KR20220034792A - TGF-β 수용체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20220034792A
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카이트 파마 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 사이토카인 신호전달에 관여하는 조작된 수용체가 제공된다. 또한, 본원에는 TGF-β 신호전달 조절을 위한 조작된 수용체, 및 TGF-β 신호전달을 조절하고 키메라 항원 수용체를 사용하여 암을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

TGF-β 수용체 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 21일자 출원된 미국 임시특허출원 제62/865,063호 및 2019년 12월 20일자 출원된 미국 임시특허출원 제62/951,217호를 우선권 주장하며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열목록은 서류 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로서 인용된다. 서열목록이 포함된 텍스트 파일의 명칭은 "K1075_ST25"이다. 상기 텍스트 파일은 109 KB이며, 2020년 6월 17일자 생성되었고, 본 명세서와 동시에 EFS-Web을 통해 전자문서로 제출된다.
기술분야
본 개시내용은 TGF-β 신호전달에 관여하는 조작된 수용체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 TGF-β 신호전달 조절을 위한 조작된 TGF-β 수용체, 및 TGF-β 신호전달, 사이토카인 신호전달을 조절하고 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
형질전환 성장인자 β(TGF-β)는 이펙터(effector) T세포의 기능 및 확장 둘 모두를 제한하는 다수의 세포 유형에 의해 분비되는 다면발현성(pleotropic) 면역억제 분자이다. 임상 및 전임상 데이터에 따르면, 종양세포, 간질세포, 및 조절 T세포를 포함하는 억제 면역 서브세트가 TGF-β를 분비하는 것으로 나타났으며, 다수의 그룹은, TGF-β가 종양 미세환경(TME)에서 이펙터 T세포의 기능 및 증식을 저해한다고 보고하였다(문헌[Thomas et al., Cancer Cell, 8(5):369-380 (2005)], 문헌[Yang et al., Trends in Immunology, 31(6) (2010)] 및 문헌[Pickup et al., Nat Rev Cancer, 13(11), 788-799 (2013)]).
TGF-β 신호전달 경로는 2개의 이량체성 막관통 형질전환 성장인자-β 단백질 수용체, 즉, TGF-β 수용체 유형 I(TGF-βRI) 및 TGF-β 수용체 유형 II(TGF-βRII)(총칭하여 "TGF-β 수용체")의 내인성 발현으로 시작된다. T세포에서, TGF-βRII는 구성적으로 인산화된다. TGF-β 리간드 결합 시, TGF-βRI 및 TGF-βRII 각각 2개의 분자는 이종사량체 수용체 복합체를 형성하여, TGF-βRI 단백질의 아미노산(aa) 185번 내지 205번 사이의 4개의 핵심 트레오닌 부위에서 TGF-βRI의 TGF-βRII 인산기전이반응(trans-phosphorylation)을 유도한다(문헌[Heldin et al., Cold Spring Harb Perspect Biol. Aug 1:8(8) (2016)]). 이어서, 인산화된 TGF-βRI은 수용체 조절 신호전달 단백질 세트인 SMAD2와 SMAD3의 인산화를 개시한다. pSMAD2와 pSMAD3은 pSMAD4와 함께 이종삼량체성 올리고머를 형성한다.이어서, 생성된 활성화된 SMAD 복합체는 핵으로 들어가 표적 전사인자 결합 부위에 도킹하여, 면역억제를 지원하는 표적 유전자의 발현을 유도한다(문헌[Inman et al., Mol Cell, 10(2):283-294 (2002)]).
일부 연구는 이펙터 T세포 기능에 대한 TGF-β의 면역억제 효과를 제한하고자 시도하였다. 여기에는 TGF-β 결합 및 TGF-β 신호전달 경로의 소분자 및 항체 기반 저해제의 사용이 포함된다(문헌[Fabregat et al., Current Pharmaceutical Design, 20, 1-14 (2014)]). 또한, 변형된 TGF-β 수용체 분자를 갖는 T세포 수용체(TCR) 구조체가 사용되었다. 하나의 예는 TGF-βRII의 절단된 형태로, 이는 유형 II 수용체의 세포내 부분이 제거되어, 다운스트림 신호전달 사건을 방지하고, 이에 의해 조작된 T세포에서 TGF-β 신호전달 경로의 우성 음성(dominant-negative) 저해제로서 작용한다(문헌[Wieser et al., Molecular and Cellular Biology 13(12): 7239-7247 (1993)] 및 문헌[Bollard et al., Blood. 99(9):3179-3187 (2002)]). 그럼에도 불구하고, 오로지 TGF-β 저해에만 기반한 효과적인 치료법은 존재하지 않으며, 몇 가지 전신 요법은 용량제한 독성이 있다. 따라서, TGF-β를 저해하는 새로운 방식의 개발이 필요하다.
본 개시내용의 하나의 구현예는 TGF-β 수용체로부터의 세포외 도메인(ECD)과 막관통 도메인(TMD)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 야생형 TGF-β 수용체에 존재하는 신호전달과 인산화를 담당하는 아미노산 잔기가 결여되어 있는 재조합 폴리펩타이드이다.
하나의 양태에서, ECD는 TGF-βRI 또는 TGF-βRII에서 선택된다. 또 다른 양태에서, TMD는 TGF-βRI, TGF-βRII, PDGFR, CD4, CD8, CD28, CD127, CD132, CD3ζ, 4-IBB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, IL-5, IL-7, IL-7Rα, BTLA, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 돌연변이체에서 선택된다. 또 다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 야생형 TGF-β 수용체에 존재하는 신호전달과 인산화를 담당하는 아미노산 잔기가 결여되어 있는 이종 세포내 도메인(ICD)을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 신호 서열을 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, ECD는 서열번호 15와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, TMD는 서열번호 16과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, ICD는 서열번호 6과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 TGF-β1에 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다. 또 다른 양태에서, 상기 발현 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, CAR은 CD19, PSMA 또는 GPC3을 포함하는 종양 항원에 결합한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 발현 벡터로 형질도입된 T세포이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 T세포의 치료적 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이다.
본 개시내용의 또 다른 구현예는, 서열번호 51의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 재조합 뉴클레오타이드이다. 하나의 양태에서, 상기 재조합 핵산은 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 재조합 핵산 서열은 서열번호 47의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
또 다른 양태에서, CAR은 GPC3을 포함하는 종양 항원에 결합한다. 본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 발현 벡터로 형질도입된 T세포이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 T세포의 치료적 유효량을 간암의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 간암을 치료하는 방법이다.
도 1: 장기적 효능과 종양 성장 지연은 초기 부피의 4배로 설정된 종양 부피 종점까지 생존을 향한 진행에 의해 결정되었다.
본 개시내용은 TGF-β 신호전달 조절을 위한 조작된 수용체 및 TGF-β 신호전달을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 개시내용은 TGF-β 활성을 조절하는 데 유용할 수 있는 우성 음성 저해제로 기능할 수 있는 조작된 수용체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 TGF-β 활성을 저해하기 위한, TGF-β 유형 I(TGF-βRI) 또는 TGF-β 유형 II(TGF-βRII)를 포함하는 우성 음성 TGF-β 수용체에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 개시내용은 T세포 면역요법에서와 같이 질환 또는 장애를 치료하기 위한 우성 음성 TGF-β 수용체의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 TME에서 T세포 기능을 증강시킬 수 있는 사이토카인 신호전달을 자극하기 위한 우성 음성 TGF-β 수용체의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 다른 면역요법과 조합된 우성 음성 TGF-β 수용체의 용도에 관한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 문헌이 우선하게 된다. 방법 및 재료가 하기에 기재되지만, 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 예들은 단지 예시적으로, 제한하고자 하는 것이 아니다.
단수 형태의 표현은 해당 표현의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 나타낸다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 "약" 또는 "대략"이라는 용어는, 기준 양, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 만큼 변하는 양, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 나타낸다. 일부 구현예에서, 수치 앞에 오는 경우 "약" 또는 "대략"이라는 용어는, 15%, 10%, 5% 또는 1%의 범위를 더하거나 뺀 값을 나타낸다.
"활성화된" 및 "활성화"라는 용어는, 검출 가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T세포의 상태를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산 및 검출 가능한 이펙터 기능과 관련이 있을 수 있다. "활성화된 T세포"라는 용어는, 특히, 증식하고 있는 T세포를 나타낸다. TCR만을 통해 생성된 신호는 T세포의 완전한 활성화에 충분하지 않을 수 있으며, 하나 이상의 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요할 수 있다. 따라서, T세포 활성화는 TCR/CD3 복합체를 통한 1차 자극 신호와 하나 이상의 2차 공동자극 신호를 포함한다. 공동자극은 TCR/CD3 복합체를 통한 자극과 같은 1차 활성화 신호를 받은 T세포에 의한 증식 및/또는 사이토카인 생산에 의해 입증될 수 있다.
"투여하는"은, 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상에게 작용제를 물리적으로 도입하는 것을 나타낸다. 본원에 개시된 제형에 대한 예시적인 투여 경로에는, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입이 포함된다. "비경구 투여"라는 구절은 통상적으로 주사에 의한, 장관내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 이에는, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 임파선내, 병변내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입뿐 아니라, 생체내 전기천공이 포함된다. 일부 구현예에서, 투여는 비(非)비경구 경로, 예를 들어 경구를 통해 이루어진다. 다른 비비경구 경로에는, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질내, 직장, 설하 또는 국소가 포함된다. 투여는 또한, 예를 들어 한 번, 여러 번 및/또는 한 번 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
"양"이라는 용어는, 유익하거나 목적하는 예방 또는 치료 결과(임상 결과 포함)를 달성하기 위한, 유전적으로 변형된 치료용 세포, 예를 들어 T세포와 같은 작용제의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"을 나타낸다. 유전적으로 변형된 치료용 세포의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 T세포의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 치료적으로 유익한 효과가 바이러스 또는 형질도입된 치료용 세포의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이다. "치료적 유효량"이라는 용어는, 대상(예를 들어, 환자)을 "치료"하는 데 효과적인 양을 포함한다. 치료량이 제시되는 경우, 투여하고자 하는 본 개시내용의 조성물의 정확한 양은 환자(대상)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 병태에서 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다.
"항체"(Ab)라는 용어는, 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 항체는 다이설파이드(disulfide) 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 각각의 H 사슬은 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약어화됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약어화됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 불변 도메인인, CL을 포함한다. VH 영역과 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존되는 영역들 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH와 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. Ab의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포)와 전형적인 보체계의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 일반적으로, 인간 항체는 2개의 동일한 중쇄(H) 폴리펩타이드(각각 약 50 kD)와 2개의 동일한 경쇄(L) 폴리펩타이드(각각 약 25 kD)가 서로 회합되어 통상 "Y형" 구조로 지칭되는 구조로 구성되어 있는 대략 150 kD의 사량체 작용제이다. 중쇄와 경쇄는 단일 다이설파이드 결합에 의해 서로 결합 또는 연결되며; 2개의 다른 다이설파이드 결합이 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여, 이량체가 서로 연결되어 사량체가 형성된다. 자연적으로 생성된 항체는 또한, 예를 들어 CH2 도메인에서 글리코실화된다.
"인간 항체"라는 용어는, 인간 면역글로불린 서열로부터 생성, 조립 또는 유도된 가변 및 불변 도메인 서열, 또는 이와 구별할 수 없는 서열을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 항체(또는 항체 구성요소)는, 이의 아미노산 서열이 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 잔기 또는 요소(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 도입되거나 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 변이)를 포함하더라도 "인간"인 것으로 간주될 수 있다. "인간화"라는 용어는, 인간 생식계열 인코딩된 서열과 더 유사하게 변형된, 비(非)인간 종(예를 들어, 마우스)의 가변 도메인에서 유도된 서열을 갖는 가변 도메인을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, "인간화" 항체는 실질적으로 인간 프레임워크 도메인의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 프레임워크 도메인과, 실질적으로 비인간 항체의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 일반적으로 인간 면역글로불린 불변 도메인의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 인간 중쇄 불변 도메인의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 선택적으로 CH4 영역을 포함할 수 있다.
"단클론 항체"는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 트랜스펙션된 세포, 또는 B 림프구의 단일 클론에 의해 생성된 항체이다. 단클론 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장세포의 융합으로부터 하이브리드 항체 형성 세포를 제조하는 방식으로 생산된다. 단클론 항체는 인간화 단클론 항체를 포함한다.
"키메라 항체"는 인간과 같은 하나의 종으로부터의 프레임워크 잔기와, 마우스와 같은 또 다른 종으로부터의 CDR(이는 일반적으로 항원 결합을 부여함)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR은 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원 특이적 결합 도메인을 포함한다.
항체는, 예를 들어 단클론 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 조작된 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 분자와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 항체 융합체(본원에서 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv), 낙타과 항체, 아피바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드 결합된 Fv(sdFv), 항-개별특이형(항-Id) 항체(예를 들어, 항-항-Id 항체 포함), 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 및 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 다클론 항체 집단을 나타낸다. 항체는 또한, 예를 들어 Fab' 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 단리된 CDR, 단일 사슬 Fv, 폴리펩타이드-Fc 융합체, 단일 도메인 항체(예를 들어, IgNAR과 같은 상어 단일 도메인 항체 또는 이의 단편), 낙타과 항체, 단일 사슬 또는 탠덤(Tandem) 디아바디(TandAb®), Anticalins®, Nanobodies® 미니바디, BiTE®, 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR 유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, 미세단백질, Fynomers®, Centyrins® 및 KALBITOR®을 포함할 수 있다.
면역글로불린은, 비제한적으로, IgA, 분비형 IgA, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는, 통상적으로 공지된 아이소타입(isotype) 중 임의의 것에서 유래할 수 있다. IgG 서브클래스 또한 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이에는, 비제한적으로, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함된다. "아이소타입"은, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 Ab 클래스 또는 서브클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다. "항체"라는 용어는, 예로서, 자연발생 및 비(非)자연발생 Ab; 단클론 및 다클론 Ab; 키메라 및 인간화 Ab; 인간 또는 비인간 Ab; 완전 합성 Ab; 및 단일 사슬 Ab를 모두 포함한다. 비인간 Ab는 인간에서 이의 면역원성을 감소시키기 위한 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 명시적으로 언급되지 않은 경우, 및 문맥이 달리 나타내지 않는 한, "항체"라는 용어는 또한 상기 언급된 면역글로불린 중 임의의 것의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 부분을 포함하며, 1가 및 2가 단편 또는 부분, 및 단일 사슬 Ab를 포함한다.
"항원 결합 분자", "항원 결합 부분" 또는 "항체 단편"은, 분자가 유래된 항체의 항원 결합 부분(예를 들어, CDR)을 포함하는 임의의 분자를 나타낸다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예에는, 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체, 및 항원 결합 분자로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 펩티바디(peptibody)(즉, 펩타이드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 분자)는 적합한 항원 결합 분자의 또 다른 예이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 종양세포 상의 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 과증식성 질환에 관여하는 세포 상의 항원, 또는 바이러스 또는 박테리아 항원에 결합한다. 추가의 구현예에서, 항원 결합 분자는 이의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다. 추가의 구현예에서, 항원 결합 분자는 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자는 아비머(avimer)를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 예에서, CDR은 참조 항체 및/또는 본 개시내용에 제공된 CDR의 서열에서 발견되는 바와 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, CDR은 참조 CDR(예를 들어, 본 개시내용에 제공된 CDR)과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개(예를 들어, 1개 내지 5개)의 아미노산 치환을 함유하거나 서열이 동일하다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, CDR은 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)의 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, CDR은 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, CDR은 CDR 내 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환되어 있지만, CDR이 참조 CDR의 아미노산 서열과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, CDR은 CDR 내 2개, 3개, 4개 또는 5개(예를 들어, 2개 내지 5개)의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환되어 있지만, CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 다양한 구현예에서, 항원 결합 단편은 참조 항체와 동일한 항원에 결합한다.
항원 결합 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 재조합적으로(즉, 조작된 핵산 서열의 발현에 의해) 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 완전히 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편의 길이는 적어도 약 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 그 이상의 아미노산; 일부 구현예에서 적어도 약 200개의 아미노산(예를 들어, 50개 내지 100개, 50개 내지 150개, 50 개 내지 200개, 또는 100개 내지 200개의 아미노산)일 수 있다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 당업계에서 통상적인 용어이다. 가변 영역은 항체들 사이에서 서열이 크게 다르며, 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는, 전형적으로 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙 중쇄의 아미노 말단에 있는 약 110개 내지 120개의 아미노산과 성숙 경쇄의 약 90개 내지 115개의 아미노산을 나타낸다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 영역에 집중되어 있으며, 가변 도메인에서 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 임의의 특정 메커니즘 또는 이론에 구애됨 없이, 경쇄와 중쇄의 CDR은 항체와 항원의 상호작용 및 특이성에 주로 기여하는 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 쥣과 CDR과 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 쥣과 CDR과 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
"VL" 및 "VL 도메인"이라는 용어는, 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 경쇄 가변 영역을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은, 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 항체 단편의 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은, 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab, 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 항체 단편의 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 나타낸다.
다음과 같은 CDR에 대한 다수의 정의가 통상적으로 사용된다: Kabat 넘버링, Chothia 넘버링, AbM 넘버링, 또는 Contact 넘버링. AbM 정의는 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용하는 2가지를 절충한 것이다. Contact 정의는 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다.
[표 1]
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"Kabat 넘버링" 등의 용어는 당업계에서 인정되는 것으로, 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 있는 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 나타낸다. 특정 양태에서, 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391] 및 문헌[Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). Kabat 넘버링 시스템을 사용하는 경우, 항체 중쇄 분자 내 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31번 내지 35번(선택적으로 35번 다음에 1개 또는 2개의 추가적인 아미노산(Kabat 넘버링 스킴(scheme)에서 35A 및 35B로 지칭됨)을 포함할 수 있음)(CDR1), 아미노산 위치 50번 내지 65번(CDR2), 및 아미노산 위치 95번 내지 102번(CDR3)에 존재한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하는 경우, 항체 경쇄 분자 내 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24번 내지 34번(CDR1), 아미노산 위치 50번 내지 56번(CDR2), 및 아미노산 위치 89번 내지 97번(CDR3)에 존재한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 스킴에 따라 결정되었다.
특정 양태에서, 항체의 CDR은 면역글로불린 구조 루프의 위치를 나타내는 Chothia 넘버링 스킴에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917]; 문헌[Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948]; 문헌[Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817]; 문헌[Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조). 전형적으로, Kabat 넘버링 규칙을 사용하는 경우, Chothia CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26번 내지 32번, 33번 또는 34번에 존재하고, Chothia CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52번 내지 56번에 존재하고, Chothia CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95번 내지 102번에 존재하며, Chothia CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24번 내지 34번에 존재하고, Chothia CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50번 내지 56번에 존재하고, Chothia CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89번 내지 97번에 존재한다. Kabat 넘버링 규칙을 사용하여 넘버링되는 경우 Chothia CDR-HI 루프의 말단은 루프 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 Kabat 넘버링 스킴이 H35A와 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A도 35B도 존재하지 않는 경우, 루프는 32번에서 종결되고; 35A만 존재하는 경우, 루프는 33번에서 종결되고; 35A와 35B 둘 모두 존재하는 경우, 루프는 34번에서 종결됨).
"불변 영역" 및 "불변 도메인"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항체 부분, 예를 들어 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
항체와 관련하여 사용되는 "중쇄"라는 용어는, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반한 임의의 별개의 유형, 예를 들어 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 나타낼 수 있으며, 이는 IgG의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)를 포함하여, 각각, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스의 항체를 생성한다.
항체와 관련하여 사용되는 "경쇄"라는 용어는, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반한 임의의 별개의 유형, 예를 들어 카파(κ) 또는 람다(λ)를 나타낼 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
"항원(Ag)"이라는 용어는, 인간 또는 동물에 주사되거나 흡수되는 조성물(예컨대, 종양 특이적 단백질을 포함하는 것)을 포함하여, 인간 또는 동물에서 T세포 반응 또는 항체의 생산을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 나타낸다. 항원은 본원에 개시된 항원과 같은 이종 항원에 의해 유도된 것들 포함하는 특정 체액성 또는 세포성 면역의 산물과 반응한다. "표적 항원" 또는 "관심 표적 항원"은 다른 정상적인(목적하는) 세포의 표면에서 실질적으로 발견되지 않고, 본원에서 고려되는 TCR 또는 CAR의 결합 도메인에 결합하도록 설계된 항원이다. 당업자는, 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 항원은 내생적으로, 즉 게놈 DNA에 의해 발현되거나, 재조합적으로 발현될 수 있다. 항원은 암세포와 같은 특정 조직에 특이적이거나, 광범위하게 발현될 수 있다. 또한, 더 큰 분자의 단편이 항원으로 작용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항원은 종양 항원이다. "표적"은 결합 모티프, 항원 결합 시스템 또는 결합제, 예를 들어 항체에 의해 결합되는 임의의 분자이다. 일부 구현예에서, 표적은 본 개시내용의 항원 또는 에피토프이다.
"암"이라는 용어는, 일반적으로 비정상적인 세포가 제어되지 않고 분할되어 근처 조직에 침범할 수 있는 질환 또는 병태의 부류에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예에는, 비제한적으로, 림프종, 백혈병, 골수종 및 다른 백혈구 악성종양을 포함하는, 면역계의 암이 포함된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은, 예를 들어 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부위암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 다발골수종, 호지킨병(Hodgkin's Disease), 비(非)호지킨림프종(NHL), 원발성 종격동 거대B세포림프종(PMBC), 미만성 거대B세포림프종(DLBCL), 여포성림프종(FL), 형질전환된 여포성림프종, 비장 변연부림프종(SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 급성림프모구성백혈병(ALL)(비(非)T세포 ALL 포함), 만성림프구성백혈병(CLL), 소아의 고형종양, 림프구성림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추신경계(CNS) 신생물, 원발성 CNS림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간교종, 뇌하수체샘종, 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 표피양암, 편평세포암, T세포림프종, 석면에 의해 유도된 것들을 포함하는 환경적으로 유도된 암, 다른 B세포 악성종양, 및 상기 암들의 조합에서 유도된 종양의 종양 크기를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 암은 다발골수종이다. 특정 암은 화학요법 또는 방사선요법에 반응할 수 있거나, 암은 불응성일 수 있다. 불응성 암은 수술적 개입으로 교정할 수 없는 암을 나타내며, 이러한 암은 초기에 화학요법 또는 방사선요법에 반응하지 않거나 시간 경과에 따라 반응하지 않게 된다. 암은 2가지 방식 이상의 전신 요법 후 재발성 또는 불응성 거대B세포림프종(달리 특정되지 않은 미만성 거대B세포림프종(DLBCL) 포함), 2가지 방식 이상의 전신 요법 후 원발성 종격동 거대B세포림프종, 고급 B세포림프종, 및 여포성림프종에서 유발된 DLBCL을 추가로 포함한다.
"암성세포", "암세포", "종양세포" 또는 이의 변형은 암성 성장 또는 조직의 개별 세포를 나타낸다. 종양은 일반적으로 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 세포의 비정상적인 성장에 의해 형성된 종창 또는 병변을 나타낸다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 일부, 예를 들어 백혈병은 반드시 종양을 형성하는 것은 아니다. 종양을 형성하는 암의 경우, 암(세포) 및 종양(세포)라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 개체에서 종양의 양은 종양의 수, 부피 또는 중량으로 측정될 수 있는 "종양 부담"이다.문맥에서 달리 요구되지 않는 한, "포함하다" 및 "포함하는" 등의 단어는 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어지는"이란, "~로 이루어지는"이라는 구절 이후에 오는 모든 것을 포함하며, 이에 제한됨을 의미한다. 따라서, "~로 이루어지는"이라는 구절은, 열거된 요소가 필요하거나 필수적이며, 다른 요소가 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다. "본질적으로 ~로 이루어지는"은, 상기 구절 이후에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대하여 본 개시내용에 명시된 활성 또는 작용에 기여하거나 이를 방해하지 않는 다른 요소에 제한됨을 의미한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비(非)극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 CDR(들) 또는 프레임워크 영역(들) 내 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 일반적으로, 2개의 서열은 일반적으로, 이들이 상응하는 위치에 보존적 아미노산 치환을 함유하는 경우, "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 예를 들어, 특정 아미노산은 일반적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 하나의 아미노산의 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로의 치환은 보존적 치환으로 간주될 수 있다. 예시적인 아미노산 분류는 하기 표 2 및 표 3에 요약되어 있다:
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
"감소시키다" 또는 "낮추다" 또는 "줄이다" 또는 "저하시키다" 또는 "약화시키다"라는 것은, 일반적으로 비히클 단독(즉, 활성 모이어티) 또는 제어 분자/조성물에 의해 유발되는 반응과 비교하여 더 적은 생리학적 반응(즉, 다운스트림 효과)을 생성, 유도 또는 유발하는 본원에서 고려되는 조성물의 능력을 나타낸다. "감소" 또는 "감소된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의미한" 양이며, 제어 조성물인 비히클에 의해 생성된 반응(참조 반응)의 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 30배 또는 그 이상(예를 들어, 500배, 1000배)(이들 수치 사이에 있으며 1 위인 모든 정수 및 소수점을, 예를 들어 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배 등을, 포함함)의 감소를 포함할 수 있다.
"우성 음성"이라는 용어는, 변경된 유전자 산물이 변형되지 않은 유전자 산물을 통해 정상적으로 전달되는 다운스트림 신호전달 기능을 저해하도록 하는 폴리펩타이드 코딩 서열의 절단 또는 돌연변이를 나타낸다.
"증강시키다" 또는 "촉진시키다" 또는 "증가시키다" 또는 "확장시키다"라는 용어는, 일반적으로 비히클 또는 제어 분자/조성물에 의해 유발되는 반응과 비교하여 더 큰 생리학적 반응(즉, 다운스트림 효과)을 생성, 유도 또는 유발하는 본원에서 고려되는 조성물의 능력을 나타낸다. 측정 가능한 생리학적 반응은 당업계의 지식 및 본원의 개시내용으로부터 명백한 다른 것들 중에서, T세포 확장, 활성화, 지속성의 증가, 및/또는 암세포 사멸 능력의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "증강된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의미한" 양이며, 비히클 또는 제어 조성물에 의해 생성된 반응의 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 30배 또는 그 이상(예를 들어, 500배, 1000배)(이들 수치 사이에 있으며 1 위인 모든 정수 및 소수점을, 예를 들어 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배 등을, 포함함)의 증가를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "에피토프"라는 용어는, 결합제에 결합하는 항원의 영역을 나타낸다. 에피토프는, 예를 들어 폴리펩타이드의 연속 아미노산(선형 또는 연속 에피토프)일 수 있거나, 에피토프는, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 2개 이상의 비(非)연속 영역이 함께 합쳐진 것(입체형태적, 비(非)선형, 불연속 또는 비연속 에피토프)일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체에 결합하는 에피토프는, 예를 들어 NMR 분광법, X선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분석법과 결합된 수소/중수소 교환(예를 들어, 액체 크로마토그래피 전자분무 질량 분석법), 어레이 기반 올리고 펩타이드 스캐닝 검정, 및/또는 돌연변이유발 맵핑(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. X선 결정학의 경우, 결정화는 당업계에 공지된 방법 중 임의의 것을 사용하여 달성할 수 있다(예를 들어, 문헌[
Figure pct00004
R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350]; 문헌[McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23]; 문헌[Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274]; 문헌[McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303]). 항체:항원 결정은 널리 공지된 X선 회절 기술을 사용하여 연구할 수 있으며, X-PLOR(예일대학교, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포됨; 예를 들어 문헌[Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.]; U.S. 2004/0014194 참조), 및 BUSTER(문헌[Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60]; 문헌[Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW]; 문헌[Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323])과 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정제할 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술의 설명에 대해서는 문헌[Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394] 및 문헌[Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085]을 참조한다.
"유전적으로 조작된" 또는 "조작된"이라는 용어는, 비제한적으로, 코딩 또는 비코딩 영역, 또는 이의 일부를 결실시키거나, 코딩 영역 또는 이의 일부를 삽입하는 것을 포함하는, 세포의 게놈을 변경시키는 방법을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형되는 세포는 환자 또는 공여자로부터 얻을 수 있는 림프구, 예를 들어 T세포이다. 세포는, 예를 들어 세포의 게놈에 혼입되는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)와 같은 외인성 구조체를 발현하도록 변형될 수 있다. 조작은 일반적으로 인간의 손에 의한 조작을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는, 자연에서 해당 순서로 함께 결합 또는 연결되지 않은 2개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로 직접 결합 또는 연결되도록 인간의 손에 의해 조작되는 경우, "조작된" 것으로 간주된다. 분자생물학 기술에 의한 세포 조작의 맥락에서, 세포 또는 유기체는 이의 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어, 형질전환, 체세포 혼성화, 트랜스펙션, 형질도입 또는 다른 메커니즘에 의해 도입된 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질이, 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이, 또는 다른 프로토콜에 의해 변경되거나 제거됨), "조작된" 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 결합제는 환자 또는 공여자로부터 얻을 수 있는 변형된 림프구, 예를 들어 T세포이다. 조작된 세포는, 예를 들어 세포의 게놈에 혼입되는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)와 같은 외인성 구조체를 발현하도록 변형될 수 있다. 조작된 폴리뉴클레오타이드 또는 결합제의 자손은 일반적으로 실제 조작이 이전 개체에 대해 수행되었음에도 불구하고 "조작된" 것으로 지칭된다. 일부 구현예에서, "조작된"은 설계되고 생산된 개체를 나타낸다. "설계된"이라는 용어는, (i) 구조가 인간의 손에 의해 선택되거나 선택되었던 작용제; (ii) 인간의 손을 필요로 하는 과정에 의해 생산된 작용제; 및/또는 (iii) 천연 물질 및 다른 공지된 작용제와 구별되는 작용제를 나타낸다. "T세포 수용체" 또는 "TCR"은 T세포의 표면 상에 존재하는 항원 인식 분자를 나타낸다. 정상적인 T세포 발달 동안, 4개의 TCR 유전자, α, β, γ 및 δ는, 각각, 재배열되어 매우 다양한 TCR 단백질을 유도할 수 있다. "유전적으로 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "재지향된 세포"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
"면역 이펙터 세포"는 하나 이상의 이펙터 기능(예를 들어, 세포독성 세포 사멸 활성, 사이토카인 분비, ADCC 및/또는 CDC 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다. 본원에서 고려되는 예시적인 면역 이펙터 세포는 T림프구, 예를 들어 범용 CD3+ T세포, 세포독성 T세포(CTL; CD8+ T세포), TIL 및 헬퍼 T세포(HTL; CD4+ T세포)이다.
