－ＥＳＯ－１を含む幾つかの抗原について、野生型ＴＣＲのそれらの天然リガンドペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体に対する親和性をｉｎ ｖｉｔｒｏで１０倍～１０００倍増加させることが分かっている（非特許文献４、非特許文献５）。
より高い親和性のＴＣＲは、Ｔ細胞がより低いレベルの抗原に応答することを可能にし、これは、腫瘍微小環境が抗原発現を低下させ、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を減らすように適応された場合に重要である（非特許文献６、非特許文献７）。Ｔ細胞が腫瘍に向かうリダイレクトは、ＴＣＲ操作Ｔ細胞療法を介して又はＴ細胞リダイレクト生物製剤を用いて実現されている（非特許文献８、非特許文献９）。
Ｔ細胞療法は、一部の再発腫瘍又は高リスク腫瘍の治療に治癒可能性を示した（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。現在、患者のＴ細胞を遺伝子操作して腫瘍抗原を認識するのに使用される方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び親和性成熟ＴＣＲを含めて２つ存在する。しかしながら、ＣＡＲは細胞表面上のエピトープのみを標的とするように限定されている。ＴＣＲベースの治療薬は細胞表面タンパク質だけでなく、細胞内タンパク質を認識することもできる。さらに、ＴＣＲアプローチは、内因性シグナル伝達分子の動員及びＴ細胞とそれらの特定の標的との間の時空間相互作用により、Ｔ細胞の天然の機能をより厳密に模倣している。しかしながら、ＴＣＲアプローチは、ＴＣＲにより認識される適切なＭＨＣ拘束性を共有する個体に限定され、並行してＨＬＡ型及び抗原発現の両方についての患者選択アッセイを開発することが必要とされる可能性がある。
ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は、ＣＤ８（分化クラスター８）と呼ばれる糖タンパク質によって安定化され、これが続いてＳｒｃファミリーキナーゼＬｃｋを動員し、シグナル伝達を増強する。ＣＤ８がＭＨＣクラスＩの定常部分に結合すると、結合親和性の増加と標的細胞上の抗原に対する応答の閾値の減少とがもたらされる（非特許文献１３、非特許文献１４）。ＣＤ８導入遺伝子をＴＣＲレンチウイルスベクターに追加することで、ＣＤ４＋Ｔ細胞に同様の応答の増加をもたらし得ることから、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞にヘルパー機能を与える能力が強化されるだけでなく、追加の直接的な腫瘍細胞殺傷も強化され、結果的におそらく臨床効果の増強がもたらされる。ＣＤ８α／ＣＤ８β（分化クラスター８）は、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び樹状細胞によって発現されるヘテロ二量体膜貫通型糖タンパク質である。ＣＤ８α／ＣＤ８βは、クラスＩペプチド－主要組織適合抗原（ｐＭＨＣ、ヒトではこれらは通常、ペプチド－ヒト白血球抗原、すなわちｐＨＬＡと記載される）上の保存領域に結合し、こうしてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によるＭＨＣペプチド特異的結合の包括的な補助受容体（共受容体；co-receptor）として機能する。ＣＤ８α／ＣＤ８βは成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞には見られず、これらの抗原特異的ＴＣＲは、関連するが異なるクラスＩＩ ｐＭＨＣ抗原に結合し、ＣＤ４ホモ二量体はＴＣＲ補助受容体として機能する。
補助受容体依存性ＴＣＲの最も一般的なタイプは、αポリペプチド鎖及びβポリペプチド鎖を有するヘテロ二量体膜貫通型糖タンパク質である。α／β ＴＣＲがクラスＩ ｐＭＨＣ抗原に結合すると、それにより細胞傷害性Ｔ細胞によるｐＭＨＣ発現標的細胞の殺傷を含む多数の細胞イベントを活性化するリン酸化イベントの細胞内シグナル伝達カスケードが誘発される。このシグナル伝達カスケードは、Ｌｃｋ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）によるＴＣＲ結合ＣＤ３膜貫通型タンパク質のリン酸化によって開始される。
ＣＤ８α／ＣＤ８βとＬｃｋとの間の細胞内会合は、ＴＣＲシグナル伝達を増強すると考えられている。ヒトでは、ＣＤ８α／ＣＤ８βヘテロ二量体に加えて、ＣＤ８＋細胞のおよそ３分の１がＣＤ８α／ＣＤ８βホモ二量体形も提示する。一部の腸Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びγ／δ Ｔ細胞では、このホモ二量体形しか見られない。ヒトにおいて、このＣＤ８αホモ二量体が完全に機能的にＣＤ８α／ＣＤ８βヘテロ二量体を代替し得ることを証拠が示唆している（非特許文献１５）。
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＴＣＲ及びＣＤ８二量体がクラスＩ ｐＨＬＡに共に結合すると、Ｔ細胞クローンの胸腺の正の選択／負の選択に影響が及ぼされる。この選択がこれらのＴ細胞クローンによって発現されるＴＣＲのｐＨＬＡ抗原親和性を決める。概して、病原体関連ｐＨＬＡ反応性Ｔ細胞クローンにおけるＴＣＲ抗原親和性は、癌関連抗原を認識する同等のＴ細胞クローンよりも高い。ＴＣＲ親和性増強技術は、癌反応性ＴＣＲの親和性を高めて、病原体反応性ＴＣＲの親和性に近づけることができる。ＴＣＲ親和性のこれらの増加により、通常はＣＤ８補助受容体に依存しないＴＣＲが得られる。これらのＴＣＲを発現する遺伝子発現ベクターによるＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞形質導入により、そうでなければ通常クラスＩＩ特異的ペプチド抗原によって活性化することしかできないキラー機能及びヘルパー機能を有するクラスＩ ｐＨＬＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の新規の実体が作り出される（非特許文献１６）。これらのＴＣＲにより、Ｔ細胞は野生型の親ＴＣＲよりも効率的にそれらの癌標的細胞を認識することが可能となる。重要なことには、ｐＨＬＡ抗原特異性はＣＤ８＋Ｔ細胞においてさえも、つまり内因性ＣＤ８補助受容体の存在下でさえも維持される。
補助受容体に依存しないとは、これらの親和性増強ＴＣＲがＣＤ４＋Ｔ細胞でも或る程度まで機能し得ることを意味するが、ＣＤ４＋Ｔ細胞での最適なＴＣＲ親和性がＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴＣＲ親和性よりも高いことは明らかである（非特許文献１６）。患者における抗腫瘍応答の大きさ及び持続時間を高める新しい改善されたＴＣＲベースの治療薬が必要とされ続けている。
McDermott et al., Cancer Treat Rev. 2014 Oct; 40(9): 1056-64 Sharma and Allison, Cell. 2015 Apr 9; 161(2): 205-14 Rosenberg et al., Nat Med. 2004 Sep; 10(9): 909-15 Li et al., Nat Biotechnol. 2005 Mar; 23(3): 349-54 Robbins et al., J Immunol. 2008 May 1; 180(9): 6116-31. Barrett and Blazar, N Engl J Med. 2009 Jul 30; 361(5): 524-5 Marincola et al., Adv Immunol. 2000; 74: 181-273 Bossi et al., Cancer Immunol Immunother. 2014 May; 63(5): 437-48 Fan et al., J Hematol Oncol. 2015 Dec 21; 8: 130 Dudley et al., J Immunother. 2003 Jul-Aug; 26(4): 332-42 Dudley et al., J Clin Oncol. 2005 Apr 1; 23(10): 2346-57 Kalos et al., Sci Transl Med. 2011 Aug 10; 3(95): 95ra73 Gao, Nature. 1997 Jun 5; 387(6633): 630-4 Artyomov et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Sep 28; 107(39): 16916-21 Cole et al., Immunology. 2012 Oct; 137(2): 139-48 Tan et al., Clin Exp Immunol. 2017 Jan; 187(1): 124-137
本発明者らは、異種Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞における異種ＣＤ８補助受容体の共発現がＴ細胞の活性を高めることを確認した。
本発明の第１の態様は、異種ＣＤ８補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を提供する。
好ましくは、異種ＴＣＲは、癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＨＬＡ（ｐＨＬＡ）に特異的に結合する。本発明によれば、異種ＴＣＲは、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、腫瘍細胞又は癌細胞によって好ましくは発現されるＨＬＡ上に任意に提示される抗原、好ましくは癌抗原又は腫瘍抗原のペプチド、抗原性ペプチド又はペプチド断片（ｐＨＬＡ）に特異的に結合し得る。本発明によれば、腫瘍抗原は、癌精巣抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）、ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫で優先的に発現される抗原）、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６／ＨＰＶ－Ｅ７（ヒトパピローマウイルス）、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、サイログロビン（Thyroglobin）、ＴＧＦＢＩＩフレームシフト抗原、ＬＡＧＥ－１Ａ、ＫＲＡＳ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、及びＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、又はＭＡＧＥ－Ａ１２であり得る。好ましくは、腫瘍抗原はＭＡＧＥ－Ａ４である。好ましくは、腫瘍抗原ペプチド断片は、アミノ酸配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを有する。本発明によれば、ＴＣＲは腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＨＬＡ（ｐＨＬＡ）に特異的に結合することができ、ここで、ＨＬＡは、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ、好ましくはＨＬＡクラスＩである。好ましくは、ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ２若しくはＨＬＡ－Ａ＊０２、又はＨＬＡ－Ａ２＋若しくはＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２０１である。
１つ以上の改変Ｔ細胞は、ＴＣＲをコードする異種核酸及びＣＤ８補助受容体をコードする異種核酸を含み得るか、又はＴＣＲ及び異種ＣＤ８補助受容体をコードする異種核酸を含み得る。
好ましくは、改変Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、又は改変Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞、若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含む若しくはそれらからなる。
好ましくは、ＣＤ８補助受容体はＣＤ８α補助受容体である。ＣＤ８α補助受容体は、配列番号１のアミノ酸配列又はその変異体を含み得る。ＣＤ８α補助受容体はホモ二量体ＣＤ８ααであり得る。代替的には、ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８αβ補助受容体ヘテロ二量体を含み得る。
異種ＴＣＲは、親和性増強ＴＣＲ、例えば特異的ペプチド強化受容体（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲであり得る。親和性増強ＴＣＲ又は特異的ペプチド強化受容体（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲである異種ＴＣＲは、抗原性ペプチドに対する特異性及び／又は活性を最適化し、及び／又は任意にＨＬＡに提示される場合に交差反応性及び／又はアロ反応性のリスクを減らすように操作され得る。したがって、（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲ特異性を、各アミノ酸でのあらゆる他の可能なアミノ酸による組み合わせの置換を使用してＴＣＲを含むＴ細胞の応答を抗原性ペプチドの合成変異体のパネルにマッピングすることによって評価して（Ｘ－Ｓｃａｎ）、ヒトプロテオーム及び一般的な病原体プロテオームにおける潜在的に交差反応性のペプチドを特定することができる。次いで、（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲを、複数の器官系からの正常な（非腫瘍）初代細胞、人工多能性幹細胞由来細胞（ｉＣｅｌｌ）、及び自己全血に対してスクリーニングすることで、オフターゲット反応性について試験することができ、広範囲のＨＬＡ分子を発現するＥＢＶ由来Ｂリンパ芽球細胞系統のパネルに対してスクリーニングすることで、交差反応性及び／又はアロ反応性のリスクを評価することができる。アロ反応性は、ＨＬＡアレルを発現する抗原陰性細胞において排除アレルの存在を特定するアッセイによって決定される。それにより、交差反応性及び／又は規定のＨＬＡアレル排除を伴わずに抗原性ペプチドに特異的であるように選択された異種ＴＣＲを有するＴ細胞が作製され得る。ＴＣＲ又は異種ＴＣＲを発現するＴ細胞は、本明細書に記載されるように、任意にＨＬＡに提示された抗原性ペプチドへの結合親和性及びアビディティについて更に選択され得る。ＴＣＲ又は異種ＴＣＲを発現するＴ細胞はまた、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞増殖、２Ｄ培養及び３Ｄ培養での抗原陽性腫瘍系統に応答したＩＦＮ－γ放出及び細胞傷害性、並びに新たに調製された抗原陽性原発腫瘍材料に応答したサイトカイン放出を含む様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって評価される効力について更に選択され得る。
本発明の第２の態様は、Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を作製する方法であって、Ｔ細胞又はＴ細胞の集団を、本発明による異種ＣＤ８補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体を発現するように改変することを含む、方法を提供する。
Ｔ細胞又はＴ細胞の集団は、任意に腫瘍又は癌を含む個体から取得され得る。
Ｔ細胞は、ＴＣＲをコードする核酸及びＣＤ８補助受容体をコードする核酸をＴ細胞に導入することによって又は本発明による異種ＴＣＲ及び異種ＣＤ８補助受容体をコードする異種核酸を導入することによって改変され得る。
本発明の第３の態様は、第１の態様による又は第２の態様の方法によって作製されたＴ細胞又は改変Ｔ細胞の集団と、薬学的に許容可能な添加剤とを含む医薬組成物を提供する。
本発明の第４の態様は、癌を治療する方法であって、治療を必要とする個体に、第１の態様による若しくは第２の態様の方法によって作製された改変Ｔ細胞の集団、又は第３の態様の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
改変Ｔ細胞の集団のＴＣＲは、個体における腫瘍又は癌細胞に、任意に高い親和性及び／又は高いアビディティで特異的に及び／又は選択的に結合することができる。例えば、上記ＴＣＲは、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、腫瘍細胞又は癌細胞によって好ましくは発現されるＨＬＡ上に任意に提示される抗原、好ましくは癌抗原又は腫瘍抗原のペプチド、抗原性ペプチド又はペプチド断片（ｐＨＬＡ）に結合し得る又は特異的に及び／又は選択的に結合し得る。
本発明の第５の態様は、個体における癌を治療する方法であって、
ドナー個体から取得されたＴ細胞の集団を準備することと、
Ｔ細胞の集団を、異種ＣＤ８補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体を発現するように改変し、それにより本発明による改変Ｔ細胞の集団を作製することと、
改変Ｔ細胞の集団をレシピエント個体に投与することと、
を含む、方法を提供する。
本発明並びに第４の態様及び第５の態様によれば、癌は、任意にＭＡＧＥタンパク質又はペプチド、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質又はペプチドを発現する、滑膜肉腫、粘液型／円形細胞脂肪肉腫（ＭＲＣＬＳ）、頭頸部癌、頭頸部ＳＣＣ（扁平上皮癌）、黒色腫、食道癌、卵巣癌、胃癌（胃部）、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌、大細胞癌）、転移性又は進行性ＮＳＣＬＣ、尿路上皮癌又は腫瘍、食道胃接合部癌（ＥＧＪ）であり得る。代替的に、癌は、肝臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、転移性胃部癌、転移性胃癌、転移性肝臓癌、転移性卵巣癌、転移性膵臓癌、転移性結腸直腸癌、転移性肺癌、結腸直腸癌又は結腸直腸腺癌、肺癌又は肺腺癌、膵臓癌又は膵臓腺癌、粘液性腺腫、膵管癌のいずれか１つであり得る。
ドナー個体及びレシピエント個体は同一であり得るか（すなわち、自家治療；或る個体から改変Ｔ細胞を取得し、後にその個体を該改変Ｔ細胞で治療する）、又はドナー個体及びレシピエント個体は相違し得る（すなわち、同種異系治療；改変Ｔ細胞を或る個体から取得し、これを引き続き異なる個体の治療に使用する）。自家とは、或る被験体に由来する任意の材料が後に同じ被験体に再導入されることを指す。
本発明の第６の態様は、第４の態様若しくは第５の態様の方法で使用される、第１の態様による若しくは第２の態様に従って作製された改変Ｔ細胞の集団、又は第３の態様の医薬組成物、並びに第４の態様若しくは第５の態様の方法で使用される医薬の製造における、第１の態様による若しくは第２の態様に従って作製された改変Ｔ細胞の集団、又は第３の態様の医薬組成物の使用を提供する。
本発明の第７の態様は、本発明による異種ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を、任意にそれぞれＴＣＲのα鎖及びβ鎖をコードする単一のオープンリーディングフレーム内に又は異なる及び／又は複数のオープンリーディングフレーム内に含む、及び／又は本発明による異種ＣＤ８補助受容体をコードするヌクレオチド配列を、任意にそれぞれＣＤ８のα鎖又はα鎖及びβ鎖をコードする単一のオープンリーディングフレーム内に又は異なるオープンリーディングフレーム内に含む、単離された核酸を提供する。代替的に、ＴＣＲ及び／又はＣＤ８補助受容体の鎖は、別個の核酸上にコードされ得る。
本発明の第８の態様は、第７の態様の単離された核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、本発明の核酸のコードされたＴＣＲ及びＣＤ８補助受容体の発現のための調節エレメントを更に含み得る発現ベクターであり得る。さらに、本発明は、本発明によるＴＣＲのα鎖をコードする核酸又はヌクレオチド配列を含む第１のコンストラクト又はベクター、及び／又は本発明によるＴＣＲのβ鎖をコードする核酸を含む第２のコンストラクト又はベクター、及びＣＤ８補助受容体のα鎖及び／又はβ鎖をコードする核酸を含む第３及び／又は第４のコンストラクト又はベクターを提供する。さらに、本発明は、好ましくはウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、又はＶＳＶｇ偽型レンチウイルスベクター等のレンチウイルスベクターであり得る、本発明の（単離された）核酸又はヌクレオチド配列を含むコンストラクト又はベクターを提供する。好ましくは、コンストラクト又はベクターは、任意に改変Ｔ細胞における、本発明のＴＣＲ及び／又はＣＤ８補助受容体をコードする本発明の核酸又はヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を駆動する効果的な調節エレメントを含む。
好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、又はＶＳＶｇ偽型レンチウイルスベクター等のレンチウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターであり得る。
本発明の第９の態様は、第７の態様の単離された核酸及び／又は第８の態様のベクターを含むウイルス粒子を提供する。
本発明の第１０の態様は、ウイルス粒子、任意に第９の態様によるウイルス粒子を作製する方法であって、
哺乳動物細胞を、第８の態様のウイルスベクター並びに１つ以上のウイルスパッケージングベクター及びエンベロープベクターにより形質導入することと、
形質導入された細胞を培養培地中で、該細胞がウイルス粒子、任意に培地中に放出されるレンチウイルス粒子を生成するように培養することと、
を含む、方法を提供する。
例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ウイルスパッケージングエレメント及びエンベロープエレメントをコードするプラスミド、並びに本発明の核酸又はヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターでトランスフェクションされ得る。本発明によれば、本発明の核酸又はヌクレオチド配列を含むＶＳＶｇ偽型ウイルスベクターは、偽型ウイルス粒子を生成する水疱性口内炎ウイルスのウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶｇ）と組み合わせて作製され得る。
さらに、本発明は、本発明によるＴ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を作製する方法であって、任意に態様９による又は態様１０に従って作製されるウイルス粒子内に含まれている、態様７による核酸の１コピー若しくは２コピー以上及び／又は態様８によるベクターをＴ細胞又はＴ細胞の集団に導入することにより、Ｔ細胞又はＴ細胞の集団を、本発明による異種ＣＤ８補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体を発現するように改変することを含む、方法を提供する。
本発明のこれらの及びその他の態様及び実施形態を以下でより詳細に記載する。
本発明のこれらの及びその他の態様及び実施形態を以下でより詳細に記載する。
詳細な説明
本発明は、異種ＣＤ８補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する改変Ｔ細胞、並びにそれらの作製方法及び使用に関する。
Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす白血球である。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球と区別され得る。Ｔ細胞には幾つかの種類があり、それぞれが異なる機能を有する。
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、ＣＤ４表面糖タンパク質を発現することから、ＣＤ４＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は適応免疫系に重要な役割を果たし、Ｔ細胞サイトカインを放出すること、及び免疫応答を抑制する又は調節するのを支援することによって他の免疫細胞の活性を支援する。ヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及び成長に必須である。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、キラーＴ細胞）は、ＣＤ８表面糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊するように作用する。ほとんどのＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子によって感染した細胞又は損傷した細胞の表面上に提示される特異抗原を認識することができるＴＣＲを発現する。抗原及びＭＨＣ分子へのＴＣＲ及びＣＤ８糖タンパク質の特異的結合は、感染した細胞又は損傷した細胞のＴ細胞によって媒介される破壊に結び付く。
本明細書に記載されるように使用されるＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合された集団であり得る。したがって、改変Ｔ細胞は、改変Ｔ細胞、任意にＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞、又は改変Ｔ細胞、任意にＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団、又はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合された集団であり得る。
本明細書に記載される使用に適したＴ細胞をドナー個体から得てもよい。幾つかの実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載される改変及び拡大の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体と同じ人物でもよい（自家治療）。他の実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載される改変及び拡大の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体とは異なる人物であってもよい（同種異系治療）。例えば、ドナー個体は、（提供の前又はその後のいずれかで）癌を患うレシピエント個体とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致している健康な個体であってもよい。
