TW202300528A - 嵌合抗原受體 - Google Patents

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塞繆爾 Ｔ 海勒
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Abstract

提供嵌合抗原受體(CAR)，其包含NGK2D ecto域。提供包含其之組成物、細胞及細胞療法。進一步提供治療方法。

Description

嵌合抗原受體
本揭露關於細胞療法之領域，且更具體而言為NKG2D嵌合抗原受體。
人類癌症就其本質而言包含了已發生基因或表觀遺傳轉化而變成異常癌細胞之正常細胞。在此過程中，癌細胞開始表現與正常細胞所表現者不同之蛋白質及其他抗原。此等異常腫瘤抗原可由人體先天性免疫系統使用以特異性靶向及殺滅癌細胞。然而，癌細胞會採用各種機制來防止免疫細胞（諸如T及B淋巴球）成功靶向癌細胞。
當前T細胞療法仰賴經富集或經修飾人類T細胞以靶向及殺滅患者中之癌細胞。為了增加T細胞靶向及殺滅特定癌細胞之能力，已開發出方法來工程改造T細胞以表現將T細胞對準特定目標癌細胞之建構體。包含能夠與特定腫瘤抗原交互作用之結合域的嵌合抗原受體(CAR)及經工程改造T細胞受體(TCR)讓T細胞能夠靶向及殺滅表現該特定腫瘤抗原之癌細胞。然而，一些腫瘤類型（且尤其是實體腫瘤）對於T細胞免疫療法具有抗性，因而需要發展針對T細胞免疫療法之腫瘤內在抗性機制的下一代增強策略。NKG2D配體會在大多數類型的腫瘤上表現，並且其相較於健康細胞會在腫瘤細胞上展現配體表現之相對選擇性，因而代表一種擴強傳統T細胞療法之目標。
揭示一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含NKG2D ecto域；跨膜域；4-1BB共刺激域；及信號傳導域，其包含CD3-ζ信號傳導域。在實施例中，該4-1BB共刺激域包含根據SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在實施例中，該CD3ζ信號傳導域包含根據SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。在實施例中，該CAR進一步包含CD8-α鉸鏈域。在實施例中，該CD8-α鉸鏈域包含根據SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。在實施例中，該NKG2D ecto域包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在實施例中，該跨膜域包含CD28跨膜區。在實施例中，該CD28跨膜域包含根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在實施例中，該信號傳導域進一步包含CD3-ε信號傳導域。在實施例中，該CD3-ε信號傳導域包含根據SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
揭示一種編碼所揭示之CAR之核酸及包含其之載體。在實施例中，該重組載體或核酸進一步包含編碼對於腫瘤抗原具有特異性之經工程改造之T細胞受體(TCR)之核酸。在實施例中，該重組載體或核酸進一步包含編碼具有對於腫瘤抗原具有特異性之第二CAR之核酸。在實施例中，該腫瘤抗原包含HPV–16 E6、HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、CS1。EGFR、EGFR家族包括ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、Flt3、FAP、胎兒AchR、FRa、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (Glypican–3, GPC3)、HLA–Al + MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–llRα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素(Mesothelin)、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NYE-S0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素(Survivin)、TACI、TAG72、TEM、或VEGFRII。
揭示一種宿主細胞，其經所揭示之核酸或重組載體轉化。在實施例中，宿主細胞係經所揭示之核酸或重組載體及編碼對於腫瘤抗原具有特異性之經工程改造之T細胞受體(TCR)或對於腫瘤抗原具有特異性之第二CAR之核酸或重組載體轉化。在實施例中，該腫瘤抗原包含HPV–16 E6、HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、CS1、EGFR、EGFR家族包含ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRa、Flt3、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、HLA–Al + MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–llRα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NYE-S0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素、TACI、TAG72、TEM、或VEGFRII。在實施例中，該宿主細胞包含誘導性多能性幹細胞(iPSC)、T細胞、或NK細胞。揭示一種醫藥組合物，其包含所揭示之T細胞及/或NK細胞。揭示一種治療有需要之患者中之疾病之方法，其包含將所揭示之T細胞及/或NK細胞、或該醫藥組成物投予至該患者。在實施例中，該宿主細胞對於該患者係同種異體的。
[相關申請案之交互參照]
本申請案主張2021年5月24日申請且標題為「Chimeric Antigen Receptor」之美國臨時專利申請案第63/192,296號之優先權，其全文以引用方式併入本文中。 用語
為了能更輕易理解本揭露，以下先定義某些用語。下列用語及其他用語之額外定義係在本說明書中各處闡述。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」、及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非有具體陳述或自上下文中明顯可知，如本文中所使用，用語「或(or)」係理解為涵括性的且同時涵蓋「或(or)」與「及(and)」。
在本文中，將使用用語「及/或(and/or)」之處認為是具體揭露兩個指定特徵或組分之各者（包含或不包含另一者）。因此，如用於諸如「A及/或B」之詞組中的用語「及/或」在本文中係意欲包括A及B；A或B；A（單獨）；及B（單獨）。同樣地，如用於諸如「A、B、及/或C」之詞組中的用語「及/或」係意欲涵蓋下列態樣之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。
如本文所使用，用語「例如( e.g.)」僅作為實例所使用，但不意欲限制，且不應解釋為僅參考本說明書中明確列舉之彼等項目。
用語「或更多(or more)」、「至少(at least)」、「多於(more than)」、及類似者，例如「至少一個(at least one)」應理解為包括但不限於至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、或多於所述值。亦包括的是任何更大之數目或其間之分數。
相反地，用語「不多於(no more than)」包括少於所述值之各值。例如，「不超過100個核苷酸」包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、及0個核苷酸。亦包括的是任何更小之數目或其間之分數。
用語「複數(plurality)」、「至少二(at least two)」、「二或更多(two or more)」、「至少第二(at least second)」、及類似者係理解為包括但不限於至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。亦包括的是任何更大之數目或其間之分數。
在本說明書各處，詞語「包含(comprising)」或諸如「comprises」或「comprising」之變型將理解為有意涵括所述元素、整數、或步驟、或元素組、整數組、或步驟組，但不排除任何其他元素、整數、或步驟、或元素組、整數組、或步驟組。應理解的是，在本文中以用語「包含」描述的態樣之處，亦另提供以用語「由…所組成(consisting of)」及/或「基本上由……所組成(consisting essentially of)」所描述之類似態樣。
除非特定陳述或從上下文顯而易見，否則用語「約(about)」係指藉由所屬技術領域中具有通常知識者所判定之特定值或組成之可接受誤差範圍內之一值或組成，其將部分取決於該值或組成如何測量或判定，即，測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含(comprising essentially of)」可意指根據所屬技術領域中之實踐之一或多個標準差內。「約」或「基本上包含」可意指至多10%之範圍（即±10%）。因此，「約」可理解為在10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、或0.001%內大於或小於所述值。舉例而言，約5 mg可包括在4.5 mg與5.5 mg之間的任何量。此外，特別是關於生物系統或程序，用語可意指至多一個數量級或至多5倍之值。除非另外說明，否則在本揭露中提供特定值或組成時，應假設「約」或「基本上包含」之意義係在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。
如本文中所述，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、或整數範圍係理解為涵括所述範圍內之任何整數值，並且在適當時亦涵括其分數（諸如整數之十分之一及百分之一），除非另有指示。
本文中所使用之單位、前綴、及符號係使用其國際單位制(SI)公認形式來提供。數字範圍涵括定義該範圍之數字。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語具有與本揭露所相關之技術領域中具有通常知識者一般理解者相同的意義。舉例而言，Juo，「The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology」，2 nded., (2001), CRC Press；「The Dictionary of Cell & Molecular Biology」，5 thed., (2013), Academic Press；及「The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology」，Cammack et al.eds., 2 nded, (2006), Oxford University Press，提供所屬技術領域中具有通常知識者用於本揭露之許多用語的一般詞典。
「投予(Administering)」係指使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何各種方法及遞送系統將藥劑實體引入至對象，諸如本文所揭示之經修飾之T細胞。用於本文所揭示之配方的例示性投予途徑包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎、或其他腸胃外投予途徑，例如藉由注射或輸注。片語「腸胃外投予(parenteral administration)」意指除腸內及局部(topical)投予以外的投予模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內(intralymphatic)、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊椎內、硬膜外、及胸骨內注射及輸注、以及體內電穿孔。在一些實施例中，配方經由非腸胃外途徑投予，例如經口。其他非腸胃外途徑包括局部、上皮或黏膜投予途徑，例如，鼻內、陰道內、直腸、舌下、或局部。亦可執行投予，例如一次、多次、及/或經過一或多個延伸週期。
用語「活化(activated)」及「活化(activation)」係指已足夠刺激以誘導可偵測細胞增殖之T細胞的狀態。在一個實施例中，活化亦可與誘導之細胞介素產生及可偵測效應功能相關。用語「經活化T細胞(activated T cell)」尤其係指增生之T細胞。透過單獨TCR產生的信號可能不足以完全活化T細胞，且亦可能需要一或多個二級或共刺激信號。因此，T細胞活化包含透過TCR/CD3複合物之初級刺激信號及一或多個二級共刺激信號。共刺激可藉由已接受初級活化信號之T細胞（諸如透過TCR/CD3複合物之刺激）的增生及/或細胞介素產生來證明。
用語「抗體(antibody)」(Ab)包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。一般而言，且抗體可包含至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈，其等藉由二硫鍵或其抗原結合分子互相連接。各H鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定域，CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域CL。VH及VL區可進一步細分成高度變異區，稱為互補決定區(CDR)，其中散布稱為架構區(FR)之更具保守性的區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，以下列順序從胺基端排列到羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組分(C1q)。一般而言，人類抗體係大約150 kD之四聚體藥劑，由兩個同一之重(H)鏈多肽（各自約50 kD）及兩個同一之輕(L)鏈多肽（各自約25 kD）組成，其等彼此締合成一般稱為「Y形狀」結構。重鏈及輕鏈藉由單一二硫鍵彼此相連或連接；其他兩個二硫鍵將重鏈鉸鏈區彼此連接，使得二聚體彼此連接並形成四聚體。天然產生之抗體亦經醣基化，例如在C H2域上。
用語「人類抗體(human antibody)」意欲包含具有可變及恆定域序列之抗體，其由人類免疫球蛋白序列或與其無法區分之序列產生、組裝、或衍生。在一些實施例中，抗體（或抗體組分）可視為「人類」，即使其胺基酸序列包含未由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之殘基或元素（例如藉由體外隨機或位點特異性突變誘發引入之變體，或藉由體內體細胞突變引入之變體）。用語「人源化(humanized)」意欲包含具有可變域之抗體，該可變域之序列衍生自非人類物種（例如小鼠）之可變域，經修飾以更類似於人類生殖系編碼之序列。在一些實施例中，「人源化」抗體包含一或多個實質上具有人類架構域之胺基酸序列的架構域、及一或多個實質上具有與非人類抗體之胺基酸序列相同之胺基酸序列的互補決定區。在一些實施例中，人源化抗體包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常係人類免疫球蛋白恆定域之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體可包含人類重鏈恆定域之C H1、鉸鏈、C H2、C H3、及可選地C H4區。
抗體可包括例如單株抗體、重組產生的抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（包括雙特異性抗體）、人類抗體、經工程改造之抗體、人源化抗體、嵌合抗體、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚物、抗體重鏈二聚物、抗體輕鏈-抗體重鏈對、體內抗體、抗體融合（本文有時稱為「抗體接合物」）、異源接合物抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fvs (scFv)、駱駝化抗體、親合體(affybody)、Fab片段、F(ab’) 2片段、二硫化物連接之Fvs (sdFv)、抗遺傳型（抗Id）抗體（包括例如抗-抗Id抗體）、微型體(minibody)、域抗體、合成抗體（本文有時稱為「抗體模擬物(antibody mimetic)」）、及上述任一者之抗原結合片段。在某些實施例中，本文所描述之抗體指多株抗體群。抗體亦可包含例如Fab'片段、Fd'片段、Fd片段、單離CDR、單鏈Fv、多肽-Fc融合、單域抗體（例如，鯊魚單域抗體，諸如IgNAR或其片段、及人類重鏈抗體(UniAb)）、駱駝科動物抗體、單鏈或Tandem雙抗體(TandAb®)、Anticalins®、Nanobodies®微型體、BiTE®、錨蛋白重複蛋白質或DARPINs®、Avimers®、DART、TCR樣抗體、Adnectins®、Affilins®、Trans-bodies®、Affibodies®、TrimerX®、微蛋白、Fynomers®、Centyrins®、及KALBITOR®。
免疫球蛋白可衍生自通常已知同型中之任一者，包括但不限於IgA、分泌IgA、IgG、IgE、及IgM。IgG亞類亦為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，且包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。「同型(isotype)」係指由重鏈恆定區基因編碼之Ab類或亞類（例如IgM或IgG1）。用語「抗體(antibody)」包括舉實例而言天然存在及非天然存在之Ab兩者；單株及多株Ab；嵌合及人源化Ab；人類或非人類Ab；全合成Ab；及單鏈Ab。非人類Ab可藉由重組方法來人源化以減少其在人中之免疫原性。在未明確陳述之情況下，且除非上下文另外指示，否則用語「抗體(antibody)」亦包括任何前述免疫球蛋白之抗原結合片段或抗原結合部分，且包括單價及二價片段或部分及單鏈Ab。
「抗原結合分子(antigen binding molecule)」、「抗原結合部分(antigen binding portion)」、「抗原結合片段(antigen binding fragment)」、或「抗體片段(antibody fragment)」或「抗原結合域(antigen binding domain)」係指包含該分子之抗原結合部分的任何分子。在一實例中，抗原結合分子係抗體、或其部分，諸如scFv。在一實例中，抗原結合分子係結合抗原之TCR之一部分，並且可係TCRα鏈之抗原結合部分及/或TCRα鏈之抗原結合部分。在一實例中，抗原結合分子可係結合NKG2D配體之NKG2D之一部分。抗原結合分子可包括抗原互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括但不限於形成自抗原結合分子之Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體、及多特異性抗體。肽體(peptibody)（亦即，包含肽結合域之Fc融合分子）係合適抗原結合分子之另一個實例。在一些實施例中，抗原結合分子結合至腫瘤細胞上之抗原。在一些實施例中，抗原結合分子結合至涉及過度增生性疾病之細胞上的抗原或結合至病毒或細菌抗原。在實施例中，抗原結合分子係嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。在某些實施例中，抗原結合分子或域係特異性結合至抗原之抗體片段，包括其互補決定區(CDR)之一或多者。在進一步實施例中，抗原結合分子係單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，抗原結合分子或域包含親和性多聚體(avimer)或由親和性多聚體組成。
在一些情況下，CDR與參考抗體（例如本揭露之抗體）中所發現之一個CDR及/或本揭露中所提供之CDR之序列實質上同一。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中相較於參考CDR，其序列同一或含有在1、2、3、4、或5（例如1至5）個之間的胺基酸取代。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中其顯示與參考CDR至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列同一性（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95至100%）。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中其顯示與參考CDR至少96%、96%、97%、98%、99%、或100%之序列同一性。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中相較於參考CDR，CDR內之一個胺基酸經缺失、添加、或取代，而該CDR之其他部分具有與參考CDR之胺基酸序列同一之胺基酸序列。在一些實施例中，CDR與參考CDR實質上同一，其中相較於參考CDR，CDR內之2、3、4、或5（例如2至5）個胺基酸經缺失、添加、或取代，而該CDR之其他部分具有與參考CDR之胺基酸序列同一之胺基酸序列。在各種實施例中，抗原結合片段與參考抗體結合相同抗原。在各種實施例中，抗原結合片段與參考抗體交叉競爭，例如結合至與參考抗體實質上同一之表位
抗原結合片段可藉由任何手段產生。舉例而言，在一些實施例中，抗原結合片段可藉由完整抗體碎斷而酶促或化學產生。在一些實施例中，抗原結合片段可重組產生（諸如藉由經工程改造之核酸序列之表現）。在一些實施例中，抗原結合片段可完全或部分地合成產生。在一些實施例中，抗原結合片段可具有至少約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190個胺基酸或更多之長度；在一些實施例中，至少約200個胺基酸（例如50至100、50至150、50至200、或100至200個胺基酸）。
用語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」可互換使用。可變區一般係指抗體之一部分，通常係輕鏈或重鏈之一部分，一般係成熟重鏈中胺基端的約110至120個胺基及成熟輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間的序列差異很大，且係用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列之變異性集中在稱為互補決定區(CDR)之區中，而可變域中更高度保守的區稱為架構區(FR)。不希望受任何特定機制或理論束縛，咸信輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之相互作用及特異性。在某些實施例中，可變區係人類可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及人類架構區(FR)。在實施例中，可變區係靈長類（例如非人類靈長類）可變區。在某些實施例中，可變區包含嚙齒動物或鼠類CDR及靈長類（例如非人類靈長類）架構區(FR)。
用語「VL」及「VL域(VL domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之輕鏈可變區。
用語「VH」及「VH域(VH domain)」可互換使用以指抗體或其抗原結合分子之重鏈可變區。
通常使用之CDR之許多定義：Kabat編號、Chothia編號、AbM編號、或Contact編號。AbM定義係Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體所使用之兩者之間之妥協。Contact定義係基於可用複雜晶體結構之分析。 表1. CDR編號
環 Kabat AbM Chothia 接觸
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96
H1 H31--H35B（Kabat編號） H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B
H1 H31--H35（Chothia編號） H26--H35 H26--H32 H30--H35
H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
用語「Kabat編號(Kabat numbering)」及類似用語在所屬技術領域中被認可，且指抗體或其抗原結合分子之重鏈及輕鏈可變區中之編號胺基酸殘基之系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統判定（參見例如Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR一般存在於胺基酸位置31至35，其可選地可包括一或兩個35以後之額外胺基酸（在Kabat編號方案中稱為35A及35B）(CDR1)、胺基酸位置50至65 (CDR2)、及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR一般存在於胺基酸位置24至34 (CDR1)、胺基酸位置50至56 (CDR2)、及胺基酸位置89至97 (CDR3)。在一特定實施例中，本文所述之抗體之CDR已根據Kabat編號方案判定。
在某些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案判定，其係指免疫球蛋白結構環之位置（參見例如Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917；Al-Lazikani B et al.,(1997) J Mol Biol 273: 927-948；Chothia C et al.,(1992) J Mol Biol 227: 799-817；Tramontano A et al.,(1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號）。一般而言，當使用Kabat編號慣例，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33、或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。在使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-HI環之結束在H32與H34之間之變化，取決於環的長度（此係因為Kabat編號方案將插入部分置於H35A及H35B處；若35A及35B均不存在，則環在32處結束；若僅存在35A，則環在33處結束；若35A及35B均存在，則環在34處結束）。在一特定實施例中，本文所述之抗體之CDR已根據Chothia編號方案判定。
用語「恆定區(constant region)」及「恆定域(constant domain)」可互換且具有所屬技術領域中通用的含義。恆定區係抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，其不直接涉及抗體與抗原之結合，但可展現各種效應功能，諸如與Fc受體相互作用。免疫球蛋白分子之恆定區通常具有相對於免疫球蛋白可變域更保守之胺基酸序列。
當參考抗體使用時，用語「重鏈(heavy chain)」可指任何不同類型，例如α、δ、ε、γ、及µ，基於恆定域之胺基酸序列，其各別產生IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM類別之抗體，包括IgG之亞類，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3、及IgG 4。
當參考抗體使用時，用語「輕鏈(light chain)」可指任何不同類型，例如基於恆定域之胺基酸序列之κ或λ。輕鏈胺基酸序列係所屬技術領域中所熟知。在特定實施例中，輕鏈係人類輕鏈。
「抗原(antigen)」係指可刺激人類或動物產生抗體或T細胞反應之化合物、組成物或物質，包括組成物（諸如包括腫瘤特異性蛋白質之一者），該等組成物被注射或吸收至人類或動物中。抗原與特定體液或細胞免疫之產物反應，包括藉由異源抗原（諸如所揭示之抗原）所誘導者。「目標抗原(target antigen)」或「所關注之目標抗原(target antigen of interest)」係在其他正常（所欲）細胞之表面上未實質上發現之抗原，且本文所涵蓋之TCR或CAR之結合域經設計以結合至其。所屬技術領域中具有通常知識者將容易地理解，任何大分子包括幾乎所有蛋白質或肽可作為抗原。抗原可內源性表現，即藉由基因體DNA表現，或可重組表現。抗原可對特定組織（諸如癌細胞）具有特異性，或其可廣泛表現。此外，較大分子之片段可充當抗原。「目標(target)」係由結合模體、CAR、TCR、或抗原結合劑（例如抗體）結合的任何分子。
「抗原特異性靶向區(antigen-specific targeting region)」(ASTR)係指靶向特定抗原之CAR或TCR的區。CAR或TCR上之靶向區係胞外的。在一些實施例中，抗原特異性靶向區包含抗體或其功能等效物或其片段或其衍生物，且靶向區之各者靶向不同抗原。靶向區可包含全長重鏈、Fab片段、單鏈Fv (scFv)片段、二價單鏈抗體或雙抗體，其各者對目標抗原具有特異性。然而有許多替代方案，諸如連接細胞介素（其導致識別帶有該細胞介素受體之細胞）、親和抗體(affibody)、來自天然存在受體之配體結合域（諸如NKG2D）、針對受體（例如在腫瘤細胞上）之可溶性蛋白質/肽配體、肽、及用以促使免疫反應之疫苗，其各可用於本揭露之各種實施例中。事實上，如所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解，幾乎任何與具有高親和力之給定抗原結合之分子均可用作抗原特異性靶向區。
「抗原呈現細胞(Antigen presenting cell)」或「APC」係指處理並向T細胞呈現抗原之細胞。例示性APC包含樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、某些活化上皮細胞、及能夠TCR刺激及適當T細胞共刺激之其他細胞類型。
「抗腫瘤效應(anti-tumor effect)」係指可呈現為下列之生物效應：腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增生減少、轉移數目減少、整體或無進展存活期增加、預期壽命增加、或改善與腫瘤相關之各種生理症狀。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤出現。
若一者之存在、水準、及/或形式與另一者相關，則兩個事件或實體係「關聯(associated)」。例如，實體（例如多肽、基因印記、代謝物、微生物等）係與疾病、病症或病狀相關聯，若其存在、水準、及/或形式與疾病、病症或病況之發生率及/或易感性相關（例如跨越相關群體）。舉例而言，若二或更多個實體彼此直接或間接相互作用，則其等實體地「相關聯」，使得其等係及/或保持在實體上彼此接近（例如結合）。在額外的實例中，彼此實體相關聯的二或更多個實體係彼此共價鍵聯或連接，或例如藉由氫鍵、凡得瓦相互作用、疏水性相互作用、磁性、及其組合之手段非共價締合。
用語「自體(autologous)」係指任何衍生自相同個體之材料，該材料之後會再重新引入至該個體。例如，本文所述之經工程改造之自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴球，接著將其工程改造以表現例如CAR構築體，接著投予回同一位患者。
「結合親和力(binding affinity)」通常係指分子（例如抗體）之單結合位點與其結合伴體（例如抗原）之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則「結合親和力」係指本質結合親和力，其反映結合對（例如抗體及抗原）之成員之間的1:1相互作用。分子X針對其伴體Y的親和力通常可由解離常數(K D)表示。親和力可以所屬技術領域中已知之多種方式測量及/或表現，包括但不限於平衡解離常數(K D)及平衡締合常數(K A)。K D係由k off/k on之商計算，而K A係由k on/k off之商計算。k on係指例如抗體至抗原之締合速率常數，且k off係指例如抗體至抗原之解離。k on及k off可藉由所屬領域中具有通常知識者已知之技術判定，諸如BIAcore®或KinExA。
用語「KD」(M)係指特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數，或抗體或抗體結合片段與抗原結合之解離平衡常數。K D與結合親和力之間存在倒數關係，因此K D值越小，親和力愈高，即越強。因此，用語「較高親和力(higher affinity)」或「較強親和力(stronger affinity)」係關於形成相互作用之較高能力且因此K D值較小，且相反地用語「較低親和力(lower affinity)」或「較弱親和力(weaker affinity)」係關於形成相互作用之較低能力且因此K D值較大。在一些情況下，特定分子（例如抗體）與其相互作用伴體分子（例如抗原X）之結合親和力（或K D）與該分子（例如抗體）與另一相互作用伴體分子（例如抗原Y）相比有較高之結合親和力，可表示為藉由將較大之K D值（較低或較弱之親和力）除以較小之K D（較高或較強之親和力）而判定之結合比率，例如表示為大5倍或10倍之結合親和力，視情況而定。
用語「k d」（sec -1或1/s）係指特定結合對（諸如抗體-抗原相互作用）之解離速率常數，或結合對（諸如抗體或抗體結合片段）之解離速率常數。所述值亦稱為k 0ir值。
用語「k a」（M-1 × sec-1或1/M）係指特定結合對（諸如抗體-抗原相互作用）之締合速率常數，或特定結合對（諸如抗體或抗體結合片段）之締合速率常數。
用語「K A」（M-1或1/M）係指特定結合對（諸如抗體-抗原相互作用）之締合平衡常數，或結合對（抗體或抗體結合片段）之締合平衡常數。藉由將k a除以k d來獲得締合平衡常數。
用語「結合(binding)」通常係指或兩個或更多個實體之間的非共價締合。直接結合涉及實體或部分之間的實體接觸。「間接(indirect)」結合涉及藉由具有一或多個中間實體之實體接觸的物理相互作用。可在多種情形中之任一者中評定兩個或更多個實體之間之結合，例如其中在單離中或在更複雜系統（例如同時共價或以其他方式與載體實體締合，且/或在生物系統（諸如細胞）中）之情況下研究相互作用之實體或部分。
用語「免疫特異性結合(immunospecifically bind)」、「免疫特異性辨識(immunospecifically recognize)」、「特異性結合(specifically bind)」、及「特異性辨識(specifically recognize)」係抗體在上下文中之類似用語，且指結合至抗原（例如表位或免疫複合物）之分子，所屬技術領域中具有通常知識者理解此類結合。舉例而言，特異性結合至抗原之分子可結合至其他肽或多肽，通常具有較低親和力，藉由例如免疫檢定、BIACORE ®、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)、或所屬技術領域中已知之其他檢定所判定。在特定實施例中，特異性結合至抗原之分子以至少2 logs、2.5 logs、3 logs、4 logs之K A，或大於分子結合至另一抗原時之K A結合至該抗原。相較於與具有不是目標之實體（即非目標）的結合域、抗體、或抗原結合系統之締合，結合可包含與具有結合域、抗體、或抗原結合系統之目標的結合域、抗體、或抗原結合系統之優先締合。在一些實施例中，若結合域、抗體、或抗原結合系統與目標之間的結合，相較於結合域、抗體、或抗原結合系統與非目標之結合大於2倍、大於5倍、大於10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或大於100倍，則結合域、抗體、或抗原結合系統選擇性地結合目標。在一些實施例中，若結合親和力小於約10 -5M、小於約10 -6M、小於約10 -7M、小於約10 -8M、或小於約10 -9M，則結合域、抗體、或抗原結合系統選擇性地結合目標。
在另一實施例中，特異性結合至抗原之分子以約1 × 10 -7M之解離常數(K d)結合。在一些實施例中，當K d係約1 × 10 -9M至約5 × 10 -9M時，抗原結合分子以「高親和力」特異性結合抗原。在一些實施例中，當K d係1 × 10 -10M至約5 × 10 -10M時，抗原結合分子以「非常高親和力」特異性結合抗原。在一個實施例中，抗原結合分子具有10 -9M之K d。在一實施例中，釋放速率小於約1 × 10 -5。
在某些實施例中，本文提供一種結合至目標人類抗原之抗體或其抗原結合分子，其以比結合至另一物種之目標抗原高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、或更高的親和力結合至目標抗原，如藉由例如放射性免疫檢定、表面電漿共振、或動力學排除檢定所測量。在一具體實施例中，結合至目標人類抗原之本文所述之抗體或其抗原結合分子將以小於該抗體或其抗原結合分子與人類抗原結合之10%、15%、或20%與另一物種之目標抗原結合，如藉由例如放射性免疫檢定、表面電漿共振、或動力學排除檢定所測量。
「癌症(cancer)」係指特徵在於本體中異常細胞之未受控生長的廣泛的各種疾病。未經調節細胞分裂及生長導致侵襲鄰近組織之惡性腫瘤形成，且亦可經由淋巴系統或血流轉移至本體之遠端部分。「癌症」或「癌症組織」可包括腫瘤。在一些實施例中，本揭露之方法可用於縮小衍生自例如下列之腫瘤的腫瘤大小：前列腺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部位癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱膈腔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤(FL)、變化型濾泡淋巴瘤、脾邊緣區型淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)（包括非T細胞ALL）、慢性淋巴球性白血病(CLL)、兒童實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導之癌症（包括由石棉誘導者）、其他B細胞惡性疾病、多發性骨髓瘤、及該等癌症之組合。特定癌症可回應於化學或輻射療法或癌症可為難治性的。難治性癌症係指手術介入不能修正之癌症，及癌症初始不回應於化學或輻射療法或癌症隨時間推移而變得不反應。
「趨化激素(chemokine)」係一種細胞介素類型，其介導細胞趨化性或方向性移動。趨化激素之實例包括但不限於IL-8、IL-16、伊紅趨素、伊紅趨素-3、巨噬細胞衍生之趨化激素（MDC或CCL22）、單核球趨化蛋白1（MCP-1或CCL2）、MCP-4、巨噬細胞炎性蛋白1α (MIP-1α, MIP-1a)、MIP-1β (MIP-1b)、γ誘導蛋白10 (IP-10)、及胸腺及活化調節趨化激素（TARC或CCL17）。
「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」係指經工程改造以包含結合域之分子及活化免疫細胞（例如T細胞，諸如初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞、NK細胞或其組合）在抗原結合時之手段。CAR亦稱為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。在一些實施例中，CAR包含結合域、胞外域、跨膜域、一或多個共刺激域、及胞內信號傳導域。已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之T細胞可稱為CAR T細胞。類似地，已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之NK細胞可稱為CAR NK細胞。
