KR20240013173A - Nkg2d-기초 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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케빈 피. 멍
조디 무라카미
사무엘 티. 헤일
에드워드 에이치. 리아오
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카이트 파마 인코포레이티드
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Abstract

NGK2D 엑토 도메인(ecto domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)가 제공된다. 이를 포함하는 조성물, 세포 및 세포 치료법이 제공된다. 치료 방법이 추가로 제공된다.

Description

NKG2D-기초 키메라 항원 수용체
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 5월 24일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Chimeric Antigen Receptor"인 미국 임시 특허 출원 제63/192,296호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 세포 치료법 분야, 더 구체적으로 NKG2D 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)에 관한 것이다.
인간 암은 본질적으로 정상 세포가 유전적 또는 후성적 전환을 거쳐 비정상 암세포가 된 것으로 이루어져 있다. 이렇게 됨에 따라, 암세포는 정상 세포에 의해 발현되는 것과 구별되는 단백질 및 다른 항원을 발현하기 시작한다. 신체의 선천성 면역계는 이러한 비정상 종양 항원을 사용하여 암세포를 특이적으로 표적화하고 사멸시킬 수 있다. 그러나, 암세포는 T 림프구 및 B 림프구와 같은 면역 세포가 암세포를 성공적으로 표적화하는 것을 막기 위해 다양한 메커니즘을 이용한다.
현재의 T 세포 치료법은 환자의 암세포를 표적화하고 사멸시키기 위해 농축되거나 변형된 인간 T 세포에 의존한다. 특정 암세포를 표적화하고 사멸화시키는 T 세포의 능력을 증가시키기 위해, T 세포를 특정 표적 암세포로 지향시키는 작제물을 발현하도록 T 세포를 조작하는 방법이 개발되었다. 특정 종양 항원과 상호작용할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 조작된 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)는 T 세포가 특정 종양 항원을 발현하는 암세포를 표적화하고 사멸화시키는 것을 가능하게 한다. 그러나, 일부 종양 유형, 특히 고형 종양은 T 세포 면역치료법에 내성이고, T 세포 면역치료법에 대한 종양 내재성(intrinsic) 내성 메커니즘을 표적화하기 위한 차세대 증강 전략의 개발 필요성이 존재한다. NKG2D 리간드는 대부분의 유형의 종양 상에서 발현되고, 이는 건강한 세포와 비교하여 종양 세포 상에서의 리간드 발현의 상대 선택성을 실증하고 전형적인 T 세포 치료법을 증대시키기 위한 표적을 나타낸다.
NKG2D 엑토 도메인(ecto domain); 막관통 도메인(transmembrane domain); 4-1BB 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및 CD3-제타(CD3-zeta) 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 개시된다. 실시형태에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열 번호 33에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, CD3제타 신호전달 도메인은 서열 번호 27에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, CAR은 CD8-알파 힌지 도메인(hinge domain)을 추가로 포함한다. 실시형태에서, CD8-알파 힌지 도메인은 서열 번호 15에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, NKG2D 엑토 도메인은 서열 번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호 21에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 신호전달 도메인은 CD3-엡실론 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 실시형태에서, CD3-엡실론 신호전달 도메인은 서열 번호 31에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
개시된 CAR을 인코딩하는 핵산 및 이를 포함하는 벡터가 개시된다. 실시형태에서, 재조합 벡터 또는 핵산은 종양 항원에 특이적인 조작된 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 재조합 벡터 또는 핵산은 종양 항원에 특이적인 제2 CAR을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 종양 항원은 HPV―16 E6, HPV―16 E7, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7―H3, B7―H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4―1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, CS1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, Flt3, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸―3(GPC3: Glypican-3), HLA―Al + MAGEI, HLA―A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA―Al + NY―ES0―1, HLA―A2 + NY―ES0―1, HLA―A3 + NY―ES0―1, IL―llRα, IL―13Rα2, 람다, 루이스(Lewis)―Y, 카파, 메소텔린(Mesothelin), Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0―1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈(Survivin), TACI, TAG72, TEMs, 또는 VEGFRII를 포함한다.
개시된 핵산 또는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 개시된다. 실시형태에서, 숙주 세포는 개시된 핵산 또는 재조합 벡터 및 종양 항원에 특이적인 조작된 T 세포 수용체(TCR) 또는 종양 항원에 특이적인 제2 CAR을 인코딩하는 핵산 또는 재조합 벡터로 형질전환된다. 실시형태에서, 종양 항원은 HPV―16 E6, HPV―16 E7, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7―H3, B7―H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4―1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, CS1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, Flt3, GD2, GD3, 글리피칸―3(GPC3), HLA―Al + MAGEI, HLA―A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA―Al + NY―ES0―1, HLA―A2 + NY―ES0―1, HLA―A3 + NY―ES0―1, IL―llRα, IL―13Rα2, 람다, 루이스―Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0―1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TACI, TAG72, TEMs, 또는 VEGFRII를 포함한다. 실시형태에서, 숙주 세포는 유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell), T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 개시된 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 개시된다. 치료를 필요로 하는 환자에서 질환을 치료하는 방법이 개시되며, 개시된 T 세포 및/또는 NK 세포 또는 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 숙주 세포는 환자에 대해 동종이계(allogeneic)이다.
용어
본 개시내용이 더 용이하게 이해되도록 하기 위해, 먼저 특정한 용어가 아래에 정의된다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가의 정의는 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수형("a", "an", 및 "the")은 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
문맥상 구체적으로 언급되지 않거나 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "또는"은 포괄적이며 "또는"과 "및"을 둘 다 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 경우 용어 "및/또는"은 다른 것의 존재 또는 부재 하의 2개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각의 구체적인 개시내용으로 간주되어야 한다. 그러므로, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 A 및 B; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기 양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원에 사용된 용어 "예를 들어"는 단지 예로서, 의도된 비제한적으로 사용되며, 본 명세서에 명시적으로 열거된 항목만을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "~ 이상", "적어도", "~ 초과" 등, 예를 들어, "적어도 하나"는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 언급된 값 초과를 포함하지만 이로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한 그 사이의 임의의 더 큰 수 또는 분수가 포함된다.
대조적으로, 용어 "~ 이하"는 언급된 값 미만의 각각의 값을 포함한다. 예를 들어, "100개 이하의 뉴클레오타이드"는, 100개, 99개, 98개, 97개, 96개, 95개, 94개, 93개, 92개, 91개, 90개, 89개, 88개, 87개, 86개, 85개, 84개, 83개, 82개, 81개, 80개, 79개, 78개, 77개, 76개, 75개, 74개, 73개, 72개, 71개, 70개, 69개, 68개, 67개, 66개, 65개, 64개, 63개, 62개, 61개, 60개, 59개, 58개, 57개, 56개, 55개, 54개, 53개, 52개, 51개, 50개, 49개, 48개, 47개, 46개, 45개, 44개, 43개, 42개, 41개, 40개, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 및 0개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 또한 그 사이의 임의의 더 작은 수 또는 분수가 포함된다.
용어 "복수", "적어도 2개", "2개 이상", "적어도 제2" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 초과를 포함하지만 이로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한 그 사이의 임의의 더 큰 수 또는 분수가 포함된다.
명세서 전체에 걸쳐, 단어 "포함하는", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군의 포함을 시사하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군의 배제를 시사하지 않는 것으로 이해될 것이다. 양태가 "포함하는"이라는 언어로 본원에 기재되는 경우에는 언제나, "~로 구성되는" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성되는"이라는 용어로 기재된 다른 유사한 양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
문맥에서 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 용어 "약"은 당업자에 의해 결정된 특정 값 또는 조성에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 나타내며, 이는 이러한 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방식, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 ~를 포함하는"은 당업계에서의 관행에 따라 하나 또는 하나 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. "약" 또는 "본질적으로 ~를 포함하는"은 최대 10%의 범위(즉, ±10%)를 의미할 수 있다. 그러므로, "약"은 언급된 값보다 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 0.001% 초과 또는 미만 이내에 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 약 5 mg은 4.5 mg 내지 5.5 mg의 임의의 양을 포함할 수 있다. 더욱이, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5-배를 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성이 본 개시내용에 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 ~을 포함하는"의 의미는 해당 특정 값 또는 조성에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않는 한, 언급된 범위 내 임의의 정수 값, 및 적절한 경우, 이의 분수(예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본원에 사용된 단위, 접두사 및 기호는 이들의 국제 단위 체계(
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) 허용 형태를 사용하여 제공된다. 수치 범위는 해당 범위를 한정하는 수치를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 업계에서 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Juo, "The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press]; 문헌["The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press]; 및 문헌["The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Press]는 본 개시내용에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
"투여"는 당업자에게 알려진 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하는, 대상체, 예컨대 본원에 개시된 변형된 T 세포에 대한 제제의 물리적 도입을 지칭한다. 본원에 개시된 제형에 대한 예시적인 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 장관내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 이는 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 임파선내, 병변내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라, 생체내 전기천공을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형은 비경구외(non-parenteral) 경로를 통해, 예를 들어 경구로 투여된다. 다른 비경구외 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질내, 직장, 설하 또는 국소를 포함한다. 투여는 또한, 예를 들어 1회, 복수회 그리고/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
용어 "활성화된" 및 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 일 실시형태에서, 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생산 및 검출 가능한 이펙터 기능과 관련이 있을 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 특히, 증식하고 있는 T 세포를 지칭한다. TCR만을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 충분하지 않을 수 있으며, 하나 이상의 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요할 수 있다. 그러므로, T 세포 활성화는 TCR/CD3 복합체를 통한 1차 자극 신호 및 하나 이상의 2차 공동자극 신호를 포함한다. 공동자극은 TCR/CD3 복합체를 통한 자극과 같은 1차 활성화 신호를 받은 T 세포에 의한 증식 및/또는 사이토카인 생산에 의해 입증될 수 있다.
용어 "항체"(Ab)는 비제한적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 항체는 디설파이드(disulfide) 결합에 의해 상호 결합된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 불변 도메인인 CL을 포함한다. VH 영역과 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역 사이에 개재된(interspersed) 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기와 같은 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. Ab의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어 이펙터 세포)와 전형적인 보체계의 제1 구성요소(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 일반적으로, 인간 항체는 2개의 동일한 중쇄(H) 폴리펩타이드(각각 약 50 kD)와 2개의 동일한 경쇄(L) 폴리펩타이드(각각 약 25 kD)가 서로 회합되어 통상 "Y형" 구조로 지칭되는 구조로 이루어진 대략 150 kD의 사량체 제제이다. 중쇄 및 경쇄는 단일 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되거나 결합되며; 2개의 다른 디설파이드 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 결합하여, 이량체는 서로 결합되고 사량체가 형성된다. 천연 생산 항체는 또한, 예를 들어 CH2 도메인에서 글리코실화된다.
용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 생성, 조립 또는 유래된 가변 및 불변 도메인 서열, 또는 이와 구별 불가능한 서열을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 항체(또는 항체 구성요소)는 이의 아미노산 서열이 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 잔기 또는 요소(예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되거나 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 변이)를 포함하더라도 "인간"인 것으로 간주될 수 있다. 용어 "인간화"는 인간 생식계열 인코딩된 서열과 더 유사하도록 변형된, 비(non)인간 종(예를 들어 마우스)의 가변 도메인으로부터 유래된 서열을 갖는 가변 도메인을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, "인간화" 항체는 실질적으로 인간 프레임워크 도메인의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 프레임워크 도메인과, 실질적으로 비인간 항체의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 일반적으로 인간 면역글로불린 불변 도메인의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 인간 중쇄 불변 도메인의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4 영역을 포함할 수 있다.
항체는 예를 들어 단일클론 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 조작된 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 분자와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 항체 융합체(본원에서 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv), 낙타과 항체, 아피바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드 결합된 Fv(sdFv), 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어 항-항-Id 항체 포함), 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 및 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 다중클론 항체 집단을 지칭한다. 항체는 또한 예를 들어 Fab' 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 단리된 CDR, 단일 사슬 Fv, 폴리펩타이드-Fc 융합체, 단일 도메인 항체(예를 들어 IgNAR과 같은 상어 단일 도메인 항체 또는 이의 단편, 및 인간 중쇄 항체(UniAbs)), 낙타과 항체, 단일 사슬 또는 탠덤(Tandem) 디아바디(diabody)(TandAb®), Anticalins®, Nanobodies® 미니바디(minibody), BiTE®, 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®, Avimers®, DART, TCR-유사 항체, Adnectins®, Affilins®, Trans-bodies®, Affibodies®, TrimerX®, 미세단백질, Fynomers®, Centyrins® 및 KALBITOR®을 포함할 수 있다.
면역글로불린은 비제한적으로, IgA, 분비형 IgA, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는 통상적으로 알려진 이소타입(isotype) 중 임의의 것으로부터 유래할 수 있다. IgG 하위부류가 또한 당업계에 알려져 있으며, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 Ab 부류 또는 하위부류(예를 들어 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는 예로서, 천연 발생 Ab와 비-천연 발생 Ab 둘 다; 단일클론 Ab 및 다중클론 Ab; 키메라 Ab 및 인간화 Ab; 인간 Ab 또는 비인간 Ab; 전체 합성 Ab; 및 단일 사슬 Ab를 포함한다. 비인간 Ab는 인간에서 이의 면역원성을 저하시키기 위해 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 명시적으로 언급되지 않은 경우 그리고 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 또한 상기 언급된 면역글로불린 중 임의의 하나의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 부분을 포함하며, 1가 및 2가 단편 또는 부분, 및 단일 사슬 Ab를 포함한다.
"항원 결합 분자", "항원 결합 부분", "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편" 또는 "항원 결합 도메인"은 분자의 항원 결합 파트를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 일례에서, 항원 결합 분자는 항체, 또는 이의 일부, 예컨대 scFv이다. 일례에서, 항원 결합 분자는 항원에 결합하는 TCR의 일부이고, TCR 알파 사슬의 항원 결합 부분 및/또는 TCR 알파 사슬의 항원 결합 부분일 수 있다. 일례에서, 항원 결합 분자는 NKG2D 리간드에 결합하는 NKG2D의 일부일 수 있다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 항원 결합 분자로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체 및 다중특이적 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 펩티바디(peptibody)(즉, 펩타이드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 분자)는 적합한 항원 결합 분자의 또 다른 예이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자는 과증식성 질환에 관여하는 세포 상의 항원에 또는 바이러스 또는 박테리아 항원에 결합한다. 실시형태에서, 항원 결합 분자는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR)이다. 특정한 실시형태에서, 항원 결합 분자 또는 도메인은 이의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다. 추가의 실시형태에서, 항원 결합 분자는 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자 또는 도메인은 아비머(avimer)를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 경우, CDR은 참조 항체(예를 들어 본 개시내용의 항체) 및/또는 본 개시내용에 제공된 CDR의 서열에서 발견되는 것과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, CDR은 참조 CDR과 비교하여 서열이 동일하거나 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개(예를 들어 1개 내지 5개)의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, CDR은 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)의 서열 동일성을 보여준다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, CDR은 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 보여준다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, CDR은 CDR 내 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가 또는 치환되어 있지만, CDR이 다르게는 참조 CDR의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, CDR은 CDR 내 2개, 3개, 4개 또는 5개(예를 들어 2개 내지 5개)의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가 또는 치환되어 있지만, CDR이 다르게는 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 다양한 실시형태에서, 항원 결합 단편은 참조 항체와 동일한 항원에 결합한다. 다양한 실시형태에서, 항원 결합 단편은 예를 들어, 참조 항체와 실질적으로 같거나 동일한 에피토프에의 결합에 대해 참조 항체와 교차 경쟁한다.
항원 결합 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어 일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 재조합적으로(예컨대 조작된 핵산 서열의 발현에 의해) 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 완전히 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은 적어도 약 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 그 초과의 아미노산; 일부 실시형태에서 적어도 약 200개의 아미노산(예를 들어 50개 내지 100개, 50개 내지 150개, 50개 내지 200개, 또는 100개 내지 200개의 아미노산)의 길이를 가질 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호 교환적으로 사용된다. 가변 영역은 전형적으로, 항체 사이에서 서열이 크게 상이하며, 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는, 항체의 일부, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙 중쇄의 아미노 말단에 있는 약 110개 내지 120개의 아미노산과 성숙 경쇄의 약 90개 내지 115개의 아미노산을 지칭한다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 이들 영역에 집중되어 있으며, 한편 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 임의의 특정 메커니즘 또는 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 경쇄와 중쇄의 CDR은 항체와 항원의 상호작용 및 특이성을 주로 담당하는 것으로 여겨진다. 특정한 실시형태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정한 실시형태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 실시형태에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어 비인간 영장류) 가변 영역이다. 특정한 실시형태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 영장류(예를 들어 비인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 항체 또는 이의 항원-결합 분자의 경쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 항체 또는 이의 항원-결합 분자의 중쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
CDR에 대한 다수의 정의가 통상적으로 하기에 사용된다: Kabat 넘버링, Chothia 넘버링, AbM 넘버링, 또는 Contact 넘버링. AbM 정의는 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 2개 사이의 절충안이다. Contact 정의는 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다.
[표 1]
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용어 "Kabat 넘버링" 및 유사한 용어는 당업계에서 인정되는 것으로, 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 있는 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다. 특정한 양태에서, 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어 문헌[Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391] 및 문헌[Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로, 선택적으로 1개 또는 2개의 부가적인 아미노산을 포함할 수 있는 아미노산 위치 31 내지 35, 뒤이어 35(Kabat 넘버링 체계에서 35A 및 35B로 지칭됨)(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3)에 존재한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 체계에 따라 결정되었다.
특정한 양태에서, 항체의 CDR은 Chothia 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있으며, 이는 면역글로불린 구조적 루프의 위치를 지칭한다(예를 들어 문헌[Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917]; 문헌[Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948]; 문헌[Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817]; 문헌[Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조). 전형적으로, Kabat 넘버링 관례를 사용하는 경우, Chothia CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26번 내지 32번, 33번 또는 34번에 존재하며, Chothia CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52번 내지 56번에 존재하고, Chothia CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95번 내지 102번에 존재하며, Chothia CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24번 내지 34번에 존재하고, Chothia CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50번 내지 56번에 존재하며, Chothia CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89번 내지 97번에 존재한다. Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-HI 루프의 단부(end)는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다양하다(이는 Kabat 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하며; 35A 또는 35B 중 어느 것도 존재하지 않는다면, 루프는 32에서 끝나고; 35A만 존재한다면, 루프는 33에서 끝나고; 35A와 35B가 둘 다 존재한다면, 루프는 34에 끝나기 때문임). 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 Chothia 넘버링 체계에 따라 결정되었다.
용어 "불변 영역" 및 "불변 도메인"은 상호 교환적으로 사용되며, 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항체 부분, 예를 들어 항원에의 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
항체와 관련하여 사용될 때 용어 "중쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 지칭할 수 있으며, 이는 IgG의 하위부류, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 부류의 항체를 각각 생성한다.
항체와 관련하여 사용될 때 용어 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 카파(κ) 또는 람다(λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
"항원"은 인간 또는 동물에 주사되거나 흡수되는 조성물(예컨대 종양-특이적 단백질을 포함하는 것)을 포함하여, 인간 또는 동물에서 항체의 생산 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 성분을 지칭한다. 항원은 본원에 개시된 바와 같이 이종 항원에 의해 유도된 것을 포함하는 특정 체액성 또는 세포성 면역력의 생성물과 반응한다. "표적 항원" 또는 "관심 표적 항원"은 다른 정상적인(원하는) 세포의 표면에서 실질적으로 발견되지 않고 본원에서 고려되는 TCR 또는 CAR의 결합 도메인에 결합하도록 설계된 항원이다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 역할을 할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 항원은 내생적으로 발현, 즉 게놈 DNA에 의해 발현될 수 있거나, 재조합적으로 발현될 수 있다. 항원은 암세포와 같은 특정한 조직에 특이적일 수 있거나, 항원은 광범위하게 발현될 수 있다. 이에 더하여, 더 큰 분자의 단편이 항원으로 작용할 수 있다. "표적"은 결합 모티프, CAR, TCR 또는 항원 결합제, 예를 들어 항체에 의해 결합되는 임의의 분자이다.
"항원-특이적 표적화 영역"(ASTR)은 특정 항원을 표적화하는 CAR 또는 TCR의 영역을 지칭한다. CAR 또는 TCR 상의 표적화 영역은 세포외이다. 일부 실시형태에서, 항원-특이적 표적화 영역은 항체 또는 이의 기능적 등가물 또는 이의 단편 또는 이의 유도체를 포함하고, 각각의 표적화 영역은 상이한 항원을 표적화한다. 표적화 영역은 전장 중쇄, Fab 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, 2가 단일 사슬 항체 또는 디아바디(diabody)를 포함할 수 있고, 이들은 각각 표적 항원에 특이적이다. 그러나, 다수의 대체물, 예컨대 연결된 사이토카인(이는 사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식으로 이어짐), 아피바디(affibody), 천연 발생 수용체, 예컨대 NKG2D로부터의 리간드 결합 도메인, (예를 들어 종양 세포 상의) 수용체에 대한 가용성 단백질/펩타이드 리간드, 펩타이드, 및 면역 반응을 촉진하기 위한 백신이 존재하며, 이들은 각각 본 개시내용의 다양한 실시형태에 사용될 수 있다. 실제로, 당업자가 인식하게 될 바와 같이, 소정의 항원에 높은 친화도로 결합하는 대체로 임의의 분자는 항원-특이적 표적화 영역으로서 사용될 수 있다.
"항원 제시 세포" 또는 "APC"는 항원을 처리하고 T 세포에 제시하는 세포를 지칭한다. 예시적인 APC는 수지상 세포, 대식 세포, B 세포, 특정한 활성화된 상피 세포, 및 TCR 자극과 적절한 T 세포 공동자극을 가능하게 하는 다른 세포 유형을 포함한다.
"항종양 효과"는, 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 전이 수의 감소, 전체 생존율 또는 무진행 생존율의 증가, 기대 수명의 증가, 또는 종양과 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선으로서 존재할 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항종양 효과는 또한 종양 발생의 예방을 지칭할 수 있다.
2개의 사건 또는 엔티티는 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 상관관계가 있다면 서로 "회합된"다. 예를 들어, 엔티티(예를 들어 폴리펩타이드, 유전적 시그너처, 대사산물, 미생물 등)는 이의 존재, 수준 및/또는 형태가(예를 들어 관련 집단에 걸쳐) 질환, 장애 또는 병태의 발생빈도 및/또는 감수성과 상관관계가 있다면, 질환, 장애, 또는 병태와 회합되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 2개 이상의 엔티티가 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 이들이 서로와 물리적으로 가깝게 존재하고/하거나 유지(예를 들어 결합)된다면 이들은 서로와 물리적으로 "회합된"다. 부가적인 예에서, 서로 물리적으로 회합되는 2개 이상의 엔티티는 예를 들어, 수소 결합에 의해, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기작용(magnetism) 및 이들의 조합을 통해 서로 공유적으로 연결되거나 결합되거나, 비공유적으로 회합된다.
용어 "자가(autologous)"는 이후에 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조작된 자가 세포 치료법(eACT™)은 환자로부터의 림프구 수집을 수반하며, 그 후에 이는 예를 들어 CAR 작제물을 발현하도록 조작된 다음, 동일한 환자에게 다시 투여된다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원(예를 들어 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재성(intrinsic) 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수(KD) 및 평형 회합 상수(KA)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업계에 알려진 수많은 방식으로 측정되고/되거나 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되며, 반면 KA는 kon/koff의 몫으로부터 계산된다. kon은 예를 들어 항원에의 항체의 회합 속도 상수를 지칭하고, koff는 예를 들어 항원에의 항체의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 당업자에게 알려진 기술, 예컨대 BIAcore® 또는 KinExA에 의해 결정될 수 있다.
용어 "KD"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수, 또는 항원에 결합하는 항체 또는 항체-결합 단편의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD와 결합 친화도 사이에는 반비례 관계가 있으므로, KD 값이 작을수록 친화도가 더 높으며, 즉, 친화도가 더 강하다. 그러므로, 용어 "더 높은 친화도" 또는 "더 강한 친화도"는 상호작용을 형성하는 더 높은 능력 및 따라서 더 작은 KD 값에 관한 것이고, 대조적으로 용어 "더 낮은 친화도" 또는 "더 약한 친화도"는 상호작용을 형성하는 더 낮은 능력 및 따라서 더 큰 KD 값에 관한 것이다. 일부 상황에서, 또 다른 상호작용 파트너 분자(예를 들어 항원 Y)에의 분자(예를 들어 항체)의 결합 친화도와 비교하여 상호작용 파트너 분자(예를 들어 항원 X)에의 특정 분자(예를 들어 항체)의 더 높은 결합 친화도(또는 KD)는 더 큰 KD 값(더 낮은 또는 더 약한 친화도)을 더 작은 KD(더 높은 또는 더 강한 친화도)로 나누어서 결정되는 결합 비로서 표현될 수 있고, 예를 들어 경우에 따라 5배 또는 10배 더 큰 결합 친화도로서 표현될 수 있다.
용어 "kd"(초-1 또는 1/s)는 특정 결합쌍, 예컨대 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수 또는 결합쌍, 예컨대 항체 또는 항체-결합 단편의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 k0ir 값으로 지칭된다.
용어 "ka"(M-1 x 초-1 또는 1/M)는 특정 결합쌍, 예컨대 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수 또는 특정 결합쌍, 예컨대 항체 또는 항체-결합 단편의 회합 속도 상수를 지칭한다.
용어 "KA"(M-1 또는 1/M)는 특정 결합쌍, 예컨대 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수 또는 결합쌍, 예컨대 항체 또는 항체 결합 단편의 회합 평형 상수를 지칭한다. 회합 평형 상수는 ka를 kd로 나누어서 수득된다.
용어 "결합"은 일반적으로 2개 이상의 엔티티 사이에서 또는 엔티티 중에서의 비공유 회합을 지칭한다. 직접 결합은 엔티티와 모이어티 사이의 물리적 접촉을 수반한다. "간접" 결합은 하나 이상의 중간 엔티티와의 물리적 접촉에 의한 물리적 상호작용을 수반한다. 2개 이상의 엔티티 사이의 결합은 임의의 여러 가지 맥락에서 평가될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 상호작용성 엔티티 또는 모이어티는 단리되어 또는 더 복잡한 시스템의 맥락에서(예를 들어 한편 담체 엔티티와 공유적으로 또는 다르게는 회합되고/되거나 세포와 같은 생물학적 시스템에서) 연구된다.
