CN111514283A - 使用抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症 - Google Patents

使用抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症 Download PDF

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Abstract

本发明提供了例如通过与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合施用包含如本文所述的CD19 CAR的重组T细胞，来治疗与表达CD19相关的疾病的组合物和方法。本发明也提供本文所述的试剂盒和组合物。

Description

使用抗CD19嵌合抗原受体治疗癌症
本申请是中国专利申请201580018102.9的分案申请，原申请的申请日是 2015年4月7日，发明名称是“使用抗CD19嵌合抗原受体治疗癌症”。
本申请要求2014年4月7日提交的美国系列号61/976,396、2014年6月3 日提交的美国系列号62/007,309、2014年8月12日提交的美国系列号 62/036,493、2014年11月6日提交的美国系列号62/076,238、2014年12月5 日提交的美国系列号62/087,888和2014年12月29日提交的美国系列号 62/097,278的优先权，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
序列表
本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。2015年4月6日创建的所述ASCII副本命名为 N2067-7051WO_SL.txt并且大小为252,236比特。
技术领域
本发明总体上涉及经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的用途，例如，与另一种药剂如(例如，激酶抑制剂和/或细胞因子)组合，用于治疗与表达分化抗原簇19蛋白(CD19)相关的疾病。
发明背景
许多B细胞恶性肿瘤患者用标准治疗不可治愈。此外，常规的治疗选项经常具有严重的副作用。已经在癌症中尝试免疫疗法，然而，几种障碍使得实现临床效果成为非常困难的目标。尽管已经鉴定到数百种所谓的肿瘤抗原，但是这些抗原通常从自身衍生并因此是免疫原性差的。另外，肿瘤使用几种机制使自身对抗免疫攻击的发动和扩大。
最近利用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法(其依赖于使 T细胞针对癌细胞(如B细胞恶性肿瘤)上的合适细胞表面分子重定向)的开发在利用免疫系统能力治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症方面显示出有前景的结果(参见，例如，Sadelain等人.,Cancer Discovery 3:388-398(2013))。鼠衍生的 CART19(即，“CTL019”)的临床结果已经在CLL患者中以及在ALL儿童中建立完全缓解方面显示出前景(参见，例如，Kalos等人,SciTransl Med 3:95ra73 (2011)；Porter等人,NEJM 365:725-733(2011)；Grupp等人,NEJM368:1509-1518(2013))。除基因修饰的T细胞上的嵌合抗原受体识别和摧毁靶向细胞的能力外，成功的治疗性T细胞疗法需要具有增殖和随时间推移持续存在的能力和进一步监测白血病细胞逃逸的能力。T细胞的可变性质，无论这是否为失能、抑制或疲惫所致，将影响CAR转化的T细胞的表现，但是熟练执业者此时对此仅具有有限的控制能力。为了有效，CAR转化的患者T细胞需要持续存在并维持响应于CAR的抗原而增殖的能力。已经显示ALL患者T细胞可以用包含鼠scFv的CART19做到这一点(参见，例如，Grupp等人,NEJM 368:1509-1518(2013))。
发明概述
本公开至少部分地以使用免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)治疗疾病如癌症(例如，血液癌或其他B细胞恶性肿瘤)的组合物和方法为特征，所述免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(CAR)分子，例如，与B细胞抗原(例如分化抗原簇19蛋白(CD19)(例如，OMIM登录号107265，SwissProt登录号P15391))结合的CAR。组合物包含表达靶向B细胞的CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且方法包括施用这些免疫效应细胞，所述免疫效应细胞与激酶抑制剂(例如，CDK4/6抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、MNK抑制剂、 PI3K/mTOR双重抑制剂或其组合中一者或多者)组合。在一些实施方案中，如与单独的任一种疗法相比，组合维持或具有更好的临床效果。本发明还涉及工程化细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞))表达与B细胞抗原(例如，CD19)结合的CAR分子以治疗与表达B细胞抗原(例如，CD19)相关的疾病 (例如，癌症，例如，血液癌)的用途，其中所述工程化细胞与激酶抑制剂(例如，选自以下一者或多者的激酶抑制剂：细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制剂、Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、mTOR抑制剂、促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR双重抑制剂或其组合) 组合。
因此，在一个方面，本发明涉及一种治疗患有与表达B细胞抗原(例如，CD19) 相关的疾病的受试者(例如，哺乳动物)的方法。该方法包括向哺乳动物施用有效量的表达结合B细胞抗原的CAR分子的细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，所述细胞与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合。在一个实施方案中，CAR分子与CD19结合，例如，本文所述的结合CD19的 CAR分子。在其他实施方案中，CAR分子与CD20、CD22或ROR1中一者或多者结合。
在一个实施方案中，与表达B细胞抗原(例如，表达CD19、CD20、CD22 或ROR1中一者或多者)相关的疾病选自增生性疾病如癌症、恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与表达B细胞抗原(例如，表达CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者)相关的非癌相关性适应症。在一个实施方案中，疾病是实体肿瘤或液体肿瘤。在一个实施方案中，癌是胰腺癌。在一个实施方案中，疾病是血液癌。在一个实施方案中，血液癌是白血病。在一个实施方案中，癌选自一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。额外的血液癌或血液学疾病包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症。在某些实施方案中，与B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者)表达相关的疾病是“白血病前期”，其是依据髓样血细胞无效产生(或发育异常 (dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合。在一些实施方案中，与B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者)表达相关的疾病包括，但不限于表达B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者) 的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。本文所述的与B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者)表达相关的疾病的任何组合可以用本文所述的方法和组合物治疗。
在一个实施方案中，与表达B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1 中一者或多者)相关的疾病是淋巴瘤，例如，MCL、何杰金淋巴瘤或DLBCL。在一个实施方案中，与表达B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1 中一者或多者)相关的疾病是白血病，例如，SLL、CLL和/或ALL。在一个实施方案中，与表达B细胞抗原相关的疾病是多发性骨髓瘤(例如，呈CD19阴性 (例如绝大部分(99.95％)肿瘤性浆细胞具有CD19阴性表型)的多发性骨髓瘤，例如，通过流式细胞术和RT-PCR二者均检出)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂(例如，本文所述的CDK4 抑制剂，例如，CD4/6抑制剂，如，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪 -1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作帕布昔利布 (palbociclib)或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂，如，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，本文所述的mTOR抑制剂，如，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以例如是mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2 抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如，本文所述的 MNK抑制剂，如，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以例如是MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一个实施方案中，抑制剂可以是PI3K/mTOR双重抑制剂，例如，PF-04695102。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基 -1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮、盐酸盐 (P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine (CYC202)；帕布昔利布(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
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唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6- 二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)； 5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺 (AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺 (AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；XL281(BMS908662)；和ribociclib。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，帕布昔利布 (PD0332991)，并且帕布昔利布以约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90 mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，在28天周期中每日施用14-21天，或在21天周期中每日施用7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的帕布昔利布。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼 (PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292； ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个优选实施方案中，BTK抑制剂不减少或不抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834； RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼 (PCI-32765)，并且依鲁替尼以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、 440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；地磷莫司((1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.04,9]三十七碳 -16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573 和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(semapimod)； (5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇 (AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基- 吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126)；和XL765。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg) 的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28 天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、 7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg) 的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088； 4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺； ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和 mTOR双重抑制剂：2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1- 哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲 (PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H- 咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)； 2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代 -9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹
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啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在一个实施方案中，细胞表达CAR分子，所述CAR分子包含抗CD19结合结构域(例如，与CD19特异性结合的鼠或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，CAR包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括本文所述的抗CD19结合结构域(例如，如本文所述的与CD19 特异性结合的鼠或人源化抗体或抗体片段)、本文所述的跨膜结构域和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含本文所述的共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。
在一个实施方案中，CAR分子能够结合CD19(例如，野生型或突变型人 CD19)。在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，所述抗CD19 结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个) 轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区 3(LC CDR3)、本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个) 重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区 3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)LC CDR和一个或多个(例如，全部三个)HC CDR的抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，抗CD19 结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个) 重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区 3(HC CDR3)，例如，抗CD19结合结构域具有两个可变重链区域，各自包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，抗CD19 结合结构域包含本文(例如，表7中)所述的鼠轻链可变区和/或本文(例如，表7 中)所述的鼠重链可变区。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表7 的氨基酸序列的鼠轻链和鼠重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表7中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换)，或包含与表7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表7 中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10 个修饰(例如，置换)，或包含与表7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:59的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表7中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表7中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、 3、4、5或6，优选地3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头- 轻链可变区。
在一个实施方案中，CAR分子包含人源化抗CD19结合结构域，所述人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2) 和轻链互补决定区3(LC CDR3)、本文所述的人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)LC CDR和一个或多个(例如，全部三个)HC CDR的人源化抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含至少HC CDR2。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化抗CD19 结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)，例如，人源化抗CD19 结合结构域具有两个可变重链区域，各自包含本文所述的HCCDR1、HC CDR2 和HC CDR3。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含至少HCCDR2。在一个实施方案中，轻链可变区包含VK3_L25种系序列的一个、两个、三个或全部四个构架区。在一个实施方案中，轻链可变区具有修饰(例如，置换，例如，在SEQ ID NO:58的鼠轻链可变区的相应位置存在的一个或多个氨基酸置换(例如，在位置71和87的一个或多个位置处的置换)。在一个实施方案中，重链可变区包含VH4_4-59种系序列的一个、两个、三个或全部四个构架区。在一个实施方案中，重链可变区具有修饰(例如，置换，例如，在SEQ IDNO:58 的鼠重链可变区的相应位置存在的一个或多个氨基酸置换(例如，在位置71、73 和78的一个或多个位置处的置换)。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如，表3中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表3中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表3中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换)，或包含与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表3 中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10 个修饰(例如，置换)，或包含与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11 和SEQ ID NO:12的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表3中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表3 中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，人源化抗CD19 结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选地3或 4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，CAR分子包含选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、 CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含了具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)、但不多于20、10或5个修饰(例如，置换)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，抗CD19结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链区)与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，编码的铰链区包含SEQ ID NO:14 或SEQ ID NO:45或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR分子还包含编码共刺激结构域(例如，本文所述的共刺激结构域)的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、 LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结构域包含 SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:51 的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含了具有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)、但不多于 20、10或5个修饰(例如，置换)的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO: 51的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR分子还包含编码胞内信号传导结构域(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和/或SEQ ID NO:17的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16 的序列和/或SEQ ID NO:43的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD27的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的序列和/或SEQ ID NO:17的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:51 的序列和/或SEQ IDNO:43的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含了具有SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:51的氨基酸序列和/或SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:43的氨基酸序列至少一个、两个或三个修饰(例如，置换)、但不多于20、10或5个修饰(例如，置换)的氨基酸序列或与SEQ IDNO:16或 SEQ ID NO:51的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列和SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43 的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列在相同可读框中表达并作为单条多肽链表达。
在一个实施方案中，CAR分子还包含前导序列(例如，本文所述的前导序列)。在一个实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CAR分子包含前导序列(例如，本文所述的前导序列，例如，SEQID NO:13或与其具有95-99％同一性的前导序列)；本文所述的抗 CD19结合结构域(例如，包含本文所述的LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、 HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3的抗CD19结合结构域，例如，表7中描述的鼠抗CD19结合结构域、表3中描述的人源化抗CD19结合结构域、或与其具有95-99％同一性的序列)；铰链区(例如，本文所述的铰链区，例如，SEQ ID NO:14或与其具有95-99％同一性的铰链区)；跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域，例如，具有SEQ ID NO:15的序列或与其具有95-99％同一性的序列的跨膜结构域；胞内信号传导结构域(例如，本文所述的胞内信号传导结构域，例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含共刺激结构域，例如，本文所述的共刺激结构域，例如，具有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列或与其具有95-99％同一性的4-1BB共刺激结构域，和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域，例如，具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43 的序列或与其具有95-99％同一性的CD3ζ刺激性结构域)。
在一个实施方案中，CAR分子包含下述氨基酸序列(例如，由其组成)：SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQID NO:42的氨基酸序列；或氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO: 37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、10个、15个、 20个或30个修饰(例如，置换)但是不多于60、50或40个修饰(例如，置换)；或与SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、 SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，表达CAR分子的细胞包含载体，所述载体包含编码 CAR分子的核酸序列。在一个实施方案中，载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是慢病毒载体。在一个实施方案中，载体还包含启动子。在一个实施方案中，启动子是 EF-1启动子。在一个实施方案中，EF-1启动子包含SEQ IDNO:100的序列。在一个实施方案中，载体是体外转录的载体，例如，转录本文所述的核酸分子的RNA的载体。在一个实施方案中，体外载体中的核酸序列还包含多聚腺苷酸化尾，例如，本文所述的多聚腺苷酸化尾，例如，包含约150个腺苷碱基的多聚腺苷酸化尾(SEQ ID NO:104)。在一个实施方案中，体外载体中的核酸序列还包含3’UTR，例如，本文所述的3’UTR，例如，包含衍生自人β-球蛋白的3’UTR 的至少一个重复序列的3’UTR。在一个实施方案中，体外载体中的核酸序列还包含启动子，例如，T2A启动子。
在本文所公开的组合物和方法的某些实施方案中，表达CAR分子的细胞(本文也称作“表达CAR的细胞”)是如本文所述的细胞或细胞群体，例如，人免疫效应细胞或细胞群体(例如，人T细胞或人NK细胞(例如，本文所述的人T细胞或本文所述的人NK细胞)。在一个实施方案中，人T细胞是CD8+T细胞。在一个实施方案中，细胞是自体T细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体 T细胞。在一个实施方案中，细胞是T细胞并且该T细胞是二酰甘油激酶(DGK) 缺陷的。在一个实施方案中，细胞是T细胞并且该T细胞是Ikaros缺陷的。在一个实施方案中，细胞是T细胞并且该T细胞是同时DGK和Ikaros缺陷的。应当理解，本文所公开的组合物和方法中提到术语“细胞”涵盖包含一个或多个细胞(例如，一个细胞群体)的组合物和方法。
在另一个实施方案中，(例如，如本文所述的)表达CAR分子的细胞还可以表达另一个物质，例如，增强表达CAR的细胞活性的物质。
在一个实施方案中，方法进一步包括施用如本文所述的表达CAR分子的细胞，所述细胞任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合，与增强表达CAR的细胞活性的物质组合。在某些实施方案中，该物质是细胞因子，例如，IL-7、IL-15、IL-21、或其组合。在一个实施方案中，方法包括施用IL-7 至受试者。细胞因子可以与表达CAR的细胞组合施用(例如，同时施用或施用表达CAR的细胞后不久施用)来递送。备选地，细胞因子可以在施用表达CAR 的细胞后一段延长的时间之后(例如，在评定受试者对表达CAR的细胞的应答后)递送。
在其他实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质可以是抑制免疫抑制性分子的物质。免疫抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、 CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、 BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制免疫抑制性分子的物质包含第一多肽(例如，免疫抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质包含例如，抑制性分子如PD1、PD-L1、CTLA4、 TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、 VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个实施方案中，淋巴细胞输注，例如同种异体淋巴细胞输注，用于治疗癌症，其中淋巴细胞输注包含如本文所述的至少一种与B细胞抗原(例如， CD19)结合的表达CAR的细胞(本文也称作表达CD19 CAR的细胞)。在一个实施方案中，自体淋巴细胞输注用于治疗癌症，其中自体淋巴细胞输注包至少一种表达CD19的细胞。
在一个实施方案中，将表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞)施用至已经接受既往干细胞移植(例如，自体干细胞移植)的受试者。
在一个实施方案中，将表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞)施用至已经接受美法仑剂量的受试者。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与改善一种或多种副作用的物质(例如，本文所述的物质)组合施用，其中所述一种或多种副作用是与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用。
在一个实施方案中，激酶抑制剂与改善一种或多种副作用的物质(例如，本文所述的物质)组合施用，其中所述一种或多种副作用是与施用激酶抑制剂相关的一种或多种副作用。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞和激酶抑制剂与治疗CD19相关疾病的其他物质(例如，本文所述的其他物质) 组合施用。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞以本文所述的剂量和/或给药方案施用。
在一个实施方案中，将CAR分子引入T细胞中，例如，使用体外转录引入，并且受试者(例如，人)接受初始施用包含CAR分子的细胞以及一次或多次后续施用包含CAR分子的细胞，其中一次或多次后续施用是先前施用后小于 15天，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，每周将包含CAR分子的细胞多于一次施用至受试者(例如，人)，例如，每周2、3、或4次施用包含CAR分子的细胞。在一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)每周接受包含CAR分子的细胞的多于一次施用(例如，每周2、3或4次施用)(本文也称作周期)，随后一周不施用包含CAR分子的细胞，并且随后将包含CAR分子的细胞的一次或多次额外施用(例如，每周多于一次施用包含CAR分子的细胞)施用至受试者。在另一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)接受多于一个周期的包含CAR分子的细胞并且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，包含CAR分子的细胞每隔1日施用，每周3次施用。在一个实施方案中，将包含CAR分子的细胞施用至少两、三、四、五、六、七、八或更多周。
在一个实施方案中，激酶抑制剂和表达CAR分子(例如，本文所述的CAR 分子)的细胞的组合作为一线治疗针对疾病(例如，癌症，例如，本文所述的癌症) 施用。在另一个实施方案中，激酶抑制剂和表达CAR分子(例如，本文所述的 CAR分子)的细胞的组合作为二线、三线、四线治疗针对疾病(例如，癌症，例如，本文所述的癌症)施用。
在一个实施方案中，将本文所述的细胞(例如，细胞群体)施用至受试者。
在一个实施方案中，该方法包括施用细胞群体，多种所述细胞包含本文所述的CAR分子。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR 的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体可以包含表达具有本文所述的抗CD19结合结构域的CAR的第一细胞和表达具有不同抗 CD19结合结构域(例如，在第一细胞表达的CAR中与抗CD19结合结构域不同的本文所述的抗CD19结合结构域)的CAR的第二细胞。作为另一个例子，表达CAR的细胞的群体可以包含表达下述CAR的第一细胞，所述CAR包含(例如，如本文所述的)抗CD19结合结构域，和表达下述CAR的第二细胞，所述 CAR包含针对除CD19以外的靶(例如，CD123或间皮素)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR的第一细胞，所述CAR包含初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR的第二细胞，所述 CAR包括次级信号传导结构域。
在一个实施方案中，方法包括施用细胞群体，其中，群体中的至少一种细胞表达了具有本文所述的抗CD19结构域的CAR，和施用增强表达CAR的细胞活性的物质，例如，表达增强表达CAR的细胞活性的物质的第二细胞。例如，在一个实施方案中，该物质可以是抑制了免疫抑制性分子的物质。免疫抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、 CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、 CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制免疫抑制性分子的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽 (例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质包含例如，抑制性分子如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、 CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在另一个方面，本发明涉及本文所述的表达CAR分子的细胞，其与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼))组合用作药物。在另一个方面，本发明涉及本文所述的激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)，其与本文所述的表达CAR分子的细胞组合用作药物。
在另一个方面，本发明涉及本文所述的表达CAR分子的细胞，其与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼))组合用于治疗表达B细胞抗原(例如，CD19)的疾病。在另一个方面，本发明涉及本文所述的激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)，其与本文所述的表达CAR分子的细胞组合用于治疗表达B细胞抗原(例如，CD19)的疾病。疾病可以例如是癌症如血液癌。癌症可以例如是淋巴瘤、CLL、MCL、ALL、DLBCL、多发性骨髓瘤或本文所述的另一种癌症。
在另一个方面，本发明涉及本文所述的表达CAR分子的细胞，其与如本文所述的细胞因子(例如，IL-7、IL-15和/或IL-21)组合用作药物。在另一个方面，本发明涉及本文所述的细胞因子，其与本文所述的表达CAR分子的细胞组合用作药物。
在另一个方面，本发明涉及本文所述的表达CAR分子的细胞，其与如本文所述的细胞因子(例如，IL-7、IL-15和/或IL-21)组合治疗表达CD19的疾病。在另一个方面，本发明涉及本文所述的细胞因子，其与本文所述的表达CAR分子的细胞组合用于治疗表达CD19的疾病。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗患有何杰金淋巴瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的表达CAR分子(例如，本文所述的CAR 分子)的细胞(例如，多个细胞)。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与增加表达CAR分子的细胞效能的物质(例如，本文所述的物质)组合施用。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与改善一种或多种副作用的物质(例如，本文所述的物质)组合施用，其中所述一种或多种副作用是与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与治疗何杰金淋巴瘤的物质(例如，本文所述的物质)组合施用。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂(例如，本文所述的mTOR抑制剂)组合施用。尽管不希望受理论约束，据信用免疫增强性低剂量(例如，不足以完全抑制免疫系统，但足以改善免疫功能的剂量)治疗伴有PD-1阳性T细胞减少或PD-1 阴性细胞增加。可以通过与表达PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)的细胞结合，耗尽PD-1阳性T细胞，但不耗尽PD-1阴性T细胞。
在一个实施方案中，这种方法可以用来优化本文所述的CAR细胞在受试者中的表现。尽管不希望受理论约束，据信在一个实施方案中，改善了内源性未修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞)的表现。尽管不希望受理论约束，据信在一个实施方案中，改善了表达CD19CAR的细胞的表现。在其他实施方案中，可以通过与下述量的mTOR抑制剂接触，离体处理已经工程化或将会工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，所述量增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T 细胞)数目或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
在一个实施方案中，在施用表达本文所述的CAR的细胞(例如，T细胞)之前启动免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂(例如，变构抑制剂(例如，RAD001) 或催化性抑制剂)的施用引发。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是RAD001 或雷帕霉素。在一个实施方案中，在足够时间的mTOR抑制剂或充分给予 mTOR抑制剂后施用CAR细胞，从而PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞) 的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如， T细胞)的比率已经至少瞬时增加。
在一个实施方案中，在足够时间的mTOR抑制剂后或在充分给予免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂后收获待工程化以表达CAR的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，从而受试者中的或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少瞬时增加。
在实施方案中，本文所述的任何方法还包括对受试者进行淋巴细胞清除，例如，在施用表达本文所述的CAR分子(例如，结合CD19的CAR分子)的一个或多个细胞之前。淋巴细胞清除可以包括例如施用以下一者或多者：美法仑、环磷氮芥(cytoxan)、环磷酰胺和氟达拉滨。
在一些实施方案中，施用的表达CAR的细胞包含可调节性CAR(RCAR)，例如，如本文所述的RCAR。RCAR可以例如包含胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含胞内信号传导结构域和第一转换开关结构域；抗原结合构件，所述抗原结合构件包含结合CD19的抗原结合结构域和第二转换开关结构域；和跨膜结构域。该方法还可以包括施用二聚化分子，例如，以足够引起第一转换开关结构域和第二转换开关结构域二聚化的量施用。
在一些实施方案中，将表达CAR的细胞和激酶抑制剂同时或基本上同时施用，例如，作为一线疗法施用。在一些实施方案中，该方法包括将BTK抑制剂 (例如，依鲁替尼)和表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)的组合作为一线疗法施用至受试者。
在其他实施方案中，依次施用表达CAR的细胞和激酶抑制剂。例如，激酶抑制剂在表达CAR的细胞前施用，或表达CAR的细胞在激酶抑制剂前施用。
在一些实施方案中，与表达CD19相关的疾病是血液癌(例如，本文所述的血液癌(如CLL、MCL、或ALL)，并且受试者是或经鉴定是针对一种或多种血液癌治疗药(例如针对BTK抑制剂如依鲁替尼)的部分应答者、非应答者或复发者。在一些实施方案中，受试者具有或经鉴定为具有BTK突变。突变可以例如是点突变、插入、或缺失。突变可以例如是在BTK抑制剂的结合位点处(例如，在ATP-结合袋处或其附近)的突变。突变可以引起对BTK抑制剂的反应(例如，耐药性)减少。
在本文所公开的任一个方法的一些实施方案中，该方法包括将BTK抑制剂 (例如，依鲁替尼)施用至受试者，从而减少BTK抑制剂的量(例如，停止施用)，并且随后将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)施用至受试者。
在一些实施方案中，该方法包括将BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)施用至受试者并且随后将BTK抑制剂和表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞) 的组合施用至受试者。
在一些实施方案中，该方法包括将BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)施用至受试者，从而减少BTK抑制剂的量(例如，停止或中止施用)，并且随后将表达CAR 的细胞(例如，表达CAR19的细胞)和第二BTK抑制剂(例如，除第一BTK抑制剂之外(例如，除依鲁替尼之外)的BTK抑制剂的组合施用至受试者。在一些实施方案中，第二BTK抑制剂选自以下一种或多种：GDC-0834、RN-486、 CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13、或其组合。
在一些实施方案中，与表达B细胞抗原(例如，CD19)相关的疾病是血液癌 (例如，本文所描述的血液癌，例如，CLL、MCL或ALL)，并且该方法延迟或减少针对激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)、给予受试者的表达CAR 的细胞(例如，表达CAR19的细胞)或这两者的耐药性。在一些实施方案中，与表达CD19相关的疾病是血液癌(例如，本文所述的血液癌，例如，CLL、MCL 或ALL)，并且其中该方法延长缓解或延迟血液癌的复发。例如，与用激酶抑制剂或表达CAR的细胞的单药疗法治疗时预计的病程相比，缓解可以延长，复发可以延迟，耐药性可以延迟，或耐药性可以减少。
可以在前述任一方法中使用的示例性治疗方案包括以下一种或多种：
在一个实施方案中，将激酶抑制剂和表达CAR的细胞(例如，表达CAR19 的细胞)作为一线疗法施用至受试者(例如，哺乳动物)。
在另一个实施方案中，将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)在施用激酶抑制剂后施用至受试者(例如，哺乳动物)。
在其他实施方案中，将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)在停止施用激酶抑制剂后施用。
在其他实施方案中，激酶抑制剂的施用在施用表达CAR19的细胞之前开始，并且表达CAR19的细胞与激酶抑制剂的持续施用组合来施用。
在一个实施方案中，向受试者施用激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)，例如，作为一线治疗药。在预定的时间间隔后(例如，1或2个月，以及2 周、3周、1个月、1.5个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、12个月、15个月、或18月)，将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)单独的或与激酶抑制剂组合施用至受试者。在一些实施方案中，以预定的时间间隔 (例如，在激酶抑制剂和/或表达CAR的细胞治疗前或期间)评估受试者对治疗的应答。如果评估显示受试者是完全应答者，则不施用表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。如果评估显示受试者是激酶抑制剂的部分应答者或具有响应于激酶抑制剂的稳定病情，则将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)与激酶抑制剂组合施用，例如，如本文所述。如果评估显示受试者是非应答者或复发者，则将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)与激酶抑制剂或第二激酶抑制剂(例如，如本文所述的第二激酶抑制剂)组合施用。
在其他实施方案中，受试者(例如哺乳动物)是或经鉴定是对BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)的完全或部分应答者或对表达CAR19的细胞的完全或部分应答者。
在一些实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)的完全应答者时，在完全应答时间期间不向受试者施用表达CAR 的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。在一些实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂的完全应答者(例如，依鲁替尼的完全应答者)时，在完全应答时间期间向受试者施用表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。在一个实施方案中，在表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)后，受试者出现应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
在一些实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)的部分应答者时，在部分应答时间期间不向受试者施用表达CAR 的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。在其他实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂的部分应答者时，在部分应答时间期间向受试者施用)(单独的或与BTK抑制剂组合的)表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现完全应答和/或应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
在一些实施方案中，当受试者在激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼) 治疗后具有(或经鉴定为具有)稳定病情时，在病情稳定时间期间不向受试者施用 CAR疗法。在其他实施方案中，当受试者在激酶抑制剂治疗后具有(或经鉴定为具有)稳定病情时，在病情稳定时间期间向受试者施用CAR疗法。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现部分应答、完全应答和/或应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
在一些实施方案中，当受试者在激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼) 治疗后具有(或经鉴定为具有)进展性病情时，在病情进展时间期间不向受试者施用表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。在其他实施方案中，当受试者在激酶抑制剂治疗后具有(或经鉴定为具有)进展性病情时，在病情进展时间期间向受试者施用表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现病情稳定、部分应答、完全应答和/或应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞与第二激酶抑制剂组合施用，其中当哺乳动物是或经鉴定是依鲁替尼的非应答者或复发者时，第二激酶抑制剂不是依鲁替尼。第二激酶抑制剂可以选自以下一种或多种：GDC-0834、RN-486、 CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774、或LFM-A13、或其组合。
在其他实施方案中，受试者(例如，哺乳动物)是(或经鉴定是)激酶抑制剂的部分应答者，并且在部分应答时间期间，向受试者施用)单独的或与BTK抑制剂组合的表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。
在其他实施方案中，受试者(例如，哺乳动物)是(或已经鉴定为是)用依鲁替尼治疗后具有进展性或稳定病情的非应答者，并且在病情进展或稳定时间期间向受试者施用单独的或与第二BTK抑制剂组合的表达CAR的细胞(例如，表达 CAR19的细胞)，其中第二激酶抑制剂不是依鲁替尼。
在另一个方面，本文中提供一种治疗患有与表达B细胞抗原(例如，CD19) 相关的疾病的受试者(例如，哺乳动物)的方法。该方法包括向受试者以组合方式 (例如同时地(或基本上同时)、或依次)施用有效量的如本文所述的激酶抑制剂(例如，本文所述的BTK激酶抑制剂，例如，依鲁替尼)和表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。
在一些实施方案中，将激酶抑制剂和表达CAR的细胞(例如，CAR19细胞) 以组合方式(例如，作为一线疗法)施用。
在一些实施方案中，将激酶抑制剂初始施用，例如，作为单药疗法或一线疗法；在减少(例如，停止或中止施用)激酶抑制剂的量后，施用表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)至受试者。
在其他实施方案中，将激酶抑制剂初始施用，例如，作为单药疗法或一线疗法；并随后施用激酶抑制剂和表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞) 的组合至受试者。
在一些实施方案中，将激酶抑制剂初始施用，例如，作为单药疗法或一线疗法；在减少(例如，停止或中止施用)激酶抑制剂的量后，随后施用第二激酶抑制剂和表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)的组合至受试者。
在一些实施方案中，以预定的时间间隔(例如，在激酶抑制剂和/或表达CAR 的细胞治疗前或期间)评估受试者对治疗的应答。如果评估显示受试者是完全应答者，则不施用表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)。如果评估显示受试者是激酶抑制剂的部分应答者或具有响应于激酶抑制剂的稳定病情，则将表达CAR的细胞(例如，表达CAR19的细胞)与激酶抑制剂组合施用，例如，如本文所述。如果评估显示受试者是非应答者或复发者，则将表达CAR的细胞 (例如，表达CAR19的细胞)与激酶抑制剂或第二激酶抑制剂(例如，如本文所述的第二激酶抑制剂)组合施用。
在一些实施方案中，与表达B细胞抗原(例如，CD19)相关的疾病是血液癌、白血病、淋巴瘤、MCL、CLL、ALL、何杰金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，激酶抑制剂选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼、 GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、 CNX-774、或LFM-A13；选自以下的CDK4抑制剂：帕布昔利布、aloisine A、夫拉平度、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066、P276-00、RAF265、indisulam、roscovitine、 dinaciclib、BMS 387032、MLN8054、AG-024322、AT7519、AZD5438、 BMS908662；或ribociclib；选自以下的mTOR抑制剂：雷帕霉素、雷帕霉素类似物如依维莫司、坦罗莫司、地磷莫司、塞马莫德(semapimod)、AZD8055、 PF04691502、SF1126、XL765、或OSI-027；或选自以下的MNK抑制剂：CGP052088、CGP57380、尾孢酰胺或ETC-1780445-2、或4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一些方面，本发明表征了一种治疗患有何杰金淋巴瘤的受试者(例如，哺乳动物)或对其提供抗肿瘤免疫力的方法。该方法包括向受试者单独的或与第二疗法组合施用有效量的表达结合CD19的CAR分子的细胞。
在另一个方面，本发明表征了一种治疗患有多发性骨髓瘤(例如，CD19阳性多发性骨髓瘤或CD19阴性骨髓瘤)的受试者(例如，哺乳动物)或对其提供抗肿瘤免疫力的方法。在一个实施方案中，多发性骨髓瘤呈CD19阴性，例如，绝大部分(99.95％)肿瘤性浆细胞具有CD19阴性表型，例如，通过流式细胞术和RT-PCR二者均检出。该方法包括向受试者单独的或与第二疗法(例如，多发性骨髓瘤的医护标准疗法)组合施用有效量的表达结合CD19的CAR分子的细胞。该方法还可以包括施用如本文所述的激酶抑制剂。
在与何杰金淋巴瘤或多发性骨髓瘤相关的方法的实施方案中，CAR分子是人源化CAR分子，例如，如本文所述。在实施方案中，CAR分子是如本文所述的CAR分子。例如，在实施方案中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，所述抗CD19结合结构域包含以下一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)：SEQ ID NO:5的LC CDR1、SEQ ID NO:26的LC CDR2和SEQ ID NO:27的LC CDR3；SEQ ID NO:19的HC CDR1、SEQ ID NO:20-23中任一者的LC CDR2 和SEQ ID NO:24的HC CDR3。
在与何杰金淋巴瘤或多发性骨髓瘤相关的方法的一些实施方案中，CAR分子(例如，CART19或CTL019)作为单药疗法施用。在一些实施方案中，该方法还包括施用激酶抑制剂，例如，BTK抑制剂(如依鲁替尼)、CDK4抑制剂、mTOR 抑制剂、或MNK抑制剂。
在与多发性骨髓瘤相关的方法的一些实施方案中，CAR分子(例如， CART19或CTL019)与多发性骨髓瘤的医护标准疗法组合(例如，与清髓化疗和 /或自体干细胞移植挽救组合)(例如，在施用美法仑(例如，高剂量美法仑)后)施用。
在另一个方面，本发明特征在于包含细胞和一种或多种激酶抑制剂的组合物，其中所述细胞表达结合B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1 中一者或多者)的CAR分子，激酶抑制剂选自Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制剂、mTOR抑制剂或促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂。表达CAR的细胞和一种或多种激酶抑制剂可以按单一剂量形式或作为两个或更多个剂量形式存在。
在实施方案中，本文公开的组合物作为药物使用。
在实施方案中，本文公开的组合物用于治疗与表达B细胞抗原(例如，CD19) 相关的疾病。
产生表达CAR的细胞的方法和组合物
在某些方面，本公开还提供一种制备可以工程化以表达CAR(例如，本文所述的CAR)的免疫效应细胞群体(例如，T细胞或NK细胞)的方法，所述方法包括：提供免疫效应细胞群体；并且使免疫效应细胞与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)在足以抑制激酶抑制剂(例如，BTK和/或ITK)的靶的条件下接触。该方法还可以包括使免疫效应细胞与编码CAR分子的核酸接触，例如，用编码CAR分子的核酸转导免疫效应细胞。
在一些方面，本公开提供一种制备表达CAR的细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞或细胞群体)的方法，所述方法包括：使细胞或细胞群体与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)接触；并且在如此条件下引入(例如，转导) 编码CAR分子的核酸至细胞或细胞群体中，从而表达CAR分子。
在产生表达CAR的细胞的方法的某些实施方案中，由核酸编码的CAR分子是结合CD19的CAR分子。在实施方案中，该方法还包括在允许细胞或至少细胞子群体表达CAR分子的条件下培养细胞或多个细胞。在实施方案中，细胞是T细胞或NK细胞，或细胞群体包括T细胞、NK细胞或这两者。在实施方案中，该方法包括使细胞或多个细胞与激酶抑制剂接触(例如10-20、20-30、 30-40、40-60或60-120分钟)并且随后从细胞或多个细胞移除大部分或全部激酶抑制剂。在实施方案中，在收获细胞或多个细胞后或在刺激细胞或多个细胞前添加激酶抑制剂。在实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂、CDK4抑制剂、 mTOR抑制剂、或MNK抑制剂。在实施方案中，激酶抑制剂是依鲁替尼。在实施方案中，细胞群体还包含癌细胞，例如，白血病细胞或淋巴瘤细胞。癌细胞可以例如是CLL细胞、MCL细胞或ALL细胞。在实施方案中，激酶抑制剂抑制癌细胞中的靶(例如，BTK)，例如，减少其活性至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在实施方案中，激酶抑制剂抑制免疫效应细胞中的靶(例如，ITK)，例如，减少其活性至少10％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些方面，本公开还提供反应混合物，所述反应混合物包含激酶抑制剂 (例如，BTK抑制剂)和CAR分子或编码CAR分子的核酸。在一些实施方案中，反应混合物还包含免疫效应细胞群体。
在一些实施方案中，一个或多个免疫效应细胞表达CAR分子或包含编码 CAR分子的核酸。在一些实施方案中，激酶抑制剂选自BTK抑制剂、CDK4 抑制剂、mTOR抑制剂、或MNK抑制剂。在一些实施方案中，BTK抑制剂选自：依鲁替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、 ONO-4059、CNX-774、或LFM-A13。在实施方案中，反应混合物包含癌细胞，例如，血液癌细胞。癌细胞可以例如是从受试者收获免疫效应细胞时从受试者收获的细胞。
在某些方面，本公开还提供了包含免疫效应细胞群体和CAR分子或编码 CAR分子的核酸的反应混合物，其中免疫效应细胞包含共价失活的ITK。在实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 95％或99％的ITK是共价失活的。在一些实施方案中，反应混合物还包含癌细胞。在实施方案中，癌细胞包含共价失活的BTK。在实施方案中，至少10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的BTK是共价失活的。在实施方案中，BTK或ITK在其ATP结合结构域处或其附近与小分子如依鲁替尼形成共价键。在实施方案中，BTK在其半胱氨酸-481处或其附近与小分子如依鲁替尼形成共价键。
在实施方案中，如本文所述的反应混合物还包含缓冲液或其他试剂，例如，含有PBS的溶液。在实施方案中，反应混合物还包含激活和/或扩增细胞群体的物质，例如，刺激CD3/TCR复合体相关信号的物质和/或刺激细胞表面上共刺激分子的配体。在实施方案中，该物质是与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28 抗体或其片段缀合的珠。在实施方案中，反应混合物还包含一种或多种用于增殖和/或生存力的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或用于细胞生长的任何其他添加物。在实施方案中，反应混合物还包含IL-15 和/或IL-7。在实施方案中，反应混合物中群体的多个细胞包含(例如，如本文所述的)包含编码CAR的序列(例如，编码CD19 CAR的序列)的核酸分子，例如，本文所述的核酸分子。在实施方案中，反应混合物中群体的多个细胞包含载体，所述载体包含编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR) 的核酸序列。在实施方案中，载体是本文所述的载体，例如，载体选自DNA、 RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在实施方案中，反应混合物还包含低温保护剂或稳定剂，例如，糖、寡糖、多糖和多元醇(例如，海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、盐和冠醚。在一个实施方案中，低温保护剂是葡聚糖。
在一些实施方案中，本文公开的制备方法还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。
在一些实施方案中，本文公开的制备方法还包括在包含2％hAB血清的血清中培养免疫效应细胞群体。
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本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式完整地并入。
本发明的其他特征、目的和优点将从本描述及附图并且从权利要求书中显而易见。
附图简述
图1A、图1B和图1C是ND317(正常供体)T细胞中测定的细胞毒性的图示，所述ND317T细胞用小鼠抗CD19 CAR或本发明的人源化抗CD19 CAR转导并且与如图1A中所示的不表达CD19(K562cc)的对照K562细胞、如图1B中所示的用CD19(K562.CD19)转化的K562细胞或如图1C中所示的从CLL患者分离的恶性B细胞(Pt14B细胞分离株)一起培养。
图2A和图2B是显示表达人源化和小鼠抗CD19 CAR的细胞对CD19+细胞的增殖应答的图示，其中更高数目的活CAR+T细胞与相对于原代CLL细胞显示最大CD4+和CD8+T细胞增殖的群体的相关性。
图3是本发明scFv的解卷积HPLC质谱的图示，其中上排描述了未处理的 scFv并且下排描述了相关的去糖基化scFv。
图4是如通过差异扫描Fluorimetry所测量的构象稳定性的图示。小鼠scFv 的Tm是57℃(粗线)。如与小鼠亲本scFv相比，全部人源化scFv变体在约70℃均显示较高的Tm。通过人源化引入的残基具有提高超过10℃的Tm。
图5是CD19 CAR转导的T细胞增殖的图示，其中CART19细胞针对 (a)CD19表达阴性并且因此作为阴性对照使用的慢性髓性白血病(“CML”)细胞系；(b)CD19表达阳性并且因此作为阳性对照使用的重组K562细胞；或(c)从 CLL患者分离并且在细胞表面上表达CD19的Pt14B细胞。
图6A和图6B是代表性CAR的示意图。
图7描述了用CD19转导的CAR T细胞治疗后NSG小鼠中的HALLX5447 原发性ALL病情进展。原代人ALL细胞在用CD19特异的CAR T细胞治疗后的NSG小鼠中的生长展示控制病情进展。CD19+人ALL细胞的平均百分数是至肿瘤植入后第65天的NSG小鼠外周血中疾病负荷的指标。黑色圆圈：通过尾静脉用100ul PBS处理的小鼠；红色方块：用模拟转导的T细胞处理的小鼠；蓝色三角形：用鼠CD19 CAR转导的T细胞处理的小鼠；和紫色倒三角形：用人源化CD19 CAR转导的T细胞处理的小鼠。通过ANOVA计算显著性；*指 p<0.01。
图8描述了患者肿瘤细胞中的CD19表达。CD138+CD45暗肿瘤细胞针对 CD19(x-轴)和CD38(y-轴)染色。大约1-2％的肿瘤细胞表达CD19抗原。
图9是显示用渐增浓度的依鲁替尼(10nM、100nM和1000nM)处理时 CART19细胞的细胞增殖和细胞尺寸的两个图示。
图10A和图10B显示在依鲁替尼存在或不存在时用MCL细胞系刺激的 CART19细胞的增殖。图10A是显示在渐增浓度的依鲁替尼(10nM、100nM和 1000nM)存在或不存在时，用肿瘤细胞系MOLM14、JEKO-1和RL刺激的 CART19细胞增殖的系列直方图。细胞通过CFSE染色并通过流式细胞术分析以确定增殖细胞的百分数，由每个直方图中的标度指明。图10B是图10A中代表性直方图的定量。
图11A和图11B显示在依鲁替尼存在或不存在时用MCL细胞系刺激的 CART19细胞的CD107a脱颗粒。图11A是显示在渐增浓度的依鲁替尼(10nM、 100nM和1000nM)存在或不存在时，用肿瘤细胞系(MOLM14、JEKO-1和RL) 刺激的CART19细胞的CD107a脱颗粒的系列流式细胞术图谱。在y-轴中测量 CD107a表达。图11B是来自图11A的结果的量化。
图12是显示在渐增浓度的依鲁替尼(10nM、100nM和1000nM)存在或不存在时，用肿瘤细胞系(MOLM14、JEKO-1和RL)刺激的CART19细胞产生胞质内IL-2的系列流式细胞术图谱。y-轴代表IL-2表达。
图13是显示在渐增浓度的依鲁替尼(10nM、100nM和1000nM)存在或不存在时，用肿瘤细胞系(MOLM14、JEKO-1和RL)刺激的CART19细胞产生胞质内TNF-α的系列流式细胞术图谱。y-轴代表TNF-α表达。
图14是显示在渐增浓度的依鲁替尼(10nM、100nM和1000nM)存在或不存在时，用肿瘤细胞系(MOLM14、JEKO-1和RL)刺激的CART19细胞产生胞质内IFN-g的系列流式细胞术图谱。y-轴代表IFN-g表达。
图15是显示在渐增浓度的依鲁替尼(10nM、100nM和1000nM)存在或不存在时，来自用肿瘤细胞系(MOLM14、JEKO-1和RL)刺激的CART19细胞中的细胞因子分泌的系列图示。
图16A、图16B、图16C、图16D、图16E和图16F是显示CART19单独或在渐增浓度的依鲁替尼存在下杀伤肿瘤细胞MOLM14(图16A和图16D)、 JEKO(图16B和图16E)和RL(图16C和图16F)的图示。将未转导的细胞(UTD) 或CART19细胞与肿瘤细胞按不同比率温育并且评估细胞总通量(图16A、图 16B和图16C)和死细胞百分数(图16D、图16E和图16F)。
图17A、图17B和图17C是在24小时后如通过计数细胞总数的流式细胞术所测量的CART19杀伤肿瘤细胞的图示。将肿瘤细胞系MOLM14(图17A)、 JEKO(图17B)和RL(图17C)与未转导细胞(UTD)或单独的CART19细胞温育 (ALONE)或与不同浓度的依鲁替尼组合温育。
图18A、图18B、图18C和图18D是在RL MCL小鼠模型中CART19剂量探索的图示。通过生物发光成像(BLI)随时间推移监测肿瘤负荷(图18A和图 18B)。随时间推移监测总生存期(图18C)。
图19A和图19B是在JEKO-1MCL小鼠模型中CART19剂量探索的图示。通过生物发光成像(BLI)随时间推移监测肿瘤负荷(图19A)并且还随时间推移监测总生存期(图19B)。
图20是显示在体内小鼠模型中施用和评估CART19和依鲁替尼联合疗法的方案的示意图。
图21A、图21B、图21C和图21D是当细胞在转导之前用依鲁替尼处理时显示用于产生CART19 T细胞的PBMC转导效率的图示。对未处理的PBMC 分析转导前(图21A)和转导后(图21C)的CAR19表达。对依鲁替尼处理的PBMC 分析转导前(图21B)和转导后(图21D)的CAR19表达。
图22A、图22B、图22C、图22D和图22E是依鲁替尼治疗影响CD3/CD28 刺激的T细胞增殖的图示。评估了渐增浓度的依鲁替尼：未处理(图22A)；0.1μM 依鲁替尼(图22B)；0.5μM依鲁替尼(图22C)、1μM依鲁替尼(图22D)和5μM 依鲁替尼(图22E)。
图23是显示依鲁替尼不影响CART19细胞毒性的图示。
图24是显示依鲁替尼处理不促进CART19细胞中TH1/TH2细胞因子偏斜的系列图示。
图25A和图25B是显示在体内清除肿瘤细胞时连续施用依鲁替尼不影响 CART19功能的图示。图25A显示在每种治疗方案期间外周血中检测到的 Nalm/6细胞。图25B显示比较在依鲁替尼给药或不给药的情况下接受CART19 的小鼠的存活的Kaplan-Meier生存曲线。
图26A、图26B、图26C、图26D、图26E和图26F是显示在依鲁替尼治疗期间所示时间点处CLL患者细胞中CAR19转导效率的图示。细胞未转导(图 26A、图26B和图26C)或用CAR19转导(图26D、图26E和图26F)。用GAM 染色的细胞表达CAR19并且在每个图谱中存在于各框内。
图27是描述来自一组患者中在依鲁替尼治疗期间所示时间点处与CAR19 转导的细胞相比，未转导细胞的增殖速率的系列图示。
图28A、图28B和图28C是显示在CLL患者中依鲁替尼治疗诱导淋巴细胞增多的图示。来自该患者的细胞在所示时间点分离：基线(图28A)；第2周期第1天(图28B)；和第12周期第1天(图28C)。
图29A、图29B和图29C是显示三位CLL患者中依鲁替尼治疗随时间推移减少CLL中肿瘤细胞上CD200表达的图示。每个图谱含有来自细胞的CD200 表达直方图的叠加，所述细胞在所示时间点分离：基线(筛选)；第2周期第1 天；和第12周期第1天。
图30A、图30B和图30C是显示在CLL患者中依鲁替尼治疗随时间推移减低PD1+T细胞的频率。来自该患者的细胞在所示时间点分离：基线(图30A)；第2周期第1天(图30B)；和第12周期第1天(图30C)。
图31A和图31B是显示MCL细胞系RL(图31A)和JEKO-1(图31B)对依鲁替尼治疗的敏感性的图示。
图32是显示在MCL的体内模型中依鲁替尼治疗的影响的图示。
图33A和图33B是何杰金淋巴瘤的免疫组织化学分析图片，所述图片显示在肿瘤中存在的表达CD19的细胞。图33A为1倍放大率并且图33B为20倍放大率。
图34是评估CART19疗法在何杰金淋巴瘤患者中治疗效能的研究的实验设置示意图。
图35A、图35B、图35C和图35D显示T细胞上PD1和CAR19表达的流式细胞分析。图35A和图35B是显示来自受试者的CD4+T细胞上PD-1和 CAR19表达分布的代表性流式细胞术图谱，所述受试者是CART疗法的完全应答者(CR)或非应答者(NR)。图35C是显示CD4+T细胞群体中的PD1细胞百分数图示，所述细胞群体来自对CART疗法应答不同的多组受试者。图35D是显示CD8+T细胞群体中的PD1细胞百分数的图示，所述细胞群体来自对CART 疗法应答不同的多组受试者。
图36A和图36B显示PD1表达在表达CD4和表达CAR19的细胞中的分布(图36A)或在表达CD8和表达CAR19的细胞中的分布(图36B)，所述细胞来自对CART疗法应答不同的多组受试者。
图37显示了来自受试者的T细胞上PD1、CAR19、LAG3和TIM3表达的流式细胞分析，所述受试者是CART疗法的完全应答者(CR)或非应答者(NR)。
图38A和图38B显示来自对CART疗法应答不同的多组受试者中PD1和 LAG3表达(图38A)或PD1和TIM3表达(图38B)的分布。
图39显示来自接受CART19、对CART19疗法显示应答的骨髓瘤患者的浆细胞IgA免疫表型分型。
图40A和图40B是显示如与安慰剂相比，流感疫苗株的滴度增加的图示。在图40A中，疫苗接种后4周相对于安慰剂群组中的增加，对意向治疗群体中的每个RAD001给药群组显示了针对3个流感疫苗株(H1N1A/加利福尼亚 /07/2009、H3N2A/维多利亚/210/2009、B/布里斯班/60/2008)中每者的几何平均流感滴度高于基线的增加。粗黑线显示滴度相对于安慰剂增加1.2倍，其中对3 个流感疫苗株中的2个毒株而言，要求达到所述增加以实现本研究的主要终点。星号“*”表示相对于安慰剂，GMT滴度增加以至少80％的后验概率超过1。图 40B是基线流感滴度<＝1:40的受试者亚群的与图40A中相同数据的图示。
图41显示疫苗接种后4周，RAD001浓度对每个流感疫苗株的几何平均滴度增加倍数的散点图。在受试者已经给药4周后测量RAD001浓度(给药后1小时)。具有药代动力学量值的全部受试者均纳入分析集中。在y轴上显示几何平均滴度在疫苗接种后4周相对于基线的增加倍数。
图42是显示如与安慰剂相比，针对异源流感毒株的滴度增加的图示。疫苗接种后4周对于安慰剂群组中的增加，对意向治疗群体中的每个RAD001给药群组显示了针对流感疫苗中未含的2个异源流感毒株(A/H1N1株A/新泽西/8/76 和A/H3N2株A/维多利亚/361/11)的几何平均流感滴度高于基线的增加。*表示相对于安慰剂，滴度增加以至少80％的后验概率超过1。
图43A和图43B是流感疫苗接种之前和之后IgG水平和IgM水平的图示。测量从流感疫苗接种前和流感疫苗接种后4周的受试者获得的血清中抗 A/H1N1/加利福尼亚/07/2009流感IgG和IgM的水平。在RAD001群组和安慰剂群组之间直到疫苗接种后4周未检出抗H1N1流感IgG和IgM水平自基线的变化的显著差异(依据Kruskal-Wallis秩和检验，全部p值均>0.05)。
图44A、图44B和图44C是以百分数计在RAD001治疗后PD-1阳性CD4 和CD8 T细胞下降和PD-1阴性CD4 T细胞增加的图示。通过FACS分析基线时、研究药物治疗6周后(第6周)和研究药物停用后6周和流感疫苗接种后4周 (第12周)的PBMC样品测定PD-1阳性CD4、CD8 T细胞和PD-1阴性CD4 T 细胞的百分数。图44A显示如与安慰剂群组(n＝25)相比，在第12周在按剂量水平0.5mg/天(n＝25)、5mg/周(n＝29)和20mg/周(n＝30)接受RAD001的群组中分别以p＝0.002(0.02)、p＝0.003(q＝0.03)和p＝0.01(q＝0.05)存在PD-1阳性CD4 T 细胞的显著减少(-37.1％--28.5％)。图44B显示如与安慰剂群组(n＝25)相比，在第12周在按剂量水平0.5mg/天(n＝25)、5mg/周(n＝29)和20mg/周(n＝30)接受 RAD001(n＝109)的群组中分别以p＝0.01(0.05)、p＝0.007(q＝0.04)和p＝0.01 (q＝0.05)存在PD-1阳性CD8 T细胞的显著减少(-43.3％--38.5％)。图44C显示如与安慰剂群组(n＝25)相比，在第12周在按剂量水平0.5mg/天(n＝25)、5mg/ 周(n＝29)和20mg/周(n＝30)接受RAD001(n＝109)的群组中分别以p＝0.0007 (0.02)、p＝0.03(q＝0.07)和p＝0.03(q＝0.08)存在PD-1阴性CD4T细胞的显著增加(3.0％-4.9％)。
图45A和图45B是对基线PD-1表达的差异校正的以百分数计在RAD001 治疗后PD-1阳性CD4和CD8 T细胞下降和PD-1阴性CD4 T细胞增加的图示。通过FACS分析基线时、研究药物治疗6周后(第6周)和研究药物停用后6周和流感疫苗接种后4周(第12周)的PBMC样品测定PD-1阳性CD4、CD8 T细胞和PD-1阴性CD4 T细胞的百分数。图45A显示与安慰剂群组(n＝25)相比，在第6周在汇总的RAD群组(n＝84)中PD-1+CD4 T细胞以p＝0.03(q＝0.13)显著减少30.2％。如与安慰剂群组相比，在第12周在汇总的RAD中PD-1阳性CD4 T 细胞以p＝0.05(q＝0.19)下降32.7％。图45B显示与安慰剂群组(n＝25)相比，在第6周在汇总的RAD001群组(n＝84)中PD-1阳性CD8 T细胞以p＝0.008(q＝0.07) 显著减少37.4％。如与安慰剂群组相比，在第12周在汇总的RAD001中PD-1 阳性CD8 T细胞以p＝0.066(q＝0.21)下降41.4％。图45A和图45B代表图44A、图44B和图44C中的数据，但是图44A、图44B和图44C的不同RAD001剂量组汇总成图45A和图45B中的单一RAD001治疗组。
图46描述了老年受试者中应答于RAD001的锻炼和活力增加。
图47A和图47B描述了RAD001对细胞中P70 S6K活性的预测影响。图 47A描述了采用每周和每日较高剂量的RAD001时的P70 S6激酶抑制作用；图 47B描述了采用每周较低剂量的RAD001时的P70 S6激酶抑制作用。
图48A和图48B显示在癌细胞系和CART细胞上的IL-7受体(CD127)表达。通过流式细胞术测量分析了三个癌细胞系中CD127的表达：RL(套细胞淋巴瘤)、 JEKO(也称作Jeko-1，套细胞淋巴瘤)和Nalm-6(B-ALL)(图48A)。通过流式细胞术分析测量在NSG小鼠中输注并且循环的CD3阳性(CART)细胞上的CD127 表达(图48B)。
图49A、图49B和图49C显示在CART19治疗和后续IL-7治疗之后的抗肿瘤应答。在第6日，用不同剂量的CART19细胞治疗在第0天植入表达萤光素酶的套淋巴瘤细胞系(RL-luc)的NSG小鼠，并且监测肿瘤负荷。将小鼠划分成4个组并且不接受CART19细胞、接受0.5x106个CART19细胞(CART19 0.5E6)、1x106个CART19细胞(CART19 1E6)或2x106个CART19细胞(CART19 2E6))。通过检测生物发光(平均BLI)测量CART治疗后的肿瘤负荷(图49A)。接受0.5x106个CART19细胞(CART19 0.5E6)或1x106个CART19细胞(CART19 1E6)的小鼠经随机分配以接受或不接受重组人IL-7(rhIL-7)。对来自图49A的三只小鼠(#3827、#3829和#3815，接受所示的初始CART19剂量)监测本文由平均生物发光(BLI)代表的肿瘤负荷，所述小鼠用IL-7治疗，始于第85天(图49B)。每周3次经IP注射施用IL-7。在第85天前(PRE)和第115天(POST)后，在未接受IL-7(对照)的小鼠和接受IL-7治疗(IL-7)的小鼠之间比较本文由平均生物发光(BLI)代表的肿瘤负荷(图49C)。
图50A和图50B显示IL-7治疗后的T细胞动力学。对接受IL-7的每只小鼠或对照小鼠监测血液中检测到的人T细胞水平(图50A)。在启动IL-7治疗前 (PRE)和在其之后14天(第14天)测量血液中检测到的CART19细胞(CD3+细胞) 的水平(图50B)。
图51描述了两个示例性RCAR布局的结构。抗原结合构件包含抗原结合结构域、跨膜结构域和转换开关结构域。胞内结合构件包含转换开关结构域、共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。这两个布局显示，本文所述的第一和第二转换开关结构域可以相对于抗原结合构件和胞内结合构件处于不同取向。本文进一步描述了其他RCAR布局。
图52A是RL细胞系的图片。
图52B是显示RL原代细胞和RL细胞系中CD19和CD5表达的一组流式细胞术散点图。
图52C是通过荧光原位杂交(FISH)显示t(11；14)转位的图片。
图52D是显示依鲁替尼抑制在不同细胞系中的IC50(依据MTT转化百分数) 的图示。
图52E是显示RL细胞在NOD-SCID-γ链敲除(NSG)小鼠中植入和所产生的肿瘤负荷的一组图片和图示。
图52F是显示MCL细胞定位至小鼠中多个器官的一组组织学图片。
图52G是已经注射MCL-RL细胞的小鼠的一组组织学图片。
图53A是显示暴露于多种MCL细胞系时CD107a+CART19细胞数目的一组图示。
图53B是显示CART19细胞在暴露于多种MCL细胞系时产生的IL-2和 TNF-α的量的一组图示。
图53C是显示在各种效应子:靶细胞比率时CART19细胞杀伤各种MCL细胞系的百分数的图示。
图53D是显示在暴露于各种MCL细胞系的CART19细胞中羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)的数量(增殖度量)的图示。
图53E是显示在扩增之前和之后T细胞百分数的一组图示。
图53F是显示表达或产生多种生物分子(例如，细胞因子)的未转导的T细胞或CAR-19转导的T细胞的百分数的一组图示。
图54A是显示当特异性或非特异性刺激CART19细胞时白介素-2诱导型T 细胞激酶(ITK)活化的一组图片。
图54B是显示采用多种浓度的依鲁替尼时CART19细胞的CD107a表面表达(脱颗粒的度量)、IL-2产生和TNF-α产生的一组图示。
图54C是显示在与多种浓度的依鲁替尼一起并暴露于各种MCL细胞系的 CART19细胞中的CFSE量的一组直方图。
图54D是显示多种细胞因子和生物标志物的表达或产生的一组图示，所述细胞因子和生物标志物作为与不同浓度的依鲁替尼组合时CART19细胞的Th1 或Th2状态的指标。
图54E是显示与不同浓度的依鲁替尼组合时CART19细胞杀伤各种MCL 细胞系的百分数的一组图示。
图54F是显示与多种浓度的依鲁替尼组合时CART19细胞的固有细胞毒功能的多种标志物表达的直方图。
图55是为了测试CART19和/或依鲁替尼对注射MCL-RL的小鼠的影响而建立的体内小鼠模型实验设计的示意图，读出为发光(肿瘤细胞数目的度量)。
图56是为了测试CART19和/或依鲁替尼对注射MCL-RL的小鼠的影响而建立的体内小鼠模型实验设计的示意图，读出为发光(肿瘤细胞数目的度量)。
图57是显示用不同浓度的依鲁替尼治疗的小鼠中发光(肿瘤细胞数目的度量)及其治疗后总生存期的一组图示。
图58是显示用依鲁替尼或CART19细胞治疗的小鼠中发光(肿瘤细胞数目的度量)及其治疗后总生存期的一组图示。
图59是显示用依鲁替尼、未转导的T细胞、依鲁替尼联合未转导的T细胞、CART19细胞和CART19细胞联合依鲁替尼治疗后的小鼠中发光(肿瘤细胞数目的度量)的图示。
图60是显示用单一依鲁替尼、单一CART19细胞或依鲁替尼与CART19 细胞的组合治疗后的小鼠中发光(肿瘤细胞数目的度量)的图示。
图61A是显示在用依鲁替尼和/或CART19细胞治疗的小鼠中产生的Th1 细胞因子水平的一组图示。图61B是显示在用依鲁替尼和/或CART19细胞治疗的小鼠中产生的Th2细胞因子水平的一组图示。
图61C是显示在用CART19细胞或CART19细胞加依鲁替尼治疗的小鼠中表达增殖标志物Ki67的细胞的百分数的图示。
图61D是显示在用CART19细胞或CART19细胞加依鲁替尼治疗的小鼠中表达抗凋亡标志物BCL-2的细胞的百分数的图示。
发明详述
定义
除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明相关领域的技术人员通常理解的相同意义。
术语“一个”和“一种”指该冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
当指可度量值如数量、时间持续期等时，术语“约”意在涵盖距指定值±20％的变动或在一些情况下±10％的变动或在一些情况下±5％的变动或在一些情况下±1％的变动或在一些情况下±0.1％的变动，因为这类变动适于开展所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”指一组多肽，最简单的实施方案中一般指两种多肽，在免疫效应细胞中时，所述多肽为细胞提供针对靶细胞(一般是癌细胞)的特异性及提供胞内信号生成。在一些实施方案中，CAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称作“胞内信号传导结构域”)，所述胞质信号传导结构域包含从如下文定义的刺激性分子和/或共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域。在一些方面，该组多肽彼此邻接，例如，处于相同的多肽链中(例如，包括嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化转换开关(dimerization switch)，其中存在二聚化分子时，所述二聚化转换开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。在一个方面，刺激性分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。在一个方面，胞质信号传导结构域还包含从至少一种如下文定义的共刺激分子衍生的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如，4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含从共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面， CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域至少包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个方面，CAR还在胞外抗原结合结构域的N末端包含前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原结合结构域(例如，scFv)切下。
