CN103442768A - 治疗癌的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供治疗卵巢癌的组合物和方法。具体而言，本发明涉及施用具有α-叶酸受体(FRα)结合结构域和4-1BB(CD137)共刺激结构域的基因修饰的T细胞以治疗卵巢癌。

Description

治疗癌的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年1月18日提交的美国临时申请号61/433,731的优先权，其通过参考以其整体并入本文。
背景技术
卵巢癌是大部分妇产科癌死亡的原因。2004年，在美国，诊断出25,580例新的病例，并且16,090名妇女死于卵巢癌。
该疾病在工业化国家中更加常见，日本除外。在美国，女性具有1.4%至2.5%(40-60个女人中1个)的生命机会发展卵巢癌。年长女人处在最高的风险下。
尽管腹膜内化疗已经推荐为卵巢癌一线治疗的护理标准，但该推荐的基础已经受到了挑战。放射疗法对于晚期阶段是无效的，因为当关键器官在放射区域中时，不能安全递送高剂量。外科疗法也是无效的。
尽管初始成功的多科性治疗——细胞减数外科和随后组合化疗，但大部分晚期疾病患者最终复发并且不能治愈。由于该原因，急切需要治疗该恶性肿瘤的新治疗方法。
基于卵巢肿瘤是相对免疫原性的，诱导内源性T细胞应答的事实，卵巢癌尤其看起来适合过继性转移方法。
所以，需要改善的治疗形态以提供抗肿瘤免疫性，并且从而治疗卵巢癌和其他癌。
发明内容
本发明提供编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括α-叶酸受体(FRα)结合结构域的核酸序列和4-1BB(CD137)共刺激结构域的核酸序列。
在一种实施方式中，核酸序列进一步包括CD3ζ结合结构域的核酸序列。
在一种实施方式中，CAR包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在一种实施方式中，编码CAR的分离的核酸序列包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:20的核酸序列。
在一种实施方式中，FRα结合结构域是抗体或其FRα-结合片段。优选地，FRα结合结构域是Fab或scFV。
在一种实施方式中，FRα结合结构域结合肿瘤抗原，其中肿瘤抗原是FRα。在一种实施方式中，肿瘤抗原与上皮恶性肿瘤相关。在另一实施方式中，肿瘤抗原是与实体瘤相关。
在一种实施方式中，FRα结合结构域包括SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:23的氨基酸序列。
在一种实施方式中，FRα结合结构域由SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:21的核酸序列编码。
在一种实施方式中，4-1BB共刺激结构域包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一种实施方式中，4-1BB共刺激结构域由SEQ ID NO:6的核酸序列编码。
在一种实施方式中，CD3ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一种实施方式中，CD3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。
在一种实施方式中，分离的核酸序列进一步包括跨膜结构域的核酸序列。
本发明也提供分离的CAR，其包括FRα结合结构域和4-1BB共刺激结构域。
本发明也提供包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列。
本发明也提供包括编码CAR的分离的核酸序列的载体，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列。
本发明也提供用于在对象中提供抗肿瘤免疫性的方法。在一种实施方式中，包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而在对象中提供抗肿瘤免疫性。在一种实施方式中，分离的核酸序列进一步包括CD3ζ信号传导结构域的核酸序列。
在一种实施方式中，共刺激结构域的存在提高T细胞存活。在另一实施方式中，共刺激结构域的存在增加对象中抗肿瘤免疫性的效能。
在一种实施方式中，对象是哺乳动物。优选地，对象是人。
本发明也提供用于在对象中刺激对细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而刺激对象中T细胞介导的免疫应答。
本发明也提供治疗对象中卵巢癌的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗对象中的卵巢癌。
本发明也提供治疗对象中癌症的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗对象中的癌症。
本发明也提供在诊断患有卵巢癌的对象中产生持续的基因工程化T细胞群的方法。在一种实施方式中，方法包括向对象施用有效量的包括编码CAR的分离的核酸序列的基因修饰的T细胞，其中分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，其中持续的基因工程化T细胞群在施用后在对象中持续至少一个月。在一种实施方式中，持续的基因工程化T细胞群在施用后持续至少三个月。
附图说明
当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图显示的实施方式的精确布置和手段。
图1是显示αFR CAR的构建和慢病毒基因转移至人T细胞的图像。
图2是表明CAR+T细胞优先分泌Th1细胞因子的图像。
图3是显示直接的和特异性的肿瘤识别和杀死αFR+人卵巢癌的图像。
图4是显示在Winn试验中并入4-1BB信号传导结构域可增强抗肿瘤活性的图像。
图5是显示使用CAR基因疗法治疗大的、确定的人卵巢癌的图像：4-1BB共刺激介导增强的T细胞存活。
图6是显示表示嵌合抗α叶酸受体免疫受体α-FR4-1BB:CD3ζ转基因和载体构建体的附图的图像。将构建体克隆入pELNS骨架载体(底部)，其包含包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区/中心终止序列(cppt/CTS)和延伸因子1-α启动子(ef-1α)。包装期间转移载体离开(driven off)5’LTR，并且当反转录时3’SIN LTR复制至5’端。
图7是显示PELNS—MOv19-4-1BB-CD3ζ的质粒图的图像。
图8，包括图8A和8B，是显示抗αFR慢病毒载体工程化的T细胞产生和溶细胞活性的一系列图像。图8A显示αFR-结合嵌合受体的示意性图示。也构建具有截短的TCRζ结构域的结合-对照嵌合受体和具有抗CD19scFv的特异性对照受体。图8B是显示在人初级CD4T细胞上检测αFR-CAR蛋白质表达的图像。通过流式细胞术确定转导效率。
图9是显示通过流式细胞术确定AE17、AE17.FR、SKOV3上的FR的细胞表面表达(顶部)的图像。用小鼠抗人αFR抗体MOV18(浅灰色柱状图)或同种型对照(深灰色柱状图)温育细胞，随后用缀合FITC的山羊抗小鼠Ig染色。使用4h51Cr释放试验测定初级人T细胞上嵌合受体靶向表达αFR的细胞系的溶细胞活性(中间)。FRa+肿瘤靶可直接诱导T细胞细胞因子分泌。结果表示为来自至少3个分开实验的1个的三重孔的平均数和SD(底部)。
图10是显示体外有效的αFR-特异性杀死AE17.FR肿瘤细胞的图像。AE17和AE17.FR细胞以指示比用GFP温育的CAR+T细胞转导约20h，其后细胞在荧光显微法下拍照。每组T细胞的CAR转导效率是～40%-50%。
图11是显示体内αFR嵌合受体转导的T细胞的抗肿瘤活性的图像。NOD/scid/IL2rγ–/–(NOG)小鼠皮下注入混合有表达CAR的T细胞(1×106个细胞/小鼠)的SKOV3Luc(1×106个细胞/小鼠)。就在注入之前进行细胞的混合，以使T细胞和标靶的相互作用最小化。在接种之后每10天对动物照相，以评估肿瘤生长，并且使用“Living Image”软件量化来自表达荧光素酶的细胞的光子发射。
图12，包括图12A至12D，是一系列图像，其显示αFR重新靶向的T细胞体内根除大的预先建立的肿瘤：共刺激信号传导结构域的效果和施用的途径。图12A和12C表明监测皮下注入3×106个SKOV3细胞的小鼠的肿瘤生长直到肿瘤体积达到200～300mm3。在第40和45天，用肿瘤内注入20×106个T细胞(～40%–50%转基因阳性)治疗负载肿瘤的小鼠。图12B和12D表明经IT、IP和IV途径用表达BBz嵌合受体的T淋巴细胞治疗负载SKOV3的NOG小鼠，并且评估对肿瘤生长的影响。
图13是显示4–1BB信号体内增强人T淋巴细胞的持久性的图像。在第74天，从眼框后出血获得外周血，并且对其为人CD45、CD4和CD8T细胞的存在染色。在对人CD45+群设门之后，使用TruCount管(BD Biosciences)量化CD4+和CD8+子集。独立于注入的途径，在BBz组中的持久性最大。
图14，包括图14A至14C，是显示αFR CAR BBz根除SKOV3肿瘤是抗原-特异性的一系列图像。图14A和14B显示在第40和45天用表达BBz CAR(抗αFR或CD19)和GFP的淋巴细胞治疗的负载SKOV3的小鼠。图14C显示，二次T细胞注入之后3周获得来自负载SKOV3的NOG小鼠的外周血，并且通过FACS Trucount试验对CD4和CD8T细胞的存在量化。
图15，包括图15A至15C，是显示αFR CAR BBz特异性T细胞抑制腹膜癌病的SKOV3鼠模型中肿瘤生长和腹水形成的一系列图像。图15A是显示CD19CAR T细胞治疗之后，NOG小鼠中腹膜内注入SKOV3肿瘤导致腹部膨胀和结节性腹膜肿瘤的图像。当与用FR CARBBz T细胞治疗的小鼠(左)比较时，小鼠发展腹水，如通过膨胀的腹部表明的(中间)，腹膜的尸检观察显示腹腔(右)内的结节性肿瘤块(箭头)。图15B和15C显示腹膜内/静脉注入αFR CAR BBz T细胞延迟肿瘤进展和腹水形成，并且提高存活率。用CD19CAR或αFR CART细胞治疗的NOG小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。
图16是显示αFR CAR BBz-特异性T细胞的过继性转移诱导卵巢癌肺转移退行的图像。尽管肿瘤响应αFR-特异性T细胞的注入而退行，但CD19-特异性T细胞治疗的小鼠中肿瘤逐渐生长。
图17是显示从健康供体分离的CD4T细胞在20的MOI下用表达GFP的HIV源的慢病毒载体转导并且培养29天的图像。X轴表示倍数扩大(圆形)或GFP表达百分数(三角形)。转导的细胞是开符号和模拟转导的细胞是闭符号。
图18，包括图18A至图18E，描绘体外FRα CAR转导的人T细胞的产生和特异性免疫识别。图18A显示基于MOv19的CAR构建体的示意性图示，所述构建体包含单独CD3ζ胞质结构域(MOv19-ζ)或组合CD137共刺激模块(MOv19-BBζ)。显示具有截短的CD3ζ结构域(MOv19-Δζ)和抗CD19-BBζ CAR的FRα-特异性CAR。VL，可变L链；L，连接体；VH，可变H链；TM，跨膜区域。图18B描绘在用慢病毒转导之后在人CD3-设门细胞上MOv19CAR表达(实体黑线)与平行的未转导的T细胞(填充的灰色柱状图)的比较。显示转导百分数。图18C描绘通过流式细胞术确定的各种人卵巢癌细胞系进行的表面FRα表达(实体黑线)；同种型抗体对照(填充的灰色柱状图)。图18D描绘用FRα+癌细胞系温育过夜之后，MOv19-ζ和MOv19-BBζ CAR转导的T细胞而不是MOv19-Δζ抗CD19-BBζ T细胞的抗原-特异性IFN-γ分泌。显示来自三重培养物的平均IFN-γ浓度±SEM(pg/mL)。图18E描绘在18-小时生物发光试验中，以指示的E/T比，通过FRα CAR+CD8+T细胞抗原-特异性杀死FRα+肿瘤细胞。未转导的T细胞(UNT)或gfp-转导的人CD8+T细胞用作对照。
图19，包括图19A至图19D，显示人MOv19-BBζ CAR T细胞体内根除大的预先建立的肿瘤，并且显示CD137共刺激信号传导结构域的效果和施用的途径。在第0和5天，用肿瘤内注入8×106个CAR+T细胞治疗负载建立的皮下肿瘤的NSG小鼠，并且每2周成像。图19A描绘肿瘤生长，如通过测径器测量[V=1/2(长度×宽度2)]评估的。图19B显示最后T细胞剂量之后2周和4周与MOv19-ζ和对照治疗组相比，在MOv19-BBζ CAR治疗的小鼠中，SKOV3fLuc+生物发光信号减少。经肿瘤内、腹膜内或静脉内途径用8×106个MOv19-BBζ T细胞治疗负载SKOV3fLuc的NSG小鼠。图19C描绘肿瘤生长，如通过测径器测量评估的。图19D显示在第73天(最后T细胞剂量之后4周)，CD137信号传导体内提高在外周血中人CD4+和CD8+T细胞的存活率。使用TruCount方法量化来自血液的CD4和CD8T细胞。显示每个治疗组中所有评估的小鼠的平均细胞浓度(细胞/μL)±SD。
图20，包括图20A至图20D，显示CAR T细胞的肿瘤根除是抗原-特异性的。在第0和5天，用表达MOv19-BBζ、抗CD19-BBζ或gfp的8×106个T细胞(40%转导效率)经肿瘤内注入治疗具有皮下SKOV3fLuc+肿瘤的NSG小鼠。图20A描绘通过测径器每2至3天测量肿瘤体积。在最后T细胞注入之后，收集外周血3周。图20B描绘血液的人CD4+和CD8+T细胞/μl的绝对数。显示平均细胞计数±SD。图20C描绘通过使用山羊抗小鼠IgG F(ab′)2，在由流式细胞术测量的来自治疗小鼠外周血的人CD3+T细胞上FRα-和CD19-特异性CAR的表达。显示每组的平均CAR+表达频率±SD。图20D描绘绝对CAR+T细胞计数，其计算为每μL血液人CD3+T细胞的数量乘以CAR+百分数。测定平均计数±SD。
图21是表明对肿瘤的体内CAR T细胞定位是抗原-特异性的一系列图像。在第0和5天，用静脉内注入表达MOv19-BBζ(顶部)、抗CD19-BBζ(中间)或gfp(底部)的8×106个T细胞治疗具有皮下SKOV3fLuc+肿瘤的NSG小鼠。从安乐死的小鼠收集生长大约另外40天的SKOV3肿瘤，并且对其染色用于人CD3表示(褐色)。代表性切片以×100放大显示。
图22，包括图22A至图22D，显示Mov19-BBζ T细胞在腹膜癌病的SKOV3鼠模型中抑制肿瘤生长和腹水形成。图22A描绘接收腹膜内注入的5×106个SKOV3fLuc+肿瘤细胞的NSG小鼠，并且将其随机分成4组，然后开始在肿瘤接种后第30和35天经腹膜内或静脉内注入表达MOv19-BBζ或抗CD19-BBζ的9×106个T细胞的疗法。图22B描绘用MOv19-BBζ T细胞(左)经静脉内(顶部)或腹膜内(底部)注入治疗的代表性NSG小鼠。如通过膨胀的腹部表明的(中间)，用抗CD19-BBζ T细胞(右)治疗的小鼠发展腹水。腹膜的尸检观察显示结节性肿瘤块(箭头；极右)。图22C描绘用MOv19-BBζ或抗CD19-BBζ T细胞经静脉内或腹膜内注入治疗的负载肿瘤的NSG小鼠的卡普兰-迈耶肿瘤-相关的存活曲线。图22D描绘负载肿瘤的NSG小鼠的卡普兰-迈耶总存活率。
图23，包括图23A和图23B，显示FRα-特异性T细胞的过继性转移诱导卵巢癌肺转移的退行。具有3天建立的SKOV3fLuc+肿瘤的NSG小鼠在肺中、在第3天和第8天接收表达MOv19-BBζ或抗CD19-BBζ的6×106个T细胞的尾静脉注入。图23A描绘肿瘤，如通过BLI监测的。图23B描绘量化的来自fLuc+肿瘤细胞的平均值±SD生物发光信号光子发射。
图24显示用MOv19-BBζ或MOv19-ζ转导的初级人T细胞在用FRα+癌细胞系刺激之后优先产生Th1细胞因子。转导的T细胞(1×105个CAR+T细胞)单独培养(没有其他)或用等数量的人FRα+SKOV3或抗原阴性PEO-1卵巢癌细胞刺激过夜。收获来自3个独立培养物的无细胞上清液，并且在温育～20小时后合并，并且使用细胞计量珠阵列技术(cytometric bead array technology)量化指示的人Th1/Th2细胞因子。值表示指示的细胞因子的IFN-γ浓度(pg/ml)。
图25，包括图25A至图25C，显示工程化表达FRα-特异性CAR的初级人T细胞体外裂解FRα+细胞系。图25A描绘转导不表达人FRα的天然小鼠恶性间皮瘤细胞系AE17，以表达高表面水平的人FRα(AE17.FRα)，如流式细胞术显示的。转导以表达MOv19-ζ、MOv19-BBζ、MOv19-Δζ或抗CD19-BBζ CAR，或绿色荧光蛋白(gfp)的初级人T细胞与Cr51标记的天然AE17或AE17.FRα细胞系以指定的效应子与标靶比共同培养4小时。图25B描绘特异性靶细胞溶胞作用的百分数，计算为(实验的释放–自发的释放)÷(最大的释放-自发的释放)×100。结果表示为三重孔的平均数，误差条表示标准偏差。转导以表达MOv19-ζ、MOv19-BBζ、MOv19-Δζ或抗CD19-BBζ CAR的人T细胞在各种效应子与标靶比下与表达gfp的AE17或AE17.FRα细胞共同培养24小时。图25C描绘转导的细胞在荧光显微方法下照相。通过gfp标记的粘附肿瘤细胞的成像减少指示靶细胞溶胞作用。
图26，包括图26A至图26D，显示肿瘤退行与体内工程化的人T细胞的稳定持久性相关，并且取决于提供CD137共刺激信号传导。图26A描绘肿瘤负荷，如通过T细胞注入之后4周每个治疗组的平均生物发光信号测量的。图26B描绘体内T淋巴细胞的持久性，其通过Trucount方法在转移经静脉内、肿瘤内或腹膜内途径递送的表达MOv9-BBζ的T细胞或肿瘤内施用表达MOv19-ζ的T细胞或对照载体(MOv19-Δζ或gfp；对照)之后4周评估。图26C显示T细胞疗法之后4周，工程化的人T细胞的稳定持久性(x轴)与生物发光信号负相关(y轴；r=-0.78)。单独在培养基中(未显示)或与SKOV3一起培养3天之后，检测通过FR-特异性CAR CD8T细胞的Bcl-XL表达。与MOv19-ζCAR+T细胞(6.7%)相比，在用FRα+肿瘤细胞刺激之后，Bcl-XL表达优先在MOv19-BBζ CAR T细胞群中增加(15.4%)。单独在培养基中培养不诱导在CAR T细胞中的Bcl-XL表达。图26D描绘3个独立的共同培养之一的代表性FACS分析。
图27是描绘T细胞疗法之后切除的肿瘤样本的肉眼评估的一系列图像。从NSG小鼠收获肿瘤，所述NSG小鼠肿瘤内(i.t.)注入盐水或负载gfp、MOv19-Δζ、MOv19-ζ、MOv19-BBζ CAR的T细胞；或静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)注入MOv19-BBζ T细胞。“没有肿瘤”表示其中没有检测到肿瘤的小鼠。在第一次T细胞注入后大概40天安乐死时从小鼠收获肿瘤。
图28是描绘本文其他地方详述的临床试验的研究方案计划的图像。
图29是显示被工程化以表达包含人源化的C4scFv的全人抗FRCAR的初级人T细胞体外识别并且应答表达FR的癌细胞系。scFv有效地在被转导以表达第一(-z)或第二(-28z)CAR(上部；对于gfp共同表达使用双顺反子载体)的T细胞表面上表达。当与表达FR的卵巢癌或乳腺癌细胞共同培养过夜时，CAR转导的而不是未转导的(UNT)T细胞分泌IFN-g。很少表达至不表达FR的细胞系(A2780和C30)未被识别(下部)。
图30是总结SEQ ID NO同一性的图像。
发明详述
本发明涉及治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于上皮癌。本发明涉及转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞过继细胞转移的策略。CAR是联合对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性和T细胞受体-活化细胞内结构域以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