용어 "면역특이적으로 결합한다", "면역특이적으로 인식한다", "특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 인식한다"는 항체의 맥락에서 유사한 용어이고, 항원(예를 들어 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 분자를 지칭하며, 이러한 결합은 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 예를 들어, 면역검정, BIACORE®, KinExA 3000 장비(Sapidyne Instruments, Boise, ID), 또는 당업계에 알려진 다른 검정에 의해 결정되는 바와 같이 일반적으로 더 낮은 친화도로 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 상기 분자가 또 다른 항원에 결합하는 경우의 KA보다 적어도 2 log, 2.5 log, 3 log, 4 log 또는 그 초과인 KA로 항원에 결합한다. 결합은 결합 도메인, 항체, 또는 항원 결합 시스템과 표적이 아닌 엔티티(즉, 비표적)와의 회합과 비교하여 결합 도메인, 항체, 또는 항원 결합 시스템과 결합 도메인, 항체, 또는 항원 결합 시스템의 표적과의 우선적인 회합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 도메인, 항체, 또는 항원 결합 시스템은 결합 도메인, 항체, 또는 항원 결합 시스템과 표적 사이의 결합이 결합 도메인, 항체, 또는 항원 결합 시스템과 비표적의 결합과 비교하여 2배 초과, 5배 초과, 10배 초과, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 초과라면 표적에 선택적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 결합 도메인, 항체 또는 항원 결합 시스템은 결합 친화도가 약 10-5 M 미만, 약 10-6 M 미만, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만 또는 약 10-9 M 미만이라면 표적에 선택적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 약 1 × 10-7 M의 해리 상수(Kd)로 결합한다. 일부 실시형태에서, Kd가 약 1 × 10-9 M 내지 약 5 × 10-9 M일 때 항원 결합 분자는 "높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, Kd가 1 × 10-10 M 내지 약 5 × 10-10 M일 때 항원 결합 분자는 "매우 높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 분자는 10-9 M의 Kd를 갖는다. 일 실시형태에서, 오프율(off-rate)은 약 1 × 10-5 미만이다.
특정한 실시형태에서, 예를 들어 방사면역검정(radioimmunoassay), 표면 플라즈몬 공명, 또는 동역학 배제 검정(kinetic exclusion assay)에 의해 측정된 바와 같이 또 다른 종의 표적 항원보다 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 더 높은 친화도로 표적 인간 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 표적 인간 항원에 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 분자는 예를 들어, 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정된 바와 같이 인간 항원에의 항체 또는 이의 항원 결합 분자의 결합의 10%, 15% 또는 20% 미만으로 또 다른 종의 표적 항원에 결합할 것이다.
"암"은 신체에서 비정상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 제어되지 않는 세포 분열 및 성장은 인접 조직에 침범하여 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수도 있는 악성 종양의 형성을 초래한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 예를 들어 전립선암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부위암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 다발성 골수종, 호지킨 질환(Hodgkin's Disease), 비(non)호지킨림프종(NHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBC), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 형질전환된 여포성 림프종, 비장 변연부 림프종(SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL)(비(non)T 세포 ALL 포함), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소아의 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암종, 중추신경계(CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 표피양암, 편평세포암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것을 포함하여 환경적으로 유도된 암, 다른 B 세포 악성종양, 다발성 골수종, 및 상기 암의 조합으로부터 유래된 종양의 종양 크기를 저하시키는 데 사용될 수 있다. 특정 암은 화학 치료법 또는 방사선 치료법에 반응할 수 있거나, 암은 불응성일 수 있다. 불응성 암은 수술적 개입으로 교정할 수 없는 암을 지칭하며, 이러한 암은 초기에 화학 치료법 또는 방사선 치료법에 반응하지 않거나 암은 시간 경과에 따라 반응하지 않게 된다.
"케모카인"은 세포 화학주성 또는 방향성 이동을 매개하는 사이토카인 유형이다. 케모카인의 예는 IL-8, IL-16, 에오탁신, 에오탁신-3, 대식 세포-유래 케모카인(MDC 또는 CCL22), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1 또는 CCL2), MCP-4, 대식 세포 염증성 단백질 1α(MIP-1α, MIP-1a), MIP-1β(MIP-1b), 감마-유도 단백질 10(IP-10), 흉선 및 활성화 조절 케모카인(TARC 또는 CCL17)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
"키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 결합 도메인, 및 항원 결합 시 면역 세포(예를 들어 무경험(naive) T 세포, 중심 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, NK 세포 또는 이들의 조합과 같은 T 세포)를 활성화시키는 수단을 포함하도록 조작된 분자를 지칭한다. CAR은 또한 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체로도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 결합 도메인, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포는 CAR T 세포로 지칭될 수 있다. 유사하게는, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포는 CAR NK 세포로 지칭될 수 있다.
"감소시키다" 또는 "낮추다" 또는 "줄이다" 또는 "저하시키다" 또는 "약화시키다"란, 일반적으로 비히클 단독(즉, 활성 모이어티) 또는 대조군 분자/조성물에 의해 야기되는 반응과 비교하여 더 적은 생리학적 반응(즉, 다운스트림 효과)을 발휘하거나 유도하거나 야기하는 본원에서 고려되는 조성물의 능력을 지칭한다. "감소" 또는 "저하된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 대조군 조성물인 비히클에 의해 발휘되는 반응(참조 반응)의 1.1배, 1.2배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 30배 또는 그 초과(예를 들어 500배, 1000배)(이들 수치 사이에 있으며 1 위인 모든 정수 및 소수점, 예를 들어 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배 등 포함)의 감소를 포함할 수 있다.
"세포외 도메인"(또는 "ECD")은 폴리펩타이드가 세포막에 존재할 때, 세포막 외부의 세포외 공간에 체류하는 것으로 이해되는 폴리펩타이드의 일부를 지칭한다. 엑토 도메인은 본원에서 세포외 도메인과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드, 예를 들어, 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질환 상태(예를 들어 암)와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 관련된 마커를 포함한다.
CAR의 결합 도메인에 뒤이어 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 이동시키는 영역을 지칭하는 "스페이서" 또는 "힌지"가 있을 수 있다(문헌[Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419]). CAR에서 힌지 영역은 일반적으로 막관통(TM) 도메인과 결합 도메인 사이에 있다. 특정한 실시형태에서, 힌지 영역은 면역글로불린 힌지 영역이고, 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역, 예커내 Igg4 힌지일 수 있다. 본원에 기재된 CAR에 사용되는 다른 예시적인 힌지 영역은 CD8알파, CD4, CD28 및 CD7과 같은 유형 1 막단백질의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역을 포함하며, 이는 이러한 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 변경될 수 있다.
"막관통" 영역 또는 도메인은 세포외 결합 부분을 면역 이펙터 세포의 원형질막에 고정시켜 표적 항원에의 결합 도메인의 결합을 용이하게 하는 CAR의 부분이다. 막관통 도메인은 CD3제타 막관통 도메인일 수 있으나, 이용될 수 있는 다른 막관통 도메인은 CD8알파, CD4, CD28, CD45, CD9, CD16, CD22, CD33, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, NKG2D, 2B4, 및 CD154로부터 수득된 것을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있는데, 이 경우 이는 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다.
"세포내 신호전달 도메인" 또는 "신호전달 도메인"은 이펙터 세포 기능, 예를 들어 활성화, 사이토카인 생산, 증식, 및 CAR-결합 표적 세포로의 세포독성 인자의 방출을 포함한 세포독성 활성, 또는 세포외 CAR 도메인에의 항원 결합으로 유도된 다른 세포 반응을 유도하기 위해, 표적 항원에의 효과적인 CAR 결합의 메시지를 면역 이펙터 세포의 내부로 전달하는 데 참여하는 키메라 항원 수용체 단백질의 부분을 지칭한다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수한 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어 세포용해 활성, 또는 사이토카인의 분비를 포함한 활성 또는 도움일 수 있다. 그러므로, 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인" 또는 "신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 다수의 경우 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된(truncated) 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절두된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 전체 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하는 것으로 의미된다. 세포내 신호전달 도메인은 "신호 전달(signal transduction) 도메인"이라고도 알려져 있으며, 전형적으로 인간 CD3 또는 FcRy 사슬의 부분으로부터 유래된다.
T 세포 수용체를 통해 생성된 신호만으로는 T 세포의 완전한 활성화에 충분하지 않으며, 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요한 것으로 알려져 있다. 그러므로, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 구별되는 부류에 의해 매개된다고 말할 수 있다: T 세포 수용체를 통해 항원 의존적 1차 활성화(1차 세포질 신호전달 서열)를 개시하는 것 및 항원 독립적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동자극 신호(2차 세포질 신호전달 서열)를 제공하는 것. 공동자극 방식으로 작용하는 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기초 활성화 도메인 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 도메인을 함유할 수 있다.
본 개시내용에서 특정하게 사용되는 ITAM 함유 1차 세포질 신호전달 서열의 예는 DAP10, DAP12, TCR제타, FcR감마, FcR베타, CD3제타, CD3감마, CD3델타, CD3엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래되는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "공동자극 신호전달 도메인" 또는 "공동자극 도메인"은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 결합 시 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 제2 신호를 제공하는 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 공동자극 분자의 예는 CD27, CD28, 4--1 BB(CD137), OX40(CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS(CD278), LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKD2C, 2B4, CD137, DAP12, B7-H2, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 이에, 본 개시내용은 CD28로부터 유래된 예시적인 공동자극 도메인을 제공하는 한편, CD3-엡신론, 4-1BB, 다른 공동자극 도메인은 본원에 기재된 CAR과의 사용에 고려된다. 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인의 포함은 CAR 수용체를 발현하는 T 세포 및 NK 세포의 효능 및 확장(expansion)을 증강시킬 수 있다. 세포내 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카르복실 말단에 직렬로 임의의 순서로 연결될 수 있다.
CD3 또는 FcR감마로부터의 신호전달 도메인을 함유하도록 조작된 CAR은 T 세포 활성화 및 이펙터 기능을 위한 강력한 신호를 전달하는 것으로 제시되어 있지만, 이들은 동시 공동자극 신호의 부재 하에 T 세포 생존 및 확장을 촉진하는 신호를 유도하기에 충분하지 않다. 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어 4-1BB, CD28, CD134 및 CD278로부터 유래된 세포내 공동자극 도메인)과 함께 결합 도메인, 힌지, 막관통 도메인, 및 CD3제타 또는 FcR감마로부터 유래된 신호전달 도메인을 함유하는 다른 CAR은 시험관내 및 동물 모델 및 암 환자에서 CAR 발현 T 세포에서 증가된 사이토카인 분비, 용해 활성, 생존 및 증식뿐만 아니라 항종양 활성을 더 효과적으로 지시할 수 있다(문헌[Milone et al., Molecular Therapy, 2009; 17: 1453-1464]; 문헌[Zhong et al., Molecular Therapy, 2010; 18: 413-420]; 문헌[Carpenito et al., PNAS, 2009; 106:3360-3365]).
"공동자극 신호"는 TCR/CD3 결찰과 같은 1차 신호와 조합되어 핵심 분자의 증식 및/또는 상향조절 또는 하향조절과 같으나 이로 제한되지 않는 T 세포 반응을 유발하는 신호를 지칭한다.
"공동자극 리간드"는 T 세포 상의 동족(cognate) 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 상의 분자를 포함한다. 공동자극 리간드의 결합은 비제한적으로, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공동자극 리간드는 자극 분자에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체와 펩타이드가 로딩된 주조직적합 복합체(MHC) 분자와의 결합에 의한 신호를 유도한다. 공동자극 리간드는 3/TR6, 4-1BB 리간드, Toll 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD30 리간드, CD40, CD7, CD70, CD83, 헤르페스 바이러스 진입 매개체(HVEM), 인간 백혈구 항원 G(HLA-G), ILT4, 면역글로불린 유사 전사체(ILT) 3, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM), B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드, 림포톡신 베타 수용체, MHC 부류 I 사슬-관련 단백질 A(MICA), MHC 부류 I 사슬-관련 단백질 B(MICB), OX40 리간드, PD-L2 또는 세포 예정사(PD) L1을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 공동자극 리간드는 비제한적으로, T 세포 상에 존재하는 공동자극 분자, 예컨대 비제한적으로 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), 자연 살해 세포 수용체 C(NKG2C), OX40, PD-1, 또는 종양 괴사 인자 슈퍼계열 구성원 14(TNFSF14 또는 LIGHT)와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 이로써 비제한적으로, 증식과 같은 T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너이다. 공동자극 분자는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여 증식과 같으나 이로 제한되지 않는 T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너인 "공동자극 분자"를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 공동자극 분자는 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD 33, CD 45, CD100(SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3(알파; 베타; 델타; 엡실론; 감마; 제타), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, CD83 리간드, CD84, CD86, CD8알파, CD8베타, CD9, CD96(Tactile), CDl-la, CDl-lb, CDl-lc, CDl-ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig 알파(CD79a), IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGBl, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT(종양 괴사 인자 슈퍼계열 구성원 14; TNFSF14), LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1(CDl la/CD18), MHC 부류 I 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구 활성화 분자, SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1, 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절두체(truncation) 또는 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 분자의 CDR(들) 또는 프레임워크 영역(들) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 일반적으로, 2개의 서열은 일반적으로, 이들이 상응하는 위치에 보존적 아미노산 치환을 함유한다면 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 예를 들어, 특정한 아미노산은 일반적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로, 그리고/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 하나의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 치환되는 것은 보존적 치환으로 간주될 수 있다. 예시적인 아미노산 분류는 아래 표 2 및 표 3에 요약되어 있다:
[표 2]
Figure pct00003
[표 3]
Figure pct00004
"병용 치료법"은 대상체가 2개 이상의 치료 요법(therapeutic regimen)(예를 들어 2개 이상의 치료 모이어티)에 동시에 노출되는 상황을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 요법은 동시에 투여될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 이러한 요법은 순차적으로 투여될 수 있고(예를 들어 두 번째 요법의 임의의 용량의 투여 전에 첫 번째 요법의 모든 "용량"이 투여됨); 일부 실시형태에서, 이러한 제제는 중복 투여 요법으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 병용 치료법의 "투여"는 다른 제제(들) 또는 방식(들)을 조합하여 투여받고 있는 대상체에게의 하나 이상의 제제(들) 또는 방식(들)의 투여를 수반할 수 있다. 명확성을 위해, 병용 치료법은 개별 제제가 단일 조성물로 함께(또는 심지어 반드시 동시에) 투여될 필요는 없지만, 일부 실시형태에서, 2개 이상의 제제 또는 이의 활성 모이어티는 조합 조성물 또는 심지어 조합 화합물로(예를 들어 단일 화학 복합체 또는 공유 엔티티의 일부로) 함께 투여될 수 있다.
"~에 상응하는"은 적절한 참조 분자 또는 조성물과 비교하여 분자 또는 조성물에서 구조 요소의 위치/동일성(identity)을 지정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 중합체 내 단량체성 잔기(예를 들어 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기 또는 폴리뉴클레오타이드 내 핵산 잔기)는 적절한 참조 중합체 내 잔기"에 상응하는" 것으로 식별될 수 있다. 예를 들어, 단순성의 목적을 위해, 폴리펩타이드 내 잔기는 참조 관련 폴리펩타이드에 기초한 캐노니컬 넘버링 시스템을 사용하여 지정될 수 있으며, 따라서 예를 들어 위치 100의 잔기"에 상응하는" 아미노산은 실제로 아미노산 사슬 내 100번째 아미노산일 필요가 없고, 단, 이는 참조 폴리펩타이드 내 위치 100에서 발견되는 잔기에 상응한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 폴리펩타이드 및/또는 핵산 내의 "상응하는" 잔기를 식별하기 위해 활용될 수 있는 예를 들어, BLAST, CS-BLAST, CUDASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM, 또는 SWIPE와 같은 소프트웨어 프로그램을 포함하는 다양한 서열 정렬 전략이 이용 가능하다.
항원 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CAR 또는 TCR은 항원과 제1 항원 결합 분자 사이의 상호작용이 참조 결합 분자가 항원과 상호작용하는 능력을 차단하거나, 제한하거나 저해하거나 다르게는 저하시킨다면 참조 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 "교차-경쟁"한다. 교차 경쟁은 완전할 수 있고, 예를 들어, 항원에의 항원 결합 분자의 결합은 참조 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 완전히 차단하거나, 교차 경쟁은 부분적일 수 있고, 예를 들어, 항원에의 항원 결합 분자의 결합은 참조 항원 결합 분자가 항원에 결합하는 능력을 저하시킨다. 특정한 실시형태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 참조 항원 결합 분자와 교차-경쟁하는 항원 결합 분자는 참조 항원 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 예를 들어 하기와 같은 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정이 사용되어, 하나의 항원 결합 분자가 또 다른 것과 경쟁하는지의 여부를 결정할 수 있다: 고체상 직접 또는 간접 방사면역검정(RIA); 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA); 샌드위치 경쟁 검정(문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253]); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619]); 고체상 직접 표지 검정, 고체상 직접 표지 샌드위치 검정(문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]); 1-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(문헌[Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15]); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(문헌[Cheung, et al., 1990, Virology 176:546--552]); 및 직접 표지 RIA(문헌[Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82]).
"사이토카인"은 특정 항원과의 접촉에 반응하여 하나의 세포에 의해 방출되는 비항체 단백질을 지칭하며, 상기 사이토카인은 제2 세포와 상호작용하여 제2 세포에서의 반응을 매개한다. 사이토카인은 세포에 의해 내생적으로 발현되거나 대상체에게 투여될 수 있다. 사이토카인은 대식 세포, B 세포, T 세포 및 비만 세포를 포함한 면역 세포에 의해 방출되어 면역 반응을 전파할 수 있다. 사이토카인은 수용자(recipient) 세포에서 다양한 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인은 항상성 사이토카인, 케모카인, 전염증성 사이토카인, 이펙터 및 급성기 단백질(acute-phase protein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터류킨(IL) 7 및 IL-15를 포함한 항상성 사이토카인은 면역 세포 생존 및 증식을 촉진하고, 전염증성 사이토카인은 염증 반응을 촉진할 수 있다. 항상성 사이토카인의 예는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 및 인터페론(IFN) 감마를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 전염증성 사이토카인의 예는, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, 종양 괴사 인자(TNF)-알파, TNF-베타, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 2, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 가용성 세포간 접착 분자 1(sICAM-1), 가용성 혈관 세포 접착 분자 1(sVCAM-1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF-C, VEGF-D 및 태반 성장 인자(PLGF)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이펙터의 예는 그랜자임 A, 그랜자임 B, 가용성 Fas 리간드(sFasL) 및 퍼포린을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 급성기 단백질의 예는 C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
용어 "도메인"은 엔티티의 일부를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "도메인"은 엔티티의 구조적 및/또는 기능적 특질과 연관이 있으며, 예를 들어, 도메인이 이의 부모(parent) 엔티티의 나머지로부터 물리적으로 분리될 때, 이는 구조적 및/또는 기능적 특질을 실질적으로 또는 전적으로 보유한다. 일부 실시형태에서, 도메인은 해당 (부모) 엔티티로부터 분리되고 상이한 (수용자) 엔티티와 연결되거나 결합될 때, 수용자 엔티티 상에 예를 들어, 부모 엔티티에서 이를 특징화하는 하나 이상의 구조적 및/또는 기능적 특질을 실질적으로 보유하고/하거나 부여하는 엔티티의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 도메인은 분자(예를 들어 저분자, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 폴리펩타이드)의 부분이다. 일부 실시형태에서, 도메인은 폴리펩타이드의 절편(section)이며; 일부 이러한 실시형태에서, 도메인은 구조적 요소(예를 들어 아미노산 서열 또는 서열 도메인, α-나선 특징, β-시트 특징, 코일드-코일 특징, 무작위 코일 특징 등), 및/또는 기능적 특질(예를 들어 결합 활성, 효소 활성, 접힘 활성, 신호전달 활성 등)을 특징으로 한다.
용어 "투여 형태"는 대상체에게 투여하기 위한 활성제(예를 들어 항원 결합 시스템 또는 항체)의 물리적으로 분리된 단위를 지칭하기 위해서 사용될 수 있다. 일반적으로, 각각의 이러한 단위는 사전결정된 양의 활성제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 이러한 양은 관련 집단에 투여될 때 원하는 또는 유익한 성과와 상관관계가 있는 것으로 결정된 투여 요법에 따른 투여에 적절한 단위 투여량(또는 이의 전체 분획)이다. 대상체에게 투여되는 치료용 조성물 또는 제제의 총량은 1명 이상의 의사에 의해 결정되고, 하나 초과의 투여 형태의 투여를 포함할 수 있다.
용어 "투여 요법"은 대상체에게 개별적으로 투여되는 하나 이상의 단위 용량의 세트를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 소정의 치료제는 하나 이상의 용량을 수반할 수 있는 권장 투여 요법을 갖는다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 각각의 용량이 다른 용량과 시간상 분리된 복수의 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 복수의 용량을 포함하고, 연속된 용량은 동일한 길이의 기간에 의해 서로 분리되며; 일부 실시형태에서, 투여 요법은 복수의 용량을 포함하고, 연속된 용량은 적어도 2개의 상이한 길이의 기간에 의해 서로 분리된다. 일부 실시형태에서, 투여 요법 내 모든 용량은 동일한 단위 용량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 투여 요법 내 상이한 용량은 상이한 양을 갖는다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 용량, 뒤이어 제1 투여량과 상이한 제2 투여량의 하나 이상의 추가 용량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 요법은 원하는 또는 유익한 성과를 달성하도록 주기적으로 조정된다.
"이펙터 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이펙터 세포는 비제한적으로, 단핵구, 대식 세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포(Langerhans' 세포), 자연 살해(NK) 세포, T-림프구 및 B-림프구 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이펙터 세포는 비제한적으로, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하는 임의의 유기체의 것일 수 있다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용의 생물학적 결과를 지칭한다. 이펙터 기능은 비제한적으로, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포-매개 포식작용(ADCP) 및 보체-매개 세포독성(CMC)을 포함한다. 이펙터 기능은 항원 결합 의존적, 항원 결합 독립적 또는 둘 다일 수 있다. ADCC는 면역 이펙터 세포에 의한 항체-결합 표적 세포의 용해를 지칭한다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, ADCC는 일반적으로 항체-코팅된 표적 세포(예를 들어 표면 상에 항원을 발현하고 이 항원에 항체가 결합되는 세포)를 인식하고 후속적으로 사멸시키는 Fc 수용체(FcR)-보유 이펙터 세포를 수반하는 것으로 이해된다. ADCC를 매개하는 이펙터 세포는 비제한적으로, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 호중구, 호산구 중 하나 이상을 포함하는 면역 세포를 포함할 수 있다.
"eACT™"로 약칭될 수 있고, 입양 세포 전달로도 알려진 용어 "조작된 자가 세포 치료법"은 환자 자체의 T 세포가 수집되고 후속적으로 하나 이상의 특정 종양 세포 또는 악성종양의 세포 표면 상에서 발현된 하나 이상의 항원을 인식하고 표적화하도록 유전적으로 변경되는 과정이다. T 세포 또는 NK 세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 예에서, CAR 양성(+) T 세포 또는 NK 세포는 적어도 하나의 공동자극 도메인과 적어도 하나의 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 부분에 연결된 특정 종양 항원에 대해 특이성을 갖는 세포외 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 발현하도록 조작된다. 일부 예에서, CAR 양성(+) T 세포 또는 NK 세포는 적어도 하나의 공동자극 도메인과 적어도 하나의 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 파트에 연결된 NKG2D 항원에 대해 특이성을 갖는 NKG2D의 세포외 도메인을 발현하도록 조작된다. 공동자극 도메인은 천연 발생 공동자극 도메인 또는 이의 변이체, 예를 들어 절두된 힌지 도메인("THD")을 갖는 변이체로부터 유래될 수 있고, 활성화 도메인은 예를 들어 CD3-제타 및/또는 CD3-엡실론으로부터 유래될 수 있다. 특정한 실시형태에서, CAR은 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 공동자극 도메인을 갖도록 설계된다.
일부 실시형태에서, CAR은 공동자극 도메인이 별개의 폴리펩타이드 사슬로서 발현되도록 조작된다. CAR T 세포 치료법 및 작제물의 예는 미국 특허출원공개 제2013/0287748호, 제2014/0227237호, 제2014/0099309호 및 제2014/0050708호에 기재되어 있으며, 이들은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. "입양 세포 치료법" 또는 "ACT"는 대상체, 예를 들어 암 환자에게 항종양 활성을 갖는 면역 세포를 전달하는 것을 수반한다. 일부 실시형태에서, ACT는 항종양 활성을 갖는 림프구(예를 들어 조작된 림프구)의 사용을 수반하는 치료 접근법이다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 지칭한다. 에피토프는 예를 들어 폴리펩타이드의 인접(contiguous) 아미노산(선형 또는 인접 에피토프)일 수 있거나, 에피토프는 예를 들어 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 2개 이상의 비(non)인접 영역이 함께 합쳐질 수 있다(입체배열적, 비선형, 불연속 또는 비인접 에피토프). 특정한 실시형태에서, 항체가 결합하는 에피토프는 예를 들어 NMR 분광법, X선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분석법과 결합된 수소/중수소 교환(예를 들어 액체 크로마토그래피 전자분무 질량 분석법), 어레이-기초 올리고-펩타이드 스캐닝 검정, 및/또는 돌연변이유발 맵핑(예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. X-선 결정학에 대해, 결정화는 당업계의 임의의 알려진 방법을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어 문헌[
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(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350]; 문헌[McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23]; 문헌[Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274]; 문헌[McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303] 참조). 항체:항원 결정은 잘 알려진 X선 회절 기법을 사용하여 연구될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 X-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포됨; 예를 들어, 문헌[Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,]; 미국 특허 출원 공보 제U.S. 2004/0014194호 참조), 및 BUSTER(문헌[Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60]; 문헌[Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW]; 문헌[Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323] 참조)를 사용하여 개선될 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기법을 포함하는 돌연변이유발 기법의 설명에 대해서는 문헌[Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394] 및 문헌[Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085]를 참조한다.
유전자, 단백질 및/또는 핵산과 관련하여 "내인성"은 세포, 예컨대 면역 세포에서 해당 유전자, 단백질 및/또는 핵산의 천연적인 존재를 지칭한다.
"외인성"은 예를 들어, 외부 공급원으로부터 세포로 도입된 제제, 예컨대 핵산, 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 세포에 도입된 핵산은 이것이 세포에서 천연적으로 발견되는 단백질을 인코딩하더라도 외인성이다. 단백질을 인코딩하는 핵산의 이러한 외인성 도입은 예를 들어, 외인성 핵산의 도입 없이 유사한 조건 하에 세포에서 천연적으로 발견될 수준을 능가하여 단백질의 발현을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다.
용어 "부형제"는 예를 들어 원하는 점조도(consistency) 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 적합한 부형제는 예를 들어 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 물질 또는 엔티티의 "단편" 또는 "부분"은 전체, 예를 들어 물리적 엔티티 또는 추상적 엔티티의 개별 부분을 포함하는 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 단편에는 전체에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조적 요소, 도메인 또는 모이어티로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개 또는 그 초과의 단량체 단위(예를 들어 잔기)를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과(예를 들어 85 내지 90%, 85 내지 95%, 85 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%)의 단량체 단위(예를 들어 잔기)를 포함하거나 이로 구성된다. 전체 물질 또는 엔티티는 일부 실시형태에서 단편의 "부모"로서 지칭될 수 있다.