术语“信号传导结构域”指蛋白质的功能性部分，所述的功能性部分通过在细胞内部传输信息而发挥以下作用：通过产生第二信使或通过响应于这类信使作为效应子发挥功能，借助定义的信号传导途径调节细胞活性。
如本文所用，术语“CD19”指分化抗原簇19蛋白，所述蛋白质是白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和 Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以按登录号NM_001178098找到。如本文所用，“CD19”包括包含突变 (例如，全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。 CD19在大部分B系癌上表达，所述B系癌例如包括急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非何杰金淋巴瘤。下文在定义“与表达CD19相关的疾病”中提供了表达CD19的其他细胞。它也是B细胞祖细胞的早期标志物。参见，例如，Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)。在一个方面， CART的抗原结合部分识别并结合在CD19蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD19蛋白表达在癌细胞上。
如本文所用，术语“CD20”指已知在B细胞上可检出的抗原决定簇。人CD20 也称作跨膜4-结构域亚家族A成员1(MS4A1)。可以在公共数据库(如GenBank、 UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD20 的氨基酸序列可以按登录号NP_690605.1和NP_068769.2找到，并且编码人CD20的转录物变体1和3的核苷酸序列可以分别按登录号NM_152866.2和 NM_021950.3找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在CD20蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD20蛋白表达在癌细胞上。
如本文所用，术语“CD22”指已知在白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD22同工型1-5的氨基酸序列可以分别按登录号 NP001762.2、NP001172028.1、NP001172029.1、NP001172030.1和NP001265346.1 找到，并且编码人CD22的变体1-5的核苷酸序列可以分别按登录号 NM001771.3、NM001185099.1、NM001185100.1、NM001185101.1和NM001278417.1找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在CD22 蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD22蛋白表达在癌细胞上。
如本文所用，术语“ROR1”指已知在白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人ROR1的同工型1和2前体的氨基酸序列可以分别按登录号NP_005003.2和NP_001077061.1找到，并且编码它们的mRNA序列可以分别按登录号NM_005012.3和NM_001083592.1找到。在一个方面，CAR 的抗原结合部分识别并结合在ROR1蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，ROR1蛋白表达在癌细胞上。
如本文所用，术语“抗体”指与抗原特异性结合的蛋白质或衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子中的多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白并且可以衍生自天然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”指抗体的至少一个部分，所述部分保留与抗原的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、驼类(camelid)VHH结构域、从抗体片段形成的多特异性抗体如包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的双价片段，和抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。也可以将抗原结合片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005, Nature Biotechnology,23:1126-1136,2005)。也可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区连续地连接，例如，借助合成性接头，例如，柔性短多肽接头连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非指定，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的 VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为邻接多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY； Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明CAR 组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，CAR包含了包含scFv 的抗体片段。可以使用多种熟知方案的任一者确定给定CDR的精确氨基酸序列界限，所述熟知方案包括由Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些或其组合。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性并且多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为邻接多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY； Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明CAR 组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，CAR包含了包含scFv 的抗体片段。
术语“抗体重链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较大者，其在正常情况下决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较小者。κ(κ)轻链和λ(λ)轻链指两个主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”指使用重组DNA技术生成的抗体，例如，通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。本术语应当还解释为意指已经通过合成编码抗体并且表达抗体蛋白的DNA分子或合成规定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中已经使用本领域可获得的和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”或“Ag”指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞的活化、或这两者。技术人员将会理解，任何大分子，实际上包括全部蛋白质或肽，可以充当抗原。另外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。技术人员将会理解，包含编码蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用本术语那样的“抗原”，其中所述蛋白质激发免疫应答。另外，本领域技术人员将会理解，抗原不必完全由基因的全长核苷酸序列编码。轻易显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列按多种组合布置以编码激发所需免疫应答的多肽。另外，技术人员将会理解，抗原完全不必要由“基因”编码。轻易显而易见的是，抗原可以生成、合成或可以衍生自生物样品、或除多肽外还可能是大分子。这种生物样品可以包括但不限于具有其他生物学组分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。
术语“抗癌作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积减少、癌细胞数目减少、转移灶数目减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少或与癌状况相关的多种生理症状改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防癌在首发位置出现的能力展示。术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上明显地不相似，以发生抗原性相互作用。
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植体。
术语“癌症”指以异常细胞失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，例如，这两种术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如，弥散型或循环型肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
短语“与表达CD19相关的疾病”包括但不限于与表达CD19相关的疾病或与表达或在任何时间表达过CD19的细胞相关的病状，例如，包括增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑问，与表达CD19相关的疾病可以包括与下述细胞相关的病状，所述细胞目前不表达CD19的，例如，因为CD19表达已经下调，例如，原因在于用靶向CD19的分子(例如，CD19 CAR)治疗，但从前表达过CD19。在一个方面，与表达CD19 相关的癌症是血液癌。在一个方面，血液癌是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与表达CD19相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于，例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如，B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T 细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)。与表达CD19相关的其他癌症或血液学疾病例如包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是依据髓样血细胞无效产生(或发育异常(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合等。与表达CD19相关的其他疾病例如包括但不限于与表达CD19相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。与表达CD19相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病、(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的 mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以按正常水平或减低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括但不限于与CD19、CD20、CD22 或ROR1中一者或多者相关的疾病或与表达或在任何时间表达过CD19、CD20、 CD22或ROR1中一者或多者的细胞相关的病状，例如，包括增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑问，与表达B细胞抗原相关的疾病可以包括与下述细胞相关的病状，所述细胞目前不表达B细胞抗原，例如，因为该抗原表达已经下调，例如，原因在于用靶向B细胞抗原的分子(例如，靶向B细胞的CAR)治疗，但从前表达过该抗原。短语“与B细胞抗原表达相关的疾病”包括如本文所述的与表达CD19相关的疾病。
术语“保守的序列修饰”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链 (例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β- 侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“刺激”指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其相应配体 (或在CAR的情况下肿瘤抗原)的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，如，但不限于借助TCR/CD3复合物的信号转导或借助适宜NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变。
术语“刺激性分子”指由提供胞质信号传导序列的免疫细胞(例如，T细胞、 NK细胞、B细胞)表达的分子，所述胞质信号传导序列相对于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激性方式调节免疫细胞的活化。在一个方面，信号是初级信号，所述初级信号例如通过TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列(也称作“初级信号传导结构域”)可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有在本发明中特别有用的胞质信号传导序列的ITAM的例子包括但不限于衍生自 CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、 CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CARS中的胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如， CD3ζ的初级信号传导序列。在本发明的具体CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO:17提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本发明的具体CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是在SEQ ID NO:43中提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”指在其表面上呈递与主要组织相容性复合体 (MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞如附属细胞(例如，B细胞、树状细胞等)。 T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将它们呈递至T细胞。
如本文中所用那样，术语“胞内信号传导结构域”指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生信号，所述信号促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞) 的免疫效应子功能。(例如，在CART细胞中的)免疫效应子功能的例子包括溶细胞活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括从负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子衍生的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括从共刺激信号或抗原非依赖性刺激衍生的那些。例如，在CART的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可以包含称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或 ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、 CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBan登录号 BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等) 的等同残基，并且“ζ刺激性结构域”或备选地“CD3ζ刺激性结构域”或“TCR-ζ刺激性结构域”定义为来自ζ链胞质域或其功能衍生物的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个方面，ζ的胞质域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:17提供的序列。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO: 43提供的序列。
术语“共刺激分子”指T细胞上与共刺激配体特异性结合，因而由T细胞介导共刺激反应(如但不限于增殖)的相关结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外有助于高效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于 MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、 ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这类共刺激分子的其他例子包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、 CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、 IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、 ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、 DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、 CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、 CD19a和与CD83特异性结合的配体。
共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中呈现：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化性NK细胞受体。这类分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、 CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、 CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、 NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
胞内信号传导结构域可以包含衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段或衍生物。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号 AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号 AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO: 16提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
如该术语在本文中所用那样，术语“免疫效应细胞”指涉及免疫应答，例如涉及促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT 细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓衍生的吞噬细胞。
如该术语在本文中所用那样，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的例子。
术语“编码”指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列在生物学过程中充当合成具有定义的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的内在特性和因其产生的生物学特性。因此，如果与该基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生某蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。其核苷酸序列与 mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和作为基因或cDNA转录的模板使用的非编码链均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此作为简并形式并编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的“核苷酸序列”还可以包括内含子到这样的程度，从而编码蛋白质的核苷酸序列可以在某个形式中含有内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中互换地使用并且指化合物、制剂、材料或组合物如本文所述那样有效实现特定生物学结果的量。
术语”内源的”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
术语”外源的”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
术语“表达”指受启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”指物质组合物，所述物质组合物包含分离的核酸并且可以用来向细胞的内部递送分离的核酸。众多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制型质粒或病毒。该术语还应当解释成进一步包括促进核酸转移入细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”指一种包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够顺式作用元件；其他表达用元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的全部那些表达载体，包括并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或含于脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞的DNA，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV 和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，特别包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活性慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0002395107430000491
基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子之间(例如，在两个核酸分子 (如，两个DNA分子或两个RNA分子之间)或在两个多肽分子之间)的次级单位序列同一性。当这两个分子中的次级单位位置被相同单体的次级单位占据时，例如，若两个DNA分子中每个分子中的某位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源或同一的。两个序列之间的同一性直接随匹配位置或同源位置的数目而变化，例如，如果两个序列中一半位置(例如长度为10个次级单位的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10 个位置中9个位置)是匹配或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人类(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、 F(ab')2或其他抗原结合子序列)。对大部分情况而言，人源化抗体及其抗体片段是这样的人免疫球蛋白(受者抗体或抗体片段)，其中来自所述受者的互补决定区 (CDR)中的残基替换为来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR中的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv 构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受者抗体中又不在输入的CDR或构架序列中存在的残基。这些修饰可以进一步修正和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将基本上包含至少1个、并且一般2个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的CDR区与非人类免疫球蛋白的那些CDR区对应并且全部或显著部分的FR 区是具有人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332: 323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“完全人的”指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与其天然状态的共存物质分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以按基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，对常见出现的核酸碱基使用以下缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷和“U”指尿苷。
术语“有效连接”或“转录性控制”指调节序列和异源核酸序列之间导致异源核酸序列表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码性序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。有效连接的DNA 序列可以彼此邻接并且，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，处于相同的可读框中。
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用例如包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,()985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes8:91-98,(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且不限制可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，本术语指短链，例如，所述短链还常见地在本领域称为肽、寡肽和寡聚体，并且还指较长链，所述较长链通常在本领域称为蛋白质，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”例如包括多肽的生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”指由细胞合成装置或引入的合成装置识别、为启动多核苷酸序列特异性转录所需要的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，这个序列还可以包含表达基因产物需要的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的那种。
术语“组成型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中在细胞的大部分或全部生理状况下产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时才产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子指与基因编码或规定的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上只有细胞是与该启动子相对应的组织型的细胞才产生的核苷酸序列。
在scFv上下文中所用的术语“柔性多肽接头”或“接头”指由氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其中单独或组合使用所述肽接头以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5和n＝6，n＝7，n＝8，n＝9和n＝10(SEQ ID NO: 105)。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO: 106)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:107)。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、 (GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复序列(SEQ ID NO:108)。本发明的范围内还包括接头在通过引用方式并入本文的WO 2012/138475中描述。
如本文所用，5'帽(还称作RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经紧接在转录起点后添加至真核信使RNA“前端”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对核糖体识别并保护免遭RNA酶作用至关重要。帽添加与转录偶联并且以共转录方式出现，从而一者影响另一者。在转录起始后不久，正在合成的mRNA的5'末端被结合于 RNA聚合酶的帽合成复合物约束。这种酶促复合物催化mRNA加帽需要的化学反应。合成过程作为多步骤生物化学反应推进。可以修饰加帽部分以调节 mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”指已经在体外合成的RNA，优选地mRNA。通常，体外转录的RNA从体外转录载体产生。体外转录载体包括用来产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚腺苷酸”是通过多聚腺苷化与mRNA连接的一系列腺苷。在瞬时表达构建体的优选实施方案中，聚腺苷酸数在50和5000之间(SEQ ID NO:109)、优选地大于64、更优选地大于100、最优选地大于300或400。可以化学或酶促地修饰聚腺苷酸序列以调节mRNA功能如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“多聚腺苷化”指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3'末端聚腺苷酸化。3'聚腺苷酸尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加至前mRNA的长腺嘌呤核苷酸序列(经常几百个)。在高等真核生物中，聚腺苷酸尾添加到含有特定序列(多聚腺苷化信号)的转录物上。聚腺苷酸尾和与之结合的蛋白质协助保护 mRNA免遭核酸外切酶降解。多聚腺苷化还对转录终止、mRNA从胞核输出和翻译重要。多聚腺苷化在DNA转录成RNA后立即在胞核中发生，但额外地还可以稍后在细胞质中发生。在转录已经终止后，mRNA链因与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用而切割。切割位点通常以切割位点附近存在碱基序列AAUAAA为特征。在已经切割mRNA后，腺苷残基被添加至切割位点处的游离3’末端。
如本文所用，“瞬时”指非整合的转基因表达数小时、数天或数周时间，其中表达时间段小于如果基因在宿主细胞中整合至基因组中或含于稳定质粒复制子内部时该基因表达的时间段。
术语“信号转导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号和跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下通常与之结合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体指均一的细胞群体。在其他情况下，这个术语单纯地指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞是体外培养的。在其他方面，细胞不是体外培养的。
如本文所用的术语“治疗性”意指治疗。治疗效果通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态而获得。
如本文所用的术语“预防”意指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”指特定过度增殖性疾病常见的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性疾病抗原衍生自癌，所述癌包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染”或“转化”或“转导”指借以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞和其后代。
术语“特异性结合”指识别样品中存在的结合配偶体(例如，刺激性肿瘤抗原) 蛋白质并与之结合的抗体或配体、但是所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中其他分子。
如该术语在本文中所用那样，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”指一组多肽，最简单的实施方案中一般指两种多肽，当在RCARX细胞中时，所述多肽为RCARX细胞提供针对靶细胞(一般是癌细胞)的特异性及提供可调节的胞内信号生成或增殖，所述多肽可以优化RCARX细胞的免疫效应子特性。RCARX 细胞至少部分地依赖抗原结合结构域以提供针对靶细胞的特异性，所述靶细胞包含抗原结合结构域结合的抗原。在一个实施方案中，RCAR包括二聚化转换开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化转换开关可以使胞内信号传导结构域与抗原结合结构域偶联。
如该术语在本文中所用那样，“膜锚定物”或“膜束缚结构域”指足以锚定胞外或胞内结构域至质膜的多肽或部分，例如，肉豆蔻酰基。
如该术语在本文中所用那样，当例如谈及RCAR时，“转换开关结构域”指存在二聚化分子时与另一个转换开关结构域缔合的实体，一般是基于多肽的实体。缔合导致与第一实体(例如，融合)连接的第一转换开关结构域和与第二实体 (例如，融合)连接的第二转换开关结构域功能性偶联。第一转换开关结构域和第二转换开关结构域统称为二聚化转换开关。在实施方案中，第一转换开关结构域和第二转换开关结构域彼此相同，例如，它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽并统称为同型二聚化转换开关。在实施方案中，第一转换开关结构域和第二转换开关结构域彼此不同，例如，它们是具有不同一级氨基酸序列的多肽并统称为异二聚化转换开关。在实施方案中，转换开关是胞内的。在实施方案中，转换开关是胞外的。在实施方案中，转换开关结构域是基于多肽(例如，基于 FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子，例如，雷帕霉素类似物 (rapalogue)。在实施方案中，转换开关结构域是基于多肽的实体，例如，结合 myc肽的scFv，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽多聚体，例如，myc 配体或与一个或多个myc scFv结合的myc配体多聚体。在实施方案中，转换开关结构域是基于多肽的实体，例如，myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如，myc抗体。
如该术语在本文中所用那样，例如指RCAR时，“二聚化分子”指促进第一转换开关结构域与第二转换开关结构域缔合的实体。在实施方案中，二聚化分子不天然地出现在受试者中或不以将导致明显二聚化的浓度出现。在实施方案中，二聚化分子是小分子，例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如RAD001。
术语“生物等效的”指为产生与参比剂量或参比量的参比化合物(例如，RAD001)产生的效果等同的效果所需要的除参比化合物(例如，RAD001)之外的药物量。在一个实施方案中，效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70 S6 激酶抑制作用所测量，例如，如在体内或体外测定法中评价，例如，如通过本文所述的测定法(例如，Boulay测定法)所测量、或通过蛋白质印迹法测量磷酸化S6水平。在一个实施方案中，效果是PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率改变，如通过细胞分选法所测量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的P70 S6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率改变水平的量或剂量。
当联系mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，RAD001或雷帕霉素、或催化性mTOR抑制剂)使用时，术语“免疫增强性低剂量”指(例如，如通过抑制P70 S6激酶活性所测量)部分地但非完全抑制mTOR活性的mTOR 抑制剂剂量。本文中讨论了用于(例如，通过抑制P70 S6激酶)评价mTOR活性的方法。该剂量不足以导致完全的免疫抑制，但是足以增强免疫应答。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致PD-1阳性T细胞的数目下降和/或PD-1阴性T细胞的数目增加、或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率增加。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致幼稚 T细胞的数目增加。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致以下一种或多种情况：
以下一种或多种标志物的表达增加：例如，在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2；
记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上KLRG1的表达减少；和
记忆T细胞前体的数目增加，所述记忆T细胞前体例如是具有以下特征的任一个或其组合的细胞：CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1 减少和BCL2增加；
其中例如，如与未处理的受试者相比，上文描述的任何变化出现，例如，至少瞬时出现。
如本文所用的“难治性”，指不响应于治疗的疾病，例如，癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗开始前或在治疗开始时抵抗治疗。在其他实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变得难治。
如本文所用的“完全应答者”指对治疗显示出完全应答(例如，完全缓解)的患有疾病(例如，癌症)的受试者。可以鉴定完全应答，例如，使用如本文所述的 Cheson标准鉴定。
如本文所用的“部分应答者”指对治疗显示出部分应答(例如，部分缓解)的患有疾病(例如，癌症)的受试者。可以鉴定部分应答，例如，使用Cheson标准鉴定。
如本文所用的“非应答者”指对治疗不显示出应答的患有疾病(例如，癌症) 的受试者，例如，该患者具有稳定的病情或进行性病情。可以鉴定非应答者，例如，使用如本文所述的Cheson标准鉴定。
术语“复发”如本文所用，指在应答性(例如，完全应答或部分应答)的初始阶段后疾病(例如，癌症)再出现。应答性初始阶段可以涉及癌细胞水平降到某个阈值以下，例如，低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。再出现可以涉及癌细胞水平升高到某个阈值以上，例如，高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。可以鉴定复发，例如，使用如本文所述的Cheson标准鉴定。
范围：在本公开各处，本发明的多个方面可以按范围样式展示。应当理解，以范围样式描述仅出于方便和简洁目的并且不应当解释为刚性限制本发明的范围。因此，范围的描述应当视为具有具体公开的全部可能子范围以及该范围内部的各个数值。例如，范围如从1至6的描述应当视为具有具体公开的如下子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内部的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，范围(如95-99％同一性)包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和 98-99％同一性。无论范围的宽度多大，这均适用。
发明描述
本文中提供了使用表达嵌合抗原受体(CAR)(例如，靶向B细胞标志物如 CD19的CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)时治疗疾病如癌症(例如，血液癌或其他B细胞恶性肿瘤)的物质组合物和使用方法。该方法尤其包括施用与另一种药物如激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合的表达本文所述的靶向B细胞的CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
本发明至少部分地提供多项实验，所述实验支持CAR疗法(例如，靶向B 细胞的CAR疗法)和激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合的高效能。激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)与CAR治疗的组合可以相对于激酶抑制剂单药疗法或某剂量的表达CAR的细胞或这两者增加联合疗法的效能。这些有益作用可以例如允许较低剂量的激酶抑制剂或表达CAR的细胞或这两者，同时维持效能。本文中的结果适用于广泛类型的癌症，例如，血液癌和其他B 细胞恶性肿瘤。例如，依鲁替尼抑制在大部分淋巴瘤中升高的BTK。表达CAR19的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)靶向表面表达CD19的癌症，所述 CD19在大部分B细胞恶性肿瘤中表达。备选地或联合CAR19，任何其他靶向 B细胞的CAR(例如，靶向以下一者或多者的CAR：CD20、CD22或ROR1) 可以用于本文所述的联合疗法中。因此，CAR治疗(例如，CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR或ROR1 CAR治疗中一者或多者)与BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)的组合适于治疗广泛类型的涉及B细胞过度增殖的癌症，包括淋巴瘤(例如，何杰金淋巴瘤)、MCL、CLL、DLBCL和多发性骨髓瘤。
根据本发明，依鲁替尼可以减小肿瘤块并动员外周血中的肿瘤性B细胞(参见，例如，本文实施例8)。不希望受理论约束，某些淋巴瘤(如MCL)以淋巴结的增殖中心中癌细胞团块为特征。表达CAR的免疫效应细胞有时难以穿透这些致密堆积的团块。因此，BTK抑制剂(如依鲁替尼)可以减少肿瘤块并且动员外周血中的肿瘤性B细胞、从而使得淋巴瘤细胞更易受表达CAR的细胞杀伤。
备选地或组合地，BTK抑制剂(如依鲁替尼)还可以影响表达CAR的细胞。本发明表明，依鲁替尼治疗增加循环型CART19细胞的水平(参见，例如，实施例8中所示的数据)。不希望受理论约束，循环型CART19细胞的水平增加可以例如是增殖增加、T细胞表型改变或其他因素的结果。例如，依鲁替尼可以抑制ITK(与BTK同源的激酶)。ITK在T细胞中表达并且对其抑制可以改变T 细胞表型。用激酶抑制剂(如依鲁替尼)治疗可以将T细胞表型从Th2表型改变成Th1表型并且因此增加T细胞增殖能力。对受试者预治疗或共施用BTK抑制剂可以增加受试者中的T细胞增殖能力，因此增加表达CAR的循环型细胞的水平。此外，用BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)预治疗的受试者可以具有在其单采血液成分术中增殖能力较高的T细胞群体用于产生CAR。
在一个方面，本发明提供了许多嵌合抗原受体(CAR)，其包含经工程化与B 细胞抗原(例如，选自CD19、CD20、CD22或ROR1蛋白中一者或多者)特异性结合的抗体或抗体片段。在一个方面，本发明提供经工程化以表达CAR的细胞 (例如，T细胞)，其中CART细胞(“CART”)显示出抗癌特性。在一个方面，细胞用CAR转化并且CAR在细胞表面上表达。在一些实施方案中，细胞(例如， T细胞)用编码CAR的病毒载体转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施方案中，细胞可以稳定表达CAR。在另一个实施方案中，细胞(例如，T细胞)用编码CAR的核酸例如mRNA、cDNA、DNA转染。在一些此类实施方案中，细胞可以瞬时表达CAR。
在一个方面，CAR的抗CD19蛋白结合部分是scFv抗体片段。在一个方面，这类抗体片段是有功能的，因为它们保留等同的结合亲和力，例如，它们以可比的亲和力结合与衍生它的IgG抗体相同的抗原。在一个方面，这类抗体片段是有功能的，在于它们提供生物学应答，所述生物学应答可以包括但不限于激活免疫应答、抑制源自其靶抗原的信号转导、抑制激酶活性等，技术人员将会理解。在一个方面，CAR的抗CD19抗原结合结构域是scFv抗体片段，所述 scFv抗体片段与衍生它的scFv鼠序列相比是人源化的。在一个方面，鼠scFv 亲本序列是PCT公开WO 2012/079000(通过引用方式并入本文)中提供和本文中作为SEQ ID NO:59提供的CAR19构建体。在一个实施方案中，抗CD19 结合结构域是在WO 2012/079000中描述并在SEQ ID NO:59中提供的scFv。
在一些方面，本发明的抗体并入嵌合抗原受体(CAR)中。在一个方面，CAR 包含PCT公开WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供和本文中作为SEQ ID NO:58提供的多肽序列，其中scFv结构域由选自SEQ ID NO:1-12的一个或多个序列置换。在一个方面，SEQ IDNO:1-12的scFv结构域是SEQ ID NO: 59的scFv结构域的人源化变体，所述SEQ ID NO:59的scFv结构域是与人 CD19特异性结合的鼠源scFv片段。这种小鼠scFv的人源化可以是临床环境需要的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(例如，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。
在一个方面，本发明CAR的抗CD19结合结构域(例如，人源化scFv)部分由其序列已经过密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达的转基因编码。在一个方面，本发明的完整CAR构建体由其整个序列已经过密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达的转基因编码。密码子优化指以下发现：编码性DNA中同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)出现的频率在不同物种中偏倚。这种密码子简并性允许相同多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括，例如，至少在美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:1中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:2中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ IDNO:3中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:4中提供的scFv部分。在一个方面，人源化 CAR19包含在SEQ ID NO:5中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19 包含在SEQ ID NO:6中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在 SEQ IDNO:7中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:8中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:9 中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:10中提供的scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ IDNO:11中提供的 scFv部分。在一个方面，人源化CAR19包含在SEQ ID NO:12中提供的scFv部分。
在一个方面，本发明的CAR将特异性抗体的抗原结合结构域与胞内信号传导分子组合。例如，在一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于CD3ζ链、 4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。在一个方面，CD19 CAR包含选自在 SEQ ID NO:31-42的一者或多者中提供的序列的CAR。在一个方面，CD19 CAR 包含在SEQ ID NO:31中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:32中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:33中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:34中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:35中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:36中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在 SEQ ID NO:37中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:38 中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:39中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:40中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:41中提供的序列。在一个方面，CD19 CAR包含在SEQ ID NO:42中提供的序列。
另外，本发明提供CD19 CAR组合物和它们在治疗涉及表达CD19的细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫疾病连同其他疾病的药物或方法中的用途。
在一个方面，本发明的CAR可以用来根除表达CD19的正常细胞，因而适于作为细胞移植之前的细胞调理性疗法使用。在一个方面，表达CD19的正常细胞是表达CD19的正常干细胞并且细胞移植是干细胞移植。
在一个方面，本发明提供经工程化表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)，其中表达CAR的细胞，例如，CAR T细胞(“CART”)，显示出抗癌特性。优选的抗原是CD19。在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含部分人源化的抗CD19抗体片段。在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含了包含scFv 的部分人源化的抗CD19抗体片段。因此，本发明提供包含人源化抗CD19结合结构域并经工程化入免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)中的CD19-CAR 和它们用于过继疗法的方法。
在一个方面，CD19-CAR包含至少一个选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任意组合的胞内结构域。在一个方面，CD19-CAR包含来自除CD137(4-1BB)或CD28之外的一个或多个共刺激分子的至少一个胞内信号传导结构域。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明涵盖了包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含与B细胞抗原(例如，CD19，例如，人CD19)特异性结合的抗体或抗体片段，其中抗体片段的序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如，ζ链。共刺激信号传导结构域指包含共刺激分子的至少一部分胞内结构域的CAR部分。在一个实施方案中，抗原结合结构域是本文所述的鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段。
在具体方面中，本发明的CAR构建体包含了选自SEQ ID NO:1-12的scFv 结构域或SEQ ID NO:59的scFv结构域，其中scFv可以前置有如SEQ ID NO: 13中提供的任选前导序列并后跟有如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49中提供的任选铰链序列、如SEQ ID NO:15中提供的跨膜区、包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的胞内信号传导结构域和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的CD3ζ序列，其中各结构域彼此邻接并处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。本发明中还包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:59 的每个scFv片段的多肽。本发明中还包括这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59的每个scFv片段和SEQ ID NO:13-17的每个结构域的多肽，以及编码的本发明CD19 CAR 融合蛋白。在一个方面，示例性CD19 CAR构建体包含任选的前导序列、胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内刺激性结构域。在一个方面，示例性CD19 CAR构建体包含任选的前导序列、胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内刺激性结构域。将含有本发明人源化scFv 结构域的特定CD19 CAR构建体作为SEQ ID NO:31-42提供或作为SEQ ID NO:59的鼠scFv结构域提供。
本文还将全长CAR序列作为SEQ ID NO:31-42和58提供，如表7和表3 中所示。
将示例性前导序列作为SEQ ID NO:13提供。将示例性铰链区/间隔序列作为SEQID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49提供。将示例性跨膜结构域序列作为SEQ ID NO:15提供。将4-1BB蛋白的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ IDNO:16提供。将CD27的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:51提供。将示例性CD3ζ结构域序列作为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43提供。
在一个方面，本发明涵盖一种重组核酸构建体，其包含编码CAR的核酸分子，其中核酸分子包含编码(例如，本文所述的)抗CD19结合结构域的核酸序列，所述核酸序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。在一个方面，抗CD19结合结构域选自SEQ ID NO:1-12和58的一者或多者。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQID NO:61-72和59的一者或多者中提供的序列的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:61的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19 结合结构域由SEQ ID NO:62的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗 CD19结合结构域由SEQID NO:63的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:64的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:65的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:66的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:67的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:68的核苷酸残基64至 813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:69的核苷酸残基 64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQID NO:70的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:71的核苷酸残基64至813编码。在一个方面，抗CD19结合结构域由SEQ ID NO:72 的核苷酸残基64至813编码。
在一个方面，本发明涵盖一种重组核酸构建体，其包含编码CAR的转基因，其中核酸分子包含编码抗CD19结合结构域的核酸序列，所述抗CD19结合结构域选自SEQ ID NO:61-72的一者或多者，所述序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。可以在CAR中使用的示例性胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3ζ、CD28、4-1BB等中的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。在一个方面，本发明CAR构建体的核酸序列选自SEQ ID NO: 85-96的一者或多者。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:85。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:86。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:87。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:88。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:89。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:90。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:91。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO: 92。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:93。在一个方面，CAR 构建体的核酸序列是SEQID NO:94。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:95。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:96。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:97。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ ID NO:98。在一个方面，CAR构建体的核酸序列是SEQ IDNO:99。
可以使用本领域已知的重组方法获得编码所需分子的核酸序列，如，例如通过从表达基因的细胞筛选文库、通过从已知包括基因的载体衍生该基因、或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织直接分离。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非克隆。
本发明包括表达可以直接转导入细胞中的CAR的逆转录病毒构建体和慢病毒载体构建体。
本发明还包括可以直接转染至细胞中的RNA构建体。一种产生用于转染的 mRNA的方法涉及用专门设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和聚腺苷酸化尾的构建体，长度一般为50-2000个碱基(SEQ ID NO: 118)。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，将RNA CAR载体通过电穿孔转导至T细胞中。
抗原结合结构域
在一个方面，本发明的CAR包含靶特异性结合元件，另外称作抗原结合结构域。结构部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当靶细胞上与具体疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。因此，可以在本发明的CAR中充当抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物例子包括与病毒感染、细菌感染和寄生虫性感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一个方面，可以通过将特异性结合所需抗原的抗原结合结构域工程化入 CAR中，将CAR介导的T细胞应答指向目的抗原。
在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向CD19的抗原结合结构域。在一个方面，抗原结合结构域靶向人CD19。在一个方面，CAR的抗原结合结构域具有与Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997) 中描述的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一个实施方案中，CAR 的抗原结合结构域包含Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165 (1997)中描述的scFv片段。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、鼠抗体、人抗体、人源化抗体和其功能性片段，包括但不限于单一结构域抗体，如驼类衍生型纳米体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)，以及本领域已知的作为抗原结合结构域发挥作用的备选支架，如重组纤连蛋白结构域等。
在一个实施方案中，CAR分子包含抗CD19结合结构域，所述抗CD19结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个) 轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区 3(LC CDR3)、本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个) 重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区 3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)LC CDR和一个或多个(例如，全部三个)HC CDR的抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含本文所述的抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个) 重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区 3(HC CDR3)，例如，抗CD19结合结构域具有两个可变重链区域，各自包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3。在一个实施方案中，抗CD19 结合结构域包含本文(例如，表7中)所述的鼠轻链可变区和/或本文(例如，表7 中)所述的鼠重链可变区。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表7 的氨基酸序列的鼠轻链和鼠重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表7中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换)，或包含与表7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表7 中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10 个修饰(例如，置换)，或包含与表7的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含SEQ ID NO:59的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表7中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表7中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、 3、4、5或6，优选地3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头- 轻链可变区。
在一些情况下，从其中将会最终使用CAR的相同物种衍生有益于抗原结合结构域。例如，对于人类中使用，包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基可能有益于CAR的抗原结合结构域。
因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文所述的鼠或人源化抗CD19 结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区 1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，包含一个或多个(例如，全部三个)LC CDR和一个或多个(例如，全部三个)HC CDR的人源化抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，人源化抗CD19 结合结构域包含本文所述的鼠或人源化抗CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如，人源化抗CD19结合结构域具有两个可变重链区域，各自包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如，表3中)所述的人源化轻链可变区和/或本文(例如，表3中)所述的人源化重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含本文(例如，表3中)所述的人源化重链可变区，例如至少两个本文(例如，表3中)所述的人源化重链可变区。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是包含表3的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表3中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、 20或10个修饰(例如，置换)，或包含与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表3中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换)，或包含与表3的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列或与其具有 95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码人源化抗CD19结合结构域的核酸序列包含选自SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表3中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表3中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，人源化抗CD19结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、 2、3、4、5或6，优选地3或4(SEQ ID NO:53)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区- 接头-轻链可变区。
在一个方面，抗原结合结构域部分包含选自SEQ ID NO:1-12的一个或多个序列。在一个方面，人源化CAR选自SEQ ID NO:31-42的一个或多个序列。在一些方面，非人类抗体是人源化的，其中修饰抗体的特定序列或区域以增加与人类中天然产生的抗体或其片段的相似性。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，所述技术包括但不限于 CDR移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，每份文献通过引用的方式完整并入本文)、镶饰或表面重塑(参见，例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596； Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994, Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，每份文献通过引用的方式完整并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利号 5,565,332，所述文献通过引用的方式完整并入本文)和在例如以下文献中公开的技术：美国专利申请公开号US 2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 9317105、Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas等人,Protein Eng., 13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca等人,J. Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904 (1996)、Couto等人,CancerRes.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto等人, Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和 Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，每份文献通过引用的方式完整并入本文。经常地，构架区中的构架残基将用来自CDR供体抗体的相应残基置换以改变、例如改善抗原结合。这些构架置换由本领域熟知的方法鉴定，例如，通过将CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基并且进行序列比较以鉴定特定位置处的不寻常构架残基。(参见，例如，Queen 等人，美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323，所述文献通过引用的方式完整并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有留在其中的来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称作“输入”残基，它们一般取自“输入”可变结构域。如本文中提供，人源化抗体或抗体片段包含来自非人类免疫球蛋白分子和构架区的一个或多个CDR，其中包含构架的氨基酸残基完全或大部分衍生自人种系。用于抗体或抗体片段人源化的多项技术是本领域熟知并且可以基本上按照Winter和合作者(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann 等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536 (1988))的方法，通过将啮齿类CDR或CDR序列置换为相应的人抗体序列进行，即，CDR移植法(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号 4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在这类人源化抗体和抗体片段中，基本上小于完整人可变结构域的区域已经由来自非人类物种的相应序列置换。人源化抗体往往是其中一些CDR残基并且可能地一些FR残基由来自啮齿动物抗体中类似位点的残基置换的人抗体。抗体和抗体片段的人源化也可以通过镶饰或表面重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
选择待用于产生人源化抗体的人可变结构域(重链和轻链的可变结构域)对于降低抗原性重要。根据所谓“最佳配合”方法，针对已知的人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。随后鉴定到与啮齿类序列最接近的人类序列并且接受它作为用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等人, J.Immunol,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。另一种方法使用从具有特定亚组重链或重链的全部人类抗体的共有序列中衍生的特定构架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(参见，例如，Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17): 1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)； Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的构架区(例如，全部四个构架区) 衍生自VH4_4-59种系序列。在一个实施方案中，构架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，置换，例如来自相应鼠序列(例如，SEQ ID NO: 59)处氨基酸的置换。在一个实施方案中，轻链可变区的构架区(例如，全部四个构架区)衍生自VK3_1.25种系序列。在一个实施方案中，构架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，置换，例如来自相应鼠序列(例如，SEQ IDNO:59)处氨基酸的置换。
在一些方面，包含抗体片段的本发明CAR组合物的部分是人源化的，保留对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，使用亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和多种构思性人源化产物的过程，制备人源化抗体和抗体片段三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选择候选免疫球蛋白序列的可能三维构象性结构的计算机程序是可获得的。对这些展示结果的检验允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥作用中的可能角色，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出并且组合FR残基，从而实现想要的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原的亲和力增加。通常，CDR残基直接并且基本上参与影响抗原结合作用。
人源化抗体或抗体片段可以保留与(例如，在本发明中的)原始抗体相似的抗原特异性，结合人CD19的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的与人CD19结合的亲和力和/或特异性。
在一个方面，抗CD19结合结构域以抗体或抗体片段的特定功能性特征或特性为特征。例如，在一个方面，本发明CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合人CD19。在一个方面，抗原结合结构域具有与Nicholson等人, Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)中描述的FMC63 scFv相同或相似的人CD19结合特异性。在一个方面，本发明涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中抗体结合结构域与CD19蛋白或其片段特异性结合，其中抗体或抗体片段包含了包括SEQ ID NO:1-12或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的可变轻链和/或可变重链。在一个方面，抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1-12 或SEQ IDNO:59的scFv的氨基酸序列。在某些方面，scFv与前导序列邻接并处于与之相同的可读框内。在一个方面，前导序列是作为SEQ ID NO:13提供的多肽序列。
在一个方面，抗CD19结合结构域是片段，例如，单链可变片段(scFv)。在一个方面，抗CD19结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2、或双功能(例如双特异性) 杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD19蛋白。
在一些情况下，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见，例如，Bird 等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH区和VL区连接在一起产生scFv分子。ScFv分子包含长度和/或氨基酸组成优化的接头(例如，Ser-Gly 接头)。接头长度可以大大影响scFv的可变区怎样折叠并相互作用。实际上，如果使用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则防止链内折叠。还需要链间折叠以使这两个可变区一起形成有功能的表位结合位点。关于接头取向和大小的例子，参见，例如，Hollinger等人,1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，和PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715，所述文献通过引用方式并入本文。
scFv可以在其VL区和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复序列如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:18)。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ IDNO:106)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:107)。接头长度的变化可以保留或增强活性，在活性研究中产生优越功效。
在一些实施方案中，可以修饰抗原结合结构域(或其他部分或完整CAR)的氨基酸序列，例如，可以修饰本文所述的氨基酸序列，例如，通过保守性置换修饰。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸) 和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，同一性百分数指两个或更多个序列中相同的程度。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域范围内或当未指定时在整个序列范围内具有60％同一性，任选地70％、71％。 72％。73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则这两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域内，或更优选地在长度100到500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内。
对于序列比较，一般地一个序列充当与检验序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行，例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math. 2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol. 48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci. USA 85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(见，例如， Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res. 25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。
还可以使用PAM120权重余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,(1988)Comput.Appl. Biosci.4:11-17)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch(1970)J.Mol.Biol. 48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
在一个方面，本发明构思了产生功能上等同分子的起始抗体或片段(例如， scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰CAR中包含的抗CD19结合结构域(例如，scFv)的VH或VL以保留抗CD19结合结构域(例如，scFv)的起始VH或 VL构架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、 79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明构思了修饰完整CAR构建体，例如，在CAR构建体的各种结构域的一种或多种氨基酸序列中修饰，旨在产生功能上等同的分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％。72％。73％、74％、75％、76％、77％、 78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序以及针对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半部分抗体和针对第二表位具有结合特异性的半部分抗体。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半部分抗体或其片段和针对第二表位具有结合特异性的半部分抗体或其片段。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和针对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，在多个实施方案中，CAR可以设计成包含与CAR的胞外结构域连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或多个与跨膜区毗邻的额外氨基酸，例如，一个或多个与衍生跨膜区的蛋白质的胞外区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个直至15个胞外区氨基酸)和/或一个或多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的胞内区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10个至多15个胞内区氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是一个结构域与CAR的其他结构域之一缔合，例如，在一个实施方案中，跨膜结构域可以来自衍生信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不从衍生CAR的任何其他结构域的相同蛋白质衍生。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最大限度减少与受体复合体的其他构件的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR 的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同方面，可以修饰或置换跨膜结构域的氨基酸序列，从而最大限度减少与表达CAR的相同细胞中存在的天然结合配偶体的结合结构域相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR已经与靶结合时，跨膜结构域就能够向胞内结构域发送信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以包含例如以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、 CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、 LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、 HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、 CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、 IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、 ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、 ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、 2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、 PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在一些情况下，跨膜结构域可以借助铰链区(例如，来自人蛋白质的铰链区) 与CAR的胞外区(例如，CAR的抗原结合结构域)连接。例如，在一个实施方案中，铰链区可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链区(例如，IgG4铰链区、IgD铰链区)、 GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链区或CD8a铰链区。在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列(例如，由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的跨膜结构域(例如，由其组成)。