"개체" 및 "대상"이라는 용어는 종종 상호교환적으로 사용되며, 본원에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 임의의 동물을 나타낸다. 적합한 대상(예를 들어, 환자)에는, 실험실 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그), 농장동물, 및 가축 또는 애완동물(예컨대, 고양이 또는 개)이 포함된다. 비인간 영장류 및 인간 환자가 포함된다. 하나의 구현예에서, 대상은 암을 앓고 있거나, 암으로 진단되었거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 인간 환자를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "환자"라는 용어는, 질환 또는 병태의 치료를 받을 수 있는 대상을 나타낸다.
"단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등의 용어는, 세포 환경으로부터, 및 세포의 다른 구성요소와의 회합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 나타내며, 즉, 이는 생체내 물질과 유의미한 관련이 없다. 유사하게, "단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 수득되고, 세포외 기질이 실질적으로 없는 세포를 나타낸다.
"단리된 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는, 자연발생 상태에서 측면에 있는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 해당 단편에 정상적으로 인접한 서열에서 제거된 DNA 단편을 나타낸다. "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 또한 상보적 DNA(cDNA), 재조합 DNA, 또는 자연에 존재하지 않고 인간의 손에 의해 제조된 다른 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다.
"림프구"라는 용어는, 자연 살해(NK) 세포, T세포 또는 B세포를 포함한다. NK세포는 선천성 면역계의 주요 구성요소를 나타내는 일종의 세포독성(세포 독성) 림프구이다. NK세포는 바이러스에 감염된 세포와 종양을 거부한다. 이는 세포자멸사 또는 세포예정사의 과정을 통해 작용한다. 이는 세포를 사멸시키기 위해 활성화될 필요가 없기 때문에 "자연 살해자"로 지칭된다. T세포는 세포 매개 면역(항체가 관여하지 않음)에서 중요한 역할을 담당한다. 이의 T세포 수용체(TCR)는 T세포를 다른 림프구 유형과 구별한다. 면역계의 특수 기관인 흉선은 주로 T세포의 성숙을 담당한다. T세포에는 6가지 유형이 존재한다: 즉, 헬퍼 T세포(예를 들어, CD4+ 세포), 세포독성 T세포(TC, 세포독성 T림프구, CTL, T-살해세포, 세포용해 T세포, CD8+ T세포 또는 살해 T세포로도 공지되어 있음), 기억 T세포((i) 나이브(naive) 세포와 같은 줄기 기억 TSCM 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+(L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+이지만, 또한 다량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3 및 LFA-1을 발현하며, 기억 세포 특유의 다수의 기능적 속성을 나타냄; (ii) 중앙 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴과 CCR7을 발현하며, IFNγ 또는 IL-4가 아닌 IL-2를 분비함, 및 (iii) 이펙터 기억 TEM 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만, IFNγ 및 IL-4와 같은 이펙터 사이토카인을 생성함), 조절 T세포(Treg, 억제 T세포 또는 CD4+CD25+ 조절 T세포), 자연 살해 T세포(NKT) 및 감마 델타 T세포. T세포는 흉선세포, 나이브 T림프구, 미성숙 T림프구, 성숙 T림프구, 휴지기 T림프구 또는 활성화된 T림프구를 포함하는 범용 CD3+ T세포인 감마 델타 T세포를 포함하는 것으로 의도된다. T세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2(Th2) 세포일 수 있다. T세포는 헬퍼 T세포(HTL; CD4+ T세포) CD4+ T세포, 세포독성 T세포(CTL; CD8+ T세포), 종양 침윤성 세포독성 T세포(TIL; CD8+ T세포), CD4+CD8+ T세포, CD4-CD8- T세포, 또는 T세포의 임의의 다른 서브세트일 수 있다. 일부 구현예에서의 사용에 적합한 T세포의 다른 예시적인 집단에는, 나이브 T세포와 기억 T세포가 포함된다. 한편, B세포는 체액성 면역(항체가 관여함)에서 주요한 역할을 담당한다. 이는 항체와 항원을 만들어 항원제시세포(APC)의 역할을 수행하며, 항원 상호작용에 의한 활성화 후 기억 B세포로 변한다. 포유류에서, 미성숙 B세포는 골수에서 형성되며, 여기서 그 이름이 유래된다.
"변형된 T세포"라는 용어는, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된 T세포를 나타낸다. 변형된 T세포에는, 유전적 변형과 비(非)유전적 변형(예를 들어, 에피솜 또는 염색체외) 둘 모두가 포함된다. 하나의 구현예에서, 변형된 T세포는 본원에 기재된 바와 같은 TGF-β 수용체 또는 CAR-DN TGF-β 수용체를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화 없음" 또는 "실질적 변화 없음" 또는 "실질적 감소 없음"이란, 일반적으로 비히클, 제어 분자/조성물에 의해 유발되는 반응과 비교하여, 세포에서 더 적은 생리학적 반응(즉, 다운스트림 효과)을 생성, 유도 또는 유발하는 본원에서 고려되는 조성물의 능력을 나타낸다. 필적하는 반응은 참조 반응과 유의하게 상이하거나 측정 가능하게 상이하지 않은 반응이다.
"악성"이라는 용어는, 종양세포의 군이 제어되지 않은 성장(즉, 정상 한계를 넘어선 분열), 침습(즉, 인접 조직에 대한 침입 및 이의 파괴), 및 전이(즉, 림프 또는 혈액을 통해 신체의 다른 위치로 퍼짐) 중 하나 이상을 나타내는 암을 나타낸다. 본원에 사용된 "전이하다"라는 용어는, 신체의 한 부분에서 또 다른 부분으로 암이 퍼지는 것을 나타낸다. 확산된 세포의 의해 형성된 종양은 "전이성 종양" 또는 "전이"로 불린다. 전이성 종양은 원래(초기) 종양에 있는 바와 같은 세포를 함유한다. 본원에 사용된 "양성" 또는 "비(非)악성"이라는 용어는, 더 크게 성장할 수 있지만 신체의 다른 부분으로 퍼지지 않는 종양을 나타낸다. 양성 종양은 자기 한정적(self-limited)이며, 전형적으로 침범하거나 전이하지 않는다.
"증식"이라는 용어는, 세포 분열(세포의 대칭 또는 비대칭 분열)의 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, "증식"은 T세포의 대칭 또는 비대칭 분열을 나타낸다. "증가된 증식"은 처리되지 않은 샘플의 세포와 비교하여 처리된 샘플에서 세포의 수가 증가할 때 발생한다.
"자극"이라는 용어는, 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 이의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되어, 비제한적으로, TCR/CD3 복합체를 통한 신호전달을 포함하는 신호전달 사건을 매개하는 1차 반응을 나타낸다. "자극 분자"는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T세포 상의 분자를 나타낸다. 본원에 사용된 "자극 리간드"는, 항원제시세포(APC)(예를 들어, 수지상세포, B세포 등) 상에 존재할 때, T세포 상의 동족 결합 파트너(본원에서 "자극 분자"로 지칭됨)와 특이적으로 결합하여, 비제한적으로, 활성화, 면역반응의 개시, 증식 등을 포함하는 T세포에 의한 1차 반응을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드에는, 비제한적으로, CD3 리간드, 예를 들어 항-CD3 항체(예컨대, OKT3) 및 CD2 리간드, 예를 들어 항-CD2 항체, 펩타이드, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV), B형 간염바이러스(HBV) 및 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV) 펩타이드, 펩타이드가 로딩된 MHC 클래스 I 분자, 수퍼아고니스트(superagonist) 항-CD2 항체 및 수퍼아고니스트 항-CD28 항체가 포함된다.
"공동자극 신호"는, TCR/CD3 결찰과 같은 1차 신호와 조합으로, T세포 증식, 사이토카인 생성, 및/또는 분자(예를 들어, CD28)의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 신호를 나타낸다.
본원에 사용된 "공동자극 리간드"는, T세포 상의 동족 공동자극 분자와 특이적으로 결합하는 항원제시세포 상의 분자를 포함한다. 공동자극 리간드의 결합은, 비제한적으로, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는 T세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공동자극 리간드는, 자극 분자에 의해 제공된 1차 신호에 더하여, 예를 들어 T세포 수용체(TCR)/CD3 복합체와 펩타이드가 로딩된 주조직적합복합체(MHC: major histocompatibility complex) 분자의 결합에 의한 신호를 유도한다. 공동자극 리간드는, 비제한적으로, 3/TR6, 4-1BB 리간드, Toll 리간드 수용체에 결합하는 아고니스트 또는 항체, B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD30 리간드, CD40, CD7, CD70, CD83, 헤르페스바이러스 진입 매개체(HVEM), 인간 백혈구 항원 G(HLA-G), ILT4, 면역글로불린 유사 전사체(ILT) 3, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착분자(ICAM), B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프독소 베타 수용체, MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 A(MICA), MHC 클래스 I 사슬 관련 단백질 B(MICB), OX40 리간드, PD-L2 또는 예정사(PD) L1을 포함할 수 있다. 공동자극 리간드에는, 비제한적으로, T세포 상에 존재하는 공동자극 분자(예컨대, 비제한적으로, 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS)와 특이적으로 결합하는 항체, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), 자연 살해 세포 수용체 C(NKG2C), OX40, PD-1, 또는 종양괴사인자 수퍼패밀리 멤버 14(TNFSF14 또는 LIGHT)가 포함된다.
"공동자극 분자"는, 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 비제한적으로, 증식과 같은 T세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T세포 상의 동족 결합 파트너이다. 공동자극 분자에는, 비제한적으로, 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 비제한적으로, 증식과 같은 T세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T세포 상의 동족 결합 파트너인 "공동자극 분자"가 포함된다. 공동자극 분자에는, 비제한적으로, 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD33, CD45, CD100(SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3(알파; 베타; 델타; 엡실론; 감마; 제타), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, CD83 리간드, CD84, CD86, CD8알파, CD8베타, CD9, CD96(Tactile), CDl-la, CDl-lb, CDl-lc, CDl-ld, CDS, CEACAM1, CRTAM, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGBl, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT(종양괴사인자 수퍼패밀리 멤버 14; TNFSF14), LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1(CDl la/CD18)), MHC 클래스 I 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자, SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절단물 또는 조합이 포함된다.
"실질적으로"라는 용어는, 기준 양, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상인 양, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 나타낸다. 하나의 구현예에서, "실질적으로 동일한"은, 기준 양, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 효과, 예를 들어 생리학적 효과를 생성하는 양, 수준, 값, 개수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 나타낸다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은, 질환 또는 병리학적 병태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 유익하거나 목적하는 효과를 포함하며, 이는 치료하고자 하는 질환 또는 병태, 예를 들어 암의 하나 이상의 측정 가능한 마커의 최소한의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 선택적으로 질환 또는 병태의 증상 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 병태의 진행 지연을 포함할 수 있다. "치료"가 반드시 질환 또는 병태, 또는 이의 관련 증상의 완전 근절 또는 치유를 나타내는 것은 아니다.
"바이러스에 의해 유도된 암"이라는 용어는, DNA 또는 RNA 바이러스에 의해 유도된 임의의 악성종양을 포함한다. 이러한 바이러스는, 비제한적으로, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV), B형 간염바이러스(HBV-간세포암종), 인간 유두종바이러스(HPV-편평세포암종, 자궁경부암종), 인간 T-림프친화 바이러스(HTLV-I-성인 T세포백혈병) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV-버킷림프종, 비인두암종)를 포함할 수 있다.
"키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 결합 모티프와, 항원 결합 시 면역 세포(예를 들어, 나이브 T세포, 중추 기억 T세포, 이펙터 기억 T세포 또는 이들의 조합과 같은 T세포)를 활성화시키는 수단을 포함하도록 조작된 분자를 나타낸다. CAR은 또한 인공T세포 수용체, 키메라 T세포 수용체 또는 키메라 면역수용체로도 공지되어 있다. 일부 구현예에서, CAR은 결합 모티프, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 하나 이상의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T세포는 CAR T세포로 지칭될 수 있다. "세포외 도메인"(또는 "ECD")은, 폴리펩타이드가 세포막에 존재할 때, 세포막 외부의 세포외 공간에 존재하는 것으로 이해되는 폴리펩타이드의 일부를 나타낸다.
"중화"라는 용어는, 리간드에 결합하여, 리간드의 생물학적 효과를 방지하거나 감소시키는 항원 결합 분자, scFv, 항체, 또는 이의 단편을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체, 또는 이의 단편은, 리간드 상의 결합 부위를 직접적으로 차단하거나, 다르게는 간접적인 수단(예컨대, 리간드의 구조 또는 에너지 변경)을 통해 리간드의 결합 능력을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체, 또는 이의 단편은 이에 결합된 단백질이 생물학적 기능을 수행하는 것을 방지한다.
"자가"라는 용어는, 이후에 재도입되게 되는 동일한 개체에서 유도된 임의의 물질을 나타낸다. 예를 들어, 본원에 기재된 조작된 자가 세포 요법(eACT™)은 환자로부터 림프구를 수집하고, 이어서 이를, 예를 들어 CAR 구조체를 발현하도록 조작한 후, 동일한 환자에게 다시 투여하는 것을 포함한다.
"동종이형(allogeneic)"이라는 용어는, 하나의 개체에서 유도된 임의의 물질이 동일한 종의 또 다른 개체에 도입되는 것, 예를 들어 동종이형 T세포 이식을 나타낸다.
"형질도입" 및 "형질도입된"이라는 용어는, 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 세포에 도입되는 과정을 나타낸다(문헌[Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)] 참조). 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큐로바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 우두바이러스 벡터, 단순헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 이들의 임의의 조합이다.
"형질전환"은 외인성 DNA가 숙주세포에 도입되는 임의의 과정을 나타낸다. 형질전환은 다양한 방법을 사용하여 자연 또는 인공 조건 하에서 일어날 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주세포에 삽입하는 임의의 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 형질전환 방법은 형질전환되는 숙주세포 및/또는 삽입되는 핵산을 기준으로 선택된다. 형질전환 방법은, 비제한적으로, 바이러스 감염, 전기천공 및 리포펙션을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, "형질전환된" 세포는, 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드 또는 숙주 염색체의 일부로 복제될 수 있다는 점에서 안정적으로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 형질전환된 세포는 도입된 핵산을 발현할 수 있다.
"벡터"라는 용어는, 제공된 핵산 서열을 포함하거나 혼입하도록 변형된 수용 핵산 분자를 나타낸다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA가 결찰될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 분자를 나타내는 "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주세포에서 자가 복제될 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비(非)에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에의 도입 시 숙주세포의 게놈에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 나아가, 특정 벡터는 이에 작동적으로 연결된 삽입된 유전자의 발현을 지시하는 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭될 수 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]에서 확인할 수 있는 바와 같은 표준 기술을 사용하여 벡터를 조작할 수 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위하여 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 사용된 "항종양 효과"는, 종양 부피의 감소, 종양세포 수의 감소, 종양세포 증식의 감소, 전이 수의 감소, 전체생존기간 또는 무진행생존기간의 증가, 기대수명의 증가, 또는 종양과 관련이 있는 다양한 생리학적 증상의 개선으로 나타날 수 있는 생물학적 효과를 나타낸다. 항종양 효과는 또한 종양 발생의 예방, 예를 들어 백신을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "사이토카인"은 특정 항원과의 접촉에 반응하여 하나의 세포에 의해 방출된 비(非)항체 단백질을 나타내며, 여기서 사이토카인은 제2 세포와 상호작용하여 제2 세포에서 반응을 매개한다. 사이토카인은 세포에 의해 내생적으로 발현되거나, 대상에게 투여될 수 있다. 사이토카인은 대식세포, B세포, T세포 및 비만세포를 포함하는 면역세포에 의해 방출되어 면역반응을 전파할 수 있다. 사이토카인은 수용세포에서 다양한 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인은 항상성 사이토카인, 케모카인, 전염증성 사이토카인, 이펙터 및 급성병기단백질(acute-phase protein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터류킨(IL) 7 및 IL-15를 포함하는 항상성 사이토카인은 면역세포 생존 및 증식을 촉진시키고, 전염증성 사이토카인은 염증반응을 촉진시킬 수 있다. 항상성 사이토카인의 예에는, 비제한적으로, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 및 인터페론(IFN) 감마가 포함된다. 전염증성 사이토카인의 예에는, 비제한적으로, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, 종양괴사인자(TNF)-알파, TNF-베타, 섬유아세포 성장인자(FGF) 2, 과립구 대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 가용성 세포간 접착분자 1(sICAM-1), 가용성 혈관 접착분자 1(sVCAM-1), 혈관내피성장인자(VEGF), VEGF-C, VEGF-D 및 태반성장인자(PLGF)가 포함된다. 이펙터의 예에는, 비제한적으로, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 가용성 Fas 리간드(sFasL) 및 퍼포린(perforin)이 포함된다. 급성병기단백질의 예에는, 비제한적으로, C반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)가 포함된다.
"케모카인"은 세포 화학주성 또는 지향성 이동을 매개하는 사이토카인의 일종이다. 케모카인의 예에는, 비제한적으로, IL-8, IL-16, 에오탁신, 에오탁신-3, 대식세포 유래 케모카인(MDC 또는 CCL22), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1 또는 CCL2), MCP-4, 대식세포 염증성 단백질 1α(MIP-1α, MIP-1a), MIP-1β(MIP-1b), 감마 유도 단백질 10(IP-10), 및 흉선 및 활성화 조절된 케모카인(TARC 또는 CCL17)이 포함된다.
"면역반응"은, 척추동물 신체에 침입한 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 이에 대한 결합, 이에 대한 손상, 이의 파괴 및/또는 이의 제거를 유도하는, 면역계의 세포(예를 들어, T림프구, B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만세포, 수지상세포 및 호중구), 및 이러한 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생성된 가용성 거대분자(Ab, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 나타낸다.
"면역요법"이라는 용어는, 면역반응을 유도, 증강, 억제 또는 다르게는 변경시키는 것을 포함하는 방법에 의한, 질환으로 고통받거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 질환이 재발할 위험이 있는 대상의 치료를 나타낸다. 면역요법의 예에는, 비제한적으로, T세포 요법이 포함된다. T세포 요법은 입양 T세포 요법, 종양침윤림프구(TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법(eACT™) 및 동종이형 T세포 이식을 포함할 수 있다. 하지만, 당업자는 본원에 개시된 조건화 방법이 임의의 이식된 T세포 요법의 효과를 증강시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다. T세포 요법의 예는, 미국 특허출원공개 제2014/0154228호 및 제2002/0006409호, 미국 특허 제5,728,388호, 및 국제 특허출원공개 WO 2008/081035호에 기재되어 있다.
면역요법의 T세포는 당업계에 공지된 임의의 공급원에서 유래할 수 있다. 예를 들어, T세포는 조혈줄기세포 집단으로부터 시험관내 분화될 수 있거나, T세포는 대상에서 얻을 수 있다. T세포는, 예를 들어 말초혈액단핵세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직 및 종양에서 얻을 수 있다. 또한, T세포는 당업계에서 이용 가능한 하나 이상의 T세포주에서 유도될 수 있다. T세포는 또한 FICOLL™ 분리 및/또는 성분채집술(apheresis)과 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상으로부터 수집된 혈액 단위에서 얻을 수 있다. T세포 요법을 위해 T세포를 단리하는 추가의 방법은 미국 특허출원공개 제2013/0287748호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
입양세포 전달로도 공지된 "eACT™"로 약어화될 수 있는 "조작된 자가 세포 요법"이라는 용어는, 환자 자신의 T세포를 수집하고, 이어서 하나 이상의 특정 종양세포 또는 악성종양의 세포 표면 상에서 발현되는 하나 이상의 항원을 인식하고 표적화하도록 유전적으로 변경하는 과정이다. T세포는, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR 양이온성(+) T세포는 적어도 하나의 공동자극 도메인과 적어도 하나의 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 부분에 연결된 특정 종양 항원에 대해 특이성을 갖는 세포외 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 발현하도록 조작된다. 공동자극 도메인은 자연발생 공동자극 도메인 또는 이의 변이체, 예를 들어 절단된 힌지 도메인("THD")을 갖는 변이체에서 유도될 수 있고, 활성화 도메인은, 예를 들어 CD3-제타에서 유도될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 공동자극 도메인을 갖도록 설계된다. CAR scFv는, 예를 들어 모든 정상 B세포 및 B세포 악성종양(비제한적으로, NHL, CLL 및 비-T세포 ALL을 포함함)을 포함하는 B세포 계통의 세포에 의해 발현되는 막관통 단백질인 CD19를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 공동자극 도메인이 별개의 폴리펩타이드 사슬로 발현되도록 조작된다. CAR T세포 요법과 구조체의 예는 미국 특허출원공개 제2013/0287748호, 제2014/0227237호, 제2014/0099309호 및 제2014/0050708호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. "입양 세포 요법" 또는 "ACT"는 대상, 예를 들어 암 환자에게 항종양 활성을 갖는 면역세포를 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, ACT는 항종양 활성을 갖는 림프구(예를 들어, 조작된 림프구)의 사용을 포함하는 치료 접근법이다.
"항원제시세포" 또는 "APC"는 항원을 처리하고 T세포에 제시하는 세포를 나타낸다. 예시적인 APC는 수지상세포, 대식세포, B세포, 특정 활성화된 상피세포, 및 TCR 자극과 적절한 T세포 공동자극을 가능하게 하는 다른 세포 유형을 포함한다.
"펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 나타낸다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는, 당업계에서 통상적으로, 예를 들어 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄와, 당업계에서 일반적으로 단백질(이에는 다수의 유형이 존재함)로 지칭되는 장쇄 둘 모두를 나타낸다. "폴리펩타이드"에는, 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질이 포함된다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 이들의 조합을 포함한다.
"동일성"이라는 용어는, 중합체 분자, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩타이드 분자 사이의 전반적인 관련성을 나타낸다. 2개의 제공된 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성%를 계산하는 방법은 공지되어 있다. 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 동일성% 계산은, 예를 들어 최적 비교를 위해 2개의 서열을 정렬하는 방식으로 수행될 수 있다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 서열과 제2 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있고, 비교를 위해 동일하지 않은 서열을 무시할 수 있음). 이어서, 상응하는 위치에 있는 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)로 점유되어 있는 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성%는, 선택적으로 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려한, 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 또는 정렬, 및 2개의 서열 사이의 동일성% 결정은 BLAST(basic local alignment search tool)와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체 분자는 이들 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 동일한 경우 서로 "상동"인 것으로 간주된다.
동일성%를 계산하기 위해, 비교되는 서열은 전형적으로 서열들 사이에서 가장 큰 매치(match)를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성%를 결정하는 데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 일례는, GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지이다(문헌[Devereux et al., 1984, Nucl . Acid Res. 12:387]; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성%를 결정하고자 하는 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 정렬하는 데 사용된다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 최적 매칭(알고리즘에 의해 결정된 "매칭된 범위")을 위해 정렬된다. 특정 구현예에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스의 경우 문헌[Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 매트릭스의 경우 문헌[Henikoff et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:10915-10919] 참조)가 또한 상기 알고리즘에 따라 사용된다. 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN, 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, gapped BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 것들을 포함하는, 아미노산 또는 핵산 서열의 비교를 위한 다른 알고리즘이 또한 이용 가능하다. 예시적인 이러한 프로그램은, 문헌[Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215(3): 403-410, 1990]; 문헌[Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]; 문헌[Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 문헌[Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999]에 기재되어 있다. 유사한 서열을 식별하는 것에 더하여, 상기 언급된 프로그램은 일반적으로 유사성 정도의 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열은, 상응하는 잔기의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상이 잔기의 관련 스트레치(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)에 걸쳐 유사하고/하거나 동일한 경우 실질적으로 유사한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 완전 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 스트레치는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개, 적어도 175개, 적어도 200개, 적어도 225개, 적어도 250개, 적어도 275개, 적어도 300개, 적어도 325개, 적어도 350개, 적어도 375개, 적어도 400개, 적어도 425개, 적어도 450개, 적어도 475개, 적어도 500개 또는 그 이상의 잔기이다. 실질적인 서열 유사성을 갖는 서열은 서로 상동일 수 있다.
"병용요법"은, 대상이 2가지 이상의 치료요법(예를 들어, 2가지 이상의 치료 모이어티)에 동시에 노출되는 상황을 나타낸다. 일부 구현예에서, 2가지 이상의 요법은 동시에 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 이러한 요법은 순차적으로 투여될 수 있고(예를 들어, 두 번째 요법의 임의의 용량의 투여 전 첫 번째 요법의 모든 "용량 "이 투여됨); 일부 구현예에서, 이러한 작용제는 중첩 투여 방식으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 병용요법의 "투여"는 다른 작용제(들) 또는 방식(들)을 조합으로 투여받고 있는 대상에게의 하나 이상의 작용제(들) 또는 방식(들)의 투여를 포함할 수 있다. 명확성을 위해, 병용요법은 개별 작용제가 단일 조성물로 함께(또는 심지어 반드시 동시에) 투여될 필요는 없지만, 일부 구현예에서, 2가지 이상의 작용제 또는 이의 활성 모이어티가 조합 조성물, 또는 심지어 조합 화합물(예를 들어, 단일 화학 복합체 또는 공유 엔티티의 일부로)로 함께 투여될 수 있다.
"투여형"이라는 용어는, 대상에게의 투여를 위한 활성제(예를 들어, 항원 결합 시스템 또는 항체)의 물리적으로 별개의 단위를 나타내는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 각각의 이러한 단위는 선결된 양의 활성제를 함유한다. 일부 구현예에서, 이러한 양은 관련 집단에 투여될 때 목적하거나 유익한 결과와 상관관계가 있는 것으로 결정된 투여 요법에 따른 투여에 적절한 단위 투여량(또는 이의 전체 분획)이다. 대상에게 투여되는 치료용 조성물 또는 작용제의 총량은 한 명 이상의 의사에 의해 결정되고, 하나 초과의 투여형의 투여를 포함할 수 있다.
"투여 요법"이라는 용어는, 대상에게 개별적으로 투여되는 하나 이상의 단위 용량의 세트를 나타내는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 주어진 치료제는 1회 이상의 용량을 포함할 수 있는 권장 투여 요법을 갖는다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 각각의 용량이 다른 용량과 시간상 분리되어 있는 다회 용량을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 다회 용량을 포함하고, 연속된 용량은 동일한 길이의 기간에 의해 서로 분리되며; 일부 구현예에서, 투여 요법은 다회 용량을 포함하고, 연속된 용량은 적어도 2가지 상이한 길이의 시간에 의해 서로 분리된다. 일부 구현예에서, 투여 요법 내 모든 용량은 동일한 단위 용량을 갖는다. 일부 구현예에서, 투여 요법 내 상이한 용량은 상이한 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 투여, 이어서 제1 투여량과 상이한 제2 투여량의 1회 이상의 추가 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여 요법은 목적하거나 유익한 결과를 달성하도록 주기적으로 조정된다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용의 생물학적 결과를 나타낸다. 이펙터 기능은, 비제한적으로, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개 포식작용(ADCP) 및 보체 매개 세포독성(CMC)을 포함한다. 이펙터 기능은 항원 결합 의존적, 항원 결합 독립적 또는 둘 모두일 수 있다. ADCC는 면역 이펙터 세포에 의한 항체 결합된 표적세포의 용해를 나타낸다. 임의의 이론에 구애됨 없이, ADCC는 일반적으로 Fc 수용체(FcR) 보유 이펙터 세포를 인식하고, 이어서 항체 코팅된 표적세포(예를 들어, 항체가 결합된 표면 항원 상에서 발현하는 세포)를 사멸시키는 것을 포함하는 것으로 이해된다. ADCC를 매개하는 이펙터 세포는, 비제한적으로, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호중구, 호산구 중 하나 이상을 포함하는 면역세포를 포함할 수 있다.
"이펙터 세포"는, 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 이펙터 세포는, 비제한적으로, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상세포, 호산구, 비만세포, 혈소판, 거대 과립 림프구, 랑게르한스세포(Langerhans' cell), 자연 살해(NK) 세포, T-림프구 및 B-림프구 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이펙터 세포는, 비제한적으로, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체의 것일 수 있다.
"부형제"라는 용어는, 예를 들어 목적하는 점조도 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 작용제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 적합한 부형제는, 예를 들어 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 물질 또는 개체의 "단편" 또는 "부분"은 전체, 예를 들어 물리적 개체 또는 추상적 개체의 개별 부분을 포함하는 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 단편에는 전체에서 발견되는 모이어티가 하나 이상 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조 요소, 도메인 또는 모이어티를 포함하거나 이로 이루어져 있다. 일부 구현예에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 단량체 단위(예를 들어, 잔기) 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개 또는 그 이상을 포함하거나 이로 이루어져 있다. 일부 구현예에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 단량체 단위(예를 들어, 잔기)(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 또는 95% 내지 100%)의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 포함하거나 이로 이루어져 있다. 전체 물질 또는 개체는 일부 구현예에서 단편의 "모체"로 지칭될 수 있다.