「減少(decrease)」、或「減低(lower)」、或「減輕(lessen)」、或「降低(reduce)」、或「消減(abate)」通常係指相較於由單獨媒劑（亦即活性部份）或對照分子/組成物造成之反應，本文所設想之組成物產生、引發、或造成較小生理反應（亦即下游效應）之能力。「減少」或「降低」量ㄧ般係「統計學上顯著的(statistically significant)」量，且可包括減少由媒劑、對照組成物產生之反應（參考反應）的1.1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30或更多倍（例如500、1000倍）（包括在1以上之所有整數及其間之小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）。
「胞外域(extracellular domain)」（或「ECD」）係指多肽之部分，其當多肽存在於細胞膜中時，應理解為位於細胞膜外之胞外空間中。Ecto域在本文中可與胞外域互換使用。
如本文中所使用，用語「胞外配體結合域(extracellular ligand-binding domain)」係指能夠結合配體（例如細胞表面分子）之寡肽或多肽。例如，可選擇胞外配體結合域以識別作用為與特定疾病狀態（例如癌症）相關之目標細胞上之細胞表面標記的配體。可作用為配體之細胞表面標記之實例包括與病毒、細菌、及寄生蟲感染、自體免疫疾病、及癌細胞相關者。
CAR之結合域後面可接著「間隔子(spacer)」或「鉸鏈(hinge)」，其係指將抗原結合域移動遠離效應細胞表面以實現適當細胞/細胞接觸、抗原結合、及活化的區(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419)。CAR中之鉸鏈區通常在跨膜(TM)與結合域之間。在某些實施例中，鉸鏈區係免疫球蛋白鉸鏈區，且可為野生型免疫球蛋白鉸鏈區或經改變之野生型免疫球蛋白鉸鏈區，諸如Igg4鉸鏈。用於本文所描述之CAR中之其他例示性鉸鏈區包括衍生自類型1膜蛋白（諸如CD8α、CD4、CD28、及CD7）之胞外區的鉸鏈區，其可係來自此等分子之野生型鉸鏈區，或可經改變。
「跨膜(transmembrane)」區或域係CAR之一部分，其將胞外結合部分錨定至免疫效應細胞之質膜，並促進結合域與目標抗原之結合。跨膜域可係CD3ζ跨膜域，然而可採用之其他跨膜域包括由CD8α、CD4、CD28、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、NKG2D、2B4、及CD154獲得者。在某些實施例中，跨膜域係合成，其中其將主要包括疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。
「胞內信號傳導域(intracellular signaling domain)」或「信號傳導域(signaling domain)」係指嵌合抗原受體蛋白之部分，其參與將有效CAR結合至目標抗原之訊息轉導至免疫效應細胞內部以引發效應細胞功能，例如活化、細胞介素產生、增生、及細胞毒性活性，包括細胞毒性因子至結合CAR之目標細胞的釋放、或與胞外CAR域結合之抗原引發的其他細胞反應。用語「效應功能(effector function)」係指細胞之特定功能。T細胞之效應功能，例如可係細胞溶解活性或包括細胞介素之分泌之幫助或活性。因此，用語「胞內信號傳導域(intracellular signaling domain)」或「信號傳導域(signaling domain)」在本文中可互換使用，指蛋白質之部分，其轉導效應功能信號且引導細胞以執行特定功能。雖然通常可採用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，不必使用整個域。在使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，只要其轉導效應功能信號，則可使用此類截短部分代替整個域。用語胞內信號傳導域意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域之任何截短部分。胞內信號傳導域亦稱為「信號轉導域」，且通常源自人類CD3或FcRy鏈之部分。
已知透過單獨T細胞受體產生之信號不足於完全活化T細胞且亦需要二級或共刺激信號。因此，T細胞活化可說是藉由兩種不同類別的細胞質信號傳導序列介導：透過T細胞受體起始抗原依賴性初級活化者（初級細胞質信號傳導序列）及以抗原非依賴性方式作用者，以提供二級或共刺激信號（二級細胞質信號傳導序列）。共刺激方式作用之細胞質信號傳導序列可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化域或ITAM之信號傳導域。
含有特定用於本揭露之主要細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括衍生自DAP10、DAP12、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d。
如本文所用，用語「共刺激信號傳導域(costimulatory signaling domain)」或「共刺激域(costimulatory domain)」係指包含共刺激分子之胞內域之CAR之部分。共刺激分子係除抗原受體或Fc受體以外之細胞表面分子，其提供T淋巴球在結合至抗原時為有效活化及功能所需之第二信號。此類共刺激分子之實例包括CD27、CD28、4-1 BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS (CD278)、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C、2B4、CD137、DAP12、B7-H2、及特異性結合CD83之配位體。因此，雖然本揭露提供衍生自CD28、CD3-ε、4-1BB之例示性共刺激域，已涵蓋其他共刺激域以用於與本文所述之CAR搭配使用。納入一或多種共刺激信號傳導域可增強T細胞及NK細胞表現CAR受體之功效及擴增。胞內信號傳導及共刺激信號傳導域可以任何順序串聯連接至跨膜域之羧基端。
儘管經工程改造以含有來自CD3或FcRγ之信號傳導域的CAR已經顯示遞送用於T細胞活化及效應功能之強效信號，在不存在伴隨共刺激信號之情況下，其不足以引起促使T細胞存活及擴增的信號。含有衍生自CD3ζ或FcRγ之結合域、鉸鏈、跨膜、及信號傳導域之其他CAR連同一或多個共刺激信號傳導域（例如衍生自4-1BB、CD28、CD134、及CD278之胞內共刺激域）可更有效地引導抗腫瘤活性以及在體外、動物模型及癌症患者中增加CAR表現T細胞之細胞介素分泌、裂解活性、存活、及增殖(Milone et al., Molecular Therapy, 2009; 17: 1453-1464; Zhong et al., Molecular Therapy, 2010; 18: 413-420; Carpenito et al., PNAS, 2009; 106:3360-3365)。
「共刺激信號(costimulatory signal)」係指與初級信號（諸如TCR/CD3連接）組合之信號引起T細胞反應，諸如但不限於關鍵分子之增生及/或上調或下調。
「共刺激配體(costimulatory ligand)」包括特異性結合T細胞上之同源共刺激分子的抗原呈現細胞上之分子。共刺激配體之結合提供介導T細胞反應之信號，包括但不限於增生、活化、分化、及類似者。除了刺激分子所提供之初級信號外，共刺激配體還會藉由結合T細胞受體(TCR)/CD3複合物與裝載有肽之主要組織相容性複合物(MHC)分子而誘導信號。共刺激配體可包括但不限於3/TR6、4-1BB配體、結合鐸(Toll)配體受體之促效劑或抗體、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD30配體、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒進入介導物(herpes virus entry mediator, HVEM)、人類白血球抗原G (HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白樣轉錄本(ILT) 3、可誘導型共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、與B7-H3特異性結合之配體、淋巴毒素β受體、MHC I類鏈相關蛋白A (MICA)、MHC I類鏈相關蛋白B (MICB)、OX40配體、PD-L2、或程式性死亡(PD) L1。共刺激配體包括但不限於與存在於T細胞上之共刺激分子特異性結合之抗體，諸如但不限於4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、與CD83特異性結合之配體、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1)、自然殺手細胞受體C (NKG2C)、OX40、PD-1、或腫瘤壞死因子超家族成員14（TNFSF14或LIGHT）。
「共刺激分子」係與共刺激配體特異性結合之T細胞上之同源結合夥伴(partner)，從而介導T細胞之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於「共刺激分子」係與共刺激配體特異性結合之T細胞上之同源結合夥伴，從而介導T細胞之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD33、CD45、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3 (α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配體、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96 (Tactile)、CDl-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα (CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT（腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14）、LTBR、Ly9 (CD229)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1 (CDl la/CD18)、MHC I類分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子、SLAM (SLAMF1; CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4）、SLAMF6（NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。
「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」係其中胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。所屬技術領域中已定義具有側鏈之胺基酸殘基之家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如天冬胺酸、麩胺酸）、未帶電極性側鏈（例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β-支鏈側鏈（例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）、及芳族側鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。在某些實施例中，抗體或其抗原結合分子之（多個）CDR內或（多個）架構區內的一或多個胺基酸殘基可用具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。通常而言，若兩個序列在對應位置中含有保守性胺基酸取代，則通常將該兩個序列視為「實質上類似的(substantially similar)」。舉例而言，某些胺基酸通常分類為「疏水性(hydrophobic)」或「親水性(hydrophilic)」胺基酸，及/或具有「極性(polar)」或「非極性(non-polar)」側鏈。用一個胺基酸取代相同類型的另一胺基酸可視為保守性取代。例示性胺基酸分類概述於以下表2及表3中： 表2
胺基酸 3字母 1字母 性質 性質 疏水性指數
丙胺酸 Ala A 非極性 中性 1.8
精胺酸 Arg R 極性 陽性 -4.5
天冬醯胺酸 Asn N 極性 中性 -3.5
天冬胺酸 Asp D 極性 陰性 -3.5
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性 2.5
麩胺酸 Glu E 極性 陰性 -3.5
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性 -3.5
甘胺酸 Gly G 非極性 中性 -0.4
組胺酸 His H 極性 陽性 -3.2
異白胺酸 Ile I 非極性 中性 4.5
白胺酸 Leu L 非極性 中性 3.8
離胺酸 Lys K 極性 陽性 -3.9
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性 1.9
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性 2.8
脯胺酸 Pro P 非極性 中性 -1.6
絲胺酸 Ser S 極性 中性 -0.8
蘇胺酸 Thr T 極性 中性 -0.7
色胺酸 Trp W 非極性 中性 -0.9
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性 -1.3
纈胺酸 Val V 非極性 中性 4.2
表3
不明確胺基酸 3字母 1字母
天冬醯胺酸或天冬胺酸 Asx B
麩醯胺酸或麩胺酸 Glx Z
白胺酸或異白胺酸 Xle J
未指定或未知之胺基酸 Xaa X
「組合療法(combination therapy)」係指對象同時暴露於二或更多個治療方案（例如二或更多種治療部分）之彼等情況。在一些實施例中，二或更多個方案可同時投予；在一些實施例中，可依序投予此類方案（例如第一方案之所有「劑量(dose)」係在投予任何劑量之第二方案之前投予）；在一些實施例中，此類藥劑以重疊給藥方案投予。在一些實施例中，組合療法之「投予(administration)」可涉及對接受在組合中之其他藥劑或療法之對象投予一或多種藥劑或療法。為清楚起見，組合療法不需要將個別藥劑在單一組成物中一起投予（或甚至不需要同時），儘管在一些實施例中，二或更多種藥劑或其活性部分可在組合組成物中一起投予，或甚至在組合化合物中投予（例如作為單一化學複合物或共價實體之一部分）。
「對應於(corresponding to)」可用以藉由與適當之參考分子或組成物比較，指定分子或組成物中之結構元件之位置/身分。例如，在一些實施例中，聚合物中之單體殘基（例如多肽中之胺基酸殘基或多核苷酸中之核酸殘基）可識別為「對應於」在適當之參考聚合物中之殘基。舉例而言，針對簡單起見之目的，多肽中之殘基可使用基於參考相關多肽之標準編號系統指定，使得在位置100處「對應於」殘基之胺基酸（例如不需要實際上為所提供胺基酸鏈中之第100個胺基酸），其對應於在參考多肽中之位置100處發現之殘基。各種序列比對策略係可用的，包含軟體程式，諸如例如BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM、或SWIPE，其可用於例如根據本揭露識別多肽及/或核酸中之「對應」殘基。
若抗原與第一抗原結合分子之間之相互作用阻擋、限制、抑制、或以其他方式降低參考結合分子與抗原相互作用之能力，則抗原結合分子（諸如抗體、其抗原結合片段、CAR或TCR）與參考結合分子（諸如抗體或其抗原結合片段）「交叉競爭(cross-compete)」。交叉競爭可完成，例如抗原結合分子與抗原之結合完全阻斷參考結合分子與抗原結合之能力，或其可為部分的，例如抗原結合分子與抗原之結合降低參考抗原結合分子與抗原結合之能力。在某些實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子相同或重疊之表位。在其他實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子不同之表位。許多類型之競爭結合檢定可用以判定一種抗原結合分子是否與另一種爭，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)；固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)；夾心競爭檢定(Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素抗生物素蛋白EIA (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619)；固相直接標記檢定，固相直接標記之夾心檢定(Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA (Morel et al., 1988, Molec.Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素抗生物素蛋白EIA (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552)；及直接標示之RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol.32:77-82)。
「細胞介素(cytokine)」係指藉由一個細胞回應於與特定抗原接觸而釋放之非抗體蛋白，其中細胞介素與第二細胞相互作用以介導第二細胞中之反應。細胞介素可藉由胞內源性表現或向對象投予。細胞介素可由免疫細胞（包括巨噬細胞、B細胞、T細胞、及肥大細胞）釋放而傳播免疫反應。細胞介素可誘導接受者細胞中之各種反應。細胞介素可包括體內恆定細胞介素、趨化激素、促炎性細胞介素、效應物、及急性期蛋白。例如，包括介白素(IL) 7及IL-15之體內恆定(homeostatic)細胞介素促進免疫細胞存活及增生，且促炎性細胞介素可促進發炎性反應。體內恆定細胞介素之實例包括但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、及干擾素(IFN) γ。促發炎細胞介素之實例包括但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF) 2、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶細胞間黏附分子1 (sICAM-1)、可溶血管黏附分子1 (sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、及胎盤生長因子(PLGF)。效應物之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶Fas配體(sFasL)、及穿孔蛋白。急性期蛋白之實例包括但不限於C反應蛋白(CRP)及血清類澱粉蛋白A (SAA)。
用語「域(domain)」係指一實體之一部分。在一些實施例中，「域」與實體之結構及/或功能性特徵相關聯，例如使得當域實體與其親本實體之其餘部分分離時，其實質上或完全保留結構及/或功能特徵。在一些實施例中，域可包含實體之一部分，當與（親本）實體分離且與不同（接收者）實體鏈接或連接時，實質上保留及/或賦予接收者實體一或多個結構及/或功能特徵，例如其在親本實體中之特徵。在一些實施例中，域係分子之一部分（例如小分子、碳水化合物、脂質、核酸、或多肽）。在一些實施例中，域係多肽之區段；在一些此類實施例中，域之特徵在於結構元件（例如胺基酸序列或序列域、α-螺旋性狀、β-薄片性狀、捲曲線圈性狀、隨機線圈性狀等），及/或功能性特徵（例如結合活性、酶活性、摺疊活性、信號傳導活性等）。
用語「劑型(dosage form)」可用以指投予至對象之活性劑之物理離散單元（例如抗原結合系統或抗體）。一般而言，各此類單元含有預定量之活性劑。在一些實施例中，此類量係根據已判定當向相關群體投予時與所期望或有益結果相關之給藥方案之適於投予之單位劑量（或其全部部分）。向對象投予之治療組成物或藥劑之總量由一或多個醫學醫師判定，且可涉及投予超過一種劑型。
用語「給藥方案(dosing regimen)」可用於指一組一或多個單位劑量，該組一或多個單位劑量係個別投予至對象。在一些實施例中，給定治療劑具有推薦劑量方案，其可涉及一或多種劑量。在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量，其各者在時間上與其他劑量分開。在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量且連續劑量藉由相等長度之時段彼此分離；在一些實施例中，給藥方案包含複數個劑量且連續劑量藉由至少兩個不同長度之時段彼此分離。在一些實施例中，給藥方案內之所有劑量係相同單位劑量。在一些實施例中，給藥方案內不同劑量係不同量。在一些實施例中，給藥方案包含第一劑量之第一劑量，隨後係不同於第一劑量之第二劑量之一或多個額外劑量。在一些實施例中，週期性調整給藥方案以達成所欲或有益結果。
「效應細胞(effector cell)」係指表現一或多種Fc受體且介導一或多種效應功能之免疫系統之細胞。在一些實施例中，效應細胞可包含但不限於單核球、巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、嗜酸性球、肥大細胞、血小板、大顆粒淋巴球、蘭格罕細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK)細胞、T淋巴球、及B淋巴球中之一或多者。效應細胞可屬於任何生物體，包含但不限於人類、小鼠、大鼠、兔、及猴。
「效應功能(effector function)」係指抗體Fc區與Fc受體或配體相互作用之生物結果。效應功能包含但不限於抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP)、及補體介導之細胞毒性(complement-mediated cytotoxicity, CMC)。效應功能可係抗原結合依賴性、抗原結合獨立性、或兩者。ADCC係指藉由免疫效應細胞裂解抗體結合之目標細胞。不希望受任何理論束縛，ADCC通常理解為涉及辨識及隨後殺滅抗體塗佈之目標細胞之Fc受體(FcR)攜帶效應細胞（例如表現在抗體結合之表面抗原上之細胞）。介導ADCC之效應細胞可包含免疫細胞，其包含但不限於自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球中之一或多者。
用語「經工程改造之自體細胞療法(engineered Autologous Cell Therapy)」可縮寫為「eACT™」亦稱為過繼性細胞轉移(adoptive cell transfer)，係收集患者之自身T細胞且隨後基因改變以識別及靶向一或多種特異性腫瘤細胞或惡性之細胞表面上表現之一或多種抗原之方法。T細胞或NK細胞可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)及/或T細胞受體(TCR)。在一些實例中，CAR陽性(+) T或NK細胞經工程改造以表現對連接至胞內信號傳導部分（包含至少一個共刺激域及至少一個活化域）之特定腫瘤抗原具有特異性的胞外單鏈可變片段(scFv)。在一些實例，CAR陽性(+) T或NK細胞經工程改造以表現對連接至胞內信號傳導部分（包含至少一個共刺激域及至少一個活化域）之NKG2D抗原具有特異性的NKG2D之胞外域。共刺激域可衍生自天然存在之共刺激域或其變體，例如具有截短鉸鏈域(「THD」)之變體，而活化域可衍生自例如CD3-ζ及/或CD3-ε。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個、或更多個共刺激域。
在一些實施例中，CAR經工程改造，使得共刺激域表示為獨立多肽鏈。實例CAR T細胞療法及建構體描述於美國專利公開案第2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309、及2014/0050708號，其全文以引用方式併入本文中。「過繼性細胞療法(Adoptive cell therapy)」或「ACT」涉及將具有抗腫瘤活性之免疫細胞轉移至對象中，例如癌症患者。在一些實施例中，ACT係涉及使用具有抗腫瘤活性之淋巴球（例如經工程改造之淋巴球）之治療方法。
「表位(epitope)」係指抗體可特異性結合之抗原的局部區域。表位可係例如多肽（線性或連續表位）之連續胺基酸，或表位可例如一起來自一或多個多肽之二或更多個非連續區域（構形、非線性、不連續、或非連續表位）。在某些實施例中，抗體結合之表位可藉由例如NMR光譜術、X射線繞射結晶學研究、ELISA檢定、與質譜測定術交換耦合之氫/氘（例如液相層析電噴霧質譜測定術）、基於陣列之寡肽掃描檢定、及/或突變誘發映射（例如位點引導之突變誘發映射）。對於X射線結晶學，可使用所屬技術領域中已知方法中之任一者來實現結晶（例如Giegé R et al.,(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350；McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23；Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274；McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303）。抗體：抗原結晶，可使用熟知之X射線繞射技術研究，且可使用電腦軟體改良，諸如X-PLOR（Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；參見例如Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194）、及BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al.,(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)。突變誘發映射研究可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何方法實現。參見例如Champe M et al.,(1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085針對突變誘發技術之描述，包括丙胺酸掃描突變誘發技術。
參考基因、蛋白質、及/或核酸之「內源性(endogenous)」係指基因、蛋白質、及/或核酸在細胞（諸如免疫細胞）中之天然存在。
「外源(exogenous)」係指引入細胞之藥劑，諸如核酸、基因、或蛋白質，例如來自外部源。即使其編碼在細胞中天然存在之蛋白質，引入細胞中之核酸係外源。此類外源引入編碼蛋白質之核酸可用以增加蛋白質之表現，其超過在類似條件下（例如不引入外源核酸）在細胞中自然發現之水準。
用語「賦形劑(excipient)」係指可包含在組成物中之藥劑，例如用以提供或促進所欲的同一性或穩定化效應。在一些實施例中，適合的賦形劑可包含例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白土粉、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥之脫脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、或類似物。
如本文所述之材料或實體之「片段(fragment)」或「部分(portion)」具有包含整個例如物理實體或抽象實體之離散部分之結構。在一些實施例中，片段缺乏整個發現之一或多個部分。在一些實施例中，片段由整個發現之特性結構元件、域或部分所組成，或包含其等。在一些實施例中，聚合物片段包含如在整個聚合物中發現之至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多個單體單元（例如殘基），或由其等所組成。在一些實施例中，聚合物片段包含在整個聚合物中發現之單體單元（例如殘基）之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、25%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或由其等所組成（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。在一些實施例中，整個材料或實體可稱為片段之「親本(parent)」。
用語「融合多肽(fusion polypeptide)」或「融合蛋白(fusion protein)」通常係指包含至少兩個區段之多肽。一般而言，含有至少兩個此類區段之多肽在下列情況下被視為融合多肽，若兩個區段係下列之部分：(1)非天然包含在相同肽中，及/或(2)先前未在單一多肽中鏈接或連接至彼此，及/或(3)已透過人手之作動而鏈接或連接至彼此。在實施例中，CAR係融合蛋白。在實施例中，TCR係融合蛋白。
用語「基因產物(gene product)」或「表現產物(expression product)」通常係指由基因（預先及/或後處理）轉錄之RNA，或由基因轉錄之RNA編碼之多肽（預先及/或後修飾）。
用語「經基因工程改造(genetically engineered)」或「經工程改造(engineered)」係指修飾細胞基因體之方法，其包括但不限於缺失編碼或非編碼區或其部分、或插入編碼區或其部分。在一些實施例中，經修飾之細胞係淋巴球，例如T細胞或NK細胞，其可自患者或供體獲得。在一些實施例中，經修飾之細胞係誘導性多能性幹細胞(iPSC)，其可分化成淋巴球，諸如T細胞或NK細胞。細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入至細胞基因體中。亦可進行其他基因編輯，例如減少排斥及/或增強細胞適應性。工程改造通常包含人手操縱。舉例而言，當二或更多個序列在自然界中未依此順序鏈接或連接，而係經人手操縱而直接鏈接或連接至彼此時，將多核苷酸視為「經工程改造」。在藉由分子生物學技術操縱細胞之背景下，若細胞或生物體已經操縱使其基因資訊被改變（例如已引入先前不存在之新基因物質，例如藉由轉化、體細胞雜交、轉染、轉導、或其他機制，或改變或移除先前存在之基因物質，例如藉由取代或缺失突變、或藉由其他規程），則將該細胞或生物體視為「經工程改造」。在一些實施例中，結合劑係經修飾之淋巴球，例如T細胞或NK細胞可獲自患者或供體。經工程改造之細胞可經修飾以表現外源構築體，諸如例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，其併入至細胞基因體中。經工程改造之多核苷酸或結合劑之後代通常稱為「經工程改造」，即使實際操縱在先前實體上進行。在一些實施例中，「經工程改造」係指已經設計及產生之實體。用語「經設計(designed)」係指藥劑(i)其結構係或經人手選擇；(ii)由需要人手之方法產生；及/或(iii)與天然物質及其他已知藥劑相異。
「T細胞受體」或「TCR」係指存在於T細胞表面上之抗原識別分子。在正常T細胞發展期間，四個TCR基因α、β、γ、及δ之各者可重新排列導致高度不同之TCR蛋白質。基於TCR之T細胞療法的實例揭示於國際專利申請案第PCT/US2013/059608及PCT/US2015/033129中，其以全文引用之方式併入本文中。
用語「異源(heterologous)」意指來自非天然存在之序列的任何來源。例如，作為共刺激蛋白質之一部分包括的異源序列係非天然存在之胺基酸，亦即與野生型人類共刺激蛋白不一致。舉例而言，異源核苷酸序列係指除野生型人類共刺激蛋白編碼序列之外的核苷酸序列。
用語「同一性(identity)」係指聚合分子之間的整體相關性，例如在核酸分子之間（例如DNA分子及/或RNA分子）及/或多肽分子之間。與兩個所提供之多肽序列之間的同一性百分比計算的方法係已知的。例如可藉由比對二個序列以用於最佳比較目的來執行兩個核酸或多肽序列之同一性百分比之計算（例如可在第一及第二序列中之一或兩者中引入間隙以用於最佳比對，且可出於比較目的忽略非同一性序列）。接著比較對應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置同一之殘基（例如核苷酸或胺基酸）佔據時，則分子在彼位置處係同一的。兩個序列之間的同一性百分比係序列共有的相同位置數目之函數，其可選地考慮間隙數目及各間隙之長度，可能需要引入間隙以達到兩個序列之最佳比對。可使用數學演算法（諸如BLAST（基本局部比對搜尋工具））實現序列之比較或比對及兩個序列之間的同一性百分比之判定。在一些實施例中，若其序列係至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），則聚合分子視為彼此「同源」。
為了計算同一性百分比，被比較之序列一般係以給予序列之間最大匹配的方式比對。可用於判定同一性百分比的電腦程式之一個實例係GCG程式封裝，其包括GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。電腦演算法GAP係用於比對兩個多肽或多核苷酸，以判定其等之序列同一性百分比。序列針對其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配進行比對（如由演算法判定之「匹配跨度(matched span)」）。在某些實施例中，標準比較矩陣（參見Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)亦由演算法使用。其他演算法亦可用於胺基酸或核苷酸序列之比較，包含在商業電腦程式中可用的演算法，諸如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、gapped BLAST、及PSI-BLAST。例示性的此類程式描述於Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990；Altschul, et al., Methods in Enzymology；Altschul, et al.，「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs，」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997；Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；及Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999。除識別類似序列之外，上文所提及之程式通常提供相似性程度之指示。在一些實施例中，兩個序列視為實質上相似若至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多其對應殘基在殘基之相關延伸係相似及/或同一（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。在一些實施例中，相關延伸係完整序列。在一些實施例中，相關延伸係至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或更多殘基。具有實質序列類似性之序列可彼此同源。
當提及核酸或其片段時，用語「實質上相同(substantial identity)」或「實質上相同(substantially identical)」指示當與另一核酸（或其互補股）之適當核苷酸插入或去除最佳地對準，核苷酸序列一致性至少約95%，且更佳地至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基，如序列一致性之任何熟知演算法所測量，諸如FASTA、BLAST或Gap，如下文所論述。在某些情況下，具有與參考核酸分子實質同一性之核酸分子可編碼具有與參考核酸分子編碼之多肽相同或實質上類似之胺基酸序列之多肽。
如施加至多肽，用語「實質相似性(substantial similarity)」或「實質上類似(substantially similar)」意指兩個肽序列，當使用預設間隙權重最佳地對準（諸如藉由程式GAP或BESTFIT）時，共享至少95%序列一致性，甚至更佳地至少98%或99%序列一致性。較佳地，不同一之殘基位置與保守胺基酸取代不同。
用語「改善(improve)」、「增加(increase)」、「抑制(inhibit)」、及「減少(reduce)」指示相對於基線或其他參考測量之值。在一些實施例中，適當的參考測量可包含在某些系統中的測量（例如在一單個個體中），在其他可比情況下，不存在（例如之前及/或之後）藥劑或治療，或存在適當的可比參考藥劑。在一些實施例中，適當的參考測量可包含在相關劑或治療存在下對所已知或預期的相當系統以相當的方式反應之測量結果。
「免疫反應(immune response)」係指免疫系統細胞（例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞、及嗜中性球）及由任何這些細胞或肝臟所生產之可溶巨分子（包括Ab、細胞介素、及補體）的作用，其會導致對脊椎動物體內之侵犯病原體、受病原體所感染之細胞或組織、癌性或其他異常細胞、或（在自體性或病理性發炎之情況下）正常人類細胞或組織的選擇性靶向、結合、損傷、破壞、及/或消除。
用語「免疫療法(immunotherapy)」係指罹患疾病、或有感染疾病或遭受疾病再發之風險的對象藉由包含誘導、增強、抑制、或以其他方式修改免疫反應之方法的治療。免疫療法之實例包括但不限於NK細胞及T細胞療法。T細胞療法可包括過繼性T細胞療法、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)免疫療法、自體細胞療法、經工程改造之自體細胞療法(eACT™)、及同種異體T細胞移植。然而，所屬技術領域中具有通常知識者會認知到，本文中所揭示之調理方法會增強任何移植T細胞療法之有效性。T細胞療法之實例描述於美國專利公開案第2014/0154228號及第2002/0006409號、美國專利第5,728,388號、及國際專利公開案WO 2008/081035。基於TCR之T細胞療法的實例揭示於國際專利申請案第PCT/US2013/059608及PCT/US2015/033129中，其以全文引用之方式併入本文中。
免疫療法之T細胞或NK細胞可來自所屬技術領域中已知之任何來源。例如，T細胞及NK細胞可來自造血幹細胞群體（例如iPSC）在體外分化或可自對象獲得。T細胞及NK細胞可從下列獲得，例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹膜、胸膜滲出液、脾臟組織、及腫瘤。此外，T細胞可衍生自所屬技術領域中可用之一或多種T細胞系。T細胞亦可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何數量之技術，諸如FICOLL™分離及/或血球分離來自對象收集之血液之單位獲得。T細胞療法單離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號，其以全文以引用方式併入本文中。
用語「體外(in vitro)」係指在一人工環境中發生的事件，例如在測試管、反應容器、細胞培養等中，而非在多細胞生物體內。用語「體外細胞( in vitrocell)」係指離體培養之任何細胞。特定言之，體外細胞可包括T細胞或NK細胞。用語「體內(in vivo)」係指在多細胞生物體（諸如人類或非人類動物）內發生之事件。