在一个方面，铰链区或间隔区包含IgG4铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含具有以下氨基酸序列的铰链区 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:45)。在一些实施方案中，铰链区或间隔区包含由以下核苷酸序列编码的铰链区： GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGT TCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGT GGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA CAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGAC CGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCC CAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTA CCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTG GCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAA GAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:46)。
在一个方面，铰链区或间隔区包含IgD铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含具有以下氨基酸序列的铰链区 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPL GVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTL PRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILL MWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVS YVTDH(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，铰链区或间隔区包含由以下核苷酸序列编码的铰链区： AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGC AGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAG AAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCA TACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCC ACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAA AGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGC ACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCA TCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTT AGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCG GCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTT CGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTC CCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCC TGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:48)。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下它将包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以在重组跨膜结构域的每个末端存在。
任选地，2和10个氨基酸长度之间的短寡聚物接头或多肽接头可以在CAR 的跨膜结构域和胞质区域之间形成键。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，接头由核酸序列 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:50)编码。
在一个方面，铰链区或间隔区包含KIR2DS2铰链区。
胞质结构域
CAR的胞质结构域或区域包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责活化其中已经引入CAR的免疫细胞的多项正常效应子功能的至少之一。术语“效应子功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”指传导效应子功能信号并且指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。尽管通常可以使用完整的胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用完整链。使用胞内信号传导结构域的截短部分到这样的程度，从而可以使用这种截短的部分替代完整链，只要它传导效应子功能信号即可。术语“胞内信号传导结构域”因此意在包括胞内信号传导结构域的足以传导效应子功能信号的任何截短部分
用于本发明CAR中的胞内信号传导结构域的例子包括协同发挥作用以在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)胞质序列和共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
已知单独通过TCR生成的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级和/ 或共刺激信号。因此，据称T细胞活化可以由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号传导结构域) 和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式发挥作用的初级胞内信号传导结构域可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
含有在本发明中特别有用的初级胞内信号传导结构域的ITAM的例子包括 CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、 CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些ITAM。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如，CD3ζ的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，如与天然ITAM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性的突变ITAM 结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含了含有修饰的ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，含有优化和/或截短的ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
含有在本发明中特别有用的初级胞内信号传导结构域的分子的其他例子包括含有DAP10、DAP12和CD32的那些分子。
CAR的胞内信号传导结构域可以本身包含CD3ζ信号传导结构域，或它可以与本发明CAR背景下有用的任何其他所需的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外淋巴细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。这类分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、 CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、 NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27共刺激作用已经证实在体外增强人CAR T细胞的扩增、效应子功能和存活并且在体内增进人 T细胞留存和抗肿瘤活性(Song等人,Blood.2012；119(3):696-706)。这类共刺激分子的其他例子包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、 SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、 CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、 ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、 ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、 SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、 Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、 SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和CD19a。
在本发明CAR的胞质部分内部的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或指定顺序连接。任选地，例如2个和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、 8、9或10个氨基酸)长度之间的短寡聚物接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，包含两个或更多个 (例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域由接头分子(例如，本文所述的接头分子)分隔。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和 CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:16的信号传导结构域。在一个方面，CD3ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:17的信号传导结构域。
在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和 CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含 QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SE Q ID NO:51)的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGAC TCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCC CACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:52)的核酸序列编码。
在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞还可以包含例如针对相同靶 (CD19)或不同靶(例如，CD123或间皮素)的第二CAR，例如，包含不同抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施方案中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以是这样的，从而抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR 的抗原结合结构域，例如，作为不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合的片段(例如，scFv)，例如，第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在另一个方面，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达另一种物质，例如，增强表达CAR的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，该物质可以是对抑制性分子抑制的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，PD1)可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、 PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质包含例如，抑制性分子如PD1、 PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域 (例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体CD28家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T 细胞和髓样细胞上表达(Agata等人,1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示 PD1、PD-L1和PD-L2的两种配体与PD1结合时，下调T细胞活化(Freeman 等人,2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人,2001Nat Immunol 2:261-8； Carter等人,2002Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中丰富(Dong 等人,2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人,2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人,2004 Clin Cancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。
在一个实施方案中，该物质包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和胞内信号传导结构域如41BB和CD3ζ融合(本文也称作PD1CAR)。在一个实施方案中，与本文所述的CD19 CAR组合使用时，PD1 CAR改善T细胞的留存。在一个实施方案中，CAR是PD1 CAR，其包含如SEQ ID NO:121中加下划线所示的PD1胞外结构域。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnw yrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelr vterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgl dfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvld krrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:121)。
在一个实施方案中，PD1 CAR包含下文提供的氨基酸序列(SEQ ID NO: 119)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsq pgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpag qfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlll slvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpq eglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:119)。
在一个实施方案中，该物质包含编码PD1 CAR的核酸序列(例如，本文所述的PD1CAR)。在一个实施方案中，下文显示PD1 CAR的核酸序列，将PD1 ECD在下文SEQ ID NO:120中加下划线
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccgg atggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggc gataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgt caaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgac tcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgc ggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagag ctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgcc gcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattgg acttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgt acattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcg tgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggac aagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggc ctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctg cacatgcaggcccttccccctcgc(SEQ ID NO:120)。
在另一个方面，本发明提供表达CAR的细胞群体，例如，CART细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体可以包含表达具有本文所述的抗CD19结合结构域的CAR的第一细胞和表达具有不同抗CD19结合结构域 (例如，在第一细胞表达的CAR中与抗CD19结合结构域不同的本文所述的抗 CD19结合结构域)的CAR的第二细胞。作为另一个例子，表达CAR的细胞的群体可以包含表达下述CAR的第一细胞，所述CAR包含(例如，如本文所述的) 抗CD19结合结构域，和表达下述CAR的第二细胞，所述CAR包含针对除CD19 以外的靶(例如，CD123)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR的第一细胞，所述CAR包括初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR的第二细胞，所述CAR包括次级信号传导结构域。
在另一个方面，本发明提供细胞群体，其中，群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的抗CD19结合结构域的CAR，和表达另一种物质(例如，增强表达CAR的细胞活性的物质)的第二细胞。例如，在一个实施方案中，该物质可以是对抑制性分子抑制的物质。在一些实施方案中，抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质包含例如抑制性分子如PD1、PD-L1、 CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、 LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
可调节的嵌合抗原受体
在一些实施方案中，其中CAR活性可以控制的可调节性CAR(RCAR)是优化CAR疗法的安全性和疗效需要的。存在可以调节CAR活性的许多方式。例如，使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶的诱导性凋亡过程(参见，例如， Di Stasa等人,NEngl.J.Med.2011Nov.3；365(18):1673-1683)可以用作本发明 CAR治疗中的安全转换开关。在一个实施方案中，表达本发明CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)还包含诱导性凋亡转换开关，其中人胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶9)或修饰形式与允许条件性二聚化的人FKB蛋白修饰融合。在小分子(如雷帕霉素类似物(例如，AP 1903、AP20187))存在下，诱导性胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶9)被激活并导致表达本发明CAR的细胞(例如，T细胞或NK 细胞)快速凋亡和死亡。基于胱天蛋白酶的诱导性凋亡转换开关(或这种转换开关的一个或多个方面)的例子已经在例如，US 2004040047；US 20110286980；US 20140255360；WO1997031899；WO 2014151960；WO 2014164348；WO 2014197638；WO 2014197638中描述；所述文献均通过引用的方式并入本文。
在一个方面，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施方案中一般是两种多肽，其中本文所述的标准CAR的组件(例如，抗原结合结构域和胞内信号传导结构域)分配在分别的多肽或构件上。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化转换开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化转换开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。在一个实施方案中，本发明的CAR利用二聚化转换开关，如例如WO 2014127261中描述的那些，所述文献通过引用的方式并入本文。
在一个方面，RCAR包含两种多肽或构件：1)包含胞内信号传导结构域(例如，本文所述的初级胞内信号传导结构域)和第一转换开关结构域的胞内信号传导构件；2)包含如本文所述的(例如靶向CD19的)抗原结合结构域和第二转换开关结构域的抗原结合构件。任选地，RCAR包含本文所述的跨膜结构域。在一个实施方案中，可以在胞内信号传导构件上、抗原结合构件上或在这两者上设置跨膜结构域。(除非另外说明，否则本文中描述RCAR的构件或元件时，该顺序可以是如所提供的那样，但是也可以包括其他顺序)。换而言之，在一个实施方案中，顺序如文本中所述那样，但是在其他实施方案中，顺序可以是不同的。例如，各元件在跨膜区一侧上的顺序可以与例子不同，例如，转换开关结构域相对于胞内信号传导结构域的安置可以是不同的，例如，倒转。
在一个实施方案中，第一转换开关结构域和第二转换开关结构域可以形成胞内或胞外二聚化转换开关。在一个实施方案中，二聚化转换开关可以是同型二聚化转换开关，例如，其中第一转换开关结构域和第二转换开关结构域是相同的，或异二聚化转换开关，例如，其中第一转换开关结构域和第二转换开关结构域彼此不同。
在实施方案中，RCAR可以包含“多重转换开关”。多重转换开关可以包含异二聚化转换开关结构域或同型二聚化转换开关结构域。多重转换开关在第一构件(例如，抗原结合构件)和第二构件(例如，胞内信号传导构件)上独立地包含多个例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10个转换开关结构域。在一个实施方案中，第一构件可以包含多个第一转换开关结构域，例如，基于FKBP的转换开关结构域，并且第二构件可以包含多个第二转换开关结构域，例如，基于FRB 的转换开关结构域。在一个实施方案中，第一构件可以包含第一转换开关结构域和第二转换开关结构域，例如，基于FKBP的转换开关结构域和基于FRB的转换开关结构域，并且第二构件可以包含第一转换开关结构域和第二转换开关结构域，例如，基于FKBP的转换开关结构域和基于FRB的转换开关结构域。
在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含一个或多个胞内信号传导结构域(例如，初级胞内信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，抗原结合构件可以包含一个或多个胞内信号传导结构域，例如，一个或多个共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件包含多个，例如，2个或3个本文所述的共刺激信号传导结构域，例如，选自41BB、CD28、CD27、ICOS和OX40的共刺激信号传导结构域，并且在多个实施方案中，不包含初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件从胞外至胞内方向包含以下共刺激信号传导结构域：41BB-CD27；41BB-CD27；CD27-41BB；41BB-CD28；CD28-41BB；OX40-CD28；CD28-OX40； CD28-41BB；或41BB-CD28。在这类实施方案中，胞内结合构件包含CD3ζ结构域。在这样一个实施方案中，RCAR包含(1)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含抗原结合结构域、跨膜结构域和两个共刺激结构域和第一转换开关结构域；和(2)胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含跨膜结构域或膜束缚结构域和至少一个初级胞内信号传导结构域和第二转换开关结构域。
一个实施方案提供其中抗原结合构件未系留于CAR细胞表面的RCAR。这允许具有胞内信号传导构件的细胞在不用编码抗原结合构件的序列转化细胞的情况下便利地与一个或多个抗原结合结构域配对。在这类实施方案中，RCAR 包含：1)胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含：第一转换开关结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域(例如，初级胞内信号传导结构域)和第一转换开关结构域；和2)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含：抗原结合结构域和第二转换开关结构域，其中抗原结合构件不包含跨膜结构域或膜束缚结构域并且任选地不包含胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，RCAR还可以包含3)第二抗原结合构件，所述第二抗原结合构件包含第二抗原结合结构域，例如，结合被抗原结合结构域结合的不同抗原的第二抗原结合结构域；和第二转换开关结构域。
本文中还提供其中抗原结合构件包含双特异性激活和靶向能力的RCAR。在这个实施方案中，抗原结合构件可以包含多个，例如，2、3、4、或5个抗原结合结构域，例如，scFv，其中每种抗原结合结构域结合至靶抗原，例如不同的抗原或相同的抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在一个实施方案中，多个抗原结合结构域串联，并且任选地，接头或铰链区布置在每个抗原结合结构域之间。本文中描述了合适的接头和铰链区。
一个实施方案提供了具有允许增殖变换的布局的RCAR。在这个实施方案中，该RCAR包含：1)胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含：任选地，跨膜结构域或膜束缚结构域；一种或多种(例如，选自41BB、CD28、CD27、 ICOS和OX40的)共刺激信号传导结构域，以及转换开关结构域；和2)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含：抗原结合结构域、跨膜结构域和初级胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ结构域)，其中抗原结合构件不包含转换开关结构域或不包含与胞内信号传导构件上的转换开关结构域二聚化的转换开关结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件不包含共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含来自同型二聚化转换开关的转换开关结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含异二聚化转换开关的第一转换开关结构域，并且RCAR包含第二胞内信号传导构件，所述第二胞内信号传导构件包含异二聚化转换开关的第二转换开关结构域。在这类实施方案中，第二胞内信号传导构件包含与胞内信号传导构件相同的胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，二聚化转换开关是胞内的。在一个实施方案中，二聚化转换开关是胞外的。
在本文描述的任何RCAR布局中，第一转换开关结构域和第二转换开关结构域包含如本文所述的基于FKBP-FRB的转换开关。
本文中还提供包含本文所述的RCAR的细胞。经工程化以表达RCAR的任何细胞可以用作RCARX细胞。在一个实施方案中，RCARX细胞是T细胞并且称作RCART细胞。在一个实施方案中，RCARX细胞是NK细胞并且称作 RCARN细胞。
本文中还提供包含编码RCAR的序列的核酸和载体。编码RCAR的多种元件的序列可以设置在相同的核酸分子上，例如，相同的质粒或载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体。在一个实施方案中，(i)编码抗原结合构件的序列和(ii)编码胞内信号传导构件的序列可以存在于相同的核酸(例如，载体)上。可以例如通过使用独立的启动子，或通过使用双顺反子转录产物(通过切割单一翻译产物或通过翻译两种独立的蛋白质产物，所述双顺反子转录产物可以导致产生两种蛋白质)实现相应蛋白质的产生。在一个实施方案中，编码可切割肽(例如， P2A或F2A序列)的序列布置在(i)和(ii)之间。在一个实施方案中，编码IRES(例如，EMCV IRES或EV71 IRES)的序列布置在(i)和(ii)之间。在这些实施方案中， (i)和(ii)转录为单个RNA。在一个实施方案中，第一启动子与(i)有效连接并且第二启动子与(ii)有效连接，从而(i)和(ii)转录为独立的mRNA。
备选地，编码RCAR的多种元件的序列可以设置在不同的核酸分子上，例如，不同的质粒或载体上，例如，病毒载体上，例如，慢病毒载体上。例如， (i)编码抗原结合构件的序列可以存在于第一核酸(例如，第一载体)上，并且(ii) 编码胞内信号传导构件的序列可以存在于第二核酸(例如，第二载体)上。
二聚化转换开关
二聚化转换开关可以是非共价或共价的。在非共价二聚化转换开关中，二聚化分子促进各转换开关结构域之间的非共价相互作用。在共价二聚化转换开关中，二聚化分子促进各转换开关结构域之间的共价相互作用。
在一个实施方案中，RCAR包含基于FKBP/FRAP或基于FKBP/FRB的二聚化转换开关。FKBP12(FKBP、或FK506结合蛋白)是充当天然产物(免疫抑制药物雷帕霉素)的初始胞内靶的丰富胞质蛋白。雷帕霉素与FKBP结合并且与大 PI3K同源物FRAP(RAFT、mTOR)结合。FRB是FRAP的93氨基酸部分，所述部分足以结合FKBP-雷帕霉素复合物(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.和 Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-雷帕霉素-binding domain within the 289-kDa FKBP12-雷帕霉素-associated protein andcharacterization of a critical serine residue.Proc Natl Acad Sci U S A 92:4947-51)。
在实施方案中，基于FKBP/FRAP(例如，基于FKBP/FRB)的转换开关可以使用二聚化分子，例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
FKBP的氨基酸序列如下：
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHY TGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLT ISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY(SEQ ID NO:122)。
在实施方案中，FKBP转换开关结构域可以包含具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与FRB或片段或其类似物结合的能力的FKBP片段，例如，SEQ ID NO:122的加下划线部分，其是：
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKP FKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHP GIIPPHATLVFDVELLKLETS(SEQ ID NO:123)
FRB的氨基酸序列是如下：
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLMEAQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO:124)
如该术语在本文中所用那样，“基于FKBP/FRAP(例如，基于FKBP/FRB) 的转换开关”指包含第一转换开关结构域和第二转换开关结构域的二聚化转换开关，所述第一转换开关结构域包含了具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如，RAD001)存在下与FRB或片段或其类似物结合的能力的FKBP片段或其类似物并且与SEQ ID NO:122或123的FKBP序列具有至少70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不多于30、25、20、 15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基；所述第二转换开关结构域包含了具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与FRB或片段或其类似物结合的能力的 FRB片段或其类似物并且与SEQ ID NO:124的FRB序列具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不多于30、 25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一个实施方案中，本文所述的RCAR包含一个包含在SEQ ID NO:122(或SEQ ID NO:123)中公开的氨基酸残基的转换开关结构域和一个包含在SEQ ID NO:124中公开的氨基酸残基的转换开关结构域。
在实施方案中，FKBP/FRB二聚化转换开关包含修饰的FRB转换开关结构域，所述修饰的FRB转换开关结构域显示出改变(例如，增强)基于FRB的转换开关结构域(例如，修饰的FRB转换开关结构域、基于FKBP的转换开关结构域)和二聚化分子(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如，RAD001)之间的复合物形成。在一个实施方案中，修饰的FRB转换开关结构域包含一个或多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个选自氨基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105和 F2108处的突变，其中野生型氨基酸突变成任何其他天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，突变FRB包含在E2032处的突变，其中E2032突变成苯丙氨酸(E2032F)、甲硫氨酸(E2032M)、精氨酸(E2032R)、缬氨酸(E2032V)、酪氨酸 (E2032Y)、异亮氨酸(E2032I)(例如，SEQ ID NO:125)或亮氨酸(E2032L)(例如， SEQ ID NO:126)。在一个实施方案中，突变FRB包含在T2098处的突变，其中T2098突变成苯丙氨酸(T2098F)或亮氨酸(T2098L)，例如，SEQ ID NO:127。在一个实施方案中，突变FRB包含在E2032处和T2098处的突变，其中E2032 突变成任何氨基酸并且其中T2098突变成任何氨基酸，例如，SEQ ID NO:128。在一个实施方案中，突变FRB包含E2032I和T2098L突变，例如，SEQ ID NO: 129。在一个实施方案中，突变FRB包含E2032L和T2098L突变，例如，SEQ ID NO:130。
表13.具有增加的二聚化分子亲和力的示例性突变FRB。
Figure BDA0002395107430000891
其他合适的二聚化转换开关包括基于GyrB-GyrB的二聚化转换开关、基于赤霉素的二聚化转换开关、标签/结合物二聚化转换开关和卤素标签/搭扣(snap) 标签二聚化转换开关。按照本文提供的指南，这类转换开关和有关的二聚化分子将是普通技术人员显而易见的。
二聚化分子
转换开关结构域之间的缔合由二聚化分子引发。在二聚化分子存在下，转换开关结构域之间的相互作用或缔合允许与第一转换开关结构域结合(例如，融合)的多肽和与第二转换开关结构域结合(例如，融合)的多肽之间的信号转导。在非限制水平的二聚化分子存在下，信号转导增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、 1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍，例如，如本文所述的系统中测量。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物(有时称作雷帕类似物)，例如，RAD001、可以用作本文所述的基于FKBP/FRB的二聚化转换开关中的二聚化分子。在一个实施方案中二聚化分子可以选自雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、RAD001(依维莫司)、佐他莫司(zotarolimus)、坦罗莫司、AP-23573(地磷莫司)、百奥莫司(biolimus) 和AP21967。适合随基于FKBP/FRB的二聚化转换开关一起使用的额外雷帕霉素类似物进一步在名为“联合疗法”的部分中或在名为“示例性mTOR抑制剂”的子部分中描述。
分裂的CAR(split CAR)
在一些实施方案中，表达CAR的细胞使用分裂的CAR。出版物WO 2014/055442和WO2014/055657中更详细地描述了分裂的CAR方案。简而言之，分裂的CAR系统包含细胞，所述细胞表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41BB)的第一CAR，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活并且细胞杀伤活性开启。因此，表达CAR的细胞仅在两种抗原存在下完全活化。
RNA转染
本文公开了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括编码可以直接转染至细胞中的RNA构建体的CAR。一种产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用专门设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和聚腺苷酸化尾的构建体，长度一般为50-2000个碱基(SEQ ID NO: 118)。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。
在一个方面，抗CD19 CAR由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码抗CD19 CAR的mRNA引入免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，以产生表达CAR的细胞，例如，CART细胞或CAR NK细胞。
在一个实施方案中，可以将体外转录的RNA CAR作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生RNA。来自任何来源的目的DNA可以直接通过PCR转化成模板，以使用适宜引物和RNA 聚合酶，体外合成mRNA。DNA的来源可以例如是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他适宜的DNA来源。所需的体外转录模板是本发明的CAR。例如，RNA CAR的模板包含胞外区，所述胞外区包含抗肿瘤抗体的单链可变结构域；铰链区、跨膜结构域(例如，CD8a的跨膜结构域)；和包含胞内信号传导结构域(例如，包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域)的胞质区。
在一个实施方案中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自源于生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5'非翻译区和/或3'非翻译区(UTR)的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人类核酸序列。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人类核酸序列，包括5'UTR和3'UTR。DNA可以备选地是正常情况下在天然存在的生物中不表达的人工DNA序列。示例性人工DNA 序列是含有各基因部分的人工DNA序列，其中所述的各基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的各DNA部分可以来自单种生物或来自多于一种生物。
PCR用来产生模板以便体外转录用于转染的mRNA。用于开展PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR中的引物设计成具有与待用作PCR模板的DNA 的区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”，指其中引物序列中的大部分或全部碱基互补或一个或多个碱基是非互补或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的复性条件下与预期的DNA靶复性或杂交。引物可以设计成与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以设计成扩增正常情况下在细胞中转录的核酸部分(可读框)，包括5'和3'UTR。引物也可以设计成扩增编码特定目的结构域的核酸部分。在一个实施方案中，引物是设计成扩增人cDNA的编码区，包括全部或部分的5'和3'UTR。可用于PCR的引物可以是通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是这样的引物，其含有与DNA模板上待扩增的DNA序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域。“上游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的DNA序列而言5'的位置。“反向引物”是这样的引物，其含有与DNA模板上待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域。“下游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的DNA序列而言3'的位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶可以在本文中公开的方法中使用。从众多来源可商业获得试剂和聚合酶。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构物。RNA优选地具有5'UTR和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR长度在1个和3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'UTR和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，所述方法包括但不限于设计与UTR的不同区域复性的PCR用引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以调节为转染转录的RNA后实现最佳翻译效率所需要的5'UTR和3'UTR长度。
5'UTR和3'UTR可以是目的核酸的天然存在的、内源5'UTR和3'UTR。备选地，相对于目的核酸并非内源的UTR序列可以通过将该UTR序列并入正向引物和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰进行添加。相对于目的核酸并非内源的UTR序列的用途可以用于调整RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的AU丰富元件可以降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域熟知的UTR特性，可以选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可以含有内源核酸的Kozak序列。备选地，当通过如上文所述的PCR正在添加相对于目的核酸并非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列再设计共有Kozak序列。Kozak序列可以增加某些RNA 转录物的翻译效率、但似乎不是令全部RNA有效翻译需要的。本领域已知许多 mRNA需要Kozak序列。在其他实施方案中，5'UTR可以是其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒的5’UTR。在其他实施方案中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR中，以阻碍核酸外切酶降解mRNA。
为了能够在不需要基因克隆的情况下从DNA模板合成RNA，转录启动子应当在待转录序列上游与DNA模板连接。当作为RNA聚合酶启动子发挥作用的序列添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子并入待转录的可读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文他处描述。其他可用启动子包括但不限于T3 RNA聚合酶启动子和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个优选实施方案中，mRNA在5'末端和3'聚腺苷酸尾均具有决定在细胞中核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性的帽。在环状DNA模板，例如，质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于真核细胞中表达的长连环体产物。转录在3'UTR末端线性化的质粒DNA产生在真核转染中并非有效的大小正常的 mRNA，即便转录后它发生聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以延伸转录物的3’末端越过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36 (1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
整合聚腺苷酸/T片段至DNA模板中的常规方法是分子克隆。但是，整合入质粒DNA的聚腺苷酸/T序列可能造成质粒不稳定性，这是为何从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常遭受缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆方法不仅繁琐和费时的，而且经常不可靠。这是为何迫切需要以下方法的原因：允许在不进行克隆情况下构建带聚腺苷酸/T 3'片段的DNA模板。
可以在PCR期间产生通过使用含有聚胸苷酸尾(如100T尾(SEQ ID NO: 110)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:111)))的反向引物或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)，产生已转录的DNA模板的聚腺苷酸/T区段。聚腺苷酸尾还向RNA提供稳定性并减少它们的降解。通常，聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾在100个和5000个腺苷之间(SEQ ID NO:112)。
RNA的聚腺苷酸尾可以在体外转录后利用聚腺苷酸聚合酶(如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP))进一步延长。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾的长度从 100个核苷酸增加至300个和400个核苷酸之间(SEQ ID NO:113)导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，接合不同化学基团至3’末端可以增加mRNA稳定性。这种接合可以含有修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，ATP 类似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾中。ATP类似物还可以增加 RNA的稳定性。
5'帽也向RNA分子提供稳定性。在一个优选实施方案中，通过本文所公开的方法产生的RNA包含5'帽。使用本领域已知和本文所述的技术提供5'帽 (Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA, 7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966 (2005))。
通过本文所公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES) 序列。IRES序列可以是任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列，所述序列启动帽非依赖性核糖体结合至mRNA并促进翻译的起始。可以包含适于细胞电穿孔的任何溶质，所述溶质可以含有促进细胞通透性和生存力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用众多不同方法的任一者，将RNA引入靶细胞中，例如包括但不限于以下的市售方法：电穿孔法(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne,德国))、(ECM830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或 Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg德国)、使用脂转染的阳离子脂质体介导转染法、聚合物囊化法、肽介导的转染法或生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可以用来递送编码本文所述的CAR的核酸至细胞或组织或受试者中。
在一些实施方案中，非病毒方法包括利用转座子(也称作转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将本身插入基因组中的某位置处的一段DNA，例如，能够自我复制并将其副本插入基因组中的一段DNA或可以是从较长核酸剪接出来并插入基因组中的另一个位置的一段DNA。例如，转座子包含由反向重复序列组成的DNA序列，所述反向重复序列在用于换位的基因旁侧分布。
使用转座子递送核酸的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和 piggyBac(PB)转座子系统。参见，例如，Aronovich等人,Hum.Mol.Genet. 20.R1(2011):R14-20；Singh等人,Cancer Res.15(2008):2961–2971；Huang等人, Mol.Ther.16(2008):580–589；Grabundzija等人,Mol.Ther. 18(2010):1200–1209；Kebriaei等人,Blood.122.21(2013):166；Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515–16；Bell等人,Nat.Protoc. 2.12(2007):3153-65；和Ding等人,Cell.122.3(2005):473-83，所述文献均通过引用的方式并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶来源。转座酶可以令转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转置到靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒切下转座子(包含转基因)) 并将它插入宿主细胞的基因组中。参见，例如，Aronovich等人,上文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人, NucleicAcids Res.41.3(2013):1829-47；和Singh等人,Cancer Res.68.8(2008): 2961–2971，所述文献均通过引用的方式并入本文。示例性转座酶包括Tc1/水手型转座酶，例如，SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃性转座酶)。参见，例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和 Grabundzija等人,所述文献均通过引用的方式并入本文。
SBTS的使用允许高效整合和表达转基因，例如，编码本文所述CAR的核酸。本文中提供例如使用转座子系统如SBTS，产生稳定表达本文所述CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法。
根据本文所述的方法，在一些实施方案中，将一种或多种含有SBTS组分的核酸(例如，质粒)递送至细胞(例如，T细胞或NK细胞)。例如，通过标准核酸(例如，质粒DNA)递送方法(例如，本文所述的方法，例如，电穿孔法、转染法或脂质体转染法)递送核酸。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子以及编码转座酶的核酸序列。在其他实施方案中，向系统(例如，双质粒系统)提供两种核酸，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子和第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共递送入宿主细胞中。
在一些实施方案中，通过使用采取SBTS的基因插入法和采取核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化大范围核酸酶(meganucleases)、再工程化归巢核酸内切酶)的遗传编辑法的组合，生成表达本文所述CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一些实施方案中，非病毒递送方法的使用允许再编程细胞(例如，T细胞或NK细胞)和直接输注细胞至受试者中。非病毒载体的优点包括但不限于便利和成本相对低地产生满足患者群体所要求的足够量、储存期间稳定性和缺少免疫原性。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供编码一种或多种本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子作为DNA 构建体提供。
因此，在一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含抗CD19结合结构域(例如，人源化抗CD19结合结构域)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含刺激性结构域(例如，共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，ζ链)。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是本文所述的抗CD19结合结构域，例如，包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59的序列或与其具有95-99％同一性的序列的抗CD19结合结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、 CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗CD19 结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链区)与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或 SEQ ID NO:49或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、 ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结结构域包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:51的序列或与其具有95-99％同一性的序列和SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列或与其具有95-99％同一性的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列在相同可读框中表达并作为单条多肽链表达。
在另一个方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，所述CAR 构建体包含SEQ ID NO:13的前导序列、具有选自以下序列的scFv结构域：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59(或与其具有95-99％同一性的序列)、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO: 49(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区、具有SEQ ID NO:15的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有SEQ ID NO:16的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQID NO:51的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域和具有SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:43的序列 (或与其具有95-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激性结构域。
在另一个方面，本发明涉及由该核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个实施方案中，分离的多肽分子包含选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO:59的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在另一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸分子，所述嵌合抗原受体分子包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域和包含刺激性结构域的胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，编码的CAR分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、 CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列和SEQ ID NO:17的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列在相同可读框中表达并作为单条多肽链表达。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49。
在另一个方面，本发明涉及一种编码的CAR分子，所述CAR分子包含SEQ ID NO:13的前导序列、具有选自以下序列或与其具有95-99％同一性的序列的 scFv结构域：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49的铰链区、具有SEQ IDNO:15的序列的跨膜结构域、具有SEQ ID NO:16的序列的4-1BB 共刺激结构域或具有SEQID NO:51的序列的CD27共刺激结构域和具有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:43的序列的CD3ζ刺激性结构域。在一个实施方案中，编码的CAR分子包含选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:59的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
可以使用本领域已知的重组方法获得编码所需分子的核酸序列，如，例如通过从表达基因的细胞筛选文库、通过从已知包括基因的载体衍生该基因、或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织直接分离。备选地，可以合成地产生目的基因，而非克隆。
本发明还提供其中插入了本发明DNA的载体。衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的附加优点，在于它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有附加的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点 (PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV) 和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)和从它们衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体例如在Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011Jun；3(6):677–713中描述。
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需的CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子如睡美人、crisper、CAS9 和锌指核酸酶完成编码CAR的核酸的表达。参见下文June等人,2009 Nature Reviews Immunology 9.10:704-716，所述文献通过引用方式并入本文。
简言之，一般通过将编码CAR多肽或其部分的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成性核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可以用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、 5,580,859、5,589,466，所述文献通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供基因治疗载体。
可以将核酸克隆入众多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆入包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特定意义的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
另外，可以将表达载体以病毒载体的形式向细胞提供。病毒载体技术是本领域熟知的并且例如在Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)中及在其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号 6,326,193)。
已经开发众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体输送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。众多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。一般地，这些位于起始位点上游30-110bp的区域内，不过已经显示众多启动子也在起始位点下游含有功能性元件。启动子元件之间的间距往往灵活，从而当各元件反转或相对于彼此移动时，启动子功能保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前，启动子元件之间的间距可以增加至相隔50bp。取决于启动子，各个元件似乎可以协同或独立地发挥作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促输送氨酰基tRNA至核糖体。EF1a启动子已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包含作为SEQ ID NO:100提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒 40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、 Epstein-Barr病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子转换开关，所述分子转换开关能够在需要这类表达时启动与之有效连接的多核苷酸序列表达或在不需要这类表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
载体还可以例如包括促进分泌的信号序列、多聚腺苷化信号和转录终止子 (例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体型复制并且在原核生物中复制的元件(例如SV40复制起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素耐药基因和/或博莱霉素标记)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报道基因或这两者以促进从寻求用病毒载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择出现表达的细胞。在其他方面，选择标记可以在独立的DNA片段上携带并且在共转染法中使用。选择标记和报道基因可以旁侧分布有能够在宿主细胞中实现表达的适宜调节序列。可用的选择标记例如包括抗生素耐药性基因，如neo等。
报道基因用于确定可能转染的细胞及评价调节序列的功能。通常，报道基因是这样的基因，所述基因不存在于接受生物或组织中或不由接受生物或组织表达并且编码其表达由某种轻易可检测特性(例如，酶活性)展示的多肽。在DNA 已经引入接受细胞之后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知技术制备或商业地获得。通常，将显示最高报道基因表达水平的具有最少5'侧翼区的构建体鉴定为启动子。这类启动子区可以与报道基因连接并用来评价多种物质调节启动子驱动型转录的能力。
向细胞引入基因并表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可以通过本领域的任何方法轻易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞)中。例如，表达载体可以通过物理手段、化学手段或生物学手段转移至宿主细胞中。
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、粒子轰击法、微量注射法、电穿孔法等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人,2012, MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。用于引入多核苷酸至宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染法。
用于引入目的多核苷酸至宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA载体和 RNA载体。病毒载体和尤其逆转录病毒载体已经具有变成使用最广泛的将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674 和5,585,362。
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的化学手段包括胶态分散体系，如大分子复合物、纳米囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载具的示例性胶态体系是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有定向递送核酸的其他方法是可获得的，如用导引的纳米粒子或其他合适的亚微米尺度递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载具是脂质体。构思使用脂质制剂以引入核酸至宿主细胞中(体外，离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封于脂质体的水质内部、散布在脂质体的脂质双层内部、借助与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分子与脂质体连接、包埋于脂质体中、与脂质体复合、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为混悬液含于脂质中、含于胶束中或与胶束复合或否则与脂质结合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体结合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以在双层结构中存在、作为胶束存在或以“塌陷”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集物。脂质是可以是天然存在脂质或合成性脂质的脂肪性物质。例如，脂质包括天然出现在细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物如脂肪酸、醇类、胺、氨基醇类和醛的化合物类。
可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱 (“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；二鲸蜡醇磷酸酯(“DCP”)可以从 K&K Laboratories获得(Plainview、NY)；胆固醇(“Choi”)可以从 Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的母液可以贮存在约-20℃。使用氯仿作为唯一溶剂，因为它比甲醇更易蒸发。“脂质体”是类属术语，其涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集物所形成的多种单一和多层脂质载体。脂质体可以表征作为具有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有水介质分隔的多个脂质层。当磷脂在过量水溶液中悬浮时，它们自发形成脂质体。脂质组分在形成封闭结构前发生自我重排并在脂质双层之间夹带水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991 Glycobiology 5:505-10)。但是，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅作为脂质分子的非均匀聚集物存在。还构思了脂质转染胺 (lipofectamine)-核酸复合物。
无论该方法是否用来引入外源核酸至宿主细胞中或否则使细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定法。这类测定法例如包括本领域技术人员熟知的“分子生物学分析”，如DNA印迹和 RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析，如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫手段(ELISA法和蛋白质印迹法)或通过本文所述测定法鉴定属于本发明范围内的物质。
本发明还提供一种载体，所述载体包含编码CAR的核酸分子。在一个方面，可以将CAR载体直接转导入细胞，例如，T细胞。在一个方面，载体是克隆载体或表达载体，例如，载体包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微小染色体)、逆转录病毒构建体和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
细胞来源
在扩增和基因修饰或其他修饰之前，细胞(例如，T细胞或天然杀伤(NK)细胞)来源可以从受试者获得。术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。受试者的例子包括人、猴、黑猩猩、犬、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。T细胞可以从众多来源获得，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞(例如，T细胞)可以使用技术人员已知的任何种类的技术(如FicollTM分离)从受试者采集的血液成分中获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且任选地，以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选实施方案中，洗涤液缺少钙并且可以缺少镁或可以缺少许多(若非全部)二价阳离子。
在钙不存在情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将轻易领会，可以通过本领域技术人员已知的方法，如根据制造商说明通过使用半自动化“通流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics CellSaver 5)，完成洗涤步骤。在洗涤后，细胞可以重悬于多种生物相容缓冲液中，如，例如，无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A或含有或没有缓冲剂的其他盐水溶液。备选地，可以移除单采样品的不想要组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一个方面，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞，例如，通过经PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离T细胞。
本文所述的方法可以例如包括例如使用(例如，本文所述的)负选择技术，选择特定免疫效应细胞(例如，T细胞)亚群，所述亚群是调节性T细胞耗尽的群体、 CD25+耗尽的细胞。优选地，调节性T细胞耗尽的细胞群体含有少于30％、25％、 20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，抗CD25 抗体或其片段或CD25-结合配体与基材(例如，珠)缀合、或否则包被在基材(例如，珠)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的基材缀合。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗尽试剂从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞对CD25耗尽试剂的比率是1e7个细胞对20uL、或1e7个细胞对15uL、或1e7个细胞对10uL、或1e7个细胞对5uL、或1e7个细胞对2.5uL、或1e7个细胞对1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于耗尽调节性T细胞，例如，CD25+而言，使用大于 500百万个细胞/ml。在又一个方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml 的细胞浓度。
在一个实施方案中，待耗尽的免疫效应细胞群体包括约6x 109个CD25+T 细胞。在其他方面，待耗尽的免疫效应细胞群体包含约1x 109个至1x 1010个 CD25+T细胞和二者之间任何整数值的CD25+T细胞。在一个实施方案中，所产生的调节性T细胞耗尽群体具有2x109个调节性T细胞，例如，CD25+细胞、或更少(例如，1x 109、5x 108、1x 108、5x 107、1x 107个或更少CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用使用具有耗尽管路套件，例如，管路162-01的 CliniMAC系统，从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在耗尽设定(如，例如，DEPLETION2.1)上运行。
不希望受具体理论约束，在单采血液成分术之前或在产生表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的负向调节物水平(例如，减少不想要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数目)可以降低受试者复发风险。例如，耗尽TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR 抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗尽、及其组合。
在一些实施方案中，生产方法包括在产生表达CAR的细胞之前(例如，耗尽)减少TREG细胞的数目。例如，生产方法包括使与样品(例如，单采样品)与抗 GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25-结合配体)接触，例如，以在产生表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品之前耗尽TREG细胞。
在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用减少TREG细胞的一种或多种疗法预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用以下一种或多种：环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合中一者或多者可以在输注表达CAR的细胞产品之前、其期间或之后进行。
在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用环磷酰胺预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用抗GITR抗体预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。
在一个实施方案中，待移除的细胞群体既不是调节性T细胞，也不是肿瘤细胞，而是否则不利影响CART细胞的扩增和/或功能的细胞，例如，表达CD14、 CD11b、CD33、CD15或由潜在免疫阻抑性细胞表达的其他标记的细胞。在一个实施方案中，构思将这类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时、或在所述耗尽后或按另一个顺序移除。
本文所述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如，多于一个耗尽步骤。可以例如，用针对负向选择的细胞独有的表面标志物的抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包含针对CD14、CD20、CD11b、 CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
本文所述的方法还可以包括从表达肿瘤抗原(例如，不包括CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体移除细胞，旨在因而提供适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)的调节性T细胞耗尽(例如，CD25+耗尽的细胞和肿瘤抗原耗尽的细胞)的群体。在一个实施方案中，将表达肿瘤抗原的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同基材(例如，珠)，或抗CD25抗体或其片段或者抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至分立的珠，其混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
还提供这些方法，所述方法包括从群体移除表达检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一者或多者，因而提供调节性T细胞耗尽(例如，CD25+耗尽的细胞)和检查点抑制蛋白耗尽的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗尽的细胞)的群体。示例性检查点抑制蛋白包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、 TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、 TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施方案中，将表达检查点抑制蛋白的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠，或抗CD25抗体或其片段或者抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至分立的珠，其混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达检查点抑制蛋白的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
本文所述的方法可以包括正选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如，3x28)缀合的珠(如
Figure BDA0002395107430001081
M-450 CD3/CD28 T)温育一段足够正选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在又一个实施方案中，该时间段范围从30分钟至36小时或更长和二者之间的全部整数值。在又一个实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6 小时。在又一个实施方案中，该时间段是10至24小时，例如，24小时。较长的温育时间可以用来在其中如与其他细胞类型相比存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞 (TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率(如本文进一步所述那样)，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。额外地，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养伊始或在其他所需的时间点偏好地选择T细胞亚群。
在一个实施方案中，可以选择表达以下一者或多者的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔素、或其他适宜的分子，例如，其他细胞因子。可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法，确定用于筛选细胞表达的方法。