本发明一般地涉及被基因修饰以稳定表达期望的CAR的T细胞的应用。表达CAR的T细胞在本文中被称为CAR T细胞或CAR修饰T细胞。优选地，该细胞可被基因修饰，以在它表面上稳定表达抗体结合结构域，给予MHC非依赖性的新型抗原特异性。在一些例子中，T细胞被基因修饰，以稳定表达CAR，所述CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ链或FcγRI蛋白的细胞内结构域联合成为单一嵌合蛋白。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一个实施方式中，可选择跨膜结构域，或可由氨基酸置换修饰，以避免这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。优选地，跨膜结构域为CD8α铰合结构域。
相对于胞浆结构域，本发明的CAR可被设计以由其本身包括CD28和/或4-1BB(CD137)信号传导结构域，或与在本发明的CAR的内容下有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。在一个实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以进一步包括CD3-ζ的信号传导结构域。例如，CAR的胞浆结构域可包括但不限于CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导模块和其组合。因此，本发明提供了CAR T细胞和它们用于过继疗法的方法。
在一种实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过将包括靶向α-叶酸受体(αFR或FRα)的期望CAR的慢病毒载体引入细胞产生。例如，慢病毒载体包括进入细胞的包含抗FRα、CD8α铰合和跨膜结构域，和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的CAR。本发明CAR的抗FRα结构域可为结合FRα的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和人源化的抗体。因此，如本文使用，抗FRα(或抗αFR)表示靶向FRα的任何组合物。本发明的CAR T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明涉及利用淋巴细胞注入施用表达CAR的基因修饰T细胞，以治疗具有癌症或处于具有癌症风险下的患者。优选地，自体淋巴细胞注入用于治疗。自体PBMC从需要治疗的患者收集，和T细胞利用本文描述和本领域已知的方法进行活化和扩展，并且随后注入返回患者。
本发明包括利用表达包括CD3-ζ和4-1BB共刺激结构域两者的抗-FRα CAR的T细胞(也被称为FRα-特异性CAR T细胞)。本发明的FRα-特异性CAR T细胞可承受稳固的体内T细胞扩展，并可建立FRα-特异性记忆细胞，其在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量。在一些例子中，本发明的注入患者的FRα-特异性CAR T细胞可消除患有上皮卵巢癌的患者体内的癌细胞。然而，本发明不限于FRα-特异性CART细胞。更确切地，本发明包括与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合的一种或多种细胞内结构域融合的任何抗原结合部分。
定义
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本文使用冠词“一个(a)”和“一个(an)”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±20%或±10%的变化，更优选±5%，甚至更优选±1%，和还要更优选±0.1%的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
如本文使用，术语“FRα结合结构域”可指本领域技术人员已知的任何FRα特异性结合结构域。在一种实例中，FRα结合结构域包括单链可变片段(scFv)，其包括特异性结合FRα的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。抗FRα抗体、抗体片段和它们的变体在本领域是熟知的，并且在下列美国专利公开中充分描述：U.S20100055034；U.S.20090324594；U.S.20090274697；U.S.20080260812；U.S.20060239910；U.S.20050232919；U.S.20040235108，其所有通过引用以它们的整体并入本文。在一种实施方式中，FRα结合结构域是抗FRα抗体的同系物、变体、异构体或功能片段。每个可能性表示本发明单独的实施方式。
如本文使用，术语“4-1BB(CD137)共刺激结构域”可指4-1BB的任何序列，其包括，例如，4-1BB的刺激信号传导结构域。本领域已知4-1BB的刺激信号传导结构域和它们的变体，并且充分描述在美国专利公开20050113564中，其通过参考以其整体并入本文。本领域已知4-1BB的核酸和氨基酸序列和它们的变体，并且充分描述在下列美国专利公开中：U.S.20060063923；U.S.20060029595；U.S.20030082157；U.S.20020168719；U.S.20040091476；U.S.20050113564；和U.S.20060002904，其所有通过引用以它们的整体并入本文。在一种实施方式中，4-1BB(CD137)共刺激结构域是4-1BB(CD137)的同系物、变体、异构体或功能片段。每个可能性表示本发明分开的实施方式。
“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等，1988,Science242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和广泛公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子，该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
如本文所用的术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。
根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统错误识别为外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
“同种异基因的(allogeneic)”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的(xenogeneic)”指的是源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖，共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“紊乱”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不必定引起动物健康状态的进一步降低。
如本文所用的“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。
“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用的“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用的，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60%同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50%的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
如本文所用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。
在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某一版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用的“慢病毒”指的是反转录病毒科的属。在反转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是所有慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。
如本文所用的术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象优选人的有益的治疗性应答。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCRTM等等克隆核酸序列，和通过合成手段。
如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可包括蛋白质或肽的序列的最大数目的氨基酸没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别，或引导合成机器的DNA序列。
如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。
通过术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级应答。刺激可介导一些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文所用的“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子。
术语“对象”意欲包括在其内可引起免疫应答的活有机体(例如，哺乳动物)。对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
如本文所用的“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然发生状态中与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与在其天然状态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。
如本文所用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。
如本文所用的短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体等等。
范围：在该公开中，本发明的多个方面可以以范围形式中示出。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从1至6的描述应被考虑为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
说明
本发明提供了治疗癌症等疾病的组合物和方法。该癌症可为血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。优选地，该癌症为上皮癌，或换言之为癌。更优选地，该癌症为上皮卵巢癌。利用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。
在一个实施方式中，本发明提供了工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞显示抗肿瘤性质。本发明的CAR可被工程化以包括胞外结构域，所述胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变(redirect)抗原识别。示例性抗原为FRα，因为该抗原在恶性上皮细胞上表达。然而，本发明不限于靶向FRα。相反地，本发明包括任何抗原结合部分，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷(tumorburden)缩小或消除。抗原结合部分优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合的一个或多个细胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括CD137(4-1BB)信号传导结构域。这是因为本发明部分地基于CAR-介导的T-细胞应答可利用共刺激结构域的添加而进一步提高的发现。例如，与没有被工程化以表达CD137(4-1BB)的其他方式相同的CAR T细胞相比，包括CD137(4-1BB)信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和CAR T细胞的体内持久性。
组合物
本发明提供了包括细胞外结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。细胞内结构域或另外的胞浆结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
抗原结合部分
在一个实施方式中，本发明的CAR包括另外被称为抗原结合部分的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
在一个实施方式中，本发明的CAR可经由工程化特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合部分而被工程化，以便靶向兴趣肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性紊乱(hyperproliferative disorder)抗原”或“与过度增生性紊乱相关的抗原”指的是对于特定过度增生性紊乱诸如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。
肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的标靶。
本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。
TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在优选的实施方式中，CAR的抗原结合部部分靶向如此抗原，所述抗原包括但不限于FRα、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Ova1、雌激素受体、孕酮受体、HER-2/neu、uPA、PAI-1等等。
取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程化以包括对期望抗原靶特异性的适当的抗原结合部分。例如，如果FRα是待靶向的期望抗原，则FRα的抗体可用作抗原结合部分，并入本发明的CAR。
在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部部分靶向FRα。优选地，本发明的CAR中的抗原结合部部分为抗-FRα scFV，其中抗-FRα scFV的核酸序列包括SEQ ID:3中提出的序列。在一个实施方式中，抗-FRα scFV包括编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CAR的抗-FRα scFV部分包括SEQ IDNO:15中提出的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本发明的CAR中抗原结合部部分是人源化的抗FRα scFV，其中人源化的抗FRα scFV的核酸序列包括SEQ ID:21中提出的序列。在一种实施方式中，人源化的抗FRα scFV包括编码SEQ ID NO:23的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR的人源化的抗FRα scFV部分包括SEQ ID NO:23中提出的氨基酸序列。
跨膜结构域
对于跨膜结构域，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和胞浆信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
优选地，本发明的CAR中的跨膜结构域为CD8跨膜结构域。在一个实施方式中，CD8跨膜结构域包括SEQ ID NO:5的核酸序列。在一个实施方式中，CD8跨膜结构域包括编码SEQ ID NO:17的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，CD8跨膜结构域包括SEQ IDNO:17的氨基酸序列。
在一些例子中，本发明的CAR的跨膜结构域包括CD8铰合结构域。在一个实施方式中，CD8铰合结构域包括SEQ ID NO:4的核酸序列。在一个实施方式中，CD8铰合结构域包括编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方式中，CD8铰合结构域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
胞浆结构域
本发明的CAR的胞浆结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的胞浆序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可由两个不同类的胞浆信号传导序列介导：通过TCR(初级胞浆信号传导序列)开始抗原-依赖性初级活化的那些和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级胞浆信号传导序列)的那些。
初级胞浆信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
包含在本发明中具有具体用途的初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的胞浆信号传导分子包括源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件也位于本发明的范围内。
本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。还在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包括SEQ ID NO:6中提出的核酸序列和CD3-ζ的信号传导结构域包括SEQ ID NO:7中提出的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包括编码SEQ ID NO:18的氨基酸序列的核酸序列，和CD3-ζ的信号传导结构域包括编码SEQ ID NO:19的氨基酸序列的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计以包括4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包括SEQ ID NO:18中提出的氨基酸序列，和CD3-ζ的信号传导结构域包括SEQ ID NO:19中提出的氨基酸序列。
载体
本发明包括包含CAR序列的DNA构建体，其中该序列包括可操作地连接至细胞内结构域的核酸序列的抗原结合部分的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的细胞内结构域。在一些例子中，CAR可包括CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的任何组合。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括抗-FRα scFv、人CD8铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:1中提出的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括编码SEQ ID NO:13的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:13中提出的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本发明的CAR包括人源化的抗FRα scFv、人CD8铰合和跨膜结构域，和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。在一种实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:20中提出的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括SEQ IDNO:22中提出的氨基酸序列。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而不被克隆。