"융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질"이라는 용어는, 일반적으로 적어도 2개의 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 일반적으로, 적어도 2개의 이러한 분절을 함유하는 폴리펩타이드는, 2개의 분절이 (1) 동일한 펩타이드에 자연적으로 포함되어 있지 않고/않거나, (2) 이전에 단일 폴리펩타이드에서 서로 결합 또는 연결되지 않았고/않았거나, (3) 인간의 손의 작용을 통해 서로 결합 또는 연결된 모이어티인 경우, 융합 폴리펩타이드인 것으로 간주된다.
"단리된"이라는 용어는, (1) 이전에 회합되었거나 다르게는 회합되었을 수 있는 적어도 일부 구성요소에서 분리된 물질, 및/또는 (2) 하나 이상의 공지되거나 공지되지 않은 오염물을 제한된 또는 정의된 양 또는 농도로 포함하는 조성물에 존재하는 물질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단리된 물질은, 해당 물질과 이전에 회합되었던 다른 비(非)물질 구성요소, 예를 들어 해당 물질과 이전에 회합되었거나 다르게는 회합되었을 수 있는 다른 구성요소 또는 오염물의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)로부터 분리될 수 있다. 특정 예에서, 물질은, 이것이 동일하거나 유사한 유형의 분자를 제한되거나 감소된 양 또는 농도로 포함하는 조성물에 존재하는 경우, 단리된 것이다. 예를 들어, 특정 예에서, 핵산, DNA 또는 RNA 물질은, 이것이 비물질 핵산, DNA 또는 RNA 분자를 제한되거나 감소된 양 또는 농도로 포함하는 조성물에 존재하는 경우, 단리된 것이다. 예를 들어, 특정 예에서, 폴리펩타이드 물질은, 이것이 비물질 폴리펩타이드 분자를 제한되거나 감소된 양 또는 농도로 포함하는 조성물에 존재하는 경우, 단리된 것이다. 특정 구현예에서, 양은, 예를 들어 조성물에 존재하는 목적하는 물질의 양을 기준으로 측정된 양일 수 있다. 특정 구현예에서, 제한된 양은 조성물 내 물질의 양의 100% 이하, 예를 들어 조성물 내 물질의 양(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이하인 양일 수 있다. 특정 예에서, 조성물은 선택된 물질에 대해 순수하거나 실질적으로 순수하다. 일부 구현예에서, 단리된 물질은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과(예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)의 순도를 갖는다. 다른 구성요소 또는 오염물이 실질적으로 없는 경우, 물질은 "순수"하다. 일부 구현예에서, 물질은, 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정한 다른 구성요소와 조합된 후에도 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있으며; 이러한 구현예에서, 물질의 단리% 또는 순도는 이러한 담체 또는 부형제가 포함되지 않은 것으로 계산된다.
"핵산"은 뉴클레오타이드의 임의의 중합체 사슬을 나타낸다. 핵산은 DNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원에서의 단리, 상보적 주형을 기반으로 한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 번식, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 20개, 225개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개 또는 그 이상의 잔기 길이(예를 들어, 20개 내지 100개, 20개 내지 500개, 20개 내지 1000개, 20개 내지 2000개, 또는 20개 내지 5000개 또는 그 이상의 잔기)이다. 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일가닥이고; 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중가닥이다. 일부 구현예에서 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 보체이거나, 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
"작동 가능하게 연결된"은, 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계에 있는 근접위치(juxtaposition)를 나타낸다. 예를 들어, 기능적 요소에 "작동 가능하게 연결된" 제어 요소는, 기능적 요소의 발현 및/또는 활성이 제어 요소와 상용 가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 회합된다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는, 수용체에게 투여될 때, 수용체에게 유해하지 않거나, 수용체에게 유익한 효과가 임의의 유해한 효과를 능가하는 분자 또는 조성물을 나타낸다. 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 제형화하는 데 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 관련하여, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 조성물의 다른 성분과 상용 가능해야 하고, 이의 수용체에게 유해하지 않거나, 수용체에게 유익한 효과가 임의의 유해한 효과를 능가해야 한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는, 신체의 한 부분에서 또 다른 부분으로(예를 들어, 한 기관에서 또 다른 기관으로) 작용제를 운반하거나 수송하는 데 관여하는, 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡술화 물질을 의미한다. 약학적 조성물에 존재하는 각각의 담체는, 제형의 다른 성분과 상용 가능하고 환자에게 유해하지 않다는 점에서나, 또는 이의 수용자에게 유익한 효과가 임의의 유해한 효과를 능가한다는 점에서, "허용 가능"해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는, 하기를 포함한다: 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분류; 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말화된 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터 및 좌제용 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올류; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르류; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 무발열원수; 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르류, 폴리카르보네이트류 및/또는 폴리무수물류; 및 약학적 제형에 이용되는 다른 비(非)독성의 상용성 물질.
"약학적 조성물"이라는 용어는, 활성제가 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 조성물을 나타낸다. 일부 구현예에서, 활성제는, 관련 대상 또는 집단에 투여될 때, 선결된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의미한 확률을 나타내는 치료 요법에서 투여에 적절한 단위 용량으로 존재한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은, 비제한적으로, 하기에 적합한 형태를 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제형화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어 드렌치(drench)(수성 또는 비(非)수성 용액 또는 현탁액), 정제(예를 들어 협측, 설하 및 전신 흡수를 목적으로 하는 것들), 볼루스, 분말, 과립, 혀 도포용 페이스트; 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속 방출형 제형; 국소 적용, 예를 들어 크림, 연고, 또는 피부, 폐 또는 구강에 도포되는 제어 방출형 패치 또는 스프레이; 질내 또는 직장내, 예를 들어 패서리, 크림 또는 발포체; 설하; 안구; 경피; 또는 비강, 폐 및 다른 점막 표면.
"참조(기준)"라는 용어는 비교가 수행되는 표준 또는 대조군을 설명한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 관심 작용제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은, 특정 작용제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값인 참조 또는 대조군과 비교된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 관심 시험, 측정 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험, 측정 및/또는 결정된다. 일부 구현예에서, 참조 또는 대조군은 선택적으로 유형 매체에서 구현된 역사적 참조 또는 대조군이다. 일반적으로, 참조 또는 대조군은 평가되는 것과 유사한 조건 또는 환경 하에서 결정되거나 특징분석된다. 선택된 참조 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 이와의 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재한다.
본 개시내용은, 명시적으로 달리 제시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 화학, 생화학, 유기화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포생물학 방법을 이용할 수 있으며, 이들 중 다수는 예시의 목적으로 하기에 기재되어 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]; 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985)]; 문헌[Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)]; 문헌[Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)]; 문헌[Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998)]; 문헌[Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)]; Annual Review of Immunology 및 Advances in Immunology와 같은 저널의 전공논문 참조.
본 개시내용은 TME에서 TGF-β의 면역억제 효과를 저해하도록 설계된 우성 음성 TGF-β 수용체의 조작된 구조체를 설명한다. 이러한 구조체는 또한 사이토카인 신호전달을 자극하여 TME에서 T세포 기능을 증강시킬 수 있다. 본원에 기재된 구조체는 TGF-β 유도 면역억제를 저해하기 위해 단독으로, 서로 조합으로 및/또는 다른 면역요법과 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 개시된 조작된 우성 음성 TGF-β 수용체는 본원에 제공된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
야생형 TGF-β 수용체 유형 I(TGF-βRI)은 세포내 억제성 pSMAD 신호전달 스킴을 전달하는 TGF-β 수용체 복합체의 일부이다. TGF-βRI의 전장 야생형 핵산 서열은 서열번호 1에 제시된 바와 같이 1509개 뉴클레오타이드 길이이다.
ATGGAGGCGGCGGTCGCTGCTCCGCGTCCCCGGCTGCTCCTCCTCGTGCTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTCCCGGGGGCGACGGCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTACAAAAGACAATTTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACAGACAAAGTTATACACAACAGCATGTGTATAGCTGAAATTGACTTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGTGCACCCTCTTCAAAAACTGGGTCTGTGACTACAACATATTGCTGCAATCAGGACCATTGCAATAAAATAGAACTTCCAACTACTGTAAAGTCATCACCTGGCCTTGGTCCTGTGGAACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAGTGTGCTTCGTCTGCATCTCACTCATGTTGATGGTCTATATCTGCCACAACCGCACTGTCATTCACCATCGAGTGCCAAATGAAGAGGACCCTTCATTAGATCGCCCTTTTATTTCAGAGGGTACTACGTTGAAAGACTTAATTTATGATATGACAACGTCAGGTTCTGGCTCAGGTTTACCATTGCTTGTTCAGAGAACAATTGCGAGAACTATTGTGTTACAAGAAAGCATTGGCAAAGGTCGATTTGGAGAAGTTTGGAGAGGAAAGTGGCGGGGAGAAGAAGTTGCTGTTAAGATATTCTCCTCTAGAGAAGAACGTTCGTGGTTCCGTGAGGCAGAGATTTATCAAACTGTAATGTTACGTCATGAAAACATCCTGGGATTTATAGCAGCAGACAATAAAGACAATGGTACTTGGACTCAGCTCTGGTTGGTGTCAGATTATCATGAGCATGGATCCCTTTTTGATTACTTAAACAGATACACAGTTACTGTGGAAGGAATGATAAAACTTGCTCTGTCCACGGCGAGCGGTCTTGCCCATCTTCACATGGAGATTGTTGGTACCCAAGGAAAGCCAGCCATTGCTCATAGAGATTTGAAATCAAAGAATATCTTGGTAAAGAAGAATGGAACTTGCTGTATTGCAGACTTAGGACTGGCAGTAAGACATGATTCAGCCACAGATACCATTGATATTGCTCCAAACCACAGAGTGGGAACAAAAAGGTACATGGCCCCTGAAGTTCTCGATGATTCCATAAATATGAAACATTTTGAATCCTTCAAACGTGCTGACATCTATGCAATGGGCTTAGTATTCTGGGAAATTGCTCGACGATGTTCCATTGGTGGAATTCATGAAGATTACCAACTGCCTTATTATGATCTTGTACCTTCTGACCCATCAGTTGAAGAAATGAGAAAAGTTGTTTGTGAACAGAAGTTAAGGCCAAATATCCCAAACAGATGGCAGAGCTGTGAAGCCTTGAGAGTAATGGCTAAAATTATGAGAGAATGTTGGTATGCCAATGGAGCAGCTAGGCTTACAGCATTGCGGATTAAGAAAACATTATCGCAACTCAGTCAACAGGAAGGCATCAAAATG
(서열번호 1).
TGF-βRI의 전장 야생형 아미노산(aa) 서열은 서열번호 2에 제시된 바와 같이 503개 아미노산들이다. 서열번호 2의 전장 TGF-βRI 폴리펩타이드는 (대략 아미노산 1번 내지 33번에 있는) 신호 펩타이드, (대략 아미노산 34번 내지 126번에 있는) 세포외 도메인, (대략 아미노산 127번 내지 147번에 있는) 막관통 도메인 및 (대략 아미노산 148번 내지 503번에 있는) 세포내 도메인를 포함한다. 세포내 도메인은 TGF-βRI의 세포내 도메인의 아미노산 185번 내지 204번 사이에 위치한 4개의 핵심 트레오닌 부위를 포함하고, pSMAD 신호전달을 개시한다.
MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYICHNRTVIHHRVPNEEDPSLDRPFISEGTTLKDLIYDMTTSGSGSGLPLLVQRTIARTIVLQESIGKGRFGEVWRGKWRGEEVAVKIFSSREERSWFREAEIYQTVMLRHENILGFIAADNKDNGTWTQLWLVSDYHEHGSLFDYLNRYTVTVEGMIKLALSTASGLAHLHMEIVGTQGKPAIAHRDLKSKNILVKKNGTCCIADLGLAVRHDSATDTIDIAPNHRVGTKRYMAPEVLDDSINMKHFESFKRADIYAMGLVFWEIARRCSIGGIHEDYQLPYYDLVPSDPSVEEMRKVVCEQKLRPNIPNRWQSCEALRVMAKIMRECWYANGAARLTALRIKKTLSQLSQQEGIKM
(서열번호 2).
세포내 신호전달 캐스케이드를 개시하는 이의 역할로 인해, 변형된 TGF-βRI 구조체는 잠재적인 치료 표적이 될 수 있다. 임의의 이론에 구애됨 없이, 우성 음성 TGF-βRI 구조체가 인산화 캐스케이드를 저해하여 T세포 기능에 대한 TGF-β의 면역억제 효과를 제한하도록 설계될 수 있다고 가정된다. 인산화를 억제하거나 감소시켜 비(非)기능적 신호전달 경로를 초래하도록 하는 임의의 절단 또는 변경이 본 개시내용에 의해 고려된다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은, 폴리펩타이드에 신호전달과 인산화를 담당하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여되어 야생형 수용체와 비교하여 비기능적 신호전달 경로를 초래하도록, 막관통 도메인 이후 절단되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, DN TGF-βRI은 서열번호 2의 세포내 도메인의 아미노산 185번에서 트레오닌 앞에서 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, DN TGF-βRI은 세포내 도메인이 없도록 절단될 수 있다. 다른 구현예에서, DN TGF-βRI은 세포내 도메인을, 인산화 신호전달에 관여하는 아미노산 잔기를 포함하지 않는 또 다른 천연 또는 비자연발생 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 인산화 활성을 감소시키는 방식으로 절단되거나 변형된다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 인산화 신호전달 분자가 pSMAD 분자와 상호작용하는 것을 저해하는 방식으로 절단되거나 변형된다. 본 개시내용은 야생형 TGF-βRI의 세포내 도메인의 인산화 신호전달에 관여하는 아미노산을 제거하도록 조작된, 절단된 우성 음성 TGF-βRI 구조체(DN TGF-βRI)를 설명한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, DN TGF-βRI은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는, TGF-β에의 결합을 위한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEL
(서열번호 3).
일부 구현예에서, 서열번호 3과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 DN TGF-βRI 세포외 리간드 결합 도메인은, 하나 이상의 이종 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다. DN TGF-βRI의 세포외 도메인은 TGF-βRII와 DN TGF-βRI의 복합체의 올리고머화를 개시하기 위해, 표적 TGF-β 분자를 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다. 나아가, 본 개시내용은 형질전환 성장인자 β 유형 I(TGF-β1), 형질전환 성장인자 β 유형 II(TGF-β2), 형질전환 성장인자 β 유형 III(TGF-β3) 및 형질전환 성장인자 β 유형 IV(TGF-β4)를 포함하는 모든 TGF-β 이소형(isoform)에 대한 DN TGF-βRI의 결합을 고려한다. 일부 구현예에서, DN TGF-βRI은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 및/또는 TGF-β4에 결합하도록 조작될 수 있다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은 TGF-β1에 결합한다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRI은 막관통 도메인에 융합된 세포외 결합 도메인을 포함한다. DN TGF-βRI은 야생형 TGF-βRI 막관통 도메인 또는 이의 일부와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 막관통 도메인은 야생형 TGF-βRI 막관통 도메인인 서열번호 4와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. AAVIAGPVCFVCISLMLMVYI (서열번호 4). 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 본원에 기재된 다양한 막관통 도메인 중 임의의 것을 포함하는 이종 막관통 도메인이다. DN TGF-βRI의 막관통 도메인은 일반적으로 막의 적어도 일부에 걸쳐있고, DN TGF-βRI을 세포막에 고정시키는 것을 돕고, DN TGF-βRI 구조체의 이량체화를 촉진시키는 소수성 알파 나선을 포함한다. DN TGF-βRI의 막관통 도메인은, TGF-β 결합 후, DN TGF-βRI을 통해 세포내 신호가 세포에서 전달되지 않도록 설계될 수 있다. 비제한적인 예로서, DN TGF-βRI의 막관통 도메인은 본원에 개시된 다른 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 갖는, 면역세포 또는 이의 전구세포에서 발현되는 임의의 또 다른 폴리펩타이드에서 유도될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 T세포에서 자연적으로 발현되거나 자연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드에서 유도될 수 있다. 폴리펩타이드의 막관통 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 부분은, 목적하는 경우, 폴리펩타이드로부터의 추가의 서열, 예를 들어 막관통 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 인접한 추가의 서열, 또는 폴리펩타이드의 다른 영역을 포함할 수 있다고 이해된다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은, 비제한적인 예로서, TGF-βRI, TGF-βRII, PDGFR, CD4, CD8, CD28, CD127, CD132, CD3ζ, 4-IBB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, IL-5, IL-7, IL-7Rα, BTLA 또는 이의 돌연변이체에서 유도된 막관통 도메인을 가질 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은 세포외 리간드 결합 도메인과, 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYI
(서열번호 5).
본원에 기재된 DN TGF-βRI 구조체는 임의의 적합한 세포내 도메인 또는 이의 일부와 함께, 또는 세포내 도메인 없이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRI은 세포내 도메인에 추가로 융합된 막관통 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 야생형 TGF-βRI의 세포내 도메인은 pSMAD2/3 활성화를 통해 T세포 기능을 저해하는 인산화 신호전달이 발생하는 곳이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 DN TGF-βRI은 세포의 세포내 신호전달이 감소되거나 저해되도록, 서열번호 2의 아미노산 147번 이후에 절단된 세포내 도메인을 포함한다.
이러한 절단은 수용체 단백질의 길이를 감소시키고, T세포 억제를 초래할 수 있는 인산화 캐스케이드를 저해하는 우성 음성 효과를 유도한다. 그 결과, DN TGF-βRI 세포내 도메인은, 수용체가 막에 고정될 수 있고 임의의 세포내 신호전달이 발생하는 것을 방지할 수 있는 한, T세포에서 자연적으로 발현되거나 자연적으로 발현되지 않는 임의의 폴리펩타이드에서 유도될 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포내 도메인은 TGF-βRI, TGF-βRII, PDGFR, CD4, CD8, CD28, CD127, CD132, CD3ζ, 4-IBB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, IL-5, IL-7, IL-7Rα, BTLA 또는 이의 돌연변이체에서 유도될 수 있다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은 서열번호 6의 세포내 도메인을 포함할 수 있다. RVNRQ (서열번호 6). 일부 구현예에서, DN TGF-βRI은 TGF-βRI의 세포외 리간드 결합 도메인, TGF-βRI의 막관통 도메인, 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 서열번호 6의 세포내 결합 도메인을 포함한다.
LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYIRVNRQ
(서열번호 7).
본원에 기재된 조작된 DN TGF-βRI은 또한 DN TGF-βRI의 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 N-말단 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이종 신호 펩타이드가 사용될 수 있다. DN TGF-βRI의 세포외 도메인은 초기 단백질을 소포체로 유도하고, 이어서 세포 표면으로 전위시키는 리더 또는 신호 펩타이드에 융합될 수 있다. 신호 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드가 세포 표면에서 발현되면, 신호 펩타이드는 일반적으로 소포체에서의 폴리펩타이드의 처리 및 세포 표면으로의 전위 동안 단백질분해에 의해 제거되는 것으로 이해된다. 따라서, DN TGF-βRI과 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 세포 표면에서 신호 펩타이드가 결여된 성숙 단백질로 발현되지만, 폴리펩타이드의 전구 형태는 신호 펩타이드를 포함한다. 임의의 적합한 신호 서열이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은 서열번호 8 또는 이의 일부와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATA (서열번호 8).
신호 펩타이드 또는 리더는 DN TGF-βRI의 글리코실화를 촉진시킬 수 있다. 신호 서열 또는 리더는 일반적으로 분비 경로로의 진입을 지시하는 새로 합성된 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 존재하는 펩타이드 서열이다. 본 개시내용에서, 신호 펩타이드는 융합 단백질로서 DN TGF-βRI의 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 연결된다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRI은 야생형 TGF-βRI과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 리간드 결합 도메인과, 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 TGF-βRI의 세포외 도메인의 N-말단에 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEL
(서열번호 9).
이러한 신호 펩타이드의 사용은 예시적인 것으로 이해된다. 당업계에 널리 공지된 임의의 적합한 신호 펩타이드를 DN TGF-βRI에 적용하여 면역세포에서 세포 표면 발현을 제공할 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩타이드의 신호 펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 유용한 신호 펩타이드는, T세포 또는 이의 전구세포에서 자연적으로 발현되는 세포 표면 단백질에서 유도될 수 있다. 따라서, 임의의 적합한 신호 펩타이드를 이용하여 DN TGF-βRI가 T세포의 세포 표면에서 발현되도록 지시할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 하나의 구현예는, 야생형 TGF-βRI과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 신호 펩타이드, 야생형 TGF-βRI과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인, TGF-βRI의 막관통 도메인, 및 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 서열번호 6의 세포내 도메인을 포함하는 조작된 DN TGF-βRI이다.
MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYIRVNRQ
(서열번호 10).
TGF-βRI에 더하여, TGF-βRII는 TGF-β 수용체 복합체의 두 번째 구성원이다. 야생형 TGF-βRI과 달리, 야생형 TGF-β 수용체 유형 II(TGF-βRII)는 구성적으로 활성이다. TGF-β 리간드의 결합 및 TGF-βRI 이량체/TGF-βRII 이량체 복합체의 형성 시, TGF-βRII의 세포질 도메인은 TGF-βRI을 인산화시킨다. 따라서, TGF-βRII는 TGF-βRI을 활성화시키고, 이어서 pSMAD 신호전달을 유도하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 개시하는 역할을 한다. TGF-βRII의 전장 야생형 핵산 서열은 서열번호 12에 제시된 바와 같이 1701개 뉴클레오타이드 길이이다.
ATGGGCAGGGGCCTGCTGAGGGGCCTGTGGCCCCTGCACATCGTGCTGTGGACCAGGATCGCCAGCACCATCCCCCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACCTGCGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCAGCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAGGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATCCTGGAGGACGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGCAGCTGCAGCAGCGACGAGTGCAACGACAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGACCTGCTGCTGGTGATCTTCCAGGTGACCGGCATCAGCCTGCTGCCCCCCCTGGGCGTGGCCATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTACAGGGTGAACAGGCAGCAGAAGCTGAGCAGCACCTGGGAGACCGGCAAGACCAGGAAGCTGATGGAGTTCAGCGAGCACTGCGCCATCATCCTGGAGGACGACAGGAGCGACATCAGCAGCACCTGCGCCAACAACATCAACCACAACACCGAGCTGCTGCCCATCGAGCTGGACACCCTGGTGGGCAAGGGCAGGTTCGCCGAGGTGTACAAGGCCAAGCTGAAGCAGAACACCAGCGAGCAGTTCGAGACCGTGGCCGTGAAGATCTTCCCCTACGAGGAGTACGCCAGCTGGAAGACCGAGAAGGACATCTTCAGCGACATCAACCTGAAGCACGAGAACATCCTGCAGTTCCTGACCGCCGAGGAGAGGAAGACCGAGCTGGGCAAGCAGTACTGGCTGATCACCGCCTTCCACGCCAAGGGCAACCTGCAGGAGTACCTGACCAGGCACGTGATCAGCTGGGAGGACCTGAGGAAGCTGGGCAGCAGCCTGGCCAGGGGCATCGCCCACCTGCACAGCGACCACACCCCCTGCGGCAGGCCCAAGATGCCCATCGTGCACAGGGACCTGAAGAGCAGCAACATCCTGGTGAAGAACGACCTGACCTGCTGCCTGTGCGACTTCGGCCTGAGCCTGAGGCTGGACCCCACCCTGAGCGTGGACGACCTGGCCAACAGCGGCCAGGTGGGCACCGCCAGGTACATGGCCCCCGAGGTGCTGGAGAGCAGGATGAACCTGGAGAACGTGGAGAGCTTCAAGCAGACCGACGTGTACAGCATGGCCCTGGTGCTGTGGGAGATGACCAGCAGGTGCAACGCCGTGGGCGAGGTGAAGGACTACGAGCCCCCCTTCGGCAGCAAGGTGAGGGAGCACCCCTGCGTGGAGAGCATGAAGGACAACGTGCTGAGGGACAGGGGCAGGCCCGAGATCCCCAGCTTCTGGCTGAACCACCAGGGCATCCAGATGGTGTGCGAGACCCTGACCGAGTGCTGGGACCACGACCCCGAGGCCAGGCTGACCGCCCAGTGCGTGGCCGAGAGGTTCAGCGAGCTGGAGCACCTGGACAGGCTGAGCGGCAGGAGCTGCAGCGAGGAGAAGATCCCCGAGGACGGCAGCCTGAACACCACCAAG
(서열번호 12).
TGF-βRII의 전장 야생형 아미노산 서열은 서열번호 13에 제시된 바와 같이 567개 아미노산이다. 서열번호 13의 전장 TGF-βRII 폴리펩타이드는 (대략 아미노산 1번 내지 22번에 있는) 신호 펩타이드, (대략 아미노산 33번 내지 170번에 있는) 세포외 도메인, (대략 아미노산 171번 내지 201번에 있는) 막관통 도메인 및 (대략 아미노산 202번 내지 567번에 있는) 세포내 도메인을 포함한다.
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK
(서열번호 13).
리간드 결합 시, 야생형 TGF-βRII의 세포내 도메인은 야생형 TGF-βRI의 세포내 도메인과의 상호작용, 야생형 TGF-βRI의 세포내 도메인의 아미노산 185번 내지 204번 사이에 위치한 4개의 핵심 트레오닌 부위의 인산화, 및 pSMAD 신호전달의 개시를 담당한다. 따라서, 임의의 이론에 구애됨 없이 및 본원에 기재된 바와 같이, 절단된 DN TGF-βRI은 TGF-βRII와 상호작용할 수 없어, pSMAD 신호전달을 억제할 수 있다고 여겨진다.
유사하게, 인산화 캐스케이드를 개시하는 DN TGF-βRI의 역할로 인해, 조작된 우성 음성 TGF-βRII(DN TGF-βRII)는 또한 인산화의 신호 개시를 담당하는 아미노산 서열을 생략하는 방식으로 DN TGF-βRI의 인산화 개시를 불가능하게 하여, pSMAD 신호전달을 또한 억제할 수 있다고 가정된다. 인산화를 억제하거나 감소시켜 비기능적 신호전달 경로를 초래하도록 하는 임의의 절단 또는 변경이 본 개시내용에 의해 고려된다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRII는, 폴리펩타이드에 신호전달과 인산화를 담당하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 결여되어 야생형 수용체와 비교하여 비기능적 신호전달 경로를 초래하도록, 막관통 도메인 이후 절단되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, DN TGF-βRII는 세포내 도메인이 없도록 절단될 수 있다. 다른 구현예에서, DN TGF-βRII는 세포내 도메인을, 인산화 신호전달에 관여하는 아미노산 잔기를 포함하지 않는 또 다른 천연 또는 비자연발생 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 인산화 활성을 감소시키는 방식으로 절단되거나 변형된다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 인산화 신호전달 분자가 pSMAD 분자와 상호작용하는 것을 저해하는 방식으로 절단되거나 변형된다. 따라서, 본원에 기재된 하나의 구현예는, 폴리펩타이드가 막관통 도메인 이후 절단되고, 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 절단된 DN TGF-βRII이다:
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQ
(서열번호 14).
본원에 기재된 일부 구현예에서, DN TGF-βRII는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는, 야생형 TGF-βRII에 대한 TGF-β의 결합을 위한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(서열번호 15)
일부 구현예에서, 서열번호 15와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 DN TGF-βRII 세포외 리간드 결합 도메인은, 하나 이상의 이종 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다. DN TGF-βRII의 세포외 도메인은 DN TGF-βRII와 야생형 TGF-βRI 또는 본원에 기재된 바와 같은 DN TGF-βRI의 복합체의 올리고머화를 개시하기 위해, 표적 TGF-β 분자를 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다. 나아가, 본 개시내용은 형질전환 성장인자 β 유형 I(TGF-β1), 형질전환 성장인자 β 유형 II(TGF-β2), 형질전환 성장인자 β 유형 III(TGF-β3) 및 형질전환 성장인자 β 유형 IV(TGF-β4)를 포함하는 모든 TGF-β 이소형에 대한 DN TGF-βRII의 결합을 고려한다. 일부 구현예에서, DN TGF-βRII는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 및/또는 TGF-β4에 결합하도록 조작될 수 있다. 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRII는 TGF-β1에 결합한다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRII는 막관통 도메인에 융합된 세포외 결합 도메인을 포함한다. DN TGF-βRII는 야생형 TGF-βRII 막관통 도메인 또는 이의 일부와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 막관통 도메인은 야생형 TGF-βRII 막관통 도메인을 포함하는 서열번호 16과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. LLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY (서열번호 16). 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 본원에 기재된 다양한 막관통 도메인 중 임의의 것을 포함하는 이종 막관통 도메인이다. DN TGF-βRII의 막관통 도메인은 일반적으로 막의 적어도 일부에 걸쳐있고, DN TGF-βRII를 막에 고정시키는 것을 돕고, DN TGF-βRII 구조체의 이량체화를 촉진시키는 소수성 알파 나선을 포함한다. DN TGF-βRII의 막관통 도메인은, TGF-β 결합 후, DN TGF-βRII를 통해 세포내 신호가 세포에서 TGF-βRI 또는 DN TGF-βRI에 전달되지 않도록 설계될 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-βRII는 세포외 리간드 결합 도메인과, 서열번호 17의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCY
(서열번호 17).
