JP2024518011A - 多様な免疫細胞のための単鎖および多鎖合成抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

本開示は、単鎖および多鎖合成抗原受容体、そのような合成抗原受容体の製造方法、ならびに疾患および障害の治療のためのその使用を提供する。

Description

関連アプリケーションの相互参照
この出願は、2021年2月19日に出願された米国仮出願第63/151,421号および2021年9月16日に出願された米国仮出願第63/245,181号に対して、35 USC §119に基づく優先権を主張しており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる目的のために。
技術分野
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、単鎖および多鎖の合成抗原受容体に関する。
配列表の参照による組み込み
この出願には、「NK-DNA-PRT-1-11231_ST25.txt」というタイトルの配列表が添付されており、2022年2月21日に作成され、34,352,306バイトのデータを有し、IBM-PC、MS-Windows（登録商標）オペレーティングシステムでマシンフォーマットされています。配列表は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
CAR は合成免疫受容体であり、T 細胞をリダイレクトして腫瘍細胞を選択的に殺すことができます。 CAR-T 細胞の成功にもかかわらず、このアプローチには「サイトカイン放出症候群」(CRS) や神経毒性などの毒性を含むいくつかの制限があります。
CAR-T とは対照的に、NK (ナチュラルキラー) 細胞には細胞溶解機能と抗ウイルス免疫が自然に備わっていますが、GvHD を引き起こす可能性のある TCR がありません。 CAR-NK 細胞は、CAR-T とは対照的に、過剰なサイトカイン産生を引き起こす可能性が低くなります。
第 2世代CAR は、いくつかの異なるポリペプチドの融合です。例えば、キムリアは、マウス scFv (FMC63)、ヒト CD8 ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト 4-1BB 共刺激ドメイン、およびヒト CD3z 活性化ドメインから構成されます。これらのドメインはやや恣意的な方法でつなぎ合わされており、結果として得られる構築物には、非特異的な凝集、緊張性シグナル伝達、生理学的調節の欠如など、いくつかの問題があります。
理論に束縛されるものではないが、二重特異性、二価、またはバイパラトープ性の抗原結合部分を有するCARを設計するためにscFvが使用される場合、これらの問題はさらに悪化する可能性がある。
上記の次世代 SAR 設計のほとんどのもう 1 つの大きな制限は、それらが主に T 細胞で活性を持ち、NK 細胞、単球/マクロファージ、樹状細胞、好中球などの他の免疫細胞では機能しないことです。
従来第2世代CARの設計上の制限のいくつかを克服するために、Ab-TCR（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/070608 A1）、TCR受容体融合タンパク質またはTFP (参照により本明細書に組み込まれるWO 2016/187349 A1)、合成免疫受容体(SIRs)(参照により本明細書に組み込まれるWO 2018/102795 A1を参照)、三官能性T細胞抗原カプラー(Tri-TAC)(参照により本明細書に組み込まれるWO2015/117229 A1を参照）を含む次世代CARと総称されるいくつかの代替設計が報告されている。これらの代替 CAR デザインは一般に、共刺激ドメインが欠如している。
国際公開第２０１７／０７０６０８号 国際公開第２０１６／１８７３４９号 国際公開第２０１８／１０２７９５号 国際公開第２０１５／１１７２２９号
本開示は、単一特異性、二重特異性、多重特異性、および汎用の次世代ＳＡＲ設計を提供する。
本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの特異的構成を有する合成抗原受容体（SARｓ）を提供し、この合成抗原受容体は、免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、単球、マクロファージ、好中球など）において発現された場合、従来のキメラ抗原受容体（CAR）を発現する免疫細胞、例えばCD3z活性化ドメインと41BBまたはCD28共刺激ドメインドメインを発現する第二世代CARと比較して、免疫細胞の活性化、標的細胞の殺傷、サイトカインの分泌（例えば、IL-2、インターフェロン-γ、TNFa）およびインビボ活性の改善を示す。
本開示は、本開示のＳＡＲと同時発現できる新規なアクセサリモジュールも提供する。本開示は、以下のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する；ａ）細胞膜に固定されたサイトカインの低親和性変異体（例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５）； b) エピトープタグを有する膜固定サイトカインおよびc) 自殺、生存、マーカー機能を果たす多目的遺伝子スイッチ。
本開示は、本開示の単鎖または多鎖ＳＡＲのいずれか１つまたは複数を有するアクセサリモジュールのいずれか１つまたは複数を発現する細胞を作製する方法を提供する。アクセサリ モジュールは、SAR なしでセル内で表現できます。本開示はまた、本開示のアクセサリーモジュールおよび／またはＳＡＲの発現のために最適化された短いプロモーターおよび内部リボソーム部位を有する最適化されたベクターを提供する。
一態様では、本開示は、生理学的シグナル伝達を提供する単鎖の新規な次世代ＳＡＲ設計に関する。さらに重要なことに、別の態様では、本開示は、マルチチェーンの新規な次世代ＳＡＲ設計に関する。
態様では、本開示は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージおよび好中球などを含む様々な免疫細胞において活性である新規な次世代合成抗原受容体（ＳＡＲ）設計に関する。この開示は、任意の細胞にＴ細胞受容体様の抗原結合特異性を与える、ユニバーサルＴＣＲ－ＳＡＲ（またはｕＴＣＲ－ＳＡＲ）と呼ばれる新規なＳＡＲ設計に関する。
本開示はまた、ＭＨＣ（またはＨＬＡ）分子と結合してペプチド抗原に結合する能力を含む、Ｔ細胞様結合特性を有する任意の細胞を含む非Ｔ細胞を提供する。本開示は、そのような細胞を生成するための一般的な方法、および様々な疾患の治療におけるそれらの使用を提供する。
本開示はまた、細胞生存、検出、追跡、濃縮、選択および除去機能を提供するための養子細胞療法に使用できる多目的スイッチを提供する。
本開示はまた、Ｉ型およびＩＩ型膜貫通タンパク質を含むキメラ融合タンパク質を生成するための普遍的な方法を提供する。この方法は、I型タンパク質の抗原結合ドメインと、II型タンパク質のサイトゾル、膜貫通、ヒンジおよび/または細胞外抗原結合ドメインを組み込んだ合成抗原受容体を生成するために使用することができる。
また、本明細書では、本明細書に記載の単鎖、二本鎖または多鎖SARおよび/またはアクセサリーモジュールのいずれかをコードする核酸も提供される。また、本明細書では、本明細書に記載の単鎖、二本鎖、および多鎖のSARおよび/またはアクセサリーモジュールのいずれかを一緒にコードする核酸のセットも提供される。
いくつかの実施形態において、上述のSARｓ（単離されたSARなど）のいずれかによれば、SARをその表面に提示するエフェクター細胞（例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、iPSCなど）が提供され、ここでエフェクター細胞は、SARの1つ以上のポリペプチド鎖及び／又は任意のアクセサリーモジュールをコードする1つ以上の核酸を含む1つ以上のプロモーターを有する1つ以上のベクターを含む。
また、本明細書では、本明細書に記載の単鎖、二本鎖および多鎖ＳＡＲおよび／またはアクセサリーモジュールのいずれかをコードする本明細書に記載の核酸のいずれかを含む哺乳動物細胞も提供される。また、本明細書では、本明細書に記載の単鎖、二本鎖および多鎖ＳＡＲおよび／またはアクセサリーモジュールのいずれかを共にコードする、本明細書に記載の核酸のセットのいずれかを含む哺乳動物細胞も提供される。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＴＣＲとは対照的に、本開示のＳＡＲが任意の哺乳動物細胞において発現され、機能的に活性であることができることを規定する。一実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球などである。本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞のいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞、ＣＤ４ + T細胞、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、T幹細胞、Treg細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞、iNKT（生得的ナチュラルキラー細胞）、NK細胞、g-NK細胞、メモリー様NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞 (CIK)、iPSC 由来 NK 細胞、α/β T 細胞、γ/δ T 細胞、iPSC 由来 T 細胞、B 細胞、マクロファージ/単球、iPSC。本明細書に記載される哺乳動物細胞のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は以下の群から選択される：ｉＰＳＣ（免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩ、ＹＴＳまたはその誘導体などの不死化細胞株である。本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞のいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞のいくつかの実施形態では、対象は癌を有すると診断または同定され、本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は同種異系である。
また、限定されないが、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞および顆粒球を含むＴ細胞以外の細胞において機能的に発現することができる単鎖および多鎖ＴＣＲが本明細書に提供される。
また、本明細書では、本明細書に記載の哺乳動物細胞のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。また、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを含むキットも提供される。
また、本明細書において提供されるのは、以下のものを含む医薬組成物である；本明細書に記載される一本鎖、二本鎖および多本鎖SARおよび／またはアクセサリーモジュールのいずれかをコードする本明細書に記載される核酸のいずれか、または本明細書に記載される一本鎖、二本鎖および多本鎖SARおよび／もしくはアクセサリーモジュールのいずれかを一緒にコードする本明細書に記載される核酸のセットのいずれか、および薬学的に許容される担体含む医薬組成物。また、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを含むキットも提供される。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的抗原を提示する標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによるＳＡＲを発現するエフェクター細胞と接触させることを含む、方法が提供され、ここで、 SAR は 1 つ以上の標的抗原に特異的に結合します。
いくつかの実施形態では、上記の標的細胞を死滅させる方法のいずれかによれば、接触はインビボで行われる。いくつかの実施形態では、接触はインビトロで行われる。
本明細書に記載のＳＡＲのいずれかを発現する細胞の検出、単離、精製、増殖、濃縮および除去のための方法が提供される。
また、本明細書において提供されるのは、一本鎖、二本鎖および多鎖SARおよび／またはアクセサリーモジュールを発現する細胞を作製する方法であって、本明細書に記載されるSARおよびアクセサリーモジュールのいずれかをコードする本明細書に記載される核酸のいずれか、または本明細書に記載される多鎖SARのいずれかをコードする本明細書に記載される核酸のセットのいずれかを哺乳動物細胞に導入することを含む方法である。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、哺乳類細胞はヒト細胞である。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞からなる群から選択される細胞である。 、NK細胞、およびマクロファージ/単球。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、対象から得られた哺乳動物細胞である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は癌を有すると診断または特定される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、導入ステップの後に、液体培地中で細胞を培養するステップをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、導入ステップの前に、対象から哺乳動物細胞を取得するステップをさらに含む。
明細書では、治療有効量の本明細書に記載の哺乳動物細胞のいずれかを対象に投与することを含む、対象における疾患（例えば、癌、感染症、アレルギー、免疫障害など）を治療する方法も提供する。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、投与ステップの前に被験体に投与される哺乳動物細胞を得るため、被験体から初期細胞を得るステップ、および本明細書に記載される一本鎖、二本鎖、多鎖SARおよび／またはアクセサリーモジュールのいずれかをコードする本明細書に記載される核酸のいずれか、または本明細書に記載される一本鎖、二本鎖、多鎖SARおよび／またはアクセサリーモジュールのいずれかを一緒にコードする本明細書に記載される核酸のセットのいずれかを初期細胞に導入するステップをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態は、導入ステップと投与ステップとの間に、対象に投与される細胞を液体培地中で培養するステップをさらに含む。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。
本明細書に記載される単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、異種抗原結合ドメインは以下の群から選択される：抗体、抗体フラグメント（vL、vH、Fabなど）、scFv、（scFv）2、VHHドメイン、FHVH（完全ヒトvHドメイン）、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場（例えば、 センチリン、アフィボディ、ZIPドメイン、アダプターなど）、VNARドメイン、リガンド、TCR、TCRの可変ドメイン（Va、Vb、Vg、Vd）および受容体。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、異種抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。
本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、異種抗原結合領域は単一の抗原に特異的に結合する。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、単一抗原は腫瘍抗原である。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、表Ｂに列挙される抗原から選択される。
本明細書に記載される単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、N末端からC末端方向またはC末端からN末端方向に進む場合、単鎖SARは、天然に存在しない細胞外抗原結合ドメイン、任意のリンカー、天然に存在する受容体の任意の細胞外リガンド結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、任意の細胞質共刺激性ドメイン、およびITAMを構成する任意の細胞質一次シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾル一次シグナル伝達ドメインは、互いに直接隣接する。本明細書に記載の単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインと任意の細胞質一次シグナル伝達ドメインは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、任意の一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、互いに直接隣接する。本明細書に記載のいずれかの一本鎖SARのいくつかの実施形態では、任意の一次シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、共刺激ドメインとＩＴＡＭは互いに直接隣接する。本明細書に記載されるいずれかの単鎖SARのいくつかの実施形態において、共刺激ドメインとITAMは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。
本明細書に記載の単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態では、N末端からC末端方向またはC末端からN末端方向に進む場合、単鎖SARは、非天然起源の細胞外抗原結合ドメイン（複数可）を含む、 任意のリンカー、天然に存在する受容体の任意の細胞外リガンド結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、およびITAMを含む。
本明細書に記載される一本鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、N末端からC末端方向またはC末端からN末端方向に進む場合、単鎖SARは、非天然に存在する細胞外抗原結合ドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、ITAM、および共刺激ドメインを含む。
本明細書に記載される一本鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、N末端からC末端方向またはC末端からN末端方向に行く場合、単鎖合成抗原受容体は、非天然に存在する細胞外抗原結合ドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン、第2の細胞内シグナル伝達ドメイン、ITAM、および第1の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
本明細書に記載の単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、N末端からC末端方向へ、またはC末端からN末端方向へ行く場合、単鎖合成抗原受容体は、異種細胞外抗原結合ドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン、ITAM、一次シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインを含む。
。本明細書に記載の単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、N末端からC末端方向へ、またはC末端からN末端方向へ行く場合、単鎖合成抗原受容体は、非天然に存在する細胞外抗原結合ドメイン（複数可）、膜貫通ドメイン、ITAM、第2の細胞内シグナル伝達ドメイン、および第1の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
本明細書に記載の単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインは互いに直接隣接している。本明細書に記載の単鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。
本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ３ｚに由来する。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインはＦｃＲγに由来する。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１０に由来する。本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインはＤＡＰ１２に由来する。
また、本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も本明細書に提供される。また、本明細書に記載される単鎖ＳＡＲのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載される核酸のいずれかを含むベクターも本明細書に提供される。
また、本明細書では、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む哺乳動物細胞も提供される。本明細書に記載される哺乳動物細胞のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、またはｉＰＳＣである。
また、本明細書にはSAR発現細胞を作製する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターのいずれかを哺乳動物細胞に導入することを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、ナイーブT細胞、メモリーT細胞、Treg細胞、ナチュラルキラーT細胞、NK細胞、B細胞、およびマクロファージ／単球の群から選択される細胞である。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、T細胞、NK細胞またはNKT細胞）を生じさせることができるiPSC（人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞または造血幹細胞からなる群から選択される細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、NK92、NK92MIまたはその誘導体などの不死化細胞株である。 本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は被験体から得られた哺乳動物細胞である。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は癌を有すると診断または同定される。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、導入する工程の後に細胞を液体培地中で培養する工程をさらに含む。
また、本明細書では、治療有効量の本明細書に記載の哺乳動物細胞のいずれかを対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法も提供する。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、投与ステップの前に、対象から初期細胞を得るステップ、および本明細書に記載される核酸のいずれかまたは本明細書に記載されるベクターのいずれかを初期細胞に導入して対象に投与される哺乳動物細胞を得るステップをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、導入ステップと投与ステップとの間に被験体に投与される細胞を液体培地で培養するステップをさらに含む。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。
本明細書では、以下を含む少なくとも１つの第１のポリペプチドを含む多重鎖ＳＡＲが提供される。オプションのヒンジドメイン、膜貫通ドメイン。およびオプションのサイトゾルドメイン。
本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、Ｖα、Ｖβ、Ｖγ、Ｖδ、ｖＬ、ｖＨドメイン、ｓｃＦｖ、ａ（ｓｃＦｖ） ２ 、 ａ VHH ドメイン、FHVH (完全ヒト vH ドメイン)、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、VNAR ドメイン、リガンド、および受容体。本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。
本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの第１のポリペプチドは、単一の抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合領域を含む。本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、単一抗原は腫瘍抗原である。
本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、ＳＡＲはＩＴＡＭを欠いているが、ＩＴＡＭを含む一次刺激ドメインを含むシグナル伝達タンパク質を補充する。本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲのいずれかのいくつかの実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ３ｚ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１０の群から選択されるシグナル伝達タンパク質を動員する。
本明細書に記載される多鎖SARのいずれかのいくつかの実施形態において、N末端からC末端方向またはC末端からN末端方向に進む場合、多鎖SARの少なくとも第1のポリペプチドは、異種抗原結合ドメイン（複数可）を含む、 任意のリンカー、天然に存在する受容体の任意の細胞外ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、任意の細胞質共刺激性ドメイン、およびITAMを構成する任意の細胞質一次シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび任意の細胞質一次シグナル伝達ドメインは、互いに直接隣接する。本明細書に記載の多鎖SARの少なくとも第1のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインと任意の細胞質一次シグナル伝達ドメインは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、任意の一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、互いに直接隣接する。本明細書に記載の多鎖SARの少なくとも第一のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態において、任意の一次シグナル伝達ドメインとコスティミュレイトリードメインは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。本明細書に記載の多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、共刺激ドメインとＩＴＡＭは互いに直接隣接している。本明細書に記載の多鎖SARの少なくとも第1のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態において、共刺激ドメインとITAMは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。
本明細書に記載される多重鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に進む場合、多重鎖は、 SARには、異種抗原結合ドメイン、任意のリンカー、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、およびITAMが含まれる。
本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に進む場合、少なくとも最初のポリペプチドは、多重鎖SARのポリペプチドには、異種抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、ITAM、および共刺激ドメインが含まれる。
本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に進む場合、少なくとも最初のポリペプチドは、多重鎖ＳＡＲのポリペプチドには、異種抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、第２の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＴＡＭ、および第１の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。
本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に進む場合、少なくとも最初のポリペプチドは、多重鎖 SAR のポリペプチドには、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ITAM、一次シグナル伝達ドメイン、および共刺激ドメインが含まれます。
本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端の方向に、またはＣ末端からＮ末端の方向に進む場合、第１のポリペプチドは、多重鎖 SAR には、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ITAM、第 2 の細胞内シグナル伝達ドメイン、および第 1 の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれます。
本明細書に記載の多重鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインは互いに直接隣接している。本明細書に記載の多鎖SARの少なくとも第1のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインは、1～500アミノ酸（例えば、1～250アミノ酸、または1～50アミノ酸）離れている。
本明細書に記載される多鎖ＳＡＲの少なくとも第１のポリペプチドのいずれかのいくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２の群から選択される１つまたは複数のタンパク質に由来する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明は、以下の非限定的な図においてさらに説明される。
図 1 は、さまざまな二重鎖の単一特異性、二重特異性、および多重特異性 SAR の概略図を示しています。
図２は、異なる形態のＡＡＢＤ（例えば、ｖＨＨ、ＳＶＨ、ａＶＨ、アフィボディ、セントイリンなど）を含む異なる二重鎖単一特異性、二重特異性および多重特異性ＳＡＲの概略図を示す。
図３は、本開示の単鎖および二本鎖ＣＤ１６－ＳＡＲが発現時に有することができる様々なフォーマットの描写を示す。これらの SAR は、Ig 様ドメイン (D1 および D2 ドメイン) の両方を含む CD16 の細胞外ドメイン全体に基づいています。
図４は、本開示のＣＤ１６－ＳＡＲが発現時に有することができる様々なフォーマットの描写を示す。これらの SAR は、CD16 の部分的な細胞外ドメインに基づいています。 SAR はモジュール形式であるため、CD16 モジュールを NKp44、NKp46などに由来するさまざまなモジュールで置き換えて、多様な SAR を生成できます。
図５は、本開示のＮＫｐ３０ ＳＡＲが発現時に有することができる様々な形式の描写を示す。 SAR はモジュール形式であるため、NKp30 モジュールを NKp44、NKp46などに由来するさまざまなモジュールで置き換えて、多様な SAR を生成できます。
図６は、 ＣＤ１９を発現するＲＳ４；１１ ＧＬｕｃ標的細胞と２時間共培養したときの、示されたＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞を用いたマタドール細胞傷害性アッセイの結果を示す。
図７は、 ＲＳ４；１１ ＧＬｕｃ標的細胞と２時間共培養した場合に、示されたＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞を用いたマタドール細胞毒性アッセイの結果を示す。
図８は、 Ｌ３６３－ＧＬｕｃ標的細胞と２時間共培養した場合に、示されたＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞を用いたマタドール細胞毒性アッセイの結果を示す。
図９は、 ＲＳ４；１１ Ｇｌｕｃ標的細胞と２時間共培養した場合に、示されたＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞を用いたマタドール細胞毒性アッセイの結果を示す。
図１０は、 ＲＳ４；１１ ＧＬｕｃ標的細胞と２時間共培養した場合に、示されたＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞を用いたマタドール細胞傷害性アッセイの結果を示す。
図１１は、 Ｌ３６３－Ｇｌｕｃ標的細胞と２時間共培養した場合に、示されたＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞を用いたマタドール細胞毒性アッセイの結果を示す。
図１２は、 ＮＫＧ２ＤなどのＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインへの抗原結合ドメインの融合を含むＳＡＲの作製の一般的な説明を示す。
図13A～Cは、以下を示す。(A) NK92、初代NK細胞およびU266細胞（NY-ESO1＋／HLA-A2）と共培養した場合のNY-ESO1ペプチド（SEQ ID NO: 10880）を標的とするuTCR-SAR（061621-SCjJ7；SEQ ID NO: 9366）を発現する初代T細胞による細胞死、(B) TNFαのアップレギュレーション、および(C）T細胞をコントロールT2細胞またはペプチドを負荷したT2細胞と共培養した場合のNY-ESO1ペプチドを標的とするuTCR-SAR（061621-SCjJ7；SEQ ID NO: 9366）を発現する初代T細胞によるIFNγのアップレギュレーション。
詳細な説明
次に、本発明をさらに説明する。以下の文章では、本発明のさまざまな態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、特に反対のことが明確に示されない限り、他の任意の態様と組み合わせることができます。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の任意の特徴と組み合わせることができる。
特に明記されていない限り、または文脈から暗黙的に示されている場合を除き、以下の用語および語句には、以下に示す意味が含まれます。明示的に別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、その用語または語句が関連する技術分野で獲得した意味を排除するものではありません。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は特定の実施形態の説明を助けるために提供されるものであり、特許請求の範囲に記載された発明を限定することを意図したものではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、一実施形態にとって有用であるが、有用であるかどうかにかかわらず、不特定の要素を含めることができる組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素に関して使用される。一般に、本明細書で使用される用語は一般に「オープンな」用語として意図されていることが当業者には理解されよう（例えば、用語「含む」は「含むがそれに限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する」は「含むがそれに限定されない」と解釈されるべきである）は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む」という用語は「含まれるがこれに限定されない」と解釈されるべきである、など）。
一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野でよく知られており、一般に使用されているものである。 。本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、また、別段の指示がない限り、本明細書全体にわたって引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州(2013))を参照されたい。本明細書に記載される免疫学、分子生物学、分析化学、有機合成化学、および医薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、送達、および患者の治療に使用されます。
本明細書で使用される「自律的抗原結合ドメイン」または「AABD」という用語は、自律的に、すなわち、別の抗原結合ドメインの不在下で抗原に結合することができる抗原結合ドメインを指す。例示的AABDは、vLドメインの不在下で抗原と結合することができる単一vHドメインまたは自律的vHドメイン(aVH)、典型的には単一ヒトvHドメイン(SVH)である。別の例示的AABDは、完全ヒトvHドメイン(FHVH)である。別の例示的AABDは、vHドメインの不在下で抗原と結合することができる単一vLドメインまたは自律的vLドメイン、典型的には単一ヒトvLドメイン(SVL)である。AABDはまた、自律的に抗原と結合することができる他の抗原結合ドメインも指す。ある実施形態において、AABDは、非scFv抗原結合ドメインである。例示的な非scFVベースの自律的抗原結合ドメインとしては、限定するものではないが、vHHドメイン、ヒト化vHHドメイン、単一可変ドメイン-TCR(svd-TCR)、および非免疫グロブリン抗原結合足場、例えば、DARPIN、アフィボディ、ZIPドメイン(例えば、RZIP、EZIP、E4、R4など)が挙げられる。)、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、オボディ、リピボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、センチリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、アルマジロリピートタンパク質またはそのフラグメント。非scFVベースの自律的抗原結合ドメインのさらなる例としては、受容体のリガンド結合ドメイン(例えば、CD16-V158A、NKG2D)またはそのフラグメント、リガンドの受容体結合ドメイン(例えば、APRIL、トロンボポエチンなど。)またはそのフラグメント、アダプター(例えば、RZIP、EZIP、E4、K4、NKG2D-YA、NKG2D-AFなど。)またはそのフラグメント、アダプター結合タンパク質(例えば、ULBP2R 、ULBP2-S3など。)またはそのフラグメント、エピトープまたはタグ(例えば、Streptag、FLAGタグなど。)、自己抗原またはそのフラグメントなどが挙げられる。
本開示は、単一特異性、二重特異性および多重特異性SARを作製するための構成要素としての、複数のヒトVHドメインなどのヒトVH(またはvH)ドメインなどのAABDの使用を記載した。ある実施形態において、本開示は、単一特異性、二重特異性および多重特異性の新規SARを作製するための構成要素としての、複数のヒトVHドメインなどのヒトVHドメインなどのAABDの使用を記載する。
量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合の「約」という用語は、±20%、場合によっては±10%、または場合によっては±5%、または場合によっては、特定の値から±１％、または場合によっては±０．１％であり、そのような変動は、開示された方法を実行するか、または本明細書に組成物を説明するのに適切であるためである。さらに、任意の値または範囲 (たとえば、 20 未満または同様の用語) には、そのような値の間またはその値までの任意の整数が明示的に含まれます。したがって、例えば、「１から５個の変異」には、１、２、３、４、および／または５個の変異が明示的に含まれる。
本明細書に記載される「ABR」または「抗原結合受容体」という用語は、抗原結合ドメインを有する任意の受容体を指す。 ABRの抗原結合ドメインは、scFv、vL、vH、VHH、抗体、抗体フラグメント(例えば、 Fab)、抗体様部分、Vα、Vβ、svd-TCR、サイトカイン、受容体などを含み得る。 、ABR には、細胞表面での発現を可能にする膜貫通ドメインまたは膜アンカードメインがあります。例示的なABRには、第1世代CAR、第2世代CAR、TFP、SIR、STAR、zSIR、cTCR、TCR、Ab-TCR、TRI-TACまたはTACなどが含まれる。本明細書に記載の合成抗原受容体(SAR) 、も ABR の例です。
「Ab-TCR」または「AbTCR」という用語は、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1に記載されているような次世代CARプラットフォームを指す。ある実施形態において、Ab-TCRは、少なくとも1つのTCRシグナル伝達モジュールを動員することができるTCRモジュールに融合された標的抗原に特異的に結合する抗体部分を含んでなる。Ab-TCRの構築に使用可能な例示的TCRモジュールは、配列番号6009-6014(表6)および参照により本明細書に組み込まれるWO2017/070608 A1に提供される。
「アクセサリモジュール」という用語は、PDL1、PDL2、 CD80、CD86 、crmA、p35、 hNEMO-K277A (またはNEMO-K277A)、 hNEMO-K277A-delta-V249-K555、mNEMO-K270A、K13のいずれか1つまたは複数を指します。 -opt、IKK2-S177E-S181E (またはIKK2-SS/EE) 、IKK1-S176E-S180E (または IKK1-SS/EE)、MyD88-L265P、TCL-1a、MTCP-1、CMV- 141、41BBL 、 CD40L 、vFLIP-K13、MC159、cFLIP-L/MRITα、cFLIP-p22、HTLV1 Tax、HTLV2 Tax、HTLV2 Tax-RS変異体、FKBPx2-K13、FKBPx2-HTLV2-Tax、FKBPx2-HTLV2-Tax-RS、IL6R-304 -vHH-Alb8-vHH、IL12f、PD1-4H1 scFV、PD1-5C4 scFV、PD1-4H1-Alb8-vHH、PD1-5C4-Alb8-vHH、CTLA4-イピリムマブ-scFv、CTLA4-イピリムマブ-Alb8-vHH、IL6 -19A-scFV、IL6-19A-scFV-Alb8-vHH、sHVEM、sHVEM-Alb8-vHH、hTERT、Fx06、Brd4 をターゲットとした shRNA、IgSP-[hTRAC-opt2]、IgSP-[hTRBC-opt2]、マルチ目的スイッチ（例えば、IL2-tBCMA、IL15-tBCMA、IL2-RQR、IL15-RQRなど）、NKG2C、CD94、 DAP10、DAP12、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、FcRγ 、および免疫細胞（例えば、 ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えば、 ＳＡＲ－ＮＫ細胞、ＳＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞）を使用して、免疫細胞の活性を減少、調節、または改変する。一実施形態では、アクセサリモジュールは治療対照（例えば、イカパーゼ９）である。いくつかの実施形態において、アクセサリーモジュールは、SARもしくはTCRまたはSAR発現細胞もしくはTCR発現細胞の発現もしくは活性を増加、減少、調節もしくは修飾するために、SARもしくはTCRなどの免疫受容体と共発現される。アクセサリーモジュールは、単一のベクターまたは 2 つ以上の異なるベクターを使用して SAR または TCR と共発現させることができます。いくつかの実施形態では、アクセサリーモジュールは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞において発現される。
本明細書で使用される場合、「親和性」は、結合強度の尺度を表すことを意味する。親和性は一般に、結合剤がその標的に結合する「能力」を指します。当技術分野では、「親和性」を測定するために多数の方法が使用されている。例えば、親和性を計算するための結合実験の使用を含む、抗原に対する抗体の親和性を計算する方法は当技術分野で知られている。本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」は、少なくとも１０ －６ Ｍの結合親和性を有する抗体と抗原との間の接触を意味する。ある態様において、抗体は少なくとも約１０ －７ Ｍの親和性で結合し、典型的には、 10 -8 M、10 -9 M、10 -10 M、10 -11 M、または 10 -12 M。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル、多重鎖または単鎖、または完全な免疫グロブリンであり得、天然源または組換え源に由来し得る。抗体は、「ヒト化」、「キメラ」 、完全ヒトまたは非ヒトであってもよい。抗体は単一のドメイン(例えば、単一のvHドメイン)を有してもよい。
「抗体フラグメント」という用語は、抗原のエピトープと(例えば、結合、立体障害、安定化/不安定化、空間分布によって)特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部を指す。抗体フラグメントの例としては、限定するものではないが、Fab、Fab'、F(ab'h、Fvフラグメント、scFv抗体フラグメント、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VHおよびCHlドメインからなるFdフラグメント、線状抗体、vLまたはvHのいずれかなどの単一ドメイン抗体(sdAb)、ラクダ科動物vHHドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体、 および単離されたCDRまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメント。抗原結合フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NARおよびビス-scFvに組み込むこともできる(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照)。抗原結合断片は、フィブロネクチンIII型(Fn3)などのポリペプチドに基づいて足場にグラフトすることもできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載している米国特許第6,703,199号を参照のこと)。
「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、通常、これによって抗体が属するクラスが決定される。
「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体構造で抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ (κ) 軽鎖およびラムダ (λ) 軽鎖は、2 つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指します。
「抗がん剤」とは、異常な細胞分裂および増殖を阻害し、新生物細胞の遊走を阻害し、浸潤を阻害し、またはがんの増殖および転移を防止する薬剤を指す。この用語には、化学療法剤、生物学的薬剤（例えば、 ｓｉＲＮＡ、改変ＭＬＶなどのウイルスベクター、アデノウイルス、細胞傷害性遺伝子を送達するヘルペスウイルス）、抗体などが含まれる。
「抗癌効果」または「抗腫瘍効果」という用語は、限定するものではないが、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少を含む様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指し、 または癌性状態に関連する様々な生理学的症状の改善。「抗癌効果」はまた、そもそも癌の発生を予防するSARの能力によっても現れ得る。
「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか、あるいはその両方を伴い得る。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働き得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAに由来し得る。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、一般に、本明細書に記載の抗原結合ドメインによって特異的に認識される結合パートナーを指す。抗原または抗原結合ドメインのいずれかによって特異的に結合され得る抗原の非限定的な例は、表Bに記載されている。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、主要組織適合性複合体（MHC）と複合体を形成した外来抗原を提示する補助細胞（例えば、 B細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。 ）表面に。
例えば、感染性病原体の力価の減少、感染性病原体のコロニー数の減少、感染症の改善を含むがこれらに限定されない、様々な手段によって現れることができる生物学的効果を指す。感染症に伴うさまざまな生理学的症状。
「抗原結合ドメイン」または「抗原結合モジュール」または「抗原結合セグメント」または「抗原特異的ドメイン」(ASD)は、その一次、二次もしくは三次配列、翻訳後修飾および/または電荷のために高い特異度で抗原に結合するポリペプチドまたはペプチドを指す。ASDは、非特異的ドメインよりも高い親和性で標的に結合することができる。 抗原結合ドメインは、異なる源、例えば、抗体(全長重鎖、Fab断片、一本鎖Fv(scFv)断片、二価一本鎖抗体またはダイアボディ)、非免疫グロブリン結合タンパク質、リガンドまたは受容体に由来し得る。いくつかの実施形態では、当業者には理解されるように、高親和性で所与の同族体または抗原に結合するほぼいずれの分子もASDとして使用することができる。 いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、T細胞受容体(TCR)またはその一部を含む。 代表的実施形態では、種々の抗原結合ドメインの標的抗原および配列番号は、本明細書の表3～7に記載されている。代表的実施形態では、vL、vH、scFV、およびそれらのCDR領域の標的抗原および配列番号は、参照により全内容が本明細書に組み込まれる、特許出願PCT/US18/53247の表6A～Cおよび特許出願PCT/US19/ 035096の表3～4に記載されている。
Ｋａ ）」という用語は、受容体とリガンドの会合の平衡定数として定義される。
「自己抗体」とは、自己抗原に特異的なB細胞によって産生される抗体を指す。
「自己抗原」という用語は、自己抗体の産生などの自己免疫応答の産生を刺激する内因性抗原を指す。自己抗原の例としては、デスモグレイン１、デスモグレイン３、およびそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
「結合力」は、結合剤とその標的との間の相互作用の強さを指す（例えば、抗体とその抗原標的、受容体とその同族体などとの間の相互作用の強さ）。機能アッセイにおける抗体活性（例えば、 、フローサイトメトリーアッセイまたはMalibu-Gloアッセイ）も抗体親和性を反映します。
「アーキテクチャ」という用語は、異なるSARおよび一般的に任意である任意のアクセサリーモジュールを含む異なる構成要素(例えば、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン)の構成を指す。一実施形態では、ＳＡＲおよびアクセサリーモジュールは、単一の核酸分子によってコードされる。別の実施形態では、ＳＡＲは第１の核酸分子によってコードされ、アクセサリーモジュールは第２の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、アクセサリモジュールは、アクセサリモジュール内の構成要素の数に応じて、複数の核酸分子によってコードされる。 ＳＡＲおよびアクセサリモジュールの２つ以上の構成要素は、２Ａリボソームスキップ配列（例えば、 Ｐ２Ａ 、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａなど）などの切断可能なリンカーによって分離され得る。 ＳＡＲおよびアクセサリモジュールの２つ以上の構成要素は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）によって分離され得る。例示的なIRESはKSHVに由来する。 SARおよびアクセサリーモジュールの2つ以上の構成要素をコードする核酸の発現は、別個のプロモーターによって駆動され得る。プロモーターの例としては、EF1α、EFS、EFS2、CMV、RSV、mutRSV、MNDU3、Hsp70、およびHsp90が挙げられる。
表 A1 : 従来の CAR アーキテクチャ。第 1 世代の従来型 CAR (従来型 CAR I) は、細胞内シグナル伝達 (ISD) ドメイン (例えば、 CD3z) を持ち、共刺激ドメインを持ちません。 TCR融合タンパク質（TFP）は、従来のCAR 1の別の例です。第2世代の従来のCAR（従来のCAR 2またはCAR II）には、1つの共刺激ドメイン（例：41BBまたはCD28 ）と細胞内シグナル伝達（ISD）ドメイン（例： CD3z）があります。 ）。第 3 世代の従来型 CAR (従来型 CAR 3 または CAR III) は、2 つの共刺激ドメイン (例: 41BB および CD28) と細胞内シグナル伝達 (ISD) ドメイン (例: CD3z) を持っています。 Ab-TCR は、vL リンカー TCR ドメイン (TCRD および vH リンカー TCR ドメイン (TCRD) を組み込んだ二重鎖受容体であり、PCT/US2016/058305 に記載されています。cTCR は、一本鎖、1.5 鎖、または、1 つまたは複数の TCR 定常鎖 (TCR-C) に融合され、T 細胞シグナル伝達の活性化をもたらす vL および vH フラグメントに由来する抗原結合ドメインからなる二重鎖受容体。型核酸配列および対応する野生型アミノ酸配列。cTCR のさまざまな構成は PCT/US2017/064379 またはWO 2018/102795 A1 に記載されています。合成免疫受容体は次世代 CAR であり、PCT/US2017/064379 またはWO 2018/102795 A1 . SIRは、一本鎖、一本鎖、または二本鎖の受容体である 一実施形態では、SIRの抗原結合ドメインは、1つまたは複数のTCR定常鎖に融合されたvLおよびvH断片に由来するいくつかの実施形態では、ＳＩＲのＴＣＲ定常鎖は、コドン最適化された核酸配列によってコードされ、その発現および鎖対合を増強する１つまたは複数の変異を含む。 zSIRは、任意のリンカーを用いて2つのCD3z鎖またはその断片に作動可能に連結された抗原結合ドメイン(例えば、vL、vHなど)を含む二重鎖受容体であり、PCT/US2019/035096に記載されている。
表Ａ１－１～Ａ１－１９は、本開示の単一特異性、二重特異性、および多重特異性ＳＡＲの例示的なアーキテクチャを提供する。使用される略語は次のとおりです。SP (シグナルペプチド)。 AADB (自律抗原結合ドメイン); L (オプションのリンカー); LL (長いリンカー)、(AABD-L)n (オプションのリンカーを含む n コピーの AABD、n = 0、1、2、3、4 以上)、AABD1-4 (1 つ以上の抗原を標的とする異なる AABD)、V1 (vL、vH、Va、Vb、Vg または Vd鎖)、Ig (Ig リンカー)、 TCR-Ig (TCR 鎖由来の Ig リンカードメイン)、ConP (接続ペプチド)、TM (膜貫通ドメイン)、CP (サイトゾルドメイン) ）、IC（細胞内ドメイン）、Ca（TCRαの定常鎖）、Cb（TCRβの定常鎖）、Cg（TCRγの定常鎖）、Cd（TCRδの定常鎖）、scFv（単鎖フラグメント可変）、scTFv（ TCRの2つの可変フラグメント（例えば、VaおよびVb）を含む単鎖フラグメント）、dCa/dCb/dCg/dCd（Igリンカードメインを欠くTCRα、β、γまたはδのN末端欠失定常鎖）、TCR-ConP （TCRα、β、γまたはδ定常鎖の連結ペプチド）、Ca-ConP（TCRα定常鎖の連結ペプチド）、IgCL（免疫グロブリン軽鎖からのIgリンカー）、IgCH1（免疫グロブリン重鎖からのIgリンカー）、CD3εγδ ECD（ CD3ε、γまたはδ鎖の細胞外ドメイン）、CSD（共刺激ドメイン）、4-1BBまたはBB（4-1BBの共刺激ドメイン）、CD28または28（CD28の共刺激ドメイン）、CD3zまたはzdまたはz（ CD3z）。 NKp30-Ig (Nkp30 の免疫グロブリン様ドメイン)、NKp44-Ig (Nkp44 の免疫グロブリン様ドメイン)、NKp46-Ig1-Ig2 (Nkp46 の免疫グロブリン様ドメイン 1 および 2)、CD16-D1 (CD16 のドメイン 1)、CD16- D2 (CD16 のドメイン 2)、scTCR (単鎖 TCR)、細胞外ドメイン (ECD)、活性化ドメイン (AD)。 Va、Vb、Vg、Vd (TCRα、β、γ、δの可変ドメイン)、FCRG (FcRγ);ヒンジドメイン (Hn)。
本明細書で使用される場合、「有益な結果」または「望ましい結果」には、疾患状態の重症度の軽減または緩和、疾患状態の悪化の防止、疾患状態の治癒、疾患状態の発症の防止、患者が病状を発症する可能性を低下させ、患者の生命または余命を延長します。
「同じエピトープに結合する」とは、抗体、ｓｃＦｖ、または他の抗原結合ドメインが標的抗原に結合し、例示された抗体、ｓｃＦｖ、または他の抗原結合ドメインと同じエピトープを有する能力を意味する。一例として、例示された抗体、ｓｃＦｖ、または他の結合剤および他の抗体のエピトープは、標準的なエピトープマッピング技術を使用して決定することができる。当技術分野で周知のエピトープマッピング技術には、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ． 66 (Glenn E. Morris 編、1996) Humana Press、トトワ、ニュージャージー。本開示のｓｃＦｖ、ＳＡＲ、抗体および他の免疫治療薬によって結合されるヒトＣＤ２０、ＢＣＭＡおよびヒトＭＰＬ抗原の例示的なエピトープは、それぞれ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／の配列番号１５１４９～１５１５４、１５１５５～１５１５９および１５１６０に提供される。 ５３２４７に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、抗体、SARまたはそれらのフラグメントに関連する場合、本開示の範囲内においてそれらの等価物または生物学的等価物が意図されることは、明示的な記載がなくとも、また別段の意図がない限り推察される。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」または「変異体」または「機能的変異体」という用語は、参照タンパク質、抗体またはその断片、その断片の受容体、リガンドまたは断片を指す場合、「その等価物」と同義であることを意図する。その、非免疫グロブリン抗原結合ドメインまたはその断片、ＳＡＲまたはその断片、ポリペプチドまたは核酸は、所望の構造または機能を依然として維持しながら最小限の相同性を有するものを意味する。本明細書に特に記載しない限り、上記のいずれも、選択的にスプライシングされたアイソフォームおよび他の動物種からの等価物を含むその等価物も含むことが企図される。例えば、等価物は、少なくとも約70％の相同性もしくは同一性、または少なくとも80％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約85％、あるいは少なくとも約90％、あるいは少なくとも約95％、または少なくとも約95％の相同性もしくは同一性を意図する。あるいは、少なくとも９８％パーセントの相同性または同一性を有し、参照タンパク質、ポリペプチド、抗体もしくはそのフラグメントまたは核酸と実質的に同等の生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドである。あるいは、ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、その等価物は、参照ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドまたはタンパク質である。
タンパク質が互いに同一性または相同性を有し、類似または同一の機能を保持できることが認識されるであろう。本明細書で使用されるポリペプチド「変異体」は、ポリペプチドの治療的、抗原的、および／または免疫原的特性が保持されるように、保存的置換および／または修飾においてのみ列挙されたポリペプチドと異なるポリペプチドである。ポリペプチド変異体は、典型的には、同定されたポリペプチドに対して少なくとも約７０％、より典型的には少なくとも約９０％、最も典型的には少なくとも約９５％の相同性を示す。あるいは、免疫反応性を有するポリペプチドについては、上記ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を改変し、改変されたポリペプチドの免疫反応性を評価することによって変異体を同定することもできる。このような修飾配列は、例えば本明細書に記載の代表的な手順を使用して調製および試験することができる。本開示には、生物学的活性を保持しながら、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、98.5％、99％または99.9％の同一性を有するSARおよびSAR成分(例えば CD16、CD32、CD64、FcRγ、DAP10、DAP12、DNAM1、OX40、2B4の細胞外領域、ヒンジ領域、膜貫通領域および細胞質領域、 KIR2DL1、KIR2DS4、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2E、NKG2F、NKG2H、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3zなど )が含まれる。本開示には、抗原結合ドメイン、細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、共刺激ドメイン、生物学的活性を保持しながら、本明細書に記載の配列のいずれかと少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、98.5％、99％または99.9％の同一性を有するアクセサリーモジュールも含まれる。バリアントには、他の種のホモログや選択的スプライスされたアイソフォームが含まれます。
本明細書で使用される場合、用語「CD3複合体」は、TCR活性化の膜貫通シグナル伝達のための多数のタンパク質を含む細胞表面分子集合体を指す。
本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合部位を意味することを意図する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら、 Ｊ．Ｂｉｏ．化学。 252:6609-6616 (1977); Kabat et al.、米国保健福祉省、「免疫学的に興味深いタンパク質の配列」(1991)。 Ｃｈｏｔｈｉａら、 Ｊ．Ｍｏｌ．バイオ。 196:901-917 (1987);およびＭａｃＣａｌｌｕｍら、 Ｊ．Ｍｏｌ．バイオ。 ２５ ２６２：７３２－７４５（１９９６）、ここでの定義には、相互に比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにも関わらず、抗体またはグラフト化抗体またはその変異体のCDRを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され使用される用語の範囲内にあることが意図される。本明細書で使用される場合、抗体の異なるCDRは、異なる定義の組み合わせによっても定義され得る。たとえば、vHCDR1 は Kabat に基づいて定義でき、VHCDR2 は Chothia に基づいて定義できます。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基は以下のとおりである。
本開示のSAR、二特異性抗体の抗原結合ドメインを構成し得る例示的なvL及びvHセグメントのCDRのSEQ ID および 本開示の他の免疫治療薬の抗原結合ドメインを構成し得る例示的なvLおよびvHセグメントのCDRのSEQ IDは、PCT／US2018／053247のそれぞれSEQ ID NO：13204～14121およびSEQ ID NO：14122～15039（表6A、B）、PCT／US2017／064379の表5～6、およびPCT／US2021／022641の表39に提供されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本開示のＳＡＲ、抗体、および他の免疫療法薬の抗原結合ドメインを構成することができる例示的なｖＬおよびｖＨセグメントの配列番号も本開示の表３に提供される。本開示に提供されるvLフラグメントおよびscFvの軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3（例えば表3）は、SEQ ID NO：10882～11118、11119～11355および11356～11592に提供される。本開示で提供されるvLフラグメントのCDR1、CDR2およびCDR3（例えば表3）は、SEQ ID NO：10882～11118、11119～11355および11356～11592で提供される。本開示で提供されるvHフラグメントおよびscFvの重鎖CDR1、CDR2およびCDR3（例えば表３）は、それぞれ、SEQ ID NO:11593-11829、11830-12066、12067-12303で提供される。
いくつかの実施形態では、標的抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール（Ｆａｂ様またはＦｖ様抗原結合モジュールなど）への言及は、抗原結合モジュールが（ａ）で標的抗原に結合することを意味する。他の分子に対する結合親和性の少なくとも約１０倍（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００以上）の親和性；または（ｂ）約１／１０以下のＫ ｄ （例えば、 １／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１１７５、１／１００、１／２００、１／３００） 、１／４００、１／５００、１／７５０、１／１０００以下）は、他の分子に結合するためのそのＫ ｄ倍である。結合親和性は、ELISA、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析、Malibu-Gloアッセイ、Topangaアッセイ、または放射性免疫沈降アッセイ(RIA)などの当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
「癌」および「癌性」とは、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類の生理学的状態を指すまたは説明する。 「腫瘍」および「癌」という用語は、本明細書では互換的に使用され、例えば、両方の用語は、固体および液体、例えば、びまん性または循環性の腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「癌」または「腫瘍」という用語には、前癌性癌および悪性癌および腫瘍が含まれる。 「癌」という用語は、組織病理学的タイプまたは浸潤段階に関係なく、あらゆる種類の癌性増殖または発癌過程、転移組織または悪性形質転換細胞、組織、または器官を含むことを意味する。
「細胞療法」または「細胞ベースの療法」または「免疫細胞療法」または「免疫エフェクター細胞療法」は、疾患の予防または治療のための細胞の使用を伴う療法を指す。細胞療法の非限定的な例としては、CAR-T細胞療法、NK細胞療法、組換えTCR-T細胞療法、TIL(腫瘍浸潤リンパ球)が挙げられる。
「化学療法剤」とは、癌の化学療法に有用であることが知られている化合物である。
は、養子細胞移入と呼ばれる技術を使用した、癌の治療法としての使用が企図される人工（非天然）免疫細胞（例えば、 Ｔ細胞）受容体である。 CAR は、人工 T 細胞受容体、キメラ T 細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られています。 CAR は、CAR が結合する特定の抗原に応答して T 細胞の活性化と増殖を刺激するように特別に構築されています。一般に、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞内で発現されると、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性、および細胞内シグナル生成を細胞に提供する、ポリペプチドのセットを指し、最も単純な実施形態では典型的には２つである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む。分子。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは互いに隣接している。一態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義する少なくとも1つの共刺激分子に由来する1つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一実施形態では、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、 ４－１ＢＢ（すなわち、 ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０、２Ｂ４、および／またはＣＤ２８から選択される。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、細胞プロセシングおよび細胞内へのＣＡＲの局在化中に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意に切断される。細胞膜。様々な実施形態において、ＣＡＲは、抗原特異的ドメイン（ＡＳＤ）、ヒンジ領域（ＨＲ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、任意の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含む組換えポリペプチドである。オプションの共刺激ドメインは一般に、第 1 世代 CAR コンストラクトには存在しません。異なる抗原結合ドメイン(例えば、 vLおよびvHフラグメント、vHH、リガンドおよび受容体など)を含み、41BB共刺激ドメインを組み込むいくつかの例示的な第2世代CARの核酸配列およびタンパク質配列を配列番号1455～1703に示す。およびPCT/US2020/014237の341-7589 (表8 )。
「コドン最適化」または「種コドンバイアスの制御」は、特定の宿主細胞の好ましいコドン使用を指す。当業者には理解されるように、コード配列を改変して特定の宿主におけるその発現を増強することは有利であり得る。当業者は、遺伝暗号の縮重的な性質により、ヌクレオチド配列が異なる様々なDNA化合物を使用して、本開示の所与のポリペプチドをコードできることを認識するであろう。
本明細書で使用される場合、「共発現」とは、２つ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現を指す。遺伝子は、例えば、単一のタンパク質または単一のポリペプチド鎖としてのキメラタンパク質をコードする核酸であり得る。本明細書に記載されるSAR（例えば、CAR、SIR、zSIR、またはTCRなど）は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖として発現され得、このポリペプチド鎖は、その後、各々が異なる機能単位を表す異なるポリペプチドに切断される。いくつかの実施形態において、ＳＡＲが２つ以上の機能的ポリペプチド単位からなる場合、異なる機能的単位は、１つ以上のポリヌクレオチド鎖を使用して共発現される。一実施形態では、共刺激は、ＳＡＲまたはＴＣＲと同時発現されるが、ＳＡＲ（例えば、 ＣＡＲ 、ＳＩＲ、ｚＳＩＲ、またはＴＣＲなど）ポリペプチドの不可欠な部分ではないアクセサリーモジュールによって提供される。別の実施形態では、異なるポリヌクレオチド鎖は、切断可能なリンカー（例えば、 Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａなど）をコードする核酸配列によって連結される（表２０） 。別の実施形態では、切断効率を高めるために、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＳＧＳＧ）モチーフ（配列番号１２３９および１２４０）も切断可能なリンカー配列の上流に追加される。例示的な切断可能なリンカーおよびフリン切断部位の核酸およびアミノ酸配列を表２０に提供する。 ＳＡＲの異なる単位をコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によって連結され得る。一実施形態では、 ＳＡＲの異なる機能単位（例えば、２つ以上の鎖）は、単一のベクターを使用して発現される。 SAR のさまざまな機能単位は、単一のプロモーターまたは複数のプロモーターを使用して発現させることができます。一実施形態では、ＳＡＲの異なる機能単位は、２つ以上のベクターを使用して発現される。例示的な切断可能なリンカーおよびフリン切断部位の核酸およびアミノ酸配列を表２０に提供する。
「保存的置換」または「保存的配列修飾」とは、コードされたタンパク質の結合特性または機能に有意な影響を与えないか、または変化させないアミノ酸修飾を指す。例えば、「保存的配列修飾」は、本開示のＳＡＲの結合特性または機能に有意な影響を与えないか、または変更しないアミノ酸修飾を指す（例えば、定常鎖、抗体、抗体フラグメント、または非抗体における保存的変化） 。免疫グロブリン結合ドメイン）。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖 (例、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖 (例、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖 (例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン)を持つアミノ酸が含まれます。 、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。したがって、本開示のＳＡＲ内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、改変されたＳＡＲは、本明細書に記載される結合アッセイおよび／または機能アッセイを使用して試験することができる。
「共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」または「CSD」は、T細胞の増殖、生存および/または発達を増強するSARの部分を指す。本開示のＳＡＲは、ゼロ、１つまたは複数の共刺激ドメインを含んでもよい。各共刺激ドメインは、例えば、TNFRスーパーファミリーのメンバー、CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、BAFF-R、HVEM、CD27、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40またはそれらの組み合わせのいずれか1つ以上の共刺激ドメインからなる。さらに例示的な共刺激ドメインとしては、2B4のシグナル伝達ドメイン、NKp30、NKp44、NKp46、GITR、CD81、CD160、DAP10およびB7-H3が挙げられる。他の共刺激ドメイン（例えば、他のタンパク質からの）は当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。共刺激ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、または天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的断片もしくは誘導体を含むことができる。本開示のＳＡＲは、ゼロ、１つまたは複数の共刺激ドメインを含んでもよい。
「共刺激分子」または「共刺激受容体」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって増殖、活性化またはサイトカイン分泌など、これらに限定されない免疫細胞による共刺激応答を媒介する免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞など）上の同族結合パートナーを指す共刺激細胞外分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子です。共刺激分子には、MHC クラス I 分子、BTLA、Toll リガンド受容体、OX40、Dap10、CD27、CD28、CD2、CD5、CD8、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/ CD18)、ICOS (CD278)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CD81、および 4-1BB (CD137)。共刺激受容体は、NK 細胞やマクロファージなどの T 細胞以外の細胞上で発現される場合があります。
「ｃＴＣＲ」という用語は、野生型ＴＣＲ核酸コード配列、およびＴＣＲに由来しない抗原結合ドメインに連結された対応する野生型ＴＣＲタンパク質を指す。 ｃＴＣＲは、（Ｇｒｏｓｓ、Ｗａｋｓ、およびＥｓｈｈａｒ、１９８９）に記載されている ADDIN EN.CITE 。 ｃＴＣＲは、いくつかの実施形態において、参照対照として使用される。例えば、ＣＤ１９結合ドメインおよびＣＤ１９－ＳＩＲ（変異体ＴＣＲ鎖およびＣＤ１９結合ドメインを含む）を有するｃＴＣＲは、標的抗原に対して異なる発現および／または異なる結合親和性を有することになる。
「サイトゾル」または「細胞質」という用語は、薬剤、例えば、成熟型の細胞の細胞質に位置するタンパク質を指す。サイトゾルタンパク質は核に移行できますが、膜貫通タンパク質ではなく、細胞外に分泌されません。
は、発熱、低血圧、息切れ、腎機能障害、呼吸器疾患などの一連の兆候や症状を伴って現れる細胞療法（例、SAR-T、二重特異性T細胞結合抗体など）の合併症です。肺機能不全および/または毛細管漏出症候群。
「変性疾患」という用語は、細胞の変性変化に基づく継続的なプロセスの結果として組織や器官に影響を及ぼし、通常の身体の磨耗や運動や食事などのライフスタイルの選択によるものであっても、時間の経過とともにますます悪化する病気を指します。習慣。変性疾患の例には、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病（II型）、およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。
本明細書で使用される用語「由来」は、第１の分子と第２の分子との間の関係を示す。これは一般に、第 1 分子と第 2 分子の間の構造的類似性を指し、第 2 分子に由来する第 1 分子に対するプロセスやソースの制限を意味したり含んだりするものではありません。例えば、抗体分子に由来する抗原結合ドメインの場合、抗原結合ドメインは、必要な機能、すなわち抗原に結合する能力を有するのに十分な抗体構造を保持している。これは、抗体を産生する特定のプロセスに対する制限を意味するものではなく、例えば、抗原結合ドメインを提供するために、抗体配列から始めて、目的外の配列を削除するか、または突然変異を導入しなければならないことを意味するものではない。抗原結合ドメインで。
「二量体化分子」という用語は、本明細書で使用される場合、第１のスイッチドメインと第２のスイッチドメインとの結合を促進する分子を指す。実施形態において、二量体化分子は、対象において天然に存在しないか、または有意な二量体化をもたらす濃度では存在しない。実施形態では、二量体化分子は小分子、例えばラパマイシンまたはラパログ、例えばＲＡＤ００１、リミデュシドまたはＡＰ２０１８７である。リミドゥシドは、約０．０１～１ｍｇ／ｋｇであり得、細胞培養物中で約０．１ｎＭのＥＣ５０を有する。 AP20187は、単回または複数回の用量で約2～10 mg/kg/日投与することができる。
本明細書に記載の標的抗原の発現に関連する疾患、または標的を発現する細胞に関連する状態が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の抗原には、例えば、癌もしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは骨髄増殖性障害または前白血病などの前癌状態が含まれる。または、本明細書に記載の標的抗原を発現する細胞に関連する非癌関連の兆候。
本明細書で使用される「遺伝子改変細胞によって標的化される疾患」は、治療を達成するために遺伝子改変細胞が罹患細胞を標的とするか健康な細胞を標的とするかに関係なく、本開示の遺伝子改変細胞による、任意の疾患に何らかの様式で関与する任意の細胞の標的化を包含する。有益な結果。
用語 「解離定数（ K d ） 」は、受容体-リガンド（結合ドメイン-同族体など）相互作用の解離の平衡定数として定義されます。いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲは、約０．１ｐＭ～約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。
本明細書で使用される「非天然免疫受容体の多様なセット」または「SARの多様なセット」とは、複数の非天然免疫受容体を指す。 または抗原を標的とするSARS。実施形態では、ＳＡＲの多様なセットは、シグナル伝達鎖または「バックボーン」の多様なセットに連結された同じ結合ドメインを有する。一実施形態では、ＳＡＲの多様なセットは、標的抗原に対して多様な範囲の結合親和性を有し得る。一実施形態では、ＳＡＲの多様なセットは、多様な発現レベルを示し得る。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、免疫応答を誘発することができる抗原の部分、または抗体もしくは抗体断片に結合する抗原の部分であると定義される。エピトープはタンパク質配列または部分配列でありえます。
本明細書で使用される場合、用語「エンゲージャー」は、免疫細胞（例えば、 Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球）および免疫細胞の活性化をもたらす腫瘍細胞。エンゲージャーの例としては、二重特異性 T 細胞エンゲージャー (BiTE)、二重特異性キラー細胞エンゲージャー (BiKE)、三重特異性キラー細胞エンゲージャー (TRiKE)、または多重特異性キラー細胞エンゲージャー、またはユニバーサルが挙げられますが、これらに限定されません。複数の免疫細胞タイプと互換性のあるエンゲイジャー。
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターには、発現に十分なシス作用性エレメントが含まれます。発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む当技術分野で知られているすべてのベクターが含まれる。
タンパク質（例えば、ＳＡＲ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５など）の「機能部分」（「生物学的活性部分」 ）とは、完全長タンパク質または成熟タンパク質の１つまたは複数の機能を保持するタンパク質の部分を指す。 IL-12またはIL-15のそのような機能には、NK細胞生存の促進、NK細胞およびT細胞の活性化および増殖の調節、ならびに造血幹細胞からのNK細胞発生のサポートが含まれる。
本明細書で使用される場合、「F(ab)」は、抗原に結合するが一価であり、Fc部分を持たない抗体構造の断片を指し、例えば、酵素パパインによって消化された抗体は2つのF(ab)を生成する。フラグメントおよびＦｃフラグメント（例えば、重（Ｈ）鎖定常領域；抗原に結合しないＦｃ領域）。
本明細書で使用される場合、「F(ab')2」は、全IgG抗体のペプシン消化によって生成される抗体フラグメントを指し、このフラグメントは2つの抗原結合(ab')(二価)領域を有し、各(ab')領域は抗原に結合するためにSS結合によって結合されたH鎖の一部と軽(L)鎖の2つの別々のアミノ酸鎖であり、残りのH鎖部分は一緒に結合されている。 「F(ab')2」フラグメントは、2 つの個別の Fab' フラグメントに分割できます。
本明細書で使用される「FcRγ」または「FCER1G」または「FCRG」または「FcRy」という用語は、Gene ID: 2207で表される遺伝子を指します。これは、高親和性IgE受容体および他のFc受容体の一部であるジスルフィドリンカー膜貫通シグナル伝達アダプターです。 。
用語「機能的部分」は、ＳＡＲに関して使用される場合、それが一部であるＳＡＲ（親ＳＡＲ）の生物学的活性を保持するＳＡＲの任意の部分または断片を指す。機能的部分には、例えば、標的細胞を認識、あるいは疾患を検出、治療、予防する能力を、親SARと類似程度、同程度、あるいはそれ以上に保持するSARの部分が含まれる。親ＳＡＲに関して、機能部分は、例えば、親ＳＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含み得る。
例えば、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に）、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。 ）。一実施形態では、柔軟なポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ） ｎ 、（例えば、配列番号２４３１）を含み、ここで、ｎは、以下に等しい正の整数である。たとえば、n= 1 、n=2、n=3。 ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。一実施形態では、柔軟なポリペプチドリンカーには、(Gly 4 Ser) 4または(Gly 4 Ser) 3が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「遺伝子改変細胞」、「リダイレクト細胞」、「遺伝子操作細胞」または「改変細胞」は、本開示のＳＡＲを発現する細胞を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＳＡＲをコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、同じベクター内にＳＡＲおよび１つまたは複数のアクセサリー分子（例えば、 ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ｃｒｍＡ、ＭＣ１５９など）をコードするベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＳＡＲをコードする第１のベクターおよびアクセサリー分子をコードする第２のベクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＳＡＲをコードする第１のベクターと、２つ以上のアクセサリー分子をコードする第２のベクターとを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＳＡＲをコードする第１のベクター、第１のアクセサリー分子をコードする第２のベクター、および第２のアクセサリー分子をコードする第３のベクターを含む。
本明細書で定義される「HLA非依存性TCR」または「MHC非依存性TCR」は、MHC制限とは独立して抗原を認識できるTCRである。例示的な実施形態では、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲは、ＭＨＣ複合体によって提示されない細胞表面上の抗原に結合し得る。一実施形態では、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲは、ＭＨＣ複合体による提示とは独立して細胞表面上に発現される抗原に結合し得る。 ＨＬＡ非依存性ＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲであり得る。例示的な実施形態では、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲは、遍在的に発現される単型抗原提示分子であるＭＲ１を認識するＭＣ．７．Ｇ５（ＭＣ７Ｇ５）である。 ＨＬＡ非依存性ＴＣＲは、操作されたＴＣＲまたは組換えＴＣＲであり得る。例示的な実施形態では、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、メソテリン、ＰＳＭＳ、またはＢＣＭＡなどの細胞表面上で発現されるタンパク質に結合し得る操作されたＴＣＲである。 ＴＣＲの可変ドメインを操作する方法（例えば、ＣＤＲ移植など）は当技術分野で知られており、タンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＭＳＬＮ、ＰＳＭＡなど）またはタンパク質に結合できるＨＬＡ非依存性ＴＣＲを生成するために使用することができる。エピトープはMHC複合体とは独立して細胞外に発現します。本開示は、１つ以上のＡＡＢＤを含む、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲを含むＴＣＲの骨格を有する二重特異性、バイパラトピックおよび多重特異性ＳＡＲを提供する。TCR（例えば、HLA非依存性TCR）の骨格を有する本開示のSARのAABDドメインは、完全ヒト、ヒト化または非ヒトであり得る。一実施形態において、本開示は、１つ以上の完全ヒトｖＨドメインを含むＴＣＲ（例えば、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲ）を提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の完全ヒトｖＬドメインを含むＴＣＲ（例えば、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲ）を提供する。
本明細書で定義される「ＨＬＡ非依存性ＴＣＲ可変ドメイン」は、ＨＬＡ非依存性様式で抗原に結合することができるＴＣＲの可変ドメインである。 ＨＬＡ非依存性可変ドメインは、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの可変ドメインであり得る。 ＨＬＡ非依存性ＴＣＲ可変ドメインは、単一可変ドメインＴＣＲ（すなわち、ｓｖｄ－ＴＣＲ）であり得る。 ＨＬＡ非依存性ＴＣＲ可変ドメインは、天然に存在するＨＬＡ非依存性可変ドメインであってもよいし、操作されたＨＬＡ非依存性可変ドメインであってもよい。例示的な実施形態において、改変されたHLA非依存可変ドメインは、当技術分野で公知の技術（例えば、CDRグラフティング、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなど）を使用して、タンパク質（例えば、CD19、CD22、BCMA、MSLN、PSMA）の細胞外ドメインに対して生成され得る。
本明細書で使用される場合、「HLA制限された」または「MHC制限された」とは、MHC分子とそのペプチドの両方を必要とする抗原認識を指す。 「HLA 制限を受けない」、「HLA 非依存性」、または「MHC 制限を受けない」抗原認識とは異なります。
本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」という用語は、その自然環境にはない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子には、ある種から別の種に導入された遺伝子が含まれます。異種遺伝子には、何らかの方法で改変された（例えば、突然変異、複数のコピーの付加、非天然の調節配列への結合など）、生物に固有の遺伝子も含まれる。別の例として、異種遺伝子には、以前または将来の細胞系統または細胞の分化状態で発現される遺伝子が含まれる。異種遺伝子は、通常、染色体中の遺伝子配列と天然には見られないDNA配列と結合しているか、染色体の天然には見られない部分（例えば、遺伝子が通常発現していない遺伝子座で発現している遺伝子）と結合している点で、内因性遺伝子とは区別される。
本明細書で使用される「ヒンジ領域」(HR)は、SARの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある親水性領域を指す。ヒンジ領域には、抗体のＦｃ断片またはその断片もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域またはその断片もしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ヒンジ領域の例としては、CD8aヒンジ、および、例えばIgG（ヒトIgG4など）のGly3またはCH1およびCH3ドメインと同程度に小さくてもよいポリペプチドからなる人工スペーサーが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、（i）IgG4のヒンジ、CH2およびCH3領域、（ii）IgG4のヒンジ領域、（iii）IgG4のヒンジおよびCH2、（iv）CD8aのヒンジ領域、（v）IgG1のヒンジ、CH2およびCH3領域、（vi）IgG1のヒンジ領域、または（vi）IgG1のヒンジおよびCH2領域のいずれか1つ以上である。いくつかの例示的なヒンジ領域が本開示の表２９に提供されている。他のヒンジ領域も当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。
「免疫障害」という用語は、免疫系の機能不全を特徴とする疾患を指す。自己免疫疾患は、体の正常な部分に対する異常な免疫反応によって生じる症状です。自己免疫疾患には少なくとも 80 種類あります。
例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、T細胞、例えば、アルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、マスト細胞、単球/マクロファージおよび骨髄性細胞が挙げられる。派生食細胞。
「免疫エフェクター機能」または「免疫エフェクター応答」、「エフェクター機能」とは、分化した細胞の特殊な機能を指す。 T細胞またはNK細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。例えば、免疫エフェクター機能または免疫応答は、標的細胞の死滅または成長もしくは増殖の阻害を促進する、T細胞またはNK細胞の特性を指す。 T 細胞の場合、一次刺激と共刺激は免疫エフェクターの機能または応答の例です。抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の場合、抗原提示およびサイトカイン分泌はエフェクター機能の例である。
本明細書で使用される「免疫応答」とは、自然免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、獲得（適応）免疫、自己免疫および／または過剰免疫を含むがこれらに限定されない免疫を指す。
本明細書で使用される場合、「インターロイキン-2」(「IL-2」)および「インターロイキン-15」(「IL-15」)は、TおよびNK細胞の活性化および増殖を調節するサイトカインを指す。これらのサイトカインは多くの生物学的活性を共有しています。それらは共通の受容体サブユニットに結合することがわかっており、同じ受容体をめぐって競合する可能性があり、その結果、互いの活性を負に制御する可能性があります。様々なIL-2およびIL-15分子の配列が当技術分野で知られている。一態様では、ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２、または７０～９９．９％のアミノ酸配列相同性を有するその変異体（例えば、配列番号７８３３～７８３７）である。一態様では、ＩＬ－１５は、野生型ＩＬ－１５、または７０～９９．９％のアミノ酸配列相同性を有するその変異体（例えば、配列番号７８３８～７８４１）である。いくつかの態様では、IL-2は哺乳類IL-2である。いくつかの態様では、ＩＬ－１５は、哺乳動物ＩＬ－１５（例えば、ホモ・サピエンス・インターロイキン１５（ＩＬ１５）、転写バリアント３、ｍＲＮＡ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００５８５．４；カニスルプス・ファミリアリス・インターロイキン１５（ＩＬ１５）、ｍＲＮＡ、 NCBI 参照配列: NM_001197188.1; Felis catusインターロイキン 15 (IL15)、mRNA、NCBI 参照配列: NM_001009207.1)。特定の態様では、IL-2またはIL-15のすべてまたは機能的部分は、膜貫通タンパク質のすべてまたは一部に結合している。一態様では、ＮＫ細胞またはＴ細胞は、膜貫通タンパク質の全部または一部に融合したＩＬ－２またはＩＬ－１５の全部または一部を含む融合タンパク質を発現する。特定の態様では、膜貫通タンパク質の部分は、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインの全部または一部を含む。
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」（ＩＳＤ）または「活性化ドメイン」という用語は、分子の細胞内シグナル伝達部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成します。免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性およびヘルパー活性が含まれます。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例としては、 T細胞受容体複合体のz鎖またはそのホモログ、ヒトCD3ゼータ鎖、CD3ポリペプチド（γ、δおよびε）、sykファミリーチロシンキナーゼ（Syk、ZAP 70など）、srcファミリーチロシンキナーゼ（Lck、Fyn、Lynなど）およびCD2、CD5、CD28のようなT細胞形質導入に関与する他の分子が挙げられるがこれらに限定されるものではない。他の細胞内シグナル伝達ドメインは当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。
別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」または「活性化ドメイン」を含むことができる。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激または抗原依存性シミュレーションに関与する分子に由来するものが含まれる。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子に由来するドメインが含まれる。例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3zの細胞質配列を含むことができ、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、CD28または41BBなどの共受容体または共刺激分子に由来する細胞質配列を含むことができる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。一次細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例としては、CD3-ゼータ、共通FcRガンマ(FCER1GまたはFcRγまたはFCRG)、FcガンマRIIIa、FcRベータ(FcイプシロンR1b)、CD3ガンマ、CD3に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。デルタ、CD3 イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10、および DAP12。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の物質を実質的に含まない分子、生物学的物質、または細胞物質を指す。一態様では、「単離された」という用語は、他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または細胞または細胞小器官、または組織または器官を指す。天然源に存在するRNA、タンパク質またはポリペプチド、細胞または細胞小器官、または組織または器官。 「単離された」という用語はまた、組換えDNA技術によって生成される場合には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培地を実質的に含まない、または化学合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、天然には断片として存在せず、天然の状態では見出されないであろう核酸断片を含むことを意味する。 「単離された」という用語は、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すのにも使用され、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。 「単離された」という用語は、本明細書では、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すためにも使用され、培養された細胞または組織と操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
「長いリンカー」または「長いリンカードメイン」は、長さが25～500アミノ酸のリンカーである。一実施形態では、長いリンカーは、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５である。 、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、450、500のアミノ酸および任意の数長さ的にはその間。一実施形態では、長いリンカーは、２５～１２５アミノ酸の長さである。一実施形態では、長いリンカーは、長さが５０～１５０アミノ酸である。一実施形態では、長いリンカーは、７５アミノ酸と１７５アミノ酸との間の長さである。一実施形態では、長いリンカーは、長さが１００～２００アミノ酸である。一実施形態では、長いリンカーは、長さが１２０～２２０アミノ酸である。一実施形態では、長いリンカーは、長さが１００～３００アミノ酸である。
一実施形態において、リンカーは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインもしくはＩｇ様ドメインもしくはそれらの断片をコードするか、またはそれらを含む。 「Ｉｇドメイン」、「Ｉｇリンカードメイン」、「Ｉｇ様ドメイン」または「Ｉｇ様リンカードメイン」という用語は、本開示では互換的に使用される。免疫グロブリンドメインは、ギリシャのキートポロジーを持つ2枚のβシートに配置された7～9本の逆平行β鎖の2層サンドイッチからなるタンパク質ドメインの一種で、約125個のアミノ酸から構成されています。 Ig ドメインは、IgV、IgC1、IgC2、または IgI として分類できます。 9 つのベータ鎖を持つ IgV ドメインは、一般に 7 つのベータ鎖を持つ IgC ドメインよりも長くなります。一実施形態では、リンカーはＩｇＶドメインまたはその断片を含む。一実施形態では、リンカーはＩｇＣドメインまたはその断片を含む。 Ig ドメインは、免疫グロブリン、T 細胞受容体鎖、クラス I MHC、クラス II MHC、β2 ミクログロブリン、コレセプター (例: CD4 、CD8、CD19など)、抗原受容体アクセサリー分子 (例: CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a ) に見られます。 、CD79b）、共刺激分子または阻害分子（例えば、CD28、CD80、 CD86）、NK細胞受容体（例えば、KIR）、白血球免疫ログリン様受容体（LILR）、IgSF CAM（例えば、NCAM、ICAM、CD2など）、サイトカイン受容体（例えば、IL-1R、CSF-1Rなど）、成長因子受容体（例えば、PDGFR）、受容体チロシンキナーゼおよびホスファターゼ、Ig結合受容体、細胞骨格タンパク質（例えば、タイチン、パRAJIンなど）および他のタンパク質（例えば、 、CD147、CD90など）。例示的なＩｇリンカードメインは、ＩｇＣＬ（配列番号３５３６）およびＩｇＧ１－ＣＨ１（配列番号３５３７）である。追加の例示的なＩｇリンカーを表１３に示す（配列番号（ＰＲＴ）：３５３８～３５６９）。一実施形態では、リンカーはＥセットドメインを有する。 Eセットドメインは、免疫グロブリンおよび/またはフィブロネクチンIII型スーパーファミリーに関連している可能性がある「初期」Ig様フォールドファミリーです。一実施形態では、リンカーはフィブロネクチンIII型ドメインを有する。
いくつかの実施形態において、本開示のSARは以下を含むFv様またはFc-TCR抗原結合モジュールを含む；a）vL、VαまたはVγドメインからなる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチド鎖と、b)vH、VβまたはVδドメインを含む第2の抗原結合ドメインを含む第2のポリペプチド鎖。いくつかの実施形態では、ｖＬ、ＶαまたはＶγドメインのＣ末端に融合された第１のペプチドリンカーおよび／またはｖＬ、ＶαまたはＶγドメインのＣ末端に融合された第２のペプチドリンカーが存在する。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドリンカーは互いに結合することができる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖定常領域に由来する。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、ＣＨ３抗体ドメインまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーに含まれる免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＨ３）は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、 IgM または IgE 重鎖、場合によりヒト。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、ＴＣＲサブユニット定常領域に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、ａ）ＴＣＲαおよびβサブユニット定常ドメインに由来する。または b) TCR γ および δ サブユニット定常ドメイン。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは合成である。いくつかの実施形態では、ｖＬ、ＶαまたはＶγおよびｖＨ、ＶβまたはＶδのＣＤＲのすべてが、同じ抗体またはＴＣＲ部分に由来する。いくつかの実施形態では、ｖＬ抗体ドメインおよびｖＨ抗体ドメインは、２つ以上の抗体部分に由来する抗体ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｖＬ抗体ドメインは、ｖＨ抗体ドメインに由来する抗体ＣＤＲを含み、および／またはｖＬ抗体ドメインは、ｖＨ抗体ドメインに由来する抗体ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｖＬ抗体ドメインは、１つの抗体に由来するフレームワーク領域および別の抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを含み、および／またはｖＨ抗体ドメインは、１つの抗体に由来するフレームワーク領域および別の抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶαドメインおよびＶβドメインは、２つ以上のＴＣＲに由来するＴＣＲ ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶαドメインはＶβ ＴＣＲドメインに由来するＣＤＲを含み、および／またはＶβドメインはＶαドメインに由来するＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、Ｖαドメインは、１つのＴＣＲに由来するフレームワーク領域および別のＴＣＲに由来する１つ以上のＣＤＲを含み、および／またはＶβドメインは、１つのＴＣＲに由来するフレームワーク領域および別のＴＣＲに由来する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶγドメインおよびＶδドメインは、２つ以上のＴＣＲに由来するＴＣＲ ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶγドメインはＶδ ＴＣＲドメインに由来するＣＤＲを含み、および／またはＶδドメインはＶγドメインに由来するＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、Ｖγドメインは、１つのＴＣＲに由来するフレームワーク領域および別のＴＣＲに由来する１つまたは複数のＣＤＲを含み、および／またはＶδドメインは、１つのＴＣＲに由来するフレームワーク領域および別のＴＣＲに由来する１つまたは複数のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、共有結合（例えば、ペプチドまたは他の化学結合）または非共有結合などによって結合される。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインはジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドリンカーはジスルフィド結合によって連結される。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それが由来する配列と比較して１つまたは複数の修飾（例えば、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失）を含む変異体である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、互いに対するそれらの結合親和性を実質的に変化させない１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、互いの結合親和性を増大させる、および／または天然に存在しないジスルフィド結合を導入する１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドリンカーは、ノブイントゥホール修飾を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８：７－１５、２００１を参照）。いくつかの実施形態では、第１および第２のペプチドリンカーは、それらの相互の会合を強化するために静電ステアリングによって修飾される（例えば、ＷＯ２００６１０６９０５およびＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７－４６、２０１０を参照）。いくつかの実施形態では、Ｆｖ様またはＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールは、ヒト、ヒト化、キメラ、半合成、または完全合成である。
IgCLおよびIgG1-CH1リンカーを含む例示的なSAR構築物は、CD8SP-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-DAP10-opt1-Spe-CD3zCP-opt1-F-P2A-dSPE-IgSP-hu-によって表される。 mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-DAP10-opt2-Xba-CD3zCP-opt2-F-F2A-dXBA-Nde-K13-opt（配列番号5869）。この構築物中のIgG1-CHIインカー(配列番号(DNA): 1143、配列番号(PRT):3537)は、表13に示す他のIg様リンカー、例えばIgG2-IC-CHI1、IgG3-CHI1で置き換えることができる。 、IgG4-CHI1、IgAI-CHI1、IgA2-CHI1、IgD-CHI1、IgE-CHI1またはIgM-CHI1。 ＩｇＣＬおよびＩｇＧ１－ＣＨ１リンカーは、それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβに由来するＩｇ様リンカーによって置き換えることもできる（表１３） 。あるいは、ＩｇＣＬおよびＩｇＧ１－ＣＨ１リンカーは、ＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖に由来するＩｇ様リンカーによって置き換えることもできる（表１３） 。
本明細書で使用する場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子を指す。特に、リガンドは別の細胞上の受容体に結合し、細胞間の認識および/または相互作用を可能にします。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」（「リンカードメイン」または「リンカー領域」とも）は、ＳＡＲポリヌクレオチドまたはＳＡＲポリヌクレオチドの２つ以上のドメインまたは領域を結合するオリゴまたはポリペプチド（またはポリペプチドをコードするオリゴ）を指す。ポリペプチド、それぞれ本明細書に開示される。リンカーは、1 ～ 500 アミノ酸の長さまたは 3 ～ 1500 ヌクレオチドの長さのいずれかにすることができます。いくつかの実施形態では、「リンカー」は、切断可能または非切断可能である。特に明記しない限り、本明細書で使用される「リンカー」という用語は、非切断性リンカーを意味する。前記非切断性リンカーは、隣接するタンパク質ドメインの互いに対する自由な動きを可能にする柔軟な残基から構成され得る。このような残基の非限定的な例としては、グリシンおよびセリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは非柔軟性残基を含む。切断可能なリンカーの例としては、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカーまたはその機能的等価物、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーには、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテスコウイルス（Ｐ２Ａ）、テセアシグナウイルス（Ｔ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ配列、またはそれらの組み合わせ、変異体および機能的等価物が含まれる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間の切断をもたらすモチーフを含み得る（例えば、 Ｔ２Ａ配列を参照）。いくつかの例示的な切断可能なリンカーの核酸配列は配列番号1233から配列番号1238で提供され、いくつかの例示的なリンカーのアミノ酸配列は配列番号3627から配列番号3632で提供される。本明細書で使用される用語は、当業者には容易に理解されるであろう。リンカーモジュールは、表 13 に示す TCR および抗体リンカーも指します。
一実施形態では、切断効率を高めるために、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＳＧＳＧ）モチーフ（配列番号３６３３）も切断可能なリンカー配列の上流に追加される。切断可能なリンカーの潜在的な欠点は、N 末端タンパク質の末端に残された小さな 2A タグがタンパク質の機能に影響を与えたり、タンパク質の抗原性に寄与したりする可能性があることです。この制限を克服するために、いくつかの実施形態では、翻訳後の残りの２Ａペプチドの切断を促進するために、フリン切断部位（ＲＡＫＲ）（配列番号３６３５）がＳＧＳＧモチーフの上流に追加される。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指します。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特です。大量の遺伝情報を宿主細胞の DNA に送達できるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の 1 つです。 HIV、SIV、および FIV はすべてレンチ ウイルスの例です。
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milone et al.に提供されているような自己不活化レンチウイルスベクターを含む。 、モル。それで。 17(8): 1453-1464 (2009)。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、 Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが含まれるが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも入手可能であり、当業者には知られているであろう。レンチウイルスベクターの他の例は、ｐＬＥＮＴＩ－ＥＦ１α（配列番号１）、ｐＬＥＮＴＩ－ＥＦ１α－ＤＷＰＲＥ（配列番号２）、ｐＣＣＬｃ－ＭＮＤＵ３－ＷＰＲＥ（配列番号４）およびｐＣＣＬｃ－ＭＮＤＵ３－Ｅｃｏ－Ｎｈｅである。 -Sal-WPRE (配列番号5)。例示的な実施形態では、ＳＡＲ、またはＳＡＲプラスアクセサリーモジュール、またはアクセサリーモジュールをコードする核酸断片は、ｐＬＥＮＴＩ－ＥＦ１αとｐＣＣＬｃ－ＥＦ１αに存在するＮｈｅ Ｉ部位とＳａｌ Ｉ部位との間にクローニングすることができる。 MNDU3-Eco-Nhe-Sal-WPREベクターは、当技術分野で知られている方法を使用する。
本明細書で使用される「キラー細胞免疫グロブリン様受容体」または「KIR」は、ナチュラルキラー細胞およびT細胞のサブセットによって発現される膜貫通糖タンパク質のファミリーを指す。
哺乳綱の任意のメンバーを指す。
「マーカー遺伝子」は、標的細胞によって通常は発現されないタンパク質をコードしており、これにより形質導入の成功の同定が可能になります。マーカー遺伝子は、形質導入された細胞（例えば、SAR発現細胞）の選択的除去または濃縮にも使用することができる。例示的なマーカー遺伝子には、ｔＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ｔＣＤ１９、ｔＢＣＭＡ、およびＲＱＲ８が含まれる。
「多目的スイッチ」または「多目的遺伝子」は、自殺、生存、およびマーカー機能を提供するタンパク質をコードします。一実施形態では、上記の機能はすべて単一のポリペプチド鎖によって提供される。多目的スイッチの例としては、IL2-tBCMA、IL15-tBCMA、IL2-RQR8、IL2-tHer2などが挙げられます。
本明細書で使用される「ミモトープ」は、エピトープの構造を模倣する巨大分子、多くの場合ペプチドである。この特性により、エピトープによって引き起こされるものと同様の抗体応答が引き起こされます。特定のエピトープ抗原に対する抗体は、そのエピトープを模倣するミモトープを認識します。ミモトープはペプチドアプタマーの一種です。
用語「多鎖合成抗原受容体」「多鎖SAR」は、2つ以上のポリペプチド鎖を含む合成抗原受容体を意味する。マルチチェーン SAR はダブルチェーン SAR になる場合があります。二重鎖ＳＡＲは、２つの膜関連ドメイン（例えば、膜貫通ドメインまたは膜アンカードメイン）を含む。 CD19を標的とする例示的な多鎖SARは、CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-Spe-SP-Bst-CD19-hu-mROO5-1である。 -vH-Mlu-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-Xba-PAC（配列番号（DNA）：5451および配列番号（PRT）：6283）。このSAR構築物では、hu-mROO5-1 vL フラグメントは CD16-F158V-FL-TMCP-v1 モジュールに操作可能にリンクされ、hu-mROO5-1-vH フラグメントはCD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3に操作可能にリンクされます。 TMCP-v3。この SAR の 2 つの鎖は、フリン (F) および P2A 切断可能なリンカー配列によって分離されています。この SAR 構築物はまた、フリン (F) および F2A 切断可能リンカー配列によって SAR ポリペプチドから分離されたピューロマイシン耐性遺伝子 (PAC) も発現します。 SAR はモジュール設計であるため、CD16A-F158V-S197P-FL-v3 モジュールおよび CD16-F158V-FL-TMCP-v1 モジュールを他のシグナリング モジュールに置き換えて、異なるシグナリング チェーンで SAR を生成できます。さらに、hu-mROO5-1 vLおよびhu-mROO5-vHフラグメントは、異なる抗原を標的とするSARを生成するために、他の抗原を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、vL、vH、vHH、FHVH、セントチリン、svd-TCRなど)によって置換され得る。 。このようなマルチチェーン SAR の例は、仮出願の表 41に示されています。 （例えば、配列番号５４５１～５４６２、５４８３～５４９４、５５１５～５５２６、５５４７～５５５８、５５７９～５５９０、５６１１～５６２２、５６４３～５６５４など）。これらの新規なＳＡＲの発現および活性は、最適な機能活性を有するＳＡＲを選択するために、本開示に記載される方法を使用して試験することができる。
本明細書で使用される場合、「MHC」または「主要組織適合性複合体」は、哺乳動物における多数の遺伝子によってコードされる細胞表面分子を指す。 MHC 分子にはクラス I とクラス II が含まれます。クラス I 分子は、ヒトでは「HLA」または「ヒト白血球抗原」とも呼ばれます。 HLA 分子発現の複雑さの一部により、HLA は HLA システムとも呼ばれます。ヒトは、典型的にはプロセシングされた抗原をCD8細胞に提示することに関与する、すなわちHLA制限されたHLA-A、HLA-BおよびHLA-C分子を発現する。 DR、DQ、DPなどのクラスII分子は、典型的には、CD4+細胞への外部由来ペプチドの提示、すなわちMHCクラスII制限に関与している。一般に制限される MHC には、移植 (骨髄) マッチングの場合と同様に、クラス I とクラス II の両方が含まれます。
本明細書で使用される「ネイティブ」または「天然に存在する」または「内因性」とは、細胞にとって天然であるか、または細胞内で天然に発現される遺伝子、タンパク質、核酸（例えば、DNA、RNAなど）またはその断片を指す。したがって、T細胞の天然または内在性TCRα鎖ポリペプチドは、TCRα定常鎖に結合した可変ドメイン(Vα)からなる。天然または内在性のＴＣＲα鎖前駆体ポリペプチドはまた、成熟ポリペプチドから切断されるアミノ末端シグナルペプチドからなる。
本明細書で使用される「天然受容体」または「天然受容体」または「内因性受容体」または「天然受容体」は、天然に存在し、抗原結合ドメインまたはリガンド結合ドメインを含む任意の受容体を指す。この用語には、他の哺乳動物種の機能的変異体、アイソフォーム、ホモログが含まれます。天然受容体は、標的に結合すると細胞シグナルを伝達することができる場合、「天然シグナル伝達受容体」または「天然シグナル伝達受容体」であり得る。天然に存在する受容体または天然受容体は、細胞に固有のものであるか、または細胞内で自然に発現される。天然に存在するシグナル伝達受容体または天然受容体の例としては、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、NKG2Dなどが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の目的では、CD3シグナル伝達鎖(CD3ε、CD3γ、CD3δおよびCD3ζ) は「天然に存在する受容体」の定義には含まれず、代わりにシグナル伝達アダプターとして分類されます。
本明細書で使用される場合、「非ＴＣＲ天然受容体」または「非ＴＣＲ天然シグナル伝達受容体」または「非ＴＣＲ受容体」または「非ＴＣＲシグナル伝達受容体」という用語は、Ｔ細胞ではない受容体を指す。受容体（TCR）。非 TCR 受容体は、T 細胞以外の細胞でも発現する可能性があります。非 TCR 受容体は、CD3ζ、CD3ε、CD3δ、および/または CD3γ 鎖の発現を欠く細胞で発現する可能性があります。 「非ＴＣＲ天然受容体」は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを欠いている。 「非TCR天然受容体」はTCRシグナル伝達モジュール全体を動員しません。一実施形態では、「非ＴＣＲ天然受容体」は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαポリペプチドを含まない。一実施形態では、「非ＴＣＲ天然受容体」は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαのコード領域全体を含まない。一実施形態では、「非ＴＣＲ天然受容体」は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの定常鎖全体を含まない。一実施形態では、「非ＴＣＲ天然受容体」は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδまたはプレＴＣＲαのヒンジドメイン全体（または接続ペプチド）を含まない。一実施形態では、「非ＴＣＲ天然受容体」は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδまたはプレＴＣＲαの膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメイン全体を含まない。非 TCR 受容体は、T 細胞以外の細胞でも発現する可能性があります。 「非ＴＣＲシグナル伝達受容体」は、 ＴＣＲ可変ドメイン（例えば、 Ｖα、Ｖβ、Ｖγ、Ｖδ）またはＩｇドメイン（例えば、配列番号１１５８～１１７５）などのＴＣＲの断片を含み得る。非ＴＣＲシグナル伝達受容体は、ＴＣＲ定常鎖全体（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの定常鎖）を含まない。