本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于反转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖(propagation)。慢病毒载体具有超过源自致癌反转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，反转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入反转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管近来已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是反转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送工具(deliveryvehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO中获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)中获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring中获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)中获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以以具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构为特征。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等，191Glycobiology5：505-10)。然而，也包括与正常的囊泡结构相比具有溶液中的不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞的方法，或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，以便证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
T细胞的活化和扩展
不论在T细胞遗传修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和扩展：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005。
通常地，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩展，所述表面具有附着于其的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段或抗-CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域中公知的其他方法一样，可使用包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diacione，Besancon，France)的抗-CD28抗体的例子(Berg等，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998;Haanen等，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999;Garland等，J.ImmunolMeth.227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“cis”形式)或分开的表面(即，以“trans”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在一些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其他结合剂。在这点上，见例如用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和扩展本发明的T细胞。
在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠即“cis”上或分开的珠即“trans”上。作为例子，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于CD4+T细胞扩展和T细胞生长的珠的1:1比率的每种抗体。在本发明的一些方面中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到T细胞扩展的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到从大约1至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的CD3:CD28抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的抗-CD28抗体被结合至颗粒，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的一些实施方式中，结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的CD3:CD28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的CD3:CD28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的CD3:CD28比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的CD3:CD28比率。
从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在一些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内和其间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗-CD3-和抗-CD28-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而一些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1颗粒每T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒每天或此后每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠组合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在一个可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
作为例子，可通过允许附接抗-CD3和抗-CD28的顺磁珠(3×28个珠)接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，以1:1比率的
Figure BDA0000383468660000361
M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液优选PBS(没有二价阳离子诸如，钙和镁)中进行联组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占0.01%的样本，或整个样本(即，100%)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在一些实施方式中，可期望显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度，在另一个实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用细胞浓度10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml。还在另一个实施方式中，使用细胞浓度75、80、85、90、95或100×106细胞/ml，在进一步的实施方式中，可使用125或150×106细胞/ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在一些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时(大约3个小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPM1培养基1640或X-vivo15，(Lonza))，其可包含增殖和存活必须的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo20、优选的(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞的生长和扩展量的细胞因子(一个或多个)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5%CO2)。
已经暴露于变化刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(Tc，CD8+)更多的辅助T细胞群(TH，CD4+)。T细胞通过刺激CD3和CD28受体的离体扩展在大约8-9天前产生主要由TH细胞组成的T细胞群，而在大约8-9天后，T细胞群包括渐增的更多的Tc细胞群。因此，取决于治疗目的，用主要包括TH细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了Tc细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩展该亚型。
进一步地，除了CD4和CD8标记，其他表型标记在细胞扩展过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。
治疗性应用
本发明包括用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或任何其组合的细胞内结构域联合的CAR。因此，在一些例子中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
本发明提供了CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR，和CAR T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。例如，不期望地，本发明的FRα-特异性CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CAR T细胞可体内分化成中心记忆样状态。
不希望被任何具体的理论所束缚，由CAR-修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。例如，FRα-特异性CAR T细胞引起对表达FRα的细胞特异性的免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-FRα scFv、人CD8α铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。即，本发明包括CAR中任何抗原结合部分产生对抗原结合部分特异性的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明的CAR中的抗原结合部分可出于治疗癌症的目的靶向肿瘤抗原。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和一些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤，和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
在一种实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部部分设计为治疗具体的癌症。FRα是糖基磷脂酰肌醇-锚定的蛋白质，其在上皮恶性肿瘤谱中的癌细胞的表面上过表达，但是在正常组织中受限。因此，设计为靶向FRα的CAR可用于治疗特征为展示FRα过表达的细胞和/或组织的任何疾病或紊乱，其包括但不限于上皮癌。例如，设计为靶向FRα的CAR可用于治疗癌症和紊乱，其包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、结直肠癌、其他实体癌等等。
然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
在此通过引用并入的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩展程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩展的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩展包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩展这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体，也可用于培养和扩展细胞。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗卵巢癌。在一些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成卵巢癌风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防卵巢癌的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
在一些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取(redraw)血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和扩展的T细胞再注入该患者。该过程可每几个周进行多次。在一些实施方式中，T细胞可从10cc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽取/多个再输注方案可用于选出一些T细胞群。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70S6激酶(Liu等，Cell66:807-815,1991;Henderson等，Immun.73:316-321,1991;Bierer等，Curr.Opin,Tmmun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在1至大约100mg的范围中，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6,120,766中描述)，但优选的日剂量为1至10mg每天。
实验实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开背景的剩余部分。
现在描述在这些实验中使用的材料和方法。
产生抗-α-叶酸受体(αFR)T-体分子(body molecule)
抗-αFR scFv(MOv19)用作模板，用于使用下列引物PCR扩增780-bp MOv19片段：
5’GCGGGATCCTCTAGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTG-3’(SEQ ID NO:24)(BamHI加下划线)和5’GCGGCTAGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCCC-3’(SEQ ID NO:25)(NheI加下划线)。
所得PCR产物包含在5α端上的BamHI位点和在3α端上的NheI位点。通过PCR使用之前构建的模板和下列引物，扩增CD8α铰合、跨膜和胞质区域：
5’GCTGGGACAAAGTTGGAAATCAAAGCTAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACC-3‘(SEQ ID NO:26)(NheI加下划线)和5’TCGACAGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3‘(SEQ IDNO:27)(用于含功能TCRζ的分子，SalI加下划线)。
通过重叠延伸经基因剪接产生嵌合免疫受体构建体。等摩尔量的MOv19PCR产物和CD8铰合、跨膜和胞质PCR产物结合
5’ATAGCATCTAGAATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTC-3‘(SEQ ID NO:28)(XbaI加下划线)和
5‘TCGACAGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3‘(SEQ IDNO:29)(用于含功能TCRζ的分子，SalI加下划线)。
接着用XbaI和SalI消化终PCR产物，并且连接入pELNS，其是基于pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE的第三代自失活慢病毒表达载体，其中转基因表达由代替CMV启动子的EF-1α启动子驱动。产生并且浓缩高效价研究级复制缺陷型慢病毒载体。
该方案中的试验药是用α-FR-CAR转导的自体T细胞(图6)。自体T细胞用表达α-FR CAR的慢病毒载体转导。这改变转导的T细胞对表达αFR的肿瘤的特异性，所述αFR在90%的上皮卵巢癌(EOC)中高水平表达，但是正常组织中基本没有。α-FR CAR连接至由TCRζ、4-1BB组成的细胞内信号传导分子。scFv MOv19源自小鼠单克隆抗体，并且因此包含免疫原性的小鼠序列。如果建立早期的临床可行性和效能，则该scFv被人源化用于稍后阶段的临床开发。转基因的胞浆信号传导结构域全部为天然的人序列。这些受体是“通用的”，因为它们以MHC-非依赖性方式结合抗原，因此，一种受体构建体可用于治疗具有α叶酸受体抗原-阳性肿瘤的患者群。将终转基因构建体克隆入pELNS慢病毒载体(图6和7)。
图8A示意性描绘了用于α叶酸受体(αFR)嵌合免疫受体基因递送的质粒。转移载体是HIV源的自失活(SIN)载体，其包括5’LTR和3’U3缺失的LTR。转基因转录由哺乳动物ef-1α启动子驱动(drive off)。转基因由细胞外结构域MOv19(αFR scFv)和信号传导结构域4-1BB和CD3ζ链组成。载体也包含用于改善转导效率的中心聚嘌呤区和中心终止序列(cppt/CTS)、用于RNA转运的rev响应元件(RRE)、用于改善RNA翻译的WPRE元件和包装序列。