임의의 이론에 구애됨 없이, DN TGF-βRII의 막관통 도메인이 야생형 TGF-βRI 또는 DN TGF-βRI과 상호작용하여, pSMAD 신호전달을 억제하는 수용체의 능력에 영향을 미칠 수 있다고 가정된다. 막관통 도메인의 변화는 또한, pSMAD 신호전달을 억제하면서 유익한 사이토카인 발현 및 신호전달을 자극할 수 있다고 추가로 가정된다. 따라서, 비제한적인 예로서, DN TGF-βRII의 막관통 도메인은 본원에 개시된 다른 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 갖는, 면역세포 또는 이의 전구세포에서 발현되는 임의의 또 다른 폴리펩타이드에서 유도될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 T세포에서 자연적으로 발현되거나 자연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드에서 유도될 수 있다. 폴리펩타이드의 막관통 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 부분은, 목적하는 경우, 폴리펩타이드로부터의 추가의 서열, 예를 들어 막관통 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 인접한 추가의 서열, 또는 폴리펩타이드의 다른 영역을 포함할 수 있다고 이해된다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRII는, 비제한적인 예로서, TGF-βRI, TGF-βRII, PDGFR, CD4, CD8, CD28, CD127, CD132, CD3ζ, 4-IBB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, IL-5, IL-7, IL-7Rα, BTLA 또는 이의 돌연변이체에서 유도된 막관통 도메인을 가질 수 있다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, 막관통 도메인은 야생형 IL-7Rα 막관통 도메인과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. PILLTISILSFFSVALLVIL (서열번호 18). 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRII는 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 리간드 결합 도메인, 링커 서열, 및 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖고, 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVIL
(서열번호 19).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 "CPT"의 아미노산 삽입을 갖는 야생형 IL-7Rα 막관통 도메인인 서열번호 20과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. PILLTCPTISILSFFSVALLVIL (서열번호 20). 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRII는 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 리간드 결합 도메인, 링커 서열, 및 서열번호 20과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖고, 서열번호 21에 제시된 바와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVIL
(서열번호 21).
본원에 기재된 DN TGF-βRII 구조체는 그 자체로, 또는 임의의 적합한 세포내 도메인 또는 이의 일부와 함께, 또는 세포내 도메인 없이 사용될 수 있으며, 절단될 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 DN TGF-βRII 구조체는 서열번호 6과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포내 도메인을 포함한다. 비제한적인 예로서, 본원에 기재된 DN TGF-βRII 구조체의 세포외 도메인은 TGF-βRI, TGF-βRII, PDGFR, CD4, CD8, CD28, CD127, CD132, CD3ζ, 4-IBB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, IL-5, IL-7, IL-7Rα, BTLA, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 돌연변이체에서 유도될 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-βRII는 세포내 도메인에 추가로 융합된 막관통 도메인에 융합된 세포외 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 DN TGF-βRII는 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 야생형 IL-7Rα의 세포내 도메인을 포함한다.
ACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 22).
또 다른 구현예에서, DN TGF-βRII는 TGF-βRII의 야생형 세포외 도메인과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열, 링커 서열, 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖고, 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성, 예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 세포내 도메인을 포함한다.
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 23).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-βRII 구조체는 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인, 링커 서열, 서열번호 20과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖고, 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포내 도메인을 포함한다.
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 24).
본원에 기재된 조작된 DN TGF-βRII 구조체는 또한 TGF-βRII의 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 N-말단 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이종 신호 펩타이드가 사용될 수 있다. DN TGF-βRII의 세포외 도메인은 초기 단백질을 소포체로 유도하고, 이어서 세포 표면으로 전위시키는 리더 또는 신호 펩타이드에 융합될 수 있다. 신호 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드가 세포 표면에서 발현되면, 신호 펩타이드는 일반적으로 소포체에서의 폴리펩타이드의 처리 및 세포 표면으로의 전위 동안 단백질분해에 의해 제거되는 것으로 이해된다. 따라서, DN TGF-βRII와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 세포 표면에서 신호 펩타이드가 결여된 성숙 단백질로 발견되지만, 폴리펩타이드의 전구 형태는 신호 펩타이드를 포함한다. 임의의 적합한 신호 서열이 사용될 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 DN TGF-βRII 구조체는 서열번호 25의 아미노산 서열 또는 이의 일부와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 신호 서열을 포함한다. MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS (서열번호 25). 또 다른 구현예에서, 신호 서열은 서열번호 26 또는 이의 일부와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 집락자극인자 2 수용체 알파 서브유닛(CSF2Rα)에서 유도된다. MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (서열번호 26). 본원에 기재된 신호 서열은 또한 선택적으로, 비제한적으로, V5-태그, myc-태그, HA-태그, Spot-태그, NE-태그를 포함하는 임의의 적합한 단백질 태그와 함께 사용될 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 신호 서열과 태그는 서열번호 27과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDL (서열번호 27).
신호 펩타이드 또는 리더는 DN TGF-βRII의 글리코실화를 촉진시킬 수 있다. 신호 서열 또는 리더는 일반적으로 분비 경로로의 진입을 지시하는 새로 합성된 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 존재하는 펩타이드 서열이다. 본 개시내용에서, 신호 펩타이드는 융합 단백질로서 DN TGF-βRII의 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 연결된다. 하나의 구현예에서, DN TGF-βRII는 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 리간드 결합 도메인과, 서열번호 28의 아미노산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인의 N-말단에 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(서열번호 28).
하나의 구현예에서, DN TGF-βRII는 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 리간드 결합 도메인, TGF-βRII의 세포외 도메인의 N-말단에 있는 신호 펩타이드, 및 서열번호 29와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 태그 서열을 포함한다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(서열번호 29).
이러한 신호 펩타이드의 사용은 예시적인 것으로 이해된다. 당업계에 널리 공지된 임의의 적합한 신호 펩타이드를 DN TGF-βRII에 적용하여 면역세포에서 세포 표면 발현을 제공할 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩타이드의 신호 펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 유용한 신호 펩타이드는, T세포 또는 이의 전구세포에서 자연적으로 발현되는 세포 표면 단백질에서 유도될 수 있다. 따라서, 임의의 적합한 신호 펩타이드를 이용하여 DN TGF-βRII가 T세포의 세포 표면에서 발현되도록 지시할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 하나의 구현예는, 신호 펩타이드, 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인, 링커 서열, 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖고, 서열번호 30과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 세포내 도메인을 포함하는 조작된 DN TGF-βRII이다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 30).
본원에 기재된 또 다른 구현예는, 신호 펩타이드, 태그 서열, 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인, 링커 서열, 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 31과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열로 제시된 바와 같이, 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포내 도메인을 포함하는 조작된 DN TGF-βRII이다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 31).
본원에 기재된 또 다른 구현예는, 신호 펩타이드, 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인, 링커 서열, 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 32와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열로 제시된 바와 같이, 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포내 도메인을 포함하는 조작된 DN TGF-βRII이다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 32).
본원에 기재된 또 다른 구현예는, 신호 펩타이드, 태그 서열, 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 세포외 도메인, 링커 서열, 서열번호 20과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 33과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열로 제시된 바와 같이, 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 세포내 도메인을 포함하는 조작된 DN TGF-βRII이다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 33).
본원에 기재된 또 다른 구현예는, 신호 펩타이드, 야생형 TGF-βRII와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인, 링커 서열, 서열번호 20과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인, 및 서열번호 34와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열로 제시된 바와 같이, 서열번호 22와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포내 도메인을 포함하는 조작된 DN TGF-βRII이다.
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDSGPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
(서열번호 34).
조작된 T세포 수용체(TCR)와 키메라 항원 수용체(CAR) 요법은 모두 다양한 악성종양의 치료를 위해 T세포의 특이성과 면역요법 효과를 이용한다. 일부 연구는, 이러한 요법이, TGF-β에 의한 T세포 억제로 인한 TME 내 억제인자에 민감할 수 있다고 시사한다(문헌[Bendle et al., J Immunol, 191:3232-3239 (2013)] 및 문헌[Vong et al., Blood, 130:1791 (2017)]). 본 개시내용은, TGF-β 억제의 존재 하에서 TCR 및/또는 CAR 확장을 유지하거나, 일부 경우에는 이를 회복시키기 위한 방법으로서, TCR 또는 CAR 요법과 조합된 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체의 사용을 고려한다.
키메라 항원 수용체(CAR) T세포 요법은 종양 진행에 대한 또 다른 치료 접근법을 제공한다. 임상적으로, 연구자들은 CAR 확장 및 지속성이 치료 효능과 상관관계가 있다고 입증하였다. 임의의 이론에 구애됨 없이, TME에서 발견되는 TGF-β 억제된 T세포 집단이 CAR 요법에 반응하지 않는 환자에서 CAR T세포 확장 및 지속성을 제한할 수 있다고 여겨진다. TME에서 생성된 저해 사이토카인은 CAR 세포 기능 및 확장을 제한하는 것으로 여겨진다. 따라서, TGF-β는 치료용 조작된 T세포의 효능을 제한할 수 있다.
TGF-β 수용체는 세포내 억제성 pSMAD 신호전달을 담당하기 때문에, 변형된 TGF-βRI 및 TGF-βRII 구조체에 초점을 둔 치료 전략은 잠재력이 있다. 나아가, 기존 또는 신규한 TCR 및 CAR 요법에 이러한 구조체를 사용하면, 암을 표적으로 하는 이러한 세포 요법의 능력을 증강시킬 수 있다. 따라서, TGF-β 신호전달을 조절하는 데 사용될 수 있는 우성 음성 TGF-β 수용체가 본원에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 우성 음성 TGF-β 수용체는 TME에서 TGF-β의 억제 효과를 제한하기 위해 TCR 또는 CAR 구조체와 공동발현될 수 있다.
본 개시내용은, T세포 면역요법에 사용되는 조작된 T세포 수용체(TCR)와 함께 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체 구조체의 사용을 고려한다. TCR의 라이브러리를 표적 항원에 대한 선택성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원에 대해 높은 결합력과 반응성을 갖는 천연 TCR을 선택하고, 클로닝하고, 이어서 입양 면역요법에 사용되는 T세포 집단에 도입할 수 있다. 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체 구조체를 또한 발현하는 조작된 TCR을 갖는 T세포는 TCR 특이성으로 인해 특정 항원을 표적화할 수 있을 뿐 아니라, TGF-β의 억제 효과로부터 T세포를 보호할 수 있다. 따라서, TCR과 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체 구조체를 조합하면, 입양 T세포 면역요법의 치료 효과를 유지하는 방법을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 DN TGF-B 수용체는 TCR과 공동발현된다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, T세포는 표적 항원을 발현하는 종양세포에 T세포에 대한 특이성을 부여하는 TCR을 형성할 수 있는 TCR의 서브유닛을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 방식으로 변형된다. 일부 구현예에서, 서브유닛이 트랜스펙션된 T세포에 표적세포로 귀환하는 능력을 부여하는 TCR을 형성하는 능력을 유지하고, 면역학적으로 관련된 사이토카인 신호전달에 참여하는 한, 서브유닛은 자연발생 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 변경을 갖는다. 조작된 TCR은 높은 결합력으로 관련이 있는 종양 관련 펩타이드를 제시하는 표적세포에 결합할 수 있고, 선택적으로 생체내에서 관련 펩타이드를 제시하는 표적세포의 효율적인 사멸을 매개할 수 있다.
조작된 TCR을 인코딩하는 핵산은 T세포의 (자연발생) 염색체에서 자연적 맥락으로부터 단리될 수 있으며, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 적합한 벡터에 혼입될 수 있다. 핵산과 이를 포함하는 벡터는 모두 T세포일 수 있는 세포 내로 전달될 수 있다. 이어서, 변형된 T세포는 형질도입된 핵산 또는 핵산들에 의해 인코딩된 TCR의 하나 이상의 사슬(및 일부 양태에서, 2개의 사슬)을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 TCR은, 이것이 도입된 TCR을 통상적으로 발현하지 않는 T세포에 도입되기 때문에, 외인성 TCR이다. 조작된 TCR의 본질적인 양태는, 이것이 주조직적합복합체(MHC) 또는 유사한 면역학적 구성요소에 의해 제시된 종양 항원에 대해 높은 결합력을 갖는다는 점이다. 조작된 TCR과 대조적으로, CAR은 MHC 독립적 방식으로 표적 항원에 결합하도록 조작된다.
본원에 기재된 핵산에 의해 인코딩된 단백질은, 부착된 추가의 폴리펩타이드가 기능성 T세포 수용체 및 MHC 의존적 항원 인식을 형성하는 α-사슬 또는 β-사슬의 능력을 방해하지 않는 한, TCR의 α-사슬 또는 β-사슬의 아미노 말단 또는 카르복실 말단 부분에 부착된 추가의 폴리펩타이드로 발현될 수 있다.
본원에서 고려되는 조작된 TCR에 의해 인식된 항원에는, 비제한적으로, 혈액암, 고형종양 및 바이러스에 의해 유도된 암 모두에 대한 항원을 포함하는 암 항원이 포함된다. HPV에 의해 유도된 자궁경부암종의 치료를 위한 TCR 요법은 유망한 관심 분야이다. 따라서, 종양용해 단백질인 HPV-16 E6 및 HPV-16 E7은 TCR과 함께 사용하기 위한 잠재적인 표적 항원일 수 있다.
다른 예시적인 항원에는, 비제한적으로, HPV-16 E6 및 HPV-16 E7을 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸(Glypican)-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스(Lewis)-Y, 카파, 메소텔린(Mesothelin), Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈(Survivin), TAG72, TEM 및 VEGFRII가 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 TCR 구조체와 본 개시내용의 DN TGF-β 수용체를 조합하면, TGF-β 억제에 의해 방해를 받는 TCR 요법의 치료 효과를 회복, 유지 또는 증강시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-β 수용체는 HPV에 대해 지향된 TCR과 T세포에서 공동발현된다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-β 수용체는 HPV-16 E6 단백질에 대해 지향된 TCR과 T세포에서 공동발현된다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-β 수용체는 HPV-16 E7 단백질에 대해 지향된 TCR과 T세포에서 공동발현된다.
T세포는 또한 세포독성을 종양세포로 재지향시키는 CAR을 발현하도록 설계된 벡터로 유전적으로 조작될 수 있다. CAR은 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 항체 기반 특이성을 T세포 수용체 활성화 세포내 도메인과 조합하여, 특정 항종양세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다. 본원에 사용된 "키메라"라는 용어는, 기원이 다른 상이한 단백질 또는 DNA의 부분으로 구성되어 있는 것을 설명한다. 본 개시내용은 키메라 항원 수용체(CAR)와 함께 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체의 사용을 고려한다. TCR의 사용과 마찬가지로, DN TGF-β 수용체와 CAR의 공동발현은 CAR 확장을 촉진시키고, TGF-β 억제에 의해 방해를 받는 CAR 요법을 보호, 및 일부 경우에는 복원할 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, DN TGF-β 수용체는 본원에 기재된 CAR과 공동발현된다.
본원에서 고려되는 CAR은 특정 표적 항원(결합 도메인 또는 항원 특이적 결합 도메인으로도 지칭됨)에 결합하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. CAR의 주요 특징은, 면역 이펙터 세포 특이성을 재지향시켜, 증식, 사이토카인 생산, 포식작용, 또는 주조직적합복합체(MHC) 독립적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자의 생산을 촉발시키고, 단클론 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공동수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 이용하는 이의 능력이다.
일부 구현예에서, CAR은, 비제한적으로, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 테더링된(tethered) 리간드, 또는 공동수용체의 세포외 도메인을 포함하는, 세포외 결합 도메인을 포함한다.
비제한적인 예로서, 표적 항원은 다음을 포함할 수 있다: HPV-16 E6 및 HPV-16 E7을 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TAG72, TEM 및 VEGFRII; 하나 이상의 힌지 도메인 또는 스페이서 도메인; 비제한적으로, CD8α, CD4, CD45, PD-1 및 CD152로부터의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 비제한적으로, CD28, CD54(ICAM), CD134(OX40), CD137(41BB), CD152(CTLA4), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1) 및 CD278(ICOS)로부터의 세포내 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 공동자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 또는 FcRγ로부터의 1차 신호전달 도메인. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, CAR은 CLL-1, CD19, CD20, CD28, CD137(4-1BB), 글리피칸-3(GPC3), PSCA 또는 PSMA를 포함하는 종양 항원에 결합한다.
힌지는 천연 공급원 또는 합성 공급원에서 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항원 결합 시스템은, CD2, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD4, CD7, CD8.알파., CD8.베타., CD11a(ITGAL), CD11b(ITGAM), CD11c(ITGAX), CD11d(ITGAD), CD18(ITGB2), CD19(B4), CD27(TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29(ITGB1), CD30(TNFRSF8), CD40(TNFRSF5), CD48(SLAMF2), CD49a(ITGA1), CD49d(ITGA4), CD49f(ITGA6), CD66a(CEACAM1), CD66b(CEACAM8), CD66c(CEACAM6), CD66d(CEACAM3), CD66e(CEACAM5), CD69(CLEC2), CD79A(B세포 항원 수용체 복합체 관련 알파 사슬), CD79B(B세포 항원 수용체 복합체 관련 베타 사슬), CD84(SLAMF5), CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103(ITGAE), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD158A(KIR2DL1), CD158B1(KIR2DL2), CD158B2(KIR2DL3), CD158C(KIR3DP1), CD158D(KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2(KIR2DL5B), CD158K(KIR3DL2), CD160(BY55), CD162(SELPLG), CD226(DNAM1), CD229(SLAMF3), CD244(SLAMF4), CD247(CD3-제타), CD258(LIGHT), CD268(BAFFR), CD270(TNFSF14), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD279(PD-1), CD314(NKG2D), CD319(SLAMF7), CD335(NK-p46), CD336(NK-p44), CD337(NK-p30), CD352(SLAMF6), CD353(SLAMF8), CD355(CRTAM), CD357(TNFRSF18), 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), LFA-1(CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80(KLRF1), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, LFA1-1, SLAMF9, LAT, GADS(GrpL), SLP-76(LCP2), PAG1/CBP, CD83 리간드, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 1 분자, MHC 클래스 2 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 활성화 NK세포 수용체 또는 Toll 리간드 수용체이거나, 이에서 유래하거나 또는 이에서 유도된(예를 들어, 이의 전부 또는 단편을 포함하는), 또는 이들의 단편 또는 조합인 힌지를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 CD28 힌지를 포함하지 않는다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원에서 유도될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막결합 또는 막관통 단백질에서 유도될 수 있다. 예시적인 막관통 도메인은 T세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD3 델타, CD3 감마, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD8 알파, CD8베타, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD22, CD27, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, TNFSFR25, CD154, 4-1BB/CD137, 활성화 NK세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD276(B7-H3), CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD84, CD96(Tactile), CDS, CEACAM1, CRTAM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD1-1a/CD18), MHC 클래스 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절단물 또는 조합에서 유도될 수 있다(예를 들어, 적어도 이의 막관통 도메인을 포함할 수 있다). 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있다(및, 예를 들어 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다). 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각 말단에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포질 도메인에 직접 결합 또는 연결된다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커(예를 들어, 2개 내지 10개 아미노산 길이)가 막관통 도메인과 세포내 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신-세린 이중체이다.
일부 구현예에서, 신호전달 도메인 및/또는 활성화 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유도된 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Love et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010)]; 문헌[Smith-Garvin et al., Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)] 참조).
특정 구현예에서, 적합한 신호전달 도메인은, 비제한적으로, 4-1BB/CD137, 활성화 NK세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8알파, CD8베타, CD96(Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRTAM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), Ly108, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD1-1a/CD18), MHC 클래스 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절단물 또는 조합을 포함한다.
CAR은, 예를 들어 신호전달 능력을 증가시키기 위해 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호뿐 아니라, 문헌[Krause et al. and Finney et al. (상기 참조)], 문헌[Song et al., Blood 119:696-706 (2012)]; 문헌[Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011)]; 문헌[Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)] 및 문헌[Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)]를 참조한다. TCR만을 통해 생성된 신호는 T세포의 완전 활성화에 충분하지 않을 수 있으며, 2차 또는 공동자극 신호가 활성화를 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 신호전달 도메인은 하나 이상의 면역세포 이펙터 기능(예를 들어, 본원에 기재된 천연 면역세포 이펙터 기능)을 활성화시키는 하나 이상의 추가 신호전달 도메인(예를 들어, 공동자극 신호전달 도메인)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 공동자극 신호전달 도메인의 일부는, 이들이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포질 도메인은 T세포 공동수용체(또는 이의 단편)의 하나 이상의 세포질 서열을 포함한다. 이러한 T세포 공동수용체의 비제한적인 예는, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), MYD88, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 결합하는 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR은 표적 폴리펩타이드, 예를 들어 종양세포에서 발현되는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인", "항원 특이적 결합 도메인", "항원 결합 도메인" 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR을 제공한다. 결합 도메인은 생물학적 분자(예를 들어, 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 지질, 다당류 또는 다른 세포 표면 표적 분자, 또는 이의 구성요소)를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 관심 생물학적 분자에 대한 임의의 자연발생, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생산된 결합 파트너를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 표적 항원의 에피토프, 예컨대 면역세포에 의해 인식되는 것과 같은 항원 결정기를 함유하는 펩타이드, 지질, 다당류 또는 핵산을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는, 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 결합제를 나타낸다. 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한, 키메라 항체(예를 들어, 인간화 쥣과 항체), 이종접합체 항체(예컨대, 이중특이적 항체) 및 이들의 항원 결합 단편과 같은 유전적으로 조작된 형태도 포함한다. 또한, 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)]; 문헌[Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997]을 참조한다.
일부 구현예에서, 표적 항원은, HPV-16 E6 및 HPV-16 E7 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TAG72, TEM, 및 VEGFRII 폴리펩타이드의 에피토프이다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, CAR은 CD19, CD20, CD28, CD137(4-1BB), CLL-1, 글리피칸-3(GPC3), PSCA 또는 PSMA를 포함하는 종양 항원 에피토프에 결합한다.
간세포암종(HCC)은 전세계적으로 가장 흔한 암 중 하나이다(문헌[El-Serag, J Clin Gastroenterology 35:S72-78 (2002)]). 현재까지 간세포암종과 관련된 임의의 다른 종양 항원과 달리, GPC3은 항체 유도 요법에 매력적인 거대 세포외 도메인을 갖는 글리코포스파티딜이노시톨 연결 막관련 단백질이다. 따라서, 악성 HCC 조직의 세포 표면에서의 GPC3의 상대적인 특이적 발현 및 거대 세포외 도메인은, GPC3을 HCC 종양 면역요법에 매력적인 표적으로 만든다. 따라서, 본 개시내용에 의해 고려되는 하나의 구현예는, 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체와 함께 사용하기 위한 GPC3에 대해 지향된 CAR이다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, CAR은 서열번호 37과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSSGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(서열번호 37).
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 어느 한 방향으로 존재한다(예를 들어, VL-VH 또는 VH-VL). 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는, scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Pluckthin, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]를 참조한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 38과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 VH 도메인을 포함한다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSS
(서열번호 38).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 39와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIK
(서열번호 39).
일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR은 암세포에서 발현되는 항원에 결합하는 scFv(쥣과, 인간 또는 인간화 scFv)일 수 있는 항원 특이적 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, scFv는 HPV-16 E6 및 HPV-16 E7을 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TAG72, TEM 및 VEGFRII에 결합한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, CAR은 CD19, CD20, CD28, CD137(4-1BB), CLL-1, 글리피칸-3(GPC3), PSCA 또는 PSMA에 결합하는 항원 특이적 결합 도메인 scFv를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR은 분자의 적절한 간격 입체형태를 위해 추가된, 다양한 도메인 사이, 예를 들어 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 링커 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 CAR은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개, 또는 그 초과의 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 길이는 약 1개 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 20개 아미노산, 또는 임의의 사이 길이의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 그 이상의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예에는, 글리신 중합체(G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커가 포함된다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되어 있지 않기 때문에, 본원에 기재된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인 사이에서 중성 테더(tether)로 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 더 넓은 파이(phi)-프사이(psi) 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 본원에서 고려되는 다른 링커에는 Whitlow 링커가 포함된다(예를 들어, 문헌[Whitlow, Protein Eng. 6(8): 989-95 (1993)] 참조). 당업자는, 링커가 목적하는 CAR 구조를 제공하기 위해 가요성 링커뿐 아니라, 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 일부 구현예에서, CAR의 설계가 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 구조체 중 임의의 것은 "GS" 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 구조체 중 임의의 것은 "GSG" 링커를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 40과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호 40).
다른 구현예에서, CAR은 가변 영역 연결 서열을 추가로 포함하는 scFv를 포함한다. "가변 영역 연결 서열"은, 중쇄 가변 영역을 경쇄 가변 영역에 연결하고, 생성된 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 유지하도록 2개의 하위 결합 도메인의 상호작용과 양립 가능한 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열이다. 하나의 구현예에서, 가변 영역 연결 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 그 이상의 아미노산 길이이다.
다른 구현예에서, CAR의 결합 도메인 다음에는, 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 이동시키는 영역을 나타내는 하나 이상의 "스페이서 도메인"이 뒤따른다(문헌[Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419]). 스페이서 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원에서 유도될 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서 도메인은, 비제한적으로, 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH2 및 CH3을 포함하는 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 자연발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CAR의 결합 도메인 다음에는, 일반적으로 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 배치시키는 역할을 하는 하나 이상의 "힌지 도메인"이 뒤따를 수 있다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원에서 유도될 수 있다. 힌지 도메인은 자연발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 CAR에 사용하기에 적합한 예시적인 힌지 도메인에는, CD8α, CD4, CD28 및 CD7과 같은 유형 1 막단백질의 세포외 영역에서 유도된 힌지 영역이 포함되며, 이는 이러한 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나, 변경된, 예를 들어 절단된 CD28 힌지 도메인일 수 있다. 힌지는 천연 공급원 또는 합성 공급원에서 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항원 결합 시스템은, CD2, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD4, CD7, CD8.알파., CD8.베타., CD11a(ITGAL), CD11b(ITGAM), CD11c(ITGAX), CD11d(ITGAD), CD18(ITGB2), CD19(B4), CD27(TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29(ITGB1), CD30(TNFRSF8), CD40(TNFRSF5), CD48(SLAMF2), CD49a(ITGA1), CD49d(ITGA4), CD49f(ITGA6), CD66a(CEACAM1), CD66b(CEACAM8), CD66c(CEACAM6), CD66d(CEACAM3), CD66e(CEACAM5), CD69(CLEC2), CD79A(B세포 항원 수용체 복합체 관련 알파 사슬), CD79B(B세포 항원 수용체 복합체 관련 베타 사슬), CD84(SLAMF5), CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103(ITGAE), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD158A(KIR2DL1), CD158B1(KIR2DL2), CD158B2(KIR2DL3), CD158C(KIR3DP1), CD158D(KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2(KIR2DL5B), CD158K(KIR3DL2), CD160(BY55), CD162(SELPLG), CD226(DNAM1), CD229(SLAMF3), CD244(SLAMF4), CD247(CD3-제타), CD258(LIGHT), CD268(BAFFR), CD270(TNFSF14), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD279(PD-1), CD314(NKG2D), CD319(SLAMF7), CD335(NK-p46), CD336(NK-p44), CD337(NK-p30), CD352(SLAMF6), CD353(SLAMF8), CD355(CRTAM), CD357(TNFRSF18), 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), LFA-1(CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80(KLRF1), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, LFA1-1, SLAMF9, LAT, GADS(GrpL), SLP-76(LCP2), PAG1/CBP, CD83 리간드, Fc 감마 수용체, MHC 클래스 1 분자, MHC 클래스 2 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 활성화 NK세포 수용체 또는 Toll 리간드 수용체이거나, 이에서 유래하거나 또는 이에서 유도된(예를 들어, 이의 전부 또는 단편을 포함하는), 또는 이들의 단편 또는 조합인 힌지를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 CD28 힌지를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서 본원에 기재된 CAR은 서열번호 41과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD8α로부터의 힌지 도메인을 포함한다. TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (서열번호 41).
"막관통 도메인"은 세포외 결합 부분과 세포내 신호전달 도메인을 융합시키고, CAR을 면역 이펙터 세포의 원형질막에 고정시키는 CAR의 부분이다. 예시적인 막관통 도메인은 T세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD3 델타, CD3 감마, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD8 알파, CD8베타, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD22, CD27, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, TNFSFR25, CD154, 4-1BB/CD137, 활성화 NK세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD276(B7-H3), CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD84, CD96(Tactile), CDS, CEACAM1, CRTAM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD1-1a/CD18), MHC 클래스 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절단물 또는 조합에서 유도될 수 있다(예를 들어, 적어도 이의 막관통 도메인을 포함할 수 있다). 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있다(및, 예를 들어 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다). 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각 말단에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포질 도메인에 직접 결합 또는 연결된다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커(예를 들어, 2개 내지 10개 아미노산 길이)가 막관통 도메인과 세포내 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신-세린 이중체이다. 하나의 구현예에서 본원에 기재된 CAR은 서열번호 42와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD8α로부터의 막관통 도메인을 포함한다. IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (서열번호 42).
일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은, 이펙터 세포 기능, 예를 들어 활성화, 사이토카인 생산, 증식, 및 CAR 결합된 표적세포로의 세포독성 인자의 방출을 포함하는 세포독성 활성, 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합으로 유도된 다른 세포 반응을 유도하기 위해, 표적 항원에 대한 효과적인 CAR 결합의 메시지를 면역 이펙터 세포의 내부로 전달하는 데 참여하는 CAR의 부분을 나타낸다. 일부 구현예에서, 신호전달 도메인 및/또는 활성화 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유도된 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Love et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010)]; 문헌[Smith-Garvin et al., Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)] 참조). 특정 구현예에서, 적합한 신호전달 도메인은, 비제한적으로, 4-1BB/CD137, 활성화 NK세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8알파, CD8베타, CD96(Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRTAM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), Ly108, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD1-1a/CD18), MHC 클래스 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절단물 또는 조합을 포함한다.