用語「單離(isolated)」係指一種物質，其：(1)已自至少一些組分分離，其中其與該物質在較早時間締合或該物質將以其他方式與其相關聯，及/或(2)存在於組成物中，該組成物包含一或多種已知或未知污染物之限制或限定量或濃度。在一些實施例中，經單離物質可自約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或超過約99%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）之其他非物質組分分離，其與該物質在較早時間相關聯，例如該物質先前或以其他方式將與其他組分或污染物相關聯。在某些情況下，若物質存在於包含相同或類似類型之分子之限制或降低量或濃度之組成物中，則單離物質。舉例而言，在某些情況下，若核酸、DNA、或RNA物質存在於包含限制或降低量或濃度之非物質核酸、DNA、或RNA分子之組成物中，則單離核酸、DNA、或RNA物質。舉例而言，在某些情況下，若多肽物質存在於包含限制或降低量或濃度之非物質多肽分子之組成物中，則單離多肽物質。在某些實施例中，量可係例如相對於在組成物中存在之所欲物質所測量之量。在某些實施例中，有限量可係組成物中之物質量不超過100%之量，例如不超過1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%之組成物中之物質量（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。在某些情況下，組成物相對於所選擇物質係純的或實質上純的。在一些實施例中，經單離物質係約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或超過約99%之純（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）。若其實質上不含其他組分或污染物，則物質係「純」。在一些實施例中，物質仍可被視為「經單離」或甚至「純」，在其已與某些其他組分諸如，例如一或多個載劑或賦形劑（例如緩衝劑、溶劑、水等）組合之後；在此類實施例中，在不包含此類載劑或賦形劑之情況下計算物質之單離百分比或純度。
「連接子(linker)」(L)或「連接子域(linker domain)」或「連接子區(linker region)」係指例如長度約1至100個胺基酸之寡肽或多肽區，其將CAR、TCR、及/或scFv之域/區中之任一者連接在一起，或甚至將這些多肽中之一或多者連接在一起。連接子可由可撓性殘基（如甘胺酸及絲胺酸）構成，使得相鄰的蛋白質域可以相對於彼此自由移動。當確保兩個相鄰域不會在空間上彼此干擾係所欲時，可使用較長連接子。連接子可係可裂解或不可裂解。可裂解連接子之實例包括2A連接子（例如T2A）、2A樣連接子或其功能等效物及其組合。在一些實施例中，連接子包括小核糖核酸病毒(picornaviral) 2A樣連接子、豬鐵士古病毒(teschovirus) (P2A)之CHYSEL (SEQ ID NO: 1)序列、病毒(T2A)、或其組合、變體、及功能等效物。在其他實施例中，連接子序列可包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly (2A)-Pro (2B)域(SEQ ID NO: 2)，其導致2A甘胺酸與2B脯胺酸之間之裂解。對所屬技術領域中具有通常知識者而言其他連接子將顯而易見，且可與本揭露結合使用。連接子可係多元素劑之一部分，其將不同元件彼此連接。舉例而言，多肽包括二或更多個功能或結構域可包含在彼此連接之此類域之間的胺基酸之延伸。在一些實施例中，包含連接子元件之多肽具有通常形式S1-L-S2之總結構，其中S1及S2可係相同或不同且表示藉由連接子彼此相關聯之兩個域。連接子可將CAR或TCR之域/區中之任一者連接或鏈接在一起。在一些實施例中，多肽連接子之長度係至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個胺基酸（例如長度係1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至70、1至80、1至90、1至100、10至20、10至30、10至40、10至50、10至60、10至70、10至80、10至90、或10至100個胺基酸）。在一些實施例中，連接子之特徵在於其傾向不採用剛性三維結構，且替代地提供多肽之靈活性。在另一實例中，其可用於連接至或更多待表現之多肽，諸如CAR及/或TCR。
其他連接子包括非可裂解連接子。使用數個連接子來實現本發明，包括「可撓性連接子」。後者富含甘胺酸。Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection Vol. 27, No. 10, pp. 325–330, 2014; Priyanka et al., Protein Sci., 2013 Feb; 22(2): 153–167。
在一些實施例中，連接子係合成連接子。合成連接子可具有約10個胺基酸至約200個胺基酸之長度，例如10至25個胺基酸、25至50個胺基酸、50至75個胺基酸、75至100個胺基酸、100至125個胺基酸、125至150個胺基酸、150至175個胺基酸、或175至200個胺基酸。合成連接子可具有10至30個胺基酸之長度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個胺基酸。合成連接子可具有30至50個胺基酸之長度，例如30至35個胺基酸、35至40個胺基酸、40至45個胺基酸、或45至50個胺基酸。
在一些實施例中，連接子係可撓性連接子。在一些實施例中，連接子富含甘胺酸（Gly或G）殘基。在一些實施例中，連接子富含絲胺酸（Ser或S）殘基。在一些實施例中，連接子富含甘胺酸及絲胺酸殘基。
用語「淋巴球(lymphocyte)」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞、或B細胞。NK細胞係代表固有免疫系統之組分的細胞毒性淋巴球之一種類型。NK細胞會除去腫瘤及受病毒感染之細胞。其透過細胞凋亡或程式性細胞死亡之程序發揮作用。其等之所以稱為「自然殺手」是因為不需要活化即可殺滅細胞。T細胞在細胞介導之免疫性中起作用（無抗體參與）。其T細胞受體(TCR)是自其他淋巴球類型使自身分化出來。胸腺（免疫系統之特化器官）主要負責T細胞之成熟。有六種類型之T細胞，亦即：輔助T細胞（例如CD4+細胞）、細胞毒性T細胞（亦稱為TC、細胞毒性T淋巴球、CTL、T-殺手細胞、細胞毒性T細胞、CD8+ T細胞或殺手T細胞）、記憶T細胞（(i)幹記憶T SCM細胞，類似初級細胞，係CD45RO−、CCR7+、CD45RA+、CD62L+（L-選擇素）、CD27+、CD28+、及IL-7Rα+、但其亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1，且展示記憶體細胞特有之多種功能屬性）；(ii)中央記憶T CM細胞，表現L-選擇素及CCR7，其分泌IL-2但不為IFNγ或IL-4，及(iii)效應記憶T EM細胞，然而，不表現L-選擇素或CCR7，但產生類似IFNγ及IL-4之效應細胞介素）、調節T細胞（Treg、抑制T細胞、或CD4+CD25+調節T細胞）、自然殺手T細胞(NKT)、及γδT細胞。另一方面，B細胞在體液免疫中起作用（具有抗體參與）。其製造抗體及抗原且扮演抗原呈現細胞(APC)之角色，且在由抗原相互作用活化之後轉變成記憶B細胞。在哺乳動物中，未成熟B細胞係在骨髓中形成，因而得到其名稱。
用語「中和(neutralizing)」係指結合至配體且防止或降低該配體之生物效應的抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段直接阻斷配體上之結合位點，或以其他方式透過間接手段（諸如配體中之結構或能量改變）改變配體之結合能力。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段防止其所結合之蛋白質執行生物功能。
「核酸(nucleic acid)」係指核苷酸之任何聚合鏈。核酸可係DNA、RNA、或其組合。在一些實施例中，核酸包含一或多種天然核酸殘基。在一些實施例中，核酸包含一或多種核酸類似物。在一些實施例中，核酸係藉由從天然來源單離、藉由基於互補模板聚合之酶促合成（體內或體外）、在重組細胞或系統中再生、及化學合成中之一或多者來製備。在一些實施例中，核酸係至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多個殘基長（例如20至100、20至500、20至1000、20至2000、或20至5000或更多個殘基）。在一些實施例中，核酸係部分或全單股；在一些實施例中，核酸係部分或全雙股。在一些實施例中，核酸具有包含編碼多肽或係編碼多肽之序列的補體之至少一個元件之核苷酸序列。
「可操作地連接(operably linked)」係指其中所述組分處於允許其等以其預期方式起作用之關係中之鄰接位置。例如，控制元件「可操作地連接」至功能元件係以在相容的條件下達成功能元件之表現及/或活性的方式與該控制元件相關聯。在實施例中，啟動子可操作地連接至核酸。
「患者(patient)」包括患有癌症（例如多發性骨髓瘤）之任何人類。用語「對象(subject)」及「患者」在本文中可互換使用。
用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」、及「蛋白/蛋白質(protein)」可互換使用，並且係指包含由肽鍵所共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸的最大數目沒有限制。多肽包括包含彼此由肽鍵所接合之二或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文中所使用，該用語係同時指短鏈（在所屬技術領域中亦經常稱為例如肽、寡肽、及寡聚物）及長鏈（在所屬技術領域中通常稱為蛋白質，而蛋白質有許多類型）。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括自然肽、重組肽、合成肽、或其組合。
用語「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」係指分子或組成物當向接受者投予時，對其接受者無害，或對其接受者的益處超過任何有害效應。關於用於調配如本文所揭示之組成物的載劑、稀釋劑、或賦形劑，醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑必須與組成物之其他成分相容且對其接受者無害，或對接受者的益處必須超過任何有害效應。用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」意指醫藥上可接受之材料、組成物、或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封材料，其涉及將藥劑自身體之一個部分攜帶或運輸至另一部分（例如自一個器官至另一個）。在醫藥組成物中存在之各載體在與配方之其他成分相容之情況下必須係「可接受(acceptable)」，且對患者無害，或必須對接受者的益處超過任何有害效應。可作為醫藥上可接受之載劑的材料之一些實例包含：糖，諸如乳糖、葡萄糖、及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及黃豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇、及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原的水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；及醫藥配方中採用的其他非毒性相容物質。
用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指其中活性劑與一或多種醫藥上可接受之載劑調配在一起之組成物。在一些實施例中，活性劑以適於治療方案中投予之單位劑量存在，該治療方案展示當向相關對象或群體投予時達成預定治療效果之統計顯著機率。在一些實施例中，醫藥組成物可經調配用於以固體或液體形式投予，包含但不限於適用於以下形式：經口投予，例如灌劑（水性或非水溶液或懸浮液）、錠劑（例如彼等目標用於口腔、舌下及全身性吸收）、用於施用至舌片之丸劑、粉末、顆粒、膏；腸胃外投予，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射作為例如無菌溶液或懸浮液或持續釋放配方；局部施用，例如作為乳膏、軟膏或控制釋放貼片、或施用至皮膚、肺或口腔之噴霧；陰道內或直腸內，例如作為栓劑、乳膏或泡沫；舌下；眼；經皮膚；或經鼻、肺及其他黏膜表面。
用語「增生(proliferation)」係指細胞分裂之增加，細胞之對稱或不對稱分裂。在一些實施例中，「增生」係指T細胞之對稱或不對稱分裂。相較於未經處理之樣本中之細胞，當經處理樣本中之細胞數目增加時，發生「增生增加」。
用語「參考(reference)」描述與其進行比較之標準或控制。舉例而言，在一些實施例中，將所關注之藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值與作為藥劑、動物、個體、群體、樣本、序列、或值之參考或對照相比較。在一些實施例中，將所關注之測試、測量或判定與參考或對照實質上同時測試、測量及/或判定。在一些實施例中，參考或對照係歷史參考或對照，該歷史參考或對照可選地實施在有形介質中。通常，參考或對照係在與評估對象相當的條件或情況下判定或表徵的。當存在足夠的相似性以證明對所選擇之參考或對照的依賴及/或比較是合理的。
「調節T細胞(regulatory T cell)」（「Treg」、「Treg細胞」、或「Tregs」）係指參與控制某些免疫活性（例如自體免疫、過敏、及對感染之反應）之CD4+ T淋巴球譜系。調節T細胞可調節T細胞群之活性，且亦可影響某些先天性免疫系統細胞類型。Treg可藉由生物標記CD4、CD25、及Foxp3之表現及CD127之低表現識別。天然存在之Treg細胞通常構成約5%至10%周邊CD4+ T淋巴球。然而，腫瘤微環境內之Treg細胞（亦即腫瘤浸潤Treg細胞），Treg細胞可能佔總CD4+ T淋巴球群之多達20至30%。
用語「樣本(sample)」通常係指從所關注源獲得或衍生之材料之等分試樣。在一些實施例中，所關注源係生物或環境源。在一些實施例中，所關注來源可包含細胞或生物體，諸如細胞群、組織、或動物（例如人類）。在一些實施例中，所關注源包含生物組織或流體。在一些實施例中，生物組織或流體可包含羊水、房水、腹水、膽汁、骨髓、血液、乳汁、腦脊髓液、耵聹、乳糜、纓、射精、內淋巴、滲出液、糞便、胃酸、胃液、淋巴液、黏液、心包液、外淋巴液、腹膜液、胸膜液、膿液、風濕液、唾液、皮脂、精液、血清、包皮垢、痰液、滑液、汗液、淚液、尿液、陰道分泌物、玻璃狀液、嘔吐物、及/或其組合或組分。在一些實施例中，生物流體可包含胞內流體、胞外流體、靜脈內流體（血漿）、組織間隙液、淋巴液、及/或移植細胞流體。在一些實施例中，生物流體可包含植物滲出液。在一些實施例中，可獲得生物組織或樣本例如藉由抽吸、活體組織切片（例如細針或組織活體組織切片）、拭子（例如口腔、鼻、皮膚、或陰道拭子）、刮刀、手術、洗滌或灌洗（例如支氣管肺泡、導管、鼻、眼部、口腔、子宮、陰道、或其他洗滌或灌洗）。在一些實施例中，生物樣本包含獲自個體之細胞。在一些實施例中，樣本係藉由任何適當方式直接自所關注來源獲得之「初級樣本(primary sample)」。在一些實施例中，如從上下文中將清楚的，用語「樣本(sample)」係指藉由處理（例如藉由移除一或多種組分及/或藉由添加一或多種劑至）初級樣本而獲得的製劑。此類「經處理樣本」可包含例如核酸或蛋白質，其係萃取自樣本中或藉由使初級樣本經受一或多種技術而獲得，諸如核酸之擴增或反轉錄、某些組分之單離及/或純化等。
「單鏈可變片段」、「單鏈抗體可變片段」或「scFv」抗體指包含僅藉由連接子肽連接之重鏈及輕鏈之可變區的抗體形式。
用語「癌症階段(stage of cancer)」係指癌症進展水準之定性或定量評定。在一些實施例中，用於判定癌症之階段之標準可包含但不限於下列之一或多者：癌症在本體中之位置、腫瘤尺寸、癌症是否已擴散至淋巴結，癌症是否已擴散至本體中之一或多種不同部分等。在一些實施例中，可使用所謂的TNM系統對癌症進行分級，根據該系統T係指主要腫瘤之尺寸及程度，通常稱為原發腫瘤；N係指附近具有癌症之淋巴結的數目；且M係指癌症是否已轉移。在一些實施例中，癌症可稱為0期（存在異常細胞但未擴散至附近組織，亦稱為原位癌或CIS；CIS不是癌症，但可能會變成癌症），I-III期（存在癌症；數目愈高，腫瘤愈大，且其擴散至附近組織之程度越大），或IV期（癌症已擴散至本體之遠端部分）。在一些實施例中，癌症可指定為選自由以下所組成之群組之階段：原位；局部（癌症受限於其開始之地點，不具有其擴散的跡象）；區域（癌症已擴散至附近淋巴結、組織、或器官）；遠端（癌症已擴散至本體之遠端部分）；及未知（不存在足夠資訊以判定該階段）。
「刺激(stimulation)」係指藉由刺激分子與其同源配體之結合誘導的初級反應，其中該結合介導信號轉導事件。「刺激分子(stimulatory molecule)」係T細胞上之分子，例如T細胞受體(TCR)/CD3複合物，其與存在於抗原呈現細胞上之同源刺激配體特異性結合。「刺激配體(stimulatory ligand)」係當存在於抗原呈現細胞（例如APC、樹突細胞、B細胞、及類似者）上時可與T細胞上之刺激分子特異性結合的配體，從而介導T細胞之初級反應，包括但不限於活化、起始免疫反應、增生、及類似者。刺激配體包括但不限於抗CD3抗體（諸如OKT3）、載有肽之MHC I類分子、超促效劑抗CD2抗體、及超促效劑抗CD28抗體。
詞組「治療劑(therapeutic agent)」可指任何藥劑，其在投予生物體時引發所欲藥理效應。在一些實施例中，若其證實跨適當群體之統計顯著效應，則將藥劑視為治療劑。在一些實施例中，適當群體可係模型生物體或人類對象之群體。在一些實施例中，適當群體可藉由各種標準定義，諸如特定年齡組、性別、遺傳背景、預先存在之臨床病況、根據生物標記之存在或不存在等。在一些實施例中，治療劑係可用於減輕、改善、和緩、抑制、預防疾病、病症、及/或病況之一或多種症狀或特徵、延緩其發作、降低其嚴重性、及/或降低其發生率的物質。在一些實施例中，治療劑係在其銷售之前已經過或需要政府機關批准之藥劑，以便投予至人類。在一些實施例中，治療劑係需要醫學處方才能投予至人類之藥劑。
一種治療劑（例如經工程改造之CAR T細胞或NK細胞）之「治療有效量(therapeutically effective amount)」、「有效劑量(effective dose)」、「有效量(effective amount)」、或「治療有效劑量(therapeutically effective dosage)」係任何量，當單獨或與另一治療劑組合使用時，保護對象免受疾病之發作或促進疾病回歸，表現為疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀期之頻率及持續時間增加，或預防由於疾病折磨造成的損害或殘疾。促進疾病回歸之治療劑之能力可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類對象中、在預測人類功效的動物模型系統中、或藉由在體外檢定中檢定藥劑之活性。
用語「轉導(transduction)」及「轉導(transduced)」係指藉由病毒載體將外來DNA引入細胞中之程序（參見Jones et al.，「Genetics: principles and analysis，」Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)）。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾(Epstein Barr)病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。
「轉化(transformation)」係指將外源DNA引入宿主細胞中之任何方法。可使用各種方法在天然或人工條件下進行轉化。轉化可使用任何已知方法來達成，該方法用於插入外來核酸序列至原核或真核宿主細胞中。在一些實施例中，基於被轉化之宿主細胞及/或待插入之核酸來選擇一些轉化方法。轉化方法可包含但不限於病毒感染、電穿孔、及脂質轉染。在一些實施例中，「轉化」細胞係經穩定地轉化，其中所插入之DNA能夠複製作為自主複製質體或作為宿主染色體之部分。在一些實施例中，轉化之細胞可表現引入核酸。
對象之「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指向對象進行之任何類型之干預或過程，或向對象投予活性劑，目的係反轉、緩解、改善、抑制、減緩或預防症狀、併發症或病況之發作、進展、發展、嚴重程度或再發、或與疾病相關聯之生物化學指示。在一個實施例中，「治療(treatment)」或「治療(treating)」」包括部分緩解。在另一實施例中，「治療」包括完全緩解。在一些實施例中，治療可係未展現出相關疾病、病症及/或病況之徵象之對象，及/或僅展現出疾病、病症及/或病況之早期徵象之對象。在一些實施例中，此類治療可係展現出相關疾病、病症及/或病況之一或多種建立徵象之對象。在一些實施例中，治療可係已診斷患有相關疾病、病症及/或病況之對象。在一些實施例中，治療可係已知具有一或多個敏感性因子之對象，該一或多個敏感性因子與相關疾病、病症及/或病況之發展風險增加的統計學上相關。
用語「載體(vector)」係指經修飾以包含或合併所提供核酸序列之接受者核酸分子。一種類型之載體係「質體(plasmid)」，其係指額外DNA可連接之環狀雙股DNA分子。另一種類型之載體係病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在其等被引入的宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起源之細菌載體及游離基因(episomal)哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離基因哺乳動物載體）在引入宿主細胞中後可整合至宿主細胞之基因體中，且藉此與宿主基因體一起複製。此外，某些載體包含直接表現可操作性地連接至其之插入基因之序列。此類載體在本文中可稱為「表現載體(expression vector)」。標準技術可用於經工程改造之載體，例如在Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其以引用方式併入本文中。
用語「序列(sequence)」係指任何長度之核苷酸序列，其可係DNA或RNA；可係線性、圓形或支鏈，且可為單股或雙股。用語「供體序列(donor sequence)」係指插入基因體中之核苷酸序列。供體序列可係任何長度，例如長度在2與10,000個核苷酸之間（或其間或以上之任何整數），較佳在長度約100與1,000個核苷酸之間（或其間之任何整數），更佳地長度在約200與500個核苷酸之間。
對於本揭露之目的，「基因(gene)」包括編碼基因產物之DNA區（參見下文），以及調節基因產物之產生的所有DNA區，無論此類調節序列是否相鄰於編碼及/或轉錄序列。因此，基因包括但不必然限於啟動子序列、終止子、轉譯調節序列，諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點、強化子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起源、基質附接位點、及基因座控制區。
「跨膜域(transmembrane domain)」係多肽之域，其包括至少一個連續胺基酸序列，當在哺乳動物細胞中表現且存在於對應內源性多肽中時，該序列穿過脂質雙層。舉例而言，當在哺乳動物細胞中表現且存在於相應之內源性多肽中時，跨膜域可包括一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個連續胺基酸序列，該序列各自穿過脂質雙層。跨膜域可例如包括至少一個（例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個）連續胺基酸序列（當在哺乳動物細胞中表現且存在於對應內源性多肽中時穿過脂質雙層），該等胺基酸序列在脂質雙層中具有α-螺旋二級結構。在一些實施例中，跨膜域可包括二或更多個連續胺基酸序列（當在哺乳動物細胞中表現且存在於對應內源性多肽中時各自穿過脂質雙層），該等胺基酸序列在脂質雙層中形成β-桶狀二級結構。跨膜域之非限制性實例描述於本文中。跨膜域之額外實例係所屬技術領域中已知的。
當用於描述多肽之位置時，詞組「質膜之胞外側(extracellular side of the plasma membrane)」意指多肽包括至少一個穿過質膜之跨膜域及位於胞外空間中之至少一個域（例如至少一個抗原結合域）。
除非具體相反地指示，否則本揭露可使用在本領域之技術範圍內之化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、基因學、免疫學、及細胞生物學之方法，其中許多為了說明之目的描述於下文。此類技術在文獻中完整解釋。參見例如Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition, 2001)；Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, updated July 2008)； Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley–Interscience；Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985)；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992； Transcription and Translation(B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)；Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in ImmunologyQ. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)； Annual Review of Immunology；以及在期刊上之專論，諸如 Advances in Immunology。
本揭露提供抗原受體(CAR)，其包含能夠結合一或多種NKG2D配體的NKG2D胞外域之一部分，在本文中稱為NKG2D CAR。其他情況下，本揭露提供用於治療癌症及/或用於起始或調節免疫反應之方法及組成物。在一些實施例中，NKG2D CAR與對於一或多種腫瘤抗原具有特異性之TCR及/或對於一或多種腫瘤抗原具有特異性之一或多個額外CAR一起表現。
本揭露之各種實施例提供編碼本文提供之NKG2D CAR的載體，例如編碼NKG2D CAR的載體。本揭露之各種實施例提供編碼TCR或一或多個額外CAR（例如，結合不同於NKG2D CAR之目標的CAR）之載體，例如編碼NKG2D CAR及TCR或一或多個額外CAR之載體。在一些實施例中，NKG2D CAR編碼於與編碼TCR或一或多個額外CAR之載體分開的載體中。在一些實施例中，NKG2D CAR編碼於與編碼TCR或一或多個額外CAR之載體相同的載體中。
本揭露之各種實施例提供編碼或表現NKG2D CAR之細胞，例如經工程改造以編碼或表現NKG2D CAR之誘導性多能性細胞(iPSC)、T細胞、或NK細胞。本揭露之各種實施例提供編碼或表現NKG2D CAR及TCR或一或多個額外CAR之細胞，例如經工程改造以編碼或表現NKG2D CAR及TCR或一或多個額外CAR之T細胞或NK細胞。本揭露提供經基因修飾之免疫細胞，其具有整合基因，例如所關注的核苷酸序列（例如組成型表現建構體及/或包含此類核苷酸序列之可誘導型表現建構體。在實施例中，免疫細胞進一步經工程改造以表現TCR或一或多個額外CAR。在一些實施例中，本揭露提供治療患有腫瘤之對象之方法，其包含向該對象投予本文所述之NKG2D CAR療法。在一些實施例中，方法進一步包含投予一或多種額外療法（例如第二結合劑（例如CAR-T細胞、CAR-NK細胞、TCR-T細胞、TIL細胞、同種異體NK細胞、及自體NK細胞）、抗體-藥物接合物、抗體、雙特異性抗體、T細胞接合雙特異性抗體、經工程改造抗體、及/或本文所描述之多肽）。
自然殺手細胞會優先表現數種鈣依賴性（C型）凝集素，其已涉及NK細胞功能之調控。NKG2D（NCBI基因ID：22914，如2021年3月7日所更新，其以引用方式併入本文中）為屬於C型凝集素樣受體之NKG2家族的跨膜蛋白。NKG2基因家族位於NK複合物內，其為含有數種優先在NK細胞中表現之C型凝集素基因的區域。NKG2D為用於偵測及消除經轉化及受感染之細胞的識別受體，因為在細胞遭受壓力（因為受到感染或基因體壓力，諸如癌症）時會誘導其配體。NKG2D結合多樣化的配體家族，包括MHC I類鏈相關A與B蛋白及UL-16結合蛋白。這些配體之表面表現對於免疫系統識別受壓力細胞而言相當重要，因而此蛋白及其配體成為治療免疫疾病及癌症之治療目標。
NKG2D配體為不存在或僅以低水準存在於正常細胞表面上之自誘導性蛋白，但是受感染、經轉化、衰老、及受壓力細胞則會過度表現這些配體。其表現在不同階段（轉錄、mRNA、及蛋白穩定化、自細胞表面裂解）藉由各種壓力路徑而受到調控。NKG2D配體與MHC I類分子同源且分成兩個家族：MIC及RAET1/ULBP。人類MIC基因位於MHC基因座內且包含七個成員(MICA-G)，其中只有MICA及MICB會產生功能性轉錄。在十種已知的人類RAET1/ULBP基因中，六種會編碼功能性蛋白：RAET1E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2、RAET1/ULBP1、RAET1L/ULBP6、RAET1N/ULBP3。
嵌合抗原受體(CAR)為可引導或重導T細胞或NK細胞（例如患者或供體T或NK細胞）至所選目標之經工程改造之受體。CAR可經工程改造以識別目標（諸如抗原且在所揭示之NKG2D CAR之情況下為NKG2D配體），並且在結合至該目標時，活化免疫細胞以攻擊及破壞帶有該目標之細胞。當這些目標存在於腫瘤細胞上時，表現該CAR之免疫細胞即可靶向及殺滅該腫瘤細胞。CAR通常包含介導抗原結合之胞外結合域（例如NKG2D ecto域）、當CAR存在於細胞表面或細胞膜時跨越或理解為跨越細胞膜之跨膜域、及胞內（或細胞質性）信號傳導域。
根據至少一個非限制性視圖，已存在至少三個「代(generation)」之CAR組成物。在第一代CAR中，結合域（例如單鏈片段變數、結合域）經由跨膜域鏈接或連接至信號傳導域（例如CD3ζ），該跨膜域可選地包含鉸鏈域及一或多個間隔物。在第二代CAR中，引入共刺激域（CM1，諸如CD28、4-1BB、或OX-40）與信號傳導域（例如CD3ζ）。在第三代CAR中，包含第二共刺激域(CM2)。
TCR係由α鏈及β鏈所構成之異二聚體。TCR信號傳導需要募集產生免疫突觸之信號傳導蛋白質。此外，TCR在質膜處之局部化取決於CD3複合物，其在T細胞中表現。可產生經工程改造單鏈TCR，例如使用CAR建構體之跨膜及信號傳導域、已知之方法及建構體（例如sTCR及TCR-CAR分子，例如TCRβ鏈與CD28 TM及CD28及CD3ζ信號傳導模組之融合）。
本揭露之NKG2D CAR可包含結合NKG2D配體之胞外NKG2D域。在一些實施例中，抗原結合系統進一步包含共刺激域、及/或胞外域（例如「鉸鏈」或「間隔子」區域）、及/或跨膜域、及/或胞內（信號傳導）域、及/或CD3-ζ或CD3-ε活化域。
在某些實施例中，NKG2D CAR包含NKG2D ecto域（胞外域）多肽，其係指與下列具有至少75%序列同一性之多肽（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID 3。LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV (seQ ID NO: 3)。在實施例中，NKG2D ecto鉸鏈域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據TTATTCAACCAAGAAGTCCAGATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGCGGCCCATGTCCGAAAAACTGGATATGTTATAAAAATAACTGTTACCAGTTCTTCGATGAATCTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCATCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTGCTCAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCACTGGATGGGATTGGTACACATTCCCACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGCGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGTTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTA (seQ ID NO: 4)之序列的核酸。在實施例中，NKG2D ecto鉸鏈域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據TTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAAAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTG (SEQ ID NO: 5)之序列的核酸。在實施例中，NKG2D ecto鉸鏈域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據TTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAGAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAATCTAAGAATTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTTAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATATATTTGCATGCAAAG GACTGTG (seQ ID NO: 55)之序列的核酸。
在一些實施例中，本揭露之NKG2D CAR可包含抗原結合系統，其包含下列之一或多者、或全部：導引肽(P)、NKG2D ecto域(B)、鉸鏈(E)、跨膜域(T)、共刺激域(C)、第二共刺激域(C')、及活化域(A)。在一些情況下，NKG2D CAR根據下列而組態：B E T A。在某些情況下，活化域包含一或多個活化域。在某些態樣中，活化域包含CD3ζ、CD3ε、或CD3ζ及CD3ε兩者。在一些情況下，NKG2D CAR根據下列而組態：P B E T A。在一些情況下，NKG2D CAR根據下列而組態：B E T C A。在一些情況下，NKG2D CAR根據下列而組態：P B E T C A。在一些情況下，NKG2D CAR根據下列而組態：B E T C C' A。在一些情況下，NKG2D CAR根據下列而組態：P B E T C C' A。
在某些實施例中，本文所涵蓋之CAR可包含各種域之間的連接子殘基，添加用於分子之適當間隔構形。本文所涵蓋之CAR可包含一、兩個、三個、四個、或五個或更多個連接子。在一些實施例中，連接子之長度係約1至約25個胺基酸、約5至約20個胺基酸、或約10至約20個胺基酸、或任何中介長度之胺基酸。在一些實施例中，連接子係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸長。
連接子之說明性實例包括甘胺酸聚合物(G)n；甘胺酸-絲胺酸聚合物(G 1–5S 1–5)n，其中n為至少一、二、三、四、或五之整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及所屬技術領域中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對非結構化，且因此可能夠充當融合蛋白域（諸如本文所述之CAR）之間的中性連繫。甘胺酸甚至比丙胺酸能進入更多的φ–ψ空間，且比具有較長側鏈之殘基限制更少（參見Scheraga, Rev. Computational Chem.11173–142 (1992)）。本文所涵蓋之其他連接子包括惠特洛(Whitlow)連接子（參見Whitlow, Protein Eng. 6(8): 989–95 (1993)）。所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，一些實施例中之CAR的設計可包括全部或部分可撓性之連接子，使得連接子可包括可撓性連接子以及賦予較低可撓性結構之一或多個部分，以提供所欲CAR結構。在一個實施例中，本文所述之建構體中之任一者可包含「GS」連接子。在另一實施例中，本文所述之建構體中之任一者包含「GSG」連接子。在一實例中，甘胺酸-絲胺酸連接子包含胺基酸序列GS (SEQ ID NO: 6)或由其組成，其可藉由根據ggatcc (SEQ ID NO: 7)或gggtcc (SEQ ID NO: 8)之核酸序列編碼。在一實例中，甘胺酸-絲胺酸連接子包含胺基酸序列GGGSGGGS (SEQ ID NO: 9)或由其組成，其可藉由根據ggcggtggaagcggaggaggttcc (SEQ ID NO: 10)之核酸序列編碼。在另一實施例中，本文所述之CAR包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 11 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 11)。在一實施例中，連接子藉由核酸序列編碼，該核酸序列與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：根據gggagcactagcggctctggcaaacctggatctggcgagggatctaccaagggc (SEQ ID NO: 12)、gggagcacaagcggctctggcaaacctggatctggcgagggatctaccaagggc (SEQ ID NO: 13)、或gggagcacaagcggctctggcaaacctggatccggcgagggatctaccaagggc (SEQ ID NO: 14)之核酸序列。
CAR之結合域可通常接著一或多個「鉸鏈域(hinge domain)」，其在定位抗原結合域遠離效應細胞表面上起作用，以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合及活化。CAR通常包含結合域與跨膜域之間的一或多個鉸鏈域。鉸鏈域可衍生自天然、合成、半合成、或重組源。鉸鏈域可包括天然存在之免疫球蛋白鉸鏈區或改變免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所涵蓋之CAR可包含鉸鏈，其係、來自、或衍生自（例如包含所有或片段的）免疫球蛋白樣鉸鏈域。在一些實施例中，鉸鏈域來自免疫球蛋白或衍生自免疫球蛋白。在一些實施例中，鉸鏈域係選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、或IgM、或其片段之鉸鏈。鉸鏈可衍生自天然來源或合成來源。適用於本文所描述之CAR中之鉸鏈區包括衍生自類型1膜蛋白（諸如CD8α、CD4、CD28、及CD7）之胞外區的鉸鏈區，其可係來自這些分子之野生型鉸鏈區，或可經改變。鉸鏈可衍生自天然來源或合成來源。在一些實施例中，本揭露之抗原結合系統可包含係來自、或衍生自（例如包含所有或片段）CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4–1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3–ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7–H3)、CD279 (PD–1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK–p46)、CD336 (NK–p44)、CD337 (NK–p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、LFA–1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP–10、ICAM–1、NKp80 (KLRF1)、IL–2Rβ、IL–2Rγ、IL–7Rα、LFA1–1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、a CD83配位體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、或Toll配位體受體、或其片段或組合。