构建包含FRα-特异性scFv(MOv19)的新的CAR，所述FRα-特异性scFv连接至失活形式的CD3-ζ细胞内结构域(MOv19-Δζ)、CD3ζ链信号传导模块(MOv19-ζ)或结合CD137(4-1BB)共刺激基序(MOv19-BB-ζ)(图6)。用CAR使用慢病毒载体转导人T细胞。在共同培养试验中，经IFN-g ELISA和细胞因子珠试验，测量CAR转导的T细胞对表达FRα的卵巢癌细胞的反应性。使用生物发光系统体外测量细胞毒性。在NOG小鼠的Winn试验和异种移植模型中探究αFR CAR潜在的抗肿瘤效能。
可给予患者或用于治疗患者细胞的材料的制备、结构和组成。
CAR构建体在宾夕法尼亚大学研发，并且在Larry Couture博士的指导下，在希望之城(The City of Hope)克隆和制造临床级载体。在宾夕法尼亚大学的临床细胞和疫苗生产机构中制造临床级工程化的T细胞。在细胞培养结束时，细胞冷藏在袋子的可注入的冷藏培养基中。每个袋包含含可注入级反应物的冷藏培养基的等分试样(体积依赖于剂量)。通过直接肿瘤内注入，超声引导或术中使用剂量升级方法，阶层1中的对象可接收单剂量的α-FR CAR转导的T细胞。使用剂量升级方法，阶层2中的对象接收转导的T细胞的分次剂量静脉内注入(在第0、1和2天分别10%、30%和60%)。
测量DNA纯度
用于制造载体的DNA分离自在氨苄西林选择下LB培养基中生长的大肠杆菌细胞。DNA经历质量控制(QC)释放检测，以确保其同一性和纯度。检测DNA的外观(澄清和无味的)、260/280比(1.7-2.0)、琼脂糖凝胶电泳(≥90%超螺旋的)、残留RNA(检测不到/μg)、线性质粒DNA或染色体DNA(检测不到/μg)、限制酶图谱、内毒素(<30EU/mg)和无菌度。
病毒产生
由希望之城(City of Hope)产生慢病毒载体。希望之城已经建造了I/II期cGMP制造机构，其由单向GMP支撑区域内的二个(2个)独立的10,000级制造套件(manufacturing suite)(A&B)组成。每个套件由下述组成：进入/穿衣气闸室(Gowning Airlock)、细胞扩展实验室、生产实验室、纯化/缓冲液制备实验室，和离开/脱衣气闸室(DegowningAirlock)。每个套件具有独立的空气处理机，其具有HEPA供给和控制的排气。控制套件之间和套件内的压差以及温度和湿度。通过中央建筑监测系统监测、记录和警告环境条件和GMP设备。所有转移和任何打开容器操作在套件的单向流100级罩中进行。
支撑GMP区域包括：GMP控制的存储器、-80℃控制的存储器、+4℃控制的存储器、USP水系统、USP气体分配系统、材料气闸室、分开的衣帽间、穿衣气闸室、进入走廊、高压灭菌器/浴室和离开走廊。所有气闸室、走廊和直接到达支撑区域由多个GMP空气处理机供应HEPA过滤的供应空气，以支撑总体100,000级别的空间。
在293T细胞中病毒产生
使用三质粒产生系统通过瞬时转染生产病毒载体，其在类似(Zufferey等，1997)的系统中提供gag/pol、tat、rev和VSV-G。仅仅重叠的区域在包装和gag和cppt/CTS序列中。根据FDA指南进行RCL检测，如稍后描述的。
该方法开始于来自GMP验证的Master Cell Bank(主细胞库)的单个小瓶的冷冻293T细胞。细胞解冻并且通过多个传代扩展，以在许多尺寸的培养烧瓶中增加细胞计数和细胞体积。希望之城具有粘附和悬浮细胞系两者。这是粘附细胞系生产方法的一般描述：
解冻的细胞离心成小球，重悬浮在细胞培养基中，并且进行细胞计数。包含培养基的多个烧瓶用细胞以特定的细胞密度接种。在37℃和5%CO2浓度下、在培养器中温育烧瓶～24小时。24小时之后，从包含细胞的烧瓶移出培养基，并且添加生长培养基至烧瓶和细胞。在相同的温度和CO2下，温育烧瓶另外的24小时。从培养器中移出烧瓶，移出培养基，用胰蛋白酶溶液从表面松动细胞，细胞计数，并且用烧瓶中的培养基以指定的接种密度扩展至5倍的烧瓶。在37℃和5%CO2下，温育烧瓶48小时。在该时间结束时，从烧瓶移出培养基，细胞被胰蛋白酶化，细胞计数，并且多达10个细胞工厂(4层)以指定的细胞密度和800mL的生长培养基每个细胞工厂接种。在37℃和5%CO2下，温育细胞工厂大约72小时。接着从细胞工厂移出培养基，细胞被胰蛋白酶化，计数，并且用于以大约1.5L的生长培养基接种十(10)个细胞工厂(每个10层)。这十(10)个细胞工厂在37℃和5%CO2下温育～24小时。从细胞工厂移出培养基并且用包含培养基、转染试剂和三种GMP质粒的转染试剂转染细胞。
转染试剂由磷酸钙溶液中三种GMP生产质粒组成；包含有效基因的DNA质粒，和两种DNA辅助质粒——p93和pVSV-G。通过全测序DNA质粒、用DNA转染大肠杆菌菌株，并使大肠杆菌生长以产生Master Cell Bank，来制备GMP质粒。来自Master Cell Bank的小瓶用于表达DNA质粒，其被纯化、等分并且检测序列、纯度和无菌度。
在用转染试剂转染细胞工厂之后，温育它们大约20小时。倾倒转染试剂并且添加生长培养基至细胞工厂。接着在收获之前温育它们另外的24小时。
载体纯化和释放检测
按照好的制造实践(GMP)纯化病毒载体。从细胞工厂倾倒包含载体的流体，集中，并且接着通过0.8/0.45微米净化过滤器过滤净化。净化的收获物加样至色谱柱中的阴离子交换树脂。用低盐缓冲液冲洗离子交换柱，并且接着用0.7M NaCl缓冲液洗脱半纯化的载体。
然后使用500kD切向流过滤器(TFF)膜浓缩洗脱缓冲液，并且用低盐缓冲液渗滤至10X的浓度。添加benzonase内切核酸酶至该溶液以去除残留DNA，并且温育大约1小时。处理的溶液进一步用500kD TFF膜浓缩另外的10X，并且接着用大约十(10)体积的配制缓冲液进行渗滤。渗滤之后，根据需要，将纯化的载体溶液进一步从10X浓缩至20X。终浓缩物以期望的体积填充至无菌血浆袋，取样，并且然后冷冻至-80℃。
检测样品，并且回顾所有文档，并且材料释放之前批准。如下进行载体释放检测：通过视觉观察检测纯度(澄清和无色的)、pH(7.0-7.4)、传导性(4-7mS/cm)、填充体积(≥40ml)、总蛋白质≤0.70mg/ml和benzonase(≤100ng/ml或0.1ppm)；通过银染色的SDS-page和通过对构建体/转基因特异性的RT-PCR检测同一性；通过对293细胞的效价检测效力(≥2.5×107TU/ml)；对于安全性，通过qPCR检测载体的gagDNA(不可检测的)，和对于RCL，通过VSV-G DNA和生物学RCL测试(下面描述)；无菌度检测包括内毒素(<100EU/ml)、无菌度(不生长)、偶然的病毒(不可检测的)和支原体(不可检测的)；也通过p24ELISA检测载体(0.1-10μg/ml)。可为每个载体提供A的分离的C。
RCL试验
根据FDA检测RCR的指南，进行具有重组或复制能力的慢病毒(RCL)的检测。C8166细胞暴露于载体上清液并且传代3周。通过ELISA针对p24生产监测培养上清液，并且针对通过PCR测量的持续的或增加数量的包装DNA监测培养上清液。按照指南用于这些试验的测试品是5%或300ml的培养上清液，这无论哪一个都小于10×108生产终止(EOP)细胞。在印第安纳大学的国立基因载体实验室中进行检测。
载体的包装、运输和存储
根据Lentigen DMF中描述的希望之城运输SOP，将第一批次的载体运输至UPENN。取决于在哪里制造GMP批次，将来批次载体的运输可从印第安纳大学的Omnia Biologics，或从Lentigen公司进行。
载体稳定性监测计划
通过转导效率，在每个细胞产物中确定载体的效力，如通过经拷贝数和/或转基因表达水平测量的。因为每个载体批次是单独的并且量小，所以对于该阶段的该研究，没有对载体实施稳定性监测计划。另外，稳定性检测计划需要CVPF运输载体回到制造机构，用于使用它们的标准试验进行滴定。将运输步骤引入稳定性检测引入了一个变量。
期望的重组DNA的靶细胞，离体处理并且返回到患者的细胞，治 疗之前和之后的细胞表征，和DNA的靶细胞并入
靶细胞产物是自体CD3+自体T淋巴细胞。通过经由在使用单用途封闭系统一次性组的Gambro Elutra上逆流离心淘析清除(耗尽，depletion)单核细胞，从白细胞提取法产物富集T淋巴细胞。在第0天，用抗CD3/CD28mAb包被的磁珠活化T淋巴细胞启动αFR T-体(T-body)制造方法。以分次剂量添加αFR载体，在第0天50%和在第1天50%。载体转导发生在第0天和第3天之间。在第3天，冲洗细胞并且替换培养基。通常扩展培养物9-12天。在培养收获时，细胞被清除(deplete)磁珠、冲洗、浓缩和冷藏。
在培养起始时，富集的CD3+T细胞培养物通常包含一些数量的残留αFR CAR+细胞(B细胞～5-10%)、CD16+(NK细胞～5-10%)和CD14+细胞(巨噬细胞在～<5%)。因此，在转导期间，这些细胞暴露于载体，并且并入重组体转录。在体外扩展之后，终细胞产物通常>90%的CD3+淋巴细胞。培养条件不支持巨噬细胞或B细胞的生长，并且在培养期结束时，B细胞占总培养物的～<2%，和巨噬细胞占～<1%。
离体转导的方法确保仅仅淋巴细胞富集的外周白细胞暴露于载体。在扩展期间的第3天冲洗掉任何残留非整合载体，并且在收获期间再次冲洗，并且在配制终细胞产物之前浓缩。载体不能移动，即使在HIV存在的情况下，所以，不用担心载体的垂直或水平传递、或传递至不存在于起始培养物中的细胞。
下面详细描述制造方法：
细胞收集和纯化
在T细胞制造方法的第0天，通过白细胞提取法收集获得非移动外周血白细胞。收集大约10L，并且在Baxter Amicus细胞分离器或等同物上处理，以获得大约5-15×109白细胞群。产物被送至(take to)CVPF，在那里对细菌和真菌培养物取样，并且通过流式细胞术表型分析(phenotyping)。在Coulter Multisizer III上确定细胞数量，并且通过台盼蓝拒染试验检测生存力。单采血液成分术产物接着用Gambro Elutra处理，其使用逆流离心力以基于尺寸和密度分离细胞群。Elutra作为封闭系统操作，并且使用一次性管组进一步使污染的风险最小化。使用Baxter CytoMate、Cell Saver(细胞回收器)5或COBE2991细胞处理器结合并冲洗Elutra分离之后收集的淋巴细胞部分。通过对Elutra后淋巴细胞组分和单核细胞组分进行的流式细胞术，评估和跟踪细胞产物的组成(CD4+、CD8+、B细胞和巨噬细胞等)。
细胞富集过程(第0天)之后，用抗CD3/抗CD28mAb包被的磁性微珠以3:1珠和细胞比活化富集的淋巴细胞。该最佳的珠:细胞比之前确定(IND#6675和Levine等，1997)。在静态组织培养烧瓶中，用缀合有小鼠抗人CD3和CD28的Dynabeads刺激富集的淋巴细胞(经淘析或阳性选择)。通过以每天50%的总转导MOI添加αFR CAR慢病毒载体，用预定的MOI(例如25TU/细胞的FR载体)在培养的第0天和第1天进行转导。在培养的第3天，载体通过在Baxter CytoMate细胞处理系统或Cell Saver5设备中的培养基替换冲洗掉。在冲洗掉载体之后，细胞和珠混合物接种回到可透过气体的组织培养烧瓶中的新鲜培养基中，并且放置在37℃下5%CO2和>90%湿度的培养器用于培养和进一步扩展。将细胞培养物保持在封闭系统中。组织培养烧瓶上的管线通过各种无菌管连接设备和热封机(例如穗连接器(spike connector)、来自Terumo无菌连接设备的管焊、来自Sebra热封机的热封)连接或断开，以防止污染的风险。在培养的第3天至第5天每天计数细胞。培养5天之后，可隔天计数细胞。添加新鲜的培养基至培养物以保持细胞在适当的密度。在细胞生长的对数期，如果需要，转移培养物至WAVE生物反应器，其中细胞浓度可达到1×107个细胞/ml或更高。之前已经建立了WAVE生物反应器2/10和20/50的最优化的细胞培养条件(6月IND12799和Hami等，2003，2004)。WAVE的优势是T细胞以更高的密度生长，其节省处理和细胞收获期间的劳动力。对于多达1×1010的细胞剂量，不需要WAVE生物反应器。
培养物收获和终制剂、冷藏
在培养的最后一天，使用Baxter Fenwal收获器或等同的系统收获并且浓缩细胞。在通过收获器处理细胞之前和之后，将细胞产物放置在Baxter MaxSep上用于去除抗CD3/CD28磁性微珠。将αFR CAR T细胞重悬浮在冷藏培养基中。使用程序降温仪(controlled-rate freezer)，在袋子中冷冻细胞。冷藏的αFR CAR T细胞产物在≤-130℃的监测的降温仪中保存。取决于药剂的尺寸，每个注入袋可包含～10-50mL的细胞。
细胞纯度和释放检测
αFR-CAR T细胞的释放检测类似于之前类似的在临床细胞和疫苗生产机构制造的用于临床试验的基因疗法细胞产物(见6月IND#6675，8568，12799，13911)。基于下述，检测并且释放αFR-CAR T细胞：细胞生存力(岗哨管(sentinel tube)，≥70%)、%CD3+细胞(≥80%)、残留珠计数(≤100个珠/3百万个细胞)、内毒素(<3.5EU/ml；3.5EU/ml的限制以下列方式获得：在100ml的最大体积下，冷藏细胞浓度100×106/ml等于1×1010细胞的细胞剂量。3.5×100=350EU，平均个体=70kg，所以限制是5EU/kg)、载体拷贝数(≥0.2拷贝每个细胞)、αFR CAR表达(通过流式细胞术，≥20%表达)、VSV-G DNA(不可检测的)、通过HIVgagDNA和p24蛋白质的RCL(阴性)、支原体(阴性)，和细菌/真菌培养物(没有生长)。
添加的DNA序列结构的监测和分析的灵敏性。
慢病毒载体通过整合它们的病毒基因组的DNA拷贝进入细胞DNA永久性修饰细胞的DNA。因此，可通过分离自PBMC的DNA的PCR，体内监测这些序列。已经开发了PCR试验，其检测CAR嵌合信号传导结构域之间的连接区域，从而遗传构建体可区别于自然存在的内源信号传导链。这允许监测每个患者中载体修饰细胞的持久性。
就其持续存在性和其结构稳定性二者而言，添加的DNA的稳定 性。
为了安全性目的，每个细胞的平均培养拷贝数限于0.2-5的范围。因为载体稳定地整合入细胞的DNA，所以扩展之后的拷贝数是稳定的。由于载体修饰的细胞的扩展、流通和持续性，给药之后体内载体拷贝的检测可随着时间增加或减少。
现在描述实验的结果。
实施例1：在过继性转移基因修饰的α-叶酸受体-特异性T细胞之 后根除人卵巢癌。
慢病毒转导之后，人T细胞表达细胞表面scFv Mov1940～50%(图3)。当与FRα+肿瘤细胞共同培养时，MOv19-ζ和BB-ζ转导的T细胞显示IFN-g、TNF-α和IL-2细胞因子的靶-特异性释放和细胞毒性功能，而用MOv19-Δζ或用GFP转导的T细胞没有显示(图4)。在体内Winn试验中，MOv19-ζ转导的T细胞能够抑制FRα+卵巢癌的赘生(outgrowth)(图5和6)。相反，用MOv19-Δζ或用GFP转导的T细胞对肿瘤生长没有作用(图5和6)。值得注意地，通过提供4-1BB(CD137)信号传导改善MOv19CAR的体内抗肿瘤活性(图6)。此外，表明共刺激结构域的并入增强T细胞的持久性并且与改善的体内抗肿瘤效能相关(图7)。
实施例2：DNA递送效率和含DNA的靶细胞百分数。
描述的慢病毒载体递送系统在递送基因至T淋巴细胞方面是高效的。在使用建议用于试验的T-体构建体的临床前实验中，其常规表明对于转导以表达具有CD3ζ和4-1BB信号传导结构域的αFR CAR的CD4+T细胞中α-FR-CAR蛋白质>60%的转导效率(图8B)。当与鼠反转录病毒载体转导效率比较时，慢病毒载体因它们出色的基因转移效率而广泛公知。
实施例3：功能的体外评估。
已经进行了数个临床前研究表明基因转移系统的体外和体内效能以及其有效负载(payload)(图9)。为了调查转导的T细胞的抗肿瘤潜能，在标准铬释放试验中使用αFR-阴性AE17细胞、AE17.FR(工程化以表达αFR的衍生物)，和建立的人卵巢癌细胞系，测量效应子功能。用αFRCAR转导的T细胞有效地裂解AE17.FR但不杀死亲本AE17细胞。重要地，αFR CAR-转导的T细胞也对表达αFR的癌细胞是高度细胞毒性的，杀死人卵巢癌SKOV3细胞系。包括两重(一前一后，in tamden)或三重4-1BB(CD137)共刺激结构域与TCR-ζ通常不增加高于仅表达αFR CAR TCR-ζ的T细胞的体外细胞毒性的体外细胞毒性。杀死是有效的，在20-h的培养期间，以10:1E:T比发生的平稳(plateau)的溶胞作用(图10)，这提示改变的T细胞能够连续杀死。而且，溶胞作用是特异性的，因为用GFP或不相关的CD19-CAR转导的T细胞不显示抗相同靶细胞的细胞毒性活性，这排除同种异体反应性或非特异性溶胞作用。此外，表达截短的TCR-ζ细胞内结构域(αFR-Δz)的T细胞也不能杀死表达αFR的标靶，这表明需要完整的TCR-ζ信号传导结构域。CAR+T细胞与一组肿瘤细胞系共同温育，并且确定分泌的效应子细胞因子IFN-g的量。CAR+T细胞识别FRa+肿瘤系SKOV3和A1847，并且以非常高的水平分泌IFN-g。在与以中等水平表达FRa的OVCAR3和A2780的共同温育中观察到中等水平的IFN-g。在与C30和PEO-1细胞系的共同温育中观察到低水平的IFN-g，通过FACS分析，C30和PEO-1细胞系对αFR表达是阴性的(图9底部)。
实施例4：功能Winn试验的体内评估。
作为αFR CAR构建体的体内抗肿瘤活性的初始测试，通过皮下注入与表达CAR的T细胞(1×106个细胞/小鼠)混合的表达荧光素酶的αFR+人卵巢癌细胞系SKOV3(1×106个细胞/小鼠)，进行Winn试验。接种之后以及每10天使动物成像，以评估肿瘤生长，并且使用“LivingImgae”软件(Xenogen)量化来自表达荧光素酶的细胞的光子发射。在用GFP或αFRCAR dz转导的T细胞处理的小鼠中没有观察到对肿瘤生长的影响(图11A)。在这些对照组中，在接种后大约30天，动物开始发展肿瘤，所有动物到第40天发展肿瘤(图11B)。与之相比，注入具有αFRCAR-z或BBz的T细胞的小鼠同等地抑制肿瘤赘生，直到接种后30天，这表明在Winn试验中需要完整的TCR CD3ζ信号传导结构域。但是，另一10天之后，来自αFR CAR CD3ζ组的所有的小鼠具有可检测的肿瘤(4/4)，而来自BBz组的仅仅3/5小鼠具有肿瘤。这些肿瘤明显小于CD3ζ组肿瘤。这些数据显示将4-1BB(CD137)并入FRα CAR可增强体内抗肿瘤活性。
实施例5：异种移植模型
为了进一步开发αFR-CAR构建体的潜在的抗肿瘤效能，开发使用SKOV3Luc肿瘤细胞的异种移植模型。在第0天，6至12-周-龄雌性NOG小鼠在肋腹上皮下接种3×106SKOV3Luc细胞。在肿瘤变得可触知约1个月之后，活化人初级T细胞(以1:1比混合所用的CD4+和CD8+T细胞)，并且如上述进行转导。在T细胞扩展2周之后，当肿瘤负荷是200～300mm3时，用T细胞治疗小鼠(～40%–50%转基因-阳性)。T细胞注入的途径、剂量和时机在各个图示中指出。用测径器测量肿瘤尺寸，并且使用式V=1/2(长度×宽度2)计算肿瘤体积，其中长度是最大的纵向直径，和宽度是最大的横向直径。在肿瘤接种后第40天和45天，用肿瘤内注入20×106T细胞(～40%–50%转基因阳性)治疗负载肿瘤的小鼠。人供体用于产生转导的T细胞。所有不接收基于细胞疗法的盐水组小鼠显示持续的肿瘤生长。类似地，接收具有信号传导缺陷的αFR CAR dz或GFP转导的T细胞的小鼠在T细胞转移时间之后显示持续的肿瘤生长。接收αFR CAR-z T细胞的小鼠显示缓慢的肿瘤生长，其当与所有的三个对照组比较时没有明显的不同(图12A、C)。与所有其他组比较，接收αFR CAR BBz T细胞的小鼠展示快速肿瘤退行，这提示4-1BB信号传导在体内介导增强的抗肿瘤应答。
为了评估不同的施用途径的效果，负载肿瘤的小鼠也使用αFRCAR BBz转导的T细胞，通过静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)注入和肿瘤内(i.t.)注入进行治疗。在静脉内和腹膜内注入之后，再次观察到有效的抗肿瘤作用(图12B,D)，但是与肿瘤内途径施用相比，肿瘤块减少显示约7天延迟(图12B)。肿瘤内注入似乎是较好的施用路径，略微(marginally)快于静脉内和腹膜内。
实施例6：转移后人T淋巴细胞的持久性。
接下来，确定工程化的T细胞在所有小鼠中的持久性。在第74天，最后过继T细胞转移之后4周，获得外周血，并且对CD4和CD8T细胞的存在进行量化。与gfp、αFR CAR dz和CD3ζ组相比，在通过IT、IP和IV途径注入BBz CAR+T细胞之后，在小鼠中CD4+和CD8+T细胞计数最高(图13)。值得注意，在BBz组中CD4+和CD8+T细胞的计数显著高于z组(P<0.01)，而z组中的总T细胞计数类似于包括盐水组而没有T细胞注入的其他对照组(p>0.05)。