용어 "융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질"은 일반적으로 적어도 2개의 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 적어도 2개의 이러한 분절을 함유하는 폴리펩타이드는, 2개의 분절이 (1) 동일한 펩타이드에 자연적으로 포함되어 있지 않고/않거나, (2) 이전에 단일 폴리펩타이드에서 서로 연결 또는 결합되지 않았고/않았거나, (3) 인간의 손의 작용을 통해 서로 연결 또는 결합된 모이어티인 경우, 융합 폴리펩타이드인 것으로 간주된다. 실시형태에서, CAR은 융합 단백질이다. 실시형태에서, TCR은 융합 단백질이다.
용어 "유전자 생성물" 또는 "발현 생성물"은 일반적으로 유전자로부터 전사되는 RNA(가공-전 및/또는 가공-후) 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 인코딩된 폴리펩타이드(변형-전 및/또는 변형-후)를 지칭한다.
용어 "유전적으로 조작된" 또는 "조작된"은 비제한적으로, 코딩 또는 비코딩 영역 또는 이의 일부를 결실시키거나, 코딩 영역 또는 이의 일부를 삽입하는 단계를 포함하는, 세포의 게놈을 변형시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형되는 세포는 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있는 림프구, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 림프구, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포로 분화될 수 있는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 세포는 예를 들어 세포의 게놈에 혼입되는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 외인성 작제물을 발현하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 거부를 감소시키고/시키거나 세포 적합성을 증강시키기 위해 다른 유전자 편집이 수행될 수 있다. 조작은 일반적으로 인간의 손에 의한 조작을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 자연에서 해당 순서로 함께 연결 또는 결합되지 않은 2개 이상의 서열이 조작된 폴리뉴클레오타이드에서 서로 직접적으로 연결 또는 결합되도록 인간의 손에 의해 조작되는 경우, "조작된" 것으로 간주된다. 분자생물학 기법에 의한 세포 조작의 맥락에서, 세포 또는 유기체는 이의 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질이 예를 들어 형질전환, 체세포 혼성화, 형질주입, 형질도입 또는 다른 메커니즘에 의해 도입되었거나, 이전에 존재하는 유전 물질이 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이에 의해 또는 다른 프로토콜에 의해 변경되거나 제거됨), "조작된" 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 결합제는 변형된 림프구, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포이며, 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있다. 조작된 세포는, 예를 들어 세포의 게놈에 혼입되는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 외인성 구조체를 발현하도록 변형될 수 있다. 조작된 폴리뉴클레오타이드 또는 결합제의 자손은 일반적으로 실제 조작이 이전 엔티티에 대해 수행되었음에도 불구하고 "조작된" 것으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, "조작된"은 설계되고 생산된 엔티티를 지칭한다. 용어 "설계된"은 (i) 이의 구조가 사람의 손에 의해 선택되거나 선택되었고/되었거나; (ii) 사람의 손을 필요로 하는 과정에 의해 생산되고/되거나; (iii) 천연 성분 및 다른 기지의 제제와 구별되는 제제를 지칭한다.
"T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 T 세포의 표면 상에 존재하는 항원 인식 분자를 지칭한다. 정상적인 T 세포 발달 동안, 4개의 TCR 유전자인 α, β, γ 및 δ는 각각, 재배열되어 매우 다양한 TCR 단백질을 이끌어낼 수 있다. TCR 기초 T 세포 치료법의 예는 국제 특허 출원 제PCT/US2013/059608호 및 제PCT/US2015/033129호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "이종성"은 천연 발생 서열 이외의 임의의 공급원으로부터 비롯됨을 의미한다. 예를 들어, 공동자극 단백질의 파트로서 포함된 이종성 서열은 천연 발생하지 않는 아미노산인데, 그 이유는 즉 야생형 인간 공동자극 단백질과 정렬하지 않기 때문이다. 예를 들어, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 야생형 인간 공동자극 단백질-인코딩 서열 이외의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "동일성"은 중합체 분자 사이의, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 그리고/또는 폴리펩타이드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 2개의 제공된 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 방법은 알려져 있다. 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 동일성 백분율 계산은 예를 들어 최적 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어 최적 정렬을 위해 제1 서열과 제2 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 동일하지 않은 서열은 무시될 수 있음). 그 후에, 상응하는 위치에서의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산)로 점유되어 있는 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 선택적으로 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있을 수 있는 갭의 수와 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 또는 정렬, 및 2개의 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 BLAST(베이직 로컬 정렬 검색 툴: basic local alignment search tool)와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 분자는 이들 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 동일한 경우 서로 "상동성"인 것으로 간주된다.
동일성 백분율을 계산하기 위해, 비교되는 서열은 전형적으로 서열 사이에서 가장 큰 매치(match)를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 백분율을 결정하는 데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 일례는 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지이다(문헌[Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387]; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 미국 위스콘신주 매디슨 소재). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 백분율이 결정될 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 정렬하는 데 사용된다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 최적 매칭(알고리즘에 의해 결정된 "매칭된 범위")을 위해 정렬된다. 특정한 실시형태에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스에 대해 문헌[Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대해 문헌[Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다. 뉴클레오타이드 서열의 경우 BLASTN 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, gapped BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상업적 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 것을 포함하는, 아미노산 또는 핵산 서열의 비교를 위한 다른 알고리즘이 또한 이용 가능하다. 예시적인 이러한 프로그램은 문헌[Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990]; 문헌[Altschul, et al., Methods in Enzymology]; 문헌[Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]; 문헌[Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 문헌[Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999]에 기재되어 있다. 유사한 서열을 식별하는 것에 더하여, 상기 언급된 프로그램은 일반적으로 유사성 정도의 표시를 제공한다. 일부 실시형태에서, 2개의 서열은 이들의 상응하는 잔기 중 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과가 잔기의 관련 스트레치(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)에 걸쳐 유사하고/하거나 동일한 경우 실질적으로 유사한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 관련 스트레치는 완전 서열이다. 일부 실시형태에서, 관련 스트레치는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개, 적어도 175개, 적어도 200개, 적어도 225개, 적어도 250개, 적어도 275개, 적어도 300개, 적어도 325개, 적어도 350개, 적어도 375개, 적어도 400개, 적어도 425개, 적어도 450개, 적어도 475개, 적어도 500개 또는 그 초과의 잔기이다. 실질적인 서열 유사성을 갖는 서열은 서로의 상동체일 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 언급할 때 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과의 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실과 최적으로 정렬되는 경우 하기에 논의된 바와 같은 임의의 널리 알려진 서열 동일성 알고리즘, 예컨대 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해 측정되는 바와 같이 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 95%, 더 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 나타낸다. 참조 핵산 분자와 실질적인 동일성을 갖는 핵산 분자는 특정한 경우, 참조 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용된 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 예컨대 기본 갭 가중치(default gap weight)를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬되는 경우 2개의 펩타이드 서열이 적어도 95%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 따라 상이하다.
용어 "향상시키다", "증가시키다", "저해하다" 및 "저하시키다"는 기준선 또는 다른 참조 측정에 상대적인 값을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조 측정은 다르게는 제제 또는 치료의 부재(예를 들어 그 전의 그리고/또는 그 후의)와 같은 필적한 조건 하에 또는 적절한 필적한 참조 제제의 존재 하에 특정한 시스템에서(예를 들어 단일 개체에서)의 측정을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 참조 측정은 관련 제제 또는 치료의 존재 하에 필적한 방식으로 반응하는 것으로 알려져 있거나 예상되는 필적한 시스템에서의 측정을 포함할 수 있다.
"면역 반응"은 병원체가 침범한 척추동물의 신체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 이에의 결합, 이에 대한 손상, 이의 파괴 및/또는 이의 제거를 초래하는, 면역계의 세포(예를 들어 T 림프구, B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구), 및 이러한 세포 중 임의의 하나 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(Ab, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
용어 "면역치료법"은 면역 반응을 유도하거나, 증강시키거나, 억제시키거나 다르게는 변형시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 질환을 앓고 있거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나 재발될 위험이 있는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다. 면역치료법의 예는 NK 세포 및 T 세포 치료법을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. T 세포 치료법은 입양 T 세포 치료법, 종양 침윤 림프구(TIL) 면역치료법, 자가 세포 치료법, 조작된 자가 세포 치료법(eACT™) 및 동종이계 T 세포 이식을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 본원에 개시된 조건화 방법이 임의의 이식된 T 세포 치료법의 효과성을 증강시킬 것임을 인식할 것이다. T 세포 치료법의 예는 미국 특허출원공개 제2014/0154228호 및 제2002/0006409호, 미국 특허 제5,728,388호, 및 국제공개 WO 2008/081035호에 기재되어 있다. TCR 기초 T 세포 치료법의 예는 국제 특허 출원 제PCT/US2013/059608호 및 제PCT/US2015/033129호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
면역치료법의 T 세포 또는 NK 세포는 당업계에 알려진 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, T 세포 및 NK 세포는 시험관내에서 조혈 줄기세포 집단(예를 들어 iPSC)으로부터 분화될 수 있거나, 대상체로부터 수득될 수 있다. T 세포 및 NK 세포는 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 이에 더하여, T 세포는 당업계에서 이용 가능한 하나 이상의 T 세포주로부터 유래될 수 있다. T 세포는 또한 FICOLL™ 분리 및/또는 성분채집술(apheresis)과 같이 당업자에게 알려진 임의의 수의 기법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. T 세포 치료법을 위해 T 세포를 단리하는 부가적인 방법은 미국 특허출원공개 제2013/0287748호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되다.
용어 "시험관내"는 다세포 유기체 내에서보다는 인공 환경에서, 예를 들어 시험관, 반응 용기, 세포 배양물 등에서 발생하는 사건을 지칭한다. 용어 "시험관내 세포"는 생체외에서 배양된 임의의 세포를 지칭한다. 특히, 시험관내 세포는 T 세포 또는 NK 세포를 포함할 수 있다. 용어 "생체내"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 지칭한다.
용어 "단리된"은 (1) 이전에 회합되었거나 다르게는 회합되었을 수 있는 적어도 일부 구성요소로부터 분리된 성분, 및/또는 (2) 제한된 또는 정의된 양 또는 농도의 하나 이상의 알려져 있거나 알려지지 않은 오염물을 포함하는 조성물에 존재하는 성분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 단리된 성분은 해당 성분과 이전에 회합되었던 다른 비(non)성분 구성요소, 예를 들어 해당 성분이 이전에 회합되었거나 다르게는 회합되었을 다른 구성요소 또는 오염물 중 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)로부터 분리될 수 있다. 특정한 예에서, 성분은 이것이 제한된 또는 저하된 양 또는 농도의 동일하거나 유사한 유형의 분자를 포함하는 조성물에 존재하는 경우, 단리된 것이다. 예를 들어 특정한 예에서, 핵산, DNA 또는 RNA 성분은 이것이 제한된 또는 저하된 양 또는 농도의 비성분 핵산, DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 조성물에 존재하는 경우, 단리된 것이다. 예를 들어, 특정한 예에서, 폴리펩타이드 성분은 이것이 제한된 또는 저하된 양 또는 농도의 비성분 폴리펩타이드 분자를 포함하는 조성물에 존재하는 경우, 단리된 것이다. 특정한 실시형태에서, 양은 예를 들어 조성물에 존재하는 원하는 성분의 양에 비해 측정된 양일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 제한된 양은 조성물 내 성분의 양의 100% 이하, 예를 들어 조성물 내 성분의 양(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이하인 양일 수 있다. 특정한 예에서, 조성물은 선택된 성분과 관련하여 순수하거나 실질적으로 순수하다. 일부 실시형태에서, 단리된 성분은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 순수하다. 다른 구성요소 또는 오염물이 실질적으로 없는 경우, 성분은 "순수"하다. 일부 실시형태에서, 성분은 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어 완충액, 용매, 물 등)와 같은 특정한 다른 구성요소와 조합된 후에도 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있으며; 이러한 실시형태에서, 성분의 단리 백분율 또는 순도는 이러한 담체 또는 부형제가 포함되지 않은 것으로 계산된다.
"링커"(L) 또는 "링커 도메인" 또는 "링커 영역"은 CAR, TCR 및/또는 scFv의 도메인/영역 중 임의의 것을 함께 또는 이들 폴리펩타이드 중 하나 이상을 함께 연결하는, 약 1 내지 100개의 아미노산 길이의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역을 지칭한다. 링커는 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기로 이루어질 수 있으며, 따라서 인접 단백질 도메인은 서로에 비해 자유롭게 이동한다. 더 긴 링커는 2개의 인접 도메인이 서로 공간적으로 방해하지 않는 것을 보장하는 것이 바람직할 때 사용될 수 있다. 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 절단 가능한 링커의 예는 2A 링커(예를 들어 T2A), 2A-유사 링커 또는 이의 기능적 등가물 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 피코르나바이러스 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스(P2A)의 CHYSEL 서열(서열 번호 1), 바이러스(T2A), 또는 이들의 조합, 변이체 및 기능적 등가물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커 서열은 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly(2A)-Pro(2B) 도메인(서열 번호 2)을 포함할 수 있는데, 이는 2A 글리신과 2B 프롤린 사이의 절단을 초래한다. 다른 링커는 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용과 함께 사용될 수 있다. 링커는 상이한 요소를 서로에 결합하는 다중-요소 제제의 일부일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 2개 이상의 기능적 또는 구조적 도메인을 포함하고, 이들을 서로 연결하는 이러한 도메인 사이의 아미노산의 스트레치를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 요소를 포함하는 폴리펩타이드는 일반 형태 S1-L-S2의 전체 구조를 갖고, 여기서 S1 및 S2는 동일하거나 상이할 수 있고, 링커에 의해 서로 회합된 2개의 도메인을 나타낸다. 링커는 CAR 또는 TCR의 도메인/영역 중 임의의 것을 함께 결합(connect)하거나 연결(link)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 링커는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 이상의 아미노산 길이(예를 들어 1개 내지 10개, 1개 내지 20개, 1개 내지 30개, 1개 내지 40개, 1개 내지 50개, 1개 내지 60개, 1개 내지 70개, 1개 내지 80개, 1개 내지 90개, 1개 내지 100개, 10개 내지 20개, 10개 내지 30개, 10개 내지 40개, 10개 내지 50개, 10개 내지 60개, 10개 내지 70개, 10개 내지 80개, 10개 내지 90개, 또는 10개 내지 100개 아미노산 길이)이다. 일부 실시형태에서, 링커는 강직한 3차원 구조를 채택하지 않는 경향이 있고, 대신에 폴리펩타이드에 가요성을 제공하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 예에서, 이는 CAR 및/또는 TCR과 같은 발현될 하나 이상의 폴리펩타이드에 연결하기 위해 사용될 수 있다.
다른 링커는 절단 불가능한 링커를 포함한다. "가요성 링커"를 포함한 다수의 링커가 본 발명을 실현하기 위해 이용된다. 후자는 글리신이 풍부하다. 문헌[Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection Vol. 27, No. 10, pp. 325―330, 2014]; 문헌[Priyanka et al., Protein Sci., 2013 Feb; 22(2): 153―167].
일부 실시형태에서, 링커는 합성 링커이다. 합성 링커는 약 10개 아미노산 내지 약 200개 아미노산, 예를 들어, 10 내지 25개 아미노산, 25 내지 50개 아미노산, 50 내지 75개 아미노산, 75 내지 100개 아미노산, 100 내지 125개 아미노산, 125 내지 150개 아미노산, 150 내지 175개 아미노산, 또는 175 내지 200개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 합성 링커는 10 내지 30개 아미노산, 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이를 가질 수 있다. 합성 링커는 30 내지 50개 아미노산, 예를 들어, 30 내지 35개 아미노산, 35 내지 40개 아미노산, 40 내지 45개 아미노산, 또는 45 내지 50개 아미노산 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커는 가요성 링커이다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리신(Gly 또는 G) 잔기가 풍부하다. 일부 실시형태에서, 링커는 세린(Ser 또는 S) 잔기가 풍부하다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리신 및 세린 잔기가 풍부하다.
용어 "림프구"는 자연 살해(NK) 세포, T 세포 또는 B 세포를 포함한다. NK 세포는 선천성 면역계의 구성요소를 나타내는 세포독성(세포 독성) 림프구의 한 유형이다. NK 세포는 바이러스에 감염된 세포와 종양을 거부한다. 이는 세포자멸사 또는 세포예정사의 과정을 통해 작용한다. 이는 세포를 사멸시키기 위한 활성화가 필요 없기 때문에 "자연 살해자"로 지칭되었다. T 세포는 세포-매개-면역력에서 역할을 한다(항체 관여가 없음). 이의 T 세포 수용체(TCR)는 다른 림프구 유형으로부터 이들 자신을 구별되게 한다. 면역계의 특수 기관인 흉선은 주로 T 세포의 성숙을 담당한다. 6개 유형의 T 세포, 즉: 헬퍼 T 세포(예를 들어 CD4+ 세포), 세포독성 T 세포(TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-살해 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 살해 T 세포로도 알려짐), 기억 T 세포((i) 무경험 세포와 같은 줄기 기억 TSCM 세포는 CD45RO―, CCR7+, CD45RA+, CD62L+(L-셀렉틴), CD27+, CD28+, 및 IL-7Rα+이지만, 이는 또한 다량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3 및 LFA-1을 발현하며, 기억 세포에 특징적인 수많은 기능적 속성을 보여주며); (ii) 중심 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고, 이는 IL-2를 분비하지만, IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 않으며, (iii) 그러나, 이펙터 기억 TEM 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만 IFNγ 및 IL-4와 같은 이펙터 사이토카인을 생산함), 조절 T 세포(Treg, 억제자 T 세포, 또는 CD4+CD25+ 조절 T 세포), 자연 살해 T 세포(NKT), 및 감마 델타 T 세포가 존재한다. 한편, B 세포는 체액성 면역력(항체가 관여함)에서 역할을 한다. 이는 항체 및 항원을 만들며, 항원 제시 세포(APC)의 역할을 수행하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후 기억 B 세포로 변한다. 포유류에서, 미성숙 B 세포는 골수에서 형성되는데, 여기서 이의 명칭이 유래된다.
용어 "중화"는 리간드에 결합하고 해당 리간드의 생물학적 효과를 방지하거나 저하시키는 항원 결합 분자, scFv, 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체 또는 이의 단편은 리간드 상의 결합 부위를 직접적으로 차단하거나, 다르게는 간접적인 수단(예컨대 리간드의 구조 또는 에너지 변경)을 통해 리간드의 결합 능력을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체 또는 이의 단편은 이에 결합된 단백질이 생물학적 기능을 수행하는 것을 방지한다.
"핵산"은 뉴클레오타이드의 임의의 중합체 사슬을 지칭한다. 핵산은 DNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보적 주형에 기초한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 번식, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 20개, 225개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개 또는 그 초과의 잔기 길이(예를 들어 20개 내지 100개, 20개 내지 500개, 20개 내지 1000개, 20개 내지 2000개, 또는 20개 내지 5000개 또는 그 초과의 잔기)이다. 일부 실시형태에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 실시형태에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서 핵산은 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 보체이다.
"작동 가능하게 연결된"은 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하는 것을 가능하게 하는 관계에 있는 근접위치(juxtaposition)를 지칭한다. 예를 들어, 기능적 요소에 "작동 가능하게 연결된(operably linked)" 제어 요소는 기능적 요소의 발현 및/또는 활성이 제어 요소와 상용성인 조건 하에 달성되는 방식으로 회합된다. 실시형태에서, 프로모터는 핵산에 작동 가능하게 연결된다.
"환자"는 암(예를 들어 다발성 골수종)을 앓고 있는 임의의 인간을 포함한다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어는 예를 들어, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로서 당업계에서 또한 보편적으로 지칭되는 단쇄와, 많은 유형이 존재하는 일반적으로 당업계에서 또한 단백질로 지칭되는 장쇄를 둘 다 지칭한다. "폴리펩타이드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 수용자에게 투여될 때, 이의 수용자에게 유해하지 않거나, 이의 수용자에 대한 유익한 효과가 임의의 유해한 효과를 능가하는 분자 또는 조성물을 지칭한다. 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 제형화하는 데 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 관련하여, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 조성물의 다른 성분과 상용성이어야 하고, 이의 수용자에게 유해하지 않거나, 수용자에게 유익한 효과가 임의의 유해한 효과를 능가해야 한다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 제제를 신체의 한 부분에서 다른 부분으로(예를 들어 한 기관에서 다른 기관으로) 운반하거나 수송하는 것에 관여하는 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 약학적 조성물에 존재하는 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고, 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능해야"하고, 수용자에게 유익한 효과가 임의의 유해한 효과를 능가해야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 하기를 포함한다: 당(sugar), 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말형 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충액, 예컨대 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 무발열원 증류수(pyrogen-free water); 등장 식염수; 링거액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약학적 제형에 이용되는 다른 비독성의 상용성 성분.
용어 "약학적 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 대상체 또는 집단에 투여될 때, 사전결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 보여주는 치료 요법에서 투여에 적절한 단위 용량으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 비제한적으로, 하기를 위해 맞춰진 형태를 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제형화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어 드렌치(drench)(수성 또는 비(non)수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어 협측, 설하 및 전신 흡수를 목적으로 하는 것, 볼루스, 분말, 과립, 혀 도포용 페이스트; 비경구 투여, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출형 제형으로서의 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의함; 국소 적용, 예를 들어 크림, 연고, 또는 피부, 폐 또는 구강에 도포되는 제어-방출형 패치 또는 스프레이로서; 질내 또는 직장내, 예를 들어 패서리, 크림 또는 발포체로서; 설하; 안구; 경피; 또는 비강, 폐 및 다른 점막 표면.
용어 "증식"은 세포 분열, 즉, 세포의 대칭 또는 비대칭 분열의 증가를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "증식"은 T 세포의 대칭 또는 비대칭 분열을 지칭한다. "증가된 증식"은 처리되지 않은 샘플의 세포와 비교하여 처리된 샘플에서 세포 수의 증가가 존재할 때 발생한다.
용어 "참조"는 비교가 수행되는 표준 또는 대조군을 설명한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 관심 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 제제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값인 참조 또는 대조군과 비교된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조군은 관심 시험, 측정 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험되고/되거나, 측정되고/되거나 결정된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조군은 선택적으로 유형(tangible) 매질에서 구현된 역사적 참조 또는 대조군이다. 일반적으로, 참조 또는 대조군은 평가되는 것에 필적한 조건 또는 상황 하에 결정되거나 특징화된다. 선택된 참조 또는 대조군에 대한 의존도 및/또는 이와의 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재한다.
"조절 T 세포"("Treg", "Treg 세포" 또는 "Tregs")는 특정한 면역 활성, 예를 들어, 자가면역, 알레르기, 및 감염에의 반응을 제어하는 데 참여하는 CD4+ T 림프구의 계열을 지칭한다. 조절 T 세포는 T 세포 집단의 활성을 조절할 수 있고, 또한 특정한 선천적 면역계 유형 세포에 영향을 미칠 수 있다. Treg는 바이오마커 CD4, CD25 및 Foxp3의 발현, 및 CD127의 낮은 발현에 의해 식별될 수 있다. 천연 발생 Treg 세포는 통상 말초 CD4+ T 림프구의 약 5% 내지 10%를 이룬다. 그러나, 종양 미세환경 내의 Treg 세포(즉, 종양-침윤적 Treg 세포), Treg 세포는 총 CD4+ T 림프구 집단의 20% 내지 30%만큼을 이룰 수 있다.
용어 "샘플"은 일반적으로 관심 공급원으로부터 수득되거나 유래된 물질의 분취물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 관심 공급원은 생물학적 또는 환경적 공급원이다. 일부 실시형태에서, 관심 공급원은 세포 또는 유기체, 예컨대 세포 집단, 조직 또는 동물(예를 들어 인간)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 공급원은 생물학적 조직 또는 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 유체는 양수, 방수(aqueous humor), 복수, 담즙, 골수, 혈액, 모유, 뇌척수액, 귀지, 유미액(chyle), 차임(chime), 사정액, 내림프, 삼출물, 대변, 위산, 위액, 림프액, 점액, 심낭액, 외림프액, 복막액, 흉막액, 고름, 점막 분비물(rheum), 타액, 피지, 정액, 혈청, 피지(smegma), 가래, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질 분비물, 유리체액, 토사물, 및/또는 이들의 조합 또는 구성요소(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 세포내 유체, 세포외 유체, 혈관내 유체(혈장), 간질액, 림프액 및/또는 체강액(transcellular fluid)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 식물 삼출물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 샘플은 예를 들어, 흡인, 생검(예를 들어 미세바늘 또는 조직 생검), 면봉(swab)(예를 들어 경구, 비내, 피부 또는 질 면봉), 긁어내기(scraping), 수술, 세척 또는 세정(lavage)(예를 들어 기관지, 관(ductal), 비내, 안구, 경구, 자궁, 질 또는 다른 세척 또는 세정)에 의해 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 수득된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 공급원으로부터 직접 수득되는 "1차 샘플"이다. 일부 실시형태에서, 문맥으로부터 분명하게 될 바와 같이, 용어 "샘플"은 1차 샘플을 가공함으로써(예를 들어 1차 샘플의 하나 이상의 구성요소를 제거함으로써 그리고/또는 하나 이상의 제제를 1차 샘플에 첨가함으로써) 수득되는 조제물을 지칭한다. 이러한 "가공된 샘플"은 예를 들어, 샘플로부터 추출되거나 1차 샘플을 하나 이상의 기법, 예컨대 핵산의 증폭 또는 역전사, 특정한 구성요소의 단리 및/또는 정제 등을 받게 함으로써 수득되는 핵산 또는 단백질을 포함할 수 있다.
"단일 사슬 가변 단편", "단일 사슬 항체 가변 단편" 또는 "scFv" 항체는 링커 펩타이드에 의해 결합된 중쇄와 경쇄 단독의 가변 영역을 포함하는 항체의 형태를 지칭한다.
용어 "암의 병기(stage)"는 암의 진행 수준의 정성적 또는 정량적 평가를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 암의 병기를 결정하는 데 사용되는 기준은 비제한적으로 암이 신체에 위치하는 장소, 종양 크기, 암이 림프절로 확산되었는지의 여부, 암이 신체의 하나 이상의 상이한 부분으로 확산되었는지의 여부 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 소위 TNM 시스템을 사용하여 병기분류될 수 있으며, 이 시스템에 따라 T는 통상 원발성 종양이라고 하는 주요 종양의 크기 및 규모(extent)를 지칭하며; N은 암을 갖는 부근의 림프절의 수를 지칭하고, M은 암이 전이되었는지의 여부를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 암은 0기(비정상 세포가 부근의 조직으로 확산되지 않으면서 존재하며, 상피내암종(carcinoma in situ) 또는 CIS라고도 하고; CIS는 암이 아니지만 암이 될 수 있을 것임), I기 내지 III기(암이 존재하며, 숫자가 높을수록 종양이 더 크고 부근의 조직 내로 더 많이 확산되었음) 또는 IV기(암이 신체의 먼 부분까지 확산되었음)로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 병기로 지정될 수 있다: 상피내암; 국한(localized)암(암이 이것이 시작된 장소에 제한되고 확산되었다는 어떠한 징후도 없음); 국소진행(regional)암(암이 부근의 림프절, 조직 또는 기관으로 확산되었음): 원격전이(distant)암(암이 신체의 먼 부분까지 확산되었음); 및 불명(unknown)암(병기를 결정할 정도의 충분한 정보가 없음).