本明細書で使用する場合、「非T細胞受容体モジュール」または「非TCRモジュール」または「非TCRシグナル伝達モジュール」または「NTCRM」という用語は、T細胞受容体膜貫通ドメインからなる配列を欠き、さらにT細胞受容体連結ペプチドおよび／または細胞内ドメインの全部または一部を欠く可能性のあるモジュールを指す。NTCRMは、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδまたはpre-TCRαの膜貫通ドメインからなる配列を欠く。NTCRMはさらに、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδまたはプレTCRαの連結ペプチドおよび／または細胞内ドメインの全部または一部を欠くことがある。
本明細書で使用される場合、用語「非CD3アダプターモジュール」または「非CD3アダプター」または「非TCR／CD3アダプター」または「「非TCR／CD3シグナル伝達アダプター」または「NCAM」は、T細胞受容体／CD3受容体複合体の構成要素ではないシグナル伝達アダプターを指す。一実施形態において、「非TCR/CD3アダプター」は、CD3ε、CD3ζ、CD3γもしくはCD3δ鎖またはそれらの変異体の膜貫通領域および／または細胞質領域を含まない。
本明細書で使用される「Ｎ末端付近」という用語は、Ｎ末端３０アミノ酸以内を意味する。。例えば、「vLおよび／またはvHドメインのN末端またはN末端近傍に作動可能に連結されたAABD」という用語は、vLまたはvHフラグメントのN末端に作動可能に連結されたAABD、またはvLまたはvHドメインを構成するN末端2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、25または30アミノ酸に作動可能に連結されたAABDを意味する。同様に、「Vaおよび/またはVbドメインのN末端またはN末端近傍に作動可能に連結されたAABD」という用語は、VaまたはVbフラグメントのN末端に作動可能に連結されたAABD、またはVaまたはVbドメインを構成するN末端2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25または30アミノ酸に作動可能に連結されたAABDを意味する。本開示のＡＡＢＤは、直接または介在リンカー配列を介して、別のドメインのＮ末端またはその近くに機能可能に連結され得る。
本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー細胞受容体」または「ＮＫ受容体」は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において発現される細胞表面受容体を指し、他の哺乳動物種からの機能的変異体、アイソフォームおよび相同体を含む。 NK受容体は、活性化受容体であっても抑制性受容体であってもよい。例示的な活性化ＮＫ受容体には、 ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＤおよびＫＩＲ３ＤＳ４が含まれる。例示的な阻害性NK受容体には、CD94-NKG2A、TIGITおよびCD96が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー細胞」（「ＮＫ細胞」）は、免疫系の細胞傷害性リンパ球の一種を指す。
本明細書で使用される場合、「ＮＫｐ３０」または「ＮＣＲ３」は、腫瘍細胞の溶解においてＮＫ細胞を助ける可能性がある天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）であるタンパク質をコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ：２５９１９７）である。この用語には、他の哺乳動物種の機能的変異体、アイソフォーム、ホモログが含まれます。
本明細書で使用される場合、「ＮＫｐ４４」または「ＮＣＲ２」は、天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）であるタンパク質をコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ：９４３６）である。この用語には、他の哺乳動物種の機能的変異体、アイソフォーム、ホモログが含まれます。
本明細書で使用される場合、「ＮＫｐ４６」または「ＮＣＲ１」は、天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）であるタンパク質をコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ：９４３７）である。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコードする 5 つの転写バリアントが発見されています。この用語には、他の哺乳動物種の機能的変異体、アイソフォーム、ホモログが含まれます。
本明細書で使用される場合、 「NKG2D」または「 KLRK1 」は、C型レクチンのメンバーであるタンパク質をコードする遺伝子(遺伝子ID:22914)である。コードされた膜貫通タンパク質は、II 型膜配向 (細胞外 C 末端を持つ) と C 型レクチン ドメインの存在によって特徴付けられます。この用語には、他の哺乳動物種の機能的変異体、アイソフォーム、ホモログが含まれます。
本明細書で使用される場合、「非天然作用物質」または「非天然」または「外因性」とは、細胞内で自然に発現されない作用物質を指す。別の言い方をすると、非天然物質は細胞内で発現するように「操作」されています。非天然物質は、天然物質のクローン版であってもよい。例示的な非天然物質としては、ＳＡＲ（例えば、ＣＡＲ、ＳＩＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰ、組換えＴＣＲ）が挙げられる。非天然物質は、レンチウイルスまたはレトロウイルス媒介遺伝子導入などの当技術分野で公知の遺伝子導入技術を使用して細胞内に発現させることができる。非天然物質は、外因性プロモーター（例えば、 EF1αプロモーター）または内因性プロモーター（例えば、 TCRαまたはTRACプロモーター）を使用して免疫細胞内で発現され得る。内因性遺伝子 (例、 CD16、NKp30など) がクローン化され、細胞内で異所的に発現される場合、それは非天然物質の別の例となります。
本明細書で使用される場合、「非天然免疫受容体」または「外因性免疫受容体」 「非天然受容体」は、免疫細胞において自然には発現されない免疫受容体を指す。別の言い方をすると、天然に存在しない免疫受容体は、免疫細胞内で発現するように「操作」されています。非天然免疫受容体は、天然免疫受容体のクローン化バージョンであり得る。あるいは、天然に存在しない免疫受容体は、組換え分子生物学技術を使用して生成されるキメラ受容体であってもよい。例示的な非天然免疫受容体は、ＳＡＲ（例えば、第２世代ＣＡＲ、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、ＳＴＡＲ、ｚＳＩＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰ、および組換えＴＣＲ）である。
本明細書で使用される場合、「非天然ＴＣＲ抗原結合ドメイン」または「外因性ＴＣＲ抗原結合ドメイン」は、天然に存在するＴＣＲに関してキメラで非天然であるＴＣＲ定常領域に作動可能に連結された結合ドメインを指す。 別の言い方をすれば、自然界に存在しないTCR抗原結合ドメインは、組換え分子生物学的技術を用いて、TCRと作動可能に結合するように "操作 "され、さらに抗原結合ドメインは、自然界に存在するTCRとは異なる分子から得られるか、またはその分子に由来する。本質的にTCRとは異なる抗原結合ドメインには、抗体vHおよびvLフラグメント、ヒト化抗体フラグメント、キメラ抗体フラグメント、受容体リガンドなどが含まれる。
本明細書で使用される場合、「非天然抗原結合ドメイン」または「非天然細胞外抗原結合ドメイン」または「異種抗原結合ドメイン」は、天然受容体の一部ではない抗原結合ドメインを指す。別の言い方をすれば、天然に存在しない抗原結合ドメインは、天然に存在するシグナル伝達レセプターと作動可能に連結するように、組換え分子生物学的技術を用いて「操作」され、さらに抗原結合ドメインは、天然に存在するシグナル伝達レセプターとは異なる分子から得られるか、またはそれに由来する。例示的な異種抗原結合ドメインには、抗体、抗体断片（例えば、vL、vH、scFv、Fab、F(ab)2など）、単一ドメイン抗体（例えば、sVH、FHVH、vHHなど）、非免疫グロブリン抗原結合が含まれる。ドメイン、単一可変ドメイン -TCR (svd-TCR)、組換え TCR、HLA 非依存性 TCR、scTCR、エピトープ、アダプター、リガンド、および受容体。
「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、各成分が機能的であり得るように、第１の成分と第２の成分との間の機能的連結または結合を指す。例えば、作動可能に連結されることには、後者の発現をもたらす、調節配列と異種核酸配列との間の結合が含まれる。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。作動可能に連結された２つのポリペプチドに関して、第１のポリペプチドはいかなる連結からも独立して機能し、第２のポリペプチドは２つの間の連結が存在しない場合のように機能する。本開示のＳＡＲの異なるドメインとの関連で使用される「機能的に連結された」という用語は、共有結合（例えば、ペプチド結合または非ペプチド化学結合）を介して連結されたドメインを指す。例示的な実施形態において、CD16Aの細胞外ドメインのN末端に操作可能に連結された異種抗原結合ドメイン（例えば、CD19 scFv）を含むSARは、CD16Aの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする核酸配列にフレーム内で融合したCD19 scFvからなる核酸配列によってコードされるSARポリペプチドを指す。一実施形態では、ＳＡＲポリペプチドの異なるドメイン間の機能的な結合は、ペプチド結合を介して達成される。しかしながら、特定の実施形態では、ＳＡＲの異なるドメインは、非ペプチド結合、例えば、ジスルフィド結合を介して、または化学的結合などを介して連結され得る。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「パーセント同一性」は、同じである２つ以上の配列を指す。 2つの配列が「実質的に同一」であるとは、2つの配列を比較し、比較ウィンドウまたは以下の配列比較アルゴリズムの1つを使用して、または手動アライメントと目視検査によって測定された指定領域にわたって最大対応するようにアライメントしたときに、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが特定の割合を有する（例えば、60％の同一性、任意で70％、71％。72%. 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の同一性が、指定された領域にわたって、あるいは指定されない場合は配列全体にわたって認められる）場合をいう。場合により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長の領域にわたって存在し、より典型的には、１００～５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）の領域にわたって存在する。酸）の長さ。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために使用できるアルゴリズムの 2 つの例は、BLAST および BLAST 2.0 アルゴリズムです。これらは、Altschul et al. に記載されています。 、（1977）Nuc。酸の解像度。 25:3389-3402;およびAltschulら。 、（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ ．バイオル。 215:403-410、それぞれ。 BLAST 分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能です。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ、（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．応用生物科学。 4:11-17)、これは、PAM120 重み剰余テーブル、ギャップ長ペナルティ 12 およびギャップ ペナルティ 4 を使用して、ALIGN プログラム (バージョン 2.0) に組み込まれています。
標的抗原の非限定的な例を表Bに列挙する。本開示のSARは、表Bに列挙する1つまたは複数(例えば、2、3、4、5またはそれ以上)の標的抗原に直接または本明細書に記載のSARアダプターを介して結合し得る。 。
いくつかの実施形態において、本開示のSARは、疾患関連抗原由来のペプチド(例えば、腫瘍関連抗原またはウイルスコード抗原;例えば、NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A4、WT1、変異体Ras、HPV16-E7、EBV-LMP2A、AFP、gp100、PSA、変異体p53、HIV-1などに由来するペプチド)とMHCクラスIタンパク質とを含む複合体に特異的に結合する1つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、vL、vH、Va、Vb、Vg、Vd、Fv、TCR-Fv、svd-TCR、scTCRなど）を含み、ここで、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、またはHLA-Gである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質はＨＬＡ－Ａである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質はＨＬＡ－Ｂである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質はＨＬＡ－Ｃである。いくつかの実施形態では、MHCクラスIタンパク質はHLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A09、HLA-A 10、HLA-A11、HLA-A 19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A 19、HLA-A24です。 A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、 HLA-A69、 HLA-A74、または HLA-A80。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質はＨＬＡ－Ａ０２である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡなどのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１～５５５のいずれか１つである。 -A*02:04、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:08、HLA-A*02:09、HLA-A *02: 10、HLA-A*02: 11、HLA-A*02: 12、HLA-A*02: 13、HLA-A*02: 14、HLA-A*02: 15、HLA-A*02 ：16、HLA-A*02：17、HLA-A*02：18、HLA-A*02：19、HLA-A*02:20、HLA-A*02:21、HLA-A*02:22 、または HLA-A*02:24。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質はＨＬＡ－Ａ ＊ ０２：０１である。 ＨＬＡ－Ａ ＊ ０２：０１は、白人全体の３９～４６％で発現されており、したがって、本開示で使用するためのＭＨＣクラスＩタンパク質の適切な選択を表す。
いくつかの実施形態において、本開示のSARは、疾患関連抗原由来のペプチド（例えば、腫瘍関連またはウイルスコード抗原、例えば、NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A4、WT1、変異体Ras、HPV16-E7、EBV-LMP2A、AFP、gp100、PSA、変異体p53、HIV-1などに由来するペプチド）とMHCクラスIIタンパク質とを含む複合体に特異的に結合する1つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、vL、vH、Va、Vb、Vg、Vd、Fv、TCR-Fv、svd-TCR、scTCRなど）を含み、ここで、MHCクラスIIタンパク質は、HLA-DP、HLA-DQ、またはHLA-DRである。
本開示のＳＡＲは、疾患関連抗原由来のペプチドと、他の種（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、サルなど）由来のＭＨＣクラスＩタンパク質またはクラスＩＩタンパク質とを含む複合体にも結合することができる。 )
本明細書で使用される「受容体」という用語は、1つまたは複数のリガンドに選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその一部を指す。
本明細書で使用される場合、用語「領域」または「部分」は、核酸分子に関して使用される場合、本明細書に記載されるCD3ζシグナル伝達領域などの、分子の全長より短い連結されたヌクレオチドのセットを指す。
「レトロウイルスベクター」という用語は、レトロウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。レトロウイルスベクターの例には、AddgeneまたはClontechから入手可能なMSCVneo、MSCV-pac（またはMSCV-puro）、MSCV-hygroが含まれる。
本明細書で使用される「SAR」又は「合成抗原受容体」という用語は、従来のCARを含み、また、以下のような細胞に抗原特異性を付与する新しいアプローチも包含する；抗体-TCRキメラ分子又はAb-TCR（参照により本明細書に組み込まれるWO 2017/070608 A1）、TCR受容体融合タンパク質またはTFP（参照により本明細書に組み込まれるWO 2016/187349 A1）、合成免疫受容体（SIR）（参照により本明細書に組み込まれるWO 2018/102795 A1）、STAR（WO2020／029774参照）、HLA非依存性TCR（WO2019157454A1参照）、三機能性T細胞抗原カプラー（Tri-TAC又はTAC）（参照により本明細書に組み込まれるWO2015／117229 A1）及びzSIR（参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2019/035096）。二重特異性および多重特異性 CAR は、PCT/US2021/022641 に記載されている。 「ＳＡＲ」という用語は、ＣＡＲおよび他の抗原結合受容体（組換えＴＣＲを含むがこれに限定されない）を包含する。
通常、「SAR-T」という用語は、合成抗原受容体を発現するように操作された T 細胞を指すために使用されます。したがって、そのようなSARを有するTリンパ球は、一般にSAR-Tリンパ球と呼ばれます。 SAR は、造血幹細胞、人工多能性幹細胞 (iPSC)、NK 細胞、マクロファージなどの T 細胞以外の細胞でも発現する可能性があります。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩまたはその誘導体などの不死化細胞株で発現される。 「SAR-NK」という用語は、SARを発現するように操作されたNK細胞を指す。
合成抗原受容体を発現するように操作されたT細胞(例えば、αβ T細胞、γδ T細胞、Treg、TILなど)を指すために使用される。したがって、そのようなSARを有するTリンパ球は、一般にSAR-Tリンパ球と呼ばれます。 SAR は、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞 (iPSC)、NK 細胞、NKT 細胞、単球、マクロファージ、B 細胞、顆粒球、樹状細胞、サイトカインなどの T 細胞以外の細胞でも発現する可能性があります。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩまたはその誘導体などの不死化細胞株で発現される。 「SAR-NK」という用語は、SARを発現するように操作されたNK（ナチュラルキラー）細胞を指します。
「眠れる森の美女トランスポゾン」または「眠れる森の美女トランスポゾンベクター」という用語は、眠れる森の美女トランスポゾンゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。
「ＴＣＲ定常鎖」または「Ｔ細胞受容体の定常領域」という用語は、ＴＣＲα／ＴＣＲａ、ＴＣＲβ１／ＴＣＲｂ１、ＴＣＲβ２／ＴＣＲｂ２、ＴＣＲγ／ＴＣＲｄ、ＴＣＲδ／ＴＣＲｄおよびプレＴＣＲαの定常鎖として定義される。例示的なＴＣＲ定常鎖を表１２に列挙する。 ＴＣＲ定常鎖は、Ｉｇ様Ｃ１ドメイン（例えば、配列番号１１６８～１１７５；表１３）、連結ペプチド（例えば、配列番号１１７７～１１８４；表１３ ）などのいくつかのサブドメインに分割することができる。 １４）、膜貫通ドメイン（配列番号１１８７～１１９０ ；表１５）、およびサイトゾルドメイン（例えば、配列番号１１９３～１１９６ ；表１６） 。 TCRα、TCRβ1/β2、TCRγ、およびTCRδ鎖のサイトゾルドメインは短く、一般にそれらのシグナル伝達活性において重要な役割を果たしているとは考えられていません。本開示は、ＴＣＲ鎖の例示的な欠失変異体および変異体も提供する（表１２） 。これらの欠失変異体やバリアントは、相補的なTCR鎖と対合する能力、TCR/CD3複合体と会合する能力、標的抗原発現細胞と係合した際にT細胞シグナルを伝達する能力（例えば、NFAT経路を活性化する）など、元のTCR鎖の機能的・生物学的特性の1つ以上を保持している限り、SARの構築に使用することができる。
「単鎖可変領域」または「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域からなる少なくとも1つの抗体フラグメントと重鎖の可変領域からなる少なくとも1つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を指し、ここで軽鎖および重鎖の可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、また単鎖ポリペプチドとして発現可能であり、そして scFvは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持する。特に指定しない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、いずれの順序でｖＬおよびｖＨ可変領域を有してもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ｖＬ－リンカー－ｖＨを含んでもよく、またはｖＬ－リンカー－ｖＨを含んでもよい。 vH-リンカー-vL。本開示では、ｓｃＦｖは、ｖＬ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｉｎｋｅｒ－ｖＨとも記載される。あるいは、scFvは(vL+vH)または(vH+vL)とも記載されます。
。本明細書において、「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、標的と抗体または抗体部分との間の結合のような、測定可能で再現可能な相互作用を指し、生物学的分子を含む異種の分子集団の存在下で標的の存在を決定する。いくつかの実施形態では、抗原に特異的に結合するSARまたは抗原結合ドメインは、他の標的に対する結合親和性の少なくとも約10倍である結合親和性で、抗原の1つ以上の抗原決定基（例えば、細胞表面抗原またはペプチド／MHCタンパク質複合体）と反応する。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、セカンドメッセンジャーを生成するか、そのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能することによって、規定のシグナル伝達経路を介して細胞内に情報を伝達し、細胞活動を調節するタンパク質の機能領域を指す。
「シグナル伝達モジュール」という用語は、細胞シグナルを開始することができる、1つまたは複数のシグナル伝達メディエーターまたはシグナル伝達アダプターを含む分子または分子複合体を指します。細胞シグナルには、NFAT、NFATなどの細胞シグナル伝達経路の活性化が含まれますが、これらに限定されません。 AKT、STAT、またはNF-κB経路 例示的な実施形態では、シグナル伝達モジュールは、シグナル伝達複合体の一部である細胞質免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を有する1つまたは複数のタンパク質を動員する。例示的に、NK細胞において機能するシグナル伝達モジュールには、CD3ζ、FcRγ、DAP10およびDAP12などのシグナル伝達アダプターが含まれる。
「シグナル伝達メディエーター」または「シグナル伝達アダプター」という用語は、天然または非天然シグナル伝達受容体によって動員されたときに細胞シグナルを開始または阻害することができる分子を指す。シグナル伝達受容体とは対照的に、シグナル伝達アダプターにはそれ自体の抗原結合ドメインまたはリガンド結合ドメインがありません。シグナル伝達アダプターの例としては、CD3ζ (CD3z)、FcRγ、DAP10、DAP12、CD3ε、CD3γ、およびCD3δが挙げられる。一実施形態において、本開示は、１つ以上の異種抗原結合ドメインが、シグナル伝達アダプターの１つ以上の鎖のヒンジドメインまたは膜貫通ドメインに機能的に連結されているＳＡＲを提供する。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体の構成要素であるシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３εなど）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体のＴＣＲα鎖、β鎖、γ鎖、および／またはδ鎖と相互作用するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体のＴＣＲα、β、γおよび／またはδ鎖と相互作用しないシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、 ＴＣＲα／β膜貫通領域内の正に荷電した残基と相互作用する、その膜貫通ドメイン内に保存されたアスパラギン酸残基を有するシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、その膜貫通ドメインに保存されたアスパラギン酸残基を欠くシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体の構成要素ではないシグナル伝達アダプター（例えば、ＤＡＰ１０）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、細胞シグナル伝達を活性化するシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、細胞シグナル伝達を阻害するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフを有するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、２つ以上のＩＴＡＭモチーフを有するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、単一のＩＴＡＭモチーフを有するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＩＴＡＭモチーフを欠くシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、天然型のジスルフィドリンカー二量体であるシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、その天然の形態ではジスルフィドリンカー二量体ではない。一実施形態では、ＳＡＲは、天然状態では膜貫通領域に位置する鎖間ジスルフィド結合を含むシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、膜貫通領域に位置しない鎖間ジスルフィド結合を含む天然状態のシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、天然状態ではその細胞外領域に位置する鎖間ジスルフィド結合を含むシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、長さが１０アミノ酸未満である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、長さが８アミノ酸未満である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、長さが１０アミノ酸を超える。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、１５アミノ酸を超える長さである。一実施形態では、ＳＡＲは、タンパク質のリン酸化を誘導するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、タンパク質の脱リン酸化を誘導するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｚａｐ７０と相互作用するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｚａｐ７０と相互作用しないシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つの鎖は、同一のシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζおよびＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つの鎖は、同一ではないシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３εとＦｃＲγ、またはＣＤ３εとＤＡＰ１０など）を含む。
「シグナル伝達鎖」または「シグナル伝達断片」という用語は、細胞シグナル伝達受容体の膜貫通および／または細胞内領域、および場合により細胞外ヒンジ／接続ペプチド領域を含むポリペプチドを指す。例示的なシグナル伝達鎖には、TCRα、TCRβ、TCRγおよびTCRδの定常鎖が含まれる。さらなる例示的なシグナル伝達鎖には、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12、DNAM-1、NKG2D、CD32、CD64、KIR3DL1、KIR2DS4、FcRγおよびCD3zの膜貫通領域および／または細胞内領域からなる鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達鎖は、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＦｃＲγおよびＣＤ３ｚのヒンジドメインまたは接続ペプチドも含む。
「合成抗原受容体」または「SAR」という用語は、細胞の表面上で発現することができ、少なくとも1つの異種抗原結合ドメインおよび少なくとも1つの膜関連ドメインを含む、天然に存在しない受容体または合成受容体を指し、ここで、膜関連ドメインは膜貫通ドメインまたは膜アンカードメイン（すなわち、GPI結合ドメイン）であり得る。 ＳＡＲの抗原結合ドメインは、その膜関連ドメインに対して異種である、すなわち、抗原結合ドメインは膜関連ドメインとは異なる供給源に由来する。 ＳＡＲは、ヒンジドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン、および／またはサイトゾルドメインをさらに含み得る。一実施形態では、ＳＡＲは、エフェクター細胞内で発現されると、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性、および細胞内シグナル生成を細胞に提供するポリペプチドまたはポリペプチドのセットを含む。 SAR は、単一チェーン、2 チェーン、または 3 つ以上のチェーンにすることができます。 SAR は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性の場合があります。 SARは、1つまたは複数の異種抗原結合ドメインを有し得る。 「ＳＡＲ」という用語には、従来のキメラ抗原受容体（例えば、第２世代ＣＡＲ）および次世代ＣＡＲ（例えば、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、ＡｂＴＣＲ、ｚＳＩＲ、ＨＩＴ、ＴＦＰ、ＴＡＣなど）が含まれる。本開示は、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4 KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、 CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、 CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、Siglec3、Siglec-7、Siglec-9、CD3ζ、DAP10、DAP12、FcRγ、TCRαβおよびTCRγδなどに由来する1つ以上の領域、ならびにその変異体および断片を含む新規SAR組成物を記載する。本開示はまた、他の種からの選択的スプライシングされたアイソフォームおよびホモログを含む、上記の遺伝子および／またはタンパク質の機能的変異体を含むＳＡＲを提供する。本開示のＳＡＲの構築に使用できる上記遺伝子およびタンパク質の例示的な領域または断片は、仮出願の表１２～１８および表２５～３１に提供される。天然受容体の例示的な細胞外ドメインは、配列番号１０８４２～１０８７７に提供される。 本開示のSARはまた、仮出願の表12-18および25-31に提供されたフラグメントのいずれかと70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％の相同性を有するポリペプチドまたはフラグメントを用いて構築することもできる。ＳＡＲの構築に使用できる例示的な追加成分（例えば、ｖＬ、ｖＨ、ｓｃＦｖ、ｖＨＨなど）の核酸配列およびアミノ酸配列を表２～１１に提供する。本開示のSARはまた、仮出願の表2-18および25-31に提供されたフラグメントのいずれかと70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％の相同性を有するポリペプチドまたはフラグメントを用いて構築することもできる。本開示の例示的なＳＡＲは、仮出願の表３２～３４に提供される。 SAR はモジュール設計であり、SAR の 1 つのモジュールを別のモジュールと交換することで追加の SAR を構築できます。これらの新規なＳＡＲの発現および活性は、最適な機能活性を有するＳＡＲを選択するために、本開示に記載される方法を使用して試験することができる。
「単鎖合成抗原受容体」または「単鎖SAR」という用語は、単一のポリペプチド鎖を含む合成抗原受容体を意味する。 ＣＤ１９を標的とし、ＣＤ１６シグナル伝達鎖に基づく例示的な単鎖ＳＡＲは、ＣＤ８ＳＰ－ＣＤ１９－ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１－（ｖＬ－ｖＨ）－ＣＤ１６Ａ－Ｆ１５８Ｖ－Ｓ１９７Ｐ－ＦＬ－ｖ３（配列番号４９５４）である。この SAR では、CD19 を標的とするヒト化 scFv (hu-mROO5-1) が、F158V および S197P 変異を保有する CD16 の高親和性非切断性変異体 (CD16A-F158V-S197P-FL) の細胞外、膜貫通、およびサイトゾルドメインに機能的に連結されています。 -v3)。異なる抗原結合ドメインがCD16A-F158V-S197P-FL-v3モジュールに機能的に連結されている追加の例示的な単鎖SARは、仮出願の表36～39に提供される。さらなる例示的な単鎖ＳＡＲは、配列番号５４６３～５４８２に提供される。 SAR はモジュール設計であるため、CD16A-F158V-S197P-FL-v3 モジュール (配列番号 (DNA): 1417 および配列番号 (PRT): 3811) は、NKp30-ECDTMCP- などの他のモジュールで置き換えることができます。 opt2 (配列番号1375)、NKp44-ECDTMCP-opt2 (配列番号1389)、NKp46-ECDTMCP-opt2 (配列番号1405)、CD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-2 (配列番号1389)配列番号１４３４）、ＣＤ３２－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２（配列番号１５８２）、ＣＤ６４－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２（配列番号１５８４）、２Ｂ４－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２（配列番号１５８０）、ＯＸ４０－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２ （配列番号１５７８）、ＣＤ２８－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２（配列番号１５７６）、４１ＢＢ－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２（配列番号１５７４）、ＫＩＲ３ＤＬ１（配列番号９６４４）およびＫＩＲ２ＤＳ４（配列番号９６５３） )などを使用して、異なるシグナル伝達チェーンを持つ単一チェーン SAR を生成します。 ＳＡＲの構築に使用することができる、天然に存在する受容体に由来する例示的なモジュールは、配列番号９６３５～９６６８に提供される。このようなＳＡＲの例は、配列番号９８６０～９８９５および仮出願の表４１に提供されている。これらの新規なＳＡＲの発現および活性は、最適な機能活性を有するＳＡＲを選択するために、本開示に記載される方法を使用して試験することができる。
「合成免疫受容体」または代替的に「ＳＩＲ」という用語は、エフェクター細胞内で発現されると、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性を細胞に提供する、ポリペプチドのセット、いくつかの実施形態では典型的には２つを指す。細胞内シグナル生成を伴う。 ＳＩＲは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１０２７９５Ａ１に記載されている次世代ＣＡＲプラットフォームを表す。典型的な実施形態では、ＳＩＲは、本明細書に記載の抗原に結合する１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント、リガンドまたは受容体）を含み、１つ以上のＴ細胞受容体定常鎖または領域に結合する。オプションのリンカー経由。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは互いに隣接している。いくつかの実施形態では、ＳＩＲは、２つ以上のポリペプチドの２つ以上のセットを含む。 ＳＩＲの各セットのポリペプチドは互いに隣接しているが（機能性ポリペプチドユニット１）、他のセットのポリペプチド（機能性ポリペプチドユニット２）とは隣接していない。いくつかの実施形態では、ＳＩＲのＴ細胞受容体定常鎖（または領域）は、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲアルファまたはＴＣＲαまたはＴＣＲａまたはｈＴＣＲアルファまたはｈＴＣＲαまたはｈＴＣＲａまたはＣα）の定常鎖から選択され、ヒトT細胞受容体-β1(TCR-β1またはTCRβ1またはTCRb1またはhTCR-β1またはhTCRβ1またはhTCRb1またはCβ1)、ヒトT細胞受容体-β2(TCR-β2またはTCRβ2またはTCRb2またはhTCR-β2またはhTCRβ2またはhTCRb2またはCβ2は、TCR-ベータ、TCRβ、TCRb、またはCβとも呼ばれます）、ヒトプレT細胞受容体アルファ（（プレTCRアルファまたはプレTCRαまたはプレTCRaまたはプレCα）、ヒトT細胞受容体ガンマ（TCR-ガンマまたはTCRγまたはTCRgまたはhTCR） －ガンマまたはｈＴＣＲγまたはｈＴＣＲｇまたはｈＴＣＲγ１またはｈＴＣＲガンマ１、またはＣγ）、またはヒトＴ細胞受容体－デルタ（ＴＣＲ－デルタまたはＴＣＲｄまたはＴＣＲδまたはｈＴＣＲ－デルタまたはｈＴＣＲｄまたはｈＴＣＲδまたはＣδ）。いくつかの実施形態では、ＳＩＲのＴＣＲ定常鎖は、それらの野生型ヌクレオチド配列によってコードされるが、他の態様では、ＳＩＲのＴＣＲ定常鎖は、野生型ではないヌクレオチド配列によってコードされる。シーケンス。いくつかの実施形態では、ＳＩＲのＴＣＲ定常鎖は野生型ポリペプチド配列をコードするが、他の実施形態では、ＳＩＲのＴＣＲ定常鎖は、１つまたは複数の変異を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＳＩＲのＴＣＲ定常鎖は、１つ以上の突然変異を有するそれらのコドン最適化配列によってコードされる。本開示はまた、対応する全長ＴＣＲ鎖の生物学的特性および機能的特性の少なくとも１つを保持するＴＣＲ定常鎖の欠失変異体もカバーする。本明細書に記載のものなど、特定の腫瘍メーカー「X」を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、 scFvまたはvHH)を含むSIRは、X-SIRまたはXSIRとも呼ばれる。例えば、CD19を標的とする抗原結合ドメインを含むSIRは、CD19-SIRまたはCD19SIRと呼ばれる。 SIR の TCR 定常鎖/ドメインは、SIR が最終的に使用される同じ種に由来する可能性があります。例えば、ヒトで使用する場合、SIRのTCR定常鎖がヒトTCR定常鎖に由来するか、またはヒトTCR定常鎖から構成されることが有益であり得る。しかしながら、場合によっては、TCR定常鎖は、SIRが最終的に使用される同じ種に由来するが、TCR定常鎖の発現を増強するアミノ酸置換を行うように修飾されていることが有益である。例えば、ヒトで使用する場合、SIRのTCR定常鎖がヒトTCR定常鎖に由来するか、またはヒトTCR定常鎖から構成されるが、特定のアミノ酸がマウスTCR定常鎖の対応するアミノ酸で置換されることが有益である可能性がある。 。このようなマウス化されたTCR定常鎖は、SIRの発現の増加をもたらす。 ＳＩＲまたはその機能的部分は、アミノ末端またはカルボキシ末端、または両方の末端に追加のアミノ酸を含むことができ、これらの追加のアミノ酸は、ＳＩＲを構成するＴＣＲまたは抗原結合ドメインのアミノ酸配列には見出されない。望ましくは、追加のアミノ酸は、SIRまたは機能部分の生物学的機能、例えば、標的細胞の認識、癌の検出、癌の治療または予防などを妨げない。追加のアミノ酸は、生物活性を増強することがさらに望ましい。親 SIR の生物学的活性に影響します。
本明細書で使用されるSVHドメインという用語は、単一のヒトV Hドメイン抗体(V H sdAb)を指す。したがって、これらの用語は同じ意味で使用されます。 SVH という用語は、独立した vH ドメインと同じ意味で使用されます。 SVH は自律抗原結合ドメイン (AABD) の一例です。例示的なSVHは、配列番号(DNA):827～828および配列番号(PRT):3221～3222に示される完全ヒトvHドメイン(FHVH)である。別の例示的なSVHは、配列番号(DNA):830～831および配列番号(PRT):8223～8224に示されるchVHドメインである。別の例示的なSVHは、配列番号(DNA):850～851および配列番号(PRT):3244～3245に示されるaVHドメインである。他の例示的なSVHドメインの配列番号を表5に示す。本開示のSARの構築に使用できる追加のSVHドメインは、WO2016062988、WO2016113556、WO2017191476、WO2018039180、WO2019006072、WO2018237037、WO2018に提供される。 119215、WO2019126756、国際公開第２０１９０５５６８９号および国際公開第２０２００１８９２２号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、 ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンド（または標的抗原）との結合によって誘導され、それによって例えば限定されないが、シグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。 、TCR/CD3を介したシグナル伝達。刺激は、特定の分子の発現の変化を媒介する可能性があります。
「「刺激性分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一 部に対して、免疫細胞の活性化を刺激的に制御する細胞質シグナル 配列を提供する免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、B細胞）により発現される分子を指す。ある態様では、シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体とペプチドを負荷したMHC分子との結合によって開始される一次シグナルであり、 増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないT細胞応答の媒介につながる一次シグナルである。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含む場合がある。細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例としては、CD3ゼータ、FcRγ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10、およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、任意の家畜化された哺乳動物またはヒト）を含むことを意図する。 「対象」または「個体」または「動物」または「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、本開示の組成物または医薬組成物の投与が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ウシなどが含まれ、ヒトが好ましい。
本明細書で使用される「スイッチドメイン」または「二量体化ドメイン」は、典型的には、二量体化分子の存在下で別のスイッチドメインと会合するポリペプチドベースの実体を指す。
「自殺遺伝子」、「自殺スイッチ」、または「キルスイッチ」は、細胞死に導く誘導能力を持つタンパク質をコードします。自殺遺伝子の例としては、HSV-TK、iCaspase 9、tEGFR、CD20、tCD19、tHer2、tBCMA、RQR8などが挙げられる。例えば、CD20発現細胞は、抗体リツキシマブによる処理によって選択的に除去することができる。同様に、tBCMA発現細胞はベランタマブマフォドチンによる処理によって選択的に除去でき、tHer2発現細胞はハーセプチンによる処理によって選択的に除去できます。
「生存遺伝子」、「生存スイッチ」、または「生命スイッチ」は、細胞に生存促進シグナルを提供するタンパク質をコードします。例示的な生存遺伝子には、膜アンカー型のIL2および膜アンカー型のIL15が含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３（ＣＤ３＋）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ＋）を発現する細胞を指す。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３およびＴＣＲを発現する天然の細胞（すなわち、組換えまたは操作された細胞ではない）である。
本明細書で使用される場合、「TCR」または「T細胞受容体」という用語は、典型的にはMHC分子によって提示される抗原の認識（すなわち、抗原認識）に関与するアルファ-ベータまたはガンマ-デルタ受容体を形成する二量体の異種細胞表面シグナル伝達タンパク質を指す。 MHC 分子の文脈では)。本開示のＴＣＲは、天然に存在しないもの、および／または精製されたもの、および／または操作されたものであってもよい。本開示のＴＣＲは、親ＴＣＲと比較して、α鎖可変ドメインおよび／またはβ鎖可変ドメインに存在する複数の変異を有し得る。 「改変されたＴＣＲ」および「変異体ＴＣＲ」は、本明細書では同義的に使用され、一般に、親ＴＣＲと比較して、特にそのＶａおよび／またはＶｂまたはＶｇおよび／またはＶｄドメインにおいて導入された１つまたは複数の変異を有するＴＣＲを意味する。操作された TCR は、HLA 依存性または HLA 非依存性の様式で抗原に結合する可能性があります。
本明細書で使用する「導入遺伝子」という用語は、生物（例えば、非ヒト動物）のゲノムに組み込まれ、有性生殖中に生物の子孫に伝達される異種遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３（ＣＤ３＋）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ＋）を発現する細胞を指す。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３およびＴＣＲを天然に発現する天然細胞（すなわち、 ＣＤ３またはＴＣＲを発現するように操作されていない細胞）である。 「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では交換可能であり、同義的に使用される。例には、ナイーブ T 細胞 (「リンパ球前駆細胞」)、セントラル メモリー T 細胞、エフェクター メモリー T 細胞、幹メモリー T 細胞 (T scm )、iPSC 由来 T 細胞、合成 T 細胞、腫瘍浸潤 T 細胞が含まれますが、これらに限定されません。 (TIL)、αβ T細胞、γδ T細胞、制御性T細胞(Treg)、またはそれらの組み合わせ。
「非Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞ではない細胞を指す。一実施形態では、非Ｔ細胞は、ＣＤ３およびＴ細胞受容体の細胞表面発現を欠いている。一実施形態では、非Ｔ細胞は、ＯＫＴ３などのＴ細胞活性化抗体に応答しない。一実施形態では、非Ｔ細胞はＣＤ３の表面発現を欠いている。一実施形態では、非Ｔ細胞は、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、およびＣＤ３δの群から選択される１つまたは複数のＣＤ３鎖の発現を欠いている。一実施形態では、非Ｔ細胞は、ＴＣＲ遺伝子の生殖系列構成を示し、Ｔ細胞遺伝子再構成を受けていない。一実施形態では、非Ｔ細胞は、機能的なＴ細胞／ＣＤ３受容体複合体を形成する能力を欠いている。非Ｔ細胞の例としては、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、および上皮細胞が挙げられる。非 T 細胞は不死化細胞株であってもよい。例示的な実施形態では、非Ｔ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩ、ＮＫＧおよびＹＴＳなどである。一実施形態では、非Ｔ細胞は、ＣＤ３およびＴ細胞受容体の発現を欠くｉＰＳＣ由来細胞である。
「Ｔ細胞受容体モジュール」または「ＴＣＲＭ」という用語は、Ｔ細胞受容体に由来する配列を含むヘテロ二量体を指す。 ＴＣＲＭは、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメインを含み、さらに、Ｔ細胞受容体接続ペプチドおよび／または細胞内ドメインのすべてまたは一部を含み得る。
本明細書で使用される「TCR-Fv」または「断片可変TCR」の「Fv-TCR」という用語は、TCR鎖の可変ドメインによって形成される抗原結合モジュールを指す。 TCR-Fvは、VαおよびVβドメイン、またはVγおよびVδドメインによって形成され得る。 ＴＣＲ－Ｆｖは、可変ドメインが由来するＴＣＲの標的抗原（例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体）に対して一部またはすべての特異的結合親和性を示す。一実施形態では、本開示のＳＡＲは、ＴＣＲ由来のＶα／Ｖβ鎖またはＶγ／Ｖδ鎖がその２つのポリペプチドに結合する場合に、ＴＣＲ－Ｆｖ抗原結合モジュールを形成する能力を実証する。
本明細書で使用される「Fv」または「フラグメント可変」という用語は、抗体の可変ドメインによって形成される抗原結合モジュールを指す。 Fv は、vL ドメインと vH ドメインによって形成されます。 Fvは、可変ドメインが由来する抗体の標的抗原に対する特異的結合親和性の一部またはすべてを示します。一実施形態では、本開示のＳＡＲは、抗体に由来するｖＬ鎖およびｖＨ鎖がその２つのポリペプチドに結合する場合に、Ｆｖ抗原結合モジュールを形成する能力を実証する。
本明細書で使用する「膜貫通タンパク質」または「膜タンパク質」は、生体膜（例えば、細胞膜などの生体膜）のリン脂質二重層などの膜上および／または膜内に位置するタンパク質である。一部のタンパク質は膜表面にのみ結合していますが、他のタンパク質は膜内に埋め込まれた 1 つ以上の領域および/または膜の片側または両側のドメインを持っています。膜貫通タンパク質の具体例としては、CD8a、CD4、CD3ζ、CD16、NKp30、NKp44、NKG2Dなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「膜貫通モジュール」または「ＴＭＭ」は、膜貫通タンパク質（例えば、ＣＤ１６Ａ）を含む分子または分子複合体を指す。
例えば、CD16A)または膜アンカータンパク質(例えば、CD16B)を含む分子または分子複合体を指す。この用語には、CD16A などの膜貫通タンパク質、および CD16B などの GPI (グリコシルホスファチジルイノシトール) 結合タンパク質が含まれます。 ＭＡＭは、ヒンジドメインおよび／またはサイトゾルドメインのすべてまたは一部をさらに含み得る。
本明細書で使用される「治療薬」とは、例えば、疾患を治療、阻害、予防し、その影響を軽減し、重症度を軽減し、発症の可能性を低減し、進行を遅らせ、および／または治癒するために使用される薬剤を指す。治療剤が標的とする疾患としては、、感染症、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、さまざまな免疫細胞上で発現される抗原、さまざまな血液疾患および/または炎症性疾患に関連する細胞上で発現される抗原が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「治療的対照」とは、SAR発現細胞の活性を制御するために使用される要素を指す。いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲ発現細胞の活性を制御するための治療対照は、短縮型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、短縮型上皮成長因子受容体ｖｉｉｉ（ｔＥＧＦＲｖｉｉｉ）、短縮型ＣＤ３０（ｔＣＤ３０）、短縮型上皮成長因子受容体ｖｉｉｉ（ｔＥＧＦＲｖｉｉｉ）、短縮型ＣＤ３０（ｔＣＤ３０）、短縮型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲｖｉｉｉ）のいずれか１つ以上を含む。 BCMA (tBCMA)、短縮型 CD19 (tCD19)、チミジンキナーゼ、シトシン デアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン-グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ、ヒト カスパーゼ 8、ヒト カスパーゼ 9、誘導性カスパーゼ 9、プリン ヌクレオシド ホスホリラーゼ、リナマラーゼ/リナマリン/グルコース オキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP)/インドール-3-酢酸 (IAA)、ガンマ-グルタミルシステイン合成酵素、CD20/αCD20、CD34/チミジンキナーゼキメラ、dox 依存性カスパーゼ-2、変異型チミジンキナーゼ (HSV-TKSR39)、AP1903/Fasシステム、キメラサイトカイン受容体（CCR）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせ。例示的な治療対照を暫定出願の表２４に示す。
「治療効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、余命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、感染性薬剤の力価の減少、感染性薬剤のコロニー数の減少、病状に関連する様々な生理学的症状の改善などを含む様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指すが、これらに限定されない。「治療効果」は、そもそも疾患の発生を予防する、または疾患の再発を予防するペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても現れることができる。
本明細書で使用される用語「治療上有効な量」とは、疾患または障害の少なくとも1つ以上の症状を減少させるために、本明細書に開示される1つ以上のペプチドまたはその変異体、変種、アナログもしくは誘導体を含む薬学的組成物の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な量の薬学的組成物に関する。本明細書で使用する「治療有効量」という語句は、任意の医学的治療に適用できる妥当な利益／リスク比で、障害を治療するのに十分な組成物の量を意味する。
ＴＣＲ受容体融合タンパク質」または「ＴＦＰ 」という用語は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１８７３４９Ａ１に記載されている次世代ＳＡＲプラットフォームを指す。一実施形態では、ＴＦＰは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、またはＴＣＲβなどのＴＣＲ鎖に融合された標的抗原に特異的に結合する抗体部分を含む。 ＴＦＰの構築に使用できる例示的なＴＣＲ鎖は、本開示の配列番号１１９０３～１１９０６によって表され、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０７０６０８Ａ１に提供されている。 CD3ε鎖を組み込んだTFPは、CD3ε TFPまたはTFPεと呼ばれる。 CD3γ鎖を組み込んだTFPは、CD3γTFPまたはTFPγと呼ばれる。 ＣＤ３δ鎖を組み込んだＴＦＰは、ＣＤ３δ ＴＦＰまたはＴＦＰδと呼ばれる。ＣＤ３ε、ＣＤ３γまたはＣＤ３δ鎖を組み込んだＴＦＰを総称して、 ＣＤ３ε／γ／δ ＴＦＰまたはＴＦＰε／γ／δと呼ぶ。
「トランスファーベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、「トランスファーベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むものと解釈されるべきである。ウイルス転移ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、SAR)の領域を指す。本開示のＳＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質またはＩＩ型膜貫通タンパク質）の膜貫通領域、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせである。他の膜貫通ドメインは当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。いくつかの実施形態では、ＴＭＤコード化ＳＡＲは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、またはゼータ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、 ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、 GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、IL2R ベータ、IL2R ガンマ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f 、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４） 、2B4)、CD84、CD96 (触覚)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO- 3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、および/またはNKG2C。例示的な膜貫通ドメインは、仮出願の表２８に提供されている。本開示のＳＡＲの膜貫通ドメインは、受容体にとって天然のものであっても、非天然のものであってもよい。 ＳＡＲはモジュール設計であるため、いくつかの実施形態では、１つのＳＡＲの膜貫通ドメインは、その生物学的特性および機能的特性を保持している限り、別のＳＡＲの膜貫通ドメインによって置き換えることができる。したがって、NKp30ベースのSARにおけるNKp30膜貫通ドメインは、NKp44の膜貫通ドメインによって置き換えられる可能性がある。得られた非天然膜貫通ドメインを有するＳＡＲは、当技術分野で公知のアッセイおよび本開示に記載のアッセイを使用して、その細胞表面発現および機能活性について試験することができる。
本明細書で使用される場合、「三機能性Ｔ細胞抗原カプラー」または「Ｔｒｉ－ＴＡＣ」または「ＴＡＣ」は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１１７２２９ Ａ１号に記載されている次世代ＳＡＲプラットフォームを指す。異なる抗原を標的とするTri-TACは、当技術分野で公知の技術を使用し、本開示に記載される抗原結合ドメイン(例えば、 vLおよびvH断片、scFv、vHH、リガンドおよび受容体など)を使用して構築することができる。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「処置する」、または「改善する」は、治療的処置を意味し、その目的は、疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を逆転させる、緩和する、改善する、阻害する、減速させる、または停止させることである。
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性か良性かを問わず、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。
は、宿主を形質転換して発現を促進するために、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体を指す（導入された配列の転写および翻訳など） 。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれます。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスから得られる、またはウイルスに由来するベクターを指す。典型的には、ウイルスは、レンチウイルスおよびガンマレトロウイルスを含むがこれらに限定されないレトロウイルスである。本開示のウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに基づいていてもよい。本開示のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。ベクターは、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）などの非霊長類レンチウイルスに基づいていてもよい。本開示のウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ内に有糸分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインベースのＴ細胞活性化膜貫通タンパク質を含む。分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインベースのＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、上で説明したように、宿主細胞膜に由来する。
「ゼータ」、あるいは「ゼータ鎖」、「CD3-ゼータ」または「TCR-ゼータ」「CD3ζ」という用語は、GenBank Ace として提供されるタンパク質として定義されます。 BAG36664.1、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基、および「ゼータ刺激ドメイン」、あるいは「CD3-ゼータ刺激ドメイン」または「 「ＴＣＲゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、ゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基、またはその機能的誘導体として定義される。
HLAクラスI欠損、又はHLAクラスII欠損、又はその両方を含む「HLA欠損」とは、HLAクラスIタンパク質ヘテロダイマー及び／又はHLAクラスIIヘテロダイマーを含む完全なMHC複合体の表面発現を欠くか、もはや維持しないか、又はそのレベルが低下している細胞を指し、したがってその減少または低下したレベルは、他の細胞または合成方法によって天然に検出可能なレベルよりも低い。
本明細書で使用される「改変HLA欠損iPSC」とは、分化能の改善、抗原ターゲティング、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する抵抗性、増殖、コスト刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクラインまたはパラクライン）、走化性、細胞細胞毒性に関連する、しかしこれらに限定されない、タンパク質を発現する遺伝子を導入することによりさらに改変されたHLA欠損iPSCを指し、例えば、非古典的HLAクラスIタンパク質（例えば、HLA-EやHLA-G）、キメラ抗原受容体（CAR）、T細胞受容体（TCR）、CD16 Fc受容体、BCL1 lb、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP 10、DAP 12、CD24、CD3z、41BBL、CD47、CD 113、PDL1などである。「改変型HLA欠損」細胞には、iPS細胞以外の細胞も含まれる。
FcγR 受容体である CD16 には、Fc 受容体 FcγRIIIa (CD16a) および FcγRIIIb (CD16b) という 2 つのアイソフォームがあることが確認されています。特に明記しない限り、CD16 は、CD16a および CD16b アイソフォームの両方、およびヒトまたは非ヒト種に由来するその他の選択的にスプライスされた変異体を指します。 CD16a は NK 細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体 IgG に結合して NK 細胞を活性化し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC) を促進します。本明細書で使用される「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、または「高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）」は、ＣＤ１６の天然または非天然変異体を指す。野生型ＣＤ１６は、低い親和性を有し、は、NK細胞活性化時に白血球上のさまざまな細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解性切断プロセスである、ドメイン外脱落を受けやすい。 Ｆ１７６Ｖ（またはＦ１５８ＶもしくはＶ１５８）は、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型変異体である。膜近位領域（位置189～212）の切断部位（位置195～198）が変化または除去されたCD16変異体は、脱落を受けない。切断部位および膜近位領域は、国際公開第２０１５１４８９２６号パンフレットに詳細に記載されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。 CD16 S197P または S197R バリアントは、操作された CD16 の非切断型バージョンです。 F158V と S197P (または S197R) の両方を含む CD16 バリアントは、高い親和性を持ち、切断されません。別の例示的な高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）変異体は、ＣＤ６４細胞外ドメインの３つのエクソンのうちの１つ以上に由来する細胞外ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。本開示のＣＤ１６ ＳＡＲは、野生型ＣＤ１６配列、またはその天然もしくは非天然変異体、例えばＦ１５８ＶおよびＳ１９７Ｐ（またはＳ１９７Ｒ）を含み得る。
ＣＤ１６またはＣＤ１６変異体を発現する免疫細胞およびｉＰＳＣは当技術分野で知られているが、一実施形態では、本開示は、ＣＤ１６またはＣＤ１６変異体の細胞外Ｆｃ結合領域を含むＳＡＲを提供する。一実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲは、抗体または抗体断片のＦｃ領域に結合する能力を保持しているが、その非天然抗原結合ドメイン（例えば、ＡＡＢＤ、ｓｃＦｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、 Fvなど）。一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１６またはＣＤ１６変異体のＤ１ドメイン（配列番号３８３６）のＮ末端領域またはＮ末端領域の近く、すなわち、またはCD16 または CD16 変異体の細胞外ドメインの N 末端領域近く。一実施形態では、任意のリンカーが、ＳＡＲの抗原結合ドメインとＣＤ１６またはＣＤ１６変異体のＤ１ドメインとの間に存在する。例示的なリンカーは、仮出願の表１１に提供されている。
一実施形態では、、CD16-SARは、抗体または抗体フラグメントのFc領域と結合する能力を欠くが、その非天然抗原結合ドメイン（例えば、AABD、scFv、vHH、FHVH、Fvなど）を介して抗原と結合する能力を有する。例示的な実施形態では、CD16-SARは、任意選択のヒンジドメインを介してCD16の膜貫通ドメインおよび任意選択で細胞質ドメインに操作可能に連結される1つまたは複数の非天然抗原結合ドメイン（例えば、AABD、scFv、vHH、FHVH、Fvなど）を含む。一実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲは、その標的抗原に結合すると、ＣＤ３ｚおよび／またはＦｃｅＲｙ１などのシグナル伝達アダプターを動員する能力を有する。 SAR の結合ドメインは、目的のエピトープまたは抗原に結合します。例えば、SARによって認識されるエピトープは、SARの結合ドメインとして使用されるscFvによって認識されるエピトープから決定される。例えば、CD19を標的とするSAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1- F-P 2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2- F-F 2A-Xba-PAC(配列番号2275)の抗原特異的ドメインは、hu-mROO5-1 scFv (SEQ ID NO: 3027) 由来の vL (SEQ ID NO: 2543) と vH (SEQ ID NO: 2785) の断片から構成されているので、SARは、scFvおよび/またはscFvが由来する親抗体と同じエピトープを標的とすることが予想される。本開示のSARおよびバックボーンの構築において使用されるいくつかのscFvおよび／またはその親抗体によって認識されるエピトープは、当該技術分野において公知である。あるいは、SARが標的とするエピトープは、その標的抗原の一連の変異体を作製し、当技術分野で公知の技術、例えば、Topanga Assay（Gopalakrishnan, R, Sci Reports, 2019）を用いて、SAR発現細胞に結合する変異体の能力を試験するで決定することができる。一例として、CD19を標的とするSAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1- F-P 2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2- F-F 2A-Xba-PAC(配列番号2275)によって認識されるエピトープは、CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis-T2A-Pac(DNA配列番号1282)の欠失および点変異体のパネルを作製することによって決定することができる。変異体構築物を適当な細胞株（例えば、293FT細胞）にトランスフェクトし、融合タンパク質を含む上清を回収してNLuc活性を測定し、異なる変異CD19-ECD-GGSG-NLuc-4xFlag-2xStreptag-8xHis融合タンパク質が上清中に分泌されていることを確認する。その後、融合タンパク質は、CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC（SEQ ID NO: 2275）構築物を発現する細胞（例えば、Jurkat細胞またはT細胞）に結合する能力について試験されるであろう。SAR発現細胞に結合しない変異体は、CD19特異的SARによって標的とされるエピトープを含有する候補である。特定のSARが認識するエピトープを決定する別のアプローチとして、異なる試験抗体を用いた機能的競合アッセイが考えられる。例えば、CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC（SEQ ID NO: 2275）SARを発現するT細胞は、漸増濃度の異なる試験CD19抗体の非存在下および存在下で、CD19を発現する細胞株(例えば、RAJI細胞)と共培養することができる。試験CD19抗体により認識されるエピトープが、SAR CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC（SEQ ID NO: 2275）により認識されるエピトープと重なる場合、試験抗体は、CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-vL-Xho-IgCL-DAP10-opt1-F-P2A-Spe-IgSP-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-Ig1CH1-DAP10-opt2-F-F2A-Xba-PAC (SEQ ID NO: 2275)SARを発現するT細胞によって誘導される標的細胞死滅およびサイトカイン産生を用量依存的に遮断すると予想される。試験抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体がコントロールとして含まれ、SARを発現するT細胞によって誘導される標的細胞の殺傷とサイトカイン産生には影響を与えないと予想される。同様に、特異的SARをJurkat-NFAT-EGFP細胞で発現させ 標的細胞株との共培養によりSAR発現Jurkat-NFAT-GFP細胞によるEGFP誘導を阻害する試験抗体の能力を用いて、試験抗体により認識されるエピトープが前記SARにより認識されるエピトープと重なるかどうかを決定することができる。
一実施形態において、本開示は、天然に存在する（すなわち、ネイティブまたは内因性）受容体またはその変異体に任意のリンカーを介して操作可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含むSAR（単離されたSARなど）を提供する。一実施形態では、ＳＡＲは、天然受容体の結合能力および機能を保持するが、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインによって与えられる結合能力および機能も獲得する。一実施形態では、ＳＡＲは、天然受容体の結合能力および機能を部分的または完全に保持する。一実施形態では、ＳＡＲは、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインによって与えられる結合能力および機能を獲得する。
一実施形態では、天然に存在する受容体は、細胞（例えば、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞）の表面に発現される任意の受容体である。例示的な実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、顆粒球およびＢ細胞から選択されるが、これらに限定されない。一実施形態では、天然に存在するシグナル伝達受容体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞など）の表面上に発現される。
一実施形態では、天然に存在する受容体は細胞シグナル伝達を誘導する、すなわち、それは天然に存在するシグナル伝達受容体である。天然に存在するシグナル伝達受容体は、活性化受容体（すなわち、細胞活性化を誘導する）または抑制性受容体（すなわち、細胞活性化をブロックする）であり得る。一実施形態では、天然に存在する受容体は、ＮＫ細胞受容体、例えば、ＮＫ活性化受容体またはＮＫ阻害受容体である。一実施形態では、天然に存在するシグナル伝達受容体は、細胞毒性を誘導する受容体であり得る。別の実施形態では、天然に存在するシグナル伝達受容体は、共刺激を提供する受容体であり得る。
一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然受容体は、膜貫通ドメインを有する。一実施形態では、天然に存在する受容体は、膜貫通アダプタータンパク質を動員することができる。一実施形態では、天然に存在する受容体は、限定されないが、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２またはそれらの変異体もしくは断片の群から選択される膜貫通アダプタータンパク質を動員することができる。このような受容体の例としては、CD16A、NKp30、NKp44、NKp46およびNKG2Dが挙げられる。一実施形態では、天然に存在する受容体は、その膜貫通領域内に負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸）を含む膜貫通アダプタータンパク質を動員することができる。一実施形態では、天然に存在する受容体は、シグナル伝達アダプタータンパク質の膜貫通領域内の負に帯電した残基（例えば、アスパラギン酸）と相互作用する正に帯電した残基（リジンまたはアルギニン）を含む膜貫通ドメインを有する。一実施形態では、天然に存在する受容体は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する。一実施形態では、天然に存在する受容体は、ヒンジ（スペーサー）ドメインおよび膜貫通ドメインを有する。一実施形態では、天然に存在する受容体は、ヒンジ（空間）ドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインを有する。このような受容体の例は、CD16Aである。一実施形態では、天然に存在する受容体は、ヒンジ（空間）ドメイン、膜アンカードメイン（例えば、ＧＰＩ結合ドメイン）を有するが、サイトゾルドメインを欠いている。このような受容体の例は、CD16Bである。
例示的な実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用することができる天然に存在する受容体としては、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１が挙げられるが、これらに限定されない。 、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D 、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、 CD5 、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、Siglec3、Siglec-7、Siglec-9、TCRαβおよびTCRγδ など、およびそのバリアントおよびフラグメント。
一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然に存在する受容体は、Ｔ細胞受容体ではない。一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然に存在する受容体は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαではない。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの定常鎖を含まない。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの細胞外ドメイン全体を含まない。一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然に存在する非Ｔ細胞受容体は、細胞内活性化ドメインを含む。一実施形態では、アクティベーションドメインは１つ以上のＩＴＡＭを含む。一実施形態では、アクティベーションドメインは１つ以上のＩＴＩＭを含む。一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然に存在する非Ｔ細胞受容体は、共刺激ドメインを含む。
例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２に由来する細胞内活性化ドメインを含む。
一実施形態において、本開示は非TCR天然型受容体、すなわちTCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδまたはpre-TCRαではない受容体の細胞外ドメイン全体に作動可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含むSARを提供する。一実施形態において、本開示は、非ＴＣＲ天然受容体の部分細胞外ドメインに機能的に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、非ＴＣＲ天然受容体の部分細胞外ドメインに機能的に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、ＮＴＣＲＭ（非Ｔ細胞受容体モジュール）の全体または部分細胞外ドメインに作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然シグナル伝達受容体は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１６Ａ、またはＮＫＧ２Ｄではない。
一実施形態では、本開示は、任意のリンカーを介して天然に存在する受容体の全体または部分的な細胞外ドメインに作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供し、ここで受容体はＴＣＲ／ＣＤ３受容体複合体の一部ではない。一実施形態において、本開示は、任意のリンカーを介して天然に存在する受容体ポリペプチド鎖の細胞外ドメインの全体または一部に作動可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含むSARを提供し、ここで受容体ポリペプチド鎖はTCR／CD3受容体複合体の一部ではない。一実施形態において、本開示は、天然に存在する受容体またはその変異体もしくはフラグメントの細胞外ドメインの全体または一部に任意のリンカーを介して作動可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含むSARを提供し、ここで、受容体はTCR／CD3受容体複合体と会合しない。
一実施形態では、本開示は、天然に存在する受容体またはその変異体もしくは断片の全体または部分的な抗原（またはリガンド）結合ドメインに機能的に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。
ある実施形態において、本開示は、天然に存在する非TCRシグナル伝達受容体またはNTCRMまたはその変異体もしくはフラグメントの全体もしくは部分的な抗原(またはリガンド)結合ドメインに作動可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなるSARを提供する。ある実施形態において、本開示は、非TCRシグナル伝達受容体またはNTCRMの全体または部分的な抗原(またはリガンド)結合ドメインまたはその変異体もしくはフラグメントに操作的に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなるSARを提供する。ある実施形態において、本開示は、天然に存在するシグナル伝達受容体またはその変異体もしくはフラグメントの全体または部分的な抗原(またはリガンド)結合ドメインに操作的に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなるSARを提供し、天然に存在するシグナル伝達受容体はTCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδまたはpreTCRαではない。ある実施形態において、本開示のSARは、天然に存在する非TCRシグナル伝達受容体の抗原結合特性の少なくとも一部を保持する。ある実施形態において、本開示のSARは、異種抗原結合ドメインのうちの1つ以上によって付与される新規な抗原結合特性を獲得する。ある実施形態において、本開示のSARは、天然に存在する非TCRシグナル伝達受容体の抗原結合特性の少なくとも一部を保持し、異種抗原結合ドメインのうちの1つ以上によって付与される新規な抗原結合特性を獲得する。
一実施形態では、任意のリンカーを介して、 ＴＣＲの可変ドメイン（すなわち、Ｖα、Ｖβ、Ｖδ、またはＶγ）に由来する異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。天然に存在するシグナル伝達受容体。一実施形態では、天然に存在するシグナル伝達受容体は、ＮＴＣＲＭ（非Ｔ細胞受容体モジュール）である。
は、任意のリンカーを介してＮＴＣＲＭのヒンジドメインに作動可能に連結されたＴＣＲの可変ドメイン（すなわち、 Ｖα 、Ｖβ、Ｖδ、またはＶγ）に由来する異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。 －Ｔ細胞受容体モジュール）および／またはシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１０など）またはそれらの変異体もしくは断片。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの細胞外ドメイン全体を含まない。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαの膜貫通ドメインを含まない。
本開示のSARの概略図を図1～5および表に示します。 A1-1からA1-19まで。
一実施形態では、本開示のＳＡＲの構築に使用できる天然受容体は、単一のポリペプチド鎖または複数のポリペプチド鎖を含み得る。天然に存在する受容体は、多重鎖受容体複合体(例えば、T細胞受容体複合体)の構成要素である可能性がある。
一実施形態では、ＳＡＲは、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、１つまたは複数の異種（または非天然）抗原結合ドメインを含む。本開示のＳＡＲの構築に使用することができる例示的な異種抗原結合ドメインには、自律抗原結合ドメイン（例えば、完全ヒトｖＨドメイン、ｖＨＨドメイン、単鎖ＴＣＲ、組換えＴＣＲまたはｓｖｄ－ＴＣＲなど）、 scFv、抗体、抗体フラグメント（vL、vH、Fabなど）、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン（例、セントイリン、アフィボディ、DARPIN、ZIPドメイン、アダプターなど）、リガンド、受容体の細胞外ドメイン（例、 、ＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、ＮＫｐ３０細胞外ドメインなど）、自己抗原、ＴＣＲ、ＴＣＲ可変フラグメント（例えば、Ｖａ、Ｖｂ、Ｖｇ、Ｖｄなど）およびそれらの変異体およびフラグメントなど。例示的な実施形態では、１つまたはより異種の抗原結合ドメインは、ｓｃＴＣＲ、ｓｖｄ－ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣ｓｃＦｖまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ様結合能力、例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する能力を獲得する。
現在臨床使用されている第二世代キメラ抗原受容体構築物(例えば、アクシカブタジーン・シロロイセル、リソカブタジーン・マラルーセルなど)は、茎(ヒンジ)、膜貫通、共刺激および細胞質ドメインに操作的に連結された異種抗原結合ドメイン(例えば、scFv)を含み、これらは次に、複数の異なる天然受容体に由来する。別の態様では、天然に存在するシグナル伝達受容体(例えば、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、KIR2DS4など)の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの天然構成またはシグナル伝達アダプター(例えば、CD3ζ、FcRγ、DAP10、DAP12など)からなるSAR(例えば、次世代CAR)が提供される。このようなSARは、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの非天然構成を含むSARと比較して、優れた生理学的細胞シグナル伝達および調節を示す。別の側面において、本開示は、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの天然構成を含んでなるSARが、非天然構成を含んでなるSARに比べてin vitroおよびin vivoで優れた有効性を示すことを提供する。
一実施形態では、SARは、天然に存在するシグナル伝達受容体もしくはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全体と任意のリンカーを介して作動可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる。一実施形態において、SARは、天然に存在するシグナル伝達受容体またはその変異体もしくは断片の細胞外抗原結合ドメイン全体、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに任意のリンカーを介して操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる。一実施形態において、SARは、1つの天然に存在するレセプターの細胞外抗原結合ドメインの一部または全体と、別の天然に存在するシグナル伝達レセプターまたはその変異体もしくはフラグメントの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと、任意のリンカーを介して操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる。一実施形態において、SARは、天然に存在するシグナル伝達受容体、シグナル伝達アダプター、またはその変異体もしくは断片の、部分的な細胞外ドメインではなく、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの全体に、任意のリンカーを介して操作可能に連結された、1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなる。一実施形態では、SARは、任意のリンカーおよび／またはスペーサー（例えば、ヒンジドメイン）を介して、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインおよび任意で細胞質ドメイン、またはその変異体または断片に操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなる。一実施形態において、SARは、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターのヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および任意に細胞質ドメイン、またはその変異体もしくは断片に、任意のリンカーを介して操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる。
一実施形態では、ＳＡＲの異なるドメインは、ペプチド結合を介して機能的に連結されている、すなわち、それらはポリペプチド鎖の一部である。
一実施形態では、ＳＡＲは細胞内活性化ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、シグナル伝達アダプターに由来する細胞内活性化ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２に由来する細胞内活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲの活性化ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフを有する活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、２つ以上のＩＴＡＭモチーフを有する活性化ドメインを含む。一実施形態では、 ＳＡＲは、単一のＩＴＡＭモチーフを有する活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＩＴＡＭモチーフを欠く活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、チロシンベースのモチーフ（ＹＩＮＭ）を含む活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＰＩ３Ｋおよび／またはＧｒｂ２のｐ８５サブユニットを動員する活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＮＦＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＮＦ－κＢ、およびＥＲＫシグナル伝達経路のうちの１つまたは複数を活性化する活性化ドメインを含む。
一実施形態では、ＳＡＲは細胞内阻害ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＰＤ１に由来する細胞内阻害ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲの阻害ドメインは、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含む。
一実施形態において、SARはシグナル伝達アダプターを動員することができる。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、限定されないが、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２の群から選択される１つまたは複数のシグナル伝達アダプターを動員することができる。例示的な実施形態において、SARは、CD3ζ、FcRγ、DAP10およびDAP12からなる群から選択される1つ以上のシグナル伝達アダプターを動員することができるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＳＡＲは、そのヒンジ、膜貫通、またはサイトゾルドメインとの相互作用を介してシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、ＳＡＲは、ヒンジ、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインのうちの１つ以上との相互作用を介してシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、本開示のＳＡＲを発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞など）は、その１つ以上の異種抗原結合ドメインが標的抗原に結合するときに、シグナル伝達アダプターを動員する。一実施形態において、本開示のSARを発現する免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞など）は、標的細胞を活性化し、増殖し、サイトカインを分泌し、および／または標的細胞の殺傷を調節（誘導または抑制）し、MHC制限抗体型特異性および／またはMHC非制限抗体型特異性を有する。
ある実施形態において、SARは、サイトゾルドメインを欠いている。ある実施形態において、SARは、長さが100アミノ酸未満(すなわち、90、80、70、60、50、50、40、30、25、20、15、10、5または2アミノ酸長未満)のサイトゾルドメインを含んでなる。ある実施形態において、SARは、長さが50アミノ酸未満のサイトゾルドメインを含んでなる。ある実施形態において、SARは、長さが25アミノ酸未満のサイトゾルドメインを含んでなる。ある実施形態において、SARは、長さが10アミノ酸未満のサイトゾルドメインを含んでなる。ある実施形態において、SARは、長さが5アミノ酸未満のサイトゾルドメインを含んでなる。ある実施形態において、SARは、細胞内活性化ドメインを欠いている。ある実施形態において、SARは、ITAMモチーフを含む細胞内ドメインを欠いている。ある実施形態において、SARは、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いている。ある実施形態において、SARは、細胞内共刺激ドメインを欠いている。ある実施形態において、SARは、CD3z、2B4、4-1BB、CD28、ICOS、CD2、CD40、DAP10およびDAP12のうちの1つ以上に由来する細胞内ドメインを欠いている。ある実施形態において、SARは、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼを直接動員することができる細胞内シグナル伝達ドメインを欠いている。
ある実施形態において、SARは、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントの膜貫通と細胞質ドメインとの間に挿入される共刺激ドメインを欠いている。第2世代CARとは対照的に、一実施形態では、本開示のSARの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、単一の天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントに由来する。別の実施形態において、本開示のSARの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、単一の天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントに由来し、共刺激受容体に由来する異種共刺激ドメインによって中断されない。別の実施形態において、本開示のSARの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、単一の天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターに由来し、互いに当接する。別の実施形態において、本開示のSARのヒンジ、膜貫通および細胞質ドメインは、単一の天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターもしくはそれらの変異体に由来し、それぞれに隣接し、すなわち、それらは中断することなく1つの連続した鎖で存在する。
ある実施形態において、SARは、1以上の共刺激ドメインをさらに含む。ある例示的実施形態において、SARは、CD28、4-1BB、CD27、OX40、CD2、CD40、CD81もしくは2B4またはそれらの変異体に由来する1以上の共刺激ドメインを含んでなる。他の共刺激ドメインも当技術分野で公知であり、本開示の別の実施形態で使用することができる。ある実施形態において、1以上の共刺激ドメインは、SARの傍膜領域に位置する。ある実施形態において、1以上の共刺激ドメインは、I型膜貫通SARの膜貫通領域に対してC末端に位置する。ある実施形態において、1以上の共刺激ドメインは、II型膜貫通SARの膜貫通領域に対してN末端に存在する。別の実施形態において、SARは、共刺激ドメインを欠いている。
ある実施形態において、本開示は、1以上の共刺激ドメインを含んでなるSARを提供する。共刺激ドメインは、天然に存在するシグナル伝達受容体(例えば、CD16AまたはNKp30など)もしくはシグナル伝達アダプター(例えば、CD3ζ、FcRγなど)またはその変異体もしくはフラグメントに由来する膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入される。例示的な実施形態において、本開示は、天然に存在するシグナル伝達受容体(例えば、CD16A、CD16B、CD64、NKp30など)に由来する細胞外ドメインに操作的に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなるSARを提供し、これは次にヒンジドメイン(例えば、CD8ヒンジまたはCD28ヒンジ)、膜貫通ドメイン(例えば、 CD8またはCD28膜貫通ドメイン)、共刺激ドメイン(例えば、4-1BBまたはCD28共刺激ドメイン)および活性化ドメイン(例えば、CD3ζまたはFcRγ活性化ドメイン)が含まれる。例示的なこのようなSARは、配列番号10818および10821によって表される。別の例示的実施形態において、本開示は、1以上の異種抗原結合ドメインを含んでなるSARを提供する。これらのドメインは、シグナル伝達アダプターに由来する細胞外ヒンジドメイン(例えば、CD3ζ、FcRγなど)に操作的に連結されている。ヒンジドメインは、次に、膜貫通ドメイン(例えば、CD3ζまたはFcRγ膜貫通ドメイン)、共刺激ドメイン(例えば、4-1BB、CD28、2B4またはOX40共刺激ドメイン)および活性化ドメイン(例えば、CD3ζまたはFcRγ活性化ドメインなど)に連結される。
ある実施形態において、SARは、1以上の異種抗原結合ドメイン(例えば、scFv、vHH、FHVH、センチリン、scTCR、svd-TCRなど)を含んでなる。これらのドメインは、任意選択のリンカーを介して、天然に存在する(または天然の)シグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントの細胞外ドメインのアミノ末端またはアミノ末端付近に操作的に連結される。ある実施形態において、SARの1以上の異種抗原結合ドメインは、任意選択のリンカーを介して、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントのヒンジ(もしくはスペーサー)ドメインのアミノ末端またはアミノ末端付近に操作的に連結される。ある実施形態において、SARの1つ以上の異種抗原結合ドメインは、任意選択のリンカーを介して、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントの膜貫通ドメインのアミノ末端またはアミノ末端付近に操作的に連結される。ある実施形態において、SARの1つ以上の異種抗原結合ドメインは、任意選択のリンカーを介して、ヒンジ(スペーサー)ドメイン、天然に存在するシグナル伝達受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントに操作的に連結される。ある実施形態において、SARの1つ以上の異種抗原結合ドメインは、任意選択のリンカーを介して、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくはフラグメントの膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメインに操作的に連結される。
例示的な実施形態では、ＳＡＲを含む天然に存在する（または内在性）シグナル伝達受容体は、細胞外側にＮ末端およびサイトゾル側にＣ末端を有するＩ型（またはグループ１）膜貫通タンパク質である。このようなＩ型（またはグループ１）内因性受容体の例としては、ＣＤ１６Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳが挙げられる。 4、KIR2DS5、KIR3DS1 、 CRTAM、TIGIT、CD96、2B4、SLAMF6、SLAMF7、CD27、CD100、CD160、ILT2/LILRB1、CD33、SIGLEC-7、SIGLEC-9、CD32、CD64など
一実施形態では、本開示は、Ｉ型膜貫通天然（または天然）シグナル伝達受容体のアミノ末端またはアミノ末端付近に機能的に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む合成抗原受容体（ＳＡＲ）を提供する。オプションのリンカー経由。一実施形態では、ＳＡＲは、天然に存在するシグナル伝達受容体の結合能力および機能を保持するが、さらに、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインによって付与される結合能力を獲得する。一実施形態では、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインは、ｓｃＴＣＲ、ｓｖｄ－ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣抗体またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲのような結合能力を獲得する。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｉ型膜貫通タンパク質である内因性受容体のアミノ末端またはアミノ末端付近に機能的に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、任意のリンカーを介して、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２のＮ末端またはＮ末端付近に作動可能に連結された異種（非天然）抗原結合ドメインを含む。 、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、CRTAM、TIGIT、CD96、2B4、SLAMF6、SLAMF7、CD27、CD100、CD160 、ILT2/LILRB1、CD33 、SIGLEC-7、SIGLEC-9、CD32、または CD64。一実施形態では、ＳＡＲはＮ末端シグナルペプチドも含む。一実施形態では、ＳＡＲは、シグナルペプチドのＣ末端に位置する１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む。
一実施形態において、SARは、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、 KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、CRTAM、TIGIT、CD96、2B4、SLAMF6、SLAMF7、CD27、CD100、CD160、ILT2/LILRB1、CD33、SIGLEC-7、SIGLEC-9、CD32またはCD64のヒンジ（スペーサー）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含んでなるポリペプチドに、1つ以上の任意のリンカーを介して操作可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含んでなる。
例示的な実施形態において、天然に存在する（または内因性の）シグナル伝達レセプターは、そのC末端が細胞外側にあり、N末端が細胞質側にあるII型（またはグループ2）膜貫通タンパク質である。本開示は、I型膜タンパク質とII型膜タンパク質との融合タンパク質を生成するための一般的な方法を提供し、それはI型膜タンパク質の1つ以上のモジュールがII型膜タンパク質の全領域または部分領域に機能的に連結された融合体である例示的な実施形態では、シグナルペプチド配列を欠くＩ型タンパク質の抗原結合ドメインのＮ末端は、ＩＩ型膜タンパク質のＣ末端に任意の連結を介して機能的に連結される。一実施形態において、SARは、天然に存在する（または内因性の）シグナル伝達受容体のカルボキシ末端またはカルボキシ末端近傍に、1つ以上の任意のリンカーを介して操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる。このようなII型(またはグループ2)内因性受容体の例には、NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2E、NKG2H、KLRG1、CD161およびCD94などが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、1つ以上の異種抗原結合ドメイン(例えば、vHH、FHVH、センチリン、scTCR、svd-TCR）は、1つ以上の任意のリンカーを介して、II型（2群）膜貫通タンパク質である内因性受容体のC末端またはC末端近傍にフレーム内で操作可能に連結される。一実施形態において、SARは、NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2E、NKG2H、KLRG1、CD161またはCD94のC末端またはC末端近傍に任意のリンカーを介して操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインを含む。NKG2DのC末端に結合したHer2およびHer3 vHHドメインを含むこのようなSARの例は、それぞれ配列番号(DNA):7696～7697および配列番号(PRT):8388～8389で表される。一実施形態では、１つ以上の異種抗原結合ドメインは、任意のリンカーを介して、ＩＩ型（グループ２）膜貫通タンパク質である内因性受容体のヒンジドメインに機能的に連結される。一実施形態では、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインは、任意のリンカーを介して、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１６１またはＣＤ９４のヒンジドメインに機能的に連結される。
細胞表面での NKG2D の効率的な発現には、DAP10 の存在が必要です。本明細書では、細胞（例えば、iPSC）を遺伝子操作してNKG2Dを導入することによって、NKG2D-SAR（すなわち、NKG2Dの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含むSAR）を単独で、またはDAP10とともに安定して過剰発現するエフェクター細胞を取得するための戦略が提供される。 -SAR、および場合によりDAP10を細胞(例えば、iPSC)に導入し、その後、指示されたiPSC分化からNK細胞およびT細胞を含むエフェクター細胞を誘導する。本開示はまた、ＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインを含むＳＡＲとともにアクセサリーモジュールとしてのＤＡＰ１０の異所性発現によって、ＤＡＰ１０を欠く細胞、または低レベルのＤＡＰ１０を発現する細胞におけるＮＫＧ２Ｄ－ＳＡＲの効率的な発現のための戦略も提供する。
CD94/NKG2C は、HLA-E に結合し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを含むタンパク質である DAP12 と会合するヘテロ二量体受容体です。細胞表面でのCD94/NKG2Cの効率的な発現にはDAP12の存在が必要であり、DAP12の膜貫通ドメインとNKG2Cの荷電アミノ酸がこの相互作用を媒介します。本明細書では、細胞（例えば、iPSC）を遺伝子操作してNKG2C-SARを導入し、場合により、NKG2C-SARを導入することによって、NKG2C-SAR（すなわち、NKG2Cの膜貫通ドメインを含むSAR）を単独で、またはDAP12とともに安定して過剰発現するエフェクター細胞を取得するための戦略が提供される。 ＤＡＰ１２を細胞（例えば、ｉＰＳＣ）に導入し、その後、誘導されたｉＰＳＣ分化からＮＫ細胞およびＴ細胞を含むエフェクター細胞を誘導する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｃ－ＳＡＲはさらにＣＤ９４またはＣＤ９４－ＳＡＲと共発現される。
過剰発現されたＮＫＧ２Ｃ－ＳＡＲを含むｉＰＳＣまたはそれに由来するエフェクター細胞において、細胞はさらに、過剰発現されたＣＤ９４もしくはＣＤ９４－ＳＡＲおよび／またはＤＡＰ１２を含む。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｃ－ＳＡＲおよびＣＤ９４（またはＣＤ９４－ＳＡＲ）および／またはＤＡＰ１２は、別個の構築物で発現される。別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｃ－ＳＡＲおよびＣＤ９４（またはＣＤ９４－ＳＡＲ）および／またはＤＡＰ１２は、ビシストロン性またはトリシストロン性構築物中で共発現され、自己切断性２Ａコード配列によって連結される。別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｃ－ＳＡＲ、ＣＤ９４（またはＣＤ９４－ＳＡＲ）およびＤＡＰ１２は、別個の構築物中で発現される。
、既知のCD94および/またはシグナル伝達アダプター(例えば、DAP10、DAP12など)の共発現によって同様に効率的に発現され得ることを提供する。彼らと関わること。
一実施形態では、本開示は、ＩＩ型膜貫通天然シグナル伝達受容体のカルボキシ末端またはカルボキシ末端付近に、任意のリンカーを介して機能的に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。一実施形態では、ＳＡＲは、天然に存在するシグナル伝達受容体の結合能力および機能を保持しているが、さらに、異種抗原結合ドメインによって与えられる結合能力を獲得する。一実施形態では、本開示は、合成抗原受容体を生成するために、ＩＩ型膜貫通天然シグナル伝達受容体のヒンジドメインまたは膜貫通ドメインに任意のリンカーを介してインフレームで機能的に連結される１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを提供する。一実施形態では、得られるＳＡＲは、天然シグナル伝達受容体の結合能力および機能を保持するが、さらに、異種抗原結合ドメインによって付与される結合能力を獲得する。一実施形態では、本開示のＳＡＲは、天然に存在する受容体の結合特性および生理学的調節を保持しながら、天然に存在する受容体が応答できる標的抗原に加えて標的抗原にも応答できる追加の抗原結合能力を獲得する。
本開示はまた、天然シグナル伝達鎖またはシグナル伝達アダプターもしくはその変異体の細胞外ドメインに任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む単鎖ＳＡＲを提供する。本開示はまた、天然シグナル伝達鎖またはシグナル伝達アダプターもしくはその変異体のヒンジ（スペーサー）ドメインに任意のリンカーを介して機能的に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む単鎖ＳＡＲを提供する。本開示はまた、天然シグナル伝達鎖またはシグナル伝達アダプターもしくはその変異体の膜貫通ドメインに任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む単鎖ＳＡＲを提供する。例示的なシグナル伝達鎖またはシグナル伝達アダプターとしては、CD3ζ、FcRγ、DAP10もしくはDAP12、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シグナル伝達鎖／アダプターは、共刺激ドメインをさらに含む。
一実施形態では、本開示は、任意のリンカーを介して、ＮＣＡＭ（非ＣＤ３アダプターモジュール）の全体または部分的な細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、または膜貫通ドメインに作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。
一実施形態では、本開示は、任意選択のリンカーを介してシグナル伝達アダプターの全体的または部分的な細胞外ドメイン、ヒンジドメインまたは膜貫通ドメインに作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供し、シグナル伝達アダプター（またはシグナル伝達鎖） ) は CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ ではありません。一実施形態では、シグナル伝達アダプターはＦｃＲγではない。
一実施形態では、単鎖ＳＡＲの１つ以上の異種抗原結合ドメインは、自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）、例えば、単一ドメイン抗体、単一ｖＨドメイン、ＦＨＶＨ、ｖＨＨドメイン、ｓｖｄ－ＴＣＲ、非免疫グロブリンを含む。抗原結合足場（例、DARPIN、アフィボディ、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディ、レペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン） 、Armadillo リピートタンパク質またはそのフラグメント）。一実施形態において、単鎖ＳＡＲの１つ以上の異種抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメント（例えば、ｖＬ、ｖＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ｓｃＦｖおよびｓｃＴＣＲなど）を含む。
SAR はモジュール形式であるため、その異なるドメインを他のドメインに置き換えて、多様な生物学的活性と特性を備えた新しい SAR を生成できる。したがって、あるSARの細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインは、得られたSARが、元のSARの生物学的活性（例えば、抗原結合、細胞シグナル伝達など）の少なくとも1つを有する限り、別のSARの細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインで置換することができる。一実施形態では、本開示は、新しいモジュール（共刺激ドメイン）をＳＡＲに挿入できることを規定する。一実施形態において、本開示は、1つの天然に存在するシグナル伝達レセプターの細胞外ドメインの全体または一部に任意のリンカーを介して操作可能に連結され、次いで、異なる天然に存在するレセプターまたはその変異体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに操作可能に連結される、1つ以上の異種抗原結合ドメインを含むSARを提供する。例示的な実施形態では、CD16A細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインからなるSARの細胞外ドメインがCD64の細胞外ドメインで置換され、CD20 vHHドメイン、CD64細胞外ドメイン、CD16A膜貫通ドメイン、およびCD16A細胞質ドメインからなる新しいSAR（SEQ ID NO: 4722）が生成される。
一実施形態では、ＳＡＲの異なるドメインは、単一の天然受容体またはシグナル伝達アダプターに由来する。一実施形態では、ＳＡＲの異なるドメインは、２つ以上の天然に存在する受容体またはシグナル伝達アダプターに由来する。一実施形態において、SARは、天然に存在する1つのレセプターの抗原結合ドメインの一部または全体と、1つ以上の異なるレセプターまたはその変異体もしくはフラグメント由来のヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと、任意のリンカーを介して操作可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる。例示的な実施形態において、SARは、N末端からC末端まで、CD19 scFv、CD16抗原結合ドメイン（D1およびD2）、CD8ヒンジドメイン、CD8膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、およびCD3z活性化ドメインからなる。このようなＳＡＲのアミノ酸配列は、配列番号１０８３６に示される。別の例示的な実施形態では、ＳＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ１６Ａ抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）、ＣＤ１６Ａヒンジドメイン、 CD28 膜貫通ドメイン、CD28 共刺激ドメイン、および CD3z 活性化ドメインからなる。別の例示的な実施形態では、ＳＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ６４抗原結合ドメイン、ＣＤ１６Ａヒンジドメイン、ＣＤ１６Ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ１６Ａサイトゾルドメインを含む。このようなSARのアミノ酸配列は配列番号10832に示されている。
一実施形態では、ＳＡＲは、天然に存在するシグナル伝達受容体またはその変異体のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインに任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む。サイトゾルドメインはすべて、単一の天然シグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプター、あるいはそれらの変異体または断片に由来する。一実施形態では、ＳＩＲを含むヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインは、単一の天然シグナル伝達受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ）またはシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζ）またはその変異体もしくは断片に由来する。別の実施形態では、SIRを構成するヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、1つ以上の天然に存在するシグナル受容体（例えば、CD16Aのヒンジドメインおよび膜貫通ドメインは、NKp30の細胞質ドメインなどと作動的に連結している）またはシグナル伝達アダプター（例えば、CD16Aのヒンジドメインおよび膜貫通ドメインは、FcRγの細胞質ドメインなどと作動的に連結している）に由来する。一実施形態において、SARは、天然に存在するシグナル伝達受容体のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに任意のリンカーを介して作動可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなり、ここで、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、1つ以上の天然に存在するシグナル伝達レセプター、シグナル伝達アダプター、またはそれらの変異体もしくはフラグメントに由来する。
一実施形態において、本開示は、アミノ（N）末端からカルボキシ（C）末端までの以下の一般式を有する2つ以上の鎖を含む非ネイティブタンパク質（すなわち、合成タンパク質）を生成する方法を提供する：
チェーン 1: SP1-A1-L1-H1-M1-(C1)n
チェーン 2: SP2-A2-L2-H2-M2-(C2)n
ここで、SP1およびSP2は、成熟ポリペプチド鎖から切断される任意のシグナルペプチドである； A1およびA2は、互いに相互作用し得る2つのタンパク質ドメインであり、L1およびL2は、任意のリンカーであり、H1およびH2は、任意のヒンジまたはスペーサードメインであり、M1およびM2は、膜アンカーまたは膜貫通ドメインであり、C1およびC2は、任意の細胞質ドメインである。一実施形態では、Ａ１およびＡ２ドメインは抗体に由来しない。一実施形態では、Ａ１およびＡ２ドメインは抗体断片ではない。一実施形態では、Ａ１およびＡ２ドメインはＭ１およびＭ２ドメインに対して異種である、すなわち、Ａ１およびＭ１ドメインは異なるタンパク質に由来し、同様にＡ２およびＭ２ドメインは異なるタンパク質に由来する。例示的な実施形態では、Ａ１およびＡ２ドメインはＴＣＲ（例えば、ＴＣＲのＶαおよびＶβドメイン）に由来し、Ｍ１およびＭ２ドメインはＣＤ３εに由来する。一実施形態では、Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインは自律ドメインではない。一実施形態では、A1ドメインとA2ドメインは、無関係なタンパク質に対する親和性よりも大きい親和性を互いに有する。一実施形態では、Ａ１およびＡ２ドメインは互いに会合して、抗原結合ドメインを生成し得る。一実施形態では、非天然タンパク質は合成抗原受容体である。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２リンカーは長いリンカーである。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２リンカーはＩｇ様リンカーである。一実施形態では、Ｌ１リンカーおよびＬ２リンカーは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって結合される。一実施形態では、Ｍ１およびＭ２ドメインは膜貫通ドメインである。一実施形態では、Ｍ１およびＭ２ドメインは同じタンパク質（例えば、ＣＤ３ζ）に由来する。一実施形態では、Ｍ１ドメインおよびＭ２ドメインは、異なるタンパク質（例えば、ＣＤ３εおよびＦｃＲγ）に由来する。一実施形態では、M1ドメインとM2ドメインは、配列が同一であり、かつ／または70％以上（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％など）のアミノ酸配列相同性を有する。一実施形態では、Ｍ１ドメインとＭ２ドメインは互いに関連する。一実施形態では、Ｍ１およびＭ２ドメインはジスルフィド結合によって結合される。一実施形態では、Ｍ１および／またはＭ２ドメインは、１つまたは複数のシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、Ｃ１、Ｃ２ドメインは細胞シグナル伝達ドメイン（例えば、活性化ドメインまたは共刺激ドメインなど）である。一実施形態では、各鎖は複数のサイトゾルドメインを有し得る。一実施形態では、両鎖は、Ａ１－Ｌ１－Ｈ１セグメントおよびＡ２－Ｌ２－Ｈ２セグメントが細胞外側に位置する細胞表面上で発現される。本開示は、合成タンパク質をコードする核酸、アミノ酸配列、合成タンパク質をコードする１つ以上のベクター、および合成タンパク質を発現する細胞を提供する。