实施例7：抗原特异性模型。
已经显示包含4-1BB的αFR CAR介导T细胞增强的存活率并且增加体内抗肿瘤活性，接下来寻求确定αFR CAR抗肿瘤活性是否是抗原特异性的。在异种移植模型中，评估也包含4-1BB信号传导结构域的CD19特异性的CAR。在建立肿瘤之后的第6周，在第40天和45天用肿瘤内注入20×106T细胞治疗负载肿瘤的小鼠(～40%–50%转基因阳性)。治疗之后，在αFR CAR BBz组中观察到肿瘤块的快速减少(图14A)。相反，用表达GFP或CD19CAR的T细胞组治疗的小鼠中肿瘤日益生长。因此，αFR CAR BBz根除SKOV3肿瘤是抗原-特异性的，因为也包含4-1BB共刺激信号传导结构域的CD19CAR不展示抗肿瘤活性(图14A、B)。用肿瘤内αFR CAR BBz治疗的小鼠具有明显高于肿瘤内抗CD19组的(P<0.05)T细胞计数，这提示肿瘤抗原驱动过继性转移的T细胞在体内扩展(图14C)。
实施例8：人卵巢癌的腹膜内模型。
在之前的实验中，表明CAR T细胞的局部注入导致根除体内建立的肿瘤。进一步确定在腹膜内模型中的αFR-特异性T细胞的抗肿瘤活性，因为卵巢癌是通常局限于腹膜腔的疾病。30天后，腹膜内接种5×106SKOV3Luc细胞有效地产生腹膜癌病(图15C)。在经IV(静脉内)或IP(腹膜内)途径表达CD19CAR BBz的T细胞转移后1-3周之内，观察到指示腹水形成的肿胀的腹部和严重的腹膜癌扩散(图15A)。这些小鼠发展显著的血性腹水(5～8ml)和多个结节性腹膜肿瘤并且由于腹部膨胀在T细胞注入后的1-3周内必须进行安乐死。尽管用αFR CAR BBz治疗的所有小鼠不形成腹水，并且展示增强的存活率(图15B)，但是在αFRCAR BBz T细胞经IP(腹膜内)和IV(静脉内)途径转移之后10周，分别60%(3/5)和40%(2/5)的负载SKOV3肿瘤的小鼠仍是活的。因此，在腹膜癌病的SKOV3鼠模型中，αFR CAR BBz特异性T细胞抑制肿瘤生长和腹水形成。重要地，αFR CAR BBz特异性T细胞提高存活时间。
实施例9：人卵巢癌的肺转移模型。
偶尔地，卵巢癌患者呈现攻击性疾病，其显示为肝或肺实质转移，或在疾病进展期间，发展转移至如脑的远距离位点。为了产生卵巢癌的肺转移模型，在第0天，8–12-周-龄的NOG小鼠静脉内注入2×106SKOV3Luc细胞(200μl PBS中)。在第3天肺中肿瘤建立的明显之后，在第3天和第8天用尾静脉注入15×106的αFR CAR BBz T细胞或CD19CAR BBz T细胞治疗动物(200μl PBS中)。该途径肿瘤接种在100%的小鼠中建立进行性肺转移，如通过生物发光成像判断的(图16顶部)。在CD19CAR T细胞治疗的小鼠中，所有动物中肿瘤进行性生长。相反，注入αFR CAR BBz-特异性T细胞导致所有治疗的动物(n=5)中肺转移的快速退行(图16，第14天)。在>2个月的跟踪之后，80%(4/5)的小鼠没有肿瘤复发的证据。一个动物具有复发的肺转移并且在第70天安乐死。因此，αFR-特异性T细胞的过继性转移提供肺转移退行的可能性。
实施例10：人应用的关联性
上面研究表明构建体体内和体外的功能性。多种人卵巢癌细胞系比如SKOV3、A1847、OVCAR3、C30、A2780和PEO-1用于体外实验(见图9底部)。该方法也在使用人卵巢癌细胞系SKOV3Luc的临床前异种移植模型中。体外系统和提议的人治疗之间可能的差异是体外实验在细胞系上进行，其可能不反映体内的肿瘤细胞。
使用的卵巢癌模型是正位人异种移植并且因此类似于腹膜内扩散的人卵巢癌疾病。与人疾病的可能差异是该模型是极其攻击性的。另一明显的差异是模型在免疫缺陷宿主中发展，而人卵巢癌在免疫活性个体中发展，尽管具有卵巢癌的患者可展示抑制细胞免疫性的基础(elements)。
实施例11：评估在人中基因转移方案成功必须的最小水平的基因 转移和/或表达以及最小水平的确定。
已经实现了终细胞产物0.2-5的拷贝数释放规格。该规格高于用慢病毒载体常规实现的，并且数值表示期望表现活性同时使来自大量插入不必要的风险最小化的范围。对于阶层1，肿瘤内3×107个CAR T细胞/m2的单次注入可作为最低剂量施用，而对于阶层2，通过静脉内注入给药的CAR T细胞使用3×108个CAR T细胞/m2的“分次剂量”作为最低剂量。可通过流式细胞术监测终产物的转导百分数，并且可在收获之后和在基线——注入后马上记录转导细胞的数量。
临床试验的主要目的是确立αFR-CAR T细胞的最佳生物剂量。该中试试验(pilot assay)的目的是评估αFR-CAR修饰的细胞的安全性、耐受性和差别生存和运输。提议的患者数量可足以达到该端点，如方案中的统计分析计划所支持的。
实施例12：在实现最小需要水平的基因转移和表达方面，递送系 统的功效。
对于表明αFR构建体转导的体外效率的数据，请参考图8，对于动物数据请参考图11、12、13、14。在以临床规模使用慢病毒载体的临床中试试验中已经表明了使用慢病毒载体技术CD3/28刺激的自体T细胞的有效转导。类似的方法可用于提议的研究。
实施例13：基因-特异性表达
用于该研究的慢病毒载体仅仅编码单一蛋白质，其是感兴趣的转基因。因此，除了转基因，载体不表达其他基因。在之前的慢病毒载体研究中，使用条件复制的病毒载体，其使用天然LTR作为启动子。在不存在tat的情况下，这些启动子中有非常低的基础活性，并且因此预期很少的连读至相邻的基因，除了在HIV感染的情况中。在初始转导细胞产物上进行对5个治疗的患者中插入位点模式的分析。发现载体以类似于用其他慢病毒载体——包括SIN载体——观察到的模式插入基因。插入的位置如对慢病毒所预期的，其主要在富集基因的区域(Levine等，2006的图3b)。插入转录活性基因的载体遍布编码区域分布。在最近的出版物中确认了这些发现，其在接收慢病毒载体转导T细胞的患者中纵向评估插入位点模式。没有检测到对整合位点选择，这表示没有致癌基因或肿瘤抑制基因的功能修饰。
提议的研究中使用的载体可以是如图6和7中描述的具有组成型活性内启动子的SIN载体。近来的研究评估了在肿瘤易感小鼠模型背景下，直接与具有完整LTR的鼠反转录病毒载体相比，SIN载体的转录活性和它们对致癌基因活化的作用。小鼠中发展的肿瘤中的基因的分子分析不支持SIN载体的致癌基因转录活化，尽管鼠反转录病毒载体诱导骨髓瘤亚组中的致癌基因活化。该是由于来自MLV LTR的更大增强子作用，和MLV载体的插入模式，其在基因的5’控制区域中占优势，在那里更可能调节基因表达。
尽管相邻基因的转录活化在用SIN慢病毒载体转导的细胞中是可能的，但是事件的频率好像比使用MLV载体转导少得多。值得注意已经在HIV感染中进行了天然实验，而T细胞白血病不是野生型慢病毒感染的已知副作用。
实施例14：DNA插入物的细胞表达和正常活性的百分数。
转基因的表达在通用的哺乳动物ef-1α启动子的控制之下，其之前已经显示在T细胞中具有最佳的转基因表达，并且因此观察到在所有转导细胞中的表达。
准备用于注入的转导的T-细胞是有生物活性的。在NOG小鼠的临床前数据中，αFR构建体在转导的细胞中的表达在小鼠模型中持续直到第74天(见图13)。在患者中，在整个试验中通过PCR和流式细胞术二者监测外周血可检测转导T细胞的持久性。
实施例15：基因异常表达
离体制造方法的优势在于可小心控制暴露于载体的细胞。结果，细胞处理期间，αFR CAR构建体可仅仅在载体靶向的细胞中表达。因为T淋巴细胞通过阴性选择分离，所以在转导期间，在培养物中可存在小百分数的单核细胞和B细胞。终产物不存在单核细胞但是可残留小百分数的B细胞(<2%)。
在第一慢病毒载体试验中，终产物的表型平均93.4%(范围80至>99%)的CD3+T细胞。在本方案中，预期类似的靶群体。
实施例16：反转录病毒颗粒的产生
已经用慢病毒载体制剂转导293细胞和初级T细胞。载体是第三代自失活(SIN)载体，并且不包含任何病毒蛋白质并且是不能复制的。因此，用该载体转导的细胞不产生感染颗粒。
通过瞬时转染，在293T细胞中生产载体。慢病毒载体制剂的释放测试包括有复制能力的慢病毒(RCL)的灵敏生物学试验。尽管由于产生系统中缺乏辅助蛋白和同源区域，产生RCL的机会是可忽略不计的，但是该终生物学试验为载体制剂中任何复制部分缺失提供功能证据。
至今，在来自之前的和正在进行的临床试验的任何GMP载体批次中，没有检测到RCL。更重要地，在迄今已经用慢病毒载体修饰的细胞治疗的23个患者的任一个中没有RCL的证据。对于建议研究的载体的开发批次和GMP批次正在进行并且可根据FDA指南检测RCL。
对于使用条件复制病毒载体的之前的临床研究，检查初级CD4T细胞中的载体的稳定性，并且表明载体拷贝数在实验的持续时间中是稳定的(图17)。如果已经发生载体的明显重排，则这将已经反映在载体拷贝数改变上。重要地是注意，即使细胞扩展超过1000-倍，实验中载体拷贝数也保持稳定，因为这些实验显示载体拷贝数不增加，如通过TaqMan PCR测量的(包含10,000至30,000个细胞的每个反应1个拷贝的灵敏性)。
也在初级T细胞中进行该载体的稳定性研究，以评估载体从生产至转导的稳定性(即单个反转录步骤)。整个载体基因组的测序显示转导细胞中生产载体和原病毒之间100%的保真度。尽管反转录的错误率是约10,000个中1个，这导致平均每2个原病毒中大约1个错误，但当转导的细胞群聚集在一起时，这种突变可能作为噪声落入背景中，因此提供100%保真度的总图。因为每个载体仅仅有一轮的反转录，所以突变率对转录功能的影响应该可忽略不计。为了使载体的不稳定性最小化，已经设计αFR-CAR载体，以便它们没有直接或反向的重复元件。
不存在关于这些载体是否可与人细胞中存在的内源性反转录元件重组的信息。但是，对于亲本wt-HIV基因组和其如何在人细胞中复制存在大量的知识。至今，即使4千万人感染了该病毒，也没有记录wt-HIV和内源性反转录病毒元件之间的生产性重组事件。假如发生该假设的重组事件，则问题变成其是否将导致产生具有比wt-HIV更大致病性的重组体。如果这发生，那么其可能已经在感染群体中发生。在全世界的感染群体中没有描述该事件的事实提示如果wt-HIV和内源性序列之间的重组事件发生，那么所得重组体极少或在人中没有致病性。
实施例17：关于转移的潜在有害作用的实验室证据(例如，瘤的发 展、有害的突变、感染颗粒的再生或免疫应答)
至今，没有HIV源慢病毒载体造成肿瘤发生的报道。Montini等近来的报道(Montini等，2006)提供了证据支持SIN慢病毒载体就基因毒性方面的相对生物安全。尽管理论上HIV源的慢病毒载体可造成插入肿瘤生成仍是可能的，但是至今不存在支持该理论的数据。
提议的研究中使用的载体是SIN载体，其已经小心地设计为仅仅包含功能需要的最小遗传元件，并且为了最大生物安全没有载体蛋白质(Dull等，1998)。在良好的制造条件下，以与FDA纯度要求一致的方式，制造和纯化载体，如关于RCR检测的2006FDA指南、关于细胞和基因疗法产物的美国药典指南和关于药学和散装化学品GMP的CFR条例中所规定的。
在本申请中，离体使用载体，并且因此较不可能诱导免疫应答。但是，在正在进行的I/II期临床试验中，观察到在第三剂载体修饰的细胞之后，在50%的患者中产生对载体包膜蛋白的抗体。因为给药安排是两周的，所以在一些或所有的患者中可能早在通过第二次注入产生免疫应答。不认为单个注入将产生抗体应答，因为在单剂量的I期临床研究中没有患者变为VSV-G Ab阳性(Levine等，2006)。产生对VSV-G的抗体不影响载体修饰的细胞在患者中的持久性，也不对应患者中的不利事件。因此，VSV-G抗体的发展具有很少至没有可检测的临床影响。在提议的临床研究中，每个患者给予两次注入。因此，在该试验中可能观察对VSV-G的抗体应答。
实施例18：致病性的动物研究
对第一慢病毒载体临床试验，进行广泛的生物分布和生物毒性研究。对于生物分布研究，总共192只小鼠分成48只小鼠的4组，其接收0.3ml下列的尾静脉注入：单独注入媒介(组1)，20,000,000个模拟的转导人T细胞(组2)，300,000个载体转导人T细胞(组3)或20,000,000个载体转导人T细胞(组4)。分开检测雄性和雌性小鼠。在第2、15、30、91和123天分析小鼠，并且评估小鼠的一生的参数，包括死亡率、临床观察/物理检查和体重。研究显示载体转导人T细胞对死亡率、临床观察或体重没有影响。没有小鼠发展T细胞肿瘤。通过PCR评估载体序列的存在。在第2和30天，所有来自组3和4检测的组织中存在载体序列。到91天，仅仅来自4只小鼠的肺、肝、脾和尾部为载体阳性，并且到123天没有检测到载体(表1)。
组织 第2天 第30天 第91天 第123天
心脏 100% 30% * *
生殖腺(睾丸/卵巢) 80% 50% * *
肝 100% 90% 10% *
腹股沟淋巴结 90% 20% * *
骨髓 100% * * *
肺 100% 40% * *
脾 100% 10% 10% *
尾 100% 40% 10% *
血液 100% 40% * *
表1.来自评估免疫缺陷小鼠中慢病毒载体-转导的人T细胞的生物分布研究的结果。显示的是来自给予最高剂量的转导细胞(每个小鼠静脉内20,000,000个人CD4细胞)的小鼠的结果，如正文中描述的。对于n=10每个时点，雄性和雌性小鼠组合。*，没有检测到载体。
在其他实验中，评估慢病毒载体修饰的T细胞的生物毒性，总共144只小鼠分成4组，每组36只小鼠，其接收如上列出的分成相同组的0.3ml尾静脉注入。分别检测雄性和雌性小鼠。评估小鼠的死亡率、临床观察/物理检查、体重、临床病理学结果、宏观病理学发现、器官重量数据、骨髓评估和组织病理学结果。来自该研究的结果是载体转导的人T细胞不与任何毒性相关，并且对任何评估的参数没有影响。
用于提议研究的载体在结构和有效负载方面不同，但是，慢病毒转导的细胞工具(人T细胞)预期以小鼠模型中类似的方式表现。
近来已经在肿瘤易发小鼠模型中检测SIN载体的基因毒性，并且尽管用鼠反转录病毒载体检测到毒性，但是在模型的灵敏性内没有能检测到毒性。αFR-CAR细胞耐受性的研究可仅仅在早期临床试验中精确确定，因为即使在人源化的小鼠模型中，各种组织之间的抗原、T细胞运输和肿瘤抗原表达在动物模型中可能也是不同的。
没有证据支持载体DNA移动或进入未治疗的细胞。在上述生物分布研究中，结合人细胞标记，仅仅在小鼠体内检测到载体序列，这表示其不能移动至非靶向的细胞。在第91或123天(研究结束)，小鼠中生殖腺没有可检测的载体序列(表1)。这也可在对于αFR CAR的计划的生物毒性和生物分布研究中评估。
所有临床前动物研究已经在免疫缺陷NOD/SCIDγ-/-(NSG)人异种移植动物模型中进行。
实施例19：通过共刺激信号传导至CD137(4-1BB)，增强CAR工 程化的T细胞的体内持久性、肿瘤定位和抗肿瘤活性
工程化以表达对酸受体-α(FRα)特异性的嵌合抗原受体(CAR)的人T细胞已经在体外显示稳固的抗上皮癌的抗肿瘤活性，但是在临床上没有，因为它们在体内不能持续并且定位到(home to)肿瘤。在该研究中，构建包含FRα-特异性scFv(MOv19)的CAR，所述FRα-特异性scFv(MOv19)单独连接至T细胞受体CD3ζ链信号传导模块(MOv19-ζ)或串联地(in tandem)与CD137(4-1BB)共刺激基序(MOv19-BBζ)结合连接。当在体外与FRα+肿瘤细胞共同培养时，转导以表达常规MOv19-ζ或共刺激MOv19-BBζ CAR的初级人T细胞分泌各种促炎症细胞因子，并且发挥细胞毒性功能。但是，仅仅转移表达共刺激MOv19-BBζ CAR的人T细胞在负载大的建立FRα+人癌症的免疫缺陷小鼠中介导肿瘤退行。MOv19-BBζ CAR T细胞注入在转移的腹膜内、皮下和肺相关人卵巢癌的模型中介导肿瘤退行。重要地，肿瘤反应与体内人T细胞选择性存活和肿瘤定位相关，并且仅仅在接收共刺激MOv19-BBζ CAR T细胞的小鼠中观察到。T细胞持久性和抗肿瘤活性主要是抗原驱动的；但是，CAR的抗原-非依赖性CD137信号传导改善T细胞持久性，但不改善体内抗肿瘤活性。本文描述的结果显示配备有串联的CD137共刺激信号传导的抗FRα CAR克服了限制常规FRα T细胞靶向策略的T细胞持久性和肿瘤定位问题，以提供有效的体内抗肿瘤活性。
如本文所描述的，通过将CD137共刺激信号传导结构域引入FRα-特异性CAR解决了受限的体内FRα-特异性T细胞持久性和肿瘤活性问题，并且研究CD137信号传导在人癌症的FRα定向的CAR T细胞疗法中的作用。与为T细胞提供CD3ζ信号传导但缺乏cis共刺激信号传导能力的“第一代”CAR相比，表达具有串联CD137信号传导结构域的FRα-特异性CAR的T细胞显示最小改善的体外抗肿瘤活性，但是在建立的人卵巢癌异种移植模型中显示显著优越的肿瘤退行能力，其与增强的体内T细胞持久性和肿瘤定位相关。肿瘤退行和T细胞持久性二者可通过各种途径的T细胞注入获得，并且静脉内(i.v.)细胞注入在晚期腹膜内(i.p.)、皮下(s.c.)和肺相关的转移疾病的异种移植模型中介导人癌症的退行。T细胞体内持久性和肿瘤活性主要是抗原驱动的；但是，在缺乏CAR的特异性抗原识别的情况下下提供CD137信号传导可提高体内T细胞持久性，但不提高体内抗肿瘤活性。FRα-特异性CAR中CD137信号传导结构域的并入因此通过提高转移的T细胞的体内持久性，和支持它们在肿瘤中的积聚和抗肿瘤效力，克服过去CAR方法的限制。
现在描述这些实验中使用的材料和方法。
材料和方法
抗FRα嵌合免疫受体构建
如之前描述的(Carpenito等，2009，Proc Natl Acad Sci USA106:3360-65)，产生嵌合免疫受体骨架构建体。抗FRα scFv序列源自MOv19(Miotti等，1987，Int J Cancer39:297-303；Figini等，1998，Cancer Res58(5):991-6)，其是针对FRα的单克隆抗体。MOv19scFv已经被充分表征(Figini等，2009，Cancer Immunol Immunother58(4):531-46；Melani等，1998，Cancer Res58:4146-54)，并且使用下列引物扩增：
5’-GCGGGATCCTCTAGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTG-3’(SEQ ID NO:24)(Bam-HI加下划线)和
5’-GCGGCTAGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCCC-3’(SEQ ID NO:25)(Nhe-I加下划线)
并且接着克隆入CAR骨架载体。用BamHI和NheI内切核酸酶消化scFv PCR产物，并且在连接至pCLPS载体之前凝胶纯化，所述pCLPS载体是基于第三代自失活CMV启动子的慢病毒表达载体，其基于pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE(Dull等，1998，J Virol72(11):8463-71)。之前已经描述抗CD19-BBζ CAR构建体(Milone等，2009，Mol Ther17:1453-64)。生产高效价慢病毒载体，并且通过以26,000rpm超离心3h浓缩10-倍，如之前描述的(Parry等，2003，J Immunol171:166-74)。
细胞系
在购买自ATCC永生化正常胎儿肾293T细胞系中进行慢病毒包装。基于免疫的试验中使用的人细胞系包括建立的人卵巢癌细胞系SKOV3、A1847、OVCAR3、C30和PEO-1。对于生物发光试验，转染靶癌细胞系以表达萤火虫荧光素酶(fLuc)，通过生物发光成像的抗生素选择阳性表达富集。对于特异性对照，用慢病毒转导小鼠恶性间皮瘤细胞系AE17，以表达FRα(AE17.FRα)。获得表达CD19的K562(CD19+K562)细胞，人红白血病细胞系(Milone等，2009，Mol Ther17:1453-64)。将293T细胞和肿瘤细胞系保持在补充10%(v/v)热灭活的FBS、2mM L-谷酰胺、100μg/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640(Invitrogen)中。所有的细胞系常规检测原体污染。
人T细胞