本明細書に記載される方法は、個体からＴ細胞を得る工程、及び／又は個体、任意に腫瘍及び／又は癌を伴う個体から得られた試料からＴ細胞を単離する工程を含んでもよい。
Ｔ細胞の集団は血液試料から単離され得る。Ｔ細胞の単離に適した方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：例えば、Rheinherz et al (1979) PNAS 76 4061を参照されたい）、細胞パニング（panning）（例えば、Lum et al (1982) Cell Immunol 72 122を参照されたい）、及び抗体被覆磁気ビーズを使用する単離（例えば、Gaudernack et al 1986 J Immunol Methods 90 179を参照されたい）が挙げられる。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞は、血液試料から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離され得る。ＰＢＭＣは標準的な技術を使用して、血液試料から抽出されてもよい。例えば、勾配遠心分離と組み合わせてフィコール（ficoll）を使用し（Boeyum A. Scand J Clin Lab Invest. 1968; 21(Suppl.97):77-89）、全血を血漿の最上層、続いて、ＰＢＭＣの層、及び多核白血球及び赤血球の底の画分に分離してもよい。幾つかの実施形態では、ＰＢＭＣはＣＤ１４＋細胞（単球）が枯渇していてもよい。
単離に続いて、Ｔ細胞を活性化してもよい。Ｔ細胞の活性化に適した方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、単離されたＴ細胞をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストに曝露してもよい。好適なＴＣＲアゴニストとして、樹状細胞等の抗原提示細胞表面上のクラスＩ又はＩＩのＭＨＣ分子に提示されるペプチド等のリガンド、及び抗ＴＣＲ抗体等の可溶性因子が挙げられる。
活性化は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生及び検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂しているＴ細胞を指す。
抗ＴＣＲ抗体は、εＣＤ３、αＣＤ３、又はαＣＤ２８等のＴＣＲの構成要素に特異的に結合し得る。ＴＣＲ刺激に適した抗ＴＣＲ抗体は、当該技術分野でよく知られており（例えばＯＫＴ３）、商業的な供給業者（例えば、米国コロラド州のeBioscience）から入手可能である。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は抗αＣＤ３抗体及びＩＬ２への曝露によって活性化され得る。Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及び抗αＣＤ２８抗体への曝露によって活性化されることがより好ましい。活性化は、ＣＤ１４＋単球の存在下又は不存在下で生じ得る。Ｔ細胞は、好ましくは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の抗体被覆ビーズによって活性化され得る。例えば、ＰＢＭＣ、又はＣＤ４＋細胞及び／又はＣＤ８＋細胞を含むＴ細胞サブセットは、フィーダー細胞（抗原提示細胞）又は抗原によらずに、抗体被覆ビーズ、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ThermoFisher Scientific）等の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で被覆された磁気ビーズを使用して活性化され得る。
分離及び活性化の後に、Ｔ細胞は、本明細書に記載されるＣＤ８補助受容体及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変され得る。
本発明によれば、ＣＤ８補助受容体は、ＣＤ８－α鎖及びＣＤ８－β鎖又はＣＤ８－α鎖及びＣＤ８－α鎖を含むＣＤ８鎖の二量体又はペアを含み得る。好ましくは、ＣＤ８補助受容体はＣＤ８α補助受容体である。ＣＤ８α補助受容体は、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含み得る。ＣＤ８α補助受容体はホモ二量体であり得る。
ＣＤ８補助受容体は、クラス１ ＭＨＣに結合し、ＴＣＲシグナル伝達を増強する。ＣＤ８補助受容体は、配列番号１の参照アミノ酸配列を含み得る又はその変異体であり得る。変異体は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＣＤ８補助受容体は、配列番号２の参照ヌクレオチド配列によってコードされ得る又はその変異体であり得る。変異体は、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。
本発明によれば、異種ＣＤ８補助受容体は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインにおいて、
（ｉ）ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、ＣＤＲ１、配列番号１５、若しくは配列番号１のアミノ酸４５～５３の配列、
（ｉｉ）ＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２、配列番号１６、若しくは配列番号１のアミノ酸７２～７９の配列、
（ｉｉｉ）ＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３、配列番号１７、若しくは配列番号１のアミノ酸８０～１１７の配列、
又はこれらの配列に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、
を有するＣＤＲを含むＣＤ８補助受容体を含み得る。
本発明によれば、異種ＣＤ８補助受容体は、配列番号１のアミノ酸配列の残基２２～１３５、又はそのアミノ酸残基２２～４４、アミノ酸残基５４～７１、アミノ酸残基８０～１１７、アミノ酸残基１２４～１３５が配列番号１のアミノ酸残基２２～４４、アミノ酸残基５４～７１、アミノ酸残基８０～１１７、アミノ酸残基１２４～１３５、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し、かつアミノ酸残基４５～５３、アミノ酸残基７２～７９及びアミノ酸残基１１８～１２３が配列番号１のアミノ酸残基４５～５３、アミノ酸残基７２～７９及びアミノ酸残基１１８～１２３のそれぞれの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はＩｇ様Ｖ型ドメインにおいて該配列を含むＣＤ８補助受容体を含み得る。
本発明によれば、ＣＤ８補助受容体は、
（ｉ）アミノ酸残基２２～４４の配列が（ａ）それぞれ配列番号１のアミノ酸残基２２～４４の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は（ｂ）それぞれ配列番号１の残基２２～４４に対して１個、２個若しくは３個の挿入若しくは欠失されたアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４５～５３の配列がＶＬＬＳＮＰＴＳＧ、配列番号１５、ＣＤＲ１、又は配列番号１のアミノ酸４５～５３である、
（ｉｉｉ）アミノ酸残基５４～７１の配列が（ａ）配列番号１のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基５４～７１の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入若しくは欠失されたアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基７２～７９の配列がＹＬＳＱＮＫＰＫ、ＣＤＲ２、配列番号１６、又は配列番号１のアミノ酸７２～７９であり得る、
（ｖ）アミノ酸残基８０～１１７の配列が配列番号１のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は配列番号１のアミノ酸残基８０～１１７の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入、欠失若しくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１８～１２３の配列がＬＳＮＳＩＭ、ＣＤＲ３、配列番号１７、又は配列番号１のアミノ酸８０～１１７であり得る、
（ｖｉｉ）アミノ酸残基１２４～１３５の配列が配列番号１のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は配列番号１のアミノ酸残基１２４～１３５の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入、欠失若しくは置換を有し得る、
又はＩｇ様Ｖ型ドメインにおいて、上記の通りであるＣＤ８補助受容体を含み得る。
ＣＤ８補助受容体を発現する本発明による改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団は、任意にＨＬＡ上に提示される場合の抗原性ペプチド、腫瘍抗原、又は癌抗原による刺激に対して又はその刺激において、本明細書に開示されるアッセイによって決定可能である親和性及び／又はアビディティの改善及び／又はＴ細胞活性化の改善を示し得る。
本発明によれば、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団のＣＤ８は、ＭＨＣ（このＭＨＣは、クラスＩ又はクラスＩＩであり得る）、好ましくはクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、すなわちＨＬＡ－Ｉ分子に又はＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ／Ｂ２Ｍ二量体と相互作用する又は特異的に結合することができ、好ましくは、ＣＤ８－αは、好ましくはＣＤ８のＩｇ様Ｖ型ドメインを介してクラスＩ ＭＨＣのα３部分（残基２２３から残基２２９の間）と相互作用する。本発明によれば、ＣＤ８は、任意に抗原提示細胞、樹状細胞及び／又は腫瘍細胞若しくは癌細胞、腫瘍組織若しくは癌組織の表面上で、ＨＬＡ ｐＭＨＣＩ又はｐＨＬＡによって結合又は提示されるＨＬＡ及び／又は抗原性ペプチドへのＴ細胞又はＴ細胞の集団のＴＣＲ結合を、異種ＣＤ８を欠くＴ細胞と比較して改善する。本発明によれば、ＣＤ８は、任意に抗原提示細胞、樹状細胞及び／又は腫瘍細胞若しくは癌細胞、腫瘍組織若しくは癌組織の表面上で、本発明のＴ細胞又はその集団のＴ細胞（ＴＣＲ）／ペプチド－主要組織適合性複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）相互作用のオフレート（ｋｏｆｆ）、したがってその半減期を、異種ＣＤ８を欠くＴ細胞と比較して改善又は増加し得て、それにより連結親和性（ligation affinity）及び／又はアビディティの改善ももたらし得る。この文脈において、ＣＤ８は、ＴＣＲをＴ細胞表面で組織化する上で重要な役割を果たし、こうしてｐＨＬＡ結合における協調性を可能にし、治療的アビディティ（therapeutic avidity）の改善をもたらし得る可能性がある。本発明によれば、異種ＣＤ８補助受容体改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団は、亜鉛依存的にＬＣＫ（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）と結合又は相互作用して、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、及びＡＰ－１のような転写因子の活性化をもたらし得る。
本明細書に記載される改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団はまた、癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチド、及び／又は腫瘍細胞及び／又は癌細胞及び／又はこれらの細胞に由来するペプチド若しくは抗原性ペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ＴＣＲは、不変のＣＤ３鎖分子との複合体として発現される非常に可変のアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖を典型的に含む、ジスルフィド結合された膜固定型ヘテロ二量体タンパク質である。これらのタイプのＴＣＲを発現するＴ細胞は、α：β（又はαβ）Ｔ細胞と呼称される。少数のＴ細胞は、可変ガンマ（γ）鎖及びデルタ（δ）鎖を含む代替的なＴＣＲを発現し、γδＴ細胞と呼称される。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ任意にＨＬＡとの複合体で異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に特異的に結合し得る及び／又は高い親和性で結合し得る異種ＴＣＲを含み得る。本発明によれば、異種ＴＣＲは、任意に表面プラズモン共鳴を用いて、任意に２５℃にて、任意に７．０から７．５の間のｐＨで測定される、０．０１μΜから１００μＭの間、０．０１μΜから５０μＭの間、０．０１μΜから２０μＭの間、０．０５μΜから２０μΜの間、又は０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．２５μＭ、０．３μＭ、０．３５μＭ、０．４μＭ、０．４５μＭ、０．５μＭ、０．５５μＭ、０．６μＭ、０．６５μＭ、０．７μＭ、０．７５μＭ、０．８μＭ、０．８５μＭ、０．９μＭ、０．９５μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ、５．５μＭ、６．０μＭ、６．５μＭ、７．０μＭ、７．５μＭ、８．０μＭ、８．５μＭ、９．０μＭ、９．５μＭ、１０．０μΜ、１０μΜから１０００μＭの間、１０μΜから５００μＭの間、５０μΜから５００μΜの間、又は１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、５００μΜの解離定数で結合し得る。解離定数ＫＤ又はｋｏｆｆ／ｋｏｎは、解離速度定数ｋｏｆｆ及び会合速度定数ｋｏｎを実験的に測定することによって決定され得る。解離定数は、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含むＴＣＲの可溶形を使用して測定され得る。したがって、本発明による異種ＴＣＲは、例えばＨＬＡ－Ａ＊０２又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１との複合体でＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを提示するＨＬＡに効率的に及び／又は高い親和性で、例えば０．０１μΜから１００μΜの間、例えば５０μΜ、１００μΜ、２００μΜ、５００μΜ、好ましくは０．０５μΜから２０．０μΜの間の解離定数で結合することができる。
本発明によれば、異種ＴＣＲは、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、腫瘍細胞又は癌細胞又は癌組織によって好ましくは発現される、ＨＬＡ上に任意に提示される抗原、好ましくは癌抗原又は腫瘍抗原のペプチド、抗原性ペプチド又はペプチド断片（ｐＨＬＡ）に選択的に結合し得る。選択的な結合は、異種ＴＣＲが、任意にＨＬＡ上に提示される抗原、好ましくは癌抗原又は腫瘍抗原の或るペプチド、抗原性ペプチド又はペプチド断片（ｐＨＬＡ）に、別のＴＣＲと比較してより大きな親和性で結合することを表す。本発明によれば、その結合は、癌精巣抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）、ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫で優先的に発現される抗原）、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６／ＨＰＶ－Ｅ７（ヒトパピローマウイルス）、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、サイログロビン、ＴＧＦＢＩＩフレームシフト抗原、ＬＡＧＥ－１Ａ、ＫＲＡＳ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、及びＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、又はＭＡＧＥ－Ａ１２であり得る癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチドに対して選択的及び／又は特異的である。好ましくは、腫瘍抗原はＭＡＧＥ－Ａ４である。追加的に及び／又は代替的に、結合の選択性は、ＨＬＡ型に対する選択性、すなわち全てがＨＬＡクラス１であるＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、及びＣ）に対応するＨＬＡ若しくはその特異的アレル、又はＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯ、ＤＱ、及びＤＲ）に対応するＨＬＡ若しくはその特異的アレルに対する選択性であり得て、好ましくは、該ＨＬＡは、クラス１であり、好ましくは、該アレルは、ＨＬＡ－Ａ２若しくはＨＬＡ－Ａ＊０２、又はＨＬＡ－Ａ２＋若しくはＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ－＊０２０１である。
好適なＴＣＲは、腫瘍抗原のペプチド断片を提示する腫瘍細胞又は癌細胞の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に特異的に結合する。ＭＨＣは、獲得免疫系が「外来」分子を認識することを可能にする、細胞表面タンパク質のセットである。タンパク質は、細胞内で分解され、ＭＨＣによって細胞表面上に提示される。ウイルス又は癌関連ペプチド等の「外来」ペプチドを提示するＭＨＣは、適切なＴＣＲを有するＴ細胞によって認識され、細胞破壊経路を促進する。腫瘍細胞又は癌細胞の表面上のＭＨＣは、癌抗原又は腫瘍抗原のペプチド断片、すなわち、腫瘍細胞又は癌細胞上に存在するが、対応する非癌細胞又は非腫瘍細胞にはない抗原を提示し得る。これらのペプチド断片を認識するＴ細胞は、腫瘍細胞又は癌細胞に対する細胞傷害性効果を発揮し得る。
好ましくは、ＴＣＲは、Ｔ細胞によって天然では発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性又は異種性である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含んでもよい。好適な異種ＴＣＲは、腫瘍抗原又は癌抗原を発現する腫瘍細胞又は癌細胞に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、任意に特定の癌患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合する異種ＴＣＲを発現するように改変されてもよい。癌患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的な技術を使用して特定され得る。
異種ＴＣＲは、組換え又は合成又は人工のＴＣＲ、すなわち天然には存在しないＴＣＲであってもよい。例えば、異種ＴＣＲは、腫瘍抗原に対するその親和性又はアビディティを増すように操作されてもよい（すなわち親和性増強ＴＣＲ）。親和性増強ＴＣＲは、天然起源のＴＣＲに対する１つ以上の突然変異、例えば、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に１つ以上の突然変異を含んでもよい。これらの突然変異は、任意に癌細胞によって発現される場合の腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させ得る。親和性増強又は成熟ＴＣＲを生成するのに適した方法は、ファージ又は酵母ディスプレイを使用してＴＣＲ突然変異体のライブラリをスクリーニングすることを含み、当該技術分野でよく知られている（例えば、非特許文献５、San Miguel et al (2015) Cancer Cell 28 (3) 281-283、Schmitt et al (2013) Blood 122 348-256、Jiang et al (2015) Cancer Discovery 5 901を参照されたい）。
親和性は、或る分子が別の分子に結合する強度であり、例えば、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示される、任意にＭＨＣとの複合体で提示される場合のペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片についてのＴＣＲ又は異種ＴＣＲを含むＴ細胞が別の分子に結合する強度である。抗原結合タンパク質のその標的への結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））又はカイネティクス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）によって決定され得る。アビディティは、例えば相互作用の価数を考慮に入れて、２つの分子が複数の部位で互いに結合する強度の合計である。本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に対する、又はそのような抗原を含む癌若しくは腫瘍の細胞若しくは組織に対する親和性及び／又はアビディティの改善を示し得る。
好ましい親和性増強ＴＣＲは、腫瘍抗原ＭＡＧＥ Ａ４を発現する腫瘍細胞又は癌細胞に結合し得る。
ＭＡＧＥＡ４ ＴＣＲは、配列番号３のα鎖参照アミノ酸配列又はその変異体及び配列番号５のβ鎖参照アミノ酸配列又はその変異体を含み得る。変異体は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。ＭＡＧＥＡ４ ＴＣＲは、配列番号４のα鎖参照ヌクレオチド配列又はその変異体及び配列番号６のβ鎖参照ヌクレオチド配列又はその変異体によってコードされ得る。変異体は、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。
本発明によれば、ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み得て、ここで、
（ｉ）α鎖可変ドメインは、
ＶＳＰＦＳＮ（αＣＤＲ１）、配列番号９、又は配列番号３のアミノ酸４８～５３の配列、
ＬＴＦＳＥＮ（αＣＤＲ２）、配列番号１０、又は配列番号３のアミノ酸７１～７６の配列、及び、
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ（αＣＤＲ３）、配列番号１１、又は配列番号３のアミノ酸１１１～１２５の配列、
を有するＣＤＲを含み、かつ、
（ｉｉ）β鎖可変ドメインは、
ＫＧＨＤＲ（βＣＤＲ１）、配列番号１２、又は配列番号５のアミノ酸５０～５４の配列、
ＳＦＤＶＫＤ（βＣＤＲ２）、配列番号１３、又は配列番号５のアミノ酸６８～７３の配列、及び、
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ（βＣＤＲ３）、配列番号１４、又は配列番号５のアミノ酸１１０～１２３の配列、又はこれらの配列に対して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性、任意にこれらの配列に対して１００％の配列同一性を有する配列、
を有するＣＤＲを含む。
したがって、ＴＣＲは、α鎖可変ドメインが配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列若しくは配列番号３のアミノ酸残基１～１３６の配列を含み、及び／又はβ鎖可変ドメインが配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列若しくは配列番号５のアミノ酸残基１～１４４の配列を含むＴＣＲを含み得る。
「前駆ＴＣＲ（progenitor TCR）」という用語は、本明細書では、それぞれ配列番号３及び配列番号５のＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖及びＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖を含むＴＣＲを指すのに使用される。前駆ＴＣＲと比べて等しい、同等の若しくはより高い親和性及び／又は等しい、同等の若しくはより遅いペプチド－ＨＬＡ複合体についてのオフレートを有する前駆ＴＣＲに対して突然変異又は改変されたＴＣＲを提供することが望ましい。本発明によるＴＣＲは、α鎖可変ドメイン及び／又はβ鎖可変ドメイン中に存在する前駆ＴＣＲに対する突然変異を２つ以上有し得る。「操作されたＴＣＲ」及び「突然変異ＴＣＲ」は、本明細書において同義的に使用され、一般に、前駆ＴＣＲに対して、特にそのα鎖可変ドメイン及び／又はβ鎖可変ドメインにおいて導入された１つ以上の突然変異を有するＴＣＲを意味する。これらの突然変異（複数の場合もある）は、ＭＡＧＥ Ａ４に対する結合親和性及び／又は特異性及び／又は選択性及び／又はアビディティを改善し得る。或る特定の実施形態では、α鎖可変ドメイン中に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、若しくは８個の突然変異、例えば４個若しくは８個の突然変異が存在し、及び／又はβ鎖可変ドメイン中に１個、２個、３個、４個、若しくは５個の突然変異、例えば５個の突然変異が存在する。幾つかの実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号７のアミノ酸残基の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。幾つかの実施形態では、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号８のアミノ酸残基の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本発明によれば、ＴＣＲは、α鎖可変ドメインが、配列番号７、又は配列番号７のアミノ酸残基１～１３６のアミノ酸配列、又はアミノ酸残基１～４７、アミノ酸残基５４～７０、アミノ酸残基７７～１１０及びアミノ酸残基１２６～１３６が配列番号７のそれぞれのアミノ酸残基１～４７、アミノ酸残基５４～７０、アミノ酸残基７７～１１０及びアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する及び／又はアミノ酸残基４８～５３、アミノ酸残基７１～７６及びアミノ酸残基１１１～１２５、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７のそれぞれのアミノ酸残基４８～５３、アミノ酸残基７１～７６及びアミノ酸残基１１１～１２５、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲを含み得る。