本開示はまた、二重鎖ＳＡＲ （例えば、分離された二重鎖ＳＡＲ）を提供する。一実施形態において、本開示は、シグナル伝達受容体の細胞外ドメイン全体もしくは部分ドメイン、膜貫通ドメイン、および任意選択で細胞質ドメイン、シグナル伝達アダプター、またはその変異体もしくはフラグメントからなる少なくとも1つのモジュールに、任意選択でリンカーを介して操作可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖SARを提供する。一実施形態では、シグナル伝達受容体は非ＴＣＲシグナル伝達受容体である。一実施形態では、シグナリングアダプタは非ＣＤ３アダプタである。一実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。
一実施形態において、本開示は、シグナル伝達受容体（例えば、CD16A、CD16B、NKp30など）の膜貫通ドメインまたは膜関連ドメイン、シグナル伝達アダプター（例えば、CD3ζ、FcRγ）またはその変異体もしくはフラグメントからなる膜関連モジュール（MAM）に任意のペプチドリンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）を介して操作可能に連結されている、それぞれが少なくとも1つの抗原結合ドメイン（例えば、vL、vβ、Vα、Vβ、VγまたはVδなど）を含む2つの鎖からなる二重鎖SARを提供する。いくつかの実施形態では、ＭＡＭは、全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、シグナル伝達受容体のヒンジドメインおよび／またはサイトゾルドメイン、および／またはシグナル伝達アダプターのヒンジドメインおよび／またはサイトゾルドメインをさらに含む。一実施形態では、シグナル伝達受容体は非ＴＣＲシグナル伝達受容体である。一実施形態では、モジュールはＮＴＣＲＭである。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（すなわち、ＮＣＡＭ）である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。一実施形態では、ＭＡＭは、ＴＣＲα、β、γ、δ、プレＴＣＲα、ＣＤ３ε、ＣＤ３ε、ＣＤ３γまたはＣＤ３δの膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、第1鎖の少なくとも1つの抗原結合ドメイン（例えば、vL、Vα、またはVγ）は、第2鎖の少なくとも1つの相補的抗原結合ドメイン（例えば、vH、Vβ、またはVδ）と会合して、標的抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール（例えば、FvまたはFc-TCR）を形成する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーは、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーは、それぞれ、長さが約５～約５００アミノ酸である。一実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは相補鎖（例えば、ｖＬとｖＨ、ＶαとＶβ、またはＶγとＶδ）を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、タンパク質、炭水化物、および脂質からなる群から選択される。例示的な実施形態では、標的抗原は、表Ｂに列挙される抗原のうちの１つまたは複数である。例示的な実施形態では、細胞表面抗原は、以下の1つ以上の群から選択されるが、これらに限定されない： CD2、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD123、CD138、CD179b、CLL-1、FLT3、クローディン18. 2、BCMA、GCC、MPL、SLAMF7、ROR1、ROR2、GPRC5D、FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16、またはHer2。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を含む複合体である。例示的な実施形態では、ペプチド抗原は、表Ｂに列挙される抗原のうちの１つまたは複数である。例示的な実施形態において、ペプチド／MHC複合体は、NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSAまたはgp100のうちの1つ以上に由来するペプチドを含む。
一実施形態において、本開示は、シグナル伝達受容体のヒンジ、膜貫通ドメイン、および任意選択で細胞質ドメインからなるモジュールに任意選択でリンカーを介して作動可能に連結される1つまたは複数の異種抗原結合ドメインからなる2本の鎖の各々からなる二重鎖SAR、またはシグナル伝達アダプター、またはその変異体もしくはフラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、各々が、シグナル伝達受容体の膜貫通ドメインおよび任意選択で細胞質ドメイン、シグナル伝達アダプター、またはその変異体もしくはフラグメントからなるモジュールに任意のリンカーを介して作動可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含む2つの鎖からなる二重鎖SARを提供する。一実施形態において、本開示は、シグナル伝達受容体の膜貫通ドメイン、またはシグナル伝達アダプター、またはその変異体もしくはフラグメントからなるモジュールに任意のリンカーを介して作動可能に連結された、1つまたは複数の異種抗原結合ドメインからなる2つの鎖の各々からなる二重鎖SARを提供する。一実施形態において、本開示は、シグナル伝達受容体の細胞質ドメイン、シグナル伝達アダプター、またはその変異体もしくはフラグメントからなるモジュールに任意のリンカーを介して作動可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる2つの鎖の各々からなる二重鎖SARを提供する。一実施形態では、シグナル伝達受容体は非ＴＣＲシグナル伝達受容体である。一実施形態では、モジュールはＮＴＣＲＭである。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（すなわち、ＮＣＡＭ）である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。
一実施形態において、本開示は、各鎖がシグナル伝達受容体（例えば、ネイティブ受容体）、シグナル伝達アダプター（例えば、NCAM）、またはそれらの変異体もしくはフラグメントの細胞外、膜貫通または細胞質ドメインからなるモジュール（例えば、NTCRM）に任意のリンカーを介して操作可能に連結された、1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる二重鎖SARを提供する。一実施形態では、二本鎖ＳＡＲを含むシグナル伝達受容体およびシグナル伝達アダプターは天然に存在する。一実施形態では、二本鎖ＳＡＲを含むシグナル伝達受容体およびシグナル伝達アダプターは、天然に存在しない。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲを含むシグナル伝達受容体およびシグナル伝達アダプターは、非Ｔ細胞受容体および非ＣＤ３アダプターである。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲを含むシグナル伝達受容体およびシグナル伝達アダプターは、天然に存在する非Ｔ細胞受容体および非ＣＤ３アダプターである。
一実施形態において、本開示は、天然に存在するシグナル伝達受容体（例えば、CD16A）、シグナル伝達アダプター（例えば、FcRγ）またはその変異体もしくはフラグメントの細胞外、膜貫通または細胞質ドメインからなる少なくとも1つのモジュール（例えば、NTCRM）に任意のリンカーを介して操作可能に連結される1つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖SARを提供する。
本出願は、1つの局面において、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）に融合した1つ以上の異種抗原結合ドメインを含む構築物（単離された構築物など）を提供する。例示的な実施形態では、NTCRMは、以下の非TCRレセプターの1つ以上に由来するが、これらに限定されない： CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、 KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、ILT2。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、標的抗原に特異的に結合する１つまたは複数の異種抗原結合ドメインおよび少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができる非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（すなわち、ＮＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよびＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質）を含む複合体である。いくつかの実施形態では、標的抗原は細胞表面抗原である。
いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的に結合するSAR（単離されたSARなど）が提供され、ここで、SARは以下からなる： a）vL、VαまたはVγドメインおよび第1の膜関連モジュール（MAM）からなる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチド鎖；および b)vH、VβまたはVδドメインからなる第2の抗原結合ドメインおよび第2の膜関連モジュール（MAM）からなる第2のポリペプチド鎖であって、ここで、第1の抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインおよび第2の抗原結合ドメインの相補的なvH、VβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成し、NTCRMは、少なくとも1つのシグナル伝達経路を活性化し、および／または少なくとも1つのシグナル伝達アダプターを動員することが可能である。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαから選択されるＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭまたは第２のＭＡＭは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαから選択されるＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、ＮＴＣＲＭは、ｉ）ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ｉｉ）ＴＣＲγおよびＴＣＲδ、またはｉｉｉ）プレＴＣＲαおよびＴＣＲβから選択される２つのＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３εから選択されるＣＤ３鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＴＣＲ鎖およびＣＤ３鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＣＤ３εの膜貫通ドメインを含まない。例示的な実施形態では、NTCRMは、以下の非TCRレセプターの1つ以上に由来するが、これらに限定されない： CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、 KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、ILT2。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２、あるいはそれらの変異体もしくは断片のうちの１つ以上から選択されるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（ＮＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第１の抗原結合ドメインと第１のＭＡＭとの間に第１のペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の抗原結合ドメインと第２のＭＡＭとの間に第２のペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーは、それぞれ長さが約５～約５００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。例示的な実施形態において、第1および／または第2のリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551)、またはTCR-Ig様リンカー(例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；またはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など)、またはその変異体もしくはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｖＬドメインはＩｇＣＬリンカーに結合され、ｖＨドメインはＩｇＣＨ１リンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ｖＬドメインはＩｇＣＨ１リンカーに結合され、ｖＨドメインはＩｇＣＬリンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ＶαドメインはＣα由来リンカー（例えば、ＴＣＲａ－Ｉｇ３）に結合され、ＶβドメインはＣβ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｂ－Ｉｇ３）に結合される。いくつかの実施形態では、ＶβドメインはＣα由来リンカー（例えば、ＴＣＲａ－Ｉｇ３）に結合され、ＶαドメインはＣβ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｂ－Ｉｇ３）に結合される。いくつかの実施形態では、ＶγドメインはＣγ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｇ－Ｉｇ３）に結合され、ＶδドメインはＣδ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｄ－Ｉｇ３）に結合される。いくつかの実施形態では、ＶγドメインはＣδ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｄ－Ｉｇ３）に結合され、ＶδドメインはＣγ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｇ－Ｉｇ３）に結合される。いくつかの実施形態では、可変ドメインおよびリンカーの他の構成が想定される。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、２つのポリペプチド鎖の発現、親和性および対合を増加させる変異を含む。一実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは相補鎖（例えば、ｖＬとｖＨ、ＶαとＶβ、またはＶγとＶδ）を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。いくつかの実施形態において、AABDは、単一vHドメイン（SVH）、単一vLドメイン（SVL）、vHHドメイン、単一ドメイン抗体、TCRの単一可変ドメイン（svd-TCR）、非免疫グロブリン抗原結合スキャフォールド、受容体のリガンド結合ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、自己抗原、アダプター結合ドメイン、Fc結合ドメイン、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントのうちの1つ以上から選択されるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は細胞表面抗原である。例示的な実施形態では、標的抗原は、表Ｂに列挙される抗原のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、タンパク質、炭水化物、および脂質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、CD2、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD70、CD123、CD138、CD179b、CLL-1、FLT3、クローディン18. 2、BCMA、GCC、MPL、SLAMF7、ROR1、ROR2、GPRC5D、FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16、またはHer2である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を含む複合体である。例示的な実施形態において、ペプチド／MHC複合体は、NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSAまたはgp100のうちの1つ以上に由来するペプチドを含む。
一実施形態では、ＳＡＲのｖＬドメインおよびｖＨドメインは、ＭＨＣ依存的に細胞内ペプチドを認識できるＴＣＲ模倣抗体に由来する。一実施形態では、ＳＡＲのＶαおよびＶβドメインは、細胞表面タンパク質を認識できるＨＬＡ非依存性ＴＣＲに由来する。一実施形態では、ＳＡＲは二重特異性または多重特異性である。一実施形態では、本開示は、ＭＨＣ制限されている２つ以上の抗原に結合できるＳＡＲを提供する。一実施形態では、ＳＡＲは、ＭＨＣ制限抗原および／またはＭＨＣ非制限抗原の２つ以上に結合することができる。一実施形態において、SARは、そのFvまたはTCR-Fvドメインを介してペプチド／MHC複合体に結合し、そのvLおよびvH、VαおよびVβ、またはVγおよびVδドメインのN末端またはN末端付近に結合している1つ以上のsvd-TCRを介して1つ以上のペプチド／MHC複合体に結合することができる。一実施形態において、SARは、そのFv、TCR-Fvドメインおよび/またはsvd-TCRドメインを介して1つ以上のペプチド/MHC複合体に結合し、そのVαおよびVβまたはVγおよびVδドメインのN末端またはN末端近傍に結合している1つ以上のAABD（例えば、vHH、FHVH、センチリンなど）を介して1つ以上の表面抗原と結合することができる。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、第１のポリペプチドは、第１のＭＡＭのＮ末端側に第１のヒンジドメイン（または接続ペプチド）またはその断片（例えば、膜貫通ドメイン）をさらに含み、および／または第２のＭＡＭは、第２のＭＡＭのＮ末端に第２のヒンジドメイン（または接続ペプチド）またはその断片（例えば、膜貫通ドメイン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、第１のＭＡＭ内の残基と第２のＭＡＭ内の残基との間のジスルフィド結合、および／または第１のヒンジドメイン内の残基と第２のヒンジドメイン内の残基との間のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、上記のSAR（単離されたSARなど）のいずれかによれば、第1のMAMは、第1のヒンジドメインのN末端に第1の相同抗原結合ドメインまたはそのフラグメントをさらに含み、および／または第2のポリペプチドは、第2のヒンジドメインのN末端に第2の相同抗原結合ドメインまたはそのフラグメントをさらに含む。一実施形態では、２つの相同抗原結合ドメインは、２つのヒンジドメインと同じ非Ｔ細胞受容体に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＭＡＭは、第１の膜貫通ドメインのＣ末端側に第１のサイトゾルドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のＭＡＭは、第２の膜貫通ドメインのＣ末端側に第２のサイトゾルドメインをさらに含む。一実施形態では、第１および／または第２のサイトゾルドメインは、１つまたは複数のＩＴＡＭを含む活性化ドメインである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、第１のポリペプチド鎖は、第１の膜貫通ドメインのＣ末端側に第１の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の膜貫通ドメインのＣ末端側に第２の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記のSAR（単離されたSARなど）のいずれかによれば、第1のポリペプチド鎖は、第1の膜貫通ドメインのC末端に1つ以上の共刺激性ドメインを含み、および／または第2のポリペプチド鎖は、第2の膜貫通ドメインのC末端に1つ以上の共刺激性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第１の抗原結合ドメインのＮ末端に第１のシグナル伝達ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の抗原結合ドメインのＮ末端に第２のシグナル伝達ペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態において、第1及び／又は第2のMAM及びNTCRMは、非T細胞受容体及び／又はシグナル伝達アダプターの膜貫通／膜固定ドメイン、任意の細胞質ドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメイン及び／又は任意の細胞外ドメインから構成される。
いくつかの実施形態において、第1及び／又は第2のMAM及びNTCRMは、単一の非T細胞受容体及び／又は単一のシグナル伝達アダプター又はその変異体に全て由来する、膜貫通／膜アンカードメイン、任意の細胞質ドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメイン及び／又は任意の細胞外ドメインから構成される。例示的な実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、すべてＣＤ３εに由来するヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインを含み、第２のポリペプチド鎖は、すべてＦｃＲγまたはＣＤ１６Ａに由来するヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第1および／または第2のMAMならびにNTCRMは、膜貫通／膜アンカードメイン、任意選択で細胞質ドメイン、任意選択でヒンジドメインおよび／または任意選択で細胞外ドメインが、1つ以上の異なる非T細胞受容体および／またはシグナル伝達アダプターまたはそのバリアントに由来して構成される。例示的な実施形態では、第1のポリペプチド鎖は、CD3ζヒンジドメイン、CD3ζ膜貫通ドメインおよびFcRγ細胞質ドメインからなり、第2のポリペプチド鎖は、DAP10ヒンジドメイン、41-BB共刺激ドメインおよびCD3ζ活性化ドメインからなる細胞質ドメインに結合したDAP10膜貫通ドメインからなる。
いくつかの実施形態では、２つの膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメイン、および／または任意の細胞外ドメインは、配列が同一であり、同じタンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、2つの膜貫通／膜アンカードメイン、任意の細胞質ドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメインおよび／または任意の細胞外ドメインは、配列が異なり、かつ／または異なるタンパク質由来である。。
いくつかの実施形態では、２つの膜貫通／膜アンカードメイン、任意選択のサイトゾルドメイン、任意選択の共刺激ドメイン、任意選択のヒンジドメイン、および／または任意選択の細胞外ドメインは、配列が異なり、かつ／または異なるタンパク質に由来する。
一実施形態において、本開示は、以下を含む標的抗原に特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）シグナル伝達受容体またはその変異体の細胞外ドメインに1つ以上の任意のリンカーを介して作動可能に連結された1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる第1の鎖；および、b）第2のシグナル伝達レセプターまたはその変異体の細胞外ドメインに、1つ以上の任意のリンカーを介して作動可能に連結された、1つ以上の異種抗原結合ドメインからなる第2の鎖。一実施形態では、一方または両方のシグナル伝達受容体は天然に存在する。一実施形態では、一方または両方のシグナル伝達受容体は、天然に存在する非Ｔ細胞受容体である。一実施形態において、第１の鎖上に存在する少なくとも１つの異種抗原結合ドメイン（例えば、ｖＬ、Ｖα、またはＶγなど）は、第１の鎖上に存在する少なくとも１つの異種抗原結合ドメイン（例えば、ｖＨ、Ｖβ、またはＶδなど）と会合する。 2番目の鎖は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール(例えば、FvまたはTCR-Fvなど)を形成する。いくつかの実施形態では、標的抗原は細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよびＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質）を含む複合体である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーは、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖の第１の任意のリンカーの残基と第２のポリペプチド鎖の第２の任意のリンカーの残基との間にジスルフィド結合が存在する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーは、それぞれ、長さが約５～約５００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551）、またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；もしくはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など）、またはその変異体もしくはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のシグナル伝達受容体は、少なくとも１つのシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζまたはＮＣＡＭなど）を動員できる非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を形成する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２からなる群から選択される。
一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）vL（抗体の軽鎖の可変ドメイン）、Va（TCRaまたはVαの可変ドメイン）、またはVg（TCRgまたはVγの可変ドメイン）ドメインからなり、非TCRシグナル受容体鎖またはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と任意のリンカーを介して操作可能に連結される第1の抗原結合ドメイン；および、b)第2の非TCRシグナル伝達レセプター鎖またはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と任意のリンカーを介して作動可能に連結している、vH（抗体の重鎖の可変ドメイン）、Vb（TCRbまたはVβの可変ドメイン）またはVdドメイン（TCRdまたはVδの可変ドメイン）である第2の抗原結合ドメイン、ここで、第一抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインと第二抗原結合ドメインのvH、VβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体鎖またはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結しているvLドメイン；および、b)任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と作動可能に連結しているvHドメイン、ここで、vLおよびvHドメインは、MHC依存性および／またはMHC非依存的に標的抗原に特異的に結合するFv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体またはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結しているVαドメイン；および、b）任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と作動可能に連結しているVβドメイン、ここで、VαおよびVβドメインは、MHC依存的にペプチド／MHC複合体に特異的に結合するTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体またはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結されたVγドメイン；および、b)任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の細胞外抗原結合ドメインの全体または部分と作動可能に連結しているVδドメイン、ここで、VγおよびVδドメインは、MHC依存的またはMHC非依存的に抗原に特異的に結合するTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。例示的な実施形態では、非ＴＣＲシグナル伝達受容体は、以下の１つ以上から選択されるが、これらに限定されない： ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ 、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１ 、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、 DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、 CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas 、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、および ILT2。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551）、またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；もしくはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など）、またはその変異体もしくはフラグメントからなる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。
一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）vL（抗体の軽鎖の可変ドメイン）、Va（TCRaまたはVαの可変ドメイン）、またはVg（TCRgまたはVγの可変ドメイン）ドメインからなり、非TCRシグナル受容体鎖またはその変異体の全体または部分的ヒンジドメインに任意のペプチドリンカーを介して操作可能に連結される、第1の抗原結合ドメイン；および、b)第2の抗原結合ドメインであって、任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプター鎖またはその変異体の全体または部分的ヒンジドメインに作動可能に連結される、vH（抗体の重鎖の可変ドメイン）、Vb（TCRbまたはVβの可変ドメイン）またはVdドメイン（TCRdまたはVδの可変ドメイン）、ここで、第一抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインと第二抗原結合ドメインのvH、VβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体鎖またはその変異体の全体または部分的ヒンジドメインに任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結されたvLドメイン；および、b)任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の全体的または部分的ヒンジドメインに作動可能に連結しているvHドメイン、ここで、vLおよびvHドメインは、MHC依存性および／またはMHC非依存的に標的抗原に特異的に結合するFv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）任意のペプチドリンカーを介して、非TCRシグナル受容体またはその変異体のヒンジドメインの全体または部分と作動可能に連結しているVαドメイン；および、b）第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の全体的または部分的ヒンジドメインに任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結しているVβドメインであって、ここで、VαおよびVβドメインは、MHC依存的にペプチド／MHC複合体に特異的に結合するTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）任意のペプチドリンカーを介して、非TCRシグナル受容体またはその変異体のヒンジドメインの全体または部分と作動可能に連結しているVγドメイン；および、b)任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の全体的または部分的なヒンジドメインと作動可能に連結しているVδドメイン、ここで、VγおよびVδドメインは、MHC依存的またはMHC非依存的に抗原に特異的に結合するTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。例示的な実施形態では、非ＴＣＲシグナル伝達受容体は、以下の１つ以上から選択されるが、これらに限定されない： ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ 、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１ 、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、 DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、 CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas 、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、および ILT2。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のペプチドリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551)、またはTCR-Ig様リンカー(例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；またはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など)、またはそれらのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。
一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）vL（抗体の軽鎖の可変ドメイン）、Va（TCRaまたはVαの可変ドメイン）、またはVg（TCRgまたはVγの可変ドメイン）ドメインからなり、非TCRシグナル受容体鎖またはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して操作可能に連結される、第1の抗原結合ドメイン；および、b)第2の抗原結合ドメインであって、任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプター鎖またはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分と作動可能に連結している、vH（抗体の重鎖の可変ドメイン）、Vb（TCRbまたはVβの可変ドメイン）またはVdドメイン（TCRdまたはVδの可変ドメイン）、ここで、第一抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインと第二抗原結合ドメインのvH、VβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体鎖またはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結しているvLドメイン；および、b)任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分と作動可能に連結しているvHドメイン、ここで、vLおよびvHドメインは、MHC依存性および／またはMHC非依存的に標的抗原に特異的に結合するFv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体またはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメイン全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結されたVαドメイン；および、b）任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分と作動可能に連結しているVβドメインであって、ここで、VαおよびVβドメインは、MHC依存的にペプチド／MHC複合体に特異的に結合するTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体またはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメイン全体または部分と任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結されたVγドメイン；および、b）任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプターまたはその変異体の膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分と作動可能に連結しているVδドメイン、ここで、VγドメインおよびVδドメインは、MHC依存的またはMHC非依存的に抗原に特異的に結合するTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。例示的な実施形態では、非ＴＣＲシグナル伝達受容体は、以下の１つ以上から選択されるが、これらに限定されない： ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ 、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１ 、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、 DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、 CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas 、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、および ILT2。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のペプチドリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551）、またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；もしくはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など）もしくはそのフラグメントからなる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。
一実施形態において、本開示は、以下を含む抗原と特異的に結合する二重鎖SARを提供する；a）非TCRシグナル受容体鎖またはシグナル伝達アダプターの膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分またはその変異体またはフラグメントに任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結された第1の抗原結合ドメイン；および、b)任意のペプチドリンカーを介して、第2の非TCRシグナル伝達レセプター鎖またはシグナル伝達アダプターの膜貫通／膜アンカリングドメインの全体または部分またはその変異体またはフラグメントに作動可能に連結している第2の抗原結合ドメイン。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。 いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、それぞれの標的抗原に特異的に結合する。一実施形態では、抗原結合ドメインの一方または両方は、自律抗原結合ドメイン（例えば、AABD、例えば、vHH、FHVH、SVH、センチリン、DARPIN、svd-TCR、アダプター、アダプター結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、リガンドの受容体結合ドメインなど）である。一実施形態では、抗原結合ドメインの一方または両方は、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）、ｓｃＦｖ、ＴＣＲまたはｓｃＴＣＲを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、第１および／または第２の抗原結合ドメインのＮ末端またはＮ末端付近に結合する１つまたは複数の自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）をさらに含む。一実施形態では、第１および／または第２のシグナル伝達鎖は、活性化ドメインおよび任意の共刺激ドメインを含むサイトゾルドメインを含む。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、元のシグナル伝達受容体（例えば、非Ｔ細胞受容体）の全体または部分的な結合特性を保持し、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインによって付与される結合特性も獲得する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、元のシグナル伝達受容体の全体的または部分的な結合特性を保持する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、１つまたは複数の異種抗原結合ドメインによって付与される結合特性をさらに獲得する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、２つのシグナル伝達受容体のシグナル伝達特性を保持する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、単独で活性化された場合には２つのシグナル伝達受容体のいずれによっても示されない新たなシグナル伝達特性を獲得する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、単独で活性化された場合に、２つのシグナル伝達受容体のシグナル伝達特性に付加的な新たなシグナル伝達特性を獲得する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、単独で活性化された場合に、２つのシグナル伝達受容体のシグナル伝達特性の相乗的である新たなシグナル伝達特性を獲得する。
一実施形態では、二本鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖を含むシグナル伝達受容体は、単一の膜貫通ドメインを有するＩ型膜タンパク質である。一実施形態では、シグナル伝達受容体は、天然に存在するシグナル伝達受容体である。一実施形態では、シグナル伝達受容体は非ＴＣＲシグナル伝達受容体である。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、シグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２など）を動員することができる。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、活性化ドメインを含むシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、１つまたは複数のＩＴＡＭを含むシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、１つまたは複数のＩＴＩＭを含むシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、共刺激ドメインを含むシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは天然に存在する。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは非天然に存在する。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、細胞内シグナル伝達経路（例えば、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋなど）を活性化するシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、細胞内シグナル伝達経路（例えば、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋなど）を阻害するシグナル伝達アダプターを動員することができる。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖が共刺激ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、活性化ドメインおよび共刺激ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖が細胞内活性化ドメインを含む。例示的な実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、シグナル伝達アダプターに由来する細胞内活性化ドメインを含む。例示的な実施形態では、二本鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２に由来する細胞内活性化ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖に存在する活性化ドメインは、１つまたは複数のＩＴＡＭを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、１つまたは複数のＩＴＡＭを含む活性化ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、２つ以上のＩＴＡＭモチーフを含む活性化ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、単一のＩＴＡＭを含む活性化ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖はＩＴＡＭを欠いている。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、チロシンベースのモチーフ（ＹＩＮＭ）を含む活性化ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、ＰＩ３Ｋおよび／またはＧｒｂ２のｐ８５サブユニットを動員する活性化ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖は、ＮＦＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＮＦ－κＢおよび／またはＥＲＫシグナル伝達経路のうちの１つまたは複数を活性化する活性化ドメインを含む。
一実施形態では、ＳＡＲは細胞内阻害ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＰＤ１に由来する細胞内阻害ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲの阻害ドメインは、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含む。
一実施形態では、SARは、シグナル伝達アダプターを動員することができる。例示的な実施形態では、SARはCD3ζ、FcRγ、DAP10およびDAP12の群から選択される1つ以上のシグナル伝達アダプターを動員することができるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本開示は、少なくとも１つがシグナル伝達アダプターを動員できる２つのポリペプチド鎖に、任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、それぞれがシグナル伝達アダプターを動員することができる２つのポリペプチド鎖に、任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。一実施形態では、一方または両方のポリペプチドは、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、両方のポリペプチドが膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドはサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、両方のポリペプチドがサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、本開示は、少なくとも１つがシグナル伝達アダプターを動員できる２つのポリペプチド鎖に、任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の細胞内活性化ドメインを含む２つのポリペプチド鎖に任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、少なくとも１つが細胞内活性化ドメインを含む２つのポリペプチド鎖に、任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、シグナリングアダプタは非ＴＣＲ／ＣＤ３シグナリングアダプタである。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＴＣＲ／ＣＤ３シグナル伝達複合体の構成要素ではない。一実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは非天然シグナル伝達アダプター、すなわち自然界には存在しないシグナル伝達アダプターである。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは１つ以上のＩＴＡＭを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは１つ以上のＩＴＩＭを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ジスルフィド結合した二量体タンパク質である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターはＩ型膜貫通タンパク質である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、シグナル伝達タンパク質、例えばプロテインキナーゼ、例えばZAP70を動員することができる。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、１つ以上の細胞シグナル伝達経路、例えば、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋなどを活性化することができる。
一実施形態では、二重鎖SARの2つの鎖を構成する2つの非TCRシグナル伝達レセプター鎖は、同じタイプおよび配列である（例えば、両方のシグナル伝達鎖は、CD16A、NKp46またはNKp30などの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる）。例示的なそのような二重鎖SARは、SEQ ID NO: 6383-6293、4675、4696および8344で表される。一実施形態では、一実施形態では、二重鎖SARの2つのシグナル伝達鎖は異なるタイプである(例えば、一方の鎖はCD16Aの細胞外、膜貫通および細胞質ドメインからなり、第2の鎖はNKp30の細胞外、膜貫通および細胞質ドメインからなるか、またはCD16Aのヒンジ、膜貫通および細胞質ドメインからなり、第2の鎖はCD3ζなどのヒンジ、膜貫通および細胞質ドメインからなる）。このようなＳＡＲの例は、配列番号４６９５および４６７０によって表される。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つのシグナル伝達鎖は、同じ受容体に由来する（例えば、両方の鎖がＣＤ１６Ａに由来する）。このようなＳＡＲの例は、配列番号４６７６によって表される。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つのシグナル伝達鎖は、異なる受容体に由来する（例えば、１つの鎖はＮＫｐ４４に由来し、第２の鎖はＮＫｐ３０に由来するなど）。このようなＳＡＲの例は、配列番号４７１３によって表される。
一実施形態では、本開示は、非ＴＣＲ受容体シグナル伝達鎖（例えば、ＣＤ１６Ａ）に由来する第１の鎖と、シグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３εまたはＦｃＲγ）に由来する第２の鎖とを含む二重鎖ＳＡＲを提供する。このようなＳＡＲの例は、配列番号４６７０によって表される。
一実施形態では、二重鎖SARは、非TCRレセプターシグナル伝達鎖（例えば、CD16A）に由来する第一の鎖と、TCRシグナル伝達鎖（例えば、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、preTCRαの定数鎖またはその変異体もしくは断片）に由来する第二の鎖とから構成され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、１つの非ＴＣＲモジュール（またはＮＴＣＲＭ）および１つのＴＣＲモジュール（またはＴＣＲＭ）を含む二重鎖ＳＡＲを提供する。このようなＳＡＲの例は、配列番号４７０８～４７１０によって表される。
一実施形態では、異種抗原結合ドメインのvL／vH、Vα／Vβ、Vγ／Vδ鎖と非TCRシグナル伝達鎖との間の任意のリンカーは、表13に表されるIg様リンカー（SEQ ID NO（DNA）1142～1175およびSEQ ID NO（PRT）：3536～3569）である。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの構築に使用されるシグナル伝達受容体は、免疫細胞の表面に発現される任意の受容体である。一実施形態では、シグナル伝達受容体は、免疫細胞の表面に発現される天然に存在するシグナル伝達受容体のシグナル伝達鎖である。例示的な実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、顆粒球およびＢ細胞から選択されるが、これらに限定されない。本開示の二重鎖SARの構築に使用することができる例示的なシグナル受容体としては、CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3．KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、 CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、Siglec3、Siglec-7、Siglec-9など、またはその変異体。さらなる実施形態では、自律抗原結合ドメイン（例えば、完全ヒトｖＨドメイン、ｖＨＨ、単鎖ＴＣＲなど）、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン（例えば、セントイリン、アフィボディなど）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、ＴＰＯ、 NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YAなど）、および受容体の細胞外ドメイン（たとえば、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、CD16Aなど）、アダプター結合ドメイン（たとえば、EZip、RZip、E4、R4など） ）は、ＳＡＲに追加の抗原結合能力を与えるために、ＳＡＲのｖＬ、ｖＨ、Ｖα、Ｖβ、Ｖγ、またはＶδ鎖のアミノ末端またはアミノ末端近くに機能的に連結することができる。
いくつかの実施形態では、標的抗原に特異的に結合するSAR（単離されたSARなど）が提供され、ここでSARは：a）vL、VαまたはVγドメインからなる第1の抗原結合ドメインおよび第1の膜関連モジュール（MAM）を含む第1のポリペプチド鎖；および、b）vH、VβまたはVδドメインからなる第2の抗原結合ドメインおよび第2の膜関連モジュール（MAM）を含む第2のポリペプチド鎖を含み、ここで、第1の抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインおよび第2の抗原結合ドメインの相補的なvH、VβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび／または第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成する。一実施形態において、SARは、少なくとも1つのシグナル伝達経路を活性化し、及び／又は少なくとも1つのシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態において、第1および／または第2のMAMは、以下のシグナル伝達アダプターのうちの1つまたは複数に由来するが、これらに限定されない： CD3ζ、FcRγ。DAP10もしくはDAP12、またはそれらの変異体もしくはフラグメント。一実施形態では、NTCRMは以下のシグナル伝達アダプターの1つ以上から構成されるが、これらに限定されない： CD3ζ、FcRγ。DAP10またはDAP12。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（ＮＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第１の抗原結合ドメインと第１のＭＡＭとの間に第１のペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の抗原結合ドメインと第２のＭＡＭとの間に第２のペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーは、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーは、それぞれ、長さが約５～約５００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの親和性および鎖対合を増大させる変異を含む。いくつかの実施形態において、第1および／または第2のリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551）、またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；もしくはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など）もしくはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。一実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは相補鎖（例えば、ｖＬとｖＨ、ＶαとＶβ、またはＶγとＶδ）を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は細胞表面抗原である。例示的な実施形態では、標的抗原は、表Ｂに列挙される抗原のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、タンパク質、炭水化物、および脂質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＬＬ －１、ＦＬＴ３、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＧＣＣ、ＭＰＬ、ＳＬＡＭＦ７、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、 FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16、または Her2。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を含む複合体である。例示的な実施形態において、ペプチド／MHC複合体は、NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSAまたはgp100のうちの1つ以上に由来するペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、第１のＭＡＭは、第１の膜貫通ドメインに対してＮ末端側に第１のヒンジドメインまたはその断片をさらに含み、第２のＭＡＭは、第２のヒンジドメインまたは第２のヒンジドメインまたはその断片をさらに含む。そのＮ末端から第２の膜貫通ドメインまでの断片。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＲＭは、第１のヒンジドメイン内の残基と第２のヒンジドメイン内の残基との間にジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態では、第１のＭＡＭは、第１の膜貫通ドメインのＣ末端側に第１のサイトゾルドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のＭＡＭは、第２の膜貫通ドメインのＣ末端側に第２のサイトゾルドメインをさらに含む。一実施形態では、第１および／または第２のサイトゾルドメインは、１つまたは複数のＩＴＡＭを含む活性化ドメインである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、第１のポリペプチド鎖は、第１の膜貫通ドメインのＣ末端側に第１の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の膜貫通ドメインのＣ末端側に第２の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第１の抗原結合ドメインのＮ末端に第１のシグナル伝達ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の抗原結合ドメインのＮ末端に第２のシグナル伝達ペプチドをさらに含む。
一実施形態では、本開示は、ａ）ｖＬ（抗体の軽鎖の可変ドメイン）、Ｖａ（ＴＣＲαまたはＶαの可変ドメイン）、または任意のペプチドリンカーを介して、シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的なヒンジドメインに機能的に連結されるＶｇ（ＴＣＲｇまたはＶγの可変ドメイン）ドメイン；およびｂ）第２の抗原結合ドメイン、任意のペプチドを介して作動可能に連結された、ｖＨ（抗体の重鎖の可変ドメイン）、Ｖｂ（ＴＣＲｂまたはＶβの可変ドメイン）、またはＶｄドメイン（ＴＣＲｄまたはＶδの可変ドメイン）第二のシグナル伝達アダプターまたはその変異体のヒンジドメイン全体または部分的リンカーであり、第一の抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインと第二の抗原結合ドメインの相補的vH、VβまたはVδドメインが形成される標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュール。一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的ヒンジドメインに任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結されたｖＬドメイン；およびｂ）任意のペプチドリンカーを介して、第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的なヒンジドメインに作動可能に連結されるｖＨドメインであって、ここで、ｖＬおよびｖＨドメインは、特異的に結合するＦｖ様抗原結合モジュールを形成する。 MHC 依存性および/または MHC 非依存性の方法で標的抗原を検出します。一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的ヒンジドメインに任意のペプチドリンカーを介して機能的に連結されたＶαドメイン；およびｂ）任意のペプチドリンカーを介して、第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的なヒンジドメインに作動可能に連結されたＶβドメインであって、ＶαおよびＶβドメインは、特異的に結合するＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールを形成する。 MHC依存的な方法でのペプチド/MHC複合体。一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的ヒンジドメインに任意のペプチドリンカーを介して機能的に連結されたＶγドメイン； ｂ）任意のペプチドリンカーを介して、第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的なヒンジドメインに作動可能に連結されたＶδドメインであって、ＶγおよびＶδドメインは、特異的に結合するＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールを形成する、Ｖδドメイン。 MHC 依存性または MHC 非依存性の方法で抗原に結合します。例示的な実施形態では、シグナル伝達アダプターは、以下の１つ以上から選択されるが、これらに限定されない： ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０もしくはＤＡＰ１０、またはその変異体もしくは断片。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（ＮＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、個別に、免疫グロブリン（例えば、配列番号３５３６～３５５１）に由来するＩｇ様リンカー（例えば、ＩｇＣＬ、ＩｇＣＨ１など）またはＴＣＲ－Ｉｇ様リンカーを含む。 （例えば、TCRb-Ig3、配列番号3560；TCRa-Ig3、配列番号3562；TCRg-Ig3、配列番号3566；またはTCRd-Ig3、配列番号3568など）または変異体、またはその断片。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。 いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは、１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む。例示的な実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、２Ｂ４、ＣＤ２７、ＣＤ８１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭもしくはＩＣＯＳからの共刺激ドメイン、あるいは変異体もしくは断片を含む。その。 いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリン（例えば、配列番号３５３６～３５５１）またはＴＣＲ－Ｉｇ様由来のＩｇ様リンカー（例えば、ＩｇＣＬ、ＩｇＣＨ１など）を含む。リンカー（例えば、TCRb-Ig3、配列番号3560；TCRa-Ig3、配列番号3562；TCRg-Ig3、配列番号3566；またはTCRd-Ig3、配列番号3568など）またはフラグメントその。 いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、第１のポリペプチド鎖（例えば、ｖＬ、ＶαまたはＶγ）のＮ末端またはＮ末端近くに結合する１つまたは複数の自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）をさらに含む。 ／または第２（例えば、ｖＨ、ＶβまたはＶδ）抗原結合ドメイン。
一実施形態では、本開示は、ａ）任意のペプチドリンカーを介して全体または部分的な膜貫通／膜に作動可能に連結された、ｖＬ、Ｖα、またはＶγドメインを含む第１の抗原結合ドメインを含む抗原に特異的に結合する二重鎖ＳＡＲを提供する。シグナル伝達アダプターまたはその変異体のアンカードメイン； ｂ）第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに任意のペプチドリンカーを介して作動可能に連結されたｖＨ、ＶβまたはＶδドメインを含む第２の抗原結合ドメインであって、ここで、ｖＬ、第一の抗原結合ドメインのVαまたはVγドメインと、第二の抗原結合ドメインの相補的vH、VβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様抗原結合モジュールを形成する。一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに任意のペプチドリンカーを介して機能的に連結されたｖＬドメイン； ｂ）任意のペプチドリンカーを介して、第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに機能的に連結されているｖＨドメインであって、ｖＬおよびｖＨドメインは、特異的に結合するＦｖ様抗原結合モジュールを形成する。 MHC依存性および/またはMHC非依存性の様式で標的抗原に結合します。一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに任意のペプチドリンカーを介して機能的に連結されたＶαドメイン； ｂ）任意のペプチドリンカーを介して第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに作動可能に連結されたＶβドメインであって、ＶαおよびＶβドメインがＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールを形成し、 MHC依存的にペプチド/MHC複合体に特異的に結合します。一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに任意のペプチドリンカーを介して機能的に連結されたＶγドメイン； ｂ）任意のペプチドリンカーを介して第２のシグナル伝達アダプターまたはその変異体の全体または部分的な膜貫通／膜アンカーリングドメインに作動可能に連結されたＶδドメインであって、ＶγおよびＶδドメインがＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールを形成するＶδドメインMHC依存性またはMHC非依存性の様式で抗原に特異的に結合します。例示的な実施形態では、シグナル伝達アダプターは、以下の１つ以上から選択されるが、これらに限定されない： ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０もしくはＤＡＰ１２、またはそれらの変異体もしくは断片。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（ＮＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは、１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む。例示的な実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、２Ｂ４、ＣＤ２７、ＣＤ８１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭもしくはＩＣＯＳからの共刺激ドメイン、あるいは変異体もしくは断片を含む。その。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリン（例えば、配列番号３５３６～３５５１）またはＴＣＲ－Ｉｇ様由来のＩｇ様リンカー（例えば、ＩｇＣＬ、ＩｇＣＨ１など）を含む。リンカー（例えば、TCRb-Ig3、配列番号3560；TCRa-Ig3、配列番号3562；TCRg-Ig3、配列番号3566；またはTCRd-Ig3、配列番号3568など）または変異体またはその断片。 いくつかの実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、第１のポリペプチド鎖（例えば、ｖＬ、ＶαまたはＶγ）のＮ末端またはＮ末端近くに結合する１つまたは複数の自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）をさらに含む。 ／または第２（例えば、ｖＨ、ＶβまたはＶδ）抗原結合ドメイン。
一実施形態では、本開示は、ａ）シグナル伝達アダプターの１つの鎖（またはシグナル伝達鎖）のアミノ末端またはアミノ末端近くに任意のリンカーを介して作動可能に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むＳＡＲを提供する。 ) またはその変形。およびｂ）任意のリンカーを介して、シグナル伝達アダプター（またはシグナル伝達鎖）またはその変異体の第２の鎖のアミノ末端またはアミノ末端付近に機能的に連結された１つまたは複数の異種抗原結合ドメイン。一実施形態では、そのようなＳＡＲは、元のシグナリングアダプタ（またはシグナリングチェーン）のシグナリング能力を保持する。一実施形態では、ＳＡＲは、異種抗原結合ドメインによって与えられる結合能力も獲得する。例示的な実施形態では、シグナル伝達アダプターは、細胞（例えば、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞）の原形質膜上で発現できる任意のシグナル伝達アダプター（またはシグナル伝達鎖）である。例示的な実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、顆粒球またはＢ細胞から選択されるが、これらに限定されない。本開示のＳＡＲの構築に使用することができる例示的なシグナル伝達アダプター（またはシグナル伝達鎖）としては、ＣＤ３ｚ（ＣＤ３ζ）、ＦｃＲγ（ＦｃεＲＩγ）、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２など、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、１つ以上の異種抗原結合ドメインが、シグナル伝達アダプターの１つ以上の鎖の細胞外ドメイン（例えば、ヒンジまたはスペーサードメイン）に機能的に連結されているＳＡＲを提供する。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体の構成要素であるシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３εなど）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、 ＴＣＲ複合体のＴＣＲα鎖、β鎖、γ鎖、および／またはδ鎖と相互作用するシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体のＴＣＲα、β、γおよび／またはδ鎖と相互作用しないシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、膜貫通領域またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδにおける正に荷電した残基（リジンまたはアルギニン）と相互作用する、その膜貫通ドメインに保存されたアスパラギン酸残基を有するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、その膜貫通ドメインに保存されたアスパラギン酸残基を欠くシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲ複合体の構成要素ではないシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３シグナル伝達アダプター（ＮＣＡＭ）である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３εまたはその変異体ではない。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、ＳＡＲは、細胞シグナル伝達を活性化するシグナル伝達アダプター（例えば、 ＣＤ３ζ ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、細胞シグナル伝達を阻害するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、 １つ以上のＩＴＡＭモチーフを有するシグナル伝達アダプター（例えば、 ＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、２つ以上のＩＴＡＭモチーフを有するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、単一のＩＴＡＭモチーフを有するシグナル伝達アダプター（例えば、ＦｃＲγ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、ＩＴＡＭモチーフを欠くシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、チロシンベースのモチーフ（ＹＩＮＭ）を含むシグナル伝達アダプター（例えば、ＤＡＰ１０）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、 ＰＩ３Ｋおよび／またはＧｒｂ２のｐ８５サブユニットを動員するシグナル伝達アダプター（例えば、ＤＡＰ１０）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、天然型のジスルフィドリンカー二量体であるシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、その天然の形態ではジスルフィドリンカー二量体ではない。一実施形態では、ＳＡＲは、天然状態では膜貫通領域に位置する鎖間ジスルフィド結合を含むシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、天然状態では膜貫通領域に位置しない鎖間ジスルフィド結合を含むシグナル伝達アダプター（例えば、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２）を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、天然状態ではその細胞外領域に位置する鎖間ジスルフィド結合を含むシグナル伝達アダプターを含む。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインの長さは１０アミノ酸未満である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、長さが８アミノ酸未満である。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、長さが１０アミノ酸を超える。一実施形態では、シグナル伝達アダプターの細胞外ドメインは、１５アミノ酸を超える長さである。
いくつかの実施形態では、上記のＳＡＲ（単離されたＳＡＲなど）のいずれかによれば、 ＳＡＲは、タンパク質のリン酸化を誘導するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、タンパク質の脱リン酸化を誘導するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｚａｐ７０と相互作用するシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｚａｐ７０と相互作用しないシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つの鎖は、同一のシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζおよびＣＤ３ζ）を含む。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つの鎖は、同一ではないシグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３εとＦｃＲγ、またはＣＤ３εとＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１０とＤＡＰ１２など）を含む。
いくつかの実施形態において、上述したシグナル伝達アダプターを含む二重鎖SAR（単離されたSARなど）のいずれかによれば、二重鎖SARの1つまたは両方の鎖は、共刺激ドメイン（例えば、4-1BB、CD28、2B4、OX40などに由来する共刺激ドメイン）を含むシグナル伝達アダプターを含む。一実施形態では、二重鎖SARの片方の鎖または両方の鎖は、活性化ドメイン（例えば、CD3ζ活性化ドメイン）に作動的に連結された共刺激ドメイン（例えば、4-1BB、CD28、2B4、OX40などに由来する共刺激ドメイン）を含むシグナル伝達アダプターを含んでなる。CD28および4-1BBのコスティミュレイトリードメインに連結される例示的なCD3ζシグナルアダプターは、それぞれSEQ ID NO:3493および3494に示されている。CD3ζの活性化ドメインと融合したOX40の共刺激ドメインからなる例示的なSARは、SEQ ID NO: 4460および4479で表される。一実施形態では、二重鎖SARの一方または両方の鎖は、2つの異なるシグナル伝達アダプターの細胞質ドメインの融合を含むシグナル伝達アダプターからなる。DAP10とCD3ζの細胞質ドメインの融合を含む鎖からなる例示的なこのようなSARは、SEQ ID NO: 4460で表される。 一実施形態において、SARは、鎖間ジスルフィド結合を消失させる変異を有するCD3z（またはCD3ζ）、FcRγ、DAP10およびDAP12の変異体からなるシグナル伝達アダプターを含む。例示的なこのようなシグナル伝達アダプターは、SEQ ID NO:3747、3753、3760、3817および3820で表される。 一実施形態において、シグナル伝達鎖は、それらのITAMモチーフに1つ以上の変異を有するCD3z、FcRγ、DAP10およびDAP12の変異体（例えば、CD3zのIXX変異体）からなる。例示的なこのようなシグナル伝達アダプターは、SEQ ID NO: 9824で表される。
本開示の二本鎖ＳＡＲの構築に使用できる例示的な抗原結合ドメインには、抗体の可変ドメイン（例えば、ｖＬ、ｖＨ）、 ＴＣＲの可変ドメイン（例えば、Ｖａ、Ｖｂ、ＶｇまたはＶｄ鎖）が含まれる。など）、抗体、抗体断片（例えば、Fab、Fab2）、自律抗原結合ドメイン（例えば、完全ヒトvHドメイン、vHH、単鎖TCR、svd-TCRなど）、scFv、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン(例えば、セントイリン、アフィボディ、ZIPドメイン、アダプターなど)、リガンド、受容体の細胞外ドメイン、自己抗原、TCR、HLA非依存性TCR、TCRの可変ドメイン(例えば、Va 、 Vb、Vg、さらなる実施形態では、自律的抗原結合ドメイン（例えば、完全ヒトｖＨドメイン、ｖＨＨ、単鎖ＴＣＲなど）、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン（例えば、セントイリン、アフィボディなど） 。 ）、リガンド（例えば、APRIL、TPO、NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YAなど）、および受容体の細胞外ドメイン（例えば、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、CD16Aなど）、アダプター結合ドメイン（例えば、ＥＺｉｐ、ＲＺｉｐ、Ｅ４、Ｒ４など）は、ＳＡＲのｖＬ、ｖＨ、Ｖα、Ｖβ、Ｖγ、またはＶδ鎖のアミノ末端またはアミノ末端近くに機能的に結合して、追加の抗原結合能力をＳＡＲに付与することができる。 SAR。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つのシグナル伝達アダプターは同じタイプである（例えば、両方の鎖がＣＤ３εに由来する）。このようなＳＡＲの例は、配列番号４７０２によって表される。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲを構成する２つのシグナル伝達アダプターは、異なるタイプのものである（例えば、１つのシグナル伝達アダプターはＣＤ３εに由来し、第２のアダプターはＦｃＲγなどに由来する） . )。このようなＳＡＲの例は、配列番号６７３３によって表される。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、非ＴＣＲ受容体シグナル伝達鎖（例えば、ＣＤ１６Ａ）に由来する１つの鎖と、シグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγ）に由来する別の鎖とを含み得る。このようなＳＡＲの例は、配列番号４６７０によって表される。
一実施形態では、二重鎖ＳＡＲは、シグナル伝達アダプター（例えば、ＣＤ３ε）を含む１つの鎖と、ＴＣＲ定常鎖（例えば、ＴＣＲα－Ｔ４８Ｃ）を含む別の鎖とを含み得る。
一実施形態では、任意のリンカーは長いリンカーである。一実施形態では、異種抗原結合ドメインのｖＬ／ｖＨ、Ｖα／Ｖβ、Ｖγ／Ｖδ鎖と非ＴＣＲシグナル伝達鎖との間の任意のリンカーは、Ｉｇ様リンカー（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２～１１７５）である。および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６～３５６９）を表１３に示す。
いくつかの実施形態において、本開示は、 Ｔ細胞の標的認識特性および機能を有する、Ｔ細胞ではない細胞を提供する。一実施形態において、本開示は、細胞にＴ細胞受容体様の標的認識および／またはシグナル伝達を与える受容体を発現する、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）を提供する。一実施形態では、本開示は、細胞にＴ細胞受容体様の標的認識および／またはシグナルを与える二重鎖または多重鎖受容体を発現する、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）を提供する。変換。一実施形態では、二重鎖または多重鎖受容体は、少なくとも２つの膜関連ドメイン（例えば、膜貫通ドメインまたは膜アンカードメイン）を含む。一実施形態では、二重鎖または多重鎖受容体は、少なくとも２つの膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体様認識は、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド標的への特異的結合を含む。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、Ｔ細胞鎖の発現を欠き、および／または機能的ＴＣＲ鎖の発現を欠く。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、機能的なＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現を欠いている。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、 ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、およびＣＤ３δ、またはそれらの変異体もしくは断片のうちの１つ以上の発現を欠いている。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、１つ以上のＣＤ３ε、ＣＤ３γおよびＣＤ３δ鎖またはその変異体もしくは断片を外因的に発現するように操作されていない。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、１つ以上のＴＣＲ鎖またはその変異体もしくは断片を外因的に発現するように操作されていない。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、ＣＤ３アゴニスト抗体によって活性化されない。一実施形態では、Ｔ細胞ではない細胞（すなわち、非Ｔ細胞）は、ＯＫＴ３抗体によって活性化されない。
一実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞、ｇ－ＮＫ細胞、記憶様ＮＫ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、ｉＰＳＣ、修飾ＨＬＡから生成される、Ｔ細胞受容体様の標的認識を有する非Ｔ細胞を提供する。欠損iPSC、iPSC由来NK細胞、iPSC由来T細胞、B細胞、マクロファージ/単球、顆粒球、樹状細胞、不死化細胞株、不死化NK細胞株、NK92細胞株、NK92MI細胞株またはその誘導体。一実施形態において、本開示は、機能的Ｔ細胞ではない細胞への単一受容体の導入後に生成される、Ｔ細胞受容体様標的認識を有する非Ｔ細胞を提供する。一実施形態では、本開示は、４つのＣＤ３鎖、すなわちＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３εの異所性発現を伴う遺伝子改変なしに生成される、Ｔ細胞受容体様の標的認識を有する非Ｔ細胞を提供する。機能的なT細胞。
例えば、ＳＡＲ、例えば、ｕＴＣＲ－ＳＡＲ）を発現する非Ｔ細胞は、標的抗原に特異的に結合すると、少なくとも１つのシグナル伝達アダプターの動員を引き起こす。一実施形態では、二重鎖受容体を発現する非Ｔ細胞は、標的抗原に特異的に結合すると、少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性化をもたらす。例示的な実施形態では、シグナル伝達経路は、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＰＩ３Ｋ、またはＥＲＫ経路の群から選択されるが、これらに限定されない。一実施形態において、二重鎖受容体を発現する非Ｔ細胞は、標的抗原に結合すると、少なくとも１つの生物学的活性の活性化をもたらす。一実施形態では、生物活性は、細胞の活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌、食作用、遊走、または細胞毒性の群から選択されるが、これらに限定されない。
別の態様では、本開示は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）制限抗原特異的細胞傷害性を有する、限定されないが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの修飾細胞を提供する。 ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、およびＭＨＣ様分子のいずれかであり得る。 MHC様分子の非限定的な例はHLA-Eである。
、２つの膜貫通／膜関連ドメインおよびＴＣＲ様抗原認識を有する二重鎖受容体を発現する、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージなどであるがこれらに限定されない修飾細胞を産生するための方法を提供する。 。この方法は、細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージ）を提供すること、およびＴＣＲ様結合特性を有する抗原特異的受容体を発現するように細胞を改変することを含む。改変されたセルは任意のセルであり得る。一般に使用される非限定的な例は、NK-92細胞、YTS細胞、および初代ヒトNK細胞である。
別の実施形態では、本開示は、任意の細胞型で発現可能なTCR様結合特性を有するSARのクラスを提供する。このようなTCR様結合特性を有し、普遍的な発現をするSARは、Universal TCR-SARまたはuTCR-SARまたはuTCRと称される。本明細書で提供されるのは、T細胞だけでなく、NK細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、内皮細胞、上皮細胞などを含むがこれらに限定されない任意の他の細胞でも発現可能な、TCRの可変抗原結合ドメイン（例えば、Va/Vα、Vb/Vβ、Vg/Vγ、Vd/Vδなど）からなる単鎖および多鎖（例えば、二重鎖）uTCR-SARである。一実施形態において、uTCRを発現する細胞は、細胞増殖、活性化、サイトカイン分泌、細胞傷害性の増加により、その抗原を発現する標的細胞に応答する。一実施形態において、標的抗原は、MHC複合体の一部として提示されるペプチドである。一実施形態では、標的抗原は脂質である。uTCRは、そのTCR結合ドメインがHLA非依存性TCRに由来する場合、非MHC制限抗原にも応答し得る。一実施形態において、本開示は、MHC複合体によって提示された場合に細胞内ペプチドに結合する特性を含む、TCR様結合特性を有する二重鎖レセプターを機能的に発現するT細胞ではない細胞を提供する。
、非ＴＣＲシグナル伝達受容体の全部または一部の細胞外ドメインに任意のリンカーを介して作動可能に連結されたｓｃＴＣＲ、ｓｖｄ－ＴＣＲもしくはＴＣＲ模倣ｓｃＦｖまたはその断片を含む１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む単鎖ｕＴＣＲ－ＳＡＲを提供する。 。いくつかの実施形態では、本開示は、ｓｃＴＣＲ、ｓｖｄ－ＴＣＲ、またはＴＣＲ模倣ｓｃＦｖを含む単鎖ＳＡＲが、 ＴＣＲ様結合能力（例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する能力）を獲得し、以下を含む任意の細胞で発現できることを提供する。 T細胞ではない、またはTCR鎖を発現する細胞。
いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的に結合するuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）が提供され、ここで、uTCR-SARは、以下からなる：a）第1の抗原結合ドメインおよび第1の膜関連モジュール（MAM）を含む第1のポリペプチド鎖；ならびに、b)第2の抗原結合ドメインおよび第2の膜関連モジュール（MAM）を含む第2のポリペプチド鎖、ここで、第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合するTCR様（例えば、TCR-Fv）抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成する。一実施形態において、NTCRMは、少なくとも1つのシグナル伝達経路を活性化し、及び／又は少なくとも1つのシグナル伝達アダプターを動員することができる。
一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲの第１および第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲの第１および第２の抗原結合ドメインは、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲの可変ドメインを含む。一実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｖγ、およびＶδドメインを含む。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインはＶαドメインまたはその変異体もしくは断片を含み、第２の抗原結合ドメインはＶβドメインまたはその変異体もしくは断片を含む。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインはＶγドメインまたはその変異体もしくは断片を含み、第２の抗原結合ドメインはＶδドメインまたはその変異体もしくは断片を含む。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、プレＴＣＲαの抗原結合ドメインまたはその変異体もしくは断片を含み、第２の抗原結合ドメインは、Ｖβドメインまたはその変異体もしくは断片を含む。一実施形態では、標的抗原はペプチド／ＭＨＣ複合体である。一実施形態では、uTCR-SARによって認識されるペプチドは細胞内ペプチドである。一実施形態では、uTCR-SARの標的抗原はMHC非依存性抗原である。一実施形態では、標的抗原は脂質である。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲの可変ドメインを含み、その標的抗原は細胞表面タンパク質である。いくつかの実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、約０．１ｐＭ～約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。
一実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、抗体または抗体断片に由来しない。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、抗体またはその変異体もしくは断片の可変ドメインではない。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、抗体のｖＬドメインおよびｖＨドメインではない。一実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、ＴＣＲ模倣抗体のｖＬドメインおよびｖＨドメインではない。
一実施形態では、ＴＣＲ様（例えば、ＴＣＲ－Ｆｖ）抗原結合モジュールは、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドに特異的に結合する。一実施形態では、ＴＣＲ様（例えば、ＴＣＲ－Ｆｖ）抗原結合モジュールは、 ＭＨＣ分子によって提示されない抗原（例えば、ＨＬＡ非依存性抗原）に特異的に結合する。一実施形態では、ＴＣＲ様（例えば、ＴＣＲ－Ｆｖ）抗原結合モジュールは、脂質抗原に特異的に結合する。
一実施形態では、uTCR-SARのMAMの少なくとも1つは、シグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、uTCR-SARの両方のMAMは、シグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、uTCR-SARのMAMの少なくとも1つは、シグナル伝達アダプターを動員することができるシグナル伝達受容体の膜貫通ドメイン/膜関連ドメインを含む。一実施形態では、uTCR-SARのMAMは両方とも、シグナル伝達アダプターを動員することができるシグナル伝達受容体の膜貫通ドメイン/膜関連ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的に結合するuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）が提供され、ここで、uTCR-SARは、以下からなる：a）VαドメインまたはVγドメインおよび第1の膜関連モジュール（MAM）からなる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチド鎖；および、b）VβドメインまたはVδドメインからなる第2の抗原結合ドメインおよび第2の膜関連モジュール（MAM）からなる第2のポリペプチド鎖；を含む、ここで、第1の抗原結合ドメインのVαまたはVγドメインおよび第2の抗原結合ドメインの相補的なVβまたはVδドメインは、標的抗原に特異的に結合するTCR様（例えば、TCR-Fv）抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成する。一実施形態では、ＮＴＣＲＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化することができ、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、標的抗原はペプチド／ＭＨＣ複合体である。
いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的に結合するuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）が提供され、ここで、uTCR-SARは、以下からなる：a）Vαドメイン（TCRα鎖由来の可変ドメイン）および第1の膜関連モジュール（MAM）からなる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチド鎖；ならびに、b)Vβドメイン(TCRβ鎖由来の可変ドメイン)からなる第2の抗原結合ドメインおよび第2の膜関連モジュール(MAM)からなる第2のポリペプチド鎖；を含み、ここで、第1の抗原結合ドメインのVαドメインおよび第2の抗原結合ドメインのVβは、標的抗原に特異的に結合するTCR様（例えば、TCR-Fv）抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成する。一実施形態では、ＮＴＣＲＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化することができ、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、標的抗原はペプチド／ＭＨＣ複合体である。一実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ（ＨＬＡ）非依存性抗原である。
いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的に結合するuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）が提供され、ここで、uTCR-SARは以下からなる：a）Vγドメイン（TCRγ鎖由来の可変ドメイン）および第1の膜関連モジュール（MAM）からなる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチド鎖；ならびに、b）Vδドメイン（TCRδ鎖由来の可変ドメイン）からなる第2の抗原結合ドメインおよび第2の膜関連モジュール（MAM）からなる第2のポリペプチド鎖；を含み、ここで、第1の抗原結合ドメインのVγドメインおよび第2の抗原結合ドメインのVδは、標的抗原に特異的に結合するTCR様（例えば、TCR-Fv）抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成する。一実施形態では、ＮＴＣＲＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化することができ、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、標的抗原はペプチド／ＭＨＣ複合体である。一実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ（ＨＬＡ）非依存性抗原である。一実施形態では、標的抗原は脂質である。
いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的に結合するuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）が提供され、ここで、uTCR-SARは、以下からなる：a）V-preTCRαドメイン（preTCRα鎖由来の可変ドメイン）および第1の膜関連モジュール（MAM）からなる第1の抗原結合ドメインを含む第1のポリペプチド鎖；ならびに、b)Vβドメイン(TCRβ鎖由来の可変ドメイン)および第二の膜関連モジュール(MAM)を含む第二の抗原結合ドメインを含む第二のポリペプチド鎖、ここで、第1の抗原結合ドメインのVαドメインおよび第2の抗原結合ドメインのVβは、標的抗原に特異的に結合するTCR様（例えば、TCR-Fv）抗原結合モジュールを形成し、第1のMAMおよび第2のMAMは、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を形成する。一実施形態では、ＮＴＣＲＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化することができ、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができる。一実施形態では、標的抗原はペプチド／ＭＨＣ複合体である。
一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαから選択されるＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭまたは第２のＭＡＭは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲαから選択されるＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３εから選択されるＣＤ３鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＴＣＲ鎖およびＣＤ３鎖の膜貫通ドメインを含まない。一実施形態では、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＣＤ３εの膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、uTCR-SARの第1および第2のMAMは、シグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインまたは膜結合ドメインを含む。一実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２、あるいはそれらの変異体もしくは断片のうちの１つ以上から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターは非ＣＤ３アダプター（ＮＣＡＭ）である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達アダプターはＣＤ３εではない。一実施形態では、uTCR-SARのMAMは非TCR受容体を含む。一実施形態では、非ＴＣＲは、以下のうちの１つ以上から選択されるが、これらに限定されない： ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３ 、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、 KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、 DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、 CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、 CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、および ILT2。 NKp46およびCD16およびNKp30のヒンジドメインを含む2つのポリペプチドに結合したNY-ESO-1 TCRの可変ドメインを含む例示的なuTCR-SARは、それぞれ配列番号10467および10468で表される。 NKp30の細胞外ドメインを含む2つのポリペプチドに結合したNY-ESO-1 TCRのVaおよびVbドメインを含む例示的なuTCR-SARは、配列番号10469によって表される。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖と第2のポリペプチド鎖は、1つ以上のジスルフィド結合を介して連結されている。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第１の抗原結合ドメインと第１のＭＡＭとの間に第１のペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の抗原結合ドメインと第２のＭＡＭとの間に第２のペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結される。いくつかの実施形態では、第１のペプチドリンカーおよび／または第２のペプチドリンカーは、それぞれ、長さが約５～約５００アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、個別に、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、またはＣδ ＴＣＲドメイン、あるいはその変異体もしくは断片を含む。例示的な実施形態において、第1および／または第2のリンカーは、個々に、免疫グロブリン由来のIg様リンカー（例えば、IgCL、IgCH1など）またはTCR-Ig様リンカー（例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO: 3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO: 3560、 SEQ ID NO:3536-3551)、またはTCR-Ig様リンカー(例えば、TCRb-Ig3、SEQ ID NO:3560；TCRa-Ig3、SEQ ID NO:3562；TCRg-Ig3、SEQ ID NO:3566；またはTCRd-Ig3、SEQ ID NO:3568など)、またはその変異体もしくはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のペプチドリンカーは、それらの発現、親和性、および鎖対合を増加させる変異を含む。一実施形態では、第１および第２の抗原結合ドメインは相補鎖（例えば、ＶαとＶβまたはＶγとＶδ）を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド鎖および第2のポリペプチド鎖は、第1の抗原結合ドメイン（例えば、vL、VαまたはVγ）および／または第2の抗原結合ドメイン（例えば、vH、VβまたはVδ）のN末端またはN末端付近に付着している1つ以上の自律抗原結合ドメイン（AABD）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、約０．１ｐＭから約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質を含む複合体である。例示的な実施形態において、ペプチド／MHC複合体は、NY-ESO-1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE4、WT1、AFP、TERT、MART-1、pp66-CMV、HPV16-E7、PRAME、EBV-LMP2A、HIV-1、PSAまたはgp100のうちの1つ以上に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ｕＴＣＲは、細胞表面抗原を標的とすることができるＨＬＡ非依存性ＴＣＲである。一実施形態では、標的抗原は細胞表面抗原である。例示的な実施形態では、標的抗原は、表Ｂに列挙される抗原のうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、タンパク質、炭水化物、および脂質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＬＬ－１、ＦＬＴ３、クローディン１８．２、ＢＣＭＡ、ＧＣＣ、ＭＰＬ、ＳＬＡＭＦ７、 ROR1、ROR2、GPRC5D、FCRL5、MSLN、EGFR、EGFRviii、PSMA、PSCA、KLK2、IL13Ra2、TROP2、PTK7、DLL3、Muc1、Muc16、または Her2。一実施形態では、uTCR-SARは二重特異性または多重特異性である。一実施形態では、本開示は、ＭＨＣ制限されている２つ以上の抗原に結合できるｕＴＣＲを提供する。一実施形態では、uTCR-SARは、MHC制限抗原および/またはMHC非制限抗原の2つ以上に結合することができる。一実施形態において、uTCR-SARは、そのTCR-Fvドメインを介してペプチド／MHC複合体に結合し、そのVαおよびVβ、またはVγおよびVδドメインのN末端またはN末端付近に結合している1つ以上のsvd-TCRを介して、1つ以上のペプチド／MHC複合体に結合することができる。一実施形態において、uTCR-SARは、そのTCR-Fvドメインおよびsvd-TCRドメインを介して1つまたは複数のペプチド／MHC複合体に結合し、そのVαおよびVβまたはVγおよびVδドメインのN末端またはN末端付近に結合している1つまたは複数のAABD（例えば、vHH、FHVH、センチリンなど）を介して1つまたは複数の表面抗原に結合することができる。
いくつかの実施形態において、上記のuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）のいずれかによれば、第1のMAMは、第1の膜貫通ドメインのN末端に第1のヒンジドメインまたはそのフラグメントをさらに含み、および／または第2のMAMは、第2の膜貫通ドメインのN末端に第2のヒンジドメインまたはそのフラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＣＲＭは、第１のヒンジドメイン内の残基と第２のヒンジドメイン内の残基との間にジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、上記のuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）のいずれかによれば、第1のMAMは、第1のヒンジドメインのN末端に第1の抗原結合ドメインまたはそのフラグメントをさらに含み、および／または第2のMAMは、第2のヒンジドメインのN末端に第2の抗原結合ドメインまたはそのフラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＭＡＭは、第１の膜貫通ドメインのＣ末端側に第１のサイトゾルドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のＭＡＭは、第２の膜貫通ドメインのＣ末端側に第２のサイトゾルドメインをさらに含む。一実施形態では、第１および／または第２のサイトゾルドメインは、１つまたは複数のＩＴＡＭを含む活性化ドメインである。いくつかの実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、約０．１ｐＭ～約５００ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）で標的抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、上記のuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）のいずれかによれば、第1のポリペプチド鎖は、第1の膜貫通ドメインのC末端側に第1の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の膜貫通ドメインのＣ末端側に第２の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記のuTCR-SAR（単離されたuTCR-SARなど）のいずれかによれば、第1のポリペプチド鎖は、第1の膜貫通ドメインのC末端に1つ以上の共刺激性ドメインを含み、および／または第2のポリペプチド鎖は、第2の膜貫通ドメインのC末端に1つ以上の共刺激性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、第１の抗原結合ドメインのＮ末端に第１のシグナル伝達ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、第２の抗原結合ドメインのＮ末端に第２のシグナル伝達ペプチドをさらに含む。
一実施形態において、本開示は、非T細胞受容体モジュール（NTCRM）を含む少なくとも1つのポリペプチドに融合したTCR可変ドメイン（例えば、Va／Vα、Vb／Vβ、Vg／Vγ、Vd／Vδなど）を含む抗原（例えば、ペプチド／MHC複合体）を特異的に標的化する二重鎖uTCR-SAR構築物（単離された構築物など）を提供する。いくつかの実施形態において、SARは、標的抗原（例えば、ペプチド／MHC複合体または脂質抗原）に特異的に結合する1つ以上のTCR可変ドメインと、少なくとも1つのシグナル伝達アダプターを動員することができる非T細胞受容体モジュール（NTCRM）とを含んでいる。例示的な実施形態では、シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２のうちの１つまたは複数であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ペプチドおよびＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質）を含む複合体である。
一実施形態では、uTCR-SARは細胞の表面上で発現される。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、Ｔ細胞ではない細胞の表面上で発現される。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、プレＴＣＲα鎖、またはそれらの変異体もしくは断片の発現を欠く細胞の表面上で発現される。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、ＣＤ３ε、Ｃｄ３γおよびＣＤ３δ鎖、またはそれらの変異体もしくは断片の発現を欠く細胞の表面上で発現される。一実施形態において、TCR様特性を有するuTCR-SARは、T細胞において発現された場合、機能的に活性である（すなわち、細胞増殖、サイトカイン分泌または細胞毒性を誘導することができる）。一実施形態において、uTCR-SARは、T細胞ではない細胞（すなわち、NK細胞、マクロファージ、顆粒球樹状細胞などで発現された場合）において発現された場合、機能的に活性である（すなわち、細胞増殖、サイトカイン分泌、または細胞毒性を誘導することができる）。一実施形態では、ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδおよびプレＴＣＲα鎖またはその変異体もしくは断片のうちの１つ以上の発現を欠く細胞において発現され、機能的に活性である。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδおよびプレＴＣＲα鎖またはその変異体の発現および／または機能を欠く細胞において発現され、機能的に活性である。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、ＣＤ３ε、Ｃｄ３γおよびＣＤ３δ鎖またはそれらの変異体の発現および／または機能を欠く細胞において発現され、機能的に活性である。
一実施形態において、uTCR-SARはT細胞にTCR様抗原認識を付与する。一実施形態において、uTCR-SARは、T細胞以外の細胞（例えば、NK細胞、g-NK細胞、メモリー様NK細胞、CIK、単球、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞、iPSC由来NK細胞など）にTCR様抗原認識を付与する。一実施形態では、uTCR-SARは、MHC(HLA)依存的にペプチド抗原に結合することができる。例示的な実施形態では、 ｕＴＣＲ－ＳＡＲを発現する細胞（例えば、ＮＫ細胞またはマクロファージ）は、ＭＨＣ（ＨＬＡ）依存的に細胞内ペプチド抗原を認識することができる。例示的な実施形態において、uTCR-SARを発現する免疫細胞（例えば、NK細胞またはマクロファージ）は、MHC（HLA）依存的様式で細胞内ペプチド抗原を認識し、1つ以上の細胞シグナル伝達経路（例えば、NFAT、PI3K、NF-κB経路など）を活性化することができる。例示的な実施形態において、uTCR-SARを発現する免疫細胞（例えば、NK細胞またはマクロファージ）は、MHC（HLA）依存的様式で細胞内ペプチド抗原を認識し、1つ以上の細胞シグナル伝達経路（例えば、NFAT、PI3K、NF-κB経路など）を遮断することができる。一実施形態では、ｕＴＣＲ／ＳＡＲを発現する免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはマクロファージ）は、細胞の活性化、増殖、サイトカイン分泌（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２の分泌）および／または細胞毒性を誘導する能力を有する。標的ペプチド抗原に結合すると。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲを発現する免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはマクロファージ）は、細胞の活性化、増殖、サイトカイン分泌（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２の分泌）および／または細胞毒性をブロックする能力を有する。標的ペプチド抗原に結合すると。一実施形態では、uTCR-SARは活性化受容体である。一実施形態では、uTCR-SARは阻害性受容体である。
一実施形態において、uTCR-SARは、TCRの可変ドメイン（例えば、Va／Vα、Vb／Vβ、Vg／Vγ、Vd／Vδ及びpreTCRα）に由来する1つ以上の抗原結合ドメインからなり、2つの鎖を有する。一実施形態において、uTCR-SARは、Va/VαドメインとVb/Vβドメインからなる。一実施形態において、uTCR-SARは、Vg／VγドメインおよびVd／Vδドメインからなる。一実施形態において、uTCR-SARは、preTCRαおよびVb／Vβドメインからなる。一実施形態において、uTCR SARの2つの可変ドメインは、2つの別個のポリペプチド鎖上に存在する。 一実施形態において、uTCR SARの抗原結合ドメイン（例えば、ペプチド／MHC複合体結合ドメイン）を構成する2つの可変ドメインは、単一のポリペプチド鎖の一部ではない。一実施形態では、uTCR-SARの2つの可変ドメインは、リンカーを介して操作可能に連結されていない、すなわち、uTCRは一本鎖TCR（scTCR）ではない。
一実施形態では、uTCRの一方または両方の鎖は膜貫通ドメインまたは膜アンカードメインを含む。一実施形態では、ｕＴＣＲ ＳＡＲの一方または両方の鎖がサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、ｕＴＣＲ ＳＡＲの一方または両方の鎖は、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達アダプターを動員することができる膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、二本鎖uTCR SARの一方または両方の鎖は、1つまたは複数のサイトゾル活性化ドメインを含む。一実施形態では、二本鎖uTCR SARの一方または両方の鎖は、そのサイトゾルドメインに1つまたは複数のITAMを含む。例示的な実施形態では、二本鎖uTCR SARの一方または両方の鎖は、1、2または3個のITAMを含むサイトゾルドメインを含む。例示的な実施形態では、ｕＴＣＲ ＳＡＲの１つの鎖は単一のＩＴＡＭを有するサイトゾルドメインを含み、一方、第２の鎖は３つのＩＴＡＭを有するサイトゾルドメインを有する。例示的な実施形態では、１つの鎖は単一の１ＩＴＡＭを有するサイトゾルドメインを含み、一方、第２の鎖は２つまたは３つのＩＴＡＭを有するサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、二重uTCR SARの一方または両方の鎖は、1つまたは複数の阻害モチーフ、例えばITIMを含む。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、１つ以上のＩＴＡＭが変異しているＣＤ３ζ鎖に由来するサイトゾル活性化ドメインを含む。例示的な実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、１つ以上のＩＴＡＭのチロシン残基がフェニルアラニンに変異しているＣＤ３ε鎖に由来するサイトゾル活性化ドメインを含む。
一実施形態では、本開示はまた、シグナル伝達鎖（アダプター）及び／又は非TCR受容体の細胞外ドメインに操作可能に連結された抗原結合ドメインとしてTCRの可変ドメイン（例えば、Vα、Vβ、Vγ及びVδ等）を含み、共刺激性ドメインを含むuTCR-SARを提供する。