购买自宾夕法尼亚大学人免疫学中心的初级人CD4+和CD8+T细胞通过阴性选择按照白细胞提取法自健康志愿者供体分离。在大学伦理审查委员会认可的方案下收集所有样本，并且从每个供体获得书面的知情同意书。在完全培养基(补充10%热灭活的FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素、10mmol/L HEPES的RPMI1640)中培养T细胞，并且用抗CD3和抗CD28单克隆抗体(mAb)包被的珠(Invitrogen)刺激，如下描述(Levine等，1997，J Immunol159:5921–30)。活化后12-24小时，用大约5至10的感染多样性慢病毒载体转导T细胞。用于体内实验的CD4+和CD8+T细胞以1:1比混合、活化和转导。隔天添加人重组白介素-2(IL-2；Novartis)至50IU/mL的终浓度，并且保持0.5×106个至1×106个细胞/mL的细胞密度。一旦T细胞好像静息下来(restdown)，如降低的生长动力学和通过使用Multisizer3Coulter计数器(Beckman Coulter)的细胞测量二者所确定的，调整工程化的T细胞培养物，以在功能试验之前平衡转基因表达细胞的频率。
流式细胞术分析
下列MAb用于表型分析：APC-Cy7小鼠抗人CD3；FITC抗人CD4；APC抗人CD8；PE-抗人CD45。所有的mAb购买自BD BiosciencesPharMingen。在T细胞转移实验中，经眼框后出血获得外周血并且为人CD45、CD4和CD8T细胞的存在染色。如制造商的说明书中描述的，在对人CD45+群设门之后，使用具有已知数量荧光珠的TruCount管(BD Biosciences)量化CD4+和CD8+子集。通过Mov18/ZEL抗体(Enzo Life Sciences)检测FRα的肿瘤细胞表面表达。通过购买自JacksonImmunoResearch的PE缀合的山羊抗小鼠IgG F(ab')2(对鼠源的scFv特异性)检测FRα特异性CAR表达。为了细胞内染色，细胞被固定，可渗透化，并且用PE缀合的抗Bcl-XL抗体(Southern Biotech)染色。在所有的分析中，使用同种型匹配的对照Abs。通过FlowJo软件分析流式细胞术数据。
细胞因子释放试验
通过在96孔圆底部板的200μl终体积的T细胞培养基中一式三份共同培养每孔1×105个T细胞与1×105个靶细胞，进行细胞因子释放试验。20～24小时之后，根据制造商的说明书(Biolegend)，使用ELISA试剂盒检查共同培养上清液的IFN-γ的存在。值表示三重孔的平均数。通过流式细胞术使用细胞因子珠阵列，根据制造商的说明书(BDBiosciences)，测量IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α细胞因子。
细胞毒性试验
对于基于细胞的生物发光试验，5×104个表达萤火虫荧光素酶的肿瘤细胞(fLuc+)用完全培养基在存在不同比的转导T细胞的情况下，使用96孔微板(BD Biosciences)培养。在37℃下温育18-20小时之后，每个孔填充用1μl D-荧光素(0.015g/ml)重悬浮的50μl DPBS并且使用Xenogen IVIS Spectrum成像。肿瘤细胞生存力百分数计算为实验样品的平均发光减去背景除以试验中使用的输入数的靶细胞的平均发光减去背景乘以100。所有的数据表示为三重孔的平均数。如所描述的(Johnson等，2006，J Immunol177(9):6548-59)，进行51Cr释放试验。在37℃下用100μCi51Cr标记靶细胞1.5小时。PBS中冲洗靶细胞3次，以105个活细胞/mL重悬浮在CM中，并且96孔V-底板的每孔添加100μL。CM中冲洗效应子细胞两次，并且以给定比添加至孔。快速离心板以沉淀细胞，并且在37℃下5%CO2培养器中温育4或8小时，之后收获上清液，并且使用1450Microbeta Liquid Scintillation计数器(Perkin-Elmer)计数。特异性溶胞作用百分数计算为(实验的溶胞作用-自发的溶胞作用/最大的溶胞作用-自发的溶胞作用)乘以100。对于gfp靶细胞溶胞作用试验，转导的T细胞与5×104表达gfp的AE17或AE17.FRα细胞，以各种效应子与标靶比共同培养24小时，并且在荧光显微方法下照相。通过gfp标记的粘附肿瘤细胞的成像减少指示靶细胞溶胞作用。
卵巢癌的异种移植模型
如之前描述的(Carpenito等，2009，Proc Natl Acad Sci USA106:3360–5，Milone等，2009，Mol Ther17:1453–64)加上本文详述的改进进行小鼠研究。从宾夕法尼亚大学Abramson癌中心的干细胞和异种移中心获得所有的动物。在无病原体条件下，用宾夕法尼亚大学IACUC认可的方案室内饲养、处理和维持8-12-周龄NOD/SCID/γ-链-/-(NSG)小鼠。对于建立的卵巢癌模型，在第0天，6至12-周-龄雌性NSG小鼠在肋腹上皮下接种3×106SKOV3fLuc+细胞。在约1个月肿瘤变得可触知之后，活化人初级T细胞(使用的CD4+和CD8+T细胞以1:1比混合)，并且如本文其他地方描述的进行转导。2周T细胞扩展之后，当肿瘤负荷是～200-300mm3时，用T细胞治疗小鼠。本文其他地方指出了T细胞注入的途径、剂量和时机。用测径器测量肿瘤尺寸，并且使用式V=1/2(长度×宽度2)计算肿瘤体积，其中长度是最大的纵向直径和宽度是最大的横向直径。在T细胞转移之前和其后约每周使动物成像，以评估肿瘤生长。使用“Living Image”软件(Xenogen)对所有体内实验量化来自fLuc+细胞的光子发射。在第一T细胞剂量之后大约40天安乐死后立即切除肿瘤，进行尺寸测量和免疫组织化学。对于卵巢癌的腹膜内模型，用5×106SKOV3fLuc+细胞腹膜内注入8至12-周-龄NSG小鼠。腹膜内接种后30天，负载良好建立的SKOV3肿瘤的小鼠被分组并且进行治疗。当小鼠痛苦和濒死时，杀死小鼠并尸检。通过将2×106SKOV3fLuc+细胞注入雌性NSG小鼠的尾静脉，建立肺转移。在第3天肺中肿瘤建立明显之后，在第3天和第8天尾静脉注入工程化的T细胞治疗动物。为监测肿瘤进展的程度，每周或每两周使小鼠成像，并且测量小鼠的体重。所有模型中，治疗之前使每组随机4-5只小鼠。
生物发光成像
也通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤生长。使用Xenogen IVIS成像系统进行BLI，并且使用Living Image软件(Xenogen)量化从动物体内表达fLuc的细胞发射的光子。简言之，负载SKOV3fLuc+肿瘤细胞的小鼠腹膜内注入悬浮在PBS中的D-荧光素(150mg/kg原料，100μL的D-荧光素每10克小鼠体重)并且在5～10分钟后异氟烷麻醉下成像。使用Living Image产生表示光强度(蓝色，最不强烈；红色，最强烈)的假色图像。在尸检中确认BLI发现物。
免疫组织化学
通过CO2吸入使小鼠安乐死，并且以组织-Tek O.C.T.化合物收集肿瘤，并且在-80℃下冷冻。标准的链霉亲和素辣根免疫过氧化酶方法用于人CD3染色。在包含10%正常山羊血清的缓冲液中稀释一抗和二抗。在4℃下，将7μm冷冻切片固定在冷丙酮中5min，并且用Dako’s(Carpentaria，CA)过氧化酶封闭系统封闭10分钟。连续温育包括下列：10%正常山羊血清(在室温(RT)下30min)；以1:100稀释的兔抗人CD3单克隆一抗(Thermo Scientific RM-9107)(在RT下45min)；以1:200稀释的生物素化山羊抗兔二抗(在RT下30min)；链霉亲和素-生物素化辣根过氧化酶复合试剂(Dako)(在RT下30min)；和在每个温育后于缓冲液中冲洗3个5分钟。接着，在RT下，将切片暴露于来自Dako的发色团DAB加5min，并且用苏木精复染、脱水、澄清和封固(mount)。
统计分析
对肿瘤负荷，通过两因素(2-way)重复测量ANOVA(肿瘤体积、光子计数)，进行统计分析。学生t检验用于评估转移T细胞的绝对数、细胞因子分泌和特异性细胞溶解的差异。通过使用时序(log-rank)检验比较卡普兰-迈耶存活曲线。GraphPad Prism4.0(GraphPad软件)用于统计计算。P<0.05认为是显著的。
现在描述实验结果。
CAR构建体
基于其对FRα的高亲和力，选择小鼠抗人FRα-特异性scFv MOv19(108–109M-1；参考Miotti等，1987，Int J Cancer39:297–303；Melani等，1998，Cancer Res58:4146–54；Figini等，1998，Cancer Res58:991–6)。FRα CAR构建体由连接至CD8α铰合和跨膜区域的MOv19scFv、随后单独CD3ζ信号传导部分(MOv19-ζ)或串联有CD137细胞内信号传导基序(MOv19-BBζ；图18A)组成。设计包含截短的CD3ζ细胞内结构域(MOv19-Δζ)的信号传导缺陷FRα-特异性CAR，以评估CD3ζ信号传导的贡献。包含串联CD3ζ和CD137信号传导基序(抗CD19-BBζ)的抗CD19CAR用作抗原特异性对照(Milone等，2009，Mol Ther17:1453–64)。将CAR构建体亚克隆至pCLPS慢病毒载体，在那里巨细胞病毒启动子驱动(drive off)转基因表达。利用为临床应用建立的基因转移技术，慢病毒载体有效地转导初级人T细胞，以表达抗FRα CAR(图18B)。在所有试验中，如通过流式细胞术评估的T细胞转导效率对于所有构建体平衡在大约50%。
初级人FRα CAR T细胞发挥体外抗原-特异性功能
因为卵巢癌频繁表达FRα(Miotti等，1987，Int JCancer39:297–303)，所以选择以不同水平(SKOV3、A1847和OVCAR3)表达表面FRα的一组建立的人卵巢癌细胞系，用于试验(图18C)。两个卵巢癌系——C30和PEO-1，是FRα阴性的。表达MOv19-BBζ或MOv19-ζ CAR的转导的T细胞识别FRα+肿瘤系，并且分泌高水平的IFN-γ，但是当用FRα-系刺激时不分泌高水平的IFN-γ(图18D)。当用FRα+癌细胞刺激时，FRα-特异性CAR T细胞也分泌高水平的IL-2和TNF-α，和低但是可检测水平的IL-4和IL-10(图24)。MOv19CARs在初级人CD4+和CD8+T细胞二者中都起作用。在所有情况下，在特异性刺激之后，MOv19-BBζ T细胞比MOv19-ζ T细胞分泌更多的IFN-γ。CD19-BBζ CAR不产生IFN-γ，除了当与工程化以表达表面CD19抗原的K562细胞共同温育时，并且当用FRα+癌细胞刺激时，表达MOv19-ΔζCAR的人T细胞不分泌细胞因子(图18D)，这显示抗原特异性和CD3ζ信号传导对于T细胞中的CAR活性是必要的。
为了查询抗原-特异性溶细胞可能性，抗FRα CAR CD8+T细胞与FRα-AE17(Jackaman等，2003，J Immunol171:5051–63)——小鼠恶性间皮瘤细胞系，或AE17.FRα(转导以表达高表面水平的人FRα的AE17系衍生物)共同培养。在标准4-小时铬释放和24-小时生物发光试验中，FRα-特异性CAR T细胞(MOv19-ζ和MOv19-BBζ)特异性裂解AE17.FRα细胞，但不裂解亲本AE17系(图25)。表达抗CD19-BBζ、MOv19-Δζ或绿色荧光蛋白(gfp)的T细胞不裂解AE17.FRα或AE17细胞。与细胞因子生产结果一致，表达MOv19-ζ或MOv19-BBζ CAR的初级人CD8+T细胞直接和有效地裂解FRα+人卵巢癌细胞系SKOV3和A1847，但不裂解FRα-系C30或624mel——一种黑素瘤细胞系(图18E)。与MOv19-ζ CAR T细胞相比，MOv19-BBζ CAR T细胞展示增加的细胞毒性，但不处于统计显著水平。因此，用FRα-特异性CAR转导的人T细胞特异性识别FRα+人和小鼠癌细胞，并且在体外发挥MHC-非限制性细胞毒性活性。
初级人FRα CAR T细胞的体内抗肿瘤活性
体外CAR功能活性不能足以预测转导的人T细胞的体内抗肿瘤潜能。在大的建立的癌的异种移植模型中评估FRα CAR构建体的抗肿瘤效能。用萤火虫荧光素酶(fLuc)-转染的FRα+SKOV3人卵巢癌细胞在肋腹上皮下接种免疫缺陷的NOD/SCID/IL-2Rγcnull(NSG)小鼠，并且在肿瘤接种后(p.i.)第40天和45天接收肿瘤内(i.t.)注入CAR+T细胞，此时肿瘤尺寸为250mm3或更大。接收盐水、MOv19-Δζ CAR T细胞或gfp T细胞的小鼠中的肿瘤进展超过T细胞转移的时间，如通过基于测径器的测量尺寸和生物发光成像所测量的(BLI；图19A和图19B)。在最迟的评估时间点(第一T细胞剂量后38天)，与所有3个对照组相比，在接收MOv19-ζ T细胞的小鼠中肿瘤生长适当延迟(P=0.027)。相反，接收MOv19-BBζ T细胞肿瘤内注入的小鼠经历快速的肿瘤退行，其明显好于MOv19-ζ T细胞(P<0.001)，这表示CD137信号的并入提高体内的总体抗肿瘤活性。用经静脉内、腹膜内注入，或肿瘤内途径递送的MOv19-BBζ–转导的T细胞治疗的负载肿瘤的小鼠经历肿瘤退行(图19C)。静脉内或腹膜内注入MOv19-BBζ T细胞之后，再次观察到抗肿瘤活性，尽管相对于肿瘤内递送退行延迟大约7天，这表示尽管局部注入是最佳的，但是全身性注入的CAR T细胞当过继性转移时可边缘化(marginalize)以介导体内有效的抗肿瘤作用。
通过4-1BB信号增加初级人FRα CAR T细胞体内的持久性
不希望被任何具体的理论所束缚，认为遵照过继T细胞疗法转移的肿瘤-反应性T细胞的持久性与肿瘤退行高度相关(Robbins等，2004，J Immunol173:7125–30)。本文其他地方描述的实验中，在最后T细胞剂量后3周，从负载肿瘤的小鼠收集外周血，并且量化持续的人CD4+和CD8+T细胞(图19D)。与gfp、MOv19-Δζ和MOv19-ζ治疗组相比，无论通过肿瘤内、腹膜内或静脉内施用途径递送，CD4+和CD8+T细胞计数在接收MOv19-BBζ CAR T细胞的小鼠中最高。注意，通过静脉内注入接收MOv19-BBζ CAR T细胞的小鼠中人T细胞计数明显高于平行的MOv19-ζ CAR组中的计数(P<0.01)，这提示CD137在体内T细胞存活中的作用。在通过静脉内、肿瘤内或腹膜内注入接收MOv19-BBζCAR T细胞的T细胞持久性水平没有显著差异(P=0.2)，尽管静脉内注入组中有较少细胞的趋势。MOv19-ζ治疗组中的总T细胞计数统计学上类似于包括在没有人T细胞注入的情况下接收盐水的小鼠的其他对照组(图26；P>0.05)，这提示单独抗原特异性不足以用于体内T细胞维持。这主要归因于差的CD4+T细胞持久性，因为循环的MOv19-ζCAR CD8+T细胞以比MOv19-Δζ CAR(P=0.026)或gfp(P=0.013)细胞更大的数量存在。最后MOv19-BBζ CAR T细胞剂量之后4周，血液中持续的人T细胞的绝对数与每个组的肿瘤负荷负相关(图26；r=-0.78)。肿瘤BLI结果与切除的残留肿瘤的尺寸一致(图27)。尽管不希望被任何理论所束缚，但是，与MOv19-ζ相比，增强的MOv19-BBζ CART细胞的持久性好像部分归因于抗原刺激之后增加的抗凋亡Bcl-XL蛋白质表达的上调(图26)。因此，肿瘤退行与工程化的人T细胞的体内稳定持久性相关，并且由提供CD137共刺激支持。
肿瘤退行和T细胞持久性是体内抗原驱动的
为了确定MOv19-BBζ CAR抗肿瘤活性是否是抗原-特异性的，用也包含CD137信号传导结构域的抗CD19–特异性CAR进行比较研究(Milone等，2009，Mol Ther17:1453–64)。具有建立的皮下SKOV3fLuc+肿瘤的NSG小鼠接收2次肿瘤内T细胞注入，经历快速肿瘤退行，而在用表达gfp或CD19-BBζ CAR的T细胞治疗的小鼠中肿瘤进行性生长(图20A)，这排除了同种异体反应性为肿瘤退行的机制。接收MOv19-BBζ T细胞的小鼠比抗CD19CAR或gfp组中的小鼠具有显著更高的人CD4+和CD8+T细胞计数(图20B；P=0.009)，这提示肿瘤抗原识别驱动过继性转移的T细胞的体内存活。有趣地，接收抗CD19-BBζ CAR T细胞的小鼠中T细胞的持久性比gfp T细胞可复现地更高(P=0.012)，这提示CAR T细胞的持久性可部分通过不需要scFv与抗原衔接的CD137驱动的过程来促进。然而，抗CD19-BBζ CAR和gfp组之间的肿瘤控制没有统计学差异(P=0.065)——即使在最后的研究时间点(第73天)，这显示在缺乏抗原特异性的情况下的持久性足以介导肿瘤反应。在这范围内(in this line)，施用MOv19-BBζ T细胞的负载肿瘤的小鼠血液中表达CAR的T细胞频率高于在接收CD19-BBζCAR T细胞的小鼠中观察到的，尽管不是统计学显著的(图20C；P=0.08)。但是，与增加的T细胞计数相联系，注入之后持续1个月的循环的CAR+T细胞的总数显著高于接收MOv19-BBζ T细胞(76±13个细胞/μL；P=0.013)的小鼠中的；CD19-BBζ CAR和gfp组中的小鼠有很少到没有可检测的CAR+T细胞的持久性，计数分别为12±4个细胞/μL和0±0个细胞/μl(图20D)。与治疗动物的血液中增加的MOv19-BBζT细胞的持久性一致，在静脉内T细胞施用之后6周，免疫组织化学分析揭示在退行的SKOV3损伤中稳固的人CD3+T细胞的积聚(图21)。在从接收抗CD19-BBζ CAR或gfp-转导的T细胞的小鼠中同时切除的肿瘤中检测到较少的CD3+T细胞。
转移疾病环境中的肿瘤退行
晚期卵巢癌是通常局限于腹膜腔的疾病，偶尔转移扩散至胸膜隔室。建立晚期腹膜内转移癌的异种模型，以评估FRα-特异性T细胞对肿瘤定位于更生理学上相关的隔室中的功能活性。当施用MOv19-BBζ或对照抗CD19-BBζ CAR T细胞疗法时，腹膜内接种SKOV3fLuc+细胞的NSG小鼠有效地发展腹膜癌病，其在肿瘤接种后30天显而易见(图22A)。T细胞转移的3周内，接收对照抗CD19-BBζ CAR T细胞的所有小鼠发展膨胀的腹部，显著的血性腹水大约5至8mL体积和多个结节性腹膜肿瘤，并且由于肿瘤-相关的腹部膨胀必须进行安乐死(图22B和图22C)。通过比较，用MOv19-BBζ CAR T细胞治疗的小鼠不发展膨胀的腹部或腹水，并且展示肿瘤-相关的存活率的明显提高(P=0.0002)，MOv19-BBζ CAR组中没有肿瘤-相关的死亡率的病例(图22C)。在用MOv19-BBζ治疗的小鼠安乐死时，肿瘤负荷最小至没有，但是小鼠需要安乐死，这是由于与活化的人淋巴细胞的异种转移之后在NSG小鼠中发展的GVHD相一致的痛苦征兆(King等，2009，ClinExp Immunol157:104–18)。仍然，在用MOv19-BBζ CAR治疗的小鼠中，在通过静脉内注入的最后T细胞注入之后观察到52天的中等存活时间，并且通过腹膜内途径为68天，与之相比，在抗CD19-BBζ CART细胞组中分别为9天和12天(MOv19-BBζ腹膜内对抗CD19-BBζ腹膜内，P=0.0023；MOv19-BBζ静脉内对抗CD19-BBζ静脉内，P=0.0025；图22D)。用MOv19-BBζ CAR细胞经腹膜内或静脉内途径治疗之后2个月，分别60%(3/5)和40%(2/5)的肿瘤-接种的小鼠仍然活着。
偶尔，卵巢癌患者发展肺转移和胸膜腹水形成，其在疾病进展期间需要胸腔穿刺术或其他支持性管理程序(supportive managementprocedure)(Sood等，1999，Clin Cancer Res5:2485–90)。通过用SKOV3fLuc+细胞经尾静脉注入接种NSG小鼠产生肺转移卵巢癌模型，在肿瘤接种后3天100%的小鼠中产生进行性肺转移(图23)。两次静脉内注入MOv19-BBζ T细胞导致肿瘤接种后14天所有治疗动物的肺转移的快速退行，并且1个月后，80%(4/5)的小鼠没有复发的证据。相对照，在接收抗CD19-BBζ T细胞的所有小鼠中出现疾病进展。
通过为抗FRα CAR T细胞提供CD137共刺激信号引起肿瘤反应和 T细胞持久性
CAR结合抗原-特异性抗体的高亲和力和特异性，其以非MHC限制的方式结合细胞表面决定簇，具有有效的T淋巴细胞效应子功能(Gross等，1989，Proc Natl Acad Sci USA86:10024–8)。具有识别肿瘤-相关的抗原的CAR的初级人淋巴细胞的遗传重新靶向提供产生用于治疗的肿瘤-反应性T细胞的稳固和快速途径。至今，基于CAR的疗法已经显示有希望但是通常限制的临床活性，尽管可复现证明体外强效应子活性(Park等，2007，Mol Ther15:825–33；Pule等，2005，Mol Ther12:933–41；Kochenderfer等，2010，Blood116:4099–102；Till等，2008，Blood112:2261–71；Kershaw等，2006，Clin Cancer Res12:6106–15)。有效的过继T细胞疗法不仅需要抗肿瘤活性，而且也需要注入的肿瘤-反应性T细胞的体内扩展和持久性(Robbins等，2004，J Immunol173:7125–30)。通过将CD137(4-1BB)共刺激信号传导结构域引入基于Mov19scFv的CAR，本文描述的实验已经解决了体内限制的CAR T细胞持久性和肿瘤活性的中心问题(Kershaw等，2006，Clin Cancer Res12:6106–15)。