"이펙터 기능"이라는 용어는, 세포의 특수한 기능을 나타낸다. T세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 세포용해 활성, 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 활성 또는 도움일 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는, 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 나타낸다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 다수의 경우, 전체 도메인을 사용할 필요가 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 경우, 절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 전체 도메인 대신 이러한 절단된 부분이 사용될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인이라는 용어는, 이펙터 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
TCR을 통해 생성된 신호만으로는 T세포의 완전한 활성화에 충분하지 않으며, 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요할 수 있다고 공지되어 있다. 따라서, T세포 활성화는 2가지 별개 부류의 세포내 신호전달 도메인, 즉, TCR을 통한 항원 의존적 1차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인(예를 들어, TCR/CD3 복합체)과, 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원 독립적 방식으로 작용하는 공동자극 신호전달 도메인에 의해 매개된다고 할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR은 하나 이상의 "공동자극 신호전달 도메인"과 "1차 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본 개시내용에서 유용한 1차 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예시적인 예에는, TCRζ, FcRγ, FcRβ, DAP12, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유도된 것들이 포함된다. 일부 구현예에서, CAR은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인과 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 도메인과 공동자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카르복실 말단에 직렬로 임의의 순서로 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, CAR은 서열번호 43과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3ζ 도메인을 갖는다.
LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(서열번호 43).
본원에서 고려되는 CAR은 CAR 수용체를 발현하는 T세포의 효능 및 확장을 증강시키기 위해 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 "공동자극 신호전달 도메인" 또는 "공동자극 도메인"이라는 용어는, 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 나타낸다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자는 CD27, CD28, CD137(4-IBB), OX40(CD134), CD30, CD40, PD-I, ICOS(CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, TRIM, LCK3, SLAM, DAPIO, LAG3, HVEM 및 NKD2C, 및 CD83을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR은 서열번호 44와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 4-IBB 공동자극 도메인을 포함한다.
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE (서열번호 44).
본원에 기재된 조작된 CAR은 또한 scFv 또는 항원 결합 도메인의 N-말단에 N-말단 신호 펩타이드 또는 태그를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이종 신호 펩타이드가 사용될 수 있다. 항원 결합 도메인 또는 scFV는 초기 단백질을 소포체로 유도하고, 이어서 세포 표면으로 전위시키는 리더 또는 신호 펩타이드에 융합될 수 있다. 신호 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드가 세포 표면에서 발현되면, 신호 펩타이드는 일반적으로 소포체에서의 폴리펩타이드의 처리 및 세포 표면으로의 전위 동안 단백질분해에 의해 제거되는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 기재된 CAR 구조체와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 세포 표면에서 신호 펩타이드가 결여된 성숙 단백질로 발현되지만, 폴리펩타이드의 전구 형태는 신호 펩타이드를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 신호 서열이 사용될 수 있다. 유사하게, 당업계에 공지된 임의의 공지 태그 서열도 사용될 수 있다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, CAR 구조체는 서열번호 45와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
EQKLISEEDLDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSSGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
(서열번호 45).
본원에 기재된 바와 같은 임의의 CAR 구조체와 본 개시내용의 DN TGF-β 수용체를 조합하면, TGF-β 억제에 의해 방해를 받는 CAR T 요법의 치료 효과를 회복, 유지 또는 증강시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체는 CAR과 T세포에서 공동발현되어, "CAR-DN TGF-β 수용체 구조체"를 형성한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, DN TGF-β 수용체 중 임의의 것은, 비제한적으로, BCMA, CD19, CD20, CD28, CD137(4-1BB), CLL-1, 글리피칸-3(GPC3), PSCA 또는 PSMA를 포함하는 항원에 결합하는 CAR과 T세포에서 공동발현된다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, CAR-DN TGF-β 수용체 구조체의 CAR 부분은 서열번호 37 또는 서열번호 45와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, CAR-DN TGF-β 수용체 구조체의 DN TGF-β 수용체 부분은 서열번호 10 또는 서열번호 14와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 T세포에서 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체의 효율적인 발현을 가능하게 하기 위해, 자가 절단 서열을 사용하여 하나의 오픈리딩프레임에서 발현하는 방식으로 동일한 양으로 다수의 유전자 구조체의 공동발현을 가능하게 할 수 있다. 임의의 적합한 절단 펩타이드 서열은 본원에 기재된 구조체, 예를 들어 2A 절단 가능한 펩타이드(예를 들어, T2A), 2A 유사 링커 또는 이의 기능적 등가물, 및 이들의 조합과 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 피코르나바이러스 2A 유사 링커, 돼지 테스코바이러스(P2A)의 CHYSEL 서열, 바이러스(T2A), 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 등가물을 포함한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, CAR-DN TGF-β 수용체 구조체는 서열번호 46과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열 갖는 자가 절단 도메인을 포함한다. EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열번호 46).
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체는 서열번호 47과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNYPLTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKNAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRNKTNNYATYYADSVKARFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVAGNSFAYWGQGTLVTVSSGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQ
(서열번호 47).
본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에서 고려되는 하나 이상의 DN TGF-β 수용체 또는 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"이라는 용어는, 메신저 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 상보적 DNA(cDNA) 또는 재조합 DNA를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥 폴리뉴클레오타이드와 이중가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 참조 서열(예를 들어, 서열목록 참조) 중 임의의 것과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체를 포함하며, 전형적으로 여기서 변이체는 참조 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 다양한 예시적인 구현예에서, 본 개시내용은, 부분적으로, 발현 벡터, 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 포함하는 조성물 및 세포를 고려한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드의 적어도 약 5개, 10개, 25개, 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 500개, 1000개, 1250개, 1500개, 1750개 또는 2000개, 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기뿐 아니라, 모든 중간 길이의 아미노산 잔기를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 개시내용에 의해 제공된다. 이러한 맥락에서 "중간 길이"는 인용된 값들 사이의 임의의 길이, 예컨대 6개, 7개, 8개, 9개 등, 101개, 102개, 103개 등; 151개, 152개, 153개 등; 201개, 202개, 203개 등을 의미한다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등의 용어는, 이하 정의되는 엄격한 조건 하에서 참조 서열과 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드, 또는 참조 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 이러한 용어는, 참조 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드가 부가 또는 결실되었거나, 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경이 참조 폴리뉴클레오타이드에 이루어질 수 있고, 이에 의해 발현된 변경된 폴리뉴클레오타이드가 참조 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 유지한다는 것은 당업계에서 충분히 이해되고 있다.
본원에 사용된 "서열 동일성" 또는, 예를 들어 "~와 50% 동일한 서열"을 포함하는 인용은, 서열이 비교 범위에 걸쳐 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 기준으로 또는 아미노산-대-아미노산 기준으로 동일한 정도를 나타낸다. 따라서, "서열 동일성%"는, 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 범위에 걸쳐 비교하고, 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치된 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 범위(즉, 범위 크기) 내 총 위치의 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성%를 산출하는 방식으로 계산될 수 있다. 본원에 기재된 참조 서열 중 임의의 것과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드와 폴리펩타이드가 포함되며, 전형적으로 여기서 폴리펩타이드 변이체는 참조 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는, 코딩 서열 자체 길이에 관계없이, 본원의 다른 곳에 개시되어 있거나 당업계에 공지된 바와 같은 다른 DNA 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서, 미번역 영역(UTR), Kozak 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 재조합효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자가 절단 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합될 수 있기 때문에, 이의 전체 길이가 상당히 다를 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 이용될 수 있으며, 여기서 총 길이는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한될 수 있다고 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지되어 있고 이용 가능한 다양한 널리 확립된 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 적절한 벡터에 삽입할 수 있다. 벡터의 예는, 플라스미드, 자가 복제 서열 및 전이 요소이다. 추가의 예시적인 벡터에는, 비제한적으로, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체(예컨대, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)), 박테리오파지(예컨대, 람다 파지 또는 M13 파지), 및 동물 바이러스가 포함된다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스 카테고리의 예에는, 비제한적으로, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순헤르페스바이러스), 폭스바이러스, 바큐로바이러스, 유두종바이러스 및 파포바바이러스(예를 들어, SV40)가 포함된다. 발현 벡터의 예는, 포유류 세포에서의 발현을 위한 pClneo 벡터(Promega); 포유류 세포에서 렌티바이러스 매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4N5-DEST™, pLenti6N5-DEST™ 및 pLenti6.2N5-GW/lacZ(Invitrogen)이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 단백질의 코딩 서열은 포유류 세포에서의 키메라 단백질의 발현을 위해 이러한 발현 벡터에 결찰될 수 있다.
발현 벡터에 존재하는 "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 전사와 번역을 수행하기 위해 숙주세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 미번역 영역, 즉, 복제 기원, 선별 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(Shine Dalgarno 서열 또는 Kozak 서열), 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 미번역 영역이다. 이러한 요소는 강도와 특이성이 다양할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템과 숙주에 따라, 유비쿼터스 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 비제한적으로, 발현 벡터와 바이러스 벡터를 포함하는 본원에 기재된 구현예를 실시하는 데 사용되는 벡터는, 외인성, 내인성 또는 이종 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 것이다. "내인성" 제어 서열은 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 제어 서열은, 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록, 유전적 조작(즉, 분자생물학적 기술)에 의해 유전자와 근접위치에 배치된 것이다. "이종" 서열은 유전적으로 조작되는 단백질 또는 세포와 동일한 종의 상이한 단백질, 또는 상이한 종으로부터 유래할 수 있는 외인성 서열이다.
본원에 사용된 "프로모터"라는 용어는, RNA 폴리머라아제에 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 나타낸다. RNA 폴리머라아제는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 일부 구현예에서, 포유류 세포에서 작동성인 프로모터는 전사가 개시되는 부위에서 대략 25개 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역 및/또는 전사 개시로부터 70개 내지 80개 염기 업스트림에 있는 또 다른 서열, 즉 CNCAAT 영역(여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있음)을 포함한다.
"인핸서"라는 용어는, 증강된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고, 일부 예에서 또 다른 제어 서열에 대한 방향과 무관하게 기능할 수 있는 DNA의 분절을 나타낸다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력하여 또는 이에 부가적으로 기능할 수 있다. "프로모터/인핸서"라는 용어는, 프로모터 기능과 인핸서 기능 둘 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 나타낸다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 상기 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계에 있는 근접위치를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오타이드 사이의 기능적 연결을 나타내며, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에 사용된 "구성적 발현 제어 서열"이라는 용어는, 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 연속적으로 또는 지속적으로 가능하게 하는 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서를 나타낸다. 구성적 발현 제어 서열은, 각각, 다양한 세포 또는 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 "유비쿼터스" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 제한된 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 가능하게 하는 "세포 특이적", "세포 유형 특이적", "세포 계통 특이적" 또는 "조직 특이적" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다. 본 개시내용은, 비제한적으로, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10Tl/2 세포, FLY 세포, Flp- 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, P A317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, Jurkat 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HTI080 세포, Hep 세포, HEK 세포, iHPC 세포, 293 세포, 293T세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, NK세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포, 또는 임의의 다른 적합한 세포주를 포함하는, 본원에 기재된 다양한 구조체와 함께 사용하기 위한 임의의 적합한 세포주의 사용을 고려한다.
본 개시내용의 일부 구현예에 사용하기에 적합한 예시적인 유비쿼터스 발현 제어 서열에는, 비제한적으로, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 단순헤르페스바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터, 우두바이러스의 HS, P7.5 및 P11 프로모터, 신장인자 1-알파(EFla) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH), 진핵생물 번역개시인자 4Al(EIF4Al), 열충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열충격 단백질 90kDa 베타, 멤버 1(HSP90B 1), 열충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌(문헌[Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)]), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나아제-I(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터, 및 골수증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머 결합 부위 치환된(MND) 프로모터(문헌[Challita et al., J Viral. 69(2):748-55 (1995)])가 포함된다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, T세포에서 안정적인 장기간 발현을 제공하고 T세포를 표적 항원을 발현하는 세포로 재지향시키기에 충분한 수준으로 제공하는 프로모터로부터, 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 조작된 TCR 또는 CAR과 공동발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 사용된 "조건부 발현"은, 비제한적으로, 유도성 발현; 억제성 발현; 생리학적, 생물학적 또는 질환 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현을 포함하는, 임의의 유형의 조건부 발현을 나타낼 수 있다. 이러한 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적 발현을 배제하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기재된 특정 구현예는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드를 발현시키거나, 관심 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가 또는 감소시키는 처리 또는 조건에 세포, 조직, 유기체 등을 적용시키는 방식으로 발현이 제어되는, 관심 폴리뉴클레오타이드의 조건부 발현을 제공한다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예에는, 비제한적으로, 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 인코딩하는 유전자에 대한 프로모터와 같은 스테로이드 유도성 프로모터(상응하는 호르몬을 이용한 처리에 의해 유도 가능함), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속을 이용한 처리에 의해 유도 가능함), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도 가능함), "유전자 스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤(mifepristone) 조절 가능한 시스템(문헌[Sirin et al., 2003, Gene, 323:67]), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라시클린 의존성 조절 시스템 등이 포함된다.
조건부 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 사용하는 방식으로 달성될 수 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에 따르면, 벡터는 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나(전형적으로 2개)의 부위(들)을 포함한다. 본원에 사용된 "재조합효소" 또는 "부위 특이적 재조합효소"라는 용어는, 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 7개, 10개, 12개, 15개, 20개, 30개, 50개 등)의 재조합 부위를 포함하는 재조합 반응에 관여하는 절제 또는 통합 단백질, 효소, 보조인자 또는 관련 단백질을 포함하며, 이는 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)] 참조), 또는 이들의 돌연변이체, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에 사용하기에 적합한 재조합효소의 예시적인 예에는, 비제한적으로, Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 리졸바아제(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCEl 및 ParA가 포함된다.
본 개시내용은, 본원에 기재된 바와 같은 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체 및 이의 단편, 이를 포함하는 세포 및 조성물, 및 폴리펩타이드를 발현하는 벡터를 비롯하여, 본원에 기재된 조작된 DN TGF-β 수용체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 조작된 TCR 및 CAR 폴리펩타이드 구조체의 공동발현을 고려한다. "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은, 달리 명시되지 않는 한, 및 통상적인 의미에 따라, 즉, 아미노산의 서열이다. 폴리펩타이드는 특정 길이에 제한되지 않으며, 예를 들어 이는 전장 단백질 서열 또는 전장 단백질의 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등뿐 아니라, 당업계에 공지된 다른 변형(자연발생 및 비자연발생 둘 모두)을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에서 고려되는 폴리펩타이드는 번역과 동시에 또는 번역 후에 단백질의 전달을 지시하는 단백질의 N-말단에 있는 신호(또는 리더) 서열을 포함한다. 본원의 개시내용에 유용한 적합한 신호 서열의 예시적인 예에는, 비제한적으로, IgG 1 중쇄 신호 서열과 CD8α 신호 서열이 포함된다. 폴리펩타이드는 다양한 널리 공지된 재조합 및/또는 합성 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에서 고려되는 폴리펩타이드는 구체적으로 조작된 DN TGF-β 수용체, 본 개시내용의 조작된 TCR 및 CAR, 또는 본원에서 고려되는 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 이에의 부가 및/또는 이의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 자연발생 폴리펩타이드와 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 다를 수 있다. 이러한 변이체는 자연발생이거나, 예를 들어 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변경시키는 방식으로 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 도입하는 방식으로 조작된 DN TGF-β 수용체, TCR 또는 CAR의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 이와 적어도 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 개시내용의 폴리펩타이드에는 본원에 기재된 참조 서열(예를 들어, 서열목록 참조) 중 임의의 것과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체가 포함되며, 전형적으로 여기서 변이체는 참조 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 폴리펩타이드 단편은, 아미노 말단 결실, 카르복실 말단 결실, 및/또는 자연발생 또는 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드의 내부 결실 또는 치환을 갖는 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 나타낸다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5개 내지 약 500개 아미노산 길이의 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단편의 길이는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 또는 450개 아미노산이라고 이해될 것이다.
폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리-His)의 합성, 정제 또는 식별의 용이성을 위해, 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 증강시키기 위해 인프레임(in-frame)으로 융합되거나, 링커 또는 다른 서열에 접합될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)], 문헌[Kunkel et al., 1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌[Watson, J. D. et al., Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987] 및 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은, 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 확인할 수 있다.
특정 구현예에서, 변이체는 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은, 펩타이드 화학의 당업자가 폴리펩타이드의 2차 구조와 소수성 성질이 실질적으로 변하지 않을 것으로 예상할 수 있도록, 한 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된 것이다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드의 구조에서 변형이 이루어질 수 있으며, 바람직한 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 인코딩하는 기능성 분자를 여전히 얻을 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 집합적 접합체, 및 관련이 없는 화학적 모이어티(예를 들어, 페길화된 분자)와의 공유결합 접합체를 추가로 포함한다. 공유결합 변이체는, 당업계에 공지된 바와 같이, 아미노산 사슬 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 관능기를 연결하는 방식으로 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 뮤테인(mutein)을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실 또한 변이체이다.
2개 이상의 폴리펩타이드의 발현을 목적으로 하는 경우, 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩타이드는 하나 이상의 자가 절단 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질로 발현될 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드와 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 융합 폴리펩타이드와 융합 단백질은 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 그 이상의 폴리펩타이드 분절을 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다. 융합 폴리펩타이드는 전형적으로 C-말단이 N-말단에 연결된 것이지만, 이는 또한 C-말단이 C-말단에, N-말단이 N-말단에, 또는 N-말단이 C-말단에 연결된 것일 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서로 또는 특정한 순서로 존재할 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한, 융합 폴리펩타이드의 목적하는 전사 활성이 보존되는 한, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 2개의 모이어티 사이의 화학적 연결에 의해 생성될 수 있거나, 일반적으로 다른 통상의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된 DNA 서열은 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이 적합한 전사 또는 변역 제어 요소에 작동 가능하게 연결되어 있다.
하나의 구현예에서, 융합 파트너는 천연 재조합 단백질보다 높은 수율로 단백질을 발현하는 것을 돕는 서열(발현 인핸서)을 포함한다. 단백질의 용해도를 증가시키거나, 단백질을 목적하는 세포내 구획으로 표적화할 수 있거나, 또는 세포막을 통한 융합 단백질의 수송을 용이하게 하기 위해 다른 융합 파트너가 선택될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본원에 기재된 각각의 폴리펩타이드 도메인 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열에 삽입될 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호에는, 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 희귀 제한효소 인식 부위, 자가 절단 리보자임 인식 부위) 및 자가 절단 바이러스 올리고펩타이드가 포함된다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조). 적합한 프로테아제 절단 부위와 자가 절단 펩타이드는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997. J Gener. Viral. 78, 699-722]; 문헌[Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594] 참조).
예시적인 프로테아제 절단 부위에는, 비제한적으로, 포티바이러스(potyvirus) Nia 프로테아제(예를 들어, 담배식각바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 Pl(P35) 프로테아제, 비요바이러스(byovirus) Nia 프로테아제, 비요바이러스 RNA-2-인코딩된 프로테아제, 아프토바이러스(aphthovirus) L 프로테아제, 엔테로바이러스(enterovirus) 2A 프로테아제, 리노바이러스(rhinovirus) 2A 프로테아제, 피코마(picoma) 3C 프로테아제, 코모바이러스(comovirus) 24K 프로테아제, 네포바이러스(nepovirus) 24K 프로테아제, RTSV(쌀 퉁그로 구형(rice tungro spherical) 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 반점(parsnip yellow fleck) 바이러스) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나아제의 절단 부위가 포함된다. 높은 절단 엄격성으로 인해, TEV(담배식각바이러스) 프로테아제 절단 부위가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 자가 절단 펩타이드는 포티바이러스 및 카르디오바이러스(cardiovirus) 2A 펩타이드, FMDV(수족구병 바이러스), 말 비염 A 바이러스, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코바이러스에서 수득된 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 자가 절단 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(문헌[Donnelly et al., 2001. J Gen. Viral. 82:1027-1041]).
일반적으로, 임의의 적절한 바이러스 벡터가 본원에 기재된 조작된 구조체의 형질도입에 사용될 수 있다고 이해된다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 조작된 DN TGF-β 수용체 구조체와 조작된 TCR 또는 CAR 구조체를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 형질도입된 T세포는 안정하고 장기적이며 지속적인 T세포 반응을 유도한다.
본원에 사용된 "레트로바이러스"라는 용어는, 이의 게놈 RNA를 선형 이중가닥 DNA 카피로 역전사시키고, 이어서 게놈 DNA를 숙주 게놈에 공유결합적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 나타낸다. 일부 구현예에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스에는, 비제한적으로, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 쥐 육종 바이러스(MoMSV), 하베이 쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 쥣과 유선종양 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스(spumavirus), 프리엔드(Friend) 쥐 백혈병 바이러스, 쥣과 줄기세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 렌티바이러스가 포함된다.
본원에 사용된 "렌티바이러스"라는 용어는, 복합 레트로바이러스의 군(또는 속)을 나타낸다. 예시적인 렌티바이러스에는, 비제한적으로, HIV(인간 면역결핍바이러스; HIV 유형 1 및 HIV 유형 2 포함); 비스나-메디(visna-maedi) 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염/뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍바이러스(FIV); 소 면역결핍바이러스(BIV); 및 원숭이 면역결핍바이러스(SIV)가 포함된다.
"벡터"라는 용어는, 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어 이에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자가 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주세포 DNA로의 통합을 가능하게 하는 데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들어 복제 결함 레트로바이러스와 렌티바이러스를 포함한다.
당업자에게 자명한 바와 같이, "바이러스 벡터"라는 용어는, 전형적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈으로의 통합을 용이하게 하는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드), 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 나타내는 데 광범위하게 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 핵산(들)에 더하여, 다양한 바이러스 구성요소 및 때때로 또한 숙주세포 구성요소를 포함할 것이다.
바이러스 벡터라는 용어는, 핵산을 세포에 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 전달된 핵산 자체를 나타낼 수 있다. 바이러스 벡터와 전달 플라스미드는 주로 바이러스에서 유도되는 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 함유한다. "레트로바이러스 벡터"라는 용어는, 주로 레트로바이러스에서 유도되는 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 나타낸다. "렌티바이러스 벡터"라는 용어는, 주로 렌티바이러스에서 유도되는 LTR을 포함하는, 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 나타낸다. "하이브리드 벡터"라는 용어는, 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열과 비(非)레트로바이러스 바이러스 서열을 모두 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전달 플라스미드를 나타낸다.
일부 구현예에서, "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"라는 용어는, 렌티바이러스 전달 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 나타내는 데 사용될 수 있다. 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등과 같은 요소가 본원에서 언급되는 경우, 이러한 요소의 서열은 본 개시내용의 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하고, 본 개시내용의 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재한다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 발현 벡터이다.
프로바이러스(provirus)의 각 말단은 "긴말단반복부(long terminal repeat)" 또는 "LTR"로 불리는 구조이다. "긴말단반복부(LTR)"라는 용어는, 이의 천연 서열의 맥락에서, 직접 반복부이고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는, 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치한 염기쌍의 도메인을 나타낸다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어, 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 기본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호, 및 바이러스 게놈의 복제와 통합에 필요한 서열을 포함하는 다수의 조절 신호를 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5로 불리는 3가지 영역으로 나뉜다. U3 영역은 인핸서 요소와 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이며, 폴리아데닐화 서열을 함유한다. R(반복) 영역의 측면에는 U3 영역과 U5 영역이 있다. LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 구성되며, 바이러스 게놈의 5' 말단과 3' 말단 둘 모두에 나타난다. 게놈의 역전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위)과 바이러스 RNA의 입자에의 효율적인 패키징에 필요한 서열(Psi 부위)이 5' LTR에 인접해 있다.
본원에 사용된 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"이라는 용어는, 바이러스 RNA를 바이러스 캡시드 또는 입자에 삽입하는데 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 나타낸다(예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조). 몇몇 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화에 필요한 최소 패키징 신호(프사이['P] 서열로도 지칭됨)를 사용한다. 따라서, 본원에 사용된 "패키징 서열", "패키징 신호", "프사이"라는 용어 및 기호 "'P"는, 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡시드화에 필요한 비코딩 서열과 관련하여 사용된다.
다양한 구현예에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. LTR 중 어느 하나 또는 둘 모두는, 비제한적으로, 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 바이러스 복제 결함을 만들어 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해 종종 3' LTR의 변형이 이루어진다. 본원에 사용된 "복제 결함"이라는 용어는, 감염성 비리온이 생산되지 않도록 완전하고 효과적인 복제를 불가능하게 하는 바이러스(예를 들어, 복제 결함 렌티바이러스 자손)를 나타낸다. "복제 가능"이라는 용어는, 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온을 생산할 수 있도록 복제를 가능하게 하는 야생형 바이러스 또는 돌연변이 바이러스(예를 들어, 복제 가능 렌티바이러스 자손)를 나타낸다.
"자가 불활성화"(SIN) 벡터는, U3 영역으로 공지된 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 첫 번째 회차의 바이러스 복제를 지나 바이러스 전사를 방지하도록 변형(예를 들어, 결실 또는 치환)된, 복제 결함 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 나타낸다. 이는, 우측(3 ') LTR U3 영역이 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로 사용되어, U3 인핸서-프로모터 없이 바이러스 전사체가 제조될 수 있기 때문이다. 본 개시내용의 추가의 구현예에서, U5 영역이, 예를 들어 이상적인 poly(A) 서열로 대체되도록, 3'LTR이 변형된다. 3'LTR, 5'LTR, 또는 3'LTR과 5'LTR 둘 모두에 대한 변형과 같은 LTR에 대한 변형이 또한 본원에서 고려된다는 점에 유의해야 한다.
바이러스 입자 생산 동안 5'LTR의 U3 영역을 이종 프로모터로 대체하여 바이러스 게놈의 전사를 유도하는 방식으로 추가적인 안전성 증강이 제공된다. 사용될 수 있는 이종 프로모터의 예에는, 예를 들어 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어, 극초기), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 단순헤르페스바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터가 포함된다. 전형적인 프로모터는 Tat 독립적 방식으로 높은 수준의 전사를 유도할 수 있다. 이러한 대체는, 바이러스 생산 시스템에 완전한 U3 서열이 존재하지 않기 때문에, 복제 가능 바이러스를 생성하는 재조합 가능성을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 이종 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식을 제어하는데 추가의 이점을 갖는다. 예를 들어, 이종 프로모터는 유도인자가 존재할 때만 바이러스 게놈의 전부 또는 일부의 전사가 일어나도록 유도될 수 있다. 유도인자에는, 비제한적으로, 하나 이상의 화학적 화합물, 또는 숙주세포가 배양되는 온도 또는 pH와 같은 생리학적 조건이 포함된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. "TAR"이라는 용어는, 렌티바이러스(예를 들어, HIV) LTR의 R 영역에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전 요소를 나타낸다. 이러한 요소는 렌티바이러스 트랜스-활성화제(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증강시킨다.
"R 영역"은 캡핑기의 시작(즉, 전사 시작)에서 시작하여 poly A 트랙의 시작 직전에 종결되는 레트로바이러스 LTR 내 영역을 나타낸다. R 영역은 또한 U3 영역과 U5 영역이 측면에 있는 것으로 정의된다. R 영역은 역전사 동안 초기 DNA를 게놈의 하나의 말단에서 또 다른 말단으로 전달하는 것을 가능하게 하는 역할을 한다.
본원에 사용된 "FLAP 요소"라는 용어는, 이의 서열이 레트로바이러스, 예를 들어 HIV-I 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린관과 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 중심 폴리퓨린관과 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 나타낸다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호 및 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173]에 기재되어 있다. HIV-I 역전사 동안, 중심 폴리퓨린관(cPPT)에서의 플러스 가닥 DNA의 중심 개시와 중심 종결 서열(CTS)에서의 중심 종결은, 3중가닥 DNA 구조인 HIV-I 중심 DNA 플랩의 형성으로 이어진다. 임의의 이론에 구애됨 없이, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 유입의 시스-활성 결정기로서 작용하고/하거나 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 벡터는 하나 이상의 배출 요소를 포함한다. "배출 요소"라는 용어는, 세포의 핵에서 세포질로의 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용 전사 후 조절 요소를 나타낸다. RNA 배출 요소의 예에는, 비제한적으로, 인간 면역결핍바이러스(HIV) 역반응 요소(RRE)(예를 들어, 문헌[Cullen et al., 1991. J Virol. 65: 1053]; 및 문헌[Cullen et al., 1991. Cell 58: 423])와, B형 간염바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE)가 포함된다. 일반적으로, RNA 배출 요소는 유전자의 3' UTR 내에 위치하며, 하나 또는 다중 카피로 삽입될 수 있다.
다른 구현예에서, 바이러스 벡터에서 이종 서열의 발현은 전사 후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 선택적으로, 전사 종결 신호를 벡터에 혼입시키는 방식으로 증가된다. 예를 들어 우드척(woodchuck) 간염바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE; 문헌[Zufferey et al., 1999, J Virol., 73:2886]); B형 간염바이러스에 존재하는 전사 후 조절 요소(HPRE)(문헌[Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864]) 및 기타(문헌[Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766])와 같은 다양한 전사 후 조절 요소가 단백질에서 이종 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 전사 또는 번역 조절 활성을 갖는 조절 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 발현의 제어를 조절하기 위한 다양한 유전자 발현 구성에 사용될 수 있다. 전사 조절 올리고뉴클레오타이드는 재조합 발현 구조체의 발현 수준을 증가(증강) 또는 감소(침묵)시킬 수 있다. 조절 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드의 조직 특이적, 발달 단계 특이적 등의 발현(구성적 또는 유도성 발현 포함)을 부여하는 것을 포함하는 맥락 특이적 방식으로 발현을 선택적으로 조절할 수 있다. 본 개시내용의 조절 올리고뉴클레오타이드는 또한 발현 가능한 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 조절 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산 분자 또는 발현 벡터의 구성요소일 수 있다. 조절 요소는 수 개의 뉴클레오타이드에서 수백 개의 뉴클레오타이드까지의 다양한 길이를 가질 수 있다.