此等鉸鏈域之多核苷酸及多肽序列係已知的。在一些實施例中，編碼鉸鏈域之多核苷酸包含與已知核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之核苷酸序列。在一些實施例中，鉸鏈域之多肽序列包含與已知多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之多肽序列。
在實施例中，鉸鏈域包含CD8α鉸鏈區。在實施例中，本文所述之CAR包含來自CD8α之鉸鏈域，該CD8α具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID NO: 15 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 15))。在實施例中，來自CD8α之鉸鏈域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：具有根據：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 16)之序列的核酸。在實施例中，來自CD8α之鉸鏈域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），具有根據：ACAACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCTTGTGAC (SEQ ID NO: 17)之序列的核酸。在實施例中，來自CD8α之鉸鏈域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：具有根據ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCCGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 18)之序列的核酸。在實施例中，來自CD8α之鉸鏈域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%），具有根據ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGCGGCGCAGTGCACACGAGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 56)之序列的核酸。
在實施例中，鉸鏈域包含截短之CD28鉸鏈區(CD28T)鉸鏈區，諸如揭示於國際專利申請案：2017年3月31日申請之PCT/US2017/025351，其以全文引用之方式併入本文中。在實施例中，本文所述之CAR包含CD28T鉸鏈域，其具有胺基酸序列，該胺基酸序列與以下具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID NO: 19 (LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 19))。在實施例中，CD28T鉸鏈域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC (SEQ ID NO: 20)之序列的核酸。
一般而言，（例如抗原結合系統之）「跨膜域(transmembrane domain)」係指當在細胞表面或細胞膜存在於分子中時，具有存在於膜中之屬性的域（例如跨越一部分或所有細胞膜）。本揭露之抗原結合系統之共刺激域可進一步包含跨膜域及/或胞內信號傳導域。不需要跨膜域中之每一胺基酸存在於膜中。舉例而言，在一些實施例中，跨膜域特徵在於蛋白質之指定段或部分實質上位於膜中。可使用多種演算法分析胺基酸或核酸序列以預測蛋白質子細胞定位（例如跨膜定位）。程式psort (PSORT.org)及Prosite (prosite.expasy.org)係此類程式之例示性。
包含於本文所述之抗原結合系統中之跨膜域的類型不限於任何類型。在一些實施例中，選擇與結合域及/或胞內域天然相關之跨膜域。在一些情況下，跨膜域包含一或多個胺基酸之修飾（例如缺失、插入、及/或取代），例如以避免此類域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合以最小化與受體複合物之其他成員相互作用。
跨膜域可衍生自天然或合成來源。在來源係天然之情況下，域可衍生自任何膜結合或跨膜蛋白。例示性跨膜域可衍生自（例如可包含至少一跨膜域）T細胞受體之α、β、或ζ鏈、2B4、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276 (B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96 (Tactile)、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DAP-12、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)結合之配位體、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1; CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4）、SLAMF6（NTB-A；Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。在一些實施例中，跨膜域可為合成（且可例如包含主要疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸）。在一些實施例中，苯丙胺酸之三聯體、色胺酸、及纈胺酸包含在合成跨膜域之各端處。在一些實施例中，跨膜域直接鏈接或連接至細胞質域。在一些實施例中，短寡肽或多肽連接子（例如在長度之2與10個胺基酸之間）可形成跨膜域與胞內域之間的連接。在一些實施例中，連接子係甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
本文所提供之跨膜域之多核苷酸及多肽序列係已知的。在一些實施例中，編碼跨膜域之多核苷酸包含與已知核苷酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之核苷酸序列。在一些實施例中，跨膜域之多肽序列包含與已知多肽序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%（例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）同一之多肽序列。可選地，短間隔子可在CAR之任何或一些胞外、跨膜、及胞內域之間形成連接。
在實施例中，本文所述之NKG2D CAR包含來自CD28之TM域，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID NO: 21 (FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 21))。在實施例中，來自CD28之TM域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列一致性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (SEQ ID NO: 22)之序列的核酸。在實施例中，來自CD28之TM域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列一致性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據TTTTGGGTATTGGTAGTAGTGGGCGGAGTCCTGGCTTGCTATAGTCTGCTAGTAACAGTGGCTTTTATTATATTTTGGGTG (SEQ ID NO: 23)之序列的核酸。在實施例中，來自CD28之TM域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列一致性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG (SEQ ID NO: 24)之序列的核酸。
在實施例中，本文所述之CAR包含來自CD8α之TM域，其具有與下列具有至少75%序列一致性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID NO: 25(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 25))。在實施例中，來自CD8α之TM域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列一致性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTATTGC (SEQ ID NO: 26)之序列的核酸。在實施例中，來自CD8α之TM域藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列一致性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC (SEQ ID NO: 57)之序列的核酸。
已知可在抗原結合至免疫細胞時轉導信號的胞內信號傳導域，其中任一者可包含於本揭露之抗原結合系統中。舉例而言，已知T細胞受體(TCR)之細胞質序列在TCR結合至抗原之後起始信號轉導（參見例如Brownlie et al., Nature Rev. Immunol. 13:257-269 (2013)）。
在一些實施例中，本文所涵蓋之CAR包含胞內信號傳導域。「胞內信號傳導域」係指CAR之部分，其參與將有效CAR結合至目標抗原之訊息轉導至免疫效應細胞內部以引發效應細胞功能，例如活化、細胞介素產生、增生、及細胞毒性活性，包括細胞毒性因子至結合CAR之目標細胞的釋放、或與胞外CAR域結合之抗原引發的其他細胞反應。在一些實施例中，信號傳導域及/或活化域包含基於免疫受體酪胺酸之活化域(ITAM)。含有細胞質信號傳導序列之ITAM之實例包含衍生自TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 ζ、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之彼等（參見例如Love et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a002485 (2010); Smith-Garvin et al., Annu. Rev. Immunol. 27:591-619 (2009)）。在某些實施例中，合適的信號傳導域包含但不限於4-1BB/CD137、活化NK細胞受體、免疫球蛋白蛋白質、B7-H3、BAFFR、BLAME (SLAMF8)、BTLA、CD100 (SEMA4D)、CD103、CD160 (BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276 (B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96 (Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、細胞介素受體、DAP-10、DNAM1 (CD226)、Fcγ受體、GADS、GITR、HVEM (LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα (CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、可誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、與CD83結合之配體、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9 (CD229)、Ly108)、淋巴球功能相關抗原1 (LFA-1; CD1-1a/CD18)、MHC第1型分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80 (KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程式性死亡1 (PD-1)、PSGL1、SELPLG (CD162)、信號傳導淋巴球性活化分子（SLAM蛋白）、SLAM (SLAMF1; CD150；IPO-3)、SLAMF4 (CD244; 2B4)、SLAMF6（NTB-A、SLAMF7、SLP-76、TNF受體蛋白、TNFR2、TNFSF14、鐸配體受體、TRANCE/RANKL、VLA1、或VLA-6、或其片段、截短、或組合。
用語「效應功能(effector function)」係指細胞之特定功能。T細胞之效應功能，例如可係細胞溶解活性或包括細胞介素之分泌之幫助或活性。因此，用語「胞內信號傳導域」係指蛋白質之部分，其轉導效應功能信號且引導細胞以執行特定功能。雖然通常可採用整個胞內信號傳導域，但在許多情況下，不必使用整個域。在使用胞內信號傳導域之截短部分的程度，只要其轉導效應功能信號，則可使用此類截短部分代替整個域。用語胞內信號傳導域意欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導域之任何截短部分。
已知透過單獨TCR產生之信號不足於完全活化T細胞且亦可能需要二級或共刺激信號。因此，T細胞活化可說是藉由兩種不同類別的胞內信號傳導域介導：透過TCR（例如TCR/CD3複合物）起始抗原依賴性初級活化之初級信號傳導域及以抗原非依賴性方式作用之共刺激信號傳導域，以提供二級或共刺激信號。在一些實施例中，本文所設想之CAR包含含一或多個「共刺激信號傳導域」及「初級信號傳導域」之胞內信號傳導域。
含有適用於本揭露之一次信號傳導域之ITAM之說明性實例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、DAP12、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之彼等。在一些實施例中，CAR包含CD3ζ初級信號傳導域及一或多個共刺激信號傳導域。胞內初級信號傳導及共刺激信號傳導域可以任何順序串聯連接至跨膜域之羧基端。在一個實施例中，CAR具有CD3ζ域，該CD3ζ域具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 27。LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 27)。在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGAAGGAGAGAAGAGTACGATGTTCTAGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCACGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTACAAAAAGATAAAATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGCCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 28)。在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGACGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 29)之序列的核酸。
在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 30)。在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAAGGGCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGCTGA (SEQ ID NO: 58)。在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CTGAGAGTTAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGACAGAATCAACTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAGGAATACGATGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAACCTAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTCTACCAGGGCTTAAGCACAGCTACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTAGATGA (SEQ ID NO: 59)之序列的核酸。在實施例中，CD3ζ域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：CTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAAGGGCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGGCGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGCTGA (SEQ ID NO: 60)。
在一些實施例中，CAR包含CD3ζ信號傳導域、CD3ε信號傳導域、及一或多個共刺激信號傳導域。胞內初級信號傳導及共刺激信號傳導域可以任何順序串聯連接至跨膜域之羧基端。在一個實施例中，CAR具有CD3ε域，該CD3ζ域具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 31。KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGL (SEQ ID NO: 31)。在一個實施例中，CAR具有CD3ε域，該CD3ζ域具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: __。KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO: 61)。
在實施例中，CD3ε域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AAGAACCGAAAAGCAAAAGCCAAGCCTGTTACAAGAGGAGCAGGGGCAGGAGGCCGACAGAGAGGGCAAAACAAAGAAAGGCCCCCGCCCGTCCCAAACCCGGATTATGAGCCAATTAGGAAGGGTCAGAGAGACCTGTATTCTGGGCTC (SEQ ID NO: 32)之序列的核酸。在實施例中，CD3ε域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AAGAACCGCAAAGCAAAGGCAAAACCCGTCACACGAGGAGCGGGCGCAGGGGGACGACAACGCGGTCAGAATAAGGAACGCCCGCCTCCAGTACCAAATCCAGATTATGAACCAATTCGGAAGGGACAACGCGATCTCTACTCCGGTCTCAATCAGAGGCGAATT (SEQ ID NO: 62)之序列的核酸。
本文所涵蓋之CAR包含一或多個共刺激信號傳導域以增強T細胞表現CAR受體之功效及擴增。如本文所用，用語「共刺激信號傳導域」或「共刺激域」係指共刺激分子之胞內信號傳導域。在一些實施例中，共刺激分子可包括DAP-10、DAP-12、CD27、CD28、CD137(4–IBB)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、PD–I、ICOS (CD278)、CTLA4、LFA–1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAPIO、LAG3、HVEM、B7-H3、NKD2C、GITR、CD5、ICAM-l、CDl la、Lck、TNFR-I、TNFR-II、FasR、NKG2C、及B7-H3、及CD83。
在實施例中，CAR包含4–1BB共刺激域，其具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 33。KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE (SEQ ID NO: 33)。在實施例中，CAR包含4–1BB共刺激域，其具有與下列具有至少75%序列同一性胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: __。KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 63)。在實施例中，4–IBB共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AAACGAGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACAACTCAGGAGGAGGATGGCTGTAGCTGCCGATTCCCGGAAGAAGAAGAAGGTGGCTGTGAA (SEQ ID NO: 34)之序列的核酸。在實施例中，4–IBB共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA (SEQ ID NO: 35)之序列的核酸。在實施例中，4–IBB共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAA (SEQ ID NO: 36)之序列的核酸。在實施例中，4–IBB共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACACAGGAGGAAGACGGCTGCAGCTGTAGATTCCCCGAGGAAGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTG (SEQ ID NO: 64)之序列的核酸。
在實施例中，CAR包含CD28共刺激域，其具有與下列具有至少75%序列同一性胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 37。RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 37)。在實施例中，CD28共刺激域係由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO: 38)之序列的核酸。
本文所述之經工程改造之NKG2D CAR亦可包含在NKG2D ecto域之N端處之N端信號肽或標籤。在一個實施例中，可使用異源信號肽。可將抗原結合域融合至前導或信號肽，其將初生蛋白質引導至內質網且隨後轉位至細胞表面。應理解的是，一旦含有信號肽之多肽在細胞表面表現，信號肽通常在多肽於內質網中處理並轉位至細胞表面之期間被蛋白裂解移除。因此，諸如本文所描述之CAR建構體之多肽作為缺乏信號肽之成熟蛋白通常在細胞表面處表現，而多肽之前驅物形式包括信號肽。可使用所屬技術領域中已知之任何合適的信號序列。類似地，亦可使用所屬技術領域中已知之任何已知標籤序列。
在實施例中，信號序列係CD8α信號序列。在實施例中，本文所述之NKG2D CAR包含CD8α信號序列，其具有與下列具有至少75%序列一致性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID NO: 39；MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 39)。在實施例中，CD8α信號序列藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ATGGCTCTTCCTGTGACTGCACTACTGCTGCCCCTGGCCTTACTTCTTCATGCTGCGCGTCCT (SEQ ID NO: 40)之序列的核酸。在實施例中，CD8α信號序列藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCT (SEQ ID NO: 65)之序列的核酸。
在一實施例中，信號序列係CSF2RA信號序列。在實施例中，本文所述之NKG2D CAR包含CSF2RA信號序列，其具有與下列具有至少75%序列一致性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%一致性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP (SEQ ID NO: 41)、MEWTWVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 42)、或MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 43)。在實施例中，CSF2RA信號序列藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCT (SEQ ID NO: 44)之序列的核酸。
CAR之組分可使用生物技術用於等效組分之常規技術交換或「對換(swapped)」。為僅提供幾個非限制性及部分實例，本揭露之CAR可包含如本文所提供之結合域與本文所提供之鉸鏈及本文所提供之共刺激域之組合。在某些實例中，本揭露之CAR可包含如本文所提供之導引序列連同本文所提供之結合域與本文所提供之鉸鏈及本文所提供之共刺激域之組合。
在本文所述之一實施例中，NKG2D CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 45。MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 45)。在實施例中，NKG2D CAR結合CAR藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ATGGCTCTTCCTGTGACTGCACTACTGCTGCCCCTGGCCTTACTTCTTCATGCTGCGCGTCCTTTATTCAACCAAGAAGTCCAGATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGCGGCCCATGTCCGAAAAACTGGATATGTTATAAAAATAACTGTTACCAGTTCTTCGATGAATCTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCATCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTGCTCAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCACTGGATGGGATTGGTACACATTCCCACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGCGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGTTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTAACAACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCTTGTGACTTTTGGGTATTGGTAGTAGTGGGCGGAGTCCTGGCTTGCTATAGTCTGCTAGTAACAGTGGCTTTTATTATATTTTGGGTGAAACGAGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACAACTCAGGAGGAGGATGGCTGTAGCTGCCGATTCCCGGAAGAAGAAGAAGGTGGCTGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGAAGGAGAGAAGAGTACGATGTTCTAGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCACGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTACAAAAAGATAAAATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGCCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 46)之序列的核酸。
在實施例中，NKG2D CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 47。LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 47)。在實施例中，NKG2D CAR結合CAR藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：TTATTCAACCAAGAAGTCCAGATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGCGGCCCATGTCCGAAAAACTGGATATGTTATAAAAATAACTGTTACCAGTTCTTCGATGAATCTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCATCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTGCTCAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCACTGGATGGGATTGGTACACATTCCCACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGCGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGTTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTAACAACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGAGGCCTGAAGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCTTGTGACTTTTGGGTATTGGTAGTAGTGGGCGGAGTCCTGGCTTGCTATAGTCTGCTAGTAACAGTGGCTTTTATTATATTTTGGGTGAAACGAGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACAACTCAGGAGGAGGATGGCTGTAGCTGCCGATTCCCGGAAGAAGAAGAAGGTGGCTGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGGCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGAAGGAGAGAAGAGTACGATGTTCTAGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCACGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTACAAAAAGATAAAATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGCCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTTCACATGCAAGCTCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 48)之序列的核酸。
在實施例中，NKG2D CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 49。MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 49)。在實施例中，NKG2D CAR結合CAR藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：ATGGCTCTTCCTGTGACAGCTCTTCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTTCTGCATGCTGCTAGACCTTTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAAAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAAAGAACCGAAAAGCAAAAGCCAAGCCTGTTACAAGAGGAGCAGGGGCAGGAGGCCGACAGAGAGGGCAAAACAAAGAAAGGCCCCCGCCCGTCCCAAACCCGGATTATGAGCCAATTAGGAAGGGTCAGAGAGACCTGTATTCTGGGCTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGACGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 50)之序列的核酸。
在實施例中，NKG2D CAR構築體具有與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：SEQ ID NO: 51。LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 51)。在實施例中，NKG2D CAR結合CAR藉由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85至90%、85至95%、85至100%、90至95%、90至100%、或95至100%）：具有根據：TTATTCAACCAAGAAGTCCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGTTACCAATTCTTCGATGAAAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAGGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGACGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCATCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACATACATCTGCATGCAAAGGACTGTGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAACCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAAAAGAACCGAAAAGCAAAAGCCAAGCCTGTTACAAGAGGAGCAGGGGCAGGAGGCCGACAGAGAGGGCAAAACAAAGAAAGGCCCCCGCCCGTCCCAAACCCGGATTATGAGCCAATTAGGAAGGGTCAGAGAGACCTGTATTCTGGGCTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGCATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGACGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 52)之序列的核酸。
本揭露涵蓋本文所述具有經工程改造之T細胞受體(TCR)之NKG2D CAR用於T細胞免疫療法中之用途。TCR庫可針對其對於目標抗原之選擇性進行篩選。以此方式，可將對於目標抗原具有高結合性(avidity)及反應性之天然TCR選出、選殖，隨後引入用於過繼性免疫療法之T細胞群中。亦表現本文所述之NKG2D CAR的具有經工程改造之TCR之T細胞或NK細胞不僅能夠因為TCR特異性而靶向特定抗原，也能靶向表現NKG2D配體之細胞。因此，將TCR與本文所述之NKG2D CAR組合可提供一種維持或增強過繼性T細胞免疫療法之治療效果的方式。在實施例中，本文所述之NKG2D CAR與TCR共表現。
在本文所述之一實施例中，T細胞或NK細胞藉由引入編碼TCR之次單元的多核苷酸而修改，其可形成對T細胞或NK細胞賦予特異性之TCR以針對表現目標抗原及/或NKG2D配體之腫瘤細胞。在一些實施例中，與天然存在之次單元相比，該等次單元具有一或多個胺基酸取代、缺失、插入、或修飾，只要該等次單元保留形成TCR而對經轉染之T細胞及NK細胞賦予靶向細胞，並參與免疫學相關細胞介素信號傳導之能力。經工程改造之TCR亦可結合顯示具有高結合性之有關腫瘤相關肽的目標細胞，且可選地在體內介導呈現相關肽之目標細胞的有效率殺滅。
編碼經工程改造之TCR的核酸可自T細胞之（天然存在）染色體中自其天然環境中單離出來，且可結合至如本文他處所述之合適載體中。核酸及包含其之載體均可轉移至細胞中，該細胞可為T細胞。經修飾之T細胞接著能夠表現由經轉導之核酸或多種核酸編碼之TCR的一或多個鏈（且在一些態樣中為兩個鏈）。在一些實施例中，經工程改造之TCR係外源TCR，因為將其引入通常不表現所引入TCR之T細胞中。經工程改造之TCR的基本態樣是其對於由主要組織相容性基因複合物(MHC)或類似免疫組分所呈現之腫瘤抗原具有高結合性。與經工程改造之TCR相比，CAR係經工程改造而以MHC非依賴性之方式結合目標抗原。
由本文所述之核酸編碼之蛋白質可表現為具有附接至TCR之α鏈或β鏈之胺基末端或羧基末端部分的額外多肽，只要所附接之額外多肽不會干擾α鏈或β鏈形成功能性T細胞受體及MHC依賴性抗原識別之能力。
由本文所涵蓋之經工程改造之TCR所識別的抗原包括但不限於癌症抗原，包括在血液科癌症與實體腫瘤兩者及病毒誘導性癌症上之抗原。用於治療HPV誘導性子宮頸癌之TCR療法係具有前景之受關注領域。溶瘤蛋白HPV–16 E6及HPV–16 E7因此可為用於與TCR搭配使用之潛在目標抗原（參見例如國際專利申請案第PCT/US2015/033129）。其他說明性抗原包括但不限於HPV致癌蛋白，包括HPV–16 E6與HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、EGFR、EGFR家族包括ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRa、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、HLA–Al+MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、MAGA-A3、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–11Rα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ES0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素、TAG72、TACI、TEM、及VEGFRII。
組合如本文所述之任何TCR構築體與本揭露之NKG2D CAR可回復、維持或增強TCR療法之治療效果。因此，在本文所述之一實施例中，NKG2D CAR在T細胞或NK細胞中與針對HPV之TCR共表現。因此，在另一實施例中，NKG2D CAR在T細胞或NK細胞中與針對HPV–16 E6蛋白之TCR共表現。因此，在本文所述之另一個實施例中，NKG2D CAR在T細胞或NK細胞中與針對HPV–16 E7蛋白之TCR共表現。