本発明によれば、ＴＣＲは、α鎖可変ドメインにおいて、
（ｉ）アミノ酸残基１～４７の配列が（ａ）配列番号７のアミノ酸残基１～４７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は（ｂ）配列番号７の残基１～４７に対して１個、２個若しくは３個の挿入若しくは欠失されたアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４８～５３の配列がＶＳＰＦＳＮ、ＣＤＲ１、配列番号９、又は配列番号７のアミノ酸４８～５３である、
（ｉｉｉ）アミノ酸残基５４～７０の配列が（ａ）配列番号７のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は（ｂ）配列番号７のアミノ酸残基５４～７０の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入若しくは欠失されたアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基７１～７６の配列がＬＴＦＳＥＮ、ＣＤＲ２、配列番号１０、又は配列番号７のアミノ酸７１～７６であり得る、
（ｖ）アミノ酸残基７７～１１０の配列が配列番号７のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は配列番号７のアミノ酸残基７７～１１０の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入、欠失若しくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１１～１２５の配列がＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ、ＣＤＲ３、配列番号１１、又は配列番号７のアミノ酸１１１～１２５であり得る、
（ｖｉｉ）アミノ酸残基１２６～１３６の配列が配列番号７のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は配列番号７のアミノ酸残基１２６～１３６の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入、欠失若しくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
本発明によれば、ＴＣＲは、β鎖可変ドメインにおいて、配列番号８のアミノ酸配列、又はそのアミノ酸残基１～４５、アミノ酸残基４６～５０、アミノ酸残基７４～１０９、アミノ酸残基１２４～１３３が配列番号８のそれぞれのアミノ酸残基１～４５、アミノ酸残基４６～５０、アミノ酸残基７４～１０９、アミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有する、並びにアミノ酸残基４６～５０、アミノ酸残基６８～７３及びアミノ酸残基１１０～１２３が配列番号８のそれぞれのアミノ酸残基４６～５０、アミノ酸残基６８～７３及びアミノ酸残基１１０～１２３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲを含み得る。
本発明によれば、ＴＣＲは、β鎖可変ドメインにおいて、
（ｉ）アミノ酸残基１～４５の配列が（ａ）配列番号８のアミノ酸残基１～４５の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は（ｂ）配列番号８の残基１～４５に対して１個、２個若しくは３個の挿入若しくは欠失されたアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６～５０の配列がＫＧＨＤＲ、ＣＤＲ１、配列番号１２、又は配列番号８のアミノ酸４６～５０である、
（ｉｉｉ）アミノ酸残基５１～６７の配列が（ａ）配列番号８のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は（ｂ）配列番号８のアミノ酸残基５１～６７の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入若しくは欠失されたアミノ酸残基を有し得る、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８～７３の配列がＳＦＤＶＫＤ、ＣＤＲ２、配列番号１３、又は配列番号８のアミノ酸６８～７３であり得る、
（ｖ）アミノ酸残基７４～１０９の配列が配列番号８のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は配列番号８のアミノ酸残基７４～１０９の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入、欠失若しくは置換を有し得る、
（ｖｉ）アミノ酸１１０～１２３の配列がＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ、ＣＤＲ３、配列番号１４、又は配列番号８のアミノ酸１１０～１２３であり得る、
（ｖｉｉ）アミノ酸残基１２４～１３３の配列が配列番号８のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有し得る又は配列番号８のアミノ酸残基１２４～１３３の配列に対して１個、２個若しくは３個の挿入、欠失若しくは置換を有し得る、ＴＣＲを含み得る。
アミノ酸及びヌクレオチド配列の同一性は一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）、Accelrys、カリフォルニア州サンディエゴ）を参照して規定されている。ＧＡＰは、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）を使用して、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する２つの完全な配列をアライメントさせる。一般に、ギャップ生成ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４でデフォルトのパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましいが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）、又はスミス－ウォーターマンアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）が、一般にデフォルトのパラメーターを用いて使用され得る。
特定のアミノ酸配列変異体は、１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個～１０個、１０個～２０個、又は２０個～３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換、又は欠失の点で参照配列と相違し得る。幾つかの実施形態では、変異体配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれより多くの挿入、欠失、又は置換された残基を有する参照配列を含み得る。例えば、最大１５個、最大２０個、最大３０個、又は最大４０個の残基が挿入、欠失、又は置換されていてもよい。
幾つかの好ましい実施形態では、変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれより多くの保存的置換の点で参照配列と相違し得る。保存的置換には、類似の特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置き換えが含まれる。例えば、或る脂肪族残基を別の脂肪族残基により置き換えることができ、或る非極性残基を別の非極性残基により置き換えることができ、或る酸性残基を別の酸性残基により置き換えることができ、或る塩基性残基を別の塩基性残基により置き換えることができ、或る極性残基を別の極性残基により置き換えることができ、又は或る芳香族残基を別の芳香族残基により置き換えることができる。保存的置換は、例えば、以下の群：
（ｉ）アラニン及びグリシン、
（ｉｉ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、及びアスパラギン、
（ｉｉｉ）アルギニン及びリジン、
（ｉｖ）アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸、
（ｖ）イソロイシン、ロイシン、及びバリン、
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、
（ｖｉｉ）セリン、トレオニン、及びシステイン、
内のアミノ酸間であり得る。
Ｔ細胞において発現される組換えＣＤ８補助受容体及び／又はＴＣＲは、Ｃ末端又はより好ましくはＮ末端に異種タグを含み得る。タグは、ＣＤ８及び／又はＴＣＲと天然に関連付けられておらず、特定の結合ペアの一方の成員を形成するペプチド配列である。組換えＣＤ８及びＴＣＲを発現するＴ細胞は、特定の結合ペアのその他の成員をタグに結合させることによって特定及び／又は精製され得る。例えば、タグは、抗タグ抗体により結合されるエピトープを形成し得る。このタグは、治療の間に改変Ｔ細胞を特定するのに有用であり得る。
適切なタグには、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７－タグ、Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ－Ａｒｇ（Ｒ５～６）、ポリ－Ｈｉｓ（Ｈ２～１０）、ポリ－Ｃｙｓ（Ｃ４）、ポリ－Ｐｈｅ（Ｆ１１）、ポリ－Ａｓｐ（Ｄ５～１６）、ＳＵＭＯタグ（InvitrogenのＣｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ ＳＵＭＯ発現システム）、Ｓｔｒｅｐｔ－ｔａｇ ＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ－ＨＡタグ（Murray, P. J. et al (1995) Anal Biochem 229, 170-9）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅタグ（Stammers, D. K. et al (1991) FEBS Lett 283, 298-302）、Ｔａｇ．１００（Qiagen；哺乳動物のＭＡＰキナーゼ２から誘導された１２アミノ酸タグ）、Ｃｒｕｚ ｔａｇ ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）、及びＣｒｕｚ ｔａｇ ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）が含まれる。既知のタグ配列は、Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533においてレビューされている。好ましい実施形態では、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ等のヘマグルチニン（ＨＡ）タグが使用され得る。
改変Ｔ細胞において発現されるＣＤ８補助受容体及びＴＣＲは、異種核酸によってコードされる組換えタンパク質である。すなわち、ＣＤ８及びＴＣＲは、組換え技術によってＴ細胞のゲノムに組み込まれたコーディング核酸から発現される。
ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲを発現するようなＴ細胞の改変は、本明細書に記載されるＣＤ８補助受容体及びＴＣＲをコードする異種核酸をＴ細胞に導入することを含み得る。Ｔ細胞への異種核酸の導入及び発現に適した方法は、当該技術分野でよく知られており、以下でより詳細に記載される。
導入後に、本明細書に記載される本発明による改変Ｔ細胞は、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲをコードする異種核酸の１コピー又は２コピー以上を含み得る。
異種ＴＣＲの発現は、Ｔ細胞が特異的に、選択的に、高い若しくは改善された親和性で又は高い若しくは改善されたアビディティで、癌を伴う個体の癌細胞の表面上に提示される１つ以上の腫瘍抗原を認識する又は該腫瘍抗原に対する改善された認識を示すようにＴ細胞の免疫原性特異性を変化させ得る。
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、異種ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲの不存在下では、癌細胞に対する結合の減少を示す場合がある、又はそれに対する結合を示さない場合がある。例えば、異種ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲの発現は、改変されていないＴ細胞と比べて、改変Ｔ細胞の癌細胞結合の親和性及び／又は特異性を増す場合がある。
「異種、異種性の」という用語は、宿主細胞等の特定の生体系に対して外来であり、その生体系に天然には存在しないポリペプチド又は核酸（すなわち、外因性のポリペプチド又は核酸）を指す。異種性のポリペプチド又は核酸は、人為的手段によって、例えば組換え技術を使用して生体系に導入され得る。例えば、ポリペプチドをコードする異種核酸は、コードされた異種ＴＣＲ及び異種ＣＤ８補助受容体を発現することができる適切な調節配列を好ましくは含む適切な発現コンストラクト又はベクターに挿入され得て、これが更に該ポリペプチドを産生するように宿主細胞を形質転換するのに使用される。異種性のポリペプチド又は核酸は、合成若しくは人工であってもよく、又は異なる種若しくは細胞型等の異なる生体系に存在してもよい。内因性のポリペプチド又は核酸は、宿主細胞等の特定の生体系に対して天然であり、その生体系に天然に存在する。組換えポリペプチドは、人為的手段によって、例えば組換え技術を使用して細胞に導入された異種核酸から発現される。組換えポリペプチド、例えば、本明細書に記載される異種ＴＣＲ又は異種ＣＤ８補助受容体は、細胞に天然に存在するポリペプチドと同一であり得る又はその細胞若しくは改変Ｔ細胞に天然に存在するポリペプチドと相違し得る。
Ｔ細胞は、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の、好ましくは癌患者の腫瘍によって提示されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に特異的に結合する異種ＴＣＲを発現するように改変され得る。癌患者は、引き続き改変Ｔ細胞で治療され得る。改変Ｔ細胞による治療に適した癌患者は、
癌を伴う個体から癌細胞の試料を取得することと、
癌細胞を改変Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲに結合すると特定することと、
を含む方法によって特定され得る。
癌細胞又は腫瘍細胞は、任意に好ましくは結合アッセイによってＴＣＲに結合することが決定される、癌細胞又は腫瘍細胞によって発現される１つ以上の腫瘍抗原を特定することによって、ＴＣＲ、すなわち改変Ｔ細胞又はその集団の異種ＴＣＲに結合すると特定され得る。癌又は腫瘍を伴う個体から取得された癌細胞又は腫瘍細胞の表面上の抗原を特定する方法は、当該技術分野でよく知られている。
幾つかの実施形態では、特定の癌患者の治療に適した異種ＴＣＲは、
癌を伴う個体から癌細胞の試料を得ることと、
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を特定することと、
によって特定され得る。
癌細胞に特異的に結合するＴＣＲは、例えば、癌細胞によって発現される１つ以上の腫瘍抗原を特定することによって特定され得る。癌を伴う個体から得られる癌細胞の表面上の抗原を識別する方法は、当該技術分野でよく知られている。１つ以上の腫瘍抗原に結合する又は１つ以上の抗原のＭＨＣ提示ペプチド断片に結合するＴＣＲは、その後、例えば、既知の特異性のＴＣＲから、又は多様な特異性を有するＴＣＲのパネル若しくはライブラリをスクリーニングすることによって特定され得る。１つ以上の定義される腫瘍抗原を有する癌細胞に特異的に結合するＴＣＲは、通例の技術を使用して産生され得る。
Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、特定されたＴＣＲ又は異種ＴＣＲを発現するように改変され得る。本発明による改変Ｔ細胞又はＴ細胞の集団は、全てがＨＬＡクラス１であるＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、及びＣ）に対応するＨＬＡ若しくはその特異的アレル、又はＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯ、ＤＱ、及びＤＲ）に対応するＨＬＡ若しくはその特異的アレルに対するＨＬＡ特異性によって拘束され得て、好ましくは、該ＨＬＡは、クラス１であり、好ましくは、該アレルは、ＨＬＡ－Ａ２若しくはＨＬＡ－Ａ＊０２、又はＨＬＡ－Ａ２＋若しくはＨＬＡ－Ａ＊０２陽性ＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ－Ａ＊０２０１である。
本明細書に記載される治療に適した個体の腫瘍細胞又は癌細胞は、抗原を発現し得て、ＴＣＲに結合するのに適正なＨＬＡ型であり得る。
癌細胞又は腫瘍細胞は、１つ以上の抗原（すなわち、本明細書に上記される癌腫瘍抗原）の発現によって個体において正常な体細胞と区別され得る。個体において正常な体細胞は、１つ以上の抗原を発現し得ないか、又は異なった方法で、例えば、より低いレベルで、異なる組織及び／又は異なる発生段階において、抗原を発現し得る。腫瘍抗原は、個体において免疫応答を誘発し得る。特に、腫瘍抗原は、個体において腫瘍抗原を発現する癌細胞に対して、Ｔ細胞媒介免疫応答を誘発し得る。患者において腫瘍細胞又は癌細胞によって発現される１つ以上の腫瘍抗原は、改変Ｔ細胞に対する異種Ｔ細胞受容体の標的抗原として選択され得る。
抗原は、抗原結合タンパク質、例えば抗体又はＴＣＲによって選択的に認識され、かつ癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は任意にＭＨＣとの複合体で癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ任意に本発明による異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片であり得る巨大分子の構造物である。抗原には、限定されるものではないが、１つ以上のＴ細胞エピトープ、すなわち異種ＴＣＲのＣＤＲによって特異的に認識及び／又は結合される抗原、タンパク質又はペプチドのエピトープ又はエピトープ領域を含むタンパク質又はペプチド（多糖類を有する又は有しない）又はタンパク質組成物が含まれる。本明細書で検討されるように、本発明のＴＣＲ分子の標的結合ドメイン又はＣＤＲは、特定のアミノ酸配列ではなく糖タンパク質若しくはそのエピトープ、又は巨大分子の糖側鎖を認識し得る。したがって、糖部分又は硫酸化糖部分が抗原として機能する。
癌細胞によって発現される腫瘍抗原には、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４等の癌生殖細胞系統遺伝子によってコードされる癌精巣（ＣＴ）抗原が含まれ得る（Simpson et al. Nature Rev (2005) 5, 615-625、Gure et al., Clin Cancer Res (2005) 11, 8055-8062、Velazquez et al., Cancer Immun (2007) 7, 11、Andrade et al., Cancer Immun (2008) 8, 2、Tinguely et al., Cancer Science (2008)、Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn (2008) 198, 99 e91-97）。
Ｔ細胞の改変及びそれらの後の拡大は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで行われてもよい。
Ｔ細胞は、任意に本明細書に記載されるベクター及び／又はウイルス粒子において、異種コーディング核酸をＴ細胞に導入することによって、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲを発現するように改変され得る。
幾つかの実施形態では、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲをコードする異種核酸は、同じ発現ベクターでＴ細胞に導入される。これは、形質導入後に両方の遺伝子を発現するＴ細胞の割合を増加させるのに役立つ可能性がある。他の実施形態では、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲをコードする異種核酸は、異なる発現ベクターでＴ細胞に導入されてもよい。
ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲは、融合タンパク質として同じ転写産物において発現され、その後、例えば部位特異的プロテアーゼを使用して分離されてもよい。代替的には、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲは、異なる転写産物において発現されてもよい。
ＴＣＲ及び／又はＣＤ８補助受容体をコードする核酸は、受容体の全てのサブユニットをコードし得る。例えば、ＴＣＲをコードする核酸は、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列及びＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＣＤ８補助受容体をコードする核酸は、ＣＤ８α鎖をコードするヌクレオチド配列及びＣＤ８β鎖をコードするヌクレオチド配列を含み得る。より好ましくは、ＣＤ８補助受容体をコードする核酸は、ＣＤ８α鎖をコードするヌクレオチド配列を含み得て、ＣＤ８補助受容体はＣＤ８αホモ二量体であり得る。
核酸は、任意の簡便な方法によってＴ細胞に導入され得る。Ｔ細胞に異種核酸を導入する又は組み込む場合、当業者によく知られているように、或る特定の注意事項を考慮に入れなければならない。挿入される核酸は、Ｔ細胞においてコードされた異種ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲの転写を駆動する有効な調節エレメントを含むコンストラクト又はベクター内に構築されなくてはならない。Ｔ細胞にコンストラクタ（constructor）ベクターを輸送する好適な技術は当該技術分野でよく知られており、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション及びレトロウイルス、又は他のウイルス、例えばワクシニア若しくはレンチウイルスを使用する形質導入が挙げられる。例えば、固相形質導入は、レトロネクチン被覆レトロウイルスベクター充填済み組織培養プレート上での培養によって、選択せずに行われ得る。
好ましくは、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲをコードする核酸は、ウイルスベクター、最も好ましくはガンマレトロウイルスベクター又はＶＳＶｇ－偽型レンチウイルスのベクター等のレンチウイルスベクターに含まれ得る。Ｔ細胞は、核酸を含むウイルス粒子と接触することによって形質導入され得る。形質導入のためのウイルス粒子は、既知の方法に従って産生され得る。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウイルスのパッケージング及びエンベロープのエレメントをコードするプラスミド、また同様にコーディング核酸を含むレンチウイルスベクターによってトランスフェクトしてもよい。ＶＳＶｇ－偽型ウイルスベクターは、偽型ウイルス粒子を産生するように、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶｇ）のウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇと組み合わせて産生されてもよい。
例えば核酸コンストラクトの作製、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現における核酸の操作及び形質転換に関する多くの既知の技術及びプロトコルが、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992に詳しく記載される。
Ｔ細胞への異種ＴＣＲ及びＣＤ８補助受容体をコードする核酸の導入に続いて、改変Ｔ細胞の初期の集団は、改変Ｔ細胞が増殖し集団を拡大するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され得る。
改変Ｔ細胞集団は、例えば抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８で被覆された磁気ビーズを使用して拡大され得る。改変Ｔ細胞は、拡大された集団を生じるように任意の簡便な技術を使用して培養され得る。好適な培養系として、撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグ又は培養皿、及び他のバイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクターが挙げられる。かかるシステムの使用は、当該技術分野でよく知られている。
ｅｘ ｖｉｖｏでのＴ細胞の増殖における使用に適した多数の培養培地、特にＡＩＭ－Ｖ、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地及びＲＰＭＩ－１６４０（Invitrogen-GIBCO）等の完全培地を利用することができる。培地は、血清、血清タンパク質、及び選択剤等の他の因子で補足されてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、２ｍＭグルタミン、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び５５μＭ β－メルカプトエタノールを含み、任意に２０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ－２で補足されたＲＰＭＩ－１６４０培地を利用してもよい。培養培地は、当業者によって通例の実験により容易に決定することができる標準濃度で、上に記載されるアゴニスト因子又はアンタゴニスト因子で補足されてもよい。