이종 핵산 전사체의 효율적인 종결과 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 다운스트림에서 발견된다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현시키고자 하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'를 포함한다. 본원에 사용된 "poly A 부위" 또는 "poly A 서열"이라는 용어는, RNA 폴리머라아제 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결과 폴리아데닐화 둘 모두를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 poly A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 부가하는 방식으로 mRNA 안정성을 향상시켜, 증가된 번역 효율에 기여할 수 있다. poly A 테일이 결여된 전사체는 불안정하고 신속하게 분해되기 때문에, 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 본 개시내용의 벡터에 사용될 수 있는 poly A 신호의 예시적인 예에는, 이상적인 poly A 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장호르몬 poly A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 poly A 서열(rβgpA), 또는 당업계에 공지된 또 다른 적합한 이종 또는 내인성 poly A 서열이 포함된다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 조작된 DN TGF-β 수용체를 인코딩하고 TCR 또는 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 3과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인을 발현하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 11과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열, 및 서열번호 4와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
TTACAGTGCTTCTGCCATTTATGCACCAAGGACAACTTCACTTGTGTCACCGATGGTTTATGCTTCGTGAGCGTGACCGAGACCACCGACAAGGTGATCCACAACAGCATGTGCATCGCCGAGATCGATTTAATCCCTCGTGACAGACCCTTCGTGTGCGCCCCTAGCAGCAAGACCGGCAGCGTGACCACCACCTACTGCTGCAACCAAGATCACTGCAACAAGATCGAGCTGCCCACCACCGTGAAGAGCAGCCCCGGTTTAGGACCCGTTGAACTGGCTGCCGTGATTGCCGGCCCCGTGTGCTTTGTGTGCATCTCTTTAATGCTGATGGTGTACATT
(서열번호 11)
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 TCR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 11과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 11과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 TCR 또는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 프로모터의 제어 하에서 서열번호 11과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 15와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인을 발현하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 48과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 것으로 제시된 핵산 서열, 및 서열번호 16과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
ATGGGCAGGGGCCTGCTGAGGGGCCTGTGGCCCCTGCACATCGTGCTGTGGACCAGGATCGCCAGCACCATCCCCCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACCTGCGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCAGCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAGGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATCCTGGAGGACGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGCAGCTGCAGCAGCGACGAGTGCAACGACAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGACCTGCTGCTGGTGATCTTCCAGGTGACCGGCATCAGCCTGCTGCCCCCCCTGGGCGTGGCCATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTACAGGGTGAACAGGCAG
(서열번호 48).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 TCR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 48과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 48과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 TCR 또는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 프로모터의 제어 하에서 서열번호 48과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 15와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인을 발현하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 35와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열, 및 서열번호 18과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGACCATCCCCCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACCTGCGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCAGCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAGGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATCCTGGAGGACGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGCAGCTGCAGCAGCGACGAGTGCAACGACAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGACCCCAGCCCCATCCTGCTGACCATCAGCATCCTGAGCTTCTTCAGCGTGGCCCTGCTGGTGATCCTG
(서열번호 35).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 TCR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 35와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 35와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 TCR 또는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 프로모터의 제어 하에서 서열번호 35와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 15와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 세포외 도메인을 발현하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 36과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열, 및 서열번호 20과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 막관통 도메인을 포함한다.
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGACCATCCCCCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACCTGCGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCAGCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAGGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATCCTGGAGGACGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGCAGCTGCAGCAGCGACGAGTGCAACGACAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGACCCCAGCGGCATCCTGCTGACCTGCCCCACCATCAGCATCCTGAGCTTCTTCAGCGTGGCCCTGCTGGTGATCCTG
(서열번호 36).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 GPC3을 표적으로 하는 CAR 구조체("GPC3-CAR")를 발현하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 49와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다:
GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTTTAGCTGTGTCTTTAGGAGAGAGGGCCACAATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTCTACAGCAGCAACCAGAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCAGCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTCACCATTAGCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTTTAACCTTCGGCCAAGGTACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCCACATCCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCCGGTGGATCTTTAAGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTTAACAAGAACGCTATGAACTGGGTGAGGCAAGCTCCCGGTAAGGGTTTAGAGTGGGTGGGTCGTATTCGTAATAAGACCAACAACTACGCCACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGCTCGTTTCACCATCTCTCGTGACGACAGCAAGAACAGCCTCTATTTACAGATGAACTCTTTAAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGTGGCTGGCAACTCCTTCGCCTACTGGGGCCAAGGCACTTTAGTGACCGTGAGCTCCgggtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
(서열번호 49).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 49와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 49와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 프로모터의 제어 하에서 서열번호 49와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 50과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체의 핵산 서열을 포함한다:
GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTTTAGCTGTGTCTTTAGGAGAGAGGGCCACAATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTCTACAGCAGCAACCAGAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCAGCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTCACCATTAGCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTTTAACCTTCGGCCAAGGTACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCCACATCCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCCGGTGGATCTTTAAGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTTAACAAGAACGCTATGAACTGGGTGAGGCAAGCTCCCGGTAAGGGTTTAGAGTGGGTGGGTCGTATTCGTAATAAGACCAACAACTACGCCACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGCTCGTTTCACCATCTCTCGTGACGACAGCAAGAACAGCCTCTATTTACAGATGAACTCTTTAAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGTGGCTGGCAACTCCTTCGCCTACTGGGGCCAAGGCACTTTAGTGACCGTGAGCTCCgggtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCTCTggagagggcagaggctctctgctgacctgcggcgacgtggaagagaacccaggccccATGGGAAGAGGTTTACTGAGAGGACTGTGGCCTTTACACATCGTGCTGTGGACTCGTATCGCCAGCACCATCCCCCCCCATGTGCAGAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAATGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACTTGTGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACTTTAGAGACAGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATTTTAGAAGATGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGCAGCTGCAGCTCCGACGAGTGCAACGATAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGATTTACTGCTGGTGATCTTCCAAGTTACCGGCATTTCTTTACTGCCTCCTTTAGGCGTGGCTATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTATAGGGTGAACAGACAG
(서열번호 50).
"코돈 최적화된" 핵산이 또한 본원에 기재되어 있다. "코돈 최적화된" 핵산은, 코돈이 특정 시스템(예컨대, 특정 종 또는 종의 군)에서의 발현에 최적화되도록 변경된 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 핵산 서열은, 천연 서열의 코돈 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수를 해당 종의 유전자에 더 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체하는 방식으로 포유류 세포 또는 특정 포유류 종(예컨대, 인간 세포)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다.
본 개시내용에 제시된 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 발현 효능과 관련된 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 전사될 DNA 서열은 더 효율적인 전사 및/또는 번역을 가능하게 하기 위해 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 서열은 시스-조절 요소(예를 들어, TATA 박스, 종결 신호 및 단백질 결합 부위), 인공 재조합 부위, 카이 부위, CpG 디뉴클레오타이드 함량, 음성 CpG 섬(island), GC 함량, 폴리머라아제 슬리피지(slippage) 부위, 및/또는 전사와 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있고; DNA 서열은 잠재 스플라이스 부위, mRNA 2차 구조, mRNA의 안정한 자유 에너지, 반복 서열, RNA 불안정성 모티프, 및/또는 mRNA 처리 및 안정성과 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있고; DNA 서열은 코돈 사용 편향, 코돈 적응성, 내부 카이 부위, 리보솜 결합 부위(예를 들어, IRES), 조기성숙 polyA 부위, Shine-Dalgarno(SD) 서열, 및/또는 번역과 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있고/있거나; DNA 서열은 코돈 맥락, 코돈-안티코돈 상호작용, 번역 정지 부위, 및/또는 단백질 폴딩과 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 GPC3-CAR 구조체("CAR 1")를 발현하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 51과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다:
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTTTAGCTGTGAGCCTTGGAGAGAGGGCCACAATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTCTACAGCAGCAACCAGAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCAGCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTCACCATTAGCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTTTAACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGGGCTCCACATCCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCCGGTGGATCTTTAAGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTTAACAAGAACGCTATGAACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGAAAAGGTTTAGAGTGGGTGGGTCGTATTCGTAATAAGACCAACAACTACGCCACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGCTCGTTTCACCATCTCTCGTGACGACAGCAAGAACAGCCTCTATTTACAAATGAACTCTTTAAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGTGGCTGGCAACTCCTTCGCCTACTGGGGCCAAGGCACTTTAGTGACCGTGAGCTCCgggtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAaCCCCTGTCCCTGCGCCCcGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTAtTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAttgAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCcTAtCAGCAaGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATtTAGGgCGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCcGAaATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCtTGTACAATGAAtTGCAGAAgGATAAGATGGCGGAGGCaTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAtCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAaGCCCTGCCCCCTCGC
(서열번호 51).
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 51과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 CAR을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 51과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 발현 벡터는 조작된 DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 프로모터의 제어 하에서 서열번호 51과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 발현 벡터는 서열번호 52("CAR DNR A")와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체의 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다:
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACTCTTTAGCTGTGAGCCTTGGAGAGAGGGCCACAATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTCTACAGCAGCAACCAGAAGAACTATTTAGCTTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCAGCAGAGAGAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGAAGCGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTCACCATTAGCTCTTTACAAGCTGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAACTACCCTTTAACCTTCGGCCAAGGAACAAAGCTGGAGATCAAGGGCTCCACATCCGGATCCGGCAAGCCCGGTAGCGGAGAAGGCAGCACAAAGGGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGGACTGGTCCAGCCCGGTGGATCTTTAAGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTTAACAAGAACGCTATGAACTGGGTCCGACAAGCTCCCGGAAAAGGTTTAGAGTGGGTGGGTCGTATTCGTAATAAGACCAACAACTACGCCACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGCTCGTTTCACCATCTCTCGTGACGACAGCAAGAACAGCCTCTATTTACAAATGAACTCTTTAAAGACCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGTGGCTGGCAACTCCTTCGCCTACTGGGGCCAAGGCACTTTAGTGACCGTGAGCTCCgggtccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAaCCCCTGTCCCTGCGCCCcGAGGCGTGCCGGCCAgcggcggggggcgcagTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTAtTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAttgAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCcTAtCAGCAaGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATtTAGGgCGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGgCGTGGCCGGGACCCcGAaATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCtTGTACAATGAAtTGCAGAAgGATAAGATGGCGGAGGCaTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTAtCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAaGCCCTGCCCCCTCGCgGCTCTggagagggcagaggctctctgctgacctgcggcgacgtggaagagaacccaggccccATGGGAAGAGGTTTACTGAGAGGACTGTGGCCTTTACACATCGTGCTGTGGACTCGTATCGCCAGCACCATCCCCCCCCATGTcCAaAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAATGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACTTGTGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACTTTAGAGACAGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATTTTAGAAGATGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGTTCTTGTTCGTCTGATGAGTGCAACGATAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGATTTACTGCTGGTGATCTTCCAAGTTACCGGCATTTCTTTACTGCCTCCgTTgGGCGTGGCTATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTATCGTGTTAATCGTCAA
(서열번호 52).
벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있으며, 여기서 임의의 LTR은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실과 같은 하나 이상의 변형을 포함한다. 벡터는 형질도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 보조 요소(예를 들어, cPPT/FLAP), 바이러스 패키징(예를 들어, 프사이(Ψ) 패키징 신호, RRE), 및/또는 치료용 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소(예를 들어, poly(A) 서열)를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함할 수 있다. 당업자는, 본 개시내용의 기존 구현예로부터 다수의 다른 상이한 구현예가 형성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"숙주세포"는, 본 개시내용의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드로 생체내, 생체외 또는 시험관내 트랜스펙션, 감염 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주세포는 패키징 세포, 생산 세포, 및 바이러스 벡터에 감염된 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터에 감염된 숙주세포가 요법을 필요로 하는 대상에게 투여된다. 특정 구현예에서, "표적세포"라는 용어는 숙주세포와 상호교환적으로 사용되며, 목적하는 세포 유형의 트랜스펙션, 감염 또는 형질도입된 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적세포는 T세포이다.
대규모 바이러스 입자 생산은 종종 합리적인 바이러스 역가를 달성하는 데 필요하다. 바이러스 입자는 전달 벡터를, 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자, 예를 들어 gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자, 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포주에 트랜스펙션시키는 방식으로 생산된다.
본원에 사용된 "패키징 벡터"라는 용어는 패키징 신호가 결여된 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 나타내며, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되어 있으며, 트랜스펙션, 형질도입 또는 감염을 통해 세포에 도입된다. 트랜스펙션, 형질도입 또는 감염 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 개시내용의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터는 트랜스펙션, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주에 도입되어, 생산 세포 또는 세포주를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 패키징 벡터는, 예를 들어 인산칼슘 트랜스펙션, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는 통상의 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 벡터는 네오네오마이신(neomycin), 히그로마이신(hygromycin), 퓨로마이신(puromycin), 블라스티시딘(blasticidin), 제오신(zeocin), 티미딘 키나아제, DHFR, Gln 합성효소 또는 ADA와 같은 우성 선별 마커와 함께 세포에 도입된 후, 적절한 약물의 존재 하에서 선별되고, 클론이 단리된다. 선별 마커 유전자는 패키징 벡터, 예를 들어 IRES 또는 자가 절단 바이러스 펩타이드에 의해 인코딩되는 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 궁극적으로 세포주에서 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주세포의 범위를 결정한다. HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV와 같은 렌티바이러스의 경우, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 패키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은, 이전에 기재된 바와 같이, 바이러스 gag 및 pol 유전자와 별개의 벡터 상에 인코딩된다.
본원에 기재된 구현예에 이용될 수 있는 레트로바이러스 유래 env 유전자의 예시적인 예에는, 비제한적으로, MLV 외피, IOAI 외피, BAEV, FeLV-B, RDI 14, SSAV, 에볼라(Ebola), 센다이(Sendai), FPV(조류 흑사병 바이러스) 및 인플루엔자바이러스 외피가 포함된다. 유사하게, RNA 바이러스(예를 들어, 피코마바이러스과(Picomaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 아스트로바이러스과(Astroviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분야바이러스과(Bunyaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 비마바이러스과(Bimaviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae)의 RNA 바이러스 패밀리)뿐 아니라, DNA 바이러스(헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 시르코바이러스과(Circoviridae), 파르보바이러스과(Parvoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)의 패밀리)의 외피를 인코딩하는 유전자가 이용될 수 있다. 대표적인 예에는, FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 광견병, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTL V, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CTIO 및 EIAV가 포함된다.
다른 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스를 위형화하기 위한 외피 단백질에는, 비제한적으로, 하기 바이러스 중 임의의 것이 포함된다: 인플루엔자 A(예컨대, H1N1, H1N2, H3N2 및 H5Nl(조류 독감)), 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염바이러스, B형 간염바이러스, C형 간염바이러스, D형 간염바이러스, E형 간염바이러스, 로타바이러스, 노워크(Norwalk) 바이러스 군 중 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스, 파르보바이러스, 뎅기열 바이러스, 원숭이 폭스, 모노네가바이러스(Mononegavirus), 리사바이러스(Lyssavirus)(예컨대, 광견병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 모콜라바이러스(Mokola virus), 듀벤헤이즈바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 바이러스 1 & 2 및 호주 박쥐 바이러스), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 헤르페스바이러스(예컨대, 단순헤르페스바이러스 유형 1 및 2, 대상포진, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 유형 6 및 8, 인간 면역결핍바이러스(HIV), 유두종 바이러스, 쥣과 감마 헤르페스바이러스), 아레나바이러스(예컨대, 아르헨티나 출혈열바이러스, 볼리비아 출혈열바이러스, 사비아(Sabia) 관련 출혈열바이러스, 베네수엘라 출혈열바이러스, 라싸열바이러스, 마추포바이러스(Machupo virus), 림프구성 맥락수막염바이러스(LCMV)), 분야바이러스과(예컨대 크리미안-콩고(Crimean-Congo) 출혈열바이러스, 한타바이러스, 신증후군 동반 출혈열 유발 바이러스, 리프트계곡열바이러스(Rift Valley fever virus) 포함), 필로바이러스과(필로바이러스)(에볼라 출혈열 및 마르부르크 출혈열 포함), 플라비바이러스과(키아사누르삼림열바이러스(Kyasanur Forest disease virus), 옴스크(Omsk) 출혈열바이러스, 진드기매개뇌염 유발 바이러스 포함), 및 파라믹소바이러스과(예컨대, 헨드라바이러스(Hendra virus) 및 니파바이러스(Nipah virus), 대두창 및 소두창(천연두) 포함), 알파바이러스(예컨대, 베네수엘라 말 뇌염바이러스, 동부 말 뇌염바이러스, 서부 말 뇌염바이러스), SARS 관련 코로나바이러스(SARS-Co V), 웨스트나일바이러스(West Nile virus), 또는 임의의 뇌염 유발 바이러스.
본원에 사용된 "위형" 또는 "위형화"라는 용어는, 바이러스 외피 단백질이 다른 특징으로 보유하는 또 다른 바이러스의 바이러스 외피 단백질로 치환된 바이러스를 나타낸다. 예를 들어, HIV는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 위형화될 수 있으며, 이는 (env 유전자에 의해 인코딩된) HIV 외피 단백질이 통상적으로 바이러스를 CD4+ 제시세포로 표적화하기 때문에, HIV가 더 넓은 범위의 세포를 감염시키는 것을 가능하게 한다.
본원에 사용된 "패키징 세포주"라는 용어는, 패키징 신호를 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 정확한 패키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어, gag, pol 및 env)를 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 세포주와 관련하여 사용된다. 본 개시내용의 패키징 세포를 제조하는 데 임의의 적합한 세포주가 이용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포주 생산에 사용되는 세포는 인간 세포이다. 패키징 세포주 생산에 사용될 수 있는 적합한 세포주에는, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10Tl/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, BMT10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HTI080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포가 포함된다.
본원에 사용된 "생산 세포주"라는 용어는, 패키징 세포주와 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 구조체를 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포주를 나타낸다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 스톡 용액의 생산은 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 스톡 용액의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633] 및 문헌[N. R. Landau et al. (1992) J Virol. 66:5110-5113]에 예시되어 있다. 감염성 바이러스 입자는 통상적인 기술을 사용하여 패키징 세포로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 감염성 입자는, 당업계에 공지된 바와 같이, 세포 용해, 또는 세포 배양물의 상청액 수집에 의해 수집될 수 있다. 선택적으로, 목적하는 경우, 수집된 바이러스 입자는 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
트랜스펙션이 아닌 바이러스 감염에 의한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 유전자(들) 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열의 전달은 "형질도입"으로 지칭된다. 하나의 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내로 형질도입된다. 특정 구현예에서, 표적세포, 예를 들어 T세포는, 이것이 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 세포에 전달된 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, "형질도입된" 것이다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 이의 세포 게놈에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, T세포는 서열번호 11과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%의 동일성)을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질도입된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 DN TGF-β 수용체 구조체와 조작된 TCR 및/또는 CAR을 공동발현하는 숙주세포가 제공된다. 숙주세포는 본 개시내용의 DN TGF-β 수용체 구조체와 조작된 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 숙주세포는 T세포 악성종양을 치료 및/또는 예방하기 위해 대상에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에 따라 이용될 수 있는, 유전자 치료에서 바이러스 벡터의 사용과 관련된 다른 방법은, 예를 들어 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[Kay, M.A. (1997) Chest 111(6 Supp.): 138S-142S]; 문헌[Ferry, N. and Heard, J.M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81]; 문헌[Shiratory, Y. et al., (1999) Liver 19:265-74]; 문헌[Oka, K. et al., (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86]; 문헌[Thule, P. M. and Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52]; 문헌[Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56]; 문헌[Alt, M. (1995) J Hepatol. 23:746-58]; 문헌[Brody, S. L. and Crystal, R.G. (1994) Ann. NY Acad. Sci. 716:90-101]; 문헌[Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172]; 문헌[Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49]; 및 문헌[Lee, H. C. et al., (2000) Nature 408:483-8].
본원에 기재된 조성물은 본원에서 고려되는 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 이를 포함하는 벡터 및 T세포 조성물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 하나의 구현예는, 본원에 기재된 하나 이상의 조작된 DN TGF-β 수용체와 조작된 TCR 및/또는 CAR을 공동발현하는 변형된 T세포를 포함하는 조성물이다. 조성물은, 비제한적으로, 약학적 조성물을 포함한다. "약학적 조성물"은, 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 치료 방식과 조합으로 세포 또는 동물에게 투여하기 위해 약학적으로 허용 가능하거나 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 제형화된 조성물을 나타낸다. 또한, 목적하는 경우, 본 개시내용의 조성물이, 예를 들어 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 소분자, 화학요법제, 전구약물, 약물, 항체, 또는 다른 다양한 약학적 활성제와 같은 다른 작용제와 조합으로 투여될 수 있다고 이해될 것이다. 추가의 작용제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 조성물에 포함될 수 있는 다른 구성요소에는 사실상 제한이 없다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 본원에서 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 상응하여, 인간 및 동물이 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여형을 나타내는 데 이용된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"에는, 비제한적으로, 미국식품의약국(United States Food and Drug Administration)에서 인간 또는 가축에 사용할 수 있다고 승인된 임의의 아쥬반트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증강제, 계면활성제, 습윤화제, 분산제, 현탁화제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제 또는 유화제가 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분류; 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체;
트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올류; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르류; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 무발열원수; 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약학적 제형에 이용되는 임의의 다른 상용성 물질.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에서 고려되는 변형된 T세포를 일정량 포함한다. 본원에서 고려되는 T세포를 포함하는 약학적 조성물이 체중 1 ㎏ 당 102개 내지 1010개의 세포, 체중 1 ㎏ 당 105개 내지 109개의 세포, 체중 1 ㎏ 당 105개 내지 108개의 세포, 체중 1 ㎏ 당 105개 내지 107개의 세포, 체중 1 ㎏ 당 107개 내지 109개의 세포, 또는 체중 1 ㎏ 당 107개 내지 108개의 세포(해당 범위 내 모든 정수값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있다고 일반적으로 명시될 수 있다. 세포의 수는 그 안에 포함된 세포 유형과 마찬가지로 조성물이 의도되는 궁극적인 용도에 따라 달라질 것이다. 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하도록 변형된 T세포는 이러한 범위 내 투여량으로 수 회 투여될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 동종이형, 동계, 이종 또는 자가일 수 있다. 목적하는 경우, 치료는 또한 융합된 T세포의 생착 및 기능을 증강시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 미토겐(예를 들어, PHA) 또는 림포카인, 사이토카인, 및/또는 케모카인(예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNF-알파, IL-18 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 포함하는 조성물은 면역저하되거나 면역억제된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 일부에서, 본원에서 고려되는 변형된 T세포를 포함하는 조성물은 암의 치료에 사용된다. 본원에 기재된 변형된 T세포는 단독으로, 또는 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15, 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 구성요소와 조합된 약학적 조성물로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 약학적 조성물은, 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로, 일정량의 유전적으로 변형된 T세포를 포함한다.
본원에서 고려되는 변형된 T세포를 포함하는 약학적 조성물은 다음을 추가로 포함할 수 있다: 중성으로 완충된 식염수, 인산염 완충된 식염수 등과 같은 완충액; 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신과 같은 아미노산 또는 폴리펩타이드; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 아쥬반트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제. 본 개시내용의 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여에 맞게 제형화될 수 있다.
용액, 현탁액 또는 다른 유사 형태일 수 있는 액체 약학적 조성물은, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 생리 식염수와 같은 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드와 같은 불휘발성유(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 긴장성 조정제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 시린지 또는 다회용 바이알에 동봉될 수 있다. 멸균 주사용 약학적 조성물이 또한 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 조성물은 유효량의 확장된 변형된 T세포 조성물을, 단독으로, 또는 하나 이상의 치료제와 조합으로 포함한다. 따라서, T세포 조성물은 단독으로, 또는 방사선요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬요법, 광역학요법 등과 같은 다른 공지된 암 치료법과 조합으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 또한 항생제 또는 항바이러스제와 조합으로 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 질환 상태, 예를 들어 암을 위한 치료로 당업계에서 허용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에서 고려되는 조성물은 또한 TGF-β의 저해제, 예를 들어 소분자 저해제 LY55299와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 고려되는 예시적인 치료제에는, 사이토카인, 성장인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항염증제, 화학요법제, 방사선요법제, 치료용 항체, 또는 다른 활성제 및 보조제가 포함된다.
특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 T세포를 포함하는 조성물은 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예시적인 예에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 티오테파(thiotepa) 및 시클로포스파미드(CYTOXAN™)와 같은 알킬화제; 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan)과 같은 알킬 설포네이트류; 벤조도파(benzodopa), 카르보퀀(carboquone), 메투레도파(meturedopa) 및 우레도파(uredopa)와 같은 아지리딘류; 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민 수지를 포함하는 에틸렌이민류 및 메틸멜라민류; 클로람부실(chlorambucil), 클로마파진(chlomaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드류; 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine)과 같은 니트로소우레아류; 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 안트라마이신(anthramycin), 아자세린(azaserin), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼리케아마이신(calicheamicin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin)과 같은 항생제; 메토트렉세이트(methotrexate) 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사산물; 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate)와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine)과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘, 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine), 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone)과 같은 안드로겐류; 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane)과 같은 항아드레날린제; 프롤린산(frolinic acid)과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지퀀(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카르바진(procarbazine); PSK®; 라족산(razoxane); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄; 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지퀀(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드류, 예를 들어 파클리탁셀(paclitaxel)(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(doxetaxel)(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴(vinblastine); 백금; 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라아제 저해제 RPS 2000; 디플루오로메틸로미틴(difluoromethylomithine, DMFO); Targretin™(벡사로텐(bexarotene)), Panretin™(알리트레티노인(alitretinoin))과 같은 레티노산 유도체; ONTAK™(데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox)); 에스페라마이신(esperamicin); 카페시타빈(capecitabine); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체. 이러한 정의에는 또한, 예를 들어 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 아로마타아제 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 및 토레미펜(toremifene)(Fareston)을 포함하는 항에스트로겐류; 및 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide) 및 고세렐린(goserelin)과 같은 항안드로겐류와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항호르몬제; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
다양한 기타 치료제가 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, T세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여된다. 항염증 작용제 또는 약물에는, 비제한적으로, 스테로이드류 및 글루코코르티코이드류(베타메타손(betamethasone), 부데소니드(budesonide), 덱사메타손(dexamethasone), 히드로코르티손 아세테이트(hydrocortisone acetate), 히드로코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니솔론, 프레드니손(prednisone), 트리암시놀론(triamcinolone) 포함), 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)(아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen), 메토트렉세이트, 설파살라진(sulfasalazine), 레플루노미드(leflunomide), 항-TNF 약제, 시클로포스파미드 및 마이코페놀레이트 포함)가 포함된다.
일부 구현예에서, NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 저해제(예컨대, VIOXX®(로페콕시브(rofecoxib)) 및 CELEBREX®(셀레콕시브(celecoxib))) 및 시알릴레이트(sialylate)로 이루어지는 군에서 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜(acetaminophen), 옥시코돈(oxycodone), 트라마돌(tramadol) 또는 프로폭시펜 히드로클로라이드로 이루어지는 군에서 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드류는 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어지는 군에서 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 개질제에는, 세포 표면 마커에 대해 지향된 분자(예를 들어, CD4, CD5 등), TNF 안타고니스트(예를 들어, 에타네르셉트(etanercept)(ENBREL®), 아달리무맙(adalimumab)(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(infliximab)(REMICADE®))와 같은 사이토카인 저해제, 케모카인 저해제 및 접착 분자 저해제가 포함된다. 생물학적 반응 개질제는 단클론 항체뿐 아니라 재조합 형태의 분자를 포함한다. 예시적인 질환 조절 항류마티스제(DMARD)에는, 아자티오프린(azathioprine), 시클로포스파미드, 시클로스포린(cyclosporine), 메토트렉세이트, 페니실라민(penicillamine), 레플루노미드, 설파살라진, 히드록시클로로퀸, 금(경구(아우라노핀(auranofin)) 및 근육내) 및 미노사이클린이 포함된다.