"자극"은 자극 분자와 이의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되는 1차 반응을 지칭하며, 상기 결합은 신호 전달 사건을 매개한다. "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체이다. "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어 APC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때 T 세포 상의 자극 분자와 특이적으로 결합하여, 이로써 활성화, 면역 반응의 개시, 증식 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 T 세포에 의한 1차 반응을 매개하는 리간드이다. 자극 리간드는 항-CD3 항체(예컨대 OKT3), 펩타이드가 로딩된 MHC 부류 I 분자, 과효능제(superagonist) 항-CD2 항체 및 과효능제 항-CD28 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
어구 "치료제"는 유기체에게 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 이끌어내는 임의의 제제를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제는 이것이 적절한 집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 실증한다면 치료제인 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 적절한 집단은 모델 유기체 또는 인간 대상체의 집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 집단은 바이오마커의 존재 또는 부재에 따라 다양한 기준, 예컨대 특정한 연령군, 성별, 유전적 배경, 기존의 임상 병태 등에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특질을 경감시키고/시키거나, 개선하고/하거나, 완화시키고/시키거나, 저해하고/하거나, 예방하고/하거나, 이의 발병을 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 저하시키고/시키거나 발생빈도를 저하시키는 데 사용될 수 있는 성분이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 이것이 인간에게 투여되기 위해 판매될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인을 받았거나 승인을 받는 것을 필요로 하는 제제이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 인간에게 투여되기 위해 의학적 처방이 필요한 제제이다.
치료제, 예를 들어, 조작된 CAR T 세포 또는 NK 세포의 "치료적 유효량", "유효 용량", "유효량", 또는 "치료적 유효 투여량"은, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용될 경우, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발병에 대해 대상체를 보호하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은 당업자에게 알려진 여러 가지 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 제제의 활성을 검정함으로써 평가할 수 있다.
용어 "형질도입" 및 "형질도입된"은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 세포에 도입되는 과정을 지칭한다(문헌[Jones et al., "Genetics: principles and analysis", Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)] 참조). 일부 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 이들의 임의의 조합이다.
"형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포에 도입되는 임의의 과정을 지칭한다. 형질전환은 다양한 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건 하에 일어날 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입하는 임의의 알려진 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 일부 형질전환 방법은 형질전환되는 숙주 세포 및/또는 삽입될 핵산에 기초하여 선택된다. 형질전환 방법은 바이러스 감염, 전기천공 및 지질주입을 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제될 수 있다는 점에서 안정적으로 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 형질전환된 세포는 도입된 핵산을 발현할 수 있다.
대상체의 "치료" 또는 "치료하는"은 질환과 관련된 증상, 합병증 또는 병태, 또는 생화학적 지표의 발병, 진행, 발증, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 경감시키거나, 개선하거나, 저해하거나, 지연시키거나 예방하는 것을 목적으로 대상체에서 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 활성제의 투여를 지칭한다. 일 실시형태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 부분 관해를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, "치료" 또는 "치료하는"은 완전 관해를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만 나타내는 대상체의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 발증의 증가된 위험과 통계적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체의 것일 수 있다.
용어 "벡터"는 제공된 핵산 서열을 포함하거나 혼입하도록 변형된 수용자 핵산 분자를 지칭한다. 하나의 유형의 벡터는 부가적인 DNA가 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 분자를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 부가적인 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정한 벡터는 이것이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제될 수 있다(예를 들어 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어 비(non)에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 특정한 벡터는 이에 작동적으로 연결된 삽입된 유전자의 발현을 지시하는 서열을 포함한다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭될 수 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]에서 확인된 바와 같은 표준 기법은 벡터를 조작하는 데 사용될 수 있으며, 이는 본원에 인용되어 포함된다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "공여자 서열"은 게놈에 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이(또는 그 사이 또는 그 초과의 임의의 정수 값), 바람직하게는 약 100개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드 길이(또는 그 사이의 임의의 정수), 보다 바람직하게는 약 200개 내지 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해 "유전자"는 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접해 있든 그렇지 않든 간에, 유전자 생성물을 인코딩하는 DNA 영역(아래 참조), 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 이에, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인설레이터, 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하지만 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
"막관통 도메인"은 포유류 세포에서 발현될 때 상응하는 내인성 폴리펩타이드에 존재하는 경우 지질 이중층을 가로지르는 적어도 하나의 인접 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 도메인이다. 예를 들어, 막관통 도메인은 포유류 세포에서 발현될 때 상응하는 내인성 폴리펩타이드에 존재하는 경우 각각 지질 이중층을 가로지르는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 인접 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 지질 이중층에 α-나선 2차 구조를 갖는 (포유류 세포에서 발현될 때 상응하는 내인성 폴리펩타이드에 존재하는 경우 지질 이중층을 가로지르는) 예를 들어, 적어도 1개(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 인접 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 지질 이중층에 β-병풍 2차 구조를 형성하는 (포유류 세포에서 발현될 때 상응하는 내인성 폴리펩타이드에 존재하는 경우 지질 이중층을 각각 가로지르는) 2개 이상의 인접 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있다. 막관통 도메인의 추가 예는 당업계에 알려져 있다.
폴리펩타이드의 위치를 설명하기 위해 사용될 때 어구 "원형질막의 세포외 측면"은 폴리펩타이드가 원형질막을 가로지르는 적어도 하나의 막관통 도메인 및 세포외 공간에 위치된 적어도 하나의 도메인(예를 들어 적어도 하나의 항원 결합 도메인)을 포함함을 의미한다.
본 개시내용은 명시적으로 달리 제시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 화학, 생화학, 유기화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포생물학 방법을 이용할 수 있으며, 이들 중 다수는 예시의 목적으로 아래에 기재되어 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001)]; 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience]; 문헌[Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985)]; 문헌[Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)]; 문헌[Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)]; 문헌[Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)]; 문헌[Annual Review of Immunology]; 뿐만 아니라 문헌[Advances in Immunology]와 같은 저널의 논문을 참조한다.
본 개시내용은 본원에서 NKG2D CAR로 지칭되는, 하나 이상의 NKG2D 리간드에 결합할 수 있는 NKG2D의 세포외 도메인의 일부를 포함하는 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 암 치료 및/또는 면역 반응의 개시 또는 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 하나 이상의 종양 항원에 특이적인 TCR 및/또는 하나 이상의 종양 항원에 특이적인 하나 이상의 부가적인 CAR과 함께 발현된다.
본 개시내용의 다양한 실시형태는 본원에 제공된 NKG2D CAR을 인코딩하는 벡터, 예를 들어 NKG2D CAR을 인코딩하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용의 다양한 실시형태는 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR(예를 들어 NKG2D CAR 이외의 상이한 표적에 결합하는 CAR)을 인코딩하는 벡터, 예를 들어 NKG2D CAR 및 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR을 인코딩하는벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR을 인코딩하는 벡터와 별개의 벡터에서 인코딩된다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR을 인코딩하는 동일한 벡터에서 인코딩된다.
본 개시내용의 다양한 실시형태는 NKG2D CAR을 인코딩하거나 발현하는 세포, 예를 들어, NKG2D CAR을 인코딩하거나 발현하도록 조작된 유도 만능 세포(iPSC), T 세포 또는 NK 세포를 제공한다. 본 개시내용의 다양한 실시형태는 NKG2D CAR 및 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR을 인코딩하거나 발현하는 세포, 예를 들어, NKG2D CAR 및 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR을 인코딩하거나 발현하도록 조작된 T 세포 또는 NK 세포를 제공한다. 본 개시내용은 통합된 유전자로 유전적으로 변형된 면역 세포, 예를 들어 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 구성적(constitutive) 발현 작제물 및/또는 이러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유도적 발현 작제물)을 제공한다. 실시형태에서, 면역 세포는 TCR 또는 하나 이상의 부가적인 CAR을 발현하도록 추가로 조작된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 본원에 기재된 NKG2D CAR 치료법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 부가적인 치료법(예를 들어 제2 결합제(예를 들어 본원에 기재된 CAR T 세포, CAR-NK 세포, TCR-T 세포, TIL 세포, 동종이계 NK 세포 및 자가 NK 세포), 항체-약물 접합체, 항체, 이중특이적 항체, T 세포-연계 이중특이적 항체, 조작된 항체, 및/또는 폴리펩타이드)의 투여를 추가로 포함한다.
자연 살해 세포는 NK 세포 기능의 조절에 관여해 온 여러 칼슘-의존적(C-유형) 렉틴을 우선적으로 발현한다. NKG2D(NCBI Gene ID: 2021년 3월 7일에 업데이트된 바와 같은 22914로서, 본원에 인용되어 포함됨)는 C-유형 렉틴-유사 수용체의 NKG2 계열에 속하는 막관통 단백질이다. NKG2 유전자 계열은 NK 세포에서 우선적으로 발현되는 여러 C-유형 렉틴 유전자를 함유하는 영역인 NK 복합체 내에 위치한다. NKG2D는 형질전환되고 감염된 세포의 검출 및 제거를 위한 인식 수용체인데, 이의 리간드가 예컨대 암에서 감염 또는 게놈 스트레스의 결과 세포 스트레스 동안 유도되기 때문이다. NKG2D는 MHC 부류 I 사슬-관련 A 및 B 단백질 및 UL-16 결합 단백질을 포함하는 다양한 계열의 리간드에 결합한다. 이들 리간드의 표면 발현은 면역계에 의한 스트레스받은(stressed) 세포의 인식에 중요하고, 그러므로 이러한 단백질 및 이의 리간드는 면역 질환 및 암의 치료를 위한 치료 표적이다.
NKG2D 리간드는 정상 세포의 표면 상에서 부재하거나 낮은 수준으로만 존재하지만 감염된, 형질전환된, 노화 및 스트레스받은 세포에 의해 과발현되는 유도-자가(induced-self) 단백질이다. 이의 발현은 상이한 단계(전사, mRNA 및 단백질 안정화, 세포 표면으로부터의 절단)에서 다양한 스트레스 경로에 의해 조절된다. NKG2D 리간드는 MHC 부류 I 분자에 상동성이고, 2개의 계열: MIC 및 RAET1/ULBP로 나뉜다. 인간 MIC 유전자는 MHC 유전자좌 내에 위치하고, 7개 구성원(MICA-G)으로 이루어지며, 이 중 단독 MICA 및 MICB는 기능적 전사체를 생산한다. 10개의 기지의 인간 RAET1/ULBP 유전자 중에서, 6개는 기능적 단백질: RAET1E/ULBP4, RAET1G/ULBP5, RAET1H/ULBP2, RAET1/ULBP1, RAET1L/ULBP6, RAET1N/ULBP3을 인코딩한다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 T 세포 또는 NK 세포(예를 들어 환자 또는 공여자 T 또는 NK 세포)를 선택된 표적으로 지향시키거나 재지향시킬 수 있는 조작된 수용체이다. CAR은 표적(예컨대 항원 및 개시된 NKG2D CAR의 경우 NKG2D 리간드)을 인식하고, 해당 표적에 결합되었을 때 면역 세포를 활성화시켜 해당 표적을 보유하는 세포를 공격하고 파괴하도록 조작될 수 있다. 이러한 표적이 종양 세포 상에 존재하는 경우, CAR을 발현하는 면역 세포는 종양 세포를 표적화하여 이를 사멸화시킬 수 있다. CAR은 일반적으로, 항원 결합을 매개하는 세포외 결합 도메인(예를 들어 NKG2D 엑토 도메인), CAR이 세포 표면 또는 세포막에 존재할 때 세포막을 경유하거나(span) 경유하는 것으로 이해되는 막관통 도메인, 및 세포내(또는 세포질) 신호전달 도메인을 포함한다.
적어도 하나의 비제한적 관점에 따르면, 적어도 3개 "세대"의 CAR 조성물이 존재해 왔다. 제1 세대 CAR에서, 결합 도메인(예를 들어 단일 사슬 단편 가변, 결합 도메인)은 선택적으로 힌지 도메인 및 하나 이상의 스페이서를 포함하는 막관통 도메인을 통해 신호전달 도메인(예를 들어 CD3ζ)에 연결되거나 결합된다. 제2 세대 CAR에서, 공동자극 도메인(CM1, 예컨대 CD28, 4-1BB, 또는 OX-40)은 신호전달 도메인(예를 들어 CD3ζ)과 함께 도입된다. 제3 세대 CAR에서, 제2 공동자극 도메인(CM2)이 포함된다.
TCR은 α-사슬과 β-사슬로 이루어진 이종이량체이다. TCR 신호전달은 면역 시냅스를 생성하는 신호전달 단백질의 모집을 필요로 한다. 이에 더하여, 원형질막에서 TCR 위치화는 T 세포에서 발현되는 CD3 복합체에 의존한다. 조작된 단일 사슬 TCR은 예를 들어, CAR 작제물의 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 사용하여 생성될 수 있으며, 이를 위한 방법 및 작제물은 알려져 있다(예를 들어 sTCR 및 TCR-CAR 분자, 예를 들어 TCRβ 사슬과 CD28 TM 및 CD28과 CD3ζ 신호전달 모듈의 융합).
본 개시내용의 NKG2D CAR은 NKG2D 리간드에 결합하는 세포외 NKG2D 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 시스템은 공동자극 도메인, 및/또는 세포외 도메인(예를 들어 "힌지" 또는 "스페이서" 영역), 및/또는 막관통 도메인, 및/또는 세포내(신호전달) 도메인, 및/또는 CD3-제타 및/또는 CD3-엡실론 활성화 도메인을 추가로 포함한다.
특정한 실시형태에서, NKG2D CAR은 NKG2D 엑토 도메인(세포외 도메인) 폴리펩타이드를 포함하며, 서열 번호 3과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV(서열 번호 3). 실시형태에서, NKG2D 엑토 도메인은 TTATTCAACCAAGAAGTCCAGATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGCGGCCCATGTCCGAAAAACTGGATATGTTATAAAAATAACTGTTACCAGTTCTTCGATGAATCTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCATCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTGCTCAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCACTGGATGGGATTGGTACACATTCCCACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGCGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGTTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTA(서열 번호 4)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, NKG2D 엑토 도메인은 TTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAAAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG(서열 번호 5)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, NKG2D 엑토 도메인은 TTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAGAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAATCTAAGAATTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTTAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATATATTTGCATGCAAAG GACTGTG(서열 번호 55)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 NKG2D CAR은 리더 펩타이드(P), NKG2D 엑토 도메인(B), 힌지(E), 막관통 도메인(T), 공동자극 도메인(C), 제2 공동자극 도메인(C'), 및 활성화 도메인(A) 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 항원 결합 시스템을 포함할 수 있다. 일부 상황에서, NKG2D CAR은 하기: B E T A에 따라 배치된다. 특정한 상황에서, 활성화 도메인은 하나 이상의 활성화 도메인을 포함한다. 특정한 양태에서, 활성화 도메인은 CD3ζ, CD3ε, 또는 CD3ζ과 CD3ε을 둘 다 포함한다. 일부 상황에서, NKG2D CAR은 하기: P B E T A에 따라 배치된다. 일부 상황에서, NKG2D CAR은 하기: B E T C A에 따라 배치된다. 일부 상황에서, NKG2D CAR은 하기: P B E T C A에 따라 배치된다. 일부 상황에서, NKG2D CAR은 하기: B E T C C' A에 따라 배치된다. 일부 상황에서, NKG2D CAR은 하기: P B E T C C' A에 따라 배치된다.
특정한 실시형태에서, 본원에서 고려되는 CAR은 분자의 적절한 간격 입체배열을 위해 첨가되는, 다양한 도메인 사이, 도메인 사이에 링커 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 CAR은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개, 또는 그 초과의 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커의 길이는 약 1개 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 20개 아미노산, 또는 임의의 개입 길이의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예는 글리신 중합체 (G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n, 여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임; 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되어 있지 않으며, 따라서 본원에 기재된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인 사이에서 중성 테더(tether)로서 역할을 할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 더 넓은 파이(phi)-프사이(psi) 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제약된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 본원에서 고려되는 다른 링커는 Whitlow 링커를 포함한다(예를 들어 문헌[Whitlow, Protein Eng. 6(8): 989-95 (1993)] 참조). 당업자는, 링커가 원하는 CAR 구조를 제공하기 위해 가요성 링커뿐만 아니라 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 일부 실시형태에서 CAR의 설계는 전체적으로 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 작제물은 "GS" 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 작제물은 "GSG" 링커를 포함한다. 일례에서, 글리신-세린 링커는 아미노산 서열 GS(서열 번호 6)를 포함하거나 이로 구성되는데, 이는 ggatcc(서열 번호 7) 또는 gggtcc(서열 번호 8)에 따른 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 일례에서, 글리신-세린 링커는 아미노산 서열 GGGSGGGS(서열 번호 9)를 포함하거나 이로 구성되는데, 이는 ggcggtggaagcggaggaggttcc(서열 번호 10)에 따른 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 서열 번호 11 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호 11)와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 링커는 gggagcactagcggctctggcaaacctggatctggcgagggatctaccaagggc(서열 번호 12) gggagcacaagcggctctggcaaacctggatctggcgagggatctaccaagggc(서열 번호 13), 또는 gggagcacaagcggctctggcaaacctggatccggcgagggatctaccaagggc(서열 번호 14)에 따른 핵산 서열과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
CAR의 결합 도메인 다음에는 일반적으로 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 배치시키는 역할을 하는 하나 이상의 "힌지 도메인"이 뒤따를 수 있다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR은 면역글로불린-유사 힌지 도메인이거나, 이로부터의 것이거나, 이로부터 유래되는 힌지를 포함할 수 있다(예를 들어 이의 전부 또는 단편을 포함함). 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 면역글로불린으로부터의 것이거나 이로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE 또는 IgM의 힌지, 또는 이의 단편으로부터 선택된다. 힌지는 천연 공급원 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본원에 기재된 CAR에 사용하기에 적합한 힌지 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD7과 같은 유형 1 막단백질의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역을 포함하며, 이는 이러한 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 변경될 수 있다. 힌지는 천연 공급원 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항원 결합 시스템은 CD2, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD4, CD7, CD8α, CD8β, CD11a(ITGAL), CD11b(ITGAM), CD11c(ITGAX), CD11d(ITGAD), CD18(ITGB2), CD19(B4), CD27(TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29(ITGB1), CD30(TNFRSF8), CD40(TNFRSF5), CD48(SLAMF2), CD49a(ITGA1), CD49d(ITGA4), CD49f(ITGA6), CD66a(CEACAM1), CD66b(CEACAM8), CD66c(CEACAM6), CD66d(CEACAM3), CD66e(CEACAM5), CD69(CLEC2), CD79A(B세포 항원 수용체 복합체 관련 알파 사슬), CD79B(B세포 항원 수용체 복합체 관련 베타 사슬), CD84(SLAMF5), CD96(Tactile), CD100(SEMA4D), CD103(ITGAE), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD158A(KIR2DL1), CD158B1(KIR2DL2), CD158B2(KIR2DL3), CD158C(KIR3DP1), CD158D(KIRDL4), CD158F1(KIR2DL5A), CD158F2(KIR2DL5B), CD158K(KIR3DL2), CD160(BY55), CD162(SELPLG), CD226(DNAM1), CD229(SLAMF3), CD244(SLAMF4), CD247(CD3-제타), CD258(LIGHT), CD268(BAFFR), CD270(TNFSF14), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD279(PD-1), CD314(NKG2D), CD319(SLAMF7), CD335(NK-p46), CD336(NK-p44), CD337(NK-p30), CD352(SLAMF6), CD353(SLAMF8), CD355(CRTAM), CD357(TNFRSF18), 유도성 T 세포 공동자극인자(ICOS), LFA-1(CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80(KLRF1), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, LFA1-1, SLAMF9, LAT, GADS(GrpL), SLP-76(LCP2), PAG1/CBP, CD83 리간드, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1 분자, MHC 부류 2 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 활성화 NK 세포 수용체 또는 Toll 리간드 수용체이거나, 이로부터의 것이거나 이로부터 유래되거나(예를 들어 이의 전부 또는 단편을 포함함), 이의 단편 또는 조합인 힌지를 포함할 수 있다.
이들 힌지 도메인의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 알려진 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인의 폴리펩타이드 서열은 알려진 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다. 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 서열 번호 15(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열 번호 15))와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD8α로부터의 힌지 도메인을 포함한다. 실시형태에서, CD8α로부터의 힌지 도메인은 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(서열 번호 16)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD8α로부터의 힌지 도메인은 ACAACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCTTGTGAC(서열 번호 17)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD8α로부터의 힌지 도메인은 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCCGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(서열 번호 18)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD8α로부터의 힌지 도메인은 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGCGGCGCAGTGCACACGAGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT(서열 번호 56)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, 힌지 도메인은 예컨대 2017년 3월 31일에 출원된 국제출원 제PCT/US2017/025351호에 개시된 절두된 CD28 힌지 영역(CD28T) 힌지 영역을 포함하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 서열 번호 19(LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(서열 번호 19))와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD28T 힌지 도메인을 포함한다. 실시형태에서, CD28T 힌지 도메인은 CTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC(서열 번호 20)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
일반적으로, (예를 들어 항원 결합 시스템의) "막관통 도메인"은 세포 표면 또는 세포막(예를 들어 세포막 중 일부 또는 전부를 경유함)의 분자에 존재할 때 막에 존재하는 속성을 갖는 도메인을 지칭한다. 본 개시내용의 항원 결합 시스템에 대한 공동자극 도메인은 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 막관통 도메인 내 모든 아미노산이 막에 존재할 필요는 없다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 단백질의 지정된 스트레치 또는 일부가 막에 실질적으로 위치하는 것을 특징으로 한다. 아미노산 또는 핵산 서열은 단백질 하위세포 위치화(예를 들어 막관통 위치화)를 예측하기 위해 여러 가지 알고리즘을 사용하여 분석될 수 있다. 프로그램 psort(PSORT.org) 및 Prosite(prosite.expasy.org)는 이러한 프로그램을 예시한다.
본원에 기재된 항원 결합 시스템에 포함된 막관통 도메인의 유형은 임의의 유형으로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 결합 도메인 및/또는 세포내 도메인과 천연적으로 회합되는 막관통 도메인이 선택된다. 일부 경우, 막관통 도메인은 예를 들어, 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 피하여 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 하나 이상의 아미노산의 변형(예를 들어 결실, 삽입, 및/또는 치환)을 포함한다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 예시적인 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 사슬, 2B4, CD28, CD3 엡실론, CD3 델타, CD3 감마, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD8 알파, CD8베타, CD9, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD22, CD27, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, TNFSFR25, CD154, 4-1BB/CD137, 활성화 NK 세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD276(B7-H3), CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD84, CD96(Tactile), CDS, CEACAM1, CRT AM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DAP-12, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T 세포 공자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD1-1a/CD18), MHC 부류 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이의 단편, 절두물 또는 조합으로부터 유래될 수 있다(예를 들어 적어도 이의 막관통 도메인을 포함할 수 있음). 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있다(예를 들어 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있음). 일부 실시형태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체(triplet)가 합성 막관통 도메인의 각각의 단부에 포함된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 세포질 도메인에 직접 연결되거나 결합된다. 일부 실시형태에서, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커(예를 들어 2개 내지 10개 아미노산 길이)가 막관통 도메인과 세포내 도메인 사이에서 연결부를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리신-세린 이중체(doublet)이다.
본원에 제공된 막관통 도메인의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 알려진 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인의 폴리펩타이드 서열은 알려진 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%(예를 들어 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%) 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 선택적으로, 짧은 스페이서는 CAR의 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인 중 임의의 것 또는 일부 사이에 연결부를 형성할 수 있다.
실시형태에서, 본원에 기재된 NKG2D CAR은 서열 번호 21(FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열 번호 21))과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD28로부터의 TM 도메인을 포함한다. 실시형태에서, CD28로부터의 TM 도메인은 TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG(서열 번호 22)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD28로부터의 TM 도메인은 TTTTGGGTATTGGTAGTAGTGGGCGGAGTCCTGGCTTGCTATAGTCTGCTAGTAACAGTGGCTTTTATTATATTTTGGGTG(서열 번호 23)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD28로부터의 TM 도메인은 TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG(서열 번호 24)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 서열 번호 25(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열 번호 25))과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD8α로부터의 TM 도메인을 포함한다. 실시형태에서, CD8α로부터의 TM 도메인은 ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTATTGC(서열 번호 26)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD8α로부터의 TM 도메인은 ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(서열 번호 57)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
항원이 면역 세포에 결합 시 신호를 전달할 수 있는 세포내 신호전달 도메인이 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것은 본 개시내용의 항원 결합 시스템에 포함될 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열은 TCR이 항원에 결합한 후 신호 전달을 개시하는 것으로 알려져 있다(예를 들어 문헌[Brownlie et al., Nature Rev. Immunol. 13:257-269 (2013)] 참조).
일부 실시형태에서, 본원에서 고려되는 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 세포 기능, 예를 들어 활성화, 사이토카인 생산, 증식, 및 CAR-결합 표적 세포로의 세포독성 인자의 방출을 포함한 세포독성 활성, 또는 세포외 CAR 도메인에의 항원 결합으로 유도된 다른 세포 반응을 유도하기 위해 표적 항원에의 효과적인 CAR 결합의 메시지를 면역 이펙터 세포의 내부로 전달하는 데 참여하는 CAR의 부분을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 신호전달 도메인 및/또는 활성화 도메인은 면역수용체 티로신-기초 활성화 도메인(ITAM)을 포함한다. 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다(예를 들어 문헌[Love et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010)]; 문헌[Smith-Garvin et al., Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)] 참조). 특정한 실시형태에서, 적합한 신호전달 도메인은 비제한적으로, 4-1BB/CD137, 활성화 NK 세포 수용체, 면역글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160(BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276(B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8알파, CD8베타, CD96(Tactile), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, 사이토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM(LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T 세포 공동자극인자(ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 결합하는 리간드, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), Ly108, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD1-1a/CD18), MHC 부류 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 예정사-1(PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, Toll 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1 또는 VLA-6, 또는 이들의 단편, 절두체 또는 조합을 포함한다.