T細胞或NK細胞亦可經載體基因工程改造，該等載體經設計以表現將毒性重導向腫瘤細胞之第二CAR（除了NKG2D CAR以外）。在一些實施例中，CAR組合了基於抗體之對於目標抗原（例如腫瘤抗原）的特異性而具有活化胞內域以產生展現特定抗腫瘤細胞免疫活性之嵌合蛋白。本揭露涵蓋本文所述之NKG2D CAR與一或多個額外CAR之組合使用。類似於TCR之使用，NKG2D CAR與一或多個額外CAR之共表現可促進擴增增強、保護及（在一些情況下）回復CAR療法。在實施例中，NKG2D CAR與一或多個額外CAR共表現。
本文所涵蓋之一或多個額外CAR包含結合至特定目標抗原之胞外域（亦稱為結合域或抗原特異性結合域）、跨膜域、及胞內信號傳導域。一或多個額外CAR之主要特徵為其重導免疫效應細胞特異性之能力，藉以利用單株抗體、可溶性配體、或細胞特異性共受體來觸發增生、細胞介素產生、吞噬作用或分子產生（其可以主要組織相容性(MHC)非依賴性方式介導表現目標抗原之細胞的細胞死亡）。
在一些實施例中，一或多個額外CAR包括胞外結合域，其包括但不限於特異性結合目標抗原之抗體或其抗原結合片段、連繫配體、共受體之胞外域。作為非限制性實例，目標抗原可包括：HPV–16 E6與HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、EGFR、EGFR家族包括ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRa、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、HLA–Al+MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–llRα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NYE-S0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素、TACI、TAG72、TEM、及VEGFRII；在本文所述之實施例中，CAR結合至腫瘤抗原，其包含BCMA、CLL-1、CD19、CD20、CD22、CD28、CD137 (4–1BB)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、PSCA、PSMA、或TACI。
在一些實施例中，本文所涵蓋之一或多個額外CAR包含特異性結合至目標多肽（例如，在腫瘤細胞上表現之目標抗原）之胞外結合域。如本文所使用，用語「結合域(binding domain)」、「胞外結合域(extracellular binding domain)」、「抗原特異性結合域(antigen–specific binding domain)」、「抗原結合域(antigen binding domain)」、及「胞外抗原特異性結合域(extracellular antigen specific binding domain)」可互換使用且提供具有特異性結合至所關注目標抗原之能力的CAR。結合域可包含具有特異性識別及結合至生物分子（例如細胞表面受體或腫瘤蛋白、脂質、多醣、或其他細胞表面目標分子、或其組分）之任何蛋白質、多肽、寡肽、或肽。結合域包含對於所關注生物分子之任何天然存在、合成、半合成、或重組產生的結合夥伴(binding partner)。
在一些實施例中，一或多個額外CAR之胞外結合域包括抗體或其抗原結合片段。「抗體(antibody)」係指一種結合劑，其為包含至少一輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區之多肽，該可變區特異性識別且結合目標抗原之表位，諸如肽、脂質、多醣、或含有抗原決定子之核酸，諸如免疫細胞所識別者。抗體包括其抗原結合片段。該用語亦包括經基因工程改造之形式，諸如嵌合抗體（例如，人源化鼠類抗體）、雜接合物抗體（諸如，雙特異性抗體）及其抗原結合片段。亦參見Pierce Catalog and Handbook, 1994–1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997。
在一些實施例中，目標抗原係HPV致癌蛋白之表位，包括HPV–16 E6與HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、EGFR、EGFR家族包括ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRa、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、HLA–Al+MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–llRα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NYE-S0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素、TAG72、TEM、TACI、及VEGFRII多肽。在本文所述之一實施例中，CAR結合至腫瘤抗原表位，其包含BCMA、CLL-1、CD19、CD20、CD22、CD28、CD137 (4–1BB)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖–3 (GPC3)、PSCA、PSMA、或TACI。
在某些實施例中，本文所涵蓋之一或多個額外CAR可包含各種域之間的連接子殘基，例如在VH及VL域之間，添加用於分子之適當間隔構形。本文所涵蓋之CAR可包含一、兩個、三個、四個、或五個或更多個連接子。在一些實施例中，連接子之長度係約1至約25個胺基酸、約5至約20個胺基酸、或約10至約20個胺基酸、或任何中介長度之胺基酸。在一些實施例中，連接子係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸長。
連接子之說明性實例包括甘胺酸聚合物(G)n；甘胺酸-絲胺酸聚合物(G1–5S1–5)n，其中n為至少一、二、三、四、或五之整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及所屬技術領域中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對非結構化，且因此可能夠充當融合蛋白域（諸如本文所述之CAR）之間的中性連繫。甘胺酸甚至比丙胺酸能進入更多的φ–ψ空間，且比具有較長側鏈之殘基限制更少（參見Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173–142 (1992)）。本文所涵蓋之其他連接子包括惠特洛(Whitlow)連接子（參見Whitlow, Protein Eng. 6(8): 989–95 (1993)）。所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，一些實施例中之CAR的設計可包括全部或部分可撓性之連接子，使得連接子可包括可撓性連接子以及賦予較低可撓性結構之一或多個部分，以提供所欲CAR結構。在一個實施例中，本文所述之建構體中之任一者可包含「GS」連接子。在另一實施例中，本文所述之建構體中之任一者包含「GSG」連接子。在另一實施例中，本文所述之CAR包含與下列具有至少75%序列同一性之胺基酸序列（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：SEQ ID NO: 40。GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 40)。
在其他實施例中，CAR包含進一步包含可變區連接序列之scFv。「可變區連接序列(variable region linking sequence)」係將重鏈可變區連接至輕鏈可變區之胺基酸序列，且提供與兩個子結合域之相互作用相容之間隔子功能，使得所得多肽保持與包含相同之輕及重鏈可變區之抗體相同的目標分子之特異性結合親和力。在一個實施例中，可變區連接序列係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸長。
在其他實施例中，CAR之結合域接著係一或多個「間隔域」，其係指將抗原結合域移動遠離效應細胞表面以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合及活化之區(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419)。間隔域可衍生自天然、合成、半合成、或重組源。在某些實施例中，間隔域係免疫球蛋白之部分，包括但不限於一或多個重鏈恆定區，例如CH2及CH3。間隔域可包括天然存在之免疫球蛋白鉸鏈區或改變免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
CAR之結合域可通常接著一或多個「鉸鏈域(hinge domain)」，其在定位抗原結合域遠離效應細胞表面上起作用，以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合及活化。CAR通常包含結合域與跨膜域之間的一或多個鉸鏈域。鉸鏈域可衍生自天然、合成、半合成、或重組源。鉸鏈域可包括天然存在之免疫球蛋白鉸鏈區或改變免疫球蛋白鉸鏈區之胺基酸序列。
當二或更多個多肽之表現係所欲者，可藉由IRES序列來分離編碼其之多核苷酸序列。在另一實施例中，二或更多個多肽可表現為包含一或多個自我剪切多肽序列之融合蛋白，諸如T2A多肽。在其他實施例中，其由不同啟動子表現，且可在兩個或更多個載體中。在一些實施例中，NKG2D CAR編碼於與TCR及/或一或多個非NKD2D CAR相同之載體中且可操作地連接至相同啟動子，其中序列藉由IRES序列分開。在一些實施例中，NKG2D CAR編碼於與TCR及/或一或多個非NKD2D CAR相同之載體中且可操作地連接至相同啟動子，其中序列藉由可裂解連接子分開。在一些實施例中，NKG2D CAR編碼於與TCR及/或一或多個非NKD2D CAR相同之載體中且NKG2D CAR連接至與TCR及/或一或多個非NKD2D CAR不同之啟動子。在一些實施例中，NKG2D CAR編碼於與TCR及/或一或多個非NKD2D CAR不同的載體中。
除非相反地規定，否則「多肽」、「多肽片段」、「肽」、及「蛋白質」係根據習知含義，即作為胺基酸序列。多肽不限於特定長度，例如其可包含全長蛋白質序列或全長蛋白質之片段，且可包括多肽之轉譯後修飾，例如醣基化、乙醯基化、磷酸化及類似者，以及所屬技術領域中天然存在及非天然存在之其他修飾。在各種實施例中，本文所設想之多肽包含在蛋白質之N端處之信號（或前導）序列，其共轉譯或轉譯後地引導蛋白質之轉移。
多肽包括「多肽變體」。多肽變體可與天然存在之多肽有一或多個取代、缺失、添加、及/或插入之不同。此類變體可係天然存在或可例如藉由修飾上述多肽序列中之一或多者而合成產生。例如，在一些實施例中，可為所欲的是藉由引入一或多個取代、缺失、添加、及/或插入來改善經工程改造之NKG2D CAR之結合親和力及/或其他生物性質。較佳地，本揭露之多肽包括與其具有至少約50%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%、或99%胺基酸同一性之多肽。本揭露之多肽包括與本文所述之參考序列（參見例如序列表）中之任一者具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性之變體，一般而言變體維持參考序列之至少一種生物活性。多肽包括「多肽片段」。多肽片段係指多肽，其可係單體或多聚體，其具有胺基端缺失、羧基端缺失、及/或天然存在或重組產生之多肽之內部缺失或取代。在某些實施例中，多肽片段可包含至少5至約500個胺基酸長之胺基酸鏈。應瞭解，在某些實施例中，片段係至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、或450個胺基酸長。
多肽亦可框內融合或接合至連接子或其他序列，以便於合成、純化或識別多肽（例如聚-His），或增強多肽至固體支撐物之結合。如上所述，本揭露之多肽可以各種方式改變，包括胺基酸取代、缺失、截短、及插入。此類操控之方法通常係所屬技術領域中已知的。例如，參考多肽之胺基酸序列變體可藉由DNA中之突變製備。用於突變誘發及核苷酸序列改變之方法係所屬技術領域中熟知的。參見例如Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488–492)、Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367–382)、美國專利第4,873,192號、Watson, J. D. et al., ( Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)及其中所引用之參考文獻。對於不影響所關注蛋白質之生物活性之適當胺基酸取代的指南可在Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)之模型中發現。
在某些實施例中，變體將含有保守性取代。「保守性取代」係其中用一個胺基酸取代具有類似性質之另一胺基酸者，使得在肽化學技術領域中具有通常知識者將預期多肽之二級結構及疏水性(hydropathic)本質實質上不變。可在本揭露之多核苷酸及多肽之結構中進行修飾，且仍獲得編碼具有所欲特徵之變體或或衍生性多肽之功能性分子。
多肽變體進一步包括醣基化形式、與其他分子之聚集接合物、及與不相關化學部份（例如聚乙二醇化分子）之共價接合物。如所屬技術領域中所已知，共價變體可藉由將官能性連接至在胺基酸鏈中或在N端或C端殘基處發現之基團來製備。變體亦包括等位基因變體、物種變體、及突變蛋白質(mutein)。不影響蛋白質功能活性的區域之截短或缺失亦係變體。
本揭露之多肽包括融合多肽。在一些實施例中，提供編碼融合多肽之融合多肽及多核苷酸。融合多肽及融合蛋白係指具有至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、或十個或更多個多肽區段之多肽。融合多肽一般將C端連接至N端，儘管其亦可將C端連接至C端、N端連接至N端、或N端連接至C端。融合蛋白之多肽可呈任何順序或指定順序。融合多肽或融合蛋白亦可包括保守修飾之變異體、多型性變異體、等位基因、突變體、子序列、及種間同源物，只要融合多肽之所欲轉錄活性得以保存。融合多肽可藉由化學合成方法或藉由兩個部分之間的化學連接產生，或通常可使用其他常見技術製備。包含融合多肽之連接之DNA序列可操作地連接至如本文其他地方所論述之適合的轉錄或轉譯控制元件。
在一個實施例中，融合伴體包含有助於表現蛋白質（表現增強子）之序列，其產量高於天然重組蛋白質。可選擇其他融合伴體以便增加蛋白質之溶解度或使蛋白質靶向至所欲胞內隔室或促進經由細胞膜傳輸融合蛋白。
融合多肽可進一步包含在本文所述之多肽域之各者之間的多肽裂解信號。此外，多肽位點可放入任何連接子肽序列中。例示性多肽裂解信號包括多肽裂解識別位點，諸如蛋白酶裂解位點、核酸酶裂解位點（例如稀有限制酶識別位點、自身裂解核酶識別位點）、及自身裂解病毒寡肽（參見deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616–26）。適合的蛋白酶裂解位點及自身裂解肽係所屬技術領域中具有通常知識者已知（參見例如Ryan et al., 1997. J Gener. Viral.78, 699–722; Scymczak et al.(2004) Nature Biotech.5, 589–594）。例示性蛋白酶裂解位點包括但不限於以下之裂解位點：馬鈴薯Y病毒(potyvirus) Nia蛋白酶（例如，煙草蝕刻病毒蛋白酶）、馬鈴薯Y病毒HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒Pl (P35)蛋白酶、byovirus Nia蛋白酶、byovirus RNA-2編碼之蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、腸病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、picoma 3C蛋白酶、豇豆花葉病毒(comovirus) 24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒(nepovirus) 24K蛋白酶、類RTSV（水稻東格魯球形病毒）3C蛋白酶、類PYVF（歐洲防風黃點病毒）3C蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa、及腸激酶。由於其高裂解嚴格性，可使用TEV（煙草蝕刻病毒）蛋白酶裂解位點。在其他實施例中，自身裂解肽可包括獲自馬鈴薯Y病毒及心病毒2A肽、FMDV（口蹄疫病毒）、馬鼻炎A病毒、Thosea asigna病毒、及豬鐵士古病毒之彼等多肽序列。在其他實施例中，自身裂解多肽位點包含2A或類2A位點、序列或域(Donnelly et al., 2001. J Gen. Viral. 82:1027–1041)。
一般而言，應理解，任何適當病毒載體可用於轉導本文所述之經工程改造之建構體。在本文中所描述之一個實施例中，用反轉錄病毒載體（例如慢病毒載體）轉導細胞（例如T細胞、NK細胞、或iPSC）。如本文中所使用，用語「反轉錄病毒(retrovirus)」係指將其基因體RNA反轉錄成直鏈雙股DNA副本隨後將其基因體RNA共價整合至宿主基因體之RNA病毒。適用於一些實施例之說明性反轉錄病毒包括但不限於：莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈威(Harvey)鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳房腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗蘭德(Friend)鼠白血病病毒、鼠幹細胞病毒(MSCV)及勞氏肉瘤病毒(RSV)及慢病毒。
如本文所用，用語「慢病毒(lentivirus)」係指複合物反轉錄病毒之群（或屬）。說明性慢病毒包括但不限於：HIV（人類免疫缺陷病毒；包括HIV類型1及HIV類型2）；梅迪-威司奈(visna-maedi)病毒(VMV)；山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)；馬傳染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；及猴免疫缺陷病毒(SIV)。
用語「載體(vector)」在本文中係指能夠轉移或運輸另一核酸分子之核酸分子。轉移之核酸通常連接至例如插入載體核酸分子中。載體可包括引導細胞中之自主複製之序列，或可包括足以允許整合至宿主細胞DNA之序列。可用載體包括例如質體（例如DNA質體或RNA質體）、轉位子、黏接質體、細菌人工染色體、及病毒載體。可用病毒載體包括例如複製缺陷反轉錄病毒及慢病毒。
如所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，用語「病毒載體」廣泛用以指包括通常促進核酸分子之轉移或整合至細胞之基因體之病毒衍生核酸元件之核酸分子（例如轉移質體），或介導核酸轉移之病毒粒子。除了核酸外，病毒粒子通常將包括各種病毒組分，且有時亦包括宿主細胞組分。
用語病毒載體(viral vector)可指能夠將核酸轉移至細胞中之病毒或病毒粒子或經轉移之核酸本身。病毒載體及轉移質體含有主要衍生自病毒之結構及/或功能基因元件。用語「反轉錄病毒載體(retroviral vector)」係指含有主要衍生自反轉錄病毒之結構及功能基因元件或其部分之病毒載體或質體。用語「慢病毒載體(lentiviral vector)」係指含有主要衍生自慢病毒之結構及功能基因元件或其部分（包括LTR）之病毒載體或質體。用語「混合載體(hybrid vector)」係指含有反轉錄病毒（例如慢病毒）序列及非反轉錄病毒序列之載體、LTR或其他核酸。在一個實施例中，混合載體係指包含用於反轉錄、複製、整合、及/或封裝之反轉錄病毒（例如慢病毒）序列之載體或轉移質體。
在一些實施例中，用語「慢病毒載體」、「慢病毒表現載體(lentiviral expression vector)」可用於指慢病毒轉移質體及/或傳染性慢病毒顆子。在本文中對元件（諸如選殖位點、啟動子、調節元件、異源核酸等）做出參考之情況下，應理解此等元件之序列以RNA形式存在於本揭露之慢病毒粒子中且以DNA形式存在於本揭露之DNA質體中。在本文所述之一個實施例中，表現載體係慢病毒表現載體。
在前病毒之各端處係稱作「長末端重複序列(long terminal repeat)」或「LTR」之結構。用語「長末端重複序列(LTR)」係指位於反轉錄病毒DNA之端部處之鹼基對之域，該等域在其天然序列背景下係直接重複序列且含有U3、R、及U5區。LTR通常提供對反轉錄病毒基因之表現（例如基因轉錄之促進、起始及多腺苷化）及病毒複製之基本功能。該LTR含有許多調節信號，包括轉錄控制元件、多腺苷化信號、及用於病毒基因體之複製及整合所需之序列。病毒LTR分成稱為U3、R、及U5之三個區。U3區含有增強子及啟動子元件。U5區係引子結合位點與R區之間之序列且含有多腺苷化序列。R（重複）區係側接U3及U5區。LTR由U3、R、及U5區構成，且在病毒基因體之5'及3'端二者處出現。相鄰於5’ LTR係用於基因體（tRNA引子結合位點）之反轉錄及用於病毒RNA有效封裝至粒子（Psi位點）所必需之序列。
如本文中所使用，用語「封裝信號(packaging signal)」或「封裝序列(packaging sequence)」係指位於反轉錄病毒基因體內之序列，需要該等序列用於將病毒RNA插入病毒殼體或粒子中，參見例如Clever et al., 1995. J of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101–2109。若干反轉錄病毒載體使用病毒基因體殼體化所需之最小封裝信號（亦稱為psi ['P]序列）。因此，如本文所使用，用語「封裝序列」、「封裝信號」、「psi」、及符號「P」係參考在病毒粒子形成期間反轉錄病毒RNA股之殼體化所需之非編碼序列使用。
在各種實施例中，載體包含經修飾之5' LTR及/或3' LTR。LTR中之任一者或兩者可包含一或多個修飾，包括但不限於一或多個去除、插入或取代。通常對3' LTR進行修飾以藉由使病毒複製缺陷來改善慢病毒或反轉錄病毒系統之安全性。如本文中所使用，用語「複製缺陷(replication–defective)」係指不能完全有效複製使得未產生傳染性病毒粒子之病毒（例如複製缺陷慢病毒後代）。用語「複製勝任(replication–competent)」係指能夠複製使得病毒之病毒複製能夠產生傳染性病毒粒子之野生型病毒或突變型病毒（例如複製勝任慢病毒後代）。
「自失活(self–inactivating)」(SIN)載體係指複製缺陷載體，例如反轉錄病毒或慢病毒載體，其中右(3') LTR增強子-啟動子區（稱作U3區）已經修飾（例如藉由去除或取代）以防止病毒轉錄超過第一輪病毒複製。此係因為右(3') LTR U3區係在病毒複製期間用作左(5') LTR U3區之模板，且因此，不可在無U3增強子-啟動子下進行病毒轉錄。在本揭露之另一實施例中，3'LTR經修飾使得U5區例如經理想poly(A)序列置換。應注意，在本文中亦涵蓋對LTR之修飾，諸如對3'LTR、5'LTR、或3'及5'LTR二者之修飾。
額外安全性增強係藉由將5'LTR之U3區用異源啟動子置換以驅動病毒基因體在病毒粒子之產生期間之轉錄來提供。可使用之異源啟動子之實例包括例如病毒性猴病毒40 (SV40)（例如早期或晚期）、巨細胞病毒(CMV)（例如立即早期）、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、及單純疱疹病毒(HSV)（胸苷激酶）啟動子。典型啟動子能夠以Tat獨立方式驅動高水準轉錄。此置換降低重組以產生複製勝任病毒之概率，因為病毒產生系統中不存在完整U3序列。在某些實施例中，異源啟動子具有控制病毒基因體轉錄之方式的額外優勢。舉例而言，異源啟動子可係可誘導，使得病毒基因體之所有或部分之轉錄僅在誘導因子存在時發生。誘導因子包括但不限於一或多種化學化合物或生理條件，諸如培養宿主細胞之溫度或pH。
在一些實施例中，病毒載體包含TAR元件。用語「TAR」係指位於慢病毒（例如HIV）LTR之R區中之「反式活化反應(trans–activation response)」基因元件。此元件與慢病毒反式活化劑(tat)基因元件相互作用以增強病毒複製。
「R區(R region)」係指在封端基團開始（即轉錄開始）時開始且在poly A束開始之前立即結束之反轉錄病毒LTR內之區。R區亦定義為側接U3及U5區。R區在反轉錄期間於許可初生DNA自基因體之一端轉移至另一端中起作用。
如本文中所使用，用語「FLAP元件(FLAP element)」係指核酸，其序列包括反轉錄病毒（例如HIV-I或HIV-2）之中心多嘌呤束及中心終止序列（cPPT及CTS）。適合的FLAP元件描述於美國專利第6,682,907號及在Zennou, et al., 2000, Cell, 101: 173中。在HIV-I反轉錄期間，正股DNA在中心多嘌呤束(cPPT)處之中心啟動及在中心終止序列(CTS)處之中心終止導致三股DNA結構：HIV-I中心DNA瓣之形成。儘管不希望受任何理論束縛，但DNA瓣可作用為慢病毒基因體核輸入之順式活化決定位及/或可增加病毒之效價。
在一個實施例中，反轉錄病毒或慢病毒轉移載體包含一或多個輸出元件。用語「輸出元件(export element)」係指順式作用轉錄後調節元件，其調節RNA轉錄本自細胞核傳輸至細胞質。RNA輸出元件之實例包括但不限於人類免疫缺陷病毒(HIV) rev反應元件(RRE)（參見例如Cullen et al., 1991. J Virol. 65: 1053；及Cullen et al., 1991. Cell 58: 423）及B型肝炎病毒轉錄後調節元件(HPRE)。一般而言，將RNA輸出元件置放於基因之3' UTR內，且可作為一或多個副本插入。
在其他實施例中，病毒載體中之異源序列之表現藉由將轉錄後調節元件、有效多腺苷化位點、及可選地轉錄終止信號併入載體中增加。各種轉錄後調節元件可增加異源核酸在蛋白質處之表現，例如伍德查克(woodchuck)肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE; Zufferey et al., 1999, J Virol., 73:2886)；B型肝炎病毒中存在之轉錄後調節元件(HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864)；及類似者(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)。
在一些實施例中，載體可包括具有轉錄或轉譯調節活性之調節性寡核苷酸。此類寡核苷酸可用於調節表現之控制之各種基因表現組態中。轉錄調節性寡核苷酸可增加（增強）或減少（沉默）重組表現建構體之表現水準。調節性寡核苷酸可以特定方式選擇性調節表現，包括例如賦予組織特異性、發育階段特異性、或多核苷酸之相似表現（包括構成或可誘導表現）。本揭露之調節性寡核苷酸亦可為包含操作地連接至可表現多核苷酸之調節性寡核苷酸之表現載體或重組核酸分子之組分。調節性元件可係自幾個核苷酸至幾百個核苷酸之各種長度。
引導異源核酸轉錄本之有效終止及多腺苷化之元件會增加異源基因表現。轉錄終止信號通常發現在多腺苷化信號之下游。在一些實施例中，載體包含編碼待表現之多肽之多核苷酸之多腺苷化序列3'。如本文中所用，用語「poly A位點」或「poly A序列」表示引導初生RNA轉錄本藉由RNA聚合酶II終止及多腺苷化二者之DNA序列。多腺苷化序列可藉由添加poly A尾至編碼序列之3'端促進mRNA穩定性，且因此促成轉譯效率增加。重組轉錄本之有效多腺苷化係所欲的，因為缺少poly A尾之轉錄本係不穩定且經快速降解。可用於本揭露之載體中之poly A信號之說明性實例包括理想poly A序列（例如AATAAA、ATTAAA、AGTAAA）、牛生長激素poly A序列(BGHpA)、兔β-球蛋白poly A序列(rβgpA)、或所屬技術領域中已知之另一適合的異源或內源性poly A序列。
本文亦描述「密碼子最佳化(codon-optimized)」核酸。「密碼子最佳化」核酸係指已改變之核酸序列，使得密碼子在特定系統（諸如特定物種或物種群組）中之表現係最佳的。舉例而言，可藉由用在物種的基因中更頻繁或最頻繁地使用之密碼子替換原生序列之至少一個、多於一個、或顯著數量之密碼子來最佳化核酸序列，以在哺乳動物細胞或特定哺乳動物物種（諸如人類細胞）中表現。密碼子最佳化不改變經編碼蛋白質之胺基酸序列。
密碼子最佳化核苷酸序列可存在與表現功效相關之改良性質。在一些實施例中，可最佳化待轉錄之DNA序列以促進更有效轉錄及/或轉譯。在一些實施例中，DNA序列可針對順式調節元件（例如，TATA盒、終止信號、及蛋白質結合位點）、人工重組位點、chi位點、CpG二核苷酸含量、陰性CpG島、GC含量、聚合酶滑移位點、及/或相關於轉錄之其他要件進行最佳化；DNA序列可針對隱蔽的切割位點、mRNA次要結構、mRNA之穩定自由能、重複序列、RNA不穩定域、及/或相關於mRNA處理及穩定之其他要件進行最佳化；DNA序列可針對密碼子使用偏壓、密碼子可調適性、內部chi位點、核糖體結合位點（例如IRES）、早期polyA位點、Shine-Dalgarno (SD)序列、及/或相關於轉譯之其他要件進行最佳化；及/或DNA序列可針對密碼子上下文、密碼子-反密碼子相互作用、轉譯暫停位點、及/或相關於蛋白摺疊之其他要件進行最佳化。
載體可具有一或多個LTR，其中任何LTR包含一或多個修改，諸如一或多個核苷酸取代、添加、或缺失。載體可進一步包含更多附件要件中之一者以增加轉導效率（例如，cPPT /FLAP）、病毒封裝（例如，Psi (Ψ)封裝信號、RRE）、及/或增加治療基因表現（例如，poly (A)序列）之其他要件，且可選地包含WPRE或HPRE。具有通常知識者應瞭解，許多其他不同實施例可自本揭露之現有實施例中形成。
「宿主細胞(host cell)」包括於體內、離體、或體外用本揭露之重組載體或多核苷酸轉染、感染、或轉導之細胞。宿主細胞可包括封裝細胞、生物細胞、及感染病毒載體之細胞。在一些實施例中，向需要療法之對象投予感染本揭露之病毒載體之宿主細胞。在某些實施例中，用語「目標細胞(target cell)」與宿主細胞可互換使用，且指所欲細胞類型之經轉染、感染、或轉導細胞。在一些實施例中，目標細胞係T細胞。
通常需要大規模病毒粒子產生以達成合理病毒力價。病毒粒子藉由轉染移轉載體至包含病毒結構及/或輔助基因之封裝細胞系中來產生，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx、或nef基因或其他反轉錄病毒基因。
如本文中所使用，用語「封裝載體(packaging vector)」係指缺乏封裝信號之表現載體或病毒載體，且包含編碼一個、兩個、三個、四個或更多個病毒結構及/或輔助基因之多核苷酸。一般而言，封裝載體包括於封裝細胞中，且經由轉染、轉導、或感染引入細胞中。轉染、轉導、或感染之方法係所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。本揭露之反轉錄病毒/慢病毒移轉載體可經由轉染、轉導、或感染引入封裝細胞系中，以產生生產細胞或細胞系。本揭露之封裝載體可藉由包括例如磷酸鈣轉染、脂質轉染、或電穿孔之常見方法引入人類細胞或細胞系中。在一些實施例中，封裝載體與顯性可選擇標記一起引入細胞，諸如新黴素、潮黴素、嘌呤黴素、殺稻瘟菌素(blastocidin)、吉歐黴素(zeocin)、胸腺激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA，接著在適當的藥物存在下選擇並分離植株。可選擇標記基因可實體地連接至藉由封裝載體編碼之基因，例如藉由IRES或自身裂解病毒肽。
病毒套膜蛋白質(env)判定宿主細胞之範圍，其可能最終藉由自細胞系產生之重組反轉錄病毒感染及轉化。在慢病毒（諸如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、及EIV）之情況下，env蛋白質包括gp41及gp120。在一些實施例中，藉由本揭露之封裝細胞表現之病毒env蛋白質在自病毒gag及pol基因之單獨載體上編碼，如先前已描述。
可在本文所描述之實施例中使用的反轉錄病毒衍生之env基因之說明性實例包括但不限於：MLV套膜、IOAI套膜、BAEV、FeLV–B、RDI 14、SSAV、Ebola、仙台病毒、FPV（雞瘟病毒）、及流感病毒套膜。類似地，可利用編碼自RNA病毒（例如，小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)、杯狀病毒科(Calciviridae)、星狀病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼腸孤病毒(Reoviridae)、雙鏈RNA病毒科(Bimaviridae)、反轉錄病毒科(Retroviridae)之RNA病毒科）以及自DNA病毒（肝去氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)、圓環病毒科(Circoviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒(Adenoviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)、及虹彩病毒科(Iridoviridae)）之套膜之基因。代表性實例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、Rabies、ALV、BIV、BL V、EBV、CAEV、SNV、ChTL V、STLV、MPMV SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CTIO、及EIAV。
在其他實施例中，用於假型化本揭露之病毒之套膜蛋白包括但不限於以下病毒中之任一者：A型流感病毒（諸如H1N1、H1N2、H3N2、及H5Nl（禽流感））、B型流感病毒、C型流感病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、輪狀病毒、諾沃克(Norwalk)病毒群之任何病毒、腸道腺病毒、小病毒、登革熱病毒、猴痘、單股負鏈病毒(Mononegavirale)、狂犬病病毒屬(Lyssavirus)（諸如狂犬病病毒、拉哥斯(Lagos)蝙蝠病毒、莫柯拉(Mokola)病毒、杜文黑基(Duvenhage)病毒、歐洲蝙蝠病毒1及2及澳大利亞蝙蝠病毒、短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)、水皰性病毒屬(Vesiculovirus)、水皰性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒（諸如單純疱疹病毒1型及2型）、水痘帶狀疱疹、巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、人類疱疹病毒(HHV)、人類疱疹病毒6型及8型、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭狀瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒狀病毒（諸如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、沙比亞相關出血熱病毒、委內瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬丘波病毒）、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、布尼亞病毒（諸如克里米亞-剛果出血熱病毒）、漢他病毒(hantavirus)、引起腎衰竭的出血熱病毒、裂谷熱病毒、包括埃博拉(Ebola)出血熱及馬爾堡(Marburg)出血熱等的絲狀病毒科(filovirus)、Kyasanur森林病病毒的黃病毒科、鄂木斯克(Omsk)出血熱病毒、蜱傳腦炎病毒及副黏液病毒科（諸如亨德拉(Hendra)病毒及尼帕(Nipah)病毒）、大天花及小天花（天花）、α病毒諸如委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、SARS相關冠狀病毒(SARS-Co V)、西尼羅河病毒、或任何引起腦炎的病毒。
如本文所用，用語「假型(pseudotype)」或「假型化(pseudotyping)」係指一種病毒，其病毒套膜蛋白已被另一種具有其他特徵的病毒套膜蛋白取代。舉例而言，HIV可能被水皰性口炎病毒G-蛋白質(VSV–G)套膜蛋白質假型化，使HIV感染較廣範圍之細胞，因為HIV套膜蛋白質（藉由env基因編碼）通常將病毒靶向CD4+呈現細胞。
如本文所用，用語「封裝細胞系(packaging cell line)」係參考不含有封裝信號之細胞系，但穩定或暫時性表現用於正確封裝病毒粒子所必需之病毒結構蛋白及複製酶（例如gag、pol、及env）。可使用任何合適的細胞系以製備本揭露之封裝細胞。一般而言，細胞係哺乳動物細胞。在另一實施例中，用以產生封裝細胞系之細胞係人類細胞。可用於產生封裝細胞系之合適細胞系包括例如CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10Tl/2細胞、FLY細胞、Psi–2細胞、BOSC 23細胞、P A317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HTI080細胞、293細胞、293T細胞、B–50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos–2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞、及211A細胞。
如本文中所使用，用語「生產細胞系(producer cell line)」係指能夠產生重組反轉錄病毒粒子之細胞系，包含封裝細胞系及包含封裝信號之轉移載體構築體。感染性病毒粒子及病毒儲備溶液之產生可使用習知技術進行。製備病毒儲備液之方法係所屬技術領域中已知的，且藉由例如Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628–633、及N. R. Landau et al. (1992) J Virol. 66:5110–5113說明。可使用習知技術自封裝細胞收集感染性病毒粒子。舉例而言，可藉由細胞裂解或收集細胞培養物之上清液來收集感染性粒子，如所屬技術領域中已知。可選地，若所欲，則可純化所收集之病毒粒子。合適的純化技術係所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。
使用反轉錄病毒或慢病毒載體藉助於病毒感染而非轉染遞送基因或其他多核苷酸序列稱為「轉導」。在一個實施例中，通過感染及前病毒整合將反轉錄病毒載體轉導至細胞中。在某些實施例中，若目標細胞（例如T細胞或NK細胞）包含藉由使用病毒或反轉錄病毒載體感染遞送至細胞之基因或其他多核苷酸序列，則目標細胞係「經轉導」。在一些實施例中，經轉導細胞包含在其細胞基因體中藉由反轉錄病毒或慢病毒載體遞送之一或多種基因或其他多核苷酸序列。