一実施形態では、TCR様結合特性を有する二重鎖uTCR SARの鎖の一方または両方は、任意に、1つ以上の共刺激ドメインを含む。一実施形態では、１つまたは複数の共刺激ドメインは、一方または両方の鎖の膜近傍領域に位置する。例示的な実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ８１、ＯＸ４０、２Ｂ４、またはＣＤ２などのサイトゾルドメインに由来する。CD28および4-1BBの共刺激ドメインからなる例示的なCD3ζシグナル鎖は、それぞれSEQ ID NO:3493および3494に示されている。 SARはモジュール形式であるため、CD28と4-1BBのコスティミュラトリードメインを、他の共刺激性レセプター（例えば、OX40、2B4、CD2、CD81など）やその変異体由来の共刺激性ドメインに置き換えて、新規なuTCR-SARを生成することができる。同様に、CD3ζシグナル伝達鎖の一方または両方を他のシグナル伝達鎖と置換して、FcRγ、DAP10およびDAP10およびその変異体のシグナル伝達鎖に基づいて、異なる共刺激ドメインを含む新規uTCR-SARを生成することができる。代表的なこのようなuTCR-SAR標的NY-ESO1ペプチド/MHC複合体は、配列番号10481～10530によって表される。
一実施形態では、ＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲは、単一特異的である。一実施形態では、ＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲは二重特異性である。一実施形態では、ＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲはバイパラトピックである。一実施形態では、ＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲは多重特異性である。一実施形態において、本開示は、ＭＨＣ複合体によって提示された場合に２つ以上の異なる細胞内ペプチドに結合することができるＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、細胞内ペプチドおよび細胞表面発現（または細胞外）タンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０など）に結合できるＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲを提供する。 NY-ESO-1ペプチド/MHC複合体およびCD20の両方を標的とするこのようなuTCR-SARの例は、配列番号10478によって表される。この構築物では、CD20を標的とするvHHドメインが、小さなリンカーを介してNY-ESO-1ペプチドを標的とするVbドメインのN末端に結合されている。 CD20 vHH ドメインは、他の表面抗原またはペプチド/MHC複合体を標的とする他の AABD に置き換えることができます。例示的な実施形態では、ＣＤ２０ ｖＨＨドメインは、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド／ＨＬＡ－Ａ２複合体を標的とする単一可変ドメインＴＣＲによって置換されて、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドとＭＡＧＥ－Ａ３ペプチドの両方を標的とすることができる二重特異性ｕＴＣＲ－ＳＡＲを生成する。 AABD は、uTCR の Va ドメインに結合して二重特異性 SAR を生成したり、Vb ドメインと Va ドメインの両方に結合して多重特異性 uTCR-SAR を生成したりすることもできます。さらに、１つ以上のＡＡＢＤ（例えば、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、セントチリン、ｓｖｄ－ＴＣＲ）を、ｕＴＣＲ－ＳＡＲの可変ドメインのそれぞれのＮ末端に結合させることができる。一実施形態において、本開示は、ＭＨＣ（またはＨＬＡ）依存性およびＭＨＣ（ＨＬＡ）非依存性様式で標的抗原に結合できるＴＣＲ様結合特性を有するｕＴＣＲ ＳＡＲを提供する。
一実施形態において、TCR結合特性を有するuTCR SARは、ペプチド／MHC複合体に結合するフラグメント可変TCR（TCR-Fv）を形成するために互いに会合する2つの可変ドメイン（例えば、VαとVβまたはVγとVδなど）からなる。一実施形態では、ＴＣＲ結合特性を有するＳＡＲは、１つまたは複数の自律的抗原結合ドメイン（例えば、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、ｓｖｄ－ＴＣＲなど）をさらに含む。一実施形態では、1つ以上の自律抗原結合ドメイン（例えば、vHH、FHVH、svd-TCRなど）は、任意のリンカーを介して、TCR可変ドメイン（例えば、VαとVβ、またはVγとVδなど）の一方または両方のN末端またはN末端付近に操作可能に連結される。例示的な実施形態において、本開示は、Vα／Vβドメインを介してMHCと複合体化したNY-ESO-1ペプチドを認識し、NY-ESO-1もしくはMAGE-A3を標的とするsvd-TCR、またはCD20もしくはBCMAなどを標的とするvHHもしくはFHVHドメインを共発現する二重鎖SARを提供する。 NY-ESO-1ペプチド/MHC複合体、CD20およびBCMAを標的とするこのようなuTCR-SARの例は、配列番号10479によって表される。
一実施形態において、本開示は、TCRのVa（Vα）ドメインが、任意のリンカー（例えば、TCRa-Ig3、SEQ ID NO：3562）を介して、1つの膜アンカー型ポリペプチド鎖の細胞外ドメインに作動可能に連結され、かつ、Vb（Vβ）ドメインが、任意のリンカー（例えば、TCR様リンカー、例えば、TCRb-Ig3；例えば、SEQ ID NO: 3560）を介して第2の膜固定ポリペプチド鎖の細胞外ドメインに操作可能に連結されている二重鎖uTCR SARを提供する。一実施形態では、二本鎖ＳＡＲを構成する膜アンカー型ポリペプチド鎖の一方または両方が膜貫通タンパク質である。
例示的な実施形態において、本開示は、TCR由来のVa（Vα）ドメインが、任意のリンカー（例えば、TCRa-Ig3、SEQ ID NO：3562）を介して、シグナル伝達アダプター（例えば、CD3ζ、FcRγ、DAP10もしくはDAP12など）の1つの鎖またはそのバリアントの細胞外ヒンジドメインに作動可能に連結され、かつ、Vb（Vβ）ドメインが、任意のリンカー（例えば、TCR様リンカー、例えば、TCRb-Ig3；例えば、SEQ ID NO: 3560）を介して、シグナル伝達アダプターまたはそのバリアントの第2鎖の細胞外ヒンジドメインに操作可能に連結されているuTCR-SARを提供する。細胞（例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージなど）において発現された場合にNY-ESO-1ペプチド／HLA-A＊02：01複合体を認識する例示的なそのようなuTCR-SARは、SEQ ID NO（DNA：9355およびSEQ ID NO: (PRT)：10447に示される。SARはモジュラー形式であるため、このSARのCD3ζシグナル伝達鎖の一方または両方は、FcRγ、DAP10およびDAP10のシグナル伝達鎖またはその変異体を含む、他のシグナル伝達鎖/アダプターによって置き換えることができる。さらに、リンカードメインを他のリンカードメインで置き換えることもできる。例示的な実施形態において、Ig様リンカーTCRa-Ig3(SEQ ID NO: 3562)は、IgCLリンカー(SEQ ID NO: 3536)で置換され、そして、リンカーTCRb-Ig3（SEQ ID NO: 3560）は、IgG-CH1（SEQ ID NO: 3537）、IgG2-0C-CH1（SEQ ID NO: 3543）、IgG2-IC-CHI1（SEQ ID NO： 3544）、IgG3-CHI1（SEQ ID NO：3545）、IgG4-CHI1（SEQ ID NO：3546）、IgAI-CHI1（SEQ ID NO：3547）、IgA2-CHI1、IgD-CHI1、IgE-CHI1またはIgM-CHI1（SEQ ID NO：3551）で置換される。ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド／ＭＨＣ複合体を標的とするこのような例示的なｕＴＣＲ－ＳＡＲ構築物は、配列番号９３５７～９３６５によって表される。
いくつかの実施形態では、ＶαドメインはＩｇＣＬリンカーに結合され、ＶβドメインはＩｇＣＨ１リンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ＶβドメインはＩｇＣＨ１リンカーに結合され、ＶαドメインはＩｇＣＬリンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ＶαドメインはＣα由来リンカー（例えば、ＴＣＲａ－Ｉｇ３）に結合され、ＶβドメインはＣβ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｂ－Ｉｇ３）に結合される。いくつかの実施形態では、ＶβドメインはＣα由来リンカー（例えば、ＴＣＲａ－Ｉｇ３）に結合され、ＶαドメインはＣβ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｂ－Ｉｇ３）に結合される。このような構築物の例は、配列番号１０４４８によって表される。いくつかの実施形態において、VγドメインはCγ由来のリンカー（例えば、TCRg-Ig3）に結合され、VδドメインはCδ由来のリンカー（例えば、TCRd-Ig3）に結合される。このような構築物の例は、配列番号１０６９４である。この構築物には、Vd2 および Vg9 可変ドメインがある。いくつかの実施形態では、ＶγドメインはＣδ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｄ－Ｉｇ３）に結合され、ＶδドメインはＣγ由来リンカー（例えば、ＴＣＲｇ－Ｉｇ３）に結合される。このような構築物の例は、配列番号１０６９３によって表される。いくつかの実施形態では、可変ドメインおよびリンカーの他の構成が想定される。
例示的な実施形態では、TCRγおよびTCRδの可変ドメインからなるuTCR-SARの場合、Vγフラグメントはシグナル伝達アダプター（例えば、 CD3ζ、FcRγ、DAP10またはDAP10など）にTCRγ由来のIg様リンカー（例えば、TCRg-Ig3、SEQ ID NO: 3566）を介して結合され、Vδフラグメントはシグナル伝達アダプターの第二の鎖にTCRδ鎖由来のIg様リンカー（例えば、TCRd-Ig3、SEQ ID NO: 3568）を介して結合される。TCRg-Ig3 および TCRg-Ig3 リンカードメインは、他のリンカードメインで置き換えることができる。本開示は、Ig（例えば、IgCLおよびIgG-CH1）またはTCRα／β（例えば、 TCRa-Ig3およびTCRb-Ig3）を、TCRγ（例えば、TCRg-Ig3、SEQ ID NO: 3566）およびTCRδ鎖（例えば、TCRd-Ig3、SEQ ID NO: 3568）由来のリンカーの一方または両方に置換することができる。
本開示は、2つのシグナル伝達鎖が異なるタイプ（例えば、CD3ζとFcγR、CD3ζとDAP10、CD3ζとDAP12、FcRγとDAP10など）であるTCRの可変ドメインを抗原結合ドメインとして含むヘテロ二量体二重鎖uTCR-SARを提供する。本開示は、1つまたは両方のシグナル伝達鎖が、天然に存在するシグナル伝達受容体、例えばCD16A、NKp30、NKp44、NKp44などの膜貫通ドメインおよび任意選択で細胞質ドメインからなるヘテロ二量体二重鎖uTCR-SARを提供する。このようなuTCR-SARの一方または両方の鎖は、1つ以上の共刺激ドメインをさらに含んでいてもよい。NY-ESO-1ペプチド/HLA-A*02:01およびMAGE-A3ペプチド/HLA-A*02:01複合体を標的とし、異なる結合ドメイン、リンカー、活性化ドメインおよび共刺激ドメインからなる例示的なuTCR-SAR構築物は、それぞれSEQ ID NO (PRT): 10447-10530および10531-10610で表される。複数の癌型を認識するHLA非依存性TCRであるMC.7.G5の可変ドメインを含む例示的なuTCR-SAR構築物は、SEQ ID NO (PRT): 10620-10692およびSEQ ID NO (DNA)： 9528-9600で表される。
本開示は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）の部分領域または全体領域を含む単鎖、二本鎖、および二本鎖ヘテロ二量体ＳＡＲを提供する。本開示は、生物学的活性を保持しながら、本明細書に記載されるCD16配列のいずれかと70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、98.5％、99％または99.9％の同一性を有するCD16またはその断片からなるSARを提供する。本開示のCD16-SARの構築において使用することができる例示的な全長CD16核酸配列およびアミノ酸配列は、SEQ ID NO (DNA)に提供される： 1415-1417およびSEQ ID NO（PRT）：3809-3811、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等残基（すなわち、ホモログ）。本開示のCD16 SARの構築に使用できるCD16フラグメントは、仮出願の表25～30に提供されている。 ＣＤ１６ ＳＡＲはまた、その配列が表２５～３０に提供されるＣＤ１６断片の変異体、または非ヒト種からの同等の残基を使用して構築することもできる。本開示の例示的な単鎖、二本鎖、および二本鎖ヘテロ二量体ＳＡＲは、仮出願の表３２、３４、および３６～３９に提供される。
CD16 には、細胞外ドメインと膜貫通ドメインに配列相同性のある CD16a と CD16b という 2 つのアイソフォームがあります。特に明記しない限り、CD16は、CD16a (FcγRIIIa)およびCD16b (FcγRIIIb)アイソフォームの両方、およびヒトまたは非ヒト種に由来する他の任意のスプライシング変異体を指す。ただし、CD16b アイソフォームにはサイトゾル ドメインが欠如しているため、CD16 サイトゾル ドメインに関する説明は、CD16a アイソフォームおよび非ヒト種の同等の残基のみに関係します。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ１６ ＳＡＲの構築に使用できるＣＤ１６配列には、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＣＤ１６Ａ－Ｆ１５８Ｖ；配列番号１４１５）に対するＣＤ１６の親和性を増加させる変異体および変異体が含まれ得る。さらに、細胞表面からの切断を防止します（例えば、CD16A-F158V-S197P; 配列番号1453）。
１４１５～１４１７に示されるヒトＣＤ１６の核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＳＡＲのヌクレオチド配列は、配列番号３８０９～３８１１のアミノ酸配列の少なくとも１、５または１０の修飾を有するが２０以下の修飾を有するＣＤ１６のアミノ酸配列をコードする配列を含むか、または配列番号３８０９～３８１１のアミノ酸配列に対して７０～９９％の同一性を有する配列。特定の実施形態では、ＳＡＲ分子は、配列番号３８０９～３８１１のアミノ酸配列、または非ヒト種由来の同等の残基を含む。
一実施形態では、本開示は、ＣＤ１６またはその変異体の部分領域または全体領域を含む単鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＣＤ１６細胞外ドメインの部分領域または全体領域を含む単鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示のＣＤ１６－ＳＡＲの構築に使用することができる例示的なＣＤ１６細胞外ドメイン配列は、配列番号（ＤＮＡ）：１４９６～１５０９および配列番号（ＰＲＴ）：３８９０～３９０３、または同等の残基（すなわち、 、ホモログ）非ヒト種由来。一実施形態において、本開示は、ＣＤ１６ヒンジドメインの部分領域または全体領域を含むＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示のＣＤ１６－ＳＡＲの構築に使用できる例示的なＣＤ１６ヒンジドメイン配列は、配列番号（ＤＮＡ）：１５４５～１５４７および配列番号（ＰＲＴ）：３９３９～３９４１、または同等の残基（すなわち、 、ホモログ）非ヒト種由来。一実施形態では、本開示は、ＣＤ１６膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含むＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示のＣＤ１６－ＳＡＲの構築に使用できる例示的なＣＤ１６膜貫通配列は、配列番号（ＤＮＡ）：１５２８～１５３０および配列番号（ＰＲＴ）：３９２２～３９２４、または同等の残基（すなわち、ホモログ）ヒト以外の種に由来する。一実施形態では、本開示は、ＣＤ１６サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含むＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示のＣＤ１６－ＳＡＲの構築に使用できる例示的なＣＤ１６膜貫通配列は、配列番号（ＤＮＡ）：１５５６～１５５８および配列番号（ＰＲＴ）：３９５０～３９５２、または同等の残基（すなわち、ホモログ）ヒト以外の種に由来する。本開示はまた、同一性または相同性を有する野生型ＣＤ１６の少なくとも１つの生物学的活性を保持するＣＤ１６の変異体またはその断片を含むＳＡＲを提供する。
一実施形態において、CD16 SARは、CD16膜貫通ドメインおよびCD16細胞質ドメインにCD16ヒンジドメインを介して結合している、両方の免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、D1およびD2）からなるCD16細胞外ドメインからなる。BCMAを標的とする例示的なそのようなCD16 SARは、CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SpeXba-PAC（SEQ ID NO（DNA）：1638およびSEQ ID NO（PRT）：4032）異なる抗原を標的とするｓｃＦｖ、ＦＨＶＨ、ｖＨＨおよび非免疫グロブリン抗原結合足場を含むさらなる例示的なこのようなＳＡＲは、配列番号（ＤＮＡ）：４８５１～５１２１に提供される。このようなCD16 SARはまた、抗体のFc領域、抗体フラグメントまたは二重特異性/三重特異性エンゲージャーに結合し、抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力を保持している。したがって、SAR CD8SP-BCMA-FHVH-33-CD16A-F158V-S197P-FL-v3（SEQ ID NO: 5062）を発現する免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、単球／マクロファージ、好中球など）は、BCMA FCVH領域を介してBCMA発現標的細胞を標的とすることができる。さらに、このような免疫細胞は、ハーセプチンの存在下で、標的化されたHer2発現標的細胞にリダイレクトすることができる。あるいは、このような免疫細胞（例えば、T細胞またはNK細胞）は、リツキシマブの存在下で、標的CD20発現標的細胞にリダイレクトされ得る。
一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲは、ＣＤ１６の最初の免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、Ｄ１）を欠いている部分的ＣＤ１６細胞外ドメインを含む。このようなCD16 SARは、D1およびD2ドメインと、 CD16ヒンジドメインを介してCD16膜貫通ドメインおよびCD16サイトゾルドメインに結合する第2免疫グロブリン様ドメイン(すなわち、D2)との間のリンカー領域を含む。 BCMAを標的とするこのようなCD16 SARの例は、CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-D2TMCPv1-F-P2A-SpeXba-PAC（配列番号（DNA）：1664および配列番号1664）によって表されるID NO (PRT): 4058)。このようなCD16-SARは、CD16のD2ドメインのみを含み、D1ドメインを欠いているため、抗体に結合する能力を欠いている。
一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲは、ＣＤ１６ヒンジドメインを介してＣＤ１６膜貫通ドメインおよびＣＤ１６サイトゾルドメインに結合するＣＤ１６ Ｄ２ドメインを含む。このようなCD16-SARは、CD16のD2ドメインのみを含み、D1ドメインを欠いているため、抗体に結合する能力を欠いている。
一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲは、ＣＤ１６膜貫通ドメインおよびＣＤ１６サイトゾルドメインに結合するＣＤ１６ヒンジドメインの部分的または全体を含む。 BCMAを標的とするそのようなCD16 SARの例は、CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-CD16-F158V-Hinge-TM-CP-v1 -F-P2A-SpeXba-PAC（配列番号( DNA): 1690および配列番号(PRT): 4084)。このような CD16-SAR は、D1 ドメインと D2 ドメインの両方を欠いているため、抗体に結合する能力がありません。
一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲは、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＡＡＢＤ）とＣＤ１６のヒンジドメインとの間に存在する異種ヒンジ（スペーサー）ドメインを含む。 ＣＤ１９を標的とするこのようなＣＤ１６ ＳＡＲの例は、ＣＤ８ＳＰ－ＣＤ１９－ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ｈｉｎｇｅ－ＣＤ１６Ａ－Ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＰ－Ｖ１５８－Ｆ－Ｐ２Ａ－ＰＡＣ（配列番号（ＤＮＡ）：７６９３）によって表される。および配列番号（ＰＲＴ）：８３８５）。この構築物は、CD8ヒンジを介して、CD16Aヒンジ、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインをコードするフラグメントに機能的に連結されたCD19標的hu-mROO5-1 scFvを含む。代替の実施形態では、ＣＤ８ヒンジ領域は、ＣＤ１６Ａ膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメインに直接連結される。 SARはモジュール設計であるため、上記構築物中のCD19-hu-mROO5-1-scFvは、別の抗原を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、scFv、AABDなど)に置き換えることができる。さらに、CD8 ヒンジ ドメインを別のヒンジ ドメインに置き換えることもできます。 ＣＤ８ヒンジの代わりにＣＤ２８ヒンジを含む例示的なそのような構築物は、ＣＤ８ＳＰ－ＣＤ１９－ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－Ｉｇ－１１３－１３７－ＣＤ１６Ａ－ｖ１５８－Ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＰ－ｖ２－Ｆによって提示される。 －Ｆ２Ａ－ＰＡＣ（配列番号（ＤＮＡ）：７６８３；配列番号（ＰＲＴ）：８３７５）（表４６）。
例えば、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ ）を有するＣＤ１６のＤ２ドメインとヒンジドメインとの間に挿入されるＡＡＢＤ（例えば、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、ｃｈＶＨ、セントチリン、アフィボディなど）を含む。リンカ）。例示的な実施形態では、このようなＣＤ１６ ＳＡＲのアミノ末端からカルボキシ末端までの異なるドメインには、Ｎ末端シグナルペプチド、ＣＤ１６－Ｄ１ドメイン、ＣＤ１６－Ｄ２ドメイン、任意のリンカー、ＡＡＢＤ（例えば、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、センチリン、アフィボディなど）、任意のリンカー、CD16 ヒンジ ドメイン、CD16 膜貫通ドメイン、および CD16 サイトゾル ドメイン。
ＳＡＲの構築に使用され得る様々なＣＤ１６ドメイン（すなわち、細胞外、Ｄ１、Ｄ２、ヒンジ、膜貫通、およびサイトゾル）は、以下の条件を満たす限り、その全配列または欠失変異体もしくは変異体を含み得ることが理解されるべきである。ドメインは、その機能的特性の少なくとも 1 つを保持します。 ＣＤ１６ドメインは、それらの野生型配列、または高親和性（例えば、Ｆ１５８Ｖ）もしくは高親和性非切断性（例えば、Ｆ１５８Ｖ／Ｓ１９７ＰもしくはＦ１５８Ｖ／Ｓ１９７Ｒ）変異体の１つ以上を含み得る。
一実施形態において、CD16 SARの抗原結合ドメインは、scFv、vL、vH、Fv、Va、Vb、Vg、Vd、TCR-Fv、vHH、FHVH、単ドメイン抗体、単鎖TCR（scTCR）、単可変ドメインTCR（svd-TCR）、非免疫グロブリン抗原結合スキャフォールド、リガンド（例．APRIL）、または受容体の細胞外ドメイン（PD1、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46など）を含む。一本鎖SARの鎖は、1つの抗原に結合してもよいし、2つ以上の抗原（例えば、2つ、3つ、4つなど）に結合してもよい。一本鎖CD16 SARの鎖は、1つ以上のアダプター（例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど）をさらに含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のCD16 SARは、一般式の分子を含む：AABD（n）-任意選択CD16 D1ドメイン-任意選択CD16リンカードメイン-任意選択CD16 D2ドメイン、CD16ヒンジドメイン-CD16膜貫通ドメイン-任意選択細胞内コスティミュラトリードメイン（n）-任意選択CD16細胞内シグナル伝達ドメインここで、nは1以上である。一実施形態では、ｎは少なくとも２、例えば２、３、４または５である。ＡＡＢＤ（自律抗原結合ドメイン）は、抗原結合ドメインを形成し、細胞内で発現される場合には細胞外側に位置する。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨドメインである。一実施形態では、ＡＡＢＤは、完全ヒト単一ＶＨ（ＳＶＨ）ドメインまたはヒト化ＳＶＨドメインである。 SVH ドメインは自律 vH ドメインとしても知られ、vL ドメインが存在しない場合でもターゲットに結合できます。 一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
は、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、ＺＩＰドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｒ４など）、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディなどの非免疫グロブリン抗原結合足場である。 、レペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、またはその断片；受容体の細胞外ドメイン（例えば、NKG2D）、リガンド（例えば、APRIL、トロンボポエチン）など。
本開示のＣＤ１６ ＳＡＲは、一般式：
ｓｃＦｖ（ ｎ ）－任意のＣＤ１６ Ｄ１－任意のＣＤ１６リンカードメイン－任意の－ＣＤ１６ Ｄ２ドメイン、ＣＤ１６ヒンジドメイン－ＣＤ１６膜貫通ドメイン－任意の－細胞内共刺激ドメイン（ｎ）－任意のＣＤ１６細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、ｎは１以上である。
別の実施形態では、共刺激ドメインもＣＤ１６－ＳＡＲのＣＤ１６鎖に組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BB、CD28、OX40および2B4などの共刺激ドメインが含まれる(表30;配列番号(DNA):1565～1572および配列番号(PRT):3959～3966)。まとめると、上記の結果は、現世代 CAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、CAR への補完的なアプローチも提供します。
異なる抗原を標的とするscFv断片と融合したCD16A全体からなるSARの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO (DNA):4851-5039およびSEQ ID NO (PRT):5151-5339で表される。scFv断片とその標的抗原の順番は、表3に示したscFvと標的抗原の順番と同じである。これらのCD16に基づくSAR構築物の完全な名称は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる仮出願の表36にも記載されている。異なるscFv、単一ドメイン抗体、アダプターまたはscTCRに結合したCD16全長配列からなる追加のSARをSEQ ID NO(PRT)：10043-10323に示す。 CD16の全長配列からなり、CD19を標的とするscFvに結合したvHHフラグメントまたはFHVHフラグメントからなる例示的なSARは、SEQ ID NO: 10324-10326で表される。 CD16全長配列からなり、アダプター（SEQ ID NO: 10331-32）またはscTCR（SEQ ID NO: 10329-10330）を含む例示的なSARもまた提供される。
異なる抗原を標的とするvHHおよびFHVHフラグメントと融合したCD16A全体からなる例示的なSARの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO (DNA):5040-5108およびSEQ ID NO (PRT):5340-5408で表される。これらのSARSの名称および標的抗原は、仮出願の表37に提供される。異なる抗原を標的とする非免疫グロブリン抗原結合ドメインと融合したCD16A全体からなる例示的なSARの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO (DNA):5110-5121およびSEQ ID NO (PRT):5410-5421で表される。これらのSARSの名称および標的抗原は、仮出願の表38に提供される。受容体、アダプターおよびサイトカインの細胞外抗原結合ドメインと融合したCD16A全体からなる例示的なSARの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO (DNA):5123-5129およびSEQ ID NO (PRT):5423-5429で表される。これらのSARSの名称および標的抗原は、仮出願の表39に記載されている。
本開示の異なるＳＡＲＳは、モジュール設計である。したがって、ＣＤ１６Ａ－Ｆ１５８Ｖ－ＦＬ－ｖ１をコードする配列（配列番号１４１５）は、異なるシグナル伝達モジュールをコードする配列（例えば、配列番号９６３５～９７４０；９８１３～９８５１）によって置き換えられ得る。このようなモジュールの例としては、CD16-F158V-D2TMCPv1 (配列番号1450)、CD16- F158V-Hinge-TM-CP (配列番号1451)、NKp30-ECDTMCP-opt1 (配列番号1369)、NKp30-Hingeが挙げられる。 -TMCP-opt1 (配列番号1370)、NKp44-ECDTMCP-opt1 (配列番号1382)、NKp44-Hinge-TM-CP-opt1 (配列番号1383)、NKp46-ECDTMCP-opt1 (配列番号1382) NO: 1395)、NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (配列番号: 1396)、NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1 (配列番号: 1397)、および NKp46-Hinge- TM-CP-opt1（配列番号1398）。 １つ以上のＣＤ１６Ａ－Ｆ１５８Ｖ－ＦＬ－ｖ１モジュールが異なるシグナル伝達モジュールで置き換えられる例示的なＳＡＲＳは、配列番号（ＰＲＴ）：９８６０～１００４２および配列番号（ＤＮＡ）：８７６８～８９５０によって表される。様々な例示的な構築物の名前および配列番号もまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる仮出願の表３３に示されている。
ＳＡＲの構築に使用することができる、異なる天然に存在する受容体の細胞外、膜貫通、およびサイトゾルドメインを含むポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号（ＰＲＴ）：９６３３～９６６８に提供される。例示的なＳＡＲを配列番号９８６０～９８９５に示す。 ＳＡＲの構築に使用することができる、異なる天然受容体のヒンジ、膜貫通、およびサイトゾルドメインを含むポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号（ＰＲＴ）：９６６９～９７０４に提供される。これらのポリペプチドに結合したCD19 scFvおよびCD28のヒンジドメインを含む例示的なCD19 SARを配列番号9896～9931に示す。 ＳＡＲの構築に使用することができる、異なる天然受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含むポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号（ＰＲＴ）：９７０５～９７４０に提供される。これらのポリペプチドに結合したCD19 scFvおよびCD28のヒンジドメインを含む例示的なCD19 SARを配列番号9957～9992に示す。上記のSARのいずれかにおけるCD19 scFVドメインは、異なる抗原結合ドメイン(例えば、scFv、vHH、FHVH、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、scTCR、scv-TCR、受容体のリガンド結合ドメイン、受容体結合)と置き換えることができる。 (リガンドまたはアダプターなどのドメイン) 新規 SAR を生成するために異なる抗原を標的とするドメイン。例示的な抗原結合ドメインは、仮出願の表３～１０に示されている。 SARはまた、天然に存在する受容体に結合した2つの異種抗原結合ドメインを含み得る。
一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲは、ＣＤ１６の細胞外ドメイン全体を含み、次の式を有する：
ＡＡＢＤ（ｎ）－ＣＤ１６ Ｄ１－ＣＤ１６リンカードメイン－ＣＤ１６ Ｄ２ドメイン－ＣＤ１６ヒンジドメイン－ＣＤ１６膜貫通ドメイン－ＣＤ１６細胞内ドメイン、ｎは１以上であり、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインを含む。 CD16細胞外ドメインは、F158V および S197P 変異を保有している可能性があります。 ＣＤ１６の細胞外ドメイン全体を含み、異なる抗原を標的とする例示的なＣＤ１６ ＳＡＲの核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号（ＤＮＡ）：４８５１～５１２９および８９５１～９２４４、ならびに配列番号（ＰＲＴ）：５１５１～５４２９に提供される。および10043-10336および仮出願の表36～39に記載されている。配列番号５１５１～５４２９、８９５１～９２４４のＳＡＲコンストラクトの抗原結合ドメインの組成および順序は、表３に示す配列番号２９２４～３１６０のｓｃＦｖの順序と同じである。配列番号９１４０～９１５３および９１８８～９２１５を有する構築物はＢＣＭＡを標的とし、配列番号９２１６～９２２２を有する構築物はＰＳＭＡを標的とし、配列番号９２２３～９２３１を有する構築物はメソテリンを標的とする。配列番号９２３２および９２３４を有する構築物は、ＣＤ１９およびＢＣＭＡの両方を標的とする二重特異性ＣＤ１６－ＳＡＲであり、一方、配列番号９２３３を有する構築物は、ＣＤ２０およびＣＤ１９を標的とする二重特異性ＣＤ１６ ＳＡＲである。配列番号９２３７および９２３８の構築物は、標的抗原としてＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（配列番号１０８８０）およびＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド（１１２～１２０）（配列番号１０８７９）ペプチドを標的とするｓｃＴＣＲを含むが、 ＳＡＲ配列番号９２４１を有する構築物は、ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド－２７０～２７９（配列番号１０８７８）を標的とする単一可変ドメインＴＣＲ（ｓｖｄ－ＴＣＲ）を含む。構築物配列番号９２３９および９２４０は、抗原結合ドメインとしてＲｚｉｐアダプターおよびＥＺｉｐアダプターを含む。最後に、配列番号９２４２～９２４４を有する構築物は、他のアダプターを含む。
単鎖 CD16-SAR を発現する T 細胞は、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、NFAT シグナル伝達を活性化し、IL2 産生を誘導し、T 細胞増殖を促進し、T 細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮する可能性があります。別の例示的な実施形態では、単鎖ＣＤ１６－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、ＩＬ２産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を促進し、ＮＫ細胞活性化を促進し、または細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、単鎖ＣＤ１６－ＳＡＲを発現する単球／マクロファージは、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、標的細胞の食作用を誘導することができる。別の例示的な実施形態では、単鎖ＣＤ１６－ＳＡＲを発現する顆粒球（例えば、好中球）は、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、標的細胞の食作用を誘導することができる。
特定の実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６またはその変異体の部分配列または全体配列を含む２つの鎖を含む、ＣＤ１６－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６細胞外ドメインの部分領域または全体領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示の二本鎖CD16-SARの構築に使用できる例示的なCD16細胞外ドメイン配列は、配列番号(DNA):1496～1509および配列番号(PRT):3890～3903に提供される。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６ヒンジドメインの部分領域または全体領域を含む二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示の二本鎖CD16-SARの構築に使用できる例示的なCD16ヒンジドメイン配列は、配列番号(DNA):1545～1547および配列番号(PRT):3939～3941に提供される。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含む、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示の二本鎖CD16-SARの構築に使用できる例示的なCD16膜貫通配列は、配列番号(DNA):1528～1530および配列番号(PRT):3922～3924で提供される。一実施形態では、本開示は、各鎖がＣＤ１６サイトゾルドメインの部分的または全体の領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示のＣＤ１６－ＳＡＲの構築に使用できる例示的なＣＤ１６膜貫通配列は、配列番号（ＤＮＡ）：１５５６～１５５８および配列番号（ＰＲＴ）：３９５０～３９５２で提供される。
本開示は、抗体のvLフラグメントが2つのCD16鎖のうちの1つに結合することができ、vHフラグメントが他のCD16鎖に結合できることを提供する。このような2つの鎖（例えば、vL- CD16およびvH- CD16）が同一細胞内で共発現すると、vL断片およびvH断片は同族抗原と結合し、細胞シグナルを伝達することができる。例示的な実施形態では、そのようなＣＤ１６－ＳＡＲを発現するＴ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、ＮＦＡＴシグナル伝達を活性化し、ＩＬ２産生を誘導し、Ｔ細胞増殖を促進し、Ｔ細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、このようなＣＤ１６－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、ＩＬ２産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を促進し、ＮＫ細胞活性化を促進し、または細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、そのようなＣＤ１６－ＳＡＲを発現する単球／マクロファージは、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、標的細胞の食作用を誘導することができる。別の例示的な実施形態では、単鎖ＣＤ１６－ＳＡＲを発現する単球／マクロファージは、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、標的細胞の食作用を誘導することができる。別の例示的な実施形態では、単鎖ＣＤ１６－ＳＡＲを発現する顆粒球（例えば、好中球）は、同族標的抗原を発現する細胞に曝露されると、標的細胞の食作用を誘導することができる。
二重鎖CD16-SARの発現および活性は、vL／vHとCD16フラグメントとの間にリンカーを組み込むことによって、さらに増大させることができる。特に、IgCL（SEQ ID NO（DNA）；1142およびSEQ ID NO (PRT): 3536）およびIgCHドメイン（SEQ ID NO (DNA)： 抗体由来のIgCLドメイン(SEQ ID NO (DNA): 1143-1157 and SEQ ID NO (PRT): 3537-3551)は、vL/vHフラグメントとCD16フラグメントの間の有用なリンカーとして機能する。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３ ；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
一実施形態では、二重鎖CD16 SARの各鎖は、CD16膜貫通ドメインおよびCD16細胞質ドメインにCD16ヒンジドメインを介して結合している、両方の免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、D1およびD2）からなるCD16細胞外ドメインからなる。 CD20およびBCMAを標的とするこのような二重鎖CD16 SARの例は、SAR CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-xho-IgCL-Bam-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SP-Apa-によって表される。 BCMA917-vHH-E59D-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-PAC (配列番号(DNA): 1633 および配列番号(PRT): 4027) 。このSARでは、CD20 vHHドメインがIgCLリンカーを介して一方のCD16鎖に結合し、BCMA vHHがIgG1-CH1リンカーを介してもう一方のCD16鎖に結合している。この二重鎖CD16 SARの2つの鎖は、P2A切断可能なリンカーを介在させた単一のベクターから発現される。このSAR構築物はピューロマイシン耐性カセット（PAC）も発現するが、これはオプションである。 CD19を標的とする別の例示的な二本鎖CD16 SARは、CD8SP-hu-mROO5-1-vL-xho-IgCL-Bam-CD16-F158V-FL-TMCP-v1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vHによって表される-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F-F2A-K13-opt（配列番号（DNA）：1628および配列番号（PRT）：4022）。このSARでは、hu-mROO5-1 vLドメインがIgCLリンカーを介して一方のCD16鎖に結合し、hu-mROO5-1 vHドメインがIgG1-CH1リンカーを介してもう一方のCD16鎖に結合している。 hu-mROO5-1 vLおよびvHフラグメントは結合して、ヒトCD19に結合できるFvを形成する。この二重鎖 CD16 SAR の 2 つの鎖は、P2A 切断可能なリンカーを介して単一のベクターから発現されます。このSAR構築物は、ヒトヘルペスウイルス8由来のコドン最適化vFLIP K13モジュールを含むアクセサリーモジュールも発現するが、これは任意である。配列番号(DNA):1629および配列番号(PRT):4023で表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1628および配列番号(PRT):4022で表されるSAR構築物と類似しているが、例外として、K13 モジュールが伝染性軟属腫ウイルスの MC159 モジュールに置き換えられます。配列番号(DNA):1630および配列番号(PRT):4024によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1628および配列番号(PRT):4022によって表されるSAR構築物と類似しているが、例外は、K13 モジュールがピューロマイシン耐性遺伝子に置き換えられることです。配列番号(DNA):1625および配列番号(PRT):4020によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1630および配列番号(PRT):4024によって表されるSAR構築物と類似しているが、例外として、IgCL および IgG1-CH1 リンカー ドメインが欠落しており、hu-mROO5-1 vL および vH フラグメントが 2 つの CD16 鎖に直接結合しています。配列番号(DNA):1631および配列番号(PRT):4025によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1630および配列番号(PRT):4024によって表されるSAR構築物と類似しているが、例外は、ヒトCD20を標的とするvHHドメインが短いGly4Serx2リンカー(配列番号(DNA):1024)を介してhu-mROO5-1 vL領域のアミノ末端に結合していることである。この構築物は、CD19 と CD20 の両方をターゲットにすることができます。配列番号(DNA):1632および配列番号(PRT):4026によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1631および配列番号(PRT):4025によって表されるSAR構築物と類似しているが、例外は、ヒトBCMAを標的とするvHHドメインが短いG4Sx3リンカー(配列番号(DNA):40)を介してhu-mROO5-1 vH領域のアミノ末端に結合していることである。この構築物は、CD19、CD20、および BCMA をターゲットにすることができます。配列番号(DNA):1634および配列番号(PRT):4028によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1630および配列番号(PRT):4024によって表されるSAR構築物と類似しているが、 IgCLおよびIgG1-CH1リンカードメインがTCRb-ECD（TCRb-wt-opt-8ECD;配列番号1166）およびTCRa-ECD（TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD;配列番号）によって置き換えられるという例外ID NO: 1168) リンカードメイン。配列番号(DNA):1635および配列番号(PRT):4029によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1631および配列番号(PRT):4025によって表されるSAR構築物と類似しているが、 IgCLおよびIgG1-CH1リンカードメインがTCRb-ECD（TCRb-wt-opt-8ECD;配列番号1166）およびTCRa-ECD（TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD;配列番号）によって置き換えられるという例外ID NO: 1168) リンカードメイン。配列番号(DNA):1636および配列番号(PRT):4030によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1632および配列番号(PRT):4026によって表されるSAR構築物と類似しているが、 IgCLおよびIgG1-CH1リンカードメインがTCRb-ECD（TCRb-wt-opt-8ECD;配列番号1166）およびTCRa-ECD（TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD;配列番号）によって置き換えられるという例外ID NO: 1168) リンカードメイン。配列番号(DNA):1637および配列番号(PRT):4031によって表される二本鎖CD16 SARは、配列番号(DNA):1633および配列番号(PRT):4027によって表されるSAR構築物と類似しているが、 IgCLおよびIgG1-CH1リンカードメインがTCRb-ECD（TCRb-wt-opt-8ECD;配列番号1166）およびTCRa-ECD（TCRa-Ig-Like-C1-Domain-6MD;配列番号）によって置き換えられるという例外ID NO: 1168) リンカードメイン。
一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６の部分的または全体の領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、各鎖がCD16細胞外ドメインの一部または全領域を含む二重鎖CD16 SARを提供する。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６ Ｄ１ドメインの部分領域または全体領域を含む二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６ Ｄ２ドメインの部分領域または全体領域を含む、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６ヒンジドメインの部分領域または全体領域を含む二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、各鎖がＣＤ１６サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含む、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、ＣＤ１６ヒンジドメインを介してＣＤ１６膜貫通ドメインおよびＣＤ１６サイトゾルドメインに結合する免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、Ｄ１およびＤ２）の両方を含むＣＤ１６細胞外ドメインを含む。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、抗体のＦｃ領域、抗体フラグメントまたは二重特異性／三重特異性エンゲージャーに結合し、抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力も保持する。一実施形態では、二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、ＣＤ１６ヒンジドメインを介してＣＤ１６膜貫通ドメインおよびＣＤ１６サイトゾルドメインに結合する第２の免疫グロブリン様ドメイン（すなわち、Ｄ２）を含む部分的ＣＤ１６細胞外ドメインを含む。一実施形態では、このような二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、ＣＤ１６のＤ２ドメインのみを含み、Ｄ１ドメインを欠いているため、抗体または抗体断片のＦｃ部分に結合する能力を欠いている。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、ＣＤ１６膜貫通ドメインおよびＣＤ１６サイトゾルドメインに結合する部分的または全体のＣＤ１６ヒンジドメインを含む。一実施形態では、このような二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、Ｄ１およびＤ２ドメインの両方を欠いているため、抗体または抗体断片のＦｃ部分に結合する能力を欠いている。
必要に応じて介在してＣＤ１６のＤ２ドメインとヒンジドメインとの間に挿入されるＡＡＢＤ（例えば、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、ｃｈＶＨ、セントチリン、アフィボディなど）を含む。リンカー（例えば、グリシン-セリンリンカー）。例示的な実施形態では、アミノ末端からカルボキシ末端までの二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを含むそのような鎖の異なるドメインには、Ｎ末端シグナルペプチド、ＣＤ１６－Ｄ１ドメイン、ＣＤ１６－Ｄ２ドメイン、任意のリンカー、ＡＡＢＤ（例えば、ｖＨＨ）が含まれる。 、ＦＨＶＨ、セントチリン、アフィボディなど）、任意のリンカー、ＣＤ１６ヒンジドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメインおよびＣＤ１６サイトゾルドメイン。
二本鎖CD16 SARの構築に使用され得る様々なCD16ドメイン(すなわち、細胞外、D1、D2、ヒンジ、膜貫通およびサイトゾルなど)は、それらの全配列または欠失変異体を含み得ること、またはそのドメインの機能的特性を保持している限り、バリアントとなります。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの一方または両方の鎖の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンド、または受容体の細胞外ドメイン。
一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの両方の鎖が抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの鎖のうちの１つだけが抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの鎖の１つは、非天然抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン）を含む。骨格、リガンド、または受容体の細胞外ドメイン）、第二の鎖は、CD16細胞外ドメインを介して抗体または抗体フラグメントのFc部分、または二重特異性/三重特異性エンゲージャーに結合します。
一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの一方の鎖は、ｖＬドメインからなる抗原結合ドメインを含み、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの第２の鎖は、ｖＨドメインからなる抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、二重鎖CD16 SARの両鎖は、同じクラス（すなわち、scFv、vHH、FHVH、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体など）の抗原結合ドメインからなる。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖は、ｖＨＨドメインを含む。一実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの各鎖はＦＨＶＨドメインを含む。一実施形態では、二重鎖CD16 SARの両鎖は、異なるクラス（すなわち、scFv、vHH、FHVH、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体など）の抗原結合ドメインからなる。例示的な実施形態では、二本鎖ＣＤ１６ ＳＡＲの一方の鎖は、ｖＨＨドメインに由来する抗原結合ドメインを含み、一方、第２の鎖は、ＦＨＶＨドメインに由来する抗原結合ドメインを含む。
二本鎖CD16 SARの2つの鎖は、同じ抗原(例えば、CD19)または異なる抗原(例えば、CD19およびCD20)を標的とすることができる。二本鎖CD16 SARの2つの鎖は、単一抗原(例えばCD19)または2つの異なる抗原(例えばCD19およびCD20)の2つの異なるエピトープを標的とすることができる。二本鎖SARの各鎖は、1つの抗原または複数の抗原(例えば、2つ、3つ、4つなど)に結合し得る。二本鎖CD16 SARの各鎖は、アダプター(例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど)をさらに含み得る。
別の実施形態では、共刺激ドメインは、二本鎖ＣＤ１６－ＳＡＲのＣＤ１６鎖の一方または両方にも組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BB、CD28、OX40および2B4などの共刺激ドメインが含まれる(表30;配列番号(DNA):1565～1572および配列番号(PRT):3959～3966)。まとめると、上記の結果は、CAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、SAR への補完的なアプローチも提供します。
本明細書に記載されるCD16A-SARの2つの鎖は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖に翻訳され、その後、異なるタンパク質に切断される。本明細書に記載されるCD16A-SARの2つの鎖は、2つの別個のプロモーターを使用して発現され、2つの別個のポリヌクレオチド鎖によってコードされ得る。本明細書に記載されるCD16A-SARの2つの鎖は、単一のベクターによってコードされ得る。本明細書に記載されるCD16A-SARの2つの鎖は、2つの異なるベクターによってコードされ得る。 ＣＤ１６－ＳＡＲをコードする核酸分子は、１つ以上のリーダー配列（シグナルペプチドとしても知られる）を含むことができる。一実施形態では、ＣＤ１６Ａ－ＳＡＲの各機能単位（例えば、ＣＤ３ｚ鎖に結合した抗原結合ドメインとフリン－ＳＧＳＧ切断可能なリンカー）は、次のようにＣＤ１６Ａ－ＳＡＲを細胞表面に向けるリーダー配列によって先行することができる。 I型膜貫通タンパク質。一実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲの抗原結合ドメインは細胞外に面している。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、配列番号３１～３４のいずれかの核酸配列および配列番号２４２５～２４２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、短い核酸配列（３～９個の核酸）含む制限酵素部位は、CD16A-SARの異なるサブユニット間、例えば、シグナル配列とCD16-SARの抗原結合ドメインの間、または抗原結合鎖とCD16鎖の間に位置する。
本開示の異なるＳＡＲＳは、モジュール設計である。したがって、CD16A-F158V-FL-v1 (配列番号1415)およびCD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3 (配列番号1417)をコードする配列は、異なるシグナル伝達モジュールをコードする配列によって置き換えられ得る(表25）。例示的なそのようなモジュールとしては、CD16-F158V-D2TMCPv1（SEQ ID NO: 1450）、CD16-F158V-Hinge-TM-CP（SEQ ID NO: 1451）、NKp30-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1369）、NKp30-Hinge-TMCP-opt1（SEQ ID NO： 1370）、NKp44-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1382）、NKp44-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO: 1383）、NKp46-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1395）、NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO： 1396）、NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO: 1397）、およびNKp46-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO: 1398）、41BB-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1573）、CD28-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO： 1575）、OX40-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1577）、2B4-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1579）、CD32-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1581）およびCD64-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1583）が挙げられる。CD16A-F158V-FL-v1およびCD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3モジュールの1つ以上が異なるシグナル伝達モジュールに置き換えられた例示的なSARSのSEQ ID NOは、仮出願の表33に示されている。
特定の実施形態において、本開示は、CD16の部分領域または全領域を組み込んだ2本の鎖を含む、CD16-SARと称される合成抗原受容体の新規なプラットフォームを提供する。
代替の実施形態において、本開示は、鎖の１つがＣＤ１６細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示の二本鎖CD16-SARの構築に使用できる例示的なCD16細胞外ドメイン配列は、配列番号(DNA):1496～1509および配列番号(PRT):3890～3903に提供される。一実施形態において、本開示は、鎖の一方がCD16ヒンジドメインの部分領域または全領域を含む二重鎖CD16 SARを提供する。本開示の二本鎖CD16-SARの構築に使用できる例示的なCD16ヒンジドメイン配列は、配列番号(DNA):1545～1547および配列番号(PRT):3939～3941に提供される。一実施形態では、本開示は、鎖の１つがＣＤ１６膜貫通ドメインの部分的または全体の領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示の二本鎖CD16-SARの構築に使用できる例示的なCD16膜貫通配列は、配列番号(DNA):1528～1530および配列番号(PRT):3922～3924で提供される。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＣＤ１６サイトゾルドメインの部分的または全体の領域を含む二重鎖ＣＤ１６ ＳＡＲを提供する。本開示のＣＤ１６－ＳＡＲの構築に使用できる例示的なＣＤ１６膜貫通配列は、配列番号（ＤＮＡ）：１５５６～１５５８および配列番号（ＰＲＴ）：３９５０～３９５２で提供される。
本開示は、抗体のvLフラグメントをCD16鎖に結合させ、vHフラグメントをCD3z、FcRγ. NKp30、NKp44、NKp46、TCRα定数鎖、TCRβ定数鎖、TCRγ定数鎖またはTCRδ定数鎖などの別のシグナル伝達鎖に結合させることができることを提供する。あるいは、本開示は、抗体のvHフラグメントをCD16鎖に結合させ、vLフラグメントをCD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46、TCRα定数鎖、TCRβ定数鎖、TCRγ定数鎖またはTCRδ定数鎖などの別のシグナル伝達鎖に結合させることができることを提供する。このような2つの鎖（例えば、vL- CD16とvH- CD3z）が同一細胞内で共発現すると、vL断片とvH断片は同族抗原と結合し、T細胞シグナルを伝達することができる。特に、そのようなCD16ヘロ二量体SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、このようなＣＤ１６－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露された場合、ＩＬ２産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を促進し、ＮＫ細胞活性化を促進し、または細胞毒性を発揮することができる。 CD16ヘテロ二量体SARの発現および活性は、vL/vHとCD16および他のシグナル伝達鎖(例えば、CD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46など)との間にリンカーを組み込むことによってさらに増加させることができる。特に、IgCL（SEQ ID NO（DNA）．1142およびSEQ ID NO (PRT): 3536）およびIgCHドメイン（SEQ ID NO (DNA)： 抗体由来のIgCLドメイン(SEQ ID NO (DNA): 1143-1157 and SEQ ID NO (PRT): 3537-3551)は、vL/vHフラグメントとCD16フラグメントの間の有用なリンカーとして機能する。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
本開示の異なるＳＡＲＳは、モジュール設計である。したがって、CD16A-F158V-FL-v1をコードする配列（配列番号1415）は、仮出願の表25に示される異なるシグナル伝達モジュールをコードする配列に置き換えることができる。例示的なそのようなモジュールとしては、CD16-F158V-D2TMCPv1（SEQ ID NO: 1450）、CD16-F158V-Hinge-TM-CP（SEQ ID NO: 1451）、NKp30-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1369）、NKp30-Hinge-TMCP-opt1（SEQ ID NO： 1370）、NKp44-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1382）、NKp44-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO: 1383）、NKp46-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1395）、NKp46-Linker-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO： 1396）、NKp46-Ig1-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO: 1397）、NKp46-Hinge-TM-CP-opt1（SEQ ID NO: 1398）、41BB-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1573）、CD28-ECDTMCP-opt1（SEQ ID NO： 1575）、OX40-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1577）、2B4-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1579）、CD32-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1581）およびCD64-ECTTMCP-opt1（SEQ ID NO: 1583）。CD16A-F158V-FL-v1モジュールの1つ以上が異なるシグナル伝達モジュールに置き換えられた例示的なSARSのSEQ ID NOを表33に示す。
また、本明細書では、本明細書で企図され記載される編集の中でも特に、CD16 SARを含むように遺伝子操作されたクローンiPSCも提供される。一実施形態では、ＣＤ１６ ＳＡＲは、高親和性ＣＤ１６ ＳＡＲまたは高親和性非切断性ＣＤ１６ ＳＡＲ（ｈｎＣＤ１６－ＳＡＲ）である。遺伝子操作されたiPSCは、iPSCに導入されたCD16-SAR(例えば、高親和性CD16 SARまたはhnCD16-SAR)を含むエフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲを含む誘導エフェクター細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲを含む誘導エフェクター細胞はＴ細胞である。一実施形態では、ｉＰＳＣまたはその派生細胞において発現されるＣＤ１６－ＳＡＲ（例えば、高親和性ＣＤ１６ ＳＡＲまたはｈｎＣＤ１６－ＳＡＲ）は、ＡＤＣＣ抗体またはその断片だけでなく、二重特異性、三重特異性、または多重特異性にも結合する。前記ＣＤ１６ ＳＡＲのＣＤ１６またはＣＤ６４細胞外結合ドメインを認識するエンゲイジャーまたはバインダー。したがって、本出願は、誘導体エフェクター細胞上で発現されるCD16-SARの細胞外ドメインとの結合を介して、1つまたは複数の予め選択されたADCC抗体を予めロードされた、誘導体エフェクター細胞またはその細胞集団を提供する。状態、疾患の治療における治療的使用であって、前記ＣＤ１６－ＳＡＲが、ＣＤ６４の細胞外結合ドメイン、またはＦＩ７６ＶおよびＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む、方法。一実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ＡＡＢＤ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、受容体の細胞外ドメイン、リガンド、または別の非免疫グロブリン抗原結合モジュールを含む。一実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲは、ＣＤ１６またはＣＤ６４のＦｃ結合ドメインのＮ末端またはその近くに結合した抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲは、 Ｆｃ結合ドメインのＮ末端にまたはその近くに結合された抗原結合ドメイン（例えば、ＡＡＢＤ、例えば、ＦＨＶＨ、ｃｈＶＨ、ａＶＨ、ｖＨＨ、Ｄａｒｐｉｎ、セントチリン、アフィボディなど）をさらに含む。 CD16 または CD64 の。
いくつかの他の実施形態では、キメラＦｃ－ＳＡＲ（ＣＦｃ ＳＡＲ）は、非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメインおよび／または非天然シグナル伝達ドメインを含むように生成される。本明細書で使用される「非天然」または「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体に由来することを意味する。ここでの図では、CD16 またはその変異体に基づく CFc-SAR には、CD16 に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、またはシグナル伝達ドメインがありません。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６ベースのＣＦｃ－ＳＡＲは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、 0X40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL-7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DSI、MKp30、MKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受容体ポリペプチド。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃ－ＳＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、 CTLA-4、または NKG2D ポリペプチド。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６ベースのＣＦｃ－ＳＡＲは、ＣＤ３ｚ、２Ｂ４、 ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、 NKp46、NKG2C、またはNKG2Dポリペプチド。 ＣＤ１６－ＳＡＲの一実施形態では、提供されるキメラ受容体は、両方ともＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、およびＮＫＧ２Ｄポリペプチドの１つに由来する膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。 CD16ベースのCFc-SARの特定の一実施形態は、NKG2Dの膜貫通ドメイン、2B4の刺激ドメイン、およびCD3zのシグナル伝達ドメインを含む。 ＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４またはＣＤ１６の細胞外ドメインの全長または部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ（または１５８Ｖ）およびＳ１９７Ｐ（またはＳ１９７Ｒ）を含む。
ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ－ＳＡＲの別の実施形態は、ＣＤ３ｚの膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。ここで、CD16の細胞外ドメインは、CD64またはCD16の細胞外ドメインの全長または部分配列に由来し、CD16の細胞外ドメインはFI76VおよびS197Pを含む。一実施形態では、ＣＤ１６キメラＦｃ ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ＡＡＢＤ（例えば、ＦＨＶＨ、ｖＨＨなど）、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、リガンド、受容体の細胞外ドメイン、または別の非免疫グロブリン抗原結合モジュールを含む。一実施形態では、ＣＤ１６キメラＦｃ ＳＡＲは、ＣＤ１６またはＣＤ６４のＦｃ結合ドメインのＮ末端またはその近くに結合した抗原結合ドメインをさらに含む。一実施形態では、hnCD16-キメラFc SARは、 FcのN末端またはその近くに結合した抗原結合ドメイン(例えば、AABD、例えば、FHVH、chVH、aVH、vHH、Darpin、センチリン、アフィボディなど)をさらに含む。 CD16 または CD64 の結合ドメイン。
上述のＣＤ１６ベースのキメラＦｃ ＳＡＲの様々な実施形態は、抗体またはその断片のＦｃ領域に結合することができる。または二重、三重、または多重特異性のエンゲージャーまたはバインダーの Fc 領域に対して。さらに、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ ＳＡＲは、それらの抗原結合ドメインによって特定される抗原（すなわち、ＡＡＢＤ、ｓｃＦｖ、Ｆｖなど）に結合することができる。したがって、BCMA-FHVHに基づく抗原結合ドメインを有するCD16ベースのキメラFc SARは、BCMAに結合する能力を有しつつ、抗体のFc領域に結合する可能性がある。結合すると、CD16-CFc SAR の刺激ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化およびサイトカイン分泌を可能にし、抗体またはその抗原結合ドメイン (例: AABD、 scFv 、 Ｆｖなど）、またはＦｃ領域だけでなく腫瘍抗原結合成分を有する前記二重特異性、三重特異性、または多重特異性エンゲージャーまたは結合剤。理論に制限されることなく、CD16 ベースのキメラ Fc 受容体の非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメイン、または細胞外ドメインへのエンゲイジャー結合を通じて、CFc-SAR はエフェクター細胞の殺傷能力に寄与する可能性があります。エフェクター細胞の増殖および/または拡大の可能性を増加させます。抗体とエンゲージャーは、抗原を発現する腫瘍細胞とCFc-SARを発現するエフェクター細胞を近接させることができ、これは腫瘍細胞の死滅の促進にも寄与します。二重、三重、多重特異性エンゲージャーまたは結合剤の例示的な腫瘍抗原には、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、 CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC 12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA /B、PSMA、PAMA、P-カドヘリン、ROR1。腫瘍細胞を攻撃する際にＣＤ１６ベースのＣＦｃ－ＳＡＲを発現するエフェクター細胞を関与させるのに適したいくつかの非限定的な例示的な二重、三重、多重特異性エンゲージャーまたはバインダーには、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（またはＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、 CD16 (または CD64)-IL15 -EPCAM、および CD16 (または CD64)-IL15-CD33。
誘導体NKにおける切断不可能なバージョンのCD16-SAR（hnCD16- SARなど）は、CD16の脱落を回避し、一定の発現を維持します。派生 NK 細胞では、非切断性 CD16-SAR により TNFa および CD107a の発現が増加し、細胞機能の向上が示されます。非切断性 CD16 はまた、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC)、および二重、三重、または多重特異性エンゲージャーの関与を強化します。 ADCC は、抗体でコーティングされた標的細胞への CD16 の結合を介した NK 細胞媒介溶解のメカニズムです。派生NK細胞に導入されたhnCD16-SARのさらなる高親和性特性により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、CD16を介してADCC抗体をNK細胞にin vitroでロードすることも可能になります。提供されるように、hnCD16-SARは、F176V(または158V)およびS197P(またはS197R)を含み得る。開示されるように、本出願はまた、状態、疾患、または感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つまたは複数の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予め負荷された、派生ＮＫ細胞またはその細胞集団を提供する。
例えば、ＡＡＢＤ、ｓｃＦｖ、Ｆｖなど）に結合した野生型ＣＤ１６配列を含む。したがって、本開示のCD16-SARは、hnCD16または野生型CD16コード領域を含み得る。
一実施形態では、本開示のＣＤ１６－ＳＡＲは、ＣＤ１６またはその変異体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインにインフレームで融合されたＣＤ３２またはＣＤ６４のＦｃ結合領域を含む。例示的な実施形態では、そのようなＣＤ１６ ＳＡＲにおける異なるモジュールの順序は、ＮＨ ２ からＣ末端まで以下を含み得る：
抗原結合ドメイン(n) - CD32 - Fc結合ドメイン - CD16膜貫通ドメイン - CD16 - 細胞内ドメイン;ここで、n = 1、2、3、またはそれ以上です。
例示的な実施形態では、そのようなＣＤ１６ ＳＡＲにおける異なるモジュールの順序は、ＮＨ ２ からＣ末端まで以下を含み得る： ここで、ｎ＝１、２、３、またはそれ以上。
抗原結合ドメイン(n)-CD64-Fc結合ドメイン-CD16膜貫通ドメイン-CD16-細胞内ドメイン
ＣＤ６４の細胞外ドメインとＣＤ１６の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合したＣＤ２０ ｖＨＨドメインを含む例示的なＣＤ２０標的ＳＡＲ構築物は、配列番号（ＤＮＡ）：２３２８および配列番号（ＰＲＴ）：４７２２によって表される。他の抗原を標的とするドメインは、CD20 vHHドメインを、異なる抗原を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、scFv、vHH、FHVH、セントイリンなど)で置き換えることによって生成することができる。
初代NK細胞とは異なり、一次供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、または他のドナー組織などの天然/天然供給源）由来の成熟T細胞はCD16を発現しません。外因性CD16-SAR構築物を発現する成熟T細胞がCD16 SARの細胞表面発現を示し、標的抗原発現細胞に曝露されたときに細胞シグナル(例えば、NFATシグナル伝達)を伝達できることは予想外であった。
また、発現された外因性 CD16-SAR を含む iPSC が T 細胞の発生生物学を損なわず、外因性 CD16-SAR を発現するだけでなく、獲得されたADCCメカニズム。派生T細胞におけるこの獲得されたADCCは、二重標的化のためのアプローチとして、および/またはCAR-T細胞療法で頻繁に起こる抗原逃避を救済するためのアプローチとしてさらに使用することができ、CAR-T標的抗原発現または発現の減少または喪失により腫瘍が再発する場合に使用することができる。 CAR (キメラ抗原受容体) による認識を避けるために、変異した抗原を除去します。前記派生Ｔ細胞が外因性ＣＤ１６－ＳＡＲ発現を介して獲得されたＡＤＣＣを含む場合、および抗体がＳＡＲによって標的化される腫瘍抗原とは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体は、ＳＡＲ－Ｔ抗原の回避をレスキューし、再発または再発を軽減または予防するために使用することができる。 CAR-T治療でよく見られる標的腫瘍の再発。二重標的化を達成しながら抗原逃避を低減および/または防止するこのような戦略は、1つまたは複数のSARを発現するNK細胞にも同様に適用可能である。
したがって、本開示は、外因性ＣＤ１６－ＳＡＲを含む派生Ｔ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６－ＳＡＲは、ＣＤ１６の野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、派生Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ（１５８Ｖ）およびＳ１９７Ｒ（またはＳ１９７Ｐ）を含む。いくつかの他の実施形態では、派生Ｔ細胞に含まれるｈｎＣＤ１６は、ＣＤ６４に由来する完全または部分的な細胞外ドメインを含むか、または非天然膜貫通ドメイン、刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。説明したように、このような派生 T 細胞は、ADCC によって媒介されるモノクローナル抗体で腫瘍を標的にし、抗体の治療効果を高める獲得機構を備えています。開示されるように、本出願はまた、状態、疾患、または感染症の治療における治療的使用に十分な量で、１つまたは複数の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予め負荷された、誘導Ｔ細胞またはその細胞集団を提供する。
初代NK細胞および初代T細胞に加えて、本開示のCD16 SARは不死化細胞株で発現させることができる。本開示のＣＤ１６ ＳＡＲの発現に適した例示的な不死化細胞株には、ＮＫ９２細胞株およびＮＫ９２ＭＩ細胞株が含まれる。さらに、本開示のＣＤ１６ ＳＡＲは、多能性造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞）で発現させることができ、これを分化させて、異なる系統に属するＣＤ１６ ＳＡＲ発現血液細胞を生成することができる。
特定の実施形態において、本開示は、ＮＫｐ３０鎖の全体または部分配列を含む、ＮＫｐ３０－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
NKp30 SARの構築に使用できるNKp30鎖の核酸配列は、配列番号1395～1414に提供される(仮出願の表25)。対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3789～3808に示す。
一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ３０の部分領域または全体領域を含む単鎖ＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。代替の実施形態では、本開示は、ＮＫｐ３０細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む単鎖ＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ３０ヒンジドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ３０膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、ＮＫｐ３０サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、ＮＫｐ３０ ＳＡＲは、ＮＫｐ３０ヒンジドメインを介してＮＫｐ３０膜貫通ドメインおよびＮＫｐ３０サイトゾルドメインに結合するＮＫｐ３０ Ｉｇドメインを含む。一実施形態では、ＮＫｐ３０ ＳＡＲは、ＮＫｐ３０膜貫通ドメインおよびＮＫｐ３０サイトゾルドメインに結合したＮＫｐ３０ヒンジドメインを含む。
ＳＡＲの構築に使用され得る様々なＮＫｐ３０ドメイン（すなわち、細胞外、Ｉｇドメイン、ヒンジ、膜貫通、およびサイトゾル）は、その配列全体または欠失変異体もしくは変異体を含み得ることが理解されるべきである。ドメインは、その機能的特性の少なくとも一部を保持します。
一実施形態では、ＮＫｐ３０ ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体を含む。単鎖ＳＡＲの鎖は、１つの抗原または複数の抗原（例えば、２つ、３つ、４つなど）に結合し得る。単鎖NKp30 SARの鎖は、1つまたは複数のアダプター(例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど)をさらに含み得る。
開示のＮＫｐ３０ ＳＡＲは、一般式：
ＡＡＢＤ（ｎ）－任意のＮＫｐ３０ Ｉｇドメイン、ＮＫｐ３０ヒンジドメイン－ＮＫｐ３０膜貫通ドメイン－任意の細胞内共刺激ドメイン（ｎ）－ＮＫｐ３０細胞内シグナル伝達ドメイン（ｎは１以上）。一実施形態では、ｎは少なくとも２、例えば２、３、４または５である。ＡＡＢＤ（自律抗原結合ドメイン）は、抗原結合ドメインを形成し、細胞内で発現される場合には細胞外側に位置する。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨドメインである。一実施形態では、ＡＡＢＤは、完全ヒト単一ＶＨ（ＳＶＨ）ドメインまたはヒト化ＳＶＨドメインである。 SVH ドメインは自律 vH ドメインとしても知られ、vL ドメインが存在しない場合でもターゲットに結合できます。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
は、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、ＺＩＰドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｒ４など）、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディなどの非免疫グロブリン抗原結合足場である。 、レペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、またはその断片；受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＣＤ１６－Ｆ１５８Ｖ、ＮＫＧ２Ｄ）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、トロンボポエチン）など。
開示のＮＫｐ３０ ＳＡＲは、一般式：
ｓｃＦｖ（ｎ）－ＮＫｐ３０ Ｉｇドメイン－ＮＫｐ３０ヒンジドメイン－ＮＫｐ３０膜貫通ドメイン－任意の－細胞内共刺激ドメイン（ｎ）－任意のＮＫｐ３０細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、ｎは１以上である。特定の実施形態において、本開示は、２つのＮＫｐ３０鎖の全体または部分配列を含む、ＮＫｐ３０－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
本開示は、抗体のｖＬフラグメントが２つのＮＫｐ３０鎖のうちの１つに結合することができ、ｖＨフラグメントが他のＮＫｐ３０鎖に結合することができることを規定する。このような2つの鎖(例えば、 vL-NKp30およびvH-NKp30)が同じ細胞内で共発現される場合、vLおよびvHフラグメントはそれらの同族抗原に結合し、T、NK細胞またはマクロファージシグナルを伝達することができる。特に、このようなNKp30-SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の実施形態では、このようなＮＫｐ３０－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、ＮＫ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞の活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。 NKp30-SAR の発現と活性は、vL/vH フラグメントと NKP30 フラグメントの間にリンカーを組み込むことによってさらに高めることができます。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと NKp30 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
別の実施形態では、共刺激ドメインもＮＫｐ３０－ＳＡＲのＮＫｐ３０鎖に組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BB、CD28、OX40および2B4などの共刺激ドメインが含まれる(表30;配列番号(DNA):1565～1572および配列番号(PRT):3959～3966)。まとめると、上記の結果は、SAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、SAR への補完的なアプローチも提供します。
本明細書に記載されるＮＫｐ３０－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖に翻訳され、その後、異なるタンパク質に切断される。本明細書に記載されるＮＫｐ３０－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの別個のプロモーターを使用して発現され、２つの別個のポリヌクレオチド鎖によってコードされ得る。本明細書に記載されるＮＫｐ３０－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のベクターによってコードされ得る。本明細書に記載されるＮＫｐ３０－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの異なるベクターによってコードされ得る。 NKp30-SARをコードする核酸分子は、1つまたは複数のリーダー配列(シグナルペプチドとしても知られる)を含むことができる。一実施形態では、ＮＫｐ３０－ＳＡＲの各機能単位（例えば、ＣＤ３ｚ鎖に結合した抗原結合ドメインとフリン－ＳＧＳＧで切断可能なリンカー）は、ＮＫｐ３０－ＳＡＲを細胞表面に向けるリーダー配列によって先行することができる。 I型膜貫通タンパク質。一実施形態では、ＮＫｐ３０－ＳＡＲの抗原結合ドメインは細胞外に面している。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、配列番号３１～３４のいずれかの核酸配列および配列番号２４２５～２４２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、短い核酸配列（３～９個の核酸）制限酵素部位を含む制限酵素部位は、NKp30-SARの異なるサブユニット間、例えば、シグナル配列とNKp30-SARの抗原結合ドメインの間、または抗原結合とNKp30鎖の間に位置する。
特定の実施形態において、本開示は、２つの鎖を含み、そのうちの１つがＮＫｐ３０の部分領域または全体領域を組み込む、ＮＫｐ３０－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
代替の実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ３０細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む二重鎖ＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ３０ヒンジドメインの部分的または全体の領域を含む、二本鎖ＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ３０膜貫通ドメインの部分的または全体の領域を含む、二重鎖ＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ３０サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含む二重鎖ＮＫｐ３０ ＳＡＲを提供する。
本開示は、抗体のvL断片をNKp30鎖に結合させることができ、vH断片をCD3z、FcRγなどの別のシグナル伝達鎖に結合させることができることを規定する。 CD16、NKp44、NKp46、TCRα定常鎖、TCRβ定常鎖、TCRγ定常鎖、またはTCRδ定常鎖など。あるいは、本開示は、抗体のvHフラグメントをNKp30鎖に結合させることができ、vLフラグメントをNKp30鎖に結合させることができることを提供する。別のシグナル伝達鎖、例えばCD3z、FcRγ、CD16、NKp44、NKp46、TCRα定常鎖、TCRβ定常鎖、TCRγ定常鎖またはTCRδ定常鎖など。2つのそのような鎖(例えば、vL-NKp30およびvH-CD3z )が存在する場合同じ細胞内で共発現すると、vL フラグメントと vH フラグメントはそれらの同族抗原に結合し、T 細胞シグナルを伝達することができます。特に、そのようなNKp30ヘロ二量体SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、このようなＮＫｐ３０－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、ＩＬ２産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を促進し、ＮＫ細胞活性化を促進し、または細胞毒性を発揮することができる。 NKp30ヘテロ二量体SARの発現および活性は、vL/vHとNKp30および他のシグナル伝達鎖(例えば、CD3z、FcRγ、NKp30、NKp44、NKp46など)との間にリンカーを組み込むことによってさらに増加させることができる。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと NKp30 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。
特定の実施形態において、本開示は、ＮＫｐ４４鎖の全体または部分配列を含む、ＮＫｐ４４－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。ＮＫｐ４４ ＳＡＲの構築に使用できるＮＫｐ４４鎖の核酸配列は、対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3775～3788に示される。
一実施形態では、本開示は、ＮＫｐ４４の部分領域または全体領域を含む単鎖ＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。代替の実施形態では、本開示は、ＮＫｐ４４細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む単鎖ＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、ＮＫｐ４４ヒンジドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ４４膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、ＮＫｐ４４サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、ＮＫｐ４４ ＳＡＲは、ＮＫｐ４４ヒンジドメインを介してＮＫｐ４４膜貫通ドメインおよびＮＫｐ４４サイトゾルドメインに結合するＮＫｐ４４ Ｉｇドメインを含む。一実施形態では、ＮＫｐ４４ ＳＡＲは、ＮＫｐ４４膜貫通ドメインおよびＮＫｐ４４サイトゾルドメインに結合したＮＫｐ４４ヒンジドメインを含む。
ＳＡＲの構築に使用され得る様々なＮＫｐ４４ドメイン（すなわち、細胞外、Ｉｇドメイン、ヒンジ、膜貫通、およびサイトゾル）は、その配列全体または欠失変異体もしくは変異体を含み得ることが理解されるべきである。ドメインは、その機能的特性の少なくとも一部を保持します。
一実施形態では、ＮＫｐ４４ ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体を含む。単鎖ＳＡＲの鎖は、１つの抗原または複数の抗原（例えば、２つ、３つ、４つなど）に結合し得る。単鎖NKp44 SARの鎖は、1つまたは複数のアダプター(例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど)をさらに含み得る。
開示のＮＫｐ４４ ＳＡＲは、一般式：
AABD(n)-任意のNKp44 Igドメイン、NKp44ヒンジドメイン-NKp44膜貫通ドメイン-任意の細胞内共刺激ドメイン(n)-NKp44細胞内シグナル伝達ドメイン、nは1以上。一実施形態では、ｎは少なくとも２、例えば２、３、４または５である。ＡＡＢＤ（自律抗原結合ドメイン）は、抗原結合ドメインを形成し、細胞内で発現される場合には細胞外側に位置する。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨドメインである。一実施形態では、ＡＡＢＤは、完全ヒト単一ＶＨ（ＳＶＨ）ドメインまたはヒト化ＳＶＨドメインである。 SVH ドメインは自律 vH ドメインとしても知られ、vL ドメインが存在しない場合でもターゲットに結合できます。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
は、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、ＺＩＰドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｒ４など）、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディなどの非免疫グロブリン抗原結合足場である。 、レペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、またはその断片；受容体（例えば、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、トロンボポエチン）など。
本開示のＮＫｐ４４ ＳＡＲは、一般式：
ｓｃＦｖ（ｎ）－ＮＫｐ４４ Ｉｇドメイン－ＮＫｐ４４ヒンジドメイン－ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン－任意の－細胞内共刺激ドメイン（ｎ）－任意のＮＫｐ４４細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、ｎは１以上である。
特定の実施形態において、本開示は、２つのＮＫｐ４４鎖の全体または部分配列を含む、ＮＫｐ４４－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。本開示は、抗体のｖＬフラグメントが２つのＮＫｐ４４鎖の一方に結合することができ、ｖＨフラグメントが他方のＮＫｐ４４鎖に結合できることを規定する。このような2つの鎖(例えば、 vL-NKp44およびvH-NKp44)が同じ細胞内で共発現される場合、vLおよびvHフラグメントはそれらの同族抗原に結合し、TまたはNK細胞シグナルを伝達することができる。特に、このようなNKp44-SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の実施形態では、このようなＮＫｐ４４－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、 ＮＫ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞の活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。 NKp44-SAR の発現と活性は、vL/vH フラグメントと NKP30 フラグメントの間にリンカーを組み込むことによってさらに高めることができます。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと NKp44 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
別の実施形態では、共刺激ドメインもＮＫｐ４４－ＳＡＲのＮＫｐ４４鎖に組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BB、CD28、OX40および2B4などの共刺激ドメインが含まれる(表30;配列番号(DNA):1565～1572および配列番号(PRT):3959～3966)。まとめると、上記の結果は、SAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、SAR への補完的なアプローチも提供します。
本明細書に記載されるＮＫｐ４４－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖に翻訳され、その後、異なるタンパク質に切断される。本明細書に記載されるＮＫｐ４４－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの別個のプロモーターを使用して発現され、２つの別個のポリヌクレオチド鎖によってコードされ得る。本明細書に記載されるＮＫｐ４４－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のベクターによってコードされ得る。本明細書に記載されるＮＫｐ４４－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの異なるベクターによってコードされ得る。 NKp44-SARをコードする核酸分子は、1つまたは複数のリーダー配列(シグナルペプチドとしても知られる)を含むことができる。一実施形態では、ＮＫｐ４４－ＳＡＲの各機能単位（例えば、ＣＤ３ｚ鎖に結合した抗原結合ドメインとフリン－ＳＧＳＧ切断可能なリンカー）は、ＮＫｐ４４－ＳＡＲを細胞表面に向けるリーダー配列によって先行することができる。 I型膜貫通タンパク質。一実施形態では、ＮＫｐ４４－ＳＡＲの抗原結合ドメインは細胞外に面している。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、配列番号３１～３４のいずれかの核酸配列および配列番号２４２５～２４２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、短い核酸配列（３～９個の核酸）制限酵素部位を含むものは、ＮＫｐ４４－ＳＡＲの異なるサブユニット間、例えばシグナル配列とＮＫｐ４４－ＳＡＲの抗原結合ドメインの間、または抗原結合とＮＫｐ４４鎖の間に位置する。
特定の実施形態において、本開示は、２つの鎖を含み、そのうちの１つがＮＫｐ４４の部分領域または全体領域を組み込む、ＮＫｐ４４－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
代替の実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４４細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む、二重鎖ＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４４ヒンジドメインの部分的または全体の領域を含む、二本鎖ＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４４膜貫通ドメインの部分的または全体の領域を含む、二重鎖ＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４４サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含む二重鎖ＮＫｐ４４ ＳＡＲを提供する。
本開示は、抗体のvL断片をNKp44鎖に結合させることができ、vH断片をCD3z、FcRγなどの別のシグナル伝達鎖に結合させることができることを規定する。 CD16、NKp30、NKp46、TCRα定常鎖、TCRβ定常鎖、TCRγ定常鎖、またはTCRδ定常鎖など。あるいは、本開示は、抗体のvHフラグメントをNKp44鎖に結合させることができ、vLフラグメントをNKp44鎖に結合させることができることを提供する。別のシグナル伝達鎖、例えばCD3z、FcRγ、CD16、NKp30、NKp46、TCRα定常鎖、TCRβ定常鎖、TCRγ定常鎖またはTCRδ定常鎖など。2つのそのような鎖(例えば、vL-NKp44およびvH-CD3z )が存在する場合同じ細胞内で共発現すると、vL フラグメントと vH フラグメントはそれらの同族抗原に結合し、T 細胞シグナルを伝達することができます。特に、このようなNKp44ヘロ二量体SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、このようなＮＫｐ４４－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、ＩＬ２産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を促進し、ＮＫ細胞活性化を促進し、または細胞毒性を発揮することができる。 NKp44ヘテロ二量体SARの発現および活性は、vL/vHとNKp44および他のシグナル伝達鎖(例えば、CD3z、FcRγ、NKp44、NKp44、NKp46など)との間にリンカーを組み込むことによってさらに増加させることができる。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと NKp44 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
特定の実施形態において、本開示は、ＮＫｐ４６鎖の全体または部分配列を含む、ＮＫｐ４６－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
NKp46 SARの構築に使用できるNKp46鎖の核酸配列を配列番号1381～1394に示す(表25)。対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3775～3788に示す(表25)。
一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ４６の部分領域または全体領域を含む単鎖ＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。代替の実施形態では、本開示は、ＮＫｐ４６細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む単鎖ＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ４６ヒンジドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＮＫｐ４６膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、ＮＫｐ４６サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含むＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、ＮＫｐ４６ ＳＡＲは、ＮＫｐ４６ヒンジドメインを介してＮＫｐ４６膜貫通ドメインおよびＮＫｐ４６サイトゾルドメインに結合するＮＫｐ４６ Ｉｇドメインを含む。一実施形態では、ＮＫｐ４６ ＳＡＲは、ＮＫｐ４６膜貫通ドメインおよびＮＫｐ４６サイトゾルドメインに結合したＮＫｐ４６ヒンジドメインを含む。
ＳＡＲの構築に使用され得る様々なＮＫｐ４６ドメイン（すなわち、細胞外、Ｉｇドメイン、ヒンジ、膜貫通、およびサイトゾル）は、その配列全体または欠失変異体もしくは変異体を含み得ることが理解されるべきである。ドメインは、その機能的特性の少なくとも一部を保持します。
一実施形態では、ＮＫｐ４６ ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体を含む。単鎖ＳＡＲの鎖は、１つの抗原または複数の抗原（例えば、２つ、３つ、４つなど）に結合し得る。単鎖NKp46 SARの鎖は、1つまたは複数のアダプター(例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど)をさらに含み得る。
開示のＮＫｐ４６ ＳＡＲは、一般式：
AABD(n)-任意のNKp46 Igドメイン、NKp46ヒンジドメイン-NKp46膜貫通ドメイン-任意の細胞内共刺激ドメイン(n)-NKp46細胞内シグナル伝達ドメイン(nは1以上)。一実施形態では、ｎは少なくとも２、例えば２、３、４または５である。ＡＡＢＤ（自律抗原結合ドメイン）は、抗原結合ドメインを形成し、細胞内で発現される場合には細胞外側に位置する。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨドメインである。一実施形態では、ＡＡＢＤは、完全ヒト単一ＶＨ（ＳＶＨ）ドメインまたはヒト化ＳＶＨドメインである。 SVH ドメインは自律 vH ドメインとしても知られ、vL ドメインが存在しない場合でもターゲットに結合できます。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
は、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、ＺＩＰドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｒ４など）、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディなどの非免疫グロブリン抗原結合足場である。 、レペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、またはその断片；受容体（例えば、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ）、リガンド（例えば、ＡＰＲＩＬ、トロンボポエチン）など。
開示のＮＫｐ４６ ＳＡＲは、一般式：
ｓｃＦｖ（ｎ）－ＮＫｐ４６ Ｉｇドメイン－ＮＫｐ４６ヒンジドメイン－ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン－任意の－細胞内共刺激ドメイン（ｎ）－任意のＮＫｐ４６細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、ｎは１以上である。
特定の実施形態では、本開示は、２つのＮＫｐ４６鎖の全体または部分配列を含む、ＮＫｐ４６－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。本開示は、抗体のｖＬフラグメントが２つのＮＫｐ４６鎖のうちの１つに結合することができ、ｖＨフラグメントが他のＮＫｐ４６鎖に結合することができることを規定する。このような2つの鎖(例えば、 vL-NKp46およびvH-NKp46)が同じ細胞内で共発現される場合、vLおよびvHフラグメントはそれらの同族抗原に結合し、TまたはNK細胞シグナルを伝達することができる。特に、そのようなNKp46-SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の実施形態では、このようなＮＫｐ４６－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、ＮＫ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞の活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。 NKp46-SAR の発現と活性は、vL/vH フラグメントと NKP30 フラグメントの間にリンカーを組み込むことによってさらに高めることができます。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと NKp46 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
別の実施形態では、共刺激ドメインもＮＫｐ４６－ＳＡＲのＮＫｐ４６鎖に組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BB、CD28、OX40および2B4などの共刺激ドメインが含まれる(表30;配列番号(DNA):1565～1572および配列番号(PRT):3959～3966)。まとめると、上記の結果は、SAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、SAR への補完的なアプローチも提供します。
本明細書に記載されるＮＫｐ４６－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖に翻訳され、その後、異なるタンパク質に切断される。本明細書に記載されるＮＫｐ４６－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの別個のプロモーターを使用して発現され、２つの別個のポリヌクレオチド鎖によってコードされ得る。本明細書に記載されるＮＫｐ４６－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のベクターによってコードされ得る。本明細書に記載されるＮＫｐ４６－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの異なるベクターによってコードされ得る。 NKp46-SARをコードする核酸分子は、1つまたは複数のリーダー配列(シグナルペプチドとしても知られる)を含むことができる。一実施形態では、ＮＫｐ４６－ＳＡＲの各機能単位（例えば、ＣＤ３ｚ鎖に結合した抗原結合ドメインとフリン－ＳＧＳＧで切断可能なリンカー）は、ＮＫｐ４６－ＳＡＲを細胞表面に向けるリーダー配列によって先行することができる。 I型膜貫通タンパク質。一実施形態では、ＮＫｐ４６－ＳＡＲの抗原結合ドメインは細胞外に面している。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、配列番号３１～３４のいずれかの核酸配列および配列番号２４２５～２４２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、短い核酸配列（３～９個の核酸）を含む制限酵素部位は、ＮＫｐ４６－ＳＡＲの異なるサブユニット間、例えば、シグナル配列とＮＫｐ４６－ＳＡＲの抗原結合ドメインとの間、または抗原結合とＮＫｐ４６鎖との間に位置する。
特定の実施形態において、本開示は、２つの鎖を含み、そのうちの１つがＮＫｐ４６の部分領域または全体領域を組み込む、ＮＫｐ４６－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
代替の実施形態では、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４６細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む二重鎖ＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４６ヒンジドメインの部分的または全体の領域を含む、二本鎖ＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４６膜貫通ドメインの部分的または全体の領域を含む、二重鎖ＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、鎖の１つがＮＫｐ４６サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含む、二重鎖ＮＫｐ４６ ＳＡＲを提供する。
本開示は、抗体のvL断片をNKp46鎖に結合させることができ、vH断片をCD3z、FcRγなどの別のシグナル伝達鎖に結合させることができることを規定する。 CD16、NKp30、NKp44、TCRα定常鎖、TCRβ定常鎖、TCRγ定常鎖、またはTCRδ定常鎖など。あるいは、本開示は、抗体のvHフラグメントをNKp46鎖に結合させることができ、vLフラグメントをNKp46鎖に結合させることができることを提供する。別のシグナル伝達鎖、例えば、CD3z、FcRγ、CD16、NKp30、NKp44、TCRα定常鎖、TCRβ定常鎖、TCRγ定常鎖またはTCRδ定常鎖など。このような2つの鎖(例えば、vL-NKp46およびvH-CD3z)が存在する場合、同じ細胞内で共発現すると、vL フラグメントと vH フラグメントはそれらの同族抗原に結合し、T 細胞シグナルを伝達することができます。特に、そのようなNKp46ヘロ二量体SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の例示的な実施形態では、このようなＮＫｐ４６－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、ＩＬ２産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を促進し、ＮＫ細胞活性化を促進し、または細胞毒性を発揮することができる。 NKp46ヘテロ二量体SARの発現および活性は、vL/vHとNKp46および他のシグナル伝達鎖(例えば、CD3z、FcRγ、NKp46、NKp46、NKp46など)との間にリンカーを組み込むことによってさらに増加させることができる。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと NKp46 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。
本開示はまた、共刺激受容体（配列番号９８６０～９９９３）を含む他のＮＫ受容体の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインに基づくＳＡＲを提供する。 SAR はモジュール形式であるため、これらのコンストラクト内の CD19 を標的とする hu-mROO5-scFv を表 3～7 に記載の他の抗原結合ドメインと切り替えて、新規の単一特異性および二重特異性 SAR を生成できます。
NKG2D は、N 末端が細胞内に位置する II 型タンパク質です。 NKG2Dの断片に基づくCARは当該技術分野で記載されているが、それらはNKG2Dのサイトゾルドメインおよび膜貫通ドメインの天然の構成を欠いている。本開示は、１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、ＡＡＢＤ、ｓｃＦｖ）を含むポリペプチドのＮ末端が、Ｎ末端からＣ末端まで細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、およびドメインドメインを含むポリペプチドにインフレームで融合されているＳＡＲを提供する。オプションのリンカーを介したNKG2DまたはII型膜タンパク質の細胞外ドメイン。このような構築物の概略図を図１２に示す。そのようなＳＡＲの例を配列番号７６８６～７６８７に示す。さらに、 ATG開始コドンを有するアダプター(例えば、CD3z)のサイトゾルドメインのN末端をNKG2DのN末端に融合して、SARに活性化ドメインを提供することができる。本開示はまた、抗原結合ドメインのＮ末端ドメインがＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＧ２Ｆ受容体の細胞外ドメインに融合されているＳＡＲを提供する。このスキームを使用して、抗原結合ドメインを含むI型タンパク質を含む任意のI型タンパク質とII型タンパク質との間の融合タンパク質を生成することができる。このスキームは、II型受容体のヒンジ、膜貫通、およびサイトゾルドメインのみを含み、その細胞外ドメインを欠く融合を生成するために使用することもできる。
最後に、本開示は、１つの抗原結合ドメインが１つの受容体鎖のＣ末端に結合し、第２の抗原結合ドメインが第２の受容体鎖のＣ末端に結合する、ＩＩ型タンパク質に基づくヘテロ二量体ＳＡＲを生成する方法も提供する。ヘテロ二量体鎖。 ＮＫＧ２ＥおよびＣＤ９４を含むそのような受容体の例は、配列番号１０３４１に提供される。
特定の実施形態において、本開示は、２つのＣＤ３ｚ鎖に由来する部分配列または全体配列を含む合成抗原受容体の新規プラットフォームが、ＮＫ細胞、ＮＫ９２細胞株、単球／マクロファージおよび好中球などの免疫細胞において機能的に発現され得ることを提供する。内在性 TCR 鎖が欠如しています。特定の実施形態では、本開示は、ｉＰＳＣ細胞、胚性幹細胞、または造血幹細胞において発現することができ、分化して免疫細胞を生成することができる、２つのＣＤ３ｚ鎖に由来する部分的または全体の配列を含む、ＳＡＲの新規プラットフォームを提供する。 zSAR を発現する NK 細胞、単球/マクロファージ、好中球など。 zSARの構築に使用できる例示的なCD3z鎖の核酸配列は、配列番号1090および1096に提供される。対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3484および3490に提供される。本開示は、抗体のvLフラグメントが2つのCD3z鎖のうちの1つに結合することができ、vHフラグメントが他のCD3z鎖に結合できることを規定する。このような2つの鎖(例えば、 vL-CD3zおよびvH-CD3z)が同じ細胞内で共発現される場合、vLおよびvHフラグメントはそれらの同族抗原に結合し、T細胞シグナルを伝達することができる。特に、そのようなzSARを発現するNK細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、増殖、活性化の増加を示し、細胞毒性を発揮する可能性がある。 zSAR の発現と活性は、vL/vH フラグメントと CD3z フラグメントの間にリンカーを組み込むことによってさらに高めることができます。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと CD3z フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
別の実施形態では、共刺激ドメインもzSARのCD3z鎖に組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BBおよびCD28の共刺激ドメインが含まれる。 41BBおよびCD28共刺激ドメインを含むCD3z鎖は、それぞれ配列番号1100、1102、および1099および1101に示されている。 ４１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激ドメインの代わりに使用できる他の例示的な共刺激ドメイン（例えば、ＯＸ４０および２Ｂ４）は、仮出願の表３０に提供される。まとめると、上記の結果は、CAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、SIR への補完的なアプローチも提供します。
本明細書に記載されるzSARの2つの鎖は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖に翻訳され、その後、異なるタンパク質に切断される。本明細書に記載されるzSARの2つの鎖は、2つの別個のプロモーターを使用して発現され、2つの別個のポリヌクレオチド鎖によってコードされ得る。本明細書に記載されるzSARの2つの鎖は、単一のベクターによってコードされ得る。本明細書に記載されるzSARの2つの鎖は、2つの異なるベクターによってコードされ得る。 zSARをコードする核酸分子は、1つまたは複数のリーダー配列(シグナルペプチドとしても知られる)を含むことができる。一実施形態では、zSARの各機能単位(例えば、CD3z鎖に結合した抗原結合ドメインとフリン-SGSG切断可能なリンカー)は、zSARをI型膜貫通として細胞表面に導くリーダー配列によって先行され得る。タンパク質。一実施形態では、zSARの抗原結合ドメインは細胞外に面している。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、配列番号３１～３４のいずれかの核酸配列および配列番号２４２５～２４２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、短い核酸配列（３～９個の核酸）を含む制限酵素部位は、zSARの異なるサブユニット間、例えばシグナル配列とzSARの抗原結合ドメインの間、または抗原結合鎖とCD3z鎖の間に位置する。