용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수한 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어 세포용해 활성, 또는 사이토카인의 분비를 포함한 활성 또는 도움일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 다수의 경우, 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절두된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 전체 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하는 데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하는 것으로 의미된다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 충분하지 않으며, 2차 또는 공동자극 신호가 또한 필요할 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, T 세포 활성화는 2개의 별개 부류의 세포내 신호전달 도메인에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR(예를 들어 TCR/CD3 복합체)을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원 독립적 방식으로 작용하는 공동자극 신호전달 도메인. 일부 실시형태에서, 본원에서 고려되는 CAR은 하나 이상의 "공동자극 신호전달 도메인" 및 "1차 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본 개시내용에서 유용한 1차 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 설명에 도움이 되는 예에는, TCRζ, FcRγ, FcRβ, DAP12, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유도된 것들이 포함된다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 1차 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 도메인과 공동자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카르복실 말단에 직렬로 임의의 순서로 결합될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR은 서열 번호 27과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3ζ 도메인을 갖는다. LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 27). 실시형태에서, CD3ζ 도메인은 CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGAAGGAGAGAAGAGTACGATGTTCTAGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCACGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTACAAAAAGATAAAATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGCCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGC(서열 번호 28)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD3ζ 도메인은 CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGACGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(서열 번호 29)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, CD3ζ 도메인은 CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(서열 번호 30)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD3ζ 도메인은 CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAAGGGCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGCTGA(서열 번호 58)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD3ζ 도메인은 CTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGA(서열 번호 59)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD3ζ 도메인은 CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAAGGGCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGCTGA(서열 번호 60)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인, CD3ε 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 1차 신호전달 도메인과 공동자극 신호전달 도메인은 막관통 도메인의 카르복실 말단에 직렬로 임의의 순서로 결합될 수 있다. 실시형태에서, CAR은 서열 번호 31과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3ε 도메인을 갖는다. KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGL(서열 번호 31). 실시형태에서, CAR은 서열 번호 __과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3ε 도메인을 갖는다. KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(서열 번호 61).
실시형태에서, CD3ε 도메인은 AAGAACCGAAAAGCAAAAGCCAAGCCTGTTACAAGAGGAGCAGGGGCAGGAGGCCGACAGAGAGGGCAAAACAAAGAAAGGCCCCCGCCCGTCCCAAACCCGGATTATGAGCCAATTAGGAAGGGTCAGAGAGACCTGTATTCTGGGCTC(서열 번호 32)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD3ε 도메인은 AAGAACCGCAAAGCAAAGGCAAAACCCGTCACACGAGGAGCGGGCGCAGGGGGACGACAACGCGGTCAGAATAAGGAACGCCCGCCTCCAGTACCAAATCCAGATTATGAACCAATTCGGAAGGGACAACGCGATCTCTACTCCGGTCTCAATCAGAGGCGAATT(서열 번호 62)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
본원에서 고려되는 CAR은 CAR 수용체를 발현하는 T 세포의 효능 및 확장을 증강시키기 위해 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "공동자극 신호전달 도메인" 또는 "공동자극 도메인"은 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 공동자극 분자는 DAP-10, DAP-12, CD27, CD28, CD137(4-IBB), OX40(CD134), CD30, CD40, PD-I, ICOS(CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, TRIM, LCK3, SLAM, DAPIO, LAG3, HVEM, B7-H3, NKD2C, GITR, CD5, ICAM-l, CDl la, Lck, TNFR-I, TNFR-II, FasR, NKG2C, 및 B7-H3, 및 CD83을 포함할 수 있다.
실시형태에서, CAR은 서열 번호 33과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE(서열 번호 33). 실시형태에서, CAR은 서열 번호 __과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열 번호 63). 실시형태에서, 4-IBB 공동자극 도메인은 AAACGAGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACAACTCAGGAGGAGGATGGCTGTAGCTGCCGATTCCCGGAAGAAGAAGAAGGTGGCTGTGAA(서열 번호 34)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, 4-IBB 공동자극 도메인은 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA(서열 번호 35)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, 4-IBB 공동자극 도메인은 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA(서열 번호 36)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, 4-IBB 공동자극 도메인은 AAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTG(서열 번호 64)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, CAR은 서열 번호 37과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(서열 번호 37). 실시형태에서, CD28 공동자극 도메인은 AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(서열 번호 38)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
본원에 기재된 조작된 NKG2D CAR은 또한 NKG2D 엑토 도메인의 N-말단에 N-말단 신호 펩타이드 또는 태그를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종성 신호 펩타이드가 사용될 수 있다. 항원 결합 도메인은 초기(nascent) 단백질을 소포체로 지향시키고 후속적으로 세포 표면으로 전좌시키는 리더 또는 신호 펩타이드에 융합될 수 있다. 일단 신호 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드가 세포 표면에서 발현되면, 신호 펩타이드는 일반적으로 소포체에서의 폴리펩타이드의 가공 및 세포 표면으로의 전좌 동안 단백질분해에 의해 제거되는 것으로 이해된다. 그러므로, 본원에 기재된 CAR 작제물과 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 신호 펩타이드가 결여된 성숙 단백질로서 세포 표면에서 발현되며, 반면 폴리펩타이드의 전구 형태는 신호 펩타이드를 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 신호 서열이 사용될 수 있다. 유사하게는, 당업계에 알려진 임의의 기지의 태그 서열도 사용될 수 있다.
실시형태에서, 신호 서열은 CD8α 신호 서열이다. 실시형태에서, 본원에 기재된 NKG2D CAR은 서열 번호 39; MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열 번호 39)와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD8α 신호 서열을 포함한다. 실시형태에서, CD8α 신호 서열은 ATGGCTCTTCCTGTGACTGCACTACTGCTGCCCCTGGCCTTACTTCTTCATGCTGCGCGTCCT(서열 번호 40)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 실시형태에서, CD8α 신호 서열은 ATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCT(서열 번호 65)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
일 실시형태에서, 신호 서열은 CSF2RA 신호 서열이다. 실시형태에서, 본원에 기재된 NKG2D CAR은 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(서열 번호 41), MEWTWVFLFLLSVTAGVHS(서열 번호 42), 또는 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열 번호 43)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CSF2RA 신호 서열을 포함한다. 실시형태에서, CSF2RA 신호 서열은 ATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCT(서열 번호 44)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
CAR의 구성요소는 동등한 구성요소에 대한 생명공학의 일상적인 기법을 사용하여 교환되거나 "교체"될 수 있다. 단지 소수의 비제한적이고 부분적인 예를 제공하기 위해, 본 개시내용의 CAR은 본원에 제공된 힌지 및 본원에 제공된 공동자극 도메인과 조합된 본원에 제공된 바와 같은 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 본 개시내용의 CAR은 본원에 제공된 힌지 및 본원에 제공된 공동자극 도메인과 조합된 본원에 제공된 바와 같은 결합 도메인과 함께 본원에 제공된 바와 같은 리더 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 실시형태에서, NKG2D CAR 작제물은 서열 번호 45와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 45). 실시형태에서, NKG2D CAR 결합 CAR은 ATGGCTCTTCCTGTGACTGCACTACTGCTGCCCCTGGCCTTACTTCTTCATGCTGCGCGTCCTTTATTCAACCAAGAAGTCCAGATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGCGGCCCATGTCCGAAAAACTGGATATGTTATAAAAATAACTGTTACCAGTTCTTCGATGAATCTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCATCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTGCTCAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCACTGGATGGGATTGGTACACATTCCCACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGCGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGTTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTAACAACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCTTGTGACTTTTGGGTATTGGTAGTAGTGGGCGGAGTCCTGGCTTGCTATAGTCTGCTAGTAACAGTGGCTTTTATTATATTTTGGGTGAAACGAGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACAACTCAGGAGGAGGATGGCTGTAGCTGCCGATTCCCGGAAGAAGAAGAAGGTGGCTGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGAAGGAGAGAAGAGTACGATGTTCTAGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCACGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTACAAAAAGATAAAATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGCCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGC(서열 번호 46)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, NKG2D CAR 작제물은 서열 번호 47과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 47). 실시형태에서, NKG2D CAR 결합 CAR은 TTATTCAACCAAGAAGTCCAGATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGCGGCCCATGTCCGAAAAACTGGATATGTTATAAAAATAACTGTTACCAGTTCTTCGATGAATCTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCATCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTGCTCAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCACTGGATGGGATTGGTACACATTCCCACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGCGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGTTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTAACAACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCTTGTGACTTTTGGGTATTGGTAGTAGTGGGCGGAGTCCTGGCTTGCTATAGTCTGCTAGTAACAGTGGCTTTTATTATATTTTGGGTGAAACGAGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACAACTCAGGAGGAGGATGGCTGTAGCTGCCGATTCCCGGAAGAAGAAGAAGGTGGCTGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGAAGGAGAGAAGAGTACGATGTTCTAGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCACGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTACAAAAAGATAAAATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGCCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGC(서열 번호 48)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, NKG2D CAR 작제물은 서열 번호 49와 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 49). 실시형태에서, NKG2D CAR 결합 CAR은 ATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTTTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAAAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAAAGAACCGAAAAGCAAAAGCCAAGCCTGTTACAAGAGGAGCAGGGGCAGGAGGCCGACAGAGAGGGCAAAACAAAGAAAGGCCCCCGCCCGTCCCAAACCCGGATTATGAGCCAATTAGGAAGGGTCAGAGAGACCTGTATTCTGGGCTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGACGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(서열 번호 50)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
실시형태에서, NKG2D CAR 작제물은 서열 번호 51과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 51). 실시형태에서, NKG2D CAR 결합 CAR은 TTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAAAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAAAGAACCGAAAAGCAAAAGCCAAGCCTGTTACAAGAGGAGCAGGGGCAGGAGGCCGACAGAGAGGGCAAAACAAAGAAAGGCCCCCGCCCGTCCCAAACCCGGATTATGAGCCAATTAGGAAGGGTCAGAGAGACCTGTATTCTGGGCTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGACGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(서열 번호 52)에 따른 서열을 갖는 핵산과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.
본 개시내용은 T 세포 면역치료법에 사용되는 조작된 T 세포 수용체(TCR)와 함께 본원에 기재된 NKG2D CAR의 사용을 고려한다. TCR의 라이브러리는 표적 항원에 대한 선택성에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원에 대해 높은 결합력과 반응성을 갖는 천연 TCR이 선택되고, 클로닝되고, 후속적으로 입양 면역치료법에 사용되는 T 세포 집단에 도입될 수 있다. 본원에 기재된 NKG2D CAR을 또한 발현하는 조작된 TCR을 갖는 T 세포 또는 NK 세포는 TCR 특이성으로 인해 특정 항원을 표적화할 수 있을 뿐만 아니라 NKG2D 리간드를 발현하는 세포를 표적화할 수 있을 것이다. 따라서, TCR과 본원에 기재된 NKG2D CAR을 조합하면, 입양 T 세포 또는 NK 세포 면역치료법의 치료 효과를 유지시키거나 증강시키는 방식을 제공할 수 있다. 실시형태에서, 본원에 기재된 NKG2D CAR은 TCR과 공동발현된다.
본원에 기재된 하나의 실시형태에서, T 세포 또는 NK 세포는 표적 항원 및/또는 NKG2D 리간드를 발현하는 종양 세포에 T 세포 또는 NK 세포에 대한 특이성을 부여하는 TCR을 형성할 수 있는 TCR의 하위단위를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입함으로써 변형된다. 일부 실시형태에서, 하위단위가 형질주입된 T 세포 및 NK 세포에 표적 세포로 귀환하는(home) 능력을 부여하는 TCR을 형성하는 능력을 보유하고 면역학적으로-관련된 사이토카인 신호전달에 참여하는 한, 하위단위는 천연 발생 하위단위와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 변경을 갖는다. 조작된 TCR은 관련 종양-연관 펩타이드를 제시하는 표적 세포에 높은 결합력으로 결합할 수 있고, 선택적으로 생체내에서 관련 펩타이드를 제시하는 표적 세포의 효율적인 사멸화를 매개할 수 있다.
조작된 TCR을 인코딩하는 핵산은 T 세포의 (천연 발생) 염색체에서 이의 천연적 맥락으로부터 단리될 수 있으며, 본원의 어디에서나 기재된 바와 같이 적합한 벡터에 혼입될 수 있다. 핵산과 이를 포함하는 벡터는 둘 다 T 세포일 수 있는 세포 내로 전달될 수 있다. 그 후에, 변형된 T 세포는 형질도입된 핵산 또는 핵산들에 의해 인코딩된 TCR의 하나 이상의 사슬(및 일부 양태에서 2개의 사슬)을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 TCR은 이것이 도입된 TCR을 통상적으로 발현하지 않는 T 세포 내로 도입되기 때문에, 외인성 TCR이다. 조작된 TCR의 본질적인 양태는 이것이 주 조직적합 복합체(MHC) 또는 유사한 면역학적 구성요소에 의해 제시된 종양 항원에 대해 높은 결합력을 갖는다는 점이다. 조작된 TCR과 대조적으로, CAR은 MHC 독립적 방식으로 표적 항원에 결합하도록 조작된다.
본원에 기재된 핵산에 의해 인코딩된 단백질은, 부착된 부가적인 폴리펩타이드가 기능성 T 세포 수용체 및 MHC 의존적 항원 인식을 형성하는 α-사슬 또는 β-사슬의 능력을 방해하지 않는 한, TCR의 α-사슬 또는 β-사슬의 아미노-말단 또는 카르복실-말단 부분에 부착된 부가적인 폴리펩타이드와 함께 발현될 수 있다.
본원에서 고려되는 조작된 TCR에 의해 인식된 항원은 혈액암, 고형 종양 및 바이러스에 의해 유도된 암 모두에 대한 항원을 포함하는 암 항원을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. HPV에 의해 유도된 자궁경부암종의 치료를 위한 TCR 치료법은 유망한 관심 분야이다. 그러므로, 종양용해(oncolytic) 단백질 HPV―16 E6 및 HPV―16 E7은 TCR과 함께 사용하기 위한 잠재적인 표적 항원일 수 있다(예를 들어 국제 특허 출원 제PCT/US2015/033129호 참조). 다른 예시적인 항원은 HPV-16 E6 및 HPV-16 E7을 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸(글리피칸)-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, MAGA-A3, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TAG72, TACI, TEM 및 VEGFRII를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 TCR 작제물을 본 개시내용의 NKG2D CAR을 조합하면, TCR 치료법의 치료 효과를 복구, 유지 또는 증강시킬 수 있다. 그러므로, 본원에 기재된 하나의 실시형태에서, NKG2D CAR은 HPV에 대해 지향된 TCR을 갖는 T 세포 또는 NK 세포에서 공동발현된다. 또 다른 실시형태에서, NKG2D CAR은 HPV―16 E6 단백질에 대해 지향된 TCR을 갖는 T 세포 또는 NK 세포에서 공동발현된다. 본원에 기재된 또 다른 실시형태에서, NKG2D CAR은 HPV-16 E7 단백질에 대해 지향된 TCR을 갖는 T 세포 또는 NK 세포에서 공동발현된다.
T 세포 또는 NK 세포는 또한 세포독성을 종양 세포로 재지향시키는 CAR(NKG2D CAR에 더하여)을 발현하도록 설계된 벡터로 유전적으로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR은 표적 항원(예를 들어 종양 항원)에 대한 항체 기초 특이성을 활성화 세포내 도메인과 조합하여, 특정 항종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성한다. 본 개시내용은 하나 이상의 부가적인 CAR과 함께 본원에 기재된 NKG2D CAR의 사용을 고려한다. TCR의 사용과 마찬가지로, NKG2D CAR과 하나 이상의 부가적인 CAR의 공동발현은 CAR 치료법을 촉진하며, 확장시키고, 증강시키며, 보호하고, 일부 경우 복구시킬 수 있다. 실시형태에서, NKG2D CAR은 하나 이상의 부가적인 CAR과 함께 공동발현된다.
본원에서 고려되는 하나 이상의 부가적인 CAR은 특정 표적 항원(결합 도메인 또는 항원 특이적 결합 도메인으로도 지칭됨)에 결합하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 하나 이상의 부가적인 CAR의 주요 특징은 면역 이펙터 세포 특이성을 재지향시켜, 이로써 증식, 사이토카인 생산, 포식작용, 또는 표적 항원 발현 세포의 세포 사멸을 주 조직적합 복합체(MHC) 독립적 방식으로 매개할 수 있는 분자의 생산을 촉발하고, 단일클론 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공동수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 활용하는 이의 능력이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 부가적인 CAR은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 테더링된(tethered) 리간드, 또는 공동수용체의 세포외 도메인을 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 비제한적인 예로서, 표적 항원은 HPV-16 E6 및 HPV-16 E7을 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TACI, TAG72, TEM 및 VEGFRII를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 실시형태에서, CAR은 BCMA, CLL-1, CD19, CD20, CD22, CD28, CD137(4―1BB), 글리피칸―3(GPC3), PSCA, PSMA 또는 TACI를 포함하는 종양 항원에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본원에서 고려되는 하나 이상의 부가적인 CAR은 표적 폴리펩타이드, 예를 들어 종양 세포에서 발현되는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인", "항원 특이적 결합 도메인", "항원 결합 도메인" 및 "세포외 항원 특이적 결합 도메인"은 상호교환적으로 사용되며, 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR을 제공한다. 결합 도메인은 생물학적 분자(예를 들어 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 지질, 다당류 또는 다른 세포 표면 표적 분자, 또는 이의 구성요소)를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 관심 생물학적 분자에 대한 임의의 천연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생산된 결합 파트너를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 부가적인 CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 표적 항원의 에피토프, 예컨대 면역 세포에 의해 인식되는 것과 같은 항원 결정기를 함유하는 펩타이드, 지질, 다당류 또는 핵산을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는, 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 결합제를 지칭한다. 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한, 키메라 항체(예를 들어 인간화 뮤린 항체), 이종접합체 항체(예컨대 이중특이적 항체) 및 이의 항원 결합 단편과 같은 유전적으로 조작된 형태를 포함한다. 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994―1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)]; 문헌[Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997]을 또한 참조한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 HPV-16 E6 및 HPV-16 E7 포함한 HPV 종양단백질, 알파 엽산 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4-1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-Al+MAGEI, HLA-A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA-Al + NY-ES0-1, HLA-A2 + NY-ES0-1, HLA-A3 + NY-ES0-1, IL-llRα, IL-13Rα2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0-1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TAG72, TEM, TACI, 및 VEGFRII 폴리펩타이드의 에피토프이다. 본원에 기재된 하나의 실시형태에서, CAR은 BCMA, CLL-1, CD19, CD20, CD22, CD28, CD137(4-1BB), 글리피칸-3(GPC3), PSCA, PSMA 또는 TACI를 포함하는 종양 항원 에피토프에 결합한다.
특정한 실시형태에서, 본원에서 고려되는 하나 이상의 부가적인 CAR은 분자의 적절한 간격 입체배열을 위해 첨가되는, 다양한 도메인 사이에, 예를 들어 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 링커 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 CAR은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개, 또는 그 초과의 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커의 길이는 약 1개 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 20개 아미노산, 또는 임의의 개입 길이의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예는 글리신 중합체 (G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n, 여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5의 정수임; 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되어 있지 않으며, 따라서 본원에 기재된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인 사이에서 중성 테더(tether)로서 역할을 할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 더 넓은 파이(phi)-프사이(psi) 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제약된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 본원에서 고려되는 다른 링커는 Whitlow 링커를 포함한다(예를 들어 문헌[Whitlow, Protein Eng. 6(8): 989―95 (1993)] 참조). 당업자는, 링커가 원하는 CAR 구조를 제공하기 위해 가요성 링커뿐만 아니라 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 일부 실시형태에서 CAR의 설계는 전체적으로 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 작제물은 "GS" 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 작제물은 "GSG" 링커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 서열 번호 40과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호 40).
다른 실시형태에서, CAR은 가변 영역 연결 서열을 추가로 포함하는 scFv를 포함한다. "가변 영역 연결 서열"은 중쇄 가변 영역을 경쇄 가변 영역에 결합하고 2개의 하위-결합 도메인의 상호작용과 상용성인 스페이서 기능을 제공하여, 생성된 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도를 유지하게 하는 아미노산 서열이다. 일 실시형태에서, 가변 영역 연결 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
다른 실시형태에서, CAR의 결합 도메인 다음에는 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 이동시키는 영역을 지칭하는 하나 이상의 "스페이서 도메인"이 뒤따른다(문헌[Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412―419]). 스페이서 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 스페이서 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH2 및 CH3을 포함하지만 이로 제한되지 않는 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CAR의 결합 도메인 다음에는 일반적으로 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 배치시키는 역할을 하는 하나 이상의 "힌지 도메인"이 뒤따를 수 있다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
2개 이상의 폴리펩타이드의 발현을 목적으로 하는 경우, 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 IRES 서열에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩타이드는 하나 이상의 자가-절단 폴리펩타이드 서열, 예컨대 T2A 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이는 상이한 프로모터로부터 발현되고, 2개 이상의 벡터에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 TCR 및/또는 하나 이상의 비(non)-NKG2D CAR과 동일한 벡터에서 인코딩되고, 서열이 IRES 서열에 의해 분리되는 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 TCR 및/또는 하나 이상의 비-NKG2D CAR과 동일한 벡터에서 인코딩되고, 서열이 절단 가능한 링커에 의해 분리되는 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 TCR 및/또는 하나 이상의 비-NKG2D CAR과 동일한 벡터에서 인코딩되고, NKG2D CAR은 TCR 및/또는 하나 이상의 비-NKG2D CAR과 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, NKG2D CAR은 TCR 및/또는 하나 이상의 비-NKG2D CAR과 상이한 벡터에서 인코딩된다.
"폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은 달리 명시되지 않는 한 그리고 통상적인 의미에 따라, 즉, 아미노산의 서열이다. 폴리펩타이드는 특정 길이에 제한되지 않으며, 예를 들어 이는 전장 단백질 서열 또는 전장 단백질의 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역-후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등, 뿐만 아니라 천연 발생과 비천연 발생 둘 다를 포함하여 당업계에 알려진 다른 변형을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본원에 고려된 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단에 신호(또는 리더) 서열을 포함하는데, 이는 단백질의 전달을 번역과 동시에 또는 번역후에 지시한다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 천연 발생 폴리펩타이드와 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 있어서 상이할 수 있다. 이러한 변이체는 천연 발생일 수 있거나, 예를 들어 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변경시킴으로써 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어 일부 실시형태에서, 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 도입함으로써 조작된 NKG2D CAR의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 개시내용의 폴리펩타이드는 이와 적어도 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 개시내용의 폴리펩타이드는 본원에 기재된 임의의 참조 서열(예를 들어 서열목록 참조)과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하며, 전형적으로 상기 변이체는 참조 서열의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 폴리펩타이드 단편은 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 천연-발생 또는 재조합-생산 폴리펩타이드의 내부 결실 또는 치환을 갖는 단량체 또는 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정한 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5개 내지 약 500개 아미노산 길이의 아미노산 사슬을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 단편은 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 또는 450개 아미노산 길이인 것으로 이해될 것이다.
폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드(예를 들어 poly-His)의 합성, 정제 또는 식별의 용이성을 위해 또는 고체 지지체에의 폴리펩타이드의 결합을 증강시키기 위해 링커 또는 다른 서열에 인-프레임으로 융합되거나 접합될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절두 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오타이드 서열 변경 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Kunkel(1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)], 문헌[Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌[Watson, J. D. et al., Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987] 및 그 안에서 인용된 참조문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 확인할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 변이체는 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은, 펩타이드 화학의 당업자라면 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성 성질이 실질적으로 변하지 않을 것이라고 예상할 수 있는 바와 같이, 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 치환이다. 변형은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 이루어질 수 있으며, 바람직한 특징을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 인코딩하는 기능성 분자를 여전히 수득할 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 집합적 접합체, 및 관련이 없는 화학적 모이어티(예를 들어 페길화된(pegylated) 분자)와의 공유결합 접합체를 추가로 포함한다. 공유결합 변이체는 당업계에 알려진 바와 같이, 아미노산 사슬 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 결합시키는 방식으로 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 뮤테인(mutein)을 포함한다. 단백질의 기능적 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절두 또는 결실 또한 변이체이다.
본 개시내용의 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및 이러한 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 그 이상의 폴리펩타이드 분절을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 폴리펩타이드는 전형적으로 C-말단이 N-말단에 연결된 것이지만, 이는 또한 C-말단이 C-말단에, N-말단이 N-말단에, 또는 N-말단이 C-말단에 연결된 것일 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서로 또는 특정한 순서로 존재할 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한, 융합 폴리펩타이드의 원하는 전사 활성이 보존되는 한, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 2개의 모이어티 사이의 화학적 연결에 의해 생산될 수 있거나, 일반적으로 다른 통상의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된 DNA 서열은 본원의 어디에서나 논의된 바와 같이 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시형태에서, 융합 파트너는 네이티브 재조합 단백질보다 높은 수율로 단백질을 발현하는 것을 돕는 서열(발현 인핸서)을 포함한다. 단백질의 용해도를 증가시키거나 단백질이 원하는 세포내 구획으로 표적화되게 할 수 있거나 세포막을 통한 융합 단백질의 수송을 용이하게 하기 위해 다른 융합 파트너가 선택될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본원에 기재된 각각의 폴리펩타이드 도메인 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 이에 더하여, 폴리펩타이드 부위는 임의의 링커 펩타이드 서열에 삽입될 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예컨대 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어 희귀 제한효소 인식 부위, 자가-절단 리보자임 인식 부위), 및 자가-절단 바이러스 올리고펩타이드를 포함한다(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26] 참조). 적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가-절단 펩타이드가 당업자에게 알려져 있다(예를 들어 문헌[Ryan et al., 1997. J Gener. Viral. 78, 699―722]; 문헌[Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589―594] 참조). 예시적인 프로테아제 절단 부위에는 포티바이러스(potyvirus) Nia 프로테아제(예를 들어 담배식각바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 Pl(P35) 프로테아제, 비요바이러스(byovirus) Nia 프로테아제, 비요바이러스 RNA-2-인코딩된 프로테아제, 아프토바이러스(aphthovirus) L 프로테아제, 엔테로바이러스(enterovirus) 2A 프로테아제, 리노바이러스(rhinovirus) 2A 프로테아제, 피코마(picoma) 3C 프로테아제, 코모바이러스(comovirus) 24K 프로테아제, 네포바이러스(nepovirus) 24K 프로테아제, RTSV(쌀 퉁그로 구형(rice tungro spherical) 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 반점(parsnip yellow fleck) 바이러스) 3C-유사 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이의 높은 절단 엄격성으로 인해, TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위가 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 포티바이러스 및 카르디오바이러스(cardiovirus) 2A 펩타이드, FMDV(수족구병 바이러스), 말 비염 A 바이러스, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코바이러스에서 수득된 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 자가-절단 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(문헌[Donnelly et al., 2001. J Gen. Viral. 82:1027-1041]).
일반적으로, 임의의 적절한 바이러스 벡터 또는 벡터들이 본원에 기재된 조작된 작제물의 형질도입에 사용될 수 있다고 이해된다. 본원에 기재된 일 실시형태에서, 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 iPSC)는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 본원에 사용된 용어 "레트로바이러스"는 이의 게놈 RNA를 선형 이중-가닥 DNA 복사체로 역전사시키고, 후속적으로 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈에 공유 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 일부 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하베이 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유선종양 바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스(spumavirus), 프리엔드(Friend) 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 렌티바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "렌티바이러스"는 복합 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다: HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2를 포함함); 비스나-메디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV).