다른 구현예에서, 본원에서 고려되는 CAR 변형된 T세포와 조합하기에 적합한 치료용 항체에는, 비제한적으로, 아바고보맙(abagovomab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아푸투주맙(afutuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알투모맙(altumomab), 아마툭시맙(amatuximab), 아나투모맙(anatumomab), 아르시투모맙(arcitumomab), 바비툭시맙(bavituximab), 벡투모맙(bectumomab), 베바시주맙(bevacizumab), 비바투주맙(bivatuzumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙(brentuximab), 칸투주맙(cantuzumab), 카투막소맙(catumaxomab), 세툭시맙(cetuximab), 시타투주맙(citatuzumab), 식수투무맙(cixutumumab), 클리바투주맙(clivatuzumab), 코나투무맙(conatumumab), 다라투무맙(daratumumab), 드로지투맙(drozitumab), 두리고투맙(duligotumab), 두시기투맙(dusigitumab), 데투모맙(detumomab), 다세투주맙(dacetuzumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 에크로멕시맙(ecromeximab), 엘로투주맙(elotuzumab), 엔시툭시맙(ensituximab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 에타라시주맙(etaracizumab), 파리에투주맙(farietuzumab), 피클라투주맙(ficlatuzumab), 피기투무맙(figitumumab), 플란보투맙(flanvotumab), 푸툭시맙(futuximab), 가니투맙(ganitumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 글렘바투무맙(glembatumumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이고보맙(igovomab), 임가투주맙(imgatuzumab), 인다툭시맙(indatuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 인테투무맙(intetumumab), 이필리무맙(ipilimumab), 이라투무맙(iratumumab), 라베투주맙(labetuzumab), 렉사투무맙(lexatumumab), 린투주맙(lintuzumab), 로르보투주맙(lorvotuzumab), 루카투무맙(lucatumumab), 마파투무맙(mapatumumab), 마투주맙(matuzumab), 밀라투주맙(milatuzumab), 민레투모맙(minretumomab), 미투모맙(mitumomab), 목세투모맙(moxetumomab), 나마투맙(namatumab), 납투모맙(naptumomab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 노페투모맙(nofetumomab), 오카라투주맙(ocaratuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오나르투주맙(onartuzumab), 오포르투주맙(oportuzumab), 오레고보맙(oregovomab), 파니투무맙(panitumumab), 파르사투주맙(parsatuzumab), 파트리투맙(patritumab), 펨투모맙(pemtumomab), 페르투주맙(pertuzumab), 핀투모맙(pintumomab), 프리투무맙(pritumumab), 라코투모맙(racotumomab), 라드레투맙(radretumab), 릴로투무맙(rilotumumab), 리툭시맙, 로바투무맙(robatumumab), 사투모맙(satumomab), 시브로투주맙(sibrotuzumab), 실툭시맙(siltuximab), 심투주맙(simtuzumab), 솔리토맙(solitomab), 타카투주맙(tacatuzumab), 타플리투모맙(taplitumomab), 테나투모맙(tenatumomab), 테프로투무맙(teprotumumab), 티가투주맙(tigatuzumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 투코투주맙(tucotuzumab), 우블리툭시맙(ublituximab), 벨투주맙(veltuzumab), 보르세투주맙(vorsetuzumab), 보투무맙(votumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), CC49 및 3F8이 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 본원에 사용된 "사이토카인"이란, 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 총칭을 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는, 림포카인, 모노카인, 케모카인 및 전형적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에는, 하기가 포함된다: 인간 성장호르몬, N-메티오닐 인간 성장호르몬 및 소 성장호르몬과 같은 성장호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신(thyroxine); 인슐린; 프로인슐린(proinsulin); 렐락신(relaxin); 프로렐락신; 여포자극호르몬(FSH), 갑상선자극호르몬(TSH) 및 황체형성호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장인자; 섬유아세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양괴사인자-알파 및 종양괴사인자-베타; 뮬러관(mullerian) 저해 물질; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩타이드; 인히빈(inhibin); 액티빈(activin); 혈관내피성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장인자; 혈소판 성장인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장인자(TGF); 인슐린 유사 성장인자-I 및 인슐린 유사 성장인자-II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도인자; 인터페론-알파, 인터페론-베타, 및 인터페론-감마와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF)와 같은 집락자극인자(CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15와 같은 인터류킨(IL); TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양괴사인자; 및 LIF 및 kit 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자. 본원에 사용된 사이토카인이라는 용어는, 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
본 개시내용은, 부분적으로, 표적세포, 예를 들어 종양 또는 암 세포로 재지향되고, 본원에 기재된 조작된 DN TGF-β 수용체와, 세포 상의 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 갖는 조작된 TCR 또는 CAR을 포함하는 유전적으로 변형된 T세포(본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함)를 고려한다. 암세포는 또한 혈액 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 암에는 몇 가지 주요 유형이 존재한다. 암종은 내부 기관의 막을 형성하거나 이를 덮고 있는 조직 또는 피부에서 시작되는 암이다. 육종은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관, 또는 다른 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액 형성 조직에서 시작되며, 많은 수의 비정상 혈액세포가 생성되어 혈액으로 들어가는 암이다. 림프종과 다발골수종은 면역계의 세포에서 시작되는 암이다. 중추신경계암은 뇌 및 척수의 조직에서 시작되는 암이다.
하나의 구현예에서, 표적세포는 항원, 예를 들어 표적 항원을 발현한다. 하나의 구현예에서, 표적세포는 췌장실질세포, 췌관세포, 간세포(hepatic cell), 심근세포, 골격근세포, 골모세포, 골격근모세포, 뉴런, 혈관내피세포, 색소세포, 평활근세포, 신경아교세포, 지방세포, 뼈세포, 연골세포, 췌도세포, CNS 세포, PNS 세포, 간 세포(liver cell), 지방세포, 간세포, 신장세포, 폐세포, 피부세포, 난소세포, 여포세포, 상피세포, 면역세포 또는 내피세포이다.
특정 구현예에서, 표적세포는 췌장 조직, 신경 조직, 심장 조직, 골수, 근육 조직, 뼈 조직, 피부 조직, 간 조직, 모낭, 혈관 조직, 지방 조직, 폐 조직 및 신장 조직의 일부이다.
하나의 구현예에서, 표적세포는 종양세포이다. 또 다른 구현예에서, 표적세포는 암을 앓고 있는 환자의 세포와 같은 암세포이다. 본원에 개시된 방법으로 사멸될 수 있는 예시적인 세포에는, 하기 종양의 세포가 포함된다: 급성 백혈병(예컨대, 급성림프구성백혈병, 급성골수구성백혈병, 및 골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적혈구성 백혈병), 만성 백혈병(예컨대, 만성골수구성(과립구성)백혈병 및 만성림프구성백혈병), 진성적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨림프종, 다발골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병을 포함하는 백혈병과 같은 액상 종양.
또 다른 구현예에서, 세포는 육종 및 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간세포암종, 폐암, 결장직장암, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종(예를 들어, 췌장, 결장, 난소, 폐, 유방, 위, 전립선, 자궁경부 또는 식도의 선암종), 땀샘암종, 피지선암종, 유두암종, 유두선암종, 수질암종, 기관지암종, 신장세포암종, 간암, 담관암종, 융모막암종, 윌름 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 방광암종, CNS 종양(예컨대, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청각신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종)과 같은 고형 종양세포이다.
하나의 구현예에서, 암은 윌름 종양, 유잉육종, 신경내분비 종양, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 피부암, 유방암, 결장암, 직장암, 전립선암, 간암, 신장암, 췌장암, 폐암, 담도암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 갑상선수질암종, 난소암, 신경교종, 림프종, 백혈병, 골수종, 급성림프모구성백혈병, 급성골수성백혈병, 만성림프구성백혈병, 만성골수성백혈병, 호지킨림프종, 비호지킨림프종 및 방광암을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 표적세포는 간, 췌장, 폐, 유방, 방광, 뇌, 뼈, 갑상선, 신장, 피부 및 조혈계의 악성세포이다. 또 다른 구현예에서, 표적세포는 간암, 췌장암, 폐암, 유방암, 방광암, 뇌암, 골암, 갑상선암, 신장암, 피부암 또는 혈액암의 세포이다. 또 다른 구현예에서, 표적세포는 세포, 예를 들어, 비제한적으로, CMV, HPV 및 EBV를 포함하는 바이러스에 의해 감염된 암세포이다.
하나의 구현예에서, 표적 항원은, HPV-16 E6 및 HPV-16 E7을 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 패밀리, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TAG72, TEM, 및 VEGFRII의 에피토프이거나, 또는 이들에 지향된다.
본원에서 고려되는 변형된 T세포는, 비제한적으로, 암, 감염성질환, 자가면역질환, 염증성질환 및 면역결핍을 포함하는 다양한 병태의 치료에 사용되는 개선된 입양 면역요법을 제공한다. 일부 구현예에서, 1차 T세포의 특이성은 본원에서 고려되는 TCR 또는 CAR과 조작된 DN TGF-β 수용체를 공동발현하도록 조작된 1차 T세포를 유전적으로 변형시키는 방식으로 종양 또는 암 세포에 대해 재지향된다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 이용하는 경우, CAR의 scFv의 항원 결합 도메인은 T세포를 종양 항원을 발현하는 세포로 지향시키고, 본원에 기재된 TGF-β 수용체 구조체는 TGF-β의 억제 효과를 저해하는 방식으로 이러한 T세포의 집단을 보호한다.
본 개시내용의 하나의 구현예는, 조작된 DN TGF-β 수용체와 조작된 TCR 또는 CAR을 공동발현하도록 T세포를 변형시키고(표적 항원을 발현하는 암세포를 표적으로 하는 본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함), 변형된 T세포를 이를 필요로 하는 수용체에게 주입하는 일종의 세포 요법을 포함한다. 따라서, 주입된 세포는 TGF-β 억제의 영향을 최소화하면서 수용체에서 종양세포를 사멸시킬 수 있다.
임의의 세포는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 폴리펩타이드에 대한 숙주세포로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵생물 세포, 진균 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포와 같은 고등 진핵생물 세포일 수 있다. 적합한 원핵생물 세포에는, 비제한적으로, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 유박테리아(eubacteria), 예를 들어 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 에스케리키아 콜라이(E. Coli)와 같은 엔테로박테리아과(Enterobactehaceae); 엔테로박터(Enterobacter); 에르위니아(Erwinia); 클레브시엘라(Klebsiella); 프로테우스(Proteus); 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium); 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella); 바실러스(Bacilli), 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis); 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. Aeruginosa); 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역세포이다. 일부 구현예에서, 면역세포는 T세포, B세포, 종양침윤림프구(TIL), TCR 발현 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상세포, 과립구, 선천성 림프세포, 거핵세포, 단핵구, 대식세포, 혈소판, 흉선세포 및 골수세포로 이루어지는 군에서 선택된다. 하나의 구현예에서, 면역세포는 T세포이다. 또 다른 구현예에서, 면역세포는 NK세포이다. 특정 구현예에서, T세포는 종양침윤림프구(TIL), 자가 T세포, 조작된 자가 T세포(eACT™), 동종이형 T세포, 이종 T세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 항체 요법, 또는 단독형 TCR 또는 CAR 변형된 T세포와 달리, 본원에 기재된 조작된 DN TGF-β 수용체와 조작된 TCR 또는 CAR을 공동발현하도록 변형된 T세포(또는 상기 기재된 바와 같은 임의의 세포)는 생체내에서 복제되어 지속적인 암 치료로 이어질 수 있는 장기 지속성에 기여할 수 있을 뿐 아니라, TGF-β의 억제 영향을 회피할 수 있는 추가의 이점이 있다. 따라서, 본원에 기재된 하나의 구현예는, 본원에 기재된 DN TGF-β 수용체와 본원에 기재된 바와 같은 TCR 또는 CAR을 공동발현하는 변형된 T세포의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, TGF-β의 활성을 저해하는 방법이다.
임의의 이론에 구애됨 없이, 본원에 기재된 변형된 T세포의 투여는, T세포가 표적 항원의 특이성을 여전히 유지하면서, TGF-β 리간드가 TGF-βRI 이량체-DN TGF-βRII 이량체 복합체에 결합함에도 불구하고, 세포내 pSMAD 신호전달을 개시하는 인산화 캐스케이드를 저해하는 DN TGF-β 수용체를 유도하는 것으로 이해된다. 또 다른 구현예에서, TGF-β의 활성을 저해하는 방법은, 형질도입되지 않은 T세포에서의 pSMAD2 및 pSMAD3의 수준과 비교하여 pSMAD2 및 pSMAD3의 수준의 감소를 포함한다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 T세포의 투여는, pSMAD2 및 pSMAD3의 수준을 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 또는 약 50% 내지 약 60% 감소시킨다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, pSMAD2의 감소는 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%일 수 있다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, pSMAD3의 감소는 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%일 수 있다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 T세포의 투여는, TGF-β1의 존재 하에서 사이토카인 분비를 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 또는 약 50% 내지 약 60% 증가시킨다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 T세포의 투여는, TGF-β1의 존재 하에서 사이토카인 분비를 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 증가시킨다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 TCR 또는 CAR과 DN TGF-β 수용체를 공동발현하는 T세포는, 치료용 T세포의 집단이 연장된 기간 동안 유지되거나 지속될 수 있도록 T세포 확장을 거칠 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 또 다른 구현예는, 본원에 기재된 T세포의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, T세포 집단을 확장시키는 방법이다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, T세포 집단은 7일 후 약 50% 내지 약 100%, 7일 후 약 60% 내지 약 90%, 또는 7일 후 약 70% 내지 약 80% 남아있다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, T세포 집단은 7일 후 약 50%, 7일 후 약 60%, 7일 후 약 70%, 7일 후 약 80%, 7일 후 약 90%, 또는 7일 후 약 100% 남아있다.
본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 T세포의 투여는, TGF-β1의 존재 하에서 형질도입된 T세포를 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 또는 약 30% 내지 약 80% 확장시킨다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 T세포의 투여는, TGF-β1의 존재 하에서 형질도입된 T세포를 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 확장시킨다.
본원에 기재된 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 코돈 최적화된 서열로부터 변형된 T세포의 투여는, 발현 효율을 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 증가시킨다. 본원에 기재된 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 코돈 최적화된 서열로부터 변형된 T세포의 투여는, 형질도입 효율을 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 증가시킨다.
임의의 이론에 구애됨 없이, CAR T세포 요법의 유망한 용도에도 불구하고, 종양 항원의 부재 하에서의 구성적 긴장성 신호전달은 감소된 효율, 불량한 CAR T세포 생존 및 독성을 초래할 수 있다고 여겨진다(문헌[Ajina et al., Mol Cancer Ther., 17(9):1795-1815(2018)]). 따라서, 긴장성 신호전달이 감소된 CAR T세포 요법은 우수한 성능을 나타낸다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 종양 항원의 부재 하에서의 본원에 기재된 바와 같은 코돈 최적화된 서열로부터 변형된 T세포의 투여는, 사이토카인 방출을 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 감소시킨다. 본원에 기재된 하나의 구현예에서, 종양 항원 부재 하에서의 코돈 최적화된 서열로부터 변형된 T세포의 투여는, 사이토카인 방출을 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 감소시킨다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 코돈 최적화된 서열로부터 변형된 T세포의 투여는, 종양 부피를 약 50% 내지 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 또는 약 30% 내지 약 80% 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 종양 부피의 감소는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%이다.
본원에 기재된 또 다른 구현예는, 본원에 기재된 바와 같은 TCR 또는 CAR과 DN TGF-β 수용체를 공동발현하는 T세포를 포함하는 조성물의 유효량, 예를 들어 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법이다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 병태, 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 따라 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 또 다른 구현예는, 본원에 기재된 바와 같은 TCR 또는 CAR과 DN TGF-β 수용체를 공동발현하는 T세포를 포함하는 조성물(본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함)의 유효량, 예를 들어 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 간암의 치료를 필요로 하는 대상에서 간암을 치료하는 방법이다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 병태, 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 따라 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 T세포를 포함하는 조성물(본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함)은, 비제한적으로, 간암, 췌장암, 폐암, 유방암, 방광암, 뇌암, 골암, 갑상선암, 신장암, 피부암 또는 바이러스에 의해 유도된 암을 포함하는 고형 종양 또는 암의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 TCR 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 유전적으로 변형된 T세포를 포함하는 조성물(본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함)은, 다양한 암의 치료에 사용되는 BCMA, CD19, CD20, CD28, CD137(4-1BB), CLL-1, GPC3, PCMA, 또는 PSMA의 에피토프에 결합하는 항원 특이적 결합 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에서 고려되는 변형된 T세포 또는 이를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을, 단독으로, 또는 하나 이상의 치료제와 조합으로, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 세포는 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 변형된 T세포의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
당업자는, 본 개시내용의 조성물의 다회투여가 목적하는 요법을 유효하게 하는 데 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회, 또는 그 이상 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 활성화된 T세포를 대상에게 투여한 후, 다시 채혈하여(또는 성분채집술을 수행하여), 본 개시내용에 따라 T세포를 활성화시키고, 이러한 활성화되고 확장된 T세포를 환자에게 다시 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 몇 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, T세포는 10cc 내지 400cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 이러한 다회 채혈/다회 재주입 프로토콜의 사용은 T세포의 특정 집단을 선택하는 역할을 할 수 있다.
본원에서 고려되는 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 착상 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 구절은 통상적으로 주사에 의한, 장관내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 나타내며, 이에는, 비제한적으로, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다. 하나의 구현예에서, 본원에서 고려되는 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위로의 직접 주사를 통해 대상에게 투여된다.
하나의 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상은 상기 대상에서 암에 대한 세포 면역반응을 증가시키는 조성물의 유효량을 투여받는다. 면역반응은 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 T세포, 조절 T세포 및 헬퍼 T세포 반응에 의해 매개되는 세포 면역반응을 포함할 수 있다. B세포를 활성화시켜 항체 생산을 유도할 수 있는 헬퍼 T세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응이 또한 유도될 수 있다. 본 개시내용의 조성물에 의해 유도된 면역반응의 유형을 분석하는 데 다양한 기술이 사용될 수 있으며, 이들은 당업계에 널리 설명되어 있다; 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y].
T세포 매개 사멸의 경우, CAR-리간드 결합은 T세포로의 CAR 신호전달을 개시하여, T세포가 다양한 메커니즘에 의해 표적세포 세포자멸사를 유도할 수 있는 단백질을 생산하거나 방출하도록 유도하는 다양한 T세포 신호전달 경로를 활성화시킨다. 이러한 T세포 매개 메커니즘에는, (비제한적으로) T세포에서 표적세포로의 세포내 세포독성 과립의 전달, 표적세포 사멸을 직접적으로(또는 다른 살해 이펙터 세포의 동원을 통해 간접적으로) 유도할 수 있는 전염증성 사이토카인의 T세포 분비, 및 표적세포의 동족 사멸 수용체(예를 들어, Fas)에 결합한 후 표적세포 세포자멸사를 유도하는 T세포 표면 상의 사멸 수용체 리간드(예를 들어, FasL)의 상향조절이 포함된다.
본원에 기재된 하나의 구현예는 암으로 진단된 대상을 치료하는 방법으로서, 대상에서 T세포를 제거하는 단계, 본원에서 고려되는 바와 같은 TCR 또는 CAR과 조작된 DN TGF-β 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함)로 상기 T세포를 유전적으로 변형시켜, 변형된 T세포의 집단을 생성하는 단계, 및 상기 대상에게 변형된 T세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 또한 조작된 DN TGF-β 수용체와 TCR 또는 CAR 분자를 인코딩하는 핵산 구조체(본원에 기재된 CAR-DN TGF-β 수용체 구조체를 포함함)를 발현하는 면역 이펙터 세포 집단을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 표적세포 집단에 대한 이펙터 세포 매개 면역 조절 반응을 자극시키는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 세포 조성물을 투여하는 방법은, 대상에서 조작된 TCR 또는 CAR을 직접적으로 발현하는 생체외 유전적으로 변형된 면역 이펙터 세포의 재도입, 또는 대상에게의 도입 시 조작된 TCR 또는 CAR을 발현하는 성숙 면역 이펙터 세포로 분화되는 면역 이펙터 세포의 유전적으로 변형된 전구체의 재도입을 유도하는 데 효과적인 임의의 방법을 포함한다. 하나의 방법은 말초혈액 T세포를 생체외에서 본 개시내용에 따른 핵산 구조체로 형질도입하는 단계, 및 형질도입된 세포를 대상에게 다시 돌려보내는 단계를 포함한다.
전술한 개시내용은 이해의 명확성을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않는 한, 본 개시내용의 교시에 비추어 특정 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 하기 실시예는 단지 예시로서 제공되는 것으로, 제한하고자 하는 것이 아니다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 산출하도록 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 비임계 매개변수를 쉽게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
조작된 우성 음성 TGF-β 수용체 유형 1(DN TGF-βRI) 구조체를 서열번호 10의 서열에 따라 설계하고 합성하였다. 이러한 구조체는 152개 아미노산 길이이며, 야생형 TGF-βRI의 아미노산 1번 내지 33번의 신호 펩타이드 도메인; 야생형 TGF-βRI의 아미노산 34번 내지 126번의 세포외 도메인; 야생형 TGF-βRI의 아미노산 127번 내지 147번의 막관통 도메인; 및 TGFβ-RII의 아미노산 148번 내지 152번의 세포내 도메인을 포함한다. 상기 구조체는 세포내 pSMAD 신호전달을 위한 핵심 인산화 부위를 생략하도록 설계되어 있다. 세포내 도메인은 특히 TGFβ-RII에서 유도되며, 5개의 아미노산을 포함한다.
또한, 조작되고 절단된 우성 음성 TGF-β 수용체 유형 2(DN TGF-βRII)를 또한 서열번호 14의 서열에 따라 설계하고 합성하였다.
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQ
(서열번호 14).
하기 실시예에 사용된 TCR 및 CAR 구조체는 당업계에 공지된 통상의 기술을 사용하여 설계하고 제조하였다. 2개의 상이한 공동자극 도메인(CD28 및 4-1BB)을 갖는 2개의 상이한 CAR 구조체가 하기에 제시되어 있다:
a. CD19: (FMC63 scFv + CD28 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인)
b. PSMA: (PSMA scFv + 4-1BB 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인).
모든 T세포 형질도입에 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. 모든 제조 및 시험한 구조체와 함께 EF1A 프로모터를 사용하였다.
STEMCELL™ Technologies(Vancouver, Canada)에서 입수한 CD3+ 세포를 건강한 공여자에서 얻은 말초혈액단핵세포에서 단리하고, CryoStor® 세포 동결보존 배지(Sigma Aldrich®)에서 동결시켰다. 렌티바이러스 형질도입 전, CD3 범용 T세포를 해동시키고, 제조업체 권장사항에 따라 CD3/CD28 Dynabeads®(ThermoFisher Scientific)를 이용하여 활성화시키고, 밤새 휴지시켰다. 다음 날, 세포를 본원에 기재된 바와 같은 우성 음성 수용체(DNR)를 포함하거나 포함하지 않는 myc 태깅된 CAR 구조체를 함유하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 5% 인간 혈청이 포함되어 있고, 매주 3회 인터류킨-2(IL-2) 100 IU(International Unit)/ml이 보충되는 TC 배지(X-VIVO™, Lonza)에서 세포를 14일 동안 성장시켰다. 14일 세포 배양 후, 모든 시험의 세포는 유세포분석으로 측정 시 전이유전자에 대해 대략 50% 내지 80% 양성이었다.
모든 유세포분석 데이터를 BD FACSDiva™ 소프트웨어를 이용하여 LSR-Fortessa(BD LSR Fortessa™)에 수집하고, 데이터를 FlowJo(모두 BD Sciences 사제)를 사용하여 분석하였다. 모든 항체 염색은 1% BSA가 함유된 PBS 중에서 4℃에서 수행하였다. 통상의 기술을 사용하여 CAR 양성%를 결정하기 위해, 세포를 BioLegend and Cell Signaling Technology의 시약을 사용하여 생존능, CD3+, CD4+, CD8+ 및 항-myc 활성에 대해 평가하였다. 확장 검정의 경우, ThermoFisher Scientific의 계수용 비드를 이용하여 CAR 세포를 열거하였다.
동일한 수의 T세포를 무혈청 X-VIVO™ 배지에서 2시간 동안 배양하고, 30분 후 제조업체(R&D Systems)의 권장사항에 따라 산에서 재구성한 1 ng/mL 또는 5 ng/mL의 가용성 재조합 TGF-β1을 이용하여 자극시켰다. 이어서, 원심분리로 세포를 수집하고, RIPA 완충액 + 프로테아제 및 프로테아제 저해제(ThermoFisher Scientific)로 용해시킨 후, pSMAD2 및 pSMAD3에 대한 LUMINEX® 분석을 수행하였다.
절단된 형태의 TGF-βRI(DN TGF-βRI)의 발현이 TGF-β의 억제 효과로부터 T세포를 구제할 수 있는 지를 조사하기 위해, CD19 및 PSMA에 대해 특이적인 scFv를 갖는 CAR, 이어서 T2A 자가 절단 펩타이드를 갖는 서열번호 10의 DN TGF-βRI을 인코딩하도록 구조체를 설계하였다. 서열번호 14의 DN TGF-βRII는 양성 대조군으로 작용하였다.
억제성 pSMAD 신호를 전달하는 TGF-βRI 분자의 세포내 부분을 제거하는 경우, 결과는 절단된 형태의 TGF-βRI(DN TGF-βRI)이 TGF-βRII에 대한 내인성 야생형 TGF-βRI 결합을 능가하여, 신호전달을 차단하고, TGF-β1에 의해 유도된 저해성 pSMAD 신호전달을 제한하여, CAR 세포 기능을 구제한다고 시사한다. TGF-β는 pSMAD 신호전달 경로를 통해 T세포에서 억제성 신호전달을 매개한다. 본원에 기재된 절단된 우성 음성 수용체가 pSMAD 유도를 제한할 수 있는 지 여부를 결정하기 위해, 1차 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 CD3+ 세포를 단리하고, CD19 CAR만(FMC63 scFv + CD28 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인), CD19 CAR + DN TGF-βRI 또는 CD19 CAR + DN TGF-βRII를 포함하는 구조체로 형질도입하였다. 다음으로, 전체 T세포를 1 ng/mL의 TGF-β1로 30분 동안 자극시키고, 전세포 용해물을 제조하고, pSMAD2 및 pSMAD3을 정량화하였다. 결과는 표 4a에 기재되어 있다.
[표 4a]
Figure pct00005
모든 조작된 T세포에서 pSMAD2 및 pSMAD3 수준의 배경 수준은 표 4a에 제시되어 잇다. CD19 CAR만을 발현하는 TGF-β1 자극된 T세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을, 각각, 10,000배 및 2,500배 유도하였으며, CD19 CAR + DN TGF-βRI 또는 CD19 CAR + DN TGF-βRII로 형질도입된 TGFβ1 자극된 세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을 더 적게 유도하였다(대략 4배 적은 pSMAD2의 유도 및 2배 적은 pSMAD3의 유도, p값 <0.01). 나아가, CD19 CAR + DN TGF-βRI 또는 CD19 CAR + DN TGF-βRII로 형질도입된 TGFβ1 처리된 T세포에서의 pSMAD2 및 pSMAD3 유도 수준은, TGFβ1과 TGF-βRI LY57299의 소분자 저해제로 공동처리된 대조군 형질도입된 T세포에서의 pSMAD2 및 pSMAD3 수준과 동등하였다. 이러한 데이터는, DN TGF-βRI 및 DN TGF-βRII가 T세포에서 TGF-β1에 의해 유도되는 억제성 pSMAD 신호전달을 제한한다는 것을 확인시켜 준다.
PSMA CAR(PSMA scFv + 4-1BB 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인), 이어서 DN TGF-βR 또는 DN TGF-βRII를 발현하는 두 번째 구조체를 제조하였다. 절단된 우성 음성 수용체가 이러한 CAR 맥락에서 pSMAD 유도를 제한할 수 있는 지 여부를 결정하기 위해, 1차 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 CD3+ 세포를 단리하고, PSMA CAR만, PSMA CAR + DN TGF-βRI 또는 PSMA CAR + DN TGF-βRII를 함유하는 구조체로 형질도입하였다. 전체 T세포를 TGF-β1(5 ng/mL, 30분)로 자극하고, 전세포 용해물을 제조하고, LUMINEX®으로 pSMAD2 및 pSMAD3을 정량화하였다. 결과는 표 4b에 기재되어 있다.
[표 4b]
Figure pct00006
PSMA CAR만을 발현하는 TGF-β1 자극된 T세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을, 각각, 8,500배 및 2,200배 유도하였으며, PSMA CAR + DN TGF-βRI 또는 PSMA CAR + DN TGF-βRII로 형질도입된 TGF-β1 자극된 세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을 더 적게 유도하였다(대략 2배 적은 유도, p값 <0.05). 따라서, 표 4a 및 표 4b의 데이터는, DN TGF-βRI 및 DN TGF-βRII가 2개의 상이한 scFv를 발현하는 CAR T세포에서, 두 가지 CD28 및 4-1BB 공동자극과 조합으로, TGF-β1 매개 pSMAD 신호전달을 제한한다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 2
CD19 CAR 양성 T세포를, 미토마이신(Sigma Aldrich) 처리된 American Type Culture Company(ATCC, Manassas, VA)의 Nalm6 표적세포와 1:1 비로 7일 동안 공동배양하였다. 비드 계수 및 유세포분석으로 측정된 CAR+ T세포의 수에 기반하여 표적세포를 1:1 비로 격일로 첨가하였다. TGFβ1 처리군의 경우, 산 활성화된 TGFβ1(5 ng/mL)을 공동배양 배지(RPMI + 10% FBS)에 격일로 첨가하였다.
쥣과 종양 모델에서 생체내 CAR T세포 효능이 일반적으로 임상 효능을 예측하기 위한 최적 표준으로 간주되지만, 장기간 시험관내 사멸 검정에서 표적에 대한 반복 자극은 종종 생체내 결과와 상관관계가 있는 것으로 결정되었다. 따라서, 일련의 자극 검정을 사용하여 CD19 CAR T세포 확장을 측정하고, DN TGF-βRI 및 DN TGF-βRII가 이러한 검정에서 TGF-β1의 억제 효과를 제한할 수 있는 지 여부를 시험하였다.
CD19 CAR T세포 기능에 대한 TGF-β1의 결과를 결정하기 위해, CD19 CAR T세포를 CD19+ Nalm6 표적세포로 1주 동안 3회 자극하고, 표적 매개 CAR T세포 확장을 측정하였다. 결과는 표 5에 기재되어 있다.