例えば、NK細胞、単球/マクロファージ、好中球、NK92細胞株など)または免疫を生じさせることができる幹細胞(例えば、iPSC、造血幹細胞など)において発現され得るCD19を標的とする。細胞は CD8SP-hu-mROO5-1-vL-IgCL-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-Spe-SP-Bst-hu-mROO5-1-vH-IgG1-CH1-KPN-CD3zECDTMCP (配列番号2306) 。 NK細胞において機能的に発現され得るCD19を標的とするさらなる例示的なzSARを配列番号(DNA):2287～2291に示す。
本開示はまた、TCRのVa、b、g、dドメインが抗原結合ドメインとして使用されるzSARを提供する。このような SAR は、uTCR-SAR のように機能します。
zSARの一方または両方のCD3ドメインを、DAP10、DAP12もしくはFcRγまたはその断片もしくは変異体などの他のシグナル伝達アダプターで置換して、これらのアダプターを含む新規SARを生成することができる。
本開示は、ＤＡＰ１０（配列番号（ＤＮＡ）：１３４９～１３５０）の部分領域または全体領域を含む単鎖、二本鎖、および二本鎖ヘテロ二量体ＳＡＲを提供する。本開示の例示的な単鎖、二本鎖、および二本鎖ヘテロ二量体ＤＡＰ１０ ＳＡＲは、仮出願の表３２および表３３に提供される。 。
一実施形態では、本開示は、ＤＡＰ１０の部分領域または全体領域を含む単鎖ＤＡＰ１０ ＳＡＲを提供する。代替の実施形態では、本開示は、ＣＤ１６細胞外ドメインの部分的または全体の領域を含む単鎖ＤＡＰ１０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、ＤＡＰ１０膜貫通ドメインの部分領域または全体領域を含むＤＡＰ１０ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、ＤＡＰ１０サイトゾルドメインの部分領域または全体領域を含むＤＡＰ１０ ＳＡＲを提供する。 DAP10を含む例示的なSARSは、CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-Xho-DAP10-opt1-F-P2A-SpeXba-PACであり、配列番号(DNA):2002および配列番号( PRT): 4396。
一実施形態において、本開示は、活性化ドメインをコードする配列にそのＣ末端でインフレームで融合されたＤＡＰ１０の部分的または全体的領域を含む単鎖ＤＡＰ１０ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、活性化ドメインは、ＣＤ３ｚのサイトゾルドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１５６２～１５６４および配列番号（ＰＲＴ）：３９５６～３９５８）に由来する。 ＣＤ３ｚ活性化ドメインに融合されたＤＡＰ１０を含む例示的なＳＡＲＳは、ＣＤ８ＳＰ－Ｓｐｈ－ＢＣＭＡ－ＦＨＶＨ９３－Ｋｐｎ－Ｇ４Ｓ－ＥｃｏＲ１－Ｘｈｏ－ＤＡＰ１０－ｏｐｔ１－Ｓｐｅ－ＣＤ３ｚＣＰ－ｏｐｔ１－Ｆ－Ｐ２Ａ－ＳｐｅＸｂａ－ＰＡＣ（配列番号（ＤＮＡ））である。 ）：２０３７および配列番号（ＰＲＴ）：４４３１）。
ＳＡＲの構築に使用され得る異なるＤＡＰ１０ドメインは、ドメインがその機能的特性の少なくとも一部を保持する限り、その全配列、欠失変異体もしくは変異体を含み得ることが理解されるべきである。
一実施形態では、ＤＡＰ１０ ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体を含む。単鎖ＳＡＲの鎖は、１つの抗原または複数の抗原（例えば、２つ、３つ、４つなど）に結合し得る。単鎖CD16 SARの鎖は、1つまたは複数のアダプター(例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど)をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＤＡＰ１０ ＳＡＲは、一般式：
ＡＡＢＤ（ｎ）－ＤＡＰ１０ヒンジドメイン－ＤＡＰ１０膜貫通ドメイン－ＤＡＰ１０－細胞内シグナル伝達ドメイン－任意の活性化ドメイン（ｎは１以上である）。一実施形態では、ｎは少なくとも２、例えば２、３、４または５である。ＡＡＢＤ（自律抗原結合ドメイン）は、抗原結合ドメインを形成し、細胞内で発現される場合には細胞外側に位置する。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨドメインである。一実施形態では、ＡＡＢＤは、完全ヒト単一ＶＨ（ＳＶＨ）ドメインまたはヒト化ＳＶＨドメインである。 SVH ドメインは自律 vH ドメインとしても知られ、vL ドメインが存在しない場合でもターゲットに結合できます。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
は、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、ＺＩＰドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｒ４など）、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディなどの非免疫グロブリン抗原結合足場である。 、レペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、またはその断片；受容体（例えば、CD16-F158V、NKG2D）、リガンド（例えば、APRIL、トロンボポエチン）など。
特定の実施形態において、本開示は、２つのＤＡＰ１０鎖を含む、ＤＡＰ１０－ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。本開示は、抗体のvLフラグメントが2つのDAP10鎖のうちの1つに結合することができ、vHフラグメントが他のDAP10鎖に結合できることを規定する。このような2つの鎖(例えば、 vL-DAP10およびvH-DAP10)が同じ細胞内で共発現される場合、vLおよびvH断片はそれらの同族抗原に結合し、T細胞シグナルを伝達することができる。特に、そのようなDAP10-SARを発現するT細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、NFATシグナル伝達を活性化し、IL2産生を誘導し、T細胞増殖を促進し、T細胞活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。別の実施形態では、このようなＤＡＰ１０－ＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、同族標的抗原を発現する細胞株に曝露されると、ＮＫ細胞の増殖を促進し、ＮＫ細胞の活性化を促進し、細胞毒性を発揮することができる。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH フラグメントと DAP10 フラグメントの間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、表１３；配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
別の実施形態では、共刺激ドメインもＤＡＰ１０－ＳＡＲのＤＡＰ１０鎖に組み込まれる。例示的な共刺激ドメインには、41BB、CD28、OX40および2B4などの共刺激ドメインが含まれる(表30;配列番号(DNA):1565～1572および配列番号(PRT):3959～3966)。まとめると、上記の結果は、SAR の設計制限の一部を克服する養子細胞療法のための新しいプラットフォームを提供し、SAR への補完的なアプローチも提供します。
本明細書に記載されるＤＡＰ１０－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のポリヌクレオチド鎖によってコードされ、単一のポリペプチド鎖に翻訳され、その後、異なるタンパク質に切断される。本明細書に記載されるＤＡＰ１０－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの別個のプロモーターを使用して発現され、２つの別個のポリヌクレオチド鎖によってコードされ得る。本明細書に記載されるＤＡＰ１０－ＳＡＲの２つの鎖は、単一のベクターによってコードされ得る。本明細書に記載されるＤＡＰ１０－ＳＡＲの２つの鎖は、２つの異なるベクターによってコードされ得る。 DAP10-SARをコードする核酸分子は、1つまたは複数のリーダー配列(シグナルペプチドとしても知られる)を含むことができる。一実施形態では、ＤＡＰ１０－ＳＡＲの各機能単位（例えば、ＣＤ３ｚ鎖に結合した抗原結合ドメインとフリン－ＳＧＳＧで切断可能なリンカー）は、ＤＡＰ１０－ＳＡＲを細胞表面に導くリーダー配列によって先行することができる。 I型膜貫通タンパク質。一実施形態では、DAP10-SARの抗原結合ドメインは細胞外に面している。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、配列番号３１～３４のいずれかの核酸配列および配列番号２４２５～２４２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、短い核酸配列（３～９個の核酸）含む制限酵素部位は、DAP10-SARの異なるサブユニット間、例えばシグナル配列とDAP10-SARの抗原結合ドメインの間、または抗原結合とCD3z鎖の間に位置する。
本開示の異なるＳＡＲＳは、モジュール設計である。したがって、DAP10モジュールをコードする配列(配列番号1349)は、異なるシグナリングモジュールをコードする配列に置き換えることができる(表25)。このようなモジュールの例としては、DAP12-ECDTMCP-opt1 (配列番号1362)、DAP12-C35S-ECDTMCP-opt1 (配列番号1366)、CD3z-ECDTM-opt1 (配列番号1351)、mutCD3z-ECDTM-opt1が挙げられる。 (配列番号1353)、CD3z-ECDTM-OX40-opt1(配列番号1357)、FcRy-C24S-ECDTMCP-opt1(配列番号1423)、FcRy-ECDTMCP-opt1(配列番号1419) 、mutCD3z-ECDTM-2B4CP-opt1 (配列番号1426)、CD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt1 (配列番号1430)、mutCD8-hinge-NKG2D-TM-2B4CP-opt-1 (配列番号1430) ID NO: 1438)。 １つ以上のＤＡＰ１０モジュールが異なるシグナリングモジュールに置き換えられた例示的なＳＡＲＳの配列番号は、仮出願の表３３に示されている。
特定の実施形態において、本開示は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０および２Ｂ４を含むがこれらに限定されない、共刺激受容体の全体または部分配列を含む、共刺激ＳＡＲと称される合成抗原受容体の新規プラットフォームを提供する。
共刺激ＳＡＲの構築に使用できる共刺激受容体鎖の核酸配列を配列番号１５７３～１５８０に示す（表２５）。対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3967～3974に示す。例示的な共刺激受容体の全体または部分配列を含む例示的な単鎖、二本鎖、および二本鎖ヘテロ二量体ＳＡＲは、仮出願の表４１および表４２に提供される。
一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合した４－１ＢＢの部分的または全体の領域を含む単鎖４－１ＢＢ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の抗原結合ドメインに結合したＣＤ２８の部分的または全体的領域を含む単鎖ＣＤ２８ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合したＯＸ４０の部分領域または全体領域を含む単鎖ＯＸ４０ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合した２Ｂ４の部分的または全体の領域を含む単鎖２Ｂ４ ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合した４－１ＢＢの部分的または全体領域を含む二重鎖４－１ＢＢ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の抗原結合ドメインに結合したＣＤ２８の部分的または全体的領域を含む二本鎖ＣＤ２８ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合したＯＸ４０の部分領域または全体領域を含む二重鎖ＯＸ４０ ＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合した２Ｂ４の部分的または全体の領域を含む二重鎖２Ｂ４ ＳＡＲを提供する。
一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメインに結合した４－１ＢＢの部分的または全体領域を含む二重鎖ヘテロ二量体４－１ＢＢ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の抗原結合ドメインに結合したＣＤ２８の部分的または全体的領域を含む二本鎖ヘテロ二量体ＣＤ２８ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の抗原結合ドメインに結合したＯＸ４０の部分的または全体的領域を含む二本鎖ヘテロ二量体ＯＸ４０ ＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上の抗原結合ドメインに結合した２Ｂ４の部分的または全体的領域を含む二重鎖ヘテロ二量体２Ｂ４ ＳＡＲを提供する。
二本鎖ヘテロ二量体SARの場合、一方の鎖は共刺激受容体(例えば、4-1BB、CD28、OX40、2B4など)から構成され、もう一方の鎖は共刺激受容体から構成され得ることに留意されたい。活性化シグナルを伝達できる受容体（例えば、CD16）。
ＳＡＲの構築に使用され得る様々な共刺激受容体ドメインは、ドメインがその機能特性の少なくとも一部を保持する限り、それらの全配列、欠失変異体もしくは変異体を含み得ることが理解されるべきである。
一実施形態では、共刺激ＳＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場、リガンドまたは受容体を含む。単鎖ＳＡＲの鎖は、１つの抗原または複数の抗原（例えば、２つ、３つ、４つなど）に結合し得る。単鎖共刺激受容体SARの鎖は、1つまたは複数のアダプター(例えば、RZIP、EZIP、NKG2D-YA、NKG2D-FAなど)をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の共刺激ＳＡＲは、一般式：
AABD(n)- 共刺激受容体ヒンジドメイン- 共刺激受容体膜貫通ドメイン- 共刺激受容体 -細胞内シグナル伝達ドメイン - 任意の活性化ドメイン ここで、nは1以上である。一実施形態では、ｎは少なくとも２、例えば２、３、４または５である。ＡＡＢＤ（自律抗原結合ドメイン）は、抗原結合ドメインを形成し、細胞内で発現される場合には細胞外側に位置する。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨドメインまたはヒト化ｖＨドメインである。一実施形態では、ＡＡＢＤは、完全ヒト単一ＶＨ（ＳＶＨ）ドメインまたはヒト化ＳＶＨドメインである。 SVH ドメインは自律 vH ドメインとしても知られ、vL ドメインが存在しない場合でもターゲットに結合できます。
一実施形態では、ＡＡＢＤは完全ヒトｖＨＨドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
SAR を符号化するベクトルには一般に、SAR を符号化する能力が制限されている。例えば、SAR ポリヌクレオチドのサイズは、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターの力価に影響する。したがって、サイズが小さい SAR が望ましい。一態様において、本開示は、1765ヌクレオチド未満、1770ヌクレオチド未満、1780ヌクレオチド未満、1790ヌクレオチド未満、1800ヌクレオチド未満、1820ヌクレオチド未満のサイズの、2つのシグナルペプチドおよび介在する2Aリンカーを含む非特異的二本鎖SARを記載する。一態様において、本開示は、シグナル配列を含まない鎖の一方が815ヌクレオチド、820ヌクレオチド、825ヌクレオチドまたは850ヌクレオチドより長くなく、シグナル配列を含まない第2の鎖が790ヌクレオチド、800ヌクレオチド、810ヌクレオチド、815ヌクレオチド、820ヌクレオチド、825ヌクレオチドまたは850ヌクレオチドより長くない、非特異的二重鎖SARを記載する。一態様では、ＳＡＲは、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＡＡＢＤ－ＴＣＲ、εＴＦＰ、γＴＦＰ、δＴＦＰ、αβＴＦＰ、γδＴＦＰ、またはＴＣＲの骨格を有する。一態様では、ＳＡＲはＳＩＲの骨格を有する。一態様において、SARは、SIR、cTCR、Ab-TCR、AABD-TCR、αβTFP、γδTFP、またはTCRαおよびTCRβ定数鎖を有するTCRの骨格を有する。一態様において、SARは、SIR、cTCR、Ab-TCR、AABD-TCR、αβTFP、γδTFP、またはTCRγおよびTCRδ定数鎖を有するTCRの骨格を有する。
本開示はまた、ＴＣＲα（配列番号（ＤＮＡ）：７１７２～７２７１；配列番号（ＰＲＴ）：７８６３～７９６３）、ＴＣＲβ（配列番号（ＤＮＡ）：７２７３～７３９８；配列番号（ＰＲＴ）：７８６３～７９６３）の定常鎖の新規な欠失変異体も提供する。配列番号(PRT): 7965-8090)、TCRγ(配列番号(DNA): 7400-7499; 配列番号(PRT): 8092-8191)およびTCRδ(配列番号(DNA): 7501-7600)これらは、ＳＩＲおよびｃＴＣＲバックボーンに基づくＳＩＲおよびｃＴＣＲおよびＳＡＲの構築に使用することができる。 TCRα、TCRβ、TCRγ、およびTCRδの定常鎖の欠失変異体の使用は、SIR/SAR構築物のサイズを縮小し、ウイルスベクターへのパッケージングを改善し、それによってウイルスベクターの力価および形質導入効率を改善するのに役立ちます。ここで説明する TCRα、TCRβ (β1 または β2)、TCRγ および TCRδ 鎖の定常鎖の欠失変異体を使用して、完全長の定常鎖で構成される SAR と比較して、多様な発現、結合親和性および活性を有する SAR を構築できます。例えば、ここに記載したTCRα、TCRβ（β1またはβ2）、TCRγおよびTCRδ鎖の定数鎖の欠失変異体は、全長の定数鎖からなるSARと比較して、発現、結合親和性、シグナル伝達活性、サイトカイン産生および／または細胞毒性が増加したSARを構築するために使用することができる。あるいは、ここに記載したTCRα、TCRβ（β1またはβ2）、TCRγおよびTCRδ鎖の定数鎖の欠失変異体を用いて、全長の定数鎖からなるSARと比較して、発現、結合親和性、シグナル伝達活性、サイトカイン産生および／または細胞毒性が低下したSARを構築することもできる。完全長の定数鎖からなるSARと比較して、発現、結合親和性、シグナル伝達活性、サイトカイン産生および／または細胞毒性が増加したSAR構築物は、標的抗原の発現量が少ない疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）を標的とするのに有用であると考えられる。発現、結合親和性、シグナル伝達活性、サイトカイン産生および／または細胞毒性が、全長の定常鎖からなるSARと比較して低下しているSAR構築物は、標的抗原を低発現している健常細胞を温存しながら、標的抗原の高レベルの発現を有する腫瘍細胞を選択的に標的とするために有用である。
一態様では、本開示は、ＴＣＲα定常鎖断片の長さが３７０、３８０、３９０、４００、４１０または４２１ヌクレオチド未満であり、ＴＣＲβ定常鎖断片が４９０ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満である二重鎖ＳＡＲを記載し、長さは５１０ヌクレオチド未満、５２０ヌクレオチド未満、５３０ヌクレオチド未満、または５４０ヌクレオチド未満。一態様では、ＳＡＲは、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＡＡＢＤ－ＴＣＲ、αβＴＦＰ、またはＴＣＲの骨格を有する。一態様では、ＳＡＲはＳＩＲのバックボーンを有する。一態様では、ＳＡＲは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常鎖、またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ定常鎖を有するＳＩＲの骨格を有する。一態様では、ＳＡＲは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常鎖、またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ定常鎖を有するｃＴＣＲの骨格を有する。一態様では、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常鎖フラグメントは、それらの鎖対合を強化し、内因性ＴＣＲαβ鎖との鎖対合を減少させる変異を保有する。一態様では、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常鎖フラグメントは、２つの鎖の間に余分なシステイン結合（二重結合）をもたらす突然変異を保有する。
1つの局面において、本開示は、SEQ ID NO: 7864-7963で表されるTCRα定数鎖のいずれかから選択されるTCRα定数鎖欠失変異体、またはSEQ ID NO: 7864-7963で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.9%の相同性を有する変異体を含むSARを提供する。一態様では、本開示は、配列番号７８６４～７９６３のいずれかを含むＴＣＲα定常鎖断片、または相補的ＴＣＲβ定常鎖と対合する能力を保持するそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体を含むＳＡＲを提供する。一態様において、本開示は、TCR/CD3複合体に取り込まれ、TCRシグナル伝達モジュールを動員し、および/または標的抗原との係合時にT細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持する、SEQ ID NO:7864-7963またはそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体のいずれかを含むTCRα定数鎖フラグメントを含むSARを提供する。SARの構築に使用できるTCRα定数鎖欠失変異体および機能的変異体の追加。
1つの局面において、本開示は、SEQ ID NO: 7965-8090で表されるTCRβ定数鎖のいずれかから選択されるTCRβ定数鎖欠失変異体、またはSEQ ID NO: 7965-8090で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.9%の相同性を有する変異体を含むSARを提供する。一態様では、本開示は、配列番号７９６５～８０９０のいずれかを含むＴＣＲβ定常鎖断片、または相補的ＴＣＲα定常鎖と対合する能力を保持するそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体を含むＳＡＲを提供する。一態様において、本開示は、TCR/CD3複合体に取り込まれ、TCRシグナル伝達モジュールを動員し、および/または標的抗原との結合時にT細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持する、SEQ ID NO:7965-8090またはそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体のいずれかを含むTCRβ定数鎖フラグメントを含むSARを提供する。SARの構築に使用できるTCRβ定数鎖欠失変異体および機能的変異体の追加。
1つの局面において、本開示は、SEQ ID NO: 8092-8191で表されるTCRγ定数鎖のいずれかから選択されるTCRγ定数鎖欠失変異体、またはSEQ ID NO: 8092-8191で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.9%の相同性を有する変異体を含むSARを提供する。一態様では、本開示は、配列番号８０９２～８１９１のいずれかを含むＴＣＲγ定常鎖断片、または相補的ＴＣＲδ定常鎖と対合する能力を保持するそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体を含むＳＡＲを提供する。一態様において、本開示は、TCR/CD3複合体に取り込まれ、TCRシグナル伝達モジュールを動員し、および/または標的抗原との結合時にT細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持する、SEQ ID NO:8092-8191またはそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体のいずれかを含むTCRγ定数鎖フラグメントを含むSARを提供する。SARの構築に使用できるTCRγ定数鎖欠失変異体および機能的変異体の追加。
1つの局面において、本開示は、SEQ ID NO: 8193-8292で表されるTCRδ定数鎖のいずれかから選択されるTCRδ定数鎖欠失変異体、またはSEQ ID NO: 8193-8292で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.9%の相同性を有する変異体を含むSARを提供する。一態様では、本開示は、配列番号８１９３～８２９２のいずれかを含むＴＣＲδ定常鎖断片、または相補的ＴＣＲγ定常鎖と対合する能力を保持するそれらの欠失変異体もしくは機能的変異体を含むＳＡＲを提供する。一態様において、本開示は、TCR/CD3複合体に取り込まれ、TCRシグナル伝達モジュールを動員し、および/または標的抗原との係合時にT細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持する、SEQ ID NO:8193-8292のいずれかまたはそれらの欠失変異体もしくは機能変異体を含むTCRδ定数鎖フラグメントを含むSARを提供する。SARの構築に使用できるTCRδ定数鎖欠失変異体および機能的変異体の追加。
など）、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ＶＨＨの群から選択される。ドメイン、FHVH (完全ヒト vH ドメイン)、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合足場 (例、セントイリン、アフィボディ、ZIP ドメイン、アダプターなど)、VNAR ドメイン、リガンド、TCR、可変TCR および受容体のドメイン (Va、Vb、Vg、Vd)。本明細書に記載されるいずれかのＳＡＲのいくつかの実施形態では、異種抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。
本開示のＳＡＲの抗原結合ドメインは、 ＨＬＡ非依存性ＴＣＲ、単一ドメインＴＣＲ、受容体のリガンド結合ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合足場、アダプターまたはその断片。
一態様では、本開示は、合成抗原受容体（ＳＡＲ）の新規組成物を提供する。別の態様では、本開示は、ＳＡＲの新規な構成／アーキテクチャを提供する。別の態様では、本開示は、有用な生物学的特性（例えば、発現、結合親和性、エフェクター機能など）を有するＳＡＲを提供する。別の態様では、本開示は、１つまたは複数の抗原に結合できるＳＡＲを提供する。別の態様では、本開示は、抗原の１つまたは複数のエピトープに結合できるＳＡＲを提供する。
一態様では、本開示は、１つを超える（すなわち、２、３、４、５またはそれ以上）抗原結合ドメインを含む合成抗原受容体（ＳＡＲ）を提供する。別の態様では、本開示は、２つ以上の抗原または抗原の２つ以上のエピトープに結合および／または応答することができるＳＡＲを提供する。別の態様では、本開示は、複数の抗原または抗原の複数のエピトープに結合および／または応答することができる二重特異性および／または多重特異性ＳＡＲを提供する。別の態様では、本開示は、二重特異性および／または多重特異性ＳＡＲの構築に有用な抗原結合ドメインを提供する。別の態様では、本開示は、二重特異性および／または多重特異性ＳＡＲの有用な構成（すなわち、異なるドメインの位置）を提供する。本開示の二重特異性および多重特異性SARは、免疫エフェクター細胞（例えば、T細胞、NKT細胞、NK細胞など）において発現された場合、同じ抗原または同じ抗原のエピトープを標的とする2つ以上の非特異的SARと比較して、ほぼ同等の有効性またはそれ以上の有効性で、複数の抗原または複数の抗原のエピトープに結合および／または応答する能力を付与する。
二重特異性または多重特異性SARにおいて2つ以上の抗原結合ドメインが存在すると、立体障害、非特異的凝集、発現不良、タンパク質のアンフォールディング、および／または抗原結合の妨害が生じる可能性がある。さらに、SARの膜貫通ドメインに対する抗原結合ドメインの位置は、得られる受容体によるシグナル伝達を最適化するために最適化される必要がある。 二つ以上のscFvを組み込んだ二重特異性CARおよび多重特異性CARが当技術分野で記載されている。しかしながら、本開示は、SAR中に1つ以上のscFv（すなわち、2、3、4またはそれ以上）が存在すると、しばしば立体障害、非特異的凝集、強直性シグナル伝達、発現不良、タンパク質のアンフォールディング、および／または抗原結合の妨害が生じ、その結果、シグナル伝達およびエフェクター機能（例えば、サイトカイン産生、細胞毒性など）が低下することを同定している。したがって、2つ以上の抗原結合ドメインからなる二重特異性SARや多特異性SARを作製する際の主要な課題は、立体障害、非特異的凝集、強直性シグナル伝達、貧弱な発現、タンパク質のアンフォールディング、および/またはシグナル伝達やエフェクター機能（サイトカイン産生、細胞毒性など）の低下につながる抗原結合の妨害を軽減するために、そのようなSARに組み込むべき有用な抗原結合ドメイン（例えば、scFv、Fv、Fab、vHH、FHVH、Centyrin、アフィボディ、サイトカイン、レセプター、svd-TCRなど）を決定することである。
第二の課題は、二重特異性および多重特異性 SAR を構成する様々な抗原結合ドメインの有用な配置を決定することである。例えば、非特異的凝集、強直性シグナル伝達、発現不良、タンパク質のアンフォールディング、および／またはシグナル伝達やエフェクター機能（サイトカイン産生、細胞毒性など）の低下をもたらす抗原結合への干渉を軽減するために、互いに対する、およびSARの他の成分（例えば、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインなど）に対する様々な抗原結合ドメインの最適な順序を決定する必要がある。これは、全てのSARにとって、特に、抗原結合ドメインが2つの異なるフラグメント（例えば、vLとvH、VaとVb、またはVgとVdなど）で構成されている本開示に記載されているような多鎖SAR（例えば、二重鎖CD16 SAR、二重鎖Dap10 SAR、二重鎖NKp30 SARなど）にとって重要な課題である。例えば、2つの別々のCD16鎖に作動可能に連結されるが結合してCに結合するFvを形成するvLおよびvHフラグメントを介してCD19に結合する二重鎖SARへの第2の抗原結合ドメイン（例えば、scFvまたはvHHドメイン）の結合は、vL断片とvH断片の相互作用を阻害する可能性があり、その結果、CD19に結合する機能的なFvを形成できなくなる
抗原結合ドメインと細胞膜の間の距離を決定するヒンジドメインの長さは、キメラ抗原受容体を介したシグナル伝達に影響を与える可能性があります。したがって、この分野におけるもう1つの課題は、複数の抗原結合ドメインの付着が、標的抗原と細胞膜の間の距離を増加させることにより、有効な免疫学的シナプスの形成やSARを介したシグナル伝達に悪影響を及ぼす可能性があるかどうかが現時点では不明であることである。 。
SAR における複数の抗原結合ドメインの融合は、立体障害や不適切なフォールディングを引き起こす可能性があります。この分野における別の課題は、二重特異性/多重特異性SARの異なる抗原結合ドメイン間にリンカードメインが必要かどうかが現時点では不明であることである。リンカードメインの長さや性質も不明である。不適切なリンカーを添加すると、2つの鎖間の相互作用や機能的なFvの形成が阻害される可能性があるため、これは二重鎖SAR（二重鎖CD16 SAR、二重鎖NKp30 SAR、二重鎖NKp44 SAR、二重鎖Dap10 SARなど）の場合に特に重要である。さらに、リンカーは、標的抗原と細胞膜の間の距離を増加させることにより、効果的な免疫学的シナプスの形成および SAR を介したシグナル伝達に悪影響を与える可能性がありる。
一態様では、本開示は上記の問題に対する解決策を提供する。
一態様では、本開示は、１つ以上の抗原結合ドメインおよび１つ以上の膜貫通ドメインを有するＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、二重特異性ＳＡＲおよび多重特異性ＳＡＲの構築に有用な抗原結合ドメインを提供する。
本開示は、異なる抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、リンカードメイン、接続ペプチド、膜貫通ドメイン、活性化ドメイン、共刺激ドメイン、アクセサリーモジュールおよび治療制御などを含むいくつかの例示的なSARを提供する。本開示のいくつかの例示的なSARの核酸配列およびアミノ酸配列は、SEQ ID NO（DNA）に記載されている： 1600-2328、4851-5129、5451-6282、7160-7170、7601-7747、8768-9602、10817-10830、およびSEQ ID NO（PRT）：3994-4722、5151-5429、6283-7114、7852-7862、8293-8439、9860-10694に記載されている。本開示の例示的なSARの名称および構成は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる仮出願の表32～34および36～42に提供される。 SARの構築において使用され得る例示的な成分のSEQ ID（DNA）およびSEQ ID（PRT）は、SEQ ID NO（DNA）：31～1243、1308～1572および8535～8767ならびにSEQ ID NO（PRT）：2425～3637、3702～3966および9627～9859、10832～10841および12304～12311に提供される。本開示のSARの構築において使用できる異なるSAR構成要素および補助試薬の名称は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる仮出願の表1～31に記載されている。 SARの標的抗原、構成および組成は、BLASTのようなプログラムを用いて構成モジュールの配列相同性検索を行うことにより、本開示で提供される核酸配列およびアミノ酸配列から推測することができる。あるいは、ApE（[https://]jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/）のようなソフトウェアを用いて、本開示で核酸配列が提供される異なるSAR構築物の組成を決定することもできる。最後に、本開示の異なるＳＡＲの構成および構成は、当業者であればそれらの名前から推測することができる。
一実施形態では、本開示は、本明細書で提供される例示的なＳＡＲのいずれかによって表されるアーキテクチャおよび／または構成を有する新規なＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、本明細書で提供される例示的なSARのいずれかの組成物またはその機能的変異体を有する新規SARを提供する。一実施形態において、本開示は、本明細書で提供される例示的なSARのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％の相同性）を有する新規SARを提供する。一実施形態において、本開示は、本明細書で提供される例示的なSARのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％の相同性）を有する新規SARを提供する（任意のアクセサリーモジュールを除く）。一実施形態において、本開示は、抗原結合ドメインおよびシグナル伝達鎖（例えば、CD16鎖）を含む領域において、本明細書で提供される例示的なSARのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％の相同性）を有する新規SARを提供する。
一態様では、本開示は、有利な抗原結合ドメインを有するＳＡＲを作製するための構成要素としての、ヒトＶＨドメイン、典型的には複数のヒトＶＨドメインを含む自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）の使用に関する。
本開示は、一態様では、自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）、その生成方法、および合成抗原受容体および潜在的に抗体治療薬の構築のためのかかるドメインの使用に関する。一実施形態では、ＡＡＢＤドメインは安定性が改善されている。別の実施形態では、ＡＡＢＤドメインは改善された熱安定性を有する。別の実施形態では、ＡＡＢＤドメインは溶解性が改善されている。別の実施形態では、ＡＡＢＤドメインは、自己凝集の傾向が少ない。別の実施形態では、ＡＡＢＤドメインは、Ｎ末端シグナルペプチドとともに哺乳動物細胞で発現される場合、細胞外空間で分泌される能力が向上している。
一態様では、ＡＡＢＤは単一ドメイン抗体または抗体断片である。一態様では、ＡＡＢＤは、可変軽鎖（ＶＬまたはｖＬ）ドメインの非存在下で抗原に結合できる単一可変重鎖（ＶＨまたはｖＨ）ドメイン（ＳＶＨドメイン）またはその断片である。別の態様では、ＡＡＢＤは、ｖＬドメインの非存在下で可溶性タンパク質として発現され得る、そのフラグメントの単一可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（またはＳＶＨドメイン）である。別の態様では、ＡＡＢＤは、Ｎ末端分泌シグナルに結合すると、ｖＬドメインの非存在下で分泌タンパク質として発現され得る、単一可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（またはＳＶＨドメイン）またはその断片である。 。本開示の特定の実施形態は、第１のＡＡＢＤを含むＳＡＲに関し、第１のＡＡＢＤは、第２のドメインの非存在下で抗原に特異的に結合する。
一態様では、ＡＡＢＤは、可変重鎖（ＶＨまたはｖＨ）ドメインの非存在下で抗原に結合できる単一可変軽鎖（ＶＬまたはｖＬ）ドメインまたはＳＶＬドメインまたはその断片である。別の態様では、ＡＡＢＤは、ｖＨドメインの非存在下で可溶性タンパク質として発現できる単一可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（またはＳＶＬドメイン）またはその断片である。別の態様では、ＡＡＢＤは、 Ｎ末端分泌シグナルに結合すると、ｖＨドメインの非存在下で分泌タンパク質として発現され得る、単一可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（またはＳＶＬドメイン）またはその断片である。 。
いくつかの実施形態では、ＡＡＢＤは、非ｓｃＦｖベースの抗原結合ドメイン、ラクダ科動物のｖＨＨドメイン、ヒト化ｖＨＨドメイン、非免疫グロブリン抗原結合足場、サイトカインまたはリガンドの受容体結合ドメイン、サイトカインまたはリガンドのリガンド結合ドメインである。受容体、単一可変ドメインＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、自己抗原、またはその断片。
一実施形態では、ＡＡＢＤは、アダプタードメイン、アダプター結合ドメイン、またはそれらの断片である。例示的なアダプターおよびアダプター結合ドメインには、RZIP、EZIP、E4、K4、NKG2D-YA、NKG2D-AF、Dドメインなどが含まれるが、これらに限定されない。
「単一ドメイン抗体、可変単一ドメイン、または免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）」という用語はすべて当技術分野で周知であり、標的抗原に結合する抗体の単一可変フラグメントを表す。これらの用語は、本明細書では同じ意味で使用されます。以下に説明するように、本開示の様々な態様の実施形態は、異なる抗原、例えば、CD19、CD20、CD22、BCMA、CD38、MPL、CD123、CD33、メソセリン、Her2、CS1／SLAMF7、CD30、GD2、GD3、FLT3、ROR1、CD79b、Lym1、Lym2、PSCA、PSMA、ALK、CD138、CEA、FAP、TAJ、CD229、IL13Ra2、CD32b、GPC3、Muc16、および軽鎖の非存在下でのKIR3DL2に結合する、SVHドメインと呼ばれる単一重鎖可変ドメイン抗体/免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインを含むSARに関する。通常は、ヒト重鎖単一可変ドメイン抗体が使用される。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲは、単一ドメイン抗体を含む、またはそれからなる結合ドメインを含み、前記ドメインは単一のヒト重鎖可変ドメイン（ＳＶＨ）である。したがって、いくつかの態様では、本開示のＳＡＲは、ＶＬドメインを欠く１つまたは複数の結合ドメインを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲは、単一ドメイン抗体を含む、またはそれからなる結合ドメインを含み、前記ドメインはラクダ科のｖＨＨ（またはＶＨＨ）ドメインまたはヒト化ｖＨＨドメインである。
本明細書で使用される場合、ＶＨドメインは、ヒトＶＨドメインまたは非ヒトＶＨドメインである。
SVH ドメインは 12 ～ 14 kDa の小分子で、さまざまな形式に組み合わせることで、SAR の多価または多重特異性抗原結合ドメインを得ることができます。 SVH ドメインは堅牢であり、血清中での高い親和性と安定性が特徴です。 SVH ドメインは、血清中での高い溶解性と凝集の欠如によっても特徴付けられます。
各単一 VH ドメイン (SVH) 抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 の順序で配置された 3 つの CDR と 4 つの FR を含みます。したがって、本開示の一実施形態では、ドメインは、以下の式ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有するヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインである。
一実施形態では、本開示は、Kabat系に従ってW103R置換を有するSVHドメインを使用して構築され得る一本鎖および多鎖SAR（例えば、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、Dap10など）を提供する。W103R置換を有するCD19を標的とする例示的なSVHはCD19-FHVH-354であり、SEQ ID NO (DNA)で表される： 836およびSEQ ID NO (PRT): 3230で表される。別の実施形態において、本開示は、Kabat系によるW103R置換を有するSVHドメインを含む、二重特異性、二価または二パラトピック抗原結合部分を有する多鎖SARを提供する。
別の実施形態では、本開示は、Kabatシステムに従ってW103R置換を有するSVHドメインからなる、多特異的、多価又は多パラトープ抗原結合部分を有する多鎖SARを提供する。 AABDは本質的にモジュラーであるため、AABDを異なる抗原を標的とする他のAABDで置換して、それらの抗原を標的とするSARを開発することができる。
別の実施形態において、本開示は、Kabat系に従ったW103R置換を有するSVHを含む、二重特異性、二価またはバイパラトープ抗原結合部分を有する一本鎖SARを提供する。
一実施形態では、本開示は、適切な条件下でジスルフィド結合を形成し、および／またはジスルフィド架橋を形成することができる非標準システインの導入によって安定化されたＳＶＨを使用して単鎖および多鎖ＳＡＲを構築できることを提供する。非標準的システインを含む例示的なSVHはCEA-300-aVHであり、配列番号(DNA):954および配列番号(PRT):3348で提供される。さらなる例示的なそのようなSVHは、WO2019149715で提供され、これはその特許文献1に組み込まれる。全体を参照により本明細書に記載する。
一実施形態において、本開示は、SVHドメインが、Kabat番号付けに従って、（i）52aおよび71位または（ii）33および52位に置換システインを含み、前記システインがジスルフィド結合を形成することが可能であり、および／または好適な条件下でジスルフィド結合を形成する、SVHを含む一本鎖SARを提供することによって、既存の養子細胞療法の欠点を緩和することを目的とする。
本開示の一実施形態では、ＳＡＲを作製するために使用されるＳＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、４４Ｅ、４５Ｅ、４５Ｒ、（１０１－１）Ｙ、および１０１Ｄからなる群から選択される置換を含む。特に、SVHは、Kabatの番号付けに従って、置換44E、45Eまたは45R、(101-1)Yおよび101Dを含む。一実施形態では、ＳＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、Ｇ４４Ｅ、Ｔ４５Ｅ、Ｔ４５Ｒ、Ｆ（１０１－１）Ｙ、およびＡ１０１Ｄからなる群から選択される置換を含む。一実施形態では、ＳＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、置換Ｇ４４Ｅ、Ｔ４５Ｅ、Ｔ４５Ｒ、Ｆ（１０１－１）Ｙ、およびＡ１０１Ｄを含む。
本開示の一実施形態では、ＳＡＲは、Ｋａｂａｔナンバリングに従って４４Ｅ、４５Ｅ、および（１０１－１）Ｙからなる群から選択される置換を有するＳＶＨを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、置換４４Ｅ、４５Ｅ、および（１０１－１）Ｙを有するＳＶＨドメインを含む。一実施形態では、ＳＶＨドメインに存在する場合、ＳＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けに従ってＧ４４Ｅ、Ｔ４５Ｅ、およびＦ（１０１－１）Ｙからなる群から選択される置換を含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｋａｂａｔナンバリングによる置換Ｇ４４Ｅ、Ｔ４５Ｅ、およびＦ（１０１－１）Ｙを含むＳＶＨドメインを含む。
一実施形態では、ＳＡＲのＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号２１４１１、２１４１２、２１４１３および２１４１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
一実施形態では、ＳＡＲのＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８１９～４８２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
一実施形態では、ＳＡＲのＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８２３～４８２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
本開示の一実施形態では、ＳＡＲのＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８２７～４８３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
本開示の一実施形態では、ＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８３１～４８３４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
本開示の一実施形態では、ＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８３５～４８３８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
一実施形態では、ＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８３９～４８４２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
一実施形態では、ＳＶＨドメインは、それぞれ配列番号４８４３～４８４６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含むｖＨフレームワークを含む。
配列番号４８１９～４６５０によるＦＲ１～４はヒトにおいて免疫原性ではないため、ＳＶＨドメインはＳＡＲの構築に特に有用である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＳＡＲ構築物は、目的の標的タンパク質、例えば、抗原などの腫瘍細胞上に発現されるタンパク質を認識するヒトＳＶＬドメイン（典型的には複数のヒトＳＶＬドメイン）を含む。本明細書で使用されるSVLドメインという用語は、単一のヒトVLドメイン抗体(VL sdAb)を指す。したがって、これらの用語は同じ意味で使用されます。 SVL という用語は、独立 vL ドメインまたは自律 vL ドメインと同じ意味で使用されます。 SVL は AABD の一種です。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤはラクダ科のｖＨＨドメインである。本開示は、複数のvHHドメインを含むSARにも関する。本開示はまた、ヒト化vHHドメインを含むSARに関する。本開示のＳＡＲの構築に使用できる例示的なｖＨＨドメインおよびそれらの標的抗原を表５に示す。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは、ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディ、レペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントチリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、Dドメイン、またはそれらの断片。本開示はまた、複数の非免疫グロブリン抗原結合足場を含むSARに関する。本開示のＳＡＲの構築に使用できる例示的な非免疫グロブリン抗原結合足場およびその標的抗原を表７～９に示す。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは、アダプター結合ドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｋ４、ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ、ＮＫＧ２Ｄ－ＹＡ、またはＤドメインなど）である。本開示には、複数のアダプターに結合するSARも含まれる。一実施形態では、アダプター結合ドメインはロイシンジッパードメインである。一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤはアダプター（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｋ４、Ｄドメイン、Ｓｔｒｅｐｔａｇ、ＦＩＴＣ、ビオチン、ＵＬＢＰ２Ｒ、ＵＬＢＰ２－Ｓ３など）に結合する。アダプターおよびアダプター結合タンパク質が相互に置換され得ることは、当業者には理解される。したがって、SAR は、EZIP モジュールを含む SAR アダプタにバインドする RZIP モジュールを含むことができます。あるいは、SAR は EZIP モジュールを備え、 SAR アダプタは RZIP モジュールを備えることができます。本開示には、複数のアダプターに結合するSARも含まれる。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは、受容体の細胞外リガンド結合ドメインまたはその断片である。本開示はまた、受容体の複数の細胞外リガンド結合ドメインを含むＳＡＲを含む。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは、リガンド、サイトカイン、またはそれらの断片の細胞外受容体結合ドメインである。本開示はまた、リガンドまたはサイトカインの複数の細胞外受容体結合ドメインを含むＳＡＲを含む。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは自己抗原である。本開示には、複数の自己抗原を含むSARも含まれる。 SARの構築に使用できる例示的な自己抗原は、Dsg3またはその断片である。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは、Ｔ細胞受容体の単一可変ドメイン（ｓｖｄ－ＴＣＲ）である。本開示はまた、Ｔ細胞受容体の複数の単一可変ドメインを含むＳＡＲを含む。 svd-TCRドメインを含む例示的なポリヌクレオチドは、PCT/US2021/022641の配列番号(DNA):21563-21564およびWO2021030182に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤは、細胞の表面上に発現される抗原に結合できる任意の単一ドメインタンパク質である。
SAR 内の複数の AABD は、異なる組み合わせで存在する可能性があります (たとえば、2 つのセントリリン、1 つのセントリリンと 1 つの vHH ドメイン、vHH ドメインと SVH ドメインとセントリリンなど)。
1つの態様において、SARのAABDはセンチリンである。本開示はまた、複数のセンチリンを含むSARに関する。一態様では、ＳＡＲのＡＡＢＤはＤＡＲＰＩＮＳである。本開示は、複数のＤＡＲＰＩＮを備えるＳＡＲにも関する。同様に、本開示は、アフィボディ、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディ、リペボディ、ファイノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、アルマジロリピートタンパク質などの複数の非免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むSARに関する。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲは複数のＡＡＢＤを含む。一実施形態では、第１のＡＡＢＤは第２のＡＡＢＤに連結されており、第１および第２のＡＡＢＤは抗原に特異的に結合する。一実施形態では、ＳＡＲによって認識される抗原は、ＭＨＣ複合体に結合するペプチド抗原である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲの２つ以上のＡＡＢＤは同じ抗原を認識する。他の実施形態では、ＳＡＲの２つ以上のＡＡＢＤは、異なる抗原を認識する。
第2世代CARのようなSARにおいて典型的に使用されるscFvは、望ましくない凝集、クラスター形成および免疫原性の可能性を有するが、自律抗原結合ドメイン（AABD）の使用は、安定なフォーマットを提供する。これは、二重特異性、二価またはバイパラトピック抗原結合部位を有するSARを設計する際に特に有用である。本明細書で本発明者らによって実証されたように、複数のAABDドメインはこのような多量体フォーマットで容易に使用することができるため、複数の標的抗原または抗原の複数のエピトープを同時に標的とすることを可能にする多特異的SARの生成が容易になる。
一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原（例えば、１、２、３、４、５、６つまたはそれ以上の抗原）を標的とすることができるＳＡＲを提供する。一実施形態において、本開示は、１つ以上のエピトープ（例えば、１、２、３、４、５、６つ以上のエピトープ）を標的とすることができるＳＡＲを提供する。一実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６つまたはそれ以上の抗原結合ドメイン）を含むＳＡＲを提供する。
一実施形態において、本開示は、各鎖が、ゼロ、膜貫通ドメインに作動可能に連結された1つ以上の抗原結合ドメイン、任意選択で活性化ドメイン、および任意選択で共刺激ドメインを含む、1つ以上の鎖からなるSARを提供する。一実施形態では、活性化ドメインは、１つまたは複数のITAMモチーフをコードする。
一実施形態において、本開示は、以下を含む合成抗原レセプターを提供する；(a）1つ以上の抗原特異的標的化領域、（b）少なくとも1つの細胞外リンカードメイン、（c）少なくとも1つの膜貫通ドメイン、（d）任意選択の共刺激ドメイン、および（e）任意選択の細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、1つの抗原特異的標的化領域は抗原特異的一本鎖Fv（scFv）フラグメントからなり、第2の抗原特異的標的化ドメインはAABDからなる。例示的な実施形態では、ＡＡＢＤは、非ｓｃＦｖ抗原結合モジュール（例えば、ＳＶＨ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、ＳＶＬ、ｓｖｄ－ＴＣＲ、セントチリン、ＤＡＲＰＩＮ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ、ＮＫＧ２Ｄ－ＹＡ）である。 、RZIP、EZIP、E4、K4、Dドメインなど）。
一実施形態において、本開示は、以下を含む二重特異性または多重特異性合成抗原レセプターを提供する；(a）少なくとも2つの抗原特異的標的化領域、（b）少なくとも1つの細胞外リンカードメイン、（c）少なくとも1つの膜貫通ドメイン、（d）任意の共刺激ドメイン、および（e）任意の細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、1つの抗原特異的標的化領域は抗原特異的一本鎖Fv（scFv）フラグメントからなり、第2の抗原特異的標的化ドメインはAABDからなる。例示的な実施形態において、AABDは、非scFv抗原結合モジュール（例えば、SVH、vHH、FHVH、SVL、svd-TCR、Centyrin、DARPIN、CD16A、CD64、CD32、NKG2D、NKG2D-AF、NKG2D-YA、RZIP、EZIP、E4、K4、Dドメインなど）である。２つのAABDからなり、CD38およびBCMAを標的とする例示的な二重特異性SARは、CD8SP-CD38-717-vHH-Ecoil-BCMA-346-vHH-CD16A-F158V-S197P-FL-v3（SEQ ID NO（DNA）：5100；SEQIDNO（PRT）：5400）である。一実施形態において、本開示は、一般式(AABD)n-任意選択リンカードメイン-scFv-ヒンジドメイン-膜貫通ドメイン-任意選択1つ以上の共刺激ドメイン-活性化ドメイン；ここで、n＝0、1、2、3、4、5またはそれ以上であり、活性化ドメインは1つまたは複数のITAMモチーフを含み得る二重特異性または多重特異性合成抗原受容体を提供する。例示的なこのようなSARは、IgSP-Apa-CD20-USC1-vHH-2HCD26-G4Sx3v2-hu-mROO5-1-scFv-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3（SEQ ID NO（DNA）．7160およびSEQ ID NO (PRT)：7853）。このSARは、CD19を標的とするヒト化hu-mROO5-1 scFvに代表される抗原結合ドメインと、CD20を標的とするCD20-vHH-2HCD26に代表される第二の抗原結合ドメインを有する。2 つの抗原結合ドメインは、Gly-Ser (G4Sx3v2) 柔軟なリンカーを介して結合されている。このSAR構築物はまた、CD16細胞外ドメイン（CD16 D1およびD2ドメインを含む）、CD16ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにCD16細胞質ドメインからなる。他の例示的な二重特異性ＳＡＲは、配列番号７１６１～７１７０によって表される。
別の例示的な二重特異性ＳＡＲは、ＩｇＳＰ－Ａｐａ－ＣＤ２０－ＵＳＣ１－ｖＨＨ－２ＨＣＤ２６－Ｇ４Ｓｘ３ｖ２－ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１－ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－Ｈｉｎｇｅ－ＣＤ１６－Ｆ１５８Ｖ－Ｓ１９７Ｐ－Ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＰ－ｖ３（配列番号３）によって表される。 ：7164）。この構築物は、ＣＤ１６ Ｄ１およびＤ２ドメインを欠き、ＣＤ２８ヒンジドメインを含むことを除いて、上記の配列番号７１６０を有する構築物と同様である。
一実施形態において、本開示は、各鎖が、膜貫通ドメインに作動可能に連結された0、1、2またはそれ以上の抗原結合ドメインを含むが活性化ドメインを欠く、1またはそれ以上の鎖からなるSARを提供する。このようなSARはそれ自体の活性化ドメインを欠いているが、活性化ドメインをコードするタンパク質を含むシグナル伝達モジュールの動員によりシグナル伝達が可能である。このようなSARによって補充され得るシグナル伝達タンパク質の例には、CD3z、DAP10またはDAP12が含まれる。このようなＳＡＲの例は、ＣＤ１６ ＳＡＲ、ＮＫｐ３０ ＳＡＲ、ＮＫｐ４４ ＳＡＲ、またはＮＫｐ４６ ＳＡＲのバックボーンに基づいている。例示的な実施形態では、本開示は、１つ以上のＡＡＢＤが二本鎖ＳＡＲの一方または両方の鎖のＮ末端またはＮ末端付近に結合しているＳＡＲを提供する。例示的な実施形態では、本開示は、１つ以上のＡＡＢＤが、ＳＡＲの一方または両方の鎖を含むｖＬ断片またはｖＨ断片のＮ末端またはＮ末端付近に結合しているＳＡＲを提供する。例示的な実施形態では、本開示は、１つ以上のＡＡＢＤが、ＴＣＲの一方または両方の鎖を含むＶａ、Ｖｂ、ＶｇまたはＶｄフラグメントのＮ末端またはＮ末端付近に結合しているＳＡＲを提供する。例示的な実施形態では、ＡＡＢＤは、非ｓｃＦｖ抗原結合モジュール（例えば、ＳＶＨ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、ＳＶＬ、ｓｖｄ－ＴＣＲ、セントチリン、ＤＡＲＰＩＮ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ、ＮＫＧ２Ｄ－ＹＡ）である。 、RZIP、EZIP、E4、K4、Dドメインなど）。
一実施形態において、本開示は、以下を含む1本半鎖SARまたは2本鎖SARを提供する；一般式(AABD）n-任意選択リンカードメイン-scFv-任意選択リンカー-TCR定数鎖を有する一本鎖、および、一般式(AABD)n-任意選択リンカードメイン-CD16/NKp30/NKp44/Nkp46定数鎖を有する第2の鎖、ここでn＝0、1、2、3、4、5またはそれ以上。CD16/NKp30/NKp44/Nkp46定数鎖は、免疫細胞（例えば、T細胞またはNK細胞など）にシグナルを直接伝達することができるか、または免疫細胞にシグナルを伝達することができる1つ以上のシグナル伝達タンパク質を動員することができる、完全長CD16/NKp30/NKp44/NKp46ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体もしくは変異体を含む送信されるシグナルは、細胞の増殖、活性化、サイトカイン分泌および／または細胞毒性を刺激するシグナルを含み得る。
一実施形態において、本開示は、2つの鎖を含む二重鎖二特異性合成抗原レセプターを提供し、各鎖は以下を含む (a）1つ以上の異種抗原特異的標的化領域、（b）少なくとも1つの細胞外リンカードメイン、（c）少なくとも1つの膜貫通ドメイン、（d）任意の共刺激ドメイン、および（e）任意の細胞内シグナル伝達ドメイン、ここで、1つの抗原特異的標的化領域は、第2の鎖上に存在するvHフラグメントおよび／またはvLフラグメントと結合してフラグメント可変体（Fv）を作製することが可能なvLフラグメントおよび／またはvHフラグメントからなり、第2の抗原特異的標的化ドメインは、AABD（e． g., vHH、SVH、センチリン、アフィボディなど）からなる。一実施形態では、Ｆｖは抗原に結合する。別の実施形態では、Ｆｖは抗原に結合しない。一実施形態では、Ｆｖは、ＡＡＢＤを含む第２の抗原特異的ターゲティングドメインの結合のための足場として機能する。一実施形態では、ＡＡＢＤは非ｓｃＦｖ抗原結合ドメインである。
２本の鎖を含む例示的な二重鎖二重特異性ＳＡＲは、ＣＤ８ＳＰ－ＣＤ２０－ＶＨＨ－２ＨＣ２Ｄ６－ＵＳＣ１－Ｋｐｎ－Ｇ４Ｓ－ＥｃｏＲ１－ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１－ｖＬ－ｘｈｏ－ＩｇＣＬ－Ｂａｍ－ＮＫｐ３０－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ１－Ｆ－Ｐ２Ａ－である。 SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PACであり、配列番号(DNA): 1605および配列番号(PRT): 3999で表される。 SAR コンストラクトの一方の鎖は、IgCL リンカーを介して NKp30 細胞外、膜貫通、およびサイトゾルドメインに融合されたヒト化 hu-mROO5-1 vL フラグメントを含み、SAR のもう一方の鎖は、IgCL リンカーに融合されたヒト化 hu-mROO5-1 vH フラグメントを含みます。 NKp30の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインを含む第2鎖。 IgG1-CH1 リンカー経由。 SAR の hu-mROO5-1 vL フラグメントと hu-mROO5-1 vH フラグメントは一緒になって、CD19 を標的とする Fv を形成します。 CD20を標的とするvHHフラグメント(CD20-USC1-vHH-2HCD26;配列番号841)は、グリシン-セリンリンカーを介してhu-mROO5-1 vHフラグメントのN末端に融合される。したがって、SAR は hu-mROO5-1 Fv を介して CD19 を標的とし、CD20-USC1-vHH-2HCD26 を介して CD20 を標的とします。 SAR はモジュール形式であることに注意してください。したがって、SAR の 1 つのモジュールを別のモジュールに置き換えることができます。例えば、ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１ ｖＬフラグメントおよびｈｕ－ｍＲＯＯ５－１ ｖＨフラグメントは、異なる抗原を標的とするｖＬ／ｖＨフラグメントと置き換えることができる。同様に、CD20-USC1-vHH-2HCD26 モジュールは、異なる抗原を標的とする別の AABD に置き換えることができます。 ＩｇＣＬおよびＩｇＧ１－ＣＨ１リンカーは、配列番号１１４２～１１７５（表１３）で提供される他の適切なＩｇ様リンカーと置き換えることができる。最後に、両方のNKp30断片の一方を、NKp44、NKp46、CD16、CD3zまたはDAP10に由来するポリペプチドの一方または両方で置き換えることができる。
NKp30 ECDTMCP 鎖の 1 つが CD16-F158V-S197P-FL-TMCP 鎖で置換された例示的な構築物は、CD8SP-CD20-VHH-2HC2D6-USC1-Kpn-G4S-EcoR1-hu-mROO5-1- で表されます。 vL-xho-IgCL-Bam-NKp30-ECDTMCP-opt1-F-P2A-SP-hu-mROO5-1-vH-Mlu-IgG1-CH1-Kpn-CD16-F158V-S197P-FL-TMCP-v3-F- Ｆ２Ａ－ＰＡＣ（配列番号（ＤＮＡ）：１６１８および配列番号（ＰＲＴ）：４０１２）。他の例示的な単一特異性、二重特異性、および三重特異性ＳＡＲ構築物は、仮出願の表３２に提供される。
CD19、CD20およびBCMAを標的とする例示的な三重特異性二重鎖構築物は、配列番号(DNA):1714および配列番号(PRT):4108によって表される。CD19、CD20およびBCMAを標的とする別の例示的な三重特異性二重鎖構築物は、配列番号によって表される。番号 (DNA): 1619 および配列番号 (PRT): 4013。
開示のＳＡＲは、 １つ、典型的には２つ以上のｖＨ（Ｖ Ｈ ）ドメイン、すなわち、１つ以上のｖＨ単一ドメイン抗体を含み、軽鎖を欠いている。一実施形態では、ＳＡＲは少なくとも２つを含む。 vH 単一ドメイン (SVH) 抗体。
開示のＳＡＲは、１つ、典型的には２つ以上のＶＨＨドメイン、すなわち、１つ以上のＶＨＨ単一ドメイン抗体を含み、軽鎖を欠いている。一実施形態では、ＳＡＲは少なくとも２つのＶＨＨ単一ドメインを含む。
開示のＳＡＲは、 １つ、典型的には２つ以上の非免疫グロブリン抗原結合足場、すなわち、 ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、ＺＩＰドメイン（例えば、ＲＺＩＰ、ＥＺＩＰ、Ｅ４、Ｒ４などから選択される１つ以上のドメイン）を含む。 ） 、アフィリン、アドネクチン、アフィチン、ボディ、レペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質またはフラグメントその。一実施形態では、ＳＡＲは２つのＡＡＢＤを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｆｖ（すなわち、結合してＦｖを形成するｖＬ／ｖＨ断片）および少なくとも１つのＡＡＢＤを含む。
開示のＳＡＲは、 １つ以上の抗原を標的とする少なくとも２つのＡＡＢＤ（例えば、２つのＳＶＨドメインまたは２つのＶＨＨドメイン、または１つのＳＶＨおよび１つのＶＨＨドメインなど）を含む。
開示のＳＡＲは、 １つまたは複数の抗原を標的とする少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。
開示のＳＡＲの抗原結合ドメインは、同じ抗原に特異的な２つまたは少なくとも２つのＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、セントチリンなど）を含み、したがって二価の結合分子を提供する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、同じ抗原に特異的であるが、前記抗原上の異なるエピトープに結合する２つまたは少なくとも２つのＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、セントチリンなど）を含む。換言すれば、抗原結合ドメインは、第１のエピトープに結合する第１のＡＡＢＤ（例えば、 ＳＶＨ、ＶＨＨ、センチリンなど）と、第２のエピトープに結合する第２のＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、センチリンなど）とを含む。 。エピトープは重複している可能性があります。したがって、抗原結合ドメインはバイパラトープ性であり、本開示の範囲にはバイパラトープ性ＳＡＲが含まれる。さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインは、同じ抗原に特異的であり、前記抗原上の同じエピトープに結合する２つのＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、セントイリンなど）を含む。
本開示のSARの抗原結合ドメインは、Fv（例えば、異なるシグナル鎖に結合し、単鎖フラグメント可変形式またはscFv形式では存在しないvLフラグメントおよびvHフラグメント）と、Fvによって結合されるものと同じ抗原に特異的である少なくとも1つのAABD（例えば、SVH、VHH、センチリンなど）とを含み、したがって、二価結合分子を提供する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、Fvと、Fvと同じ抗原に特異的であるが前記抗原上の異なるエピトープに結合する少なくとも1つのAABD(例えば、SVH、VHH、センチリンなど)とを含む。言い換えれば、抗原結合ドメインは、第一のエピトープに結合するFvと、第二のエピトープに結合する第二のAABD（例えば、SVH、VHH、Centyrinなど）から構成される。エピトープは重複している可能性がある。したがって、抗原結合ドメインはバイパラトープであり、本開示の範囲にはバイパラトープSARが含まれる。さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインは、同じ抗原に特異的であり、前記抗原上の同じエピトープに結合するFvおよび少なくとも1つのAABD(例えば、SVH、VHH、センチリンなど)を含む。さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインはFvと少なくとも1つのAABD（例えば、SVH、VHH、センチリンなど）から構成され、Fv断片はいかなる特異的抗原にも有意な親和性で結合しないか、または有意でない親和性で結合し、1つ以上のAABDの結合のための足場として役立つにすぎない。
一実施形態では、本開示のSARの抗原結合ドメインは、TCR-Fv（例えば、異なるシグナル鎖に結合され、単鎖TCR形式またはscTCR形式には存在しないVα／VβフラグメントまたはVγ／Vδフラグメント）と、TCR-Fvによって結合されるのと同じ抗原に特異的である少なくとも1つのAABD（例えば、SVH、VHH、センチリンなど）とからなり、したがって二価の結合分子を提供する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、TCR-Fv(例えば、Va/VbまたはVg/Vd)およびTCR-Fvと同じ抗原に特異的であるが、前記抗原上の異なるエピトープに結合する少なくとも1つのAABD（例えば、SVH、VHH、センチリンなど）を含む。すなわち、抗原結合ドメインは、第一のエピトープに結合するTCR-Fvと、第二のエピトープに結合する第二のAABD（例えば、SVH、VHH、Centyrinなど）から構成される。エピトープは重複している可能性がある。したがって、抗原結合ドメインは、バイパラトープであり、本開示の範囲は、バイパラトープSARを含む。さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインは、同じ抗原に特異的であり、前記抗原上の同じエピトープに結合するTCR-Fvおよび少なくとも1つのAABD(例えば、SVH、VHH、センチリンなど)を含む。さらに別の実施形態では、抗原結合ドメインはTCR-Fvと少なくとも1つのAABD（例えば、SVH、VHH、センチリンなど）から構成され、TCR-Fv断片は、いかなる特異的抗原にも有意な親和性で結合しないか、または有意でない親和性で結合し、1つ以上のAABDの結合のための足場として役立つにすぎない。
別の実施形態では、抗原結合ドメインは、２つの異なる抗原に特異的な２つのＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、セントイリンなど）を含み、したがって二重特異性抗原結合ドメインを提供する。換言すれば、抗原結合ドメインは、第１の標的に結合する第１のＡＡＢＤ（例えば、 ＳＶＨ、ＶＨＨ、センチリンなど）と、第２の標的に結合する第２のＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、センチリンなど）とを含む。 。したがって、特定の実施形態では、本開示は二重特異性ＳＡＲに関する。
本明細書で使用する場合、「二重特異性SAR」または「二重特異性抗原結合ドメイン」という用語は、従って、以下のものからなるポリペプチドを指す；第1の標的抗原に対して結合特異性を有する結合部位を有する、本明細書に記載の結合分子、および、第2の標的抗原に対する結合特異性を有する結合部位を有する第2のポリペプチドドメイン、すなわち、二重特異性結合分子は2つの標的に対する特異性を有する。第1の標的および第2の標的は、同じではない、すなわち、異なる標的、例えば、タンパク質である；両方とも細胞表面に存在し得る。したがって、本明細書に記載の二重特異性結合分子は、第1の標的および第2の標的を発現する(またはその細胞表面に提示する)細胞に選択的かつ特異的に結合することができる。別の実施形態では、結合分子は2つ以上の抗原結合ドメインからなり、多重特異性結合分子を提供する。本明細書に記載の多特異的抗原結合ドメインは、第一の標的を結合することに加えて、1つ以上の付加的な標的を結合することができる。すなわち、多特異的ポリペプチドは、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、またはそれ以上の標的を結合することができ、ここで、多特異的ポリペプチド剤は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、またはそれ以上の標的結合部位をそれぞれ有する。
３つ以上のＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、セントイリンなど）を含む抗原結合ドメインも本開示の範囲内である。
一態様では、本開示は、２つ以上の抗原を標的とするための本開示のＳＡＲの最適な構成を記載する。一態様では、本開示は、１つ以上の抗原の２つ以上のエピトープを標的とするための本開示のＳＡＲの最適な構成を記載する。
本開示の単鎖および二本鎖ＳＡＲは、当技術分野で公知の方法を用いて内在性ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲおよび／またはＴＣＲδ遺伝子の発現が減少または除去されたＴ細胞において発現され得る。内因性の機能的なＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＴＲＧＣおよび／またはＴＲＤＣ鎖の発現が減少または除去されたそのようなＴ細胞は、同種異系細胞治療の目的に使用することができる。
本開示の一本鎖SARおよび二本鎖SARは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPCT/US2018/053247に記載されるような方法を使用して、T細胞のTRAC、TRBC、TRGCおよび/またはTRDC遺伝子座に標的化され得る。内在性ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＴＲＧＣおよび／またはＴＲＤＣ遺伝子座がＳＡＲの挿入によって破壊されたそのようなＴ細胞は、同種異系細胞治療の目的に使用することができる。
本開示はまた、同種異系ＳＡＲ－Ｔ細胞を生成する目的で、二重特異性および多重特異性ＳＡＲをＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子座に標的化するための組成物および方法を提供する。
一実施形態では、本開示の一本鎖SARおよび二本鎖SARは、免疫細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、単球、マクロファージおよび／または好中球などで発現される1つ以上の遺伝子をコードする内因性遺伝子座を標的とすることができる。
一実施形態では、本開示の単鎖および二本鎖ＳＡＲは、ＮＫ細胞で発現される１つまたは複数の遺伝子をコードする内在性遺伝子座を標的とすることができる。
一実施形態では、本開示の一本鎖および二本鎖SARは、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、NKG2D、NKG2AおよびDNAM1からなる群から選択される1つ以上の遺伝子をコードする内因性遺伝子座を標的とすることができる。
一実施形態では、本開示の一本鎖SARおよび二本鎖SARは、SARの抗原結合ドメインが、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、NKG2D、NKG2CおよびDNAM1遺伝子の細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、および／または膜貫通ドメインの一部または全部とフレーム内で発現されるように、CD16A、CD16B NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、NKG2D、NKG2C、およびDNAM1のうちの1つ以上をコードする内因性遺伝子座に標的化される。
一実施形態では、本開示の一本鎖および二本鎖SARは、SARの抗原結合ドメインが、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、およびDNAM1遺伝子をコードするシグナルペプチドの下流およびフレーム内に挿入されるように、CD16A、CD16B、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DS4、DAP10、DAP12、FcRγ、CD3z、およびDNAM1遺伝子の1つまたは複数をコードする内因性遺伝子座に標的化される。
ゲノム操作されたiPSCの指向性分化による、T細胞およびNK細胞を含む免疫細胞の生成方法は、WO2020117526、WO2020210398、WO2019126748、WO2019112899、WO2019018603およびUS10370452を含めて当技術分野で公知であり、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、ＳＡＲの新規抗原結合ドメインは、造血系細胞上で優先的にまたは排他的に発現される抗原に結合する。造血系細胞上で優先的にまたは排他的に発現される例示的な抗原は、CD19、CD20、CD22、BCMA、CS1、CD33、MPL、CD138、CD38およびCD123である。一態様では、ＳＡＲの新規な抗原結合ドメインは、非造血系細胞上で優先的にまたは排他的に発現される抗原に結合する。非造血系細胞上で優先的にまたは排他的に発現される例示的な抗原は、メソテリン（MSLN）、Her2、EGFR、PSMA、PSCA、GPC3などである。ある態様では、SARは2つ以上の新規抗原結合ドメインを発現し、新規抗原結合ドメインの少なくとも1つは造血系細胞に優先的または排他的に発現する抗原に結合し、新規抗原ドメインの少なくとも1つは非造血系細胞に発現する抗原に結合する。
本開示は、ＳＡＲの２つ以上のＡＡＢＤ（例えば、ＳＶＨ、ＶＨＨ、セントチリンなど）がリンカー、例えばペプチドリンカーによって接続され得ることを規定する。リンカーはまた、FvまたはTCR-Fvを含むvLおよび/またはvHドメインとAABDとの間に存在し得る。例えばリンカーを含む適切なリンカーには、(Gly 4 Ser) nなどのGS残基が含まれ、ここでn = 1から10、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。リンカーは、配列番号(DNA): 1024～1028および配列番号(PRT): 3418～3422で提供される。
リンカーはまた、ＳＡＲのＦｖまたはＴＣＲ－Ｆｖを含むｖＬおよびｖＨドメインと、ｖＬおよびｖＨドメインが結合するＴＣＲ定常鎖接続ペプチドとの間に存在し得る。特に、ＩｇＣＬドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４２および配列番号（ＰＲＴ）：３５３６）およびＩｇＣＨドメイン（配列番号（ＤＮＡ）：１１４３～１１５７および配列番号（ＰＲＴ）：３５３７～３５５１）抗体に由来するものは、vL/vH とシグナル伝達鎖の間の有用なリンカーとして機能します。追加のＩｇ様ドメインは当技術分野で公知であり（例えば、配列番号（ＤＮＡ）：１１６８～１１７５および配列番号（ＰＲＴ）：３５６２～３５６９）、本開示の代替実施形態において有用なリンカーとして機能し得る。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲの抗原結合ドメインを含む１つまたは複数のＡＡＢＤは、介在するｖＬ／ｖＨフラグメントなしでシグナル伝達鎖に結合される。このような構築物では、リンカーは、ＳＡＲのＡＡＢＤと、ＡＡＢＤが結合するシグナル伝達鎖との間にも存在し得る。一実施形態では、二本鎖ＳＡＲのＡＡＢＤの一方はリンカーＩｇＣＬ（配列番号１１４２）に結合され、他方のＡＡＢＤはリンカーＩｇＧ１－ＣＨ１（配列番号１１４３）に結合される。一実施形態では、二本鎖ＳＡＲのＡＡＢＤの一方はリンカーＩｇＣＬ（配列番号１１４２）に結合され、他方のＡＡＢＤはリンカーＩｇＧ４－ＣＨＩ１（配列番号１１５２）に結合される。一実施形態では、二本鎖ＳＡＲのＡＡＢＤの一方はリンカーＴＣＲａ－ｗｔ－ｏｐｔ－６ＥＣＤ（配列番号１１５８）に結合され、他方のＡＡＢＤはリンカーＴＣＲｂ－ｗｔ－ｏｐｔ－６ＥＣＤ（配列番号１１５８）に結合される。 ID NO: 1160)。
いくつかの実施形態において、SARポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、2つのシグナル伝達鎖（例えば、CD16A、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、DAP12など、または本明細書に記載されるそれらの変異体もしくはバリアント）のNH2末端またはNH2末端近傍に別々に結合される抗体のvLドメインおよびvHドメインに由来するか、またはそれらから構成され を結合して、特定の抗原に結合する断片変数を共同で構成する。
いくつかの実施形態において、SARポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、MHC分子と会合して特異的ペプチド抗原に結合するフラグメント可変-TCR（TCR-Fv）を共同で構成するために、2つのシグナル鎖(例えば、CD16A、NKp30、NKp44、NKp46、CD3z、DAP10、DAP12など、または本明細書に記載されるその変異体もしくはバリアント）のNH2末端又はNH2末端付近に別々に結合されるTCRのVα及びVβドメインに由来するか、又はそれらから構成される。
いくつかの実施形態において、SARポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、特異的ペプチド抗原／MHCまたは脂質抗原に結合するフラグメント可変-TCR（TCR-Fv）を共同で構成するために、2つのポリペプチド鎖(例えば、CD16A、NKp30、NKp44、NKp46、CD3z、DAP10、DAP12など、または本明細書に記載されるその変異体もしくはバリアント）のNH2末端またはNH2末端近傍に別々に結合されるTCRのVγドメインおよびVδドメインに由来するか、またはこれらからなる。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲポリペプチドは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として発現され、シグナル伝達鎖（例えば、ＣＤ１６Ａ 、 ＮＫｐ３０ 、 ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２ｔなど、または本明細書に記載のそれらの変異体もしくは変異体）。
特定の実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つのポリペプチド鎖のＡＡＢＤは、構造が類似している（例えば、両方のＡＡＢＤは、ＳＶＨまたはラクダ科動物のＶＨＨドメインまたはアフィボディまたはセントチリンである）。一実施形態では、二重鎖ＳＡＲの２つのポリペプチド鎖のＡＡＢＤは構造が類似していない（例えば、第１の抗原結合ドメインはＳＶＨであり、第２の抗原結合ドメインはラクダ科動物ＶＨＨである）。
いくつかの実施形態では、コードされるSARポリペプチドの抗原結合ドメインは、対応する野生型配列または非野生型配列の抗体、単一ドメイン抗体（SDAB ）、VHドメイン、VLドメイン、ラクダ科VHHドメイン、または、DARPIN、アフィボディ、アフィリン、アデクチン、アフィチン、オボディ、レペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、センチリン、プロネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、アルマジロリピートタンパク質、自己抗原、受容体またはリガンドなどの非免疫グロブリン足場のコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる。
SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO 2440～2676の軽鎖可変ドメイン（vLまたはVL）アミノ酸配列のいずれか1つ以上を含み、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が、他のアミノ酸残基、またはSEQ ID NO 2440～2676のアミノ酸配列に対して70～99.9％の同一性を有する配列、またはSEQ ID NO:2440～2676の相補性決定領域(CDR)に対して70～100%の同一性を有する配列、または10736から10972の3つの相補性決定領域の各々において3個までのアミノ酸置換を有する配列によって置換されている。 表3は、本開示で使用する例示的なvLドメインのscFvの標的抗原、名称、SEQ ID NO（DNA）、SEQ ID NO（PRT）、SEQ ID NO（PRT）を示す。
いくつかの実施形態において、SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 2682-2918の重鎖可変ドメイン(vHまたはVH)アミノ酸配列のいずれか1つ以上を含み、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が、任意の他のアミノ酸残基、または配列番号2682～2918のアミノ酸配列と70～99.9%の同一性を有する配列によって置換される。SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 2682-2918の重鎖可変ドメイン(vHまたはVH)アミノ酸配列のいずれか1つ以上を含み、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が、他のアミノ酸残基、またはSEQ ID NO: 2682-2918のアミノ酸配列に対して70～99.9%の同一性を有する配列、またはSEQ ID NO: 2682-2918の相補性決定領域(CDR)に対して70～100%の同一性を有する配列、またはSEQ ID NO: 2682-2918の3つの相補性決定領域のいずれかにおいて3個までのアミノ酸置換を有する配列によって置換される。表3は、本開示で使用する例示的なvHドメインのscFvの標的抗原、名称、SEQ ID NO（DNA）、SEQ ID NO（PRT）、SEQ ID NO（PRT）を示す。
いくつかの実施形態において、SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO:3253-3296のラクダ科単一ドメイン抗体(vHHまたはVHH)アミノ酸配列のいずれか1つ以上からなり、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が、他のアミノ酸残基、またはSEQ ID NO:3253-3296のアミノ酸配列に対して70～99.9%の同一性を有する配列、またはSEQ 3253-3296の3つの相補性決定領域(CDR)のいずれかに3個までのアミノ酸置換を有する配列によって置換される。
いくつかの実施形態では、SARポリペプチドのコードされた1つまたは複数の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 3366-3377の非免疫グロブリン抗原結合スカフォールドアミノ酸配列のいずれか1つまたは複数を含み、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が任意の他のアミノ酸残基、または配列番号3366～3377のアミノ酸配列と70～99%の同一性を有する配列によって置換される。
いくつかの実施形態では、SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、SEQ ID NO 3378-3395のレセプターアミノ酸配列のいずれか1つ以上からなり、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が、任意の他のアミノ酸残基、または配列番号3378～3395のアミノ酸配列に対して70～99.9%の同一性を有する配列によって置換される。
いくつかの実施形態では、SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号3391の自己抗原アミノ酸配列を含み、最大19個のアミノ酸残基であるが、20個以下のアミノ酸が、任意の他のアミノ酸残基、または配列番号3391のアミノ酸配列と70～100%の同一性を有する配列によって置換される。
いくつかの実施形態では、SAR分子のコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号3396～3406のリガンドアミノ酸配列のいずれか1つ以上を含み、ここで、最大20個のアミノ酸残基であるが、21個以下のアミノ酸が、配列番号3396～3406のアミノ酸配列に対して70～100%の同一性を有する任意の他のアミノ酸残基または配列によって置換される。
いくつかの実施形態では、SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、配列番号2924～3160のscFvアミノ酸配列のいずれか1つ以上を含み、ここで、40個までのアミノ酸残基であるが、41個以下のアミノ酸が、その他のアミノ酸残基、またはSEQ ID NO 2924～3160のアミノ酸配列に対して70～100％の同一性を有する配列、またはSEQ ID NO 2924～3160の各々における6つの相補性決定領域（CDR）において70～100％の同一性を有する配列、またはSEQ ID NO：2924～3160の各々における6つの相補性決定領域（CDR）のいずれかに最大3個の置換を有する配列によって置換される。
いくつかの実施形態では、SARポリペプチドのコードされた1つ以上の抗原結合ドメインは、抗原結合部分、例えば、この抗原を標的とするvLおよびvH断片のCDR、または表3に列挙されるvLおよびvH断片のCDRのいずれかにおいて3個までのアミノ酸置換を有するドメインのCDRのいずれか1つ以上を含む。表3に示したvLおよびvHフラグメントのCDR1-3の配列は、当技術分野で公知の方法により決定することができる。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲポリペプチドのコードされた１つ以上の抗原結合ドメインは、この抗原を標的とするｖＨＨフラグメントの抗原結合部分、例えばＣＤＲのいずれか１つ以上を含む。
一実施形態では、ＳＡＲの抗原結合ドメインは、この標的抗原に結合することが知られている受容体の抗原結合部分である。
別の実施形態では、本開示は、本開示のＳＡＲのいずれかと異なる標的上の同じエピトープに結合するＳＡＲ（すなわち、本開示のＳＡＲのいずれかと異なる標的への結合について相互競合する能力を有するＳＡＲ）を提供する。開示）。いくつかの実施形態では、これらのＳＡＲの抗原特異的ドメインは、ＳＡＲの成分として使用された抗体のｖＬ断片、ｖＨ断片、および／またはｓｃＦｖ断片から決定され得る。いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究のための参照抗体は、本明細書に記載されるｖＬ、ｖＨ、ｓｃＦｖ、ＳＶＨ、ｖＨＨ、非免疫グロブリン抗原結合ドメインである。例示的な実施形態では、配列番号３０２７によって表される参照ｓｃＦｖ ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１を交差競合研究に使用して、本開示のｈｕ－ｍＲＯＯ５－１ベースのＳＡＲによって認識される標的エピトープを決定することができる。いくつかの実施形態では、記載される本開示のＳＡＲによって認識される標的エピトープを決定するための交差競合研究のための参照ＡＡＢＤフラグメントは、本明細書に記載されるＡＡＢＤフラグメントである。いくつかの実施形態では、記載される本開示のＳＡＲによって認識される標的エピトープを決定するための相互競合研究のための相互競合研究のための参照非免疫グロブリン抗原結合足場は、非免疫グロブリン抗原結合足場ベースのＡＡＢＤである。いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲによって認識される標的エピトープを決定するための相互競合研究のための参照リガンドはリガンドである。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の二重特異性SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異性SARのそれぞれの親和性と比較して、標的抗原のそれぞれに対して30％以上(例：40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、99％以上など）の親和性を示す。結合親和性は、Topanga Assayなどの当技術分野で知られているアッセイを使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の二重特異性SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異性SARの各々のシグナル伝達活性と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対して30％以上（例えば、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上、99％以上など）のシグナル伝達活性を示す。シグナル伝達活性は、Jurkat-NFAT-GFP細胞アッセイなどの当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の二重特異性SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異性SARの各々のサイトカイン産生と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対して30％以上（例えば、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上、99％以上など）のサイトカイン（例えば、TNFα、IFNγ、IL-2など）産生を示す。サイトカイン産生（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－２など）は、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の二重特異性SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異性SARの各々の細胞傷害活性と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対して30％以上（例えば、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％、99％など）の細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性は、マタドールまたは放射性クロム放出アッセイなどの当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載の他の実施形態において、本開示の二特異性SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異性SARの各々のインビボ活性と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対するインビボ活性の30％以上（例えば、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％、99％等）を示す。一実施形態では、インビボ活性は、免疫不全マウスの異種移植モデルを使用して測定される。
本明細書に記載される他の実施形態において、本開示の多特異的SARは、エフェクター細胞において発現され、同様の条件下で比較された場合、対応する非特異的SARの各々の親和性と比較して、標的抗原の各々に対して30％以上（例えば、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上、99％以上など）の親和性を示す。結合親和性は、Topanga Assayなどの当技術分野で知られているアッセイを使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の多特異的SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異的SARの各々のシグナル伝達活性と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対するシグナル伝達活性の30％以上（例えば、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上、99％以上など）を示す。シグナル伝達活性は、Jurkat-NFAT-GFP細胞アッセイなどの当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の多特異的SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異的SARの各々の細胞傷害活性と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対して30％以上（例えば、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％、99％など）の細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性は、マタドールまたは放射性クロム放出アッセイなどの当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の多特異的SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異的SARの各々のサイトカイン産生と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対して30％以上（例えば、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または95％以上、99％以上など）のサイトカイン（例えば、TNFα、IFNγ、IL-2など）産生を示す。サイトカイン産生（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－２など）は、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。
本明細書に記載される他の実施形態では、本開示の多特異的SARは、エフェクター細胞で発現させ、同様の条件下で比較した場合、対応する非特異的SARの各々のインビボ活性と比較して、標的抗原発現細胞の各々に対するインビボ活性の30％以上（例えば、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％、99％など）を示す。一実施形態では、インビボ活性は、免疫不全マウスの異種移植モデルを使用して測定される。
いくつかの実施形態では、細胞表面に存在する場合、二重特異性SARのFvまたはTCR-Fv（すなわち、vL/vH、Vα/VβまたはVγ/Vδフラグメント）によって構成される抗原結合ドメインの同族抗原に対する結合親和性は、前記SARのvL、vH、Vα、Vβ、VγまたはVδフラグメントのN末端領域に結合している1つまたは複数のAABDによって実質的に低下しない。一実施形態では、ＳＡＲは二重鎖ＳＡＲである。
いくつかの実施形態では、細胞の表面に存在する場合、二重特異性SARのFvまたはTCR-Fv（すなわち、vL/vH、Vα/VβまたはVγ/Vδフラグメント）によって構成される抗原結合ドメインの、前記SARのvL、vH、Vα、Vβ、Vγおよび/またはVδフラグメントのN末端領域またはN末端近傍に結合している1つまたは複数のAABDを含む同族抗原に対する抗原結合親和性が、対応する非特異的SARの抗原結合ドメインの抗原結合親和性の少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％であり、ここで、1つ以上のAABDは、vL、vH、Vα、Vβ、VγまたはVδ断片のN末端領域またはN末端領域の近くに結合しない。
いくつかの実施形態では、前記第2のSAR鎖の存在下での前記第1のSAR鎖の抗原結合ドメインのその同族抗原に対する結合は、前記第2のSAR鎖の非存在下での前記第1のSAR鎖の抗原結合ドメインのその同族抗原に対する結合の70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％である。
いくつかの実施形態では、SARの第2の鎖（またはCAR）の存在下でのSARの第1の鎖の抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、SARの第2の鎖（またはCAR）の非存在下でのSARの第1の鎖の抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％である。
一実施形態では、Ｖ Ｈドメインは、SEQ ID NO: 3210-3252と比較して1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または他の改変を有するSEQ ID NO: 3210-3252から選択され、単一ドメイン抗体の生物学的機能を保持する。
別の実施形態では、Ｖ Ｈドメインは、SEQ ID NO: 3210-3252と比較して1つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または他の改変を有するSEQ ID NO: 3210-3252から選択され、単一ドメイン抗体の生物学的機能を保持する。一実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、１つまたは複数のフレームワーク領域内にある。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上のＣＤＲ内にある。一実施形態では、アミノ酸置換はフレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
本開示はまた、本明細書に記載される単一ドメイン抗体の配列最適化された変異体を含む。
開示のＳＡＲの結合ドメインは、 ＢＣＭＡに対するバイパラトピック標的化を提供する。したがって、結合ドメインは、BCMAの第1エピトープに結合する第1AABD(例えば、V H単一ドメイン抗体)およびBCMAの第2エピトープに結合するAABD(例えば、V H単一ドメイン抗体)を含む。第１および第２のエピトープは重複していてもよい。
開示のＳＡＲの結合ドメインは、 ＣＤ２２に対するバイパラトピック標的化を提供する。したがって、結合ドメインは、 CD22の第1のエピトープに結合する第1のV H単一ドメイン抗体およびCD22の第2のエピトープに結合する第2のV H単一ドメイン抗体を含む。第１および第２のエピトープは重複していてもよい。
開示のＳＡＲの結合ドメインは、 ＣＤ３８に対するバイパラトピック標的化を提供する。したがって、結合ドメインは、 CD38の第1のエピトープに結合する第1のV H単一ドメイン抗体およびCD38の第2のエピトープに結合する第2のV H単一ドメイン抗体を含む。第１および第２のエピトープは重複していてもよい。
開示のＳＡＲの結合ドメインは、 ＣＥＡに対するバイパラトピック標的化を提供する。したがって、結合ドメインは、CEAの第1のエピトープに結合する第1のV H単一ドメイン抗体およびCEAの第2のエピトープに結合する第2のV H単一ドメイン抗体を含む。第１および第２のエピトープは重複していてもよい。
開示のＳＡＲの結合ドメインは、 ＰＳＭＡに対するバイパラトピック標的化を提供する。したがって、結合ドメインは、ＰＳＭＡの第１のエピトープに結合する第１のＶ Ｈ単一ドメイン抗体およびＰＳＭＡの第２のエピトープに結合する第２のＶ Ｈ単一ドメイン抗体を含む。第１および第２のエピトープは重複していてもよい。
一実施形態において、本開示のSARの結合ドメインは、二重特異的標的化を提供する。したがって、結合ドメインは、BCMAに結合するV H単一ドメイン抗体と、第2の標的を標的とする第2の結合部分とを含む。第２の結合部分は、抗体フラグメント、典型的にはＶ Ｈ単一ドメイン抗体、セントチリン、アフィボディ、またはｖＨＨドメインであり得る。第２の標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＳ１、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、５Ｔ４、Ｌ１ ＣＡＭ、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１、ｃＫｉｔ、ＲＯＲ１、メソテリン、ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤから選択され得る。 ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたはＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、ＨＥＲ２、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６、ＭＵＣ１、免疫チェックポイント標的、またはそれらの組み合わせ。しかし、当業者であれば、他の腫瘍抗原も本開示の範囲内の潜在的な組み合わせ標的であることを理解するであろう。単鎖 SAR の場合、2 つの結合ドメインはどちらの順序で存在してもよい。
一実施形態では、SARの第1結合ドメインは、BCMAと結合するAABD（例えば、VH単一ドメイン抗体またはSVH、vHHまたはセンチリンなど）と、CD38を標的とする第2結合部分とからなる。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。例示的なvL/vHフラグメントおよびそれらの標的抗原を表3に示す。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。例示的なＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片およびそれらの標的抗原を表４に示す。
一実施形態では、SARの1つの結合ドメインは、BCMAと結合するAABD（例えば、VH単一ドメイン抗体またはSVH、vHHまたはセンチリンなど）と、CD19を標的とする第2の結合部分とからなる。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。例示的なvL/vHフラグメントおよびそれらの標的抗原を表3に示す。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。例示的なＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片およびそれらの標的抗原を表４に示す。
一実施形態では、SARの第1結合ドメインは、BCMAと結合するAABD（例えば、VH単一ドメイン抗体またはSVH、vHHまたはセンチリンなど）と、CD22を標的とする第2結合部分とからなる。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。例示的なvL/vHフラグメントおよびそれらの標的抗原を表3に示す。一実施形態では、ＳＡＲは、異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖ（またはＴＣＲ－Ｆｖ）を形成するために結合するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。例示的なＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片およびそれらの標的抗原を表４に示す。
一実施形態では、SARの第1結合ドメインは、BCMAと結合するAABD（例えば、VH単一ドメイン抗体またはSVH、vHHまたはセンチリンなど）と、CD20を標的とする第2結合部分とからなる。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。
一実施形態では、ＳＡＲの第１の結合ドメインは、ＣＤ２２に結合するＡＡＢＤと、ＣＤ２０を標的とする第２の結合部分とを含む。
一実施形態では、ＳＡＲの第１の結合ドメインは、ＣＤ２２に結合するＡＡＢＤと、ＣＤ１９を標的とする第２の結合部分とを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。
一実施形態では、ＳＡＲの第１の結合ドメインは、ＣＤ１９に結合するＡＡＢＤと、ＣＤ２０を標的とする第２の結合部分とを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。
ＣＤ１９に結合するＡＡＢＤと、ＣＤ３８を標的とする第２の結合部分とを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。
ＣＤ１９に結合するＡＡＢＤと、ＣＤ１２３を標的とする第２の結合部分とを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。
ＣＤ１９に結合するＡＡＢＤと、ＢＡＦＦ－Ｒを標的とする第２の結合部分とを含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して特定の抗原を標的とするＦｖを形成するｖＬ／ｖＨフラグメントをさらに含む。一実施形態では、ＳＡＲは、結合して異なる抗原を標的とするＴＣＲ－Ｆｖを形成するＶａ／ＶｂまたはＶｇ／Ｖｄ断片をさらに含む。
上記で詳細に記載した結合ドメインに加えて、本開示のSARは、1つまたは複数のシグナル伝達鎖またはフラグメントおよびその変異体をさらに含んでもよい。 例示的なシグナル伝達鎖およびフラグメントは、SEQ ID NO（DNA）：1349～1584および8541～8767（新規鎖）ならびにSEQ NO（PRT）：3743～3966、3385、3394、7818～7822、9633～9859に提供される。本開示はまた、細胞外ドメイン、細胞外および膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン（SEQ ID NO（DNA）：1535～1549およびSEQ ID NO (PRT):3929～3943）、細胞質ドメイン（SEQ ID NO (DNA):1550～1564およびSEQ ID NO (PRT):3944～3958）およびコスティミュレイトリードメイン（SEQ ID NO (DNA):1565～1572およびSEQ ID NO (PRT):3959～3966）を提供する。例示的な実施形態では、SARを構築するためのシグナル伝達鎖および断片は、SEQ ID NO: 3743-3966 3385, 3394, 7818-7822, 9633-9859 で表されるポリペプチド、またはそれらと少なくとも60％、70％、80％もしくは90％の相同性を有する断片、またはそれらの機能的変異体、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などの同等残基（すなわちホモログ）からなる。他の哺乳動物種からのシグナル伝達鎖およびフラグメントを、本開示のＳＡＲを作製するために本開示の方法において使用できることが理解されるべきである。さらに、ヒトおよび他の哺乳動物種に由来するシグナル伝達鎖およびフラグメントのハイブリッドであるシグナル伝達鎖およびフラグメントを、本開示のＳＡＲを作製するために本開示の方法において使用することができる。最後に、本明細書に記載のシグナル伝達鎖およびフラグメントの選択的にスプライシングされたアイソフォームを本開示の方法で使用して、ＳＡＲを作製することができる。
本開示のＳＡＲは、１つ以上の膜貫通ドメインを含む。本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ）は、原形質膜を横断し、小胞体シグナル伝達ドメインおよび抗原結合ドメインに接続されるＳＡＲの領域を指し、後者の場合、必要に応じてヒンジドメインまたは接続ドメインを介して、ペプチド。一実施形態では、本開示のＳＡＲの膜貫通ドメインは、 Ｉ型またはＩＩ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、または人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ３ｚ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２８およびＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含む。他の膜貫通ドメインは当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。具体的には、配列番号３９１４～３９２８に示されるＴＭＤ配列が開示の範囲内にある。
開示のＳＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。 「細胞内シグナル伝達ドメイン」、「細胞質ドメイン」、または「エンドドメイン」は、活性化シグナルをT細胞に伝達し、細胞がその特殊な機能を実行するように指示するドメインです。具体的には、配列番号３９４４～３９５８に示される細胞内シグナル伝達ドメイン配列が開示の範囲内にある。
開示のＳＡＲは、抗原特異的結合後のＳＡＲ－Ｔ細胞活性を増強するための１つ以上の共刺激ドメインをさらに含む。複数の共刺激ドメインを単一の SAR に含めて、複数のシグナル伝達経路を動員することができます。具体的には、配列番号３９５９～３９６６を有する共刺激ドメイン配列が開示の範囲内にある。
一実施形態において、本開示のSARは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとを接続するヒンジまたはスペーサー領域をさらに含む。このヒンジまたはスペーサー領域を使用して、得られる SAR のさまざまな長さと柔軟性を実現できる。本開示に従って使用できるヒンジ領域またはスペーサー領域の例としては、抗体のFc断片またはその断片もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域またはその断片もしくは誘導体、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、CD8Aヒンジドメイン、CD28ヒンジドメイン、CD16ヒンジドメイン、NKp30ヒンジドメイン、NKp44ヒンジドメイン、NKp46ヒンジドメイン、および人工スペーサー配列、例えばペプチド配列、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他のヒンジまたはスペーサ領域は当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。具体的には、配列番号３５９２～３５９８および３９２９～３９４３に示されるヒンジ配列が開示の範囲内にある。 TCR接続ペプチド(配列番号3571～3579)もヒンジドメインとして機能し得る。
開示のＳＡＲは、 ＳＡＲの異なるドメインを接続する「リンカードメイン」または「リンカー領域」をさらに含む。このドメインには、長さ約 1 ～ 500 アミノ酸のオリゴまたはポリペプチド領域が含まれます。適切なリンカーは当業者には明らかであり、本開示の代替実施形態と関連して使用することができる。
開示のＳＡＲは、 「リーダー配列」をさらに含む。一実施形態では、リーダー配列はＣＤ８Ａドメインである。具体的には、配列番号２４２５～２４３０のリーダー配列が開示の範囲内にある。
開示のＳＡＲは、阻害シグナルを伝達する抗原結合ドメインを含む。
開示のＳＡＲは、可溶性ポリペプチドアダプターまたはタグに結合することを可能にするアダプター結合ドメインを含む。例示的なアダプターおよびアダプター結合ドメインは、配列番号3407～3435に提供される。例示的な実施形態では、ＲＺＩＰコード化ＳＡＲを、ＣＤ１９発現細胞を標的とするために、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＥＺＩＰコード化ポリペプチド（配列番号３４０９）と併用することができる。同様に、NKG2D-AF-G4Sx3-NKG2D-AFコード化SAR（例えば、SEQ ID NO: 5481）は、BCMAを標的化するために、ULBP2Rコード化ポリペプチド（例えば、CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2R、SEQ ID NO: 5131）と組み合わせて使用され得る。代替の実施形態において、NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YAコード化SAR（例えば、SEQ ID NO: 5482）は、BCMAを標的化するために、ULBP2-S3コード化ポリペプチド（例えば、CD8SP-BCMA-FHVH93-GS-ULBP2-S3、SEQ ID NO: 5132）と組み合わせて使用され得る。同様に、Streptag（SEQ ID NO: 4970）またはFITC（例えば、SEQ ID NO: 4963-4964）を標的とする抗原結合ドメインをコードするSARは、Streptag標識またはFITC標識抗体／抗体フラグメントと組み合わせて、後者によって結合された抗原を標的とするために使用することができる。他のアダプターは当技術分野で知られており（例えば、WO2019099440およびDiana Darowskiら、MABS、2019、VOL.11、NO.4、621-631）、本開示の代替実施形態で使用することができる。
ＳＡＲは、標識、例えば、蛍光標識または他のタグなどのイメージングを容易にする標識をさらに含んでもよい。これは、例えば腫瘍結合を画像化する方法に使用できます。標識は抗原結合ドメインに結合していてもよい。
本明細書に記載されるＳＡＲは、単一のポリペプチド鎖として合成され得る。この実施形態では、抗原特異的標的化領域はＮ末端にあり、縦列に配置され、リンカーペプチドによって分離されている。
例えば、抗体または抗体フラグメント、リガンドまたは受容体）を含む単離されたＳＡＲポリペプチド分子を提供する。 。
いくつかの実施形態では、SARは、単一のシグナル伝達鎖(クラス1)のNH2末端に連結された単一の抗原結合ドメインを含有する単一のポリペプチドを含むか、またはそれからなり得る。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲは、集合して機能的ＳＡＲ（クラス２）を作製する２つのポリペプチドを含むか、またはそれらからなる。このような二重鎖クラス２ＳＡＲのポリペプチドのそれぞれは、シグナル伝達鎖を含み、（クラス２Ａのように）１つ以上の抗原結合ドメインを含むか、または（クラス２Ｂのように）含まない。クラス 2A SAR では、各抗原結合ドメインが別個のシグナル伝達鎖の N 末端に結合しています。例えば、抗原結合ドメイン1（抗体のvLフラグメントなど）が一方のDAP10鎖に結合して機能的ポリペプチドユニット1を構成し、抗原結合ドメイン2（抗体のvHフラグメント）が第2のDAP10鎖に結合して機能的ポリペプチドユニット2を構成する。このようなSARの2つの機能的なポリペプチドユニットは、同じ細胞内で共発現され、互いに対になって機能的に活性になる。各抗原結合ドメインは二重特異性または多重特異性であり、それによってクラス 2 SAR が 2 つを超える抗原を標的にすることができることに留意すべきである。
いくつかの実施形態では、クラス2SARの2つの機能的ポリペプチド単位は、異なるベクターを使用して細胞内で共発現される。いくつかの実施形態において、クラス2SARの2つの機能的ポリペプチド単位は、クラス2SARの2つの機能的ポリペプチド単位をコードする2つのポリヌクレオチドをコードするために2つの別個の調節エレメント（例えば、プロモーター）を用いる単一のベクターを用いて細胞内で共発現される。本開示は、第2のポリペプチドユニットまたは第3のアクセサリーモジュールを発現させるために使用できる小さなプロモーターが、EFSプロモーター、EFS2プロモーター、またはRSVプロモーターであることを提供する。いくつかの実施形態において、クラス2 SARの2つの機能的ポリペプチド単位は、SARの2つのポリペプチドをコードするヌクレオチド断片を分離するIRES配列を含むポリヌクレオチドを発現するために単一のプロモーターを用いる単一のベクターを用いて細胞内で共発現される。いくつかの実施形態において、クラス2 SARの2つの機能的ポリペプチド単位は、切断可能なリンカー（例えば、F2A、T2A、E2A、P2Aなど）を含む単一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために単一のプロモーターを用いる単一のベクターを用いて細胞内で共発現される。その結果、mRNAは1つのポリペプチドをコードし、このポリペプチドはその後、SARの2つの機能的ポリペプチドユニットを生成する。いくつかの実施形態では、クラス2 SARの2つの機能的ポリペプチド単位は、両方の機能的ポリペプチド単位をコードする単一のmRNA配列のトランスフェクションを用いて共発現されるが、他の実施形態では、2つの機能的ポリペプチド単位は、それぞれが1つの機能的ポリペプチド単位をコードする2つの異なるmRNA配列のトランスフェクションによって共発現される。いくつかの実施形態において、SARをコードするベクターまたはmRNAは、追加の遺伝子／タンパク質（治療コントロール、阻害分子、アクセサリーモジュールなど）をコードしていてもよく、これらは、別々のプロモーター（例えば、EFS、EFS2またはRSVプロモーター）またはそれらの組み合わせを使用して発現されるIRESまたは切断可能なリンカーによって、SARコード配列から分離されていてもよい。別の実施形態では、治療対照または補助モジュールまたはその両方は、SARが発現される細胞において、別個のベクターまたはmRNAを使用して発現され得る。治療コントロールまたはアクセサリーモジュールは、SARの機能にとって必須ではなく、本実施形態のSARのいずれも、治療コントロールまたはアクセサリーモジュールなしで使用できることは理解されるべきである。例えば、PAC（ピューロマイシン耐性遺伝子）などの抗生物質耐性カセットは、SARの機能を損なうことなく、本開示のSARコードベクターから除去することができる。
また、親ＳＡＲと実質的または有意な配列同一性または類似性を有し、それが変異体であるＳＡＲの生物学的活性を保持する、本明細書に記載のＳＡＲの機能的変異体も提供される。機能的変異体には、例えば、親ＳＡＲと同程度、同じ程度、またはより高い程度まで標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載のＳＡＲ（親ＳＡＲ）の変異体が含まれる。親ＳＡＲに関して、機能的変異体は、例えば、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、親ＳＡＲとアミノ酸配列において約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上同一である。