용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어 이에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자가 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 가능하게 하는 데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 예를 들어 플라스미드(예를 들어 DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 예를 들어 복제 결함 레트로바이러스와 렌티바이러스를 포함한다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 전형적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈으로의 통합을 용이하게 하는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어 전달 플라스미드), 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭하는 데 광범위하게 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 다양한 바이러스 구성요소 및 또한 때로는 핵산(들)에 더하여 숙주 세포 구성요소를 포함할 것이다.
용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포에 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자, 또는 전달된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래되는 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래되는 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스로부터 유래되는 LTR을 포함한 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "하이브리드 벡터"는 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열과 비(non)레트로바이러스 바이러스 서열을 둘 다 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다. 일 실시형태에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전달 플라스미드를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 용어 "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"는 렌티바이러스 전달 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종성 핵산 등과 같은 요소가 본원에서 지칭되는 경우, 이러한 요소의 서열은 본 개시내용의 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하고, 본 개시내용의 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재함을 이해해야 한다. 본원에 기재된 일 실시형태에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 발현 벡터이다.
프로바이러스(provirus)의 각각의 말단은 "긴 말단 반복부(long terminal repeat)" 또는 "LTR"이라고 하는 구조이다. 용어 "긴 말단 반복부(LTR)"는 이의 천연 서열의 맥락에서 직접 반복부이고 U3, R 및 U5 영역을 함유하는 레트로바이러스 DNA의 말단에 위치한 염기쌍의 도메인을 지칭한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 근본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호, 및 바이러스 게놈의 복제와 통합에 필요한 서열을 포함하는 다수의 조절 신호를 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5라고 하는 3개의 영역으로 나뉜다. U3 영역은 인핸서 요소 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이며, 폴리아데닐화 서열을 함유한다. R(반복) 영역은 U3 영역 및 U5 영역에 의해 플랭킹된다(flank). LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 이루어지며, 바이러스 게놈의 5' 말단과 3' 말단 둘 다에 나타난다. 게놈의 역전사에 필요한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위)과 바이러스 RNA의 입자에의 효율적인 패키징에 필요한 서열(Psi 부위)은 5' LTR에 인접해 있다.
본원에 사용된 용어 "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"은 바이러스 RNA를 바이러스 캡시드 또는 입자에 삽입하는데 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 지칭한다(예를 들어 문헌[Clever et al., 1995. J of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조). 몇몇 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화에 필요한 최소 패키징 신호(프사이['P] 서열로도 지칭됨)를 사용한다. 그러므로, 본원에 사용된 용어 "패키징 서열", "패키징 신호", "프사이" 및 기호 "'P"는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡시드화에 필요한 비(non)코딩 서열과 관련하여 사용된다.
다양한 실시형태에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. LTR 중 어느 하나 또는 둘 다는 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 바이러스 복제-결함을 만들어 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 향상시키기 위해 종종 3' LTR의 변형이 이루어진다. 본원에 사용된 용어 "복제-결함"은 감염성 비리온이 생산되지 않도록 완전하고 효과적인 복제를 불가능하게 하는 바이러스(예를 들어 복제-결함 렌티바이러스 자손)를 지칭한다. 용어 "복제-적격(competent)"은 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온을 생산할 수 있도록 복제를 가능하게 하는 야생형 바이러스 또는 돌연변이 바이러스(예를 들어 복제 가능 렌티바이러스 자손)를 지칭한다.
"자가-불활성화"(SIN) 벡터는 U3 영역으로 알려진 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 제1 라운드의 바이러스 복제를 지나는 바이러스 전사를 방지하도록 변형(예를 들어 결실 또는 치환)된, 복제-결함 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 이는 우측(3 ') LTR U3 영역이 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로 사용되어, U3 인핸서-프로모터 없이 바이러스 전사체가 제조될 수 있기 때문이다. 본 개시내용의 추가의 실시형태에서, U5 영역이 예를 들어 이상적인 poly(A) 서열로 대체되도록 3'LTR이 변형된다. 3'LTR, 5'LTR, 또는 3'LTR과 5'LTR 둘 다에 대한 변형과 같은 LTR에 대한 변형이 또한 본원에서 고려됨을 주지해야 한다.
바이러스 입자 생산 동안 5'LTR의 U3 영역을 이종성 프로모터로 대체하여 바이러스 게놈의 전사를 유도함으로써 부가적인 안전성 증강이 제공된다. 사용될 수 있는 이종성 프로모터의 예는 예를 들어 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어 초기 또는 후기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어 극초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV) 및 단순헤르페스바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적 방식으로 높은 수준의 전사를 유도할 수 있다. 이러한 대체는 바이러스 생산 시스템에 완전한 U3 서열이 존재하지 않기 때문에, 복제-적격 바이러스를 생성하는 재조합 가능성을 감소시킨다. 특정한 실시형태에서, 이종성 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식을 제어하는 데 있어서 부가적인 이점을 갖는다. 예를 들어, 이종성 프로모터는 유도 인자가 존재할 때만 바이러스 게놈의 전부 또는 일부의 전사가 일어나도록 유도될 수 있다. 유도 인자는 하나 이상의 화학적 화합물, 또는 숙주 세포가 배양되는 온도 또는 pH와 같은 생리학적 조건을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. 용어 "TAR"은 렌티바이러스(예를 들어 HIV) LTR의 R 영역에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 렌티바이러스 트랜스-활성화제(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증강시킨다.
"R 영역"은 캡핑기의 시작(즉, 전사 시작)에서 시작하여 poly A 트랙트(tract)의 시작 직전에 종료되는 레트로바이러스 LTR 내 영역을 지칭한다. R 영역은 또한 U3 영역과 U5 영역에 의해 플랭킹되는 것으로 정의된다. R 영역은 역전사 동안 초기 DNA를 게놈의 하나의 말단으로부터 다른 말단으로 전달하는 것을 가능하게 하는 역할을 한다.
본원에 사용된 용어 "FLAP 요소"는 이의 서열이 레트로바이러스, 예를 들어 HIV-I 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린 트랙트와 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 중심 폴리퓨린 트랙트와 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호 및 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173]에 기재되어 있다. HIV-I 역전사 동안, 중심 폴리퓨린 트랙트(cPPT)에서의 플러스 가닥 DNA의 중심 개시와 중심 종결 서열(CTS)에서의 중심 종결은 삼중-가닥 DNA 구조인 HIV-I 중심 DNA 플랩의 형성으로 이어진다. 임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 유입의 시스(cis)-활성 결정기로서 작용할 수 있고/있거나 바이러스 역가를 증가시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 벡터는 하나 이상의 외수송(export) 요소를 포함한다. 용어 "외수송 요소"는 세포의 핵으로부터 세포질로의 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용성 전사후 조절 요소를 지칭한다. RNA 외수송 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어 문헌[Cullen et al., 1991. J Virol. 65: 1053]; 및 문헌[Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일반적으로, RNA 외수송 요소는 유전자의 3' UTR 내에 위치하며, 하나 또는 다중 복사체로서 삽입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 바이러스 벡터에서 이종성 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위 및 선택적으로 전사 종결 신호를 벡터에 혼입시킴으로써 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소는 단백질에서 이종성 핵산, 예를 들어 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(문헌[WPRE; Zufferey et al., 1999, J Virol., 73:2886]); B형 간염 바이러스(HPRE)에 존재하는 전사후 조절 요소(문헌[Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864]); 및 유사한 것(문헌[Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766])의 발현을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 전사 또는 번역 조절 활성을 갖는 조절 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 발현의 제어를 조절하기 위한 다양한 유전자 발현 구성에 사용될 수 있다. 전사 조절 올리고뉴클레오타이드는 재조합 발현 작제물의 발현 수준을 증가(증강) 또는 저하(침묵)시킬 수 있다. 조절 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 폴리뉴클레오타이드의 구성적 또는 유도적 발현을 포함하여 조직 특이적 발현, 발달 단계 특이적 발현 또는 유사한 발현을 부여하는 것을 포함하는 맥락 특이적 방식으로 발현을 선택적으로 조절할 수 있다. 개시내용의 조절 올리고뉴클레오타이드는 또한 발현 가능한 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산 분자 또는 발현 벡터의 구성요소일 수 있다. 조절 요소는 수 개의 뉴클레오타이드에서 수백 개의 뉴클레오타이드까지의 다양한 길이를 가질 수 있다.
이종성 핵산 전사체의 효율적인 종결과 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종성 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 다운스트림에서 발견된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현시키고자 하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "poly A 부위" 또는 "poly A 서열"은 RNA 폴리머라제 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결과 폴리아데닐화 둘 다를 지시하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리아데닐화 서열은 poly A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 첨가함으로써 mRNA 안정성을 촉진시켜, 증가된 번역 효율에 기여할 수 있다. poly A 테일이 결여된 전사체는 불안정하고 신속하게 분해되기 때문에, 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 개시내용의 벡터에 사용될 수 있는 poly A 신호의 예시적인 예는 이상적인 poly A 서열(예를 들어 AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장호르몬 poly A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 poly A 서열(rβgpA), 또는 당업계에 알려진 또 다른 적합한 이종성 또는 내인성 poly A 서열을 포함한다.
또한 "코돈 최적화된" 핵산이 본원에 기재되어 있다. "코돈 최적화된" 핵산은 코돈이 특정 시스템(예컨대 특정 종 또는 종들의 군)에서의 발현에 최적화되도록 변경된 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열은 네이티브 서열의 코돈 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수를 해당 종의 유전자에 더 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체함으로써 포유류 세포 또는 특정 포유류 종(예컨대 인간 세포)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다.
코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 발현 효능과 관련된 향상된 특성을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 전사될 DNA 서열은 더 효율적인 전사 및/또는 번역을 가능하게 하기 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA 서열은 시스-조절 요소(예를 들어 TATA 박스, 종결 신호 및 단백질 결합 부위), 인공 재조합 부위, 카이 부위, CpG 디뉴클레오타이드 함량, 음성 CpG 섬(island), GC 함량, 폴리머라제 슬리피지(slippage) 부위, 및/또는 전사와 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있고; DNA 서열은 은성(cryptic) 스플라이스 부위, mRNA 2차 구조, mRNA의 안정한 자유 에너지, 반복 서열, RNA 불안정성 도메인, 및/또는 mRNA 처리 및 안정성과 관련된 다른 요소와 관련하여 최적화될 수 있고; DNA 서열은 코돈 사용 편향, 코돈 적응성, 내부 카이 부위, 리보솜 결합 부위(예를 들어 IRES), 조기성숙 polyA 부위, 샤인-달가노(SD: Shine-Dalgarno) 서열, 및/또는 번역과 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있고/있거나; DNA 서열은 코돈 맥락, 코돈-안티코돈 상호작용, 번역 정지 부위, 및/또는 단백질 폴딩과 관련된 다른 요소에 관하여 최적화될 수 있다.
벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있는데, 여기서 임의의 LTR은 하나 이상의 변형, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 벡터는 형질도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 보조 요소(예를 들어 cPPT/FLAP), 바이러스 패키징(예를 들어 프사이(Ψ) 패키징 신호, RRE), 및/또는 치료용 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소(예를 들어 poly(A) 서열)를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함할 수 있다. 당업자는 개시내용의 기존의 실시형태로부터 다수의 다른 상이한 실시형태가 형성될 수 있음을 이해할 것이다.
"숙주 세포"는 개시내용의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드로 생체내에서, 생체외에서 또는 시험관내에서 형질주입되거나 감염되거나 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 패키징 세포, 생산 세포, 및 바이러스 벡터에 감염된 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 바이러스 벡터에 감염된 숙주 세포가 치료법을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 용어 "표적 세포"는 숙주 세포와 상호교환적으로 사용되며, 원하는 세포 유형의 형질주입, 감염 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 세포는 T 세포이다.
대규모 바이러스 입자 생산은 종종 합리적인 바이러스 역가를 달성하는 데 필요하다. 바이러스 입자는 전달 벡터를, 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자, 예를 들어 gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자, 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포주에 형질주입함으로써 생산된다.
본원에 사용된 용어 "패키징 벡터"는 패키징 신호가 결여된 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭하며, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 바이러스 구조 및/또는 부속 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되어 있으며, 형질주입, 형질도입 또는 감염을 통해 세포에 도입된다. 형질주입, 형질도입 또는 감염 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 본 개시내용의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터는 형질주입, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주에 도입되어, 생산 세포 또는 세포주를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 패키징 벡터는 예를 들어 인산칼슘 형질주입, 리포펙션 또는 전기천공을 포함한 통상의 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 벡터는 네오마이신(neomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 퓨로마이신(puromycin), 블라스토시딘(blastocidin), 제오신(zeocin), 티미딘 키나제, DHFR, Gln 합성효소 또는 ADA와 같은 우성 선별 마커와 함께 세포에 도입된 후, 적절한 약물의 존재 하에 선별되고, 클론이 단리된다. 선택 가능한 마커 유전자는 예를 들어, IRES 또는 자가 절단 바이러스 펩타이드에 의해, 패키징 벡터에 의해 인코딩된 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
바이러스 외피 단백질(env)은 궁극적으로 세포주에서 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV와 같은 렌티바이러스의 경우, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 패키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 이전에 기재된 바와 같이, 바이러스 gag 및 pol 유전자와 별개의 벡터 상에서 인코딩된다.
본원에 기재된 실시형태에 이용될 수 있는 레트로바이러스 유래 env 유전자의 예시적인 예는 MLV 외피, IOAI 외피, BAEV, FeLV-B, RDI 14, SSAV, 에볼라(Ebola), 센다이(Sendai), FPV(조류 흑사병 바이러스) 및 인플루엔자바이러스 외피를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 유사하게는, RNA 바이러스(예를 들어 피코마바이러스과(Picomaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 아스트로바이러스과(Astroviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분야바이러스과(Bunyaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 비마바이러스과(Bimaviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae)의 RNA 바이러스 계열), 뿐만 아니라, DNA 바이러스(헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 시르코바이러스과(Circoviridae), 파르보바이러스과(Parvoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 폭스바이러스과(Poxyiridae), 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)의 계열)의 외피를 인코딩하는 유전자가 활용될 수 있다. 대표적인 예는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 광견병(Rabies), ALV, BIV, BL V, EBV, CAEV, SNV, ChTL V, STLV, MPMV SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CTIO, 및 EIAV를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스를 위형화하기 위한 외피 단백질은 하기 바이러스: 인플루엔자 A(예컨대 H1N1, H1N2, H3N2 및 H5Nl(조류 독감)), 인플루엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염바이러스, B형 간염바이러스, C형 간염바이러스, D형 간염바이러스, E형 간염바이러스, 로타바이러스, 노워크(Norwalk) 바이러스 군 중 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스, 파르보바이러스, 뎅기열 바이러스, 원숭이 폭스, 모노네가바이러스(Mononegavirus), 리사바이러스(Lyssavirus)(예컨대 광견병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 모콜라바이러스(Mokola virus), 듀벤헤이즈바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 바이러스 1 & 2 및 호주 박쥐 바이러스), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 헤르페스바이러스(예컨대 단순헤르페스바이러스 유형 1 및 2, 대상포진, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 유형 6 및 8, 인간 면역결핍바이러스(HIV), 유두종 바이러스, 뮤린 감마 헤르페스바이러스), 아레나바이러스(예컨대 아르헨티나 출혈열바이러스, 볼리비아 출혈열바이러스, 사비아(Sabia) 관련 출혈열바이러스, 베네수엘라 출혈열바이러스, 라싸열바이러스, 마추포바이러스(Machupo virus), 림프구성 맥락수막염바이러스(LCMV)), 분야바이러스과(예컨대 크리미안-콩고(Crimean-Congo) 출혈열바이러스, 한타바이러스, 신증후군 동반 출혈열 유발 바이러스, 리프트계곡열바이러스(Rift Valley fever virus) 포함), 필로바이러스과(필로바이러스)(에볼라 출혈열 및 마르부르크 출혈열 포함), 플라비바이러스과(키아사누르삼림열바이러스(Kaysanur Forest disease virus), 옴스크(Omsk) 출혈열바이러스, 진드기매개뇌염 유발 바이러스 포함), 및 파라믹소바이러스과(예컨대 헨드라바이러스(Hendra virus) 및 니파바이러스(Nipah virus), 대두창 및 소두창(천연두) 포함), 알파바이러스(예컨대 베네수엘라 말 뇌염바이러스, 동부 말 뇌염바이러스, 서부 말 뇌염바이러스), SARS 관련 코로나바이러스(SARS-Co V), 웨스트나일바이러스(West Nile virus), 또는 임의의 뇌염 유발 바이러스 중 임의의 하나를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "위형(pseudotype)" 또는 "위형화(pseudotyping)"는 이의 바이러스 외피 단백질이 다른 특징을 갖는 또 다른 바이러스의 것으로 대체된 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는 수포성 구내염 바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 위형화될 수 있으며, 이는 (env 유전자에 의해 인코딩된) HIV 외피 단백질이 통상적으로 바이러스를 CD4+ 제시 세포로 표적화하기 때문에 HIV가 더 넓은 범위의 세포를 감염시키는 것을 가능하게 한다.
본원에 사용된 용어 "패키징 세포주"는 패키징 신호를 함유하지 않지만, 바이러스 입자의 올바른 패키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어 gag, pol 및 env)를 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 세포주와 관련하여 사용된다. 본 개시내용의 패키징 세포를 제조하는 데 임의의 적합한 세포주가 이용될 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 패키징 세포주 생산에 사용되는 세포는 인간 세포이다. 패키징 세포주 생산에 사용될 수 있는 적합한 세포주는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10Tl/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC1 세포, BSC40 세포, BMT10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HTI080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "생산자 세포주"는 패키징 세포주 및 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 작제물을 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포주를 지칭한다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 스톡 용액의 생산은 통상적인 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 스톡 용액의 제조 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628―633] 및 문헌[N. R. Landau et al. (1992) J Virol. 66:5110―5113]에 의해 예시된다. 감염성 바이러스 입자는 통상적인 기법을 사용하여 패키징 세포로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 감염성 입자는 당업계에 알려진 바와 같이, 세포 용해 또는 세포 배양물의 상층액 수집에 의해 수집될 수 있다. 선택적으로, 원하는 경우, 수집된 바이러스 입자는 정제될 수 있다. 적합한 정제 기법은 당업자에게 널리 알려져 있다.
형질주입이 아닌 바이러스 감염에 의한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 유전자(들) 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열의 전달은 "형질도입"으로 지칭된다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내로 형질도입된다. 특정한 실시형태에서, 표적 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 이것이 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 세포에 전달된 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, "형질도입된" 것이다. 일부 실시형태에서, 형질도입된 세포는 이의 세포 게놈에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 작제물 중 하나 이상을 발현하는 숙주 세포가 개시된다. 숙주 세포는 조작된 TCR 및/또는 CAR을 발현하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 본 개시내용의 특정한 실시형태에 따라 활용될 수 있는 유전자 치료법에서 바이러스 벡터의 사용에 관한 다른 방법은 예를 들어, 문헌[Kay, M.A. (1997) Chest 111(6 Supp.): 138S―142S]; 문헌[Ferry, N. and Heard, J.M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975―81]; 문헌[Shiratory, Y. et al., (1999) Liver 19:265―74]; 문헌[Oka, K. et al., (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179―86]; 문헌[Thule, P. M. and Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7:1744―52]; 문헌[Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335―56]; 문헌[Alt, M. (1995) J Hepatol. 23:746―58]; 문헌[Brody, S. L. and Crystal, R.G. (1994) Ann. NY Acad. Sci. 716:90―101]; 문헌[Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159―2172]; 문헌[Smith―Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43―49]; 및 문헌[Lee, H. C. et al., (2000) Nature 408:483―8]에서 찾을 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 본원에서 고려되는 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 T 세포 조성물 및 NK 조성물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 일 실시형태는 NKG2D CAR을 발현하는 변형된 T 세포를 포함하는 조성물이다. 본원에 기재된 또 다른 실시형태는 NKG2D CAR을 발현하는 변형된 NK 세포를 포함하는 조성물이다. 조성물은 약학적 조성물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. "약학적 조성물"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 방식과 조합하여 세포 또는 동물에게 투여하기 위해 약학적으로 허용 가능하거나 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한, 원하는 경우, 본 개시내용의 조성물은 예를 들어 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 저분자, 화학치료제, 전구약물, 약물, 항체, 또는 다른 다양한 약학적 활성제와 같은 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다고 이해될 것이다. 부가적인 제제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 조성물에 포함될 수 있는 다른 구성요소에는 사실상 제한이 없다.
어구 "약학적으로 허용 가능한"은 본원에서 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 상응하여 인간 및 동물이 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭하는 데 이용된다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 이는 미국 식품의약국(FDA)에서 사람이나 가축에 사용할 수 있는 것으로 승인된 것이다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 당류(sugar), 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충액, 예컨대 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 무발열원 증류수; 등장 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 인산염 완충액; 및 약학적 제형에 이용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 일 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 일정량의 본원에서 고려되는 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 본원에서 고려되는 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물은 체중 1 kg당 102개 내지 1010개의 세포, 체중 1 kg당 105개 내지 109개의 세포, 체중 1 kg당 105개 내지 108개의 세포, 체중 1 kg당 105개 내지 107개의 세포, 체중 1 kg당 107개 내지 109개의 세포, 또는 체중 1 kg당 107개 내지 108개의 세포(해당 범위 내 모든 정수값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있다고 일반적으로 명시될 수 있다. 세포의 수는 그 안에 포함된 세포 유형과 마찬가지로 조성물이 의도되는 궁극적인 용도에 따라 달라질 것이다. 조작된 NKG2D CAR을 발현하도록 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 이러한 범위 내 투여량으로 수 회 투여될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 동종이계, 동계(syngeneic), 이종 또는 자가일 수 있다. 원하는 경우, 치료는 또한 융합된 T 세포의 생착 및 기능을 증강시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 미토겐(예를 들어 PHA) 또는 림포카인, 사이토카인, 및/또는 케모카인(예를 들어 IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNF-알파, IL-18 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 포함하는 조성물은 면역저하되거나 면역억제된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 활용될 수 있다. 일부에서, 본원에서 고려되는 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 조성물은 암의 치료에 사용된다. 본원에 기재된 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 단독으로 또는 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15, 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 구성요소와 조합된 약학적 조성물로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 고려되는 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합되어 일정량의 유전적으로 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다.
본원에서 고려되는 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성으로 완충된 식염수, 인산염 완충된 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들어 알루미늄 하이드록사이드); 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여에 맞게 제형화될 수 있다.
용액, 현탁액 또는 다른 유사 형태일 수 있는 액체 약학적 조성물은 주사용수, 생리 식염수와 같은 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드와 같은 불휘발성유(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조정제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 주사기 또는 다회용 바이알에 동봉될 수 있다. 멸균 주사용 약학적 조성물이 또한 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에서 고려되는 조성물은 유효량의 확장된 변형된 T 세포 또는 NK 세포 조성물을 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합하여 포함한다. 그러므로, T 세포 또는 NK 세포 조성물은 단독으로 또는 방사선 치료법, 화학치료법, 이식, 면역치료법, 호르몬 치료법, 광역학적 치료법 등과 같은 다른 알려진 암 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제 및 항바이러스제와 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 질환 상태, 예를 들어 암을 위한 치료로 당업계에서 허용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본원에서 고려되는 조성물은 또한 TGF-β의 저해제, 예를 들어 저분자 저해제 LY55299와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항염증제, 화학치료제, 방사선요법제, 치료용 항체, 또는 다른 활성제 및 보조제를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본원에서 고려되는 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 조성물은 임의의 수의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예시적인 예는, 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카르보퀀(carboquone), 메투레도파(meturedopa) 및 우레도파(uredopa); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민 수지를 포함한 에틸렌이민 및 메틸멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예컨대 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 안트라마이신(anthramycin), 아자세린(azaserin), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼리케아마이신(calicheamicin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5―FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5―FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코사이드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지퀀(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론; 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진(procarbazine); PSK®; 라족산(razoxane); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄; 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(paclitaxel)(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀(doxetaxel)(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin); 빈블라스틴(vinblastine); 백금; 에토포사이드(etoposide)(VP―16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테니포사이드(teniposide); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT―11; 토포이소머라제 저해제 RPS 2000; 디플루오로메틸로미틴(DMFO: difluoromethylomithine); 레티노산 유도체, 예컨대 Targretin™(벡사로텐(bexarotene)), Panretin™(알리트레티노인(alitretinoin)); ONTAK™(데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox)); 에스페라마이신(esperamicin); 카페시타빈(capecitabine); 및 상기 중 임의의 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이러한 정의에는 또한, 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 아로마타아제 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 및 토레미펜(toremifene)(Fareston)을 포함하는 항에스트로겐; 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체와 함께 투여될 수 있다.