[표 5]
Figure pct00007
결과는, TGF-β1이 비히클 처리 단독에 비해 검정에서 CD19 CAR T세포 확장을 대략 7배 억제하는 것으로 나타났다. DN TGF-βRI 또는 DN TGF-βRII가 TGF-β1을 이용한 이러한 반복 자극 검정에서 CD19 CAR T세포 기능을 구제할 수 있는 지 여부를 결정하기 위해, T세포에 CD19 CAR + TGF-βRI 또는 CD19 CAR + TGF-βRII를 형질도입하고, TGF-β1의 존재 및 부재 하에서 연속 표적 자극에 의한 이의 확장을 7일 후에 측정하였다. 결과는, TGF-βRI가 CD19 CAR T세포 확장에 대한 TGF-β1의 억제 효과를 구제하는 것으로 나타났다.
실시예 3
CAR 양성 T세포를 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하도록 조작된 American Type Culture Company(ATCC, Manassas, VA)에서 입수한 K562 표적세포와 공동배양하였다. 96시간 동안 공동배양하고, 세포를 회전시키고, 상청액을 수집하였다. 상청액을 LUMINEX® 멀티플렉스 검정에서 인터페론 감마(IFNγ)에 대해 분석하고, LUMINEX® 시스템(ThermoFisher Scientific)에서 분석하였다. 일부 군의 경우, 시험의 시작 시 배양 배지에 산 활성화된 TGF-β1을 5 ng/mL 첨가하였다.
CAR T세포는 IFNγ을 포함하는 세포독성 분자의 분비에 의해 종양세포에 대한 세포용해 효과를 매개한다. 외인성 TGF-β1의 효과를 PSMA+ 표적세포가 포함된 배양에서 PSMA CAR T세포로부터의 IFNγ 생산에 대해 시험하였다. 결과는 표 6에 기재되어 있다.
[표 6]
Figure pct00008
2일마다 제공된 5 ng/mL의 외인성 TGF-β1이 96시간에 걸쳐 IFNγ의 CAR T세포 생산을 3배 초과로 감소시키는 것으로 확인되었다. 나아가, PSMA CAR + DN TGF-βRI 또는 PSMA CAR + DN TGF-βRII로 형질도입된 TGF-β 처리된 T세포는 PSMA+ 표적세포에 대한 반응에서 IFNγ 생산을 감소시키지 않았으며, TGF-β1로 처리되고 PSMA+ 표적세포와 공동배양된 PSMA CAR T세포보다 IFNγ를 더 많이 생산한 것으로 확인되었다. 이러한 데이터는, DN TGF-β 수용체가 TGF-β1 억제에 의해 방해를 받는 CD19 CAR T세포와 PSMA CAR T세포 둘 모두의 기능적 특성을 회복시킨다는 것을 시사한다.
실시예 4
서열번호 10의 DN TGF-βRI과 서열번호 14의 DN TGF-βRII를 각각 하기 제시된 CAR 구조체와 함께 사용하여 추가의 시험을 수행하였다:
a. GPC3: (GPC3 scFV + CD28 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인); 및
b. 서열번호 45의 GPC3: (GPC3 scFV + 4-1BB 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인). 이전 시험과 유사하게, 1차 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 CD3+ 세포를 단리하고, 상기 GPC3 구조체를 형질도입하였다. 모든 조작된 T세포에서 pSMAD2 및 pSMAD3 수준의 배경 수준은 표 7에 제시되어 잇다. GPC3 CAR만을 발현하는 TGF-β1 자극된 T세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을, 각각, 10,000배 및 700배 유도하였으며, GPC3 CAR + DN TGF-βRI 또는 CD19 CAR + DN TGF-RII(서열번호 47에 제시된 바와 같음)로 형질도입된 TGFβ1 자극된 세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을 유의하게 더 적게 유도하였다(대략 20배 적은 pSMAD2의 유도 및 4배 적은 pSMAD3의 유도, p값 <0.01). GPC3 CAR + DN TGF-βRI은 pSMAD2 및 pSMAD3의 유도를 제한하지 못했다(4-1BB 공동자극을 이용한 경우 대략 3배 적은 pSMAD2의 유도 및 4-1BB 공동자극을 이용한 경우 대략 1.3배 적은 pSMAD3의 유도). 결과는 표 7에 기재되어 있다.
[표 7]
Figure pct00009
또한, GPC3 CAR 양성 T세포를 American Type Culture Company(ATCC, Manassas, VA.)에서 입수한 Hep3B 표적세포와 공동배양하였다. 표적세포를 3일 내지 4일마다 주 당 2회 첨가하였고, CAR+ T세포의 수를 비드 계수와 유세포분석으로 측정하였다. TGF-β1 처리군의 경우, 산 활성화된 TGF-β1(5 ng/mL)을 공동배양 배지(RPMI + 10% FBS)에 3일 내지 4일마다 주 당 2회 첨가하였다. 결과는 표 8에 기재되어 있다.
[표 8]
Figure pct00010
실시예 5
상기 실험에 더하여, 본원에 기재된 CD19, PSMA 및 GPC3 구조체에서 DN TGF-βRII와 함께인 DN TGF-βRI의 활성을 생체내 동물 모델에서 평가하였다. 본 연구는, 본원에 기재된 바와 같이 pSMAD 감소, CAR 세포 확장 및 사이토카인 생산에서 수용체를 평가하였다.
실시예 6
조작된 우성 음성 TGF-β 수용체 유형 2(DN TGF-βRII) 구조체를 서열번호 33의 서열에 따라 제조하였다. 이러한 구조체는 394개 아미노산 길이이고, 야생형 TGF-βRII의 아미노산 1번 내지 22번의 신호 펩타이드 도메인; 아미노산 23번 내지 32번의 태그 서열; 아미노산 33번 내지 169번의 세포외 도메인; 아미노산 170번 내지 171번의 링커 서열, "CPT" 삽입을 갖는 서열번호 20의 아미노산 172번 내지 194번의 IL-7Rα의 막관통 도메인; 및 IL-7Rα의 아미노산 195번 내지 394번의 세포내 도메인을 포함한다.
인간 PBMC에서 단리된 CD3+ 세포에 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 구조체를 형질도입하였다. T세포를 무혈청 X-VIVO™ 배지에서 2시간 동안 배양하고, 30분 후 제조업체(R&D Systems)의 권장사항에 따라 산에서 재구성한 1 ng/mL의 가용성 재조합 TGF-β1을 이용하여 자극하였다. 이어서, 원심분리로 세포를 수집하고, RIPA 완충액 + 프로테아제 및 프로테아제 저해제(ThermoFisher Scientific)로 용해시킨 후, pSMAD2, pSMAD3, pERK 및 pSTAT5에 대한 LUMINEX® 분석을 수행하였다. 모든 조작된 T세포에서 pSMAD2 및 pSMAD3 수준의 배경 수준은 매우 낮았다. TGF-β1 자극된 T세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을, 각각, 4,000배 및 1,500배 유도하였고, DN TGF-βRII 구조체로 형질도입된 TGF-β1 자극된 세포는 pSMAD2 및 pSMAD3을 유의하게 더 적게 유도하였으며(대략 25배 더 적은 pSMAD2의 유도 및 11배 더 적은 pSMAD3의 유도, p값 <0.01), pERK 및 pSTAT5 신호전달은 키메라 형질도입된 T세포에서 상승되었다(pERK의 경우 28배 더 높고, pSTAT5의 경우 거의 80배 더 높음). 증가된 pERK 및 pSTAT 신호전달은 TGF-β1에의 노출에 의존하지 않았으며, IL-7Rα 매개 구성적 신호전달로 인해 노출 유무에 관계없이 상승하였다. 결과는 표 9에 기재되어 있다.
[표 9]
Figure pct00011
실시예 7
서열번호 51의 GPC3 표적화 CAR 구조체(CAR 1)의 코돈 최적화된 서열을 2개의 추가 GPC3 표적화 CAR 구조체와 비교하였다. 하기 제시된 바와 같은 CAR 구조체를 생성하여 시험을 수행하였다:
a. 서열번호 51의 코돈 최적화된 서열에 제시된 바와 같은 구조체 CAR 1: (GPC3 scFv + 4-1BB 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인).
b. 서열번호 53에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는 구조체 CAR 2: (GPC3 scFv + 4-1BB 세포내 도메인 + 문헌[Li, Gastroenterology, 2020] 및 WO2019094482A1에 기재된 바와 같은 CD3ζ 세포내 도메인).
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACATATGGAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTGGAGGGTCATTGAGACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAAGAATGCCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGGCCGCATAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGCCAGGTTTACCATCTCCAGAGATGATTCAAAGAACTCACTCTATCTGCAAATGAACAGCTTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGTGGCTGGTAACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGGCGGAGGCGGATCAGGTGGTGGCGGATCTGGAGGTGGCGGAAGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTAGCTGTGTCACTGGGAGAGAGGGCCACTATCAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGCAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCAGTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGGCTGAAGACGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
(서열번호 53).
c. 서열번호 54에 제시된 바와 같은 구조체 CAR 3: (CAR 2와 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 뉴클레오타이드 서열이 스플라이싱 및 반복을 최소화하도록 최적화된 전이유전자를 포함하는 구조체).
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGCGAATTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACATATGGAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTGGAGGGTCATTGAGACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAAGAATGCCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGGCCGCATAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGCCAGGTTTACCATCTCCAGAGATGATTCAAAGAACTCACTCTATCTGCAAATGAACAGCTTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGTGGCTGGAAACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCGCTGGAGGAGGCGGATCAGGTGGTGGCGGATCTGGAGGTGGCGGAAGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTAGCTGTGTCACTGGGAGAGAGGGCCACTATCAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGCAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAAAAGCCAGGGCAGCCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCAGTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGGCTGAAGACGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGAGTCAACCACTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAAGGGCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGCTGA
(서열번호 54).
이전 시험과 유사하게, 1차 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 CD3+ 세포를 단리하고, 폴리브렌의 존재 하에서 및 Jurkat 세포에서의 발현 역가에 기반한 2가지의 감염 다중도에서 상기 GPC3 CAR 구조체로 형질도입하였다. 제작의 종결 시, 세포를 Cryostor® CS5에서 동결시키고, 해동 시까지 액체 질소에서 보관하였다. 해동 시, 세포를 T세포 배양 배지에서100 UI/mL IL-2와 함께 밤새 휴지시키고, 세척하고, PBS 중에 1:1000으로 희석한 Live/Dead™ Violet, 1:200으로 희석한 DyLight™ 650에 형광 접합된 재조합 인간 GPC3(rhGPC3) 및 1:100으로 희석한 항-CD3 BV650으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 1x105개 세포의 DNA 펠릿을 QuickExtract™ 완충액에서 추출하고, 동결시키고, 세포 당 통합된 바이러스의 빈도를 정량화하는 액적 디지털 PCR(droplet digital PCR)로 평균 벡터 카피 수(VCN)를 측정하는 데 사용하였다. CAR+ 세포의 백분율은 Live/Dead™ 음성, CD3+ 양성 세포 중 rhGPC3으로 염색된 세포의 백분율로 정의되며, CAR+의 평균 형광 강도(MFI) 및 벡터 카피 수(VCN)가 실시예에 제시되어 있다. 표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, VCN, % CAR+가 더 높은 구조체 CAR 1은 이의 형질도입 효율이 구조체 CAR 2 및 CAR 3보다 더 높다고 시사된다. 구조체 CAR 1은 또한 CAR+ 세포의 MFI가 더 높으며, 이는 rhGPC3에 대한 CAR의 더 효율적인 발현 또는 더 높은 친화도를 나타낼 수 있다.
[표 10]
Figure pct00012
실시예 8
상기 기재된 바와 같이 제조하고, 동결시키고, 휴지시키고, 염색한 CAR+ T세포(5x104개)를 HCC 표적세포(5x104개)와 48시간 동안 공동배양시켜 사이토카인 방출을 유도하고, 상청액을 -80℃에서 동결시켰다. 상청액을 PBS에서 500배 희석한 후, Millipore MILLIPLEX® Map Human High Sensitivity T cell Panel(Cat # HSTCMAG-28PMX13BK)을 사용하여 인터페론 감마(IFNγ) 농도를 측정하였다. 표 11의 데이터는, 구조체 CAR 1이 GPC3- 세포주 Hep3B GPC3 KO 및 Sk-Hep1의 존재 하에서 구조체 CAR 2 및 CAR 3보다 IFNγ를 덜 분비한다는 것을 보여준다. 이러한 데이터는, CAR 1 구조체가 CAR 2 및 CAR 3 구조체보다 더 적은 긴장성 활성화를 유도한다는 것을 시사한다.
[표 11]
Figure pct00013
실시예 9
구조체 CAR 1, CAR 2 및 CAR 3으로 형질도입된 T세포, 또는 형질도입되지 않은(UT) T세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고, NSG 마우스의 Hep3B 이종이식 모델에서 생체내 시험하였다. Hep3B 2.1-7 세포를 2x106개의 세포로 실험 첫날 NSG 마우스에 이식하였다. 그 후 3일 내지 4일마다, 캘리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 14일차에, 종양의 평균 크기가 149 ㎣에 도달했을 때, 동물을 군별로 나누고, PBS 비히클, 형질도입되지 않은 T세포, 구조체 CAR 1, CAR 2 또는 CAR 3으로 제조된 GPC3 CAR T세포(6x106개의 CAR+ 세포 또는 2x106개의 CAR+ 세포로)로 정맥내 주사를 통해 처리하였다. 연구 전반에 걸친 종양 부피는 하기 표 12 내지 표 19에 기재되어 있다. 구조체 CAR 1로 제조된 CAR T세포는 종양 성장 제어로 입증된 바와 같이 6x106개 및 2x106개의 용량에서 구조체 CAR 2 및 CAR 3보다 더 강력하였다.
[표 12]
Figure pct00014
[표 13]
Figure pct00015
[표 14]
Figure pct00016
[표 15]
Figure pct00017
[표 16]
Figure pct00018
[표 17]
Figure pct00019
[표 18]
Figure pct00020
[표 19]
Figure pct00021
실시예 10
GPC3 CAR-DN TGF-βRII 구조체를 서열번호 47에 제시된 바와 같이 제조하고, Hep3B 종양세포에 대해 시험하였다. 2x106개의 Hep3B 2.1-7 세포를 실험 첫날 NOD-SCID IL-2R 감마null(NSG) 마우스에 이식하였다. 그 후 3일 내지 4일마다, 캘리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다. 14일차에, 종양의 평균 크기가 150 ㎣에 도달했을 때, 동물을 군별로 나누고, PBS 비히클, 형질도입되지 않은 T세포, GPC3 CAR T세포 또는 GPC3 CAR + DN TGF-βRII T세포(1x106개의 CAR+ 세포 또는 4x106개의 CAR+ 세포로)로 정맥내 주사를 통해 처리하였다. 연구 종점의 종양 부피가 2000 ㎣을 초과하는 동물은 연구에서 제외시켰다. 연구 전반에 걸친 종양 부피는 하기 표 20 내지 표 25에 기재되어 있다. DN TGF-βRII의 첨가는 1x106개의 CAR+ 세포 용량 또는 그 이상에서 종양 제어의 개선과 함께, GPC3 scFv의 효능을 개선시켰다.
[표 20]
Figure pct00022
[표 21]
Figure pct00023
[표 22]
Figure pct00024
[표 23]
Figure pct00025
[표 24]
Figure pct00026
[표 25]
Figure pct00027
실시예 11
실시예 10의 구조를 사용하여, 모든 코호트가 온전한 마지막 날(33일차)에, 터키 다중비교 검정(Tukey's multiple comparisons test)을 이용한 일원분산분석(One-way ANOVA)으로 항종양 효능의 유의성을 평가하고, 표 26에 포함시켰다. 초기 부피의 4배로 설정된 종양 부피 종점까지 생존에 대한 진행으로 장기적 효능과 종양 성장 지연을 결정하고(도 1, 표 27), 로그 순위(Log-rank)(Mantel-Cox) 검정으로 통계적 유의성을 결정하였다(표 28).
[표 26]
Figure pct00028
[표 27]
Figure pct00029
[표 28]
Figure pct00030
33일차에, GPC3 CAR은 표 26에 제시된 바와 같이 효능에 있어서의 용량 의존적 효과와 함께, 종양 부피 제어에 있어서 효과적이었다. 1x106개의 CAR에서, DN TGF-βRII의 첨가는 종양 효능에 유의미한 영향을 미쳤다. 더 높은 용량의 CAR에서 관찰된 더 큰 효능을 고려할 때, 4x106개의 용량으로는 33일차에 이러한 효과가 나타나지 않았다. 하지만, 초기 종양 부피의 4배까지 종양 성장 지연을 평가할 때(표 27 및 표 28), DN TGF-βRII의 첨가는 1x106개 및 4x106개의 CAR 용량 둘 모두에서 장기적 효능에 유의미한 효과가 있었다.
실시예 12
코돈 최적화된 서열에서 생성된 CAR-DN TGF-βRII 구조체를 비코돈 최적화된 서열에서 생성된 유사한 구조체와 비교하기 위해 추가의 실험을 수행하였다. 하기 CAR-DN TGF-βRII 구조체를 생성하였다:
a. 서열번호 52에 제시된 바와 같은 구조체 CAR DNR A: (GPC3 scFv + 4-1BB 세포내 도메인 + CD3ζ 세포내 도메인, T2A 자가 절단 모티프, 및 DN TGF-βRII).
b. 서열번호 55의 구조체 CAR DNR B: (GPC3 scFv + 4-1BB 세포내 도메인 + 문헌[Li, Gastroenterology, 2020] 및 WO2019094482A1에 기재된 바와 같은 CD3ζ 세포내 도메인, T2A 및 DN TGF-βRII).
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACATATGGAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTGGAGGGTCATTGAGACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAAGAATGCCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGGCCGCATAAGAAATAAAACTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGCCAGGTTTACCATCTCCAGAGATGATTCAAAGAACTCACTCTATCTGCAAATGAACAGCTTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGTGGCTGGTAACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGGCGGAGGCGGATCAGGTGGTGGCGGATCTGGAGGTGGCGGAAGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTAGCTGTGTCACTGGGAGAGAGGGCCACTATCAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGCAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCAGTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGGCTGAAGACGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGTTGGAGATCAAAACTAGTACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGAGGGCAGAGGCTCTCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCAGGCCCCATGGGAAGAGGTTTACTGAGAGGACTGTGGCCTTTACACATCGTGCTGTGGACTCGTATCGCCAGCACCATCCCCCCCCATGTCCAAAAGAGCGTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAATGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGAGGTTCAGCACTTGTGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGAGGAAGAACGACGAGAACATCACTTTAGAGACAGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATTTTAGAAGATGCCGCCAGCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGTTCTTGTTCGTCTGATGAGTGCAACGATAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGATTTACTGCTGGTGATCTTCCAAGTTACCGGCATTTCTTTACTGCCTCCGTTGGGCGTGGCTATCAGCGTGATCATCATCTTCTACTGCTATCGTGTTAATCGTCAATGA
(서열번호 55).
이전 실험과 유사하게, 1차 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 CD3+ 세포를 단리하고, 폴리브렌의 존재 하에서 및 Jurkat 세포의 발현 역가에 기반한 2가지의 감염 다중도에서 상기 GPC3 CAR 구조체로 형질도입하였다. 제작의 종결 시, 세포를 Cryostor® CS5에서 동결시키고, 해동 시까지 액체 질소에서 보관하였다. 해동 시, 세포를 T세포 배양 배지에서100 UI/mL IL-2와 함께 밤새 휴지시키고, 세척하고, PBS 중에 1:1000으로 희석한 Live/Dead™ Violet, 1:200으로 희석한 DyLight™ 650에 형광 접합된 재조합 인간 GPC3(rhGPC3) 및 1:100으로 희석한 항-TGF-βRII-PE및 항-CD3 BV650으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 1x105개 세포의 DNA 펠릿을 QuickExtract™ 완충액에서 추출하고, 동결시키고, 세포 당 통합된 바이러스의 빈도를 정량화하는 액적 디지털 PCR로 평균 벡터 카피 수(VCN)를 측정하는 데 사용하였다. CAR+ 세포의 백분율은 Live/Dead™ 음성, CD3+ 세포 중 rhGPC3으로 염색된 세포의 백분율로 정의되며, CAR+의 평균 형광 강도(MFI) 및 벡터 카피 수(VCN)가 실시예에 제시되어 있다. 구조체 CAR DNR A는 CAR+ 세포의 MFI가 더 높으며, 이는 rhGPC3에 대한 CAR의 더 효율적인 발현 또는 더 높은 친화도를 나타낼 수 있다.
[표 29]
Figure pct00031
실시예 13
상기 기재된 바와 같이 제조하고, 동결시키고, 휴지시키고, 염색한 CAR+ T세포(5x104개)를 HCC 표적세포(5x104개)와 48시간 동안 공동배양시켜 사이토카인 방출을 유도하고, 상청액을 -80℃에서 동결시켰다. 상청액을 PBS에서 500배 희석한 후, MILLIPLEX® Map Human High Sensitivity T cell Panel(Cat # HSTCMAG-28PMX13BK)을 사용하여 인터페론 감마(IFNγ) 농도를 측정하였다. 표 30의 데이터는, 구조체 CAR DNR A가 GPC3- 세포주 Hep3B GPC3 KO 및 Sk-Hep1의 존재 하에서 구조체 CAR DNR B보다 IFNγ를 덜 분비한다는 것을 보여준다. 이러한 데이터는, CAR DNR A가 CAR DNR B보다 CAR에 의해 매개되는 긴장성 활성화가 적다는 것을 시사한다.
[표 30]
Figure pct00032
일반적으로, 하기 청구범위에서 사용된 용어는 청구범위를 본 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이러한 청구범위에 부여된 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Kite Pharma, Inc. <120> TGF-Beta Receptors and Methods of Use <130> K1075.P/82352-321521 <140> K1075.P <141> 2020-06-17 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1509 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaggcgg cggtcgctgc tccgcgtccc cggctgctcc tcctcgtgct ggcggcggcg 60 gcggcggcgg cggcggcgct gctcccgggg gcgacggcgt tacagtgttt ctgccacctc 120 tgtacaaaag acaattttac ttgtgtgaca gatgggctct gctttgtctc tgtcacagag 180 accacagaca aagttataca caacagcatg tgtatagctg aaattgactt aattcctcga 240 gataggccgt ttgtatgtgc accctcttca aaaactgggt ctgtgactac aacatattgc 300 tgcaatcagg accattgcaa taaaatagaa cttccaacta ctgtaaagtc atcacctggc 360 cttggtcctg tggaactggc agctgtcatt gctggaccag tgtgcttcgt ctgcatctca 420 ctcatgttga tggtctatat ctgccacaac cgcactgtca ttcaccatcg agtgccaaat 480 gaagaggacc cttcattaga tcgccctttt atttcagagg gtactacgtt gaaagactta 540 atttatgata tgacaacgtc aggttctggc tcaggtttac cattgcttgt tcagagaaca 600 attgcgagaa ctattgtgtt acaagaaagc attggcaaag gtcgatttgg agaagtttgg 660 agaggaaagt ggcggggaga agaagttgct gttaagatat tctcctctag agaagaacgt 720 tcgtggttcc gtgaggcaga gatttatcaa actgtaatgt tacgtcatga aaacatcctg 780 ggatttatag cagcagacaa taaagacaat ggtacttgga ctcagctctg gttggtgtca 840 gattatcatg agcatggatc cctttttgat tacttaaaca gatacacagt tactgtggaa 900 ggaatgataa aacttgctct gtccacggcg agcggtcttg cccatcttca catggagatt 960 gttggtaccc aaggaaagcc agccattgct catagagatt tgaaatcaaa gaatatcttg 1020 gtaaagaaga atggaacttg ctgtattgca gacttaggac tggcagtaag acatgattca 1080 gccacagata ccattgatat tgctccaaac cacagagtgg gaacaaaaag gtacatggcc 1140 cctgaagttc tcgatgattc cataaatatg aaacattttg aatccttcaa acgtgctgac 1200 atctatgcaa tgggcttagt attctgggaa attgctcgac gatgttccat tggtggaatt 1260 catgaagatt accaactgcc ttattatgat cttgtacctt ctgacccatc agttgaagaa 1320 atgagaaaag ttgtttgtga acagaagtta aggccaaata tcccaaacag atggcagagc 1380 tgtgaagcct tgagagtaat ggctaaaatt atgagagaat gttggtatgc caatggagca 1440 gctaggctta cagcattgcg gattaagaaa acattatcgc aactcagtca acaggaaggc 1500 atcaaaatg 1509 <210> 2 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 35 40 45 Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 50 55 60 Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 85 90 95 Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 100 105 110 Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala 115 120 125 Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met 130 135 140 Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn 145 150 155 160 Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr 165 170 175 Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg 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atgggcaggg gcctgctgag gggcctgtgg cccctgcaca tcgtgctgtg gaccaggatc 60 gccagcacca tcccccccca cgtgcagaag agcgtgaaca acgacatgat cgtgaccgac 120 aacaacggcg ccgtgaagtt cccccagctg tgcaagttct gcgacgtgag gttcagcacc 180 tgcgacaacc agaagagctg catgagcaac tgcagcatca ccagcatctg cgagaagccc 240 caggaggtgt gcgtggccgt gtggaggaag aacgacgaga acatcaccct ggagaccgtg 300 tgccacgacc ccaagctgcc ctaccacgac ttcatcctgg aggacgccgc cagccccaag 360 tgcatcatga aggagaagaa gaagcccggc gagaccttct tcatgtgcag ctgcagcagc 420 gacgagtgca acgacaacat catcttcagc gaggagtaca acaccagcaa ccccgacctg 480 ctgctggtga tcttccaggt gaccggcatc agcctgctgc cccccctggg cgtggccatc 540 agcgtgatca tcatcttcta ctgctacagg gtgaacaggc agcagaagct gagcagcacc 600 tgggagaccg gcaagaccag gaagctgatg gagttcagcg agcactgcgc catcatcctg 660 gaggacgaca ggagcgacat cagcagcacc tgcgccaaca acatcaacca caacaccgag 720 ctgctgccca tcgagctgga caccctggtg ggcaagggca ggttcgccga ggtgtacaag 780 gccaagctga agcagaacac cagcgagcag ttcgagaccg tggccgtgaa gatcttcccc 840 tacgaggagt acgccagctg gaagaccgag aaggacatct tcagcgacat caacctgaag 900 cacgagaaca tcctgcagtt cctgaccgcc gaggagagga agaccgagct gggcaagcag 960 tactggctga tcaccgcctt ccacgccaag ggcaacctgc aggagtacct gaccaggcac 1020 gtgatcagct gggaggacct gaggaagctg ggcagcagcc tggccagggg catcgcccac 1080 ctgcacagcg accacacccc ctgcggcagg cccaagatgc ccatcgtgca cagggacctg 1140 aagagcagca acatcctggt gaagaacgac ctgacctgct gcctgtgcga cttcggcctg 1200 agcctgaggc tggaccccac cctgagcgtg gacgacctgg ccaacagcgg ccaggtgggc 1260 accgccaggt acatggcccc cgaggtgctg gagagcagga tgaacctgga gaacgtggag 1320 agcttcaagc agaccgacgt gtacagcatg gccctggtgc tgtgggagat gaccagcagg 1380 tgcaacgccg tgggcgaggt gaaggactac gagcccccct tcggcagcaa ggtgagggag 1440 cacccctgcg tggagagcat gaaggacaac gtgctgaggg acaggggcag gcccgagatc 1500 cccagcttct ggctgaacca ccagggcatc cagatggtgt gcgagaccct gaccgagtgc 1560 tgggaccacg accccgaggc caggctgacc gcccagtgcg tggccgagag gttcagcgag 1620 ctggagcacc tggacaggct gagcggcagg agctgcagcg aggagaagat ccccgaggac 1680 ggcagcctga acaccaccaa g 1701 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Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys 180 185 190 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 195 200 205 Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 225 230 235 240 Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr 245 250 255 Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Thr 260 265 270 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 275 280 285 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 305 310 315 320 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 325 330 335 Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 340 345 350 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 355 360 365 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 370 375 380 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 420 425 430 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 435 440 445 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 450 455 460 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 <210> 58 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 58 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro His Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Asn Lys 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275 280 285 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 305 310 315 320 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 325 330 335 Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 340 345 350 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 355 360 365 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 370 375 380 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 420 425 430 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 435 440 445 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 450 455 460 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490

Claims (20)

  1. TGF-β 수용체로부터의 세포외 도메인(ECD)과 막관통 도메인(TMD)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 야생형 TGF-β 수용체에 존재하는 신호전달과 인산화를 담당하는 아미노산 잔기가 결여되어 있는 재조합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, ECD가 TGF-βRI 또는 TGF-βRII에서 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, TMD가 TGF-βRI, TGF-βRII, PDGFR, CD4, CD8, CD28, CD127, CD132, CD3ζ, 4-IBB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, IL-5, IL-7, IL-7Rα, BTLA, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 돌연변이체에서 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 TGF-β 수용체에 존재하는 신호전달과 인산화를 담당하는 아미노산 잔기가 결여되어 있는 이종 세포내 도메인(ICD)을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ECD가 서열번호 15와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, TMD가 서열번호 16과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, ICD가 서열번호 6과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 14와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β1에 결합하는, 재조합 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서, CAR이 CD19, CD20, PSMA, PCMA, CLL-1 또는 GPC3을 포함하는 종양 항원에 결합하는, 발현 벡터.
  12. 제8항 또는 제9항의 발현 벡터로 형질도입된 T세포.
  13. 제12항의 T세포의 치료적 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  14. 서열번호 51의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 재조합 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 48의 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 재조합 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는, 재조합 핵산.
  17. 제16항에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, CAR이 GPC3을 포함하는 종양 항원에 결합하는, 발현 벡터.
  19. 제17항 또는 제18항의 발현 벡터로 형질도입된 T세포.
  20. 제19항의 T세포의 치료적 유효량을 간암의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 간암을 치료하는 방법.
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