機能的変異体は、例えば、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する親SARのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的変異体は、少なくとも1つの非保存的アミノ酸置換を有する親SARのアミノ酸配列を含むことができる。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能的変異体の生物学的活性を妨害したり阻害したりしないのが一般的である。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物活性を増強することができ、その結果、機能的変異体の生物活性は、親CARと比較して増加する。
SAR（機能的部分および機能的変異体を含む）は、SAR（またはその機能的部分もしくは機能的変異体）がその生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物における疾患細胞を検出する能力、または哺乳動物における疾患を治療もしくは予防する能力などを保持することを条件として、任意の長さ、すなわち任意の数のアミノ酸からなることができる。例えば、SARは約300～約5000アミノ酸長、例えば300、400、500、600、700、800、900、1000またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。
別の態様では、本開示は、上で定義したＳＡＲをコードする少なくとも１つの核酸を含む単離された核酸構築物に関する。一実施形態では、核酸は、表Ｂに列挙された標的の１つを標的とするタンパク質をコードする。
明細書に記載の任意のＳＡＲポリペプチドに対して少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列も本開示の範囲内である。 ＳＡＲはモジュール設計であるため、本明細書で説明するＳＡＲの１つ以上のモジュールを異なるモジュールで置き換えることによって、追加のＳＡＲを生成することができる。例えば、 ＳＡＲの抗原結合ドメイン（すなわち、ｖＬ、ｖＨ、ｓｃＦｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨ、セントチリンなど）は、他の抗原を標的とする抗原結合ドメインによって置き換えることができる。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸分子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの組み合わせを指す。 RNAには、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAが含まれます。本明細書に記載のＳＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列）。核酸は、自殺遺伝子をさらに含み得る。構築物は、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態であってもよい。
一実施形態では、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、本明細書に記載の核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク、2013）。哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、ウイルスに基づいたシステムが数多く開発されています。例えば、アデノウイルスベクター等のレトロウイルスが用いられる。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。これは例で実証されています。本開示はまた、上記のSARを含むウイルスに関する。
本開示には、細胞に直接トランスフェクトできるRNA構築物も含まれる。トランスフェクションに使用するmRNAを作製する方法は、特別に設計されたプライマーによる鋳型のin vitro転写（IVT）を含み、3'および5'非翻訳配列（「UTR」）（例えば、本明細書に記載される、 本明細書に記載の3'および／または5'UTR）、5'キャップ（例えば、本明細書に記載の5'キャップ）および/または内部リボソーム進入部位（IRES）（例えば、本明細書に記載のIRES）、発現させる核酸、およびポリAテールを含むコンストラクトを産生するために、ポリAを付加する（典型的には50-2000塩基長）（SEQ ID NO:13-16）。このようにして生成された RNA は、さまざまな種類の細胞に効率的にトランスフェクトできる。一実施形態では、鋳型はＳＡＲの配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡ ＳＡＲベクターは、エレクトロポレーションによって細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはｉＰＳＣに形質導入される。別の実施形態では、ＲＮＡ ＳＡＲベクターは、マイクロ流体デバイスを使用して細胞膜に一時的な摂動を引き起こすことによって、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入される。 ＳＡＲの異なる鎖（または機能的ポリペプチド単位）は、１つまたは複数のベクター、異なるベクターまたは技術の組み合わせを使用して細胞に導入することもできる。
別の実施形態では、ＳＡＲの一方の鎖または機能的ポリペプチド単位はレトロウイルスベクターを使用して導入することができ、他方の機能的ポリペプチド単位はレンチウイルスベクターを使用して導入することができる。別の態様では、一方の機能的ポリペプチド単位はレンチウイルスベクターを使用して導入され、他方の機能的ポリペプチド単位はスリーピングビューティートランスポゾンを使用して導入される。さらに別の態様では、１つの機能的ポリペプチド単位はレンチウイルスベクターを使用して導入され、他の機能的ポリペプチド単位はＲＮＡトランスフェクションを使用して導入される。さらに別の態様では、１つの機能的ポリペプチド単位は、当技術分野で公知の遺伝子ターゲティング技術を使用する内因性ＴＣＲ鎖遺伝子座での遺伝子組換えによって細胞内に産生され、一方、他の機能的ポリペプチド単位は、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用して導入される。
RNAは、多数の異なる方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または銃銃粒子を含むがこれらに限定されない市販の方法を使用することができる。 「遺伝子銃」などの送達システム（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）、またはマイクロ流体デバイスを使用して細胞膜に一時的な摂動を引き起こすことによる（以下を参照）例えば、特許出願ＷＯ２０１３／０５９３４３Ａ１およびＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０６４６）。
いくつかの実施形態では、非ウイルス法には、トランスポゾン（転移因子とも呼ばれる）の使用が含まれる。
トランスポゾンを使用する核酸送達の例示的な方法には、Sleeping Beautyトランスポゾンシステム(SBTS)およびpiggyBac(PB)トランスポゾンシステムが含まれる。
いくつかの実施形態では、 ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入とヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (TALEN)、CRISPR/Cas システム、または人工メガヌクレアーゼ再工学ホーミングエンドヌクレアーゼ)。
いくつかの実施形態では、非ウイルス送達方法の使用により、細胞、例えば、Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、幹細胞またはｉＰＳＣもしくは合成Ｔ細胞の再プログラミング、および対象への細胞の直接注入が可能になる。
さらなる態様では、本発明はまた、上記のような１つ以上の核酸構築物を含む単離された細胞または細胞集団にも関する。したがって、細胞は、本開示のＳＡＲ核酸構築物を発現するように遺伝子改変されている。したがって、本発明は、本発明のＳＡＲ核酸構築物を含み、それを安定に発現する遺伝子操作された細胞を提供する。一実施形態では、細胞は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、制御性T細胞、造血幹細胞および／または多能性胚／誘導幹細胞からなる群から選択される。Ｔ細胞は、本開示のＳＡＲ核酸構築物によるトランスフェクションのために患者から単離され得る。
例えば、細胞は、ex vivoで本開示の核酸でトランスフェクトすることができる。様々な方法により、本開示のＳＡＲを発現する安定なトランスフェクタントが生成される。一実施形態では、細胞を安定にトランスフェクトし、再方向付けする方法は、裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによるものである。本開示のＳＡＲをコードする裸のＤＮＡを使用して細胞を遺伝子操作する追加の方法には、化学的形質転換法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソームおよび／またはカチオン性ポリマーを使用する）、非化学的形質転換法（例えば、エレクトロポレーションを使用する）が含まれるが、これらに限定されない。 、光学的形質転換、遺伝子エレクトロトランスファーおよび／または流体力学的送達）および／または粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃を使用するインペールフェクションおよび／またはマグネトフェクション）。組み込まれた再構成されていないベクターの存在およびSARの発現を示すトランスフェクトされた細胞は、エクスビボで拡張され得る。ウイルス形質導入法を使用して、本開示のＳＡＲを発現するリダイレクトされた細胞を生成することもできる。
いくつかの実施形態では、本開示のベクターはプロモーターをさらに含むことができる。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、EF-1プロモーター、CMV IE遺伝子プロモーター、EF-1αプロモーター、MNDU3プロモーター、ユビキチンCプロモーター、コアプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターが挙げられる。 。いくつかの実施形態では、プロモーターはEF-1プロモーターである。さらなる実施形態では、ＥＦ－１プロモーターは配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、ベクターはＲＮＡ核酸である。いくつかの実施形態では、ベクターはポリ（Ａ）テールを含む。
別の態様において、本開示は、SAR、例えば本明細書に記載のSARをコードする核酸、またはSAR分子、例えば本明細書に記載のSARをコードする核酸を含むベクターと、細胞、例えば本明細書に記載のT、NK、NK細胞株、マクロファージ、NKT、幹細胞、iPSCまたは合成T細胞に導入する（例えば、形質導入する）ことを含む、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）を作製する方法を提供する。
細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞もしくはＮＫＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）、または免疫エフェクター細胞もしくは合成Ｔ細胞を生じさせることができる幹細胞／前駆細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ９２、ＮＫ９２ＭＩまたはその誘導体などの不死化細胞株である。いくつかの実施形態では、本方法における細胞は、内在性Ｔ細胞受容体α、β１、β２、プレＴＣＲα、γもしくはδ、またはそれらの組み合わせの定常鎖を欠損している。いくつかの実施形態では、本方法における細胞は、ＨＬＡ抗原を欠損している。いくつかの実施形態では、本方法における細胞はβ２ミクログロブリンを欠損している。いくつかの実施形態において、本方法における細胞は、SARの標的抗原の発現が欠損している。例えば、SAR発現T細胞は、SARがCD5を指向する場合には内因性CD5が欠損しており、SARがTCR-β1定数鎖を指向する場合にはTCR-β1定数鎖が欠損しており、SARがTCR-β2を指向する場合にはTCR-β2定数鎖が欠損しており、SARがCS1を指向する場合にはCS1が欠損している
いくつかの実施形態では、ＳＡＲをコードする核酸分子を導入することは、ＳＡＲをコードする核酸分子を含むベクターを形質導入すること、またはＳＡＲをコードする核酸分子をトランスフェクトすることを含み、ここで、核酸分子はインビトロ転写されたＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲの２つ以上の成分をコードする核酸分子は、細胞に２つ以上のベクターを形質導入することによって、またはＳＡＲの異なるサブユニットをコードする２つ以上の核酸分子をトランスフェクトすることによって導入される。例えば、細胞は、それぞれがＳＡＲの２つの機能的ポリペプチド単位のうちの１つをコードする２つの別個のベクターで形質導入され得る。同様に、細胞は、 SARの2つの機能的ポリペプチド単位のうちの1つをそれぞれコードする2つの別個のインビトロ転写RNAで形質導入され得る。 SARの機能的ポリペプチド単位に加えて、RNAの各々は、両方のRNAで形質導入された細胞を選択するために使用され得る異なる選択マーカーまたはレポーター(例えば、tEGFR、tBCMA、またはCD34もしくはCNB30もしくは変異体DHFR)を有し得、したがって、SARの機能的ポリペプチドユニットの両方を発現する。
一実施形態では、本開示のＳＡＲは、内因性遺伝子の調節エレメントを使用して発現させることができる。一実施形態では、ＳＡＲの１つまたは複数の異種抗原結合ドメインをコードする発現カセットは、天然に存在するシグナル伝達受容体またはシグナル伝達アダプターの遺伝子座を標的とする。一実施形態では、ＳＡＲの１つまたは複数の異種抗原結合ドメインは、天然の受容体またはシグナル伝達アダプターの全体または部分的な細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトゾルドメインをコードするｍＲＮＡと融合して転写される。一実施形態では、ＳＡＲの１つ以上の異種抗原結合ドメインは、天然の受容体またはシグナル伝達アダプターのヒンジドメインおよびサイトゾルドメインをコードするｍＲＮＡと融合して転写される。一実施形態では、ＳＡＲの１つ以上の異種抗原結合ドメインは、天然の受容体またはシグナル伝達アダプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメインをコードするｍＲＮＡと融合して転写される。一実施形態では、ＳＡＲは、天然に存在する受容体またはシグナル伝達アダプターのプロモーターおよび転写調節エレメントの下で発現される。一実施形態では、内因性遺伝子座へのＳＡＲの標的化は、天然に存在する受容体またはシグナル伝達アダプターの発現の破壊をもたらす。
遺伝子を任意の特定の遺伝子座に標的化する方法は、当技術分野で知られている。一実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９またはＺｎフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬ ＥＮの使用を含む。一実施形態では、SAR発現カセットは、CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、 KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、 CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、そしてCD161の群から選択される天然受容体の遺伝子座を標的とする。一実施形態では、SAR発現カセットは、TAPIの遺伝子座、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαもしくはβ定数領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、または染色体6p21領域の遺伝子を標的とする。
いくつかの実施形態では、本方法はさらに、a）免疫エフェクター細胞（例えば、T細胞又はNK細胞）の集団を提供する工程；及びb）該集団からT制御細胞を除去し、それによりT制御欠失細胞の集団を提供するステップを含み、ここで、ステップa）およびb）は、SARをコードする核酸を集団に導入する前に行われる。
一実施形態では、細胞はヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージまたは樹状細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はイヌ細胞である。
一実施形態では、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体鎖を欠損している。本開示による機能的ＴＣＲの発現を安定に欠くＴ細胞は、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９、および内因性Ｔ細胞受容体鎖を標的とするｓｈＲＮＡの使用などの様々なアプローチを使用して産生され得る。
機能的な内在性TCRを欠くT細胞は、例えば、その表面に機能的な内在性TCRを全く発現しないように操作されるか、機能的な内在性TCRを構成する1つ以上のサブユニット（例えば、内在性TCRα、TCRβ1、TCRβ2、TCRγ、TCRδまたはプレTCRαの定数鎖）を発現しないように操作されるか、またはその表面に機能的な内在性TCRをほとんど産生しないように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つ以上の突然変異型または切断型の発現によって、実質的に障害された内因性ＴＣＲを発現することができる。 「実質的に障害のあるＴＣＲ」という用語は、このＴＣＲが宿主において有害な免疫反応を誘発しないことを意味する。
本開示は、NK細胞において発現され、シグナル伝達活性を示すだけでなく、T細胞、および単球／マクロファージ、好中球、樹状細胞を含む他の免疫系譜においても発現され、シグナル伝達活性を示すことができる新規鎖（例えば、NKp30、NKp44、NKp46、DAP10、CD3z、NKG2D、CD16など）に基づくSARを提供する。本開示は、非Ｔ細胞におけるＴＣＲ様結合特性、すなわちペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する能力の普遍的な方法を提供する。したがって、本開示は、TCR様結合特性を有する非T細胞を提供する。実施形態では、本開示は、本開示のＳＡＲを発現させることによって、Ｔ細胞ではない細胞にＴＣＲ様結合特性を付与することができることを提供し、ここで、ＳＡＲは、ＴＣＲの可変ドメインを含むがＴＣＲモジュールを欠くｕＴＣＲ－ＳＡＲである。この実施形態では、本開示は、複数の遺伝子操作を必要とせずに、任意の細胞にＴＣＲ様の結合特性を与える簡単なワンステップ方法を提供する。一実施形態では、この方法は細胞内でのｕＴＣＲ－ＳＡＲの異所性発現を伴い、複数のＣＤ３サブユニットの異所性発現および高発現クローンの選択に必要な追加のステップおよび時間の浪費を必要としない。したがって、この方法は、初代NK細胞、造血幹細胞またはiPSCなどの初代細胞を含む任意の細胞にT細胞様の結合およびシグナル伝達を与えるのに適している。この方法はまた、NK細胞株（例えば、NK92、NK92MI、NKGおよびYTS細胞株）のような不死化細胞株に対して、抗原に対するT細胞様結合（すなわち、ペプチド抗原に対するHLA依存的結合）および／またはTCR様シグナル伝達および細胞傷害性を付与するために用いることもできる。
本開示のSAR（例えば、uTCR-SAR、CD16-SARなど）は、非T細胞を含む任意の細胞において発現され得るため、本開示の方法は、生理的T細胞受容体複合体を介したシグナル伝達に依存するSIR、AbTCRなどの他の次世代CARプラットフォームと比較して、明確な利点を有する。本開示は、複数の組織および系統において活性なプロモーター(例えば、EF1α、MNDU3、ユビキチンなど)下で発現されるSARを提供する。本開示は、本開示のSARを幹細胞（例えば、造血幹細胞またはiPSC）中で発現させることができ、幹細胞を分化させると、NK、T、マクロファージ、好塩基球、好中球、B細胞、顆粒球、樹状細胞などの複数の系譜においてSARが機能的に発現し、それによってSARが標的とする抗原に対する強力な免疫応答がもたらされることを提供する。一実施形態では、ＳＡＲはインビボで造血幹細胞において発現され、異なる血液系統への分化がインビボで起こる。本開示の別の実施形態では、ＳＡＲはインビトロで幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）内で発現され、異なる血液系統への分化がインビトロで起こる。次いで、インビトロで分化および増殖した複数の系統の血液細胞が対象に投与される。
いくつかの実施形態において、本開示は、初代細胞（例えば、 一次NK細胞、g-NK細胞、CIK、メモリー様NK細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、B細胞、顆粒球など）、細胞株、造血幹細胞、iPSC細胞、HLA欠損iPSC細胞、HLA欠損NK細胞、HLA欠損NK細胞株などの群から選択され、TCR様結合特性および／またはシグナル伝達活性を有する非T細胞を提供する。
以上のことから、本出願は、少なくとも1つのSARを含むiPS細胞、iPS細胞株細胞、またはそれからの誘導体細胞を提供し、誘導体細胞は、SARを含むiPS細胞の分化から得られる機能的エフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、誘導体細胞は造血細胞であり、これには限定されないが、確定的造血内皮（HE）能を有する中胚葉細胞、確定的HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞が含まれる、 造血多能性前駆細胞（MPP）、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄系細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージであるが、これには限定されない。いくつかの実施形態において、機能的誘導体造血細胞は、T細胞、NK細胞、制御細胞などのエフェクター細胞からなる。
別の実施形態では、ＳＡＲを含むｉＰＳＣまたはその誘導細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８およびＩＬ２１のうちの少なくとも１つを含む外因性サイトカインおよび／またはサイトカイン受容体をさらに含む。
さらに、少なくともSAR発現を含むiPSC、iPS細胞株細胞、またはそれからの誘導体細胞が提供され、細胞の活性化、生存、持続、および／または増殖に寄与するサイトカインシグナル伝達を可能にするために、少なくとも1つの外因性サイトカインおよび／またはその受容体（IL）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み得、ここで、iPSC株は、改善された活性化、生存、持続性、拡大、およびエフェクター細胞機能を有する機能的誘導体造血細胞を産生するために、指向性分化が可能である。外因的に導入されたサイトカインシグナル伝達（複数可）は、IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、およびIL21のいずれか1つ、または2つ以上のシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導性である。いくつかの実施形態において、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン／サイトカイン受容体の一過性／時間的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、またはｍＲＮＡを含むＲＮＡを介して行われる。いくつかの実施形態において、SAR過剰発現iPSCまたはその誘導体細胞に含まれる外因性細胞表面サイトカインおよび／または受容体は、IL7、IL10、IL15、IL18またはIL21シグナル伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ７などの膜アンカー型である。ｈＩＬ２の膜アンカー型をコードする例示的な構築物は、配列番号１３３０によって表される。いくつかの実施形態では、サイトカインは、多目的スイッチの一部である。
また、SARおよび過剰発現されたNKG2C、CD94、DAP12、DAP10、BiKE、TriKE、hnCD16、CAR、IL、B2Mノックアウトおよび／またはCITAノックアウト；ならびに任意選択で、HLA-Gをコードするポリヌクレオチドを含む、iPS細胞、改変HLA欠損iPCS、iPS細胞株細胞、またはそれからの誘導体細胞が提供され、ここで、iPS細胞は、機能的な誘導体造血細胞を産生するために指向性分化が可能である。iPSCおよびその誘導体であるNK細胞またはT細胞の一実施形態では、細胞は他のゲノム編集の中でもB2M-/- CIITA-/-からなり、HLA-IおよびHLA-IIの両方が欠損しており、iPSCおよびその誘導体であるエフェクター細胞は持続性および/または生存性が改善されている。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、インビボでの持続性および／または生存が増加している。
そのようなものとして、本明細書で提供されるのは、SAR、外因性サイトカイン／レセプター、B2Mノックアウト、およびCIITAノックアウトを含むiPSCであり；ここで、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチドが任意に導入され；そしてiPSCが、機能的な誘導体造血細胞を産生するために指向性分化が可能である。また、本出願には、過剰発現SAR、外因性サイトカイン／レセプター、B2Mノックアウト、およびCIITAノックアウトからなる機能的iPSC誘導体造血細胞も含まれ、ここで、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチドが任意に導入され、そして誘導体造血細胞は、確定造血内皮（HE）能を有する中胚葉細胞、確定HE、CD34造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、造血多能性前駆細胞（MPP）、T細胞前駆細胞、NK細胞前駆細胞、骨髄系細胞、好中球前駆細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージを含むが、これらに限定されない。また、本出願には、過剰発現したSAR、外因性サイトカイン/受容体、B2Mノックアウト、およびCIITAノックアウトを含む機能的iPSC誘導造血細胞も含まれる。ここで、B2Mがノックアウトされる場合、HLA-Gをコードするポリヌクレオチドが任意に導入され、派生造血細胞には、最終的造血内皮(HE)能を有する中胚葉細胞、最終的HE、CD34造血細胞、造血細胞が含まれるが、これらに限定されない。幹細胞および前駆細胞、造血多分化能前駆細胞 (MPP)、T 細胞前駆細胞、NK 細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、T 細胞、NKT 細胞、NK 細胞、B 細胞、好中球、樹状細胞、およびマクロファージ。
SARを構成する前記1つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む細胞または細胞の集団の一実施形態では、細胞は、以下の1つまたは複数をさらに含む：(i）BiKEまたはTriKE；（ii）B2Mヌルまたは低値；（iii）CIITAヌルまたは低値；（iv）HLA-Gまたは非開裂型HLA-Gの導入発現；（v）キメラ抗原受容体（CAR）；（vi）細胞表面発現外来性サイトカインまたはその受容体の部分ペプチドまたは完全ペプチド；（vii）多目的スイッチをコードする付属モジュール；(viii）B2M、TAPI、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ一定領域、 NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、または染色体6p21領域のいずれかの遺伝子の少なくとも1つにおける欠失または発現低下、および(ix）HLA-E、41BBL、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、FcRγ、DAP10、DAP12、CD4、CD8、CD16、CD47、CD94、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、Fcレセプター、エンゲイジャー、または二重特異性もしくは多重特異性エンゲイジャーもしくは万能エンゲイジャーと結合するための表面トリガーレセプターの少なくとも1つにおいて、導入または発現の増加。
uTCR-SARの代替アプローチにおいて、本開示はまた、NK細胞またはNK細胞株などの非T細胞において発現される内因性TCRシグナルに依存するSIR、AbTCR、cTCRおよび他の類似のプラットフォーム上でSARを発現させる方法を提供する。一実施形態では、細胞は免疫細胞（例えば、NK、単球、マクロファージ、好中球、NK92細胞株など）または幹細胞（例えば、iPSC）であり、免疫細胞または幹細胞は、CD3ε、CD3γ、CD3δおよびCD3ζのうちの1つ以上、またはそれらの変異体を異所的に発現するように操作される。一実施形態では、細胞は免疫細胞または幹細胞（例えば、iPSC）であり、免疫細胞（例えば、NK、単球、マクロファージ、好中球など）または幹細胞（例えば、iPSC）は、1つ以上のCD3ε、CD3γ、CD3δまたはその変異体を異所的に発現するように操作される。一実施形態において、CD3ε、CD3γ、CD3δおよびCD3ζを異所的に発現するように操作された細胞は、本開示の1つ以上のSARも発現する。一実施形態では、本開示のSARは、1つ以上のTCR定数鎖またはそのフラグメント（例えば、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδなどの定数鎖）からなる。1つ以上のTCR定常鎖または断片を含む例示的なSARとしては、SIR(配列番号2305)、cTCR、Ab-TCR(配列番号2309および2310)、STAR、HIT、TFPおよびTFPαβおよびTFPγδが挙げられる。一実施形態において、細胞におけるCD3ε、CD3γ、CD3δ及び／又はCD3ζの発現は、1つ以上のTCR定数鎖又は断片を含むSARの機能発現を促進する。。
一実施形態では、細胞は幹細胞であり、幹細胞は１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体鎖を欠損している。別の実施形態では、細胞は、ＳＡＲの１つ以上の標的抗原（例えば、ＭＰＬ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ１９など）が欠失されているか、またはＳＡＲによってもはや認識されない形態に変異されている幹細胞である。 。一例として、CD19を標的とするSARは、CRISP/Cas9またはZnフィンガーヌクレアーゼを使用してCD19を欠損させた幹細胞で発現されるため、そのような幹細胞によって産生されるB細胞は、CD19を標的とするSARを発現するT細胞によって排除されない。 SAR。あるいは、CD19を標的とするSARは、内因性CD19がCRISP/Cas9またはZnフィンガーヌクレアーゼを使用してSARの標的とならない形態に変異した幹細胞で発現され、そのような幹細胞によって産生されるB細胞がSARによって排除されないようにする。 CD19 を標的とする SAR を発現する T 細胞。別の実施形態では、ＳＡＲは免疫エフェクター細胞で発現され、自家ドナーまたは同種ドナーからの幹細胞は、ＳＡＲ標的抗原の発現を欠くか、またはそうではない変異型のＳＡＲ標的抗原を発現するように遺伝子操作される。 SARによって認識されています。たとえば、CD19を標的とするSARは、CRISP/Cas9またはZnフィンガーヌクレアーゼを使用してCD19を欠損させた自家または同種造血幹細胞とともに患者に注入されたT細胞で発現され、そのような幹細胞によって産生されるB細胞はCD19 を標的とする SAR を発現する T 細胞によって細胞は排除されません。あるいは、CD19 を標的とする SAR は、CRISP/Cas9 または Zn フィンガー ヌクレアーゼを使用して内因性 CD19 が SAR の標的とならない形態に変異している自家または同種造血幹細胞とともに患者に注入される T 細胞で発現されます。そのため、そのような幹細胞によって産生されたB細胞は、CD19を標的とするSARを発現するT細胞によって排除されない。同様のアプローチを使用して、治療のためにこれらの抗原を標的とするSAR-T細胞を受けている被験者において、shRNA、CRISP/Cas9またはZnフィンガーヌクレアーゼを使用して、幹細胞内の他の内因性抗原(例えば、MPL、CD33、CD123など)を変異または除去することができる。これらの抗原が疾患関連細胞または疾患の原因となる細胞上で発現される特定の疾患について説明します。
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球など）または幹細胞を対象から得ることができる。 「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、単球/マクロファージ、好中球など）は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、生体組織などの多くの供給源から得ることができます。感染部位、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍。一実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えば、プレリキサフォル）などの動員剤を投与された対象から得られる。免疫細胞は組織常在性ガンマデルタ T 細胞であり、 SAR の発現前にin vitro で培養および増殖させることができます。
免疫細胞（例えば、T細胞、NK細胞、単球/マクロファージ、好中球など）は、幹細胞のインビトロ分化によって得ることができる。一実施形態では、免疫細胞は、 ｉＰＳＣのインビトロ分化によって得られる。
ＳＡＲを発現するために使用される免疫細胞は、自己免疫細胞であっても同種異系免疫細胞であってもよい。
-SARを含む本開示のSARを発現する細胞は、疾患の治療に使用される。
したがって、本開示は、本明細書に記載のSARを含む細胞または細胞集団を被験体に投与することを含み、癌などの疾患の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする被験体に、本開示の細胞および／または医薬組成物の薬学的に活性な量を投与することを含む。
本開示はまた、治療において使用するための、本明細書に記載のSAR、SARを含む細胞または細胞集団に関する。本開示はまた、癌の治療に使用するための、本明細書に記載のＳＡＲまたはＳＡＲを含む細胞に関する。本開示はまた、癌の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載のＳＡＲまたはＳＡＲを含む細胞の使用にも関する。
別の態様では、本開示は、対象における標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法であって、ＳＡＲを発現する細胞または細胞集団の有効量を対象に投与することを含む方法に関する。本開示の抗原結合ドメインは、標的細胞集団または組織を特異的に認識するように選択される。
別の態様では、本開示は、対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、本開示のＳＡＲを発現するように遺伝子改変された有効量の細胞または細胞集団を哺乳動物に投与することにより、被験者の抗腫瘍免疫。
別の態様では、本発明は、本発明のＳＡＲ核酸構築物を前記細胞または細胞集団において発現させることを含む、遺伝子改変された細胞または細胞集団を生成する方法に関する。この方法は、本明細書に記載の核酸（例えば、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡ；本明細書に記載のＳＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列）を細胞に導入することを含み得る。実施形態において、ＲＮＡは、ＳＡＲポリペプチドを一時的に発現する。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、または細胞集団）である。このような方法によって生成された細胞も本開示の範囲内である。
別の態様では、本開示は、本開示のＳＡＲで前記細胞を形質転換することを含む、適応免疫療法に使用するための細胞集団を生成するエクスビボ方法に関する。
本開示のある態様において、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞又はNK細胞は、FicollＴＭ分離のような当業者に公知の任意の数の技術を用いて、被験者から採取された単位血液から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。一態様において、細胞は、T細胞及び／又はNK細胞が薬剤の投与によって動員された対象から収集される。いくつかの実施形態では、免疫細胞の収集前に、CXCR4アンタゴニスト（例えば、Plerixafor）、サイトカイン（例えば、 G-CSF、GM-CSFまたはサルグラモスチム、ノイラスタまたはペグフィルガストリム）、β2アゴニスト（エピネフリンなど）、チロシンキナーゼ阻害剤（ダサチニブなど）、化学療法薬（シクロホスファミド、ドキソルビシンなど）を単独でまたは組み合わせて投与したドナーから免疫細胞を収集する。いくつかの実施形態では、ドナーは自己ドナーであるが、他の実施形態では、ドナーは同種ドナーである。
通常、アフェレーシス製品には、T 細胞、単球、顆粒球、B 細胞、NK 細胞、その他の有核白血球、赤血球、血小板などのリンパ球が含まれています。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、場合により、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。一実施形態では、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。別の実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合があり、またはすべてではないにしても多くの二価カチオンを欠く場合がある。
別の実施形態では、本明細書に記載のＳＡＲ発現エフェクター細胞は、ＳＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤である。阻害分子の非限定的な例としては、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM（例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および／またはCEACAM-5）、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4およびTGFRβが挙げられる。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第2のポリペプチド、例えば、 41BB、CD27、OX40、CD28、Dap10、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40またはこれらの組み合わせ)および/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζシグナル伝達ドメイン)のような細胞内シグナル伝達ドメインと会合した、阻害分子に結合する第1のポリペプチド、例えば、scFvもしくはVHH、またはレセプターもしくはリガンドフラグメントを含む。一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、本明細書に記載のシグナル伝達鎖（例えば、CD16、NKp30、NKp44、およびNKp46など）に関連する第1のポリペプチド、例えば、scFvもしくはVHHフラグメント、または阻害性分子に結合する受容体もしくはリガンドフラグメントからなる。
別の実施形態では、本明細書に記載のＳＡＲ発現細胞は、アクセサリーモジュール、例えば、ＳＡＲ発現細胞の活性を調節する薬剤をさらに発現することができる。 ＳＡＲ発現細胞の活性を増強または調節することができる薬剤を含むアクセサリーモジュールのいくつかの例を配列番号３７０２～３７２５に提供する。例えば、一実施形態では、薬剤は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、またはそれらの組み合わせの発現および／または活性を増加させる薬剤であり得る。別の実施形態では、薬剤は、ＳＡＲ発現細胞に共刺激シグナルを提供する薬剤（例えば、ｖＦＬＩＰ Ｋ１３、ｖＦＬＩＰ ＭＣ１５９、ｃＦＬＩＰ－Ｌ、ｃＦＬＩＰ－ｐ２２、ＨＴＬＶ１ Ｔａｘ、ＨＴＬＶ２ Ｔａｘ、４１ＢＢまたはＣＤ２８）であり得る。別の実施形態では、薬剤は、誘導可能な様式でＳＡＲ発現細胞に共刺激シグナルを提供する薬剤（例えば、ＦＫＢＰｘ２－Ｋ１３、Ｍｙｒ－ＭＹＤ８８－ＣＤ４０－Ｆｖ'－Ｆｖなど）であり得る。別の実施形態において、薬剤は、ＳＡＲ発現細胞の増殖または持続を促進するサイトカインまたはケモカイン（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ１２ｆまたはＩＬ－２１）であり得る。例示的な実施形態では、薬剤は膜アンカー型のヒトＩＬ２（配列番号（ＤＮＡ）：１３３０および配列番号（ＰＲＴ）：３７２４）である。
本開示は、「多目的スイッチ」として機能する治療用制御装置／付属品モジュールも提供する。例示的な実施形態では、多目的スイッチは、細胞内で異所的に発現される場合、養子細胞療法の目的で生死スイッチとして機能する。一実施形態では、多目的スイッチは、受容体結合ドメインを含む第１モジュールと、キルスイッチとして機能する第２モジュールおよび膜アンカーモジュールとして機能する第３モジュールとのインフレーム融合を含む。一実施形態では、第１のモジュールは、細胞表面上に発現される受容体に結合する、すなわち、受容体の細胞外ドメインに結合する。一実施形態では、第１のモジュールは、結合すると生存促進および／または増殖シグナルを細胞に伝達する受容体に結合する。一実施形態では、第１モジュールはシスで受容体に結合する（すなわち、分子スイッチを発現する細胞と同じ細胞上で発現される受容体に結合する）。 一実施形態では、第１のモジュールはトランスで受容体に結合する（すなわち、分子スイッチを発現する細胞以外の細胞上で発現される受容体に結合する）。一実施形態では、第１のモジュールは受容体にシスおよびトランスで結合する。一実施形態では、第２モジュールと第３モジュールは同じ内因性タンパク質に由来する。一実施形態では、第２および第３モジュールは、異なる内因性タンパク質に由来する。一実施形態では、第２のモジュールは、内在性タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片を含む。一実施形態では、第２のモジュールを使用して、分子スイッチを発現する細胞の死を誘導することができる。一実施形態では、第２のモジュールは、薬剤が結合したときに分子スイッチを発現する細胞の死を誘導するために使用することができる。例示的な実施形態では、第２のモジュールに結合したときに分子スイッチを発現する細胞の死を誘導する薬剤は、抗体、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、抗体薬物複合体、二重特異性抗体、またはフラグメントである。その。一実施形態では、第２のモジュールを使用して、分子スイッチを発現する細胞を選択的に濃縮または枯渇させることができる。一実施形態では、第２のモジュールを使用して、薬剤が結合したときに分子スイッチを発現する細胞を選択的に検出、富化および／または枯渇させることができる。例示的な実施形態では、第２のモジュールに結合した場合に分子スイッチを発現する細胞を選択的に検出、富化および／または枯渇させるために使用できる薬剤は、抗体、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、または非免疫グロブリン抗原結合ドメインである。その断片。一実施形態では、分子スイッチは、エクスビボで細胞を選択的に検出、濃縮、および／または枯渇させるために使用される。一実施形態では、分子スイッチは、インビボで細胞を選択的に枯渇させるために使用される。一実施形態において、分子スイッチを発現する細胞を検出、枯渇または濃縮するために使用される薬剤（すなわち、抗体、抗体薬物複合体、二重特異性抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメインまたはその断片）は、FDAによってヒトへの投与が承認されている。ヒトへの投与がFDAによって承認されている例示的な薬剤は当技術分野で知られており、リツキシマブ、ハーセプチン、アービトラックス、アドセトリス、エンブレルなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、分子スイッチを発現する細胞を検出、枯渇、濃縮するために使用される薬剤は、生体外臨床使用についてFDAによって承認されている。例示的なそのような薬剤は、臨床的に承認されたCliniMACS CD34システム(Miltenyi)と併せて使用されることがFDAによって承認されているCD34に対する抗体である。例示的な多目的スイッチは、Synth-IL2-Nde-tBCMA-L244ter (配列番号(DNA):7152および配列番号(PRT):7843)であり、細胞外ドメインにインフレームで融合されたIL2のIL2受容体結合ドメインを含むそしてBCMAの膜貫通ドメイン。この多目的スイッチは、免疫細胞(例えば、T細胞またはNK細胞など)で発現されると、IL2を含むN末端モジュールを介してIL2受容体に結合することによって生存シグナルを免疫細胞に提供する。この多目的スイッチの 2 番目のモジュールは、 BCMA 結合剤 ( BCMA 抗体など) によって認識される BCMA の細胞外ドメインを含み、導入遺伝子 (SARなど) を発現する細胞の検出、選択的除去、および/または濃縮に使用できます。 。第２のモジュールを含むＢＣＭＡの細胞外ドメインは、 ＢＣＭＡを標的とする抗体または抗体薬物複合体などのＢＣＭＡ標的薬剤の使用による導入遺伝子（例えば、ＳＡＲ）発現細胞の選択的自殺にも使用することができる。この分子スイッチの 3 番目のモジュールは、BCMA のヒンジおよび/または膜貫通ドメインで構成され、スイッチを細胞膜に固定する役割を果たします。一実施形態では、第２のモジュールは、エピトープまたはミモトープの１つまたは複数のコピーを含む合成モジュールである。一実施形態では、エピトープは内因性タンパク質の細胞外ドメインに存在する。一実施形態では、ミモトープは、内因性タンパク質の細胞外ドメインに存在するエピトープを模倣する。エピトープまたはミモトープの１つ以上のコピーを含む例示的な合成モジュールは、 ＣＤ３４エピトープおよび２つのＣＤ２０ミモトープを有するモジュールであるＲＱＲ８である。 RQR8 モジュールを使用すると、臨床的に承認された CliniMACS CD34 システム (Miltenyi) を使用した選択が可能になります。さらに、この構築物は広く使用されている医薬品抗体リツキシマブに結合し、導入遺伝子発現細胞の選択的欠失をもたらします。追加の例示的な多目的分子スイッチとしては、IL2またはその変異体とtBCMA（SEQ ID NO（DNA）．7151～7155）、IL15またはその変異体およびtBCMA（SEQ ID NO（DNA）：7156～7157）、IL2およびその変異体およびtHer2、IL2およびその変異体およびtEGFR、IL2およびそのRQR8などである。多目的スイッチはモジュール形式であるため、1 つのモジュールを別のモジュールに置き換えることができる。したがって、IL2モジュールは、異なるサイトカイン(例えば、IL15、IL18、IL21など)で置き換えることができます。これらの多目的タンパク質は、サイトカイン部分(例えば、IL2、IL15、IL18、IL21など)を通じて生存促進シグナルを提供しますが、第二のモジュール（例えば、RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19など）に結合する薬剤（例えば、抗体）の使用によって細胞を死滅させるために使用でき、それによって自殺遺伝子として作用し、毒性に直面しても、投与された T 細胞の選択的削除が可能になります。 2番目のモジュール(例えば、RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19など)も、形質導入の測定のためのマーカーとして使用し、形質導入された細胞の選択を可能にすることができる。
別の実施形態では、薬剤は阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えばPD1は、いくつかの実施形態において、SAR発現細胞が免疫エフェクター応答を行う能力を低下させることができる。別の実施形態では、薬剤は、PD1またはCTLA4を標的とするscFVであり得る。一実施形態では、薬剤は、第1のポリペプチド、例えば、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM（例えば、CEACAM-1、CEACAM-3および／またはCEACAM-5）、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4もしくはTGFRβなどの阻害分子、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）、ならびに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の41BB、CD27またはCD28）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のCD3ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である第2のポリペプチドを含む。一実施形態において、薬剤は、PD1またはそのフラグメントの第1のポリペプチド（例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部）、および本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインの第2のポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるCD28シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記載されるCD3ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む。
一実施形態では、本明細書に記載のＳＡＲ発現エフェクター細胞は、同じまたは異なる標的に対する異なる抗原結合ドメインを含み得る第２のＳＡＲをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のＳＡＲは、第１のＳＡＲと同じまたは異なる細胞タイプを標的とすることができる。
一実施形態では、本明細書に記載のＳＡＲ発現エフェクター細胞は、同じまたは異なる抗原結合ドメイン、場合により同じまたは異なる標的を有する第２のＳＡＲをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２のＳＡＲは、第１のＳＡＲと同じまたは異なる細胞タイプを標的とすることができる。 2 つの SAR は、同じバックボーンを持つ場合もあれば、異なるバックボーンを持つ場合もあります。例示的な実施形態では、２つのＳＡＲは、ＣＤ１６ ＳＡＲのバックボーンを有し得る。別の例示的な実施形態では、１つのＳＡＲはＳＩＲのバックボーンを有することができ、一方、第２のＳＡＲはＣＤ１６ ＳＡＲのバックボーンを有することができる。別の例示的な実施形態では、１つのＳＡＲはＡｂ－ＴＣＲのバックボーンを有することができ、一方、第２のＳＡＲはＣＤ１６ ＳＡＲのバックボーンを有することができる。異なる骨格上のいくつかの例示的なSARの核酸配列およびアミノ酸配列は、仮出願の表32および表34に示されている。一実施形態では、ＳＡＲは、疾患関連抗原と同じ疾患細胞型（例えば、癌）上に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とする第１のＳＡＲと、第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＳＡＲ（または第２世代ＣＡＲ）とを含む。ただし、共刺激シグナル伝達ドメインです。理論に束縛されることは望まないが、コスティミュレイトリーシグナル伝達ドメイン、例えば4-1BB、CD28、CD27、2B4またはOX40をSAR（例えば第2世代CAR）に配置することで、両方の標的が発現している細胞に対するSAR活性を調節することができる。一実施形態では、一実施形態では、SAR発現細胞は、i）本明細書に記載の標的抗原に結合する1つ以上の抗原結合ドメイン、および1つまたは2つのシグナル伝達鎖を含む第1の疾患関連抗原SAR（例えば、CD16 SAR）、およびii）異なる標的抗原（例えば、第1の標的抗原と同じ疾患関連（例えば、癌）細胞型に発現する抗原）を標的とする第2世代CARまたはTFPεを含み、そして抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含む。別の実施形態では、SAR発現細胞は、i）本明細書に記載の標的抗原と結合する抗原結合ドメイン、および1つまたは2つのシグナル伝達鎖を含む第1のSAR（例えば、CD16 SAR）と、ii）第一の標的抗原以外の抗原（例えば、第一の標的抗原と同じ癌細胞型に発現する抗原）を標的とし、第一の標的抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むCARを含み、そして抗原に特異的な抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびコスティミュレイトリーシグナリングドメインを含む。このCAR構築物はCD3zドメインを欠いている。さらに別の実施形態では、SAR発現細胞は、i）本明細書に記載の標的抗原に結合する1つ以上の抗原結合ドメイン、および1つまたは2つのシグナル伝達鎖を含む第1の疾患関連抗原SAR（例えば、CD16 SAR）、およびii）異なる標的抗原（例えば、第1の標的抗原と同じ疾患関連（例えば、癌）細胞型に発現する抗原）を標的とするCARを含み、そして共刺激ドメインはない、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
別の例示的な実施形態では、免疫細胞は２つのＳＡＲを発現し得、その一方は共刺激シグナルを提供し、他方は一次活性化シグナルを提供する。一実施形態では、１つのＳＡＲは４－１ＢＢベースのＳＡＲのバックボーンを有することができ、一方、第２のＳＡＲはＣＤ１６ベースのＳＡＲのバックボーンを有することができる。別の例示的な実施形態では、１つのＳＡＲはＣＤ２８ベースのＳＡＲのバックボーンを有し、第２のＳＡＲはＣＤ１６ベースのＳＡＲのバックボーンを有し得る。別の例示的な実施形態では、１つのＳＡＲはＯＸ４０ベースのＳＡＲのバックボーンを有することができ、一方、第２のＳＡＲはＣＤ１６ベースのＳＡＲのバックボーンを有することができる。別の例示的な実施形態では、１つのＳＡＲは２Ｂ４ ＳＡＲのバックボーンを有することができ、一方、第２のＳＡＲはＣＤ１６ベースのＳＡＲのバックボーンを有することができる。
SARは活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達することができるが、活性化ドメインを含むITAMを有さない可能性があることが理解されるべきである。このような SAR は、ITAM を含む活性化ドメインを持つタンパク質をリクルートする可能性があります。活性化ドメインを含むITAMを欠くSARの例としては、CD16のバックボーンを有するSARが挙げられるが、これに限定されない。
一実施形態では、CARは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、41BB、CD27、2B4、OX40、CD28、Dap10、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40またはそれらの組み合わせからの1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインなど）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、CD3ゼータシグナル伝達ドメインなどであるが、これらに限定されない）を含む。
一実施形態では、ＳＡＲ発現エフェクター細胞は、本明細書に記載のＳＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態では、阻害性ＣＡＲは、正常細胞には結合するが、癌細胞には結合しない抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）のいずれか１つの細胞内ドメインであり得る。 ）、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4またはTGFRベータ。
特定の実施形態では、第1のSAR分子（例えば、CD16 SAR、NKp30 SAR、NKp44 SAR、NKp46 SARまたはDAP10 SARなど）の抗原結合ドメイン から構成される の抗原結合ドメインはscFvを構成し、第2のSAR分子（例えば、CD16 SAR、NKp30 SAR、NKp44 SAR、NKp46 SARまたはDAP10 SARなど）の抗原結合ドメインはscFvを構成しない。例えば、第１のＳＡＲ分子の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、第２のＳＡＲ分子の抗原結合ドメインはラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含むＳＡＲ、およびＰＤ１細胞外ドメインまたは断片を含むＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供する。その。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメインを含む阻害分子をさらに含む。膜貫通ドメイン、例えばKIR膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えばITIMドメイン、例えばinhKIR ITIMドメイン。
本開示はまた、ＳＡＲ分子、ＳＡＲ分子を発現する細胞、またはＳＡＲ分子をコードする核酸を含む細胞を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、対象は、本明細書に記載の障害を有し、例えば、対象は、本明細書に記載の標的抗原を発現する癌、感染症、アレルギー疾患、変性疾患、または自己免疫疾患を有する。さらに一実施形態では、対象は、本明細書に記載の障害のリスクが増加しており、例えば、対象は、本明細書に記載の標的抗原を発現する癌、感染症、アレルギー疾患、変性疾患、または自己免疫疾患のリスクが増加している。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は動物である。さらに別の実施形態では、対象は犬などの愛玩動物である。
一実施形態では、本開示は、疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または免疫エフェクター細胞を発現するように操作され得る幹細胞を提供することによって提供する。標的化Ｘ－ＳＩＲであって、Ｘは本明細書に記載の疾患関連抗原を表し、疾患の原因細胞または疾患関連細胞は前記Ｘ抗原を発現する。表４９は、異なる抗原のリストと、これらの抗原を標的とするＳＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を使用して予防、阻害または治療できる例示的な疾患を示す。
別の実施形態において、本開示は、癌を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、記載のＸ標的ＳＡＲ（またはＸ標的ＳＡＲ）を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を提供することによって提供する。ここで、癌細胞は抗原標的「X」を発現する。一実施形態では、Ｘは正常細胞と癌細胞の両方で発現されるが、正常細胞ではより低いレベルで発現される。一実施形態では、この方法は、Ｘを標的とするＳＡＲがＸを発現する癌細胞に結合して死滅させることを可能にするが、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％未満の親和性でＸに結合するＳＡＲを選択するステップをさらに含む。例えば、本明細書に記載のアッセイによって決定されるように、 Ｘを発現する正常細胞の５％以下が死滅する。例えば、本明細書に記載のＧｌｕｃ放出細胞毒性アッセイを使用して、例えば癌細胞を標的とするＸ標的ＳＡＲを同定することができる。一実施形態では、選択されたＳＡＲは、約１０ －４ Ｍ～１０ －８ Ｍ、より一般的には約１０ －５ Ｍ～１０ －７ Ｍ、典型的には約１０ －６ Ｍの結合親和性Ｋ Ｄ を有する抗原結合ドメインを有する。標的抗原の場合は 10 -7 M。一実施形態では、選択された抗原結合ドメインは、少なくとも２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、５０分の１、１００分の１、または１，０００分の１低い結合親和性を有する。参照抗体、例えば、本明細書に記載され、ＳＡＲの結合ドメインが由来する抗体。
は、本明細書に記載の二重特異性ＳＡＲ（またはＡｘＢ標的化ＳＡＲ）を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）をそれを必要とする対象に提供することによって癌を治療または予防する方法を提供し、ここで、 Ａおよび B は、SAR の標的となる 2 つの異なる抗原を表します。一実施形態では、抗原ＡはＣＤ１９であり、抗原ＢはＣＤ２２であり、疾患はＢ細胞リンパ腫または白血病である。一実施形態では、抗原ＡはＣＤ１９であり、抗原ＢはＣＤ２０であり、疾患はＢ細胞リンパ腫または白血病である。一実施形態では、抗原ＡはＣＤ１９であり、抗原ＢはＢＣＭＡであり、疾患はＢ細胞リンパ腫または白血病である。一実施形態では、抗原ＡはＣＤ１９であり、抗原ＢはＣＤ３８であり、疾患はＢ細胞リンパ腫または白血病である。一実施形態では、抗原ＡはＢＣＭＡであり、抗原ＢはＣＤ３８であり、疾患は形質細胞障害または原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）である。一実施形態では、抗原ＡはＢＣＭＡであり、抗原ＢはＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７であり、疾患は形質細胞障害または原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ）である。一実施形態では、抗原ＡはＣＤ１２３であり、抗原ＢはＭＰＬであり、疾患は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性障害または骨髄線維症である。一実施形態では、抗原ＡはＣＤ１２３であり、抗原ＢはＣＤ３３であり、疾患は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、または骨髄増殖性障害である。一実施形態では、抗原Ａおよび抗原Ｂの両方が血球上で発現される。一実施形態では、一方の抗原は、血液系細胞（例えば、正常Ｂ細胞またはリンパ腫細胞）上で優先的または排他的に発現され、他方の抗原は、非血液細胞（例えば、前立腺癌細胞）上で優先的または排他的に発現される。例示的な実施形態では、抗原ＡはＰＳＭＡであり、抗原ＢはＣＤ１９であり、疾患は前立腺癌である。このような構築物では、ＣＤ１９の標的化は、正常Ｂ細胞上で発現されるＣＤ１９の標的化によってＳＡＲ細胞に増殖シグナルを提供し、一方、ＰＳＭＡの標的化は前立腺癌細胞の死滅を誘導する。
別の実施形態では、本開示は、疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または免疫エフェクター細胞を発現するように操作され得る幹細胞を提供することによって提供する。 ＣＤ１９×Ｃ２０二重特異性ＳＡＲにおいて、疾患原因細胞または疾患関連細胞はＣＤ１９およびＣＤ２０を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫疾患である。一実施形態では、治療または予防される癌は、急性Ｂ細胞白血病、慢性Ｂ細胞白血病、またはＢ細胞リンパ腫である。
別の実施形態では、本開示は、疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または免疫エフェクター細胞を発現するように操作され得る幹細胞を提供することによって提供する。 ＣＤ１９×Ｃ２２二重特異性ＳＡＲにおいて、疾患原因細胞または疾患関連細胞はＣＤ１９およびＣＤ２２を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫疾患である。一実施形態では、治療または予防される癌は、急性Ｂ細胞白血病、慢性Ｂ細胞白血病、またはＢ細胞リンパ腫である。
別の実施形態では、本開示は、疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または免疫エフェクター細胞を発現するように操作され得る幹細胞を提供することによって提供する。 ＣＤ１９×Ｃ２２×ＣＤ２０三重特異性ＳＡＲにおいて、疾患原因細胞または疾患関連細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、およびＣＤ２０を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫疾患である。一実施形態では、治療または予防される癌は、急性Ｂ細胞白血病、慢性Ｂ細胞白血病、またはＢ細胞リンパ腫である。
別の実施形態では、本開示は、疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または免疫エフェクター細胞を発現するように操作され得る幹細胞を提供することによって提供する。 BCMAxCD38二重特異性SAR。疾患の原因となる細胞または疾患に関連する細胞はBCMAおよびCD38を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫疾患である。一実施形態では、治療または予防される癌は、形質細胞障害（例えば、形質細胞白血病、骨髄腫）である。
は、ＣＤ５を発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、疾患を治療または予防する方法を提供する。 -SAR、疾患の原因となる細胞または疾患に関連する細胞がCD5を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫疾患である。一実施形態では、治療または予防される癌は、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫である。一実施形態では、治療または予防される免疫障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、糖尿病、移植片対宿主病、または自己免疫性甲状腺炎である。
は、ＴＣＲＢ１を発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、疾患を治療または予防する方法を提供する。 -SARにおいて、疾患の原因となる細胞または疾患に関連する細胞がTCRB1（T細胞受容体ベータ1鎖）を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫疾患である。一実施形態では、治療または予防される癌は、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫である。一実施形態では、治療または予防される免疫障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、糖尿病、移植片対宿主病、または自己免疫性甲状腺炎である。
は、ＴＣＲＢ２を発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、疾患を治療または予防する方法を提供する。 -SIRでは、疾患の原因となる細胞または疾患に関連する細胞がTCRB2(T細胞受容体ベータ2 SAR)を発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫障害である。一実施形態では、治療または予防される癌は、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫である。一実施形態では、治療または予防される免疫障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、糖尿病、移植片対宿主病、または自己免疫性甲状腺炎である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、またはＴを発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、疾患を治療または予防する方法を提供する。細胞受容体ガンマデルタ-SIRであり、疾患原因細胞または疾患関連細胞はT細胞受容体ガンマデルタを発現する。一実施形態では、治療または予防される疾患は、癌または免疫障害である。一実施形態では、治療または予防される癌は、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫である。一実施形態では、治療または予防される免疫障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、糖尿病、移植片対宿主病、または自己免疫性甲状腺炎である。
別の実施形態では、本開示は、疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、免疫エフェクター細胞（例えば、 Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または免疫エフェクター細胞を発現するように操作され得る幹細胞を提供することによって提供する。 SAR エンコード CD4-DC-SIGN。一実施形態では、治療または予防される疾患はＨＩＶ１／ＡＩＤＳである。
別の実施形態では、本開示は、自己免疫疾患を治療または予防する方法を、それを必要とする対象に、発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または幹細胞を提供することによって提供する方法を提供する。自己抗原またはその断片をコードするSAR。一実施形態では、自己免疫疾患は、糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、またはクローン病である。一態様では、疾患は尋常性天疱瘡であり、ＳＡＲの抗原結合ドメインはデスモグレイン３の細胞外ドメイン（Ｄｓｇ３）を含む。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または免疫エフェクターを生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。天然に存在する受容体の細胞外ドメイン（例えば、CD16、CD64、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2Dなど）またはその断片を1つまたは複数の薬剤（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメインフラグメント、自律的抗原結合ドメイン、二重特異性エンゲージャー、二重特異性T細胞エンゲージャーまたはBiTE、二重特異性キラーエンゲージャーまたはBiKE、三重特異性エンゲージャー、三重特異性T細胞これらは、 ＳＡＲを含む天然に存在する受容体に結合し、疾患関連細胞上に発現される抗原にも結合する。一実施形態では、ＳＡＲは、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６またはＣＤ６９）の細胞外ドメインを含む。 など）およびＳＡＲ発現細胞は、Ｆｃ受容体に結合する１つまたは複数の薬剤（例えば、抗体、抗体断片または非免疫グロブリン抗原結合ドメイン）とともに投与される。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、天然に存在する受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＤまたはＮＫＧ２Ｃ）の細胞外ドメインを含み、ＳＡＲ発現細胞は、１つまたは複数の薬剤（例えば、 ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥ、ＢｉＴＥ）とともに投与される。天然に存在する受容体の細胞外ドメインに結合します。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＮＫｐ４６の細胞外ドメインを含み、ＣＤ１９発現細胞を標的とするように、ＮＫｐ４６およびＣＤ１９に結合する二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）または三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）とともに投与される。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＮＫｐ４６の細胞外ドメインを含み、メソテリン発現細胞を標的とするために、ＮＫｐ４６およびメソテリンに結合する二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）とともに投与される。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。
一態様では、薬剤（例えば、抗体、ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥまたはその断片）は、対象へのＳＡＲ細胞の投与前に、エクスビボでＳＡＲ発現細胞に結合される。一態様では、薬剤（例えば、抗体、ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥまたはそれらの断片）は、インビボで投与される。一態様では、薬剤（例えば、抗体、ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥまたはその断片）は、ＳＡＲ発現細胞の注入前、注入と同時に、または注入後に投与される。一態様では、薬剤の単回用量が投与されるが、他の態様では、薬剤（例えば、抗体、BiKE、TRiKEまたはその断片）の複数回用量が投与される。一態様では、複数のタイプの薬剤が投与される。一態様では、薬剤（例えば、抗体、ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥ、またはそれらの断片）は、単一の抗原を標的とする。一態様では、１つまたは複数の薬剤（例えば、抗体、ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥまたはその断片）は、複数の抗原を標的とする。例示的な実施形態では、ＳＡＲはＮＫｐ４４の細胞外ドメインを含み、ＳＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９発現細胞を標的とするようにＮＫｐ４６およびＣＤ１９に結合する二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）または三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）とともに投与される。例示的な実施形態では、ＳＡＲはＮＫｐ４４の細胞外ドメインを含み、ＳＡＲ発現細胞は、ＮＫｐ４６に結合する三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）およびＳＡＲ上の共刺激受容体（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）とともに投与される。 －ＣＤ１９発現腫瘍細胞を標的として死滅させるために、腫瘍細胞上でエフェクター細胞およびＣＤ１９を発現する。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、 ＮＫｐ４６およびＣＤ１６の両方の細胞外ドメインを含み、ＳＡＲ発現細胞は、有効性が増大してメソテリン発現細胞を標的とするように、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６およびメソテリンに結合する三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）とともに投与される。例示的なＢｉＫＥおよびＴＲｉＫＥは、Ｇａｕｔｈｉｅｒ Ｌら、ＣＥＬＬ、（２０１９）、１１７、１７０１に記載されている。他のＢｉＫＥおよびＴＲｉＫＥは当技術分野で知られており、本開示の代替実施形態で使用することができる。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または免疫エフェクターを生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。 ＳＡＲのＣＤ１６ドメインに結合する抗体または抗体フラグメントおよび疾患関連細胞上に発現される抗原とともに、ＣＤ１６またはその欠失もしくは点変異フラグメントをコードするユニバーサルＳＡＲを発現するように操作された細胞。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）または免疫エフェクター細胞を生じさせることができる幹細胞を提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。免疫グロブリン結合受容体（例えば、CD16、CD64など）またはその欠失または点変異断片をコードするユニバーサルSARを発現するように操作されている。 SARを発現する免疫エフェクター細胞は、SAR受容体の免疫グロブリン結合ドメインおよび疾患関連細胞上に発現する1つまたは複数の抗原に結合する1つまたは複数の抗体または抗体断片とともに患者に投与される。一態様では、抗体は、対象へのＳＡＲ細胞の投与前に、エクスビボでＳＡＲ発現細胞に結合される。一態様では、抗体はインビボで投与される。一態様では、抗体または抗体フラグメントは、ＳＡＲ発現細胞の注入前、注入と同時、または注入後に投与される。一態様では、複数回用量の抗体または抗体断片が投与される。一態様では、複数のタイプの抗体または抗体断片が投与される。一態様では、抗体または抗体断片は単一の抗原を標的とする。一態様では、抗体または抗体断片は複数の抗原を標的とする。例示的な抗体は、リツキシマブ、ハーセプチン、エルビトラックスなどである。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞である。
それを必要とする対象に免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）または免疫エフェクター細胞を生じさせることができる幹細胞を提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。本明細書に記載のシグナル伝達鎖に結合した免疫グロブリン結合受容体またはその欠失もしくは点変異断片（例えば、配列番号３９１４～３９５８）をコードするユニバーサルＳＡＲと、抗原結合ドメイン（例えば、 scFv、vHH、vL、vH、または非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、BiTE、BiKE、TRiKE）。 SARを発現する免疫エフェクター細胞は、SAR受容体の免疫グロブリン結合ドメインに結合する1つまたは複数の抗原結合ドメイン、および疾患関連細胞上に発現する1つまたは複数の抗原とともに患者に投与される。一態様では、抗原結合ドメインは、対象へのＳＡＲ細胞の投与前に、エクスビボでＳＡＲ発現細胞に結合される。一態様では、抗原結合ドメインはインビボで投与される。一態様では、抗体または抗体フラグメントは、ＳＡＲ発現細胞の注入前、注入と同時、または注入後に投与される。一態様では、複数回用量の抗原結合ドメインが投与される。一態様では、複数のタイプの抗原結合ドメインが投与される。一態様では、抗原結合ドメインは単一の抗原を標的とする。一態様では、抗原結合ドメインは複数の抗原を標的とする。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。
例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および／またはマクロファージなど）または幹細胞を提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。免疫グロブリン受容体またはその欠失もしくは点変異断片をコードするユニバーサルSARを、上記の受容体に結合する1つまたは複数の抗体または抗体断片とともに発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる。疾患関連細胞上でより多くの抗原が発現します。
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ、ＮＫ細胞および／またはマクロファージ）または幹細胞を提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。 T細胞受容体定常鎖に結合したCD16またはその欠失もしくは点変異体（例えばF158V変異体）フラグメントをコードするユニバーサルSARと、抗原結合ドメイン（例えば、 、ｓｃＦｖ、ｖＨＨ、ｖＬ、ｖＨ、または非免疫グロブリン抗原結合ドメイン）がＴ細胞受容体定常鎖に結合している。 ＳＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＳＡＲのＣＤ１６ドメインに結合する１つ以上の抗体または抗体フラグメントおよび疾患関連細胞上に発現する１つ以上の抗原とともに患者に投与される。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。一実施形態では、抗体はインビボで投与される。一実施形態では、抗体はエクスビボでＣＤ１６－ＳＡＲ細胞に結合する。一実施形態では、抗体の複数回の注入が投与される。
例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）または免疫エフェクターを生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。 ＳＡＲのＣＤ１６ドメインに結合する１つ以上の抗体または抗体フラグメントとともに、ＣＤ１６またはその欠失もしくは点突然変異フラグメント（例えば、 Ｆ１５８Ｖ突然変異体）をコードするユニバーサルＳＡＲを発現するように操作された細胞、および１つ以上の疾患関連細胞上に発現する抗原。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。
、ＮＫＧ２Ｄ受容体をコードするＳＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。またはその欠失もしくは点変異断片（例えば、配列番号３４０７および３４３５）。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ変異体は、ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ－Ｇ４Ｓｘ３－ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ（配列番号３４０７）である。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ変異体は、ＮＫＧ２Ｄ－ＹＡ－Ｇ４Ｓｘ３－ＮＫＧ２Ｄ－ＹＡ（配列番号３４３５）である。一実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｖＨＨ、ＦＨＶＨなど）を含むタンパク質とともに、ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ－Ｇ４Ｓｘ３－ＮＫＧ２Ｄ－ＡＦ（配列番号３４０７）を発現するＳＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を対象に投与する。 ULBP2Rと融合。 ULBP2Rと融合したBCMA-93-FHVHを含む例示的なタンパク質は、配列番号5431に示される。別の実施形態では、NKG2D-YA-G4Sx3-NKG2D-YA（配列番号5）を発現するSARを発現する免疫エフェクター細胞が対象に投与される。 : 3435)、 ULBP2-S3と融合した抗原結合ドメイン(例えば、scFv、vHH、FHVHなど)を含むタンパク質を含む。 ULBPP2-S3と融合したBCMA-93-FHVHを含む例示的なタンパク質は、配列番号5432に示される。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、または形質細胞、B細胞、または細胞である。 T細胞。
は、ＣＤ１９を発現するように操作された免疫エフェクター細胞を生じさせることができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、疾患を治療または予防する方法を提供する。 -ターゲットを絞った SAR。一態様では、疾患は免疫疾患またはアレルギー疾患である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）をそれを必要とする対象に提供することによって疾患を治療または予防する方法を提供する。一態様では、疾患は免疫疾患またはアレルギー疾患である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）をそれを必要とする対象に提供することによって疾患を治療または予防する方法を提供する。一態様では、疾患は免疫疾患またはアレルギー疾患である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または免疫エフェクターを生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。疾患関連細胞上で発現される抗原に結合する、ＦＩＴＣ標識抗体、抗体フラグメント、抗体フラグメント、受容体、リガンド、または非免疫グロブリン足場とともに、ＦＩＴＣ－ＳＡＲを発現するように操作された細胞。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、形質細胞、B細胞、またはT細胞である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または免疫エフェクターを生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。疾患関連細胞上で発現される抗原に結合するビオチン標識抗体、抗体断片、抗体断片、受容体、リガンド、または非免疫グロブリン足場とともにアビジン-SARを発現するように操作された細胞。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、または形質細胞である。
例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）または免疫エフェクターを生じさせることができる幹細胞を、それを必要とする対象に提供することによって、癌、感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療または予防する方法を提供する。疾患関連細胞上で発現される抗原に結合する、Streptag含有抗体、抗体フラグメント、受容体、リガンド、または非免疫グロブリン足場とともにStreptag-SARを発現するように操作された細胞。一態様では、疾患関連細胞は、癌細胞、感染細胞、または形質細胞である。
開示は、その抗原結合ドメインが抗体またはIgEに結合する抗体フラグメント。一態様では、疾患は免疫疾患またはアレルギー疾患である。
、ＰＤ１－ＳＡＲ（すなわち、抗原結合ドメインとしてＰＤ１の細胞外ドメインを含むＳＡＲ）を用いた対象のインビボ治療に関する。 PD1-SAR は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用される場合があります。あるいは、PD1-SAR は、他の SAR、CAR、免疫原性物質、標準的な癌治療法、または他の抗体と組み合わせて使用することもできます。一実施形態では、対象は、本明細書に記載のＰＤ１－ＳＡＲおよびＸ－ＳＡＲで治療される。別の実施形態では、ＰＤ１－ＳＡＲは、別のＳＡＲまたはＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＳＡＲまたはＣＡＲ、およびキナーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載のキナーゼ阻害剤と併用される。
、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように、Ｘ－ＳＡＲおよびＰＤ１－ＣＡＲまたはＣＴＬ４－ＣＡＲを使用して対象をインビボで治療することに関する。一実施形態では、対象は、本明細書に記載のＰＤ１－ＣＡＲまたはＣＴＬＡ４－ＣＡＲおよびＸ－ＳＡＲで治療される。
免疫系の特定の細胞は、特定の標的細胞に対して細胞傷害活性を示します。細胞傷害性 T リンパ球は、MHC クラス I 分子に結合した抗原由来ペプチドを特異的に認識できる T 細胞受容体 (TcR) を発現します。対照的に、ナチュラルキラー (NK) 細胞は MHC 制限を受けておらず、殺傷効果を発揮するために MHC 分子による抗原提示を必要としません。これらは、ペプチドをロードした MHC の非存在下でストレスを受けた細胞を認識し、MHC を欠いている細胞を殺すことができます。したがって、NK 細胞は自然免疫において重要な役割を果たしています。これがなければ、これらの「非 MHC」細胞は他の免疫細胞によって検出され破壊されないからです。
NK 細胞 (「大型顆粒リンパ球」とも定義される) は、共通リンパ前駆細胞 (B リンパ球および T リンパ球も生じます) から分化した細胞系統を表します。 T細胞とは異なり、NK細胞は原形質膜にCD3を天然には含みません。重要なのは、NK細胞はTCRを発現せず、通常、他の抗原特異的な細胞表面受容体も欠如しています（TCRおよびCD3と同様に、免疫グロブリンB細胞受容体も発現せず、代わりに通常はCD16およびCD56を発現します）。したがって、NK細胞は、細胞は CD3-、CD56+ 表現型によって区別されます。NK 細胞の細胞傷害活性は感作を必要としませんが、IL-2 を含むさまざまなサイトカインによる活性化によって増強されます。NK 細胞は一般に、抗原に必要な適切なまたは完全なシグナル伝達経路を欠いていると考えられています。したがって、抗原受容体依存性のシグナル伝達、活性化、および拡張はできないと考えられています。
癌を治療するための T 細胞ベースの治療法が多数開発されています。 ＴＣＲに基づく細胞療法アプローチはいくつかの研究で有望であることが示されているが、ＭＨＣ制限という欠点がある。すなわち、使用されるＴＣＲは患者の免疫タイプに適合しなければならない。 TCR とは異なり、CAR は受信者と MHC を一致させる必要がありません。しかし、これまでのところ、CARの適切な標的として使用できる癌特異的表面抗原はほとんど同定されておらず、したがって癌治療におけるCARの使用は現時点では限られている。 TCR または CAR による T 細胞の修飾を伴うすべての養子細胞療法アプローチでは、患者または組織タイプが一致するドナーからの T 細胞の単離と修飾が必要であり、製造に必要な時間とコストが増加します。手順の。 ＡＣＴの上記制限を克服しようとする代替方法は、例えばＷＯ９８／４９２６８に記載されているように、細胞傷害性ＮＫ細胞を利用する。しかし、NK細胞はCD3ε、γ、δ鎖の発現を欠き、天然の状態ではTCRを発現しません。 CD3ε、γ、δ、および ζ 鎖を異所的に発現するように操作された NK92 細胞株は、TCR 発現をサポートすることが示されています。ただし、この方法は面倒です。
本開示は、ユニバーサルＴＣＲ（またはｕＴＣＲ－ＳＡＲ）と呼ばれる新規なＴＣＲを提供する。一実施形態では、uTCR-SARは発現に関してCD3鎖に依存せず、任意の細胞で発現することができる。一実施形態では、ｕＴＣＲ－ＳＡＲは、２つの鎖を有するという点で生理学的ＴＣＲに似ている。一実施形態では、ｕＴＣＲの抗原結合ドメインは、ＴＣＲに由来する可変ドメイン（Ｖａ／ＶαおよびＶｂ／ＶβまたはＶｇ／ＶγおよびＶｄ／Ｖδ）を含む。一実施形態では、uTCRは完全なTCR定常鎖を欠いている。一実施形態では、ｕＴＣＲの一方または両方の鎖は、ＴＣＲ定常鎖の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを欠いている。一実施形態では、ｕＴＣＲの一方または両方の鎖は、ＴＣＲ定常鎖のヒンジ、膜貫通および／またはサイトゾルドメインを欠いている。
本開示は、NK細胞に基づく癌特異的キラー細胞を普遍的に使用できるように提供することを目的としている。これは、現在T細胞に必要とされているように、細胞が治療対象の免疫型に適合している必要がないことを意味する。に基づいた治療法ですが、必要に応じて対象者の特定の免疫タイプやがんタイプに合わせて調整することもできます。したがって、ユニバーサルキラー細胞は個別化医療に使用できる可能性があります。
一実施形態では、対象には、本開示のＳＡＲを発現する異なる細胞が投与される。一実施形態では、ＳＡＲは、 ＳＡＲの複数の異なる系統（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞など）に分化する幹細胞（例えば、造血幹細胞またはｉＰＳＣ）において発現される。発現している細胞。天然の T 細胞受容体およびいくつかの次世代 CAR プラットフォーム (たとえば、SIR、Ab-TCR、HIT、または TFPなど) は、T 細胞でのみ機能的に発現できます。本開示のuTCR-SARの利点は、それが任意の細胞型で発現できることである。一実施形態では、ＳＡＲ （例えば、ｕＴＣＲ－ＳＡＲ）は、幹細胞（例えば、造血幹細胞またはｉＰＳＣ）内で発現され、幹細胞（例えば、造血幹細胞またはｉＰＳＣ）は、エクスビボで複数の異なる系統（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球）に分化する、樹状細胞など）のuTCR-SAR発現細胞。次いで、対象に、ＳＡＲ（例えば、ｕＴＣＲ－ＳＡＲ）発現細胞の集団を投与する。代替の実施形態では、ＳＡＲ（例えば、ｕＴＣＲ－ＳＡＲ）は、造血幹細胞において発現され、次いで、対象に投与される。 SAR発現造血幹細胞は、インビボで複数系統のSAR発現免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞など)に分化する。
本開示はまた、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰαβおよびＴＦＰγδなどの次世代キメラ受容体が、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞および好中球において乏しいまたは無視できる程度の発現を示すことを提供する。本開示は、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ９２およびその誘導体）、単球／マクロファージ、単球細胞株、および好中球におけるＳＩＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰαβおよびＴＦＰγδの発現方法を提供する。この方法には、NK 細胞、単球/マクロファージ、樹状細胞、および好中球における CD3 複合体の 1 つ以上の鎖の異所性発現が含まれます。代替の実施形態では、この方法は、分化してＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞と好中球。一実施形態では、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、好中球および幹細胞において異所的に発現され得るＣＤ３複合体の鎖には、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３εが含まれる。 SIR、cTCR、Ab-TCR、TFPαβの機能的発現を促進するために、NK細胞、単球/マクロファージ、樹状細胞、好中球および幹細胞において異所的に発現させることができる例示的なCD3ε、CD3γ、CD3δおよびCD3ζ鎖の配列番号。およびＴＦＰγδは仮出願の表１８に記載されている。一実施形態では、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖は、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰαβおよびＴＦＰγδの機能的発現を促進するために、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、好中球および幹細胞において異所的に発現される。代替の実施形態では、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、およびＣＤ３δ鎖は、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、および好中球細胞において異所的に発現され、ＳＩＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰαβおよびＴＦＰγδの機能的発現を促進する。一実施形態では、ＣＤ３複合体の１つ以上の鎖が単一のベクターを使用して発現される。例示的なベクターは、配列番号１３３１および１３３２によって表される。別の実施形態では、ＣＤ３複合体の１つ以上の鎖は、２つ以上のベクターを使用して発現される。
いくつかの態様では、ＳＡＲ発現細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、幹細胞またはｉＰＳＣなど）は、異なるＣＡＲ修飾細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、 g-NK、CIK細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、幹細胞、iPSCなど）。特に明記しない限り、養子細胞療法製品の製造および投与に関する当該技術分野で知られている技術は、SARをコードするベクターの生成、SARをコードするベクターによる遺伝子改変のための異なる細胞型の採取、単離および培養に使用することができる。 SAR 発現細胞の増殖、保存、輸送、解凍、効力試験、無菌試験および投与に使用します。
ＳＡＲは、エクスビボおよび／またはインビボで標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血細胞など）に導入することができる。 SAR発現エフェクター細胞は、対象への投与前にエクスビボで増殖させることができる。一実施形態では、ＳＡＲ発現エフェクター細胞は、対象への投与前に２～３０日間エクスビボで増殖させることができる。本開示は、SAR発現細胞が無増殖プロトコールを使用して製造できることを規定する。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、１日または２日の期間にわたって製造される。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１５日、２１日または３０日未満の期間にわたって製造される。 SAR を発現するエフェクター細胞は、保存のために凍結保存し、投与前に解凍することができます。
本開示の別の態様では、本開示によるＳＡＲまたはＳＡＲを含む単離細胞もしくは細胞集団と、場合により薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本開示の遺伝子改変細胞または医薬組成物は、非経口投与を含む任意の都合のよい経路によって投与することができる。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、膀胱内、皮内、局所または皮下投与が含まれる。組成物は、１つ以上の投与単位の形態をとることができる。
ＳＡＲ発現免疫細胞は、細胞の絶対数で個体に投与することができ、例えば、前記個体は、約１０００細胞／注射から最大約１００億細胞／注射、例えば約、少なくとも約、または約１００億細胞／注射で投与することができる。注入ごとに最大約 lx l0 8 、 lx l0 7 、 5 x l0 7 、 lx l0 6 、 5 x l0 6 、 lx l0 5 、 5 x l0 5 、 lx l0 4 、 (など) の SAR 細胞、または任意の 2 つの数値の間の任意の範囲 (エンドポイントも含む)。他の実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、細胞の相対数によってそのような個体に投与することができ、例えば、前記個体には、個体１キログラム当たり約１０００個の細胞から最大約１００億個の細胞を、例えば少なくとも約１０００個の細胞を投与することができる。 1kgあたり約、または最大約1x l0 8 、1x l0 7 、5 x l0 7 、 1x l0 6 、5 x l0 6 、1x l0 5 、5 x l0 5 、1x l0 4個（など）の細胞個々の数値、または任意の 2 つの数値間の任意の範囲 (終点も含む)。 ＳＡＲ細胞はまた、前記患者におけるＳＡＲ細胞の数と腫瘍のサイズとの間のおおよその比率に従って、そのような患者に投与することもできる。腫瘍のサイズは、Ｘ線、超音波画像化などの従来の画像化方法によって決定または推定することができる。他の実施形態では、総線量は、体表面積ｍ ２によって計算することができ、 １ｍ ２当たり１×１０ ８ 、１×１０ ７ 、５×１０ ７ 、１×１０ ６を含む。平均的な人の身長は 1.6 ～ 1.8 平方メートルです。
SAR発現免疫細胞(例えば、NK92細胞株)は、投与前に放射線照射することができる。 SAR発現免疫細胞は、対象に投与する前に、それらを複製不能にする薬剤(例えば、マイトマイシン-C)で処理することができる。
SAR発現細胞、および場合により他の抗腫瘍剤は、患者に1回投与することができ、または複数回、例えば1、2、3、4、5、6、7、 8 、9日に1回、または複数回投与することができる。 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23時間ごと、または1、2、3、4、5、6、または7日に1回、あるいは1日ごとに1回治療期間中の 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 週間以上、またはエンドポイントを含む任意の 2 つの数値の間の任意の範囲。
ＳＡＲ発現細胞は、静脈内、腹腔内、胸膜内、くも膜下腔内、脳室内、皮内、皮下、腫瘍内、病変内、肝内経路などの当技術分野で公知の異なる経路によって投与することができる。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、化学療法、放射線療法、生物学的療法、抗体療法またはホルモン治療などの従来の療法を含む他の療法と組み合わせて投与される。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、対象がリンパ球除去化学療法を受けた後に対象に投与される。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、対象がリンパ球除去化学療法と骨髄除去化学療法の両方を受けた後に対象に投与される。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、対象がエトポシドを含む化学療法を受けた後に対象に投与される。一実施形態では、ＳＡＲ発現細胞は、以下のうちの１つ以上から選択される薬剤とともに投与される。プロテインホスファターゼ阻害剤。キナーゼ阻害剤（例えば、ｓｒｃキナーゼ阻害剤）； Lckキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブ）。 ＳＡＲ発現エフェクター細胞上に発現される１つ以上の抗原および標的細胞上に発現される１つ以上の抗原（例えば、抗体、抗体フラグメント、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ、ＴＲｉＫＥなど）に結合する薬剤；サイトカイン（例えば、IL2、IL15など）。免疫阻害分子の阻害剤（例えば、ＰＤ１またはＰＤＬ１阻害剤）； TREG細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤（例えば、ラパマイシン）。 ＳＡＲ修飾細胞（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１など）の増殖および／または存続を増加させる薬剤；ケモカイン。 SARの発現を増加させる薬剤。 SARの発現または活性の調節を可能にする薬剤; SAR修飾細胞の生存および/または持続の制御を可能にする薬剤。 SAR修飾細胞の副作用を制御する薬剤（例えば、トシリズマブ、アナキンラ、ステロイド、ダサチニブ、イブルチニブなど）。 Brd4阻害剤。治療薬または予防薬を疾患の部位に送達する薬剤。 ＳＡＲが向けられる標的抗原の発現を増加させる薬剤（例えば、ＢＣＭＡ標的ＳＡＲとともに使用される場合のγセクレターゼ阻害剤）。 ＳＡＲと同時発現される多目的スイッチに結合する薬剤（例えば、リツキシマブ、ハーセプチンまたは）；同種異系SAR細胞を免疫攻撃から保護する薬剤（例えば、CD52抗体）およびアデノシンA2a受容体アンタゴニスト。
一実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＳＡＲ分子を発現する細胞を、ＳＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と組み合わせて投与することを含み、ここで薬剤はサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－ ２ 、 7、IL-15、IL-21、またはそれらの組み合わせ。サイトカインは、例えば、ＳＡＲ発現細胞の投与と同時または直後に送達することができる。あるいは、サイトカインは、ＳＡＲ発現細胞の投与後、例えば、ＳＡＲ発現細胞に対する対象の応答を評価した後、長期間後に送達することができる。一実施形態では、サイトカインは、対象に投与と同時に（例えば、同日に投与）、または投与直後に（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日投与）、対象に投与される。他の実施形態では、サイトカインは、長期間（例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、または６週間）後に対象に投与される。細胞または細胞集団の投与後、または細胞に対する対象の反応の評価後、数週間、８週間、１０週間、またはそれ以上）。
［０００１］本開示は、Ｓｒｃ阻害剤（例えば、Ｌｃｋ阻害剤、例えば、ダサチニブ、ポナチニブなど）が本開示のＳＡＲの活性を制御できることを規定する。一実施形態では、ダサチニブは、ＣＤ３ｚ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄなどの膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含むＳＡＲの活性を制御することができる。一実施形態では、本開示は、本開示の新規なＳＡＲ発現細胞の副作用を治療するのは、Ｓｒｃ阻害剤（例えば、Ｌｃｋ阻害剤、例えば、ダサチニブ）である。一実施形態では、ダサチニブは、ＳＡＲ発現細胞の活性を制御または停止させるために、ＳＡＲ発現細胞の投与後に患者に投与される。一実施形態では、ダサチニブは、ＳＡＲ発現細胞によって引き起こされるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を予防および／または治療するために対象に投与される。一実施形態では、ダサチニブは、ＳＡＲ発現細胞によって引き起こされる神経合併症を予防および／または治療するために対象に投与される。一実施形態では、ダサチニブは、ＳＡＲ発現細胞によって引き起こされるＣＲＳおよび神経合併症を予防および／または治療するために、他の薬剤（例えば、ステロイド、トシリズマブ、アナキンラなど）と組み合わせて使用される。
［０００２］一実施形態では、ダサチニブは、少なくとも１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、７０ｍｇ／日、９０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１４０ｍｇ／日、１８０ｍｇの用量で経口投与される。 /日、210mg/日、250mg/日または280mg/日。 一実施形態では、本開示は、本開示の新規なＳＡＲ発現細胞の副作用を治療するために投与できる薬剤がポナチニブであることを提供する。一実施形態では、ポナチニブは、ＣＡＲ発現細胞の活性を制御または停止させるために、ＣＡＲ発現細胞の投与後に患者に投与される。一実施形態では、ポナチニブは、少なくとも１５ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、４５ｍｇ／日、６０ｍｇ／日の用量で経口投与される。一実施形態では、ポナチニブは、ＳＡＲ発現細胞によって引き起こされるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を予防および／または治療するために対象に投与される。一実施形態では、ポナチニブは、ＳＡＲ発現細胞によって引き起こされる神経合併症を予防および／または治療するために対象に投与される。一実施形態では、ポナチニブは、ＳＡＲ発現細胞によって引き起こされるＣＲＳおよび神経合併症を予防および／または治療するために、他の薬剤（例えば、ステロイド、トシリズマブ、アナキンラなど）と組み合わせて使用される。
［０００３］一実施形態では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤を使用して、新規シグナル伝達ドメインを有する本開示のＳＡＲ発現細胞の持続期間を延長できることを提供する。一実施形態では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤を使用して、新規シグナル伝達ドメインを有する本開示のＳＡＲ発現細胞の持続期間を延長することができることを提供し、ここで、ＳＡＲは、ＣＤ３ｚ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＮＫｐ３０の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ゾルドメインを含む。 、NKp44、NKp46、および/またはNKG2Dなど。 一実施形態では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤を使用して、新規シグナル伝達ドメインによる本開示のＳＡＲ発現細胞の消耗を遅延／逆転させることができることを提供し、ここで、ＳＡＲは、ＣＤ３ｚ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０ 、一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤はＬｃｋ阻害剤である。一実施形態では、Ｌｃｋ阻害剤はダサチニブまたはポナチニブである。一実施形態では、ダサチニブは、本開示のＳＡＲ発現細胞の枯渇を予防／遅延させるために使用することができる。一実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ３ｚ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、 ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、および／またはＮＫＧ２Ｄなどの膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、ダサチニブを使用して、ＳＡＲ発現細胞の消耗を逆転させることができる。開示。一実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ３ｚ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、および／またはＮＫＧ２Ｄなどの膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。一実施形態では、ダサチニブは、ＳＡＲ発現細胞を投与された対象に投与される。断続的に。一実施形態では、対象は複数サイクルのチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブ）を受ける。一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブまたはポナチニブ）による治療は、本開示のＳＡＲ発現細胞のアポトーシスを防止する。一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブまたはポナチニブ）は、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、およびＬＡＧ－３からなる群から選択される少なくとも１つのＴまたはＮＫ細胞枯渇マーカーの発現を減少させる。一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブまたはポナチニブ）による治療は、ＳＡＲ発現細胞上のＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７の発現を増加させる。一実施形態では、治療は、ＳＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の少なくとも部分的な機能を回復するのに十分な時間継続される。一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ダサチニブまたはポナチニブ）は、ＳＡＲ発現細胞を継続的に投与された対象に投与される。実施形態では、ダサチニブは、約１０ｍｇ／日～２４０ｍｇ／日（例えば、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７０ｍｇ／日、８０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日）の用量で投与される。 1日、110mg/日、120mg/日、140mg/日、180mg/日、210mg/日、240mg/日または300mg/日）。
［０００４］一実施形態では、ポナチニブを使用して、本開示のＳＡＲ発現細胞の持続期間を延長することができる。一実施形態では、ポナチニブを使用して、本開示のＳＡＲ発現細胞の枯渇を遅らせることができる。一実施形態では、ポナチニブは、ＳＡＲ発現細胞を断続的に投与された対象に投与される。一実施形態では、ポナチニブは、ＳＡＲ発現細胞を継続的に投与された対象に投与される。
開示の組成物は、液体、例えば、溶液、エマルション、または懸濁液の形態であってもよい。この液体は、注射、注入（例えば、ＩＶ注入）または皮下による送達に有用であり得る。本開示の液体組成物は、溶液、懸濁液、または他の同様の形態であっても、以下の１つまたは複数を含むこともできる：水、食塩水、典型的には生理食塩水、リンガー液、等張性塩化ナトリウム、固定油などの滅菌希釈剤。合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、またはその他の溶媒など。ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤。張度を調整するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはブドウ糖。組成物は、ガラス、プラスチック、または他の材料で作られたアンプル、使い捨て注射器、または複数回用量のバイアルに封入することができる。
本開示の医薬組成物の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な用量範囲を特定するのに役立つように、インビトロまたはインビボアッセイを任意で使用することができます。組成物に使用される正確な用量は、投与経路、疾患または障害の重症度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
開示の組成物は、適切な用量が得られるように、有効量の本開示の結合分子を含む。化合物の正確な用量は、特定の製剤、適用方法、およびその特定の部位、宿主および治療される疾患に応じて変化するであろう。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬剤の組み合わせ、反応感受性、疾患の重症度などの他の要因も考慮されるものとします。投与は、最大耐用量の範囲内で連続的または定期的に行うことができる。
典型的には、この量は、組成物の重量に基づいて本開示の結合分子の少なくとも約０．０１％である。
本開示の典型的な組成物は、非経口用量単位が約０．０１重量％～約２重量％の本開示の結合分子を含むように調製される。
静脈内投与の場合、組成物は、典型的には動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇ、典型的には動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの間などを含むことができる。通常、動物の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ～約１０ｍｇである。
本発明の組成物は、エアロゾル、スプレー、懸濁液などの適切な担体の形態、または使用に適した任意の他の形態をとることができる。適切な医薬担体の他の例は、EW Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
医薬組成物は、製薬分野で周知の方法論を使用して調製することができる。例えば、注射により投与することを意図した組成物は、本開示の結合分子を水と組み合わせて溶液を形成することによって調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を促進することができる。
開示の医薬組成物は、他の治療薬、例えば、抗癌剤、化学療法薬、手術または放射線と同時投与することができる。
一実施形態では、癌は、血液癌または悪性腫瘍、または固形腫瘍から選択される。一実施形態では、癌は転移性である。
一実施形態では、癌は、任意の器官または組織の任意の癌である。本開示のＳＡＲが標的とする例示的な疾患および抗原を表４９に示す。例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＢＣＭＡおよびＣＤ３８を標的とするために使用され、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、原発性滲出性リンパ腫および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの形質細胞障害および自己免疫障害を治療するために使用される。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＢＣＭＡおよびＣＤ３８に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。別の例示的な実施形態では、ＳＡＲは、ＢＣＭＡおよびＣＤ２２を標的とするために使用され、リンパ腫、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、原発性滲出性リンパ腫および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのリンパ系疾患および形質細胞疾患を治療するために使用される。 。このようなSARには、本明細書に記載のBCMAおよびCD22に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。一実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、およびＣＤ２０を標的とするために使用され、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ腫などの形質細胞、リンパ系および自己免疫疾患を治療するために使用される。リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、全身性エリテマトーデス（SLE）。このようなSARには、本明細書に記載のCD19、CD22、BCMAおよびCD20に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。一実施形態では、ＳＡＲは、ＰＳＭＡおよびＣＤ１９を標的とし、前立腺癌を治療するために使用される。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＰＳＭＡおよびＣＤ１９に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。 CD19 特異的抗原結合ドメインは、主に SAR の活性化、増殖、および拡大を刺激するために使用されます。
一実施形態では、本開示のＳＡＲは、任意の疾患（例えば、感染症、アレルギー、自己免疫、変性疾患など）を治療するために使用される。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＢＣＭＡおよびＣＤ１９を標的とするために使用され、リンパ腫、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞白血病原発性滲出性リンパ腫および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのリンパ系障害および形質細胞障害を治療するために使用される。このようなSARには、本明細書に記載のBCMAおよびCD19に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、およびＣＤ２２を標的とするために使用され、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ－ＡＬＬなどのリンパ系、形質細胞および自己免疫疾患を治療するために使用される。 、慢性リンパ性白血病および全身性エリテマトーデス（SLE）。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＢＣＭＡ、ＣＤ３８、およびＣＤ２２に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、 ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、およびＣＤ１９を標的とするために使用され、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ－ＡＬＬなどのリンパ系、形質細胞および自己免疫疾患を治療するために使用される。 、慢性リンパ性白血病および全身性エリテマトーデス（SLE）。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＢＣＭＡ、ＣＤ３８、およびＣＤ１９に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、およびＣＤ１９を標的とするために使用され、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ型リンパ腫などのリンパ系、形質細胞および自己免疫疾患を治療するために使用される。 -ALL、慢性リンパ性白血病、全身性エリテマトーデス（SLE）。このようなSARには、本明細書に記載のBCMA、CD38、CD22およびCD19に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、ＣＤ２０およびＣＤ１９を標的とするために使用され、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などのリンパ系、形質細胞および自己免疫疾患を治療するために使用される。 、B-ALL、慢性リンパ性白血病、全身性エリテマトーデス（SLE）。このようなSARには、本明細書に記載のBCMA、CD38、CD22、CD20およびCD19に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とするために使用され、リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのリンパ性疾患および自己免疫疾患を治療するために使用される。このようなSARには、本明細書に記載のCD19およびCD22に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とするために使用され、リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのリンパ性疾患および自己免疫疾患を治療するために使用される。このようなSARには、本明細書に記載のCD19およびCD22に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、およびＣＤ２０を標的とするために使用され、リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのリンパ性疾患および自己免疫疾患を治療するために使用される。このようなSARには、本明細書に記載のCD19、CD20およびCD22に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＰＳＭＡを標的とし、前立腺癌を治療するために使用される。このようなＳＡＲは、本明細書に記載されるＰＳＭＡに特異的な抗原結合ドメインを含む。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＰＳＭＡおよびＣＤ２２を標的とし、前立腺癌を治療するために使用される。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＰＳＭＡおよびＣＤ２２に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。 CD22 特異的抗原結合ドメインは、主に SAR の活性化、増殖、および拡大を刺激するために使用されます。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＰＳＭＡおよびＣＤ２０を標的とし、前立腺癌を治療するために使用される。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＰＳＭＡおよびＣＤ２０に特異的な抗原結合ドメインが含まれる。 CD20 特異的抗原結合ドメインは、主に SAR の活性化、増殖、および拡大を刺激するために使用されます。