为了通过正向或负向选择分离所需的细胞群体，细胞的浓度和表面(例如，粒子如珠)可以变化。在某些方面，可能想要明显减少其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞浓度)以确保细胞和珠最大限度接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、或50亿/ml 的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用75、 80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25 亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T 细胞)、或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等) 中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗价值并且希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关方面，可能想要使用较低的细胞浓度。通过大幅度稀释T细胞和表面(例如，粒子如珠)的混合物，粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选出表达高量待与粒子结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的 CD28并且在稀释的浓度比CD8+T细胞被更高效地捕获。在一个方面，使用的细胞浓度是5x 106/ml。在其他方面，所用的浓度可以是约1x 105/ml至1x 106/ml 和其间的任何整数值。
在其他方面，可以将细胞在2-10℃或在室温在摇床上按不同的速度温育长度不同的时间。
待刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论约束，通过移除细胞群体中的粒细胞和一定程度移除单核细胞，冷冻和后续解冻步骤提供更均匀的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以悬浮于冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将用于这种环境下，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和 7.5％DMSO的培养基或例如含有Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的冻存细胞培养基，细胞随后以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸气相中。也可以使用其他受控冷冻方法，以及立即在-20℃或在液氮中不受控冷冻。
在某些方面，将冷冻的细胞如本文所述那样解冻和洗涤并允许在室温静置1 小时，之后使用本发明的方法激活。
在本发明背景下还构思了，在可能需要如本文所述的已扩增细胞时之前的某个时间段从受试者采集血液样品或单采产品。就这一点而论，待扩增的细胞来源可以在需要的任何时间点采集，并且所需的细胞(如T细胞)可以分离并冷冻供稍后用于将从免疫效应细胞疗法获益的任何种类的疾病或病状(如本文所述的那些)的免疫效应细胞疗法中。在一个方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者，所述受试者面临形成疾病的风险、但是尚未形成疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供稍后使用。在某些方面，可以将T细胞扩增、冷冻并在稍后时间使用。在某些方面，样品从诊断如本文所述的特定疾病后不久、但在任何治疗之前的患者采集。在又一个方面，在任何数目的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物分离细胞，所述的治疗模式包括但不限于药物治疗，如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒药、化疗、辐射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和FK506、抗体、或其他免疫清除剂如CAMPATH、抗 CD3抗体、环磷氮芥、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和照射。
在本发明的又一个方面，在留给受试者有功能的T细胞的治疗后马上从患者获得T细胞。在这个方面，已经观察到在某些癌症治疗、尤其用损伤免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久于患者正常情况下将从治疗中恢复的时间期间，获得的T细胞的质量可能就其离体扩增能力而言最佳或改善。同样地，在使用本文所述的方法离体操作后，这些细胞可以处于移植和体内扩增增强的优选状态。因此，在本发明背景范围内构思了，在这个恢复期期间采集血细胞，包括 T细胞、树状细胞或造血谱系的其他细胞。另外，在某些方面，动员(例如，用 GM-CSF动员)和条件化方案可以用来在受试者中产生这样的条件，其中有利于特定细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩增，特别在治疗后的限定时间窗口期间有利。示意性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树状细胞和免疫系统的其他细胞。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞从已经接受免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂的受试者获得。在一个实施方案中，在足够时间的mTOR抑制剂后或在充分给予免疫增强性低剂量的 mTOR抑制剂后收获待工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体(例如，T细胞)，从而受试者中的或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少瞬时增加。
在其他实施方案中，可以通过与下述量的mTOR抑制剂接触，离体处理已经工程化或将会工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，所述量增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)数目或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
在一个实施方案中，T细胞群体是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK缺陷性细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。可以通过遗传方法产生DGK缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止DGK表达的 RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理，产生DGK缺陷性细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷性细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞。可以通过遗传方法产生Ikaros缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止Ikaros表达的RNA 干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺)处理，产生Ikaros缺陷性细胞。
在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷的和Ikaros缺陷的，例如，不表达DGK和Ikaros、或具有减少或抑制的DGK活性和Ikaros活性。这类DGK 和Ikaros缺陷性细胞可以通过本文所述任何方法产生。
在一个实施方案中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异体CAR
在本文所述的实施方案中、免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II 类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如如此工程化，从而它不在其表面上表达任何功能性TCR，如此工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基，或如此工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。备选地， T细胞可以表达实质上受损的TCR，例如，通过表达突变或截短形式的一个或多个TCR亚基。术语“实质上受损的TCR”意指这种TCR将不在宿主中激发不良免疫反应。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性 HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。
在一些实施方案中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA，例如， HLA I类和/或HLA II类。
可以通过任何合适的手段(包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基)，获得缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是例如因本文所述的任何方法而不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如，可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力的细胞。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、 BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。对抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平抑制)可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如， siRNA或shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如，如本文所述。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施方案中，可以在T细胞中使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA抑制TCR表达和/或HLA表达。
可以使用任何常规表达系统(例如，如慢病毒表达系统)实现在T细胞中表达siRNA和shRNA。
下调TCR的组分表达的示例性shRNA例如在美国公开号2012/0321667中描述。下调HLA I类基因和/或HLA II类基因表达的示例性siRNA和shRNA 例如在美国公开号US 2007/0036773中描述。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用的“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制 TCR和/或HLA的CRISPR”指一组成簇规律间隔的短回文重复序列或一个包括这种重复序列组的系统。如本文所用，“Cas”指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统指衍生自CRISPR和Cas的系统，所述系统可以用来沉默或突变TCR和/或HLA基因。
在大约40％测序的真细菌基因组和90％测序的古细菌中找到了天然存在的CRISPR/Cas系统。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8:172。这种系统是一个类型的原核免疫系统，其赋予对外来基因元件如质粒和噬菌体的抵抗性并提供一种形式的获得免疫力。Barrangou等人(2007)Science 315:1709-1712； Marragini等人(2008)Science322:1843-1845。
已经修饰CRISPR/Cas系统用于真核生物如小鼠或灵长类中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature 482:331-8。通过向真核细胞引入含有特别设计的CRISPR和一个或多个适宜Cas的质粒，实现这一点。
CRISPR序列，有时称作CRISPR基因座，包含交替的重复序列和间隔序列。在天然存在的CRISPR中，间隔序列通常包含相对于细菌为外来的序列如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas系统中，间隔序列衍生自 TCR或HLA基因序列。
来自CRISPR基因座的RNA组成型表达并由Cas蛋白加工成小RNA。这些小RNA包括旁侧分布有重复序列的间隔序列。RNA引导其他Cas蛋白在 RNA或DNA水平沉默外源性基因元件。Horvath等人(2010)Science 327: 167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct 1:7。间隔序列因此充当RNA 分子的模板，类似于siRNA。Pennisi(2013)Science 341:833-836。
由于这些间隔序列天然出现在许多不同类型的细菌中，CRISPR的确切布局和Cas基因及产物的结构、功能和数目或多或少地在物种之间不同。Haft等人(2005)PLoSComput.Biol.1:e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.8:R61； Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.60:174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.151: 2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.151:653-663；and Stern等人(2010) Trends.Genet.28:335-340。例如，Cse(Cas亚型，大肠杆菌)蛋白(例如，CasA) 形成将CRISPR RNA转录物加工成Cascade保留的间隔序列-重复单元的功能复合体Cascade。Brouns等人(2008)Science 321:960-964。在其他原核生物中， Cas6加工CRISPR转录物。在大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1或Cas2。激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与识别并切割互补靶RNA的小 CRISPR RNA形成功能性复合体。更简单的CRISPR系统依赖于Cas9蛋白，所述蛋白是具有两个活性切割位点(双螺旋的每条链各一个)的核酸酶。Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA组合可以用于编辑基因的系统中。Pennisi(2013) Science 341:833-836。
CRISPR/Cas系统因此可以用来编辑TCR和/或HLA基因(添加或缺失碱基对)、或导入过早停止，这因此减少TCR和/或HLA的表达。CRISPR/Cas系统可以备选地如同RNA干扰那样使用，以可逆方式关闭TCR和/或HLA基因。在哺乳动物细胞中，例如，RNA可以引导Cas蛋白质至TCR和/或HLA启动子上，在空间上阻断RNA聚合酶。
使用本领域已知的技术，可以生成抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas 系统，例如，美国公开号20140068797和Cong(2013)Science 339:819-823中描述的那种。也可以生成本领域已知的抑制TCR和/或HLA的其他人工 CRISPR/Cas系统，例如，在Tsai(2014)Nature Biotechnol.,32:6 569-576；美国专利号8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945和8,697,359中描述的那种。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的 TALEN”指转录激活物样效应核酸酶，一种可以用来编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
通过TAL效应子DNA结合结构域融合于DNA切割结构域，人工产生 TALEN。转录激活物样效应(TALEs)可以经工程化以结合任何目的DNA序列，包括HLA或TCR基因的一部分。通过工程化的TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何目的DNA序列(包括HLA或TCR序列)特异的限制性酶。随后可以将这些酶引入细胞中，在那里，它们可以用于基因组编辑。Boch(2011) Nature Biotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou 等人(2009)Science 326:3501。
TALE是黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的高度保守的33-34氨基酸序列，第12和第13氨基酸例外。这两个位置高度可变，显示与特异性核苷酸识别的强相关性。它们因此可以经工程化以结合目的DNA序列。
为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，所述核酸酶是野生型或突变型FokI核酸内切酶。已经对FokI产生几种突变以便其用于TALEN中；这些突变例如改善切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39: e82；Miller等人(2011)NatureBiotech.29:143-8；Hockemeyer等人(2011) Nature Biotech.29:731-734；Wood等人(2011)Science 333:307；Doyon等人 (2010)Nature Methods 8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.25: 786-793；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.200:96。
FokI结构域作为二聚体发挥作用，因而需要取向和间距正确的对靶基因组中位点具有独特DNA结合结构域的两个构建体。TALE DNA结合结构域和 FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个独立TALEN结合位点之间的碱基数目似乎均是实现高水平活性的重要参数。Miller等人,(2011)Nature Biotech. 29:143-8。
HLA或TCR TALEN可以在细胞内部使用以产生双链断口(DSB)。如果修复机制借助非同源末端接合不当地修复断口，则可以在断口位点处引入突变。例如，不当修复可以引入移码突变。备选地，可以将外来DNA随TALEN一起引入细胞中；取决于外来DNA的序列和染色体序列，这种方法可以用来纠正 HLA或TCR基因中的缺陷或向wt HLA或TCR基因中引入这种缺陷，因此减少HLA或TCR的表达。
可以使用本领域已知的任何方法(包括使用模块化组件的多种方案)，构建对 HLA或TCR中的序列特异的TALEN。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29: 149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:e19509。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/ 或TCR的ZFN”指锌指核酸酶，一种可以用来编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
如同TALEN，ZFN包含与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll 等人(2011)GeneticsSociety of America 188:773-782；和Kim等人(1996)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160。
锌指是由一个或多个锌离子稳定化的小蛋白结构性基序。锌指可以例如包含Cys2His2，并且可以识别大约3bp序列。可以组合特异性已知的多种锌指以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指状物多肽。各种选择和模块化装配技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交法和双杂交系统和哺乳动物细胞。
如同TALEN，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN以靶向非回文性DNA位点。两个独立ZFN必须结合DNA的对侧链，其核酸酶恰当地间隔分开。Bitinaite等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5。
还如同TALEN，ZFN可以在DNA中产生双链断口，后者若如果不当地修复则可以产生移码突变、导致细胞中HLA和/或TCR的表达和量减少。ZFN 也可以随同源重组一起用于在HLA或TCR基因中突变。
可以使用本领域已知的任何方法，构建对HLA和/或TCR中的序列特异的ZFN。参见，例如，Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；和Guo等人 (2010)J.Mol.Biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开 2012/0060230。
端粒酶表达
尽管不希望受任何具体理论约束，在一些实施方案中，治疗性T细胞在患者中具有短期留存，原因在于T细胞中缩短的端粒；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者中的持久性。参见Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT) 的催化性亚基。在一些方面，本公开提供一种产生表达CAR的细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基)的核酸接触。细胞可以在接触编码CAR的构建体之前、与之同时或之后与核酸接触。
在一个方面，本公开以一种产生免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞) 群体的方法为特征。在一个实施方案中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如， T细胞或NK细胞)群体、使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸接触；并且使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸在允许CAR和端粒酶表达的条件下接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在一个实施方案中，hTERT具有GenBank蛋白质ID AAC51724.1的如下氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,IsUp-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell第90卷，第4期，1997年8月22日，第785–795页)：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVP WDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSV RSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQL GAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRP RRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSV GRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLV ETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTP AAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGS RHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEI LAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLREL SEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFS VLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQD RLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQET SPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCY GDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVN FPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAG RNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWK NPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVT YVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ ID NO:131)
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO:131的序列至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。在一个实施方案中， hTERT具有SEQ ID NO:131的序列。在一个实施方案中，hTERT在N末端、 C末端或这两者处包含缺失(例如，不多于5、10、15、20或30个氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或这两者处包含转基因氨基酸序列(例如，不多于5、10、15、20或30个氨基酸的转基因氨基酸序列)。
在一个实施方案中，hTERT由如下的GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,IsUp-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell第90卷，第4期，1997年8月22日，第785–795页)：
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaaggagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcggaggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcaggttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttgggaaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcggtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggcccccgaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccctggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctggggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctggggaagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgcttggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgaggagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcaggtctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaagagtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctgcgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacgtccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactacgtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtgaaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcctctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgggcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgacaccatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacgtactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggccttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggctcacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctgaatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtgcgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctccacgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcggcgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacccacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtgaacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggcttttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccggaccctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctcaccttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttgcggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgcaccaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcagctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgacacggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggccaagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattcctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggacagcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgcagccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccacagccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagggaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttggccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtccagccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcggctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacataggaatagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccacccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtgaccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggtcaaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttgaaaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa(SEQ ID NO:132)
在一个实施方案中，hTERT由下述核酸编码，所述核酸具有与SEQ ID NO: 132的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。在一个实施方案中，hTERT由SEQ ID NO:132的核酸编码。
免疫效应细胞(例如，T细胞)的活化和扩增
可以通常使用如在例如以下文献中所述的方法，活化和扩增免疫效应细胞如T细胞：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358； 6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843； 5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
离体扩增造血干细胞和祖先细胞的方法在通过引用方式并入本文的美国专利号5,199,942中描述，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此，本发明不限于离体扩增细胞的任何具体方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增可以包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体采集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖先细胞；和(2)离体扩增这类细胞。除美国专利号 5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit 配体可以用于细胞的培养和扩增。
通常，可以通过接触于下述表面扩增免疫效应细胞(例如，T调节性细胞耗尽的细胞)群体，所述表面已经与刺激CD3/TCR复合物相关的信号的物质和刺激T细胞表面上共刺激分子的配体连接。特别地，可以如本文所述那样，如通过接触于固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体，或通过接触于蛋白激酶C激活物(例如，草苔虫内酯)连同钙离子载体，刺激T细胞群体。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如， T细胞群体可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞增殖，可以使用抗CD3抗体和抗 CD28抗体。抗CD28抗体的例子包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,
Figure BDA0002395107430001211
France)，可以如本领域共知的其他方法可能那样使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999； Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，T细胞的初级刺激性信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例如，提供每种信号的物质可以处于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，物质可以与相同表面(即，处于“顺式”形式)偶联或与分立的表面偶联(即，处于“反式”形式)。备选地，一个物质可以与表面偶联并且另一种物质处于溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的物质与细胞表面结合并且提供初级激活信号的物质处于溶液中或与表面偶联。在某些方面，两种化学物质均可以处于溶液中。在一个方面，物质可以处于可溶性形式，并且随后交联至表面，如表达将会与该物质结合的Fc受体或抗体或其他结合物的细胞。在这个方面，关于在本发明中构思用于活化和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810。
在一个方面，两种物质固定在珠上，它们固定在相同的珠上、即，“顺式”，或固定在分别的珠上、即，“反式”。例如，提供初级活化信号的物质是抗CD3 抗体或其抗原结合片段并且提供共刺激信号的物质是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种物质均以等同的分子数量共同固定至相同珠上。在一个方面，对于CD4+T细胞扩增和T细胞生长，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率。在本发明的某些方面，如此使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，从而如与使用比率1:1时观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增增加。在一个特定方面中，如与使用比率1:1时观察到的扩增相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率是从100:1至1:100和其间的全部整数值。在一个方面，比抗CD3抗体更多的抗CD28抗体与粒子结合、即， CD3:CD28的比率小于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体对抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定的方面中，使用1:100与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:75与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在又一个方面，使用1:50与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:30与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个优选的方面，使用1:10与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:3与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在又一个方面，使用3:1与珠结合的CD3:CD28抗体比率。
粒子对细胞比率1:500至500:1和其间任何整数值可以用来刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以轻易地领会，粒子对细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小规格珠仅可能结合一些细胞，而较大的珠可能结合许多细胞。在某些方面，细胞对粒子的比率范围从1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在其他方面中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值、也可以用来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3偶联粒子和抗CD28 偶联粒子对T细胞的比率可以如上文所示变动，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、 2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率是每个 T细胞至少1:1粒子。在一个方面，使用1:1或更小的粒子对细胞比率。在一个特定方面，优选的粒子:细胞比率是1:5。在其他方面，粒子:细胞比率可以根据刺激的日期变动。例如，在一个方面，粒子:细胞比率在第1天是1:1至10:1，并且此后每日或每隔1日添加额外粒子至细胞持续至多10天，按1:1至1:10的最终比率(基于添加日时的细胞计数)添加。在一个特定方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是1:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:5。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:5。在一个方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是2:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:10。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:10。本领域技术人员将理解，多种其他比率可以在本发明中适用。特别地，比率将根据粒度和细胞尺寸和类型变动。在一个方面，使用的最常见比率是在第1天接近1:1、2:1和3:1。
在其他方面，细胞(如T细胞)与物质包被的珠组合，随后分离珠和细胞，并且随后培养细胞。在备选的方面，在培养之前，不分离物质包被的珠和细胞，而是在一起培养。在又一个方面，首先通过应用某种力(如磁力)浓缩珠和细胞、导致细胞表面标志物的连接增加，因而诱导细胞刺激作用。
例如，可以通过使得与抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞，连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104个至109个T细胞)和珠(例如，
Figure BDA0002395107430001241
M-450 CD3/CD28 T顺磁珠按比率1:1)在缓冲液例如PBS(不含二价阳离子如钙和镁)中合并。再次，本领域普通技术人员可以轻易地领会，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少并仅占样品的0.01％或整个样品(即，100％)可能包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目均属于本发明的情景范围内。在某些方面，可能想要明显减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)以确保细胞和粒子最大限度接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、 50亿/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。在某些方面，这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，扩增用编码CAR(例如，本文所述的CAR)的核酸转导的细胞，例如，通过本文所述的方法扩增。在一个实施方案中，将细胞在培养下扩增几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约 14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方案中，将细胞扩增4至9天时间。在一个实施方案中，将细胞扩增8天或更短(例如，7、6或5天)时间。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)在培养下扩增5天并且所产生的细胞比相同培养条件下培养扩增9天的相同细胞更有效力。效力可以例如由多种T细胞功能例如增殖、靶细胞杀伤作用、细胞因子产生、活化、移行、或其组合定义。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩增9天的相同细胞相比，在培养下扩增5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少1、2、3或4倍。在一个实施方案中，将表达本文所述的CD19 CAR的细胞在培养下扩增5天，并且与相同培养条件下培养扩增9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的促炎细胞因子产量，例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF 水平。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩增9天的相同细胞相比，在培养下扩增5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示以pg/ml计的促炎细胞因子产量(例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平)增长至少1、2、3、 4、5、10倍或更多。
也可能需要几轮刺激，从而T细胞培养时间可以是60天或更长。适于T 细胞培养的条件包括适宜的培养基(例如，极限基本培养基或RPMI培养基1640 或、X-vivo15、(Lonza))，所述培养基可以含有增殖和生存力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、 GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加物。用于细胞生长的其他添加物包括但不限于表面活性剂、血浆和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、 AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo20、Optimizer，连同添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有足以生长和扩增T细胞的适宜量的血清(或血浆)或定义的成组激素和/或某种量的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素仅包含于实验性培养物中，不包含于待输注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，适宜的温度(例如，37℃)和环境(例如，空气外加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在适宜的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩增，所述培养基包括导致细胞在14天扩增时间内增加至少200倍(例如，200倍、 250倍、300倍、350倍)(例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量) 的一种或多种白介素。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15 和IL-7)存在下扩增。
在实施方案中，本文所述的方法(例如，生产表达CAR的细胞的方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2，从细胞群体移除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。本文中描述了从细胞群体移除调节性T细胞(例如，CD25+T细胞)的方法。在实施方案中，方法(例如，生产方法)还包括：使细胞群体(例如，其中调节性T细胞(如CD25+T细胞)已经耗尽的细胞群体；或先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体)与IL-15 和/或IL-7接触。例如，将细胞群体(例如，先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一些实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与组合物在产生表达CAR 的细胞期间(例如，离体)接触，所述组合物包含白介素-1(IL-15)多肽、白介素-1 受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)的组合。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的表达CAR 的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者组合的组合物在产生表达CAR 的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者的组合物在离体扩增期间接触。在一个实施方案中，接触过程导致淋巴细胞亚群(例如，CD8+T细胞) 存活和增殖。
已经暴露于变动的刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，常见的血液或单采外周血单个核细胞产物具有比细胞毒T细胞或阻抑T细胞群体 (TC、CD8+)更大的辅助T细胞群体(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生了约第8-9天之前优势包含TH细胞的T细胞群体，而约第8-9天之后，T细胞群体包含日益更大的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注优势包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离TC细胞的抗原特异性亚群，可能有益的是更大程度地扩增这个亚群。
另外，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物也显著地变动，但是在细胞扩增过程期间大多可重复地变动。因此，这种重现性使得为特定目的而调整活化的T细胞产物的能力成为可能。
在其他实施方案中，本文公开的产生方法还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。
在一些实施方案中，在CAR细胞生产过程期间添加激酶抑制剂(例如，BTK 抑制剂如依鲁替尼)。根据本文中的非限制性理论，激酶抑制剂可以改善产生的细胞群体的质量。例如，表达CAR的细胞经常从癌症患者的自身血浆单采样品产生，所述样品可能含有癌细胞，并且激酶抑制剂可以改变这些癌细胞(例如，表达BTK的癌症如CLL或MCL)中的信号传导，例如，减少其增殖或增加凋亡水平。作为另一个例子，激酶抑制剂可以改变表达CAR的细胞(或在表达CAR 前的免疫效应细胞)中的信号传导，例如，通过抑制T细胞中的ITK来改变。激酶抑制剂可以使T细胞的平衡从TH2细胞偏向TH1细胞。
激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)可以按足以抑制其靶(例如， BTK)的水平添加至反应混合物。在一些实施方案中，激酶抑制剂(例如，BTK 抑制剂如依鲁替尼)按约0.1-0.2、0.2-0.5、0.5-1、1-2、2-5、或5-10μM的浓度添加。在一些实施方案中，激酶抑制剂是共价性抑制剂(如依鲁替尼)并且短促脉冲足以不可逆地失活靶，同时避免非特异性毒性。因此，可以将激酶抑制剂添加例如10-20、20-30、30-40、40-60或60-120分钟。例如，如果激酶抑制剂具有非共价作用模式，也可以将激酶抑制剂添加较长的时间段。因此，可以将激酶抑制剂添加例如持续2-4、4-6、6-8、8-12、12-18、或18-24小时、或持续1-2、 2-3、3-4、4-6、6-8、8-10天、或持续正在培养细胞的时间整个长度。可以将激酶抑制剂在生产过程期间的多个时间点添加，例如，在收获细胞后、在用珠刺激前、在用珠刺激后、在转导前、在转导后、或在施用细胞至患者前。在一些实施方案中，将激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)在收获细胞后或在例如用珠刺激前添加。在这种情况下，在之前和之后，可以指，例如，之前或之后约1、5、15、30、45或60分钟、或之前或之后1、2、3、4、5或6小时。
一旦CD19 CAR构建，则多种测定法可以用来评价分子的活性，如但不限于抗原刺激后扩增T细胞的能力、在再次刺激不存在的情况下维持T细胞扩增的能力和适宜的体外模型和动物模型中的抗癌活性。下文进一步详细描述评价 CD19 CAR的作用的测定法。
原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可以用来检测单体和二聚体的存在。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。非常简要地，将表达CAR的T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞的1:1混合物) 在体外扩增多于10天，随后裂解和在还原条件下进行SDS-PAGE。使用针对 TCR-ζ链的抗体，通过蛋白质印迹法检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源 TCR-ζ链的CAR。相同T细胞亚群用于非还原性条件下的SDS-PAGE分析以允许评价共价二聚体形成。
可以通过流式细胞术测量在抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如， CD4+T细胞和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28珠刺激，随后用在待分析的启动子控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在培养第6日通过流式细胞术评价CD4+和/或CD8+T细胞亚群中的GFP荧光。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，CD4+T细胞和CD8+T细胞的混合物在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并且使用双顺反子慢病毒载体在第1天用CAR转导，其中所述双顺反子慢病毒载体使用2A核糖体跳跃序列表达CAR连同eGFP。在洗涤后，将培养物用 CD19+K562细胞(K562-CD19)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32 和4-1BBL的K562细胞在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在下再刺激。每隔1日按100IU/ml添加外源IL-2至培养物。使用基于珠的计数法，通过流式细胞术计数GFP+T细胞。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在再次刺激不存在的情况下维持的CAR+T细胞扩增。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并在第1天用所示CAR转导后，在培养第8天使用库尔特粒度分析仪粒子计数器Nexcelom Cellometer Vision或 Millipore Scepter测量平均T细胞量(fl)。
动物模型也可以用来测量CART活性。例如，可以使用在免疫缺陷性小鼠中利用人CD19特异性CAR+T细胞处理原代人前B ALL的异种移植模型。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。非常简短地，在建立ALL后，将小鼠随机分配至治疗组。将不同数目的αCD19-ζ工程化 T细胞和αCD19-BB-ζ工程化T细胞按1:1比率共注射至携带B-ALL的 NOD-SCID-γ-/-小鼠中。在注射T细胞后的各种时间评价来自小鼠的脾DNA中αCD19-ζ载体和αCD19-BB-ζ载体的拷贝数。按每周一次间隔评估动物的白血病。在用αCD19-ζCAR+T细胞或模拟转导的T细胞注射的小鼠中测量外周血 CD19+B-ALL母细胞计数。使用对数秩检验，比较各组的生存曲线。此外，也可以分析NOD-SCID-γ-/-小鼠中注射T细胞后4周的外周血CD4+T细胞绝对计数和CD8+T细胞绝对计数。将小鼠用白血病细胞注射并且3周后，用经工程化以通过双顺反子慢病毒载体表达CAR的T细胞注射，所述双顺反子慢病毒载体编码与eGFP连接的CAR。通过注射之前与模拟转导的细胞混合，将T细胞对45–50％输入的GFP+T细胞归一化，并且通过流式细胞术证实。按1周间隔评估动物的白血病。使用对数秩检验，比较各CAR+T细胞组的生存曲线。
可以评价剂量依赖性CAR治疗应答。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21日用CAR T细胞、等同数目的模拟转导的T细胞或不用T细胞注射的小鼠中建立白血病后35–70天，获得外周血。来自每个组的小鼠随机采血以测定外周血CD19+ALL母细胞计数并且随后在第35和第49日杀死。在第57和第70天评价剩余动物。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如，在Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)处描述。简而言之，在微量滴定板中通过将洗涤的T细胞与表达CD19(K19)的K562细胞或表达CD32和CD137 的K562细胞(KT32-BBL)按T细胞:K562最终比率2:1混合，评估CAR介导的增殖。K562细胞在使用之前用γ-辐射照射。将抗CD3(克隆OKT3)单克隆抗体和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至培养物，以KT32-BBL细胞充当刺激T 细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持CD8+T细胞离体长期扩增。如制造商所描述那样使用CountBrightTM荧光珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)和流式细胞术，计数培养物中的T细胞。使用T细胞依据GFP表达鉴定CAR+T细胞，其中使用的所述T细胞用表达eGFP-2A连接的CAR的慢病毒载体工程化。对于不表达GFP的CAR+T细胞，用生物素酰化的重组CD19蛋白和第二亲和素-PE 缀合物检测CAR+T细胞。还同时用特异性单克隆抗体(BDBiosciences)检测T 细胞上的CD4+表达和CD8+表达。使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA)根据制造商的说明，对再次刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光并且根据制造商的说明分析数据。
细胞毒性可以由标准51Cr-释放测定法评估。参见，例如，Milone等人, MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，将靶细胞(K562系和原代前B-ALL细胞)在37℃用51Cr(作为NaCrO4，New England Nuclear,Boston, MA)加载2小时伴以频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤2次并铺种至微量滴定板中。在孔中，将效应T细胞与靶细胞在完全RPMI中按不同的效应细胞:靶细胞比率(E:T)混合。还制备仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100去垢剂溶液(总释放，TR)的额外孔在37℃温育4小时后，从每个孔收获上清液。随后使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)测量释放的51C。每条件按至少三次重复进行并且使用下式计算裂解百分数：裂解％＝(ER-SR)/(TR–SR)，其中ER代表每种实验条件的51Cr平均释放。
成像技术可以用来评价携瘤动物模型中CAR的特异性转运和增殖。已经描述此类测定法，例如，在Barrett等人,Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011) 中描述。简而言之，将NOD/SCID/γc–/–(NSG)小鼠用Nalm-6细胞静脉内注射， 7天后，用CAR构建体电穿孔后4小时，用T细胞静脉内注射。T细胞用表达萤火虫萤光素酶的慢病毒构建体稳定转染并且对小鼠的生物发光成像。备选地，可以如下测量Nalm-6异种移植模型中单次注射CAR+T细胞的治疗功效和特异性：NSG小鼠用经转导以稳定表达萤火虫萤光素酶的Nalm-6注射，7天后，随后单次尾静脉注射以CD19 CAR电穿孔的T细胞。在注射后的各种时间点对动物成像。例如，可以在第5日(处理前2天)和第8日(CAR+PBL后24小时)是生成代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性白血病的光子密度热图。
其他测定法，包括在本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些，也可以用来评价本发明的CD19 CAR构建体。
激酶抑制剂
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂(例如，本文所述的CDK4 抑制剂，例如，CDK4/6抑制剂，如，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作帕布昔利布或 PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂，如，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR 抑制剂，例如，本文所述的mTOR抑制剂，如，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以例如是mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如，本文所述的MNK抑制剂，如，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以例如是 MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基 -1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮、盐酸盐 (P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine (CYC202)；帕布昔利布(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
Figure BDA0002395107430001311
唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6- 二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)； 5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺 (AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺 (AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)和XL281(BMS908662)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，帕布昔利布(PD0332991)，并且帕布昔利布以约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90 mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，在28天周期中每日施用14-21天，或在21天周期中每日施用7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的帕布昔利布。
示例性CDK4/6抑制剂是下文显示其结构的LEE011(也称作ribociclib)。
Figure BDA0002395107430001321
不受理论约束，认为联合CDK4/6抑制剂(例如，本文所述的LEE011或其他CDK4/6抑制剂)施用本文所述的表达CAR的细胞可以实现更高的应答性，例如，应答率更高和/或复发率更低，例如，与单一CDK4/6抑制剂相比。
尽管不希望受理论约束，在一些实施方案中，CDK4/6抑制剂起到降低癌细胞(例如，MCL细胞)中细胞周期蛋白D1活性的作用。一些癌细胞以易位所致的细胞周期蛋白D1水平升高为特征。CDK4与细胞周期蛋白D复合以促进细胞周期推进。因此，在一些实施方案中，CK4/6抑制剂的施用减少癌细胞增殖。参见，例如，Marzec等人,“Mantle cell lymphomacells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive toselective inhibition of CDK4 kinase activity.”Blood.2006 Sep 1；108(5):1744-50.Epub 2006年5月11日。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼 (PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292； ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个实施方案中，BTK抑制剂不减少或不抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486； CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼 (PCI-32765)，并且依鲁替尼以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、 440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在实施方案中，将BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)是施用至患有CLL、套细胞淋巴瘤(MCL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)的受试者。例如，对其施用BTK抑制剂的受试者的第17染色体短臂中具有缺失(del(17p)(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，对其施用BTK抑制剂的受试者不具有del(17p)。在实施方案中，对其施用BTK抑制剂的受试者患有复发的CLL或SLL，例如，先前已经向受试者施用过一种癌疗法(例如，先前施用过一次、两次、三次或四次既往癌疗法)。在实施方案中，对其施用BTK抑制剂的受试者患有难治性CLL或SLL。在其他实施方案中，对其施用BTK抑制剂的受试者患有滤泡淋巴瘤，例如，复发性或难治性滤泡淋巴瘤。
下文显示依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)的结构。
Figure BDA0002395107430001331
超过大约400nM的依鲁替尼浓度在临床上没有意义。在Advani等人(J Clin Oncol2012；31:88)的研究中，平均依鲁替尼血清峰浓度是约130ng/ml，其等同于295nM(基于依鲁替尼的分子量440.5)。因此，数据显示1uM浓度的依鲁替尼对T细胞的影响显著地超过体内有临床意义的浓度。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；地磷莫司((1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.04,9]三十七碳 -16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573 和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇 (AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基- 吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126)；和XL765。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg) 的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28 天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、 7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg) 的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺； ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如，本文所述的PI3K抑制剂，例如，吉利德(idelalisib)或duvelisib)和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与吉利德和利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与duvelisib和利妥昔单抗组合施用至受试者。吉利德(也称作GS-1101或 CAL-101；Gilead)是阻断PI3K的δ同工型的小分子。下文显示吉利德(5-氟-3- 苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)的结构。
Figure BDA0002395107430001351
Duvelisib是阻断PI3K-δ,γ的小分子。下文显示duvelisib的结构(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2H)-异喹啉酮)。
Figure BDA0002395107430001352
在实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有复发的CLL 或SLL，例如，先前已经向受试者施用过一种癌疗法(例如，先前施用过抗CD20 抗体或先前施用过依鲁替尼)。例如，受试者在第17染色体短臂中具有缺失 (del(17p)(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施方案中，受试者包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在实施方案中，受试者在第11染色体长臂中具有缺失(del(11q))。在其他实施方案中，受试者不具有del(11q)。在实施方案中，吉利德按以下剂量施用：约100-400mg(例如，100-125、125-150、150-175、175-200、 200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375、或375-400mg)，例如，BID施用。在实施方案中，duvelisib按以下剂量施用：约15-100mg(例如，约15-25、25-50、50-75、或75-100mg)，例如，一日2次施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、 425-450、450-475、或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和 mTOR双重抑制剂：2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1- 哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲 (PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H- 咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)； 2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺 (GSK2126458)；8-(6-甲氧基-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代 -9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹
Figure BDA0002395107430001361
啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合施用至受试者。示例性ALK激酶抑制剂包括但不限于克里唑替尼(Pfizer)、色瑞替尼(Novartis)、艾乐替尼(alectinib)(Chugai)、brigatinib(也称作AP26113； Ariad)、entrectinib(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(参见，例如，临床试验识别编号NCT02048488)、CEP-37440(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施方案中，受试者患有实体癌，例如，本文所述的实体癌，例如，肺癌。
克里唑替尼的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼的化学名称是5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基 -4-(4-哌啶基)苯基]-N4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾乐替尼的化学名称是9-乙基-6.6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈。brigatinib的化学名称是5-氯-N2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧苯基}-N4-[2-(二甲基氧磷基)苯基]-2,4-嘧啶。entrectinib的化学名称是 N-(5-(3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基) 氨基)苯甲酰胺。PF-06463922的化学名称是(10R)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基 -15-氧代-10,15,16,17-四氢-2H-8,4-(甲桥)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并
Figure BDA0002395107430001362
二氮杂十四(熳)环-3-甲腈。CEP-37440的化学结构是(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]环庚烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-N-甲基苯甲酰胺。X-396的化学名称是(R)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合施用至受试者。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解成犬尿氨酸的酶。许多癌过量表达IDO，例如，前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、颈部癌、胃癌、卵巢癌、头癌和肺癌。pDC、巨噬细胞和树状细胞(DC)可以表达IDO。不受理论约束，认为(例如，IDO催化)L-色氨酸减少通过诱导T细胞失能和凋亡而产生免疫抑制环境。因此，在不受理论约束的情况下，认为IDO抑制剂可以增强本文所述的表达CAR的细胞的效能，例如，通过减少对表达CAR的免疫细胞的抑制或其死亡。在实施方案中，受试者患有实体瘤，例如，本文所述的实体瘤，例如，前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。示例性IDO 抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸、indoximod(NewLinkGenetics)(参见，例如，临床试验识别号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(IncCorp.)(参见，例如，临床试验识别号NCT01604889；NCT01685255)
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与髓样衍生阻抑细胞(MDSC)的调节物组合施用至受试者。MDSC在许多实体瘤的周围及其肿瘤部位积累。这些细胞抑制T细胞应答，因而妨碍表达CAR的细胞疗法的效能。不受理论约束，认为施用MDSC调节物增强本文所述的表达CAR的细胞的效能。在一个实施方案中，受试者患有实体瘤，例如，本文所述的实体瘤，例如，胶质母细胞瘤。示例性MDSC调节物包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见，例如，临床试验识别号 NCT00757757。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见，例如，Pyonteck等人,Nat.Med.19(2013):1264-72。下文显示BLZ945的结构。
Figure BDA0002395107430001381
在一些实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂 (例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15 受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15(Admune Therapeutics,LLC))二者的组合施用至受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra 的异二聚体非共价复合物。hetIL-15例如在通过引用方式并入本文的美国 8,124,084、美国2012/0177598、美国2009/0082299、美国2012/0141413和美国 2011/0081311中描述。在实施方案中，皮下施用het-IL-15。在实施方案中，受试者患有癌症，例如，实体癌，例如，黑素瘤或结肠癌。在实施方案中，受试者患有转移性癌症。
治疗性应用
CD19相关疾病和/或病症
在一个方面，本发明提供用于治疗与CD19表达相关的疾病的方法。在一个方面，本发明提供用于治疗其中部分肿瘤为CD19阴性且部分肿瘤为CD19 阳性的疾病的方法。例如，本发明的CAR可用于治疗已经就与CD19表达增高相关的疾病而接受过治疗的受试者，其中已经就与CD19水平升高而接受过治疗的受试者显示出与CD19水平升高相关的疾病。
本文所述的疗法可以用来治疗例如响应于激酶抑制剂如依鲁替尼(例如，部分应答或完全应答)的受试者或没有这种响应的受试者(例如，非应答者或复发者)。不希望受理论约束，许多接受激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼) 治疗的患者可以显示出治疗应答降低(例如，是治疗的部分应答者或非应答者、或在治疗期间复发)。因此，与激酶抑制剂组合实施本文公开的CAR疗法可以产生有益作用。
下文描述用于这些受试者的示例性治疗方案。
在一些情况下，当受试者是激酶抑制剂(例如BTK抑制剂如依鲁替尼)的非应答者或复发者时，则停用激酶抑制剂并实施CAR疗法。在其他情况下，当受试者不响应于激酶抑制剂(例如BTK抑制剂如依鲁替尼)时，激酶抑制剂治疗继续并且向治疗方案增加CAR疗法。这种用途例如得到本文中实施例8中的实验支持，所述实验显示CAR治疗作为单药疗法在依鲁替尼耐药性细胞中有效。不希望受理论约束，继续激酶抑制剂治疗可以例如，通过增加血流中表达CAR的细胞数目，改善CAR疗法的有效性(参见本文中实施例8)。
不受理论约束，作为激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)的非应答者或复发者的受试者可以因至少两个理由而不响应：受试者可能在药物靶中具有阻止靶抑制作用的突变(例如，BTK，例如，C481S突变)、或可能在其他途径中具有甚至充分抑制靶时仍可以驱动增殖的改变(例如，PLCγ中的突变，如 PLCγ中导致组成型BTK非依赖性细胞信号传导的激活性突变)。可以根据无响应性的原因，改变治疗。例如，在第一种情况下(在一些实施方案中)，如果受试者具有(或经鉴定为具有)阻止激酶抑制剂抑制其靶的突变，则可以将第二激酶抑制剂(例如，针对相同靶)替换(或与之组合施用)该激酶抑制剂。更具体地，在其中该患者具有(或经鉴定为具有)阻止依鲁替尼抑制BTK的突变的一些实施方案中，则可以将第二BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂如GDC-0834、 RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774、或LFM-A13)替换依鲁替尼。不希望受理论约束，第二激酶抑制剂可以作用于未遭该突变破坏的靶区域并且因此受试者对第二激酶抑制剂敏感。在其他实施方案中，维持原初激酶抑制剂(例如BTK抑制剂如依鲁替尼)。根据本文的非限制性理论，原初激酶抑制剂可以对表达CAR的细胞具有有用的活性，例如，促进TH1表型、促进增殖或否则增加细胞水平或活性。
如上文所示，在一些情况下，受试者无响应，原因是受试者在另一个途径中具有甚至充分抑制靶时仍可以驱动增殖的改变(例如，突变)。因此，如果受试者具有(或是鉴定已经具有)在途径中造成激酶抑制剂活性无效的改变，则激酶抑制剂疗法可以维持。不希望受理论约束，激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)活性可以在癌细胞中促进有用的生物学变化，即便激酶抑制剂单独不足以减慢增殖。例如，激酶抑制剂可能足以动员癌细胞离开淋巴结，使它们更易受 CAR疗法伤害。
现在转到响应于激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)的受试者，现在描述各种治疗方案。在一些实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂的完全应答者时，在完全应答时间期间不向受试者施用CAR治疗。在其他实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂的完全应答者时，在完全应答时间期间向受试者施用CAR治疗。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。例如，依鲁替尼单药疗法治疗的MCL具有约17.5个月的中位应答持续期。
在一些实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)的部分应答者时，在部分应答时间期间不向受试者施用CAR疗法。在其他实施方案中，当受试者是(或经鉴定是)激酶抑制剂的部分应答者时，在部分应答时间期间向受试者施用CAR治疗。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现完全应答和/或应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
在一些实施方案中，当受试者在开始激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)治疗后具有(或经鉴定为具有)稳定病情时，在病情稳定时间期间不向受试者施用CAR疗法。在其他实施方案中，当受试者在开始激酶抑制剂治疗后具有 (或经鉴定为具有)稳定病情时，在病情稳定时间期间向受试者施用CAR疗法。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现部分应答、完全应答和/或应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
在一些实施方案中，当受试者在开始激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)治疗后具有(或经鉴定为具有)进展性病情时，在病情进展时间期间不向受试者施用CAR疗法。在其他实施方案中，当受试者在开始激酶抑制剂治疗后具有(或经鉴定为具有)进展性病情时，在病情进展时间期间向受试者施用CAR疗法。在一个实施方案中，在CAR疗法后，受试者出现病情稳定、部分应答、完全应答和/或应答延长或复发延迟(例如，与不用CAR疗法治疗时预计的病程相比)。
因此，可以在治疗前或期间进行一个或多个疾病评估步骤，以确定哪种疗程适于给定的患者。例如，可以向受试者施用激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)作为一线治疗药。随后，在一段时间(例如，1或2个月，以及2周、 3周、1个月、1.5个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、12个月、 15个月、或18个月)后，可以评估患者的反应。如果评估显示受试者是完全应答者，则在一些实施方案中不施用CAR疗法，例如，如上文所述。如果评估显示受试者是部分应答者或具有稳定病情，则在一些实施方案中，将CAR疗法与激酶抑制剂组合施用，例如，如上文所述。如果评估显示受试者是非应答者或复发者，则在一些实施方案中，将CAR疗法与该激酶抑制剂或第二激酶抑制剂组合施用，例如，如上文所述。在一些实施方案中，激酶抑制剂控制疾病，同时生产表达CAR的细胞，例如，同时患者自身的T细胞正在经工程化以表达 CAR和/或其他因子。
划分患者的应答者状态或复发者状态的临床标准是本领域已知的。作为一个例子，对于恶性淋巴瘤，标准化的应答标准在Cheson等人,J Clin Oncol 17:1244(1999)和Cheson等人,“Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”,J Clin Oncol25:579-586(2007)中描述(所述两份文献均通过引用的方式完整并入本文)。因此，在一些实施方案中，根据Cheson标准或改良 Cheson标准，将受试者认定为完全应答者、部分应答者、具有稳定病情、非应答者或复发者。用于分类其他血液学恶性肿瘤的标准是本领域已知的。
根据Cheson 2007的表2中的标准，完全应答者出现全部疾病迹象消失；部分应答者出现可度量病情的消退并且没有新部位；病情稳定的患者未能实现 CR/PR或PD；并且病情复发或病情进展的患者具有任何新病灶或或出现先前受累部位距最低点增加大于或等于50％。评估可以涉及确定疾病是否为嗜FDG 的、PET阳性或阴性的，是否存在结节，例如，是否在肝脏或脾中可触及以及是否骨髓被清除或显示累及。
可以施用CAR疗法和激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)，例如，同时或依次施用。在一些实施方案中，CAR疗法在与开始激酶抑制剂疗法基本上相同的时间启用。在一些实施方案中，CAR疗法在开始激酶抑制剂疗法之前开始。在一些实施方案中，CAR疗法在开始激酶抑制剂疗法之后启用。例如， CAR疗法可以在开始激酶抑制剂疗法之后例如至少1、2、3或4周、或1、2、 3、4、6、9、12、15、18或24个月启用。在一些实施方案中，在患者在其体内具有生理意义水平的激酶抑制剂的同时，CAR疗法启用。