CD137是TNF受体家族成员，其在T细胞增殖和存活，尤其对于记忆T细胞库中的T细胞起到重要的作用(Shuford等，1997，J Exp Med186:47–55；Takahashi等，1999，J Immunol162:5037–40；Suhoski等，2007，Mol Ther15:981–8)。基于其表现的支持CD8T细胞扩展(Suhoski等，2007，Mol Ther15:981–8)和上调重要的抗凋亡蛋白Bcl-XL表达(Lee等，2002，Eur J Immunogenet29:449–52)的能力，选择CD137，并且结果显示4-1BBL离体共刺激的肿瘤-特异性T细胞的过继性转移支持体内的持久性和抗肿瘤活性(Yi等，2007，Cancer Res67:10027–37)。如单独表达CD3ζ信号传导的“第一代”Mov19-ζ CAR，工程化以表达包含串联的CD3ζ信号传导和CD137信号传导结构域的“第二代”Mov19-BBζ CAR的T细胞一旦遇到肿瘤优先分泌高水平的Th1细胞因子，包括IFN-γ、TNF-α和IL-2，并且发挥强的体外抗肿瘤活性。这里，IFN-γ细胞因子生产水平通常与肿瘤细胞靶表达的FRα的水平相关，并且通过Mov19-ζ CAR和Mov19-BBζ CAR T细胞造成的肿瘤细胞的细胞溶解是有效的——即使以体外3:1的效应子与靶细胞(E/T)比。在所有体外抗肿瘤试验中，表达Mov19-BBζ CAR的工程化T细胞胜过Mov19-ζ CAR T细胞，虽然不总为统计学显著的水平。有趣地，唯一的例外是肿瘤刺激诱导的Th2细胞因子分泌水平，其中Mov19-ζ CAR T细胞造成的FRα衔接诱导更多的IL-4和IL-10产生，这提示结合的CD3ζ和CD137信号传导增强了Th1不对称反应(skewed response)。
第一代和第二代CAR载体之间的不同(dichotomy)在体内研究中最为明显，其中负载CD137的Mov19-BBζ CAR T细胞促进建立的人卵巢癌异种移植模型中大的血管化肿瘤更好退行，而用Mov19-ζ CAR T细胞，肿瘤进展几乎不减弱。16×106个总Mov19-BBζ CAR T细胞的转移消除估计的2.5×108个肿瘤细胞(假设250mm3肿瘤块包含大约2.5×108个细胞)；有效地，大约1:15E/T比。与之前的临床观察一致(Dudley等，2002，Science298:850–4；Robbins等，2008，J Immunol180:6116–31)，肿瘤反应与增强的体内T细胞持久性和Mov19-BBζ CART细胞的肿瘤定位相关，其不被任何具体的理论所束缚，好像部分归因于肿瘤刺激之后Bcl-XL上调的表达。肿瘤退行是抗原-特异性的，因为抗CD19-BBζ T细胞的转移对肿瘤进展没有影响。经全身性或局部T细胞递送，肿瘤退行和T细胞持久性是可获得的，这显示转移的T细胞循环、定位到肿瘤和进行抗肿瘤功能的能力。不被任何具体的理论所束缚，尽管由于施用的容易性，静脉内注入在临床应用中是优选的，并且在模型中是有效的，但本文提供的数据提示T细胞的局部施用可提供最佳的治疗效果，其可能部分由于增加的T细胞运输至肿瘤和提供有利的E/T比。但是，这种递送可能不适用于具有多个肉眼可见转移位点(gross metastatic site)或微转移的肿瘤。
尽管在T细胞注入后3周，外周血中可检测到Mov19-BBζ和抗CD19-BBζ T细胞，但是Mov19-BBζ，而不是抗CD19-BBζ T细胞积聚在FRα+肿瘤损伤中，提示肿瘤中发生负载CAR的T细胞的抗原-选择性保持，并且可能是肿瘤退行部分必须的(Mukai等，1999，Cancer Res59:5245–9)。在之前的研究中，转移的TCR转基因的T细胞在过继性转移之后早期无差别地移动，但是只在抗原-阳性肿瘤中经历抗原依赖性活化，这导致肿瘤破坏(Palmer等，2004，J Immunol173:7209–16)。表达趋化因子受体的CAR T细胞的转移可提高优先迁移至肿瘤位点以促进体内抗肿瘤活性(Craddock等，2010，J Immunother33:780–8)。本文提供的结果支持体内T细胞持久性、定位和肿瘤活性主要是抗原依赖性，很可能是连锁(linked)过程的假设。但是，值得注意地，在试验中使用抗CD19-BBζ T细胞作为特异性对照显示通过CAR提供CD137信号传导通过独立于scFv衔接抗原的机制允许改善的体内T细胞持久性而不是抗肿瘤活性，这提示CD137模块的低水平的组成型活性，这与之前的数据一致(Milone等，2009，Mol Ther17:1453–64)。不被任何具体的理论所束缚，仍可能非特异性CD137-共刺激人T细胞的持久性通过小鼠中异种抗原的低水平TCR识别结合CAR的组成型CD137信号传导驱动，如通过出现移植块抗宿主表现所显示的，其是使用的异种NSG小鼠模型的固有限制。
在更早的临床研究中，通过用双特异性小鼠mAb OC/TR——针对T淋巴细胞上的CD3分子和EOC细胞上的FRα——负荷预活化的T细胞产生用于治疗的重新靶向的T细胞(Canevari等，1988，Int J CancerSuppl2:18–21)。施用FRα-改变的T细胞至具有最小残留卵巢癌的女人，在27%的患者中产生抗肿瘤反应，具有轻微至中等的免疫疗法-相关的毒性；但是，由于不能产生稳定的抗FRα–特异性T细胞记忆和在大约90%的治疗患者中诱导抗双特异性mAb的人抗小鼠抗体，该疗法受到限制(Canevari等，1995，J Natl Cancer Inst87:1463–9)。在针对癌症的抗FRα CAR疗法的I期研究中，Kershaw和同事(Kershaw等，2006，Clin Cancer Res12:6106–15)转移通过第一代基于MOv18scFv的CAR重新靶向FRα的T细胞至具有晚期卵巢癌的免疫活性患者中。亲本MOv18抗体对FRα具有与本CAR构建体中使用的MOv19类似的亲和力(108-109M-1)(Miotti等，1987，Int J Cancer39:297–303；Figini等，1998，Cancer Res58:991–6)，尽管它们在CAR的scFv产物中的相对亲和力是未知的。MOv18和MOv19也结合非交叉反应性表位(Miotti等，1987，Int J Cancer39:297–303)，其可影响它们对达到表面抗原的相对能力。使用MOv18-ζ CAR的疗法是安全的并且可行的；但是，没有患者经历肿瘤反应，其归因于体内研究中在注入之后转移的T-细胞持久性的缺少、差的肿瘤定位和降低CAR T细胞活性的血清抑制因子的发展(Kershaw等，2006，Clin Cancer Res12:6106–15)。本文提供的研究解决了这些问题。与Kershaw和同事的研究(Kershaw等，2006，ClinCancer Res12:6106–15)类似，改变T细胞体外细胞毒性的第一代MOv19-ζ CAR仅仅延迟体内肿瘤进展，并且CAR不长期在体内持续。本文显示可通过为抗FRα CAR T细胞提供CD137共刺激信号引发肿瘤反应和T细胞持久性，其原则上通过使它们的CAR与肿瘤抗原衔接促进。而且，MOv19-BBζ T细胞的转移导致人T细胞在退行的卵巢癌损伤中增加的积聚。尽管在MOv19-BBζ CAR构建中使用的小鼠抗人MOv19 scFv可能在免疫活性受体中引起抗小鼠体液反应，如在过去使用MOv18 scFv的CAR研究和试验中可见(Kershaw等，2006，ClinCancer Res12:6106–15；Canevari等，1995，J Natl Cancer Inst87:1463–9；Lamers等，2011，Blood117:72–82)，但非清髓性(nonmyeloablative)免疫抑制预处理可使宿主内源性免疫性失能，以促进体内小鼠源的表达CAR和TCR的T细胞的持久性，促进肿瘤退行(Kochenderfer等，2010，Blood116:4099–102；Berger等，2001，J Virol75:799–808；Johnson等，2009，Blood114:535–46)。免疫缺陷NSG小鼠模型T细胞转移在宿主淋巴清除(lymphodepletion)情形下中的使用，虽然缺少人衍生物和内源性免疫重构。基于本文呈现的结果，用于下一代CAR-改变的疗法的全人抗FRα scFv候选物的使用是值得研究的(Figini等，1998，Cancer Res58:991–6；Figini等，2009，Cancer Immunol Immunother58:531–46)。本文呈现的结果支持下述想法：FRα-特异性CAR中并入CD137信号传导结构域通过改善转移的T细胞在体内的持久性，从而增加它们在肿瘤中的保持力并且支持抗肿瘤效力，克服了过去CAR方法的限制。当靶向具有保持介导严重不良事件可能性的CAR或外源TCR的自体/肿瘤抗原时，必须小心考虑(Johnson等，2009，Blood114:535–46；Morgan等，2010，Mol Ther18:843–51)；但是，在正常组织上存在的FRα主要定位于极化上皮细胞的顶表面，在那里可能难以获取肠胃外施用的叶酸缀合物和改变的T细胞(Low等，2004，Adv Drug Deliv Rev56:1055–8)。
实施例20：中试阶段I剂量升级研究，以建立在具有复发的卵巢 癌患者中自体叶酸受体(α-FR)-α改变的T细胞静脉内施用的安全性和 证据的概念。
开发用于癌疗法的CAR T细胞的最大问题是鉴定增强注入后细胞持久性的载体设计，并且使CAR T细胞至肿瘤位点的运输最优化。该研究设计检验载体设计的改变与之前卵巢癌的研究相比改善CAR T细胞存活率的假设(Hwu等，2006，Clinical Cancer Research，12(20):6106-6115)。本文描述的是I期研究，以确定在具有卵巢癌、接收抗α-FR CAR T细胞的对象中施用抗α-FR嵌合抗原受体(CAR)转导的(CAR)T细胞的安全性、耐受性和可行性。方案计划显示在图28中。开始筛选对象并且确定他们的资格。满足所有资格标准的那些对象在筛选的4-6周内进行单采血液成分术，以获得外周血单核细胞(PBMC)，用于CAR T细胞制造。从PBMC纯化T细胞，用扩展的抗α-FR scFv体外转导，并且接着冷冻，用于进一步的施用。
试验药和剂量
研究药物是已经被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)由具有对α-FR特异性的细胞外单链抗体(scFv)和细胞内TCRz链和4---1BB信号传导结构域组成。开发CAR构建体，并且已经制造携带MOv19---BBζ CAR的临床级pELNS慢病毒载体。CAR T细胞冷藏在可注入的冷藏培养基中，并且以1袋或2袋施用。每袋包含冷藏培养基的等分试样(体积依赖于剂量)，所述冷藏培养基包含下列可注入级别试剂(%v/v):每袋31.25勃脉力(plasmalyte)‐A、31.25右旋糖(5%)、0.45NaCl、多达7.50DMSO、1.00葡聚糖40、5.00人血清白蛋白和适当数量的自体T细胞。
检测3个T细胞剂量水平，以预期的～3×107CAR+T细胞/m2的“最小预期的生物学作用水平”(MABEL)剂量开始，以达到预期的～3×108CAR+T细胞/m2的“没有观察到的不良作用水平”(NOAEL)剂量。对于另外的安全性，随后“分次剂量”方法给药3天，使用在第0天总期望的10%、在第1天30%和在第2天60%，通过静脉内注入，施用CAR‐转导T细胞。
使用“分次剂量”方案在第0、1和2天通过快速静脉内注入，患者静脉内接收单剂量的CAR T细胞。化疗之后，注入按计划进行2天。
人群1 3×107个CAR T细胞/m2(最小接受的剂量2.5×107个和最大接受的剂量3.5×107个)
人群2 1×108个CAR T细胞/m2(最小接受的剂量8×107个和最大接受的剂量1.2×108个)
人群3 3×108个CAR T细胞/m2(最小接受的剂量2.6×108个和最大接受的剂量3.4×108个)
制备
在生产机构中制备CAR T细胞，并且不从生产机构释放，直到满足注入细胞的释放标准(例如，细胞纯度、无菌度、载体的平均拷贝数/细胞等)。一旦释放，细胞送至临床。包含CAR‐转导T细胞的袋(50至100ml容量)在血库条件下存储在宾夕法尼亚大学监测的-150℃冷冻器中。注入袋存储在冷冻器中直到需要。
细胞解冻
转导的T细胞在干冰上从生产机构运送至临床的干细胞装置，在那里释放产物。转导的T细胞通过研究护士/协调人员转运至临床的患者床边。在临床隔离室中进行注入。在使用保持在36℃至38℃的水浴时，细胞在床边解冻一袋。该袋被温和地按摩，直到细胞刚好解冻。应当确保不应有冷冻块留在容器内。如果CAR T细胞产物显示具有损坏或渗漏袋，或以其他方式显示被损害，不能注入，并且返回生产机构。
研究药物的返回或破坏
由于各种原因，CAR T细胞可能需要返回生产机构，包括但不限于：1)错贴标签的产物；2)患者禁止注入/注射的情况，和3)对象拒绝注入/注射；任何未用的产物返回生产机构进行处理。
术前用药法(premedication)
T细胞注入后的副作用可包括短暂的发热、冷颤、疲劳和/或恶心。推荐对象在注入CAR T细胞前，通过口服对乙酰氨基酚650mg和口服或IV盐酸苯海拉明25-50mg进行预用药。这些药物处理在需要时可每六个小时进行重复。如果该患者持续发热，没有由对乙酰氨基酚缓解，则可采用非甾类的抗炎性药物的疗程。推荐患者在任何时间都不接受全身性皮质类固醇类诸如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙(甲强龙制剂(Solu-Medrol))或地塞米松(地卡特隆(Decadron))，除了在威胁生命的紧急情况下，因为这可对T细胞产生反作用。如果需要皮质类固醇类进行急性注入反应，则推荐100mg最初剂量的氢化可的松。
研究药物的施用
解冻后在大约10‐40分钟内注入细胞。转导的T细胞以大约10ml至20ml每分钟的流速通过快速静脉内注入经具有三通旋塞的18-规格的不含乳胶的Y-型输血器连续3天施用。通过重力注入进行给药。如果通过重力的注入速度太慢，则转导的T细胞药物产物经旋塞吸入50mL注射器，并且以需要的速度手工注入。注入的持续时间是大约15分钟。一袋或两袋CAR T细胞在干冰上递送至床边，和该细胞在还是冷的时被施用给对象。每个注入袋粘贴包含下列的标签：“仅自体使用”。另外，该标签具有至少两个独特的标示符，比如对象的首字母、出生日期和研究编号。在注入之前，两个个体在对象存在的情况下独立地确认所有这些信息，并且因此确认该信息与参与者正确匹配。
注入期间，紧急医学设备(即，救护车)是可用的，以防对象具有变态反应或严重的低血压危险或对注入的任何其他反应。在注入之前和之后，测量生命体征(温度、呼吸率、脉搏和血压)，然后每15分钟，持续至少2小时并且直到这些体征令人满意且稳定。告知对象不要离开，直到医师考虑这样做对他/她是安全的时。
用转导的T细胞完成给药后的15分钟(±5分钟)内，获得血液样品，用于转导T细胞数量的基线确定。
筛选和基线评估：
在检测开始之前患者签署知情同意书。在单采血液成分术的4‐6周内完成筛选程序，并且包括：
·包括/排除标准的检查
·确认ECOG性能状态<2
·肿瘤负荷评估：按照标准护理进行，以包括CT扫描胸腔、腹部和骨盆。如果在访问前4周内完成，则不必重复
·物理检查(包括生命体征、身高和体重、医学和药物史)
·伴随药物治疗的检查
·血液学：全血细胞计数(CBC)、分类(differential)、血小板、凝血酶原时间(PT)和部分凝血激酶时间(PTT)
·血清化学：BUN、肌酸酐、电解质和葡萄糖；钙、镁、磷酸盐、SGOT、SGPT、碱性磷酸酶、LDH、总胆红素、尿酸、总蛋白和白蛋白
·病毒学(筛查)：HIV‐1,2、HTLV‐1/2、乙型肝炎(HbsAg、α‐HBc)、丙型肝炎(αHCV)。
·血清CA‐125
·尿分析
·EKG(多达6周，可在机构外面进行)
·VSV‐G抗体应答和人抗‐鼠抗体(HAMA)。
·CT/MRI(多达6周，可在机构外面进行)
·研究血液抽取
单采血液成分术
在单采血液成分术中心进行～10‐15升单采血液成分术程序。在该程序期间，为CAR T细胞获得PBMC。从单个白细胞提取法，打算收获至少50×109个白细胞，以制造CAR T细胞。也获得用于FDA回顾要求和用于研究的基线血液白细胞并且冷藏。不被任何具体的理论所束缚，预期大约4周后细胞产物准备好释放。如果未达到靶数量的T细胞，则在该研究过程期间可提供重复的单采血液成分术。
瞬时淋巴清除方法(第‐5至第‐3天)
在第-5天至第-3天，通过静脉内环磷酰胺(300mg/m2/d，持续3天)和静脉内氟达拉滨(30mg/m2/d，持续3天)，对象接收单个疗程的门诊患者条件性淋巴清除化疗。这是良好耐受的门诊患者方法。根据治疗医师的判断，允许剂量减少至环磷酰胺250mg/m2/d和氟达拉滨25mg/m2/d。
下列包括第‐5天至第‐3天的疗程：
对象用650mg对乙酰氨基酚(泰诺，Tylenol)预用药，并且用具有10meq/1KCL的0.9%氯化钠以2.6ml/kg/hr水合(水合根据研究者的判断进行)。
对象每天在1小时内接收环磷酰胺持续3天，300mg/m2/天IV，以250ml D5W。最大剂量不超过基于大于最大理想体重的140%的体重计算的剂量。
对象每天接收氟达拉滨3天，30mg/m2/天IVPB，每天15‐30分钟内。最大剂量不超过基于大于最大理想体重的140%的体重计算的剂量(Metropolitan Life Insurance Company)。在环磷酰胺之后大约1‐2小时，开始氟达拉滨。
作为预防，向对象施用抗生素、抗真菌剂和抗病毒剂：典型的预防剂量是：Altrex500mg每天，菌特灵(Bactrium)DS一片qMWF和氟康唑(Fluconazole)200mg每天。持续药物治疗直到绝对淋巴细胞计数(ALC)和绝对是嗜中性粒细胞计数(ANC)计数回到预药物治疗基线。
鼓励患者在化疗之前、期间和之后当天进食流体2‐3升/天。按临床指示给予造血生长因子。
用于第一个治疗循环(第0、1和2天)的CAR T细胞使用
对象在隔离室中接收注入。如本文其他地方描述的，在患者床边解冻细胞。以可耐受地尽快的注入速度给予解冻的细胞，从而每个注入的持续时间是大约10-15分钟。为了促进混合，使用Y型-适配器同时施用细胞。在注入之前和注入后20分钟获得血液样品，用于确定基线CAR T细胞水平。如本文其他地方描述的，对象注入和预用药。注入后观察对象至少2小时，每15分钟监测生命体征(温度、呼吸率、脉搏和血压)，持续至少2小时，并且直到这些体征令人满意且稳定。在T细胞注入之前和之后15分钟以及其后每15分钟，脉搏血氧定量确定血氧用作肺部评估的手段，直到完成观察周期。
对象评估
在T细胞注入之前第0、1和2天对象已经完成下述：
·ECOG性能状态
·物理检查(包括生命体征、体重、ConMed和不良事件评估)。
·血液学：CBC、分化和血小板、凝血酶原时间(PT)和部分凝血激酶时间(PTT)。
·血清化学：BUN、肌酸酐、电解质、葡萄糖、钙、SGOT、SGPT、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白。
·尿分析：随机尿蛋白质，随机尿肌酸酐以测量尿蛋白质:肌酸酐(UPC)比。在对象中确定24-小时尿蛋白质，在UTI存在的情况下，蛋白尿大于+1。
·血清CA-125
·血清HAMA和VSV-G水平
·研究血液抽取
在T细胞注入后的第7、14、25和39天已经完成下述：
·ECOG性能状态
·物理检查(包括生命体征、体重、ConMed和不良事件评估)。
·血液学：CBC、分类和血小板、凝血酶原时间(PT)和部分凝血激酶时间(PTT)。
·血清化学：BUN、肌酸酐、电解质、葡萄糖、钙、SGOT、SGPT、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白。
·尿分析：随机尿蛋白质，随机尿肌酸酐，以测量尿蛋白质:肌酸酐(UPC)比。对象中确定24-小时尿蛋白质，在UTI存在的情况下，蛋白尿大于+1。