簡便には、細胞を、好適な培養培地中、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気で３７℃にて培養する。
Ｔ細胞及び他の哺乳動物細胞の培養に関する方法及び技術は当該技術分野でよく知られている（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451、Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293、Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52を参照されたい）。
幾つかの実施形態では、上記集団から改変Ｔ細胞を単離及び／又は精製することが簡便な場合がある。ＦＡＣＳ及び抗体被覆磁気粒子を含む、任意の簡便な技術が使用され得る。
任意に、本明細書で記載されるように作製された改変Ｔ細胞の集団及び／又は精製された改変Ｔ細胞の集団は、例えば、使用の前に凍結乾燥及び／又は凍結保存によって保管されてもよい。
改変Ｔ細胞の集団を、バッファー、担体、希釈剤、防腐剤、及び／又は薬学的に許容可能な添加剤等の他の試薬と混合してもよい。好適な試薬を以下に詳述する。本明細書に記載される方法は、改変Ｔ細胞の集団と薬学的に許容可能な添加剤を混合することを含んでもよい。
投与（例えば、注入による）に適した医薬組成物は、酸化防止剤、バッファー、防腐剤、安定剤、静菌剤、及び意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性で等張なパイロジェンフリー（pyrogen-free）の無菌注射溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が挙げられる。かかる製剤における使用に適した等張のビヒクルの例として、塩化ナトリウム注射液、リンガー溶液、又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。好適なビヒクルを、標準的な薬学の教科書、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990に見ることができる。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明による改変Ｔ細胞又はＴ細胞の集団は、個体への静脈点滴に適した医薬組成物へと製剤化され得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、適切な医学的良識の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、合理的なベネフィット／リスク比と見合った、被験体（例えばヒト）の組織と接触する使用に適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。また、担体、添加剤等はそれぞれ、製剤の他の原料と適合するという意味でも「許容可能」でなくてはならない。
本発明の一態様は、異種及び／又は組換えＣＤ８補助受容体、並びに癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に及び／又は腫瘍細胞若しくは癌細胞、好ましくは個体、好ましくは腫瘍若しくは癌を伴う個体の又は該個体からの腫瘍細胞若しくは癌細胞に特異的に結合する異種及び／又は組換えＴＣＲを発現する改変Ｔ細胞の集団を提供する。適切な集団は上記の方法によって作製され得る。
改変Ｔ細胞の集団は、医薬としての使用に対するものであってもよい。例えば、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団は、癌免疫療法、例えば養子Ｔ細胞療法に使用され得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、クラスＩ抗原応答の改善を示し得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、任意に癌抗原若しくは腫瘍抗原、又は癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示されるペプチド若しくは癌ペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に応答して、ＣＤ４０Ｌの発現、ＡＰＣ若しくはＤＣに対する親和性、サイトカイン産生、細胞傷害活性、樹状細胞成熟の誘導若しくは樹状細胞サイトカイン産生の誘導の改善若しくは増加を示し得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、ＣＤ４０Ｌの発現の増加、及び／又はＡＰＣ（抗原提示細胞）若しくはＤＣ（樹状細胞）及び／又はＣＤ４０を発現するＡＰＣ若しくはＤＣに対する親和性の増加若しくは改善を示し得る。本発明によるＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４＋ＣＤ４０＋Ｔ細胞の数の増加を示し得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、活性化後のＴ細胞の拡大、分裂又は増殖のレベルの増加を示し得る。活性化は、サイトカイン、インターロイキン、抗体、ペプチド又は抗原性ペプチド、例えば癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、異種ＴＣＲによって認識される癌抗原又は腫瘍抗原のペプチド断片、又はペプチド若しくは抗原性ペプチド若しくはペプチド断片を提示する細胞若しくは組織、例えば腫瘍若しくは癌の細胞若しくは組織の存在下で開始され得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に応答して、サイトカイン産生のレベルの増加を示し得る。サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－１２、又はＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、好ましくは、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＭＩＰ１β、好ましくは、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１βであり得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片の存在において、樹状細胞の成熟の改善を促進し得る。成熟の改善は、樹状細胞のＣＤ８０マーカー、ＣＤ４０マーカー、又はＨＬＡ－ＤＲマーカーの発現の増加を含み得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に応答して、樹状細胞におけるサイトカイン産生のレベルの増加の誘導を示し得る。サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－１２、又はＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、好ましくは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、又はＭＩＧ、代替的には、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、及びＭＩＧであり得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、任意に異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に応答して、腫瘍細胞単独によって産生されたＩＬ－６と比べて低下したレベルでの樹状細胞によるＩＬ－６の産生の誘導を示し得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に応答して、細胞傷害活性の改善及び／又はグランザイム及び／又はＩＦＮ－γの産生レベルの増加を示し得る。
本発明によるＴ細胞又はＴ細胞の集団は、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチド、異種ＴＣＲによって認識される癌抗原又は腫瘍抗原のペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片を提示する腫瘍細胞又は癌細胞の殺傷の改善を示し得る。
上記によれば、Ｔ細胞又はＴ細胞の集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物であり得る又はそれらを含み得る。
養子細胞療法又は養子免疫療法は、標的細胞上に発現される表面抗原又はペプチドＭＨＣ複合体に特異的な遺伝子改変ＴＣＲ及び／又は補助受容体（例えばＣＤ８）を発現するように遺伝子移入によって操作されたヒトＴリンパ球又はＮＫリンパ球の養子移植を指す。これを使用して、選択された標的、例えば癌又は腫瘍を治療するための腫瘍又は癌に特異的な抗原に応じて様々な疾患を治療することができる。養子細胞療法は、白血球アフェレーシスと呼ばれるプロセスを使用してドナー又は患者の白血球の一部を除去することを含む。次いで、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を拡大させ、ＴＣＲポリヌクレオチド及び／又は補助受容体（例えばＣＤ８）を含む発現ベクターと混合して、ＴＣＲ及び／又は補助受容体（例えばＣＤ８）をＴ細胞又はＮＫ細胞に移入することができる。Ｔ細胞又はＮＫ細胞を再び拡大させ、拡大が終わったら、操作されたＴ細胞又はＮＫ細胞を洗浄し、濃縮し、その後に凍結させて、患者が操作された細胞の注入を受ける準備ができるまでの試験、出荷、及び貯蔵の時間を見越しておく。
本発明の他の態様は、癌及び／又は腫瘍の治療のための医薬の製造に対する本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団の使用、癌及び／又は腫瘍の治療に対する本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団、並びに本明細書に記載される改変Ｔ細胞の集団を、それを必要とする個体に投与することを含み得る、癌及び／又は腫瘍の治療法を提供する。
改変Ｔ細胞の集団は、自己由来であってもよい、すなわち、改変Ｔ細胞が、元々は、後に改変Ｔ細胞が投与される個体と同じ個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とが同じである）。個体に投与するのに適した改変Ｔ細胞の集団は、個体から取得された初期のＴ細胞の集団を準備することと、ＣＤ８補助受容体、並びに腫瘍細胞若しくは癌細胞、又は癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつ個体における異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に特異的に結合するＴＣＲを発現するようにＴ細胞を改変することと、改変Ｔ細胞を培養することとを含む方法によって作製され得る。
改変Ｔ細胞の集団は、同種異系であってもよい、すなわち、改変Ｔ細胞は、元々は、後に改変Ｔ細胞が投与される個体とは異なる個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とが異なる）。同種異系とは、同種の異なる動物に由来する移植片を指す。ドナー個体及びレシピエント個体は、ＧＶＨＤ及びその他の不所望な免疫作用を避けるためにＨＬＡ適合され得る。レシピエント個体に投与するのに適した改変Ｔ細胞の集団は、ドナー個体から取得された初期のＴ細胞の集団を準備することと、ＣＤ８補助受容体、並びに腫瘍細胞若しくは癌細胞、又は癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつレシピエント個体における異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に特異的に結合するＴＣＲを発現するようにＴ細胞を改変することと、改変Ｔ細胞を培養することとを含む方法によって作製され得る。
改変Ｔ細胞の投与後に、レシピエント個体は、任意に癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示され、かつレシピエント個体における異種ＴＣＲによって認識されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片を提示する腫瘍又は癌の細胞又は組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を示し得る。これは、個体における癌状態に有益な効果を有し得る。
本明細書で使用される場合に、「癌」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は区別なく使用され、単数形又は複数形のいずれかで、宿主生物にとって病的なものとなる悪性形質転換を受けた細胞を指す。
十分に確立された技術、特に組織学的検査によって、原発癌細胞を非癌細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用される癌細胞の定義には、原発癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来するあらゆる細胞も含まれる。この細胞には、転移癌細胞、並びに癌細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物及び細胞系統が含まれる。通常固形腫瘍として発症する癌の型について言及する場合に、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えばコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、又は身体検査での触診等の手法によって腫瘍塊に基づいて検出可能な腫瘍、及び／又は患者から取得可能な試料中の１つ以上の癌特異抗原の発現のために検出可能な腫瘍である。
本発明に従って治療され得る癌状態又は癌を含む癌状態は、悪性癌細胞の異常増殖を特徴とし得て、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ及びＣＬＬ等の白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫等のリンパ腫、並びに肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胃部癌、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、及び大脳腫瘍（cerebral cancer）等の固形癌と並んで、原発不明の癌（ＣＵＰ：cancer of unknown primary）を含み得る。
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に従って治療され得る癌状態又は癌を含む癌は、造血組織系血液癌（又は血液癌若しくは血液の癌若しくは血液関連の癌）、例えば血液細胞又は免疫細胞に由来する癌であり得て、これらの癌は「液体腫瘍」と呼ばれる場合もある。血液腫瘍に基づく病態の具体例としては、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病及び急性リンパ球性白血病等の白血病、多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ及びワルデンストレームマクログロブリン血症等の形質細胞悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等のリンパ腫等が挙げられる。癌は、異常な数の芽球細胞若しくは望ましくない細胞増殖が存在する又はリンパ系悪性腫瘍及び骨髄性悪性腫瘍の両方を含む血液の癌と診断されるあらゆる癌であり得る。骨髄性悪性腫瘍には、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病（又は骨髄球性白血病若しくは骨髄原性白血病若しくは骨髄芽球性白血病）（未分化型又は分化型）が含まれる。
個体における癌細胞は、個体において正常な体細胞とは免疫学的に異なってもよい（すなわち、癌性腫瘍が免疫原性であってもよい）。例えば、癌細胞は、個体において、癌細胞によって発現される１つ以上の抗原に対する全身免疫応答を誘発可能な場合がある。免疫応答を誘発する腫瘍抗原は、癌細胞に特異的であってもよく、又は個体において１つ以上の正常細胞によって共有されてもよい。
上に記載される治療に適した個体は、齧歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えばマウス）、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物（例えばネコ）、ウマ科動物（例えばウマ）、霊長類、真猿類（simian）（例えばサル（monkey)又は類人猿（ape））、サル（例えばマーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、又はヒト等の哺乳動物であってもよい。
好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療有効性を実証するモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えば、ネズミ科動物、霊長類、ブタ、イヌ科動物、又はウサギの動物）が利用され得る。
幾つかの実施形態では、最初の癌治療の後、個体は微小残存病変（ＭＲＤ：minimal residual disease）を有する場合がある。
癌を伴う個体は、当該技術分野に既知の臨床基準に従って癌の診断を行うのに十分な少なくとも１つの識別可能な兆候、症状、又は検査所見を示し得る。かかる臨床基準の例は、Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001等の医学の教科書に見ることができる。幾つかの例では、個体における癌の診断は、該個体から得られた体液又は組織の試料中の特定の細胞型（例えば、癌細胞）の特定を含む場合がある。
例えば、本発明による改変Ｔ細胞の集団、医薬組成物、治療方法、又は療法において使用される改変Ｔ細胞の集団に関連し得る抗腫瘍効果は、腫瘍成長速度の低下、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、又は癌状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果である。これは、任意に、ビヒクルによる治療を含む若しくは治療を含まない又はＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞の集団による治療を含むコントロール又はコントロール個体と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定され得る。「抗腫瘍効果」はまた、第一に腫瘍の発生の予防における、例えば予防的治療としての、本明細書に記載されるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団の能力によって現れ得る。抗腫瘍効果は、例えば本明細書で上記されたコントロール又はコントロール個体と比較した、治療された個体のＴＴＰ（無増悪期間）、ＯＳ（全生存期間）、又はＰＦＳ（無増悪生存期間）の改善の測定によって決定され得る。
治療は、ヒト又は動物のいずれかの（例えば、獣医学的用途での）幾らかの所望の治療効果、例えば病態の進行の抑制又は遅延が達成されるあらゆる治療又は療法であり得て、これには、治療をしていない場合に予想されるものを超える又は例えば本明細書で上記されたコントロール若しくはコントロール個体と比較した被験体又は患者の、例えばＴＴＰ（無増悪期間）、ＯＳ（全生存期間）、又はＰＦＳ（無増悪生存期間）の改善によって測定される、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒又は寛解（部分的又は全体的のいずれか）、病態の１つ以上の症状及び／又は徴候の予防、遅延、軽減若しくは停止、又は生存延長が含まれる。
治療はまた、予防的（すなわち予防法）であり得る。例えば、癌を発生又は再発しやすい又はそのリスクにある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。そのような治療は、任意に例えば本明細書に上記されたコントロール又はコントロール個体と比較して、個体における癌の発生又は再発を予防又は遅延し得る。
特に、治療は、癌の完全寛解及び／又は癌転移の阻害を含む、癌成長の阻害を含み得る。癌成長は、一般的には、癌においてより発達した形態への変化を示す多くの指標のいずれか１つを指す。したがって、癌成長の阻害を測る指標として、癌細胞生存の減少、腫瘍体積又は形態の減少（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像検査法を使用して決定される）、腫瘍成長の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験における成績の改善、Ｔ細胞の活性の増加、及び腫瘍特異抗原のレベルの減少が挙げられる。本明細書に記載されるように改変されたＴ細胞の投与は、癌成長、特に被験体に既に存在する癌の成長に抵抗する及び／又は個体における癌成長の傾向を減少する個体の能力を改善し得る。
改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞を含む医薬組成物は、全身的／局所的又は所望の作用部位にかかわらず、限定されないが、非経口、例えば注入、静脈内又は皮下によるものを含む任意の簡便な投与経路によって被験体に投与され得る。注入は、針又はカテーテルによる好適な組成物中のＴ細胞の投与を含む。典型的には、Ｔ細胞は静脈内又は皮下に注入されるが、Ｔ細胞は筋肉内注射及び硬膜外経路等の他の非経口経路によって注入されてもよい。好適な注入技術は当該技術分野で知られており、治療法において一般的に使用される（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med., 319:1676, 1988を参照されたい）。
典型的には、投与される細胞の数は、必要に応じて治療を繰り返して、例えば数日～数週間の間隔で、典型的には３０分間の間に、体重１ｋｇ当たり約１０５個～約１０１０個、典型的には１個体当たり２×１０８個～２×１０１０個の細胞である。改変Ｔ細胞及び改変Ｔ細胞を含む組成物の適切な投薬量は、患者によって変化し得ることが十分理解される。最適な投薬量を決定することは、一般的には、本発明の治療のあらゆるリスク又は健康に害のある副作用に対する治療利益のレベルの釣り合いを取ることを含む。選択される投薬量のレベルは、限定されないが、特定の細胞の活性、投与経路、投与時間、細胞の喪失又は不活性化の速度、治療期間、併用される他の薬物、化合物及び／又は物質、並びに患者の年齢、性別、体重、病状、全身の健康状態、及び以前の病歴を含む様々な因子に依存する。細胞の量及び投与経路は、最終的には医師の裁量によるが、一般的には、投薬量は、実質的に有害な又は健康に害のある副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する、作用部位における局所濃度を達成するものとなる。
改変Ｔ細胞が単独で投与される場合、幾つかの状況では、改変Ｔ細胞は、改変Ｔ細胞の集団のｉｎ ｖｉｖｏでの拡大を促進するため、標的抗原、標的抗原を提示するＡＰＣ、及び／又はＩＬ－２と組み合わせて投与される細胞であってもよい。
改変Ｔ細胞の集団は、サイトカイン、例えばＩＬ－２、細胞傷害性化学療法、放射線、並びに抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＴＩＭ３、抗ＫＩＲ、抗ＬＡＧ３、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４の抗体等のチェックポイント阻害剤を含む癌免疫療法剤等の１つ以上の他の治療法と任意に別々に、逐次に又は同時に組み合わせて投与されてもよい。
本発明によれば、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団は、少なくとも１つの、任意に１つ、２つ、３つ又は４つの外因性及び／又は組換え共刺激リガンドを更に含み得る及び／又は更に発現し得る。ＴＣＲと少なくとも１つの外因性共刺激リガンドとの間の相互作用は、細胞の非抗原特異的シグナル及び活性化をもたらし得る。共刺激リガンドには、限定されるものではないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバー、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが含まれる。ＴＮＦは全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主な役割は、免疫細胞の調節である。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、多くの共通の特徴を共有している。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの大部分は、短い細胞質セグメントと比較的長い細胞外領域とを含むＩＩ型の膜貫通型タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーには、限定されるものではないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦＰ）／リンフォトキシン－アルファ（ＬＴａ）、リンフォトキシン－ベータ（ＴＴｂ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ－１、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が含まれる。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識プロセス、結合プロセス、又は接着プロセスに関与する細胞表面タンパク質及び可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンと構造的な特徴を共有しており、これらは免疫グロブリンドメイン（フォールド）を有している。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとしては、限定されるものではないが、ＣＤ８０及びＣＤ８６（両者ともＣＤ２８のためのリガンド）が挙げられる。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明によれば、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団は、少なくとも１つの外因性及び／又は組換え共刺激リガンドを更に含み得て、これらは、４－１ＢＢＬ又はＣＤ８０、好ましくは４－１ＢＢＬ、代替的には４－１ＢＢＬ及びＣＤ８０であり得る。