当组合施用时，CAR疗法和激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)或这两者可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量。在某些实施方案中，CAR疗法、激酶抑制剂或这两者的施用量或剂量比单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，产生所需作用(例如，治疗癌症)的CAR治疗、激酶抑制剂或这两者的量或剂量比实现相同治疗作用所需要的单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
当组合施用时，CAR疗法和激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)或这两者可以按这样的持续时间施用，所述持续时间长于、短于或等于单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的持续时间。在某些实施方案中，施用CAR疗法、激酶抑制剂或这两者的持续时间比单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的持续时间短(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，产生所需作用(例如，治疗癌症)的施用CAR治疗、激酶抑制剂或这两者的持续时间比实现相同治疗作用所需要的单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的持续时间短(例如，短至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在一些实施方案中，向患者施用缩短疗程的激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)。例如，在施用CAR疗法后，缩短疗程的激酶抑制剂可以持续总计约 0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-15、15-18、18-21或21-24个月，或可以持续约0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-15、15-18、18-21或21-24个月。在实施方案中，缩短疗程的激酶抑制剂在复发前结束。在实施方案中，激酶抑制剂在缩短的疗程期间按正常(例如，单药疗法)水平施用。
在实施方案中，单次施用表达CAR的细胞包含约5x 108个CD19 CART 细胞。表达CAR的细胞的给药还可以包含约5x 106、1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x109、2x 109或5x 109个细胞，例如CD19 CAR 细胞，例如，CD19 CART细胞。
在一个方面，本发明涉及一种载体，所述载体包含与用于哺乳动物细胞(例如，T细胞)中表达的启动子有效连接的CD19 CAR。在一个方面，本发明提供表达CD19 CAR的重组细胞(例如，T细胞)用于治疗表达CD19的肿瘤，其中表达CD19 CAR的重组T细胞称作CD19CART。在一个方面，本文所述的CD19 CART能够使肿瘤细胞与至少一个在其表面上表达的CD19 CAR接触，从而 CART靶向肿瘤细胞并且抑制肿瘤的生长。
在一个方面，本发明涉及一种抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与本文所述的表达CD19 CAR的细胞(例如，CD19 CART细胞)接触，从而CART响应于抗原而激活并靶向癌细胞，其中抑制肿瘤的生长。表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞)与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合施用。
如本文所用，“组合”施用意指，在受试者罹患病症期间向受试者递送两种或更多种不同治疗，例如，在受试者已经诊断患有该病症后并且在该病症已经治愈或消除或治疗已经出于其他原因而停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始递送第二治疗时，一种治疗的递送仍然正在进行，从而就施用而言存在重叠。这有时在本文中称作“同时”或“同步递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在开始递送第二种治疗前结束。在任一种情况的一些实施方案中，治疗因为联合施用而更有效。例如，第二治疗是更有效的，例如，在第二治疗较少时观察到等同作用，或第二治疗减少症状到更大程度，大于如果第二治疗在第一治疗不存在时施用所见的程度、或采用第一治疗时观察到类似的情况。在一些实施方案中，如此递送，从而与该病症相关的症状或其他参数的减少大于一种治疗在另一种治疗不存在下递送情况下将会观察到的减少。两种治疗药的效果可以部分加合、完全加合或超过加合。递送可以是这样的，从而当递送第二治疗药时，仍然可检测第一治疗药的效果。在一个实施方案中，将表达CAR的细胞按本文所述的剂量和/或给药方案施用，并且激酶抑制剂或增强表达CAR的细胞活性的物质按本文所述的剂量和/或给药方案施用。
本发明包括一个类型的细胞疗法，其中T细胞经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)并且将CAR T细胞输注至有需求的受体。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。不同于抗体疗法，CAR修饰的T细胞能够在体内复制，产生可以导致持久肿瘤控制的长期留存。在多个方面中，在施用T细胞至患者后，向患者施用的T细胞或其后代在患者中留存至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、 16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2 年、3年、4年或5年。
本发明还包括一个类型的细胞疗法，其中T细胞经修饰(由体外转录的RNA 修饰)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并且将CAR T细胞输注至有需求的受体。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。因此，在多个方面，在施用T细胞至患者后，向患者施用的T细胞存在少于1个月，例如，3周、2周、1周。
不希望受任何具体理论约束，由CAR修饰的T细胞激发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答、或备选地可以归因直接与间接免疫应答。在一个方面，CAR转导的T细胞显示出响应于表达CD19的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和强力溶细胞活性，抵抗可溶性CD19抑制，介导旁观者杀伤作用并介导建立的人肿瘤消退。例如，在表达CD19的肿瘤的内部不均一视野内部抗原较少的肿瘤细胞可能易遭CD19重定向的T细胞的间接破坏，其中所述 CD19重定向的T细胞事先已经针对毗邻的抗原阳性癌细胞进行了应答。
在一个方面，本发明的全人CAR修饰的T细胞可以是一个类型在哺乳动物中用于离体免疫和/或体内治疗的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。
对于离体免疫，在施用细胞至哺乳动物之前在体外进行至少一种以下操作： i)扩增细胞、ii)引入编码CAR的核酸至细胞或iii)冷冻保存细胞。
离体程序是本领域熟知的并且在下文更充分地讨论。简而言之，将细胞从哺乳动物(例如，人)分离并用本文公开的表达CAR的载体进行基因修饰(即，在体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用至哺乳动物受者以提供治疗益处。哺乳动物受者可以是人并且CAR修饰的细胞可以相对于受者是自体的。备选地，细胞可以相对于受者是同种异体、同基因的或异种的。就离体免疫而言除使用基于细胞的疫苗之外，本文所述的方法中还包括用于体内免疫以激发患者中针对抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述的细胞活化和扩增可以用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本文所述的表达CAR的细胞用于治疗与表达CD19 相关的疾病、病症和病状。在某些方面，这些细胞用于治疗面临形成与表达CD19 相关的疾病、病症和病状的风险的患者。因此，本发明提供用于治疗或预防与表达CD19相关的疾病、病症和病状的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用治疗有效量的与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合的本文所述的表达CAR的细胞。
本发明还提供用于抑制表达CD19的细胞群体增殖或减少表达CD19的细胞群体的方法，所述方法包括：使包含表达CD19的细胞的细胞群体与结合至表达CD19的细胞的本文所述的抗CD19 CAR的细胞接触，并且使表达CD19 的细胞群体与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)接触。在一个具体方面，本发明提供用于抑制表达CD19的癌细胞群体增殖或减少表达CD19的癌细胞群体的方法，所述方法包括：使包含表达CD19的癌细胞群体与结合至表达CD19 的细胞的本文所述的抗CD19 CAR的细胞接触，并且使表达CD19的癌细胞与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)接触。在一个方面，本发明提供用于抑制表达CD19的癌细胞群体增殖或减少表达CD19的癌细胞群体的方法，所述方法包括：使包含表达CD19的癌细胞群体与结合至表达CD19的细胞的本文所述的抗CD19 CAR的细胞接触，并且使表达CD19的癌细胞与激酶抑制剂 (例如，本文所述的激酶抑制剂)接触。在某些方面，在患有与表达CD19的细胞相关的血液癌或另一种癌的受试者或前述癌的动物模型中，相对于阴性对照，本文所述的表达抗CD19 CAR的细胞和激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)的组合减少细胞和/或癌细的量、数目、数量或百分数至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达CD19的细胞相关的疾病(例如，表达CD19的血液癌或非典型癌)的方法，所述方法包括：向有需求的受试者施用与表达CD19的细胞结合的表达抗CD19 CAR的细胞并且施用激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)。在一个方面，受试者是人。与表达CD19的细胞相关的病症的非限制性例子包括自身免疫疾病(如狼疮)、炎性疾病(如变态反应和哮喘)和癌症(如表达CD19的血液癌或非典型癌)。
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达CD19的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：向有需求的受试者施用与表达CD19的细胞结合的本发明抗CD19 CART细胞。在一个方面，受试者是人。
本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达CD19的细胞相关的癌症复发的方法，所述方法包括：向有需求的受试者施用与表达CD19的细胞结合的本发明的表达抗CD19的细胞(如抗CD19 CART细胞)。在一个方面，该方法包括与有效量的另一种治疗组合向有需求的受试者施用有效量的本文所述的表达抗CD19的细胞(如抗CD19 CART细胞)，所述细胞与表达CD19的细胞结合。
在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者中的癌症的方法。该方法包括与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合向受试者施用本文所述的表达靶向B细胞(例如，T细胞或NK细胞)的CAR的细胞(例如，免疫效应细胞)，从而治疗受试者中的癌症。通过本文所述方法可治疗的癌症的例子是与表达B细胞抗原(例如，CD19)相关的癌症。在一个实施方案中，疾病是实体肿瘤或液体肿瘤。在一个实施方案中，疾病是血液癌。在一个实施方案中，血液癌是白血病。在一个实施方案中，例如，根据WHO分级，血液癌是成熟B细胞肿瘤。在一个实施方案中，血液癌是CD19+B淋巴细胞衍生的恶性肿瘤。在一个实施方案中，癌选自一种或多种急性白血病，所述急性白血病包括但不限于B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；额外的血液癌或血液学疾病，包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，T 细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤、CNS的原发性DLCB、原发性皮肤 DLBCL腿型或老年人的EBV+DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、滤泡淋巴瘤、儿科滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤(粘膜相关性淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、 Waldenstrom巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病(例如，不可分类性)、脾弥散性红髓小B细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病变种、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链病(例如，α重链病、γ重链病、或μ重链病)、浆细胞骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、结内边缘区淋巴瘤、儿科结内边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔的(它们)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关的多中心Castleman病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、不可分类的 B细胞淋巴瘤(例如，具有在DLBCL和Burkitt淋巴瘤之间或在DLBCL和经典何杰金淋巴瘤之间的特征)和“白血病前期”，其是依据髓样血细胞无效产生(或发育异常(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合，并且包括但不限于与表达B细胞抗原(例如，CD19)相关的疾病，包括但不限于表达B细胞抗原(例如， CD19)的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病；及其任意组合。
在一些实施方案中，癌症是何杰金淋巴瘤并且患者用表达CAR的细胞例如作为单药疗法或与一种或多种额外的治疗药组合治疗。在实施方案中，何杰金淋巴瘤处于I、II、III或IV期。额外的治疗药可以例如包括激酶抑制剂，如 BTK抑制剂，如依鲁替尼。额外的治疗药可以包括何杰金淋巴瘤治疗药。额外的治疗药可以例如包括放射疗法、MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)、 ABVD(阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)、斯坦福V(联合化疗和放射治疗的治疗方案)、或BEACOPP(博来霉素、依托泊苷、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松)。在一些实施方案中，受试者先前已经用以下一者或多者治疗过或对以下一者或多者耐受或抵抗：放射疗法、MOPP、斯坦福V或 BEACOPP。
与表达B细胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中一者或多者) 相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。
在一些实施方案中，用本文所述的组合治疗的癌症可以是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是血液癌症，特征为浆细胞克隆在骨髓中堆积。多发性骨髓瘤的当前疗法包括但不限于用作为沙利度胺类似物的来那度胺治疗。来那度胺具有多种活性，所述活性包括抗肿瘤活性、血管生成抑制作用和免疫调节。在一些实施方案中，CD19 CAR(例如，如本文所述)可以用来靶向骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，本文所述的组合可以与一种或多种额外的疗法(例如，来那度胺治疗)一起使用。
本文所述的表达CAR的细胞可以单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/ 或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合施用。
在实施方案中，将淋巴细胞清除化疗在施用(例如，输注)CAR细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)之前、与之同时或在其之后施用至受试者。在一个例子中，将淋巴细胞清除化疗在施用CAR细胞之前施用至受试者。例如，淋巴细胞清除化疗在CAR细胞输注之前1-4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施方案中，例如，如本文所述，施用多剂量的CAR细胞。例如，单剂量包含约5x 108个CAR细胞。在实施方案中，将淋巴细胞清除化疗在施用本文所述的表达CAR的细胞之前、与之同时或在其之后施用至受试者。
血液癌
血液癌疾病是多种类型侵袭血液、骨髓和淋巴系统的癌症如白血病、淋巴瘤和恶性淋巴细胞增生性疾病。
白血病可以划分成急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步划分为急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴样白血病(CLL)。其他相关的疾病包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称作“白血病前期”)，其是依据髓样血细胞无效产生(或发育异常(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合，和转变成AML的风险。
淋巴瘤是一组从淋巴细胞形成的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤。
联合疗法
本文所述的表达CAR的细胞(例如，和本文所述的激酶抑制剂)的组合可以与其他已知药物和疗法组合使用。
本文所述的表达CAR的细胞、激酶抑制剂和/或至少一种额外的治疗药可以在相同的组合物中或在分立的组合物中同时施用或依次施用。对于依次施用，本文所述的表达CAR的细胞可以首先施用并且额外的药物可以接着施用，或施用顺序可以反转。
CAR疗法和/或其他治疗药、手术或模式可以在活动性疾病时间期间或在缓解或活动度更小的疾病时间期间施用。CAR疗法可以在另一种治疗前、与该治疗同时、治疗后或在疾病缓解期间施用。
当组合施用时，CAR疗法和一种或多种额外的药物(例如，激酶抑制剂和/ 或第三药物)或前者全部可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量。在某些实施方案中，CAR疗法，额外的药物(例如，激酶抑制剂和/或第三药物)或前者全部的施用量或剂量比单独(例如，作为单药疗法)使用的每种药物的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，产生所需作用(例如，治疗癌症)的CAR治疗、额外药物(例如，激酶抑制剂和/或第三药物)或全部的量或剂量比实现相同治疗作用所需要的单独(例如，作为单药疗法) 使用的每种药物的量或剂量低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
其他方面，本文所述的表达CAR的细胞(例如，和激酶抑制剂)的组合可以在治疗方案中与手术、化疗、辐射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和FK506、抗体、或其他免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3 抗体或其他抗体治疗药、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和照射、肽疫苗(如Izumoto等人,2008J Neurosurg 108:963-971中描述的那种)组合使用。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，和本文所述的激酶抑制剂)的组合可以与另一种化疗药组合使用。示例性化疗药包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))；长春碱类生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)；烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫单抗(tositumomab)、贝伦妥单抗 (brentuximab))；抗代谢物(包括，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))；TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)；免疫调节剂如沙立度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。
考虑用于联合疗法的一般化疗药包括阿那曲唑
Figure BDA0002395107430001501
比卡鲁胺
Figure BDA0002395107430001502
硫酸博来霉素
Figure BDA0002395107430001503
白消安
Figure BDA0002395107430001504
白消安注射
Figure BDA0002395107430001505
卡培他滨(希罗达)、N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0002395107430001506
卡莫司汀
Figure BDA0002395107430001507
苯丁酸氮芥
Figure BDA0002395107430001508
顺铂
Figure BDA0002395107430001509
克拉立滨
Figure BDA00023951074300015010
环磷酰胺(
Figure BDA00023951074300015011
或
Figure BDA00023951074300015012
)、阿糖胞苷、嘧啶阿糖甙
Figure BDA00023951074300015013
阿糖胞苷脂质体注射
Figure BDA00023951074300015014
达卡巴嗪
Figure BDA00023951074300015015
更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸佐柔比星
Figure BDA00023951074300015016
柠檬酸佐柔比星脂质体注射剂
Figure BDA00023951074300015017
地塞米松、多西紫杉醇
Figure BDA00023951074300015018
盐酸多柔比星
Figure BDA00023951074300015019
依托泊苷
Figure BDA00023951074300015020
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00023951074300015021
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00023951074300015022
氟他胺
Figure BDA00023951074300015023
替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(difluorodeoxycitidine)、羟基脲
Figure BDA00023951074300015024
伊达比星
Figure BDA00023951074300015025
异环磷酰胺
Figure BDA00023951074300015026
伊立替康
Figure BDA00023951074300015027
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00023951074300015028
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00023951074300015029
6-巯基嘌呤(嘌呤)、甲氨蝶呤
Figure BDA00023951074300015030
米托蒽醌(米托蒽醌)、米罗他(mylotarg)、紫杉醇(紫杉酚)、 phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20连同卡莫司汀植入物
Figure BDA00023951074300015031
柠檬酸他莫昔芬
Figure BDA00023951074300015032
替尼泊苷
Figure BDA00023951074300015033
6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明
Figure BDA00023951074300015034
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00023951074300015035
长春碱
Figure BDA00023951074300015036
长春新碱
Figure BDA00023951074300015037
和长春瑞滨
Figure BDA00023951074300015038
示例性烷基化剂包括而不限于氮芥类、环乙亚胺衍生物类、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类和三氮烯类)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA00023951074300015039
Figure BDA0002395107430001511
Figure BDA0002395107430001512
尿嘧啶氮芥、
Figure BDA0002395107430001513
Figure BDA0002395107430001514
)、chlormethine
Figure BDA0002395107430001515
环磷酰胺(
Figure BDA0002395107430001516
Figure BDA0002395107430001517
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA0002395107430001518
美法仑
Figure BDA0002395107430001519
苯丁酸氮芥
Figure BDA00023951074300015110
哌泊溴烷
Figure BDA00023951074300015111
三亚乙基蜜胺
Figure BDA00023951074300015112
三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA00023951074300015113
塞替派
Figure BDA00023951074300015114
白消安
Figure BDA00023951074300015115
卡莫司汀
Figure BDA00023951074300015116
罗莫司汀
Figure BDA00023951074300015117
链佐星
Figure BDA00023951074300015118
和达卡巴嗪
Figure BDA00023951074300015119
额外的示例性烷基化剂包括而不限于奥沙利铂
Figure BDA00023951074300015120
替莫唑胺 (
Figure BDA00023951074300015121
和
Figure BDA00023951074300015122
)；更生霉素(dactinomycin)(也称作放线菌素-D、
Figure BDA00023951074300015123
)；美法仑(也称作L-PAM、L-沙可来新和苯丙氨酸氮芥、
Figure BDA00023951074300015124
)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称作六甲基三聚氰胺(HMM)、
Figure BDA00023951074300015125
)；卡莫司汀
Figure BDA00023951074300015126
苯达莫司汀
Figure BDA00023951074300015127
白消安(
Figure BDA00023951074300015128
和
Figure BDA00023951074300015129
)；卡铂
Figure BDA00023951074300015130
罗莫司汀(也称作CCNU、
Figure BDA00023951074300015131
)；顺铂(也称作CDDP、
Figure BDA00023951074300015132
和
Figure BDA00023951074300015133
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00023951074300015134
环磷酰胺(
Figure BDA00023951074300015135
和
Figure BDA00023951074300015136
)；达卡巴嗪(也称作DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、
Figure BDA00023951074300015137
)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称作六甲基三聚氰胺(HMM)、
Figure BDA00023951074300015138
)；异环磷酰胺
Figure BDA00023951074300015139
Prednumustine；丙卡巴肼
Figure BDA00023951074300015140
二氯甲二乙胺(也称作氮芥、氮氯嗪和盐酸氮芥、
Figure BDA00023951074300015141
)；链佐星
Figure BDA00023951074300015142
塞替派(也称作 thiophosphoamide、TESPA和TSPA、
Figure BDA00023951074300015143
)；环磷酰胺
Figure BDA00023951074300015144
Figure BDA00023951074300015145
和苯达莫司汀
Figure BDA00023951074300015146
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与氟达拉滨、环磷酰胺和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗(FCR)合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有 CLL。例如，受试者在第17染色体短臂中具有缺失(del(17p)(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施方案中，受试者包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在实施方案中，氟达拉滨按以下剂量施用：约10-50mg/m2(例如，约10-15、 15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45或45-50mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，环磷酰胺按以下剂量施用：约200-300mg/m2(例如，约200-225、225-250、250-275、或275-300mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约400-600mg/m2(例如，400-450、450-500、 500-550或550-600mg/m2)，例如，静脉内施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与苯达莫司汀和利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有CLL。例如，受试者在第17染色体短臂中具有缺失(del(17p)(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者不具有 del(17p)。在实施方案中，受试者包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在实施方案中，苯达莫司汀按以下剂量施用：约70-110mg/m2(例如，70-80、80-90、90-100或100-110mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约400-600 mg/m2(例如，400-450、450-500、500-550或550-600mg/m2)，例如，静脉内施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和/或皮质类固醇(例如，泼尼松)组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBCL)。在实施方案中，受试者具有非大型局限期DLBCL(例如，包括患有小于7cm大小/直径的肿瘤)。在实施方案中，受试者用与R-CHOP组合的照射治疗。例如，向受试者施用R-CHOP(例如，1-6个周期，例如，1、2、 3、4、5或6个周期的R-CHOP)，随后照射。在一些情况下，照射之后向受试者施用R-CHOP(例如，1-6个周期，例如，1、2、3、4、5或6个周期的R-CHOP)。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和利妥昔单抗(EPOCH-R)组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达 CAR的细胞与调整剂量的EPOCH-R(DA-EPOCH-R)组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有B细胞淋巴瘤，例如，Myc-重排的侵袭性B细胞淋巴瘤。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与利妥昔单抗和/或来那度胺组合施用至受试者。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-氧代1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)是免疫调节剂。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗和来那度胺组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有滤泡淋巴瘤(FL) 或套细胞淋巴瘤(MCL)。在实施方案中，受试者患有FL并且先前尚未用癌疗法治疗过。在实施方案中，来那度胺按以下剂量施用：约10-20mg(例如，10-15 或15-20mg)，例如，每日施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500 mg/m2)，例如，静脉内施用。
示例性免疫调节剂例如包括阿夫土珠单抗(afutuzumab)(从
Figure BDA0002395107430001531
可获得))；PEG化非格司亭
Figure BDA0002395107430001532
来那度胺(CC-5013、雷利米得
Figure BDA0002395107430001533
)；沙立度胺
Figure BDA0002395107430001534
pomelidomide、actimid(CC4047)；和IRX-2(从IRX Therapeutics可获得的人细胞因子的混合物，包含白介素1、白介素2和干扰素γ、CAS951209-71-5)。
示例性蒽环类例如包括多柔比星(阿霉素和
Figure BDA0002395107430001535
)；博来霉素
Figure BDA0002395107430001536
佐柔比星(盐酸佐柔比星、柔红霉素和盐酸红比霉素(rubidomycin)、
Figure BDA0002395107430001537
)；脂质体佐柔比星(柠檬酸佐柔比星脂质体、
Figure BDA0002395107430001538
)；米托蒽醌(DHAD、
Figure BDA0002395107430001539
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(
Figure BDA00023951074300015310
Idamycin
Figure BDA00023951074300015311
)；丝裂霉素
Figure BDA00023951074300015312
格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春碱类生物碱例如包括酒石酸长春瑞滨
Figure BDA0002395107430001541
长春新碱
Figure BDA0002395107430001542
和长春地辛
Figure BDA0002395107430001543
)；长春碱(也称作硫酸长春碱、长春花碱和 VLB、
Figure BDA0002395107430001544
和
Figure BDA0002395107430001545
)；和长春瑞滨
Figure BDA0002395107430001546
示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米
Figure BDA0002395107430001547
卡非佐米(PX-171-007、 (S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)； marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708)； delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基-L-丝氨酰胺 (ONX-0912)。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与贝伦妥单抗(brentuximab)组合施用至受试者。贝伦妥单抗是抗CD30抗体和单甲基澳瑞司他汀E的抗体-药物缀合物。在实施方案中，受试者患有何杰金淋巴瘤(HL)，例如，复发性或难治性HL。在实施方案中，受试者包含CD30+HL。在实施方案中，受试者已经接受过自体干细胞移植(ASCT)。在实施方案中，受试者尚未接受ASCT。在实施方案中，贝伦妥单抗按以下剂量施用：约1-3mg/kg(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3 mg/kg)，例如，静脉内施用，例如，每3周施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与贝伦妥单抗和达卡巴嗪或组合或与贝伦妥单抗和苯达莫司汀组合施用至受试者。达卡巴嗪是化学名称为5-(3,3-二甲基 -1-三氮烯基)咪唑-4-甲酰胺的烷基化剂。苯达莫司汀是化学名称为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷基化剂。在实施方案中，受试者患有何杰金淋巴瘤(HL)。在实施方案中，受试者先前尚未用癌疗法治疗过。在实施方案中，受试者是至少60岁，例如，60、65、70、75、80、85岁或较老。在实施方案中，达卡巴嗪按以下剂量施用：约300-450mg/m2(例如，约300-325、 325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，苯达莫司汀按以下剂量施用：约75-125mg/m2(例如，75-100或 100-125mg/m2，例如，约90mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，贝伦妥单抗按以下剂量施用：约1-3mg/kg(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3 mg/kg)，例如，静脉内施用，例如，每3周施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与CD20抑制剂，例如，抗 CD20抗体(例如，抗CD20特异性抗体或双特异性抗体)或其片段组合施用至受试者。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗、obinutuzumab、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、ocaratuzumab和Pro131921(Genentech)。参见，例如，Lim 等人,Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是与CD20 结合和造成CD20表达细胞的细胞裂解的嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施方案中，将利妥昔单抗静脉内施用，例如，作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如，约500-550、550-600、600-650、 650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、 1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、 1800-1900、或1900-2000mg)利妥昔单抗。在一些实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：150mg/m2至750mg/m2，例如，约150-175mg/m2、175-200 mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350 mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475 mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600 mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2，其中m2表示受试者的体表面积。在一些实施方案中，利妥昔单抗按至少4天(例如，4、7、14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如，利妥昔单抗按至少0.5周(例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8周或更长)的给药间隔施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如，至少2周，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20周或更长时间。例如，利妥昔单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用每个治疗周期总计至少4个剂量(例如，每个治疗周期至少4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或更多个剂量)。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含奥法木单抗。奥法木单抗是分子量大约149kDa的抗CD20 IgG1κ人单克隆抗体。例如，奥法木单抗使用转基因小鼠和杂交瘤技术生成并且从重组鼠细胞系(NS0)表达及纯化。参见，例如， www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验识别号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352和NCT01397591。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与奥法木单抗组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施方案中，将奥法木单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如，约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、 400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、 800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、 1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000 mg)奥法木单抗。在实施方案中，奥法木单抗按起始剂量约300mg、随后2000mg 施用，例如，施用约11个剂量，例如，施用24周。在一些实施方案中，奥法木单抗按至少4天(例如，4、7、14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如，奥法木单抗按以下给药间隔施用：至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周或更长时间。在一些实施方案中，奥法木单抗抗按本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如，至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60周或更长时间，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间，或1、2、3、4、 5年或更长时间。例如，奥法木单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用每个治疗周期总计至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20个或更多个剂量)。
在一些情况下，抗CD20抗体包含奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是人源化抗CD20 单克隆抗体，例如，如临床试验识别号NCT00077870、NCT01412333、 NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570和Kappos等人,Lancet. 19.378(2011):1779-87中所述。
在一些情况下，抗CD20抗体包含维妥珠单抗。维妥珠单抗是针对CD20 的人源化单克隆抗体。参见，例如，临床试验识别号NCT00547066、 NCT00546793、NCT01101581和Goldenberg等人,Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55。
在一些情况下，抗CD20抗体包括GA101。GA101(也称作obinutuzumab 或RO5072759)是人源化和糖工程化的抗CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；临床试验识别号： NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422和NCT01414205；和 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情况下，抗CD20抗体包含AME-133v。AME-133v(也称作 LY2469298或ocaratuzumab)是针对CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，所述单克隆抗体具有增加的FcγRIIIa受体亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)活性。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Forero-Torres等人,Clin CancerRes.18.5(2012):1395-403。
在一些情况下，抗CD20抗体包含PRO131921。PRO131921是与利妥昔单抗相比，经工程化以具有更好的FcγRIIIa结合作用和增强的ADCC的人源化抗 CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25；和 Casulo等人,Clin Immunol.154.1(2014):37-46；和临床试验识别号 NCT00452127。
在一些情况下，抗CD20抗体包含TRU-015。TRU-015是从针对CD20的抗体的结构域衍生的抗CD20融合蛋白。TRU-015比单克隆抗体小，但是保留 Fc介导的效应子功能。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25。TRU-015含有与人IgG1铰链区连接的抗CD20单链可变片段(scFv)、CH2和CH3结构域，但是缺少CH1结构域和CL结构域。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD20抗体缀合于或结合至治疗药，例如，本文所述的化疗药(例如，环磷氮芥、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏药、抗恶心药(或镇吐药)、止疼药或细胞保护药。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与B细胞淋巴瘤2(BCL-2) 抑制剂(例如，venetoclax，也称作ABT-199或GDC-0199)和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与venetoclax和利妥昔单抗组合施用至受试者。Venetoclax是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子。下文显示venetoclax(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4.4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1- 基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并 [2,3-b]吡啶-5-基氧)苯甲酰胺)的结构。
Figure BDA0002395107430001581
在实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有复发性CLL，例如，先前已经向受试者施用癌疗法。在实施方案中，venetoclax按以下剂量施用：约15-600mg(例如，15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、 400-500或500-600mg)，例如，每日
施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用，例如，每月一次施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与减少Treg细胞群体的分子组合施用至受试者。减少Treg细胞数目(例如，耗尽Treg细胞)的方法是本领域已知的并且包括，例如，CD25耗尽法、施用环磷酰胺、调节GITR功能。不希望受理论约束，认为在单采血液成分术之前或在施用本文所述的表达CAR的细胞之前，减少受试者中Treg细胞的数目减少了肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如，Treg) 的数目并降低受试者的复发风险。在一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与靶向 GITR和/或调节GITR功能的分子，如GITR激动剂和/或耗尽调节性T细胞 (Treg)的GITR抗体组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR 的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合时，与环磷酰胺组合施用至受试者。在一个实施方案中，将GITR结合分子和/或调节GITR 功能的分子(例如，GITR激动剂和/或耗尽Treg的GITR抗体)在施用表达CAR 的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在实施方案中，将环磷酰胺在施用(例如，输注或回输) 表达CAR的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前施用至受试者。在实施方案中，将环磷酰胺和抗GITR抗体在施用(例如，输注或回输)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前施用至受试者。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液癌如ALL或CLL)。在一个实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有ALL。在实施方案中，受试者患有实体癌，例如，本文所述的实体癌。
示例性GITR激动物例如包括GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，双价抗GITR抗体)，如，例如，以下文献中描述的GITR融合蛋白；美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO 2010/003118和2011/090754，或例如以下文献中描述的抗GITR抗体：美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号 8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO 2011/028683、PCT公开号WO 2013/039954、PCT公开号WO 2005/007190、 PCT公开号WO2007/133822、PCT公开号WO 2005/055808、PCT公开号WO 99/40196、PCT公开号WO 2001/03720、PCT公开号WO 99/20758、PCT公开号WO 2006/083289、PCT公开号WO 2005/115451、美国专利号7,618,632和 PCT公开号WO 2011/051726。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞和本文所述的激酶抑制剂的组合与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)组合施用至受试者。在一个实施方案中，GITR激动剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶calcineurin的药物(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70 S6激酶的药物(雷帕霉素)(Liu等人, Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在又一个方面，本发明的细胞组合物可以连同骨髓移植、使用化疗药如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外照射放射疗法 (XRT)、环磷酰胺和/或抗体如OKT3或CAMPATH一起(例如，在其之前、同时或在其后)施用至受试者。在一个方面，将本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法如与CD20反应的药物(例如，Rituxan)后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可以接受高剂量化疗标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受扩增的本发明免疫细胞输注。在一个额外的实施方案中，将扩增的细胞在手术前或在之后施用。
在一个实施方案中，可以向受试者施用减少或改善与施用表达CAR的细胞相关的副作用的药物。与施用表达CAR的细胞相关的副作用包括但不限于CRS 和嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，又称作巨噬细胞活化综合征(MAS)。 CRS的症状包括高热、恶心、一过性低血压、缺氧等。因此，本文所述的方法可以包括施用本文所述的表达CAR的细胞至受试者并且进一步施用一种药物以管理因表达CAR的细胞治疗产生的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2受体和IL-6的一者或多者。因此，施用以治疗这种副作用的药物可以是中和这些可溶性因子中一者或多者的药物。这类药物的例子包括但不限于类固醇(例如，皮质类固醇)、TNFα的抑制剂和IL-6的抑制剂。TNFα抑制剂的例子是抗TNFα抗体分子，如，英夫单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗 (certolizumab pegol)和戈利木单抗(golimumab)。TNFα抑制剂的另一个例子是融合蛋白如entanercept。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的例子是抗IL-6抗体分子或抗IL-6受体抗体分子如托珠单抗(tocilizumab)(toc)、sarilumab、elsilimomab、CNTO328、ALD518/BMS-945429、CNTO136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、 FE301和FM101。在一个实施方案中，抗IL-6受体抗体分子是托珠单抗。基于 IL-1R的抑制剂的例子是阿那白滞素。
在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达CAR的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，该物质可以是对抑制性分子抑制的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、 CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、 BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。对抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平抑制)可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或 shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)可以用来抑制表达CAR的细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，抑制表达CAR的细胞内部的抑制性分子。在这些实施方案中，对抑制性分子表达抑制的dsRNA分子与编码CAR的亚基(例如，全部组分)的核酸连接。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以例如是与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，物质可以是与PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称作MDX-010和MDX-101并且作为
Figure BDA0002395107430001611
销售； Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(tremelimumab)(从Pfizer可获得的IgG2单克隆抗体，以前称作ticilimumab、CP-675,206))。在一个实施方案中，物质是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，物质是与LAG3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，物质是与CEACAM(例如，CEACAM-1、 CEACAM-3和/或CEACAM-5)结合的抗体或抗体片段。
PD1是受体CD28家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、 ICOS和BTLA。PD1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等人, 1996 Int.Immunol 8:765-75)。已经显示与PD1结合时，PD1、PD-L1和PD-L2 的两种配体下调T细胞活化(Freeman等人,2000J Exp Med 192:1027-34； Latchman等人,2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人,2002Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中丰富(Dong等人,2003J Mol Med 81:281-7； Blank等人,2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人,2004 ClinCancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。PD1、PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是已知的并且可以与本文所述的CD19CAR组合使用。例如，纳武单抗(nivolumab)(也称作BMS-936558或MDX1106；Bristol-MyersSquibb)是特异性阻断PD1的全人IgG4单克隆抗体。与PD1特异性结合的纳武单抗(克隆5C4)和其他人单克隆抗体在US 8,008,449、EP 2161336和WO 2006/121168中公开。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。 Pidilizumab和其他人源化抗PD1单克隆抗体在WO 2009/101611中公开。派姆单抗(Pembrolizumab)(以前称作lambrolizumab并且又称作Keytruda、 MK03475；Merck)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD1抗体在US 8,354,509和WO 2009/114335中公开。MEDI4736(Medimmune)是与PDL1结合的人单克隆抗体并且抑制配体与PD1 的相互作用。MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化 IgG1单克隆抗体。针对PD-L1的MDPL3280A和其他人单克隆抗体在美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中公开。其他抗PD-L1结合剂包括 YW243.55.S70(重链可变区和轻链可变区在WO 2010/077634的SEQ ID NO:20 和21中显示)和MDX-1 105(也称作BMS-936559和，例如，WO 2007/005874中公开的抗PD-L1结合物)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，在WO 2010/027827和WO2011/066342中公开)是阻断PD1和B7-H1之间相互作用的 PD-L2Fc融合可溶性受体。其他抗PD-1抗体包括AMP514(Amplimmune)，连同其他，例如，US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)还负向调节T细胞功能，特别在分泌IFN-g的CD4+辅助T细胞1和CD8+T细胞毒性1细胞中，并且在T细胞耗尽中发挥至关重要的作用。抑制TIM3和其配体(例如，半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1)之间的相互作用可以增加免疫应答。TIM3和其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子，或肽抑制剂与TIM3的IgV结构域结合以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽在WO 2013/006490和US 20100247521中公开。其他抗TIM3抗体包括 RMT3-23的人源化形式(Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551中公开)和克隆8B.2C12(Monney等人,2002,Nature,415:536-541中公开)。抑制TIM3和 PD-1的双特异性抗体在US 20130156774中公开。
在其他实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质是CEACAM抑制剂 (例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体在WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251和WO 2014/022332 中描述，例如，单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，例如，如US 2004/0047858、US7,132,255和WO 99/052552中所述。在其他实施方案中，抗CEACAM抗体与CEACAM-5结合，如Zheng等人,PLoS One.2010Sep 2；5(9). pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或与CEACAM-1和 CEACAM-5交叉反应，例如，如WO2013/054331和US 2014/0271618中所述。
不希望受理论约束，认为癌胚抗原细胞黏附分子(CEACAM)(如 CEACAM-1和CEACAM-5)至少部分地介导对抗肿瘤免疫应答的抑制(参见，例如，Markel等人,JImmunol.2002Mar 15；168(6):2803-10；Markel等人,J Immunol.2006 Nov 1；177(9):6062-71；Markel等人,Immunology.2009 Feb；126(2):186-200；Markel等人,CancerImmunol Immunother.2010 Feb；59(2):215-30；Ortenberg等人,Mol Cancer Ther.2012Jun；11(6):1300-10； Stern等人,J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701；Zheng等人,PLoS One. 2010 Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，已经将CEACAM-1描述为TIM-3的异嗜性配体及在TIM-3介导的T细胞耐受性和耗尽中发挥作用(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，共同阻断CEACAM-1和TIM-3已经显示在异种移植物结直肠癌模型中增强抗肿瘤免疫应答(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014),上文)。在其他实施方案中，共同阻断CEACAM-1和PD-1降低T细胞耐受性，例如，如WO 2014/059251中所述那样。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其他免疫调节剂(例如，抗PD-1和/或抗TIM-3抑制物)一起使用，以增强针对癌(例如，黑素瘤、肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌以及如本文所述的其他癌)的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞活化基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其中已经显示所述细胞表面分子在CD8+T细胞耗尽中发挥作用。LAG3和其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG3抗体并且IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗尽性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，所述IMP321是LAG3的可溶性部分和与MHC II 类分子结合并激活抗原呈递细胞(APC)的Ig融合的重组融合蛋白。其他抗体例如在WO 2010/019570中公开。
在一些实施方案中，CAR疗法和激酶抑制剂与Toll样受体(TLR)激动剂组合施用。TLR激动剂可以是TLR9激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂是寡脱氧核苷酸，例如，CG富集的寡脱氧核苷酸，例如，未甲基化的CG富集的寡脱氧核苷酸。参见，例如，Sagiv-Barfi等人,“Ibrutinib enhances the antitumor immune response induced by intratumoralinjection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse lymphoma model.”Blood.2015 Feb6.pii: blood-2014-08-593137，所述文献通过引用方式完整并入本文。在一些实施方案中，TLR激动剂与表达CAR的NK细胞组合施用。不受理论约束，TLR激动剂可以促进NK细胞(如表达CAR的NK细胞)的活化。在一些实施方案中，TLR 激动剂通过注射(例如，瘤内注射)施用。
在一些实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质可以例如是包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，并且第二结构域是与正向信号相关的多肽，例如，包含如本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与正向信号相关的多肽可以包括CD28、 CD27、ICOS的共刺激结构域，例如，CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域和/或(例如，本文所述的)(例如，CD3ζ的)初级信号传导结构域。在一个实施方案中，融合蛋白是由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达抗CD19 CAR的细胞(例如，T细胞)表达。
在一个实施方案中，增强本文所述的表达CAR的细胞活性的物质是 miR-17-92。
在一个实施方案中，增强本文所述的表达CAR的细胞活性的物质是细胞因子。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活和稳态相关的重要功能。可以对接受本文所述的表达CAR的细胞的受试者施用的细胞因子包括：IL-2、IL-4、 IL-7、IL-9、IL-15、IL-18和IL-21或其组合。在优选的实施方案中，施用的细胞因子是IL-7、IL-15、或IL-21或其组合。细胞因子可以施用一天一次或一天超过一次，例如，一天2次、一天3次、或一天4次。可以将细胞因子施用多于一天，例如将细胞因子施用2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。例如，将细胞因子一天一次施用7天。
在实施方案中，细胞因子与表达CAR的细胞组合施用。细胞因子可以与表达CAR的细胞同时或同步施用，例如，在同一天施用。细胞因子可以配制在与表达CAR的细胞相同的药物组合物中，或可以配制在分离的药物组合物中。备选地，细胞因子可以在施用表达CAR的T细胞后不久施用，例如，在施用表达CAR的细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用。在细胞因子按超过一天的给药方案施用的实施方案中，细胞因子给药方案的第1天可以在施用表达CAR的细胞的同一天、或细胞因子给药方案的第1天可以是在施用表达CAR的T细胞后的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一个实施方案中，在第1天将表达CAR的细胞施用至受试者，并且在第2天将细胞因子一天一次施用接下来的7天。在一个优选实施方案中，与表达CAR的细胞待组合施用的细胞因子是IL-7、IL-15和/或IL-21。
在其他实施方案中，将细胞因子在施用表达CAR的细胞后施用足够的时间段，例如，在施用表达CAR的细胞后施用至少2周、3周、4周、6周、8周、 10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11 个月、或1年或更长时间。在一个实施方案中，将细胞因子在评估受试者对表达CAR的细胞的反应后施用。例如，根据本文所述的剂量和治疗方案，向受试者施用表达CAR的细胞。在施用表达CAR的细胞后2周、3周、4周、6周、 8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更长时间，使用本文所述任何方法，评估受试者对CART 疗法的反应，包括对肿瘤生长的抑制、减少循环型肿瘤细胞、或肿瘤消退。可以向针对CART疗法未显示出足够反应的受试者施用细胞因子。施用细胞因子至针对CART疗法具有次优反应的受试者改善了CART效能和/或抗肿瘤活性。在一个优选实施方案中，在施用表达CAR的细胞后施用的细胞因子是IL-7。
与低剂量mTOR抑制剂组合
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂组合施用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于90％、至少 10％但不多于90％、至少15％但不多于90％、至少20％但不多于90％、至少30％但不多于90％、至少40％但不多于90％、至少50％但不多于90％、至少 60％但不多于90％或至少70％但不多于90％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于80％、至少 10％但不多于80％、至少15％但不多于80％、至少20％但不多于80％、至少 30％但不多于80％、至少40％但不多于80％、至少50％但不多于80％、至少 60％但不多于80％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于70％、至少 10％但不多于70％、至少15％但不多于70％、至少20％但不多于70％、至少 30％但不多于70％、至少40％但不多于70％、至少50％但不多于70％的mTOR 抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于60％、至少 10％但不多于60％、至少15％但不多于60％、至少20％但不多于60％、至少 30％但不多于60％、至少40％但不多于60％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于50％、至少 10％但不多于50％、至少15％但不多于50％、至少20％但不多于50％、至少 30％但不多于50％、至少40％但不多于50％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于40％、至少 10％但不多于40％、至少15％但不多于40％、至少20％但不多于40％、至少 30％但不多于40％、至少35％但不多于40％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于30％、至少 10％但不多于30％、至少15％但不多于30％、至少20％但不多于30％、至少 25％但不多于30％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于20％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于30％、至少1％、2％、 3％、4％或5％但不多于35％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于40％或至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于45％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于90％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
如本文中讨论，mTOR抑制作用的程度可以表述为P70 S6激酶抑制作用的程度，例如，mTOR抑制作用的程度可以通过P70 S6激酶活性下降的水平(例如，通过P70 S6激酶底物的磷酸化下降)来确定。可以通过本文所述的方法评价 mTOR抑制水平，例如通过Boulay测定法或用蛋白质印迹法测量磷酸化的S6 水平。
示例性mTOR抑制剂
如本文所用，术语“mTOR抑制剂”指在细胞中抑制mTOR激酶的化合物或配体、或其可药用盐。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是变构抑制剂。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是催化性抑制剂。
变构性mTOR抑制剂包括中性三环状化合物雷帕霉素(西罗莫司 (sirolimus))、雷帕霉素相关化合物，所述雷帕霉素相关化合是与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，例如包括，雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称作雷帕类似物)和抑制mTOR活性的其他大环内酯类化合物。
雷帕霉素是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的已知大环内酯类抗生素，其具有式A中所示的结构。
Figure BDA0002395107430001681
参见，例如，McAlpine,J.B.,等人,J.Antibiotics(1991)44:688；Schreiber,S.L.等人,J.Am.Chem.Soc.(1991)113:7433；美国专利号3,929,992。存在针对雷帕霉素提出的各种编号方案。为避免混淆，当本文中命名特定雷帕霉素类似物时，参考使用式A编号方案的雷帕霉素给出名称。
可用于本发明中的雷帕霉素类似物例如是O-取代的类似物，其中雷帕霉素的环己基环上的羟基由其中R1是羟烷基、羟烷氧基烷基、酰氨基烷基或氨烷的 OR1基替换；例如，如US 5,665,772和WO 94/09010中所述的RAD001，也称作依维莫司，所述文献的内容通过引用方式并入。其他合适的雷帕霉素类似物包括在26-或28-位置处取代的那些。雷帕霉素类似物可以是上文提到的类似物的差向异构体、特别地，在位置40、28或26取代的类似物的差向异构体，并且可以任选地进一步氢化，例如，如US6,015,815、WO 95/14023和WO 99/15530中所述，所述文献的内容通过引用方式并入，例如ABT578，也称作佐他莫司或在US 7,091,213、WO 98/02441和WO 01/14387中描述的雷帕霉素类似物，所述文献的内容通过引用方式并入，例如，AP23573，也称作地磷莫司 (ridaforolimus)。
来自US 5,665,772的适用于本发明中的雷帕霉素类似物的例子包括但不限于40-O-苄基-雷帕霉素、40-O-(4’-羟甲基)苄基-雷帕霉素、40-O-[4’-(1,2-二羟乙基)]苄基-雷帕霉素、40-O-烯丙基-雷帕霉素、40-O-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环 -4(S)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕霉素、(2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-二羟戊-2’-烯-1’-基)- 雷帕霉素、40-O-(2-羟)乙氧羰基甲基-雷帕霉素、40-O-(2-羟)乙基-雷帕霉素、 40-O-(3-羟)丙基-雷帕霉素、40-O-(6-羟)己基-雷帕霉素、40-O-[2-(2-羟)乙氧基] 乙基-雷帕霉素、40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊环-3-基]甲基-雷帕霉素、 40-O-[(2S)-2,3-二羟丙-1-基]-雷帕霉素、40-O-(2-乙酰氧)乙基-雷帕霉素、40-O-(2- 尼克酰基氧)乙基-雷帕霉素、40-O-[2-(N-吗啉代)乙酰氧]乙基-雷帕霉素、 40-O-(2-N-咪唑基乙酰氧)乙基-雷帕霉素、40-O-[2-(N-甲基-N’-哌嗪基)乙酰氧] 乙基-雷帕霉素、39-O-去甲基-39,40-O,O-亚乙基-雷帕霉素、(26R)-26-二氢 -40-O-(2-羟)乙基-雷帕霉素、40-O-(2-氨基乙基)-雷帕霉素、40-O-(2-乙酰氨基乙基)-雷帕霉素、40-O-(2-尼克酰胺基乙基)氨基甲酸)-雷帕霉素、40-O-(2-(N-甲基咪唑-2’-基乙氧羰基酰胺基)乙基)-雷帕霉素、40-O-(2-乙氧羰基氨基乙基)-雷帕霉素、40-O-(2-甲苯基亚磺酰氨基乙基)-雷帕霉素和40-O-[2-(4’,5’-二羰乙氧基 -1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕霉素。
可用于本发明中的其他雷帕霉素类似物是这样的类似物，其中雷帕霉素的环己基环上的羟基和/或在28位置处的羟基替换为羟基酯基团，例如，US RE44,768中存在的雷帕霉素类似物，例如坦罗莫司。
可用于前述发明中的其他雷帕霉素类似物包括那些类似物，其中在16位置处的甲氧基替换为另一个取代基，优选地(任选地羟基取代的)炔氧基、苄基、邻甲氧苄基或氯苄基和/或其中删除在39位置处的甲氧基连同39碳，从而雷帕霉素的环己基环变成缺少39位置甲氧基的环戊基环；例如，如WO 95/16691和WO 96/41807中所述，所述文献的内容通过引用方式并入。可以进一步修饰类似物，从而在雷帕霉素的40位置处的羟基被烷基化和/或32-羰基被还原。
来自WO 95/16691的雷帕霉素类似物包括但不限于16-去甲氧基-16-(戊-2- 炔基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-(4-羟基-丁-2-炔基)氧-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-苄氧基-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、16-去甲氧基-16-苄氧基-雷帕霉素、16- 去甲氧基-16-邻-甲氧苄基-雷帕霉素、16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧乙基)-16-戊-2- 炔基)氧-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-甲酰基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-羟甲基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-羧基-42- 去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-(吗啉-4-基)羰基-42-去甲-雷帕霉素、39-去甲氧基-40-去氧-39-[N-甲基,N-(2-吡啶-2-基-乙基)]氨甲酰基-42-去甲-雷帕霉素和39- 去甲氧基-40-去氧-39-(对甲苯磺酰腙甲基)-42-去甲-雷帕霉素。
来自WO 96/41807的雷帕霉素类似物包括但不限于32-去氧-雷帕霉素、 16-O-戊-2-炔基-32-去氧-雷帕霉素、16-O-戊-2-炔基-32-去氧-40-O-(2-羟基-乙基)- 雷帕霉素、16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氢-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、32(S)-二氢 -40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素和32(S)-二氢-40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素。
另一个合适的雷帕霉素类似物是如US 2005/0101624中所述的umirolimus，所述文献的内容通过引用方式并入。
RAD001，也称作依维莫司
Figure BDA0002395107430001701
具有化学名称 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟 -12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环并[30.3.1.04,9]三十七碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮。
变构性mTOR抑制剂的其他例子包括西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素、 AY-22989)、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称作坦罗莫司或 CCI-779)和地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。变构性mTOR抑制剂的其他例子包括佐他莫司(ABT578)和umirolimus。
备选地或额外地，已经发现ATP-竞争性催化性mTOR抑制剂直接靶向mTOR激酶结构域并靶向mTORC1和mTORC2二者。有比这类变构性mTOR 抑制剂如雷帕霉素更有效的mTORC1抑制剂，因为它们调节雷帕霉素耐药性 mTORC1输出，如4EBP1-T37/46磷酸化和帽依赖性翻译。
催化性抑制剂包括：BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉-3-基-2,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈、或单甲苯磺酸盐形式。BEZ235的合成在WO2006/122806中描述；CCG168(否则称作AZD-8055，Chresta,C.M. 等人,Cancer Res,2010,70(1),288-298)；其具有化学名称{5-[2,4-双-((S)-3-甲基- 吗啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺(WO 09104019)；3-(2-氨基苯并[d]
Figure BDA0002395107430001711
唑-5-基)-1-异丙基-1H-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO 10051043和WO 2013023184)；A N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧苯基)氨基)喹
Figure BDA0002395107430001712
啉-2-基)氨磺酰)苯基)-3- 甲氧基-4-甲基苯甲酰胺(WO 07044729和WO12006552)；PKI-587(Venkatesan, A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，其具有化学名称1-[4-[4-(二甲基氨基) 哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；GSK-2126458 (ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，其具有化学名称2,4-二氟-N-{2-甲氧基 -5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代 -9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO 10114484)；(E)-N-(8-(6-氨基-5-(三氟甲基)吡啶-3- 基)-1-(6-(2-氰丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亚基)氰腈 (WO 12007926)。