·EKG
·血清HAMA和VSV-G水平
·研究血液抽取
在大约39天对象经历CT引导的肿瘤活组织检查。
注入前和注入后实验室以评估安全性和移植物植入
要求对象经历～100ml静脉切开放血术(2个红色顶部和3个绿色顶部)以评估CAR T细胞的存在和安全性，并且用于在第一治疗循环的下列时间点收集免疫数据：第‐5天(淋巴清除之前)，第0天(T细胞注入之前)，每个T细胞注入之后15分钟和2小时，接着每天直到第7天，然后在第9、11、14、18、25天再次收集，然后每2周一次直到EOS。
在EOS(第58天)，收集另外～200ml静脉切开放血术(5个绿色顶部和3个红色顶部)。所有的对象经历～6ml静脉切开放血术：在化疗注入之前环磷酰胺化疗的第1和第3天；和T细胞注入之前；其后每周两次直到ANC和ALC达到预治疗基线或分别1500和1000，研究期间每月记录血清CA‐125水平，但是不包括在临床决定中。
研究结束评估(EOS，第～58天)
在第～58天如下完成特定监测测试和程序：
·ECOG性能状态
·物理检查(包括生命体征、体重、ConMed和不良事件评估)。
·血液学：CBC、分类和血小板、凝血酶原时间(PT)和部分凝血激酶时间(PTT)。
·血清化学：BUN、肌酸酐、电解质、葡萄糖、钙、SGOT、SGPT、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白、LDH、镁、磷酸盐、尿酸。
·血清CA-125
·肿瘤负荷评估：CT/MRI扫描胸腔、腹部和骨盆
·EKG
·对象具有～200ml静脉切开放血术，用于免疫监测(5个绿色顶部和2个红色顶部).C
·CT/MRI
第58天(研究结束(EOS))，对象已经完成第一治疗循环，并且已经经历免疫和临床评估(如通过免疫-相关的反应标准测量的)。一旦疾病进展，实现免疫相关的完全缓解(ir-CR)的对象具有接收另一循环的选择权。在淋巴清除之后，经历ir-部分缓解(ir-PR)、ir-稳定的疾病(ir-SD)或ir-疾病进展(ir-PD)的那些具有接收另一治疗循环的选择权。只有如果满足所有的安全性参数并且继续下一循环是安全的对象才接收大于一个的循环。对象也必须具有可获得的基因工程化的T细胞。
初级端点
研究的初级端点包括：
·安全性：监测从研究治疗第一天直到EOS任何时间，与研究治疗“可能地”、“有希望地”或“明确地”相关的研究相关的不良事件的发生(定义为≥3级体征/症状、实验室毒性和临床事件，之前记录的一些例外)。
·可行性：可行性定义为不满足载体转导效率的释放标准的制造产物的数量。测定T细胞纯度、生存力和无菌度(定义为“制造失败”)。
二级端点
研究的主要二级端点包括：
·CAR T细胞的持久性和移植物植入：通过DNA PCR评估给药后CAR T细胞的移植物植入在PBMC中的载体拷贝数。通过在每个T细胞注入后～15分钟，2小时，然后每天，直到第7天，接着在第9、11、14、18、25天，然后每两周一次，直到研究结束进行RT-PCR测量抗α-叶酸受体CAR T细胞在血液中的数量。通过比较用于安全性曲线(safety profile)的剂量水平和在循环和肿瘤活组织检查中CAR T细胞的移植物植入，限定最佳的生物学剂量(OBD)；OBD在第28天具有最高的移植物植入，具有可接受的毒性曲线。
·临床效能：确定用环磷酰胺/氟达拉滨的淋巴清除后用CAR T细胞治疗的患者的免疫相关的应答、无进展存活的分布、总存活率和进展的时间。
·使用研究实验室试验，确定CAR T细胞对肿瘤免疫性和α-叶酸受体表达的作用。
·CAR+T细胞的持久性、移植物植入、表型和功能：使用PE缀合的山羊抗小鼠IgG F(ab')2(Jackson Immuno Research)，通过流式细胞术，容易确定FRα CAR+T细胞。给药后～15分钟、24小时、48小时、72小时、第7天、第14天、第21天和第28天以及在第6周、第8周、第12周、第16周和每6个月纵向量化外周血中的CAR+T细胞。另外，通过DNA定量(q)PCR检测CAR+T细胞在PBMC中的载体拷贝数，其是用于CAR+T细胞持久性测试的能够获得的(acquisitively)灵敏的方法。CAR+T细胞的表型分析包括对记忆细胞(CCR7、CD62L、CD45RA、CD27、CD28、Fas等)对效应子细胞标记(CD45R0、CCR6、CD25、CD38、HLADR、GITR、PD1等)的详细问询(interrogation)。CAR+T细胞也针对IL-7受体CD127和IL-15受体α表达进行表型分析。用PHA-离子霉素或关联抗原离体刺激，随后细胞内细胞因子(INFγ、TNFα、IL-2、IL-17、IL-4、TGFβ、IL-10)、粒酶、CD137和CD107a的问询，提供转移后体内极化和功能的详细的和纵向的表征。通过DNAqPCR量化肿瘤活组织检查中的CAR+T细胞的存在，并且与在基线和研究结束的FRα蛋白质表达相关联。
·CAR免疫原性：通过HAMA和VSV-G ELISA评估宿主对CART细胞的免疫应答的发展，并且与CAR+T细胞的移植物植入相关联。
·CAR+T细胞对肿瘤微环境的影响：通过免疫组织化学进行详细的白细胞子集渗透分析，并且通过多重qPCR和/或Affymetrix试验进行全面的肿瘤微环境免疫分析。
·剂量最优化：通过比较用于安全性曲线的剂量水平以及循环和肿瘤活组织检查中CAR+T细胞的移植物植入，限定OBD；OBD在第28天具有最高的移植物植入，具有可接受的毒性曲线。
血清中修饰的T-细胞的数量、HAMA水平、对抗α-叶酸受体的宿主免疫性和免疫功能的血清ELISPOT测量、以及VSV-G抗体应答作为时间的函数图形显示。对接收组织活体检查的那些患者，计算有和没有肿瘤内抗α-叶酸转导细胞的肿瘤之间的α-叶酸受体表达的平均水平。计算比例和平局数的95%置信区间。
使用Luminex并且评估一组具有通过治疗而被调节的可能性的细胞因子/炎性趋化因子/免疫因子，进行细胞因子测量。该组由所有下列因子或其子集组成：IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40/p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF。对在第-5天(淋巴清除之前)、第0天(T细胞注入之前)、每次T细胞注入后15分钟和2小时，然后每天直到第7天，然后再次在第9、11、14、18、25天，接着每2周一次直到EOS收集的血清样品进行这些测量。这有助于确定第一3个人群中IL-7的曲线，并且帮助更好地确定在将来人群中rhIL‐7的施用安排。
临床效能
作为二级试验端点报告了抗肿瘤活性。该试验的目的是在CAR T细胞的临床发展中早期确定使用IV施用途径的这些细胞的持久性和移植物植入。在该研究中，使用新的免疫-相关的应答标准，评估应答和进展。
使用irRC定义肿瘤反应
在使用免疫-相关的应答标准(irRC)对进行性疾病的肿瘤评估下，多个直径的产物的和并入新的可测量损伤的贡献。使用irRC标准的每个评估中的肿瘤负荷的每个净百分数变化说明旧的和新的损伤二者随它们出现的尺寸和生长动力学(Wolchok等，2009，Clinical CancerResearch，15(23):7412-7420；Hoos等，2010，Journal of the NationalCancer Institute，102(18):1388-1397；Hodi，2010，New England Journalof Medicine，363(13):1290)。
使用irRC定义索引损伤响应(Index Lesions Response)
·ir完全缓解(irCR)：所有索引损伤完全消失。
·ir部分缓解(irPR)：相对于基线，所有索引损伤和所有新的可测量损伤的两个最大垂直直径的产物的和减少50%或更大(即，肿瘤负荷的变化百分数)。注意：新的可测量损伤的外观包括在总体肿瘤负荷中，但不自动量化为进行性疾病，直到当与最低点的SPD比较时SPD增加≥25%。
·ir稳定的疾病(irSD)：在没有进行性疾病的情况下，不符合irCR或irPR的标准。
·ir进行性疾病(irPD)：与最低点的SPD比较时，肿瘤负荷的变化百分数增加至少25%(即，考虑所有索引损伤和任何新损伤的产物的和)。
使用irRC的非索引损伤响应的定义
·ir完全缓解(irCR)：所有非索引损伤完全消失。
·ir部分缓解(irPR)或ir稳定的疾病(irSD)：非索引损伤(一个或多个)不在PR的定义中考虑，这些术语不适用。
·ir进行性疾病(irPD)：非索引损伤(一个或多个)的数量或尺寸的增加不构成进行性疾病，除非/直到肿瘤负荷的变化百分数增加25%(即，索引损伤最低点的DPD增加需要的量)。
新的损伤对irRC的影响
新的损伤本身和独自不量化为进行性疾病。但是，它们对总肿瘤负荷的贡献包括在SPD中，其又进入肿瘤反应的irRC标准。因此，新的不可测量的损伤不终止来自该研究的任何对象。
使用irRC定义总体应答
使用irRC总体应答基于这些标准：
·免疫-相关的完全缓解(irCR)：从记录完全缓解的日期持续至少4周，所有肿瘤损伤完全消失(索引和非索引一起，没有新的可测量/不可测量的损伤)。
·免疫-相关的部分缓解(irPR)：测量所有索引损伤的两个最大垂直直径的产物的和，并且捕获为SPD基线。在每个随后的肿瘤评估中，所有索引损伤和新的可测量损伤的两个最大垂直直径的产物的和加在一起，以提供产物直径的免疫应答和(irSPD)。相对于irSPD的基线与之前的SPD基线相比，50%或更大的减少被认为是免疫部分缓解(irPR)。
·免疫-相关的稳定的疾病(irSD)：irSD定义为在没有进行性疾病的情况下，不能满足免疫完全缓解或免疫部分缓解的标准。
·免疫-相关的进行性疾病(irPD)：推荐在困难的情况下，通过系列成像确认PD。下列任何一种构成进行性疾病：
o相对于为索引损伤计算的基线SPD，所有索引损伤的产物的和至少25%的增加。
o相对于为索引损伤计算的基线SPD，所有索引损伤和新的可测量损伤的产物的和(irSPD)至少25%的增加。
注入后每年评估1至15年
研究结束时，按照ASGT和FDA提出的近来的长期跟踪(LTFU)指南长期跟踪患者达15年。LTFU需要注入后第一个5年中6个月的随访，并且接着如果血液中不再检测到载体修饰的细胞，则一年一次随访。随访涉及血液抽取和物理检查。
撤回对象的数据收集和跟踪
根据FDA指南，细胞疗法临床试验之后，对接收研究药物的对象跟踪数据收集达15年。只要患者具有可检测的scFv嵌合受体转导的细胞，则跟踪它们的毒性、免疫反应和任何长期不良事件。许多对细胞疗法应答的患者也可具有延长的DFS，但是也处在稍后复发的危险中。目的是不定跟踪所有用CAR T细胞治疗的患者至少直到他们的疾病需要可选治疗时，和/或他们不再处于来自注入细胞毒性的风险下(即移植物植入的失去)。因此，对于下列持续收集数据：1)移植物植入，只要患者有风险(直到证明可检测的转导T细胞失去)；2)DFS，直到有疾病进展；3)存活，直到死亡时或4)直到患者取消同意临床数据收集。
由于偏好或地理考虑，在其他机构或实践中跟随的患者已经经来自当地医师的记录和/或周期性研究评估的电话采访跟踪。一个例子是涉及来自国外但是在另一中心护理的患者。从治疗医师获得毒性和其他临床评估。尽所有努力联系好像失去跟踪的对象，以便至少获得存活数据。在对象不能完成跟踪要求的情况下，所有尝试联系对象的文档包括至少3电话联系(不同日和一天的不同时间)和挂号信。如果1)在跟踪6月之后有证据缺少应答、复发或进行性疾病或2)在它们的疾病需要新的治疗的任何时间(即常规的化疗)对象取消DFS评估。在死亡时，取消对象存活评估。
实施例21：人源化的抗FR CAR识别并且应答表达FR的癌细胞 系。
构建包括人源化的C4scFV的全人抗FR CAR。转导初级人T细胞以表达人源化的抗FR CAR，并且人源化的抗FR CAR有效地在转导的T细胞表面上表达(图29)。转导的和未转导的T细胞与卵巢或乳腺癌细胞共同培养过夜。人源化的抗FR CAR转导的T细胞体外识别表达FR的细胞系，因为当与表达FR的细胞系共同培养时转导的，而不是未转导的T细胞分泌IFN-γ。表达很少或不表达FR的细胞系(A2780和C30)不被转导的T细胞识别(图29)。
本文引用的每一和每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此都通过引用全文并入。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但显而易见的是可由本领域技术人员设计本发明的其他实施方式和变形，而不脱离本发明的真实精神和范围。权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。
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Claims (41)

1.编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括α-叶酸受体(FRα)结合结构域的核酸序列和4-1BB(CD137)共刺激结构域的核酸序列。
2.权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包括CD3ζ信号传导结构域的核酸序列。
3.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中CAR包括SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的分离的核酸序列，包括SEQ ID NO:1或SEQID NO:20的核酸序列。
5.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRα结合结构域是抗体或其FRα-结合片段。
6.权利要求5所述的分离的核酸序列，其中所述FRα-结合片段是Fab或scFv。
7.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRα结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原是FRα。
8.权利要求7所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与上皮恶性肿瘤相关联。
9.权利要求7所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关联。
10.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRα结合结构域包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
11.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述FRα结合结构域由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21的核酸序列编码。
12.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述4-1BB共刺激结构域包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
13.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述4-1BB共刺激结构域由SEQ ID NO:6的核酸序列编码。
14.权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述CD3ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
15.权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述CD3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。
16.权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包括跨膜结构域的核酸序列。
17.分离的嵌合抗原受体(CAR)，其包括FRα结合结构域和4-1BB共刺激结构域。
18.权利要求17所述的分离的CAR，进一步包括CD3ζ信号传导结构域。
19.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述CAR包括SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
20.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述FRα结合结构域是抗体或其FRα-结合片段。
21.权利要求20所述的分离的CAR，其中所述FRα-结合片段是Fab或scFv。
22.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述FRα结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原是FRα。
23.权利要求22所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原与上皮恶性肿瘤相关联。
24.权利要求22所述的分离的CAR，其中所述肿瘤抗原是与实体瘤相关联。
25.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述FRα结合结构域包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
26.权利要求17所述的分离的CAR，其中所述4-1BB共刺激结构域包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
27.权利要求18所述的分离的CAR，其中所述CD3ζ信号传导结构域包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
28.权利要求17所述的分离的CAR，进一步包括跨膜结构域。
29.基因修饰的T细胞，包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列。
30.载体，包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列。
31.用于在对象中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而在所述对象中提供抗肿瘤免疫性。
32.权利要求31所述的方法，其中所述分离的核酸序列进一步包括CD3ζ信号传导结构域的核酸序列。
33.权利要求31所述的方法，其中所述共刺激结构域的存在提高T细胞存活率。
34.权利要求31所述的方法，其中所述共刺激结构域的存在增加所述对象中的抗肿瘤免疫性的效能。
35.权利要求31所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
36.权利要求31所述的方法，其中所述对象是人。
37.用于在对象中刺激对细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而刺激所述对象中T细胞介导的免疫应答。
38.治疗对象中卵巢癌的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗所述对象中的卵巢癌。
39.治疗对象中癌症的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，从而治疗所述对象中的癌症。
40.在诊断具有卵巢癌的对象中产生持续的基因工程化T细胞群的方法，所述方法包括：向所述对象施用有效量的基因修饰的T细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述分离的核酸序列包括FRα结合结构域的核酸序列和4-1BB共刺激结构域的核酸序列，其中所述持续的基因工程化T细胞群在施用后在所述对象中持续至少一个月。
41.权利要求40所述的方法，其中所述持续的基因工程化T细胞群在施用后在人中持续至少3个月。
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