揭示表現本揭露之建構體中之一或多者的宿主細胞。宿主細胞可以一或多種病毒載體轉導，該病毒載體包含編碼表現經工程改造之TCR及/或CAR之一或多個多肽之核酸序列。可根據本揭露之某些實施例使用的在基因療法中使用之病毒載體相關之其他方法，可見於例如Kay, M.A. (1997) Chest 111(6 Supp.): 138S–142S; Ferry, N. and Heard, J.M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975–81; Shiratory, Y. et al., (1999) Liver 19:265–74; Oka, K. et al., (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179–86; Thule, P. M. and Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7:1744–52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335–56; Alt, M. (1995) J Hepatol. 23:746–58; Brody, S. L. and Crystal, R.G. (1994) Ann. NY Acad. Sci. 716:90–101; Strayer, D.S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159–2172; Smith–Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43–49；及Lee, H. C. et al., (2000) Nature 408:483–8。
本文所描述之組成物可包含一或多個多核苷酸、多肽、包含其之載體、及T細胞組成物及NK組成物，如本文所涵蓋。本文所描述之一個實施例係組成物，其包含表現NKG2D CAR之經修飾T細胞。本文所描述之另一實施例係組成物，其包含表現NKG2D CAR之經修飾NK細胞。組成物包括但不限於醫藥組成物。「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指配製在醫藥學上可接受或生理學上可接受之溶液之組成物，其用於單獨或與一或多種其他療法組合投予至細胞或動物。亦應理解，若所欲，本揭露之組成物可與其他藥劑組合投予，諸如例如細胞介素、生長因子、激素、小分子、化學治療劑、前藥、藥物、抗體、或其他各種醫藥學上活性劑。亦不限於可包括在組成物中之其他組分，其限制條件係額外藥劑不會不利地影響組成物遞送預期療法之能力。
本文中使用詞組「醫藥學上可接受之(pharmaceutically acceptable)」係指在合理的醫療判斷範疇內適合於與人類及動物之組織接觸與合理的效益/風險比相符而不具有過量毒性、刺激、過敏反應、或其他問題或併發症之彼等化合物、材料、組成物、及/或劑型。
如本文所用，「醫藥上可接受之賦形劑、載劑、稀釋劑、或賦形劑(pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient)」包括但不限於任何的佐藥、載劑、賦形劑、助滑劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、界面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等張劑、溶劑、界面活性劑、或乳化劑，其已經美國食品藥物管理局(United States Food and Drug Administration)核准可用於人類或馴養動物。例示性醫藥上可接受之載劑包括但不限於糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、及乙酸纖維素；西黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動物及植物脂肪、石蠟、聚矽氧、皂土、矽酸、氧化鋅；油，諸如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油、及黃豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇、及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無致熱原的水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及醫藥配方中採用的任何其他相容物質。
在本文所述之一個實施例中，本揭露之組成物包含本文所涵蓋之經修飾之T細胞或NK細胞之量。通常可以說明，包含本文所涵蓋之T細胞或NK細胞之醫藥組成物可以10 2至10 10個細胞/kg體重、10 5至10 9個細胞/kg體重、10 5至10 8個細胞/kg體重、10 5至10 7個細胞/kg體重、10 7至10 9個細胞/kg體重、或10 7至10 8個細胞/kg體重（包括彼等範圍內之所有整數值）之劑量投予。細胞數目將取決於組成物之最終用途以及其中所包括之細胞類型。經修飾以表現經工程改造之NKG2D CAR的T細胞或NK細胞可以此等範圍內之劑量多次投予。細胞可係經歷治療之患者的同種異體、同基因、異種、或自體。若所欲，治療亦可包括投予如本文所述之促分裂原（例如PHA）或淋巴球、細胞介素、及/或趨化激素（例如IFN–γ、IL–2、IL–7、IL–15、IL–12、TNF–α、IL–18、及TNF–β、GM–CSF、IL–4、IL–13、Flt3–L、RANTES、MIP1α等），以增強注入的T細胞之植入及功能。
大致上，包含如本文所述活化及擴增之細胞的組成物可用於治療及預防免疫功能不全或免疫抑制之個體中產生之疾病。在一些情況下，包含本文所涵蓋之經修飾之T細胞或NK細胞之組成物用於治療癌症。本文所述之經修飾之T細胞或NK細胞可單獨投予，或作為醫藥組成物與載劑、稀釋劑、賦形劑、及/或其他組分，諸如IL-2、IL-7、及/或IL-15、或其他細胞介素或細胞群體組合投予。在一些實施例中，本文所涵蓋之醫藥組成物包含與一或多種醫藥學或生理學上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑組合之經基因修飾之T細胞或NK細胞之量。
包含本文所涵蓋之經修飾之T細胞或NK細胞之醫藥組成物可進一步包含緩衝液，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、及類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或聚葡醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑（例如氫氧化鋁）；及防腐劑。本揭露之組成物可經調配用於腸胃外投予，例如血管內（靜脈內或動脈內）、腹膜內或肌肉內投予。
液體醫藥組成物（無論是溶液、懸浮液、或其他類似之形式）均可包括下列之一或多者：無菌稀釋劑（諸如用於注射之水）、鹽水溶液，諸如生理鹽水、林格氏溶液、等張氯化鈉、不揮發油（諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單甘油酯或二甘油酯）、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽，以及用於調節張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。腸胃外製劑可封閉在安瓿、拋棄式注射器、或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。亦包括無菌可注射醫藥組成物。
在一些實施例中，本文所涵蓋之組成物包含單獨或與一或多種治療劑組合之經擴增修飾之T細胞或NK細胞組成物之有效量。因此，T細胞或NK細胞組成物可單獨或與其他已知癌症治療組合投予，諸如輻射療法、化學療法、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等。組成物亦可與抗生素及抗病毒劑組合投予。此項技術中可接受此類治療劑作為如本文所述之疾病狀態（諸如癌症）之治療。在一個實施例中，本文所涵蓋之組成物亦可與TGF-β之抑制劑（例如小分子抑制劑LY55299）投予。所涵蓋之例示性治療劑包括細胞介素、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、消炎劑、化學治療劑、放射治療劑、治療性抗體、或其他活性及輔助劑。
在某些實施例中，包含本文中所涵蓋之T細胞或NK細胞之組成物可結合任何數目的化學治療劑來投予。化學治療劑之說明性實例包括但不限於烷化劑，諸如噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN™)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)、及優瑞多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)、及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥子氣，諸如氯芥苯丁酸、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、黴法蘭(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎拉黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤及5-氟脲嘧啶(5–FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如環胞苷(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5–FU；雄性激素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺麩精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；埃夫咪辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇，例如紫杉醇(TAXOL®, Bristol–Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)及多西他賽(docetaxel) (TAXOTERE®, Rhone–Poulenc Rorer, Antony, France)；氯芥苯丁酸；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP–16)；依弗醯胺；絲裂黴素C (mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊苷；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT–11；拓撲異構酶抑制劑RPS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視網酸衍生物，諸如Targretin™（貝瑟羅汀(bexarotene)）、Panretin™（阿利維A酸(alitretinoin)）；ONTAK™（地尼白介素(denileukin diftitox)）；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱；及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。該定義亦包括抗荷爾蒙劑，其作用為調控或抑制對腫瘤之荷爾蒙作用，諸如抗雌激素，包括例如泰莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基泰莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、克沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)、及托瑞米芬(toremifene) (Fareston)；及抗雄性激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳菩林(leuprolide)、及戈舍瑞林(goserelin)；及以上任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
可結合本文中所述之組成物使用各種其他治療劑。在一個實施例中，包含T細胞之組成物係與抗發炎劑一起投予。消炎劑或藥物包括但不限於類固醇及糖皮質激素（包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫化可體松(hydrocortisone acetate)、氫化可體松(hydrocortisone)、氫化可體松、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、曲安奈德(triamcinolone)），非類固醇消炎藥物(NSAIDS)包括阿司匹靈、伊布洛芬、萘普生(naproxen)、胺甲喋呤、柳氮磺胺吡啶、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺、及黴酚酸酯。
在一些實施例中，NSAID係選自由以下組成之群組：伊布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox–2抑制劑（諸如VIOXX® (rofecoxib)及CELEBREX® (celecoxib)）、及唾液酸鹽。例示性止痛劑係選自由以下組成之群組：乙醯胺酚、羥考酮、特拉嗎竇、或鹽酸丙氧芬(proporxyphene hydrochloride)。例示性糖皮質素係選自由以下組成之群組：可體松、地塞米松、氫化可體松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、或潑尼松。例示性生物反應改質劑包括針對以下之分子：細胞表面標記物（例如CD4、CD5等）、細胞介素抑制劑（諸如TNF拮抗劑（例如依那西普(etanercept)(ENBREL®））、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA®)、及英夫利昔單抗(infliximab) (REMICADE®)、趨化激素抑制劑、及黏合分子抑制劑。生物反應調節劑包括單株抗體以及分子之重組形式。例示性疾病修飾抗風濕藥物(DMARD)包括硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、胺甲喋呤、青黴胺、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥氯喹、金（口服金諾芬(auranofin)及肌內）、及米諾四環素。
在其他實施例中，適合與本文考慮的CAR或TCR修飾的T細胞或NK細胞組合的治療性抗體包括但不限於阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿夫妥珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿馬替單抗(amatuximab)、安那莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、貝伐珠單抗(bivatuzumab)、蘭妥莫單抗(blinatumomab)、布吐西單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡托莫西單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他妥珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、克里伏妥珠單抗(clivatuzumab)、康納土單抗(conatumumab)、達他單抗(daratumumab)、德珠單抗(drozitumab)、杜里土單抗(duligotumab)、杜西吉土單抗(dusigitumab)、地莫單抗(detumomab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛圖單抗(dalotuzumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩斯土昔單抗(ensituximab)、鄂托默單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、法妥珠單抗(farietuzumab)、費拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非吉單抗(figitumumab)、法蘭土單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、加尼圖單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)、格雷巴單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、伊姆加土珠單抗(imgatuzumab)、因達西單抗(indatuximab)、伊諾妥珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、樂薩妥木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛瓦土珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、瑪帕妥木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫塞妥莫單抗(moxetumomab)、納納土單抗(namatumab)、那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、諾莫單抗(nofetumomab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧那組單抗(onartuzumab)、奧普珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕薩珠單抗(parsatuzumab)、帕曲單抗(patritumab)、潘妥莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、平妥莫單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、雷妥莫單抗(racotumomab)、雷曲妥單抗(radretumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、辛圖珠單抗(simtuzumab)、索利圖單抗(solitomab)、他卡珠單抗(tacatuzumab)、他普莫單抗(taplitumomab)、泰納莫單抗(tenatumomab)、泰普洛單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、土庫珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維托珠單抗(veltuzumab)、伏司妥珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、CC49、及3F8。
在一些實施例中，本文中所述之組成物係結合細胞介素來投予。如本文中所使用，「細胞介素(cytokine)」係意欲指由一個細胞群體所釋放且作用於其他細胞上而作為細胞間介導物之蛋白質的通用用語。此類細胞介素之實例係淋巴激素、單核因子(monokines)、趨化激素、及傳統多肽荷爾蒙。細胞介素中包括係生長荷爾蒙，諸如人類生長荷爾蒙、N-甲硫胺醯基人類生長荷爾蒙、及牛生長荷爾蒙；副甲狀腺荷爾蒙；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素(prorelaxin)；醣蛋白荷爾蒙，諸如濾泡刺激素(FSH)、甲狀腺刺激素(TSH)、及黃體激素(LH)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳素；胎盤泌乳原；腫瘤壞死因子–α及–β；密拉氏管抑制物質；小鼠促性腺素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；促血小板生成素(thrombopoietin) (TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉換生長因子(TGF)，諸如TGF–α及TGF–β；似胰島素生長因子–I及–II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素–α、–β、及–γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞–CSF (M–CSF)；顆粒球-巨噬細胞–CSF (GM–CSF)；及顆粒球–CSF (G–CSF)；介白素(IL)，諸如IL–1、IL–1α、IL–2、IL–3、IL–4、IL–5、IL–6、IL–7、IL–8、IL–9、IL–10、IL–11、IL–12；IL–15，腫瘤壞死因子，諸如TNF–α或TNF–β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配體(KL)。如本文中所使用，用語細胞介素包括來自自然來源或重組T細胞培養物之蛋白質、及初始序列細胞介素之生物活性等效物。
任何細胞可用作本揭露之多核苷酸、載體、或多肽的宿主細胞。在一些實施例中，細胞可係原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、或高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞。合適的原核細胞包括但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobactehaceae)，諸如大腸桿菌屬，例如大腸桿菌；腸桿菌屬；伊文氏桿菌屬；克留氏菌屬；變形桿菌屬；沙氏桿菌屬，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；鋸桿菌屬，例如黏質沙門氏菌(Serratia marcescans)、及志賀桿菌(Shigella)；桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)；假單孢菌屬，諸如綠膿桿菌(P. aeruginosa)；及鏈黴菌屬。在一些實施例中，細胞係人類細胞。在一些實施例中，細胞係免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由下列所組成之群組：T細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、TCR表現性細胞、自然殺手(NK)細胞、樹突細胞、顆粒球、先天性淋巴細胞、巨核細胞、單核球、巨噬細胞、血小板、胸腺細胞、及骨髓細胞。在一個實施例中，免疫細胞係T細胞。在另一實施例中，免疫細胞係NK細胞。在某些實施例中，T細胞係腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、自體T細胞、經工程改造自體T細胞(eACT™)、異體T細胞、異源T細胞、或其任何組合。不同於抗體療法或獨立的經NKG2D CAR修飾之T細胞，T細胞（或如上文所描述之任何細胞）
本文所述之另一實施例係一種治療有需要之對象之癌症的方法，其包含投予有效量，例如治療有效量之包含如本文所述之表現TCR或CAR之T細胞或NK細胞之組成物。投予之量及頻率將藉由患者之病況及患者之疾病之類型及嚴重程度等因素來判定，但適當的劑量可藉由臨床試驗判定。
在其他實施例中，提供一種方法，其包含向有需要之患者投予治療有效量的本文所涵蓋之經修飾之T細胞或包含其之組成物，單獨或與一或多種治療劑組合。在某些實施例中，本揭露之細胞用於治療有患癌風險之患者。因此，本揭露提供治療或預防癌症之方法，其包含向有需要之對象投予治療有效量之本揭露之經修飾之T細胞。
所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，可能需要多次投予本揭露之組成物，以影響所欲療法。舉例而言，組成物可在1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年、2年、5年、10年、或更久內投予1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、或10次、或更多次。
在某些實施例中，可能所欲投予活化T細胞至對象，且隨後再抽血（或進行血球分離術），根據本揭露從其中活化T細胞，且用此等活化及擴增之T細胞輸注患者。此方法可每幾週進行多次。在某些實施例中，T細胞可由抽取10 cc至400 cc之血液中活化。不受理論束縛，使用此多個血液抽吸/多重輸注方案可用以選擇出某些T細胞群。
本文所涵蓋之組成物之投予可以任何方便的方式進行，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝取、輸血、植入、或移植。在一些實施例中，組成物係腸胃外投予者。如本文中所使用，詞組「腸胃外投予(parenteral administration/administered parenterally)」係指除腸內及局部投予外之投予模式，通常藉由注射，且包括但不限於血管內、靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、腫瘤內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊椎內及胸骨內注射及輸注。在一個實施例中，本文所涵蓋之組成物藉由直接注射至腫瘤、淋巴結、或感染位點向對象投予。
在一個實施例中，向有需要之對象投予有效量之組成物以增加對象對癌症之細胞免疫反應。免疫反應可包括藉由能夠殺死感染細胞、調控T細胞、及輔助T細胞反應之細胞毒性T細胞介導之細胞免疫反應。主要由能夠活化B細胞從而導致抗體產生之輔助T細胞介導之體液免疫反應亦可被誘導。各種技術可用於分析由本揭露之組成物所誘導之免疫反應的類型，該等技術在所屬技術領域中熟知；例如，在免疫學中之電流協定，由下列編輯：John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Eth M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley_amp Sons, NY, N.Y。
在T細胞介導之殺滅之情況下，CAR配位體結合引發CAR信號傳導至T細胞，產生誘導T細胞之多種T細胞信號傳導途徑之活化，以產生或釋放能夠藉由各種機制誘導目標細胞凋亡之蛋白質。此等T細胞介導之機制包括（但不限於）將胞內細胞毒性顆粒自T細胞轉移至目標細胞中，促炎性細胞介素之T細胞分泌可直接誘導目標細胞殺滅（或間接經由募集其他殺手效應細胞），且上調T細胞表面上之死亡受體配位體（例如FasL），其在與目標細胞上的同源死亡受體（例如Fas）結合後誘導目標細胞凋亡。
在實施例中，本文描述一種治療經診斷患有癌症之對象之方法，其包含將來自對象之T細胞取出，用包含編碼如本文所涵蓋之NKG2D CAR之核酸之載體來基因修飾該等T細胞，從而產生經修飾之T細胞群，且向相同對象投予經修飾之T細胞群。
在某些實施例中，本揭露亦提供用於刺激對象中之效應細胞介導之對目標細胞群之免疫調節劑反應之方法，其包含向對象投予表現編碼NKG2D CAR分子之核酸建構體之免疫效應細胞群之步驟。
用於投予本文所述之細胞組成物之方法包括任何方法，其可有效導致再引入經離體基因修飾之免疫效應細胞，其在對象中直接表現經工程改造之NKG2D CAR，或再引入免疫效應細胞之經基因修飾之先驅細胞，在引入對象中時分化成表現NKG2D CAR分子之成熟免疫效應細胞。一種方法包含用根據本揭露之核酸建構體離體轉導周邊血液T細胞，且將經轉導之細胞返回至對象中。
儘管前述揭露已藉由說明及實例之方式進行詳細說明以用於清晰理解目的，然而根據本揭露之教示對所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見可在不背離隨附申請專利範圍之精神或範圍內進行某些變化及修改。僅以說明性的方式而非限制性的方式提供以下實例。所屬技術領域中具有通常知識者將容易地識別許多非臨界參數，其可改變或修改以產生基本上類似的結果。 實例 實例1 NKG2D CAR 構築體設計
如下列實例中所使用，設計經工程改造之NKG2D嵌合抗原受體構築體且在反轉錄病毒載體中合成。第一構築體（稱為NKG2D CAR1）從N至C端包括信號肽、NKG2D胞外域、CD8α鉸鏈、CD28跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列顯示於下：MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 53)。
第二構築體（稱為NKG2D CAR2）從N至C端包括信號肽、NKG2D胞外域、CD8α鉸鏈、CD28跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ε信號傳導域及CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列顯示於下： MALPVTALLLPLALLLHAARPLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 54)。
第三構築體（稱為NKG2D CAR3）從N至C端包含NKG2D胞外域、CD8鉸鏈、CD8跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列包含下列胺基酸序列：LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 66)。在一個態樣中，CAR3由下列核苷酸序列編碼： 1 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 61 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 121 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 181 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 241 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 301 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 361 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 421 gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 481 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 541 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 601 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 661 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 721 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 781 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 841 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 901 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 961 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1021 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1081 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1141 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1201 aaagccaaag cgccgccacc atggctcttc ctgtgacagc tcttctgctg cccctggccc 1261 tgcttctgca tgctgctaga cctgagcaaa agttgatttc tgaggaagac ctcgccggca 1321 gtttattcaa ccaagaagtc caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta 1381 agaactggat atgttacaaa aataactgtt accaattctt cgatgaatct aagaattggt 1441 atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tcttaaagta tacagcaaag 1501 aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc 1561 caacaaatgg atcttggcag tgggaagacg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa 1621 taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcatc gagctttaaa ggctatatag 1681 aaaactgttc aactccaaat acatatattt gcatgcaaag gactgtgacc acgacgccag 1741 cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca acccctgtcc ctgaggcctg 1801 aagcgtgccg gccagcggcg ggcggcgcag tgcacacgag agggctggac ttcgcctgtg 1861 atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta 1921 tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta 1981 tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag 2041 aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc 2101 agcaagggca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg 2161 ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc 2221 ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga 2281 ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca 2341 gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca agctctgccc cctcgctga (SEQ ID NO: 67)。 CAR3可由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：(SEQ ID NO: 67)。在某些態樣中，(SEQ ID NO: 67)之核酸序列可經修飾以移除編碼Myc（人類c-Myc原致癌基因）表位標籤及Myc標籤與NKD2D胞外域之間的連接子之序列。(SEQ ID NO: 67)之核酸序列編碼在位置1221至1283之CD8a信號肽，可將該信號肽取代為不同信號肽。
第四構築體（稱為NKG2D CAR4）從N至C端包含NKG2D胞外域、CD8α鉸鏈、CD28跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列包含下列胺基酸序列：LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 68)。在一個態樣中，CAR4由下列核苷酸序列編碼： 1 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 61 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 121 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 181 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 241 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 301 gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 361 agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 421 gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 481 ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 541 tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 601 tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 661 ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 721 ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 781 tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 841 aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 901 gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 961 cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1021 tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1081 ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1141 cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1201 aaagccaaag cgccgccacc atggctcttc ctgtgacagc tcttctgctg cccctggccc 1261 tgcttctgca tgctgctaga cctgagcaaa agttgatttc tgaggaagac ctcgccggca 1321 gtttattcaa ccaagaagtc caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta 1381 agaactggat atgttacaaa aataactgtt accaattctt cgatgaatct aagaattggt 1441 atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tcttaaagta tacagcaaag 1501 aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc 1561 caacaaatgg atcttggcag tgggaagacg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa 1621 taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcatc gagctttaaa ggctatatag 1681 aaaactgttc aactccaaat acatatattt gcatgcaaag gactgtgacc acgacgccag 1741 cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca acccctgtcc ctgaggcctg 1801 aagcgtgccg gccagcggcg ggcggcgcag tgcacacgag agggctggac ttcgcctgtg 1861 atttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag 1921 tggcctttat tattttctgg gtcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac 1981 aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc 2041 cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc 2101 ccgcgtacca gcaagggcag aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg 2161 agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa 2221 ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct 2281 acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc 2341 agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcaa gctctgcccc 2401ctcgctga (SEQ ID NO: 69) CAR4可由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：(SEQ ID NO: 69)。在某些態樣中，(SEQ ID NO: 69)之核酸序列可經修飾以移除編碼Myc（人類c-Myc原致癌基因）表位標籤及Myc標籤與NKD2D胞外域之間的連接子之序列。(SEQ ID NO: 69)之核酸序列編碼在位置1221至1283之CD8a信號肽，可將該信號肽取代為不同信號肽。