催化性mTOR抑制剂的其他例子包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4- 哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO 2006/122806) 和Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人,et al.,Biochem J.,2009,421(1),29-42。 Ku-0063794是雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)的特异性抑制剂。WYE-354是催化性mTOR抑制剂的另一个例子(Yu K等人,(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of NovelATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target ofRapamycin.Cancer Res.69(15):6232-6240)。
根据本发明可用的mTOR抑制剂还包括前述任一者的前药、衍生物、可药用盐或其类似物。
可以配制mTOR抑制剂，如RAD001，以基于本文所述的特定剂量，基于本领域充分建立的方法递送。特别地，美国专利6,004,973(通过引用方式并入本文)提供了随本文所述的mTOR抑制剂可用的制剂的例子。
mTOR抑制作用的评价
mTOR使激酶P70 S6磷酸化，因而激活P70 S6激酶并允许它磷酸化其底物。mTOR抑制作用的程度可以表述为P70 S6激酶抑制作用的程度，例如， mTOR抑制作用的程度可以通过P70 S6激酶活性下降的水平(例如，通过P70 S6 激酶底物的磷酸化下降)来确定。可以通过在抑制剂不存在的情况下(例如，在施用抑制剂之前)及在抑制剂存在下或在施用抑制剂后测量P70 S6激酶活性(P70 S6激酶使底物磷酸化的能力)，测定mTOR抑制水平。抑制P70S6激酶的水平给出mTOR抑制水平。因此，如果P70 S6激酶被抑制40％，则如通过P70 S6 激酶活性所测量的mTOR活性被抑制40％。本文中提及的抑制作用的程度或水平是在剂量间隔范围内抑制作用的平均水平。例如，如果抑制剂每周一次给予，抑制水平由间隔(即一周)范围内抑制作用的平均水平给出。
通过引用方式并入的Boulay等人,Cancer Res,2004,64:252-61教授了一种可以用来评估mTOR抑制水平的测定法(本文中称作Boulay测定法)。在一个实施方案中，该测定法依赖于测量在施用mTOR抑制剂(例如，RAD001)之前和之后来自生物样品的P70 S6激酶活性。样品可以在mTOR抑制剂治疗预选择的时间，例如，治疗后24、48和72小时取得。可以使用例如来自皮肤或外周血单个核细胞(PBMC)的生物样品。从样品制备总蛋白提取物。使用特异性识别 P70 S6激酶的抗体，通过免疫沉淀法从蛋白质提取物分离P70 S6激酶可以在体外激酶测定法中测量分离的P70 S6激酶的活性。分离的激酶可以与40S核糖体亚单位底物(其为P70 S6激酶的内源底物)和γ-32P在允许底物磷酸化的条件下温育。随后，反应混合物可以在SDS-PAGE凝胶上分离并使用磷光成像仪分析32P 信号。与40S核糖体亚基的大小相对应的32P信号显示磷酸化的底物和P70 S6 激酶的活性。可以通过以下方式计算激酶活性的增加和减少，(例如，使用 ImageQuant,Molecular Dynamics)对磷酸化底物的32P信号的面积和强度定量，赋予任意单位值至定量的信号并且将来自施用前的值与来自施用后的值或与参比值比较。例如，激酶活性抑制百分数可以用下式计算：1-(施用后获得的值/ 施用前获得的值)X100。如上文描述，本文中提及的抑制作用的程度或水平是在剂量间隔范围内抑制作用的平均水平。
用于评价激酶活性(例如，P70 S6激酶活性)的方法还在因而通过引用方式并入的US7,727,950中提供。
也可以通过PD1阴性/PD1阳性T细胞比率的变化评价mTOR抑制水平。来自外周血的T细胞可以通过现有技术已知的方法鉴定为PD1阴性或阳性。
低剂量mTOR抑制剂
本文所述的方法使用免疫增强性低剂量mTOR抑制剂，多种剂量的mTOR 抑制剂，例如，变构性mTOR抑制剂，包括雷帕霉素类似物如RAD001。相反，完全或接近完全抑制mTOR途径的抑制剂水平是免疫抑制性的并且例如用来防止器官移植排异。此外，完全抑制mTOR的大剂量雷帕霉素类似物还抑制肿瘤细胞生长并用来治疗多种癌症(参见，例如，Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors.SalvadoriM.World J Transplant.2012 Oct 24；2(5):74-83；Current and Future TreatmentStrategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma:Role of mTORInhibition；Finn RS.Liver Cancer.2012 Nov；1(3-4):247-256；Emerging SignalingPathways in Hepatocellular Carcinoma.Moeini A,Cornellà H,Villanueva A.LiverCancer. 2012 Sep；1(2):83-93；Targeted cancer therapy-Are the days of systemicchemotherapy numbered？Joo WD,Visintin I,Mor G.Maturitas.2013 Sep 20.； Role ofnatural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIsand mTOR inhibitor.Santoni M,Berardi R,Amantini C, Burattini L,Santini D,Santoni G,Cascinu S.Int J Cancer.2013年10月2日)。
本发明是至少部分地基于以下令人惊讶的结果：明显低于目前临床环境下所用那些剂量的mTOR抑制剂剂量具有增加受试者中免疫应答和增加PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞比率的优越作用。令人惊讶的是，产生仅部分抑制 mTOR活性的低剂量mTOR抑制剂能够有效地改善人类受试者中的免疫应答并增加PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率。
备选地或额外地，在不希望受任何理论约束的情况下，认为免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂可以增加幼稚T细胞数目，例如，至少暂时增加，例如，如与未治疗的受试者相比。备选地或额外地，再次不希望受理论约束，认为在足量时间或充分给药后mTOR抑制剂治疗导致以下一种或多种情况：
以下一种或多种标志物的表达增加：例如，在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的CD62L高、CD127高、CD27+和BCL2；
例如记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上KLRG1的表达减少；和
记忆T细胞前体的数目增加，所述记忆T细胞前体例如是具有以下特征的任一个或其组合的细胞：CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1 减少和BCL2增加；
并且其中例如，如与未处理的受试者相比，上文描述的任何变化出现，例如，至少暂时出现(Araki,K等人,(2009)Nature 460:108-112)。记忆T细胞前体是分化程序中早期的记忆T细胞。例如，记忆T细胞具有以下一个或多个特征： CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1减少和/或BCL2增加。
在一个实施方案中，本发明涉及按选择的给药方案(例如，每日一次或每周一次)施用时与下述mTOR抑制水平相关的mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR 抑制剂(例如，雷帕霉素类似物、雷帕霉素或RAD001)或催化性mTOR抑制剂) 组合物或剂型，其中所述mTOR抑制水平与完全或明显免疫抑制不相关，而与增强免疫应答相关。
可以在持续释放制剂中提供mTOR抑制剂，例如，变构性mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素类似物、雷帕霉素或RAD001)或催化性mTOR抑制剂。可以在持续释放制剂中提供本文所述的任何组合物或单位剂型。在一些实施方案中，持续释放制剂将具有比速释制剂低的生物利用率。例如，在实施方案中，为了达到相似的速释制剂治疗效果，持续释放制剂将具有约2至约5、约2.5至约3.5、或约3倍在速释制剂中提供的抑制剂的量。
在一个实施方案中，提供一般用于每周一次施用的(例如，RAD001)的速释形式，所述速释形式具有0.1至20、0.5至10、2.5至7.5、3至6或约5mg每单位剂型。对于每周一次施用，这些速释制剂对应于分别具有0.3至60、1.5至30、7.5至22.5、9至18、或约15mg mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。在实施方案中，两种形式均基于一次/周施用。
在一个实施方案中，提供一般用于每日一次施用的(例如，RAD001)的速释形式，所述速释形式具有0.005至1.5、0.01至1.5、0.1至1.5、0.2至1.5、0.3 至1.5、0.4至1.5、0.5至1.5、0.6至1.5、0.7至1.5、0.8至1.5、1.0至1.5、0.3 至0.6、或约0.5mg每单位剂型。对于每日一次施用，这些速释形式对应于分别具有0.015至4.5、0.03至4.5、0.3至4.5、0.6至4.5、0.9至4.5、1.2至4.5、 1.5至4.5、1.8至4.5、2.1至4.5、2.4至4.5、3.0至4.5、0.9至1.8、或约1.5mg mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。对于每周一次施用，这些速释形式对应于分别具有0.1至30、0.2 至30、2至30、4至30、6至30、8至30、10至30、1.2至30、14至30、16 至30、20至30、6至12、或约10mg mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。
在一个实施方案中，提供一般用于每日一次施用的(例如，RAD001)的速释形式，所述速释形式具有0.01至1.0mg每单位剂型。对于每日一次施用，这些速释制剂对应于分别具有0.03至3mg mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。对于每周一次施用，这些速释制剂对应于分别具有0.2至20mg mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。
在一个实施方案中，提供一般用于每周一次施用的(例如，RAD001)的速释形式，所述速释形式具有0.5至5.0mg每单位剂型。对于每周一次施用，这些速释制剂对应于分别具有1.5至15mg mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素或RAD001)的持续释放形式。
如上文所述，mTOR途径的一个靶是P70 S6激酶。因此，可用于本文所述的方法和组合物中的mTOR抑制剂剂量是这些剂量，相对于mTOR抑制剂不存在的情况下P70 S6激酶的活性而言，所述剂量足以实现不大于80％的P70 S6 激酶活性抑制作用，例如，如通过本文所述的测定法(例如，Boulay测定法)所测量。在又一个方面，本发明提供这样量的mTOR抑制剂，相对于mTOR抑制剂不存在的情况下P70 S6激酶的活性而言，所述量足以实现不大于38％的 P70 S6激酶活性抑制作用。
在一个方面，例如，当施用至人类受试者时，可用于本文所述的方法和组合物中的mTOR抑制剂剂量足以实现90+/-5％(即，85-95％)、89+/-5％、88 +/-5％、87+/-5％、86+/-5％、85+/-5％、84+/-5％、83+/-5％、82+/-5％、 81+/-5％、80+/-5％、79+/-5％、78+/-5％、77+/-5％、76+/-5％、75+/-5％、 74+/-5％、73+/-5％、72+/-5％、71+/-5％、70+/-5％、69+/-5％、68+/-5％、 67+/-5％、66+/-5％、65+/-5％、64+/-5％、63+/-5％、62+/-5％、61+/-5％、 60+/-5％、59+/-5％、58+/-5％、57+/-5％、56+/-5％、55+/-5％、54+/-5％、 54+/-5％、53+/-5％、52+/-5％、51+/-5％、50+/-5％、49+/-5％、48+/-5％、 47+/-5％、46+/-5％、45+/-5％、44+/-5％、43+/-5％、42+/-5％、41+/-5％、 40+/-5％、39+/-5％、38+/-5％、37+/-5％、36+/-5％、35+/-5％、34+/-5％、 33+/-5％、32+/-5％、31+/-5％、30+/-5％、29+/-5％、28+/-5％、27+/-5％、 26+/-5％、25+/-5％、24+/-5％、23+/-5％、22+/-5％、21+/-5％、20+/-5％、 19+/-5％、18+/-5％、17+/-5％、16+/-5％、15+/-5％、14+/-5％、13+/-5％、 12+/-5％、11+/-5％或10+/-5％的P70 S6激酶活性抑制作用，例如，如通过本文所述的测定法(例如，Boulay测定法)所测量。
可以使用本领域已知的方法(如，例如，根据美国专利7,727,950中描述的方法)、通过免疫印迹分析磷酰P70 S6K水平和/或磷酰P70 S6水平或通过体外激酶活性测定法，测量受试者中的P70 S6激酶活性。
如本文所用，谈及mTOR抑制剂剂量的术语“约”指mTOR抑制剂的量直至+/-10％的变异性、但可以包括所述剂量前后无变异。
在一些实施方案中，本发明提供了包括向受试者按目标谷水平内部的剂量施用mTOR抑制剂(例如，变构抑制剂，例如，RAD001)的方法。在一些实施方案中，谷水平显著地低于与器官移植患者和癌症患者中所用的谷水平。在一个实施方案中，施用mTOR抑制剂(例如，RAD001或雷帕霉素)以产生这样的谷水平，所述谷水平小于产生免疫抑制或抗癌作用的谷水平的1/2、1/4、1/10或 1/20。在一个实施方案中，施用mTOR抑制剂(例如，RAD001或雷帕霉素)以产生这样的谷水平，所述谷水平小于在用于免疫抑制或抗癌适应症的FDA批准包装插页上提供的谷水平的1/2、1/4、1/10或1/20。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向受试者按提供目标谷水平0.1 至10ng/ml、0.1至5ng/ml、0.1至3ng/ml、0.1至2ng/ml、或0.1至1ng/ml 的剂量施用mTOR抑制剂，例如，变构抑制剂，例如，RAD001。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向受试者按提供目标谷水平0.2 至10ng/ml、0.2至5ng/ml、0.2至3ng/ml、0.2至2ng/ml、或0.2至1ng/ml 的剂量施用mTOR抑制剂，例如，变构抑制剂，例如，RAD001。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向受试者按提供目标谷水平0.3 至10ng/ml、0.3至5ng/ml、0.3至3ng/ml、0.3至2ng/ml、或0.3至1ng/ml 的剂量施用mTOR抑制剂，例如，变构抑制剂，例如，RAD001。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向受试者按提供目标谷水平0.4 至10ng/ml、0.4至5ng/ml、0.4至3ng/ml、0.4至2ng/ml、或0.4至1ng/ml 的剂量施用mTOR抑制剂，例如，变构抑制剂，例如，RAD001。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向受试者按提供目标谷水平0.5 至10ng/ml、0.5至5ng/ml、0.5至3ng/ml、0.5至2ng/ml、或0.5至1ng/ml 的剂量施用mTOR抑制剂，例如，变构抑制剂，例如，RAD001。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向受试者按提供目标谷水平1至 10ng/ml、1至5ng/ml、1至3ng/ml、或1至2ng/ml的剂量施用mTOR抑制剂，例如，变构抑制剂，例如，RAD001。
如本文所用，术语“谷水平”指紧邻下一次给药前血浆中的药物浓度或在两次给药之间的最小药物浓度。
在一些实施方案中，RAD001的目标谷水平在约0.1和4.9ng/ml之间的范围内。在一个实施方案中，目标谷水平是低于3ng/ml，例如，在0.3或更小和 3ng/ml之间。在一个实施方案中，目标谷水平是低于3ng/ml，例如，在0.3或更小和1ng/ml之间。
在又一个方面，本发明可以按照与下述目标谷水平相关的量利用除RAD001 之外的mTOR抑制剂，所述目标谷水平与RAD001的指定目标谷水平生物等效。在一个实施方案中，除RAD001之外的mTOR抑制剂的目标谷水平是这样的浓度，所述浓度产生与本文所述的RAD001谷水平相同的mTOR抑制水平(例如，如通过本文所述的方法所测量，例如，P70 S6激酶抑制作用)。
药物组合物：mTOR抑制剂
在一个方面，本发明涉及经配制以便与本文所述的CAR细胞组合使用的包含mTOR抑制剂(例如，如本文所述的mTOR抑制剂)的药物组合物。
在一些实施方案中，mTOR抑制剂经配制以便与(例如，如本文所述)的额外药物组合施用。
通常，本发明的化合物将借助本领域已知的任何常规和可接受模式以如上文所述的治疗有效量，单独的或与一种或多种治疗药组合施用。
可以使用常规溶解方法和混合方法制备药物制剂。例如，散装原料药(例如， mTOR抑制剂或稳定化形式的化合物(例如，与环糊精衍生物或其他已知复合剂的复合物)在本文所述的一种或多种赋形剂存在下溶解于合适溶剂中。mTOR抑制剂一般配制成提供轻易可控药物剂量和给予患者精致和可易操作产品的药物剂型。
本发明的化合物可以通过任何常规途径、尤其肠内方式，例如，口服方式，例如，以片剂或胶囊剂形式、或肠胃外方式，例如，以可注射溶液剂或混悬剂形式、局部方式，例如，以洗剂、凝胶剂、油膏剂或乳膏剂形式、或以鼻用或栓剂形式作为药物组合物施用。在一个方面，mTOR抑制剂与如本文所述的另一种药物(同时或分别)组合施用的情况下，两种组分均可以通过相同途径(例如，肠胃外)施用。备选地，另一种药物可以通过相对于mTOR抑制剂而不同的途径施用。例如，可以口服施用mTOR抑制剂并且可以肠胃外施用另一种药物。
缓释
本文公开的mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂或催化性mTOR 抑制剂)可以按照包含本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或RAD001)的口服固态剂型形式作为药物制剂提供，所述口服固态剂型满足产物稳定性要求和/或具有胜过速释(IR)片剂的有利药代动力学特性，如平均血浆峰浓度降低、药物吸收程度的患者间或患者内变异性及血浆中峰浓度降低、Cmax/Cmin比率降低和/或食物影响减少。提供的药物制剂可以允许更精确的剂量调整和/或减少不良事件频率，因此用本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或RAD001)为提供患者更安全的治疗。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或RAD001)的稳定的延长释放制剂，所述的延长释放制剂是多粒状系统并且可以具有多个功能层和包衣。
如本文所用的术语“延长释放、多粒状制剂指能够经延长的时间段例如经至少1、2、3、4、5或6小时释放本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或 RAD001)的制剂。例如，如本文所述，延长释放制剂可以含有由特殊赋形剂制成的基质和包衣，所述基质和包衣以这样的方式配制，从而使得有效成分在摄入后在延长的时间段范围内可获得。
术语“延长释放”可以与术语“缓释”(SR)或“延长的释放”互换地使用。术语“延长释放”指根据药典-欧洲药典(第7版)片剂和胶囊剂专论和USP药物剂型总论<1151>中的定义，在口服施用后不立即释放而经延长方式释放活性原料药的药物制剂。如本文所用的术语“速释”(IR)指根据“产业指南：“速释固体口服剂型溶出度检验”(FDA CDER，1997)的定义，在不到60分钟内释放85％的活性药物物质的药物制剂。在一些实施方案中，术语“速释”意指在30分钟时间内依维莫司从片剂释放，例如，如本文所述的溶出度测定法中测量。
本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或RAD001)的稳定型延长释放制剂可以以使用本领域已知的测定法(如如本文所述的溶出度测定法)时的体外释放曲线为特征：分别根据USP检验专论711和欧洲药典检验专论2.9.3，向溶出杯在37℃灌装900ml pH 6.8的含有十二烷基硫酸钠0.2％的磷酸盐缓冲液并且使用桨法以75转/分钟进行溶出。
在一些实施方案中，本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或RAD001) 的稳定型延长制剂在体外释放测定法中释放根据以下发行质量标准释放mTOR 抑制剂：
0.5小时：<45％或<40％，例如，<30％
1小时：20-80％，例如，30-60％
2小时：>50％或>70％，例如，>75％
3小时：>60％或>65％，例如，>85％，例如，>90％。
在一些实施方案中，本文公开的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或RAD001) 的稳定型延长制剂在体外释放测定法中不早于45、60、75、90、105分钟或120 分钟释放50％的mTOR抑制剂。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，一个或多个如本文中公开的表达CAR的细胞，任选地与激酶抑制剂(例如，BTK抑制剂如依鲁替尼)组合，可以通过生物聚合物支架，例如，生物聚合物植入物施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的输送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在或合成的生物相容性(例如，基本上不诱导炎性反应或免疫应答) 和/或生物可降解性聚合物。
合适的生物聚合物的例子包括但不限于单独或按任何浓度和以任何比率与任何其他聚合物组合物组合的琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙粘固剂 (CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-五乙酰a-D-半乳糖)、纤维素、壳多糖、壳聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原蛋白、羟基磷灰石、聚(3-羟丁酸酯-共-3-羟基-己酸酯)(PHBHHx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乙烯醇)(PVA)、蚕丝、大豆蛋白和大豆蛋白分离物。生物聚合物可以用促进黏附或移行促进的分子(例如，与淋巴细胞的胶原蛋白受体结合的胶原蛋白拟似肽和/或增强待递送细胞的递送、扩增或功能(例如，抗癌活性) 的刺激性分子)扩张或修饰。生物聚合物支架可以是可注射物，例如，凝胶或半固体，或固态组合物。
在一些实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞铺种到生物聚合物支架上，之后递送至受试者。在实施方案中，生物聚合物支架还包含本文所述的一种或多种额外治疗药(例如，另一个表达CAR的细胞、抗体、或小分子)或增强表达CAR的细胞的活性物质，例如，并入支架的生物聚合物或与之缀合。在实施方案中，将生物聚合物支架在肿瘤处或在足以介导抗肿瘤作用的肿瘤附近注射(例如，瘤内注射)或手术植入。生物聚合物组合物和用于递送它们的方法的额外例子在Stephan等人,Nature Biotechnology,2015,33:97-101；和WO2014/110591中描述。
药物组合物和治疗
本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药物或生理可接受载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的表达CAR的细胞，例如，多个表达CAR的细胞。这类组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，配制本发明的组合物以便静脉内施用。
本发明的药物组合物可以按适于待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的量和频率将由这类因素决定，如患者的状况和患者疾病的类型和严重性，不过适宜的剂量可以通过临床试验确定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如，不存在)可检测水平的杂质，例如，所述杂质选自内毒素、支原体(Mycoplasma)、有复制能力的慢病毒 (RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残余抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自以下的至少一种：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白假丝酵母(Candida albicans)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)A群。
当指出“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、程度感染或转移和患者(受试者)状况的个体差异时确定。通常可以声称，本文所述的包含T细胞的药物组合物可以按104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内部的全部整数值)的剂量施用。T细胞组合物也可以按这些剂量施用多次。细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面，可能希望施用活化的T细胞至受试者并且随后接着回抽血液 (或进行单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞并向患者回输这些活化和扩增的T细胞。这个过程可以每些周实施多次。在某些方面，可以活化来自10cc至400cc抽血的T细胞。在某些方面，活化来自20cc、30cc、40 cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽血的T细胞。
施用主题组合物可以按任何便利方式实施，包括气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、瘤内、淋巴结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹腔内施用至患者。在一个方面，通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的T细胞组合物。在一个方面，通过静脉内注射施用本发明的T细胞组合物。可以将T细胞组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在特定的示例性方面，受试者可以接受白细胞单采术，其中将白细胞收集、富集或离体耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如，T细胞。可以通过本领域已知的方法扩增和处理这些T细胞分离物，从而可以引入本发明的一个或多个 CAR构建体，因而产生本发明的CART细胞。有需求的受试者可以随后接受高剂量化疗标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植同时地，受试者接受扩增的本发明CAR T细胞输注。在一个额外的方面，将扩增的细胞在手术前或在之后施用。
待施用至患者的上述疗法的剂量将随正在治疗的病症的确切性质和治疗的接受者变动。人类施用剂量的放大可以根据本领域接受的惯例进行。对于成年患者，CAMPATH的剂量例如通常将在1至约100mg范围内，通常每日施用1 天和30天之间的时间。优选的每日剂量是1至10mg每日，不过在一些情况下，使用至多每日40mg的更大剂量(美国专利号6,120,766中所述)。
在一个实施方案中，将CAR引入T细胞中，例如，使用体外转录引入，并且受试者(例如，人)接受初始施用本发明的CAR T细胞以及一次或多次后续施用本发明的CAR T细胞，其中一次或多次后续施用是先前施用后小于15天，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天的施用。在一个实施方案中，每周将本发明的CAR T细胞多于一次施用至受试者(例如，人)，例如，每周2、3、或4次施用本发明的CAR T细胞。在一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)每周接受CAR T细胞的多于一次施用(例如，每周2、3或4 次施用)(本文也称作周期)，随后一周不施用CAR T细胞，并且随后将CAR T 细胞的一次或多次额外施用(例如，每周多于一次施用CAR T细胞)施用至受试者。在另一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)接受多于一个周期的CAR T细胞并且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，CAR T细胞每隔1日施用，每周3次施用。在一个实施方案中，将本发明的CAR T细胞施用至少两、三、四、五、六、七、八或更多周。
在一个方面，使用慢病毒载体(如慢病毒)生成表达CAR的细胞。以这种方式生成的细胞(例如，CAR T)将具有稳定的CAR表达。
在一个方面，使用病毒载体(如γ逆转录病毒载体，例如，本文所述的γ逆转录病毒载体)生成表达CAR的细胞，例如，CART。使用这些载体生成的CART 可以具有稳定的CAR表达。
在一个方面，在转导后CART瞬时表达CAR载体4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15天。可以通过递送RNA CAR载体实现CAR的瞬时表达。在一个方面，将CAR RNA通过电穿孔法转导入T细胞中。
可能在使用瞬时表达CAR的T细胞(尤其用携带的鼠scFv的CART)治疗的患者中出现的潜在问题是多次治疗后的变态反应。
在不受这个理论约束的情况下，认为这种变态反应可能由患者形成抗CAR 体液应答(即，具有抗IgE同种型的抗CAR抗体)引起。认为当存在10至14天抗原暴露间断期的情况下，产生抗体的患者细胞发生从(不引起变态反应的)IgG 同种型至IgE同种型的类别转换。
如果患者在CAR疗法过程期间面临产生抗CAR抗体应答的高风险如由 RNA转导产生的那些)，CART输注间断期不应当持续超过10至14天。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详述本发明。除非另外说明，否则仅出于说明目的提供这些实施例并且它们不意在起到限制作用。因此，本发明无论如何不应当解释为受以下实施例限制，反而应当解释为涵盖因本文提供的教授内容变得显而易见的任何和全部变型。
在不进一步描述的情况下，认为使用前文描述和以下示意性实施例，本领域普通技术人员可以制得并利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。以下工作实施例具体地指出本发明的多个方面并且不得解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。
实施例1:鼠抗CD19抗体的人源化
CD19抗体分子可以例如是WO 2014/153270中描述的抗体分子(例如，人源化抗CD19抗体分子)，所述文献通过引用方式完整并入本文。鼠CD19抗体的人源化是临床环境需要的，其中小鼠特异性残基可能在接受CART19治疗 (即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA) 应答。杂交瘤衍生的鼠CD19抗体的VH序列和VL序列从发表的文献(Nicholson 等人,1997,上文)提取。通过移植来自鼠CD19抗体的CDR区到人种系接纳体构架VH4_4-59和VK3_L25(vBASE数据库)上，完成人源化。除CDR区之外，从鼠序列留下被认为支持CDR区的结构完整性的五个构架残基即VH#71、#73、 #78和VL#71、#87。另外，人J元件JH4和JK2分别用于重链和轻链。所产生的人源化抗体氨基酸序列分别命名为FMC63_VL_hz和FMC63_VH_hz1，并且下文在表1中显示。残基编号遵循Kabat(Kabat E.A.等人,1991,上文)。对于 CDR定义，使用Kabat以及Chothia等人(1987,上文)的定义。来自小鼠CD19 的残基以粗/斜体显示。加框的位置#60/61/62表示CDR H2(又称作HCDR2)中的潜在翻译后修饰(PTM)位点。
表1：人源化CD19可变结构域的氨基酸序列(按出现顺序分别是SEQ ID NO:114-117)。
Figure BDA0002395107430001851
这些人源化CD19 IgG用来产生可溶性scFv以测试表达并将scFv用于完整 CARTCD19构建体(参见下文实施例)。有意义的是在人源化期间，CDR H2区域中的位置62偏好是丝氨酸残基而非鼠CDR H2中存在的丙氨酸。鼠序列缺少翻译后修饰(PTM)并且在CDR H2中的位置60/61/62处分别具有天冬酰胺-丝氨酸-丙氨酸。在人源化期间，这产生潜在PTM基序(显示为CDR H2中加框表示的位点)。检验了人源化过程期间生成的PTM位点是否实际上是“真实”PTM位点或仅是理论PTM位点。假设氨基酸基序天冬酰胺后接丝氨酸(NS)可以易遭受翻译后脱酰胺化，而不是轻易显而易见的某种情况。还假设冬酰胺后接脯氨酸以外的任何氨基酸并且随后接续丝氨酸(NxS，x≠P)可能易受翻译后N-糖基化。为了检验这种假设，生成两个IgG变体，其中位置60(已知是糖基化位点)处的天冬酰胺突变成丝氨酸或谷氨酰胺并且分别命名为FMC63_VH_hz2(N60S)和 FMC63_VH_hz2(N60Q)。生成这些构建体以消除潜在翻译后修饰位点(PTM)并检验剩余的活性(参见下文实施例2)。
克隆：
获得编码小鼠和人源化VL结构域和VH结构域的DNA序列，并且为了在来自智人(Homo sapiens)的细胞中表达而优化了构建体的密码子。
将编码VL结构域和VH结构域的序列从克隆载体中亚克隆入适于哺乳动物细胞分泌的表达载体中。将重链和轻链克隆至独立表达载体中以允许共转染。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、多聚腺苷化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体型复制并且在原核生物中复制的元件(例如SV40复制起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素耐药基因和博莱霉素(zeocin)标记)。
表达：
在HEK293F哺乳动物细胞中按1ml规模表达嵌合体和人源化IgG候选物。澄清的上清液用于FACS结合研究。更精确地，将HEK293F细胞在补充有青/ 链霉素的FreeStyle培养基中稀释至5E5个细胞/ml并将1ml转移入24孔圆底深孔平板。将0.5μg轻链哺乳动物表达质粒和0.5μg重链哺乳动物表达质粒连同4μl FuGENE HD(Roche REF 04709705001)稀释于相同培养基中。在室温温育15分钟后，将DNA/Fugene混合物逐滴添加至细胞并置于5％CO2培养箱中在250转/分钟、37℃培养5天。上清液随后通过离心与细胞分离。为了测量IgG 含量，将200μL等分试样置于96孔微量滴定板的各孔中。使用Protein A Dip 和读取生物传感器(Fortebio目录号18-5010)，一式两份测量全部样品和标准物。将平板置于Octet仪(ForteBio)中并且在恒温室中允许平衡至27℃。使用Octet 用户软件3.0版自动处理数据并且通过与IgG标准曲线比较测定浓度。
通过FACS的结合分析：
使用细胞系300.19-hsCD19FL，用流式细胞术结合测定法评价人源化抗体和嵌合抗体。通过用编码全长人CD19编码序列和天然启动子以及博莱霉素抗性基因的载体(hCD19FL/pEF4-myc-His A)转染小鼠前B细胞系300.19，产生这个细胞系。简言之，将300.19细胞用线性化质粒电穿孔，并且随后使用APC 缀合的抗人CD19Ab(来自BD 555415的克隆HIB19)鉴定表达高水平hsCD19 的细胞并随后使用FACS Aria流式细胞仪分选。培养分选的所述hsCD19+细胞并证实其稳定表达高水平hsCD19。
可以用含有表达的IgG的无血清培养基直接进行该结合测定法。全部评价的IgG均归一化至相同的浓度(85nM)，之后按3倍系列稀释度稀释到1.4pM。随后，在96孔板中，将5x105个细胞/孔的等分试样在4℃与稀释的IgG温育 30分钟。将细胞用FACS缓冲液(PBS中的0.5％BSA)洗涤两次，之后添加1:1000 稀释于FACS缓冲液中的检测抗体APC缀合的山羊抗hu IgG，Fc片段特异的(Dianova#109-136-098)。将细胞在4℃进一步温育30分钟，随后在FACS缓冲液中洗涤2次并使用FACS Calibur(BD Bioscience)分析。用GraphPad Prism TM3.0软件以非线性回归分析、S型剂量应答(可变斜率)进行结合曲线绘制(荧光强度中位数对IgG浓度)和EC50确定。
FACS分析显示，全部所评价IgG的表观结合作用可以广泛地变动，一些构建体作为IgG相对于scFv显示出5至10倍EC50偏移。基于EC50值，选择与嵌合参比相比具有2倍范围内或更好结合亲和力的先导候选物。
实施例2：表征衍生自人源化CD19 IgG抗体的抗CD19可溶性scFv片段
使用标准分子生物学技术从实施例1中描述的人源化CD19 IgG产生可溶性scFv片段。这些可溶性scFv用于测试scFv的稳定性、细胞表面表达和结合特性的特征研究中。另外，还实施实验以研究人源化过程期间引入的潜在PTM 的影响。
scFv表达和纯化
为了转染每种scFv构建体，使用PEI作为转染试剂，将大约3e8个293F 细胞用100μg质粒按比率3:1(PEI:DNA)转染。将细胞在摇瓶中的100ml EXPi293表达培养基(Invitrogen)内在37℃、125转/分钟、8％CO2培育。在6 日后收获培养物并用于蛋白质纯化。
通过在3500g离心20分钟收获293F细胞。收集上清液并通过VacuCap90 PF过滤装置(w/0.8/0.2μm Super Membrane,PALL)过滤。添加大约400μl Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)至上清液。将混合物在4℃转动并温育4小时。将它加载于纯化柱上并用含20mM组氨酸的洗涤缓冲液洗涤。将蛋白质用500μl 含300mM组氨酸的洗脱缓冲液洗脱。样品在4℃对PBS缓冲液透析过夜。使用Nanodrop 2000c对蛋白质样品定量。
scFv构象和胶体稳定性分析
通过DSF测定scFv的热稳定性：将10-20μl蛋白质样品与最终稀释度 1:1000的染料Sypro橙(Invitrogen目录号S6650)以PBS中的25μl总体积混合，运行BioRad CFX1000(25℃，2分钟，随后递增0.5℃持续30秒，25℃至 95℃)。
对于分析性SEC实验，20μl PBS中的大约15-20μg scFv蛋白质样品按0.3 ml/分钟流速在n个Agilent 1100系列上进样到TSKgel Super SW2000上。
依据FACS结合的EC50
将小鼠细胞系300.CD19在含0.5mg/ml博莱霉素的RPMI1640中培育。将大约5e5个细胞/每孔转移至BD Falcon 96孔平板。将细胞以900转/分钟离心 (Sorval Legend XT离心机)3分钟。取出上清液。将抗CD19 scFv蛋白质样品稀释于含5％FBS的DPBS中。将样品加入各孔、与细胞充分混合并温育1小时。将细胞在含5％FBS的DPBS中洗涤2次。将细胞与抗聚His PE(R&D)温育1 小时，在FACS分析前(来自BD Biosciences的LSRII)洗涤2次。
采用Proteon的动力学分析
使用Bio-Rad Proteon测定动力学。使用标准胺偶联法，在GLC传感芯片上进行固定化。将scFv样品在乙酸盐溶液pH 4.5中稀释至0.03mg/mL并以流速30μL/分钟施加至芯片持续300秒。随后将CD19配体系列稀释于PBS-Tween 中并以流速50μL/分钟注射120秒，解离时间为480秒。用甘氨酸pH 2.5再生芯片表面。使用1:1朗格缪尔模型拟合数据。
表面表达CART19构建体和通过FACS染色
用不同的抗hCD19 CART瞬时转染的HEK293F悬浮细胞在转染后2天收获。将大约1e6个细胞置于v形96孔平板的每个孔中(Greiner Bio-One,德国) 并且用0.2ml FACS缓冲液(含有4％牛血清白蛋白(BSA)(BSA级分V,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的1XPBS洗涤3次。将细胞重悬于0.2ml含0.2μg 生物素酰化蛋白质L(GenScript,Piscataway,NJ)或100nM hCD19 (AA1-291)-hIgG1 Fc(在NIBRI中生成)的FCAS缓冲液中并在4℃温育30分钟。随后将细胞用0.2ml FACS缓冲液洗涤3次，并且对于含蛋白质L的样品，与 0.2mlFACS缓冲液中的1μl链霉亲和素Alexa Fluor 488(Life Technologies, Grand Island,NY)温育；或对于含hCD19-hIgG1 Fc的样品，与0.2ml FACS 缓冲液中的2μl PE抗人Fcγ(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)在4℃在暗处温育30分钟。用0.2ml FACS缓冲液洗涤3次后，在使用FACSDiva软件(BD BD Biosciences,San Jose,CA)的LSRII仪(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析细胞。将免疫荧光染色分析为活细胞的相对对数荧光并且测量Alexa Fluor 488阳性细胞或PE阳性细胞的百分数。
分析人源化过程期间生成的潜在PMT
有意义的是在人源化期间，CDR H2区域中的位置62偏好是丝氨酸残基而非鼠CDRH2中存在的丙氨酸，如实施例1中所述。检验了人源化过程期间生成的PTM位点是否实际上是“真实”PTM位点或仅是理论PTM位点。生成两个IgG变体，其中位置60处的天冬酰胺(已知是糖基化位点)突变成丝氨酸或谷氨酰胺并且分别命名为FMC63_VH_hz2(N60S)和FMC63_VH_hz2(N60Q)。生成这些构建体以消除潜在的翻译后修饰位点(PTM)并测试剩余的活性。
结果
在293F细胞中表达抗CD19人源化scFv和小鼠scFv和借助His标签纯化。全部人源化scFv的表达和产率均比原始小鼠scFv高得多(数据未显示)。
为了证实身份并评估完整性，与N-聚糖酶F(PNGaseF)温育或不温育的情况下分析scFv构建体，随后均进行高效液相色谱质谱法(HPLC-MS)(参见图3) 和SDS-PAGE(数据未显示)。PNGaseF是从共有序列N-X-S/T/C特异性移除N 联聚糖结构的酶，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。简而言之，将样品于水中稀释至0.1μg/μL并且保持不处理或与PNGaseF按1:2(w/w)PNGaseF:scFv 比率在37℃温育3小时。
使用来自Novex的NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶，进行SDS-PAGE分析。将大约2μgscFv载入每条泳道并且在200V恒流实施电泳40分钟。在电泳后，将凝胶用PhastGel Blue R250染液(Amersham Pharmacia)染色并用10％乙酸、 30％甲醇脱色。
在连接至Xevo-Tof质谱仪的Water’s Acquity UPLC系统上进行HPLC-MS 分析。将大约1μg的每份样品以流速0.5mL/分钟加载于设定至60℃的R 1/10 2.1x 100mm 10μmPOROS柱(Applied Biosciences)上。流动相由0.1％甲酸(A) 和0.1％甲酸、75％异丙醇、25％乙腈(B)组成。在12分钟内用25％-90％B的反相梯度从柱洗脱蛋白质。使用电喷雾正扫描按m/z范围600-4000Da以源锥孔电压斜坡道20-50V进行采集。使用MaxEnt1对所得到的谱解卷积。
人源化过程期间引入糖基化位点。非PTM变体(VH：N60S或N60Q)没有这种额外的形式。该构建体是在HC CDR2中具有N联糖基化共有位点的唯一构建体。从SDS-PAGE分析中，对于观察到二重峰的103101-WT(S/N)以外的全部构建体，未处理的样品作为与各序列的近似分子量相符的单一条带迁移。这个构建体是在H-CDR2中具有N联糖基化共有位点的唯一构建体。用 PNGaseF处理时，二重峰的高分子量条带不再存在，提示部分占据这个位点。类似地，从解卷积的质谱观察到的分子量与从氨基酸序列预测的那些分子是相符的。但是，尽管其他构建体展示单一主要分子种类，但103101-WT(S/N)还具有一个1217道尔顿的群体，该分子量高于用PNGaseF处理后不再存在的序列中预测的分子量。这与存在单一优势N联糖型(基于质量可能是寡甘露糖5)一致。通过MS分析证实糖基化形式的存在，如图3中所显示。
通过差示扫描荧光法(DSF)测量构象稳定性。如图4中所示，小鼠scFv的 Tm是57℃，而人变体显示在约70℃的更高Tm。全部人源化scFv的Tm均比鼠scFv好得多，从而明确显示全部人源化scFv均比鼠scFv更稳定。这种稳定性可能转移到CART19构建体，可能导致改善的治疗性特性。
使用基于SPR的检测方法，通过与hCD19表达细胞结合以及通过与hCD19 抗原结合，测量纯化的scFv的活性。将小鼠细胞系300用来确定scFv的结合作用。针对hCD19的小鼠scFv的EC50是大约06-1.6nM。各个人源化变体显示在低或次nM EC50范围内相同范围的EC50。
实施例3：CD19 CAR构建体
最终CAR构建体中待用的ScFv衍生自实施例1中描述的人源化IgG。在 scFv中VL结构域和VH结构域出现的顺序变动(即，VL-VH、或VH-VL取向)，并且其中3个或4个拷贝的“G4S”(SEQ ID NO:18)亚基(其中每个亚基包含序列 GGGGS(SEQ ID NO:18)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO:107)或(G4S)4(SEQ ID NO: 106))连接可变结构域以产生scFv结构域的完整性，如表2中所显示。
表2显示VH和VL取向和接头长度(“3G4S”作为SEQ ID NO:107公开和“4G4S”作为SEQ ID NO:106公开)的人源化CD19 scFv构建体。
Figure BDA0002395107430001901
Figure BDA0002395107430001911
下文在表3中提供人源化scFv片段的序列(SEQ ID NO:1-12)。使用SEQ ID NO:1-12，连同下文显示的额外序列SEQ ID NO:13-17，生成完整CAR构建体，以产生具有SEQ IDNO:31-42的完整CAR构建体。
前导区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:13)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
前导区(核酸序列)(SEQ ID NO:54)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC CD8铰链区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:14)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8铰链区(核酸序列)(SEQ ID NO:55)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCC CTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCC TGTGAT
CD8跨膜区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:15)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
跨膜区(核酸序列)(SEQ ID NO:56)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
4-1BB胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:16)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
4-1BB胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:60)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACT ACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:17)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:101)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTC TATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGG GACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACT GCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGG GCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:43)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:44)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
IgG4铰链区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:102)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链区(核苷酸序列)(SEQ ID NO:103)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCG TGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGT GGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCT GACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCT GCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACAC CCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTT CTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCAC CCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGG TGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
这些克隆均在衍生自4-1BB的共刺激结构域的信号结构域中含有Q/K残基变化。
表3：人源化的CD19 CAR构建体
Figure BDA0002395107430001931
Figure BDA0002395107430001941
Figure BDA0002395107430001951
Figure BDA0002395107430001961
Figure BDA0002395107430001971
Figure BDA0002395107430001981
Figure BDA0002395107430001991
Figure BDA0002395107430002001
Figure BDA0002395107430002011
Figure BDA0002395107430002021
Figure BDA0002395107430002031
Figure BDA0002395107430002041
Figure BDA0002395107430002051
Figure BDA0002395107430002061
Figure BDA0002395107430002071
Figure BDA0002395107430002081
Figure BDA0002395107430002091
Figure BDA0002395107430002101
表7：鼠CD19 CAR构建体
Figure BDA0002395107430002102
Figure BDA0002395107430002111
对于重链可变结构域，在表4中显示scFv结构域的人源化CDR序列，并且对于轻链可变结构域，在表5中显示scFv结构域的人源化CDR序列。“ID”代表每个CDR的相应SEQ IDNO。
表4.重链可变结构域CDR(Kabat)
Figure BDA0002395107430002112
表5.轻链可变结构域CDR
Figure BDA0002395107430002121
表6是使CD19构建体数字名称与scFv轻链和重链的特定取向、分隔重链和轻链的接头单位(即(G4S)3(SEQ ID NO:107)或(G4S)4(SEQ ID NO:106))的数目和重链CDR2中区分性氨基酸序列相关的鉴定要点。
表6：CD19 CAR命名。
Figure BDA0002395107430002122
CAR scFv片段随后克隆至慢病毒载体中以在单个编码框中并使用表达用 EF1α启动子(SEQ ID NO:100)，产生全长CAR构建体。
EF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAAT TGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGG TGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAA GTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTG CAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTC GCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCG CTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTA AATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCAC ATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGG TGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAA AGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACC CACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACC TCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACT GAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:100)
如实施例4中所述实施人源化CAR构建体的分析。
实施例4：分析CART中的人源化CD19构建体
为了评价借助CAR技术靶向CD19的可行性，将抗CD19抗体的单链可变片段连同CD3ζ链和4-1BB共刺激分子以四种不同布局克隆至慢病毒CAR表达载体中，并且基于CD19 CAR转导的T细胞(“CART19”或“CART19 T细胞”) 响应于CD19+靶的效应T细胞应答的量和质量，选择最佳构建体。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生及靶细胞杀伤或溶细胞活性(脱颗粒)。
材料和方法
产生重定向的人源化CART19 T细胞
人源化CART19慢病毒转移载体用来产生包装入VSVg假型化慢病毒粒子的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与组合了脂质转染胺试剂的三种包装组分VSVg、gag/pol和rev混合，以将它们一起转染至293T细胞中。在24小时和48小时后，将培养基收集、过滤和通过超速离心浓缩。所产生的病毒制备物贮存在-80C。通过在SupT1细胞上滴定，测定转导单位的数目。通过与CD3x28 珠接合24小时并且随后添加适宜数目的转导单位以获得所需百分数的转导T细胞，活化新鲜的幼稚T细胞而产生重定向的CART19 T细胞。允许这些修饰的 T细胞扩增直至它们变得静息并且大小回落，此时将它们冷冻用于稍后分析。使用库尔特粒度分析仪III，测量细胞数目和大小。在冷冻保存前，在LSRII 上通过流式细胞分析测定(在细胞表面上表达CART19)的转导细胞的百分数和这种表达的相对荧光强度。可以通过比较转导细胞百分数与它们的相对荧光强度，从直方图检测CAR的相对表达水平。
评价人源化CART19重定向的T细胞的溶细胞活性、增殖能力和细胞因子分泌。
为了评价人源化CAR19 T细胞杀伤、增殖和分泌细胞因子的功能性能力，将细胞解冻并允许其恢复过夜。除人源化CART19之外，为了比较，也使用鼠 CART19，同时使用SS1-BBz作为非靶向表达的CAR，用于背景CAR/T细胞效应。在全部测定法中“对照”金标准(GS)CART19用来比较测定法变化。重要地，GS CART19是在研究级(即，非临床级)生产条件下产生的细胞并且包括添加IL-2至生长培养。这可能影响这些细胞的总生存力和功能并且不应当作为直接比较其他转导的T细胞群体的研究级生产来评价。T细胞杀伤作用是针对 K562的，一个表达或不表达CD19或Pt14的慢性髓性白血病细胞系，从CLL 患者分离的B细胞。对于这种基于流式细胞的细胞毒性测定法，将靶细胞用 CSFE染色以定量其存在。将靶细胞对CD19表达染色以证实相似的靶抗原水平。按效应子:靶细胞比率10:1、3:1、1:1、0.3:1和0:1的滴定来测量CAR19 T 细胞的溶细胞活性，其中效应子定义为表达抗CD19嵌合受体的T细胞。通过混合适宜数目的T细胞与恒定数目的靶细胞，启动该测定法。在16小时后，移除每种混合物的总体积并且适当地联合洗涤每个孔。将T细胞对CD2染色并且全部细胞用活/死标志物7AAD染色。在最终洗涤后，将沉淀的细胞用预定数目的计数珠以特定体积重悬。通过LSRII流式细胞术收集细胞染色数据并使用珠以FloJo软件分析来定量结果。
为了测量人源化CAR19 T细胞的细胞增殖和细胞因子产生，将细胞解冻并允许其恢复过夜。除人源化CART19之外，为了比较，也使用鼠CART19，同时使用SS1-BBz作为非靶向表达的CAR，用于背景CAR/T细胞效应。在全部测定法中“对照”金标准(GS)CART19用来比较测定法变化。T细胞杀伤作用是针对K562的，一个表达或不表达CD19或Pt14的慢性髓性白血病细胞系，从 CLL患者分离的B细胞。此外，CD3x28珠用来评价T细胞响应于内源免疫信号的潜力。为了分析增殖，T细胞用CSFE染色。增殖是反映亲本标记现在分离入两个子代细胞的CSFE染液的稀释度。该测定法仅测定了1:1和1:0的效应子:靶比率，其中效应子定义为表达抗CD19嵌合受体的T细胞。该测定法一式两份进行并且在混合细胞后24小时，将50％的培养基移除/更换以使用Luminex 10-plex人细胞因子检测组进行细胞因子分析。在5天后，将T细胞对CAR表达染色，表型分型为CD4细胞或CD8细胞并用7AAD对活/死细胞染色。在最终洗涤后，将沉淀的细胞用预定数目的BD计数珠以特定体积重悬。通过LSRII 流式细胞术收集细胞染色数据并使用珠以FloJo软件分析来定量结果。通过计数的细胞数目相对于特定数目的珠而言乘以尚待计数的珠分数，确定总细胞计数。
为了评价人源化CART19细胞对目前成功的鼠CART19类似发挥作用的潜力，我们想要在体外评估它们杀伤靶向的细胞、响应于靶向的抗原而增殖和显示留存迹象的能力。通过包装每个人源化CART19慢病毒构建体并且在SupT1 细胞上滴定它们，我们能够确定病毒的量以归一化转导到大约50％。以相似的平均整合位点/细胞开始，这允许更直接地比较活性。
始于来自普通单采供体的血液，生成了治疗性CAR19 T细胞，其中通过负向选择T细胞、CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞获得所述普通单采供体的幼稚 T细胞。将这些细胞用CD3x28珠在10％RPMI中于37℃、5％CO2活化。
在24小时后，T细胞正在成熟(blasting)并且添加归一化量的病毒。T细胞开始分裂进入对数生长模式，这通过测量细胞计数/ml和细胞尺寸监测。在T 细胞开始静息下来时，对数生长减弱并且细胞尺寸收缩。减慢的生长速率和T 细胞大小逼近约300fl的组合决定待冷冻或重新刺激的T细胞的状态。
存在非常相似的T细胞静息趋势，如依据大小所见。人源化CART细胞与当前的鼠CART19和UTD群体之间几乎重叠的样式显示在活化后人源化 CAR19对正常T细胞扩增未产生不寻常的影响。作为对照，SS1-BBz用来定义不想要的抗原非依赖性CAR活性。总细胞数的扩增特性显示，各个扩增物中实际数目的差异可能主要因细胞的不同起始数目所致。通过归一化T细胞起始数目，观察到全部CART19细胞紧密簇集。此外，在代次较低和脱离群体的细胞系中检测到抗原非依赖性CAR活化的不利影响。
测定了这些表达CAR19的细胞中每者的表面表达水平。针对转导作用归一化的已滴定病毒显示与转导效率(转导细胞百分数)相关的可比较表达水平。从较早包装物外推出一些CAR的滴度，并且虽然它们的转导百分数较低，但如预期那样，它们的MFI也减少。结果表明，与UTD和鼠CAR19 T细胞相比时，不存在人源化CAR19对细胞正常情况下扩增能力的可检测不利影响。
分析了人源化CART19细胞选择性感知细胞上表达的细胞表面特定表位并摧这些毁细胞的能力。野生型K562细胞不表达CD19，但是可以经转导以表达 CD19。比较这些杀伤曲线，滴定效应细胞的量显示表达CD19的那些细胞被摧毁。来自相同供体并用人源化CART19细胞或当前临床用鼠CART19细胞调节的重定向的T细胞显示其杀伤能力无差异。杀伤曲线显示，在靶向来自患者14 的CD19+CLL细胞的人源化CART19细胞之间存在非常相似的杀伤能力。有趣地，存在溶细胞总活性的下降、尤其对GS CART19而言，提示这些细胞可能拥有特定抑制特性。靶细胞上表达的CD19的相似水平表明，表达水平不是细胞杀伤作用差异的原因。
受对照CD3x28珠和表达CD19的靶刺激后，全部构建体中均找了人源化 CART19细胞在看到靶细胞后增殖的必需特性。靶向Pt14 CLL细胞似乎表明，具有轻链至重链取向的scFv的增殖速率略微较大，当具有3x或4xGGGGS键(分别是SEQ ID NO:107和106)时未见偏倚。增殖结果反映细胞总数在5天范围内积累，这表明人源化CART19即2146、2144、2136、2141和2137驱动更多的增殖信号至T细胞。令人印象深刻地，在靶向Pt14 CLL细胞的人源化CART19 细胞中检测到这个结果。
总之，在针对抗原特异性靶的溶细胞活性、增殖反应和细胞因子分泌方面，人源化CART19构建体显示出与当前鼠CART19非常相似的特征。人源化 CART19细胞(2146、2144、2136、2141和2137)在激活靶时驱动更多增殖信号至T细胞的潜力将似乎是这些新构建体潜在地增强治疗应答的额外益处。
结果
使用脱颗粒测定法和细胞因子产生测定法，展示了工程化的CART19 T细胞特异性靶向CD19+细胞。
分析了本发明的人源化CD19 CAR构建体(又称作“huCART19”)转导的 ND317细胞。在CD3x28活化和人源化CART19候选物转导后T细胞扩增期间，相对于鼠CART19和未修饰的(UTD)T细胞，存在T细胞大小的密切相似性。
实验显示在CD3x28活化和不同的人源化CART19候选物转导后T细胞扩增期间，相对于鼠CART19和未修饰的(UTD)T细胞，存在累积的T细胞数目的细微差异性。
人源化CART19的细胞表面表达是可比较的并且它们的表达水平与鼠 CART19非常相似。各直方图的重叠与转导细胞的百分数良好相关，其中所述直方图描绘了每个人源化CART19转导的T细胞的细胞表面表达染色样式和从这些特性计算的平均荧光强度(MFI)。
另外，人源化CART19在靶向表达CD19的靶细胞方面具有相似的特异性细胞毒活性并且与鼠CART19可比较。使用滴定性效应子对靶(E:T)比率，采用靶向CSFE标记的K562cc(图1A，不表达CD19的对照)、K562.CD19(图1B，经转导表达CD19的K562细胞)或Pt14(图1C，来自CLL患者的B细胞)的效应子即人源化CART19细胞，绘制了来自16小时基于流式的杀伤测定法的图。全部人源化CART19细胞的溶细胞活性均类似于和可比较于鼠CART19。不同靶之间的溶细胞活性差异是相似和可比较的，表明鼠CART19的活性在 CART19的人源化形式中保留。
与靶细胞混合后6天CFSE标记的人源化CART19细胞的直方图重叠显示了它们的增殖能力(图5)。从CAR19递送的增殖反应是与靶细胞接合和杀伤靶细胞后的必需反应，以形成阳性临床应答。SS1-BBz CSFE染色的稀释(表明分裂性子代细胞稀释亲本细胞染色)是未静息的T细胞以靶向作用非依赖机制维持分裂的结果。
用模拟TCR和共刺激物CD28内源接合的CD3x28珠评价细胞群体总体增殖能力。数据显示每个细胞群体具有可比较的增殖潜力。与表达CD19的K562 细胞接合时，全部人源化CART19细胞和鼠CART19细胞均强烈和可比较地增殖。人源化CART19细胞还良好响应从CLL患者获得的B细胞，尽管一些细胞似乎略微较少地响应。如图2A和图2B中所示，可以见到人源化CART19 细胞2136、2137、2140、2141、2144和2146具有略微更稳健的增殖，如更大的CSFE染色稀释所证实。这些构建体均具有相同的可变轻链对重链取向，从而表明了这是选择的方向。更仔细观察重链CDR2位点中的氨基酸变化(表1) 揭示，三个变异YSSSL、YQSSL和YNSSL(分别是SEQ ID NO:28、29和30) 各自在看到靶后似乎具有更稳健增殖的构建体中展示出来。此外，这些观察到的构建体具有含有3拷贝亚基(3G4S)(SEQ ID NO:107)的G4S接头和含有4拷贝亚基(4G4S)(SEQ ID NO:106)的G4S接头，表明接头大小不影响功能。
从上文描述的增殖性扩增过程确定在肿瘤接合5天后的细胞总数。细胞显示数目比起初疫苗接种下降，表明为维持存活需要活化。分析内源活化对照以显示，总细胞计数在6天结束时相似。靶向表达CD19的K562细胞的人源化 CART19细胞显示，两种鼠CART19细胞均最终具有较高细胞数目，2146略微高于具有相似值的其他构建体。在暴露于来自患者14(pt14)的B细胞后6天还分析了总细胞数并且总细胞数有意义地显示：先前选出的人源化CART19构建体2146、2144、2136、2141和2137(均具有轻链至重链取向并且代表三个氨基酸变异YSSSL、YQSSL和YNSSL(分别是SEQ ID NO:28、29和30))产生较高的总细胞数，高于鼠CART19。多种人源化抗CD19 CAR克隆之间这种意料之外的区分可以转换成这些构建体转导的CAR T细胞的更好临床疗效。
分析在暴露于不表达CD19的对照K562细胞后从人源化CART19细胞产生的细胞因子的背景水平。使用luminex 30-plex组分析24小时上清液。来自 CD3x28珠刺激内源免疫系统的潜在细胞因子谱显示，每种细胞群体具有可比较的细胞因子谱。
数据还显示，对相同的靶反应时，人源化CART19和鼠CART19以相似水平产生相似的细胞因子谱。当靶向Pt14靶细胞时细胞因子谱是较低的，但是相似。
实施例5：体内ALL模型中的人源化CD19 CAR T细胞治疗。
可以在免疫受损的小鼠中培育原代人ALL细胞，无需在体外培养它们。这些小鼠可以用来测试嵌合抗原受体(CAR)T细胞在代表将会在门诊出现的患者群体的模型中的效能。这里所用的模型HALLX5447在 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中传代2次，之后使用在测试CAR T 细胞效能的研究中。
先前已经显示鼠CD19 CAR T细胞靶向和杀伤原发性人ALL的NSG小鼠模型中的白血病细胞。CD19 scFv(单链Fc可变片段)已经人源化并且本实施例将表达人源化CD19 CAR的T细胞(CAR 2)在体内消除ALL肿瘤细胞的能力与鼠CD19 CAR T细胞比较。这里，已经在(如通过人CD19+细胞的外周血FACS 分析所测试)具有建立的原发性人ALL的小鼠中直接比较这些细胞的效能。在静脉内植入1.5x106个原代ALL细胞后，肿瘤植入后2周实现血液中2.5-4％ CD19+人细胞的疾病负荷。这个CD19百分数是小鼠血液中总细胞百分数。CAR T细胞治疗之前小鼠中的100％人细胞是肿瘤细胞。这个模型中将外周血中 CD19+人细胞的百分数大于2％视为人ALL疾病建立。肿瘤植入后大约2至3 周一旦白血病在小鼠中建立，则用CAR T细胞治疗携带白血病小鼠。每个组中的小鼠将用总计5x 106个人T细胞治疗。用表达CAR的慢病毒转导供体人T 细胞的效率在40-60％之间。在T细胞治疗后，将小鼠每周一次采血，以分析血液中CD19+人细胞百分数作为病情进展的生物标志物。
材料与方法：
原代人ALL细胞：在植入之前未在体外培养原代细胞。这些细胞从ALL 患者收获并且随后转移入小鼠以建立并扩增。在小鼠中扩增肿瘤细胞后，收获骨髓和脾细胞并以分别的批次在存活状态下冷冻以便再植入。将细胞在90％ FBS和10％DMSO中以最小浓度5x106个细胞/毫升冷冻。为了再植入，将冷冻的ALL细胞解冻并且随后静脉内注射入NSG小鼠，旨在产生具有ALL的小鼠，所述小鼠将用于比较人源化CD19 CAR T细胞和鼠CD19 CAR T细胞的抗肿瘤效能。
小鼠：6周龄NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠从Jackson Laboratory接收(原种编号005557)。在实验之前允许动物适应Novartis NIBRI 动物设施至少3天。根据Novartis ACUC规程和指导原则操作动物。
肿瘤植入：体内连续传代的原发人ALL细胞(模型HALLX5447)在37℃水浴中解冻。随后将细胞转移至15ml锥形管并用冷的无菌PBS洗涤两次。随后计数原代ALL细胞并且以15x 106个细胞/毫升PBS的浓度重悬。将细胞置于冰上并且立即(在1小时内)植入小鼠中。将ALL细胞在100μl体积中经尾静脉静脉内注射，总计1.5x106个细胞/小鼠。
给予CAR T细胞：在肿瘤植入后16天对小鼠施用5x 106个T细胞。将细胞在37摄氏度水浴中部分解冻并且随后通过添加1ml冷无菌PBS至含有细胞的管，完全解冻。将解冻的细胞转移至15ml falcon管并用PBS调节至终体积 10ml。将细胞以1000rpm洗涤2次，每次10分钟，并且随后在血细胞计数板上计数。随后将T细胞以50x106个细胞/ml冷PBS的浓度重悬并且保持在冰上直至给予小鼠。对小鼠用100μl CAR T细胞经尾静脉进行静脉内注射，每只小鼠的剂量为5x106个T细胞。用100μl单一PBS(PBS)、未转导的T细胞(模拟)、鼠CD19 CAR T细胞(muCTL019)或人源化CD19 CAR T细胞(huCTL019)处理 5只小鼠/组。未转导的T细胞、muCTL019 T细胞和huCTL019 T细胞均从相同的人供体平行制备。
动物监测：每日监测小鼠的健康状态，包括每周二次测量体重。体重变化百分数计算为(BW当前的–BW开始时的)/(BW开始时的)x 100％。通过外周血FACS分析每周一次监测肿瘤负荷。将小鼠每周一次经尾静脉采血到冰上保持的EDTA涂覆管。从管中取10-20μl血液置于冰上的96孔平板中。将红细胞用ACK红细胞裂解缓冲液(Life Technologies，目录号A10492-01)裂解并且随后用冷PBS洗涤两次。将细胞与人和小鼠Fc区的Fc阻断混合物(Miltenyi Biotec，目录号 130-059-901和130-092-575)温育30分钟并且随后与抗人CD19抗体温育30分钟。将细胞用2％多聚甲醛溶液固定20分钟、洗涤和储存在PBS+2％FBS中过夜，之后在BD Canto或Fortessa上分析、随后进一步使用FlowJoFACS分析软件进行分析。分析细胞以确定携带人HALLX5447 ALL肿瘤的NSG小鼠的血液中人CD19+细胞的百分数。将血液中的CD19百分数报告为均数±均数标准误(SEM)。
使用以下式计算治疗/对照(T/C)的百分数值：
如果ΔT≥0，则T/C％＝100xΔT/ΔC；
如果ΔT<0，则消退％＝100xΔT/T开始时的；
其中T＝在研究最后一天药物治疗组的平均外周血CD19百分数；T开始时的＝在给药起始日药物治疗组的外周血CD19百分数；ΔT＝在研究最后一天药物治疗组的平均外周血CD19百分数–在给药起始日药物治疗组的平均外周血CD19 百分数；C＝在研究最后一天对照组的平均外周血CD19百分数；和ΔC＝在研究最后一天对照组的平均外周血CD19百分数–在给药起始日对照组的平均外周血 CD19百分数。
处于100％至42％范围内的T/C值解读为没有或具有最小抗肿瘤活性；≤42％和>10％的T/C值解读为具有抗肿瘤活性或肿瘤生长抑制作用。T/C值≤10％或消退值≥-10％解读为肿瘤停滞。消退值<-10％报告为消退。
结果：
在人ALL的原发性模型中评价鼠CD19 CAR T细胞和人源化CD19 CAR T 细胞的抗肿瘤活性并且直接比较。在第0天植入肿瘤后，将小鼠随机分组至各治疗组并在第16天用5x106个T细胞静脉内治疗。监测ALL疾病负荷和动物健康直至动物达到终点。在肿瘤植入后第65日，当对照组中的疾病负荷在外周血中高于80％人CD19+细胞时，将全部组中的小鼠安乐死。
从肿瘤植入后第24日起并持续至第65天研究结束，在对照组和鼠CD19 CAR T细胞或人源化CD19 CAR T细胞治疗的组之间观察到疾病负荷的明显差异，p<0.01。鼠CD19 CART细胞和人CD19 CAR T细胞展示出在NSG小鼠中控制人HALLX5447 ALL肿瘤细胞生长的相似能力。两个组均在HALLX5447 植入后第21日显示12-15％人CD19+细胞的外周血疾病峰水平。在肿瘤细胞植入后42天，huCTL019组中人CD19+细胞不可检出，而muCTL019组中人CD19+细胞的百分数降至约1％。鼠CD19 CAR T细胞和人源化CD19 CAR T细胞均在这个模型中产生可比较的控制原代人ALL细胞扩增的能力(P>0.05)。模拟转导的T细胞组的T/C％值是94.40％，显示模拟转导的T细胞没有抗肿瘤活性。 muCTL019组的消退百分数是-89.75％并且huCTL019组是-90.46％，显示这两种治疗均能够引起HALLX5447肿瘤模型消退。图7中显示外周血人CD19+细胞百分数作为这些小鼠中疾病负荷的量度。未接受任何T细胞的PBS治疗组在静脉内植入的NSG小鼠中展示了基线原发性ALL肿瘤生长动力学。模拟治疗组接受了未转导的T细胞，所述T细胞发生与CAR T细胞相同的体外扩增过程。这些细胞在这个肿瘤模型中充当T细胞对照以显示T细胞的非特异性应答。在整个实验期间PBS治疗组和模拟转导的T细胞治疗组均展示肿瘤继续进展。鼠CD19 CAR T细胞和人源化CD19 CAR T细胞均在注射5x106个T细胞1周内控制病情进展并且在这项65天研究的过程期间展示相似的维持疾病控制能力。
在效能研究中以携带原发性人ALL的NSG小鼠模型(HALLX5447)评估鼠和人源化CD19 CAR转导的T细胞的抗肿瘤活性。这项研究展示，鼠CD19 CAR T细胞和人源化CD19 CART细胞(muCTL019和huCTL019)能够在人ALL的原发性模型中发动抗肿瘤应答。此外，muCTL019细胞和huCTL019细胞的这种反应是相同的，如通过外周血疾病负荷所验定。鼠CD19 CAR T细胞和人源化CD19 CAR T细胞均在给予T细胞至小鼠一周内控制原发性ALL生长。最初在治疗后，疾病负荷在减少到实际上不可检出水平前继续增加。采用鼠CAR T细胞或人源化CAR T细胞的一个治疗在65天病情进展的过程期间在控制治疗的小鼠中产生持久的抗肿瘤应答。人源化CD19 CAR T细胞展示了与采用鼠 CD19 CAR T细胞所见相似的发动有效抗CD19肿瘤应答和控制ALL疾病负荷的能力。
实施例6：用于治疗多发性骨髓瘤的CD19 CAR T细胞。
甚至采用化疗、靶向疗法和自体干细胞移植的现行治疗方案时，骨髓瘤仍视为不可治愈性疾病。本实施例描述了用具有嵌合抗原受体的针对CD19的自体T细胞(慢病毒/CD19:4-1BB:CD3ζ；也称作“CART19”或CTL019)治疗多发性骨髓瘤(MM)。这个实施例表明基于靶向表达很低(大部分方法不可检测)水平的CD19的骨髓瘤干细胞和/或肿瘤细胞，针对CD19的CAR疗法具有建立深的、长期持久缓解的潜力。
在治疗侵入性继发浆细胞白血病患者中，我们发现在经多线化疗时已经进展的患者中，救援自体干细胞移植后两天施用CART19导致浆细胞白血病快速清除和非常良好的部分应答。这位患者在治疗之前依赖输血多月；在这种治疗后两个月，她已经恢复其血液计数(正常范围血小板计数和白细胞计数)并且自她因治疗而出院以来已经不需要输血。
因为骨髓瘤细胞天然不表达CD19，CART19治疗在这种肿瘤中引起肿瘤快速而显著应答的观察结果是令人惊讶的。不希望受具体理论约束，推断CART19 能用来治疗骨髓瘤，原因是：(1)尽管依据通过流式细胞术在常规上认为骨髓瘤细胞是CD19表达阴性的，但是存在数据表明骨髓瘤细胞可以表达很低水平的 CD19，从而依据RNA，而不是流式细胞术或免疫组织化学，可检测到表达；和(2)构思靶向克隆型B细胞，认为所述克隆型B细胞是产生多发性骨髓瘤并且特别抵抗化疗的癌性干细胞。在B细胞和骨髓瘤肿瘤细胞之间存在克隆关系，但常规的骨髓瘤疗法针对恶性浆细胞而非B细胞。治疗骨髓瘤的CART19因此靶向与大部分骨髓瘤疗法不同的细胞群体。
在我们的单一患者经历中，该患者具有循环型浆细胞并且我们能够测试其肿瘤细胞的CD19表达。该患者大约1-2％的肿瘤细胞表达CD19抗原。(图8)。因此，推断CART19可以对其很小的肿瘤细胞群体产生直接影响，具有非常良好的部分应答；尽管基于靶向仅很小的CD19+肿瘤细胞群体，但本来没有预料到这样的效果。
在这种情况中，在大剂量美法仑后进行自体干细胞移植挽救之后施用 CART19。尽管这是骨髓瘤的标准疗法，它没有治愈性。另外，这位患者先前已经接受依次自体干细胞移植并且在移植后早期(<6个月)复发。不希望受具体理论约束，与救援自体干细胞移植组合时，使用如本实施例中所述的CART19 细胞可以在治疗骨髓瘤中具有不重叠的机制。
一名难治性多发性骨髓瘤患者在清髓化疗和ASCT后用CTL019治疗。尽管可检测的CTL019丢失并且正常CD19阳性B细胞重生，但缓解维持，这表明这种应答的确不需要持久的CTL019活性。另外，甚至尽管依据流式细胞术和RT-PCR，绝大部分(99.95％)肿瘤性浆细胞是CD19阴性，但这位患者的应答仍得以实现。
这位患者的优势肿瘤性浆细胞群体中缺乏可检测的CD19表达，表明了 CTL019的临床相关靶位于这个优势CD19阴性群体之外。多发性骨髓瘤患者中的肿瘤性浆细胞显示出遗传、免疫表型和功能异质性。整个抗骨髓瘤疗法期间，克隆的存活可能要求特定亚群。在本文报告的患者中，例如，表达CD19的浆细胞小亚群可能已经相对耐受美法仑，但对CTL019敏感。这项研究结果表明与常规抗骨髓瘤疗法偶联时，治疗性靶向该克隆的小亚群可以导致持久的临床获益。
备选地，这位患者中CTL019的临床相关靶可能位于这个肿瘤性浆细胞群体之外。例如，CTL019可以靶向相对小但是产生肿瘤性浆细胞的干细胞群体。因此，多发性骨髓瘤可能是多重晚期B谱系细胞类型的疾病，而不只是终末分化型浆细胞的疾病，从而靶向B淋巴细胞的疗法如CTL019可能从属于直接靶向浆细胞的疗法而有用。
10名额外的多发性骨髓瘤患者将在I期试验中用CART19治疗，迄今已经治疗至少三位患者。
剂量依据和风险/益处
针对这个方案，我们已经选择通过静脉内施用途径使用平缓给药法。这个方案的主要目的是测试向多发性骨髓瘤患者施用CART-19细胞的安全性和可行性。预计的主要毒性是(1)当CAR遇到恶性细胞或正常B细胞上其代用CD19 抗原时细胞因子释放；(2)正常B细胞耗尽，类似于利妥昔单抗疗法；(3)与移植物抗宿主病类似的类固醇反应性皮肤和胃肠道综合征，如扩增/共刺激的自体T 细胞已经与ASCT联合用于MM时先前已经观察到的那样。理论顾虑为 CART-19T细胞的转化或失控增殖是否可能在针对高水平CD19的应答中出现。与另一项CLL患者研究相比，在本申请中这不太成为顾虑，因MM中克隆型B细胞的负担预计远低于那项研究中治疗的难治性CLL患者的恶性B细胞的负担。
剂量依据
对于前3名患者，我们已经在范围从1.4x 107至1.1x 109个CART-19细胞的剂量观察到临床活性。这种观察结果显示，至少在治疗的前3名患者中，不存在明显的剂量应答关系。在剂量上两个对数倍差异施用的患者中观察到完全的应答。因此，不同于被代谢的标准药物，CAR T细胞可以具有大的剂量应答范围。这很可能是因为CAR T细胞能够在患者中广泛地增殖。我们因此设定 1-5x108个CART-19细胞的剂量范围用于输注。在基于体恤使用所提供的这项单一患者研究中，向该患者提供多达5x 108个CART19细胞，无剂量下限。对于10名患者的试验，将向患者提供1-5x 107个CART-19细胞。
总体设计
这是基于体恤使用所提供的单一患者研究；它仿照确定输注经转导以表达 CART-19的自体T细胞是否安全的I期研究。该研究的主要目的是在第一次 ASCT后提前复发之后接受救援ASCT的患者中确定CART-19T细胞的安全性、耐受性和植入潜力。研究方案由一项开放标签前导性研究组成。
在进入时，受试者将接受其MM的骨髓活组织检查及例行实验室和影像学评估。合格受试者将接受稳态单采血液成分术，以获得大量外周血单个核细胞 (PBMC)用于生产CART-19。从PBMC纯化T细胞、用TCRζ/4-1BB慢病毒载体转导、在体外扩增并且随后冷冻供将来施用。记录与已经成功生产T细胞的患者数目相比，尚未充分采集、扩增或生产T细胞的患者数目；预计在这个患者群体中产物生产的可行性不是问题。
受试者将通常已经从准备其第一次ASCT时进行的动员/收集过程储存足够的剩余外周血干细胞，以实施两次额外的ASCT。根据治疗医师偏好的治疗方案，那些未存足够剩余外周血干细胞的受试者将不在其稳态单采血液成分术之前或之后接受第二次动员/收集手术。在初始白细胞单采术后大约2周，受试者将入院并接受大剂量美法仑(第-2日)，接着两天后输注自体干细(第0天)，并且 12至14天后(第+12-14日)，全部受试者均将接受CART-19细胞输注。将入选直至10名患者。
全部受试者将按定期间隔接受血检以评估安全性和CART-19细胞的植入和留存，直至研究的第4周。在第+42日和第+100天，受试者将接受骨髓抽吸/ 活检，以评估骨髓浆细胞负担和CART-19细胞向骨髓的运输情况。将在第100 天根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)标准136作出正式反应评估会，并且将根据多发性骨髓瘤患者的例行临床实践监测TTP。这项研究中测量的主要功效结果将是比较患者初始ASCT后的TTP与这项研究中ASCT后的TTP。
由于这项研究的主要终点是输注CART-19细胞联合ASCT的安全性和可行性，所以研究将采用提前终止规则。简而言之，如果小于2例意料之外的重度不良事件在治疗的前五位受试者中出现，则研究将随后增加额外的5位受试者达到目标入选数10。在入选后续受试者直至5名受试者已经入选并如此观察前，我们将在CART-19输注后观察治疗的受试者40天(即，直至在第42日第一正式反应评估)。对于治疗第二组5名患者，将不要求受试者之间的等待时间。
在6个月强化随访后，将用医疗史、体格检查和血液检验至少按季度评价受试者两年。在这种评价后，受试者将进入通过电话和问卷进行年度随访的累计研究至多额外13年，以评估长期健康问题的诊断，如形成新的恶性肿瘤。
主要研究终点
这项预试验设计成在第一次ASCT后提前复发之后就MM接受救援ASCT 的患者中检验CD1 TCRζ/4-lBB转导的自体T细胞安全性和可行性。
主要安全性终点和可行性终点包括：
出现如NC J CTC2定义的研究相关不良事件：3级体征/症状、实验室毒性和在从输注直至第24周的任何时间可能、或许或明确与研究治疗相关的临床事件。这种将包括输注毒性和可能与CART-19细胞相关的任何毒性，包括但不限于：
a.发热
b.皮疹
c.中性粒细胞减少症、血小板减少症、贫血、骨髓再生障碍
d.肝功能障碍
e.肺的浸润或其他的肺毒性
f.侵袭胃肠道或皮肤的GVHD样综合征。
从患者单采产品生产CART-19细胞的可行性。确定不符合载体转导效率、 T细胞纯度、生存力、无菌性和肿瘤污染的放行标准的所生产产品的数目。
采用CART19的自体干细胞移植后的应答深度和持续期将与每位患者在标准自体干细胞移植后起初实现的应答深度和持续期比较。
受试者选择和退出
纳入标准
受试者必须已经因MM接受过既往ASCT并且已经在干细胞输注的365天内出现进展。已经接受两次既往ASCT作为计划的依次ASCT巩固治疗方案组成部分的受试者是合格的。进展将根据IMWG进展性病情标准或(对于初始 ASCT后达到CR或sCR的患者)自CR复发的标准定义(Durie等人,Leukemia 2006；20(9):1467-1473)。注意：不要求患者必须在既往ASCT的365天内入选，并且患者可以在这项研究中入选前，在既往ASCT后复发/进展之后用其他药物 (包括实验性药物)治疗。
受试者必须已经签署书面知情同意书。
受试者必须具有接受大剂量美法仑的足够重要器官功能，如以下标准所定义，在美法仑输注日之前12周内测量：a.血清肌酐≤2.5或估计肌酐清除率≥30ml/ 分钟和无透析依赖性。b.SGOT≤3x正常上限并且总胆红素≤2.0mg/dl(其中高胆红素血症因Gilbert’s综合征所致的患者例外)。c.左心室射血分数 (LVEF)≥45％或，如果LVEF<45％，则心脏科医生的正式评价确定不存在有临床意义的心血管功能受损。LVEF评估必须已经在入选六周内进行。d.肺功能充分，FEV1、FVC、TLC、DLCO(对肺活量和血红蛋白浓度适当修正后)≥40％预测值。肺功能检测必须在入选六周内进行。
受试者必须具有0-2的ECOG性能状态，除非更高的性能状态仅因骨痛所致。
排除标准受试者必须不：
患有任何活动性和未控制的感染。
患有活动性乙型肝炎、丙型肝炎或HIV感染。
患有如概述的妨碍参与的任何未控制的医学病症。
治疗方案
复发性/进展性多发性骨髓瘤的治疗
在入选之前，患者可以根据其治疗医师偏好接受复发性/进展性多发性骨髓瘤治疗。治疗可以在入选时继续。
患者必须在单采血液成分术之前停止全部治疗2周及在大剂量美法仑之前停止全部治疗2周。如果预计在单采血液成分术和大剂量美法仑之间流逝超过2 周，患者可以在单采血液成分术后根据其治疗医师的决定恢复治疗。
大剂量美法仑(第－2日)
患者将在第-3或-2日入院并且将在开始治疗方案之前接受主治医生检查和例行实验室检验，这将包括监测溶瘤综合征参数。用于监测MM的实验室检验 ((SPEP、定量免疫球蛋白和无血清轻链分析)的血液将在启动治疗前抽取，如果这类检验尚未在入院7天内进行。
大剂量治疗将由第-2日按剂量200mg/m2经大约20分钟静脉内施用的美法仑组成。对于年龄>70岁的患者或根据治疗医师的决定可能不耐受200mg/m2剂量的任何年龄患者，美法仑剂量将降至140mg/m2。全部患者均将接受标准镇吐预防，这可以包括地塞米松和标准抗生素预防。
干细胞回输(第0天)
干细胞输注将在第0天，施用大剂量美法仑后至少18小时进行。干细胞将根据标准机构实践在前驱给药后经大约20-60分钟静脉内输注。应当输注至少2 x 106个CD34+祖细胞/kg体重。此外，至少1x 106个CD34+祖细胞/kg体重应当用作备份干细胞产品在延迟植入或晚期移植失败的情况下输注。G-CSF应当皮下施用，始于第5日，根据标准机构实践给药。其他支持性护理措施如输血支持将是根据标准机构指南进行。
CART19细胞输注(第+12-14日)
将给予CART-19转导的T细胞的单剂量，其由多达5x107个CART-19细胞组成。输注CD19 TCRζ4-1BB载体转导的细胞的最小可接受剂量是1x107。在干细胞输注后第+12-14日作为单剂量通过快速静脉内输注给予CART-19细胞。如果患者在12-14日窗口中不符合本文所述的任何纳入标准，则CART-19 输注可以延迟超过第+12-14日直至该标准满足。