一実施形態では、ＳＡＲは、ＰＳＭＡおよびＢＣＭＡを標的とし、前立腺癌を治療するために使用される。このようなＳＡＲには、本明細書に記載のＰＳＭＡおよびＢＣＭＡに特異的な抗原結合ドメインが含まれる。 BCMA 特異的抗原結合ドメインは、主に SAR の活性化、増殖、および拡大を刺激するために使用されます。
開示のＳＡＲまたはＳＡＲを含む細胞は、既存の療法または治療薬、例えば抗癌療法と組み合わせて使用される。したがって、別の態様では、本発明は、本発明のＳＡＲ－ＴもしくはＳＡＲ－ＮＫおよび／もしくはＳＡＲ－マクロファージまたは医薬組成物の投与と、抗癌療法とを含む併用療法にも関する。抗癌療法には、治療薬または放射線療法が含まれ得、遺伝子療法、ウイルス療法、RNA療法、骨髄移植、ナノ療法、標的抗癌療法、または腫瘍溶解薬が含まれる。他の治療薬の例としては、他のチェックポイント阻害剤、抗腫瘍剤、免疫原性薬剤、弱毒化癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来の抗原または核酸でパルスされた樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、IL- 2 、 IFNa2、GM-CSF）、標的となる小分子および生体分子（シグナル伝達経路の構成要素、例えばチロシンキナーゼのモジュレーターおよび受容体チロシンキナーゼの阻害剤、ならびにEGFRアンタゴニストを含む腫瘍特異的抗原に結合する薬剤など）、抗炎症剤、細胞毒性剤、放射性毒性剤、または免疫抑制剤、および免疫刺激サイトカイン（例えば、GM-CSF）をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞、化学療法。一実施形態では、本開示のＳＡＲ－ＴまたはＳＡＲ－ＮＫおよび／またはＳＡＲ－Ｔおよび／またはＳＡＲ－マクロファージ医薬組成物は、手術と組み合わせて使用される。本開示のＳＡＲ－ＴまたはＳＡＲ－ＮＫ医薬組成物は、他の治療法と同時に、または異なる時点で、例えば同時に、別々に、または連続的に投与することができる。
免疫細胞（例えば、NK、T細胞など）の生存、したがって細胞毒性にはサイトカインのサポートが必要です。インターロイキン-15 (IL-15) と IL-2 を非分泌型の膜結合型で発現させると、NK 細胞と T 細胞の増殖が維持され、細胞毒性が改善されることが知られています。
本開示は、IL-2および/またはIL-15の低親和性変異体のすべてまたは機能的部分を発現する免疫細胞を産生する方法を提供する。 ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５の全部または一部は、膜結合ポリペプチド、分泌ポリペプチド、またはそれらの組み合わせとして発現され得る。この方法は、IL-2またはIL-15の低親和性変異体のすべてまたは機能的部分をコードする核酸を1つまたは複数の免疫細胞(例えば、 NK細胞)に導入することを含む。一態様では、ＩＬ－２またはＩＬ－１５の低親和性変異体の全部または機能的部分をコードする核酸は、膜貫通タンパク質の全部または一部に連結（例えば、融合）される。あるいは、またはさらに、IL-2またはIL-15変異体のすべてまたは機能的部分をコードする核酸が免疫細胞(例えば、 NK細胞)に導入される。当業者には明らかなように、IL-2またはIL-15変異体のすべてまたは機能的部分をコードする核酸、およびIL-2またはIL-15変異体のすべてまたは機能的部分がすべてに融合されている態様は、または、膜貫通タンパク質の一部が免疫細胞（たとえば、NK細胞）に導入されます。これは、単一の核酸または複数の（たとえば、別々の; 2つの）核酸を使用して行うことができます。NK細胞またはT細胞は、条件下で維持されます。 IL-15またはIL-2のすべてまたは機能部分が膜結合ポリペプチドおよび/または分泌ポリペプチドとして発現され、それによってIL-15またはIL-2のすべてまたは機能部分を発現するNK細胞またはT細胞が産生される。膜結合ポリペプチドおよび／または分泌ポリペプチドとしてのIL-2 特定の態様では、IL-15またはIL-2のすべてまたは機能的部分をコードする核酸が、CD8aのシグナルペプチドおよびCD8aのシグナルペプチドに融合される。 CD8a の膜貫通ドメインの一部が NK 細胞に導入されます。
さらに別の態様では、本開示は、ＮＫ細胞の増殖および／または生存を増強する方法（例えば、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボ）を対象とする。この方法は、IL-15またはIL-2のすべてまたは機能的部分をコードする核酸を導入することを含む。 IL-15の全部または一部(例えば、野生型IL-15)をコードする核酸、および/または膜貫通タンパク質の全部または一部に融合したIL-15の全部または機能的部分をコードする核酸をNKに導入することができる。細胞。したがって、NK細胞は、IL-15のすべてまたは機能部分を、膜結合ポリペプチド、分泌ポリペプチド、またはそれらの組み合わせとして発現することができる。 NK細胞は、IL-15の全部または一部が膜結合ポリペプチド、分泌ポリペプチド、またはそれらの組み合わせとして発現され、NK細胞が増殖する条件下で維持される。特定の態様では、IL-15の全部または機能的部分をコードする核酸がCD8aのシグナルペプチドに融合され、CD8aの膜貫通ドメインの全部または一部がNK細胞に導入される。いくつかの態様では、この方法は、膜結合型IL-15および/または分泌型IL-15を含むNK細胞をIL-2と接触させることをさらに含むことができる。いくつかの態様では、IL-2の濃度は約10 IU/mlから約1000 IU/mlである。他の態様では、IL-2の濃度は、約20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、 400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720 740、760、780、800、820、840、860、88 0、900 、920、940、960、980IU/ml。
当業者には明らかなように、核酸を導入するためのさまざまな方法を使用することができる。
また、当業者には明らかなように、 ( i ) IL-15のすべてまたは機能的部分が膜結合ポリペプチドとして発現され、かつ、 ／または分泌ポリペプチドとして、および／または（ｉｉ）膜結合型ＩＬ－１５および／または分泌型ＩＬ－１５増殖物を含むＮＫ細胞を使用することができる。この方法は、本明細書で提供される方法によって産生される１つまたは複数のＮＫ細胞を単離または分離することをさらに含むことができる。さらに、方法は、１つまたは複数のＮＫ細胞を培養することをさらに含むことができる。いくつかの態様では、NK細胞株が産生される。
本開示は、本明細書に記載の方法によって産生される（１つ以上の）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株、および本明細書に提供されるＮＫ細胞を含む組成物も包含する。特定の態様では、組成物は、本明細書で提供される１つ以上のＮＫ細胞または細胞株を含む医薬組成物である。医薬組成物は、ＩＬ－２のすべてまたは機能部分（例えば、（１つまたは複数の）ＩＬ－２タンパク質のすべてまたは機能部分；ＩＬ－２のすべてまたは機能部分をコードする核酸）をさらに含むことができる。
例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞）にＩＬ２および／またはＩＬ１５シグナル伝達を提供するために使用できる、膜アンカー型のＩＬ２およびＩＬ１５およびそれらの低親和性変異体（表４３）を提供する。本開示のＳＡＲを発現する免疫細胞（例えば、配列番号８４２８）。代表的な低親和性IL2変異体の配列番号を配列番号7834～7837に示す。代表的な低親和性IL15変異体の配列番号は、配列番号7839～7841に提供される。膜アンカー型IL2および/またはIL15の低親和性変異体には、変異体が発現する細胞に選択的に生存シグナルを提供し、隣接する細胞のIL2および/またはIL15シグナル伝達を刺激しないという利点がある。したがって、膜アンカー型IL2および/またはIL15の低親和性変異体には、治療指数が向上するという利点がある。
次世代 SAR コンストラクトの技術的な課題は、その検出、単離、精製、または除去のための簡単な方法が存在しないことです。 SAR構築物へのエピトープタグの付加は記載されているが、その標的抗原へのSAR結合および/またはオフターゲットシグナル伝達を妨害するという問題がある。出願人は、結合活性およびシグナル伝達活性を妨げることなく、エピトープタグを膜アンカー型サイトカイン（例えば、IL2および1L15）に付加できることを発見した。本開示は、膜アンカー型のＩＬ２およびＩＬ１５、ならびに検出、単離に使用できる１つまたは複数のエピトープタグ（例えば、セツキシマブミモトープ、リツキシマブタグ、ハーセプチンミモトープ、ＭＹＣタグ、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩなど）も含むそれらの低親和性変異体を提供する。 、ＳＡＲ発現細胞を含む、それらを発現する細胞の精製および／または枯渇。例示的なエピトープタグは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２２６４１の表３７を含む文献で知られており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらのエピトープタグは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２２６４１に記載の方法を使用して、免疫細胞（例えば、ＳＡＲ発現ＮＫ細胞またはＴ細胞）の検出、単離、精製および／または枯渇に使用することができる。
養子免疫療法の有効性の向上は、CRS、神経毒性、移植片対宿主病（GvHD）、リンパ球増殖、挿入変異誘発などの重篤な短期および長期の有害事象の報告と関連しています。改変された T 細胞は投与後何年も増殖して存続する可能性があるため、毒性に直面しても養子注入された T 細胞の選択的欠失を可能にする安全機構を組み込むことが望ましい。自殺遺伝子により、 in vivoで形質導入された細胞の選択的欠失が可能になります。 HSV-TK と iCasp9 という 2 つの自殺遺伝子が臨床試験中です。
養子細胞療法の効率を最大化するためには、形質導入効率をモニタリングし、形質導入された細胞を選択するための機構を有することが望ましい。次いで、形質導入された細胞の精製された集団を患者に投与することができる。
次世代 CAR 構築物 (例えば、SIR、zSIR、Ab-TCRなど) の発現を含む一部の T 細胞工学戦略では、容易に検出可能な表面タンパク質のトランスジェニック発現がもたらされない可能性があります。このような場合、末梢血中の細胞の形質導入の測定と追跡は困難です。さらに、一部の設定では、たとえば GvHD 遺伝子治療プロトコルでは、形質導入された T 細胞のみを投与することが不可欠です。ここでは、臨床グレードの分類を可能にするマーカーが必要です。
ピューロマイシン耐性遺伝子 (PAC)、tEGFR、CD20、低親和性神経成長因子受容体など、いくつかのマーカー遺伝子が報告されています。最近では、短縮型 CD34 および RQR8 がマーカーとして使用されています。これらには、CD34 Miltenyi CliniMACS 選択システムが臨床グレードの分類に容易に利用できるという利点があります。
マーカーおよび自殺遺伝子（例えば、HSV-TK、iCaspase 9、tEGFRなど）は長いコード配列を有しており、これらのタンパク質をマーカー遺伝子として含めると、ベクターのパッケージング能力と転写効率に負担がかかる可能性があります。最後に、上記の自殺遺伝子および/またはマーカー遺伝子はいずれも免疫細胞に生存シグナルを提供することができません。自殺機能、マーカー機能、生存機能は 2 つ以上の遺伝子を含めることによって提供できますが、これによりベクターのパッケージング能力と転写効率にさらに負担がかかる可能性があります。したがって、自殺、生存、およびマーカー機能を提供できる多目的遺伝子スイッチが必要とされている。
本開示は、自殺、生存、およびマーカー機能を果たす多目的遺伝子スイッチを提供する。例示的な実施形態では、多目的スイッチは、細胞内で異所的に発現される場合、養子細胞療法の目的で生死（または生存自殺）スイッチとして機能する。一実施形態では、多目的スイッチは次の式を有する。SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4。ここで、SP は多目的スイッチの細胞表面輸送を可能にし、切断されて成熟ペプチドを生成する任意のシグナルペプチドです。D1 は細胞生存を促進する受容体に結合する受容体結合ドメインです。D2 はマーカー/自殺ドメインです。D3 はD1およびD2ドメインが標的細胞の表面から突き出ることを可能にするヒンジドメイン/ストークドメイン、D4は分子スイッチを標的細胞に固定する膜結合ドメイン(例えば、膜貫通ドメインまたは膜アンカードメイン)である。細胞膜および L1、L2、および L3 はオプションのリンカードメインです。
一実施形態では、多目的スイッチは、受容体結合ドメインを含む第１のモジュール（Ｄ１）と、マーカー／自殺スイッチとして機能する第２のモジュール（Ｄ２）および第３のモジュール（Ｄ３）とのフレーム内融合を含む。ヒンジ/ストークドメインとして機能し、膜結合ドメインとして機能する第 4 モジュール (D4) として機能します。一実施形態では、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４モジュールは、同じ内在性タンパク質に由来する。一実施形態では、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４モジュールは、異なる内因性タンパク質に由来する。一実施形態では、Ｄ３およびＤ４は、同じ内因性タンパク質に由来する。一実施形態では、Ｄ３およびＤ４は、異なる内因性タンパク質に由来する。
一実施形態では、第１のモジュール（Ｄ１）は、細胞表面上に発現される受容体に結合する、すなわち、受容体の細胞外ドメインに結合する。一実施形態では、第１のモジュール（Ｄ１）は、結合すると生存促進および／または増殖シグナルを細胞に伝達する受容体に結合する。一実施形態では、第１モジュールはシスで受容体に結合する（すなわち、分子スイッチを発現する細胞と同じ細胞上で発現される受容体に結合する）。 一実施形態では、第１のモジュールはトランスで受容体に結合する（すなわち、分子スイッチを発現する細胞以外の細胞上で発現される受容体に結合する）。一実施形態では、第１のモジュールは受容体にシスおよびトランスで結合する。一実施形態では、第１のモジュール（Ｄ１）は、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、またはそれらの変異体もしくは断片の受容体結合ドメインを含む。例示的なサイトカイン、ケモカインおよびリガンドには、以下のいずれかが含まれるが、これらに限定されない：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7 、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL18、IL-19、IL20、IL-21、IL -22、IL-23、IL27、IL-28、CD40L、4-1BBL、CD30L、OX40L、FLT3-L、エイプリル、BAFF、ランテス、MIP、エリスロポエチン、トロンボポエチン、SCF（幹細胞因子）、G-CSF、一実施形態では、第１のモジュールは、抗体、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ｖＬ、ｖＨ、Ｆａｂなど）、単一ドメイン抗体（例えば、ｖＨＨ、ＦＨＶＨなど）である。または受容体に結合できる非免疫グロブリン抗原結合モジュール。例示的な実施形態では、受容体は以下の１つから選択される：ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－８Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩＬ－ 10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-18R、IL-19R、IL-20R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-27R、IL-28R、 CCR1、CCR3、CCR5、MIP-1R、PF4 受容体、エリスロポエチン受容体 (Epo-R)、TPO-R/MPL、GSF-R、c-Kit、および M-CSF 受容体。
一実施形態では、第２のモジュール（Ｄ２）は、内在性タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片を含む。例示的な実施形態では、Ｄ２は、以下の内因性タンパク質またはその断片のうちの１つまたは複数の細胞外ドメインを含む。 CD19; CD123; CD22; CD30; CD38、CD52、CD171; CS1 (SLAMF7、CD319); C型レクチン様分子-1 (CLL-1またはCLECL1); CD33;上皮成長因子受容体バリアント III (EGFRviii);ガングリオシド G2 (GD2);ガングリオシドGD3; BCMA; Tn 抗原 (Tn Ag);前立腺特異的膜抗原 (PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体 1 (ROR1)。 FMS 様チロシンキナーゼ 3 (FLT3);腫瘍関連糖タンパク質 72 (TAG72); CD38; CD44v6;癌胎児性抗原 (CEA);上皮細胞接着分子 (EPCAM); B7H3 (CD276);キット (CD117);インターロイキン 13 受容体サブユニット アルファ 2 (IL-13Ra2 または CD213A2)。メソテリン;インターロイキン 11 受容体アルファ (IL-11Ra);前立腺幹細胞抗原 (PSCA);プロテアーゼ セリン 21 (テスティシンまたは PRSS21);血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2);ルイス(Y)抗原; CD24;血小板由来増殖因子受容体ベータ (PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4 (SSEA-4); CD20;葉酸受容体アルファ (FRα または FR1);葉酸受容体ベータ (FRb);受容体チロシンプロテインキナーゼ ERBB2 (Her2/neu);ムチン 1、細胞表面関連 (MUC1)。上皮成長因子受容体 (EGFR);神経細胞接着分子 (NCAM);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ (FAP);インスリン様成長因子 1 受容体 (IGF-1 受容体)、炭酸脱水酵素 IX (CA1X)。エフリン A 型受容体 2 (EphA2);シアリルルイス接着分子 (sLe);ガングリオシドGM3;高分子量黒色腫関連抗原 (HMWMAA); o-アセチル-GD2 ガングリオシド (OAcGD2);腫瘍内皮マーカー 1 (TEM1/CD248)。腫瘍内皮マーカー 7 関連 (TEM7R);クローディン 6 (CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）; G タンパク質共役受容体クラス C グループ 5、メンバー D (GPRC5D)。 CD97; CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ (ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的 1 (PLAC1); globoH グリコセラミド (GloboH) の六糖部分。乳腺分化抗原 (NY-BR-1);ウロプラキン 2 (UPK2); A 型肝炎ウイルス細胞受容体 1 (HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ 3 (ADRB3);パネキシン 3 (PANX3); G タンパク質共役受容体 20 (GPR20);リンパ球抗原 6 複合体、遺伝子座 K 9 (LY6K)。嗅覚受容体 51E2 (OR51E2); TCR ガンマ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP);アンドロゲン受容体; T 細胞によって認識される扁平上皮癌抗原 3 (SART3); CD79a; CD79b; CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体 1 (LAIR1); IgA 受容体の Fc フラグメント (FCAR または CD89)。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリー A メンバー 2 (LILRA2); CD300 分子様ファミリーメンバー f (CD300LF); C 型レクチンドメインファミリー 12 メンバー A (CLEC12A);骨髄間質細胞抗原 2 (BST2); EGF 様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様 2 (EMR2)。リンパ球抗原 75 (LY75);グリピカン-3 (GPC3); Fc受容体様5 (FCRL5);免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＭＰＬ、ＣＤ３４、ＬＡＭＰ１ ＴＲＯＰ２、ＧＦＲα４、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ６、ＮＹＢＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ２００Ｒ、Ｓｌｅａ（ＣＡ１９．９；シアリルルイス抗原）；フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1/CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL11Ra、IL13Ra2、IL-17R、CD179b-IGLl1、TCRガンマデルタ、NKG2D、CD32 ( FCGR2A)、Tim1-/HVCR1、CSF2RA (GM-CSFR-alpha)、TGFbetaR2、Lews Ag、TCR-beta1 鎖、TCR-beta2 鎖、TCR-γ 鎖、TCR-δ 鎖、FITC、黄体ホルモン受容体 (LHR) 、卵胞刺激ホルモン受容体 (FSHR)、性腺刺激ホルモン受容体 (CGHR または GR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、CD99、Ras G12V、組織因子 1 (TF1)、GPRC5D、Claudin18.2 (CLD18A2 または CLDN18A.2)、P -糖タンパク質、STRAP1、Liv1、ネクチン-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル（LCCC）、TAJ/TROY、MPL（TPO-R）、KIR3DL2、CD32b、CD229、Toso、PD-1、 PD-L1、PD-L2、TNFR1、TRAIL-R1 (DR4)、TRAIL-R2 (DR5)、CTLA4、IL-36R、CD25、LAG3、VEGF-A、MASP-2、胸腺間質リンホポエチン、組織因子、IFNAR1 、IL5、 IL-6、IL-12、IL-23、 IL-17A、IL-13、アンジオポエチン様3、CGRP、IL-23p19、vWF、C5、IFNγ、CD4、CD8、CD7、NKp30、NKp44、 NKp46、NKG2D、PDGRFα、α4β7インテグリン、 α4インテグリン、VEGF、GPIIb/IIIa PCSK9、Blys 、およびBAFF-R。
一実施形態では、第２のモジュール（Ｄ２）を使用して、分子スイッチを発現する細胞の死を誘導することができる。一実施形態では、第２のモジュール（Ｄ２）は、薬剤が結合したときに分子スイッチを発現する細胞の死を誘導するために使用することができる。例示的な実施形態では、第２のモジュールに結合したときに分子スイッチを発現する細胞の死を誘導する薬剤は、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、抗体薬物複合体である。 、二重特異性抗体もしくはその断片、または細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＳＡＲ－Ｔ、ＳＡＲ－ＮＫ細胞など）。一実施形態では、第２のモジュールを使用して、分子スイッチを発現する細胞を選択的に濃縮または枯渇させることができる。一実施形態では、第２のモジュールを使用して、薬剤が結合したときに分子スイッチを発現する細胞を選択的に検出、富化および／または枯渇させることができる。例示的な実施形態では、第２のモジュールに結合した場合に分子スイッチを発現する細胞を選択的に検出、富化および／または枯渇させるために使用できる薬剤は、抗体、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、または非免疫グロブリン抗原結合ドメインである。その断片。一実施形態では、分子スイッチは、エクスビボで細胞を選択的に検出、濃縮および／または枯渇させるために使用される。一実施形態では、分子スイッチは、インビボで細胞を選択的に枯渇させるために使用される。一実施形態では、分子スイッチを発現する細胞を検出、枯渇または濃縮するために使用される薬剤（すなわち、抗体、抗体薬物複合体、二重特異性抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメインまたはその断片）は、ヒトに対して承認されている。 FDAによる管理。ヒトへの投与に関してＦＤＡによって承認されている、またはＦＤＡの承認を保留中の例示的な薬剤は当技術分野で知られており、限定されないが、リツキシマブ、ハーセプチン、アービトラックス、アドセトリス、エンブレル、 トレメリムマブ、 モスネツズマブ、 テクリストマブ、 ドナネマブ、 スペソリマブ、ファリシマブ、 チスレリズマブ、ベランタマブマフォドチン、ペンブロリズマブ、ニボルマブおよびＱｂｅｎｄなど。抗体を使用して細胞を選択的に枯渇および／または濃縮する方法は、当技術分野で知られている（例えば、ＷＯ２０１８／１７８３７８）。一実施形態では、分子スイッチを発現する細胞を検出、枯渇または濃縮するために使用される薬剤は、エクスビボ臨床使用についてＦＤＡによって承認されている。このような薬剤の例は、臨床的に承認されたCliniMACS CD34システム(Miltenyi)と併用することがFDAによって承認されたCD34に対する抗体である。
本開示の分子スイッチは、ポリペプチドが標的細胞の表面で発現されると、Ｄ１およびＤ２ドメインを標的細胞の表面から突出させるヒンジ／ストーク配列（Ｄ３）を含む。
ストーク配列(D3)は、D1およびD2を細胞表面から十分に遠ざけ、例えばD1の受容体への結合および/または抗体のD2ドメインへの結合を容易にする。
ストーク配列 (D3) は、D1-D2 ドメインを細胞表面から持ち上げます。
ストーク配列は、実質的に直線状のアミノ酸配列であってもよい。ストーク配列は、D1 および D2 ドメインを標的細胞の表面から遠ざけるのに十分な長さである可能性がありますが、そのコード配列がベクターのパッケージングおよび形質導入効率を損なうほど長くはありません。ストーク配列は、例えば、長さが20～100アミノ酸であってもよい。ストーク配列は、長さが約 40 ～ 50 アミノ酸であり得る。
ストーク配列は高度にグリコシル化されている可能性があります。
ストーク配列は、配列番号(DNA):7132および配列番号(PRT):7824で表される配列を含むか、またはそれらとほぼ同等の長さであり得る。
ストーク/ヒンジ配列は、必要に応じて細胞内アンカー配列と一緒に、膜貫通ドメイン (D4) に機能的に連結されています。膜貫通ドメインおよび細胞内アンカー配列は、ストーク配列の細胞外部分と同じタンパク質に由来してもよいし、または異なるタンパク質に由来してもよい。ストーク/ヒンジおよび膜貫通ドメインおよび細胞内アンカー配列は、CD8 に由来する可能性があります。例示的なＣＤ８ヒンジおよび膜貫通配列は、配列番号（ＰＲＴ）：３６０３に提供される。
分子スイッチは、同じであっても異なっていてもよい、任意のリンカー（またはスペーサー）ドメインであるＬ１、Ｌ２およびＬ３を含んでもよい。例示的なリンカーは、配列番号３４１８～３４３４に提供される。分子スイッチは、アミノ末端にシグナルペプチドを含んでもよい。例示的なシグナルペプチドは、配列番号２４２５～２４２８に提供される。ポリペプチドが標的細胞によって発現されると、シグナルペプチドが切断され、成熟ペプチド産物が生成されます。
例示的な多目的スイッチは、Synth-IL2-Nde-tBCMA-L244ter (配列番号(DNA):7152および配列番号(PRT):7843)であり、細胞外ドメインにインフレームで融合されたIL2のIL2受容体結合ドメインを含むそしてBCMAの膜貫通ドメイン。この多目的スイッチは、免疫細胞(例えば、T細胞またはNK細胞など)で発現されると、 IL2のIL-2R結合ドメインを含むN末端D1モジュールを介してIL2受容体に結合することによって生存シグナルを免疫細胞に提供する。この多目的スイッチの第 2 モジュール (D2) は、BCMA 結合剤 ( BCMA 抗体など) によって認識される BCMA の細胞外ドメインを含み、導入遺伝子 ( SARなど) の検出、選択的除去、および/または濃縮に使用できます。 ）発現細胞。第２（Ｄ２）モジュールを含むＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＢＣＭＡを標的とする抗体または抗体薬物複合体などのＢＣＭＡ標的薬剤の使用による導入遺伝子（例えば、ＳＡＲ）発現細胞の選択的自殺にも使用することができる（例えば、ベランタマブ マホドチン）。この分子スイッチの 3 番目 (D3) および 4 番目 (D4) モジュールは、BCMA のヒンジ/ストークおよび膜貫通ドメインで構成され、スイッチを細胞膜に固定する役割を果たします。
分子スイッチはモジュール形式であるため、結果として得られるスイッチが少なくとも 1 つの生物学的活性 (生存スイッチまたは自殺スイッチとして機能する能力など)を保持している限り、異なるモジュールを他のモジュールで置き換えることができます。したがって、IL2モジュールは、異なるサイトカイン(例えば、IL15、IL18、IL21など)で置き換えることができます。これらの多目的タンパク質は、サイトカイン部分(例えば、IL2、IL15、IL18、IL21など)を通じて生存促進シグナルを提供しますが、第二のモジュール（例えば、RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19、tCD30など）に結合する薬剤（例えば、抗体）を使用することにより細胞を死滅させるために使用でき、それによって自殺として作用する毒性にもかかわらず、投与された T 細胞の選択的欠失を可能にする遺伝子。第２のモジュール(例えば、RQR3、tBCMA、tHer2、tEGFR、tCD19、tCD30など)も、形質導入の測定のためのマーカーとして使用し、形質導入された細胞の選択を可能にすることができる。
例示的な実施形態では、ＩＬ２モジュールは、低親和性ＩＬ２変異体、ＩＬ１５またはＩＬ１５変異体によって置き換えることができる。 ｔＢＣＭＡに融合された低親和性ＩＬ２変異体を含む例示的な多目的スイッチは、配列番号（ＤＮＡ）：７１５２～７１５５および配列番号（ＰＲＴ）：７８４４～７８４７で提供される。 ＩＬ－１５およびｔＢＣＭＡに融合されたその低親和性変異体を含む例示的な多目的スイッチは、配列番号（ＤＮＡ）：７１５６～７１５７および配列番号（ＰＲＴ）：７８４８～７８４９で提供される。別の例示的な実施形態では、ｔＢＣＭＡモジュールを他のモジュールで置き換えることができる。例示的な多目的スイッチは、ｔＣＤ３０に融合されたＩＬ２を含む。配列番号（ＤＮＡ）：７１５８および配列番号（ＰＲＴ）：７８５０で提供される。例示的な多目的スイッチは、ｔＥＧＦＲおよび他の表面タンパク質（例えば、Ｈｅｒ３、ＣＤ１９、ＰＤ１）に融合されたサイトカインを含む。 、ＰＤＬ１、ＣＤ４０など）も同様に構築でき、本開示の代替実施形態で使用できる。
多目的スイッチ発現カセットはサイズがコンパクトで、ウイルスベクターに簡単にパッケージ化できます。これらは、個別のプロモーターを必要とする個々のマーカー、自殺遺伝子、生存遺伝子をコードする発現カセットよりもはるかに扱いやすいサイズです。それらは、個々の遺伝子によって示される感度と少なくとも等しい感度を有する生存、自殺、およびマーカー遺伝子要素を含むという追加の利点を有する。
一実施形態では、第２のモジュール（Ｄ２）は、エピトープまたはミモトープの１つ以上のコピーを含む合成モジュールである。一実施形態では、エピトープは内因性タンパク質の細胞外ドメインに存在する。一実施形態では、ミモトープは、内因性タンパク質の細胞外ドメインに存在するエピトープを模倣する。例示的な内因性タンパク質は、前のセクションに示されている。エピトープまたはミモトープの１つ以上のコピーを含む例示的な合成モジュールはＲＱＲ８（配列番号９６１９）であり、これはＣＤ３４エピトープおよび２つのＣＤ２０ミモトープを有するモジュールであり、ＷＯ／２０１３／１５３３９１に記載されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。 RQR8モジュールを使用すると、臨床的に承認された CliniMACS CD34 システム (Miltenyi) を使用した選択が可能になります。さらに、この構築物は広く使用されている医薬品抗体リツキシマブに結合し、導入遺伝子発現細胞の選択的欠失をもたらします。追加の多目的分子スイッチの例 ＩＬ２またはその変異体およびｔＢＣＭＡ（配列番号（ＤＮＡ）：７１５１～７１５５）、ＩＬ１５またはその変異体およびｔＢＣＭＡ（配列番号（ＤＮＡ）：７１５６～７１５７）、ＩＬ２およびその変異体およびｔＨｅｒ２を含む融合タンパク質を含み、 ＩＬ２およびその変異体およびｔＥＧＦＲ、ＩＬ２およびそのＲＱＲ８、ＩＬ２およびその変異体およびＣＤ３０（配列番号７８５０）など。多目的スイッチはモジュール形式であるため、１つのモジュールを別のモジュールに置き換えることができる。
開示の多目的スイッチをコードするポリペプチドは、配列番号７８４３～７８５０および９６２１～９６２５として示される配列の変異体を含むか、またはそれらから構成され得、これは、示される配列と少なくとも７０％、８０％または９０％の同一性を有する。配列番号７８４３～７８５０および９６２１～９６２５ポリペプチドの機能活性を保持している限り、配列番号７８４３～７８５０および９６２１～９６２５として挙げられる。例えば、配列 7843-7847 の変異体は、(i) IL-2R に結合するはずです。 (ii) BCMA 抗体 (例えば、J6M0 またはベランタマブ マフォドチン)に結合します。 (iii) 細胞表面に発現すると、J6M0 またはベランタマブ マフォドチンの存在下で細胞の死滅を誘導します。 J6M0 は US9273141B2 に記載されています。
相同性比較は、目によって、またはGCG Wisconsin Bestfitパッケージなどの容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して行うことができる。
開示の多目的分子スイッチは、ポリペプチドが対象タンパク質（POI）に融合されている融合タンパク質の形態であってもよい。融合タンパク質は、多目的スイッチをコードするポリペプチドと目的のタンパク質との間に自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ）を含んでもよい。
目的のタンパク質は、標的細胞の表面で発現する分子です。 POI は、標的細胞が生体内にある場合に治療効果または予防効果を発揮する可能性があります。 ＰＯＩは、ＳＡＲ（例えば、ＣＡＲ、ＳＩＲ、ｚＳＩＲ、ＨＩＴ、ＳＴＡＲ、ｃＴＣＲ、Ａｂ－ＴＣＲ、ＴＦＰ、ＴＡＣ、組換えＴＣＲなど）または内因性ＴＣＲであり得る。
開示の多目的スイッチをコードするポリペプチドまたは融合タンパク質をコードすることができる核酸配列を提供する。
核酸は、標的細胞によって発現されると、コードされた多目的スイッチポリペプチドを標的細胞の細胞表面で発現させる。核酸が多目的スイッチポリペプチドとPOIの両方を(例えば融合タンパク質として)コードする場合、本開示のポリペプチドとPOIの両方が標的細胞の表面で発現されるはずである。
核酸配列は、RNAであっても、cDNAなどのDNAであってもよい。
本開示は、多目的分子スイッチの核酸配列を含むベクターも提供する。ベクターはまた、目的の導入遺伝子、すなわち、POI (例えば、SAR)をコードする遺伝子を含み得る。
ベクターは、多目的スイッチをコードするポリペプチドおよび場合により目的のタンパク質を発現するように、標的細胞をトランスフェクトまたは形質導入できなければならない。
ベクターは、プラスミドなどの非ウイルスベクターであってもよい。ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸と、ＰＯＩを含む核酸とを別個の実体として、または単一のヌクレオチド配列として含んでもよい。それらが単一のヌクレオチド配列として存在する場合、それらは、下流配列の翻訳を可能にするために、２つのコード部分の間に１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み得る。一実施形態では、多目的分子スイッチおよびＰＯＩは、別個のプロモーターを使用して単一のベクターから発現され得る。別の実施形態では、多目的スイッチおよびＰＯＩは、別個のベクトルから表現され得る。
開示の多目的スイッチポリペプチドを発現する細胞を提供する。細胞は、細胞表面で多目的スイッチポリペプチドおよびPOI(例えば、SAR)を共発現し得る。本開示はまた、本開示の多目的スイッチポリペプチドをコードすることができる核酸配列を含む細胞を提供する。細胞は、本開示によるベクターで形質導入またはトランスフェクトされている可能性がある。この細胞は養子細胞療法に適している可能性がある。細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのＴ細胞であってもよい。 T 細胞は既存の特異性を持っている可能性があります。例えば、それはエプスタイン・バーウイルス（EBV）特異的T細胞であり得る。細胞は、NK細胞、NKT細胞、iPSC由来T細胞、または合成T細胞であってもよい。細胞は患者に由来してもよい。例えば、細胞は患者から採取され、その後、本開示によるベクターでエクスビボで形質導入され得る。 ACT に適した T 細胞集団には、バルク末梢血単核球 (PBMC)、CD8+ 細胞 (たとえば、CD4 枯渇 PBMC) が含まれます。制御性T細胞（Treg）が選択的に枯渇したPBMC。分離された中央記憶 (Tcm) セル。 EBV 固有の CTL。およびトリウイルス固有の CTL。
本開示は、本開示による細胞を含む細胞集団も含む。細胞集団は、本開示によるベクターで形質導入されている可能性がある。細胞集団の一部の細胞は、細胞表面で本開示による多目的スイッチポリペプチドを発現し得る。細胞集団の一部の細胞は、細胞表面で多目的スイッチポリペプチドおよびPOI (例えば、SAR)を共発現し得る。細胞集団は、エクスビボ患者由来の細胞集団であってもよい。
例えばＳＡＲなどのタンパク質をコードする）による形質導入を測定するための方法を提供し、この方法は、本開示の多目的スイッチポリペプチドを共発現するベクターを細胞集団に形質導入するステップを含む。目的のタンパク質（例えば、ＳＡＲ）と、細胞表面上の多目的スイッチ（例えば、ＢＣＭＡ、ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープなど）の発現を検出することと、本開示の多目的スイッチポリペプチドを発現する細胞の割合が対応する。目的の導入遺伝子で形質導入された細胞の割合に応じて調整します。
、以下のステップを含む、 ＰＯＩ（例えば、ＳＡＲ）を発現する細胞を選択するための方法を提供する。
ｉ ） ＰＯＩ（例えば、 SAR);と
(ii)多目的スイッチ(例えば、BCMA結合エピトープ、Her2結合エピトープ、またはQBEnd10結合エピトープ)を発現すると同定された細胞を選択する。
細胞は、ＦＡＣＳまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ ｃｌｉｎｉＭＡＣＳシステムなどの当技術分野で知られている方法によって同定および／または分類され得る。
、上記の方法を使用して細胞集団からPOI(例えばSAR)を発現する細胞を選択するステップを含む、POI(例えばSAR)を発現する細胞が濃縮された精製細胞集団を調製するための方法を提供する。 。本開示は、そのような方法によって調製されたPOI発現細胞の精製集団も提供する。精製された細胞集団において、細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％がＰＯＩ（および本開示による多目的スイッチポリペプチド）を発現し得る。
細胞表面における本開示のポリペプチドの発現を検出するステップを含む、インビボで形質導入された細胞を追跡するための方法を提供する。細胞は、生物発光イメージングなどの当技術分野で知られている方法によってインビボで追跡され得る。このような用途のために、本開示のポリペプチドは、ルシフェラーゼなどの検出可能なタンパク質と共発現するように操作され得る。
本開示はまた、本開示によるベクターによって形質導入された細胞を欠失させるための方法を提供し、この方法は、多目的スイッチポリペプチドに結合する薬剤に細胞を曝露するステップを含む。一実施形態では、薬剤は多目的スイッチポリペプチドのＤ２ドメインに結合する。一実施形態では、薬剤は抗体（例えば、リツキシマブ、エルチブトラックスまたはＪ６Ｍ０）であり、細胞は補体の存在下で抗体に曝露される。一実施形態では、薬剤は抗体薬物複合体（例えば、ベランタマブ・マフォドチン、Ｔ－ＤＭ１またはエンヘルツなど）である。一実施形態では、多目的スイッチはｔＢＣＭＡまたはその変異体もしくは断片を含み、薬剤はＪ６Ｍ０またはベランタマブマフォドチンである。一実施形態では、多目的スイッチはｔＨｅｒ２またはその変異体もしくは断片を含み、薬剤はハーセプチン、 Ｔ－ＤＭ１またはエンヘルツである。一実施形態では、多目的スイッチはＲＱＲ８またはその変異体もしくは断片を含み、薬剤はリツキシマブである。一実施形態では、多目的スイッチはｔＥＧＦＲまたはその変異体もしくは断片を含み、薬剤はＥｒｂｉｔｒｕｘである。
開示の多目的スイッチポリペプチドが細胞の表面で発現される場合、ポリペプチドのＤ２ドメインへの薬剤（例えばリツキシマブ）の結合により細胞の溶解が引き起こされる。薬剤（例えば、リツキシマブ）の複数の分子が、細胞表面で発現される多目的スイッチポリペプチドごとに結合し得る。
、例えば薬剤（例えば、リツキシマブ、ハーセプチン、エルビトラックス、Ｊ６Ｍ０、ベランタマブ・マフォドチン、Ｔ－ＤＭ１またはエンヘルツなど）を患者に投与することによって、インビボで起こり得る。移入された細胞を削除する決定は、移入された細胞に起因する望ましくない影響が患者で検出された場合に生じる可能性がある。たとえば、許容できないレベルの毒性が検出される可能性があります。異なる薬剤の投与量、経路、および投与頻度は当技術分野で知られており、薬剤および対象の臨床状態に応じて変化するであろう。一実施形態では、薬剤の複数用量が投与される。
遺伝子改変された T 細胞の養子移入は、抗腫瘍免疫応答などの望ましい免疫応答を生成するための魅力的なアプローチです。
本開示は、対象における疾患を治療および／または予防するための方法を提供し、この方法は、本開示による細胞を対象に投与するステップを含む。この方法は、細胞集団を対象に投与するステップを含んでもよい。細胞集団は、上記の方法を使用して、目的の導入遺伝子を発現する細胞を濃縮することができる。
この方法には次の手順が含まれる場合があります。
o (i) 患者から血液サンプルなどの細胞サンプルを採取する。
o (ii) T細胞を抽出するステップ、
o 多目的スイッチをコードする核酸配列および目的の導入遺伝子（例えば、ＳＡＲ）を含む本発明のベクターをＴ細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程、
o (iv) 形質導入された細胞をエクスビボで拡大する
o (v) 細胞を患者に戻す。
形質導入された細胞は、腫瘍特異的標的化および殺傷の強化などの所望の治療特性を有する可能性がある。
次世代 SAR 構築物 (例えば、SIR、zSIR、Ab-TCR、HIT、STARなど) の技術的課題は、それらの検出、単離、精製、または枯渇のための簡単な方法が存在しないことです。 CAR構築物へのキルスイッチの付加は記載されているが、SARの標的抗原への結合および/またはオフターゲットシグナル伝達を妨害するという問題がある。出願人は、サイトカイン（例えば、IL2および1L15など）が、それらの結合およびシグナル伝達活性を妨げることなく、膜アンカー型分子（例えば、BCMA、CD30など）にインフレームで融合できることを発見した。本開示は、サイトカイン（例えば、ＩＬ２およびＩＬ１５など）および膜アンカー分子（例えば、ＢＣＭＡまたはＣＤ３０）に融合されたそれらの低親和性変異体を提供する。 BCMAおよびCD30（例えば、 Adcetris）に対して利用可能なFDA承認の抗体および抗体薬物複合体があるため、これらの分子は、毒性の場合にそれらを発現する細胞（例えば、SAR細胞）を根絶するためのキルスイッチとして使用することができる。
融合構築物はまた、それらを発現する細胞の検出、単離、精製および／または枯渇に使用できる１つまたは複数のエピトープタグ（例えば、セツキシマブミモトープ、リツキシマブタグ、ハーセプチンミモトープ、ＭＹＣタグ、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩなど）を含んでもよい。 SAR発現細胞。例示的なエピトープタグは文献で知られている（例えば、配列番号３４２３～３４３４。これらのエピトープタグは、免疫細胞（例えば、ＳＡＲ発現ＮＫ細胞またはＴ細胞）の検出、単離、精製および／または枯渇に使用することができる。 PCT/US2021/022641に記載されている方法。
製品は、容器と、容器上の、または容器に付随するラベルまたは添付文書とを備えることができる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。 。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、その表面に本開示のＳＡＲを提示するエフェクター細胞である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の症状の治療に使用されることを示しています。ラベルまたは添付文書は、SARエフェクター細胞組成物を患者に投与するための説明書をさらに含むことになる。本明細書に記載の併用療法を含む製品およびキットも企図される。
添付文書とは、治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれる説明書を指し、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、禁忌および/または警告に関する情報が含まれています。いくつかの実施形態では、添付文書は、組成物が標的抗原陽性癌（副腎皮質癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸癌、食道癌、神経膠芽腫、神経膠腫、肝細胞癌など）を治療するために使用されることを示す。 、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、膵臓がん、褐色細胞腫、形質細胞腫、神経芽腫、卵巣がん、前立腺がん、肉腫、胃がん、子宮がんまたは甲状腺がん）。他の実施形態では、添付文書は、組成物が標的抗原陽性ウイルス感染（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＣＶなどによる感染）を治療するために使用されることを示す。
さらに、製品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびブドウ糖溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器など、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
例えば、本明細書に記載の標的抗原陽性疾患または障害の治療に有用なキットも提供され、必要に応じて製品と組み合わせて使用される。本開示のキットは、 ＳＡＲエフェクター細胞組成物（または単位剤形および／または製品）を含む１つまたは複数の容器を含み、いくつかの実施形態では、別の薬剤（本明細書に記載の薬剤など）および／または使用説明書をさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかに従って使用する。キットは、治療に適した個体の選択に関する説明をさらに含んでもよい。
開示のキットに提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた説明書であるが、機械読み取り可能な説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスクに記録された説明書）もまた、同様である。許容できる。
例えば、いくつかの実施形態では、キットは、その表面にＳＡＲを提示するエフェクター細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）その表面にＳＡＲを提示するエフェクター細胞を含む組成物、およびｂ）有効量の少なくとも１つの他の薬剤を含み、他の薬剤は、ＭＨＣタンパク質の発現を増加させ、および／またはＭＨＣタンパク質の発現を増強する。 MHCタンパク質（例えば、IFNγ、IFNP、IFNa、またはHsp90阻害剤）によるペプチドの表面提示。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）その表面にＳＡＲを提示するエフェクター細胞を含む組成物、およびｂ）標的抗原陽性疾患（癌または癌など）の治療のために個体にＳＡＲエフェクター細胞組成物を投与するための説明書を含む。ウイルス感染）。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）その表面にＳＡＲを提示するエフェクター細胞を含む組成物、ｂ）有効量の少なくとも１つの他の薬剤を含み、他の薬剤は、ＭＨＣタンパク質の発現を増加させ、および／または表面を強化する。 ＭＨＣタンパク質によるペプチドの提示、およびｃ）標的抗原陽性疾患（癌またはウイルス感染など）の治療のために個体にＳＡＲエフェクター細胞組成物および他の薬剤を投与するための指示。 ＳＡＲエフェクター細胞組成物および他の薬剤は、別個の容器または単一の容器中に存在することができる。例えば、キットは、１つの異なる組成物、または１つの組成物がＳＡＲエフェクター細胞を含み、別の組成物が他の薬剤を含む２つ以上の組成物を含んでもよい。
組成物を形成するためにＳＡＲをエフェクター細胞（個体に由来するエフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞など）と組み合わせるための説明書を含む。表面にＳＡＲを提示するエフェクター細胞を含み、標的抗原陽性疾患（癌またはウイルス感染など）の治療のために個体にＳＡＲエフェクター細胞組成物を投与するステップ。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）ＳＡＲを含む組成物、およびｂ）エフェクター細胞（細胞傷害性細胞など）を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ａ）ＳＡＲを含む組成物、ｂ）エフェクター細胞（細胞傷害性細胞など）、およびｃ）ＳＡＲをエフェクター細胞と組み合わせて、細胞上に存在するエフェクター細胞を含む組成物を形成するための説明書を含む。その表面をＳＡＲとし、標的抗原陽性疾患（癌またはウイルス感染など）の治療のために個体にＳＡＲエフェクター細胞組成物を投与する。
いくつかの実施形態では、キットは、ＳＡＲをコードする核酸（または核酸のセット）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）ＳＡＲをコードする核酸（または核酸のセット）、およびｂ）核酸（または核酸のセット）を発現するための宿主細胞（エフェクター細胞など）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）ＳＡＲをコードする核酸（または核酸のセット）、およびｂ）ｉ）宿主細胞（エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞など）内でＳＡＲを発現させるための説明書を含む。 ｉｉ）ＳＡＲを発現する宿主細胞を含む組成物を調製するステップ、およびｉｉｉ）標的抗原陽性疾患（癌またはウイルス感染症など）の治療のために、ＳＡＲを発現する宿主細胞を含む組成物を個体に投与するステップ。いくつかの実施形態では、宿主細胞は個体に由来する。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）ＳＡＲをコードする核酸（または核酸のセット）、ｂ）核酸（または核酸のセット）を発現するための宿主細胞（エフェクター細胞など）、およびｃを含む。 ）ｉ）宿主細胞においてＳＡＲを発現させること、ｉｉ）ＳＡＲを発現する宿主細胞を含む組成物を調製すること、およびｉｉｉ）標的抗原の治療のために個体にＳＡＲを発現する宿主細胞を含む組成物を投与するための指示、陽性の病気（がんやウイルス感染など）。
開示のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、瓶、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ）などが含まれるが、これらに限定されない。キットはオプションで、バッファーや解釈情報などの追加コンポーネントを提供する場合があります。したがって、本出願は、バイアル（密封バイアルなど）、ボトル、ジャー、柔軟な包装などを含む製品も提供する。
ＳＡＲエフェクター細胞組成物の使用に関する説明書には、一般に、意図する治療のための用量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、またはサブユニット用量であり得る。例えば、１週間、８日、９日、１０日、１１日のいずれかのような長期間にわたって個体に効果的な治療を提供するために十分な用量の本明細書に開示されるＳＡＲエフェクター細胞組成物を含むキットが提供され得る。 、12日、13日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、3か月、4か月、5か月、7か月、8か月、9か月、またはそれ以上。キットはまた、複数の単位用量のＳＡＲおよび医薬組成物および使用説明書を含み、薬局、例えば病院薬局および調剤薬局での保管および使用に十分な量で包装されてもよい。
本開示は、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の膜露出エピトープを標的とするｖＬ、ｖＨ、およびｓｃＦｖを提供する（表４７）。本開示はまた、Ｈｓｐ７０を標的とするこれらのｖＬ、ｖＨ、およびｓｃＦｖポリペプチドに基づく、Ｈｓｐ７０を標的とするＳＡＲを提供する。 Ｈｓｐ７０を標的とする例示的なＳＡＲの配列番号は、（配列番号（ＤＮＡ）：７７５４～７８０８および配列番号（ＰＲＴ）：８４４６～８５００）に提供される。 ＳＡＲは、レンチウイルス媒介遺伝子導入を使用して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞など）で発現され、本開示に記載されるインビトロおよびインビボアッセイを使用して、Ｈｐｓ７０発現Ｄａｕｄｉ細胞に対する細胞毒性について試験される。
多くの異なるバックボーンを持つ SAR のin vivo送達が、急性リンパ性白血病患者でテストされます。レンチウイルス媒介遺伝子導入やウイルス様粒子による遺伝子導入など、多くの送達方法が試みられています。 SIR、cTCR、および Ab-TCR のバックボーンを持つ SAR は、第1世代 CAR、第 2世代CAR、第 3世代のバックボーンを持つ SAR と比較して、 in vivo遺伝子送達においてより安全であることが観察されています。 CAR、TFPε、TFPγ、TFPδ、TFPζ、CD16-SAR、NKp30-SAR、NKp44-SAR、NKp46-SAR、DAP10-SAR、またはNKG2D SAR。 SIR、acTCR、および Ab-TCR の骨格を持つ CD19-SAR をコードするレンチウイルス ベクターは、循環 CD19 発現 B-ALL 細胞への挿入頻度が、SIR の骨格を持つ SAR をコードするレンチウイルス ベクターと比較して低いことが観察されます。第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、ＴＦＰε、ＴＦＰγ、ＴＦＰδ、ＴＦＰζ、ＣＤ１６－ＳＡＲ、ＮＫｐ３０－ＳＡＲ、ＮＫｐ４４－ＳＡＲ、ＮＫｐ４６－ＳＡＲ、ＤＡＰ１０－ＳＡＲ、またはＮＫＧ２Ｄ ＳＡＲ。さらに、挿入後であっても、SIR、acTCR、およびAb-TCRの骨格を有するSARは、循環CD19発現B-ALL細胞では発現しないが、第1世代CARの骨格を有するSARは良好に発現することが観察される。第 2世代CAR、第 3世代CAR、TFPε、TFPγ、TFPδ、TFPζ、CD16-SAR、NKp30-SAR、NKp44-SAR、NKp46-SAR、DAP10-SAR、または NKG2D SAR が循環 B-ALL で観察される細胞。さらに、SAR の偶発的な挿入による B-ALL 再発のリスクは、第1世代のバックボーンを持つ SAR と比較して、SIR、cTCR、および Ab-TCR のバックボーンを持つ SAR の方が低いことにも注目されます。 ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、ＴＦＰε、ＴＦＰγ、ＴＦＰδ、ＴＦＰζ、ＣＤ１６－ＳＡＲ、ＮＫｐ３０－ＳＡＲ、ＮＫｐ４４－ＳＡＲ、ＮＫｐ４６－ＳＡＲ、ＤＡＰ１０－ＳＡＲ、またはＮＫＧ２Ｄ ＳＡＲ。
例えば、メソテリン、PSMAなど）を標的とするCAR-T細胞は、患者への注入時に不十分な増殖を示すことが観察されている。本開示は、血球上で発現される抗原（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０など）を標的とすることができるＳＡＲを提供することによって、この問題の解決策を提供する。このようなSARは、固形腫瘍を標的とするSARとともに免疫細胞内で共発現され、固形腫瘍を標的とするSAR-T細胞に増殖上の利点をもたらすことができる。例えば、ＣＤ１９を標的とするＳＡＲ（配列番号７６６０）は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）において、ＰＳＭＡを標的とするＳＡＲ（配列番号７６１７）またはＨｅｒ２を標的とするＳＡＲと共発現され得る。 ＰＳＭＡ ＳＡＲを発現し、ＣＤ１９ ＳＡＲも共発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、ＰＳＭＡ ＳＡＲを単独で発現する免疫細胞と比較して、より大きな増殖およびインビボ持続性を示すことが観察される。二重特異性または多重特異性免疫細胞（例えば、二重特異性または多重特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞）を生成するための本開示のＳＡＲの特有の利点は、第１世代または第２世代と比較してそれらの比較的小さいサイズに基づいている。第 2世代のCAR。したがって、ウイルスベクター (レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなど) に簡単にパッケージ化できます。さらに、本開示のＳＡＲは、多くの異なるシグナル伝達鎖（例えば、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ｚなど）を含む。異なるシグナル伝達鎖（すなわち、骨格）を有するＳＡＲを組み合わせて、シグナル伝達タンパク質に関して互いに競合しない様々な二重特異性および多重特異性ＳＡＲを生成することができる。したがって、本開示のＳＡＲは、多様な免疫応答を生成するために使用することができる。
前述したように、レンチウイルス インサートのサイズにはパッケージングの制限があります。本開示は、細胞治療および他の遺伝子工学応用のための遺伝子発現のための、ヒトヘルペスウイルス8型（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスまたはKSHV）由来の内部リボソーム侵入配列（IRES）の使用について記載する。他の既知のIRESと比較して、KSHV IRES (配列番号7116)はサイズが比較的小さいため、ウイルスベクターに容易にパッケージングすることができる。我々は、介在するKSHV IRES配列を使用してSIRカセットの後にtBCMAが発現される二本鎖SIRをコードするレンチウイルスベクターを生成した。我々は、レンチウイルスベクターに感染したT細胞におけるtBCMAの効果的な発現を観察した。また、標準的なパッケージングミックスを使用して 293FT 細胞にパッケージングした場合、得られたレンチウイルスベクターの良好な力価も観察されました。また、T 細胞における SIR の高レベルの発現も観察され、KSVH IRES の存在が上流の SIR の発現に影響を与えないことが示唆されました。上記構築物に感染したT細胞におけるSIRおよびtBCMAの発現は両方とも、F2Aリボソームスキップ配列を使用してtBCMAが発現されたレンチウイルスベクターに感染したT細胞におけるそれらの発現と比べて良好であった。
本開示は、以下の例示的な発明の態様を企図している。
態様１． 標的抗原に特異的に結合する合成抗原受容体（ＳＡＲ）であって、（ｉ）以下からなる群から選択される１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む第１のモジュールを含む、合成抗原受容体（ＳＡＲ）。 ａ）抗体； b) 抗体フラグメント; c) 抗体の重鎖可変領域(vHドメイン)またはその断片。 ｄ）抗体の軽鎖可変領域（ｖＬドメイン）またはその断片； ｅ）単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはそのフラグメント； ｆ）単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）またはその断片； g) vHHドメインまたはその断片; ｈ）抗体の単量体可変領域； ｉ）単一のｖＨドメイン（ＳＶＨ）またはその断片； ｊ）単一のｖＬドメイン（ＳＶＬ）またはその断片； ｋ）ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、アフィリス、アドネクチン、アフィチン、オボディ、レペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、セントイリン、プロネクティから選択される非免疫グロブリン抗原結合足場、アンチカリン、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、Dドメイン、および上記のいずれかのフラグメント； ｌ）受容体またはその断片のリガンド結合ドメイン； m) リガンドの受容体結合ドメイン; n) 二重特異性抗体、抗体断片、scFV、vHH、SDAB、非免疫グロブリン抗原結合足場、受容体、またはリガンド。 o) 自己抗原またはその断片。 ｐ）アダプター結合ドメインまたはその断片； ｑ）Ｆｃ結合ドメインまたはその断片； ｒ）ＴＣＲまたはＨＬＡ非依存性ＴＣＲまたはその断片； ｓ）ＴＣＲまたはそのフラグメントのＶａ、Ｖｂ、ＶｇまたはＶｄフラグメント、（ｉｉ）少なくとも１つの膜関連ドメインを含む第２のモジュールであって、膜関連ドメインは膜貫通ドメインまたは膜アンカードメインであり得る； （ｉｉｉ）１つ以上のサイトゾルドメインを含む任意の第３のモジュールであって、第１、第２、および任意の第３のモジュールは、１つ以上の任意のリンカーを介して機能的に連結されている。
態様2. 1つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む第1のモジュールが、任意のリンカーを介して、(1)全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；または（２）天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；または（３）天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；または、（４）天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体の細胞質ゾルドメイン。または（５）シグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくは断片の全体または部分的な細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメイン。
態様３．ａ ）天然に存在する受容体が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδおよびプレＴＣＲαからなる群から選択されるＴ細胞受容体を含まない、態様２に記載のＳＡＲ。および／またはｂ）天然に存在する受容体はＴ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を含まない。および／またはｃ）シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３εおよびＣＤ３δの群から選択されるＣＤ３アダプターではない。および/または)シグナル伝達アダプターが FcRγ ではない。
態様4. 天然に存在する受容体が、N末端細胞外ドメインを有するI型膜タンパク質であり、1つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むポリペプチドのN末端が、任意の結合を介して機能的に連結されている、態様2または3に記載のSAR。 ａ）天然に存在する受容体ポリペプチド鎖の全部または一部の細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン、またはその断片または変異体。またはｂ）天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；またはｃ）天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；または d) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖のサイトゾルドメインまたはその断片もしくは変異体。
態様５． 天然に存在する受容体Ｉ型膜タンパク質が、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１からなる群から選択される、態様４に記載のＳＡＲ。 、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas 、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＲＴＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ、ＩＬＴ２、ＬＡＩＲ１、それらの変異体および断片。
態様6. 天然に存在する受容体が、C末端細胞外ドメインを有するII型膜タンパク質であり、1つまたは複数の異種抗原結合ドメインをコードするポリペプチドのN末端が、任意の結合を介して機能的に連結されている、態様2または3に記載のSAR。 ａ）天然に存在する受容体ポリペプチド鎖の全部または一部の細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン、またはその断片または変異体。またはｂ）天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；またはｃ）天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；または d) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖のサイトゾルドメインまたはその断片もしくは変異体。
態様 ７．II型膜タンパク質のＮ末端に機能的に連結されたシグナル伝達アダプターのサイトゾルドメインを含むポリペプチドのＮ末端をさらに含む、態様６に記載のＳＡＲ。
態様８． シグナル伝達アダプターが、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１０の群から選択される、態様７に記載のＳＡＲ。
態様９． シグナル伝達アダプターのサイトゾルドメインのＮ末端に作動可能に連結された１つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドのＮ末端をさらに含む、態様８に記載のＳＡＲ。
態様１０．１ つ以上の共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、２Ｂ４、ＣＤ２７、ＣＤ８１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ４０からなる群から選択される、態様９に記載のＳＡＲ。 、HVEM、アイコス。
態様 １１．ＤＡＰ１０を含むアクセサリーモジュールと同時発現される、態様１０に記載のＳＡＲ。
態様12. 天然に存在する受容体II型膜タンパク質が、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、KLRG1、CD94、CD161、それらの変異体、およびそれらの断片からなる群から選択される、態様6～10のいずれかに記載のSAR。 。
態様１３． 全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインがすべて単一の天然に存在する受容体に由来し、１つの連続したポリペプチド鎖中に存在する、態様３に記載のＳＡＲ。
態様１４． 全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインが、２つ以上の異なる天然受容体に由来する、態様２に記載のＳＡＲ。
態様１５．ａ） 天然に存在する受容体の全部または部分的な細胞外抗原結合ドメインが、１つまたは複数の異なる天然に由来する任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインに機能的に連結されている、態様１４に記載のＳＡＲ。受容体;または、ｂ）天然に存在する受容体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメインおよび任意のヒンジドメインが、１つまたは複数の異なる天然に存在する受容体に由来する膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインに機能的に連結されており、またはｃ）天然に存在する受容体の全部または一部の細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジおよび膜貫通ドメインが、１つまたは複数の異なる天然に存在する受容体に由来するサイトゾルドメインに機能的に連結されている。
態様１６． サイトゾルドメインがITAMを含む活性化ドメインを含む、態様２に記載のSAR。
態様１７． サイトゾルドメインがITAMを含む活性化ドメインを欠いている、態様２に記載のSAR。
態様１８． サイトゾルドメインが、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１０の群から選択される１つまたは複数のシグナル伝達アダプターを動員する、態様２に記載のＳＡＲ。
態様１９． サイトゾルドメインが１つ以上の共刺激ドメインを含む、態様２に記載のＳＡＲ。
態様２０．１ つ以上の共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、２Ｂ４、ＣＤ２７、ＣＤ８１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ４０からなる群から選択される、態様２に記載のＳＡＲ。 、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、それらのバリアント、およびそれらのフラグメント。
態様２１． サイトゾルドメインが共刺激ドメインを欠いている、態様２に記載のＳＡＲ。
態様２２． サイトゾルドメインが、膜貫通ドメインと活性化ドメインとの間に位置する１つまたは複数の共刺激ドメインを含む、態様２に記載のＳＡＲ。
態様２３． 天然受容体が、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ４からなる群から選択される、態様２に記載のＳＡＲ。 、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I 、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＲＴＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ、ＩＬＴ２、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、それらの変異体およびそれらの断片。
態様２４． 天然に存在する受容体の細胞外抗原結合ドメインの抗原結合特性を部分的または完全に保持し、細胞外抗原結合ドメインに位置する１つまたは複数の異種抗原結合ドメインの抗原結合特異性を獲得する、態様２および３に記載のＳＡＲ。最初のモジュール。
態様２５． 細胞の表面上で発現されると、細胞にＭＨＣ（またはＨＬＡ）依存性および／またはＭＨＣ（またはＨＬＡ）非依存性の抗原認識を与えることができる、態様１に記載のＳＡＲであって、ａ） SAR の抗原結合ドメインは単一の連続したポリペプチド鎖で構成されていません。および／またはｂ）ＳＡＲの抗原結合ドメインは、抗体または抗体断片に由来しない。および／またはｃ）ＳＡＲはＴ細胞受容体モジュールを含まない。
態様２６．ＳＡＲ の抗原認識ドメインがＴＣＲの少なくとも２つの可変ドメインに由来する、態様２５に記載のＳＡＲ。
態様２７．２ つの可変ドメインが、Ｖα、Ｖβ、Ｖγ、ＶδおよびプレＴＣＲαから選択される少なくとも２つの可変ドメインのヘテロ二量体を含む、態様２６に記載のＳＡＲ。
態様２８．２ つの可変ドメインがＶαおよびＶβ、またはＶγおよびＶδである、態様２７に記載のＳＡＲ。
態様２９．２ つの可変ドメインが柔軟なペプチドリンカーによって連結されていない、態様２８に記載のＳＡＲ。
態様３０． 単鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）ではない、態様２９に記載のＳＡＲ。
態様３１．２ つの鎖を有し、少なくとも１つの鎖が膜結合している、態様２５に記載のＳＡＲ。
態様３２． 両方の鎖が膜結合している、態様３１に記載のＳＡＲ。
態様３３．ＭＨＣ （ＨＬＡ）分子と複合体を形成したペプチドに結合することができる、態様２５に記載のＳＡＲ。
態様３４． 細胞の表面上で発現すると、ペプチド／ＭＨＣ複合体によって結合されたときに少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員する能力を細胞に付与する、態様２５に記載のＳＡＲ。
態様３５． 細胞の表面上で発現されると、ペプチド／ＭＨＣ複合体によって結合されたときに少なくとも１つのシグナル伝達経路を開始する能力を細胞に与える、態様２５に記載のＳＡＲ。
態様３６． 非Ｔ細胞において機能的に発現され得る、態様２５に記載のＳＡＲ。
態様３７． 機能的ＣＤ３複合体の発現を欠く細胞において機能的に発現され得る、態様３６に記載のＳＡＲ。
態様３８．ＣＤ３γ鎖 、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の機能的発現を欠く細胞において機能的に発現され得る、態様３７に記載のＳＡＲ。
態様３９． 非Ｔ細胞にＴ細胞様抗原認識を与えることができる、態様３６に記載のＳＡＲ。
態様４０．ＣＤ３γ鎖 、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の機能的発現を欠くＴ細胞にＴ細胞様抗原認識を与えることができる、態様３６に記載のＳＡＲ。
態様４１． 非Ｔ細胞への抗原認識時にＴ細胞様シグナル伝達を与えることができる、態様３６に記載のＳＡＲ。
態様４２．ＣＤ３γ鎖 、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の機能的発現を欠くＴ細胞にＴ細胞様シグナル伝達を与えることができる、態様３６に記載のＳＡＲ。
態様４３． 任意の細胞にＴ細胞様の抗原認識を与えることができる、態様２２２に記載のＳＡＲ。
態様４４． 少なくとも２つの鎖を含む、態様１に記載のＳＡＲであって、ａ）第１のポリペプチド鎖が、ｖＬ、ＶαまたはＶγドメインを含む第１の抗原結合ドメインおよび第１の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含み； ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ｖＨ、ＶβまたはＶδドメインを含む第２の抗原結合ドメインおよび第２の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含む；ここで、第1の抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインと第2の抗原結合ドメインの相補的vH、VβまたはVδドメインは、標的に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様の抗原結合モジュールを形成する抗原;第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員できる非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を形成する。
態様45. 第1のポリペプチド鎖が、第1の抗原結合ドメインと第1のMAMとの間に第1のペプチドリンカーをさらに含み、第2のポリペプチド鎖が、第2の抗原結合ドメインとの間に第2のペプチドリンカーをさらに含む、態様44に記載のSAR。そして2番目のMAM。
態様４６． 第１および／または第２のペプチドリンカーが、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を個別に含む、態様４５に記載のＳＡＲ。
態様４７． 第１および／または第２のペプチドリンカーが、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む、態様４６に記載のＳＡＲ。
態様４８． 第１および／または第２のペプチドリンカーが、個別に、Ｃα、Ｃβ、ＣγもしくはＣδ ＴＣＲドメイン、またはその断片を含む、態様４６に記載のＳＡＲ。
態様４９． 第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖が１つ以上のジスルフィド結合を介して連結されている、態様４４または４５に記載のＳＡＲ。
態様５０． 第１および／または第２のペプチドリンカーが、２つのポリペプチド鎖の発現、親和性および／または対合を増加させる変異を含む、態様４５に記載のＳＡＲ。
態様５１．第１および／または第２のペプチドリンカーが、配列番号３５３６～３５６９および ９６２７～９６３１、１０８３２～１０８４１および１２３０４～１２３１１のいずれか１つに記載の配列を含む、態様４５に記載のＳＡＲ、または少なくとも７０％の同一性を有する配列。
態様５２． 第１のポリペプチドが、第１のＭＡＭのＮ末端側に第１のヒンジドメインまたはその断片をさらに含む、態様４４に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチドは、第２のＭＡＭのＮ末端に第２のヒンジドメインまたはその断片をさらに含む。
態様５３． 第１のＭＡＭ中の残基と第２のＭＡＭ中の残基および／または第１のヒンジドメイン中の残基と第２のヒンジドメイン中の残基との間のジスルフィド結合を含む、態様４４に記載のＳＡＲ。
態様54. 第1のポリペプチドが、第1のヒンジドメインのN末端に第1の相同抗原結合ドメインまたはその断片をさらに含む、および/または第2のポリペプチドが、第2の相同抗原結合ドメインまたはその断片をさらに含む、態様44に記載のSAR。ここで、２つの相同な抗原結合ドメインは、対応するヒンジドメインと同じ天然に存在する非Ｔ細胞受容体に由来する。
態様５５． 第１のポリペプチドが、第１のＭＡＭを含む第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に任意の活性化ドメインを含む第１のサイトゾルドメインをさらに含む、態様４４に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチドは、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端に任意の活性化ドメインを含む第２のサイトゾルをさらに含む。
態様５６． 第１のポリペプチド鎖が、第１のＭＡＭの第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側にある共刺激ドメイン配列を含む第１のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含み、態様４４に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチド鎖は、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に共刺激ドメイン配列を含む第２のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含む。
態様57. 共刺激ドメインがCD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEMもしくはICOSから選択される、態様56に記載のSAR、または変異体またはその断片。
態様58. 第1および/または第2のMAMおよびNTCRMが、非T細胞の膜貫通/膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメイン、および/または任意の細胞外ドメインから構成される、態様44に記載のSAR。受容体および/またはシグナル伝達アダプター。
態様59. 第1および/または第2のMAMおよびNTCRMが、すべて、単一の非T細胞受容体および/またはシグナル伝達アダプターもしくはその変異体。
態様６０．第１および／または第２のＭＡＭおよびＮＴＣＲＭ が、異なる非細胞由来の膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメインおよび／または任意の細胞外ドメインから構成される、態様５８に記載のＳＡＲ。 -T細胞受容体および/またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体。
態様６１．２ つの膜貫通／膜アンカードメイン、任意の細胞質ドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメイン、および／または任意の細胞外ドメインが配列において同一であり、同じタンパク質に由来する、態様５８に記載のＳＡＲ。
態様６２．２ つの膜貫通／膜アンカードメイン、任意の細胞質ドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメインおよび／または任意の細胞外ドメインが、配列が異なり、および／または異なるタンパク質に由来する、態様５８に記載のＳＡＲ。
態様６３．ａ ）非Ｔ細胞受容体が天然に存在する受容体であり、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３からなる群から選択される、態様５８に記載のＳＡＲ。 、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4 -1BB、CD27 、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、いずれかのバリアント前述の内容およびその断片。 ｂ）シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、前述のもののいずれかの変異体、およびそれらの断片からなる群から選択される。
態様６４．ａ ）第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭが、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３εから選択されるＣＤ３鎖の膜貫通ドメインおよび場合によりサイトゾルドメインを含まない、態様４４に記載のＳＡＲ。および／またはｂ）第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＴＣＲ鎖およびＣＤ３鎖の膜貫通ドメインを含まない。および／またはｃ）第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＣＤ３εの膜貫通ドメインを含まない。
態様６５．ＭＡＭ のうちの１つだけが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδおよびプレＴＣＲαからなる群から選択されるＴ細胞受容体に由来する、態様４４に記載のＳＡＲ。
態様66. 少なくとも2つの鎖を含む、態様1に記載のSARであって、a)第1のポリペプチド鎖が、vLドメインを含む第1の抗原結合ドメインと、TCRα、TCRβ、TCRγもしくはTCRδまたは変異体から選択される第1のTCR定常鎖とを含む、SAR。その; ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ｖＨドメインと、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδまたはその変異体から選択される第２のＴＣＲ定常鎖とを含む第２の抗原結合ドメインを含み；ここで、第１のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲαの定常鎖であり、第２のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲβの定常鎖である、または、第１のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲβの定常鎖であり、第２のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲαの定常鎖である、または、第１のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲγの定常鎖であり、第２のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲδの定常鎖であるか、または第１のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲδの定常鎖であり、第２のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲγの定常鎖である、または第１のＴＣＲ定常鎖はＴＣＲγの定常鎖である、定常鎖および／または第２のＴＣＲ定常鎖は、そのＮ末端領域でアミノ酸残基を欠き、ここで、ｖＬおよびｖＨドメインは、標的抗原に特異的に結合するＦｖ様抗原結合モジュールを形成し；第１のＴＣＲ定常鎖および第２のＴＣＲ定常鎖は、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができるＴ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を形成する。
態様６７．ａ ）ＴＣＲα定常鎖が、配列番号（ＰＲＴ）：７８６３～７９６３のアミノ酸配列、またはそれに対して８０～９９％の相同性を有する配列によって表される、態様６６に記載のＳＡＲ。 ｂ）ＴＣＲβ定常鎖は、配列番号（ＰＲＴ）：７９６４～８０８９のアミノ酸配列、またはそれと８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。 ｃ）ＴＣＲγ定常鎖は、配列番号（ＰＲＴ）：８０９１～８１９１のアミノ酸配列、またはそれと８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。 ｄ）ＴＣＲδ定常鎖は、配列番号（ＰＲＴ）：８１９２～８２９２のアミノ酸配列、またはそれに対して８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。
態様68. 第1および/または第2のポリペプチド鎖が、第1のポリペプチド鎖のN末端またはN末端付近に結合する1つまたは複数の自律抗原結合ドメイン(AABD)をさらに含む、態様44または66に記載のSAR。および／または第２の抗原結合ドメイン。
態様69. AABDが、単一vHドメイン(SVH)、単一vLドメイン(SVL)、vHHドメイン、単一ドメイン抗体、単一可変ドメインの1つまたは複数から選択される、態様68に記載のSAR。 ＴＣＲ（ｓｖｄ－ＴＣＲ）、非免疫グロブリン抗原結合足場、受容体のリガンド結合ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、自己抗原、アダプター結合ドメイン、Ｆｃ結合ドメイン、その断片、および／またはその変形。
態様70. 1つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むモジュールが、a)細胞表面タンパク質抗原、b)ペプチド/MHC複合体、およびc) 脂質抗原。
態様７１． 標的抗原が、ＣＤ１９；ＣＤ１９；およびＣＤ１９からなる群から選択される、態様１に記載のＳＡＲ。 CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 サブセット 1、CRACC、SLAMF7、CD319、および 19A24 とも呼ばれます)。 C型レクチン様分子-1 (CLL-1またはCLECL1); CD33;上皮成長因子受容体バリアント III (EGFRviii);ガングリオシド G2 (GD2);ガングリオシドGD3; TNF 受容体ファミリーメンバー B 細胞成熟 (BCMA); Tn 抗原 ((Tn Ag); 前立腺特異的膜抗原 (PSMA); 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体 1 (ROR1); FmsLike チロシンキナーゼ 3 (FLT3); 腫瘍関連糖タンパク質 72 (TAG72); CD38; CD44v6;急性白血病またはリンパ腫で発現するが造血前駆細胞では発現しないグリコシル化 CD43 エピトープ、非造血系癌で発現するグリコシル化 CD43 エピトープ、癌胎児性抗原 (CEA)、上皮細胞接着分子 (EPCAM)、B7H3 (CD276)、KIT (CD117) ; インターロイキン 13 受容体サブユニット アルファ-2 (IL-13Ra2 または CD213A2); メソセリン; インターロイキン 11 受容体アルファ (IL-11Ra); 前立腺幹細胞抗原 (PSCA); プロテアーゼ セリン 21 (テスティシンまたは PRSS21); 血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2); ルイス (Y) 抗原; CD24; 血小板由来成長因子受容体ベータ (PDGFR-ベータ); 胎児期特異的抗原-4 (SSEA-4); CD20; 葉酸受容体アルファ; 受容体チロシンタンパク質キナーゼ ERBB2 (Her2/neu); ムチン 1、細胞表面関連 (MUC1); 上皮成長因子受容体 (EGFR);神経細胞接着分子 (NCAM);プロスターゼ;前立腺酸性ホスファターゼ (PAP);伸長因子 2 変異 (ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ (FAP);インスリン様成長因子 1 受容体 (IGF-1 受容体)、炭酸脱水酵素 IX (CA1X)。プロテアソーム (プロソーム、マクロペイン) サブユニット、ベータ タイプ、9 (LMP2);糖タンパク質 100 (gpl00);ブレークポイントクラスター領域 (BCR) とアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ 1 (Abl) (bcr-abl) からなる癌遺伝子融合タンパク質。チロシナーゼ;エフリン A 型受容体 2 (EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子 (sLe);ガングリオシドGM3;トランスグルタミナーゼ 5 (TGS5);高分子量黒色腫関連抗原 (HMWMAA); o-アセチル-GD2 ガングリオシド (OAcGD2);葉酸受容体ベータ。腫瘍内皮マーカー 1 (TEM1/CD248)。腫瘍内皮マーカー 7 関連 (TEM7R);クローディン 6 (CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）; G タンパク質共役受容体クラス C グループ 5、メンバー D (GPRC5D)。染色体 X オープン リーディング フレーム 61 (CXORF61); CD97; CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ (ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的 1 (PLAC1); globoH グリコセラミド (GloboH) の六糖部分。乳腺分化抗原 (NY-BR-1);ウロプラキン 2 (UPK2); A 型肝炎ウイルス細胞受容体 1 (HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ 3 (ADRB3);パネキシン 3 (PANX3); G タンパク質共役受容体 20 (GPR20);リンパ球抗原 6 複合体、遺伝子座 K 9 (LY6K)。嗅覚受容体 51E2 (OR51E2); TCR ガンマ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質 (WT1);がん/精巣抗原 1 (NY-ES0-1);癌/精巣抗原 2 (LAGE-1a);黒色腫関連抗原 1 (MAGE-A1); MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、PRAME、PSA、ETS 転座バリアント遺伝子 6、染色体 12p 上に位置 (ETV6-AML)。精子タンパク質 17 (SPA17); Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体 2 (Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1 (MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2 (MAD-CT-2); Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質 p53 (p53); p53 変異体。プロステイン;生き残っている。テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1 (PCT A-1 またはガレクチン 8)、T 細胞によって認識される黒色腫抗原 1 (MelanA または MARTI)。ラット肉腫 (Ras) 変異体。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）;肉腫転座ブレークポイント;黒色腫アポトーシス阻害剤 (ML-IAP); ERG (膜貫通プロテアーゼ、セリン 2 (TMPRSS2) ETS 融合遺伝子); N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ V (NA17);ペアボックスタンパク質Pax-3 (PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリン B1; v-myc 鳥骨髄細胞腫症ウイルス性腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ (MYCN); Ras ホモログファミリーメンバー C (RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質 2 (TRP-2);シトクロム P450 1B 1 (CYP1B 1); CCCTC 結合因子 (ジンクフィンガータンパク質) 様 (BORIS またはインプリント部位調節因子の兄弟)、T 細胞 3 (SART3) によって認識される扁平上皮癌抗原。ペアボックスタンパク質 Pax-5 (PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32 (OY-TES1);リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（LCK）;キナーゼアンカータンパク質 4 (AKAP-4)。滑膜肉腫、X ブレークポイント 2 (SSX2)。最終糖化生成物 (RAGE-1) の受容体。腎臓ユビキタス 1 (RU1);腎臓ユビキタス 2 (RU2);レグマイン。ヒトパピローマウイルス E6 (HPV E6);ヒトパピローマウイルス E7 (HPV E7);腸のカルボキシルエステラーゼ。熱ショックタンパク質 70-2 変異 (mut hsp70-2)。 CD79a; CD79b; CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体 1 (LAIR1); IgA 受容体の Fc フラグメント (FCAR または CD89)。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリー A メンバー 2 (LILRA2); CD300 分子様ファミリーメンバー f (CD300LF); C 型レクチンドメインファミリー 12 メンバー A (CLEC12A);骨髄間質細胞抗原 2 (BST2); EGF 様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様 2 (EMR2)。リンパ球抗原 75 (LY75);グリピカン-3 (GPC3); Fc受容体様5 (FCRL5);免疫グロブリン ラムダ様ポリペプチド 1 (IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYC エピトープ タグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRalpha4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea (CA19.9; シアリル ルイス抗原) フコシル- GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマデルタ、NKG2D、CD32 (FCGR2A)、Tn ag、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、 CSF2RA (GM-CSFR-alpha)、TGFbetaR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-beta1 鎖、TCR-beta2 鎖、TCR-γ 鎖、TCR-δ 鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体（FSHR）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（CGHR）、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、インフルエンザA型ヘマグルチニン（HA）、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC (GCC)、デスモグレイン 3 に対する自己抗体 (Dsg3)、デスモグレイン 1 に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA 、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子 1 (TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2 (CLD18A2 OR CLDN18A.2)、P-糖タンパク質、 STEAP1、LIV1、NECTIN-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンス塩素チャネル、および SARS-CoV2 スパイクタンパク質。
態様72. コードされたSARポリペプチドが、以下からなる群から選択される1つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む、態様1に記載のSAR: (i)配列番号1のいずれかに記載の配列を含む重鎖可変領域(vH)配列番号２６８２～２９１８、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または配列番号２６８２～２６８２～２９１８のいずれか１つ以上に記載の配列に対して３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において少なくとも８０％の同一性を有する配列。 ２９１８、または配列番号２６８２～２９１８のいずれか１つ以上に記載の配列の３つのＣＤＲに３つ未満の置換を有する配列、または配列番号２９１８に属するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に３つ未満の置換を有する配列。 vHおよび配列番号: １１５９３～１１８２９、１１８３０～１２０６６、１２０６７～１２３０３、または配列番号２６８２～２６８２～のいずれか１つ以上に示される配列と同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列。 ２９１８であり、その抗原に結合するポリペプチドをコードする。 （ｉｉ）配列番号２４４０～２６７６のいずれか１つに示される配列、または配列番号２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域（ｖＬ）： ２４４０～２６７６、または配列番号２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に記載の配列と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において少なくとも８０％の同一性を有する配列、または３つの配列のうち３つ未満の置換を有する配列配列番号１２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に示される配列のＣＤＲ、またはｖＬに属し、配列番号１２４４０～２６７６に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に３つ未満の置換を有する配列のＣＤＲ。 それぞれ、１０８８２～１１１１８、１１１１９～１１３５ ５および１１３５６～１１５９２、または配列番号２４４０～２４４０～のいずれか１つ以上に示される配列と同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列。 ２６７６であり、その抗原に結合するポリペプチドをコードする。 （ｉｉｉ）配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つに記載の配列もしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または６つの相補性において少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つ以上に示される配列、または配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つ以上に示される配列の６つのＣＤＲにおいて６個未満の置換を有する配列に対する決定領域（ＣＤＲ）と、 ２９２４～３１６０、またはｓｃＦＶを含むｖＨに属し、配列番号： １１５９３～１１８２９、１１８３０～１２０６６、１２０６７～１２３０３は、 ｓｃＦｖを含むｖＬに属し、配列番号： それぞれ、１０８８２～１１１１８、１１１１９～１１３５５、および１１３５６～１１５９ 、または配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つ以上に示される配列と同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列。そしてその抗原に結合するポリペプチドをコードする。 (iv)配列番号3210～3353、10695～10713のいずれか1つに記載の配列、または少なくとも70%の同一性を有する配列を含む、単一ドメイン抗体、vHHドメイン、SVH、および/またはFHVHドメイン配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上に示される配列、および／または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）においていずれか１つまたは複数に示される配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３、または配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上に記載の配列の３つのＣＤＲに３つ未満の置換を有する配列、または配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上の配列配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上に示される配列として同じ標的抗原または標的抗原上の同じエピトープに結合し、その抗原に結合するポリペプチドをコードするもの； (v) 配列番号3366～3377のいずれか1つのポリヌクレオチド、または配列番号3366～3377のいずれか1つもしくは複数に記載の配列と少なくとも70%の同一性を有する配列によってコードされる非免疫グロブリン足場配列番号３３６６～３３７７のいずれか１つ以上に記載の配列と同じ標的抗原または標的抗原上の同じエピトープに結合するもの；（ｖｉ）記載の配列を含む受容体のリガンド結合ドメイン配列番号３３７８～３３９５、３８８０、３８８２、３８８６、３８９３、３８９６、３８９７、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有し、その同族体に結合するポリペプチドをコードする配列のいずれかにおいて； (vii)配列番号3396～3406、10786～10787のいずれか1つに記載の配列、またはそれと少なくとも70%の同一性を有する配列を含み、その同族体に結合するポリペプチドをコードするリガンドの受容体結合ドメイン; （ｖｉｉｉ）配列番号３４０７～３４３５、１０７７１～１０７８０のいずれか１つに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含み、そのアダプターに結合するポリペプチドをコードするアダプター結合ドメイン； （ｉｘ）配列番号１０７８８～１０７９１のいずれか１つに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含み、その自己抗体または自己抗体産生細胞に結合するポリペプチドをコードする自己抗原； （ｘ）配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれかに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むＴＣＲ可変領域（Ｖａ、Ｖｂ、ＶｇまたはＶｄ）、または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において、配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれか１つ以上に記載の配列、または３つ未満の置換を有する配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列。配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれか１つ以上に示される配列、または配列セットと同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列の３つのＣＤＲ第４に、配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれか１つ以上において、その抗原に結合するポリペプチドをコードするもの； （ｘｉ）配列番号９６１３～９６１４のいずれかに記載の配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列、または３つの配列において７０～９９％の同一性を有する配列を含む単一可変ＴＣＲドメイン（ｓｖｄ－ＴＣＲ）配列番号９６１３～９６１４のいずれか１つ以上に示される配列に対する相補性決定領域（ＣＤＲ）、または配列番号９６１３～９６１４のいずれか１つ以上に示される配列の３つのＣＤＲにおいて３つ未満の置換を有する配列に対する相補性決定領域（ＣＤＲ）、 ９６１３～９６１４、または配列番号９６１３～９６１４のいずれか１つ以上に記載の配列と同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合し、その抗原に結合するポリペプチドをコードする配列。
態様73. 天然に存在する受容体および/またはシグナル伝達アダプターもしくはその断片が、配列番号3743～3966、3385、3394、7818～7822、9633～9859から選択される配列を含む、態様2または58に記載のSAR。またはそれに対する配列に対して７０％の相同性を有する配列。
態様74. 天然 に存在する受容体のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメインおよび/またはシグナル伝達アダプターを含むポリペプチドが、配列番号9669～9704、3813、8721から選択される配列を含む、態様2または58に記載のSAR。 、８７３３および８７４６、またはそれらの配列に対して７０％の相同性を有する配列。
態様75. 天然に存在する受容体および/またはシグナル伝達アダプターの膜関連ドメインが、配列番号3914～3928、9741～9776、9852～9855から選択される配列を含む、態様1、2、または58に記載のSAR。またはそれに対する配列に対して７０％の相同性を有する配列。
態様76. 天然に存在する受容体および/またはシグナル伝達アダプターのサイトゾルドメインが、配列番号3944～3958、9777～9812、9856～9859から選択される配列を含む、態様1、2または58に記載のSAR。それに対する配列に対して７０％の相同性を有する配列。
態様77. 天然に存在する受容体および/またはシグナル伝達アダプターの活性化ドメインが、配列番号9856～9859および9777から選択される配列、または配列に対して70%の相同性を有する配列を含む、態様16または55に記載のSAR。そこに。
態様78. 共刺激ドメインが、配列番号9807～9810から選択される配列、またはその配列に対して70%の相同性を有する配列を含む、態様9、48および56に記載のSAR。
態様７９ 各鎖のＮ末端に存在するリーダー配列またはシグナルペプチドをさらに含み、場合により配列番号２４２５～２４３０からなる群から選択される配列を含む、態様１に記載のＳＡＲ。
態様８０．ＳＡＲが ＳＡＲヘテロ二量体を含む、態様１に記載の単離されたＳＡＲポリペプチド。
態様８１ ポリペプチドが、切断可能なリンカーによって連結された２つのＳＡＲ鎖を含む、態様１または８０に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様82. 切断 可能リンカーが自己切断性切断可能リンカーである、態様81に記載の単離された合成抗原受容体(SAR)ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様８３ 切断 可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカーまたはその機能的等価物のいずれか１つ以上である、態様８２に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様８４ 切断 可能なリンカーが、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａリンカー、またはそれらの機能的等価物のいずれか１つ以上である、態様８３に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様85. 切断 可能なリンカーが配列番号3627～3632のいずれか1つまたは複数の配列を含む、態様84に記載の単離された合成抗原受容体(SAR)ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様86. 切断 可能リンカーの前にフリン切断部位もしくはフリン様切断部位またはその機能的等価物が任意に存在する、態様84に記載の単離された合成抗原受容体(SAR)ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様８７ 切断 可能なリンカーに先行するフリン切断部位が、配列番号３６３５～３６３６のいずれか１つ以上の配列を含む、態様８６に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様88. 切断 可能なリンカーの前に柔軟なリンカーが存在する、態様86～87のいずれか1つの単離された合成抗原受容体(SAR)ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様89. 切断可能なリンカーに先行する柔軟なリンカーが1つ以上のSer-Glyリンカーまたはその機能的等価物をコードする、態様88に記載の単離された合成抗原受容体(SAR)ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様９０． 切断可能なリンカーに先行する柔軟なリンカーが配列番号３６３３～３６３４の配列を含む、態様８９に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様９１． フリン切断部位の順序となるように、フリン切断部位の後に柔軟なリンカーが続き、その後に切断可能なリンカーが続く、態様８８～９０のいずれか１つの単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。 - 柔軟なリンカー - 切断可能なリンカー。
態様９２．ＳＡＲが、 選択された抗原に対して所望の結合親和性を有するように設計されている、態様１または８０に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
態様９３．ａ） サイトカインまたはその変異体、およびａ）サイトカインまたはその変異体からなる群から選択されるポリペプチドを含むアクセサリーモジュールをさらに発現する、態様１に記載のＳＡＲ。 b) 膜アンカー型サイトカイン。 c) エピトープタグを有する膜アンカー型サイトカイン。 d) 自殺、生存、マーカー機能として機能する多目的スイッチ。 e) シグナル伝達アダプター分子。 f) キルスイッチ。
態様９４．ａ） サイトカインが、配列番号７８３３～７８４２の配列またはそれに対して最大７０％の配列相同性を有する変異体を含み、かつｂ）膜アンカー型サイトカインが、配列番号７８３３～７８４２を有する配列を含む、態様９３に記載のアクセサリーモジュール。配列番号７８２５～７８３２またはそれに対して最大７０％の配列相同性を有する変異体、ｃ）多目的スイッチは、配列番号７８４３～７８５０の配列またはそれに対して７０％の配列相同性を有する変異体を含む、およびｄ）アダプターは、CD3ζ、FcRγ、DAP10およびDAP12の群から選択される。
態様９５．式 ：ＳＰ－Ｄ１－Ｌ１－Ｄ２－Ｌ２－Ｄ３－Ｌ３－Ｄ４を有する態様９４の多目的スイッチを含むポリペプチド。式中、SPは、多目的スイッチの細胞表面輸送を可能にし、切断されて成熟ペプチドを生成する任意のシグナルペプチドであり、D1は、細胞の生存を促進する受容体に結合する受容体結合ドメインであり、
多目的スイッチを標的細胞に固定する膜結合ドメインです。細胞膜、L1、L2、および L3 はオプションのリンカーです。
態様９６． 多目的スイッチポリペプチドが、第１のモジュール（Ｄ１）、（Ｄ２）、（Ｄ３）および（Ｄ４）のインフレーム融合を含む、態様９５に記載のポリペプチド。
態様９７ ａ）Ｄ３およびＤ４モジュールが同じ内因性タンパク質に由来する、態様９６に記載のポリペプチド。または b) D2、D3、および D4 モジュールが異なる内因性タンパク質に由来する。または c) D3 と D4 は同じ内因性タンパク質に由来します。または d) D3 と D4 は異なる内因性タンパク質に由来します。
態様98. 第1のモジュール(D1)が細胞表面上で発現される受容体に結合する、態様95に記載のポリペプチド。
態様99. 受容体が結合すると、生存促進および/または増殖シグナルを細胞に伝達する、態様98に記載のポリペプチド。
態様100. 第1のモジュールが受容体にシスで結合する、および/または第1のモジュールが受容体にトランスで結合する、態様98に記載のポリペプチド。
態様１０１． 第１のモジュール（Ｄ１）が、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、またはそれらの変異体もしくは断片の受容体結合ドメインを含む、態様９５に記載のポリペプチド。
態様１０２．前記 Ｄ１が、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５からなる群から選択されるサイトカイン、ケモカインまたはリガンドの受容体結合ドメインを含む、態様１０１に記載の多目的スイッチ。 、IL18、IL21、CD40L、4-1BBL、CD30L、OX40L、FLT3-L、エイプリル、BAFF、ランテス、MIP、エリスロポエチン、トロンボポエチン、SCF（幹細胞因子）、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、前述のいずれかの変形、および前述のいずれかのフラグメント。
態様 １０３．Ｄ１が、配列番号７８３３～７８４２で表される配列を有するポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する変異体を含む、態様１０１に記載のポリペプチド。
態様104. D1が、受容体に結合できる抗体、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、scFv、または非免疫グロブリン抗原結合モジュールを含む、態様95に記載のポリペプチド。
態様105. D1が、IL2R、IL6R、IL7R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL15R、IL18、IL21 CCR1、CCR3、CCR5、 MIP-1R、PF4 受容体、エリスロポエチン受容体 (Epo-R)、TPO-R/MPL、GSF-R、c-Kit、および M-CSF 受容体。
態様１０６．Ｄ２が 非内在性ポリペプチドを含む、態様９５に記載のポリペプチド。
態様１０７．Ｄ２ が内在性タンパク質の細胞外ドメインまたはその変異体もしくは断片を含む、態様９５に記載のポリペプチド。
態様108. D2が、以下の内因性タンパク質またはその変異体もしくは断片のうちの1つまたは複数の細胞外ドメインを含む、態様95に記載のポリペプチド: CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD38、CD52、CD171; CS1 (SLAMF7、CD319); C型レクチン様分子-1 (CLL-1またはCLECL1); CD33;上皮成長因子受容体バリアント III (EGFRviii);ガングリオシド G2 (GD2);ガングリオシドGD3; BCMA; Tn 抗原 (Tn Ag);前立腺特異的膜抗原 (PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体 1 (ROR1)。 FMS 様チロシンキナーゼ 3 (FLT3);腫瘍関連糖タンパク質 72 (TAG72); CD38; CD44v6;癌胎児性抗原 (CEA);上皮細胞接着分子 (EPCAM); B7H3 (CD276);キット (CD117);インターロイキン 13 受容体サブユニット アルファ 2 (IL-13Ra2 または CD213A2)。メソテリン;インターロイキン 11 受容体アルファ (IL-11Ra);前立腺幹細胞抗原 (PSCA);プロテアーゼ セリン 21 (テスティシンまたは PRSS21);血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2);ルイス(Y)抗原; CD24;血小板由来増殖因子受容体ベータ (PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4 (SSEA-4); CD20;葉酸受容体アルファ (FRα または FR1);葉酸受容体ベータ (FRb);受容体チロシンプロテインキナーゼ ERBB2 (Her2/neu);ムチン 1、細胞表面関連 (MUC1)。上皮成長因子受容体 (EGFR);神経細胞接着分子 (NCAM);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ (FAP);インスリン様成長因子 1 受容体 (IGF-1 受容体)、炭酸脱水酵素 IX (CA1X)。エフリン A 型受容体 2 (EphA2);シアリルルイス接着分子 (sLe);ガングリオシドGM3;高分子量黒色腫関連抗原 (HMWMAA); o-アセチル-GD2 ガングリオシド (OAcGD2);腫瘍内皮マーカー 1 (TEM1/CD248)。腫瘍内皮マーカー 7 関連 (TEM7R);クローディン 6 (CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）; G タンパク質共役受容体クラス C グループ 5、メンバー D (GPRC5D)。 CD97; CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ (ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的 1 (PLAC1); globoH グリコセラミド (GloboH) の六糖部分。乳腺分化抗原 (NY-BR-1);ウロプラキン 2 (UPK2); A 型肝炎ウイルス細胞受容体 1 (HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ 3 (ADRB3);パネキシン 3 (PANX3); G タンパク質共役受容体 20 (GPR20);リンパ球抗原 6 複合体、遺伝子座 K 9 (LY6K)。嗅覚受容体 51E2 (OR51E2); TCR ガンマ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP);アンドロゲン受容体; T 細胞によって認識される扁平上皮癌抗原 3 (SART3); CD79a; CD79b; CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体 1 (LAIR1); IgA 受容体の Fc フラグメント(FCAR または CD89)。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリー A メンバー 2 (LILRA2); CD300 分子様ファミリーメンバー f (CD300LF); C 型レクチンドメインファミリー 12 メンバー A (CLEC12A);骨髄間質細胞抗原 2 (BST2); EGF 様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様 2 (EMR2)。リンパ球抗原 75 (LY75);グリピカン-3 (GPC3); Fc受容体様5 (FCRL5);免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＭＰＬ、ＣＤ３４、ＬＡＭＰ１ ＴＲＯＰ２、ＧＦＲα４、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ６、ＮＹＢＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ２００Ｒ、Ｓｌｅａ（ＣＡ１９．９；シアリルルイス抗原）；フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1/CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL11Ra、IL13Ra2、IL-17R、CD179b-IGLl1、TCRガンマデルタ、NKG2D、CD32 ( FCGR2A)、Tim1-/HVCR1、CSF2RA (GM-CSFR-alpha)、TGFbetaR2、Lews Ag、TCR-beta1 鎖、TCR-beta2 鎖、TCR-γ 鎖、TCR-δ 鎖、FITC、黄体ホルモン受容体 (LHR) 、卵胞刺激ホルモン受容体 (FSHR)、性腺刺激ホルモン受容体 (CGHR または GR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、CD99、Ras G12V、組織因子 1 (TF1)、GPRC5D、Claudin18.2 (CLD18A2 または CLDN18A.2)、P -糖タンパク質、STRAP1、Liv1、ネクチン-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル（LCCC）、TAJ/TROY、MPL（TPO-R）、KIR3DL2、CD32b、CD229、Toso、PD-1、 PD-L1、PD-L2、TNFR1、TRAIL-R1 (DR4)、TRAIL-R2 (DR5)、CTLA4、IL-36R、CD25、LAG3、VEGF-A、MASP-2、胸腺間質リンホポエチン、組織因子、IFNAR1 、IL5、IL-6、IL-12、IL-23、IL-17A、IL-13、アンジオポエチン様3、CGRP、IL-23p19、vWF、C5、IFNγ、CD4、CD8、CD7、NKp30、NKp44、 NKp46、NKG2D、PDGRFα、α4β7インテグリン、α4インテグリン、VEGF、GPIIb/IIIa PCSK9、Blys、およびBAFF-R。
態様109. D2が、多目的スイッチを発現する細胞を検出、富化および/または死滅させるために使用できる薬剤によって結合され得る、態様95に記載のポリペプチド。
態様110. 薬剤が、抗体、抗体断片、scFv、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、抗体薬物複合体、二重特異性ドメインのうちの1つまたは複数から選択される、態様109に記載のポリペプチド。抗体もしくはその断片、または細胞。
態様111. D2に結合する薬剤がインビボまたはエクスビボでのヒト臨床使用が承認されている、態様110に記載のポリペプチド。
アスペクト112. アスペクト111のポリペプチド。これは、リツキシマブ、ヘルセプチン、エンテルトゥ、エルビトラックス、アドセトリス、エンブレル、トレメリムマブ、モスネトゥズマブ、テクリスタマブ、ドナネマブ、スピソリマブ、ファーリシマブ、トスレイムカッサンマブ、トスレン科、エンブレル、トレメリムマブ、モスネチュズマブ、エンブレル、エンブレル、エンブレル、エンブレル、エンブレル、エンブレクマブ、エンブレル、エンブレキマブ、エンブレルから構成されるアスペクト111のポリペプチドです。 、タファシタマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブおよびQbend10。