다양한 다른 치료제가 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, T 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여된다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론 포함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노미드를 포함한 비스테로이드 항염증 약물(NSAIDS), 항-TNF 약제, 사이클로포스파미드, 및 마이코페놀레이트를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 저해제(예컨대 VIOXX®(로페콕시브(rofecoxib)) 및 CELEBREX®(셀레콕시브(celecoxib))) 및 시알릴레이트(sialylate)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜(acetaminophen), 옥시코돈(oxycodone), 트라마돌(tramadol) 또는 프로폭시펜 하이드로클로라이드로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 변형제는 세포 표면 마커에 대한 분자(예를 들어 CD4, CD5 등), TNF 길항제(예를 들어 에타네르셉트(etanercept)(ENBREL®), 아달리무맙(adalimumab)(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(infliximab)(REMICADE®))와 같은 사이토카인 저해제, 케모카인 저해제 및 접착 분자 저해제를 포함한다. 생물학적 반응 변형제는 단일클론 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 질환-변형 항류마티스 약물(DMARD)은 아자티오프린(azathioprine), 사이클로포스파미드, 사이클로스포린(cyclosporine), 메토트렉세이트, 페니실라민(penicillamine), 레플루노미드, 설파살라진, 하이드록사이클로로퀸, 금(경구(아우라노핀(auranofin)) 및 근육내) 및 미노시클린을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에서 고려되는 CAR 또는 TCR 변형된 T 세포 또는 NK 세포와 조합하기에 적합한 치료용 항체는 아바고보맙(abagovomab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아푸투주맙(afutuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알투모맙(altumomab), 아마툭시맙(amatuximab), 아나투모맙(anatumomab), 아르시투모맙(arcitumomab), 바비툭시맙(bavituximab), 벡투모맙(bectumomab), 베바시주맙(bevacizumab), 비바투주맙(bivatuzumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙(brentuximab), 칸투주맙(cantuzumab), 카투막소맙(catumaxomab), 세툭시맙(cetuximab), 시타투주맙(citatuzumab), 식수투무맙(cixutumumab), 클리바투주맙(clivatuzumab), 코나투무맙(conatumumab), 다라투무맙(daratumumab), 드로지투맙(drozitumab), 두리고투맙(duligotumab), 두시기투맙(dusigitumab), 데투모맙(detumomab), 다세투주맙(dacetuzumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 에크로멕시맙(ecromeximab), 엘로투주맙(elotuzumab), 엔시툭시맙(ensituximab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 에타라시주맙(etaracizumab), 파리에투주맙(farietuzumab), 피클라투주맙(ficlatuzumab), 피기투무맙(figitumumab), 플란보투맙(flanvotumab), 푸툭시맙(futuximab), 가니투맙(ganitumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 글렘바투무맙(glembatumumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이고보맙(igovomab), 임가투주맙(imgatuzumab), 인다툭시맙(indatuximab), 이노투주맙(inotuzumab), 인테투무맙(intetumumab), 이필리무맙(ipilimumab), 이라투무맙(iratumumab), 라베투주맙(labetuzumab), 렉사투무맙(lexatumumab), 린투주맙(lintuzumab), 로르보투주맙(lorvotuzumab), 루카투무맙(lucatumumab), 마파투무맙(mapatumumab), 마투주맙(matuzumab), 밀라투주맙(milatuzumab), 민레투모맙(minretumomab), 미투모맙(mitumomab), 목세투모맙(moxetumomab), 나마투맙(namatumab), 납투모맙(naptumomab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 노페투모맙(nofetumomab), 오카라투주맙(ocaratuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오나르투주맙(onartuzumab), 오포르투주맙(oportuzumab), 오레고보맙(oregovomab), 파니투무맙(panitumumab), 파르사투주맙(parsatuzumab), 파트리투맙(patritumab), 펨투모맙(pemtumomab), 페르투주맙(pertuzumab), 핀투모맙(pintumomab), 프리투무맙(pritumumab), 라코투모맙(racotumomab), 라드레투맙(radretumab), 릴로투무맙(rilotumumab), 리툭시맙, 로바투무맙(robatumumab), 사투모맙(satumomab), 시브로투주맙(sibrotuzumab), 실툭시맙(siltuximab), 심투주맙(simtuzumab), 솔리토맙(solitomab), 타카투주맙(tacatuzumab), 타플리투모맙(taplitumomab), 테나투모맙(tenatumomab), 테프로투무맙(teprotumumab), 티가투주맙(tigatuzumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 투코투주맙(tucotuzumab), 우블리툭시맙(ublituximab), 벨투주맙(veltuzumab), 보르세투주맙(vorsetuzumab), 보투무맙(votumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), CC49 및 3F8을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 본원에 사용된 "사이토카인"이란, 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 총칭을 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 케모카인 및 전형적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신(thyroxine); 인슐린; 프로인슐린(proinsulin); 렐락신(relaxin); 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 종양 괴사 인자-베타; 뮬러관-저해 성분; 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; 인히빈(inhibin); 액티빈(activin); 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 대식 세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예컨대 IL―1, IL-1α, IL―2, IL―3, IL―4, IL―5, IL―6, IL―7, IL―8, IL―9, IL―10, IL―11, IL―12; IL-15, 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토카인은 천연(natural) 공급원 또는 재조합 세포 배양물에서 유래한 단백질, 및 천연(native) 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
임의의 세포는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 폴리펩타이드에 대한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 진균 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 적합한 원핵 세포는 비제한적으로 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 유박테리아(eubacteria), 예를 들어 에스케리키아(Escherichia), 예컨대 에스케리키아 콜라이(E. Coli)와 같은 엔테로박테리아과(Enterobactehaceae); 엔테로박테리아(Enterobacter); 에르위니아(Erwinia); 클레브시엘라(Klebsiella); 프로테우스(Proteus); 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium); 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella); 바실러스(Bacilli), 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis); 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. Aeruginosa); 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), TCR 발현 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프 세포, 거핵 세포, 단핵구, 대식 세포, 혈소판, 흉선 세포 및 골수 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 특정 실시형태에서, T 세포는 종양 침윤 림프구(TIL), 자가 T 세포, 조작된 자가 T 세포(eACT™), 동종이계 T 세포, 이종성 T 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 항체 치료법 또는 독립형 NKG2D CAR 변형된 T 세포, T 세포(또는 상기에 기재된 바와 같은 임의의 세포)와는 다름.
본원에 기재된 또 다른 실시형태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 유효량, 예를 들어 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 TCR 또는 CAR을 발현하는 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에서 고려되는 변형된 T 세포 또는 이를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정한 실시형태에서, 개시내용의 세포는 암이 발증할 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 그러므로, 본 개시내용은 암의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 치료적 유효량의 개시내용의 변형된 T 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
당업자는 본 개시내용의 조성물의 다회 투여가 원하는 치료법을 유효하게 하는 데 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회, 또는 그 이상 투여될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 후, 다시 채혈하여(또는 성분채집술을 수행하여) 본 개시내용에 따라 T 세포를 활성화시키고, 이러한 활성화되고 확장된 T 세포를 환자에게 다시 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 몇 주마다 여러 번 수행될 수 있다. 특정한 실시형태에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 다회 채혈/다회 재주입 프로토콜의 사용은 T 세포의 특정 집단을 선택하는 역할을 할 수 있다.
본원에서 고려되는 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 착상 또는 이식을 포함하여 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 비경구 투여된다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된"은 통상적으로 주사에 의한, 장관내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 이는 비제한적으로, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일 실시형태에서, 본원에서 고려되는 조성물은 대상체에게 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로의 직접 주입에 의해 투여된다.
일 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 상기 대상체에서 암에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는 조성물의 유효량을 투여받는다. 면역 반응은 감염된 세포를 사멸화시킬 수 있는 세포독성 T 세포, 조절 T 세포 및 헬퍼 T 세포 반응에 의해 매개되는 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. B 세포를 활성화시켜 항체 생산을 유도할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응이 또한 유도될 수 있다. 여러 가지 기법이 본 개시내용의 조성물에 의해 유도되는 면역 반응의 유형을 분석하는 데 사용되며, 이는 당업계: 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y]에 잘 기재되어 있다.
T 세포 매개 사멸의 경우, CAR-리간드 결합은 T 세포로의 CAR 신호전달을 개시하여, T 세포가 다양한 메커니즘에 의해 표적 세포 세포자멸사를 유도할 수 있는 단백질을 생산하거나 방출하도록 유도하는 다양한 T 세포 신호전달 경로를 활성화시킨다. 이러한 T 세포 매개 메커니즘은 T 세포에서 표적 세포로의 세포내 세포독성 과립의 전달, 표적 세포 사멸을 직접적으로(또는 다른 살해 이펙터 세포의 동원을 통해 간접적으로) 유도할 수 있는 전염증성 사이토카인의 T 세포 분비, 및 표적 세포의 동족 사멸 수용체(예를 들어 Fas)에 결합한 후 표적 세포 세포자멸사를 유도하는 T 세포 표면 상의 사멸 수용체 리간드(예를 들어 FasL)의 상향조절을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 하나의 실시형태는 암으로 진단된 대상을 치료하는 방법으로서, 대상체로부터 T 세포를 제거하는 단계, 본원에서 고려되는 바와 같은 NKG2D CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 상기 T 세포를 유전적으로 변형시켜 변형된 T 세포 집단을 생산하는 단계, 및 동일한 대상체에게 변형된 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 대상체에서 표적 세포 집단에 대한 이펙터 세포 매개 면역 조절자 반응을 자극시키는 방법을 제공하며, NKG2D CAR 분자를 인코딩하는 핵산 작제물을 발현하는 면역 이펙터 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 세포 조성물을 투여하는 방법은 대상체에서 조작된 NKG2D CAR을 직접적으로 발현하는 생체외 유전적으로 변형된 면역 이펙터 세포의 재도입, 또는 대상체에게 도입 시 NKG2D CAR 분자를 발현하는 성숙 면역 이펙터 세포로 분화되는 면역 이펙터 세포의 유전적으로 변형된 전구체의 재도입을 초래하는 데 효과적인 임의의 방법을 포함한다. 하나의 방법은 말초 혈액 T 세포를 생체외에서 본 개시내용에 따른 핵산 작제물로 형질도입하는 단계 및 형질도입된 세포를 대상체에게 다시 돌려보내는 단계를 포함한다.
전술한 개시내용은 이해의 명확성을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않는 한, 본 개시내용의 교시에 비추어 특정 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 하기 실시예는 예시의 방식으로만 제공되며 제한의 방식이 아니다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 산출하도록 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 비임계 매개변수를 쉽게 인식할 것이다.
실시예
실시예 1
NKG2D CAR 작제물 설계
하기 실시예에 사용된 바와 같이, 조작된 NKG2D 키메라 항원 수용체 작제물을 레트로바이러스 벡터에서 설계하고 합성하였다. NKG2D CAR1이라고 하는 제1 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 신호 펩타이드, NKG2D 세포외 도메인, CD8알파 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 아래에 제시된다: MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 53).
NKG2D CAR2라고 하는 제2 작제물은 N-말단으로부터 신호 펩타이드, C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8알파 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ε 신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 수용체의 아미노산 서열은 아래에 제시된다:
MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 54).
NKG2D CAR3이라고 하는 제3 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8 힌지, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 66). 일 양태에서, CAR3은 하기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다:
1 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt
61 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg
121 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa
181 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa
241 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt
301 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga
361 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt
421 gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt
481 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt
541 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt
601 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg
661 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct
721 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg
781 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca
841 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg
901 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg
961 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt
1021 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac
1081 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag
1141 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta
1201 aaagccaaag cgccgccacc atggctcttc ctgtgacagc tcttctgctg cccctggccc
1261 tgcttctgca tgctgctaga cctgagcaaa agttgatttc tgaggaagac ctcgccggca
1321 gtttattcaa ccaagaagtc caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta
1381 agaactggat atgttacaaa aataactgtt accaattctt cgatgaatct aagaattggt
1441 atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tcttaaagta tacagcaaag
1501 aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc
1561 caacaaatgg atcttggcag tgggaagacg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa
1621 taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcatc gagctttaaa ggctatatag
1681 aaaactgttc aactccaaat acatatattt gcatgcaaag gactgtgacc acgacgccag
1741 cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca acccctgtcc ctgaggcctg
1801 aagcgtgccg gccagcggcg ggcggcgcag tgcacacgag agggctggac ttcgcctgtg
1861 atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta
1921 tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta
1981 tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag
2041 aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc
2101 agcaagggca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg
2161 ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc
2221 ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga
2281 ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca
2341 gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca agctctgccc cctcgctga(서열 번호 67).
CAR3은 (서열 번호 67)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 양태에서, (서열 번호 67)의 핵산 서열은 Myc(인간 c-Myc 전암유전자(proto-oncogene)) 에피토프 태그 및 Myc 태그와 NKG2D 세포외 도메인 사이의 링커를 인코딩하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. (서열 번호 67)의 핵산 서열은 위치 1221 내지 1283에서 CD8a 신호 펩타이드를 인코딩하며, 이러한 신호 펩타이드는 상이한 신호 펩타이드에 대해 치환될 수 있다.
NKG2D CAR4라고 하는 제4 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8알파 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 68). 일 양태에서, CAR4는 하기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다:
1 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt
61 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg
121 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa
181 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa
241 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt
301 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga
361 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt
421 gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt
481 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt
541 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt
601 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg
661 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct
721 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg
781 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca
841 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg
901 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg
961 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt
1021 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac
1081 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag
1141 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta
1201 aaagccaaag cgccgccacc atggctcttc ctgtgacagc tcttctgctg cccctggccc
1261 tgcttctgca tgctgctaga cctgagcaaa agttgatttc tgaggaagac ctcgccggca
1321 gtttattcaa ccaagaagtc caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta
1381 agaactggat atgttacaaa aataactgtt accaattctt cgatgaatct aagaattggt
1441 atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tcttaaagta tacagcaaag
1501 aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc
1561 caacaaatgg atcttggcag tgggaagacg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa
1621 taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcatc gagctttaaa ggctatatag
1681 aaaactgttc aactccaaat acatatattt gcatgcaaag gactgtgacc acgacgccag
1741 cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca acccctgtcc ctgaggcctg
1801 aagcgtgccg gccagcggcg ggcggcgcag tgcacacgag agggctggac ttcgcctgtg
1861 atttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag
1921 tggcctttat tattttctgg gtcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac
1981 aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc
2041 cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc
2101 ccgcgtacca gcaagggcag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg
2161 agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa
2221 ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct
2281 acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc
2341 agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gctctgcccc
2401ctcgctga(서열 번호 69)
CAR4는 (서열 번호 69)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 양태에서, (서열 번호 69)의 핵산 서열은 Myc(인간 c-Myc 전암유전자) 에피토프 태그 및 Myc 태그와 NKG2D 세포외 도메인 사이의 링커를 인코딩하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. (서열 번호 69)의 핵산 서열은 위치 1221 내지 1283에서 CD8a 신호 펩타이드를 인코딩하며, 이러한 신호 펩타이드는 상이한 신호 펩타이드에 대해 치환될 수 있다.
NKG2D CAR5라고 하는 제5 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8 힌지, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ε 신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRILRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 70). 일 양태에서, CAR5는 하기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다:
1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc
61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga
121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg
181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca
241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa
301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc
361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca
421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg
481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg
541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag
601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt
661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt
721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac
781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt
841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga
901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc
961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccaccac tcctgctcca agacctccta
1021 cccccgctcc tacaatcgcc agccaacctc tgagcctgag accggaggca tgcagacctg
1081 cggcaggggg agcagttcac acaagaggct tggacttcgc ttgcgacatc tacatctggg
1141 cccctctggc cggcacatgc ggagttcttc ttcttagcct ggtgatcacc ctgtactgca
1201 agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga cctgtgcaga
1261 ccacacagga ggaagacggc tgcagctgta gattccccga ggaagaggag ggcggctgtg
1321 agctgaagaa ccgcaaagca aaggcaaaac ccgtcacacg aggagcgggc gcagggggac
1381 gacaacgcgg tcagaataag gaacgcccgc ctccagtacc aaatccagat tatgaaccaa
1441 ttcggaaggg acaacgcgat ctctactccg gtctcaatca gaggcgaatt ctgagagtta
1501 agttcagcag gagcgccgac gcccctgcct accagcaagg acagaatcaa ctgtacaacg
1561 agctgaacct gggcagacgg gaggaatacg atgtgctgga caagaggaga ggcagagacc
1621 ccgagatggg cggcaaacct agaagaaaga acccccagga gggcctgtat aacgagctcc
1681 agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgaa agaagaagag
1741 gcaagggcca cgacggcctc taccagggct taagcacagc tacaaaggac acctacgacg
1801 ccctgcacat gcaggccctg ccccctagat ga(서열 번호 71)
CAR5는 (서열 번호 71)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 양태에서, (서열 번호 71)의 핵산 서열은 Myc(인간 c-Myc 전암유전자) 에피토프 태그 및 Myc 태그와 NKG2D 세포외 도메인 사이의 링커를 인코딩하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. (서열 번호 71)의 핵산 서열은 위치 486 내지 548에서 CD8a 신호 펩타이드를 인코딩하며, 이러한 신호 펩타이드는 상이한 신호 펩타이드에 대해 치환될 수 있다.
NKG2D CAR6이라고 하는 제6 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8알파 힌지, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ε 신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 72). 일 양태에서, CAR6은 하기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다:
1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc
61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga
121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg
181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca
241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa
301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc
361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca
421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg
481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg
541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag
601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt
661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt
721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac
781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt
841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga
901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc
961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa
1021 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag
1081 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg
1141 cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca
1201 aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa
1261 ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg
1321 aaaagaaccg aaaagcaaaa gccaagcctg ttacaagagg agcaggggca ggaggccgac
1381 agagagggca aaacaaagaa aggcccccgc ccgtcccaaa cccggattat gagccaatta
1441 ggaagggtca gagagacctg tattctgggc tcctgagagt gaagttcagc aggagcgcag
1501 acgcccccgc gtaccagcaa gggcagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa
1561 gagaggagta cgatgttttg gacaagaggc gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc
1621 cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg
1681 aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc
1741 tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaagctc
1801 tgccccctcg ctga(서열 번호 73)
CAR6은 (서열 번호 73)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 양태에서, (서열 번호 73)의 핵산 서열은 Myc(인간 c-Myc 전암유전자(proto-oncogene)) 에피토프 태그 및 Myc 태그와 NKG2D 세포외 도메인 사이의 링커를 인코딩하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. (서열 번호 73)의 핵산 서열은 위치 486 내지 548에서 CD8a 신호 펩타이드를 인코딩하며, 이러한 신호 펩타이드는 상이한 신호 펩타이드에 대해 치환될 수 있다.
NKG2D CAR7이라고 하는 제7 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8알파 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ε 신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 74). 일 양태에서, CAR7은 하기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다:
1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc
61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga
121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg
181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca
241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa
301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc
361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca
421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg
481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg
541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag
601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt
661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt
721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac
781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt
841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga
901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc
961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa
1021 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag
1081 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg
1141 tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt
1201 tctgggtcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac
1261 cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag
1321 gaggatgtga aaagaaccga aaagcaaaag ccaagcctgt tacaagagga gcaggggcag
1381 gaggccgaca gagagggcaa aacaaagaaa ggcccccgcc cgtcccaaac ccggattatg
1441 agccaattag gaagggtcag agagacctgt attctgggct cctgagagtg aagttcagca
1501 ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcaag ggcagaacca gctctataac gagctcaatc
1561 taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagaggcg tggccgggac cctgagatgg
1621 ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata
1681 agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc
1741 acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca
1801 tgcaagctct gccccctcgc tga(서열 번호 75)
CAR7은 (서열 번호 75)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 양태에서, (서열 번호 75)의 핵산 서열은 Myc(인간 c-Myc 전암유전자(proto-oncogene)) 에피토프 태그 및 Myc 태그와 NKG2D 세포외 도메인 사이의 링커를 인코딩하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. (서열 번호 75)의 핵산 서열은 위치 486 내지 548에서 CD8a 신호 펩타이드를 인코딩하며, 이러한 신호 펩타이드는 상이한 신호 펩타이드에 대해 치환될 수 있다.
NKG2D CAR8이라고 하는 제8 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 NKG2D 세포외 도메인, CD8알파 힌지, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ε 신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함한다. 이 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRILRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열 번호 76). 일 양태에서, CAR8은 하기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다:
1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc
61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga
121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg
181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca
241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa
301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc
361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca
421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg
481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg
541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag
601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt
661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt
721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac
781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt
841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga
901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc
961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa
1021 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag
1081 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg
1141 tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt
1201 tctgggtcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac
1261 cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag
1321 gaggatgtga aaagaaccgc aaagcaaagg caaaacccgt cacacgagga gcgggcgcag
1381 ggggacgaca acgcggtcag aataaggaac gcccgcctcc agtaccaaat ccagattatg
1441 aaccaattcg gaagggacaa cgcgatctct actccggtct caatcagagg cgaattctga
1501 gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcaagggcag aaccagctct
1561 ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc
1621 gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg
1681 aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc
1741 ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct
1801 acgacgccct tcacatgcaa gctctgcccc ctcgctga(서열 번호: 77)
CAR8은 (서열 번호 77)과 적어도 75%의 서열 동일성(예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성; 예를 들어, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 또는 95% 내지 100%)을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 특정한 양태에서, (서열 번호 77)의 핵산 서열은 Myc(인간 c-Myc 전암유전자(proto-oncogene)) 에피토프 태그 및 Myc 태그와 NKG2D 세포외 도메인 사이의 링커를 인코딩하는 서열을 제거하도록 변형될 수 있다. (서열 번호 77)의 핵산 서열은 위치 486 내지 548에서 CD8a 신호 펩타이드를 인코딩하며, 이러한 신호 펩타이드는 상이한 신호 펩타이드에 대해 치환될 수 있다.
실시예 2
형질도입 효율
렌티바이러스 벡터를 모든 T-세포 형질도입에 사용하였다. HPV16+ E711-19 에피토프를 표적화하는 조작된 TCR을 NKG2D CAR 작제물에 의한 단일형질도입 또는 공동형질도입에 사용하였다(문헌[Jin B.Y. et al., 2018 JCI Insight]). 건강한 공여자로부터 수득된 이전에 동결보존된 PBMC를 해동시키고, 300 IU의 IL-2가 보충된 Optimizer T 세포 배지에서 항-CD3으로 48시간 동안 활성화시켰다. PBMC를, HPV16+ E711-19 에피토프를 표적화하는 조작된 TCR(이 실시예 및 아래 실시예에서 HPV-TCR로 지칭됨), NKG2D CAR, 또는 둘 다의 작제물을 함유하는 레트로바이러스로 형질도입하였다. 형질도입된 T 세포를 IL-7(10 ng/mL), IL-15(10 ng/mL) 및 Akt VIII 저해제(AKTi, 1 μM)가 보충된 Optimizer T 세포 배지에서 10일 동안 확장시켰다. 형질도입 효율을 T 세포 활성화 후 제8 일 및 제15 일에 유세포분석법에 의해 측정하였다. TCR 형질도입 효율을 검출하기 위한 항체는 항-마우스 TCRβ 클론 H57-597(BioLegend)을 포함하고, NKG2D 형질도입 효율을 검출하기 위한 항체는 항-인간 CD314 클론 1D11(BioLegend)을 포함한다. 모든 유세포분석 데이터를 BD FACSDiva™ 소프트웨어를 이용하여 LSR-Fortessa(BD LSR Fortessa™)에서 수집하고, 데이터를 FlowJo(모두 BD Sciences)를 사용하여 분석하였다. 모든 항체 염색을 1% BSA를 함유하는 PBS에서 4℃에서 수행하였다.
표 4는 유세포분석법에 의한 배양 제8 일 및 제15 일 후, 형질도입된 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포의 발현 수준(평균 형광 강도(MFI) 및 양성 세포 %)을 보여준다. 높은 형질도입 효율은 모든 작제물에서 관찰되었다. 작은 NKG2D+ 단독 집단은 HPV-TCR + NKG2D CAR1 군 및 HPV-TCR + NKG2D CAR2 군에 존재한다.
[표 4]
Figure pct00006
표 19는 Myc 염색 및 유세포분석법에 의한 발현 측정에 기초하여 배양 제7/8 일 후, 형질도입된 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포의 발현 수준(평균 형광 강도(MFI) 및 양성 세포 %)을 보여준다. 높은 형질도입 효율은 모든 작제물에서 관찰되었다.
[표 19]
Figure pct00007
실시예 3
확장 및 생존력
세포 확장을 Vi-세포 XR 세포 카운터(Beckman Coulter)에 의해 측정하고, 세포 생존력을 얼음 상에서 PBS 중 Live/Dead Blue(ThermoFisher)로 세포를 20분 동안 염색함으로써 측정하고, T 세포 활성화 후 제8 일 및 제15 일에 유세포분석법에 의해 분석하였다(표 5). 형질전환된 T 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 표 5는 IL-7, IL-15 및 AKTi가 보충된 Optimizer 배지로 배양된 형질도입된 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포의 확장 및 세포 생존력을 보여준다. NKG2D CAR1 단독, NKG2D CAR2 단독, HPV-TCR + NKG2D CAR1 및 HPV-TCR + NKG2D CAR2는 HPV-TCR 단독 또는 형질도입되지 않은 T 세포보다 큰 수준의 증식을 나타내었다.
[표 5]
Figure pct00008
실시예 4
생성물 속성 결정
기억 표현형 및 CD4/CD8 비를 T 세포 활성화 후 제8 일에 유세포분석법에 의해 측정하였다(표 6). 기억 표현형을 평가하는 데 사용된 항체는 항-인간 CD45RA 클론 HI100(BioLegend), 항-인간 CD45RO 클론 UCHL1(BioLegend), 항-인간 CCR7 클론 G043H7(BioLegend), 항-인간 CD62L 클론 DREG-56(BioLegend)을 포함한다. CD4/CD8 비를 평가하는 데 사용된 항체는 항-인간 CD3 클론 SK7(BioLegend), 항-인간 CD4 클론 RPA-T4(BioLegend) 및 항-인간 CD8 클론 SK1(BioLegend)을 포함한다. 형질전환된 T 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 기억 표현형을 하기와 같이 평가하였다: 무경험 T 세포(CD45RA+ CD45RO- CCR7+ CD62L+); 중심(central) 기억 T 세포(CD45RA- CD45RO+ CCR7+ CD62L+); 이펙터 기억 T 세포(CD45RA- CD45RO+ CCR7- CD62L-); 말단(terminal) 이펙터 T 세포(CD45RA+ CD45RO- CCR7- CD62L-). 모든 유세포분석 데이터를 BD FACSDiva™ 소프트웨어를 이용하여 LSR-Fortessa(BD LSR Fortessa™)에서 수집하고, 데이터를 FlowJo(모두 BD Sciences)를 사용하여 분석하였다. 모든 항체 염색을 1% BSA를 함유하는 PBS에서 4℃에서 수행하였다.
제8 일 후 보충 IL-2가 있는 TC 배지로 배양된 형질도입된 CD3+ T 세포 및 형질도입되지 않은 CD3+ T 세포의 CD4/CD8 비 및 기억 표현형이 표 6에 제시된다. 형질도입된 T 세포와 형질도입되지 않은 T 세포 사이에서 CD4/CD8 비의 어떠한 유의한 변화도 없었다. 형질도입되지 않은 T 세포 및 HPV-TCR 단독 형질도입된 T 세포는 NKG2D CAR1 단독, NKG2D CAR2 단독, HPV-TCR + NKG2D CAR1, 또는 HPV-TCR + NKG2D CAR2로 형질도입된 T 세포보다 더 큰 무경험(
Figure pct00009
) T 세포 구획을 나타내었다. 이에 더하여, 형질도입되지 않은 T 세포 및 HPV-TCR 단독 형질도입된 T 세포는 NKG2D CAR1 단독, NKG2D CAR2 단독, HPV-TCR + NKG2D CAR1, 또는 HPV-TCR + NKG2D CAR2로 형질도입된 T 세포보다 더 작은 기억 T 세포 구획을 나타내었다.
[표 6]
Figure pct00010
실시예 5
세포독성
HPV-TCR 형질도입된 T 세포는 HPV16+ 종양 세포주를 효과적으로 제거하고 높은 수준의 IFNγ를 생산하는 것으로 이전에 제시되었다. HPV-TCR을 이용한 I상 임상 시험으로부터 환자 종양의 시퀀싱(문헌[Nagarsheth N.B. et al., 2021 Nat Med])은 종양이 고도로 이종성이고 MHC-I 항원 가공 및 제시 경로에서 돌연변이를 나타낼 수 있어서, 이로써 종양을 HPV-TCR 조작된 입양 TCR-T 치료법에 내성이 되게 함을 시사한다. 환자 종양 데이터를 모델링하기 위해, CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 β2M을 넉아웃시킴으로써(β2MKO) HPV16+ 종양 세포주(CaSki)가 A*02:01을 결여하도록 조작하였다(문헌[Vakulskas CA et al., 2018 Nature]). 부가적으로, 통상적으로 HLA-A*02:01이 결여된 SiHa HPV16+ 종양 세포주를 레트로바이러스를 사용하여 A*02:01을 과발현하도록 조작하였다. CaSki 및 SiHa 종양 세포주는 높은 E7 발현 및 낮은 E7 발현으로 인해 각각 선택되었다. 형질도입되지 않은 PBMC 및 형질도입된 PBMC를 이용한 온전한 HLA-A*02:01이 있거나 없는 이들 종양 세포주의 사멸화를 표 7 및 8에 제시된 다양한 이펙터-대-표적(E:T) 비의 xCELLigence RTCA MP(Agilent Technologies) 플랫폼을 사용하여 평가하였다.