第五構築體（稱為NKG2D CAR5）從N至C端包含NKG2D胞外域、CD8鉸鏈、CD8跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ε信號傳導域及CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列包含下列胺基酸序列：LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRILRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 70)。在一個態樣中，CAR5由下列核苷酸序列編碼： 1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc 61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga 121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccaccac tcctgctcca agacctccta 1021 cccccgctcc tacaatcgcc agccaacctc tgagcctgag accggaggca tgcagacctg 1081 cggcaggggg agcagttcac acaagaggct tggacttcgc ttgcgacatc tacatctggg 1141 cccctctggc cggcacatgc ggagttcttc ttcttagcct ggtgatcacc ctgtactgca 1201 agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga cctgtgcaga 1261 ccacacagga ggaagacggc tgcagctgta gattccccga ggaagaggag ggcggctgtg 1321 agctgaagaa ccgcaaagca aaggcaaaac ccgtcacacg aggagcgggc gcagggggac 1381 gacaacgcgg tcagaataag gaacgcccgc ctccagtacc aaatccagat tatgaaccaa 1441 ttcggaaggg acaacgcgat ctctactccg gtctcaatca gaggcgaatt ctgagagtta 1501 agttcagcag gagcgccgac gcccctgcct accagcaagg acagaatcaa ctgtacaacg 1561 agctgaacct gggcagacgg gaggaatacg atgtgctgga caagaggaga ggcagagacc 1621 ccgagatggg cggcaaacct agaagaaaga acccccagga gggcctgtat aacgagctcc 1681 agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgaa agaagaagag 1741 gcaagggcca cgacggcctc taccagggct taagcacagc tacaaaggac acctacgacg 1801 ccctgcacat gcaggccctg ccccctagat ga (SEQ ID NO: 71) CAR5可由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：(SEQ ID NO: 71)。在某些態樣中，(SEQ ID NO: 71)之核酸序列可經修飾以移除編碼Myc（人類c-Myc原致癌基因）表位標籤及Myc標籤與NKD2D胞外域之間的連接子之序列。(SEQ ID NO: 71)之核酸序列編碼在位置486至548之CD8a信號肽，可將該信號肽取代為不同信號肽。
第六構築體（稱為NKG2D CAR6）從N至C端包含NKG2D胞外域、CD8α鉸鏈、CD8跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ε信號傳導域及CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列包含下列胺基酸序列：LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 72)。在一個態樣中，CAR6由下列核苷酸序列編碼： 1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc 61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga 121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa 1021 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag 1081 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg 1141 cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca 1201 aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa 1261 ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg 1321 aaaagaaccg aaaagcaaaa gccaagcctg ttacaagagg agcaggggca ggaggccgac 1381 agagagggca aaacaaagaa aggcccccgc ccgtcccaaa cccggattat gagccaatta 1441 ggaagggtca gagagacctg tattctgggc tcctgagagt gaagttcagc aggagcgcag 1501 acgcccccgc gtaccagcaa gggcagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa 1561 gagaggagta cgatgttttg gacaagaggc gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc 1621 cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg 1681 aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc 1741 tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaagctc 1801 tgccccctcg ctga (SEQ ID NO: 73) CAR6可由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：(SEQ ID NO: 73)。在某些態樣中，(SEQ ID NO: 73)之核酸序列可經修飾以移除編碼Myc（人類c-Myc原致癌基因）表位標籤及Myc標籤與NKD2D胞外域之間的連接子之序列。(SEQ ID NO: 73)之核酸序列編碼在位置486至548之CD8a信號肽，可將該信號肽取代為不同信號肽。
第七構築體（稱為NKG2D CAR7）從N至C端包含NKG2D胞外域、CD8α鉸鏈、CD28跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ε信號傳導域及CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列包含下列胺基酸序列：LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 74)。在一個態樣中，CAR7由下列核苷酸序列編碼： 1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc 61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga 121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa 1021 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag 1081 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg 1141 tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt 1201 tctgggtcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 1261 cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 1321 gaggatgtga aaagaaccga aaagcaaaag ccaagcctgt tacaagagga gcaggggcag 1381 gaggccgaca gagagggcaa aacaaagaaa ggcccccgcc cgtcccaaac ccggattatg 1441 agccaattag gaagggtcag agagacctgt attctgggct cctgagagtg aagttcagca 1501 ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcaag ggcagaacca gctctataac gagctcaatc 1561 taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagaggcg tggccgggac cctgagatgg 1621 ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata 1681 agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc 1741 acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca 1801 tgcaagctct gccccctcgc tga (SEQ ID NO: 75) CAR7可由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：(SEQ ID NO: 75)。在某些態樣中，(SEQ ID NO: 75)之核酸序列可經修飾以移除編碼Myc（人類c-Myc原致癌基因）表位標籤及Myc標籤與NKD2D胞外域之間的連接子之序列。(SEQ ID NO: 75)之核酸序列編碼在位置486至548之CD8a信號肽，可將該信號肽取代為不同信號肽。
第八構築體（稱為NKG2D CAR8）從N至C端包含NKG2D胞外域、CD8α鉸鏈、CD28跨膜域、4-1BB細胞間域、及包含CD3ε信號傳導域及CD3ζ信號傳導域之信號傳導域。此嵌合抗原受體之胺基酸序列包含下列胺基酸序列：LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRILRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 76)。在一個態樣中，CAR8由下列核苷酸序列編碼： 1 cgcggaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc 61 aaggcatgga aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtta ggaacagaga 121 gacagcagaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg 181 gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc ccgccctcag cagtttctag agaaccatca 241 gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa 301 tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc 361 acaacccctc actcggcgcg ccagtccttc gaagtagatc tttgtcgatc ctaccatcca 421 ctcgacacac ccgccagcgg ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaatta attcacgccg 481 ccaccatggc tcttcctgtg acagctcttc tgctgcccct ggccctgctt ctgcatgctg 541 ctagacctga gcaaaagttg atttctgagg aagacctcgc cggcagttta ttcaaccaag 601 aagtccaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaagaac tggatatgtt 661 acaaaaataa ctgttaccaa ttcttcgatg aatctaagaa ttggtatgag agccaggctt 721 cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctta aagtatacag caaagaggac caggatttac 781 ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt 841 ggcagtggga agacggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga 901 agggagactg tgcactctat gcatcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc 961 caaatacata tatttgcatg caaaggactg tgaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa 1021 caccggcgcc caccatcgcg tcgcaacccc tgtccctgag gcctgaagcg tgccggccag 1081 cggcgggcgg cgcagtgcac acgagagggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg 1141 tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt 1201 tctgggtcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac 1261 cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag 1321 gaggatgtga aaagaaccgc aaagcaaagg caaaacccgt cacacgagga gcgggcgcag 1381 ggggacgaca acgcggtcag aataaggaac gcccgcctcc agtaccaaat ccagattatg 1441 aaccaattcg gaagggacaa cgcgatctct actccggtct caatcagagg cgaattctga 1501 gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcaagggcag aaccagctct 1561 ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc 1621 gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg 1681 aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc 1741 ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct 1801 acgacgccct tcacatgcaa gctctgcccc ctcgctga (SEQ ID NO: 77) CAR8可由核酸編碼，該核酸與下列具有至少75%序列同一性（諸如至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%同一性；例如85%至90%、85%至95%、85%至100%、90%至95%、90%至100%、或95%至100%）：(SEQ ID NO: 77)。在某些態樣中，(SEQ ID NO: 77)之核酸序列可經修飾以移除編碼Myc（人類c-Myc原致癌基因）表位標籤及Myc標籤與NKD2D胞外域之間的連接子之序列。(SEQ ID NO: 77)之核酸序列編碼在位置486至548之CD8a信號肽，可將該信號肽取代為不同信號肽。 實例2 轉導效率
將反轉錄病毒載體用於所有T細胞轉導。靶向HPV16+ E7 11-19表位之經工程改造TCR且用於與NKG2D CAR構築體單獨或共轉導(Jin B.Y. et al., 2018 JCI Insight)。將獲自健康供體且先前已冷凍保存之PBMC解凍並在補充有300 IU的IL-2之Optimizer T細胞培養基中用抗CD3活化48小時。將PBMC用含有靶向HPV16+ E7 11-19表位之經工程改造TCR（在此實例及以下實例中稱為HPV-TCR）、NKG2D CAR、或這兩種構築體之反轉錄病毒轉導。將經轉導T細胞在補充有IL-7 (10 ng/mL)、IL-15 (10 ng/mL)、及Akt VIII抑制劑(AKTi, 1 µM)之Optimizer T細胞培養基中擴增10天。在T細胞活化後第8天及第15天藉由流動式細胞測量術測量轉導效率。偵測TCR轉導效率之抗體包括抗小鼠TCRβ殖株H57-597 (BioLegend)而用於偵測NKG2D轉導效率之抗體包括抗人類CD314殖株1D11 (BioLegend)。所有流動式細胞測量術數據均在LSR–Fortessa (BD LSR Fortessa™)上使用BD FACSDiva™軟體收集並使用FlowJo（全部來自BD Sciences）分析數據。含有1% BSA之PBS在4℃下進行所有抗體染色。
表4顯示藉由流動式細胞測量術在培養第8天及第15天後經轉導及未經轉導之T細胞的表現水準（測量為平均螢光強度(MFI)及陽性細胞%）。在所有構築體中均觀察到高轉導效率。小的僅NKG2D+群存在於HPV-TCR + NKG2D CAR1及HPV-TCR + NKG2D CAR2群體中。 表4：在活CD3+ T細胞上圈選的經轉導及未經轉導PBMC中之轉殖基因的表現水準及百分比
實驗組 mTCRβ MFI 陽性% NKG2D MFI 陽性%
第8天 第15天 第8天 第15天 第8天 第15天 第8天 第15天
未經轉導之T細胞 21 18 0.1% 0.1% 1026 1145 23.5% 20.1%
僅HPV-TCR 55481 59065 82.5% 84.5% 1284 1354 21.6% 21.1%
僅NKG2D CAR1 14 33 0.4% 0.6% 25733 22040 96.6% 97.4%
僅NKG2D CAR2 10 25 0.5% 0.3% 16637 15327 91.7% 86.8%
HPV-TCR + NKG2D CAR 1 48476 50264 70.1% 71.4% 22635 20930 97.5% 94.7%
HPV-TCR + NKG2D CAR 2 46045 48190 68.8% 69.5% 17188 16418 92.9% 86.3%
表19顯示基於Myc染色及藉由流動式細胞測量術之表現測量在培養第7/8天後經轉導及未經轉導之T細胞的表現水準（為平均螢光強度(MFI)及陽性細胞%）。在所有構築體中均觀察到高轉導效率。 表19：來自兩位供體的經轉導及未經轉導T細胞中之轉殖基因的表現水準及百分比
   供體1 供體2
   Myc% Myc%
CAR3 98.6 96.9
CAR6 99.7 99.6
CAR5 80.1 62.1
CAR4 99.2 98.7
CAR7 98.8 98.4
CAR8 98.9 98.6
NTD 0.15 0.2
實例3 擴增及活力
藉由Vi-Cell XR Cell Counter (Beckman Coulter)測量細胞擴增，並且藉由用Live/Dead Blue (ThermoFisher)在PBS中在冰上染色細胞20分鐘測量細胞活力，然後藉由流式細胞測量術在T細胞活化後第8天及第15天進行分析（表5）。如實例2中所述將經轉化之T細胞活化。表5顯示使用補充有IL-7、IL-15、及AKTi之Optimizer培養基培養的經轉導及未經轉導之T細胞的擴增及細胞活力。僅NKG2D CAR1、僅NKG2D CAR2、HPV-TCR + NKG2D CAR1、及HPV-TCR + NKG2D CAR2顯示高於僅HPV-TCR或未經轉導之T細胞的增生水準。 表5：在CD3+ T細胞上圈選的經轉導及未經轉導PBMC中之倍數擴增及活力
實驗組 活力 倍數擴增
第8天 第15天 第8天
未經轉導之T細胞 98.2% 96.5% 51x
僅HPV-TCR 94.2% 88.9% 42x
僅NKG2D CAR1 85.1% 74.3% 81x
僅NKG2D CAR2 89.4% 88.8% 74x
HPV-TCR + NKG2D CAR1 90.4% 78.5% 75x
HPV-TCR + NKG2D CAR2 88.6% 83.0% 68x
實例4 產物屬性判定
藉由流動式細胞測量術在T細胞活化後第8天測量記憶表型及CD4/CD8比率（表6）。用於評估記憶表型之抗體包括抗人類CD45RA殖株HI100 (BioLegend)、抗人類CD45RO殖株UCHL1 (BioLegend)、抗人類CCR7殖株G043H7 (BioLegend)、抗人類CD62L殖株DREG-56 (BioLegend)。用於評估CD4/CD8比率之抗體包括抗人類CD3殖株包括抗人類CD3殖株SK7 (BioLegend)、抗人類CD4殖株RPA-T4 (BioLegend)、及抗人類CD8殖株SK1 (BioLegend)。如實例2中所述將經轉化之T細胞活化。記憶表型評估如下：初始T細胞(CD45RA+ CD45RO- CCR7+ CD62L+)；中央記憶T細胞(CD45RA- CD45RO+ CCR7+ CD62L+)；效應記憶T細胞(CD45RA- CD45RO+ CCR7- CD62L-)；末端效應T細胞(CD45RA+ CD45RO- CCR7- CD62L-)。所有流動式細胞測量術數據均在LSR–Fortessa (BD LSR Fortessa™)上使用BD FACSDiva™軟體收集並使用FlowJo（全部來自BD Sciences）分析數據。含有1% BSA之PBS在4℃下進行所有抗體染色。
表6中顯示的是用具有補充IL-2之TC培養基培養的經轉導及未經轉導之CD3+ T細胞的CD4 /CD8比率與記憶表型。經轉導之T細胞及未經轉導之T細胞之間的CD4/CD8比率無顯著變化。未經轉導及經僅HPV-TCR轉導之T細胞顯示大於用僅NKG2D CAR1、僅NKG2D CAR2、HPV-TCR + NKG2D CAR1、或HPV-TCR + NKG2D CAR2轉導之T細胞的初始T細胞部分。此外，未經轉導及經僅HPV-TCR轉導之T細胞顯示小於用僅NKG2D CAR1、僅NKG2D CAR2、HPV-TCR + NKG2D CAR1、或HPV-TCR + NKG2D CAR2轉導之T細胞的記憶T細胞部分。 表6：在活CD3+ T細胞上圈選的經轉導及未經轉導之PBMC的CD4/CD8比率及記憶表型
實驗組 CD4/CD8比率 記憶表型
CD4 CD8 初始 TCM TEM TE
未經轉導 51.8% 48.2% 22.7% 46.0% 14.0% 5.3%
僅HPV-TCR 45.7% 54.3% 24.3% 45.0% 15.0% 5.8%
僅NKG2D CAR1 46.8% 53.2% 3.5% 63.0% 28.1% 9.4%
僅NKG2D CAR2 44.7% 55.3% 8.5% 56.4% 25.7% 5.4%
HPV-TCR + NKG2D CAR1 48.1% 51.9% 3.1% 61.6% 28.2% 7.1%
HPV-TCR + NKG2D CAR2 47.2% 52.8% 7.2% 57.4% 28.5% 6.9%
實例5 細胞毒性
經HPV-TCR轉導之T細胞先前已顯示有效消除HPV16+腫瘤細胞系且產生高的IFNγ水準。來自對於HPV-TCR之第I期臨床試驗(Nagarsheth N.B. et al., 2021 Nat Med)的腫瘤定序表明，腫瘤係高度不均一的且可在MHC-I抗原處理及呈現路徑中展現突變，從而使其對於經HPV-TCR工程改造之過繼性TCR-T療法具有抗性。為了模擬患者腫瘤數據，將HPV16+腫瘤細胞系(CaSki)工程改造為缺乏A*02:01，此藉由使用CRISPR-Cas9系統剔除β2M (β2MKO)來達成(Vakulskas CA et al., 2018 Nature)。此外，使用反轉錄病毒載體，將SiHa HPV16+腫瘤細胞系（其通常缺乏HLA-A*02:01）工程改造為過度表現A*02:01。選擇CaSki及SiHa腫瘤細胞系分別是因為高及低E7表現。對於使用未經轉導及經轉導之PBMC對這些具有或不具有完整HLA-A*02:01之腫瘤細胞系的殺滅進行評估，其係使用xCELLigence RTCA MP (Agilent Technologies)平台在表7及表8中所示之各種效應對目標(E:T)比率下進行。
表7顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence盤中在各種E:T比率下與WT或β2MKO CaSki細胞共培養之經轉導T細胞的結果。在72小時後測量阻抗值(IV)。對照IV代表未經轉導之T細胞的阻抗值，而實驗IV代表僅HPV-TCR、僅NKG2D CAR1、僅NKG2D CAR2、HPV-TCR + NKG2D CAR1、或HPV-TCR + NKG2D CAR2的阻抗值。細胞毒性百分比藉由下列方程式計算：
Figure 02_image001
表7：在不同E:T比率藉由經轉導及未經轉導PBMC對WT及β2MKO CaSki細胞的殺滅
實驗組 WT CaSki β2MKO CaSki
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
未經轉導 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
僅HPV-TCR 102.5% 101.5% 96.1% 13.6% 11.2% 7.5%
僅NKG2D CAR1 103.0% 101.4% 96.7% 102.6% 101.6% 97.0%
僅NKG2D CAR2 103.2% 104.0% 101.3% 104.4% 98.1% 93.5%
HPV-TCR + NKG2D CAR1 105.1% 102.3% 98.4% 102.4% 103.8% 96.5%
HPV-TCR + NKG2D CAR2 101.8% 99.3% 89.2% 101.6% 100.3% 89.8%
表8顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在各種E:T比率下與表現WT或A*02:01之SiHa細胞共培養之經轉導T細胞的結果。在72小時後測量阻抗值(IV)並計算細胞毒性百分比，如上所述。 表8：藉由轉導及未經轉導PBMC對SiHa細胞的殺滅
實驗組 WT SiHa A*02 SiHa
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
未經轉導 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
僅HPV-TCR 13.7% 8.9% 2.1% 99.5% 78.3% 57.1%
僅NKG2D CAR1 102.5% 99.5% 94.1% 102.1% 101.1% 84.1%
僅NKG2D CAR2 103.6% 97.4% 91.1% 99.8% 93.5% 75.3%
HPV-TCR + NKG2D CAR1 101.5% 99.8% 88.6% 104.2% 100.8% 87.0%
HPV-TCR + NKG2D CAR2 102.3% 93.6% 77.5% 102.2% 98.5% 79.4%
經HPV-TCR轉導之T細胞成功消除了WT CaSki及A*02 SiHa細胞系，但無法消除β2M KO CaSki或WT SiHa細胞系。重要的是，經NKG2D CAR轉導之T細胞及經NKG2D CAR與HPV-TCR共轉導之T細胞能夠成功殺滅CaSki及SiHa細胞系，與其HLA-A*02:01狀態無關。 實例6 細胞介素產生
藉由在培養24小時後自用於實例5中之xCELLigence 96孔盤取出上清液來測量細胞介素產生。使用Meso Sector S 600平台(Institute for Biopharmaceutical Research, Inc.)測量細胞介素水準。當與WT或A*02 SiHa細胞共培養時，來自HPV-TCR + NKG2D CAR T細胞之IFNγ產生類似於經HPV-TCR轉導之細胞。然而，當與β2MKO CaSki或WT SiHa共培養時，來自HPV-TCR + NKG2D CAR T細胞之IFNγ產生相較於經HPV-TCR轉導之T細胞有所增加（參見表9及表10）。這些數據顯示，當經HPV-TCR轉導之T細胞消除目標細胞時，NKG2D CAR T細胞會分泌標稱含量的IFNγ，但是當經HPV-TCR轉導之T細胞不消除目標細胞時，則會產生足夠的IFNγ。有趣的是，經NKG2D CAR1 and HPV-TCR + NKG2D CAR1轉導之T細胞產生比經NKG2D CAR2或HPV-TCR + NKG2D CAR2轉導之T細胞更高的IFNγ水準。
表9顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在各種E:T比率下與WT或β2MKO CaSki細胞共培養之經轉導T細胞的結果。在24小時時，將培養基上清液取出並進行處理以用於使用Meso Sector S 600平台根據製造商指示判定IFNγ濃度(pg/mL)。 表9：與CaSki細胞共培養之經轉導及未經轉導PBMC的IFNγ產生
實驗組 WT CaSki β2MKO CaSki
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
僅HPV-TCR 1721 641 273 130 90 40
僅NKG2D CAR1 4486 2931 1053 5024 2820 1306
僅NKG2D CAR2 2836 1063 403 1989 777 262
HPV-TCR + NKG2D CAR1 3721 1369 523 4191 2067 895
HPV-TCR + NKG2D CAR2 1467 561 212 1567 622 192
表10顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在各種E:T比率下與WT或A*02 SiHa細胞共培養之經轉導T細胞的結果。在24小時時，將培養基上清液取出並進行處理以用於使用Meso Sector S 600平台根據製造商指示判定IFNγ濃度(pg/mL)。 表10：與SiHa細胞共培養之經轉導及未經轉導PBMC的IFNγ產生
實驗組 WT SiHa A*02 SiHa
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
僅HPV-TCR 30 12 3 155 75 45
僅NKG2D CAR1 7538 3968 1970 7271 4145 1380
僅NKG2D CAR2 4638 1300 342 4034 1554 560
HPV-TCR + NKG2D CAR1 5563 2522 1149 6518 3223 1296
HPV-TCR + NKG2D CAR2 3240 901 232 3223 938 284
實例7 經轉導之T 細胞的長期擴增及耗竭
長期殺滅檢定中之重複抗原刺激會使T細胞功能性耗竭且據信與體內效力相聯。為了完成連續抗原刺激檢定，每2至3天將目標細胞（WT CaSki、β2MKO CaSki、WT SiHa、或A*02 SiHa）添加至經轉導之T細胞（參見實例2）。在第五次刺激時，使用xCELLigence RTCA MP平台對WT CaSki、β2MKO CaSki、WT SiHa、或A*02 SiHa之細胞毒性在表11及12中所示之各種E:T比率下進行評估。儘管添加了NKG2D CAR，經HPV-TCR + NKG2D CAR轉導之T細胞在連續刺激後成功消除了其目標，並且相較於經僅HPV-TCR轉導之T細胞展現出高的擴增水準（參見表11、表12）。
表11顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在3:1 E:T比率下與WT CaSki細胞共培養之經轉導T細胞的結果。接著每2至3天添加WT CaSki細胞。在第五次刺激時，將T細胞在96孔xCELLigence盤中在各種E:T比率下與WT或β2MKO CaSki細胞共培養。在72小時後測量阻抗值(IV)並計算細胞毒性百分比，如上所述。 表11：在5輪的抗原刺激後藉由經轉導及未經轉導PBMC對CaSki細胞的殺滅
實驗組 WT CaSki β2MKO CaSki
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
僅HPV-TCR 86.8% 44.2% 12.5% 11.2% 4.1% -3.3%
僅NKG2D CAR1 100.4% 99.6% 75.6% 102.4% 90.1% 57.1%
僅NKG2D CAR2 101.1% 92.5% 44.9% 98.2% 81.3% 36.1%
HPV-TCR + NKG2D CAR1 N.D N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
HPV-TCR + NKG2D CAR2 102.4% 97.1% 62.4% 95.0% 73.2% 26.7%
表12顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在3:1 E:T比率下與WT CaSki細胞共培養之經轉導T細胞的結果。接著每2至3天添加WT CaSki細胞。在第五次刺激時，將T細胞在96孔xCELLigence盤中在各種E:T比率下與WT或A*02 SiHa細胞共培養。在72小時後測量阻抗值(IV)並計算細胞毒性百分比，如上所述。 表12：在5輪的抗原刺激後藉由經轉導及未經轉導PBMC對SiHa細胞的殺滅
實驗組 WT SiHa A*02 SiHa
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
僅HPV-TCR 4.7% -2.1% -6.2% 9.1% -2.2% -5.4%
僅NKG2D CAR1 99.7% 82.5% 40.9% 98.8% 87.1% 39.2%
僅NKG2D CAR2 92.5% 80.4% 23.6% 94.1% 65.2% 21.7%
HPV-TCR + NKG2D CAR1 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
HPV-TCR + NKG2D CAR2 91.8% 78.1% 29.0% 90.5% 70.1% 19.6%
實例8 用HPV16+ 腫瘤細胞系共培養的NKG2D CAR 及與HPV-TCR 共表現之NKG2D CAR 的細胞毒性及細胞介素產生
為了說明基於NKG2D之CAR的安全性，將經僅NKG2D CAR1、僅NKG2D CAR2、HPV-TCR + NKG2D CAR1、及HPV-TCR + NKG2D CAR2轉導之T細胞，與C33A細胞系（其相當大程度為NKG2D配體陰性）及初級正常子宮頸上皮細胞在各種E:T比率下共培養，如表13及表14中所示。選擇初級正常子宮頸上皮細胞，因為其有更高的NKG2D配體表現。來自xCELLigence RTCA MP平台之細胞毒性數據及來自Meso Sector S 600平台之IFNγ產生指示對於C33A及初級正常子宮頸上皮細胞兩者之低反應性。這些數據表明，NKG2D CAR2具有堅強的安全概況且不太可能展現出偏離目標效應。
表13顯示在第8天分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在各種E:T比率下與C33A或初級正常子宮頸上皮細胞共培養之經轉導T細胞的結果。在24小時時，將培養基上清液取出並進行處理以用於使用Meso Sector S 600平台判定IFNγ濃度(pg/mL)。 表13：藉由轉導及未經轉導PBMC之C33A及初級正常子宮頸上皮細胞的殺滅
實驗組 C33A 初級正常子宮頸
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
未經轉導之T細胞 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
僅HPV-TCR 7.6% 4.5% -4.3% 3.3% 3.0% -8.1%
僅NKG2D CAR1 30.1% 1.6% -4.5% 17.2% 1.8% -5.4%
僅NKG2D CAR2 9.5% 2.5% -6.2% 7.5% 2.7% -2.9%
HPV-TCR + NKG2D CAR1 21.0% 8.5% -6.4% 12.2% 4.5% -5.6%