１つ以上の他の治療薬を、好ましくは改変Ｔ細胞の投与の部位とは別の部位において、本明細書に記載される任意の簡便な手段又は治療経路によって投与してもよい。
改変Ｔ細胞の投与は、１用量で、連続的に又は一連の治療を通して断続的に（例えば、適切な間隔で分割された用量で）達成されてもよい。投与に最も有効な手段及び投薬量を決定する方法は当業者によく知られており、治療法に使用される製剤、治療目的、治療される標的細胞、及び治療される被験体によって変化する。主治医によって選択される用量レベル及び投薬パターンによって単回又は複数回の投与が行われ得る。改変Ｔ細胞は、任意で少なくとも１×１０９個のＴ細胞の単回の注入で投与されることが好ましい。典型的には、投与される細胞数は、典型的には３０分間にわたって、体重１ｋｇ当たり約１０５個～約１０１０個、典型的には１個体当たり２×１０８個の細胞～２×１０１０個の細胞であり、必要に応じて、例えば数日から数週間の間隔で治療が繰り返される。細胞の適切な投薬量、細胞の量、及び投与経路は、最終的には医師の裁量となることが理解されるであろう。
本発明の他の態様は、本明細書に記載される改変Ｔ細胞の生成のための核酸及び他の試薬を提供する。
本発明による単離された核酸は、癌細胞に又は癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチド、癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示されるペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に特異的に結合するＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、ＣＤ８補助受容体をコードするヌクレオチド配列とを含み得て、好ましくは、ＴＣＲは、ＭＡＧＥ－Ａ４に特異的に結合する。
コーディング配列は、同一の若しくは異なるプロモーター又は他の調節エレメントに制御可能に連結され得る。好適な調節エレメント又はプロモーターは当該技術分野でよく知られており、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１α）等の哺乳動物プロモーターが挙げられる。幾つかの実施形態では、コーディング配列は、切断認識配列によって分離され得る。これは、ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲが、フーリン（furin）等の部位特異的プロテアーゼによって細胞内での切断を経て２つの別々のタンパク質を生成する、単一融合物として発現されることを可能とする。好適な切断認識配列として、２Ａ－フーリン配列が挙げられる。
ＣＤ８補助受容体及びＴＣＲをコードするヌクレオチド配列は、同一の発現ベクターに位置してもよい。例えば、好適な発現ベクターは、上に記載される核酸を含んでもよい。或いは、コーディング配列は、別々のベクターに位置してもよい。
好適なベクターは当該技術分野でよく知られており、上により詳しく記載される。
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含んだ好適なベクターが選択又は構築され得る。ベクターは、哺乳動物細胞において核酸の発現を駆動するため、適切な調節配列を含むことが好ましい。また、ベクターは、Ｅ．コリ（E.coli）等の細菌宿主においてその選択、発現及び複製を可能とする複製起点、プロモーター領域、及び選択マーカー等の配列も含み得る。好ましいベクターとして、ＶＳＶｇ－偽型自己不活性化ベクターを含むレンチウイルスのベクター等のレトロウイルスベクターが挙げられる。
レンチウイルス等のウイルスベクターは、１つ以上のウイルスタンパク質によってカプセル化された核酸ベクターを含むウイルス粒子に含まれてもよい。ウイルス粒子は、本明細書中に記載のウイルスベクターと、１つ以上のウイルスのパッケージングベクター及びエンベロープベクターとで哺乳動物細胞を形質導入することと、形質導入された細胞が培養培地中に放出されるウイルス粒子又はレンチウイルス粒子を産生する（任意にウイルス粒子又はレンチウイルス粒子は精製される）ように、細胞を培地において培養することとを含む方法によって産生することができる。
ウイルス粒子の放出に続いて、ウイルス粒子を含む培養培地を収集してもよく、任意にウイルス粒子を濃縮してもよい。
産生及び任意の濃縮に続いて、ウイルス粒子を、例えば、Ｔ細胞の形質導入における使用の準備が整った状態で－８０℃において凍結することにより保管してもよい。
本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」という用語によって置き換えられる「含む、備える（comprising）」という用語を有する上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」という用語によって置き換えられる「含む、備える（comprising）」という用語を有する上に記載される態様及び実施形態を提供する。
本出願は、別段の要求がない限り、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、別段の要求がない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。
上の実施形態の変形形態、更なる実施形態及びそれらの変形形態は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様又は同等のあらゆる組成物及び方法を、本開示の方法の実施又は試験において使用することができるが、例示的な組成物及び方法は本明細書に記載されている。本明細書に記載される開示のどの態様及び実施形態を組み合わせることもできる。例えば、本明細書に開示される任意の従属請求項又は独立請求項の主題を複数組み合わせることができる（例えば、各従属請求項からの１つ以上の引用を、それらが従属する独立請求項に基づいて単一の請求項に組み合わせることができる）。
本明細書で示される範囲には、記載される特定の範囲内の全ての値と、特定の範囲についての端点に関する値とが含まれる。本開示の図及び表は、本明細書に開示される方法のいずれかの要素を構成し得る範囲及び個別の値も記載している。本明細書に記載される濃度は、周囲温度及び周囲圧力で決定される。これは、例えば、室温での又はプロセスの流れの特定の部分内での温度及び圧力であり得る。好ましくは、濃度は、２５℃及び１ｂａｒの圧力の標準状態で決定される。「約」という用語は、任意の特定の測定値についての平均値の２標準偏差内の値を意味する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合に、単数形（"a"、"and"、及び"the"）は、文脈上別段の規定がない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば「ペプチド鎖（a peptide chain）」は、１つ以上のペプチド鎖に対する参照であり、当業者に既知のその均等物を含む。
本明細書で言及される全ての文献及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。
本発明は更に、以下の態様を提供する：
１．異種補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団であって、任意にＴＣＲ及び補助受容体が組み換えられており、任意に補助受容体がＣＤ８補助受容体である、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
２．異種ＴＣＲが、癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチドに結合する又は特異的に結合する、態様１の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
３．異種ＴＣＲが、任意に癌状態に関連するペプチド、ペプチド抗原、若しくは抗原性ペプチドに結合する若しくは特異的に結合し、又は任意に癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示される癌抗原若しくは腫瘍抗原のペプチド若しくはペプチド断片に結合する、態様１の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
４．ペプチド、ペプチド抗原、抗原性ペプチド、又はペプチド断片が、ペプチド提示分子、任意に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、任意にクラスＩ又はクラスＩＩと複合体を形成しており、任意にペプチドが、ＨＬＡ－Ａ２又はＨＬＡ－Ａ＊０２又はＨＬＡ－Ａ＊０２０１と複合体を形成している、態様２又は３のいずれかの改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
５．異種ＴＣＲが、ペプチド、ペプチド抗原、抗原性ペプチド、又はペプチド断片、癌精巣抗原である癌抗原又は腫瘍抗原又はそれらのペプチドに結合する、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
６．異種ＴＣＲが、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）、ｇｐ１００（糖タンパク質１００）、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫で優先的に発現される抗原）、ｐ５３、ＨＰＶ－Ｅ６／ＨＰＶ－Ｅ７（ヒトパピローマウイルス）、ＨＢＶ、ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、サイログロビン、ＴＧＦＢＩＩフレームシフト抗原、ＬＡＧＥ－１Ａ、ＫＲＡＳ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、及びＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０若しくはＭＡＧＥ－Ａ１２、又はそれらのペプチドのいずれかに結合する、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
７．異種ＴＣＲが、腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ４又はそのペプチド、好ましくは配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１８）に結合する、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
８．異種ＴＣＲが、癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチド及び／又はペプチド提示分子に特異的に及び／又は選択的に結合する、態様２～７のいずれかの改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
９．異種ＣＤ８補助受容体が、ヘテロ二量体又はホモ二量体、ＣＤ８αβヘテロ二量体又はＣＤ８ααホモ二量体である、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
１０．異種ＣＤ８補助受容体が、
（ａ）アミノ酸配列ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ（配列番号１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＬＳＱＮＫＰＫ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性のＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＬＳＮＳＩＭ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性のＣＤＲ３、
（ｂ）アミノ酸配列ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ（配列番号１５）のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＬＳＱＮＫＰＫ（配列番号１６）のＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＬＳＮＳＩＭ（配列番号１７）のＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｄ）配列番号１の配列を有するアミノ酸配列、
を含む、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
１１．異種ＴＣＲが、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、
（ｉ）α鎖可変ドメインが、
ＶＳＰＦＳＮ（αＣＤＲ１）、配列番号９、又は配列番号３のアミノ酸４８～５３の配列、
ＬＴＦＳＥＮ（αＣＤＲ２）、配列番号１０、又は配列番号３のアミノ酸７１～７６の配列、及び、
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ（αＣＤＲ３）、配列番号１１、又は配列番号３のアミノ酸１１１～１２５の配列、
を有するＣＤＲを含み、かつ、
（ｉｉ）β鎖可変ドメインが、
ＫＧＨＤＲ（βＣＤＲ１）、配列番号１２、又は配列番号５のアミノ酸５０～５４の配列、
ＳＦＤＶＫＤ（βＣＤＲ２）、配列番号１３、又は配列番号５のアミノ酸６８～７３の配列、及び、
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ（βＣＤＲ３）、配列番号１４、又は配列番号５のアミノ酸１１０～１２３の配列、又はこれらの配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
を有するＣＤＲを含む、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
１２．異種ＴＣＲが、α鎖可変ドメインが配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又はβ鎖可変ドメインが配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲを含む、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
１３．Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、及び／又はＴ細胞の集団がＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含む、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
１４．改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団が、異種ＣＤ８補助受容体を欠くＴ細胞又はＴ細胞の集団と比較して、任意に癌抗原若しくは腫瘍抗原、又は癌抗原若しくは腫瘍抗原の又は癌細胞若しくは癌組織の腫瘍によって提示されるペプチド若しくは癌ペプチド、抗原性ペプチド、ペプチド断片に応答して、ＣＤ４０Ｌの発現、サイトカイン産生、細胞傷害活性、樹状細胞成熟の誘導若しくは樹状細胞サイトカイン産生の誘導の改善若しくは増加を有する、任意の上記の態様の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
１５．上記の態様のいずれかによる異種ＴＣＲ及び異種補助受容体をコードする核酸。
１６．核酸が異種補助受容体をコードする第１のヌクレオチド配列及び異種ＴＣＲをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、態様１５の核酸。
１７．任意にベクターが、発現ベクターであり、任意に核酸のコードされた異種ＴＣＲ及び異種補助受容体の発現のための調節エレメントを更に含む、態様１５又は１６のいずれかの核酸を含むベクター。
１８．第１のヌクレオチド配列が、それぞれＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖をコードする単一のオープンリーディングフレーム内に又は２つの異なるオープンリーディングフレーム内にあり、かつ第２のヌクレオチド配列が、それぞれ補助受容体α鎖及び補助受容体β鎖又はそれぞれ補助受容体α鎖及び補助受容体α鎖をコードする単一のオープンリーディングフレーム内に又は２つの異なるオープンリーディングフレーム内にある、態様１６の核酸を含む態様１７のベクター。
１９．態様１５若しくは１６の核酸又は態様１７若しくは１８のベクターを含むウイルス粒子。
２０．態様１５若しくは１６の核酸又は態様１７若しくは１８のベクターを含む、態様１～１４による改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
２１．１つ以上の外因性共刺激リガンド又は組換え共刺激リガンドを更に含む、態様１～１４又は２０のいずれか１つの改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
２２．任意に態様１９のウイルス粒子内に含まれている態様１５若しくは１６のいずれかの核酸の１コピー若しくは２コピー以上又は態様１７若しくは１８のいずれかのベクターをＴ細胞又はＴ細胞の集団に導入することを含み、任意にＴ細胞若しくはＴ細胞の集団に１つ以上の外因性共刺激リガンド又は組換え共刺激リガンドをコードする核酸又は上記核酸を含むベクターを更に導入することを含む、態様１～１４のいずれか１つの改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を作製する方法。
２３．改変Ｔ細胞（単数又は複数）又はその集団が増殖し及び／又は集団を拡大するように改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、任意に引き続き集団の改変Ｔ細胞を分離及び／又は精製することを更に含む、態様２２の方法。
２４．態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、又は態様１９のウイルス粒子と共に、１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は添加剤を含む、医薬組成物。
２５．医療に使用される、態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、又は態様２４の医薬組成物。
２６．癌及び／又は腫瘍の治療に使用され、任意に治療が癌免疫療法及び／又は養子Ｔ細胞療法、任意に自家養子Ｔ細胞療法又は同種異系養子Ｔ細胞療法である、態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、又は態様２４の医薬組成物。
２７．個体における癌及び／又は腫瘍を治療する方法であって、個体に態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、又は態様２４の医薬組成物を投与することを含み、任意に、治療が、癌免疫療法及び／又は養子Ｔ細胞療法、任意に自家養子Ｔ細胞療法又は同種異系養子Ｔ細胞療法である、方法。
２８．癌及び／又は腫瘍の治療用の医薬の製造における、態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、又は態様２４の医薬組成物の使用であって、任意に、治療が、癌免疫療法及び／又は養子Ｔ細胞療法、任意に自家養子Ｔ細胞療法又は同種異系養子Ｔ細胞療法である、使用。
２９．癌が固形腫瘍である、態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、態様２４の医薬組成物、態様２６による使用、態様２７の方法、又は態様２８の使用。
３０．癌が、滑膜肉腫、粘液型／円形細胞脂肪肉腫（ＭＲＣＬＳ）、頭頸部癌、頭頸部ＳＣＣ（扁平上皮癌）、黒色腫、食道癌、卵巣癌、胃癌（胃部）、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺ＮＳＣＬＣ（扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌、大細胞癌）、転移性又は進行性ＮＳＣＬＣ、尿路上皮癌又は腫瘍、食道胃接合部癌（ＥＧＪ）のいずれか１つから選択され、任意に癌又は腫瘍がＭＡＧＥタンパク質又はペプチド、任意にＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質又はペプチドを発現する、態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、態様２４の医薬組成物、態様２６による使用、態様２７の方法、又は態様２８若しくは２９の使用。
３１．癌が、肝臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、転移性胃部癌、転移性胃癌、転移性肝臓癌、転移性卵巣癌、転移性膵臓癌、転移性結腸直腸癌、転移性肺癌、結腸直腸癌又は結腸直腸腺癌、肺癌又は肺腺癌、膵臓癌又は膵臓腺癌、粘液性腺腫、膵管癌のいずれか１つから選択される、態様１～１４、２０若しくは２１のいずれか１つの改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６のいずれかの核酸、態様１７若しくは１８のいずれかのベクター、態様１９のウイルス粒子、態様２４の医薬組成物、態様２６による使用、態様２７の方法、又は態様２８若しくは２９の使用。
３２．改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団、核酸、ベクター、ウイルス粒子、又は医薬組成物が、任意に投与される又は別々に、逐次に若しくは同時に投与される１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するための又は使用される、態様１～１４、２０若しくは２１の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、態様１５若しくは１６の核酸、態様１７若しくは１８のベクター、態様１９のウイルス粒子、態様２４の医薬組成物、態様２６による使用、態様２７の方法、又は態様２８若しくは２９の使用。
本発明を、以下の非限定的な実施例において添付の図面を参照することによって更に説明する。
ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット内のＣＤ４０Ｌ＋細胞の存在比率を示す図である。ＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞の存在比率を、Ｔ細胞の刺激なしで（Ｔ細胞のみ）、抗原陰性標的細胞（Ｃｏｌｏ２０５）又は抗原陽性標的細胞（Ａ３７５）で刺激して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団のＴＣＲ陰性（ＴＣＲ－）サブセット及びＴＣＲ陽性（ＴＣＲ＋）サブセットにおいて決定した。ペプチドパルスされた（＋Ｐ）標的細胞は、コントロールとしての役割を果たした（右側のグラフ）。箱ひげ図は、試験された５つの全てのＷａｖｅ産物についてのデータをまとめたものであり、これらの中でそれぞれの個別のデータ点は１つのＷａｖｅ産物を表す。Ｒを使用して被験者内要因としてのサブセット（すなわちＣＤ４／８）、ＴＣＲ＋／－、及び形質導入レベルに関する三元反復測定ＡＮＯＶＡに続いてサブセット／ＴＣＲの組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてのペアワイズ事後検定により、統計的有意性を評価し、Holm法を使用してｐ値を調整した。 抗原陽性Ａ３７５に応答した形質導入されたＣＤ４＋リンパ球及びＣＤ８＋リンパ球の増殖指数を示す図である。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ（白色）及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ（白色）を発現するＣＤ８＋Ｖａｌｐｈａ２４＋（Ａ）細胞及びＣＤ４＋Ｖａｌｐｈａ２４＋（Ｂ）細胞について、全ての応答する細胞が経た分裂の平均数をプロットした。ＰＩを４つの別個のドナーについて、４つのドナー全体の合計平均±ＳＥＭとして示した。二元ＡＮＯＶＡに続いて群間の分散についてのSidak事後多重比較検定を使用して、統計的有意性を評価した。 抗原に応答したＩＦＮγの産生を示す図である。５×１０４個のＴ細胞を、Ａ）５×１０４個のＴ２細胞及びｘ軸に示されるＭＡＧＥ－Ａ４のＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶペプチドのタイトレーション、又はＢ）５×１０４個の抗原陽性Ａ３７５細胞のいずれかと共に同時インキュベートした。２４時間後に上清を採取し、後のＭａｇｐｉｘ（商標）による分析のために凍結させた。５つのアッセイからのデータを整理し、Ｒを使用して分析した（ＣＥＬ＿ＡＮＡ１８＿０２１）。列はＴ細胞ドナー（Ｗａｖｅ２１３～２１７）を示し、行は異なるＴ細胞画分（混合ＰＢＬ産物、分離ＣＤ４＋又は分離ＣＤ８＋）を示した。Ｔ細胞形質導入は、色によって、すなわち非形質導入（ｎｔｄ）＝灰色、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝白色、そしてＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝黒色によって示されている。Ａ）データは２つの生物学的反復の平均±ＳＥＭとして表される。応答曲線を、４パラメーターｌｏｇロジスティック関数を使用してベースラインを０に制約して当てはめた。Ｂ）各点は１つの生物学的反復（biological replicate）を表す。データはＣＥＬ＿ＡＮＡ１８＿０２１に整理した。 抗原に応答したＩＬ－２の産生を示す図である。５×１０４個のＴ細胞を、Ａ）５×１０４個のＴ２細胞及びｘ軸に示されるＭＡＧＥ－Ａ４のＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶペプチドのタイトレーション、又はＢ）５×１０４個の抗原陽性Ａ３７５細胞のいずれかと共に同時インキュベートした。２４時間後に上清を採取し、後のＭａｇｐｉｘ（商標）による分析のために凍結させた。５つのアッセイからのデータを整理し、Ｒを使用して分析した（ＣＥＬ＿ＡＮＡ１８＿０２１）。列はＴ細胞ドナー（Ｗａｖｅ２１３～２１７）を示し、行は異なるＴ細胞画分（混合ＰＢＬ産物、分離ＣＤ４＋又は分離ＣＤ８＋）を示した。Ｔ細胞形質導入は、色によって、すなわちｎｔｄ＝灰色、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝白色、そしてＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝黒色によって示されている。