来那度胺维持疗法
在他们的第一次ASCT后接受来那度胺并耐受维持的受试者在大约第+100 天再启用来那度胺维持疗法，假定根据治疗医师的判断不存在禁忌症。起始剂量将是10mg/天，除非先前经验决定用于特定患者的备选起始剂量。维持治疗将继续直至病情进展或不耐受。
研究药物的配制和施用
CART-19T细胞在CVPF中配制并且直至符合FDA批准的输注细胞放行标准(例如，细胞剂量、细胞纯度、无菌性、平均载体拷贝数/细胞等)才从CVPF 放行。一旦放行，将细胞送至床边供施用。
细胞解冻：将冷冻的细胞在干冰中转运至受试者的床边。将细胞在床边使用维持在36℃至38℃的水浴解冻。温和地按摩输液袋直至细胞已经刚刚解冻。容器中不应当留有冷冻的团块。如果CART-19细胞产品似乎已经受损或袋子泄漏或否则似乎受损，不应当输注它并应当将它返回CVPF，如下文详述。
前驱给药：T细胞输注后的副作用包括一过性发热、寒战和/或恶心；综述参见Cruz等人(Cytotherapy 2010；12(6):743-749)。推荐受试者在输注CART-19 细胞之前用对乙酰氨基酚和盐酸苯海拉明前驱给药。这些药物可以根据需要每六小时重复使用。如果该患者持续出现对乙酰氨基酚无法缓解的发热，则可以开具一个疗程的非甾体抗炎药。推荐患者在任何时间不接受全身性皮质类固醇类如氢化可的松、泼尼松、甲泼尼龙或地塞米松，危及生命的急救例外，因为这可以对T细胞具有不良作用。
发热反应：在如下不太可能的情况时：在输注CAR T细胞后受试者形成败血症或全身性菌血症，则应当启动适宜的培养和医疗管理措施。如果怀疑污染的CART-19T细胞产品，则可以使用储存在CVPF的归档样品，对产品再检验无菌性。
施用：免疫抑制患者的使用注意事项是，输注将在Rhoad的隔离室内进行。将转导的T细胞经具有三通旋塞阀的18号无乳胶Y形输血套件，以大约10mL 至20ml/分钟的流速，通过快速静脉内输注法施用。输注的持续时间将基于待输注的总体积和推荐的输注速率。每个输注袋将粘附有含以下内容的标签：“仅供自体使用”。此外，标签将具有至少两个唯一标识符，如受试者的姓名首字母缩写、出生日期和研究编号。在输注之前，两位个体将在受试者在场下独立地验证全部这种信息并因而确认该信息正确地匹配参与者。
急救医疗设备(即，急救手推车)将在输注期间在受试者出现变态反应或重度低血压危象或任何其他输注反应的情况下可获得。生命体征(温度、呼吸速率、脉搏和血压)将在输注之前和之后取得、随后每15分钟取得至少1小时并且直至这些体征令人满意和稳定。将要求受试者不得离开直至医师认定他或她可安全离开。
包装
输注将由单剂量1-5x107个CA T19转导的细胞组成，输注的最小可接受剂量是1x107个CART-19细胞。每个袋将含有等份(依赖于剂量的体积)的冷冻介质，所述冷冻介质含有以下输注级试剂(％v/v)：31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖(5％)、0.45％NaCl、至多7.5％DMSO、1％葡聚糖40、5％人血清白蛋白。
单采血液成分术
在单采中心实施大体积(12-15升或4-6个血液容积)单采血液成分术。在这个手术期间获得供CART-19的PBMC。从单个白细胞单采术中意图收获至少 5x109个白细胞以生产CART-19T细胞。还获得用于FDA回顾要求和研究的基线血液白细胞并冷冻。细胞产品预计大约2-4周后做好放行准备。流式细胞术淋巴细胞亚群定量，包括测定CD19和CD20 B细胞。对人抗VSV-G和抗鼠抗体(HAMA)进行基线评估。如果受试者先前已经根据现行良好产生实践在临床细胞和疫苗生产设施储存了足够的单采收藏物，则这些细胞可以用作CART-19 产生的细胞来源。使用储存的单采产品将避免受试者接受额外单采收藏的费用、时间和风险。
细胞减少性化疗
淋巴细胞清除的化疗将是如本文所述的大剂量美法仑。
CART-19输注
在干细胞回输后第+12-14日，输注将开始。
第一次输注之前第+12-14日，患者将接受血常规CBC连同分类计数及 CD3、CD4和CD8计数评估，因为给予化疗以部分地诱导淋巴细胞减少症。
首次给药将使用单剂量施用。细胞在患者的床边解冻。解冻的细胞将按快得可忍受的输注速率给予，从而输注持续时间将是大约10-15分钟。为了促进混合，将使用Y-适配器同时施用细胞。受试者将如文中所述输注并前驱给药。将评估受试者的生命体征并且在给药之前、在输注结束时和此后每15分钟持续 1小时进行脉搏血氧测定法，并且直至这些是稳定和令人满意的。在第一次输注之前的任何时间和在每次输注(并送至TCSL)后20分钟至4小时，获得测定基线CART-19水平的血液样品。
出现与大剂量美法仑相关的毒性的患者将延迟其输注方案直至这些毒性已经消散。要求延迟T细胞输注的具体毒性包括：1)肺部：要求补充氧以保持饱和度大于95％或X光胸片上存在进展的放射摄影异常；2)心脏：医疗管理未控制的新的心率失常；3)需要血管加压剂支持的低血压；4)活动性感染：T细胞输注48小时内细菌、真菌或病毒阳性血液培养。
毒性管理
未控制的T细胞增殖。与同种异体或自体T细胞输注相关的毒性已经用一个疗程的药理免疫抑制作用管理。已经报导T细胞相关毒性响应于全身性皮质类固醇类。如果出现未控制的T细胞增殖(3级或4级与CART-19细胞相关的毒性)，受试者可以用皮质类固醇类治疗。受试者将用甲泼尼龙(2mg/kg静脉内，分成间隔八小时一次，共2天)脉冲治疗，随后快速递减。
此外，基于按另一个方案治疗的受试者的观察结果，存在巨噬细胞激活综合征(MAS)的某种顾虑，尽管预计CD19+肿瘤负荷在骨髓瘤患者中比CLL患者中低得多。这种毒性的治疗和治疗时程将根据患者的医师和研究者的决定。建议的管理措施可能包括：如果受试者出现持续超过连续2天的大于101°F的发热并且不存在感染证据(阴性血液培养物、CXR或其他来源)，可以考虑托珠单抗4mg/kg。可以根据医师的决定考虑增加皮质类固醇类和抗TNF疗法。
B细胞耗尽：B细胞耗尽和低丙球蛋白血症可能将出现。这是采用抗CD20 定向疗法常见的。在有临床意义的低丙球蛋白血症(即全身性感染)情况下，受试者将依据既定的临床给药指导原则给予静脉内免疫球蛋白(IVIG)，以恢复正常水平的血清免疫球蛋白水平，如已经用利妥昔单抗那样实施。
原代移植体失效：与第一次ASCT相比，原代移植体失效(即，无植入)可能在第二ASCT后更常见。合规标准规定，根据治疗医师的决定在原代移植体失效的情况下，足够的干细胞必须可用于挽救性回输。
结果
在这项正在进行的试验中，现在已经用CTL019治疗了三名抵抗治疗的晚期多发性骨髓瘤患者。这些患者中两位患者的结果显示，基于三月时间点处的主要效力评估，二者均已经具有来自CTL019治疗的明显抗肿瘤作用。第三位患者尚未达到三月时间点。下文更详细地描述两位患者的结果。
第一位骨髓瘤患者已经完成她的+100天反应评估，并且她对CART19疗法具有很好的反应。进行了以下试验，结果如下：
-SPEP/免疫固定：阴性
-尿免疫固定：在其免疫固定时不可测量的模糊κ轻链条带(在第38日也存在，因此并非新条带)
另外，该患者符合严格完全缓解标准，所述严格完全缓解标准包括：
-无血清轻链比率：正常
-骨髓活组织检查：阴性
-IgA免疫表型分型：IgA低于检测限
除从尿免疫固定的不可测量的模糊κ轻链条带结果之外，该患者符合“严格完全缓解”的全部标准。图39中显示在3个时间点(第-2日、第+38日、第+103 日)的浆细胞免疫表型分型总结，并且该总结表明患者的IgA低于检测限。该总结显示在第-2日的重骨髓瘤负担并且在第+38日和第+103日无可检测负担，这将该患者依据流式分析划归为“MRD阴性”。在第+103日，该总结显示正常、多克隆、CD19+浆细胞和B细胞恢复。该患者没有疾病或治疗的症状并且功能上如同正常人。
治疗的第二位患者尚未达到+100天时间点。但是，在当前时间点，她表现良好，但是这太早以至于不能确定CTL019输注的影响。
实施例7：套细胞淋巴瘤的激酶抑制剂/CAR19 T细胞联合疗法
适应性T细胞疗法为治疗淋巴样恶变(lymphoid malignancy)保留了可观的前景。使用针对B细胞特异性CD19抗原的嵌合抗原受体(CAR)转导的自体T 细胞(CAR19 T细胞/CART19细胞)过继转移，使用CTL109，在小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(SLL/CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中临床应答有前景。我们最近已经报告了在使用CD19特异性CAR(CAR19 T细胞/CART19 细胞)治疗CD19阳性恶性肿瘤的I期试验中入选的3位化疗难治性SLL/CLL 患者的初步数据。所用的方法涉及使用慢病毒对患者衍生的大体积T细胞基因修饰以表达靶向CD19的CAR，所述CAR含有衍生自CD137和TcRz的信号传导结构域。对于这项研究，使用我们的抗CD3和-CD28珠扩增方法扩增细胞并且在清除淋巴细胞后无细胞因子支持情况下提早输注细胞(Kalos M等人, (2011)Sci Transl Med.3:95ra73；和Porter DL等人,(2011)N Engl J Med.365: 725-733)。这些早期结果极有前景：(i)在单一疗程后，2/3患者实现完全缓解并且在治疗后15多个月的现在保持无疾病，而三分之一用皮质类固醇类治疗的患者在输注T细胞后很快展示强烈的部分应答。(ii)在这些患者中，我们能够概括出被认为是基于过继T细胞疗法的策略的最终效能所要求的要素，即稳健的体内T细胞扩增、疾病根除、T细胞缩减和长期功能性留存。迄今，已经治疗10 位SLL/CLL患者，2位保持完全临床缓解和分子缓解，5位出现部分缓解并且 3位显示缺少可度量的应答。在另一项研究中，两位B细胞ALL患者实现完全缓解，1位复发伴以白血病细胞缺少CD19表达。
在大的细胞转化之前和之后的套细胞淋巴瘤(MCL)也将可能从基于 CART19的过继疗法获益、尤其与激酶抑制剂(如直接影响MCL细胞的那些) 组合时。
为了进一步分析基于CART19的过继疗法联合激酶抑制剂的组合，高通量筛选法将用来评价与CART19细胞组合的几种抑制剂，所述抑制剂靶向对MCL 发病机制关键的激酶：CDK4/6、BTK和mTOR。在MCL异种移植物小鼠模型中更详细地在体外和在体内评价最有前景的组合，所述组合最终可以指导形成在MCL患者中评价小分子激酶抑制剂和CART细胞免疫疗法组合的临床方案。
在这项研究中，进行临床前研究以确定这种方法在各种MCL亚型中的潜在临床疗效以及评价使用单独的或与从激酶家族选择的蛋白质的小分子抑制剂组合的CART19细胞治疗性靶向MCL细胞的能力，其中所述激酶家族的表达和活性对MCL细胞存活和生长至关重要。
研究计划
在临床前设计中，将评价使用激酶的抑制剂治疗性靶向MCL细胞(培养细胞和原代型细胞)的能力，所述激酶在MCL细胞和CART19细胞中具有记录的致病相关性。高通量MTT测定法将用来确定这些抑制剂的影响以鉴定抑制剂应用的潜在最佳组合、给予和时程。将在MCL异种移植模型中首先在体外并随后在体内更详细地就细胞功能、基于磷酸化的细胞信号传导和基因表达方面评价最有前景的2-3种组合。
表征激酶抑制剂/CART-19细胞组合有效靶向MCL细胞的能力的体外研究
在这个目标下，研究上文所列的详细功能性、表型、生物化学和分子测定法，旨在体外研究小分子激酶抑制剂对MCL细胞的影响以及研究CART19细胞和MCL细胞之间相互作用和抑制剂对这些相互作用的影响。
实现这个目标的基准将是产生综合数据集以：
i.记录CART19细胞被培养的和原代的MCL细胞活化并裂解这些细胞；
ii.显示当相对于CART19细胞施用，就抑制剂的剂量和某种情况下其时程而言适当应用时，选择的激酶抑制剂增强彼此和/或CART19细胞在没有不利影响CART19细胞功能的情况下消除MCL细胞的能力；和
iii.对于使用NSG小鼠的体内MCL异种移植实验中待使用的BTK抑制剂，建立了用于日程和给药的方案。
这项研究的目标例如是评价是否鉴定到靶向对MCL病理生物学至关重要的激酶(CDK4、BTK和mTOR)的小分子抑制剂与CART19细胞的最佳治疗性组合、监测CART19活性并表征治疗对MCL的功能性、生物化学和分子影响。
这些研究应当为目标2中待体内评价的BTK治疗激酶抑制剂联合CART19 疗法的时序和剂量计划建立合理方案。
评价单独的和与BTK抑制剂组合的CART19细胞靶向滤泡淋巴瘤的能力的体内研究
在这个目标下，我们将在动物模型中测试选择的抑制剂/CART19细胞组合影响建立的和原代MCL细胞生长的能力。
实现这个目标的基准将是产生数据集以：
i.显示如与对照(单一药剂和模拟药剂治疗的动物)相比，选择的抑制剂 /CART19细胞组合明显增强植入MCL的动物存活；
ii.为待作为未来临床试验基础使用的选定激酶抑制剂/CART19组合的计划和给药建立方案。
这项研究的目的包括评价目标1中对鉴定的激酶抑制剂/CART19加BTK 抑制剂组合定义的治疗和施用计划并且测试BTK治疗是否与CART19协同靶向异种移植有(培养和原代)MCL细胞的NSG小鼠中的MCL。
以下细胞类型、化合物、动物和实验方法将用来实现所提出的目标：
MCL细胞：
4个MCL细胞系(Jeko-1、Mino、SP-49和SP-53)和来自15例原发性MCL(12 例寻常的和3例母细胞样)的活细胞冷冻的样品。尽管细胞系自发地良好生长，但原代细胞将单独培养以及在采集自HS5骨髓间质细胞的条件培养基存在下培养以改善它们的生存力。
CART19细胞
使用慢病毒转导并使用既定方案生成经工程化表达CAR19的原代人T细胞(KalosM等人,(2011)Sci Transl Med.3:95ra73；和Porter DL等人,(2011)N Engl J Med.365:725-733)。在单个转导事件后，T细胞一般以超过30％的频率表达CAR19。
我们的研究将使用来自5位SLL/CLL患者的CART19群体(具有1x107个细胞/小瓶的50-100小瓶/患者已经可获得)。使用抗CAR19-特异性独特型抗体 (STM)鉴定CART19细胞。使用CD19+NALM-6、CD19阴性K562和CD19- 转导的K562细胞系，在NSG小鼠中以标准化方式在体外和在体内控制CART19 活性。虽然CART19细胞功能并非MHC限制性的，但是也将使用来自至少5 位MCL患者的CART19细胞。
激酶抑制剂
将测试以下激酶的抑制剂：CDK4/6(PD0332991)、BTK(PCI-32765)、 mTORC1(雷帕霉素)、MNK(4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(Marzec M等人,PLoS One 6:e24849)；和一种来自Eli Lilly的新化合物(Gupta M等人, (2012)Blood 119:476-487)；mTOR(OSI-027)和双重 lPI3K/mTOR(PF-04691502)。
化合物将首先按预定的有效剂量范围(包括患者血清中达到的无毒浓度)评价，以确保最佳激酶抑制作用。
动物：
体内实验将使用NOD-SCID-IL-2Rgc失效(NSG)小鼠进行，所述小鼠是杂交种并使用从Jackson Laboratory(Bar Harbor)获得的种鼠，从干细胞和异种移植中心可获得。小鼠将在使用HEPA过滤的微隔离器的无菌条件下圈养并饲以照射的食物和酸化水。
在实验持续期，将移植的小鼠用抗生素(新霉素和多粘菌素)治疗。6至8周龄动物，雄性和雌性均等混合，将根据研究机构动物护理和使用委员会批准的方案用于全部研究。
我们已经在此前的T细胞过继转移研究中专门使用NSG动物评价CART19 细胞的差异活性(Witzig TE等人,(2010)Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2010:265-270，MTT测定法)。评价MCL细胞生长的高通量MTT测定法将首先对应于单独或以多种组合应用的激酶抑制剂进行。这种测定法能够同时测定细胞增殖速率和生存力，从而允许在CART19细胞存在或不存在下高效评价小分子抑制剂的许多可能组合。这项分析的关键方面将在潜在协同、加合或拮抗效应方面表征药物作用。此外，将评价小分子抑制剂对CART19细胞的影响。尽管BTK抑制应当是B细胞特异的，但是mTOR和CDK4/6抑制将影响CART19细胞。建立恰当的药物施加时程以最大限度减少它们对CART19 细胞的潜在影响将是这些实验的目标之一。
为了进行试验，将MCL细胞以1x104个细胞/孔、一式三份疫苗接种在96 孔板中并暴露于培养基或多种组合下的激酶抑制剂和多种浓度的CART-19细胞。在48小时和74小时后，通过使用MTT还原比色测定法(Promega)测定代谢活跃细胞的相对数目。
将使用Student t检验评价对照和不同处理条件的各均值(+/-S.D.)之间差异的显著性，p值<0.05视为统计显著的。
细胞增殖和凋亡测定法：
接着将在CFSE标记测定法和末端dUTP切口末端标记(tunel)测定法中评价最有前景的药物组合，以分别确定MCL细胞生长抑制的细胞抑制组分和细胞毒组分。在前一测定法中，将MCL细胞用CFSE标记，添加BTK抑制剂和 /或未标记的CART-19细胞。在48小时后，培养的细胞将通过FACS分析MCL 型细胞的CFSE标记样式。使用来自BD Biosciences的ApoAlertDNA片段化分析试剂盒，根据制造商的方案进行Tunel测定法。
简言之，MCL细胞将与抑制剂和/或CART19细胞一起培养48或72小时。在洗涤后，将细胞用标记的抗CD20抗体染色并透化、洗涤以及在37℃在TdT 缓冲液中温育1小时。终止反应，洗涤细胞、重悬并使用CellQuest PRO软件，通过流式细胞术分析。
CART19功能测定法：
我们将使用CD107脱颗粒、胞内细胞因子分泌(ICS)测定法、增殖细胞裂解测定法和多重细胞因子检测测定法(32)，测量CART19细胞对MCL细胞系的效应子活性。对于脱颗粒测定法和ICS测定法，效应子(T细胞)和靶(肿瘤细胞) 将在抗CD107抗体存在下按0.2:1的E:T共温育4小时，随后按照既定方案对表面标志物(CAR19、CD3、CD8、CD4)和胞内细胞因子标志物染色。将使用基于流式细胞术的细胞裂解测定法评估MCL细胞的细胞裂解。对于增殖测定法，效应细胞将预加载以CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯羧基-荧光素-琥尼基酯酶)、与靶细胞按0.2:1的E:T混合、在37℃共温育4天、对表面标志物(CAR19、 CD3、CD8、CD4)染色并通过流式细胞术分析CFSE的稀释情况。
多重细胞因子测定法
我们将使用基于Luminex的珠测定法如(STM32)中所述那样测量CART19 细胞响应于MCL靶时的细胞因子产生。对于这些分析，我们将使用同时测量血清、血浆、或组织培养上清液中IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40/p70)、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、 IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、嗜酸性粒细胞趋化因子、 RANTES、MCP-1、VEGF、G-CSF、EGF、碱性FGF和HGF的Invitrogen 30-plex 试剂盒。
CART19细胞的多参数流式细胞分析：
使用四色流式细胞术和通过宾夕法尼亚大学Abramson癌症中心流式细胞术中心可获得的配备4种激光(蓝色(488nM)、紫色(405nM)、绿色(532nM)和红色(633nM)的定制BDLSR II，我们将测量与肿瘤细胞共温育后，与功能性活化相关的表面标志物调节作用和CART19细胞上的抑制作用。将使用FlowJo 软件(TreeStar,San Carlos,CA)分析全部流式细胞术数据。使用排除死细胞和靶细胞(CD19+)的抛弃通道和检测CART19细胞(STM)的CAR19独特型特异性试剂，这些分析将基本上如(STM42)中所述那样进行。我们将在与肿瘤细胞共温育后在CART19阳性细胞和阴性细胞(CD3+/CD8+和CD3+/CD4+)上(根据需要在完整细胞或透化细胞上)评价以下标志物。我们已经为这些标志物建立多参数组：
-活化/效应子功能：CD25、CD154、CD134、CD137、CD69、CD57、CD28、 T-bet
-抑制CD152(CTLA4)、PD1、LAG3、CD200
-抑制(Treg)CD4+/CD25++/CD127-、Fox-P3+
同时，针对通过CD19和CD5染色鉴定的MCL细胞检查以下免疫抑制蛋白的表达：CD174(PD-L1)、CD173(PD-L2)和CD152。
抑制剂对细胞信号传导的影响：
研究的这个部分将仅关注选择的化合物；经证明在上文描述的功能测定法 (细胞生长、增殖和凋亡)中最有效的化合物。分别研究每种药物和所选择组合的影响并且将针对特定化合物调整研究。例如，尽管mTORC1和MNK抑制剂组合将评价mTORC1信号传导、尤其eIF-4E磷酸化，但是BTK抑制将重点在于 PI3K-AKT途径和MEK-ERK途径和CDK4/6对Rb磷酸化的抑制作用。这些研究将使用磷酸特异性抗体如所述那样通过蛋白质印迹法进行(Marzec M等人, (2006)Blood.108:1744-1750；Marzec M等人,(2008)Blood 111:2181-2189； Zhang Q等人,(2011)Proc Natl Acad Sci USA 108:11977-11982)。简言之，将裂解MCL细胞并且将使用Lowry法(Bio-Rad)分析蛋白质提取物并将其载入聚丙烯酰胺凝胶中。为了检验蛋白质磷酸化，印迹的膜将与磷酰特异性抗体(例如对 S6rpS235/236、eIF4ES209、4E-BP1T37/46、4E-BP1T70特异的抗体(Cell Signaling))温育以评价mTORC1和MNK活性和它们的抑制状况。接下来，膜将与适宜的过氧化物酶缀合的第二抗体温育。印迹物将使用来自Amersham的 ECL Plus系统显色。
基因组规模的基因表达分析：
抑制细胞信号传导一般导致基因转录变化。为了确定选择的抑制剂或一些抑制剂对MCL中基因转录的影响，基因组规模的基因表达分析将如以下文献中所述那样进行：Marzec M等人,(2008)Blood 111:2181-2189；Zhang Q等人, (2011)Proc Natl Acad SciUSA 108:11977-11982。简言之，细胞将按一式三份培养物用选择的抑制剂或其稀释物处理0、4和8小时。进一步纯化总RNA以富集mRNA，其中逆转录、标记并通过与针对全部已知基因外显子的Affimetrix 微芯片杂交而检查所述mRNA。归一化微阵列数据并如GeneSpring和MAS5 算法中所执行那样的使用RMA总结。使用错误发现率(FDR)，所得到的p值将通过Benjamini-Hochberg上升法针对多重检验修正。差异性表达检验将使用多种工具(包括SAM和PartekPro)完成。新出现的目的基因将随后基于表达模式聚类(GeneSpring或Spotfire)并且将使用NIH-David作为检索工具，在KEGG、 Ingenuity Pathway Analysis和GeneOntology数据库中分析聚类的功能组和途径。对于基于数据鉴定的基因，将依据定量RTPCR对多种MCL类型(标准与母细胞样和SOX11阳性与SOX11阴性)的样品(至少20份)的更大汇集物进行独立表达确认。
全外显子组DNA序列分析：
为了就其发病机制方面更好表征MCL病例及更好表征对本文提到的联合疗法的应答到可能的程度，检查外显子组DNA序列。使用NimbleGen Sequence Capture 2.1M人外显子组阵列和HiSeq 2000/1000Illumina仪，进行MCL DNA 样品和正常外周血DNA样品的全外显子组捕获和下一代测序法。
在异种移植的肿瘤中评价治疗作用：
使NSG小鼠携带MCL肿瘤(肿瘤衍生自两种MCL细胞系：Jeko和Mino 及作为组织碎片或较不优选地作为细胞悬液植入的原代细胞)。通过皮下植入肿瘤小碎片增殖肿瘤。一旦肿瘤达到直径0.2-0.3cm，启动疗法。通过灌胃按预选择的剂量和时程在体外施用激酶抑制剂(例如，鉴于其B细胞特异性和预计对 CART19细胞缺少任何抑制性作用，我们期望与CART19细胞同时施加BTK 抑制剂)。将CART-19细胞以1x107/动物的剂量注入带瘤小鼠的尾静脉，将激酶抑制剂通过灌胃按预选择的剂量和时程在体外施用，所述剂量是我们已经建立的足以可重现地根除恶性细胞并且与此同时不引起异种移植物抗宿主病的剂量。生成CART19细胞的大型主原液(1x 1010)并冷冻，以最大限度减少与效应细胞差异相关的变异性。来自这些实验的主要度量是存活，我们使用 Kaplan/Meier曲线评估所述存活。作为次要度量，我们在输注T细胞后评价 CART19细胞在动物中的差异性扩增。这将因如下事实成为可能：输注的T细胞产品将由CART19阳性细胞和CART19阴性细胞按限定的比率组成。对于这些分析，将动物每周一次通过尾静脉采血法放血(每次25微升)，随后进行红细胞溶解和对人CD3、CD4、CD8和CART19染色。CART19细胞偏好性扩增(按 CART19+/CART19-比率增加至少2倍)将是MCL驱动的CART19细胞选择性扩增的证据。为了评估治疗结果，根据下式如下测量植入的皮下肿瘤体积：体积＝0.4ab2，其中a和b分别指地肿瘤的长直径和短直径。使用标准t检验对小鼠处理组和非处理组之间的肿瘤体积差异作统计分析。小鼠在实验结束时 (>30天)或如果肿瘤达到直径>1.2cm或当动物痛苦的任何迹象明显时处死。使用标准t检验对小鼠处理组和非处理组之间的肿瘤体积差异作统计分析。收获、加工肿瘤以及内脏并通过组织学对其分析，并且对于选择的组织，使用一组针对B细胞(CD20、CD79a、Pax-5、CD10、BCL-6)和T细胞(CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、TIA-1)和增殖标志物Ki-67的抗体通过免疫组织化学分析。
统计分析：
在体外功能研究中，使用Student t检验评价对照和不同处理条件的各均值 (+/-S.D.)之间差异的显著性，p值<0.05视为统计显著。基于我们的此前经验，预计各小鼠实验组之间的差异大。因此，假设治疗手段差异和标准偏差之间比率是至少3(这是预计的)，则将10只NSG小鼠用于每个治疗组，这将在双侧双样品t-检验时以0.05I类错误水平确保至少90％把握度。将数据显示为均数± SEM。使用双样品t检验进行各组间比较。p<0.05的值视为显著。对于无肿瘤存活研究，将含10小鼠的组用于存活比较，并且记录疾病状态(肿瘤与无肿瘤) 和每只小鼠的无肿瘤时间。绘制Kaplan-Meier生存曲线并且进行对数秩检验以比较各生存曲线。显著性水平控制在0.05。
实施例8：套细胞淋巴瘤的依鲁替尼/CAR19 T细胞联合疗法
这个实施例中描述的实验表征了与依鲁替尼治疗组合的CART19在体外和在体内治疗套细胞淋巴瘤的活性。依鲁替尼是BTK的小分子抑制剂，经常用于治疗一些血液癌。本文所述的体外实验包括评估增殖、细胞因子产生、CD107a 脱颗粒和细胞毒性。异种移植小鼠模型用来体内研究CART1联合依鲁替尼治疗的效能和最佳剂量。尽管依鲁替尼在MCL中显示可观活性，但是约30％患者无应答，并且在应答者当中，仅21％至约三分之一患者出现完全缓解(Wang 等人,NEJM 369.6(2013):507-16)。完全缓解的实现与改善的无疾病进展生存期相关。另外，疗法可以导致耐药，同时中位应答持续时间为17.5月。在某些环境下，在依鲁替尼疗法后已经在BTK结合位点或紧邻下游观察到突变，这凸显可能变得日益频繁的一种耐药机理。参见，例如，Woyach等人,NEJM. 370.24(2014):2286-94。另外，BTK功能的阻断导致抑制B细胞受体(BCR)信号传导并且不直接具有细胞毒性。参见，例如，Ponader等人,Blood. 119.5(2012):1182-89。缺少细胞毒性和不能根除恶性克隆容易诱发选择压力下的克隆进化。另外，在用依鲁替尼治疗CLL的患者中初步观察到向侵袭性疾病的转化增加令人顾虑。参见，例如，Byrd等人,NEJM.369.1(2013):32-42；和Parikh 等人,Blood.123.11(2014):1647-57。
在患有各种B细胞肿瘤、最重要地患有急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的大部分患者中，输注针对B细胞特异性CD19抗原(CTL019、CART19)的嵌合抗原受体(CAR)转导的自体T细胞导致剧烈临床应答。参见，例如，Maude等人,NEJM.371.16(2014):1507-17；和Ruella等人,Expert Opin.Biol.Ther. (2015):1-6。淋巴结团块或巨大病灶的存在可能导致T细胞浸润减少及因此抗肿瘤活性降低。巨大的淋巴结病似乎不破坏对依鲁替尼的应答。Wang等人,NEJM. 369.6(2013):507-16。另外，依鲁替尼已经显示在缩减肿瘤块和动员外周血中肿瘤性B细胞方面具有特定效能。
方法
细胞系和原代样品：MCL细胞系从ATCC(Mino、Jeko-1、SP-49)获得，而MCL-RL从MCL患者的进展性胸腔积液产生。对于体外实验，将细胞系用补充有10％胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI培养基维持培养。对于一些实验，MCL-RL和Jeko-1细胞用叩甲绿色萤光素酶/eGFP转导并且随后分选以获得>99％阳性群体。使用急性白血病细胞系MOLM-14、K562或NALM-6和 T-ALL细胞系JURKAT作为对照。这些细胞系最初从ATCC获得。去识别化的原代人MCL骨髓(BM)标本和外周血(PB)标本从宾夕法尼亚大学临床实践获得。对于全部功能研究，将原代细胞在实验前至少12小时解冻并在37℃静置。
CAR构建体和CAR T细胞的产生：鼠抗CD19嵌合抗原受体(含有CD8 铰链区、41BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域)如先前所描述那样生成。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy:the Journal of the American Society of Gene Therapy.17.8(2009):1453-64。表达CAR的T细胞的产生如先前所描述那样进行。参见例如，Gill等人,Blood.123.15(2014):2343-54。正常供体CD4和CD8 T细胞或PB单个核细胞(PBMC)从宾夕法尼亚大学人免疫学中心获得。将T细胞以1x106/ml铺种，CD4:CD8比率为1:1，并且使用在培养第 1天添加及在第6天移除的抗CD3/CD28 Dyna珠(Life Technologies,11161D)，在X-vivo15培养基(Lonza,04-418Q)、人血清AB 5％(Gemini,100-512)、青霉素 /链霉素(Gibco,15070063)和Glutamax(Gibco,35050061)中扩增。在第2天用慢病毒转导T细胞。T细胞在培养下扩增8-15天并且当中位细胞体积低于300fl 时收获。T细胞随后在FBS 10％DMSO中冷冻供未来实验用。在全部实验之前，将T细胞解冻并在37℃静置过夜。
依鲁替尼：依鲁替尼(PCI-32765)作为粉末或DMSO溶液购自 MedKoo(#202171)或Selleck Biochemicals(#S2680)。对于体外实验，依鲁替尼稀释至浓度10、100和1000nM。对于体内实验，将依鲁替尼散剂溶解于10％ HP-β-环糊精溶液中(1.6mg/ml)并在饮用水中施用至小鼠。
多参数流式细胞分析：抗人抗体购自Biolegend、eBioscience或BectonDickinson。从体外培养物或从动物分离细胞，在补充有2％胎牛血清的PBS中洗涤1次并且在室温染色15分钟。为了定量细胞数，根据制造商的说明使用 Countbright(Invitrogen)珠。在全部分析中，基于前向与侧向散射特征对目的群体设门，随后进行单峰设门，并且使用Live Dead Aqua(Invitrogen)对活细胞设门。包括时间设门用于质量控制。如先前所描述那样监测CAR19的表面表达。参见，例如，Kalos等人,Science TranslationalMedicine.3.95(2011):95ra73。在四色激光Fortessa-LSR细胞仪(Becton-Dickinson)进行流式细胞术并用FlowJo X 10.0.7r2(Tree Star)进行分析。
脱颗粒测定法：如先前所描述那样进行脱颗粒测定法。参见，例如，Kalos 等人,Science Translational Medicine.3.95(2011):95ra73。将T细胞与靶细胞按 1:5比率在T细胞培养基中温育。将抗CD107a-PECY7(Biolegend)、抗CD28(BD Biosciences)、抗CD49d(BD Biosciences)抗体和莫能菌素(BD Biosciences)添加至共培养物。在4小时后，收获细胞并对CAR表达、CD3、CD8和Live Dead aqua(Invitrogen)染色。将细胞固定并透化(Invitrogen Fix/Perm缓冲液)和随后进行胞内染色以检测多种细胞因子(IFN、TNFα、IL-2、GM-CSF、MIP1b)。
增殖分析：将T细胞洗涤并以1x107/ml重悬于100ul PBS中并用100ul CFSE 2.5uM(Invitrogen)在37℃染色5分钟。随后用冷培养基猝灭反应并将细胞洗涤3次。靶以100Gy剂量照射。T细胞按1:1比率与照射的靶细胞温育 120小时，在24小时添加培养基。将细胞随后收获、对CD3、CAR和Live Dead aqua(Invitrogen)染色，并且添加Countbright珠(Invitrogen)，之后进行流式细胞分析以绝对定量。
细胞毒测定法：萤光素酶/eGFP+NALM-6或RL细胞如先前所描述用于细胞毒性测定法。参见例如，Gill等人,Blood.123.15(2014):2343-54。将靶按所示的比率与效应T细胞温育4或16小时。在Xenogen IVIS-200光谱照相机上通过生物发光成像计算杀伤作用。
细胞因子测量：效应细胞和靶细胞按1:1比率在T细胞培养基中温育24小时。收获上清液并根据制造商的操作方案(Invitrogen)，通过30-plex Luminex 阵列(LuminexCorp,FLEXMAP 3D)分析。参见，例如，Kalos等人,Science Translational Medicine.3.95(2011):95ra73。
体内实验：最初从Jackson Laboratories获得的NOD-SCID-γ链-/-(NSG) 小鼠购自宾夕法尼亚大学干细胞和异种移植中心。全部实验均按照研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。本文中讨论所应用的异种移植模型的示意图。将细胞(MCL细胞系或T细胞)在200ul PBS中按所示浓度注射至小鼠尾静脉中。使用Xenogen IVIS-200光谱照相机，进行生物发光成像，并用LivingImage software v.4.3.1(CaliperLifeSciencies分析。根据IACUC方案在实验结束时或当时它们符合预先指定终点时，使动物安乐死。
免疫组织化学：使用Bond Polymer Refine检测系统，在Leica Bond-III仪上进行福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组织化学(IHC)染色。不稀释地使用针对CD3、CD4、CD8、Pax5和CyclinD1的抗体。用ER2溶液(Leica Microsystems AR9640)，进行热诱导表位修复20分钟。使用Aperio ScanScopeTM以数字获得图像。
统计分析全部统计均使用Windows版6.04GraphPad Prism 6进行。
套细胞淋巴瘤细胞系
现存的大部分套细胞淋巴瘤(MCL)系已经永生化并在体外增殖多个世代，因此丧失对B细胞受体信号传导的依赖性。因此，它们对依鲁替尼的敏感性低劣。进行体外实验以确定MCL细胞系对依鲁替尼处理的敏感性。这些细胞系还用来评估依鲁替尼/CART19联合治疗在这个实施例进一步讨论的实验中的效能。MCL细胞从多发复发型MCL患者的胸腔积液收获。原始细胞(RLprimary) 和从它们衍生的细胞系(RL)均具有母细胞样形态、MCL常见免疫表型并且依据荧光原位杂交(FISH)(图52A、52B、52C)对经典t(11；14)转位呈阳性。
RL细胞和JEKO-1细胞用不同剂量的依鲁替尼(0.1nM、1nM、10nM、 100nM、1μM和10μM)培养并且通过测量生物发光(BLI)的减少确定对依鲁替尼的敏感性。如图31A中所示，RL细胞以剂量依赖性方式对依鲁替尼处理敏感。但是，JEKO-1细胞抵抗依鲁替尼处理(未显示生物发光随依鲁替尼剂量增加而减少)。
还使用MTT测定法分析RL、Jeko-1和Mino细胞对依鲁替尼的敏感性。 RL在体外暴露于渐增浓度的依鲁替尼导致对增殖和下游中介物磷酸化的剂量依赖性抑制作用，显示依鲁替尼的中靶效应，IC50为10nM。与之相反，建立的MCL细胞系Jeko-1和Mino相对抵抗依鲁替尼，IC50结果为至多10μM(图 52D)。为了证实RL作为体内实验的有效模型，向免疫缺陷性NOD-SCID-γ链敲除(NSG)小鼠植入1x106个表达萤光素酶的RL细胞(图52E)。评估它们的肿瘤负荷和存活。在静脉内注射后，MCL移入全部小鼠并定位至脾和肝，随后散布至骨髓、血液和淋巴结(图52F)。受累脾和肝的组织学与MCL的实质浸润一致(图52G)。
这些结果显示，这些不同的细胞系可能因此用来模仿依鲁替尼敏感性MCL 和依鲁替尼耐药性MCL。
套细胞淋巴瘤细胞对CART19的杀伤作用敏感
大部分临床前工作显示，已经使用对依鲁替尼不敏感的B-ALL细胞系实现 CART19的效能。另外，迄今已经在B-ALL患者中报道了最佳临床应答，而惰性B细胞恶性肿瘤患者据报道具有较低的应答。
为了在这个模型中显示MCL对CART19的杀伤作用敏感，健康供体T细胞用已经临床试验中使用的抗CD19 CAR构建体转导。参见，例如，Porter, NEJM 2011。进行一系列体外实验以显示依鲁替尼敏感性细胞系RL和依鲁替尼耐药性细胞系Jeko-1导致等同的CART-19脱颗粒、细胞因子产生、杀伤和增殖(图53A、图53B、图53C、图53D)。此外，外周血或骨髓从处于白血病期的两位MCL患者获得、从而允许扩增和用抗CD19 CAR转导自体T细胞。患者衍生的自体CART19细胞对MCL有反应，而未转导的T细胞对相应的自体MCL无反应(图53E、图53F)。这些结果表明，MCL对CART19的效应子功能敏感。
在体外评估依鲁替尼/CART19处理
依鲁替尼对T细胞的影响之前是基于短期活性测定法折减，如Honigberg 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107(2010):13075-80所述。稍后，一项对依鲁替尼对T细胞激酶ITK的影响的分析据报告通过抑制Th2型极化，支持依鲁替尼对CD4 T细胞的免疫调节作用。参见Dubovsky等人,Blood 122.15(2013):2539-49。几个小组对CART19治疗的患者的细胞因子分析表明， CART19疗法与Th1(IL2、IFNγ、TNF)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10)和其他细胞因子均相关(参见，例如，Kalos等人,Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73)。在这个实施例中，在依鲁替尼处于、高于和低于将在患者中期望的依鲁替尼浓度(血清中平均峰浓度100-150ng/ml)时评价CART19功能的影响，参见Advani等人,J.Clin.Oncol.2013；31:88。
发现CART19细胞含有ITK。在依鲁替尼存在下借助TCR非特异性刺激 CART19细胞导致磷酸化ITK(pITK-Y180)减少，如先前对CD4+T细胞所报告。参见Dubovsky等人,Blood122.15(2013):2539-49。与之相反，借助CAR特异性刺激CART19细胞未导致ITK活化削弱(图54A)。这种观察结果显示，CART19 功能或许将不会不利地受暴露于依鲁替尼影响。
此外，确定在依鲁替尼存在下CART19细胞的短期和长期体外功能。处于临床相关浓度的依鲁替尼并不损害CART19细胞增殖、脱颗粒或细胞因子产生；虽然高于生理浓度时，存在对CART19细胞功能的抑制，这可能代表非特异性毒性(图54B、图54C、图10B)。
特别地，从正常健康供体分离的PBMC用如上文所述的慢病毒抗CD19 CAR构建体转导。培养和传代所产生的表达CAR19的T细胞(CART19)以确定增殖和扩增能力。将1:1比率的表达CD4的T细胞:表达CD8的T细胞在具有或没有不同浓度依鲁替尼(10nM、100nM和1000nM依鲁替尼)的情况下培养。在每次细胞传代时添加依鲁替尼。在第0天、第5天、第6天、第7天、第9 天和第10天计数细胞数目(图9A)。还监测细胞体积(图9B)。
CFSE-染色和流式细胞分析还用来评估受肿瘤细胞系MOLM14、JEKO-1 和RL刺激后CART19细胞在依鲁替尼存在下的增殖。MOLM14是AML细胞系并且JEKO-1和RL是套细胞淋巴瘤细胞系。具体而言，RL细胞是衍生自从复发型MCL患者的胸腔积液获得的肿瘤性B细胞的MCL新细胞系。将 CART19细胞和肿瘤细胞按1:1比率混合并且在5天期间评估增殖。在图10A的每个直方图中指明正在增殖的细胞的百分数。如图10B中所示的增殖定量显示，大剂量依鲁替尼可能在与MCL细胞系共培养期间抑制CART19细胞增殖。
T细胞的脱颗粒显示溶细胞性T细胞的活化和启动抗原特异性细胞毒性的能力。CD107a是T细胞脱颗粒的功能性标志物，所述功能性标志物在T细胞刺激后在细胞表面上瞬时表达。在肿瘤细胞系MOLM14、JEKO-1和RL刺激后，流式细胞分析用来对表达CD107a的CART19 T细胞定量。表达CD107a 的细胞存在于图11A中所示的细胞图谱的Q2(象限2)内。图11B中显示从图11A 图谱获得的结果的定量。这些结果表明，CART19细胞与MCL-RL或JEKO-1的共培养导致大量CAR特异性CD107a脱颗粒。
在不同肿瘤细胞系刺激后还定量了在依鲁替尼存在下CART19 T细胞的细胞因子产生。通过流式细胞术评估IL-2、TNF-α和IFN-γ产生。产生细胞因子的细胞存在于图12、图13和图14中所示的图谱的象限2中。受JEKO-1和RL 刺激的CART19 T细胞显示细胞因子表达增加。另外，渐增浓度的依鲁替尼处理不影响产生细胞因子的CART19细胞的百分数。
通过30-plex LUMINEX测定法分析在肿瘤细胞刺激后并在不同浓度的依鲁替尼存在下，来自CART19细胞的细胞因子分泌。分析TH1细胞分泌的细胞因子如IL-2、IFN-γ和TNF-α。分析TH2细胞分泌的细胞因子，包括IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、IL-17、MIP1a、GM-CSF、MIP-1b、CP-1、IL-1Ra、 IL-7、IP-10、IL-1b、VEGF、G-CSF、EGF、HGF、IFNa、IL-12、RANTES、嗜酸性粒细胞趋化因子，IL-2R、MIG和IL-8。如图15中所示，TH1和TH2细胞因子由CART19 T细胞分泌。
另外，使用两项不同技术的实验显示，在依鲁替尼暴露的CART19细胞和依鲁替尼未暴露的CART19细胞之间不存在Th1/Th2极化的差异(图54D)。
CART19细胞对MCL细胞的杀伤作用在依鲁替尼存在下增加，提示来自该组合的至少加合效应(图54E)。然而，CART19细胞的固有细胞毒功能在依鲁替尼存在下不增加(图54F)。
进行额外的生物发光测定法以评估CART19细胞的肿瘤细胞杀伤作用。将 CART19细胞按不同比率(如1:1；1:0.5；1:0.25；和1:0)在96孔平板中一式两份与携带萤光素酶报道分子的肿瘤细胞MOLM14、JEKO-1和RL一起铺种。在24小时后，检测和定量生物发光。结果显示，与CART19细胞温育后， MOLM14样品中的生物发光不减少。然而，对于JEKO-1细胞和RL细胞，在 CART19细胞存在下生物发光减少，这表明CART19细胞介导对JEKO-1细胞和RL细胞的杀伤(图16A、图16B、图16C、图16D、图16E和图16F)。用依鲁替尼处理时，生物发光存在进一步下降，这表明依鲁替尼和CART19的组合造成比单一ART19处理而言，增加的JEKO-1和RL细胞杀伤作用。与这些结果一致的是，在每种处理后的总细胞计算值显示，CART19处理JEKO-1细胞和RL细胞造成细胞数目减少并且用CART19和依鲁替尼处理时，造成细胞数目进一步减少(图17B和17C)，这显示联合疗法不仅有效杀伤MCL细胞，还导致高效杀伤MCL细胞系。
在体内评估依鲁替尼/CART19治疗
在这些实验中，套细胞淋巴瘤小鼠模型用来在体内评估CART19和依鲁替尼联合疗法。
该实施例中使用如图20、55和56中所示的那些示意图。图20显示在MCL 体内小鼠模型中检验CART19/依鲁替尼联合疗法的示意图。在NSG小鼠中注射1x106个来自RL(MCL-3)、JEKO-1(MCL-4)和NALM6(MCL-5)细胞系的细胞(每个实验20只小鼠)。在允许植入的1周后，在第0天启动治疗，其中治疗是：0.5-1x106个CART19细胞(通过注射)、25mg/kg/天依鲁替尼(经口灌胃)、或CART19+依鲁替尼治疗。在第7天、第14天、第21天和第28天，对生物发光成像以监测肿瘤尺寸。接受依鲁替尼治疗的小鼠连续地用依鲁替尼治疗。还监测小鼠的存活。图55和图56显示在MCL体内小鼠模型中检验CART19/ 依鲁替尼联合疗法的附加示意图。将2x106个MCL-RL细胞注入NSG小鼠。在允许植入的1周(通过生物发光成像证实植入)后，在第7天(在注射MCL-RL 细胞后)启动治疗，其中治疗是：运载体对照、CART19细胞(2x106个细胞)和/ 或依鲁替尼(125mg/kg/天)。在第14、21、28和35天(在注射MCL-RL细胞后)，对生物发光成像以监测肿瘤尺寸。
检查单一依鲁替尼对MCL体内小鼠模型的影响。将GFP/萤光素酶基因转染的RL细胞静脉内注入免疫缺陷性NSG小鼠，在肝和脾中产生100％MCL 植入，最终扩散至淋巴结和骨髓中。用不同剂量的依鲁替尼(25mg/kg/天和250 mg/kg/天)治疗小鼠。在多种时间点评估了代表肿瘤生长的平均生物发光。如图 32中所示，RL衍生的肿瘤展示剂量相关的敏感性。进行了在含有RL细胞的小鼠中滴定依鲁替尼剂量的额外实验并且在图57中显示。更高剂量导致不增加毒性的情况下更好的抗肿瘤活性，这与门诊中对于MCL使用更高的依鲁替尼剂量相符(Wang等人,NEJM 369.6(2013):507-16)。
还进行了CART19剂量探索。在第0天将两种携带GFP-萤光素酶报道分子的MCL细胞系RL(MCL-1)和JEKO-1(MCL-2)注入NSG小鼠。将CART19 T细胞在第7天以不同剂量(例如按0.5x e6个细胞、1x e6个细胞或2x e6个细胞)注射。监测小鼠，例如100天。在各种时间点，监测小鼠的肿瘤尺寸(例如，生物发光成像)(图18A和图18B和图19A)和总生存(例如，Kaplan-Meier生存曲线)(图18C和图19B)。不同剂量的CART19细胞显示剂量依赖性抗肿瘤效能， 2x 106个CART19细胞/小鼠是最有效的剂量(图19A)。
这些研究提供了实施头对头比较两种MCL疗法的机会。如图58中所示，仅在CART-19细胞治疗的小鼠中实现长期存活。当未转导的T细胞联用依鲁替尼与单一依鲁替尼比较时，不存在抗肿瘤作用的差异。因此，在全部后续实验中，对照组是运载体和单独的依鲁替尼(图59)。
还测试向依鲁替尼添加CART19，如图56的示意图中详述。评价依鲁替尼对肿瘤负荷的影响显示在各早期时间点肿瘤生长适度地延迟。与之相反， CART19细胞疗法导致肿瘤负荷明显减少几周。在接受单一CART19细胞的小鼠中，这之后是惰性复发，始于第40天，而用CART19细胞以及依鲁替尼治疗的小鼠直至第80天才有可检测的疾病(图60)。实验结束时收获的器官的组织病理学显示全部对照和依鲁替尼治疗的小鼠中疾病留存，同时依鲁替尼治疗的小鼠中存在肿瘤坏死病灶。用单一CART19治疗的大部分小鼠在长期显示惰性复发，其伴随CART19细胞留存，而用CART19-依鲁替尼治疗的小鼠显示肿瘤清除和CART19从受累器官消失(数据未显示)。
CART19和依鲁替尼联合作用的机制
本文中的体外实验显示依鲁替尼既不破坏、也不明显增加CART19短期效应子功能。体内研究显示依鲁替尼单药疗法具有低的抗肿瘤作用。结果显示，依鲁替尼可能显著地增强CART19细胞的抗肿瘤功能(图60)。因此，进行实验以确定这种作用的机制。
抑制ITK已经显示抑制Th2极化和偏向Th1表型(Dubovsky等人,Blood 122.15(2013):2539-49)。在CART19细胞和依鲁替尼治疗的小鼠中，与CART19 细胞单药疗法相比时，使用这种测定法未观察到Th1细胞增加(图61A、图61B)。然而，小鼠暴露于依鲁替尼导致外周CART19细胞增加。治疗组和对照组之间不存在增殖标志物Ki67的差异(图61C)，从而这种测定法未检出增殖差异。类似地，不存在抗凋亡标志物Bcl2或凋亡标志物磷脂酰丝氨酸的差异，显示CART 细胞数目差异与凋亡受损不相关(图61D)。由于依鲁替尼已经与患者中的外周淋巴细胞增多症相关，所以进行实验以确定这是否还存在于采用单一依鲁替尼治疗的小鼠中。在启用依鲁替尼后1周，依鲁替尼治疗的小鼠中存在更多的循环型MCL细胞和更少的淋巴结/器官MCL细胞。有趣地，这种增加在依鲁替尼敏感性和依鲁替尼耐药性体内模型中均观察到，还在植入急性白血病细胞系 NALM-6的NSG小鼠观察到这种增加(数据未显示)。
为了理解依鲁替尼在体内T细胞扩增中的作用，我们向NSG小鼠植入 MCL-RL WT细胞并用萤光素酶-阳性T细胞处理它们。与UTD或UTD-依鲁替尼相比，CTL019和CTL019-依鲁替尼处理的小鼠均显示强烈的T细胞扩增 (数据未显示)。我们随后研究了体内不同T细胞亚群的频率并且在输注T细胞后1周未见PB T细胞的差异(数据未显示)。由于CXCR4涉及人类中依鲁替尼驱动的B细胞动员，所以我们在体内检查了CXCR4在CTL019或CTL019-依鲁替尼处理的小鼠的PB T细胞中的表达：CXCR4水平在2个组中相似(数据未显示)。最后，分析了CART19和CART19-依鲁替尼处理的小鼠的PB T细胞上抑制性/共刺激性受体的表达。TIM3、LAG3、CD137或CTLA4表达的差异不明显，然而观察到与依鲁替尼组合的CTL019和UTD处理的小鼠中PD-1表达减少的趋势。
结论
B细胞恶性肿瘤疗法包括B细胞受体信号传导的小分子抑制剂和基于CD19 指导的T细胞的疗法。在复发型MCL的背景下，BTK抑制剂依鲁替尼现在由 FDA批准并形成高的初始应答率。不幸地，这些应答倾向于一过性并且需要比用于CLL的那些药物剂量更高的药物剂量。CART-19在高风险B-ALL患者中导致持久反应，并且它也可以在其他B细胞恶性肿瘤中有效。初步数据表明，成熟B细胞恶性肿瘤对CART-19的应答可能低于B-ALL，但是这种不一致的机制尚未确定。这个实施例研究了在治疗MCL时添加依鲁替尼至CART19的影响。
依鲁替尼敏感性各异(IC50范围从10nM至10μM)的不同MCL细胞系用于体外实验。这些不同的细胞系用来模仿依鲁替尼敏感性MCL和依鲁替尼耐药性MCL。在依鲁替尼除最高剂量之外的全部剂量时，CART19细胞功能未受损，具有完好的T细胞扩增动力学、肿瘤识别与杀伤作用和细胞因子产生。另外，结果未揭示依鲁替尼暴露时辅助T细胞极化。这个结果可以归因于多因素组合，包括使用混合的CD4细胞和CD8细胞培养物，这与Dubovksy等人,Blood 122.15(2013):2539-49进行的仅CD4实验模型相反。依鲁替尼敏感性细胞系和依鲁替尼耐药性细胞系均强烈地活化CART19细胞并引起杀伤、细胞因子产生和增殖。CART19和依鲁替尼的组合在体外至少导致加性肿瘤杀伤作用。这个实施例中的结果显示当各自按有临床意义的施用剂量和方案(CART19单次给药，依鲁替尼连续施用)作为单药疗法使用时，CART19相对于依鲁替尼的优效性。
在这个实施例中，使用实验室中生成的MCL-RL细胞系还生成全身性异种移植MCL模型。用不同剂量的同种异体CAR19 T细胞治疗这些小鼠导致剂量依赖性抗肿瘤作用。还在依鲁替尼耐药性JEKO-1细胞系中观察到针对 CART-19的相似剂量应答。MCL-RL在体内用不同剂量(例如，0、25和125 mg/kg/天)的依鲁替尼处理，分别地导致70、81和100天的中位总生存期 (p<0.001)。依鲁替尼125mg/kg和CART19的体内直接比较显示显著改善 CART19治疗的小鼠的肿瘤控制。另外，植入MCL-RL的小鼠用运载体、依鲁替尼、CART19或CART19和依鲁替尼组合(iCART19)治疗。在有临床意义的剂量，MCL的CART19单药疗法优效于依鲁替尼单药疗法，并且依鲁替尼与 CART19的组合导致抗肿瘤作用增加。特别地，iCART19组合在体内起初导致较高循环水平的CART19细胞，随后导致肿瘤深度应答，并且将依鲁替尼添加至CART19时，复发显著地延迟。iCART19组合产生改善的肿瘤控制，80％小鼠达到完全缓解和长期无疾病生存期。在机理上，依鲁替尼治疗的小鼠具有较高数目的循环型CART19细胞，而无Th1/Th2或记忆表型的变化。因此，本文中的结果显示，依鲁替尼可以按理性方式与CART19组合并且表明，这些疗法每者的特性可以补偿另一者的缺陷，因此导致长期抗肿瘤作用增强。B细胞受体信号传导抑制作用与抗CD19定向T细胞疗法联用的实验和结果为理性组合 B细胞恶性肿瘤的无交叉耐药性疗法开辟了道路。
肿瘤应答和复发的动力学表明，依鲁替尼起到以下作用：加深单一CTL019 实现的初始应答或增强CTL019细胞的长期免疫监视能力。
实施例9：慢性淋巴细胞白血病的依鲁替尼/CAR19 T细胞联合疗法
依鲁替尼还用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。依鲁替尼尚未展示对T 细胞或NK细胞的细胞毒效应。但是，在CLL细胞中，依鲁替尼促进程序性细胞死亡并抑制肿瘤细胞移行和黏附。在这个实施例中，进行实验以检验：1)依鲁替尼对于从接受依鲁替尼治疗的患者产生CART19的影响；和2)就最佳体内功能而言依鲁替尼联合CART19治疗的最佳时程。
依鲁替尼对CART19产生和功能的影响
使用如本文(例如在实施例6中)所述的单采血液成分术，获得正常供体 PBMC。将PBMC与5μM依鲁替尼温育30分钟或不作处理(用于对照)，并且随后将细胞洗涤2次。使用本文(例如在实施例4中)所述的方法，随后将细胞用含有CAR19的慢病毒构建体转导以产生CART19 T细胞。从依鲁替尼处理的 PBMC产生的CART19 T细胞的数目进行FACS分析以与未处理的PBMC相比，确定从依鲁替尼处理的PBMC产生的CART19 T细胞的数目。如图21中所示，15％依鲁替尼处理的转导的PBMC表达CAR19，并且12％未处理的转导的PBMC表达CAR19。这些结果显示依鲁替尼治疗并未影响慢病毒转导效率或CART19 T细胞产生。因此，可以从接受依鲁替尼治疗的CLL患者生产 CART19 T细胞。
开展进一步体外分析以确定依鲁替尼对CART19 T细胞增殖、CART19细胞毒性和TH1:TH2细胞因子产生比率的影响。
为了测量细胞增殖，将细胞用CFSE染色以检测正在增殖的细胞并通过 FACS分析，如实施例4中所述。将CART19 T细胞与不同浓度的依鲁替尼(0.1 μM、0.5μM、1μM和5μM)温育并且用CD3/CD28珠刺激或不作刺激。在图 22中，叠加直方图以在每个依鲁替尼浓度比较未刺激的CART19 T细胞与 CD3/CD28刺激的CART19 T细胞。对于每个依鲁替尼浓度，均观察到CD3/CD28刺激的T细胞增殖，因而显示依鲁替尼治疗不影响CART19细胞增殖。
使用实施例4中描述的方法还评估了依鲁替尼对CART19 T细胞的细胞毒性的影响。将未转导的T细胞和CAR19转导的T细胞用培养基、DMSO、或1 μM依鲁替尼处理。使用滴定性效应子对靶(E:T)比率，用(培养基处理、DMSO 处理或依鲁替尼处理的)效应子CART19细胞进行基于流式的杀伤测定法，以确定针对表达CD19的靶细胞的特异性细胞毒活性。如图23中所示，用依鲁替尼处理的CART19 T细胞展示与对照(用培养基或DMSO处理的CART19 T细胞) 相同的针对表达CD19的靶细胞的特异性细胞毒活性百分数。因此，依鲁替尼处理不影响CART19细胞毒性。
依鲁替尼处理能限制TH2活化并且因此可以促进T细胞中的TH1选择性压力并使人CLL患者中的TH1/TH2细胞因子偏斜。进行测定法以测量在依鲁替尼或DMSO(对照)存在或不存在下的TH1和TH2细胞因子产生。如图24中所示，依鲁替尼不促进CART19细胞中的TH1细胞因子和TH2细胞因子偏斜。
依鲁替尼/CART19联合治疗在体内的效能
在体内小鼠模型中评估CART19功能。将Nalm/6细胞(人急性淋巴母细胞性白血病细胞系)植入NSG小鼠中并每日监测小鼠持续至少50天。Nalm/6肿瘤模型产生对依鲁替尼不敏感的肿瘤并且因此允许分析体内CART19功能及缩减肿瘤体积/治疗癌症的效能。在第7天开始，每日通过经口灌胃向小鼠施用 DMSO(对照)或依鲁替尼。将CART19在第7天或第9天施用、或不处理小鼠(对照)。在第4、11、18、25和32天，测量在小鼠中循环的Nalm/6细胞的数目，例如，通过外周血FACS分析测量，以确定CART19在依鲁替尼存在或不存在下清除Nalm/6细胞的效能。例如，将细胞用抗人CD19抗体染色以确定携瘤 NSG小鼠的血液中人CD19+(Nalm/6)细胞的百分数。
如图25A中所示，未接受CART19注射的小鼠显示出肿瘤Nalm/6细胞增加。但是，接受CART19注射联合每日施用DMSO的小鼠显示成功清除(减少)Nalm/6细胞。但是，接受CART19注射联合每日施用依鲁替尼的小鼠也显示成功清除Nalm/6细胞，动力学和效能与接受DMSO处理的小鼠相同。因此，这些结果显示，依鲁替尼治疗不损害CART19从这个肿瘤模型清除Nalm/6细胞的功能。
在注射Nalm/6细胞后，监测小鼠的健康状态至少50天。图25B的 Kaplan-Meier生存曲线显示，在注射Nalm/6细胞后，未治疗(未接受CART19 T 细胞)并且接受DMSO或依鲁替尼的小鼠无一存或超过30天。然而，用CART19 T细胞联合DMSO或联合依鲁替尼治疗增加小鼠的存活。因此，这些结果连同来自图13A的肿瘤负荷结果一起显示，依鲁替尼治疗不损害CART19从体内 NSG-Nalm/6肿瘤模型清除肿瘤细胞的功能。
CLL患者中依鲁替尼/CART19联合治疗的最佳时程
使用来自正在接受依鲁替尼治疗持续1年的CLL患者的样品，评估依鲁替尼治疗CLL期间施用CART19的最佳时间。来自9位CLL患者(患者 111330026、患者111330030、患者111330039、患者111330056、患者111330073、患者111330074、患者111330081、患者111330086和患者111330111)的PBMC 样品在不同的依鲁替尼治疗周期分离并且用来生产CART19 T细胞。在依鲁替尼治疗前采集PBMC样品以建立基线，并且随后在依鲁替尼治疗期间在第2周期第1天和第12周期第1天采集。评估产生CART19的几个不同参数，如转导、增殖、细胞毒性和细胞因子产生。其他评价可以包括离体免疫表型分型，如评估记忆性、抑制剂分子和耗尽。
图26显示流式细胞分析来自CAR19转导患者111330030的T细胞的结果，所述结果代表CAR转导后从其他8位患者获得的结果。使用例如实施例4中所述的方法，将PBMC在所示时间(基线，例如，在治疗前；第2周期在第1天；和第12周期在第1天)从患者采集并用含有CAR19的慢病毒载体转导。转导的 PBMCs随后对膜联蛋白、CD3、CD4和GAM染色(以检测CAR)，并且随后通过FACS分析法分析。图14中各图的加框区域显示GAM阳性并成功转导成为CART19 T细胞的细胞百分数。下方三个图显示，CAR19在基线时在约23％的细胞中、在第2周期第1天在28％的细胞中和在第12周期第1天在44％的细胞中成功转导。
接下来，在每个时间点(基线、第2周期在第1天和第12周期在第1天)评估增殖速率(或群体倍增)CART19细胞或未转导的细胞(对照)12天。图27显示对于三位患者：患者111330039(#39)、患者111330026(#26)和患者 111330030(#30)，经12天群体倍增的图示。这些结果表明就增殖速率而言，对于CAR转导，优选在第2周期第1天和第12周期第1天之间分离的PBMC。
依鲁替尼治疗影响CART19功能的潜在机制
从CLL患者样品评估可能影响CART19功能的依鲁替尼治疗的多种机制。
通过FACS分析法评估的表达CD19(CD19+)的细胞的分析结果。来自接受依鲁替尼治疗的CLL患者的PBMC在基线时(在依鲁替尼治疗前)、在第2周期第1天和在第12周期第1天分离并且随后对CD19染色。FACS分析显示，依鲁替尼造成表达CD19的细胞减少(图28A、图28B和图28C)。因此，这些结果表明依鲁替尼治疗诱导淋巴细胞增多症。
进行额外的分析以检查依鲁替尼治疗期间随时间推移在肿瘤细胞上的 CD200表达。免疫抑制性分子CD200在原代B细胞CLL肿瘤细胞上面上调。 CD200与其受体即单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞上和T淋巴细胞上表达的 CD200R结合。CD200与其受体的相互作用传递抑制性信号至巨噬细胞谱系，从而令细胞因子谱从TH1改变成TH2并且导致诱导调节性T细胞。来自患者111330030、111330026和111330039在基线时(筛选)、第2周期第1天和第12周期第1天的样品进行膜联蛋白、CD19(以分选表达CD19的肿瘤细胞)和CD200 染色并通过FACS分析。检测来自每个时间点的肿瘤细胞上CD200表达的各直方图对每位患者叠加(图29A、图29B和图29C)。通常，在依鲁替尼治疗期间肿瘤细胞上的CD200表达随时间的推移而减少。
还评估依鲁替尼治疗期间表达PD1的T细胞的频率。来自患者的样品在基线、第2周期第1天和第12周期第1天获得并对膜联蛋白、CD3、CD8和PD1 染色。对呈膜联蛋白阴性和CD3阳性的细胞分析CD8和PD1表达。在图30A、图30B和图30C中用框指出表达CD8和PD1的细胞。比较细胞在基线(图30A)、第2周期第1天(图30B)和第12周期第1天(图30C)的FACS图谱，显示依鲁替尼治疗随时间推移降低表达PD1的细胞的频率。
从上文所述实验获得的数据显示，向接受依鲁替尼的CLL患者施用 CART19疗法的最佳时间是在第2周期和第12周期之间或在第12周期。
实施例10：用于何杰金淋巴瘤的CAR19 T细胞疗法
CAR19 T细胞疗法也可以用来治疗理何杰金淋巴瘤(HL)。何杰金淋巴瘤以存在从克隆性生发中心B细胞衍生的恶性何杰金Reed-Sternberg(HRS)细胞为特征。存在显示CAR19 T细胞疗法针对HL的治疗效能的几种因素。HL肿瘤的CD19染色显示了在肿瘤和肿瘤微环境内部的表达CD19(CD19+)的细胞(图 33)。一项研究显示表达CD19的克隆性B细胞群体(CD20+CD27+ALDH+)负责产生和维持何杰金淋巴瘤细胞系并且还在大部分HL患者的血液中循环(Jones 等人,Blood,2009,113(23):5920-5926)。还已经提出这种克隆性B细胞群体导致或有助于恶性HRS细胞的生成。因此，CART19疗法将耗尽有助于肿瘤形成或肿瘤细胞维持的这个B细胞群体。另一项研究显示，B细胞耗尽在多个鼠模型中妨碍实体瘤生长(Kim等人,J Immunotherapy,2008,31(5):446-57)。在支持耗尽HL肿瘤微环境中的B细胞产生某种抗肿瘤作用的构想中，正在对当前治疗药(如rituxan)临床测试靶向和耗尽HL中的肿瘤B细胞(Younes等人,Blood, 2012,119(18):4123-8)。还已经显示与慢性炎症相关的重新癌发生是B细胞依赖的(de Visser等人,Cancer Cell,2005,7(5):411-23)。来自这些研究的结果显示通过减少或抑制病情进展或肿瘤生长，靶向B细胞群体，尤其HL肿瘤微环境中的B细胞群体，将可用于治疗HL。
此外，表达CD19的正常B细胞还浸润在HL中的肿瘤微环境。在CLL和 ALL中采用CART19疗法的先前研究(例如，在实施例4和5中描述)显示， CART19暴露于CD19+靶导致了细胞因子产生和巨噬细胞产生。因此，可以通过输注CART19以便与HL中存在的正常CD19+B细胞相互作用，实现HL肿瘤微环境从促肿瘤微环境调整成抗肿瘤微环境。例如，CART19暴露于表达 CD19的靶引起细胞因子产生，例如，炎性细胞因子，所述细胞因子通过扩增细胞毒T细胞、激活巨噬细胞和召集具有抑制肿瘤生长的各种功能的其他免疫效应细胞(如白细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞)，促进抗肿瘤活性。因为靶CD19+B 细胞可能并非恶性(例如，正常循环的B细胞)，所以对于调节肿瘤微环境而言，可能优选暂时而非延长的CART19作用。
一项在HL患者中检查CART19疗法治疗效能的研究可以如下文描述那样进行(图34)。该研究也将评估CART19在HL受试者中的安全性和耐受性并且确定CART19细胞对HL肿瘤微环境的影响。
在这项研究中治疗8位经典HL患者。患者具有全部年龄，不过可以为儿科患者和成年患者建立独立的药物递送方案。这项研究中的患者没有可用的可能治愈性治疗选项(如自体(ASCT)或同种异体干细胞移植)、或不适于这类治愈性治疗选项。例如，患者可以是以下任一情况：在救援化疗后PET+、在贝伦妥单抗治疗后PET+、或在具有或没有贝伦妥单抗既往暴露情况下ASCT后PET+。在目前可用的疗法下，患者将具有有限的预后(几个月至小于或等于2年的预期存活期)。并且最终，患者可能不接受抗CD20抗体疗法。患者因缺少可行性而排除，例如，如果患者具有不足以6次输注CART19的T细胞数目，则排除该患者。
通过体外转录产生CAR19 mRNA。将CAR19 mRNA电穿孔至供体T细胞中，并且通过与CD3/CD28珠温育扩增和刺激所产生的细胞。将含有1x108– 5x108个RNA电穿孔的CAR19 T细胞的剂量输送至患者，1周3次持续2周(例如，在第0、2、4、7、9和11天)。在治疗后1个月依据临床、CT和正电子发射断层扫描评估总体应答率。前6月每月一次监测应答和存活，随后每三个月监测1次直至第一次CART19输注(第0天)后2年。监测技术包括在CART19 治疗之前和之后肿瘤或淋巴结的活检(例如，用于免疫组织化学分析和/或基因表达概况分析的RNA)和正电子发射断层扫描。例如，通过比较在治疗前和治疗后大约1周(或治疗后允许细胞表型改变的适宜时间)的基因表达概况分析结果，分析CART19细胞对HL肿瘤微环境的影响，其中所述基因表达概况分析是对来自选定患者中可取得的淋巴结活检样品进行的。为了评估CART19治疗的安全性和耐受性，报告不良事件的频率和严重程度，包括细胞因子释放综合征(CRS) 和巨噬细胞激活综合征(MAS)的频率。
可以与CART19治疗同时施用化疗。第一剂量的CART19可以前置有淋巴细胞清除化疗，例如，环磷氮芥(cytoxan)。
实施例11:CLL患者的非应答者亚群显示出免疫检查点抑制蛋白分子的表达增加
在这项研究中，对来自34位CLL患者临床生产的CART19细胞评估免疫检查点抑制蛋白分子(如PD-1、LAG3和TIM3)的表达。这个群组对CART19 的应答是已知的并且因此可以评估应答和生物标志物表达模式之间的相关性。
通过流式细胞术分析从针对CART19疗法的应答不同的CLL患者中生产的CART19细胞，以确定CAR和免疫检查点抑制蛋白分子(PD-1、LAG3和 TIM3)的表达。CART19细胞来自：健康供体(HD)(n＝2)；对CART疗法应答的 CLL患者(CR)(n＝5)；对CART疗法部分应答的CLL患者(PR)(n＝8)；对CART19 疗法不应答的CLL患者(NR)(n＝21)。根据本领域已知的流式细胞分析标准方法，将细胞用荧光标记的抗体染色，所述抗体特异性识别CD3、CD4、CD8、CD27、CD45RO、CAR19分子和免疫检查点分子PD-1、LAG3和TIM3。通过流式细胞分析软件测定每种标志物(例如，CD4+、CD8+等)的表达，并对各亚群(例如， CD4+T细胞、CD8+T细胞、或表达CAR19的T细胞)进一步分析免疫检查点分子PD-1、LAG3和TIM3的表达。
图35A和图35B中显示用来测定表面标志物表达的流式细胞术图谱分析的例子。使用流式细胞术，测定表达CD4的T细胞并且进一步分析这些细胞的CAR19和PD-1表达，从而图谱的x-轴表示CAR19表达(左上象限(Q5)和左下 (Q8)象限显示CAR19阴性CD4+细胞，而右上(Q6)象限和右下(Q7)象限显示表达CAR19的CD4+细胞)，并且y-轴显示PD-1表达情况(左下(Q8)象限和右(Q7) 象限显示PD-1阴性CD4+细胞并且左上(Q5)象限和右(Q6)象限显示表达PD-1 的CD4+细胞)。在来自CART应答者的CD4+群体中，44.7％的CD4+细胞总体上表达PD-1并且约22.3％表达CAR19的细胞是PD-1阳性，而27.2％表达 CAR19的细胞是PD-1阴性(图35A)。与之相反，在来自非应答者的CD4+群体中，表达CAR19的细胞总体上显著减少(约15.3％，相比之下在CR中49.5％)，其中14.7％表达CAR19的细胞为PD-1阳性而仅0.64％为PD-1阴性(图35B)。图35A和图35B中各图谱之间的比较显示，与CART应答者(约44.7％)相比，百分数高得多的来自非应答者的CD4+细胞表达PD-1(约92.9％)。
使用上文描述的方法和分析，对每一应答组中的每位患者，测定CD4+群体和CD8+群体中表达PD-1(PD-1+)的细胞的百分数。显示与CAR疗法应答者(CR) 相比，非应答者在CD4+(图35C)群体和CD8+(图35D)群体中具有更大百分数的 PD-1+细胞；CD4+群体和CD8+群体的平均PD-1百分数增加是统计显著的。在 CD4+(图35C)群体和CD8+(图35D)群体中，部分应答者(PR)显示出比应答者 (CR)更高的PD-1+细胞百分数。
接下来，对每一应答组中的每位患者，测定表达CAR19的CD4+群体和表达CAR19的CD8+群体中表达PD-1(PD-1+)的细胞的百分数。相似分析如上进行，额外的步骤为：对CD4+细胞和CD8+细胞分析CAR19表达情况并且在鉴定表达CAR19的细胞后，测定来自表达CAR19的细胞群体中具有PD-1表达细胞的百分数。对表达CAR19的CD4+群体和CD8+群体观察了与CD4+总群体和CD8+总群体中观察到的趋势相似的趋势：显示与CAR疗法应答者(CR) 相比，非应答者在CD4+(图36A)群体和CD8+(图36B)群体中均具有更大百分数的PD-1+细胞；CD4+群体和CD8+群体的平均PD-1百分数增加是统计显著的。在CD4+(图36A)群体和CD8+(图36B)群体中，部分应答者(PR)显示出比应答者 (CR)更高的PD-1+细胞百分数。
进行进一步分析以确定来自针对CAR疗法应答不同的患者中表达PD-1、LAG3和TIM3的细胞的分布。图37中显示CD4+群体中PD-1、LAG3和TIM3 表达的代表性细胞图谱分析。首先对细胞群体分析CD4+和CD8+表达。随后对 CD4+群体(或CD8+群体，未显示)分析PD-1和CAR19表达(图37，左侧图谱)。如先前所描述，与CART应答者(CR)相比，非应答者(NR)总体具有显著增加的 PD-1+细胞百分数(NR为约92.9％PD-1阳性，相比之下CR为44.7％PD-1阳性)。另外，在非应答者中，表达CAR19的细胞大多是PD-1阳性(14.7％PD-1 阳性和CAR+，相比之下，0.64％PD-1阴性和CAR+)。随后对群体分析PD-1 和LAG3共表达(图37、中间图谱)。右上象限(Q2)中显示同时表达PD-1和LAG3 的细胞。与CART应答者相比，非应答者具有显著增加的表达2种免疫检查点抑制蛋白PD-1和LAG3的细胞百分数(67.3％，相比之下，7.31％)。还用TIM3 表达分析PD-1表达。在图37右侧图谱中，框表示同时表达PD-1和TIM3的细胞。类似于用PD-1和LAG3获得的结果，与CART应答者相比，非应答者具有显著更高的同时表达免疫检查点抑制蛋白PD-1和TIM3的细胞百分数 (83.3％，相比之下，28.5％)。如上文所述使用流式细胞分析，对每一应答组中的每位患者，测定表达PD-1的细胞(PD1+)、表达PD-1和LAG3的细胞(PD1+ LAG3+)和表达PD-1和TIM3的细胞(PD1+TIM3+)的细胞百分数。与CART 应答者相比，显示非应答者具有增加的PD1+LAG3+细胞(图38A)和PD1+ TIM3+细胞(图38B)百分数，所述百分数对两个细胞群体均是统计显著的。部分应答者还显示与CART应答者相比两个细胞群体的百分数增加，而与非应答者相比平均数降低。
这些结果表明，与对CAR疗法应答或部分应答的患者相比，对CAR疗法不应答的患者显示免疫检查点抑制蛋白(例如，PD-1、LAG3和TIM3)表达增加。因此，这些结果显示，抑制或减少免疫检查点抑制蛋白(例如，PD-1、LAG3、或TIM3)表达的药剂可以用于施用至接受CAR疗法的患者，以防止借助免疫检查点途径(例如，由PD-1、LAG3或TIM3介导)的免疫抑制作用，因而增加表达CAR的细胞的效能。
实施例12：mTOR抑制对高龄者中免疫衰老的影响
与衰老最明确联系的途径之一是mTOR途径。已经显示mTOR抑制剂雷帕霉素在小鼠中延长的寿命并改善老小鼠中多种衰老相关的状况(Harrison,DE 等人(2009)Nature460:392-395；Wilkinson JE等人(2012)Aging Cell 11:675-682；和Flynn,JM等人(2013)Aging Cell 12:851-862)。因此，这些研究结果显示，mTOR抑制剂可能对人类中的衰老和衰老相关状况具有有益作用。
一个可以在短期临床试验时间范围内研究的年龄相关表型是免疫衰老。免疫衰老是在老年人中出现的免疫功能下降，导致感染敏感性增加和对疫苗接种 (包括流感疫苗接种)的反应降低。免疫功能随年龄而下降归因于免疫缺陷的累积，包括造血干细胞(HSCs)产生幼稚淋巴细胞的能力下降和对抗原性刺激具有缺陷应答的耗尽型PD-1阳性淋巴细胞数目增加(Boraschi、D等人,(2013)Sci. Transl.Med.5:185ps8；Lages,CS等人(2010)AgingCell 9:785-798和Shimatani, K等人,(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:15807-15812)。年老小鼠中的研究显示，用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗6周恢复了HSC功能，导致幼稚淋巴细胞的产生增加、流感疫苗接种应答改善和寿命延长(Chen,C等人,(2009)Sci.Signal.2:ra75)。
为了评估mTOR抑制作用对人类衰老相关表型的影响及mTOR抑制剂 RAD001是否改善免疫衰老，在接受RAD001或安慰剂的老年志愿者中评价对流感疫苗的应答。本文中呈献的结果表明，RAD001增强老年志愿者中耐受良好的剂量下对流感疫苗的应答。RAD001还减少随年龄积累的程序性死亡(PD)-1 阳性CD4和CD8 T淋巴细胞的百分数。这些结果显示，mTOR抑制作用对老年志愿者中的免疫衰老具有有益影响。
如本文所述，用mTOR抑制剂RAD001(雷帕霉素类似物)治疗6周改善了老年志愿者中对流感疫苗接种的应答。
方法
研究群体
无不稳定性医学基础疾病的年龄>＝65岁高龄志愿者在新西兰和澳大利亚的 9个研究中心入选。筛选时的排除标准包括血红蛋白<9.0g/dL、白细胞计数 <3,500/mm3、中性粒细胞计数<2,000/mm3、或血小板计数<125,000/mm3、未控制的糖尿病、不稳定性局部缺血性心脏病、有临床意义的基础性肺病、免疫缺陷史或免疫抑制疗法接受史、凝血病史或需要长期抗凝的医学疾病史、预估肾小球滤过率<30ml/分钟、存在严重未控制的高胆固醇血症(>350mg/dL、9.1 mmol/L)或高甘油三酯血症(>500mg/dL、5.6mmol/L)。
治疗组之间的基线人口统计资料是相似的(表7)。218位入选的受试者中，211位完成研究。7位受试者退出研究。5位受试者因不良事件(AE)退出，1位受试者撤回知情同意书并且1位受试者因违背研究方案而离开研究。
表7：研究患者人口统计特征和基线特征
Figure BDA0002395107430002621
*体重指数是以千克计的体重除以按米计的身高的平方
研究设计和实施
从2011年12月至2012年4月、218位老年志愿者入选一项随机分配、观察者设盲、安慰剂对照试验。使用验证的自动化随机分配系统，将受试者随机分配到治疗组，每个治疗组中RAD001对安慰剂的比率为5:2。治疗组是：
RAD001 0.5mg/日或安慰剂
RAD001 5mg/周或安慰剂
RAD001 20mg/周或安慰剂
试验是观察者设盲的，因为RAD001 0.5 mg/日群组和20 mg/周群组中的安慰剂略微不同于这些群组中的RAD001片剂。评价受试者的研究员工看不到研究药物并且因此是完全设盲的。全部群组的治疗持续时间是6周，在此期间受试者每2周在门诊接受安全性评价。在受试者已经给药4周后，给药前测量和在给药后1小时测量RAD001稳态水平。在完成研究药物的6周疗程后，给予受试者2周无药物间歇期，以逆转RAD001诱导的任何可能的免疫抑制作用，并且随后给予含有毒株H1N1A/加利福尼亚/07/2009、H3N2A/维多利亚 /210/2009、B/布里斯班/60/2008的2012年季节性流感疫苗接种(
Figure BDA0002395107430002631
Novartis Vaccinesand Diagnostics，锡耶纳、意大利)。流感疫苗接种后4周，采集受试者的血清用于测量流感滴度。通过标准血凝抑制分析测量针对3个流感疫苗株以及至2个异源毒株(A/H1N1菌株A/新泽西/8/76和A/H3N2株A/维多利亚/361/11)的抗体滴度(Kendal,AP等人,(1982)Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance.Atlanta:Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。如先前所描述，测量流感疫苗接种前和之后4周取得的血清样品中对A/H1N1/加利福尼亚/07/2009特异的IgG和IgM的水平(Spensieri,F. 等人,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:14330-14335)。结果表示为荧光强度。
全部受试者均提供书面知情同意书。根据良好临床标准原理实施研究并由适宜的伦理委员会和监管机构批准。
安全性
在研究访视期间评估不良事件并采集血液用于血液学和生物化学安全性评估。还在受试者服用研究药物的6周期间居家填制的日记中收集不良事件信息。从知情同意时刻直至末次研究访视后30天采集关于全部不良事件的数据。事件由研究者划分为轻微、中度或重度。
统计分析
使用正常贝叶斯回归模型以无信息先验分布进行几何平均滴度比率的初步分析。该模型对每种抗体滴度按对数标度拟合。每个模型中的主要结果是第84 天量值。第63天量值纳入结果向量中。使用与先验陈述混合的SAS9.2 proc拟合该模型。将矩阵的协方差结构视为非结构化(选项类型＝UN)。使用扁平先验。对于血清转换率的次要分析，使用对数回归。
意向治疗群体定义为接受至少一个全剂量研究药物并且没有影响效力数据的研究方案严重偏离的全部受试者。入选本研究的合计218位受试者中199位在意向治疗群体中。
免疫表型分型
在受试者已经脱离研究药物6周时且在流感疫苗接种后4周，从3个时间点(基线；研究药物治疗6周后；和研究结束时)采集的全血分离外周血单个核细胞。如先前所描述，在美国加利福尼亚州斯坦福大学人类免疫监测中心使用8 色免疫表型分型组，通过流式细胞术分析76个PBMC亚群(Maecker,HT等人, (2012)Nat Rev Immunol.12:191-200)。使用冻干的8色免疫表型分型套装(BD Lyoplate,BD Biosciences,圣迭戈,CA)，通过流式细胞术分析76个PBMC亚群。生存力>80％及产生2x106个或更多细胞的PBMC样品纳入分析中。
对每个RAD001给药群组计算免疫表型距基线至研究药物治疗第6周的相对变化和距基线的至研究结束的(第12周)的相对变化。实施Student t检验以检查在每个给药组内部针对安慰剂作用校正后，免疫表型距基线至两个血液采样时间点的相对变化是否分别明显不同于零。在治疗作用分析中未实施遗失数据归责。因此如果患者在基线时具有遗失表型数据，这位患者不纳入这个表型的分析中。如果患者在6周或12周具有遗失表型数据，则这位患者因为受影响的时间点而不包括于这个表型的分析。
根据3个给药组在76个表型中实施608项检验以相对于安慰剂作用比较治疗作用。实施分层的错误发现率(FDR)控制方法以控制与多重检验相关的假阳性发生，然而提供明显更好的把握度。取细胞类型群作为分层因素并且在每个分层内部分别实施FDR(q-值)计算。全部无效假设均按0.05显著性水平抛弃，相应q-值为≤0.1。多重检验校正策略连同按0.05显著性水平和相应q<0.1抛弃，确保了小于10％的结果是错误的。
在第二次分析中，如果合并全部三个RAD001给药组，则在汇总的治疗组和安慰剂组之间免疫表型变化。为了确定治疗组和安慰剂组之间哪些免疫表型变化不同，在基线和研究药物治疗第6周之间和在基线和研究结束(第12周)之间对每个测量的表型计算患者内部细胞计数比率。这些比率经对数变换、并通过协方差分析法在每个时间点分析，以检测汇总的治疗组和安慰剂组之间的差异。在76个表型中实施152项检验以相对于安慰剂作用比较汇总的治疗作用。实施分层的错误发现率(FDR)控制方法以控制与多重检验相关的假阳性发生，然而提供明显更好的把握度(Benjamini,Y.等人(1995)J.Roy.Statist.57:289-300 和Sun,L.等人(2006)Genet.Epidemiol.30:519-530)。取细胞类型群作为分层因素并且在每个分层内部分别实施FDR(q-值)计算。全部无效假设均按0.05显著性水平和小于20％的q-值抛弃。这可以解读为抛弃具有小于0.05P值和小于 20％概率的那些假设：每个观察的显著结果归因于多重检验。
结果
通常，RAD001耐受良好、特别地在0.5mg/日和5mg/周给药方案时。在研究期间无死亡发生。3位受试者出现4个被评估为与RAD001不相关的严重不良事件(SAE)。这4个SAE是血小板计数正常的1位受试者中左眼视网膜出血伴后续失明，所述受试者事先已经完成一个5mg/周RAD001 6周的6周疗程；安慰剂治疗的1位受试者中的严重背痛和安慰剂治疗的1位受试者中的重度胃肠炎。表8中提供任何治疗组中发生率>2％的治疗相关性不良事件(AE)清单。最常见的RAD001相关AE是大部分病例中具有轻度严重性的口腔溃疡。总体上，接受RAD001的受试者具有与安慰剂治疗的那些受试者相似的重度AE发生率。仅评估一例重度AE与RAD001口腔溃疡相关，即20mg/周RAD001治疗的受试者中的口腔溃疡。
表8：依据首选术语在任何治疗组中>2％的治疗相关性AE发生率
Figure BDA0002395107430002661
通过测量对2012年季节性流感疫苗的血清学应答评价RAD001改善老年志愿者中免疫功能的能力。表9中提供在基线时和在供在流感疫苗接种后4周针对3个流感疫苗株中每个毒株的血凝集抑制(HI)几何平均滴度(GMT)。主分析变量是HI GMT比率(疫苗接种后4周/基线)。该研究有把握能够显示，在3个流感疫苗株的至少2个毒株中存在1)相对于安慰剂，GMT增加≥1.2倍；和2) 安慰剂修正的GMT比率超过1的后验概率不低于80％。选择这个终点是因为 MF-59疫苗佐剂诱导的流感GMT比率增加1.2倍与流感疾病减少相关(Iob,A 等人,(2005)Epidemiol Infect 133:687-693)。
表9.在基线时和在流感疫苗接种后4周每个流感疫苗株的HI GMT
Figure BDA0002395107430002671
基线表示流感疫苗接种之前2周
第4周表示流感疫苗接种后4周
N是每群组的受试者人数
GMT是几何平均滴度
GMT比率是疫苗接种后4周的GMT/基线时的GMT
CV％表示变异系数
在意向治疗(ITT)群体中，免疫增强性低剂量RAD001(0.5mg/日或5mg/周) 群组而非较高剂量(20mg/周)群组达到本研究的主要终点(图40A)。这表明在较低剂量时存在不同的RAD001免疫调节机制，并且在较高剂量，mTOR抑制的已知免疫抑制作用可能发挥作用。另外，结果提示免疫增强性低剂量RAD001 治疗后老年人中免疫功能改善的趋势。
在亚群分析中，具有低基线流感滴度(≤1:40)的受试者亚群出现比ITT人群更大的RAD001相关的滴度增加(图40B)。这些数据显示，RAD001特别有效增强受试者的流感疫苗应答，所述受试者在基线时没有保护性滴度(>1:40)并且因此面临最高的流感疾病风险。
RAD001浓度对每个流感疫苗株的滴度增加的散点图显示反向暴露/反应关系(图41)。基于mTOR介导的S6激酶(S6K)磷酸化的建模和模拟过程预测，在给药间隔期间20mg/周给药方案几乎完全抑制mTOR介导的S6K活性，5mg/ 周给药方案抑制S6K活性超过50％并且0.5mg/日给药方案抑制S6K磷酸化大约38％(Tanaka,C等人,(2008)J.Clin.Oncol 26:1596-1602)。因此，在增强老年人的免疫应答方面，采用免疫增强性低剂量RAD001时部分的mTOR抑制作用(例如，mTOR介导的S6K磷酸化)即使不比采用高剂量RAD001时几乎完全的mTOR抑制作用更有效，但可能是有效的。
在流感疫苗接种后4周，还评价了血清转换率。血清转换定义为从疫苗接种前阴性滴度(即，HI滴度<1:10)变成疫苗接种后HI滴度≥1:40或距疫苗接种前非阴性(≥1:10)HI滴度增加至少4倍。在意向治疗群体中，如与安慰剂群组相比， RAD001群组中H3N2株和B株的血清转换率增加，虽然这种增加未达到统计显著性(表10)。在基线流感滴度<＝1:40的受试者亚群中，RAD001治疗还增加 H3N2株和B株的血清转换率，并且在0.5mg/日施用群组中这些结果对B株达到统计显著性。这些数据进一步显示，RAD001增强老年人中对流感疫苗接种的血清学应答。
表10：疫苗接种后4周对流感发生血清转换的受试者的百分数
Figure BDA0002395107430002681
Figure BDA0002395107430002691
*RAD001和安慰剂之间血清转换的比值比显著与1不同(通过治疗作为固定效应的对数回归获得的双侧p-值<0.05)
当前的季节性流感疫苗经常提供针对持续出现的流感毒株的不充分保护作用，所述流感毒株作为先前循环的病毒的变体存在。然而，如与安慰剂相比，在mTOR抑制剂雷帕霉素存在下针对流感疫苗接种的小鼠形成更宽的针对流感的血清学应答。更宽的血清学应答包括针对多个流感亚型表达的保守表位的抗体，所述抗体针对疫苗中未含的异源流感毒株感染提供保护作用(Keating,R等人,(2013)Nat Immunology 14:2166-2178)。为了确定RAD001是否在老年志愿者中扩大针对流感的血清学应答，测量了针对流感疫苗中未含的2个异源流感毒株(A/H1N1株A/新泽西/8/76和A/H3N2菌株A/维多利亚/361/11)的HI滴度。如与安慰剂群组相比，RAD001群组中异源毒株的HI GMT比率的增加更高(图 42)。此外，如与安慰剂群组相比，RAD001群组中异源毒株的血清转换率更高。对于H3N2异源毒株，5mg和20mg/周RAD001施用群组中血清转换率增加是统计显著的(表11)。汇总的RAD001群组的H3N2血清转换率是39％，相比之下，安慰剂群组为20％(p＝0.007)。本文中呈献的结果表明，mTOR抑制作用拓宽老年志愿者对流感疫苗接种的血清学应答并增加针对季节性流感疫苗中未含有的异源流感毒株的抗体滴度。
雷帕霉素治疗的小鼠中拓宽的针对异源流感毒株的血清学应答已经与B细胞中类别转换抑制作用和抗流感IgM水平增加相关(Keating,R.等人,(2013)Nat Immunol 14:2166-2178)。然而，类别转换抑制作用可能不涉及在RAD001治疗的人体中拓宽的血清学应答，因为疫苗接种后抗流感IgM水平和IgG水平在 RAD001治疗群组和安慰剂治疗群组之间无差异(图43)。
表11：在季节性流感疫苗接种后4周针对异源流感毒株发生血清转换的受试者的百分数
Figure BDA0002395107430002701
*RAD001和安慰剂之间血清转换的比值比显著与1不同(通过治疗作为固定效应的对数回归获得的双侧p-值<0.05)
为了解释RAD001增强老年志愿者中免疫功能的机制，对PBMC样品进行免疫表型分型，所述PBMC样品从基线时、研究药物治疗6周后和流感疫苗接种后4周(在研究药物停用后6周)的受试者获得。尽管大部分PBMC亚群的百分数在RAD001群组和安慰剂群组之间并无不同，如与安慰剂群组相比， RAD001群组中PD-1阳性CD4和CD8细胞的百分数较低(图44)。PD-1阳性 CD4和CD8细胞随年龄而积累并且对抗原刺激具有缺陷性应答，原因是PD-1 抑制T细胞受体诱导的T细胞增殖、细胞因子产生和溶细胞功能(Lages,CS等人,(2010)Aging Cell9:785-798)。安慰剂群组中存在PD-1阳性T细胞百分数随时间推移增加。在第12周(疫苗接种后4周)，这种增加可能归因于流感疫苗接种，因为已经显示流感病毒增加PD-1阳性T细胞(Erikson,JJ等人(2012)JCI 122:2967-2982)。但是在全部RAD001群组中，CD4 PD-1阳性T细胞百分数在第6周和第12周自基线降低(图44A)。在两个较低剂量的RAD001群组中，CD8PD-1阳性细胞百分数也在第6和第12周均自基线降低(图44B)。评价了PD-1 阴性CD4 T细胞的百分数并且与安慰剂群组相比，该百分数在RAD001群组中增加(图44C)。
在更严格的统计分析下，在来自RAD001群组的结果汇总并且针对基线 PD-1表达的差异校正时，与安慰剂群组(n＝25)相比，在第6周在汇总的RAD 群组(n＝84)中PD-1阳性CD4 T细胞统计以p＝0.03(q＝0.13)显著减少30.2％(图 45A)。如与安慰剂群组相比，在第12周在汇总的RAD中PD-1阳性CD4 T细胞以p＝0.05(q＝0.19)下降32.7％。图45B显示与安慰剂群组(n＝25)相比，在第6 周在汇总的RAD001群组(n＝84)中PD-1阳性CD8 T细胞以p＝0.008(q＝0.07)统计显著地减少37.4％。如与安慰剂群组相比，在第12周在汇总的RAD001中 PD-1阳性CD8 T细胞以p＝0.066(q＝0.21)下降41.4％。因此，来自图44和图 45的结果共同表明，RAD001相关的PD-1阳性CD4和CD8 T细胞百分数下降可以有助于增强的免疫功能。
结论
综上所述，本文中呈献的数据显示，mTOR抑制剂RAD001改善年龄相关的老年人免疫功能下降，如通过对流感疫苗接种的应答所评估，并且这种改善以可接受的风险/益处平衡获得。在老年小鼠研究中，6周mTOR抑制剂雷帕霉素治疗不仅增强对流感疫苗接种的应答，还延长寿命，显示免疫衰老的改善可以是更广泛影响衰老相关表型的标志物。