표 7은 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 96웰 xCELLigence 플레이트에서 WT 또는 β2MKO CaSki 세포와 함께 다양한 E:T 비로 공동배양된 형질도입된 T 세포(실시예 2 참조)의 결과를 보여준다. 임피던스 값(IV)을 72시간 이후에 측정하였다. 대조군 IV는 형질도입되지 않은 T 세포의 임피던스 값을 나타내고, 실험 IV는 HPV-TCR 단독, NKG2D CAR1 단독, NKG2D CAR2 단독, HPV-TCR + NKG2D CAR1, 또는 HPV-TCR + NKG2D CAR2의 임피던스 값을 나타낸다. 세포독성 퍼센트를 하기 식에 의해 계산하였다:
%Cytotoxicity = 1 ― (Control IV ― Experimental IV) * 100
[표 7]
Figure pct00011
표 8은 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 96웰 xCELLigence E-플레이트에서 다양한 E:T 비로 WT 또는 A*02:01 발현 SiHa 세포와 함께 공동배양된 형질도입된 T 세포(실시예 2 참조)의 결과를 보여준다. 임피던스 값(IV)을 72시간 이후에 측정하고, 세포독성 퍼센트를 위에 기재된 바와 같이 계산하였다.
[표 8]
Figure pct00012
HPV-TCR 형질도입된 T 세포는 WT CaSki 및 A*02 SiHa 세포주를 성공적으로 제거하였으나, β2M KO CaSki 또는 WT SiHa 세포주는 제거할 수 없었다. 중요하게는, NKG2D CAR 형질도입된 T 세포 및 HPV-TCR과 함께 NKG2D CAR이 공동형질도입된 T 세포는 이의 HLA-A*02:01 상태와는 독립적으로 CaSki 및 SiHa 세포주를 성공적으로 사멸화시킬 수 있었다.
실시예 6
사이토카인 생산
24시간의 배양 후 실시예 5에 사용된 xCELLigence 96-웰 플레이트로부터 상층액을 회수함으로써 사이토카인 생산을 측정하였다. 사이토카인 수준을 Meso Sector S 600 플랫폼(Institute for Biopharmaceutical Research, Inc.)을 사용하여 측정하였다. HPV-TCR + NKG2D CAR T 세포로부터의 IFNγ 생산은 WT 또는 A*02 SiHa 세포와 함께 공동배양되었을 때 HPV-TCR 형질도입된 세포와 유사하였다. 그러나, HPV-TCR + NKG2D CAR T 세포로부터의 IFNγ 생산은 β2MKO CaSki 또는 WT SiHa 세포와 함께 공동배양되었을 때 HPV-TCR 형질도입된 T 세포와 비교하여 증가하였고, 이는 세포독성 데이터와 상관관계가 있다(표 9 및 표 10 참조). 이들 데이터는 NKG2D CAR T 세포가, HPV-TCR 형질도입된 T 세포가 표적 세포를 제거할 때 공칭(nominal) 수준의 IFNγ를 분비하지만, HPV-TCR 형질도입된 T 세포가 표적 세포를 제거하지 않았을 때 충분한 IFNγ를 생산함을 보여주었다. 흥미롭게도, NKG2D CAR1 및 HPV-TCR + NKG2D CAR1 형질도입된 T 세포는 NKG2D CAR2 또는 HPV-TCR + NKG2D CAR2 형질도입된 T 세포보다 큰 수준의 IFNγ를 생산한다.
표 9은 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 96웰 xCELLigence T-플레이트에서 WT 또는 β2MKO CaSki 세포와 함께 다양한 E:T 비로 공동배양된 형질도입된 T 세포의 결과를 보여준다. 24시간 후, 배지 상층액을 추출하고, Meso Sector S 600 플랫폼을 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 IFNγ 농도(pg/mL)를 결정하기 위해 가공하였다.
[표 9]
Figure pct00013
표 10은 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 96웰 xCELLigence 플레이트에서 다양한 E:T 비로 WT 또는 A*02 SiHa 세포와 함께 공동배양된 형질도입된 T 세포의 결과를 보여준다. 24시간 후, 배지 상층액을 추출하고, Meso Sector S 600 플랫폼을 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여 IFNγ 농도(pg/mL)를 결정하기 위해 가공하였다.
[표 10]
Figure pct00014
실시예 7
형질도입된 T 세포의 장기간 확장 및 고갈
장기간 사멸화 검정에서 반복된 항원 자극은 T 세포를 기능적으로 고갈시키고, 생체내 효능과 상관관계가 있는 것으로 여겨진다. 일련의 항원 자극 검정을 완료하기 위해, 표적 세포(WT CaSki, β2MKO CaSki, WT SiHa, 또는 A*02 SiHa)를 2일 내지 3일마다 형질도입된 T 세포에 첨가하였다(실시예 2 참조). 5번째 자극 후, WT CaSki, β2MKO CaSki, WT SiHa, 또는 A*02 SiHa의 세포독성을 xCELLigence RTCA MP 플랫폼을 사용하여 표 11 및 12에 제시된 다양한 E:T 비로 평가하였다. NKG2D CAR의 첨가에도 불구하고, HPV-TCR + NKG2D CAR 형질도입된 T 세포는 일련의 자극 후 이의 표적을 성공적으로 제거하였고, HPV-TCR 단독 형질도입된 T 세포와 비교하여 높은 수준의 확장을 나타내었다(표 11, 표 12 참조).
표 11은 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 WT CaSki 세포와 함께 3:1 E:T 비로 공동배양된 형질도입된 T 세포의 결과를 보여준다. 그 후에, WT CaSki 세포를 2일 내지 3일마다 첨가하였다. 5번째 자극 후, T 세포를 96웰 xCELLigence 플레이트에서 WT 또는 β2MKO CaSki 세포와 함께 다양한 E:T 비로 공동배양하였다. 임피던스 값(IV)을 72시간 이후에 측정하고, 세포독성을 위에 기재된 바와 같이 계산하였다.
[표 11]
Figure pct00015
표 12는 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 WT CaSki 세포와 함께 3:1 E:T 비로 공동배양된 형질도입된 T 세포의 결과를 보여준다. 그 후에, WT CaSki 세포를 2일 내지 3일마다 첨가하였다. 5번째 자극 후, T 세포를 96웰 xCELLigence 플레이트에서 WT 또는 A*02 SiHa 세포와 함께 다양한 E:T 비로 공동배양하였다. 임피던스 값(IV)을 72시간 이후에 측정하고, 세포독성을 위에 기재된 바와 같이 계산하였다.
[표 12]
Figure pct00016
실시예 8
NKG2D CAR 및 HPV16+ 종양 세포주와 함께 공동배양된 HPV-TCR과 함께 공동발현되는 NKG2D CAR의 세포독성 및 사이토카인 생산
NKG2D 기초 CAR의 안전성을 평가하기 위해, NKG2D CAR1 단독, NKG2D CAR2 단독, HPV-TCR + NKG2D CAR1, 및 HPV-TCR + NKG2D CAR2 형질도입된 T 세포를 대체로 NKG2D 리간드 음성인 C33A 세포주 및 1차 정상 경추 상피 세포와 함께 표 13 및 표 14에 제시된 바와 같이 다양한 E:T 비로 공동배양하였다. 1차 정상 경추 상피 세포는 더 높은 NKG2D 리간드 발현으로 인해 선택되었다. xCELLigence RTCA MP 플랫폼으로부터의 세포독성 데이터 및 Meso Sector S 600 플랫폼으로부터의 IFNγ 생산은 C33A 세포와 1차 정상 경추 상피 세포 둘 다에 대한 낮은 반응성을 나타내었다. 이들 데이터는 NKG2D CAR2가 강한 안전성 프로파일을 갖고 표적외 효과를 나타낼 가능성이 낮음을 시사한다.
표 13는 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 96웰 xCELLigence E-플레이트에서 C33A 또는 1차 정상 경추 상피 세포와 함께 다양한 E:T 비로 공동배양된 형질도입된 T 세포의 결과를 보여준다. 24시간 후, 배지 상층액을 추출하고, Meso Sector S 600 플랫폼을 사용하여 IFNγ 농도(pg/mL)를 결정하기 위해 가공하였다.
[표 13]
Figure pct00017
표 14는 제8 일에 분류된 다음, 제10 일에 96웰 xCELLigence E-플레이트에서 C33A 세포주 또는 1차 정상 경추 상피 세포와 함께 다양한 E:T 비로 공동배양된 형질도입된 T 세포의 결과를 보여준다. 24시간 후, 배지 상층액을 추출하고, Meso Sector S 600 플랫폼을 사용하여 IFNγ 농도(pg/mL)를 결정하기 위해 가공하였다.
[표 14]
Figure pct00018
실시예 9
마우스 이종이식 모델에서 HPV16+ 종양에 대한 NKG2D CAR의 생체내 효능
WT와 β2MKO HPV16+ 고형 종양을 둘 다 제거하는 데 있어서 HPV-TCR 단독, NKG2D CAR 단독, 및 HPV-TCR + NKG2D CAR의 생체내 효능을 결정하기 위해, 5E6 WT CaSki 및 5E6 β2MKO CaSki 세포를 6 내지 8주령 암컷 NSG 마우스(NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/ SzJ)의 좌측 옆구리 및 우측 옆구리에 각각 피하 이식하였다. 5개의 연구군을 포함시켰다: 비히클 대조군(PBS), 형질도입되지 않은 T 세포(NTD), HPV-TCR 단독, NKG2D CAR2 단독, 및 HPV-TCR + NKG2D CAR2. WT CaSki 세포의 종양 부피가 대략 70 mm3에 도달하고 β2MKO CaSki 세포가 대략 30 mm3에 도달하였을 때, 마우스당 20 × 106개의 T 세포를 제6 일에 입양 전달하였다. 어떠한 IL-2 보충도 첨가하지 않았다. 종양을 3일 내지 4일마다 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 마우스 체중을 기록하였다. T 세포 입양 전달 후 24시간째에, 그리고 그 후에 매주 말초 혈액을 수집하였다. 말초 혈액에서 T 세포의 지속성을 유세포분석법을 통해 특징화하였다. 말초 혈액에서 T 세포 지속성을 평가하기 위한 항체는 항-마우스 CD45 클론 30-F11(BioLegend), 항-인간 CD45 클론 HI30(BioLegend), 항-인간 CD4 클론 RPA-T4(BioLegend), 항-인간 CD8 클론 SK1(BioLegend), 항-인간 CD279 클론 EH12.2H7(BioLegend), 항-인간 HLA-DR 클론 L243(BioLegend), 항-마우스 TCRβ 클론 H57-597(BioLegend), 항-인간 CD314 클론 1D11(Biolegend) 및 L/D Blue(ThermoFisher)를 포함한다. 모든 유세포분석 데이터를 BD FACSDiva™ 소프트웨어를 이용하여 LSR-Fortessa(BD LSR Fortessa™)에서 수집하고, 데이터를 FlowJo(모두 BD Sciences)를 사용하여 분석하였다. 모든 항체 염색을 1% BSA를 함유하는 PBS에서 4℃에서 수행하였다. 연구 지속기간은 62일이었다. 전반적으로, HPV-TCR은 좌측 옆구리에서 WT CaSki 세포의 종양 성장을 제어할 수 있었으나, 우측 옆구리에 이식된 β2MKO CaSki 세포의 종양 제어의 어떠한 징후도 보여주지 않았다. 대조적으로, NKG2D CAR2 단독 및 HPV-TCR + NKG2D CAR2는 WT 세포와 β2MKO CaSki 세포 둘 다의 종양 성장을 성공적으로 제어하였다(표 15, 표 16 참조). 더욱이, 종양-보유 마우스의 체중은 종양 크기로 인해 마우스가 연구에서 누락되어야 할 때까지 입양 T 세포 전달 후 처음 몇 주 동안 유의하게 변동하지 않았다. (표 17 참조). NKG2D CAR2 단독 또는 HPV-TCR + NKG2D CAR2 T 세포를 받은 모든 마우스에서 어떠한 관찰 가능한 종양이 없음에도 불구하고, 대부분의 마우스는 종양 성장의 재발을 실증하였고, 이는 형질도입된 T 세포의 지속성의 결여를 시사한다. 이는 입양 T 세포 전달 후 3주째에 말초 혈액 내 형질도입된 T 세포의 부재에 의해 추가로 뒷받침된다(표 18 참조).
[표 15]
Figure pct00019
Figure pct00020
[표 16]
Figure pct00021
Figure pct00022
[표 17]
Figure pct00023
Figure pct00024
[표 18]
Figure pct00025
일반적으로, 하기 청구범위에서 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시형태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이러한 청구범위에 부여된 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 이에, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> KITE PHARMA, INC. <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR <130> K-1106-WO-PCT <140> PCT/US2022/030557 <141> 2022-05-23 <150> 63/192,296 <151> 2021-05-24 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 2 Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 3 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 20 25 30 Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser 35 40 45 Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn 85 90 95 Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala 100 105 110 Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr 115 120 125 Ile Cys Met Gln Arg Thr Val 130 135 <210> 4 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 ttattcaacc aagaagtcca gattcccttg accgaaagtt actgcggccc atgtccgaaa 60 aactggatat gttataaaaa taactgttac cagttcttcg atgaatctaa aaactggtat 120 gagagccagg catcttgtat gtctcaaaat gccagcctgc tcaaagtata cagcaaggag 180 gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcactgga tgggattggt acacattccc 240 acaaatggat cttggcagtg ggaagacggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300 attgaaatgc agaagggaga ctgcgcactc tatgcatcga gctttaaagg ttatatagaa 360 aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc atgcaaagga ctgta 405 <210> 5 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 ttattcaacc aagaagtcca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60 aactggatat gttacaaaaa taactgttac caattcttcg atgaaagtaa aaactggtat 120 gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaggag 180 gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240 acaaatggat cttggcagtg ggaagacggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300 attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcatcga gctttaaagg ctatatagaa 360 aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc atgcaaagga ctgtg 405 <210> 6 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gly Ser 1 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 ggatcc 6 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gggtcc 6 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ggcggtggaa gcggaggagg ttcc 24 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 gggagcacta gcggctctgg caaacctgga tctggcgagg gatctaccaa gggc 54 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 gggagcacaa gcggctctgg caaacctgga tctggcgagg gatctaccaa gggc 54 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 gggagcacaa gcggctctgg caaacctgga tccggcgagg gatctaccaa gggc 54 <210> 15 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 16 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcaacccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 17 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 acaacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcaacccctg 60 tccctgaggc ctgaagcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgctt gtgac 135 <210> 18 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcaacccctg 60 tccctgcgcc ccgaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 1 5 10 15 His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 20 25 30 <210> 20 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca 60 agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc 90 <210> 21 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttatt gc 72 <210> 27 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 28 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg gcagaaccaa 60 ctctataacg agctcaatct aggaaggaga gaagagtacg atgttctaga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagcca cgaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aacgaactac aaaaagataa aatggcggag gcctacagtg agattggcat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggcc tcagtacagc caccaaggac 300 acctatgacg cccttcacat gcaagctctg ccccctcgc 339 <210> 29 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aacgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattggcat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgacggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 30 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagaggcgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 31 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser 35 40 45 Gly Leu 50 <210> 32 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 aagaaccgaa aagcaaaagc caagcctgtt acaagaggag caggggcagg aggccgacag 60 agagggcaaa acaaagaaag gcccccgccc gtcccaaacc cggattatga gccaattagg 120 aagggtcaga gagacctgta ttctgggctc 150 <210> 33 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 35 40 <210> 34 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 aaacgaggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 acaactcagg aggaggatgg ctgtagctgc cgattcccgg aagaagaaga aggtggctgt 120 gaa 123 <210> 35 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 40 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 atggctcttc ctgtgactgc actactgctg cccctggcct tacttcttca tgctgcgcgt 60 cct 63 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 42 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 165 170 175 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 180 185 190 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 ttattcaacc aagaagtcca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60 aactggatat gttacaaaaa taactgttac caattcttcg atgaaagtaa aaactggtat 120 gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaggag 180 gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240 acaaatggat cttggcagtg ggaagacggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300 attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcatcga gctttaaagg ctatatagaa 360 aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc atgcaaagga ctgtgaccac gacgccagcg 420 ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcaac ccctgtccct gcgcccagag 480 gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 600 gcctttatta ttttctgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 660 ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 720 gaagaagaag aaggaggatg tgaaaagaac cgaaaagcaa aagccaagcc tgttacaaga 780 ggagcagggg caggaggccg acagagaggg caaaacaaag 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gagcgcagac gcccccgcgt accagcaagg gcagaaccag 60 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagaggcgt 120 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaagctctg ccccctcgct ga 342 <210> 61 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser 35 40 45 Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 50 55 <210> 62 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 62 aagaaccgca aagcaaaggc aaaacccgtc acacgaggag cgggcgcagg gggacgacaa 60 cgcggtcaga ataaggaacg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 20 25 30 Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser 35 40 45 Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn 85 90 95 Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala 100 105 110 Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr 115 120 125 Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 130 135 140 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 145 150 155 160 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 165 170 175 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 180 185 190 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 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tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420 gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200 aaagccaaag cgccgccacc atggctcttc ctgtgacagc tcttctgctg cccctggccc 1260 tgcttctgca tgctgctaga cctgagcaaa agttgatttc tgaggaagac ctcgccggca 1320 gtttattcaa ccaagaagtc caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta 1380 agaactggat atgttacaaa aataactgtt accaattctt cgatgaatct aagaattggt 1440 atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tcttaaagta tacagcaaag 1500 aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc 1560 caacaaatgg atcttggcag tgggaagacg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa 1620 taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcatc gagctttaaa ggctatatag 1680 aaaactgttc aactccaaat acatatattt gcatgcaaag gactgtgacc acgacgccag 1740 cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca acccctgtcc ctgaggcctg 1800 aagcgtgccg gccagcggcg ggcggcgcag tgcacacgag agggctggac ttcgcctgtg 1860 atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta 1920 tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta 1980 tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag 2040 aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc 2100 agcaagggca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg 2160 ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc 2220 ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga 2280 ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca 2340 gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca agctctgccc cctcgctga 2399 <210> 68 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 20 25 30 Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser 35 40 45 Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn 85 90 95 Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala 100 105 110 Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr 115 120 125 Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 130 135 140 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 145 150 155 160 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 165 170 175 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 180 185 190 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys 195 200 205 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 210 215 220 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 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acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420 gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080 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agttcctgcc ccggctcagg 180 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 240 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 300 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 360 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 420 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 480 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 540 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 600 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 660 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 720 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 780 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 840 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 900 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 960 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccaccac tcctgctcca agacctccta 1020 cccccgctcc tacaatcgcc agccaacctc tgagcctgag accggaggca tgcagacctg 1080 cggcaggggg agcagttcac acaagaggct tggacttcgc ttgcgacatc tacatctggg 1140 cccctctggc cggcacatgc ggagttcttc ttcttagcct ggtgatcacc ctgtactgca 1200 agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga cctgtgcaga 1260 ccacacagga ggaagacggc tgcagctgta gattccccga ggaagaggag ggcggctgtg 1320 agctgaagaa ccgcaaagca aaggcaaaac ccgtcacacg aggagcgggc gcagggggac 1380 gacaacgcgg tcagaataag gaacgcccgc ctccagtacc aaatccagat tatgaaccaa 1440 ttcggaaggg acaacgcgat ctctactccg gtctcaatca gaggcgaatt ctgagagtta 1500 agttcagcag gagcgccgac gcccctgcct accagcaagg acagaatcaa ctgtacaacg 1560 agctgaacct gggcagacgg gaggaatacg atgtgctgga caagaggaga ggcagagacc 1620 ccgagatggg cggcaaacct agaagaaaga acccccagga gggcctgtat aacgagctcc 1680 agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgaa agaagaagag 1740 gcaagggcca cgacggcctc taccagggct taagcacagc tacaaaggac acctacgacg 1800 ccctgcacat gcaggccctg ccccctagat ga 1832 <210> 72 <211> 408 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aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 720 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 780 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 840 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 900 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 960 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa 1020 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag 1080 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg 1140 cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca 1200 aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa 1260 ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg 1320 aaaagaaccg aaaagcaaaa gccaagcctg ttacaagagg agcaggggca ggaggccgac 1380 agagagggca aaacaaagaa aggcccccgc ccgtcccaaa cccggattat gagccaatta 1440 ggaagggtca gagagacctg tattctgggc tcctgagagt gaagttcagc aggagcgcag 1500 acgcccccgc gtaccagcaa gggcagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa 1560 gagaggagta cgatgttttg gacaagaggc gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc 1620 cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg 1680 aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc 1740 tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaagctc 1800 tgccccctcg ctga 1814 <210> 74 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 20 25 30 Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser 35 40 45 Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn 85 90 95 Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala 100 105 110 Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr 115 120 125 Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 130 135 140 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 145 150 155 160 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 165 170 175 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 180 185 190 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys 195 200 205 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 210 215 220 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 225 230 235 240 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 245 250 255 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 260 265 270 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 275 280 285 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Arg Val Lys Phe Ser 290 295 300 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 305 310 315 320 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 325 330 335 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 340 345 350 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 355 360 365 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 370 375 380 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 385 390 395 400 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 405 410 <210> 75 <211> 1823 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 75 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc 60 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga 120 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 180 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 240 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 300 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 360 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 420 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 480 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 540 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 600 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 660 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 720 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 780 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 840 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 900 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 960 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa 1020 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag 1080 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg 1140 tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt 1200 tctgggtcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 1260 cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 1320 gaggatgtga aaagaaccga aaagcaaaag ccaagcctgt tacaagagga gcaggggcag 1380 gaggccgaca gagagggcaa aacaaagaaa ggcccccgcc cgtcccaaac ccggattatg 1440 agccaattag gaagggtcag agagacctgt attctgggct cctgagagtg aagttcagca 1500 ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcaag ggcagaacca gctctataac gagctcaatc 1560 taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagaggcg tggccgggac cctgagatgg 1620 ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata 1680 agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc 1740 acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca 1800 tgcaagctct gccccctcgc tga 1823 <210> 76 <211> 416 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe 20 25 30 Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser 35 40 45 Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn 85 90 95 Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala 100 105 110 Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr 115 120 125 Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 130 135 140 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 145 150 155 160 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 165 170 175 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 180 185 190 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys 195 200 205 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 210 215 220 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 225 230 235 240 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 245 250 255 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 260 265 270 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 275 280 285 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile Leu 290 295 300 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 305 310 315 320 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 325 330 335 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 340 345 350 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 355 360 365 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 370 375 380 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 385 390 395 400 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 405 410 415 <210> 77 <211> 1838 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc 60 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga 120 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 180 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 240 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 300 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 360 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 420 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 480 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 540 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 600 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 660 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 720 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 780 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 840 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 900 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 960 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa 1020 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag 1080 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg 1140 tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt 1200 tctgggtcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 1260 cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 1320 gaggatgtga aaagaaccgc aaagcaaagg caaaacccgt cacacgagga gcgggcgcag 1380 ggggacgaca acgcggtcag aataaggaac gcccgcctcc agtaccaaat ccagattatg 1440 aaccaattcg gaagggacaa cgcgatctct actccggtct caatcagagg cgaattctga 1500 gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcaagggcag aaccagctct 1560 ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc 1620 gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg 1680 aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 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<223> This region may encompass 1-5 residues <220> <221> SITE <222> (1)..(50) <223> This sequence may encompass 1-5 "(G)n(S)n" repeating units wherein n = 1-5 <400> 78 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ser Ser 50

Claims (24)

  1. 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)로서,
    NKG2D 엑토 도메인(ecto domain);
    막관통 도메인(transmembrane domain);
    4-1BB 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
    CD3-제타(CD3-zeta) 신호전달 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서,
    CD8-알파 힌지 도메인(hinge domain)을 추가로 포함하는 CAR.
  3. 제2항에 있어서, CD8-알파 힌지 도메인은 서열 번호 15에 따른 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, NKG2D 엑토 도메인은 서열 번호 3에 따른 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  6. 제5항에 있어서, CD28 막관통 도메인은 서열 번호 21에 따른 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열 번호 33 또는 서열 번호 63에 따른 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CD3제타 신호전달 도메인은 서열 번호 27에 따른 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달 도메인은 CD3-엡실론 신호전달 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  10. 제9항에 있어서, CD3-엡실론 신호전달 도메인은 서열 번호 31 또는 서열 번호 61에 따른 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74 및 서열 번호 76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CAR.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 CAR을 인코딩하는 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75 및 서열 번호 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  14. 제12항 또는 제13항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제14항 또는 제12항 또는 제13항에 있어서, 조작된 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 재조합 벡터 또는 핵산.
  16. 제14항 또는 제12항 또는 제13항에 있어서, 종양 항원에 특이적인 제2 CAR을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 재조합 벡터 또는 핵산.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 종양 항원은 HPV―16 E6 및 HPV―16 E7, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7―H3, B7―H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4―1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, CS1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, Flt3, GD2, GD3, 글리피칸―3(GPC3: Glypican-3), HLA―Al + MAGEI, HLA―A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA―Al + NY―ES0―1, HLA―A2 + NY―ES0―1, HLA―A3 + NY―ES0―1, IL―llRα, IL―13Rα2, 람다, 루이스(Lewis)―Y, 카파, 메소텔린(Mesothelin), Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0―1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈(Survivin), TACI, TAG72, TEMs, 또는 VEGFRII를 포함하는, 재조합 벡터 또는 핵산.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 핵산 또는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  19. 제12항 또는 제13항의 핵산 또는 제14항의 재조합 벡터 및 종양 항원에 특이적인 조작된 T 세포 수용체(TCR) 또는 제2 CAR을 인코딩하는 핵산 또는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 종양 항원은 HPV―16 E6 및 HPV―16 E7, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, αvβ6 인테그린, BCMA, B7―H3, B7―H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD28, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD137(4―1BB), CD138, CD171, CEA, CSPG4, CLL-1, CS1, EGFR, ErbB2(HERII)를 포함한 EGFR 계열, EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FRa, Flt3, GD2, GD3, 글리피칸―3(GPC3), HLA―Al + MAGEI, HLA―A2 + MAGE1, HLAA3 + MAGE1, HLA―Al + NY―ES0―1, HLA―A2 + NY―ES0―1, HLA―A3 + NY―ES0―1, IL―llRα, IL―13Rα2, 람다, 루이스―Y, 카파, 메소텔린, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NYE-S0―1, PRAME, PSCA, PSMA, RORI, SSX, 서바이빈, TACI, TAG72, TEMs, 또는 VEGFRII를 포함하는, 숙주 세포.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC, T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제21항의 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 치료를 필요로 하는 환자에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제21항의 숙주 세포 또는 제22항의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 숙주 세포는 환자에 대해 동종이계(allogeneic)인, 방법.
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