Ａ）データは２つの生物学的反復の平均±ＳＥＭとして表される。応答曲線を、４パラメーターｌｏｇロジスティック関数を使用してベースラインを０に制約して当てはめた。Ｂ）各点は１つの生物学的反復を表す。データはＣＥＬ＿ＡＮＡ１８＿０２１に整理した。 樹状細胞共培養アッセイにおけるＩＬ－１２（ｐ４０／ｐ７０）の産生を示す図である。左側、中央、及び右側のパネルは、示されるように、混合ＰＢＬ、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び分離ＣＤ８＋Ｔ細胞からのデータを示している。ｘ軸は、Ｔ細胞及び腫瘍のみ（「Ｔ細胞」）、Ｔ細胞、腫瘍及びＤＣ（「Ｔ細胞＋ＤＣ」）、腫瘍細胞のみ（「培地」）、又はＴ細胞を含まないＤＣ及び腫瘍細胞（「ＤＣ」）を示している。Ｔ細胞形質導入は、色によって、すなわちｎｔｄ＝灰色、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝白抜き黒色、そしてＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝塗りつぶされた黒色によって示されている。ＤＣ活性化についての追加のポジティブコントロールはＬＰＳ（塗りつぶされた三角形）であった。個々のプロットは複数のドナーについて示されている（ＴＥＡ及びＴＳＡ＝自家ＤＣを含む小規模なＴ細胞、Ｗａｖｅ２１６及びＷａｖｅ２１７＝ドナーＴＳＡからのＤＣと共培養された大規模なＴ細胞）。 ＤＣ共培養アッセイにおけるＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）の産生を示す図である。左側、中央、及び右側のパネルは、示されるように、混合ＰＢＬ、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び分離ＣＤ８＋Ｔ細胞からのデータを示している。ｘ軸は、Ｔ細胞及び腫瘍のみ（「Ｔ細胞」）、Ｔ細胞、腫瘍及びＤＣ（「Ｔ細胞＋ＤＣ」）、腫瘍細胞のみ（「培地」）、又はＴ細胞を含まないＤＣ及び腫瘍細胞（「ＤＣ」）を示している。Ｔ細胞形質導入は、色によって、すなわちｎｔｄ＝灰色、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝白抜き黒色、そしてＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝塗りつぶされた黒色によって示されている。ＤＣ活性化についての追加のポジティブコントロールはＬＰＳ（塗りつぶされた三角形）であった。個々のプロットは複数のドナーについて示されている（ＴＥＡ及びＴＳＡ＝自家ＤＣを含む小規模なＴ細胞、Ｗａｖｅ２１６及びＷａｖｅ２１７＝ドナーＴＳＡからのＤＣと共培養された大規模なＴ細胞）。 ＤＣ共培養アッセイにおけるＩＬ－６の産生を示す図である。左側、中央、及び右側のパネルは、示されるように、混合ＰＢＬ、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び分離ＣＤ８＋Ｔ細胞からのデータを示している。ｘ軸は、Ｔ細胞及び腫瘍のみ（「Ｔ細胞」）、Ｔ細胞、腫瘍及びＤＣ（「Ｔ細胞＋ＤＣ」）、腫瘍細胞のみ（「培地」）、又はＴ細胞を含まないＤＣ及び腫瘍細胞（「ＤＣ」）を示している。Ｔ細胞形質導入は、色によって、すなわちｎｔｄ＝灰色、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝白抜き黒色、そしてＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝塗りつぶされた黒色によって示されている。ＤＣ活性化についての追加のポジティブコントロールはＬＰＳ（塗りつぶされた三角形）であった。個々のプロットは複数のドナーについて示されている（ＴＥＡ及びＴＳＡ＝自家ＤＣを含む小規模なＴ細胞、Ｗａｖｅ２１６及びＷａｖｅ２１７＝ドナーＴＳＡからのＤＣと共培養された大規模なＴ細胞）。 ＤＣ共培養アッセイにおけるＩＦＮγの産生を示す図である。左側、中央、及び右側のパネルは、示されるように、混合ＰＢＬ、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び分離ＣＤ８＋Ｔ細胞からのデータを示している。ｘ軸は、Ｔ細胞及び腫瘍のみ（「Ｔ細胞」）、Ｔ細胞、腫瘍及びＤＣ（「Ｔ細胞＋ＤＣ」）、腫瘍細胞のみ（「培地」）、又はＴ細胞を含まないＤＣ及び腫瘍細胞（「ＤＣ」）を示している。Ｔ細胞形質導入は、色によって、すなわちｎｔｄ＝灰色、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝白抜き黒色、そしてＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ＝塗りつぶされた黒色によって示されている。ＤＣ活性化についての追加のポジティブコントロールはＬＰＳ（塗りつぶされた三角形）であった。個々のプロットは複数のドナーについて示されている（ＴＥＡ及びＴＳＡ＝自家ＤＣを含む小規模なＴ細胞、Ｗａｖｅ２１６及びＷａｖｅ２１７＝ドナーＴＳＡからのＤＣと共培養された大規模なＴ細胞）。 大きなＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織（約８００μｍ直径－１２００個の細胞／ウェルで播種した）に対するＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す図である。各ウェル中の微小組織の中心コアのＧＦＰ蛍光面積を、各処理について経時的に測定した（全ての条件について６回の反復の平均±ＳＥＭで示される）。点線はＴ細胞の添加を示している。黒い矢印は、アッセイ終点でのＣＤ４＋ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ Ｔ細胞及びＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞に関する微小組織面積の差を示している。データは、時間の経過に伴う各条件についての微小組織コアの蛍光面積として表されている。 大きなＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織に対するＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す図である。ＰＢＬ、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び分離ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分についてのｎｔｄ、ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４又はＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８に関する微小組織の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す散布図。各データ点は、各Ｗａｖｅ産物に関する全ての条件についてのｎ＝６の平均を示している。全てのデータは、Ｔ細胞添加の時点に正規化されて示されている。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、小さな微小組織について各ドナー画分内で全体的な正規化されたＡＵＣデータを比較した（ｎｓ＝非有意；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 大きなＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織（約８００μｍ直径－１２００個の細胞／ウェルで播種した）に対するＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す図である。各ウェル中の微小組織の中心コアのＧＦＰ蛍光面積を、各処理について経時的に測定した（全ての条件について６回の反復の平均±ＳＥＭで示される）。点線はＴ細胞の添加を示している。黒い矢印は、アッセイ終点でのＣＤ４＋ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ Ｔ細胞及びＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞に関する微小組織面積の差を示している。データは、時間の経過に伴う各条件についての微小組織コアの蛍光面積として表されている。 大きなＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織に対するＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す図である。ＰＢＬ、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び分離ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分についてのｎｔｄ、ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４又はＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８に関する微小組織の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す散布図。各データ点は、各Ｗａｖｅ産物に関する全ての条件についてのｎ＝６の平均を示している。全てのデータは、Ｔ細胞添加の時点に正規化されて示されている。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、小さな微小組織について各ドナー画分内で全体的な正規化されたＡＵＣデータを比較した（ｎｓ＝非有意；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 小さな（Ａ）及び大きな（Ｂ）ＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織（約８００μｍ直径－１２００個の細胞／ウェルで播種した）に対するＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す図である。Ｗａｖｅドナー２１７Ｔ細胞についての代表的な画像は、アッセイの間の以下の時点：Ｔ細胞添加の４時間前（＝標的播種の１４３時間後）、Ｔ細胞添加の０時間後（＝標的播種の１４７時間後）、Ｔ細胞添加の１４１時間後（＝標的播種の２８８時間後）、Ｔ細胞添加の４３８時間後（＝標的播種の５８５時間後）でのｎｔｄのＣＤ４＋Ｔ細胞、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（８００００個の細胞／ウェル）によるＧＦＰ蛍光微小組織を示している。 Ａ３７５．ＧＦＰ ３Ｄ微小組織との共培養におけるｎｔｄのＴ細胞、ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ Ｔ細胞及びＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ Ｔ細胞によるＩＦＮγ及びグランザイムＢの放出を示す図である。Ｔ細胞添加の約５０時間後に、二重反復アッセイプレートから上清を収集した。上清中のＩＦＮγ（Ａ）及びグランザイムＢ（Ｂ）のレベルを、４倍の試料希釈後にＥＬＩＳＡによって測定した。グラフは、小さな（約５０５μｍ～６００μｍの直径）又は大きな（約８００μｍの直径）Ａ３７５．ＧＦＰ ３Ｄ微小組織と共にインキュベートされたＰＢＬ、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞、ＭＡＧＥ－Ａ４－ＣＤ８ ＴＣＲ Ｔ細胞、又はｎｔｄのＴ細胞によって産生されるサイトカインのレベルを示している。各データ点は、各Ｗａｖｅ産物に関する全ての条件についてのｎ＝６の平均を示している。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、小さな又は大きな微小組織に対して各ドナー画分内で全体的なＩＦＮγ及びグランザイムＢの放出を比較した（ｎｓ＝非有意；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。注記．最大検出可能範囲を超える測定されたグランザイムＢサイトカイン値は、最高の測定可能な値（＝４００００ｐｇ／ｍｌ）と等しい値に割り当てられた。
この第２世代のＴＣＲ研究において、ＣＤ８αホモ二量体を、特定のペプチド強化親和性受容体（ＳＰＥＡＲ）ＭＡＧＥ－Ａ４ｃ１０３２ＴＣＲ（本明細書では、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ）、すなわち現在臨床試験（ＮＣＴ０３１３２９２２）で試験されている第１世代のＴＣＲに追加した。
ＨＬＡクラスＩ拘束性の特定のペプチド強化親和性受容体（ＳＰＥＡＲ）ＴＣＲを末梢血リンパ球に形質導入することで、同じ特異性の細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞及びヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞の両方が作製されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ８補助受容体の欠如は、操作されたＴＣＲの結合アビディティに影響を与え得る。操作されたＴＣＲ ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ｃ１０３２（本明細書ではＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４）に沿ってＣＤ４＋Ｔ細胞にＣＤ８α補助受容体を追加すると、ＴＣＲ結合アビディティが高まり、腫瘍抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の多機能応答が増強され、それにより樹状細胞（ＤＣ）活性化及び細胞傷害性の増強を通じて腫瘍に対する免疫応答が拡大することが予想された。
実施例１．改変Ｔ細胞の作製
以下の実験の目的は、形質導入されたヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＬＡクラスＩ及びペプチド抗原複合体とのＴＣＲ相互作用の安定性が、細胞傷害性Ｔ細胞上に一般的に存在するＣＤ８補助受容体の存在によって促進され、それによりクラスＩ抗原に応答してＣＤ４＋Ｔ細胞機能の改善をもたらし、腫瘍抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の多機能応答を増強するかどうかを調査することであった。
ヒトＴ細胞をレンチウイルスで形質導入して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを認識する親和性増強ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ（配列番号３及び配列番号５）及び分化クラスターＣＤ８α（ホモ二量体）補助受容体（配列番号１）を構成的に共発現させた。ＣＤ８αを欠いたコントロールＴ細胞も提供された。
ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の一過性トランスフェクションによって、ＣＤ８αを有する又は有しない強化親和性ＴＣＲをコードするレンチウイルス粒子を作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞をトランスフェクションの４８時間～７２時間前に５層のセルファクトリーで播種して、単一のレンチウイルス導入遺伝子プラスミド（ＣＤ８αを有する又は有しないＴＣＲをコードする）及び一連の補完的なレンチウイルスパッケージングプラスミドで同時トランスフェクションしたときに６０％～８０％の集密度を確保した。複製欠損型レンチウイルス粒子を４８時間～７２時間にわたって作製し、これらを上清から回収し、遠心分離を介して濃縮し、凍結保存した。レンチウイルスの生物学的力価測定を実施して、最適な形質導入効率を得て、Ｔ細胞形質導入のために約１の感染多重度（ＭＯＩ）を得るのに必要とされるレンチウイルスベクターの容量を得た。
高力価レンチウイルス懸濁液の添加による形質導入のために「Ｗａｖｅ」Ｔ細胞を得て、拡大させた。「Ｗａｖｅ」拡大のために、凍結保存された健康なヒトドナーロイコパック（正常な末梢血から収集された濃縮白血球アフェレーシス製品）からＣＤ３＋Ｔ細胞を分離し、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆されたマイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣＴＳ、Life Technologies）を使用して刺激した。ＣＤ３＋細胞を、「Ｗａｖｅ」プラットフォーム（Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、GE Healthcare Life Sciences）を使用して拡大させて、Ｔ細胞産物を得た。
大規模な「Ｗａｖｅ」Ｔ細胞を、ヒトＰＢＭＣから取得した。２．０×１０９個～２．５×１０９個のヒトＰＢＭＣを含むロイコパックを解凍し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆されたマイクロビーズを使用して分離し、ＶｕｅＬｉｆｅバッグにＣＤ３＋細胞を播種した。各ドナーにつき、幾つかのＶｕｅＬｉｆｅバッグに播種した：３つは非形質導入（ｎｔｄ）のＴ細胞を生成し、３つはＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲのみを生成し、２つはＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞を生成した。引き続き、１のＭＯＩを得るのに適切な容量のレンチウイルスベクターでＣＤ３＋細胞を形質導入した。成長期間の後に、細胞を洗浄し、新しいＶｕｅＬｉｆｅバッグに入れた。細胞数を毎日監視し、培地の容量を必要に応じて最大５００ｍＬまで増やした。全ての条件が１５０×１０６個の細胞を上回ったら、細胞をＷａｖｅバッグ及びＸｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに移した。その後に、拡大させたＴ細胞をＷＡＶＥバッグから回収し、Ｔ細胞を洗浄してプールした。ビーズを細胞から除去した後に、後の分析のために複数のアリコートで採取、洗浄、及び凍結保存を行った。
幾つかの実験では、Ｔ細胞産物から精製されたＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋細胞を分離する必要があった。細胞分離手順を凍結保存の日に実施し、アッセイの準備ができた事前に分離されたバイアルを得た。ＣＤ４＋細胞の減少によって、ＣＤ８＋細胞集団を負に選択した。このために、Miltenyi BiotecのＣＤ４マイクロビーズを製造業者の使用説明書に従って使用した。α／β ＣＤ８ヘテロ二量体を有するネイティブＣＤ８細胞にのみ結合するＣＤ８β抗体で、ＣＤ４＋細胞集団を負に選択した。要するに、１．０×１０７個のＴ細胞を５μｇのマウス抗ヒトＣＤ８β抗体（クローン３ＴＵ９６Ｉ８、Creative Diagnostics）と共に４℃で３０分間インキュベートした（必要に応じて量を調整した）。１回の洗浄サイクルで、抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（Miltenyi）を製造業者のプロトコルに従って使用して、ＬＤカラム（Miltenyi）において非結合の画分を負に選択した。得られた画分の純度をフローサイトメトリーによって決定した。
以下のように、ＣＤ４細胞に焦点を当て、ＣＤ４０Ｌの活性化、サイトカイン放出及び標的細胞の直接殺傷を決定して、Ｔ細胞と樹状細胞との間の相互作用を調査することによって、Ｔ細胞活性化を測定した。
実施例２．刺激後のＣＤ４０Ｌ表面発現の評価
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４としても知られる）は、ＴＮＦファミリーのメンバーである。ＣＤ４０リガンドは、主に活性化Ｔ細胞、優先的にはＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現される。ＣＤ４０リガンドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ４０に結合する共刺激分子として機能し、この文脈で最も重要なことには、これらのＡＰＣは抗原特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するようライセンシングされる。
ＣＤ４０Ｌの表面発現を一晩の刺激後にＷａｖｅ Ｔ細胞で分析した。このために、０．１×１０６個の標的細胞を０日目に９６ウェル平底プレートへと播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩接着させた。Ａ３７５細胞を抗原陽性標的細胞系統として使用し、Ｃｏｌｏ２０５を抗原陰性標的細胞系統として使用した。１日目にＴ細胞をエフェクター：標的比５：１（０．５×１０６個の細胞／ウェル）で抗ＣＤ４０Ｌ ＢＶ４２１抗体（５μｌ／ウェル）と共に添加した。同時に、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）を添加（２．６４μｌ／ｍｌのＲ１０最終濃度）して、細胞表面上のＣＤ４０Ｌ－抗体複合体を保持／安定化した。次いで、プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後に、ＣＤ３ ＦＩＴＣ、ＣＤ４ ＢＶ６５０、ＣＤ８ ＡＰＣｅＦ７８０、Ｖａｌｐｈａ２４ ＰＥ、及びＡＱＵＡで細胞を染色して、生きた形質導入Ｔ細胞及び特定のサブセットの特定を可能にした。Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０機器においてソフトウェアＦＡＣＳＤｉｖａバージョン８．０．１を使用してデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．３又はバージョン１０．４．１を使用してデータ分析を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２を用いてグラフを作成した。統計的有意性を、Ｒを使用して被験者内要因としてのサブセット（すなわちＣＤ４／８）、ＴＣＲ＋／－、及び形質導入レベルに関する三元反復測定ＡＮＯＶＡに続いて、サブセット／ＴＣＲの組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてペアワイズ事後検定により評価し、Holm法を使用してｐ値を調整した。
図１は、試験された５つのＷａｖｅ Ｔ細胞産物のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットのデータをまとめたものである。抗原陰性細胞系統（Ｃｏｌｏ２０５）との共培養後に、非形質導入（ｎｔｄ）Ｗａｖｅ Ｔ細胞と、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｗａｖｅ Ｔ細胞と、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ４＋ＴＣＲ Ｗａｖｅ Ｔ細胞との間でＣＤ４０Ｌ＋細胞の存在比率に差は見られない。これは、形質導入された細胞（ＴＣＲ＋）及びＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲの発現を欠く細胞（ＴＣＲ－）の両方に当てはまる。これらの存在比率はまた、単独で培養されたＴ細胞（Ｔ細胞のみ）で観察された存在比率と非常に類似している。細胞が抗原陽性標的細胞（Ａ３７５）と一緒に存在すると、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ形質導入Ｗａｖｅ Ｔ細胞のＣＤ４＋ＴＣＲ＋サブセット内でＣＤ４０Ｌ＋細胞の存在比率に増加が見られた。刺激されていないＴ細胞と比較して、ＣＤ４＋ＴＣＲ細胞上のＣＤ４０Ｌ＋の存在比率が増加した。抗原の認識及び活性化に続いて、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲで形質導入されたＷａｖｅ産物において有意に高い割合のＣＤ４＋ＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞が検出される。
実施例３．Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞抗原特異的機能に対するＣＤ８αホモ二量体の効果を、ＭＡＧＥ－Ａ４陽性細胞系統Ａ３７５に応答したＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞産物及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞産物内のＶａｌｐｈａ２４＋ＣＤ８＋（ＴＣＲ）Ｔ細胞サブセット及びＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの増殖指数（ＰＩ）を計算することによっても評価した（図２）。増殖指数は、応答している細胞が経た分裂の平均数を説明している。
細胞分裂の回数の簡単な検出を可能にする蛍光色素を使用したフローサイトメトリーによって、抗原に応答したＴ細胞の増殖を評価した。Ｔ細胞をバイオレットレーザー励起性色素ＶＰＤ４５０で染色して、親細胞を均一に標識した。分裂すると、色素は娘細胞間で均一に分布し、その後それぞれはその親細胞の蛍光強度のおよそ半分を保持する。したがって、色素強度の低下は細胞分裂、ひいては増殖を示す。
４つの異なるドナーからの非形質導入（ｎｔｄ）ｗａｖｅ Ｔ細胞産物、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ ｗａｖｅ Ｔ細胞産物及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ ｗａｖｅ Ｔ細胞産物を解凍し、トリプトファン除去ＲＰＭＩ中で２．０×１０６個の細胞／ｍｌで２６時間静置して、細胞同期を促進した。次いで、Ｔ細胞をＶＰＤ４５０で染色し、１０－５ＭのＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶの存在下又は不存在下で５：１のＴ細胞対標的細胞の比にて、単独で又は抗原提示細胞との共培養でインキュベートした。標的細胞の増殖を防ぐために、共培養の前に、抗原を提示するＡ３７５（ＭＡＧＥ－Ａ４陽性）及びＣｏｌｏ２０５（ＭＡＧＥ－Ａ４陰性）に照射（それぞれ約４８Ｇｙ及び約３３Ｇｙ）した。３日間の共培養後に、細胞を回収し、Ｔ細胞マーカー（ＴＣＲを標識するＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＶａｌｐｈａ２４）及び生存率について染色した。