由于RAD001给药在疫苗接种之前2周停止，RAD001的免疫增强作用可以由药物治疗停止后持续存在的相关细胞群体的变化介导。本文中呈献的结果显示，如与安慰剂相比，RAD001减少耗尽的PD-1阳性CD4和CD8 T细胞的百分数。PD-1表达由TCR信号传导诱导并且在持续抗原刺激(包括慢性病毒性感染)的背景下仍保持高。尽管不希望受理论约束，但可能的是，RAD001减少老年志愿者中的长期免疫激活作用并因而导致PD-1表达减少。RAD001还可以直接抑制PD-1表达，如已经对抑免蛋白环孢菌素A所报道的那样(Oestreich,KJ 等人(2008)J Immunol.181:4832-4839)。RAD001诱导的PD-1阳性T细胞百分数降低可能改善T细胞应答的质量。这与此前研究一致，所述此前研究显示 mTOR抑制改善小鼠和灵长类中CD8记忆T细胞对疫苗接种应答的质量(Araki, K等人,(2009)Nature 460:108-112)。在年老小鼠中，还已经显示mTOR抑制作用增加造血干细胞数目、导致幼稚淋巴细胞的产生增加(Chen,C等人(2009)Sci Signal 2:ra75)。尽管这个实施例中未检测到相对于安慰剂群组，RAD001群组中幼稚淋巴细胞百分数显著差异，但是可以进一步研究这种可能机制。
可以进一步研究RAD001拓宽对异源流感毒株的血清学应答的机制。还已经显示雷帕霉素抑制流感疫苗接种后B细胞中的类别转换过程。作为结果，生成了独特的抗流感抗体库，所述库促进针对流感疫苗中未含有的流感病毒亚型致死性感染的毒株的交叉保护作用(Keating,R等人(2013)Nat Immunol. 14:2166-2178)。本文所述的结果显示RAD001在流感疫苗接种之前2周已经停用RAD001的老年受试者中未改变B细胞类别转换过程。尽管基础机制需要进一步阐明，本文所述的对异源流感毒株的血清学应答增加可以在季节性疫苗和人群中循环型流感毒株之间存在不良匹配的年份引起针对流感疾病的增强保护作用。
RAD001对流感抗体滴度的影响可比于经批准以增强老年人对流感疫苗接种应答的MF59疫苗佐剂的影响(Podda,A(2001)Vaccine 19:2673-2680)。因此， RAD001驱动的针对流感疫苗接种的抗体应答增强可以转换成临床获益，如老年人中采用MF59佐剂化的流感疫苗所展示的那样(Iob,A等人(2005) Epidemiol Infect.133:687-693)。然而，RAD001还用来抑制器官移植患者的免疫应答。这些似乎矛盾的结果提出以下可能性：mTOR抑制剂的免疫调节作用可能是剂量和/或抗原依赖的(Ferrer,IR等人(2010)J Immunol.185:2004-2008)。本文中观察到反向RAD001暴露/疫苗接种应答关系的趋势。以下是可能的：完全的mTOR抑制作用通过正常亲环蛋白-雷帕霉素机制抑制免疫功能，而部分的mTOR抑制作用，至少在老年人中，因不同的衰老相关表型抑制作用而增强免疫功能。有意义地是，mTOR活性在衰老动物模型的多个组织(包括造血干细胞)中增加(Chen C.等人(2009)Sci Signal 2:ra75和Barns,M.等人(2014)Int J Biochem Cell Biol.53:174-185)。因此，与更完全抑制mTOR活性相反，下调 mTOR活性至幼龄组织中所见的水平可能在衰老适应症中是临床有益的。
mTOR抑制剂如RAD001在治疗衰老相关适应症中的安全特征已经令人关注。RAD001在肿瘤学或器官移植物适应症中所用剂量时的毒性包括对于许多衰老相关适应症而言将不可接受的口炎、腹泻、恶心、细胞减少症、高脂血症和高血糖发生率。然而，这些AE与血液中RAD001的谷水平相关。因此，选择这项研究中使用的RAD001给药方案以最小化谷水平。0.5mg/日群组、5mg/ 周群组和20mg/周施用群组的平均RAD001谷水平分别是0.9ng/ml、低于0.3 ng/ml(定量下限)和0.7ng/ml。这些谷水平显著地低于与器官移植患者和癌症患者中所用的施用方案相关的谷水平。此外，6周的有限疗程降低不良事件风险。这些结果表明，这项研究中使用的给药方案可以对老年人的一些病症产生可接受的风险/益处。然而，本文所述的实验中明显数目的受试者形成口腔溃疡，甚至当低至0.5mg/日给药时也是如此。因此，免疫增强性低剂量RAD001的安全特征为进一步研究提供正当理由。开发安全特征比目前可用雷帕霉素类似物更清晰的mTOR抑制剂可以在未来为衰老相关病状提供更好的治疗选项。
实施例13：增强高龄受试者中对疫苗的免疫应答
老年人中免疫功能下降导致感染发生率增加和对疫苗接种的应答降低。作为确定mTOR抑制作用是否在人类中具有抗衰老效果的第一个步骤，实施随机化安慰剂对照试验以确定mTOR抑制剂RAD001是否逆转衰老相关的免疫功能下降，如通过老年志愿者中的疫苗接种应答所评估。在全部情况下，获得适宜的专利同意并且该研究由国家卫生当局批准。
研究中使用RAD001的以下3个给药方案：
20mg/周(谷水平：0.7ng/ml)
5mg/周(谷水平低于检测限)
0.5mg/日(谷水平：0.9ng/ml)
选择这些给药方案是因为它们具有比批准用于移植和肿瘤学适应症的 RAD001剂量更低的谷水平。谷水平是身体内最低的药物水平。与每日10mg 肿瘤学给药方案相关的RAD001的谷水平是大约20ng/ml。与0.75-1.5mg每日两次移植给药方案相关的谷水平是大约3ng/ml。与之相反，与我们的免疫研究中使用的给药方案相关的谷水平要小3-20倍。
由于RAD001相关的AE与谷水平相关，预测3个给药方案对正常志愿者具有足够的安全性。此外，预测3个剂量产生一系列mTOR抑制作用。P70 S6 激酶(P70 S6K)是被mTOR磷酸化的下游靶。P70 S6K磷酸化水平充当mTOR 活性的度量。基于RAD001临床前和临床研究中获得的P70 S6K磷酸化数据建模和模拟，预测20mg/周几乎完全抑制mTOR活性持续整周，而预测5mg/周和0.5mg/日部分地抑制mTOR活性。
>＝65年的高龄志愿者随机分配至3个RAD001治疗组(每组50位受试者) 或安慰剂(每组20位受试者)之一。将受试者用研究药物治疗6周，给予2周间隔，并且随后接受流感疫苗接种(Aggrippal,Novartis)和肺炎球菌(Pneumovax 23, Merck)疫苗接种。疫苗接种后4周，通过用血凝抑制分析法测量针对流感疫苗中3个流感毒株(H1N1、H3N2和B流感亚型)的几何平均滴度(GMT)，评估对流感疫苗接种的应答。研究的主要终点是(1)安全性和耐受性和(2)疫苗接种后4 周如与安慰剂相比，2/3的流感疫苗株中流感滴度增加1.2倍。选择这个终点是因为流感滴度增加1.2倍与疫苗接种后流感疾病减少相关，并因此有临床意义。5mg/周给药和0.5mg/日给药耐受良好，并且不同于20mg/周给药，达到GMT 主要终点(图40A)。在老年志愿者中，如与安慰剂相比，RAD001不仅改善对流感疫苗接种的应答，它还改善对肺炎球菌疫苗接种的应答。肺炎球菌疫苗含有来自23个肺炎球菌血清型的抗原。在我们的受试者中测量针对这些血清型中7 种血清型的抗体滴度。与安慰剂相比，全部3个RAD群组中针对6/7血清型的抗体滴度均增加。
合并的流感和肺炎球菌滴度数据表明，部分(小于80-100％)mTOR抑制作用比更完整的mTOR抑制作用更有效地逆转衰老相关的免疫功能下降。
实施例14：低剂量mTOR抑制增加活力和锻炼
在临床前模型中，采用雷帕霉素类似物雷帕霉素时的mTOR抑制作用增加年老小鼠中的自发体力活动(Wilkinson等人,Rapamycin slows aging in mice. (2012)AgingCell；11:675-82)。有意义地，如与给药后1年执行的问卷调查中的安慰剂相比，实施例13中描述的在0.5mg/日施用群组中的受试者还报告活力和锻炼能力增加(图46)。这些数据表明，采用雷帕霉素类似物时的部分mTOR 抑制作用可能对衰老相关病态具有有益作用，而不仅是免疫功能。
实施例15：用RAD001抑制P70 S6激酶
进行建模和模拟以预测RAD001每日和每周剂量范围，其中预测所述剂量范围部分地抑制mTOR活性。如上文所示，P70 S6K被mTOR磷酸化并且是 mTOR的下游靶，所述下游靶与衰老最密切关联，因为敲除P70 S6K增加寿命。因此对部分抑制P70 S6K活性的RAD001剂量进行建模。预测>＝0.1mg和<20 mg范围内的每周给药实现部分抑制P70 S6K活性(图47)。
对于每日施用，30pM至4nM的RAD001浓度部分地抑制细胞系中的P70 S6K活性(表12)。预测用每日>＝0.005mg至<1.5mg的RAD001剂量实现这些血清浓度。
表12：在体外抑制HeLa细胞中P70 S6K活性的百分数
RAD001浓度 0 6pM 32pM 160pM 800pM 4nM 20nM
P70 S6K抑制％ 0 0 18 16 62 90 95
结论
用仅部分抑制P70 S6K的mTOR抑制剂剂量治疗衰老相关病态或通常增强免疫应答的方法。低剂量RAD001的mTOR部分抑制作用在衰老适应症中的效能是意料之外的结果。在>＝0.1mg至<20mg/周和>＝0.005mg至<1.5mg/日之间的RAD001剂量范围将实现mTOR部分抑制作用并且因此预期在衰老相关病态或在增强免疫应答方面具有效能。
实施例16：外源IL-7增强CAR T细胞的功能
在过继转移CAR T细胞后，一些患者出现有限的CAR T细胞留存，这可以导致次优水平的抗肿瘤活性。在这个实施例中，在已经观察到对CAR T细胞初始次优反应的小鼠异种移植模型中评估施用外源人IL-7的影响。
首先在不同癌细胞系中和表达CAR的细胞中评估IL-7受体CD127的表达。通过流式细胞术分析了两个套细胞淋巴瘤细胞系(RL和Jeko-1)和一个B-ALL 细胞系(Nalm-6)的CD127表达。如图48A中所示，在测试的三个癌细胞系中，显示RL具有最高的CD127表达，Jeko-1和Nalm-6次之。将CART19细胞输注至NSG小鼠中并且通过流式细胞术评估循环型CART19细胞上的CD127表达。如图48B中所示，CD127在全部循环型CART19细胞上均匀表达。
接下来，在淋巴瘤动物模型中评估外源IL-7治疗对CART19细胞的抗肿瘤活性的影响。在第0天(D0)向NSG小鼠植入表达萤光素酶的套细胞株系(RL luc)、随后在第6天给予CART19细胞治疗。将NSG小鼠分入各组，其中一个组不接受CART19细胞，第二组接受0.5x106个CART19细胞，第三组接受1x106个CART19细胞并且第四组接受2x106个CART19细胞。通过测量所植入肿瘤的平均生物发光，监测肿瘤尺寸超过80天。仅接受2x106个CART19细胞的小鼠展示肿瘤排异及肿瘤生长抑制(图49A)。显示来自接受0.5x106个CART19细胞或1x106个CART19细胞的两个组的小鼠具有次优抗肿瘤应答。来自这两个组的小鼠随后随机分配，其中三只小鼠(接受0.5x106个CART19细胞的小鼠 #3827和#3829和接受1x106个CART19细胞的小鼠#3815)通过腹膜内注射按200 ng/小鼠的剂量接受外源重组人IL-7，每周3次，始于第85天，并且两只小鼠不注射。在图49B中显示从第85-125天接受外源IL-7的小鼠的肿瘤负荷，通过平均生物发光进行检测。接受IL-7的全部小鼠显示肿瘤负荷减少1-3个对数的明显应答。最初接受较高剂量CART19细胞的小鼠(接受1x106个CART19 细胞的小鼠#3815)显示更明显的应答。当IL-7治疗之前和之后接受IL-7治疗的小鼠的肿瘤负荷与对照比较时，仅在已经接受IL-7治疗的小鼠中观察到肿瘤负荷减少(图49C)。
还检查了在淋巴瘤动物模型中IL-7治疗后的T细胞动力学。在IL-7治疗之前，人CART19细胞在血液中是不可检测的。一旦IL-7治疗，则治疗的小鼠中存在快速、但可变的T细胞数目增加(图50A)。接受IL-7的小鼠中观察到的 T细胞扩增的程度还与肿瘤应答相关。在IL-7治疗期间最高扩增时血液中检测到最高T细胞数目的小鼠(小鼠#3815)具有最稳健的肿瘤负荷减少(参见图49B)。另外，最高扩增的时间与作为基线注射的T细胞剂量相关。还在IL-7治疗之前和之后测量了血液中表达CD3的细胞数目/水平。在对照小鼠中，检测到非常少的表达CD3的细胞，而在IL-7治疗后IL-7治疗的小鼠显示CD3+细胞明显增加(图50B)。
总之，这个实施例中的结果显示，外源IL-7处理在体内增加T细胞增殖和抗肿瘤活性，这表明在CAR疗法后具有次优结果的患者中使用IL-7可以改善这些患者中的抗肿瘤应答。
等同物
本文引用的每份和每项专利、专利申请和出版物的公开内容因此通过引用的方式完整并入本文。尽管本发明已经参考具体方面公开，但显而易见本发明的其他方面和变型可以由本领域其他技术人员构思，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意在解释成包括全部此类方面和等同变型。
序列表
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 43
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 44
<211> 336
<212> DNA
<213> 人
<400> 44
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 45
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 45
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225 230
<210> 46
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 46
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690
<210> 47
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 47
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 48
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 48
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840
gaccatt 847
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
肽"
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 50
Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys
20 25 30
<210> 51
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 51
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 52
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 52
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 53
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> /注解="该序列可以包含1-6 repeating "Gly Gly
Gly Gly Ser" repeating units"
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 54
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸"
<400> 54
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
ccc 63
<210> 55
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 55
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 56
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
寡核苷酸"
<400> 56
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
肽"
<400> 57
Tyr Asn Ser Ala Leu
1 5
<210> 58
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 58
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 59
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 60
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 60
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 61
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 61
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagcc accaccatca tcaccatcac cat 813
<210> 62
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 62
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactaccaat catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagcc accaccatca tcaccatcac cat 813
<210> 63
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 63
atggctctgc ccgtgaccgc actcctcctg ccactggctc tgctgcttca cgccgctcgc 60
ccacaagtcc agcttcaaga atcagggcct ggtctggtga agccatctga gactctgtcc 120
ctcacttgca ccgtgagcgg agtgtccctc ccagactacg gagtgagctg gattagacag 180
cctcccggaa agggactgga gtggatcgga gtgatttggg gtagcgaaac cacttactat 240
tcatcttccc tgaagtcacg ggtcaccatt tcaaaggata actcaaagaa tcaagtgagc 300
ctcaagctct catcagtcac cgccgctgac accgccgtgt attactgtgc caagcattac 360
tactatggag ggtcctacgc catggactac tggggccagg gaactctggt cactgtgtca 420
tctggtggag gaggtagcgg aggaggcggg agcggtggag gtggctccga aatcgtgatg 480
acccagagcc ctgcaaccct gtccctttct cccggggaac gggctaccct ttcttgtcgg 540
gcatcacaag atatctcaaa atacctcaat tggtatcaac agaagccggg acaggcccct 600
aggcttctta tctaccacac ctctcgcctg catagcggga ttcccgcacg ctttagcggg 660
tctggaagcg ggaccgacta cactctgacc atctcatctc tccagcccga ggacttcgcc 720
gtctacttct gccagcaggg taacaccctg ccgtacacct tcggccaggg caccaagctt 780
gagatcaaac atcaccacca tcatcaccat cac 813
<210> 64
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 64
atggctctgc ccgtgaccgc actcctcctg ccactggctc tgctgcttca cgccgctcgc 60
ccacaagtcc agcttcaaga atcagggcct ggtctggtga agccatctga gactctgtcc 120
ctcacttgca ccgtgagcgg agtgtccctc ccagactacg gagtgagctg gattagacag 180
cctcccggaa agggactgga gtggatcgga gtgatttggg gtagcgaaac cacttactat 240
caatcttccc tgaagtcacg ggtcaccatt tcaaaggata actcaaagaa tcaagtgagc 300
ctcaagctct catcagtcac cgccgctgac accgccgtgt attactgtgc caagcattac 360
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gcatcacaag atatctcaaa atacctcaat tggtatcaac agaagccggg acaggcccct 600
aggcttctta tctaccacac ctctcgcctg catagcggga ttcccgcacg ctttagcggg 660
tctggaagcg ggaccgacta cactctgacc atctcatctc tccagcccga ggacttcgcc 720
gtctacttct gccagcaggg taacaccctg ccgtacacct tcggccaggg caccaagctt 780
gagatcaaac atcaccacca tcatcaccat cac 813
<210> 65
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 65
atggccctcc cagtgaccgc tctgctgctg cctctcgcac ttcttctcca tgccgctcgg 60
cctgagatcg tcatgaccca aagccccgct accctgtccc tgtcacccgg cgagagggca 120
accctttcat gcagggccag ccaggacatt tctaagtacc tcaactggta tcagcagaag 180
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gccagatttt ccgggagcgg gtctggaacc gactacaccc tcaccatctc ttctctgcag 300
cccgaggatt tcgccgtcta tttctgccag caggggaata ctctgccgta caccttcggt 360
caaggtacca agctggaaat caagggaggc ggaggatcag gcggtggcgg aagcggagga 420
ggtggctccg gaggaggagg ttcccaagtg cagcttcaag aatcaggacc cggacttgtg 480
aagccatcag aaaccctctc cctgacttgt accgtgtccg gtgtgagcct ccccgactac 540
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ggatcagaga ctacttacta ctcttcatca cttaagtcac gggtcaccat cagcaaagat 660
aatagcaaga accaagtgtc acttaagctg tcatctgtga ccgccgctga caccgccgtg 720
tactattgtg ccaaacatta ctattacgga gggtcttatg ctatggacta ctggggacag 780
gggaccctgg tgactgtctc tagccatcac catcaccacc atcatcac 828
<210> 66
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 66
atggccctcc cagtgaccgc tctgctgctg cctctcgcac ttcttctcca tgccgctcgg 60
cctgagatcg tcatgaccca aagccccgct accctgtccc tgtcacccgg cgagagggca 120
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tactattgtg ccaaacatta ctattacgga gggtcttatg ctatggacta ctggggacag 780
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<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 67
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ccagaagatt tcgcagtgta tttctgccag cagggcaata cccttcctta caccttcggt 780
cagggaacca agctcgaaat caagcaccat caccatcatc accaccat 828
<210> 68
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 68
atggcactgc ctgtcactgc cctcctgctg cctctggccc tccttctgca tgccgccagg 60
ccccaagtcc agctgcaaga gtcaggaccc ggactggtga agccgtctga gactctctca 120
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多核苷酸"
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<212> DNA
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
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<212> DNA
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<220>
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
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<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 72
atggctctgc ccgtgaccgc actcctcctg ccactggctc tgctgcttca cgccgctcgc 60
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<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro
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Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
195 200 205
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Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
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<210> 74
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 74
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
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Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro
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Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
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Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
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Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
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Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
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His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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<212> PRT
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<220>
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
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<211> 271
<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 76
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
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Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
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Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
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Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser
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<220>
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 77
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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115 120 125
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<211> 276
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<220>
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
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275
<210> 79
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 79
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<220>
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多肽"
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<211> 276
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多肽"
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<211> 271
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 83
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<212> PRT
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<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 84
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<220>
<221> 来源
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多核苷酸"
<400> 85
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ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840
cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900
cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960
gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020
tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080
tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260
gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320
atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380
gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440
caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 86
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 86
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多核苷酸"
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<211> 1458
<212> DNA
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<220>
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 88
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tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140
agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200
ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260
gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320
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<210> 89
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多核苷酸"
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<210> 90
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 90
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<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
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<210> 92
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
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<210> 93
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 93
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<210> 94
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 94
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
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cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcg gaggcggtgg gagccaggtc caactccaag aaagcggacc gggtcttgtg 480
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tactattgcg ctaagcatta ctattatggc gggagctacg caatggatta ctggggacag 780
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cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 900
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<210> 95
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 95
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ccgaccatcg cctctcagcc gctttccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 900
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<210> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 96
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
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caggccctgc cgcctcgg 1458
<210> 97
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 97
atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60
ccggacatcc agatgaccca aaccacctca tccctctctg cctctcttgg agacagggtg 120
accatttctt gtcgcgccag ccaggacatc agcaagtatc tgaactggta tcagcagaag 180
ccggacggaa ccgtgaagct cctgatctac catacctctc gcctgcatag cggcgtgccc 240
tcacgcttct ctggaagcgg atcaggaacc gattattctc tcactatttc aaatcttgag 300
caggaagata ttgccaccta tttctgccag cagggtaata ccctgcccta caccttcgga 360
ggagggacca agctcgaaat caccggtgga ggaggcagcg gcggtggagg gtctggtgga 420
ggtggttctg aggtgaagct gcaagaatca ggccctggac ttgtggcccc ttcacagtcc 480
ctgagcgtga cttgcaccgt gtccggagtc tccctgcccg actacggagt gtcatggatc 540
agacaacctc cacggaaagg actggaatgg ctcggtgtca tctggggtag cgaaactact 600
tactacaatt cagccctcaa aagcaggctg actattatca aggacaacag caagtcccaa 660
gtctttctta agatgaactc actccagact gacgacaccg caatctacta ttgtgctaag 720
cactactact acggaggatc ctacgctatg gattactggg gacaaggtac ttccgtcact 780
gtctcttcac accatcatca ccatcaccat cac 813
<210> 98
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 98
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser His His His His His His His His
260 265 270
<210> 99
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 99
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgc 1458
<210> 100
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 100
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210> 101
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 101
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 102
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 102
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225 230
<210> 103
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 103
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690
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<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 104
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150
<210> 105
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> /注解="该序列可以包含1-10个重复"Gly Gly
Gly Ser"重复单元"
<400> 105
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
肽"
<400> 106
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
肽"
<400> 107
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
肽"
<400> 108
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 109
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /注解="该序列可以包含50-5000个核苷酸"
<400> 109
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560
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多核苷酸"
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /注解="该序列可以包含50-5000个核苷酸"
<400> 111
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440
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tttttttttt tttttttttt 5000
<210> 112
<211> 5000
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980
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<212> DNA
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多核苷酸"
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 114
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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多肽"
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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多肽"
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 117
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 118
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2000)
<223> /注解="该序列可以包含50-2000个核苷酸"
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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多肽"
<400> 119
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
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Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
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Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195 200 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
210 215 220
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
225 230 235 240
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
245 250 255
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260 265 270
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275 280 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
290 295 300
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325 330 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
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Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
355 360 365
Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 120
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多核苷酸"
<400> 120
atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga 60
ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg 120
gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc 180
tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc 240
gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa 300
ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg 360
acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg 420
gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg 480
cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg 540
actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct 600
gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg 660
gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc 720
aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa 780
accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc 840
gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac 900
cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg 960
cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg 1020
tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga 1080
gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag 1140
gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc 1182
<210> 121
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 121
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro
20 25 30
Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly
35 40 45
Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe
85 90 95
Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val
100 105 110
Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser
115 120 125
Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg
130 135 140
Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser
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Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala
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Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
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Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
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Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
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Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
245 250 255
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
260 265 270
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
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Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
340 345 350
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
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Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 122
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 122
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ser Pro Lys Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly
20 25 30
Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr
35 40 45
Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg
50 55 60
Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile
100 105 110
Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu
115 120 125
Glu Thr Ser Tyr
130
<210> 123
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 123
Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys
1 5 10 15
Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly
20 25 30
Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met
35 40 45
Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln
50 55 60
Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu
85 90 95
Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Thr Ser
100 105
<210> 124
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 124
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 125
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 125
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 126
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 126
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 127
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 127
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 128
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> 任何氨基酸
<400> 128
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 129
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 129
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 130
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的
多肽"
<400> 130
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser
85 90 95
<210> 131
<211> 1132
<212> PRT
<213> 人
<400> 131
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
Thr Ile Leu Asp
1130
<210> 132
<211> 4027
<212> DNA
<213> 人
<400> 132
caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 60
cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 120
tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 180
gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 240
cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 300
cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 360
cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 420
acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 480
gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 540
tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 600
ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 660
cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 720
ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 780
ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 840
cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 900
ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 960
agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1020
ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1080
ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1140
agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1200
tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1260
agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1320
cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1380
acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1440
acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1500
acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1560
agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1620
ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1680
ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1740
atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1800
gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1860
cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1920
gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1980
ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2040
tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2100
gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2160
cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2220
aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2280
gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2340
acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2400
agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2460
gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2520
gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2580
gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2640
tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2700
ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2760
agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2820
tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2880
tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2940
gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3000
gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3060
acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3120
atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3180
tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3240
ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3300
tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3360
agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3420
cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg 3480
agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc 3540
ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct 3600
gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc 3660
tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc 3720
agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc 3780
cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc 3840
caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt 3900
gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg 3960
ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaa 4027

Claims (75)

1.包含表达结合CD19的CAR分子的细胞(例如，细胞群体)(“表达CAR19的细胞”)的组合物，用于与一种或多种激酶抑制剂组合来治疗患有与表达CD19相关的疾病的哺乳动物，其中激酶抑制剂选自Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制剂、mTOR抑制剂或促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂。
2.治疗患有与表达CD19相关的疾病的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的表达结合CD19的CAR分子的细胞(例如，细胞群体)(表达CAR19的细胞)，所述细胞与选自Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制剂、mTOR抑制剂或促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂的一种或多种激酶抑制剂组合。
3.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中将激酶抑制剂和表达CAR19的细胞作为一线疗法施用至哺乳动物。
4.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中将表达CAR19的细胞在施用激酶抑制剂后施用至哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的用途或方法，其中：
(i)将表达CAR19的细胞在停止施用激酶抑制剂后施用；或
(ii)激酶抑制剂的施用在施用表达CAR19的细胞之前开始，并且表达CAR19的细胞与激酶抑制剂的持续施用组合来施用。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的用途或方法，其中哺乳动物是或经鉴定是对BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)的完全或部分应答者或对表达CAR19的细胞的完全或部分应答者。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途或方法，其中BTK抑制剂选自依鲁替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的用途或方法，其中CDK4抑制剂选自：帕布昔利布、aloisine A、夫拉平度、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066，P276-00、RAF265、indisulam、roscovitine、dinaciclib、BMS 387032、MLN8054、AG-024322、AT7519、AZD5438、BMS908662；或ribociclib。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的用途或方法，其中mTOR抑制剂选自：雷帕霉素、雷帕霉素类似物如依维莫司、坦罗莫司、地磷莫司、塞马莫德、AZD8055、PF04691502、SF1126、XL765或OSI-027。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的用途或方法，其中MNK抑制剂选自：CGP052088、CGP57380、尾孢酰胺、ETC-1780445-2或4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
11.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中激酶抑制剂是依鲁替尼并且依鲁替尼具有每日约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg或600mg的剂量。
12.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中细胞表达包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR分子。
13.根据权利要求12所述的用途或方法，其中胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和初级信号传导结构域。
14.根据权利要求12或13所述的用途或方法，其中CAR分子包含抗CD19结合结构域，所述抗CD19结合结构域包含抗CD19结合结构域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)、轻链互补决定区3(LC CDR3)、重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的用途或方法，其中抗CD19结合结构域包含表7的鼠轻链可变区、表7的鼠重链可变区或这两者。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的用途或方法，其中抗CD19结合结构域包含SEQID NO:5的LC CDR1、SEQ ID NO:26的LC CDR2和SEQ ID NO:27的LC CDR3。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的用途或方法，其中抗CD19结合结构域包含SEQID NO:19的HC CDR1、SEQ ID NO:20-23任一者的LC CDR2和SEQ ID NO:24的HC CDR3。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的用途或方法，其中抗CD19结合结构域包含SEQID NO:59的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
19.根据权利要求12-14、16或17中任一项所述的用途或方法，其中抗CD19结合结构域是人源化抗CD19结合结构域。
20.根据权利要求19所述的用途或方法，其中人源化抗CD19结合结构域包含选自：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
21.根据权利要求19或20所述的用途或方法，其中人源化抗CD19结合结构域是scFv，所述scFv包含经接头与重链可变区连接的轻链可变区，例如，其中接头包含SEQ ID NO:53的序列。
22.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中CAR分子包含选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
23.根据权利要求22所述的用途或方法，其中跨膜结构域包含SEQ ID NO:15的序列。
24.根据权利要求12所述的用途或方法，其中抗CD19结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接，例如，其中铰链区包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:45的序列。
25.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中CAR分子包含共刺激结构域，例如，其中共刺激结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)或4-1BB(CD137)，例如，其中共刺激结构域包含SEQID NO:16或SEQ ID NO:51的序列。
26.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中CAR分子包含胞内信号传导结构域，例如，其中胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域、CD3ζ的功能性信号传导结构域或这两者，或其中胞内信号传导结构域包含CD27的序列、CD3ζ的功能性信号传导结构域或这两者。
27.根据权利要求26所述的用途或方法，其中胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列、SEQ ID NO:17的序列或这两者；其中胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的序列、SEQ ID NO:43的序列或这两者；其中胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的序列、SEQ ID NO:17的序列或这两者；或其中胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:51的序列、SEQID NO:43的序列或这两者。
28.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中CAR分子还包含前导序列，例如，其中前导序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
29.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中CAR分子包含SEQ ID NO:58、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
30.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，与抑制选自以下的免疫抑制分子的物质组合使用：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ。
31.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中组合物包含1-5x 108个表达CAR的细胞。
32.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中与表达CD19相关的疾病是癌症。
33.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中与表达CD19相关的疾病是血液癌，例如，选自白血病或淋巴瘤的血液癌。
34.根据权利要求32所述的用途或方法，其中癌症选自：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤、急性淋巴样白血病(ALL)、何杰金淋巴瘤、B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、与慢性炎症相关的DLBCL、滤泡淋巴瘤、儿科滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤(粘膜相关性淋巴组织的结外边缘区淋巴瘤)、边缘区淋巴瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非何杰金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾弥散性红髓小B细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病变种、淋巴浆细胞性淋巴瘤、重链病、浆细胞骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤的、结内边缘区淋巴瘤、儿科结内边缘区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔(胸腺的)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、HHV8相关的多中心Castleman病中出现的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或不可分类的淋巴瘤。
35.根据权利要求32所述的用途或方法，其中癌症选自MCL、CLL、ALL、何杰金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
36.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，与细胞因子组合使用。
37.根据权利要求36所述的用途或方法，其中细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21。
38.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中CAR是可调节性CAR(RCAR)。
39.根据权利要求38所述的用途或方法，其中RCAR包含：
胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含胞内信号传导结构域和第一转换开关结构域，
抗原结合构件，所述抗原结合构件包含结合CD19的抗原结合结构域和第二转换开关结构域；和
跨膜结构域。
40.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中哺乳动物具有或经鉴定为具有BTK突变。
41.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中与表达CD19相关的疾病是血液癌，并且其中对激酶抑制剂、表达针对哺乳动物的CAR分子的细胞或这两者的抵抗性延迟或减少。
42.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中与表达CD19相关的疾病是血液癌，并且其中对血液癌的缓解是延长的或者血液癌的复发延迟。
43.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中表达CAR19的细胞与第二激酶抑制剂组合施用，其中当哺乳动物是或经鉴定是依鲁替尼的非应答者或复发者时，第二激酶抑制剂不是依鲁替尼。
44.根据权利要求43所述的用途或方法，其中第二激酶抑制剂选自以下一种或多种：GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13、或其组合。
45.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中哺乳动物是(或经鉴定是)激酶抑制剂的部分应答者，并且在部分应答的时间期间向哺乳动物单独地或与BTK抑制剂组合地施用表达CAR19的细胞。
46.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中哺乳动物是(或已经鉴定为是)用依鲁替尼治疗后具有进展性或稳定病情的非应答者，并且在病情进展或稳定期间向哺乳动物单独地或与第二BTK抑制剂组合地施用表达CAR19的细胞，其中第二激酶抑制剂不是依鲁替尼。
47.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中激酶抑制剂是依鲁替尼并且配制依鲁替尼以便施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期，例如，其中周期长度是21或28天。
48.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，包括用至少一种表达CD19 CAR的细胞进行淋巴细胞输注。
49.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中配制细胞和激酶抑制剂以同时施用。
50.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中配制细胞和激酶抑制剂以依次递送。
51.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，其中哺乳动物已经历过淋巴细胞清除。
52.根据权利要求51所述的用途或方法，其中淋巴细胞清除包括施用美法仑、环磷氮芥、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。
53.根据前述权利要求任一项所述的用途或方法，还包括施用免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂至哺乳动物。
54.根据权利要求53所述的用途或方法，其中mTOR抑制剂是依维莫司或雷帕霉素。
55.制备表达CAR的细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞)或细胞群体的方法，包括：
使细胞或细胞群体与BTK抑制剂接触；和
在一些条件下导入(例如，转导)编码CAR分子的核酸至细胞或细胞群体中，从而表达CAR分子。
56.根据权利要求55所述的方法，其中CAR分子是结合CD19的CAR分子。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中细胞是T细胞或NK细胞，或其中细胞群体包括T细胞、NK细胞或这两者。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其包括使细胞或细胞群体与BTK抑制剂接触10-20、20-30、30-40、40-60或60-120分钟并且随后从细胞或细胞群体移除大部分或全部BTK抑制剂。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中在收获细胞或细胞群体后或在刺激细胞或细胞群体前添加BTK抑制剂。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的方法，其中BTK抑制剂选自依鲁替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13。
61.根据权利要求55-60中任一项所述的方法，其中细胞群体还包含癌细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中BTK抑制剂抑制癌细胞中的BTK。
63.根据权利要求55-62中任一项所述的方法，还包括从细胞群体清除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)。
64.反应混合物，其包含免疫效应细胞群体、BTK抑制剂和CAR分子或编码CAR分子的核酸。
65.根据权利要求64所述的反应混合物，其中一个或多个免疫效应细胞表达CAR分子或包含编码CAR分子的核酸。
66.根据权利要求64所述的反应混合物，其中BTK抑制剂选自依鲁替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13。
67.根据权利要求64所述的反应混合物，其还包含癌细胞。
68.反应混合物，其包含免疫效应细胞群体和CAR分子或编码CAR分子的核酸，其中免疫效应细胞包含共价失活的ITK。
69.根据权利要求68所述的反应混合物，其还包含癌细胞。
70.根据权利要求68所述的反应混合物，其中癌细胞包含共价失活的BTK。
71.包含表达结合CD19的CAR分子的细胞(“表达CAR19的细胞”)和一种或多种激酶抑制剂的组合物，其中激酶抑制剂选自Bruton酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制剂、mTOR抑制剂或促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制剂。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中表达CAR19的细胞和一种或多种激酶抑制剂以单一剂量形式或作为两个或更多个剂量形式存在。
73.根据权利要求71或72所述的组合物，用作药物。
74.根据权利要求71或72所述的组合物，用于治疗与表达CD19相关的疾病。
75.根据前述权利要求任一项所述的用途、方法或组合物，其中表达CAR19的细胞是人免疫效应细胞(例如，人T细胞或人NK细胞)或细胞群体。
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