HPV-TCR + NKG2D CAR2 9.7% 5.9% -5.4% 6.0% 1.1% -4.3%
表14顯示在第8天進行分選接著在第10天在96孔xCELLigence E盤中在各種E:T比率下與C33A細胞系或初級正常子宮頸上皮細胞共培養之經轉導T細胞的結果。在24小時時，將培養基上清液取出並進行處理以用於使用Meso Sector S 600平台判定IFNγ濃度(pg/mL)。 表14：與C33A細胞系或初級正常子宮頸上皮細胞共培養之經轉導及未經轉導PBMC的IFNγ產生
實驗組 C33A 初級正常子宮頸
3:1比率 1:1比率 1:3比率 3:1比率 1:1比率 1:3比率
未經轉導之T細胞 50 48 47 53 49 37
僅HPV-TCR 67 54 61 60 53 49
僅NKG2D CAR1 549 251 109 378 204 74
僅NKG2D CAR2 134 85 62 104 74 52
HPV-TCR + NKG2D CAR1 309 159 65 268 73 37
HPV-TCR + NKG2D CAR2 121 84 67 142 73 48
實例9 在小鼠異種移植模型中NKG2D CAR 對HPV16+ 腫瘤之體內效力
為了判定僅HPV-TCR、僅NKG2D CAR、及HPV-TCR + NKG2D CAR在消除WT及β2MKO HPV16+這兩種實體腫瘤之體內效力，將5E6 WT CaSki及5E6 β2MKO CaSki細胞分別皮下植入於6至8周齡雌性NSG小鼠(NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/ SzJ)之左及右側腹。包括五個研究組：媒劑對照(PBS)、未經轉導之T細胞(NTD)、僅HPV-TCR、僅NKG2D CAR2、及HPV-TCR + NKG2D CAR2。當WT CaSki細胞已達到大約70 mm 3及當β2MKO CaSki細胞已達到大約30 mm 3時，在第6天將每小鼠20 × 10 6個T細胞過繼性轉移。未添加IL-2補充。每3至4天使用數位卡尺測量腫瘤並記錄小鼠重量。在T細胞過繼性轉移後24小時收集末梢血液，之後每周收集。透過流動式細胞測量術表徵末梢血液中之T細胞持久性。用於評估末梢血液中之T細胞持久性的抗體包括抗人類CD45殖株30-F11 (BioLegend)、抗人類CD45殖株HI30 (BioLegend)、抗人類CD4殖株RPA-T4, (BioLegend)、抗人類CD8殖株SK1 (BioLegend)、抗人類CD279殖株EH12.2H7 (BioLegend)、抗人類HLA-DR殖株L243 (BioLegend),抗人類TCRβ殖株H57-597 (BioLegend)、抗人類CD314殖株1D11 (Biolegend)、及L/D Blue (ThermoFisher)。所有流動式細胞測量術數據均在LSR–Fortessa (BD LSR Fortessa™)上使用BD FACSDiva™軟體收集並使用FlowJo（全部來自BD Sciences）分析數據。含有1% BSA之PBS在4℃下進行所有抗體染色。研究持續時間為62天。整體而言，HPV-TCR能夠限制WT CaSke細胞在左側側腹的腫瘤生長，但未顯示植入在右側側腹上之β2MKO CaSki的任何腫瘤限制跡象。相比之下，僅NKG2D CAR2及HPV-TCR + NKG2D CAR2成功限制了WT及β2MKO CaSki細胞兩者的腫瘤生長（參見表15、表16）。此外，在過繼性T細胞轉移後的前幾周，帶有腫瘤之小鼠的重量沒有顯著波動，直到小鼠因為腫瘤尺寸而離開研究。（參見表17）。儘管在接受僅NKG2D CAR2或HPV-TCR + NKG2D CAR2 T細胞之所有小鼠中均沒有可觀察到的腫瘤，但大多數小鼠均展現腫瘤生長復發，表明經轉導之T細胞缺乏持久性。此進一步受到在過繼性T細胞轉移後三周末梢血液中不存在經轉導之T細胞所支持（參見表18）。 表15：WT CaSki細胞之腫瘤體積隨時間之變化
腫瘤接種後天數 6 8 11 13 15 18 20 22 25 27 29 32 34
媒劑 77 78 97 107 126 251 316 343 394 526 607 625 665
85 87 96 111 180 301 402 440 501 541 652 704 793
72 75 76 86 158 166 232 331 406 463 531 633 663
63 70 80 89 168 191 208 239 253 326 398 496 503
63 67 71 93 148 236 327 342 452 500 537 549 676
90 97 100 108 111 134 210 271 350 392 463 536 551
64 67 72 78 121 169 217 302 328 368 488 500 613
66 72 73 75 111 199 248 384 420 506 536 646 683
NTD 88 98 106 112 148 288 345 460 591 695 708 758 760
68 72 76 84 105 256 340 468 555 660 705 759 880
70 74 74 80 90 241 250 281 305 363 398 564 747
67 73 79 91 129 255 312 543 573 599 616 647 684
64 74 76 78 79 120 148 162 200 291 429 459 264
79 87 91 104 116 309 331 443 529 581 716 737 878
72 77 86 88 114 295 319 356 435 527 567 623 635
63 65 79 85 90 242 253 330 434 489 490 492 499
僅HPV-TCR 73 76 79 33 32 16 11 12 34 64 112 232 324
63 77 79 43 35 23 16 30 57 77 125 280 384
68 72 81 56 33 29 25 26 70 91 102 125 144
64 73 74 45 41 21 15 17 22 83 151 182 265
89 94 99 57 47 15 23 46 69 156 264 382 430
67 72 73 42 29 20 19 34 48 71 88 162 248
65 71 75 30 26 15 13 28 33 66 84 236 254
66 74 76 27 14 10 9 13 34 48 47 132 207
69 75 84 54 50 39 34 51 93 117 191 229 489
67 70 73 19 17 13 20 32 75 106 146 342 371
僅NKG2D CAR2 74 79 92 69 65 53 66 81 126 350 355 541 953
70 77 79 44 25 20 25 57 129 157 245 276 444
75 82 86 40 19 16 24 31 67 95 147 205 224
63 72 76 19 13 11 14 25 39 90 98 104 275
78 83 90 57 27 23 30 68 182 239 237 332 616
63 75 79 44 40 15 40 77 135 215 269 351 362
64 73 77 33 29 15 28 57 80 111 118 240 307
69 78 82 48 24 17 21 28 63 118 137 216 420
63 67 70 27 18 11 12 39 53 154 162 296 381
64 70 75 33 26 11 36 39
HPV-TCR + NKG2D CAR2 67 70 72 35 19 17 17 42 90 155 215 276 350
66 74 77 29 20 15 19 32 68 107 227 240 390
66 75 79 32 27 24 20 23 53 58 79 198 304
77 81 86 26 25 13 9 28 41 116 186 297 358
72 78 81 33 23 16 17 43 102 161 213 260 483
81 89 94 28 23 14 17 22 28 55 110 291 345
67 71 75 34 17 13 21 36 87 158 286 365 448
64 70 72 26 22 12 14 19 33 57 79 166 198
66 70 74 38 21 11 25 32 75 94 187 287 392
65 67 69 25 20 8 15 27 55 68 80 168 320
腫瘤接種後天數 36 39 41 43 46 48 50 53 55 57 60 62   
媒劑 717 796 884 923   
926 1217 1306   
742 831 1034 1149   
610 780 985   
739 757 923   
582 693 981 1039 1090   
685 857 982   
833 881 1152   
NTD 704   
913 798 535   
863 425 394 438 384   
802 711 569 347 279 211 166 165   
238 153 123 111 101 84 60   
715   
624 464 296   
261   
僅HPV-TCR 390 426 632 328 211 163 127 176 176 177 160 97   
435 440 549 826 827 883   
221 210 376 472 513 533 600 372 158 165 164   
590 547 633 601 391 380 384 407 409 268 289 213   
579 621 779 962   
375 412 497 635 649 744 651 504 479 489 424 185   
340 355 451 628 607 635 802 834   
291 365 474 558 733 647 868 413 280 282 277 181   
523 517 754 855   
402 565 721 938 877 755 691 668 669 799   
僅NKG2D CAR2 466 760 1139 1569 1992   
471 524 755 983 1013 1119 1083 933 1098 1189   
278 416 736 868 1024 1110 1262 1068 1095 1160 915 944   
363 481 581 827 1038 970 901 846 846 913 994   
935 1044 1332 1724 2306   
450 808 1103 1278 1316 1329 1638 1698   
430 610 726 785 847 890 1045 1087 1109 1121 1194   
496 564 762 870 1185 1048 1077 1138 1339   
461 572 714 756 771 853 934 1118 1154 1235   
  
HPV-TCR + NKG2D CAR2 419 513 783 847 1158 1174 1209 1542   
495 632 917 1114 1320 1102 1262 1176   
457 484 458 569 631 670 807 1475   
425 594 816 1028 1020 1068 1082 1162   
647 805 676 865 978 994 1017 887 890 924 1096   
450 517 552 572 807 916 939 1008 965 1016 1079 607   
550 814 1165 1376 1494 2014   
374 415 605 823 941 1034 1312 1932   
611 773 1163 1347 1585   
496 693 559 678 795 912 1165 1411 1339   
表16 ：β2MKO CaSki 細胞之腫瘤體積隨時間之變化
腫瘤接種後天數 6 8 11 13 15 18 20 22 25 27 29 32 34
媒劑 34 36 51 58 105 197 281 354 400 487 561 669 689
28 29 39 44 98 128 206 234 344 371 382 484 501
23 30 41 51 79 182 238 300 323 385 409 417 454
22 31 38 44 79 114 198 223 242 297 341 511 613
31 36 48 54 89 196 273 369 400 459 532 676 762
63 73 79 99 155 215 310 357 364 441 511 504 586
44 47 52 58 101 247 254 342 423 522 539 690 748
64 66 71 115 131 313 432 551 574 681 676 822 880
NTD 35 43 48 55 75 161 169 209 259 312 343 487 494
35 38 57 63 92 169 213 323 413 455 492 584 667
19 25 33 40 76 78 83 123 130 192 201 330 375
31 40 48 54 77 110 134 173 242 322 349 371 381
45 48 53 65 85 240 242 250 349 399 419 449 270
46 47 55 59 107 217 231 284 373 460 472 401 408
20 27 31 33 45 136 158 165 279 319 334 356 377
50 58 62 67 114 290 298 404 407 473 539 517 327
僅HPV-TCR 41 49 66 72 143 350 367 414 450 530 609 633 680
37 40 49 63 120 266 374 470 520 554 586 707 816
14 21 32 44 71 224 230 308 335 413 506 738 758
25 30 37 51 102 211 243 293 336 372 454 563 629
59 63 69 81 137 239 299 483 542 556 581 657 638
21 29 30 45 90 225 298 401 537 624 688 855 904
24 28 38 60 113 207 281 390 515 570 612 771 863
27 31 53 72 82 210 274 315 351 413 521 579 661
17 22 35 53 67 216 248 337 347 431 425 501 688
32 40 44 112 208 216 366 498 727 772 795 945 965
僅NKG2D CAR2 58 64 68 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0
36 47 50 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0
26 36 38 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0
49 54 57 27 0 0 0 0 0 0 0 0 0
44 49 51 29 0 0 0 0 0 0 0 0 0
35 40 43 26 12 0 0 0 0 0 0 0 0
21 30 34 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0
40 42 45 26 0 0 0 0 0 18 25 29 56
29 33 43 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0
38 43 46 30 19 0 0 0
HPV-TCR + NKG2D CAR2 32 41 42 29 0 0 0 0 0 0 0 0 0
33 40 43 27 0 0 0 0 0 17 15 49 56
15 23 30 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0
68 74 77 32 15 4 4 4 11 23 22 58 114
28 37 39 17 0 0 0 0 0 0 0 25 84
25 31 32 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0
35 39 46 25 7 0 0 0 0 0 18 31 96
32 35 38 24 0 0 0 0 0 0 12 39 62
22 26 40 23 0 0 0 0 0 18 18 72 86
37 42 46 27 0 0 0 0 0 0 0 0 0
腫瘤接種後天數 36 39 41 43 46 48 50 53 55 57 60 62   
媒劑 774 836 1083 1187   
624 767 1007   
607 668 805 1035   
759 937 1037   
933 1020 1300   
624 703 806 953 1080   
776 902 1019   
942 968 1141   
NTD 488   
685 618 522   
436 404 256 236 151   
383 295 272 282 155 154 166 100   
259 125 85 77 74 59 60   
297   
397 346 423   
145   
僅HPV-TCR 832 837 980 879 533 409 416 392 249 297 186 117   
813 862 915 1017 1152 1222   
805 643 865 1020 949 981 768 668 427 357 282   
763 758 762 829 793 671 680 552 558 578 201 154   
734 869 1029 1204   
756 781 839 944 1000 944 952 962 589 534 444 296   
939 883 1035 1209 1121 1164 1183 1312   
758 868 878 882 903 218 519 721 792 565 697 590   
866 869 994 1163   
699 565 774 1036 1039 1083 1094 1246 1319 1376   
僅NKG2D CAR2 0 89 167 179 304   
0 90 174 195 236 280 457 632 856 1045   
0 55 126 139 147 160 213 299 388 442 598 648   
0 55 73 91 179 212 334 523 711 885 1178   
0 54 88 122 189   
90 94 115 160 180 211 354 418   
0 33 98 151 171 224 308 525 657 860 1167   
138 172 234 279 387 398 538 753 1025   
0 84 159 231 275 321 530 717 827 1094   
  
HPV-TCR + NKG2D CAR2 123 134 177 181 248 264 356 488   
172 172 224 233 317 428 604 892   
54 112 162 188 227 283 450 598   
140 217 351 403 479 526 630 961   
189 195 272 365 407 480 609 687 758 895 1015   
0 60 74 148 157 172 222 459 669 750 753 750   
129 153 206 238 258 311   
168 171 172 195 264 364 541 792   
189 234 250 295 430   
0 100 150 194 221 294 442 508 712   
表17 ：帶有腫瘤小鼠之重量隨時間之變化
腫瘤接種後天數 6 8 11 13 15 18 20 22 25 27 29 32 34
媒劑 0.0 -3.9 -1.7 -5.6 -3.9 -0.9 -3.9 -0.4 0.4 1.3 4.3 4.8 3.9
0.0 3.1 3.6 3.1 7.1 12.5 12.1 9.4 10.3 9.4 11.6 12.5 10.7
0.0 -0.9 0.0 -1.8 0.9 2.7 0.4 4.0 4.9 4.5 6.7 4.9 3.1
0.0 0.8 -1.5 -3.1 0.8 5.0 0.4 -0.4 -0.8 0.8 1.2 2.7 -0.4
0.0 -0.8 3.3 1.6 4.1 9.8 9.4 11.9 9.8 8.2 10.7 11.1 9.0
0.0 -6.8 -6.0 -12.0 -8.8 -5.2 -6.8 -5.6 ## -12.9 ## -5.6 -8.8
0.0 -2.7 -0.4 -4.0 -1.8 5.4 0.4 2.7 5.4 4.9 5.4 7.1 1.8
0.0 -0.4 2.3 2.7 2.3 6.8 5.7 7.2 7.6 8.4 8.7 8.7 7.6
NTD 0.0 -0.8 2.3 -1.1 4.2 6.8 3.8 6.8 8.3 3.8 6.0 3.4 -8.3
0.0 -0.8 -2.1 -3.7 0.8 -0.8 -4.5 -2.5 -1.2 -4.1 -2.5 3.3 -1.2
0.0 1.4 5.2 0.9 4.2 10.3 6.6 8.0 8.9 8.5 8.9 10.8 -2.3
0.0 -3.8 1.7 -1.7 0.0 3.8 1.3 -2.5 -0.8 -3.8 -1.7 3.8 -1.7
0.0 -0.4 0.4 -6.1 -2.7 1.1 0.4 0.4 -3.8 -6.8 -6.4 -5.3 -8.7
0.0 -5.0 -2.1 -6.2 -3.7 1.2 -3.3 0.4 0.4 0.8 -1.2 -10.8 -16.2
0.0 -3.2 -2.4 -3.2 -1.2 3.6 2.8 4.7 3.2 2.4 2.0 -2.0 -8.3
0.0 -2.8 -4.0 -4.8 -2.0 -1.2 -3.2 -3.2 -2.0 -3.6 -2.4 -7.2 -13.7
僅HPV-TCR 0.0 4.0 4.9 1.3 3.1 6.7 -2.7 -1.8 1.3 3.1 4.5 5.4 3.1
0.0 -1.6 0.4 -3.1 -0.8 2.0 -2.7 -1.2 -0.8 -3.9 -2.7 -1.2 -3.5
0.0 -2.5 -2.1 -5.4 -5.0 3.3 -2.5 0.0 0.8 -0.8 2.5 5.0 0.4
0.0 0.4 3.5 0.9 6.5 10.4 5.6 6.1 5.6 3.5 8.2 11.3 7.4
0.0 -3.2 0.7 -2.8 -1.4 1.1 -2.1 0.7 -0.7 -1.1 1.8 2.1 -1.1
0.0 3.0 5.1 1.7 4.7 10.3 6.0 10.3 10.3 8.1 9.8 7.7 3.8
0.0 0.0 2.1 -0.4 4.2 5.4 2.9 5.4 6.3 1.7 5.0 9.6 5.9
0.0 2.0 2.0 0.0 0.0 2.4 0.4 0.8 3.2 3.6 1.6 5.2 2.4
0.0 3.4 3.1 5.3 3.1 5.0 0.4 2.7 4.6 2.3 4.2 6.5 0.4
0.0 -3.4 -4.5 -7.2 -4.5 -2.6 -2.3 -3.4 -2.3 -6.4 -4.2 0.4 -3.4
僅NKG2D CAR2 0.0 -3.2 -1.6 -6.0 -0.4 0.4 -3.2 -5.2 -3.2 -1.2 3.2 6.4 2.0
0.0 2.7 6.4 4.5 9.5 9.1 9.5 12.7 14.1 17.3 15.5 16.8 13.2
0.0 0.5 3.3 -2.8 3.3 5.2 0.5 3.3 -0.9 -0.9 1.9 3.3 -0.5
0.0 -4.5 -4.5 -7.0 -2.9 -2.9 -6.1 -1.2 -2.5 -5.3 -4.5 -3.3 -3.7
0.0 -0.4 2.2 1.8 4.0 4.0 -0.4 0.9 0.4 -1.3 2.7 5.4 3.1
0.0 1.6 3.6 2.0 1.6 5.6 1.6 4.0 2.8 2.4 1.6 6.0 2.4
0.0 -3.7 1.2 0.0 6.6 6.2 1.2 1.7 3.3 -0.4 2.1 3.7 0.4
0.0 -3.7 -4.1 -4.8 1.5 -3.0 -5.9 -5.9 -9.3 -9.6 -8.1 -8.9 -8.9
0.0 2.9 4.1 5.4 10.4 10.0 5.8 6.2 6.2 2.5 6.6 5.0 3.3
0.0 -0.8 0.4 -1.6 1.6 3.3 0.8 -0.4
HPV-TCR + NKG2D CAR2 0.0 0.8 2.5 1.6 2.9 7.0 4.9 6.6 5.3 5.7 5.7 7.0 3.7
0.0 0.4 0.9 -3.4 0.4 0.9 -2.2 -2.6 1.7 -1.7 -0.9 -0.4 -4.7
0.0 -9.0 -9.0 -12.1 -10.2 -7.4 -11.3 -10.2 -9.8 -11.7 -11.3 -9.0 -9.8
0.0 -4.0 -0.9 -7.1 -1.8 4.0 1.3 4.5 2.2 1.8 3.6 4.9 3.6
0.0 0.8 3.8 0.0 4.6 8.0 5.9 8.4 7.2 7.2 6.8 4.6 4.6
0.0 -2.8 2.8 -0.9 1.4 2.3 -0.5 0.5 -1.4 -0.5 2.3 -1.9 -3.8
0.0 2.7 -2.2 0.0 -0.4 0.0 1.8 2.7 2.2 0.4 4.9 -0.9 -1.3
0.0 0.4 1.9 0.4 1.5 3.8 -3.4 -6.1 -8.0 -11.1 -8.0 -6.9 -8.0
0.0 -1.9 1.9 1.1 1.1 5.3 1.1 0.0 -1.9 -1.1 3.4 1.1 -2.7
0.0 -1.6 -2.4 -3.6 -1.6 2.0 -3.6 -4.0 -4.4 -7.5 -4.0 -5.6 -6.7
腫瘤接種後天數 36 39 41 43 46 48 50 53 55 57 60 62   
媒劑 3.5 3.5 3.5 5.6   
7.6 14.3 12.5   
7.6 8.9 8.9 10.7   
0.8 8.5 4.2   
7.0 11.1 12.7   
-6.0 -2.4 -3.6 -0.8 1.6   
0.4 -0.4 0.4   
3.0 3.4 2.3   
NTD -15.8   
-4.5 -14.0 -23.6   
0.9 0.0 -3.3 -2.8 -18.3   
-2.1 -2.5 -5.9 -9.7 -15.7 -16.1 -18.6 -21.2   
-14.4 -11.7 -13.6 -14.4 -17.4 -17.0 -21.6   
###   
-13.4 -15.0 -21.7   
-20.1   
僅HPV-TCR 5.4 13.0 8.1 5.8 4.0 6.7 5.8 1.3 2.2 1.8 0.4 -4.5   
-3.5 1.6 1.6 2.3 -2.3 -2.0   
-1.3 1.7 3.3 1.3 -0.4 -0.8 -0.8 -7.5 -10.5 -15.1 -21.3   
7.4 12.1 12.1 10.8 10.0 5.6 3.9 -1.3 -3.5 -7.4 -8.7 -12.1   
-2.1 1.4 1.4 3.9   
2.1 3.4 0.4 0.0 3.0 2.1 -5.1 -2.6 -1.7 -6.0 -3.8 -2.6   
5.0 9.2 9.6 5.9 9.6 7.9 9.2 9.2   
-0.8 4.8 2.0 5.6 0.8 3.2 6.4 -1.6 4.0 2.4 3.2 2.0   
0.0 3.1 -2.3 -3.1   
-4.9 0.8 -1.5 1.1 1.9 -2.6 0.8 -1.5 0.8 2.3   
僅NKG2D CAR2 -2.4 2.8 3.2 5.6 8.8   
12.3 14.1 20.5 20.9 17.7 19.1 20.0 18.2 22.7 24.1   
2.3 8.0 6.1 7.5 10.3 12.7 12.7 9.4 12.7 15.0 18.3 16.4   
-1.2 0.8 -1.6 -1.2 1.2 -0.8 1.6 -0.4 0.0 2.9 5.7   
-0.1 6.3 4.0 9.9 12.6   
-0.4 5.2 2.4 6.8 4.0 6.0 8.0 7.6   
0.0 2.1 2.5 3.3 4.1 5.0 5.8 7.0 7.9 11.2 14.9   
-8.9 -4.8 -5.2 -3.7 -3.0 -4.4 -2.6 -2.2 2.2   
2.9 8.7 8.3 9.5 4.6 3.7 10.0 11.2 12.4 14.1   
  
HPV-TCR + NKG2D CAR2 4.9 6.6 8.6 11.1 13.1 13.9 13.1 12.3   
-4.3 3.4 3.9 9.9 8.2 5.2 5.6 4.7   
-8.6 -6.3 -9.0 -7.8 -5.9 -1.2 -0.4 1.6   
5.4 5.8 6.7 9.4 8.0 11.2 10.7 10.7   
2.1 4.2 2.5 6.3 4.6 8.0 8.9 6.3 8.4 8.4 11.0   
-2.3 0.0 -0.5 -1.4 1.9 3.3 5.2 1.9 7.0 4.7 8.9 4.2   
0.0 4.9 3.1 4.9 8.5 9.4   
-7.6 -5.7 -6.9 -3.4 -2.7 1.5 3.1 3.1   
-4.2 -1.1 0.4 1.1 3.8   
-6.0 -1.6 -4.8 -1.6 -0.4 1.2 4.4 5.6 4.8   
表18 ：末梢血液中之經過繼性轉移T 細胞的百分比
末梢淋巴球中之hCD45 百分比
腫瘤接種後天數 1 7 14 21 28 35
媒劑 0.00 0.01 0.03 0.02 0.02 0.01
0.00 0.04 0.04 0.02 0.02 0.02
0.06 0.00 0.02 0.02 0.01 0.01
0.01 0.00 0.02 0.02 0.01 0.01
0.10 0.00 0.03 0.02 0.00 0.01
0.02 0.01 0.03 0.02 0.00 0.00
0.01 0.09 0.03 0.02 0.01 0.00
0.19 0.00 0.02 0.01 0.00 5.03
NTD 8.03 8.63 2.56 9.25 41.80 78.20
7.47 0.36 2.24 4.62 19.80 43.20
9.44 8.83 1.95 4.58 16.70 29.90
5.45 6.13 2.09 4.55 11.50 28.10
6.90 6.54 0.73 8.59 25.30 27.20
4.61 5.04 1.48 5.09 53.60 38.00
7.35 6.04 1.26 6.15 29.80 26.60
4.77 3.45 1.94 14.80 40.00 0.00
僅HPV-TCR 4.14 1.77 0.16 0.09 1.33 0.45
3.26 1.24 0.17 0.15 0.16 0.43
4.21 2.11 0.33 0.51 0.00 18.60
3.32 4.59 0.43 0.62 0.00 2.02
3.62 2.92 0.16 0.29 0.00 1.53
3.26 1.97 0.15 0.11 0.69 1.99
3.24 2.41 0.16 0.58 1.80 0.58
4.23 2.46 0.17 0.62 0.49 5.95
4.36 4.46 0.20 2.52 0.38 0.47
3.18 2.72 0.12 0.22 0.24 0.02
僅NKG2D CAR2 0.43 1.35 0.04 0.07 0.01 0.50
0.60 1.92 0.09 1.28 1.39 0.01
0.67 3.19 0.07 0.06 0.02 4.89
0.65 3.15 0.09 0.16 0.65 0.01
1.06 1.43 0.13 0.06 0.04 0.10
0.75 2.70 0.05 0.12 0.03 0.02
0.73 3.39 0.10 0.09 0.02 0.01
0.86 2.98 0.10 0.07 0.02 0.02
0.00 1.21 0.05 0.05 0.02 0.02
0.65 1.75 0.09 0.07 0.03 0.00
HPV-TCR + NKG2D CAR2 0.42 1.91 0.06 0.02 0.03 0.01
0.32 1.99 0.06 0.03 0.00 0.03
0.40 1.84 0.10 0.06 0.02 0.81
0.37 1.81 0.13 0.37 0.40 0.02
0.32 2.10 0.06 0.02 0.01 0.10
0.25 1.62 0.05 0.01 0.01 0.01
0.24 1.32 0.09 0.05 0.01 0.22
0.26 2.71 0.10 0.02 0.01 0.33
0.30 2.76 0.05 0.26 0.08 0.02
0.30 3.12 0.07 0.05 0.02 10.90
一般而言，在以下申請專利範圍中，使用之用語不應解釋為將申請專利範圍限制為本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，但應解釋為包括所有可能實施例連同此類申請專利範圍授權之等效物的完整範疇。因此，申請專利範圍不受本揭露限制。
無
無

Claims (24)

  1. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含： NKG2D ecto域； 跨膜域； 4-1BB共刺激域；及 信號傳導域，其包含CD3-ζ信號傳導域。
  2. 如請求項1之CAR，其進一步包含： CD8-α鉸鏈域。
  3. 如請求項2之CAR，其中該CD8-α鉸鏈域包含根據SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之CAR，其中該NKG2D ecto域包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之CAR，其中該跨膜域進一步包含CD28跨膜域。
  6. 如請求項5之CAR，其中該CD28跨膜域包含根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之CAR，其中該4-1BB共刺激域包含根據SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 63之胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之CAR，其中該CD3ζ信號傳導域包含根據SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之CAR，其中該信號傳導域進一步包含CD3-ε信號傳導域。
  10. 如請求項9之CAR，其中該CD3-ε信號傳導域包含根據SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 61之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之CAR，其包含與選自由下列所組成之群組的胺基酸序列具有至少90%序列同一性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、及SEQ ID NO: 76。
  12. 一種核酸，其編碼如請求項1至11中任一項之CAR。
  13. 如請求項12之核酸，其包含與選自由下列所組成之群組的核苷酸序列具有至少90%序列同一性之核苷酸序列：SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、及SEQ ID NO: 77。
  14. 一種重組載體，其包含如請求項12或13之核酸。
  15. 如請求項14之重組載體或如請求項12或13之核酸，其中該重組載體或核酸進一步包含編碼經工程改造之T細胞受體(TCR)之核酸。
  16. 如請求項14之重組載體或如請求項12或13之核酸，其中該重組載體或核酸進一步包含編碼對於腫瘤抗原具有特異性之第二CAR之核酸。
  17. 如請求項15或16之重組載體或核酸，其中該腫瘤抗原包含HPV–16 E6與HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、CS1、EGFR、EGFR家族包括ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRa、Flt3、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、HLA–Al + MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–llRα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NYE-S0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素、TACI、TAG72、TEM、或VEGFRII。
  18. 一種宿主細胞，其經如請求項12至17中任一項之核酸或重組載體轉化。
  19. 一種宿主細胞，其經如請求項12或13之核酸或如請求項14之重組載體及編碼經工程改造之T細胞受體(TCR)或對於腫瘤抗原具有特異性之第二CAR之核酸或重組載體轉化。
  20. 如請求項19之宿主細胞，其中該腫瘤抗原包含HPV–16 E6與HPV–16 E7、α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7–H3、B7–H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD137 (4–1BB)、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CLL-1、CS1、EGFR、EGFR家族包含ErbB2 (HERII)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒AchR、FRa、Flt3、GD2、GD3、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)、HLA–Al + MAGEI、HLA–A2 + MAGE1、HLAA3 + MAGE1、HLA–Al + NY–ES0–1、HLA–A2 + NY–ES0–1、HLA–A3 + NY–ES0–1、IL–llRα、IL–13Rα2、λ、路易士–Y、κ、間皮素、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NYE-S0–1、PRAME、PSCA、PSMA、RORI、SSX、生存素、TACI、TAG72、TEM、或VEGFRII。
  21. 如請求項18至20中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞包含iPSC、T細胞、或NK細胞。
  22. 一種醫藥組成物，其包含如請求項21之宿主細胞。
  23. 一種治療有需要之患者中之疾病之方法，其包含將如請求項21之宿主細胞或如請求項22之醫藥組成物投予至該患者。
  24. 如請求項23之方法，其中該宿主細胞對於該患者係同種異體的。
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