ＣＤ４及びＣＤ８の総Ｔ細胞集団の両方において、ＴＣＲ陽性画分及びＴＣＲ陰性画分内でフローサイトメトリーを使用して増殖を評価した。Ｇ０ゲートを設定するガイドとして形質導入された試料及びｎｔｄの試料からのＴ細胞のみを使用して、増殖ピークを手動でゲーティングした。これは非分裂細胞を表した。Ｇ０ゲートをゲーティングした後に起こった分裂細胞の各世代（Ｇ１、Ｇ２…Ｇｘ）をピークＶＰＤ４５０減少及び抗原駆動型増殖として、分裂したパーセント及び増殖指数を計算することによって評価した。ＢＤ（商標）ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０で、ＣＢＰ０７９ｖ００に準拠したＢＤ（商標）ハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）システムを使用して試料を取得した。データ取得には、ＦＡＣＳＤｉｖａバージョン８．０．１を使用し、取得後の分析はＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．４．１及びＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ｖ７．０２を使用して実施した。ＣＤ４＋画分内で、４つのｗａｖｅドナー全体で、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲで形質導入された細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲと比較してより大幅な拡大を示した（図２）。ＣＤ４＋細胞に追加のＣＤ８αホモ二量体が存在すると、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲと比較した場合に、分裂を経た細胞のパーセンテージ及び増殖指数が増加した。
実施例４．腫瘍細胞系統に応答したサイトカイン産生
ＣＤ４＋Ｔ細胞の主なエフェクター機能は、抗原提示細胞だけでなく他のＴ細胞サブセットにフィードバックシグナルを与えることにより免疫応答を調和させることである。この役割は、ＣＤ４０Ｌのような共刺激シグナルの発現、又はサイトカイン及びケモカインの分泌によって媒介され得る。
ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞によるサイトカインの産生を調査するために、Ｔ細胞を、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶペプチドのタイトレーションを伴うＴ２細胞又は抗原陽性Ａ３７５腫瘍細胞のいずれかと共に２４時間共培養した。Ｔ細胞は、採取されたまま（ＰＢＬ）でも、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかについて精製された産物としても使用された。
Ｔ細胞及び標的細胞を、９６ウェルのＵ字底培養プレートのウェルに、１ウェル当たり５００００個の標的細胞及び５００００個のＴ細胞にて二重反復で添加した。標的細胞は、１０－６Ｍ～１０－１０Ｍの範囲内の外因性ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶが追加された若しくはネガティブコントロールとしてペプチドを含まないＴ２、又はＭＡＧＥ－Ａ４陽性腫瘍細胞系統Ａ３７５のいずれかであった。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ＭＡＧＰＩＸ（商標）によるサイトカイン分析のために培養培地を収集した（１５０μｌ）。
ＭＡＧＰＩＸ（商標）によるサイトカイン及びケモカインの分析を、Invitrogenの２５プレックスヒトサイトカインパネルキットを使用して実施した。Bio-RadのＢｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）ＭＡＧＰＩＸ（商標）マルチプレックスリーダーを使用して、ＭＡＧＰＩＸバージョン４．２ビルド１７０５用の取得ソフトウェアＬｕｍｉｎｅｘ ＸＰＯＮＥＮＴを用いて試料を取得した。取得後にＲ（ｖ３．３．２）を使用して分析を実施した。標準曲線の頂点より上の値は全て頂点の値に調整した。各サイトカインにつき別個に、被験者内要因としての形質導入及びＴ細胞画分に関して二元反復測定ＡＮＯＶＡを実行した後に、形質導入／Ｔ細胞画分の組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてペアワイズ事後検定を行い、Holm法を使用してｐ値を調整した。関連のサイトカインの予め規定されたサブセットを分析した：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－２受容体。図３に示されるデータは、ＩＦＮγの産生に関連している。図４のデータは、ＩＬ２の産生に関連している。図３に示されるように、共培養に分離ＣＤ４＋細胞が含まれる場合に（上面）、サイトカインの絶対レベルはより低かったが（特にＩＦＮγについて、ここでは、ｙ軸上の最大値は、図４のＩＬ２についての４０００ｐｇ／ｍｌに対して７５０ｐｇ／ｍｌである）、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞（黒色）によるサイトカイン放出において、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ（白色）と比較してはるかにより一貫した改善が見られる。このパターンは、５つの全てのドナーにわたって一貫している（このアッセイで十分に応答しなかったＷａｖｅ２１４を除く）。抗原陽性のＡ３７５腫瘍細胞に対するＩＦＮγ応答においても同様の結果が見られる（図３、下段のパネル）。概して、ＰＢＬ又はＣＤ８＋画分における２つのＴＣＲコンストラクトの間にほとんど差はないが、ＣＤ４＋を調査すると、５つのドナーのうち４つのドナーでコンストラクト間のサイトカイン放出の改善を確認することができる。
図４では、ＣＤ４＋細胞データ（上面）は、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ（白色）と比較して、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞（黒色）によるサイトカイン放出にも一貫した改善が見られることを裏付けている。顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、及びＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）の産生についても同じ傾向が当てはまる（データは示していない）。残りの６つのサイトカイン（ＩＬ－１７、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－２受容体）は５つのｗａｖｅドナーのうち４つで最小の産生を示したが、産生されたレベルは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋分離細胞の両方についてＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と比較してＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞からの方がより高かった。
結論として、分析されたサイトカイン、特にＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１βからは、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞によるサイトカイン放出に改善が見られる。
実施例５．樹状細胞共培養における腫瘍細胞系統に応答したサイトカイン産生
ＣＤ８αをＴＣＲ形質導入ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することにより、免疫系の追加の要素との結合を促すことで、持続的な抗腫瘍応答が誘発され得ることが期待されたため、ＤＣ成熟及びＴ細胞活性化の間のＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と樹状細胞（ＤＣ）との相互作用を評価することが本発明者らの目的であった。腫瘍微小環境の関連において、ＤＣの成熟及び活性の改善は、全体的な抗腫瘍免疫応答及びＴ細胞の活性化を増進させる助けとなり得る。
ＤＣ成熟及びＴ細胞活性化プロセスの間のＴ細胞と樹状細胞との間の相互作用を調査するために、未成熟ＤＣ、Ｔ細胞及び腫瘍細胞系統の共培養を含む２つのアッセイタイプを構成した。これは、外因性ペプチド（ＭＨＣクラスＩにのみ存在する）を単に負荷するのではなく、ＤＣが周囲の腫瘍細胞から抗原を取り込み、それらのＭＨＣクラスＩＩ上に提示するｉｎ ｖｉｖｏの状況を反映するように設計された。自家の状況に対処するとともに臨床の大規模なＴ細胞への適用を確認するために、アッセイは、適合した樹状細胞を含む血液ドナーから作製された小規模なＴ細胞だけでなく、ｗａｖｅ規模（wave scale）のＴ細胞も含んでいた。
（ａ）細胞調製及び共培養
共培養は４８時間に設定され、各アッセイタイプは、ドナー適合ＤＣを含む２つの小規模なＴ細胞調製物（ドナーＴＥＡ及びＴＳＡ、又はＮＬＡ及びＯＢＡ）及び不適合ＤＣを含む２つの大規模なドナー（Ｗａｖｅ２１３及びＷａｖｅ２１７又はＷａｖｅ２１６及びＷａｖｅ２１７）を含んでいた（図面の凡例で指定される）。これらのアッセイのために、抗原陽性標的細胞系統（Ａ３７５又はＮＣＩ－Ｈ１７５５）及び抗原陰性標的細胞系統（Ｎａｌｍ６）が含まれていた。樹状細胞成熟についてのポジティブコントロールとして、サイトカインカクテル又はリポ多糖（ＬＰＳ）のいずれかを含むウェルが含まれていた。
ＣＤ１４＋単球からの分化の７日後に、未成熟樹状細胞をＲ１０中で３回洗浄し、計数して、４８ウェルプレートに播種し、ＭＡＧＥ－Ａ４陽性又はＭＡＧＥ－Ａ４陰性の腫瘍細胞系統及びＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と共培養した。共培養を４８時間に設定し、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートして、ＤＣ成熟及び活性化に対するこの共培養の効果を評価した。全ての共培養実験では、１０００００個の標的細胞（Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５又はＮａｌｍ６）、１０００００個の樹状細胞、及び４０００００個のＴ細胞を使用した。同じドナーから作製されたＴ細胞及び樹状細胞を各アッセイで使用した。４８時間の共培養後に、上清を収集し（１ウェル当たり１５０μｌ）、ＭＡＧＰＩＸ（商標）による後続のサイトカイン及びケモカインの分析のために－８０℃で凍結するか、又はフローサイトメトリーのために細胞を採取した。
（ｂ）樹状細胞の成熟状態に対する効果
４８時間の共培養期間が終わってから樹状細胞の成熟状態を評価するために、フローサイトメトリーを使用して多色免疫表現型分析を行って、樹状細胞上の成熟マーカーの発現を決定した。免疫表現型検査の共培養に使用される標的細胞系統は、樹状細胞と標的細胞との間を容易に区別することができるように核ＧＦＰでタグ付けした。使用されたモノクローナル抗体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ４０Ｌに対する抗体であった。ＣＤ１ａに加えて、ＤＣをＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣ ＩＩ）について染色した。これらのマーカーのうち３つ全ては、未成熟樹状細胞において低いレベルで発現され、ＤＣ成熟に際して上方調節される。未成熟樹状細胞の予想される表現型はＣＤ１ａ＋、ＨＬＡ－ＤＲｌｏｗ、ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ４０ｌｏｗ、ＣＤ１４－／ｌｏｗであり、成熟樹状細胞の表現型はＣＤ１ａ＋、ＨＬＡ－ＤＲｈｉｇｈ、ＣＤ８０ｈｉｇｈ、ＣＤ１４－／ｌｏｗである。
ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞又はＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と同時インキュベートされた樹状細胞は、抗原陽性Ａ３７５細胞に応答して、ＣＤ８０マーカー、ＣＤ４０マーカー、及びＨＬＡ－ＤＲマーカーの同等の上方調節を示したが、抗原陰性のＮａｌｍ６細胞又は非形質導入Ｔ細胞では示さなかったため、活性化はＴＣＲ及び抗原に特異的である。ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＰＢＬ又はＭＡＧＥ－Ａ４ ＰＢＬと共にインキュベートされたＤＣの間に差はなかった。抗原により特異的に活性化されるＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４形質導入Ｔ細胞及びＭＡＧＥ－Ａ４形質導入Ｔ細胞は両方とも未成熟樹状細胞の成熟を促進し得る（データは示していない）。
（ｃ）サイトカインアッセイ
サイトカインアッセイについての方法論は実施例４に記載されている。
（ｃ．ｉ．）ＩＬ－１２
ＩＬ－１２は、活性化された成熟樹状細胞によって産生される主要なサイトカインであり、ＣＤ４０シグナル伝達によって増強される。ＩＬ－１２及び／又はＩＦＮγの存在下で活性化されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１細胞に分化する傾向があり、これは続いてＩＦＮγの産生及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増加を支援する。
１×１０５個の抗原陽性（Ａ３７５及びＮＣＩ－Ｈ１７５５）腫瘍細胞系統又は抗原陰性（Ｎａｌｍ６）腫瘍細胞系統を、４８ウェルプレートにおいて１×１０５個の未成熟樹状細胞及び４×１０５個のＴ細胞と共培養した。４８時間後に培養上清を採取し、Ｍａｇｐｉｘ（商標）によってサイトカインを分析した。データは図５に示されている。標準曲線の頂点を超えたデータ点を全て最大値としてプロットした。ＩＬ－１２についての標準曲線は標準曲線の最高点で依然として一貫して線形範囲にあるため、データ分析及びグラフ生成のために、ＩＬ－１２（ｐ４０／ｐ７０）についての標準範囲を１０００００ｐｇ／ｍｌに拡張した。全ての実験条件は生物学的二重反復（biological duplicates）で試験され、両方のデータ点がプロットされている。各サイトカイン及びポジティブコントロール標的につき別個に、被験者内要因としての形質導入、Ｔ細胞画分、及びＤＣの存在又は不存在に関して三元反復測定ＡＮＯＶＡを実行した後に、形質導入／Ｔ細胞画分／ＤＣの組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてペアワイズ事後検定を行い、Holm法を使用してｐ値を調整した。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとの間の有意な比較のみがグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
図５では、ＩＬ－１２がＤＣを含む条件（Ｘ軸上の「Ｔ細胞＋ＤＣ」）でのみ見られたことから、これがＤＣに特有の分析物であることが確認された。Ａ３７５又はＮＣＩ－Ｈ１７５５の抗原陽性標的系統のいずれかに応答して、非分離Ｔ細胞との共培養において大量のＩＬ－１２がＤＣによって産生された（「ＰＢＬ」、左側のパネル）。ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と共培養した場合に、ＩＬ－１２の量は、ＬＰＳ（塗りつぶされた三角形）と共にインキュベートされたポジティブコントロール試料で見られる量の最大２倍であった。ドナー全体にわたって一貫して、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞（黒色の点）に曝露されたＤＣによって、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞（白抜きの点）と共に培養されたＤＣよりも有意に多くのＩＬ－１２が産生された（ｐ＝０．００２７７９ Ａ３７５及びｐ＝０．００００９６４ ＮＣＩ－Ｈ１７５５）。Ｔ細胞と共に又は培地のみで培養されたＤＣによっては、ＩＬ－１２は産生されなかったことから、これがＭＡＧＥ－Ａ４抗原に特異的な応答であることが確認された。
共培養に分離ＣＤ４＋Ｔ細胞が含まれる場合に（中央のパネル）、ＤＣは依然としてＩＬ－１２を産生した。大規模なＣＤ４＋ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（Ｗａｖｅ２１６及びＷａｖｅ２１７）によって誘導されるＩＬ－１２のレベルは、混合ＰＢＬで見られるレベルとほぼ同様であったが、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞ではバックグラウンドをほとんど上回らなかった。小規模なドナー（ＴＥＡ及びＴＳＡ）との共培養において産生されたＩＬ－１２レベルは低かったが、それでもバックグラウンドを上回っていた。結論として、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞ではより大きな応答があった。ＣＤ４＋条件と混合ＰＢＬ条件との間のＩＬ－１２産生の増加は、ＤＣ成熟のライセンシングが主にＣＤ４＋の機能であるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞も抗原に応答してＤＣとＴ細胞との間の正のフィードバックループで重要な役割を果たすことを強調している。共培養に分離ＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる場合に、ＤＣは小規模なＴ細胞と組み合わせた場合にＩＬ－１２を一切産生せず、大規模なドナーと組み合わせた場合に中程度のレベルを生じ、これはＣＤ８α改変によって影響されなかった。
（ｃ．ｉｉ．）ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ又はＣＸＣＬ９）
ＭＩＧは、ＩＦＮγに応答して樹状細胞、マクロファージ、及びその他の細胞型によって産生されるＴ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の化学誘引物質である。その主な機能は、プライミングされたＴリンパ球を炎症部位に動員することである。
１×１０５個の抗原陽性（Ａ３７５及びＮＣＩ－Ｈ１７５５）腫瘍細胞系統又は抗原陰性（Ｎａｌｍ６）腫瘍細胞系統を、４８ウェルプレートにおいて１×１０５個の未成熟樹状細胞及び４×１０５個のＴ細胞と共培養した。４８時間後に培養上清を採取し、Ｍａｇｐｉｘ（商標）によってサイトカインを分析した。
データは図６に示されている。標準曲線の頂点を超えたデータ点を全て最大値としてプロットした。全ての実験条件は生物学的二重反復で試験され、両方のデータ点がプロットされている。各サイトカイン及びポジティブコントロール標的につき別個に、被験者内要因としての形質導入、Ｔ細胞画分、及びＤＣの存在又は不存在に関して三元反復測定ＡＮＯＶＡを実行した後に、形質導入／Ｔ細胞画分／ＤＣの組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてペアワイズ事後検定を行い、Holm法を使用してｐ値を調整した。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとの間の有意な比較のみがグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
ＭＩＧの分泌パターン（図６）はＩＬ－１２に類似している。混合ＰＢＬ Ｔ細胞と共培養されたＤＣによって産生されたＭＩＧは、アッセイの定量限界を上回っており、差を測定することができない。しかしながら、分離ＣＤ４＋細胞と共にインキュベートした場合に、ＤＣによって産生されるＭＩＧは、大規模なドナー及び小規模なドナーの両方で、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲに応答してＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と比較して明らかな差がある。大規模なＣＤ８＋Ｔ細胞との共培養においてＤＣによって高レベルのＭＩＧも産生された。
（ｃ．ｉｉｉ．）ＩＬ－６
ＩＬ－６は、ＤＣを含む幾つかの細胞型によって作り出される。臨床的には、ＩＬ－６は予後不良と関連しており、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に関与する主要なサイトカインの１つである。ＩＬ－６についてのＭａｇｐｉｘデータは図７に示されている。ＮＣＩ－Ｈ１７５５細胞系統は、約３ｐｇ／ｍｌ～４０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－６を分泌するが、形質導入Ｔ細胞による共培養された場合の応答は、一般に標的のみの応答（ｘ軸上の「培地」又はｎｔｄ（灰色の点））を上回るため、ＤＣによる幾らかの産生が見られる。Ｔ細胞及びＡ３７５細胞との共培養に応答して、ＤＣにより幾らかのＩＬ－６産生も見られる（最大約１０００ｐｇ／ｍｌ）。
１×１０５個の抗原陽性（Ａ３７５及びＮＣＩ－Ｈ１７５５）腫瘍細胞系統又は抗原陰性（Ｎａｌｍ６）腫瘍細胞系統を、４８ウェルプレートにおいて１×１０５個の未成熟樹状細胞及び４×１０５個のＴ細胞と共培養した。４８時間後に培養上清を採取し、Ｍａｇｐｉｘ（商標）によってサイトカインを分析した。標準曲線の頂点を超えたデータ点を全て最大値としてプロットした。全ての実験条件は生物学的二重反復で試験され、両方のデータ点がプロットされている。各サイトカイン及びポジティブコントロール標的につき別個に、被験者内要因としての形質導入、Ｔ細胞画分、及びＤＣの存在又は不存在に関して三元反復測定ＡＮＯＶＡを実行した後に、形質導入／Ｔ細胞画分／ＤＣの組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてペアワイズ事後検定を行い、Holm法を使用してｐ値を調整した。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとの間の有意な比較のみがグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞との共培養において、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲよりも多くのＩＬ－６がＤＣによって産生されるが（１．８倍～２．９倍、Ａ３７５に関してｐ＝０．０２７１１５）、これらの量は、ＤＣがポジティブコントロール（ＬＰＳ、塗りつぶされた三角形）又は腫瘍細胞自体によって作られたＩＬ－６（ＮＣＩ－Ｈ１７５５）により刺激された場合に見られるよりもはるかに少ない。それに対して、同じアッセイで産生されたＩＬ－１２（プロＴ細胞サイトカイン）のレベルは、どちらのポジティブコントロールよりも高かった（図５）。
（ｃ．ｉｖ．）ＩＦＮγ
ＩＦＮγは、抗原に応答して活性化Ｔ細胞によって分泌される主要なサイトカインであり、抗腫瘍応答において多くの役割を有する。
１×１０５個の抗原陽性（Ａ３７５及びＮＣＩ－Ｈ１７５５）腫瘍細胞系統又は抗原陰性（Ｎａｌｍ６）腫瘍細胞系統を、４８ウェルプレートにおいて１×１０５個の未成熟樹状細胞及び４×１０５個のＴ細胞と共培養した。４８時間後に培養上清を採取し、Ｍａｇｐｉｘ（商標）によってサイトカインを分析した。データは図８に示されている。ＤＣの不存在下にて４８時間でＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγ（ｘ軸上の「Ｔ細胞」、図８）は、上述の２４時間の共培養アッセイで見られたことを大まかに反映しており（数千、図３）、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞産物とＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞産物との間に限定的な（統計的に有意ではない）差が見られる。標準曲線の頂点を超えたデータ点を全て最大値としてプロットした。２５プレックスアッセイキットのＩＦＮγについての標準範囲は最大約４４５０ｐｇ／ｍｌである。標準曲線は、標準曲線の最高点で依然として一貫して線形範囲にあるため、データ分析及びグラフ生成のために標準範囲を２００００ｐｇ／ｍｌに拡張し、各グラフのｙ軸をこの値に設定した。全ての実験条件は生物学的二重反復で試験され、両方のデータ点がプロットされている。各サイトカイン及びポジティブコントロール標的につき別個に、被験者内要因としての形質導入、Ｔ細胞画分、及びＤＣの存在又は不存在に関して三元反復測定ＡＮＯＶＡを実行した後に、形質導入／Ｔ細胞画分／ＤＣの組み合わせ内の形質導入の各組み合わせについてペアワイズ事後検定を行い、Holm法を使用してｐ値を調整した。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとの間の有意な比較のみがグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
ＤＣをＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞及び抗原陽性標的細胞（Ａ３７５又はＮＣＩ－Ｈ１７５５）の共培養に添加すると、ＩＦＮγの放出は劇的に増加するが（最大２９倍、ドナーＴＥＡ、ＮＣＩ－Ｈ１７５５）、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞に対するＤＣ添加の効果はより小さい（最大７倍、ドナーＴＥＡ、ＮＣＩ－Ｈ１７５５）。ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞によってＤＣの存在下で産生されたＩＦＮγの間には、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞と比較して有意差がある（ｐ＝０．０００１１１ Ａ３７５、ｐ＝０．０００１９７ ＮＣＩ－Ｈ１７５５）。小規模なＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞ドナー（ＴＥＡ及びＴＳＡ）は、抗原陽性の標的細胞及びＤＣと共培養した場合にＩＦＮγレベルの更により顕著な増加を示した。このデータは、ＤＣ：Ｔ細胞の相互作用の他の影響（arm）を示しており、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞によるＤＣの活性化の改善により、今度はＤＣがＴ細胞の活性化を改善することができる。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ又はＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞をＭＡＧＥ－Ａ４陰性Ｎａｌｍ６細胞と共培養した場合に、ＩＦＮγの産生はＤＣの添加の有無にかかわらず観察されなかったことから、観察された応答は抗原特異的であることが裏付けられる。
実施例６．ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞による抗原陽性微小組織の殺傷
ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞による抗原陽性微小組織の殺傷を調査した。腫瘍細胞に対する細胞傷害活性は、一般にＣＤ８＋細胞の機能として特徴付けられるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞のマイナーな機能でもあり得る。ＧＦＰ標識された３Ｄ癌細胞系統微小組織に対するＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性を、３Ｄ癌細胞微小組織のＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイによって決定した。
細胞質ＧＦＰレンチウイルスで形質導入されたＭＡＧＥ－Ａ４及びＨＬＡ－Ａ２陽性のＡ３７５．ＧＦＰ黒色腫細胞を、１５０個の細胞／ウェル及び１２００個の細胞／ウェルの開始細胞密度で超低付着性（ＵＬＡ）３８４ウェルマイクロプレートに播種し、手短に遠沈した後に、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートして、種々のサイズの３Ｄ微小組織を自然に形成させた。細胞播種の時点から開始したイメージングを、Ｔ細胞の添加後にアッセイが完了するまでＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ ４０７６８（Essen Bioscience）を使用して１０倍の倍率にて３時間間隔で画像を取得しながら継続した。Ｔ細胞を添加する前に、各ウェルで均一な微小組織の形成が確認された。６日後に、１５０個の細胞／ウェルでの播種から形成された微小組織は、約５５０μｍ～６００μｍの直径（以下で「小さな微小組織」と呼称される）であったが、１２００個の細胞／ウェルでの播種から形成された微小組織は、約８００μｍの直径（以下で「大きな微小組織」と呼称される）であった。ＵＬＡプレートに播種されたＡ３７５．ＧＦＰ細胞は、Ｔ細胞を添加する前の６日間にわたって２つの均一なサイズ（小さなサイズ及び大きなサイズ）の安定した微小組織を形成した。図１３Ａ及び図１３Ｂの上部のパネルは、Ｗａｖｅ２１７細胞の関係における、それぞれ小さな及び大きなＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織についてのパネルを示す。
Ｔ細胞の集団は、非分離ＰＢＬ（２００００個の細胞／ウェル）、並びに純粋な分離ＣＤ４＋画分（８００００個の細胞／ウェル）及びＣＤ８＋画分（２００００個の細胞／ウェル）として添加した。１０μｍのＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドも、指定されたウェルに全ての条件について追加のコントロールとして添加した（データは示していない）。アッセイが完了した後に、全ての時点についての各ウェルからの緑色蛍光の生画像を分析し、それによりコア微小組織蛍光面積をマスクしたことで、研究される全ての時点について各反復及び処理条件に関する微小組織面積を計算することができた。時間の経過に伴う蛍光尺度の増加又は減少は、それぞれ３Ｄ微小組織の成長又は死の指標であった。３Ｄ微小組織の殺傷尺度プロットを作成した。
全てのデータをＴ細胞添加の時点に正規化して、Ｔ細胞の殺傷前の反復の間の微小組織サイズの全ての小さなばらつきを補正した。時間の経過に伴う微小組織面積及び曲線下面積（ＡＵＣ）データをアッセイの終点まで決定した。データは図９～図１３に示されている。
図９及び図１１のデータは、１４７時間（Ａ）又は１４５時間（Ｂ）での安定した微小組織形成に続いて、ドナーＷａｖｅ２１４、Ｗａｖｅ２１５及びＷａｖｅ２１７（Ａ）又はＷａｖｅ２１３及びＷａｖｅ２１６（Ｂ）に由来するＡＤＰ－Ａ２Ｍ４及びＡＤＰ－Ａ２Ｍ４ＣＤ８ ＴＣＲ形質導入された又はｎｔｄのＰＢＬ（２００００個の細胞／ウェル）、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞（８００００個の細胞／ウェル）、又は分離ＣＤ８＋Ｔ細胞（２００００個の細胞／ウェル）を添加したことを示している。Ａ及びＢ）図９及び図１１のパネルＡ及びパネルＢは、ｎｔｄのＴ細胞の添加に続いて、Ａ３７５．ＧＦＰ微小組織がアッセイの過程で着実に成長し続けた後に、Ｔ細胞の添加の約６日～８日後にアッセイプレートのウェルにとっての限界サイズに達することを示している。非分離ＰＢＬ又は純粋なＣＤ８＋集団からのＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞又はＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞を両方のサイズのＡ３７５．ＧＦＰ微小組織に添加すると、Ｔ細胞が組織に浸潤したため短時間の微小組織の拡大が引き起こされ、その後に微小組織は急速かつ完全に破壊された。これは、正規化された微小組織面積の急速な喪失によって測定された（図９及び図１１のパネルＡ及びパネルＢ）。
図１０及び図１２は、非分離ＰＢＬ又は純粋なＣＤ８＋Ｔ細胞集団のいずれかからのＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞とＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞との間で全体的な殺傷率に有意差がなかったことを裏付けている（図１０及び図１２の中央及び右のパネル）。しかしながら、分離ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲで形質導入すると、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲのみで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、両方のサイズのＡ３７５．ＧＦＰ微小組織に対して細胞傷害性の有意な増強が誘発された（図１０及び図１２の左パネル）。試験された５つの全てのＷａｖｅ ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞産物は一貫して３Ｄ微小組織の殺傷の改善を示した。さらに、ＣＤ４＋ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞による両方の微小組織サイズの完全な破壊が、アッセイの終わりまでに５つのドナーのうち３つで達成された（図９及び図１１（Ａ～Ｂ）の左側のパネル；図１３の「ｉｉｉ」を参照）。これらのデータは、ＣＤ８α補助受容体の発現がＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞のエフェクター機能を有意に増強することを裏付けている。
実施例７．Ａ３７５．ＧＦＰ ３Ｄ微小組織に応答したＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞のＩＦＮγ及びグランザイムＢ産生
ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ非分離ＰＢＬ、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞がＡ３７５．ＧＦＰ ３Ｄ微小組織に応答してＩＦＮγ及びグランザイムＢを産生する能力を評価した。Ｔ細胞添加の約５０時間後に、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイプレートで並行して構成された二重反復プレートから上清を収集した。上清を３８４ウェルプレートにおいてＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ及びグランザイムＢについて分析した。ＥＬＩＳＡプレートに添加する前に、試料上清をＲ１０アッセイ培地中で４倍に希釈した。Ｇｌｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＨＲＰ基質を使用してプレートを現像し、各プレートを５分間インキュベートした後に、BMG LABTECHのＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダーで読み取った。Ｏｍｅｇａデータ分析ソフトウェア（バージョン３．１０Ｒ６）でデータ分析を行い、試料の希釈を説明するために、得られたサイトカイン値に４倍希釈係数を適用した。分析されたデータをＥｘｃｅｌにエクスポートし、Ｒのバージョン３．２．２のカスタムＲスクリプトを使用してグラフ化した。Ｒスクリプト内では、最高標準濃度を超える値を有する試料ウェルに最高標準の値を割り当てた。標準曲線範囲未満の値を有するウェルには０の値を割り当てた。外因性ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドを含まない標的の存在下で対応するｎｔｄのＴ細胞についての最高値を１００ｐｇ／ｍｌ上回る値を使用して、バックグラウンドシグナルと陽性ＩＦＮγ応答との間を区別した。外因性ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドを含まない標的の存在下で対応するｎｔｄのＴ細胞についての最高値を２００ｐｇ／ｍｌ上回る値を使用して、バックグラウンドシグナルと陽性グランザイムＢ応答との間を区別した。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、各画分内で全てのｗａｖｅにわたって組み合わされたデータに関して各標的微小組織サイズについてＩＦＮγ及びグランザイムＢの放出のレベルを比較した。
Ｔ細胞添加の約５０時間後に、並行アッセイプレートから上清を収集し、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。試験された５つの全てのＷａｖｅ Ｔ細胞産物に由来する非分離ＰＢＬ及びＣＤ８＋サブセットからのＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞に関して、頑健なサイトカイン応答が観察された（図１４）。非分離ＰＢＬ又は精製ＣＤ８＋サブセットのそれぞれからのＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞及びＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮγ又はグランザイムＢのレベルに有意差は観察されなかった。これにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞における追加のＣＤ８α補助受容体の発現が抗原陽性標的に対する細胞傷害性の増強をもたらさないことが示された。
ＩＦＮγ及びグランザイムＢの産生のレベルは、ＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲによって、両方のサイズのＡ３７５．ＧＦＰ ３Ｄ微小組織に応答して、試験された全てのＷａｖｅ産物にわたる精製ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して有意に増加した（図１４の左パネル）。これらのデータは、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較したＣＤ８α＿ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲ ＣＤ４＋Ｔ細胞の殺傷能力の増強と一致する（図９～図１３）。
全体として、これらのデータは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αホモ二量体とＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲとの操作された共発現が、ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＲのみで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、抗原陽性３Ｄ微小組織に対する細胞傷害性応答の実質的な改善を誘発することを示唆している。これは、ＣＤ８αを使用して組換えＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞を増強することで、抗原陽性標的に対する細胞傷害性応答の効力が増強されることの論理的根拠を与える。
Figure 2022513148000001
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGAGCCAGTTCCGGGTGTCGCCGCTGGATCGGACCTGGAACCTGGGCGAGACAGTGGAGCTGAAGTGCCAGGTGCTGCTGTCCAACCCGACGTCGGGCTGCTCGTGGCTCTTCCAGCCGCGCGGCGCCGCCGCCAGTCCCACCTTCCTCCTATACCTCTCCCAAAACAAGCCCAAGGCGGCCGAGGGGCTGGACACCCAGCGGTTCTCGGGCAAGAGGTTGGGGGACACCTTCGTCCTCACCCTGAGCGACTTCCGCCGAGAGAACGAGGGCTACTATTTCTGCTCGGCCCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGAAGACGTGTTTGCAAATGTCCCCGGCCTGTGGTCAAATCGGGAGACAAGCCCAGCCTTTCGGCGAGATACGTCGGTTCAAGAGCTAAAAGAAGTGGTAGTGGTGCCCCTGTGA
配列番号２（ＣＤ８α）
Figure 2022513148000002
ATGAAGAAGCACCTGACCACCTTTCTCGTGATCCTGTGGCTGTACTTCTACCGGGGCAACGGCAAGAACCAGGTGGAACAGAGCCCCCAGAGCCTGATCATCCTGGAAGGCAAGAACTGCACCCTGCAGTGCAACTACACCGTGTCCCCCTTCAGCAACCTGCGGTGGTACAAGCAGGACACCGGCAGAGGCCCTGTGTCCCTGACCATCCTGACCTTCAGCGAGAACACCAAGAGCAACGGCCGGTACACCGCCACCCTGGACGCCGATACAAAGCAGAGCAGCCTGCACATCACCGCCAGCCAGCTGAGCGATAGCGCCAGCTACATCTGCGTGGTGTCCGGCGGCACAGACAGCTGGGGCAAGCTGCAGTTTGGCGCCGGAACACAGGTGGTCGTGACCCCCGACATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAATAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTCAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGGTCCAGCGGCAGCCGGGCCAAGAGA
配列番号４（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖のコーディング配列）
Figure 2022513148000003
ATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTCTACCTGCTGGGCACCGGCTCTATGGATGCCGACGTGACCCAGACCCCCCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCTCCCAGACCAAGGGCCACGACCGGATGTACTGGTACAGACAGGACCCTGGCCTGGGCCTGCGGCTGATCTACTACAGCTTCGACGTGAAGGACATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCCAGACAGGCTCAGGCCAAGTTCAGCCTGTCCCTGGAAAGCGCCATCCCCAACCAGACCGCCCTGTACTTTTGTGCCACAAGCGGCCAGGGCGCCTACGAGGAGCAGTTCTTTGGCCCTGGCACCCGGCTGACAGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAAATCAGCCACACCCAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTGTCCACCGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCTTGGGGGCGCGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGAAAGGCCACACTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGC
配列番号６（ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖のコーディング配列）
Figure 2022513148000004
Figure 2022513148000005
ＶＳＰＦＳＮ 配列番号９；ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖（残基４８～５３）
ＬＴＦＳＥＮ 配列番号１０；ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖（残基７１～７６）
ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦ 配列番号１１；ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ α鎖（残基１１１～１２５）
ＫＧＨＤＲ 配列番号１２；ＣＤＲ１ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖（残基４６～５０）
ＳＦＤＶＫＤ 配列番号１３；ＣＤＲ２ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖（残基６８～７３）
ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦ 配列番号１４；ＣＤＲ３ ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲ β鎖（残基１１０～１２３）
ＶＬＬＳＮＰＴＳＧ 配列番号１５；ＣＤＲ１ ＣＤ８α（残基４５～５３）
ＹＬＳＱＮＫＰＫ 配列番号１６；ＣＤＲ２ ＣＤ８α（残基７２～７９）
ＬＳＮＳＩＭ 配列番号１７；ＣＤＲ３ ＣＤ８α（残基１１８～１２３）
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ 配列番号１８

Claims (30)

  1. 異種ＣＤ８補助受容体及び異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  2. 前記ＣＤ８補助受容体が、ＣＤ８αである、請求項１に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  3. 前記ＣＤ８補助受容体が、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  4. 前記ＴＣＲが、癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチドに結合し、及び／又は親和性増強ＴＣＲである、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  5. 前記ＴＣＲが、ＭＡＧＥ Ａ４ ＴＣＲであり、及び／又はＭＡＧＥ－Ａ４に結合し得る、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  6. 前記ＴＣＲが、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するα鎖アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  7. 前記ＴＣＲが、配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するβ鎖アミノ酸配列を含む、請求項５又は６に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のＴＣＲ及びＣＤ８補助受容体をコードする核酸又は核酸コンストラクト。
  9. ｉ．ＣＤ８補助受容体をコードする第１のヌクレオチド配列と、
    ｉｉ．Ｔ細胞受容体をコードする第２のヌクレオチド配列と、
    を含む、請求項８に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  10. 前記ＣＤ８補助受容体が、ＣＤ８αである、請求項８又は９に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  11. ＣＤ８αをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  12. 前記ＴＣＲが、癌抗原若しくは腫瘍抗原若しくはそれらのペプチドに結合し、及び／又は親和性増強ＴＣＲである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  13. 前記ＴＣＲが、ＭＡＧＥＡ４ ＴＣＲであり、及び／又はＭＡＧＥ－Ａ４に結合し得る、請求項７～１１のいずれか一項に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  14. 前記ＴＣＲが、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  15. 前記ＴＣＲが、配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２又は１３に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  16. 前記ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  17. 前記ＴＣＲをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の核酸又は核酸コンストラクト。
  18. 請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
  19. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
  20. 請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、又は請求項１８若しくは１９に記載のベクターを含むウイルス粒子。
  21. 請求項１～７のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を作製する方法であって、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクトの１コピー若しくは２コピー以上又は請求項１８若しくは１９に記載のベクターをＴ細胞又はＴ細胞の集団に導入することを含み、任意に、前記核酸又は前記ベクターが、請求項２０に記載のウイルス粒子内に含まれている、方法。
  22. 請求項８～１９のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト又はベクターを含む、又は請求項２１に記載の方法に従って作製される改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団。
  23. 請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  24. 療法及び／又は医療において使用される、請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
  25. 癌及び／又は腫瘍の治療において使用され、任意に、前記治療が、癌免疫療法及び／又は養子Ｔ細胞療法、任意に自家養子Ｔ細胞療法又は同種異系養子Ｔ細胞療法である、請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
  26. 個体における癌及び／又は腫瘍を治療する方法であって、前記個体に請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子、又は請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含み、任意に、前記治療が、癌免疫療法及び／又は養子Ｔ細胞療法、任意に自家養子Ｔ細胞療法又は同種異系養子Ｔ細胞療法である、方法。
  27. 癌及び／又は腫瘍の治療用の医薬の製造に使用される、請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子、又は請求項２２に記載の医薬組成物の使用であって、任意に、前記治療が、癌免疫療法及び／又は養子Ｔ細胞療法、任意に自家養子Ｔ細胞療法又は同種異系養子Ｔ細胞療法である、使用。
  28. 請求項２３若しくは２４に従って又は請求項２５に記載の方法において使用される、又は請求項２６の使用のための、前記癌が固形腫瘍である、請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
  29. 請求項２３若しくは２４に従って又は請求項２５に記載の方法において使用される、又は請求項２６若しくは２７の使用のための、改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団、核酸、ベクター、ウイルス粒子、又は医薬組成物が、任意に投与される又は別々に、逐次に若しくは同時に投与される１つ以上の更なる治療剤と組み合わせて使用するためのものである又は使用される、請求項１～７若しくは請求項２１のいずれか一項に記載の改変Ｔ細胞若しくは改変Ｔ細胞の集団、請求項８～１７のいずれか一項に記載の核酸若しくは核酸コンストラクト、請求項１８若しくは１９に記載のベクター、又は請求項２０に記載のウイルス粒子、又は請求項２２に記載の医薬組成物。
  30. 改変Ｔ細胞又は改変Ｔ細胞の集団を操作する方法であって、
    ｉ．Ｔ細胞又はＴ細胞の集団を準備することと、
    ｉｉ．請求項１８又は１９に記載のベクターを前記Ｔ細胞又はＴ細胞の集団に導入することと、
    ｉｉｉ．前記ベクターを前記Ｔ細胞又はＴ細胞の集団において発現させることと、
    を含む、方法。
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