態様１１３．Ｄ３ が５～１００アミノ酸長のストーク（ヒンジドメイン）配列を含む、態様９５に記載のポリペプチド。
態様１１４． 配列番号（ＰＲＴ）：７８４３～７８５０、配列番号（ＰＲＴ）：９６２５および配列番号：９６２０～９６２４によって表されるアミノ酸配列を含む、態様９５に記載のポリペプチド、または少なくとも８０を有する変異体。それに対する％相同性。
態様１１５． 配列番号７８４３～７８４９として示される配列、または配列番号７８４３～７８４９として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつ（ i) J6M0 に結合します。 (ii) ベランタマブ マフォドチンに結合し、(iii) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると生存を促進します。 (v) T 細胞または NK 細胞の表面で発現すると、ベランタマブ マフォドチンの存在下で細胞の死滅を誘導します。
態様１１６． 配列番号９６２０～９６２４として示される配列、または配列番号９６２０～９６２４として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつ（ i) QBEND10 をバインドします。 (ii) リツキシマブに結合し、(iii) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると生存を促進します。 (v) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると、リツキシマブの存在下で補体を介した細胞の死滅を誘導します。
態様117. 配列番号9625として示される配列、または配列番号9625として示される配列と少なくとも80%の同一性を有し、(i)ハーセプチンに結合するその変異体を含む、態様95に記載のポリペプチド。 ; (ii) Enhertu に結合し、(iii) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると、生存を促進します。 (v) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると、ハーセプチンまたはエネヘルツの存在下で細胞の死滅を誘導します。
態様１１８．態様 １のＳＡＲの第１および／または第２のポリペプチド鎖および／または態様９３の１つ以上のアクセサリーモジュールをコードする組換え核酸。
態様119. アクセサリーと共発現される、態様118に記載の組換えポリヌクレオチドを含む組換え発現システムであって、アクセサリーモジュールが、短縮型上皮成長因子受容体(tEGFR)、短縮型上皮成長因子受容体からなる群から選択される、組換え発現システム。 viii (tEGFRviii)、短縮型 CD30 (tCD30)、短縮型 BCMA (tBCMA)、短縮型 CD19 (tCD19)、CD34、チミジンキナーゼ、シトシン デアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン-グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ、ヒト カスパーゼ 8、ヒト カスパーゼ 9、誘導性カスパーゼ 9 (icaspase9)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ/リナマリン/グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)/インドール-3-酢酸(IAA)、ガンマ-グルタミルシステインシンテターゼ、CD20/アルファCD20、CD34/チミジンキナーゼキメラ、dox-依存性カスパーゼ-2、変異型チミジンキナーゼ (HSV-TKSR39)、AP1903/Fas システム、キメラサイトカイン受容体 (CCR)、選択マーカー、多目的スイッチ、vFLIP-K13、vFLIP-MC159、4-1BBL-CD40L 、DAP10、DAP12、NKG2C、CD94、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、FcRγ、ジヒドロキシ葉酸受容体（DHFR）、変異型DHFR、メチル化DNAタンパク質システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼII（IMDHP2）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（PAC） ）、ブラストサイジン耐性遺伝子、変異体カルシニューリン a/b（Can/b）、CNa12、CNb30、およびそれらの組み合わせ。
態様120. SARの1つまたは2つの鎖および1つまたは複数のアクセサリーモジュールをコードする組換えポリヌクレオチドが、任意の柔軟なリンカー、任意のフリン切断部位またはフリン様切断をコードするヌクレオチド配列によって連結されている、態様119に記載の組換え発現システム。サイトと切断可能なリンカー。
態様１２１．ＳＡＲ の１つまたは２つの鎖および１つまたは複数のアクセサリーモジュールをコードする組換えポリヌクレオチドが、ｉ）１つまたは複数のプロモーターを使用して発現される、態様１２０に記載の組換え発現系。 ii) 1 つ以上の内部リボソーム侵入部位 (IRES)。 iii) 1つまたは複数の切断可能なリンカー; iv) i、ii、iii の任意の組み合わせ。
態様１２２．ａ ）プロモーターが、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター（配列番号８５０５）、ＥＦＳ２プロモーター（配列番号８５０６）、ＲＳＶプロモーター（配列番号８５０６）である、態様１２１に記載の組換え発現系。 ：８５０７）、またはｍｕｔＲＳＶプロモーター（配列番号８５０８）、またはそれと７０％の同一性を有する配列； ｂ）ＩＲＥＳは、Ｋ－ＩＲＥＳ（配列番号８５０４）またはそれと７０％の同一性を有する配列である。
態様123. 態様118の組換えポリヌクレオチドおよび態様119の組換え発現系を含む少なくとも1つのベクターであって、ベクターがDNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、スリーピングビューティートランスポゾンベクター、ピギーバックトランスポゾンベクター。
態様１２４．１ つ以上の構成的プロモーターまたは調節可能なプロモーターを含む、態様１２３に記載のベクター。
態様１２５． プロモーターが、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーター（配列番号８５０５）、ＥＦＳ２プロモーター（配列番号８５０６）、ＲＳＶプロモーター（配列番号８５０７）から選択される、態様１０４に記載のベクター。 ）、またはｍｕｔＲＳＶプロモーター（配列番号８５０８）、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１ａプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ＭＳＣＶ ＬＴＲプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または合成Ｎｏｔｃｈ（ＳｙｎＮｏｔｃｈ）プロモーター。
態様126. ベクターがインビトロ転写ベクターであるか、またはベクターがポリ(A)テールもしくは3'UTRをさらに含む、態様123に記載のベクター。
態様127. 態様 1の少なくとも1つのSARポリペプチドまたはヘテロ二量体、態様118の核酸、任意のアクセサリーモジュール、態様119の組換え発現系、および態様123のベクターを含む、エフェクター細胞または幹細胞。
態様128. 細胞が複数の一本鎖または二本鎖SARポリペプチドを含む、態様127に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１２９ 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つの単鎖または二本鎖ＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる抗原を標的とする、態様１２８に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３０． 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが同じ抗原を標的とする、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３１． 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが、抗原に対して少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる結合親和性を含む、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３２． 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる天然受容体またはシグナル伝達アダプターを含む、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３３． 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、サイトゾルドメインを有する、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３４． 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが活性化受容体であり、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドが阻害性受容体である、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３５． 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの２つ以上のＳＡＲポリペプチドが活性化受容体であるか、または複数のＳＡＲポリペプチドのうちの２つ以上のＳＡＲポリペプチドが阻害性受容体である、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様１３６ 複数のＳＡＲポリペプチドのうちの２つ以上のＳＡＲポリペプチドが、異なるシグナル伝達アダプターを動員し、および／または異なるシグナル伝達経路を活性化する、態様１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
態様137. エフェクター細胞が、α/β T細胞、γ/δ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、T幹細胞、Treg細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞、iNKT（先天性ナチュラルキラー細胞）、NK細胞、g-NK細胞、記憶様NK細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（CIK）、iPSC 、改変型HLA欠損iPSC、iPSC由来NK細胞、iPSC由来T細胞、B細胞、マクロファージ/単球、顆粒球、樹状細胞、不死化細胞株、不死化NK細胞株、NK92細胞株、NK92MI細胞株、ＹＴＳ細胞、またはそれらの誘導体。
態様138. 複数の多様なSARポリペプチドを含む、態様127～137のいずれか1つのエフェクター細胞の集団。
態様１３９ 複数の多様なＳＡＲポリペプチドが異なる配列を含むが、同じ標的抗原または異なる抗原に結合する、態様１３８に記載の免疫細胞またはエフェクター細胞の集団。
態様140. 態様127のSAR発現エフェクター細胞を作製する方法であって、態様123の少なくとも1つのベクターまたは態様118の少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドをエフェクター細胞、細胞株、造血幹細胞、 SARポリペプチドおよび任意のアクセサリーモジュールが発現されるような条件下で、エフェクター細胞を生じさせることができる前駆細胞またはIPSC。
態様141. エフェクター細胞が、機能的TCR、機能的HLA、β2マクログロブリン、TAPI、TAP2、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、 TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、または染色体6p21領域内の任意の遺伝子;および／またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ９４、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、 PDL1、A2AR、Fc受容体、エンゲージャー、または二重特異性または多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体。
態様142. 第1の内因性TCRサブユニットおよび/または第2の内因性TCRサブユニットの発現を遮断または減少させるようにエフェクター細胞が修飾されている、態様127に記載のエフェクター細胞。
態様１４３．Ｔ 細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δを発現せず、非ＴＣＲ抗原認識ドメインを含む組換え二本鎖ＳＡＲを発現するように組換え発現によって修飾されている、態様１２７に記載のエフェクター細胞。前記細胞は、ＣＤ３鎖ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３εを発現し、ＣＤ３鎖およびＳＡＲは、細胞の表面に位置する機能的ＣＤ３－ＳＡＲ複合体を形成する、Ｔ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を含む、Ｔ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を含む。
態様１４４．Ｔ 細胞受容体（ＴＣＲ）を発現せず、および／またはＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δを発現せず、細胞にとって外因性の組換え二本鎖ＴＣＲを発現するように組換え発現によって修飾されている、態様１２７に記載のエフェクター細胞、前記組換え二本鎖ＴＣＲは、ａ）ＶαおよびＶβドメイン、またはｂ）ＶγおよびＶδドメインを含むＴＣＲ抗原認識ドメインと非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を含むＳＡＲである。
態様145. 非T細胞受容体に由来する第1のMAMおよび第2のMAMを含む非T細胞受容体モジュール(NTCRM)に任意のリンカーを介して作動可能に連結されたTCR抗原認識モチーフを含む、態様144に記載のエフェクター細胞。 ／またはシグナル伝達アダプターを含み、さらに任意の細胞質共刺激ドメインを含む。
態様１４６．ＮＫ 細胞、ｇ－ＮＫ細胞、記憶様ＮＫ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、ｉＰＳＣ、修飾ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣからなる群から選択される、態様１４３～１４５のエフェクター細胞。 －由来ＮＫ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、マクロファージ／単球、樹状細胞、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはＣＤ３ε鎖の１つ以上が欠損しているＴ細胞、不死化細胞株、不死化ＮＫ細胞株、ＮＫ９２細胞株、ＮＫ９２ＭＩ細胞株、ＹＴＳ細胞またはそれらの誘導体。
態様１４７． インビトロ転写されたＲＮＡまたは複数のＲＮＡまたは合成ＲＮＡまたは複数のＲＮＡを細胞または細胞の集団に導入することを含む、態様１２７のエフェクター細胞を生成する方法であって、前記ＲＮＡまたは複数のＲＮＡが態様１１８の組換えポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含む、方法。
態様148. 態様 127～146のいずれか1つの免疫エフェクター細胞を生じさせることができる有効量の免疫エフェクター細胞または幹細胞を対象に投与することを含む、対象に抗疾患免疫を提供する方法であって、細胞は、自己Ｔ細胞もしくは同種Ｔ細胞、または自己ＮＫ細胞もしくは同種ＮＫ細胞、または自己マクロファージもしくは同種マクロファージ、または自己顆粒球もしくは同種顆粒球、または自己樹状細胞もしくは同種異系細胞である。樹状細胞、エフェクター細胞を生じさせることができる自己造血幹細胞もしくは同種造血幹細胞、または自己もしくは同種異系iPSC。
態様１４９ 同種異系Ｔ、ＮＫ、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞、造血幹細胞またはｉＰＳＣが、機能的ＴＣＲ、機能的ＨＬＡ、β２マクログロブリン、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、 LAG3、TIM3、TIGIT、または染色体 6p21 領域内の任意の遺伝子。および／またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ９４、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、 PDL1、A2AR、Fc受容体、エンゲージャー、または二重特異性または多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体。
態様１５０． 標的抗原を提示する標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を態様１２７に記載のエフェクター細胞と接触させることを含み、ＳＡＲが標的抗原に特異的に結合する方法。
態様151. 標的細胞を、SAR発現エフェクター細胞上で発現される1つまたは複数の抗原および標的細胞上で発現される1つまたは複数の抗原に結合する1つまたは複数の薬剤と接触させるステップをさらに含む、態様150に記載の方法。
態様１５２． 薬剤が、ＳＡＲ発現エフェクター細胞を、薬剤によって標的化される抗原を発現する標的細胞にリダイレクトすることができる、態様１５１に記載の方法。
態様153. 作用 物質が、抗体、抗体、抗体、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン断片、自律的抗原結合ドメイン、二重特異性エンゲージャー、二重特異性T細胞エンゲージャーである、態様151に記載の方法。 BiTE）、二重特異性キラーエンゲージャー（BiKE）、三重特異性エンゲージャー、三重特異性T細胞エンゲージャー、または三重特異性キラーエンゲージャー（ TRiKE）、またはそれらの組み合わせ。
態様154. エフェクター細胞が、1つまたは複数の天然受容体の細胞外ドメインを含むSARを発現する、態様151に記載の方法。
態様155. SARが、CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、 KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD 81、 CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、および CD161。
態様１５６． 薬剤が、抗体、抗体、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン断片、自律的抗原結合ドメイン、二重特異性エンゲージャー、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、天然に存在する受容体または変異体の1つまたは複数の細胞外ドメインに特異的に結合できる少なくとも1つのドメインを含む、二重特異性キラーエンゲージャー(BiKE)、三重特異性エンゲージャー、三重特異性T細胞エンゲージャー、または三重特異性キラーエンゲージャー( TriKE)、またはＳＡＲを含むその断片。
態様１５７． 作用物質が以下に特異的に結合する、態様１５１または１５６に記載の方法。 ａ）ＳＡＲを含む１つ以上の天然受容体またはその変異体もしくは断片の細胞外ドメイン；および/または b) SAR の一部ではない 1 つまたは複数の天然に存在する受容体の細胞外ドメイン。
態様１５８． 薬剤が、１つ以上の天然に存在する共刺激受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することができる、態様１５１または１５７に記載の方法。
態様１５９． 薬剤が、１つ以上の天然に存在する活性化受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することができる、態様１５１または１５７に記載の方法。
態様１６０． 薬剤が、共刺激ドメインを含むＳＡＲの細胞外ドメインに特異的に結合することができる、態様１５１または１５７に記載の方法。
態様１６１． 薬剤が、活性化ドメインおよび共刺激ドメインを含むＳＡＲの細胞外ドメインに特異的に結合することができる、態様１５１または１５７に記載の方法。
態様162. SARがFc受容体の細胞外ドメインを発現し、薬剤が抗体、抗体、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン断片、自律的抗原結合ドメイン、 Ｆｃドメインを含む、二重特異性エンゲージャー、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性エンゲージャー、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）。
態様163. Fc受容体が、CD16A、CD16B、CD64、CD32またはその変異体もしくは断片のうちの1つまたは複数である、態様162に記載の方法。
態様164. 標的抗原が、表Bに列挙される抗原の1つまたは複数である、態様151に記載の方法。
態様165. 生存を調節する薬剤と組み合わせて、合成抗原受容体(SAR)分子を含む、態様123～146のいずれかに記載の免疫エフェクター細胞の有効量を対象に投与する、態様148または149に記載の方法。免疫細胞の増殖、分化、および／または有効性を決定する薬剤であり、薬剤は以下の１つまたは複数から選択される。ａ）プロテインホスファターゼ阻害剤。 b) キナーゼ阻害剤。 c) Lckキナーゼ阻害剤。 ｄ）ＳＡＲ発現エフェクター細胞上に発現される１つ以上の抗原および標的細胞上に発現される１つ以上の抗原に結合する薬剤； e) サイトカイン; f)免疫阻害分子の阻害剤。 g) TREG細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤。 ｈ）ＳＡＲ修飾細胞の増殖および／または存続を増加させる薬剤； i) ケモカイン; j) SARの発現を増加させる薬剤； k) SARの発現または活性の調節を可能にする薬剤; ｌ） ＳＡＲ修飾細胞の生存および／または持続の制御を可能にする薬剤； m) SAR 修飾細胞の副作用を制御する薬剤。 n) Brd4阻害剤。 o) 疾患部位に治療薬または予防薬を送達する薬剤。 ｐ）ＳＡＲが向けられる標的抗原の発現を増加させる薬剤； q) SAR と同時発現される多目的スイッチに結合するエージェント。 ｒ）アデノシンＡ２ａ受容体アンタゴニスト。
態様166. 態様1のSARポリペプチド分子、態様118のポリヌクレオチド、態様119のベクター、態様127～146のいずれか1つの細胞、および/または態様151および165の薬剤を含む医薬組成物、薬学的に許容される担体。
態様167. 有効量の態様166に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における標的抗原関連疾患を予防または治療する方法。
態様168. 標的抗原関連疾患が、増殖性疾患、前癌状態、癌、免疫疾患、アレルギー性疾患、変性疾患、感染症、および癌に関連しない適応症。
態様１６９． 癌が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、B細胞性前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛性リンパ腫細胞性白血病、小細胞性または大細胞性濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALT リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫 (PEL)、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストローム マクログロブリン血症、または前白血病。
態様１７０． 癌が、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、がん副甲状腺のがん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、新生物中枢神経系（CNS）、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、メルケル細胞がん、類表皮がん、扁平上皮がん、T細胞リンパ腫、環境誘発がん、前記癌の組み合わせ、および前記癌の転移病変。
態様１７１． 疾患が、コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２およびその変異体、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ CMV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、BKウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス8インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、MERSおよびSARSコロナウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、デングウイルス、西部ナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、ジカウイルス、RSV、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘・帯状疱疹ウイルス、HIV-1、HTLV1、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ニパおよびリフトバレー熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、または結核菌、非定型抗酸菌種、ニューモシスチス・ジロベシ、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ムコールの感染に関連している、またはカンジダ。
態様１７２． 疾患が、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、星本甲状腺炎、ＳＬＥ、サルコイドーシス、強皮症、混合性結合組織病、移植片対宿主病、またはアルツハイマー病。
態様１７３． ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の表面上の多目的スイッチの発現を検出するステップを含む、態様９３に記載のＳＡＲをコードするベクターおよび多目的スイッチの形質導入効率を調べるための方法。
態様１７４． 態様９５のＳＡＲを発現する細胞を選択するための方法であって、以下の工程を含む方法： ｉ）態様１４０によるベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の表面上の多目的スイッチの発現を検出する工程； (ii)多目的スイッチを発現していると識別されたセルを選択する。
態様１７５．ＳＡＲ を発現する細胞が濃縮された精製細胞集団を調製する方法であって、態様１７４に記載の方法を使用して細胞集団からＳＡＲを発現する細胞を選択するステップを含む、方法。
態様１７６．以下のステップを含む、態様１７５に記載の方法：（ｉ）生体 外で患者から単離された細胞集団に、態様１４０に記載のベクターを形質導入またはトランスフェクトする工程； （ｉｉ）側面１７４に記載の方法により、形質導入／トランスフェクトされた細胞集団からＳＡＲを発現する細胞を選択するステップ。
態様１７７ 態様９４～１１７の多目的スイッチポリペプチドを発現する細胞が濃縮され、従ってＳＡＲを発現する細胞が濃縮された細胞集団。
態様１７８．細胞 表面における態様１７３のいずれかに記載の多目的スイッチポリペプチドの発現を検出するステップを含む、インビボで形質導入された細胞を追跡するための方法。
態様１７９ 多目的スイッチを含むアクセサリモジュールに結合する薬剤に細胞を曝露するステップを含む、態様１２７に記載のセルを削除する方法。
態様１８０．ａ ）多目的スイッチが配列番号７８４３～７８５０の配列またはそれと８０％相同性を有する変異体を含み、薬剤がベランタマブマフォドチンである、態様１７９に記載の方法。 ｂ）多目的スイッチは、配列番号９６２０～９６２４の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はリツキシマブまたはＣＤ２０抗体である。 ｃ）多目的スイッチは、配列番号９６２５の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はハーセプチン、エンヘルツ、またはＨｅｒ２標的化抗体である。 ｄ）多目的スイッチは配列番号７８５０の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はアドセトリスまたはＣＤ３０標的化抗体である。
態様181. 態様1の少なくとも1つのSARポリペプチド分子、態様93のアクセサリーモジュール、態様94の多目的スイッチ、態様118の組換えポリヌクレオチド、態様119の組換え発現システム、態様119のベクターを含むキット。態様１２３または態様１２７の細胞、態様１５１および／または態様１６５の薬剤、ならびに態様１６６の組成物。
態様１８２．ａ ） 生体外で実施される、態様１４０に記載の方法。 b)生体内;または c) ex vivoとin vivoの両方。
態様１８３． 少なくとも２つの鎖を含む、態様１に記載のＳＡＲであって、ａ）第１のポリペプチド鎖が、ＶαまたはＶγドメインを含む第１の抗原結合ドメインおよび第１の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含み； ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ＶβまたはＶδドメインを含む第２の抗原結合ドメインおよび第２の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含む。第１の抗原結合ドメインのＶαまたはＶγドメインと第２の抗原結合ドメインの相補的ＶβまたはＶδドメインは、標的抗原に特異的に結合するＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールを形成し；第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員できる非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を形成する。
態様184. 第1のポリペプチド鎖が第1の抗原結合ドメインと第1のMAMの間に第1のペプチドリンカーをさらに含み、第2のポリペプチド鎖が第2の抗原結合ドメインの間に第2のペプチドリンカーをさらに含む、態様183に記載のSAR。そして2番目のMAM。
態様１８５． 第１および／または第２のペプチドリンカーが、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を個別に含む、態様１８４に記載のＳＡＲ。
態様１８６． 第１のポリペプチドが、第１のＭＡＭを含む第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に第１のサイトゾルドメインをさらに含む、態様１８３に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチドは、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に第２のサイトゾルドメインをさらに含む。
態様１８７． 第１のポリペプチド鎖が、第１のＭＡＭの第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側にある共刺激ドメイン配列を含む第１のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含み、態様１８３に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチド鎖は、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に共刺激ドメイン配列を含む第２のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含む。
態様188. 共刺激ドメインがCD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEMもしくはICOSから選択される、態様187に記載のSAR、または変異体またはその断片。
態様１８９． 第１および／または第２のＭＡＭおよびＮＴＣＲＭが、非Ｔ細胞の膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメイン、および／または任意の細胞外ドメインから構成される、態様１８３に記載のＳＡＲ。受容体および/またはシグナル伝達アダプター。
態様１９０．ａ ）非Ｔ細胞受容体が、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１からなる群から選択される、態様１８９に記載のＳＡＲ。 、KIR3DL2、KIR3DL4、 KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5 、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＲＴＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ、ＩＬＴ２、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、前述のいずれかの変異体およびその断片；および／またはｂ）シグナル伝達アダプターは、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、前述のいずれかの変異体、およびそれらの断片からなる群から選択される。
態様１９１． 非Ｔ細胞において発現されると、それにＴ細胞受容体様の標的結合認識および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターの動員および／または少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性化を付与する、態様１８３に記載のＳＡＲ。 。
態様１９２．ａ） ＳＡＲ発現エフェクター細胞を含む医薬組成物の投与による毒性を予防または逆転させるために、対象に治療有効量のチロシンキナーゼ阻害剤をさらに投与する、態様１６７に記載の方法。および／またはｂ）ＳＡＲ発現エフェクター細胞の枯渇を防止または逆転させる。
態様１９３ チロシンキナーゼ阻害剤がＬｃｋ阻害剤である、態様１９２に記載の方法。
態様１９４． チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブまたはポナチニブである、態様１９２に記載の方法。
態様195. 治療により、対象におけるT細胞によるIL-2の分泌が増加する、態様192に記載の方法。
態様１９６． 治療により対象におけるＴ細胞のアポトーシスが減少する、態様１９２に記載の方法。
態様197. 治療により、PD-1、TIM-3、およびLAG-3からなる群から選択される少なくとも1つのT細胞枯渇マーカーの発現が減少する、態様192に記載の方法。
態様198. 治療によりCD62LまたはCCR7の発現が増加する、態様192に記載の方法。
態様１９９ 複数サイクルの治療が対象に施される、態様１９２に記載の方法。
態様２００． チロシンキナーゼ阻害剤が断続的に投与される、態様１９２に記載の方法。
態様２０１． チロシンキナーゼ阻害剤が、少なくとも部分的なＴ細胞機能を回復するのに十分な期間投与され、その後中止される、態様１９２に記載の方法。
態様２０２． チロシンキナーゼ阻害剤が経口投与される、態様１９２に記載の方法。
態様２０３． 対象に投与される遺伝子操作されたＴ細胞に関連する毒性がサイトカイン放出症候群である、態様１９２に記載の方法。
態様２０４． 対象に投与される遺伝子操作されたＴ細胞に関連する毒性がオンターゲットオフ腫瘍毒性またはオフターゲットオフターゲット腫瘍毒性である、態様１９２に記載の方法。
態様２０５．対象 がヒトである、態様１９２に記載の方法。
態様２０６．Ｔ 細胞の標的認識特性および機能を有するＴ細胞ではない細胞であって、細胞ａ）ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、 TCRγ、TCRδ、またはpreTCR;および／またはｂ）ＣＤ３ε、ＣＤ３γおよび／またはＣＤ３δの群から選択される１つ以上のＣＤ３鎖の発現を欠く；および/または c) 機能的な TCR モジュール (TCRM) を形成する能力が欠如している。
態様２０７．ＴＣＲＭ を含み、Ｔ細胞の細胞標的認識特性を与える二重鎖受容体を発現する、態様２０６に記載の細胞。
態様２０８． 標的抗原に特異的に結合するＴＣＲ－Ｆｖ抗原結合モジュールを形成することができる受容体を細胞表面上に発現することができる、態様２０７に記載の細胞。
態様２０９．ＴＣＲ －Ｆｖを構成する２つの可変ドメインが単一のポリペプチド鎖の一部ではない、態様２０８に記載の受容体。
態様２１０．ＴＣＲ －Ｆｖを構成する２つの可変ドメインが、ａ）ＶαおよびＶβ、またはｂ）ＶγおよびＶδである、態様２０６に記載の細胞。
態様２１１． 標的抗原を提示する標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を態様２０６に記載のエフェクター細胞と接触させることを含み、細胞が標的抗原を特異的に認識する方法。
態様２１２． その標的ペプチド抗原を発現する標的細胞を死滅させることができる、態様２１０に記載の細胞。
態様２１３． 態様２０６の細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
態様２１４． 有効量の態様２０６の細胞または態様２１３の医薬組成物を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における標的抗原関連疾患を予防または治療する方法。
態様２１５．Ｔ 細胞受容体様抗原認識を有する態様２０６の非Ｔ細胞を作製する方法。
態様２１６．ＴＣＲ 様抗原認識を有する非Ｔ細胞が、ａ）ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδおよびプレＴＣＲα鎖、またはｂ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の二量体、またはｃ）を発現しない、態様２１５に記載の方法。 ＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖の二量体、またはｄ）プレＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の二量体。
態様２１７．ａ ）ＴＣＲ鎖の外因性発現、またはｂ）ＣＤ３ε、ＣＤ３γおよびＣＤ３δの群から選択されるＣＤ３鎖の外因性発現を含まない、態様２１５に記載の方法。
態様２１８． 単一の遺伝子改変を含む、態様２１５に記載の方法。
態様２１９． 二本鎖受容体をコードする１つまたは２つの組換えポリヌクレオチドの導入を含む、態様２１５に記載の方法。
態様２２０．ＮＫ 細胞、ｉＮＫＴ（先天性ナチュラルキラー細胞）、ｇ－ＮＫ細胞、記憶様ＮＫ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、ｉＰＳＣ、改変型ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣである、態様２１０に記載の細胞。 －由来ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、顆粒球、樹状細胞、不死化細胞株、不死化ＮＫ細胞株、ＮＫ９２細胞株、ＮＫ９２ＭＩ細胞株、ＹＴＳ細胞、ＮＫＧ細胞株、またはそれらの誘導体。
態様２２１．ＩＩ 型膜貫通タンパク質と、Ｎ末端シグナルペプチドを有するＩ型膜貫通タンパク質または分泌タンパク質との間の単離された融合タンパク質。
態様222. I型膜貫通タンパク質またはN末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の細胞外ドメインと融合したII型タンパク質のサイトゾル、膜貫通および部分的または全体の細胞外ドメインを含む、態様221に記載の単離された融合タンパク質。 。
態様２２３．Ｉ 型膜タンパク質またはＮ末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の全部または一部の細胞外ドメインをコードするポリペプチドのＮ末端が、Ｃ末端シグナルペプチドに機能的に連結されている、態様２２１に記載の単離された融合タンパク質。 N 末端から C 末端の方向にある II 型タンパク質の末端。
態様２２４．ａ） Ｎ末端シグナルペプチドを有するＩ型膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端を３’にインフレームで融合させるステップを含む、態様２２１に記載の融合タンパク質を作製する方法。 II型タンパク質の部分的または全体の細胞外ドメインをコードするヌクレオチドの末端； ｂ）融合タンパク質の発現を可能にするために、適切な細胞に組換えポリヌクレオチドを導入するステップ。
態様２２５． 融合タンパク質が、特定の抗原を標的とするキメラ抗原受容体または合成抗原受容体をコードする、態様２２１に記載の単離された融合タンパク質。
態様２２６． 態様２２４によって作製され、態様２２１の融合タンパク質を発現する細胞、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
態様２２７。 態様２２６の組成物を使用する治療方法。
態様228. 配列番号1600～2328、4851～5129、5451～6282、7160～7170、7601～7747、8768～9602、10817～からなる群から選択される配列を含む合成免疫受容体をコードする組換えポリヌクレオチド。 １０８３０、または上記のいずれか１つに記載の合成免疫受容体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列。
態様229. 配列番号3994～4722、5151～5429、6283～7114、7852～7862、8293～8439、9860～10694からなる群より選択される合成免疫受容体ポリペプチドをコードするアミノ酸配列、または配列番号:上記のいずれか１つに記載の合成免疫受容体をコードするアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する。
例
異なる細胞表面および細胞内抗原を標的とする異なる構築物の細胞毒性を測定するためにルシフェラーゼ（例えば、 GLucまたはNLuc）を発現するように操作された細胞株を表Aに提供する。これらの実験で使用した細胞株、細胞株上の標的抗原、およびそれらの増殖培地を以下の表Aに示します。細胞は、5% CO 2加湿インキュベーター内で 37℃で培養されました。細胞株は、ATCC、NIH AIDS 試薬プログラムから入手したもの、または研究室で入手したものです。
NFAT 依存性 EGFP (または GFP) レポーター遺伝子を操作して JNG と名付けられた Jurkat 細胞株 (クローン E6-1) は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の Arthur Weiss 博士から寄贈されたもので、CAR シグナル伝達を研究することが記載されています (( Wu, CY et al. , Science 350:293-302,2015). Jurkat 細胞は 10% FBS を補充した RPMI-1640 培地で維持しました. NK92MI 細胞は ATCC から入手し、提供された説明書に従って維持しました. NK92 細胞はT2 細胞も ATCC から入手し、20% FBS および 200 U/mL の hIL2 を含む RPMI 培地で維持しました。
SARをコードするレンチウイルスベクターの生成
SAR 構築物は、レンチウイルス、レトロウイルス、またはスリーピング ビューティーのトランスポゾン ベクターでクローン化されました。例示的なベクターは配列番号１～６に提供される。本開示のＳＡＲを生成するために使用できる他のベクターは当技術分野で知られている。 psPAX2ベクターは Didier Trono から贈られたものです (Addgene プラスミド # 12260) 。 ｐＬＰ／ＶＳＶＧエンベローププラスミドおよび２９３ＦＴ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。レトロウイルス転移ベクター MSCVneo、MSCVhygro、および MSCVpac とパッケージングベクター pKAT は以前に記載されています (PCT/US2018/53247)。 SAR（例えば、第2世代CAR、SIR、Ab-TCRおよびTFPなど）の生成方法、GGS-NLuc融合タンパク質の生成および使用、およびルシフェラーゼ（例えば、 GLucおよびLuc146-）の生成および使用。 1H2) マタドールアッセイを使用した細胞毒性の測定のためのレポーター細胞株が記載されています (PCT/US2017/024843、PCT/US2017/025602、PCT/US2017/052344、PCT/US2017/064379 および PCT/US2018/53247)。これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
SAR の抗原結合ドメインを含む配列は、コドン最適化され、公的に入手可能なソフトウェア (例: ThermoFisher または IDT) および商用ベンダー (例: IDT) を使用して人工的に合成されます。得られた断片は PCR 増幅され、標準的な分子生物学技術を使用して、さまざまな SIR バックボーンを含むさまざまなベクターにクローン化されます。一般に、SAR 構築物は通常、レンチウイルス ベクター内でクローン化されます。 SIR コンストラクトの配列は自動配列決定を使用して確認されます。
例示的なＳＡＲ構築物コード化ベクターは、ｐＣＣＬｃ－ＭＮＤＵ３－Ｎｈｅ－ＣＤ８ＳＰ－Ｒ１－ＮＹ－ＥＳＯ－ＩＧ４－Ｖｂ－Ｘｈｏ－ＴＣＲβＥＣＤ－Ｂａｍ－ＣＤ３ｚＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ－Ｆ－Ｐ２Ａ－Ｓｐｅ－ＳＰ－Ｂｓｔ－ＮＹ－ＥＳＯ－ＩＧ４である。 -Va-Mlu-TCRαECD-Kpn-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-Xba-PAC-Sal-ΔWPRE (配列番号9366)。この構築物は、pCCLc-MNDU3-delta-WPRE レンチウイルス ベクター バックボーン (配列番号 6) にクローン化されます。ベクターは、CD8シグナルペプチド（配列番号31）、EcoRI部位、NY-ESOを標的とするTCR （IG4）のVβ/Vbドメインを含むヌクレオチドを含むSAR構築物の発現を駆動するMNDU3プロモーターを含む。 -1 (配列番号: 966)、Xho I 部位、TCRβECD リンカー (または TCRβ-Ig3; 配列番号: 1166)、BamH I 制限部位、CD3zECDTMCP-opt シグナル伝達鎖 (配列番号: 1089)ヒト CD3z の細胞外、膜貫通および細胞質ドメイン、フリン切断部位、P2A 切断可能リンカー、Spe I 制限部位、シグナルペプチド、Bst I 制限部位、NY-ESO を標的とする TCR (IG4) の Vα/Va ドメイン-1ペプチド/HLA-A2 (配列番号966)、 Mlu I部位、TCRαECDリンカー(またはTCRa-Ig3; 配列番号1168)、Kpn I制限部位、第2のCD3zECDTMCP-opt2シグナル伝達モジュール(配列番号１０８１６）は、ヒトＣＤ３ｚの細胞外、膜貫通および細胞質ドメイン、フリン切断部位、Ｆ２Ａ切断可能リンカー、Ｘｂａ Ｉ制限部位、プロモマイシン耐性（ＰＡＣ）カセットおよびＳａｌ Ｉ制限部位を含む。発現カセットには多くの便利な制限部位があり、抗原結合ドメイン断片 ( Vb 、Va、vL、vH ドメインなど)、リンカー ( TCRβECD 、TCRαECD、IgCL、IgG-CHI など)、またはシグナル伝達鎖 (例: CD3zECDTMCP-opt および opt2) を切り取って、別のモジュールと置き換えることができます。したがって、当業者は、このベクターおよび抗原結合ドメイン（例えば、抗体のvLおよびvHドメイン）の配列を使用して、他の任意の新しい抗原を標的とし、異なるリンカーおよびシグナル伝達鎖を含むSARを生成することができる。
レンチウイルスおよびレトロウイルスベクター
レンチウイルスは、本質的に以前に記載されているように（Natarajan et al、Scientific Reports、10:2318）、 PCT / US2018/53247。 293FT細胞を10％FCSを含むDMEM（本明細書ではDMEM-10と呼ぶ）中で増殖させた。トランスフェクションの約 48 ～ 72 時間後、すべての培地を収集、プールし、1000 rpm で 1 分間遠心分離して、細胞破片および非接着細胞を除去しました。無細胞上清を0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した。場合によっては、4℃、18500 rpmで2時間の遠心分離によって上清をさらに濃縮しました。ウイルスペレットをXVIVO培地に初期容量の1/10で再懸濁しました。ウイルスは、標的細胞に感染させるために新鮮な状態で使用されるか、アリコートに分けて -80°C で凍結保存されました。
T細胞、NK細胞、PBMCの感染
軟膜細胞は、ロサンゼルス小児病院の血液銀行から健康な匿名化された成人ドナーから入手し、Ficoll-Hypaque 勾配遠心分離によって末梢血単核球 (PBMC) を分離するために使用されました。 ＰＢＭＣは、そのまま使用するか、または製造業者の指示に従って磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＴ細胞またはＮＫ細胞を単離するために使用した。 ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＣＤ３抗体、１０ｎｇ／ｍｌのＣＤ２８抗体および１００ＩＵの組換えヒト－ＩＬ２で置き換えたＸＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。細胞は、5% CO2 加湿インキュベーター内で 37°C で培養されました。レンチウイルスベクターによる感染の前に、細胞を上記の培地中で1日間活性化した。一般に、初代細胞（例えば、 T細胞）は、午前中にスピン感染（ 8μgの存在下でXVIVO培地に再懸濁された濃縮ウイルス300μlを用いて、1800rpm、 37 ℃で90分間）を使用して感染させた。 /mlのPolybrene(R) (Sigma、カタログ番号H9268) 培地を夕方に交換し、感染をさらに2日間繰り返し、合計3回の感染を行った。3回目の感染後、細胞をペレット化し、新鮮な溶液に再懸濁した。 10ng/ml CD3 抗体、10ng/ml CD28 抗体および 100 IU 組換えヒト IL2 を含み、それぞれの抗生物質 (指示がある場合) を補充した XVIVO 培地を、特に指示がない限り、選択のために細胞培養フラスコに入れます。薬剤選択を使用しない場合は培地に 10 ～ 15 日間、薬剤選択を使用する場合には 20 ～ 30 日間培養します。JNG および癌細胞株の感染では、約 500,000 個の細胞を 2 ml の未濃縮ウイルスで感染させました。上清をポリブレン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号． H9268）。翌朝、細胞をペレット化し、必要に応じてそれぞれの抗生物質を含む培地に再懸濁し、選択のために細胞培養フラスコに入れました。初代NK細胞をNK活性化ビーズ(Miltenyi Biotech)で24～96時間刺激した後、ポリブレン(登録商標)を含まない濃縮レンチウイルスベクターで感染させた。分析前に、細胞をIL-2含有NK培地中で増殖させた。
健康なドナーからの血液を使用して、NK 細胞分離キット (Miltenyi) を使用して NK 細胞を分離しました。 NK92細胞はATCCから入手した。 NK初代細胞およびNK92細胞は、20%ウシ胎児血清、0.2mMイノシトール、0.1mM 2-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、1.5g/L重炭酸ナトリウム、 0.02mM葉酸。 NK92細胞については、培地に200 IU/mlのIL2をさらに補充した。 NK初代細胞を感染前に7日間培養し、500μL/mlのIL2で活性化した。レンチウイルス感染は、6ウェルプレートでのスピン感染により濃縮されたレンチウイルス上清を用いて行われました。初代NK細胞の場合、約500 IU/ml IL2を補充し、ポリブレンを含まない500μlの濃縮ウイルスを感染させた1.5ml培地中の400万個のNK細胞。 NK92細胞については、6μg/mlのポリブレンを使用した。プレートを2,800 rpmで90分間、32 ℃で5時間遠心分離しました。 ５時間後に培地を交換し、翌日感染を繰り返した。
本質的に、レンチウイルスベクター産生について上記したのと同様の手順を、レトロウイルスベクターの生成に使用した。ただし、293FT細胞を、一般に、10μgのレトロウイルス構築物、4μgのレトロウイルス構築物を使用して、10mlのDMEM-10培地中の10cm組織培養プレートでトランスフェクトした。 pKATおよび2μgのVSVGプラスミド。ウイルスの収集と標的細胞の感染は、基本的にレンチウイルスベクターについて上述したように実施した。
抗体、ペプチド、薬物
NY-ESO1 (配列番号:10880)、MAGE-A3-270-270 (配列番号:10878)、およびMAGE-A3-112-120 (配列番号:10879)ペプチドは、Genscriptによって合成された。ジギトニンはSigma から購入し (カタログ番号 D141)、DMSO で 100mg/ml のストック溶液を作成しました。 1 mg/ml の希釈ストックを PBS で作成しました。細胞溶解に使用したジギトニンの最終濃度は、別段の記載がない限り、30μg/mlであった。
エリサ
市販の ELISA を使用して、特定の標的細胞株と 24 ～ 96 時間共培養した CAR 発現 Jurkat-NFAT-GFP エフェクター細胞または T 細胞の細胞培養上清中のヒト IL2、IFNγ、IL6、および TNFα を測定しました。 R&D Systems (ミネソタ州ミネアポリス) および BD Biosciences のキットを使用し、製造元の推奨に従ってください。
SARの発現を検出するためのFACS解析
マウス抗ヒトｃ－Ｍｙｃ ＡＰＣ結合モノクローナル抗体（カタログ番号ＩＣ３６９６Ａ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。ビオチン化プロテイン L は GeneScript (ニュージャージー州ピスカタウェイ) から購入し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 1 mg/ml に再構成し、4℃で保存しました。 ストレプトアビジン-APC (SA1005) は ThermoFisher Scientific から購入しました。 APC 標識 NY-ESO-1/HLA-A2 および MAGE-A3 (270-279)-HLA-A2 四量体は、エモリー大学の NIH 四量体施設から入手しました。それらは、 NY-ESO1 (配列番号: 10880) および MAGE-A3-270-279 (配列番号: 10878) ペプチドを標的とします。
四量体を使用した SAR の検出では、1 × 10 6細胞を収集し、4% ウシ血清アルブミン (BSA) 洗浄バッファーを含む 3 ml の氷冷 1 × PBS で 3 回洗浄しました。洗浄後、細胞を、10μlのAPC結合四量体を含む氷冷洗浄緩衝液0.1mlに再懸濁し、暗所で1時間インキュベートし、続いてFACSによる分析前に氷冷洗浄緩衝液で2回洗浄した。
プロテイン L 染色を使用した SAR の検出では、1 × 10 6細胞を収集し、4% ウシ血清アルブミン (BSA) 洗浄バッファーを含む 3 ml の氷冷 1 × PBS で 3 回洗浄しました。洗浄後、細胞を、1μgのプロテインLを含む氷冷洗浄緩衝液0.1mlに4℃で1時間再懸濁した。細胞を氷冷した洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、０．１ｍｌの洗浄緩衝液中の１０μｌのＡＰＣ結合ストレプトアビジンとともに（暗所で）３０分間インキュベートし、続いて氷冷した洗浄緩衝液で２回洗浄した。 FACSは、BD BiosciencesのFACSVerseアナライザーを使用して実施されました。
細胞死アッセイ
細胞死を測定するために、PCT/US2017/052344「非放射性細胞毒性アッセイ」に記載されているように、Gluc、NLuc、または熱安定性甲虫ルシフェラーゼ (LucPPe または Luc146-1H2) の異所性サイトゾル発現に基づくマタドール アッセイを利用しました。他に示さない限り、異なるルシフェラーゼを安定して発現する標的細胞を、標的細胞の増殖に使用した培地中の384ウェルプレートに三重に播種した。懸濁液中で増殖する標的細胞は一般にウェル当たり２～３×１０ ４の濃度で播種したが、接着性単層として増殖する標的細胞はウェル当たり１～２×１０ ４の濃度で播種した。他に示されない限り、標的細胞は、エフェクター：標的（E：T）比で、遺伝子改変された（すなわち、SARを発現する）エフェクター細胞（例えば、T細胞およびNK細胞、または細胞株（NK92、NK92MIまたはTHP細胞））と共培養された。 4 時間から 96 時間、1:1 から 10:1 まで変化します。標的細胞が付着細胞 (例: HeLa 細胞)として増殖する場合、T 細胞を添加する前に一晩ウェルの底に付着させました。 GLuc 発現標的細胞の場合、天然セロエントRAJIン (Nanaolight) を含む 0.5 x CTZ アッセイ緩衝液を直接注入することにより、BioTek シナジー プレート リーダーで測定されるルシフェラーゼ活性の増加によって、エフェクター細胞を介した標的細胞の溶解誘導をアッセイしました。ルシフェリンは、Luc146-1H2 を発現する標的細胞の基質として使用されました。 培地のみを含むウェル（Med）、およびSAR構築物に感染していないエフェクター細胞とともに標的細胞をインキュベートしたウェル（UI）におけるルシフェラーゼ活性を、示されている場合には対照として使用した。
標的細胞上の抗原の発現を検出し、SAR の構築に使用されるさまざまな抗原結合部分の抗原結合活性を測定するアッセイ
標的細胞上の抗原の発現は、PCT/US2017/025602に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれるように、抗体による免疫染色または高感度抗原検出アッセイと組み合わせたバイオインフォマティクスによって決定された。
SAR を発現する免疫エフェクター細胞は、機能的な SAR を特定するために以下のアッセイでテストされます。
(A) Topanga アッセイ( NLuc 結合アッセイ) : コントロール ベクターおよび SAR を発現する Jurkat-NFAT-GFP、T 細胞または NK 細胞を標的 CD19-Nluc 融合タンパク質で染色し、標的抗原への結合能力を測定することによってアッセイします。 Topanga アッセイを使用した Nluc 活性。以下の図に示すように、CD19モノクローナルhu-mROO5-1のvLおよびvH断片がDAP10のヒンジ、膜貫通およびサイトゾルドメインに結合している新規次世代SAR（配列番号2275）を発現するNK92MI細胞IgCL および IgG-CH1 リンカーを介した細胞は、コントロールの親細胞と比較して、CD19-Nluc Topanga 試薬への結合の増加を示します。第２世代ＣＡＲ（配列番号５１４１）は、ポジティブコントロールとして機能する。
この実験は、さまざまな次世代 SAR を発現する NK92MI 細胞で繰り返されます。次の図に示すように、SAR (配列番号: 2277) を発現する NK92MI 細胞は、Topanga アッセイにおいて CD19-Nluc 融合タンパク質に対して非常に高い結合を示しました。 DAP10-SAR (配列番号2275) を発現するNK92MI細胞も、中程度のCD19結合を示した。
インビトロでの細胞毒性活性のアッセイ。 未感染の NK92 細胞または T 細胞、またはコントロールベクターまたは SAR を発現する細胞を、非分泌型のルシフェラーゼ (GLuc、NLuc、Turboluc 16 など) を発現する標的細胞株と 4 ～ 96 時間共培養し、 PCT/US17/52344に記載されているように、ルシフェラーゼ活性を測定することによって細胞溶解を検査した。以下の表に示すように、ＳＡＲ（配列番号２２７７）を発現するＮＫ９２ＭＩ細胞は、マタドールアッセイで測定した場合、最も高い細胞毒性を示した。 DAP10-SAR（配列番号2275）を発現するNK92MI細胞も、中程度の細胞毒性を示した。
NF-κB 活性化アッセイ
Jurkat 細胞は、NF-κB 応答性プロモーターの下でホタル ルシフェラーゼ cDNA (Luc) を発現するように操作されました。続いて、以下の SAR 構築物をコードするレンチウイルス ベクターを細胞に感染させ、さまざまな SAR を安定して発現する細胞を生成しました。異なる SAR を発現する Jurkat-NF-κB 細胞を RAJI-wt (CD19+ve) または RAJI-CD19-KO (CD19-null) 細胞と 24 時間共培養し、ルシフェラーゼ活性を測定しました。
添付の表５３は、配列番号２２７５および２２７７のＳＡＲを発現するジャーカット細胞によるＮＦ－κＢ活性の誘導を示す。配列番号１８６０のＮＫｐ４６ ＳＡＲによるＮＦ－κＢ誘導はなかった。
NFAT プロモーターの誘導により GFP 発現が促進されます。 Jurkat-NFAT-GFP (JNG) 細胞は、さまざまな SAR 構築物をコードするレンチウイルス ベクターに感染し、ピューロマイシンで選択されます。対照ＪＮＧ細胞およびＳＡＲ発現ＪＮＧ細胞を、それらの同族抗原を発現する異なる標的細胞株と約２４時間共培養する。したがって、CD19を標的とするSARを発現するJNG細胞をCD19抗原発現細胞株RAJIと共培養し、標的抗原に結合して細胞シグナル伝達を誘導するJNG細胞の能力を、フローサイトメトリーを使用してGFP発現の誘導を測定することによってアッセイする。 CD19 を欠く RAJI 細胞 (RAJI-CD19-KO) をネガティブコントロールとして使用します。 GFP 発現の誘導は、対照細胞に対して GFP を誘導する SAR 発現細胞の割合に応じて、 1+、2+、3+などとして定量化されます。したがって、１．６＋は、ＳＡＲを発現するＪＮＧ細胞の約１６％が、標的細胞との共培養時に、対照ＪＮＧ親細胞で見られるレベルを超えるＧＦＰ誘導を示したことを意味する。以下の表の結果は、ほとんどの一本鎖および二本鎖SAR構築物の発現によるNFAT誘導性GFP発現の活性化を示している。この結果はまた、配列番号２２７６、２２８０、２３１４～２３１６、２３１９～２３２６によって表されるＳＡＲなどの二本鎖ヘテロ二量体ＳＡＲ構築物によるＮＦＡＴの誘導を示す。この結果はさらに、CD16Aの完全な細胞外ドメインを有する少なくとも1つの鎖を発現するSAR構築物が、その抗原結合ドメイン(例えば、BCMA-FHVH)の標的となる抗原を発現する細胞に応答するだけでなく、結合する能力も保持していることを示している。異なる抗原を標的とする抗体の Fc 領域に。したがって、例示的な実施形態では、ＳＡＲ構築物ＣＤ８ＳＰ－Ｓｐｈ－ＢＣＭＡ－ＦＨＶＨ９３－Ｋｐｎ－ Ｇ４Ｓ－ＥｃｏＲ１－ＣＤ１６Ａ－Ｆ１５８Ｖ－ＦＬ－Ｆ－Ｐ２Ａ－Ｓｐｅ－ＩｇＨＳＰ－Ａｐａ－ＣＤ２０－ＶＨＨ－ＵＳＣ１－２ＨＣ２Ｄ６を発現するＪＮＧ細胞は、 -Bam-G4S-Bst-CD16A-F158V-FL-v2-F2A-Xba-PAC（配列番号2283）は、RAJI（CD19+およびBCMA+）およびL363（CD19-ve）と共培養すると、NFAT駆動型GFPを誘導します/BCMA+) 細胞株は、それぞれその抗原結合ドメイン BCMA-FHVH93 および CD20-VHH-USC1-2HC2D6 を介して検出されます。さらに重要なことは、このＳＡＲ（配列番号２２８３）構築物を発現するＪＮＧ細胞は、Ｈｅｒ２発現ＳＫＯＶ３細胞と共培養した場合にＧＦＰを誘導できないことである。ただし、この SAR 構築物を構成する 2 本の CD16A-F158V-FL 鎖のいずれかに結合できるハーセプチン (1μg/ml) の存在下で、この SAR を発現する JNG 細胞を SKOV3 細胞と共培養すると、GFP の強力な誘導が観察されます。 。 SAR コンストラクト CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-G4S-EcoR1-CD16A-V158A-FL-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH を発現する JNG 細胞を用いて実験を繰り返した場合にも、本質的に同様の結果が得られます。 -USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-Xba-PAC (配列番号2314)。この構築物は、一方のシグナル伝達鎖が CD16A-V158A-FL で構成され、もう一方のシグナル伝達鎖が [hTCRa-T48C-opt] で構成される二本鎖ヘテロ二量体 SAR です。対照的に、最初のIg様ドメインを欠くCD16A鎖(CD16-V158A-D2TMCP-v1)を含む配列番号2315および2316で表されるSAR構築物は、SKOV3細胞と共培養した場合、GFPを誘導できない。ハーセプチン。しかし、これらの SAR 構築物は、RAJI 細胞との共培養時に依然として GFP を活性化する可能性があり、CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-G4S-Bst-CD19-hu-mROO5-1-vH-Mlu-[hTCRa] による機能的なシグナル伝達を示唆しています。 -T48C-opt] チェーンがこのコンストラクトに存在します。一方、この SAR を発現する JNG 細胞は、L363 細胞との共培養時に GFP を誘導できず、BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP 鎖が発現していないか、機能的に活性ではないことが示唆されます。同様に、構築物CD8SP-Sph-BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP-v1-F-P2A-Spe-IgHSP-Apa-CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-CD16-F158V-S197Pを発現するJNG細胞-D2TMCP-v3-F-F2A-Xba-PAC (配列番号2322) は、RAJI 細胞または L363 細胞と共培養した場合、GFP を誘導できません。さらに、これらの細胞は、ハーセプチンの存在下でSKOV3細胞と共培養するとGFPを誘導できません。これらの結果は、BCMA-FHVH93-Kpn-CD16-V158A-D2TMCP-v1 鎖も CD20-VHH-USC1-2HC2D6-Bam-CD16-F158V-S197P-D2TMCP-v3 鎖も機能的に発現されていないことを示唆しています。
この結果はさらに、 2つの別個の鎖に結合したvLおよびvHフラグメントを含む多くの二本鎖構築物を発現するJNG細胞が、その同族抗原発現細胞との共培養によりGFPを誘導できることを実証する。このような構築物の例は、２２７５～２２７８、２２８０～２２８２、２３１９、２３２１、２３００、２３２３～２３２６によって表される。これらの結果は、vL および vH フラグメントが集合して、2 本の別個の鎖に結合している場合でも、同族抗原に結合してシグナルを伝達できる機能的な Fv を形成できることを示しています。これは、2 つの鎖が構造的に異なり、ヘテロ二量体化またはホモ二量体化が知られていない場合に観察されます。このような二本鎖ヘテロ二量体構築物の例は、配列番号２２７６、２２８０、２３２３～２３２６によって表される。
結果はさらに、CD16の細胞外、膜貫通、およびサイトゾルドメイン全体をコードする1つまたは2つの鎖を含むSAR構築物(例えば、配列番号3843、3853および3863)が、コードするSAR構築物と比較して、NFAT駆動型GFPの強い誘導を示すことを実証する。 CD16の最初のIgドメインを欠いているCD16鎖(例えば、配列番号3844、3854、および3864)。さらに、ＣＤ１６の細胞外、膜貫通、およびサイトゾルドメイン全体をコードするＣＤ１６の１つまたは２つの鎖を含むＳＡＲ構築物（例えば、配列番号３８４３、３８５３および３８６３）は、一般に、ＮＦＡＴ駆動ＧＦＰのより強力な誘導を示す。同様に、配列番号３７６３または３７６９で表されるＮＫｐ３０の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメイン全体（例えば、ＮＫｐ３０－ＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ１またはｏｐｔ２）を含むＳＡＲ構築物（例えば、配列番号２２９７）を発現するＪＮＧ細胞は、強い同族抗原発現細胞株と共培養した場合のNFAT駆動型GFPの誘導。
TCRα、β、γおよびδ鎖が欠失した多くの二本鎖SIRが構築され、JNG細胞で発現されました。以下の表に示すように、驚くべきことに、TCRα、β、γ、またはδ鎖が欠失したSIR（配列番号7619～7625）は、JNG細胞で発現させた場合に強いNFAT-GFP活性を示した。 δ鎖を使用して、さまざまな発現およびシグナル伝達活性を備えた多様な SIR パネルを生成し、多様な免疫応答を生成できます。
NFAT プロモーターの誘導により GFP 発現が促進されます。 Jurkat-NFAT-GFP (JNG) 細胞は、抗原結合ドメインとして scFv または vHH ドメイン、シグナル伝達鎖として CD16A-F158V-S197P-FL-v3 を含むさまざまな CD16-SAR 構築物をコードするレンチウイルス ベクターに感染します。細胞は薬物選択を行わずに 4 日間増殖させます。対照ＪＮＧ細胞およびＳＡＲ発現ＪＮＧ細胞を、それらの同族抗原を発現する異なる標的細胞株と約２４時間共培養する。したがって、CD19を標的とするSARを発現するJNG細胞をCD19抗原発現細胞株RAJIと共培養し、標的抗原に結合して細胞シグナル伝達を誘導するJNG細胞の能力を、フローサイトメトリーを使用してGFP発現の誘導を測定することによってアッセイする。結果は、標的抗原を発現する細胞株と共培養した場合に、異なる SAR を発現する JNG 細胞による NFAT 駆動の GFP 発現の誘導を示しています。仮出願の表３６～３８に列挙されている他のＣＤ１６ ＳＡＲ構築物を用いて実験を繰り返した場合にも、本質的に同様の結果が得られる。
異なる SAR 構築物を発現する JNG および NK92 細胞を生成し、前のセクションで説明したように、標的抗原を発現する細胞株を使用して、NFAG-GFP アッセイおよび細胞毒性アッセイ (マタドール アッセイ) についてテストしました。配列番号および標的抗原とともに表されるさまざまなSAR構築物の結果の要約を以下に提供する。マタドールアッセイにおける誘導倍数は、対照 NK92 細胞との共培養時に観察されたルシフェラーゼ活性と比較した、標的細胞と SAR 発現 NK92 細胞との共培養時のルシフェラーゼ活性の増加として計算されました。共培養アッセイは、0.3:1～1:1のE:T比で2時間実施した。
CD19 標的 SAR を発現する NK92 細胞は、CD19 発現 NALM6 細胞および RAJI 細胞に対して細胞毒性を示す
NK92細胞を、示されたCD19-TARGETED SAR構築物をコードするレンチウイルスベクターに感染させた。細胞をピューロマイシン中で選択した。親NK92細胞またはSAR発現NK92細胞を、エフェクター：標的（E：T）比0.25：1でGlucを安定発現する指定の標的細胞株と2連で4時間共培養しました。共培養期間の終わりに、CTZ アッセイ緩衝液を添加した後、マタドール アッセイによって Gluc 活性を測定しました。結果は、さまざまな CD19 標的 SAR を発現する NK92 細胞との共培養により、Nalm6-Gluc 細胞および RAJI-Gluc 細胞を含む培養物中で Gluc 活性が特異的に増加することを示しています。対照的に、 CD19 発現が欠如している RAJI-CD19-KO、U927、および THP-1 細胞を含む培養物では、GLuc 活性の有意な増加はありません。これはアッセイの特異性を示しています。従来の第2世代CAR（配列番号5441）を発現するNK92細胞は、Nalm6細胞およびRAJI細胞に対して最も高い細胞毒性を示しましたが、RAJI-CD19-KO、U937およびTHP-1細胞に対しても非特異的な細胞毒性を示しました。
マタドールアッセイ
示された SAR を発現する NK92 親細胞と NK92 細胞、および RS4;11-Gluc 標的細胞を、E:T 比 0.3:1 および 1:1 (それぞれ 5,000 : 15,000 細胞および 15,000 : 15,000 細胞) で共インキュベートしました。 2時間のインキュベーション後、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して細胞死を測定しました。結果は図６に示されており、配列番号７６９５、７６９２および７６０７を有するＳＡＲによる細胞死の効果的な誘導を示している。
マタドールアッセイ
示された SAR を発現する NK92 親細胞と NK92 細胞、および RS4;11-Gluc 標的細胞を、E:T 比 0.3:1 および 1:1 (それぞれ 5,000 : 15,000 細胞および 15,000 : 15,000 細胞) で共インキュベートしました。 2時間のインキュベーション後、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して細胞死を測定しました。結果を図７に示し、配列番号７６７９を有するＳＡＲによる細胞死の効果的な誘導を示している。
マタドールアッセイ
示された SAR を発現する NK92 親細胞および NK92 細胞、および L363-Gluc 標的細胞を、0.3:1 および 1:1 の E:T 比 (それぞれ 5,000 : 15,000 細胞および 15,000 : 15,000 細胞) で共インキュベートしました。 2時間のインキュベーション後、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して細胞死を測定しました。結果を図８に示し、配列番号７６７９のＳＡＲによる細胞死の効果的な誘導を示している。
マタドールアッセイ
示された SAR を発現する NK92 親細胞と NK92 細胞、および RS4;11-Gluc 標的細胞を、E:T 比 0.3:1 および 1:1 (それぞれ 5,000 : 15,000 細胞および 15,000 : 15,000 細胞) で共インキュベートしました。 2時間のインキュベーション後、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して細胞死を測定しました。示されているように、hu-mROO5-1-scFv、CD28ヒンジ領域、およびNKp44-Hinge-TMCPまたはNKp46-Hinge-TMCPを含む両方のSAR構築物は、効果的な細胞死を誘導した。結果を図 9 に示します。
マタドールアッセイ
示された SAR を発現する NK92 親細胞と NK92 細胞、および RS4;11-Gluc 標的細胞を、E:T 比 0.3:1 および 1:1 (それぞれ 5,000 : 15,000 細胞および 15,000 : 15,000 細胞) で共インキュベートしました。 2時間のインキュベーション後、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して細胞死を測定しました。結果を図 10に示します。
マタドールアッセイ
示された SAR を発現する NK92 親細胞および NK92 細胞、および L363-Gluc 標的細胞を、0.3:1 および 1:1 の E:T 比 (それぞれ 5,000 : 15,000 細胞および 15,000 : 15,000 細胞) で共インキュベートしました。 NK92細胞およびNK92-SAR細胞はまた、膜アンカー型IL2(配列番号7133)を共発現した。 2時間のインキュベーション後、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して細胞死を測定しました。結果を図 11 に示します。
マタドールアッセイ
NK92 細胞は、SAR コンストラクト NKG2D-opt2-G4Sx3-Bst-Her2-47D5-vHH-Mlu-F-F2A-Xba-PAC (配列番号 7696) および NKG2D-opt2-G4Sx3-Bst-Her3- を発現するように操作されました。 ２１Ｆ０６－ｖＨＨ－Ｍｌｕ－Ｆ－Ｆ２Ａ－Ｘｂａ－ＰＡＣ（配列番号７６９７）。 NK92 親細胞と SAR を発現する NK92 細胞を、E:T 比 1:1 で SKOV3-Gluc 標的細胞と共培養します。細胞死は、セエレテRAJIンの添加によるマタドールアッセイを使用して測定されました。結果は、配列番号７６９６および７６９７を有するＳＡＲ構築物を発現するＮＫ９２細胞との共培養によるＧｌｕｃ活性の増加を示し、細胞死の誘導を反映している。
SAR-NK細胞
NY-ESO1 (157-165) ペプチド (配列番号: 10880) を標的とする NY-ESO1-Tetramer-APC (HLA-A*02:01 human NY-ESO1 157-165 C165V APC-Labeled Tetramer) は NIH から入手しました四量体施設。 NY-ESO1-SIR(061621-SCjJ7;配列番号9366)に感染したJNG細胞をピューロマイシンで選択した。安定した細胞を、暗所、室温で30分間、NY-ESO1-テトラマー-APC（HLA-A*02:01ヒトNY-ESO1 157-165 C165V APC標識テトラマー）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。 NY-ESO1 SARを発現するJNG細胞は、JNG-UI細胞(1.42%)と比較してAPC陽性(10%)であった。同様に、NY-ESO1-SAR (061621-SCjJ7; 配列番号9366) で一過的にトランスフェクトされ、NY-ESO1-四量体-APC で染色された 293FT 細胞は、トランスフェクトされていない 293FT 細胞 (0.97%) と比較して、52.3% APC 陽性でした。 。実験は、ＳＡＲのＶａドメインが異なるＶａドメイン（配列番号８５１４）で置き換えられた構築物を用いて繰り返された。この SAR 構築物をトランスフェクトした 293FT 細胞は、NY-ESO1-tetramer-APC で >70% の染色を示し、このプラットフォームを使用して TCR 様結合能力を持ち、異なる可変ドメインを含む異なる SAR を構築できることが示されました。次に、NY-ESO1-SIR (061621-SCjJ7; 配列番号9366) 構築物のリンカードメイン(すなわち、TCRa-Ig3およびTCRb-Ig3)およびシグナル伝達モジュール(たとえば、CD3zECDTMCP-optおよびCD3zECDTMCP opt2)を置換した。異なるリンカー（例えば、ＩｇＣＬ、ＩｇＧ－ＣＨＩなど）、および異なるシグナル伝達アダプターおよびその変異体およびフラグメントを含むシグナル伝達モジュールによって。得られたSAR構築物は、配列番号9427～9434によって表される。この構築物は、293FT 細胞にトランスフェクトされた場合、NY-ESO1-四量体-APC による染色の増加を示しました。 ＮＹ－ＥＳＯ１を標的とし、異なるバックボーンを含む他の例示的な構築物は、配列番号９３５６～９４２６によって表され、同様に試験される。 MAGE-A3 (112-120)/HLA-A2 (配列番号: 9439-9506、9517-9518) を標的とする uTCR-SAR 構築物を、 NIH 四量体施設。
ＴＨＰ－１細胞は、ｕＴＣＲ－ＳＡＲ ＮＹ－ＥＳＯ１－ＳＡＲ（０６１６２１－ＳＣｊＪ７；配列番号９３６６）をコードするレンチウイルスベクターで安定に形質導入される。細胞は、NY-ESO1-四量体-APCによる染色の増加と、表面NY-ESO1/HLA-A2複合体発現による標的細胞の食作用の増加を示します。
NY-ESO1-SAR (061621-SCjJ7; 配列番号9366) をコードする濃縮レンチウイルスベクターを使用して、NK92 細胞株、初代 T 細胞および初代 NK 細胞を感染させました。感染後、細胞を上記のようにNY-ESO1-四量体-APCで染色した。 NY-ESO1-SAR (061621-SCjJ7; 配列番号: 9366) の発現により、NK92 細胞株では APC+ ve 細胞が 4.93% から 84.06% に増加し、初代 NK 細胞では 3.3% から 10.98% に増加し、初代培養細胞では APC+ ve 細胞が増加しました。 T細胞は29%から59.3%へ。これらの結果は、NY-ESO1-SARがT細胞と非T細胞の両方を含むさまざまな細胞株で機能的に発現でき、それらの細胞にTCR様結合能力を付与できることを示しています。
ＮＫ９２細胞、初代ＮＫ細胞、およびＮＹ－ＥＳＯ１－ＳＡＲ（０６１６２１－ＳＣｊＪ７；配列番号９３６６）を発現する初代Ｔ細胞を、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ２を補充したＸＶＩＶＯ培地中で１日間増殖させた。 NYESOペプチド(10μM)、CD28アゴニスト抗体(1μg/ml)、NY-ESO-1ペプチド+CD28抗体の存在下および非存在下でGLucを発現するT2-細胞と共培養を行った。 T2細胞にNY-ESO1ペプチドを37℃で30分間ロードしました。さらに、外来性 HLA-A2 コード配列と NY-ESO-1 コード配列を発現するレンチウイルス ベクター (020122-BBjV1) を感染させた T2 細胞を対照として含めました。さらに、L363 (NY-ESO1+/HLA-A2+) および U266 (NY-ESO1+/HLA-A2+) 細胞を発現する Gluc。 020122-BBjV1 ベクターで形質導入された L363 細胞および U266 細胞が含まれていました。すべての標的細胞とエフェクター細胞を、サプリメントを含まない XVIVO 培地中で白色 384 ウェル プレートに E:T 比 1:1 で 4 時間播種しました。標的細胞は、30μlの培地中10,000細胞/ウェルで使用しました。マタドールアッセイは、自動ディスペンサーを使用してウェルモードでPBS中の1:100 CTZアッセイ緩衝液15μlを注入した後に実施した。発光を5秒間読み取った。その結果、NY-ESO1-SAR (061621-SCjJ7; 配列番号9366) に感染したNK92、初代NKおよび初代T細胞を含むU266-Gluc細胞の培養物における細胞死を反映するGluc活性の顕著な増加が示されました。感染していないコントロール細胞と比較して。 Gluc 活性は、NK92 培養物における 23356 から、NY-ESO1-SAR を発現する NK92 における 334646 まで増加しました。 Gluc 活性は、初代 NK 細胞の培養における 17788 から、NY-ESO1-SAR を発現する初代 NK における 162764 まで増加しました。 Gluc 活性は、初代 T 細胞の培養における 2183 から、NY-ESO1-SAR を発現する初代 T 細胞における 491493 まで増加しました。同様に、NK92、初代NK細胞、および初代T細胞におけるNY-ESO1-SAR（061621-SCjJ7;配列番号9366）の発現は、L363細胞および020122-BBjV1ベクターで安定的に形質導入されたL363細胞に対する細胞毒性の増加を示した。未感染のコントロール細胞。最後に、NK92細胞および初代NK細胞におけるNY-ESO1-SAR（061621-SCjJ7;配列番号9366）の発現は、NY-ESO1ペプチドを負荷されたT2細胞に対する細胞毒性の増加を、NY-ESO1ペプチドを負荷されたT2細胞に対して示した。ペプチドが詰め込まれています。
対照Ｔ２細胞またはＮＹ－ＥＳＯ１ペプチドを負荷したＴ２細胞を、９６ウェルＵ底プレート中の１００μｌ培地中に５０Ｋ細胞／ウェルでプレーティングした。対照エフェクター細胞（NK92および初代T細胞）、またはNY-ESO1-SARをコードするレンチウイルスベクター（061621-SCjJ7;配列番号9366）に感染させたエフェクター細胞を、E:T比1:1で添加した。 。 24時間後、ELISAのために上清を収集した。その結果、NK92細胞およびNY-ESO1-SAR（061621-SCjJ7;配列番号9366）を発現する初代T細胞と共培養した場合、NY-ESO1ペプチドを負荷したT2細胞におけるIFNγおよびTNFαの産生が増加することが示された。 ）非感染対照細胞と比較した（図１３）。この効果は、NY-ESO1ペプチドが負荷されたT2細胞に特異的であり、NY-ESO1ペプチドが負荷されていないT2細胞では同じ程度には見られなかった。
NK92、初代NK、および初代T細胞は、uTCR-SAR CD8SP-MAGE-A3-112-120-Vb-TCRb-S57C-ECD-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-MAGE-A3-112を発現するレンチウイルス構築物に感染します。 －１２０－Ｖａ－ＴＣＲａ－Ｔ４８Ｃ－ＥＣＤ－ＣＤ３ｚＥＣＤＴＭＣＰ－ｏｐｔ２（配列番号９４５０）は、ＨＬＡ－Ａ２と複合したＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド（１１２～１２０）を標的とする。 ＭＡＧＥ－Ａ３ペプチド（配列番号１０８７９）を負荷したＴ２細胞を使用して、実験を上記のように繰り返す。 uTCR-SAR 発現細胞との共培養は、形質導入されていない細胞との共培養と比較して、細胞毒性およびサイトカイン (IFNγ および TNFα) 産生の増加をもたらすことが示されています。ペプチドが負荷されていない T2 細胞は、ネガティブコントロールとして機能します。
本質的に上記と同様のアプローチを使用して、NY-ESO1、MAGE-A3および他の細胞内ペプチド抗原を標的とするuTCR-SARを発現する一次マクロファージを生成することができる。
本質的に上記と同様のアプローチを使用して、他のペプチド抗原を標的とするuTCR-SARを生成および試験することができる。 NY-ESO1、MAGE-A3、MC7.G5（HLA非依存性TCR）およびVd2/Vg9（γδTCR）を標的とするTCRの可変ドメインを含むいくつかの追加の例示的な単一特異性および二重特異性uTCR-SAR構築物の配列番号を提示する。配列番号９３５５～９６０２において。これらの構築物は、初代NK細胞、初代T細胞、NK細胞株、iPSC細胞、造血細胞および他のエフェクター細胞（例えば、CIK、メモリー様NK、g-NK樹状細胞など）で発現させ、技術を使用して活性を試験することができます。当該技術分野において知られている。
THP-1 細胞上の CD19 標的 SAR の発現
ATCC から入手した THP-1 (単球) 細胞に、CD19 を標的とする指定の SAR 構築物をコードするレンチウイルス ベクターを感染させました。細胞をピューロマイシン中で選択した。 CD19 標的 SAR 発現 THP-1 細胞が CD19 細胞外ドメインに結合する能力は、以前に記載されているように FLAG-CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 (配列番号 3675) を使用する Topanga アッセイによってテストされました (Gopalakrishnan, R)ら、Sci. Reports、9:1957、2019)。結果は、親THP-1細胞と比較して、配列番号2312、2291、5138、2313によって表されるSARを発現するTHP -1細胞へのCD19 Topanga試薬の結合の増加を示す。これらの結果は、これらの SAR が単球系統の THP-1 細胞の表面で機能的に発現することができ、CD19 標的抗原への結合の増加を示すことを示しています。
CD19-TARGETED SAR を発現する THP-1 細胞は、CD19+ RAJI 細胞の貪食作用の増加を示す
7.5 x 10 4 THP-1 細胞を、10% FBS を含む RPMI 中の 1ng/mL の PMA (ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート) を使用して単球/マクロファージ系統に分化させました。 2 セット 3 回で 48 時間。細胞は付着するようになり、２回洗浄した。次いで、７．５×１１０ ４ 個のＲＡＪＩ－Ｎｌｕｃ細胞およびＲＡＪＩ－ＣＤ１９－ＫＯ－Ｎｌｕｃ細胞標的細胞を適切なウェルに３～４時間添加した。懸濁細胞を除去し、プレートを２回洗浄した。 PBS中のEDTA 500μLを加え、37 ℃で5分間インキュベートしました。細胞をはぎ取り、チューブに入れ、4 ℃ 、1000rpmで5分間回転させました。PBSを除去し、100μLの1xウミシイタケルシフェラーゼアッセイ溶解液を加えました。緩衝液(Promega)をチューブに加え、氷上で10分間インキュベートした。サンプルを4 ℃ 、12,000で10分間遠心分離した。25μLの上清を3回収集し、25μLのCTZ（セレントRAJIン）アッセイ緩衝液を加え、プレートリーダーを使用して発光を測定した。以下の表６０に示すように、配列番号２２９１および５１３８のＳＡＲを発現するＴＨＰ－１細胞は、ＲＡＪＩ細胞との共培養において、ＴＨＰ－１親細胞と比較してより高いＮＬｕｃ活性を示した。これらの結果は、CD19-TARGETED-SAR 発現THP-1 細胞による CD19 発現 RAJI 細胞の貪食作用の増加を示しています。対照的に、配列番号２２９１および５１３８のＳＡＲを発現するＴＨＰ－１細胞は、ＣＤ１９発現を欠くＲＡＪＩ－ＣＤ１９－ＫＯ細胞との共培養において、ＴＨＰ－１親細胞と比較してＮＬｕｃ活性の増加を示さなかった。
多目的スイッチの表現。
NK92細胞は、SARをコードし、異なる膜アンカー型サイトカインまたは多目的スイッチを含むアクセサリーモジュールを共発現するレンチウイルスベクターで安定に形質導入された。 Synth-IL2-tBCMA-L24多目的スイッチを発現する例示的な構築物は、配列番号8509～8512によって表される。感染後、NK92細胞をIL2から取り出した。配列番号７１３３～７１３７、７１５１～７１５７および８５２９～８５３４によって表されるアクセサリーモジュールの共発現により、ＩＬ２を欠く培地で増殖させた場合、ＮＫ９２細胞は生存したが、対照の形質導入されていないＮＫ９２細胞は死滅した。マタドールアッセイで測定したところ、さまざまな SAR 構築物を発現する NK92 細胞は、SAR の強力な発現と活性を示しました。 IL2-tHer2 (配列番号: 8533)、IL2-RQR8 (配列番号: 8529)、およびIL2-tBCMA (配列番号: 7151)を表す多目的スイッチを発現するNK92細胞を、ハーセプチン、リツキシマブ、およびJ6MO抗体で染色した。それぞれ Her2、RQR8、BCAM に結合し、陽性染色を示すことがわかりました。さらに、IL2-RQR8 (配列番号: 8529) を発現する NK92 細胞も、CD34 に結合する QBEND-10 抗体による染色を示します。上記の多目的スイッチを発現するＪＮＧ細胞は、上記の抗体を使用して検出された場合、多目的スイッチの細胞表面発現も示す。これらの結果は、SAR発現細胞が、多目的スイッチに結合する抗体で染色し、続いて細胞選別(例えば、フロー選別または磁気選別)することによって検出、単離および精製できることを示す。これらの結果はさらに、多目的スイッチに結合する抗体で染色し、続いて細胞選別（例えば、フロー選別または磁気選別）を使用するネガティブ選択によってSAR発現細胞を除去できることを示す。さらに、多目的スイッチを発現する細胞は、ハーセプチン、リツキシマブ、J6M0、BCMA-ADC などのスイッチに結合する抗体で処理すると死滅します。
短い内部プロモーター（例えば、EFS、EFS2、RSVなど）を使用してアクセサリーモジュールが発現される構築物が、SARおよびアクセサリーモジュールの優れた発現を示すことも観察された。これは、2 つの鎖を持つ SAR コンストラクトの場合に特に見られました。
養子細胞療法のための複数の抗原を標的とする自己 SAR-T 細胞の使用。患者は、感染症（例えば、HIV1、EBV、CMV、HTLV1など）、変性疾患（例えば、アルツハイマー病）、自己免疫疾患（例えば、尋常性天疱瘡）、アレルギー性疾患（例えば、慢性特発性蕁麻疹）を含む多くの異なる疾患を有する。また、複数のがんが、さまざまな疾患原因抗原または疾患関連抗原を標的とする養子移入された自己 SAR-T 細胞を用いた免疫療法の IRB 承認の第 I 相臨床試験に登録されています。さまざまな疾患の SAR は、疾患の原因細胞または疾患関連細胞における標的抗原の既知の発現に基づいて選択されます。可能であれば、疾患の原因細胞または疾患関連細胞上の SAR 標的の発現は、SAR の抗原結合ドメインが柔軟なリンカーを介して非分泌型の NLuc タンパク質に融合した ABD-GGS-NLuc 融合タンパク質との結合によって確認されます。 。あるいは、市販の抗体を使用した免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用して、疾患の原因細胞または疾患関連細胞上の SAR 標的の発現を確認します。 T細胞は、白血球除去法を使用して対象から収集され、適切なSARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入され、 CD3/CD28ビーズを使用してエクスビボで増殖されます。得られた細胞生成物は、品質管理試験（無菌性試験および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む）を受けた後、凍結保存されます。一方、研究参加者はリンパ除去化学療法（30 mg/m 2 /日のフルダラビンと500 mg/m 2 /日のシクロホスファミド×3日間）を開始します。リンパ球除去療法の完了から1日後、研究参加者は形質導入されたリンパ球を静脈内注入され、続いて耐性が得られるまで8時間ごとに高用量（720,000 IU/kg）IL-2（アルデスロイキン；プロメテウス、カリフォルニア州サンディエゴ）が投与される。事前に保管された SAR-T 細胞産物は、患者のベッドサイドで輸送され、解凍されて注入されます。 ＳＡＲ－Ｔ生成物の用量は、研究プロトコールに従って、 １×１０ ４ ＳＡＲ＋ｖｅ ＣＤ３細胞／ｋｇから５×１０ ９ ＳＡＲ＋ｖｅ ＣＤ３細胞／ｋｇまで変化する。 SAR-T 製品は、1 回の注入または分割注入で投与できます。研究参加者には、T細胞注入の少なくとも30分前に、15 mg/kgのアセトアミノフェンPO（最大650 mg）およびジフェンヒドラミン0.5～1 mg/kg IV（最大用量50 mg）を前投与することができます。研究参加者は、必要に応じてヒトIL-2の毎日の注射を受けることができる。その後、医師の裁量で臨床および実験室の相関追跡研究を実行できます。
養子細胞療法のための同種異系 SAR-T 細胞の使用。同種骨髄移植を受けた再発性急性リンパ性白血病または高リスク中悪性度B細胞リンパ腫の患者は、養子移植された同種SAR-T細胞による免疫療法を受けることができます。ドナー (同種異系移植に使用したものと同じドナー) から収集した白血球除去製品は、Miltenyi Biotec の CliniMACS Prodigy(R) システムを使用し、メーカーの推奨に従って CD3 陽性 T リンパ球の選択を受けます。 ＴＲＡＣおよびβ２Ｍの発現は、当技術分野で公知の技術を使用するＣＲＩＳＰ９媒介ノックアウトによって除去され、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体およびＨＬＡの細胞表面発現を欠くＴ細胞が選択される。細胞は、CD3およびCD28磁気ビーズベースの人工抗原提示細胞を使用して活性化され、臨床グレードのCD20標的SARウイルス(例えば、CD8SP - CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3(配列番号2))で形質導入される。 : 5047]). 細胞は閉鎖系で 9 ～ 12 日間増殖され、得られた細胞製品は品質管理試験 (無菌性および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む) を受けた後、凍結保存されます。その間、研究参加者はリンパ除去化学療法を開始します(30 mg/m 2 /日のフルダラビンと 500 mg/m 2 /日のシクロホスファミド x 3 日間) リンパ球除去レジメンの完了 1 日後、研究参加者は形質導入リンパ球の静脈内注入を受け、続いて高用量 (720,000 IU/kg) が投与されます。 ) IL-2 (アルデスロイキン; プロメテウス、カリフォルニア州サンディエゴ) 耐性が得られるまで 8 時間ごと。SAR-T 細胞製品は患者のベッドサイドで輸送、解凍され、注入されます。SAR-T 製品の用量は 1 x 10 から変化する場合があります。研究プロトコルに従って、 4 SAR+ve CD3 細胞/kg ～ 5 x 10 9 SAR+ve CD3 細胞/kg。 SAR 製品は、1 回の注入または分割注入で投与できます。研究参加者には、SAR-T細胞注入の少なくとも30分前に、15 mg/kgのアセトアミノフェンPO（最大650 mg）およびジフェンヒドラミン0.5～1 mg/kg IV（最大用量50 mg）を前投与することができます。その後、臨床および臨床検査の相関追跡研究を医師の裁量で実施できます。これには、CD20 発現 ALL/リンパ腫細胞および/または養子移入された T 細胞の存在に関する定量的 RT-PCR 研究が含まれる場合があります。 FDG-PET および/または CT スキャン。疾患特有の病理学的評価のための骨髄検査。リンパ節生検。および/または遺伝子導入研究に適用されるFDAの生物学的反応修飾物質諮問委員会によって定められたガイドラインに従った長期追跡調査。免疫抑制剤の使用も医師の裁量に任されています。本質的に同様のアプローチを、本開示のＳＡＲを発現する同種異系免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いて他の疾患を治療するために使用することができ、この場合、ＳＡＲは、疾患の原因細胞または疾患関連細胞上に発現される１つまたは複数の抗原を標的とする。基本的に同様のプロトコルを使用して、表 36 ～ 38 にリストされている他の SAR コンストラクトをテストします。
SARを発現する自己または同種異系NK細胞の使用
ドナー（同種異系移植に使用したものと同じドナー）から収集した白血球除去製品は、Miltenyi Biotec の CliniMACS Prodigy(R) システムを使用し、メーカーの推奨に従って NK 細胞の選択を受けます。 NK細胞は、hIL2を使用して3～5日間活性化され、その後、CD20を標的とするSAR （例えば、CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3（配列番号5047）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入される）レンチウイルスは、膜アンカー型の IL2 もコードします (配列番号 1330)。NK 細胞を、ヒト CD20 を 50 単位で発現する人工抗原提示 K562 細胞 (aAPC) の存在下で、エクスビボで 15 日間増殖させます。得られた細胞産物は、品質管理試験 (無菌性および腫瘍特異的細胞毒性試験を含む) を受けた後、凍結保存されます。その間、研究参加者はリンパ枯渇化学療法 (30 mg/m2/日とフルダラビン 500 mg/m2) を開始します。 m2/日シクロホスファミド x 3 日) リンパ球除去レジメンの完了 1 日後、研究参加者は形質導入された NK 細胞を静脈内に注入され、続いて耐性が得られるまで 8 時間ごとに高用量 (720,000 IU/kg) IL-2 が投与されます。 NK 細胞産物は患者のベッドサイドで輸送され、解凍されて注入されます。 SAR-NK産物の用量は、研究プロトコールに従って1×10 4 SAR+ve NK細胞/kgから5×10 9 SAR+ve NK細胞/kgまで変化し得る。 SAR-NK産物は、1回の注入または分割注入で投与することができます。
SARを発現するiPSC由来NK細胞の作製
CD19 標的 SAR コンストラクトCD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (配列番号 5042) は、 2 つの異なる臍帯幹細胞由来 iPSC 細胞株 (606A1、NCRM-1) で発現されます。末梢血由来iPSC細胞株（648A1）。抗ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを使用するＴｏｐａｎｇａ試薬およびＦＡＣＳとの結合によって決定されるＳＡＲを発現する単一細胞クローンは、単離され、増殖され、ＱＣ分析（例えば、染色体の完全性、多能性、同一性確認、マイコプラズマおよび不妊性）を受ける。各 iPSC 細胞株に由来するいくつかの独立したクローンは、液体窒素中で凍結され、マスターセルバンクとして機能します。
iPSCおよびSARトランスフェクトiPSCからのNK細胞の誘導は、当技術分野で知られているプロトコールを使用して行われる。簡単に説明すると、3,000 個の TrypLE 適応 iPSC を、40 ng/ml ヒト幹細胞因子 (SCF)、20 ng/ml ヒト血管内皮増殖因子 (VEGF)、および 20 ng を含む APEL 培養物を含む 96 ウェル丸底プレートに播種します。 /ml 組換えヒト骨形成タンパク質 4 (BMP-4)。造血分化の 11 日目後、CD34+/CD43+ および CD34+/CD45+ についてフローサイトメトリーによって細胞の造血前駆細胞を評価します。
次に、スピン胚様体 (EB) を、NK 細胞培養条件下でコーティングされていない 24 ウェル プレートの各ウェルに直接移します。その後、5 ng/mL IL-3 (最初の週のみ)、10 ng/mL IL-15、20 ng/mL IL-7、20 ng/mL SCF、および 10 ng/mL flt3 を使用して、細胞はさらに NK 細胞に分化します。リガンドを28～32日間保持します。半分の培地交換は毎週行われます。 50単位/mLのhIL-2の存在下で、ヒトCD19を発現する人工抗原提示K562細胞(aAPC)を発現する照射mbIL-21を使用して、NK細胞を増殖のために回収する。 Matador アッセイを使用したin vitro効力試験の後、細胞はNSG マウスの NALM6 異種移植モデルを使用したin vivo研究に使用されます。追加の無菌性および効力アッセイの後、細胞は、CD19発現B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、慢性リンパ性白血病、およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の患者の治療のためのヒト臨床試験に使用される予定です。
本質的に同様の手順が、当技術分野で知られているｉＰＳＣからＴ細胞への分化のためのプロトコールを使用して、本開示のＳＡＲを発現するｉＰＳＣ由来Ｔ細胞の生成に使用されるであろう。
SARを発現するNK92細胞の作製と利用
、CD20を標的とするSAR （例えば、CD8SP-CD20-VHH-USC1-CD16A-F158V-S197P-FL-v3（配列番号5047））をコードするレンチウイルスベクターで形質導入される。膜アンカー型のIL2をコードする(配列番号1330) NK92細胞を、ヒトCD20を発現する人工抗原提示K562細胞(aAPC)および50単位/mLのhIL-2の存在下で、エクスビボで15日間増殖させる。細胞はγ線照射され、得られた細胞産物は品質管理試験（無菌性および腫瘍特異的なインビトロおよびインビボ細胞毒性試験を含む）を受けた後、細胞は凍結保存されます。その間、研究参加者はリンパ除去化学療法（30 mg）を開始します。 /m2/日のフルダラビンと 500 mg/m2/日のシクロホスファミド x 3 日）リンパ球除去レジメンの完了 1 日後、研究参加者は形質導入された NK92 細胞を静脈内注入されます。SAR-NK 製品の用量は 1 x 10 から変化する場合があります。研究プロトコルに従って、 4 SAR+ve NK92 細胞/kg ～ 5 x 10 9 SAR+ve NK92 細胞/kg。 SAR-NK92産物は、単回注入または分割注入で投与することができる。
SARを発現するように操作された造血幹細胞の生成
ＣＤ３４陽性造血幹細胞は、Ｇ－ＣＳＦ動員白血球除去産物から精製され、 ＣＤ８ＳＰ－ＣＤ１９－ＦＨＶＨ－３５４－ＣＤ１６Ａ－Ｆ１５８Ｖ－Ｓ１９７Ｐ－ＦＬ－ｖ３（配列番号： 5042) 。造血幹細胞における内因性CD19の発現は、米国特許第10660919号に記載の技術を使用して任意に除去される。被験者は骨髄破壊的化学療法を受け、その後遺伝子改変幹細胞が注入されます。本質的に同様のアプローチを使用して、造血幹細胞における内因性CD33の除去と組み合わせてCD33標的SAR(例えば配列番号4871)を発現させる。本質的に同様のアプローチを使用して、造血幹細胞における内因性MPLの除去と組み合わせてMPL標的SAR(例えば配列番号4919)を発現させる。
マクロファージ/単球を発現するSARの生成と利用
CD8SP-CD19-FHVH-354-CD16A-F158V-S197P-FL-v3 (配列番号5042)で表されるCD19標的SARは、マクロファージ/単球で発現され、記載された方法を用いたCD19発現リンパ腫の治療に使用されます。 WO2019152781に記載。
SAR-T/NK 細胞肝動脈注入。静脈内注入に加えて、SAR-T 細胞および SAR-NK 細胞を動脈内に注入して、疾患に関係する局所領域または臓器に高濃度の SAR 発現細胞を提供することもできます。
SAR-T/NK細胞の腹腔内投与。 ＳＡＲ －Ｔ／ＮＫ細胞は、本質的にＫｏｎｅｒｕ Ｍら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１５；１３：１０２）に記載されているように、腹腔内投与することもできる。
腫瘍内注射のための SAR-T/NK 細胞の使用。 ＳＡＲ －Ｔ／ＮＫ細胞はまた、基本的にＢｒｏｗｎ ＣＥら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． 2015年9月15日; 21(18): 4062-4072。
異なるSAR発現細胞の組み合わせ
患者は、1 つまたは複数の抗原を標的とする異なる SAR 発現細胞の組み合わせを投与される場合があります。例えば、患者は、CD19標的SAR-T、CD20標的SAR-NK、およびCD22標的SARマクロファージを受けてもよい。あるいは、対象は、CD19標的SAR-T細胞、CD19標的SAR-NK細胞、およびCD19標的SARマクロファージを受けてもよい。
SAR の組み合わせを使用して免疫応答を微調整し、閾値効果が達成された場合にのみシグナル伝達がトリガーされるようにすることができます。したがって、配列番号７６０１のＢＣＭＡを標的とするＳＡＲおよび配列番号７６０７のＣＤ１９を標的とするＳＡＲを発現するＮＫ細胞は、ＢＣＭＡおよびＣＤ１９の両方を発現する細胞に曝露された場合、相加効果または相乗効果を示す可能性がある。相加的/相乗的効果は、異なる抗原 (BCMA や CD19など)を標的とすることによって達成できます。相加的/相乗効果を達成する別のアプローチは、同じ抗原を標的とするが、異なるシグナル伝達鎖を含む異なる SAR 受容体を介することです。例えば、配列番号7607のCD19-SARを発現するNK細胞(CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC)は、別のCD19-SARを共発現することもできる配列番号７６７６（ＣＤ８ＳＰ－ＣＤ１９－ｈｕ－ｍＲＯＯ５－１－ＣＤ１６Ａ－ｖ１５８－Ｓ１９７Ｐ－ＦＬ－ｖ３－Ｆ－Ｆ２Ａ－ＰＡＣ）を有する。代替の実施形態では、２つのＳＡＲは、同じ抗原の異なるエピトープを標的とすることができる。例えば、配列番号7607のCD19-SARを発現するNK細胞(CD8SP-CD19-hu-mROO5-1-scFv-NKp30-ECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC)は、別のCD19-SARを共発現することもできる配列番号7660 (FMC64-CD16A-v158-S197P-FL-v3-F-F2A-PAC)を有する、または配列番号7668 (hCD19-Bu12-CD16A-v158-S197P-FL-v3)を有するCD19-SAR -F-F2A-PAC)。
別の実施形態では、ＣＤ１６シグナル伝達鎖を含むＳＡＲを、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、Ｄａｐ１０および／またはＣＤ３ｚシグナル伝達鎖を含むＳＡＲと組み合わせて、相加的／相乗効果を得ることができる。別の実施形態では、ＮＫｐ３０シグナル伝達鎖を含むＳＡＲを、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｄａｐ１０および／またはＣＤ３ｚシグナル伝達鎖を含むＳＡＲと組み合わせて、相加的／相乗効果を得ることができる。同様に、NKp44シグナル伝達鎖を含むSARを、CD16、NKp30、NKp46、NKG2D、Dap10および/またはCD3zシグナル伝達鎖を含むSARと組み合わせて、相加的/相乗効果を得ることができる。同様に、NKp46シグナル伝達鎖を含むSARを、CD16、NKp30、NKp44、NKG2D、Dap10および/またはCD3zシグナル伝達鎖を含むSARと組み合わせて、相加的/相乗効果を得ることができる。同様に、DAP10シグナル伝達鎖を含むSARを、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、および/またはCD3zシグナル伝達鎖を含むSARと組み合わせて、相加的/相乗効果を得ることができる。同様に、CD3zシグナル伝達鎖を含むSARを、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、および/またはDAP10シグナル伝達鎖を含むSARと組み合わせて、相加的/相乗効果を得ることができる。同様に、NKG2Dシグナル伝達鎖を含むSARを、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、CD3z、および/またはDAP10シグナル伝達鎖を含むSARと組み合わせて、相加的/相乗効果を得ることができる。

Claims (245)

  1. 標的抗原に特異的に結合する合成抗原受容体（SAR）であって、以下を含むSAR：
    (i) 以下からなる群から選択される１つ以上の異種抗原結合ドメインを含む第１のモジュール：
    a) 抗体。
    b) 抗体フラグメント；
    c) 抗体の重鎖可変領域（vHドメイン）またはその断片；
    d) 抗体の軽鎖可変領域（vLドメイン）またはその断片；
    e) 単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはそのフラグメント；
    f) 単一ドメイン抗体（SDAB）またはそのフラグメント；
    g) vHHドメインまたはその断片；
    h) 抗体の単量体可変領域。
    i) 単一のvHドメイン（SVH）またはその断片。
    j) 単一の vL ドメイン (SVL) またはそのフラグメント。
    k) ＤＡＲＰＩＮ、アフィボディ、アフィリス、アドネクチン、アフィチン、オボディ、レペボディ、フィノマー、アルファボディ、アビマー、アトリマー、センチリン、プロネクティ、アンチカリンから選択される非免疫グロブリン抗原結合足場、クニッツドメイン、Armadilloリピートタンパク質、Dドメイン、および上記のいずれかのフラグメント；
    l) 受容体またはその断片のリガンド結合ドメイン；
    m) リガンドの受容体結合ドメイン。
    n) 二重特異性抗体、抗体フラグメント、scFV、vHH、SDAB、非免疫グロブリン抗原結合足場、受容体またはリガンド。
    o) 自己抗原またはその断片；
    p) アダプター結合ドメインまたはその断片；
    q) Fc結合ドメインまたはその断片；
    r) ＴＣＲまたはＨＬＡ非依存性ＴＣＲまたはその断片；と
    s) ＴＣＲのＶａ、Ｖｂ、ＶｇもしくはＶｄ断片またはその断片、

    (ii) 少なくとも１つの膜関連ドメインを含む第２のモジュールであって、膜関連ドメインは膜貫通ドメインまたは膜アンカードメインであり得る。と
    (iii) 1つまたは複数のサイトゾルドメインを含む任意の第3モジュール、
    ここで、第 1 モジュール、第 2 モジュール、およびオプションの第 3 モジュールは、1 つ以上のオプションのリンカーを介して動作可能にリンクされます。
  2. １つ以上の異種抗原結合ドメインを含む前記第１のモジュールが、任意のリンカーを介して、以下を含むポリペプチドに機能的に連結されている、請求項１に記載の単鎖ＳＡＲ：
    (1) 天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    (2) 天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    (3) 天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    (4) 天然に存在する受容体またはその断片もしくは変異体のサイトゾルドメイン。また
    (5) シグナル伝達アダプターまたはその変異体もしくは断片の全体または部分的な細胞外ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメイン。
  3. 請求項２に記載のＳＡＲであって、
    a) 天然に存在する受容体は、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、およびプレTCRαからなる群から選択されるT細胞受容体を含まない。および/または
    b) 天然に存在する受容体は、T細胞受容体モジュール(TCRM)を含まない。および/または
    c) シグナル伝達アダプターは、CD3ζ、CD3γ、CD3ε、およびCD3δの群から選択されるCD3アダプターではない。および/または
    d) シグナル伝達アダプターは FcRγ ではありません。
  4. 前記天然に存在する受容体が、Ｎ末端細胞外ドメインを有するＩ型膜タンパク質であり、１つ以上の異種抗原結合ドメインを含むポリペプチドのＮ末端が、任意のリンカーを介して前記細胞外ドメインに機能的に連結されている、請求項２または３に記載のＳＡＲ。を含むポリペプチドのN末端またはN末端付近
    a) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    b) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    c) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    d) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖のサイトゾルドメイン、またはその断片もしくは変異体。
  5. 前記天然受容体Ｉ型膜タンパク質が、 ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、 KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、 CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、 CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、LAIR1、それらの変異体および断片。
  6. 前記天然に存在する受容体が、Ｃ末端細胞外ドメインを有するＩＩ型膜タンパク質であり、１つ以上の異種抗原結合ドメインをコードするポリペプチドのＮ末端が、任意のリンカーを介して前記細胞外ドメインに機能的に連結されている、請求項２または３に記載のＳＡＲ。以下を含むポリペプチドのC末端またはC末端付近:
    a) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    b) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体のヒンジドメイン、膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    c) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖またはその断片もしくは変異体の膜貫通／膜関連ドメインおよび任意のサイトゾルドメイン；また
    d) 天然に存在する受容体ポリペプチド鎖のサイトゾルドメイン、またはその断片もしくは変異体。
  7. ＩＩ型膜タンパク質のＮ末端に作動可能に連結されたシグナル伝達アダプターのサイトゾルドメインを含むポリペプチドのＮ末端をさらに含む、請求項６に記載のＳＡＲ。
  8. 前記シグナル伝達アダプターが、CD3ζ、FcRγ、DAP10またはDAP10の群から選択される、請求項7に記載のSAR。
  9. 前記シグナル伝達アダプターのサイトゾルドメインのＮ末端に作動可能に連結された１つ以上の共刺激ドメインを含むポリペプチドのＮ末端をさらに含む、請求項８に記載のＳＡＲ。
  10. 前記1つまたは複数の共刺激ドメインが、 CD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEMおよびアイコス。
  11. ＤＡＰ１０を含むアクセサリモジュールと同時発現される、請求項１０に記載のＳＡＲ。
  12. 前記天然受容体II型膜タンパク質が、 NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、 KLRG1、CD94、CD161、それらの変異体、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項6～10のいずれか一項に記載のSAR。
  13. 前記全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、前記任意選択のヒンジドメイン、前記膜貫通ドメインおよび任意選択のサイトゾルドメインがすべて単一の天然に存在する受容体に由来し、1つの連続したポリペプチド鎖中に存在する、請求項3に記載のSAR 。
  14. 細胞外抗原結合ドメイン全体または部分、任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインが、２つ以上の異なる天然受容体に由来する、請求項２に記載のＳＡＲ。
  15. 請求項１４に記載のＳＡＲであって、
    a) 天然に存在する受容体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメインは、１つまたは複数の異なる天然に存在する受容体に由来する任意のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインに機能的に連結されており、また
    b) 天然に存在する受容体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメインおよび任意のヒンジドメインは、1つまたは複数の異なる天然に存在する受容体に由来する膜貫通ドメインおよび任意のサイトゾルドメインに機能的に連結されており、また
    c) 天然に存在する受容体の全体または部分的な細胞外抗原結合ドメイン、任意のヒンジおよび膜貫通ドメインは、1つまたは複数の異なる天然に存在する受容体に由来するサイトゾルドメインに機能的に連結されている。
  16. 前記サイトゾルドメインがITAMを含む活性化ドメインを含む、請求項2に記載のSAR。
  17. 前記サイトゾルドメインがITAMを含む活性化ドメインを欠いている、請求項２に記載のSAR。
  18. 前記細胞質ゾルドメインが、ＣＤ３ε、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１０の群から選択される１つまたは複数のシグナル伝達アダプターを動員する、請求項２に記載のＳＡＲ。
  19. 前記サイトゾルドメインが１つ以上の共刺激ドメインを含む、請求項２に記載のＳＡＲ。
  20. 前記１つ以上の共刺激ドメインが、 ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、２Ｂ４、ＣＤ２７、ＣＤ８１、ＣＤ２、ＣＤ５、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、 ICOS、そのバリアント、およびそのフラグメント。
  21. 前記サイトゾルドメインが共刺激ドメインを欠いている、請求項２に記載のＳＡＲ。
  22. 前記サイトゾルドメインが、前記膜貫通ドメインと前記活性化ドメインとの間に位置する１つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項２に記載のＳＡＲ。
  23. 天然に存在する受容体が、CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、 KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、 TNFR- II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、CD161、それらの変異体およびそれらの断片。
  24. 前記ＳＡＲが、天然に存在する受容体の細胞外抗原結合ドメインの抗原結合特性を部分的または完全に保持し、第１のモジュールに位置する１つまたは複数の異種抗原結合ドメインの抗原結合特異性を獲得する、請求項２または３に記載のＳＡＲ。 。
  25. 細胞の表面上で発現されると、細胞にMHC(またはHLA)依存性および/またはMHC(またはHLA)非依存性の抗原認識を与えることができる、請求項1に記載のSAR。
    a) SARの抗原結合ドメインは単一の連続したポリペプチド鎖から構成されていません。および/または
    b) SARの抗原結合ドメインは抗体または抗体断片に由来しない。および/または
    c) SAR には T 細胞受容体モジュールが含まれていません。
  26. 前記ＳＡＲの抗原認識ドメインが、ＴＣＲの少なくとも２つの可変ドメインに由来する、請求項２５に記載のＳＡＲ。
  27. 前記２つの可変ドメインが、Ｖα、Ｖβ、Ｖγ、ＶδおよびプレＴＣＲαから選択される少なくとも２つの可変ドメインのヘテロ二量体を含む、請求項２６に記載のＳＡＲ。
  28. 前記２つの可変ドメインが、ＶαおよびＶβ、またはＶγおよびＶδである、請求項２７に記載のＳＡＲ。
  29. 前記２つの可変ドメインが柔軟なペプチドリンカーによって連結されていない、請求項２８に記載のＳＡＲ。
  30. 単鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）ではない、請求項２９に記載のＳＡＲ。
  31. ２つの鎖を有し、少なくとも１つの鎖が膜結合している、請求項２５に記載のＳＡＲ。
  32. 両方の鎖が膜結合している、請求項３１に記載のＳＡＲ。
  33. ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子と複合体を形成したペプチドに結合することができる、請求項２５に記載のＳＡＲ。
  34. 細胞の表面上で発現されると、ペプチド／ＭＨＣ複合体によって結合されたときに少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員する能力を細胞に付与する、請求項２５に記載のＳＡＲ。
  35. 細胞の表面上で発現されると、ペプチド／ＭＨＣ複合体によって結合されたときに少なくとも１つのシグナル伝達経路を開始する能力を細胞に与える、請求項２５に記載のＳＡＲ。
  36. 非Ｔ細胞において機能的に発現され得る、請求項２５に記載のＳＡＲ。
  37. 機能的ＣＤ３複合体の発現を欠く細胞において機能的に発現され得る、請求項３６に記載のＳＡＲ。
  38. ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の機能的発現を欠く細胞において機能的に発現され得る、請求項３７に記載のＳＡＲ。
  39. 非Ｔ細胞にＴ細胞様の抗原認識を与えることができる、請求項３６に記載のＳＡＲ。
  40. ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の機能的発現を欠くＴ細胞にＴ細胞様の抗原認識を与えることができる、請求項３６に記載のＳＡＲ。
  41. 非Ｔ細胞に対する抗原認識時にＴ細胞様シグナル伝達を与えることができる、請求項３６に記載のＳＡＲ。
  42. ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖の機能的発現を欠くＴ細胞にＴ細胞様シグナル伝達を与えることができる、請求項３６に記載のＳＡＲ。
  43. 任意の細胞にＴ細胞様の抗原認識を与えることができる、請求項２２２に記載のＳＡＲ。
  44. 少なくとも２つの鎖を含み、
    ａ）第１のポリペプチド鎖は、ｖＬ、Ｖα、またはＶγドメインを含む第１の抗原結合ドメインおよび第１の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含む；と
    ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ｖＨ、Ｖβ、またはＶδドメインを含む第２の抗原結合ドメインおよび第２の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含む；
    ここで、第1の抗原結合ドメインのvL、VαまたはVγドメインと第2の抗原結合ドメインの相補的vH、VβまたはVδドメインは、標的に特異的に結合するFvまたはTCR-Fv様の抗原結合モジュールを形成する抗原;と
    ここで、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員できる非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を形成する。
  45. 前記第１のポリペプチド鎖が、前記第１の抗原結合ドメインと前記第１のＭＡＭとの間に第１のペプチドリンカーをさらに含み、前記第２のポリペプチド鎖が、前記第２の抗原結合ドメインと前記第２のＭＡＭとの間に第２のペプチドリンカーをさらに含む、請求項４４に記載のＳＡＲ 。ママ。
  46. 前記第１および／または第２のペプチドリンカーが、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む、請求項４５に記載のＳＡＲ。
  47. 前記第１および／または第２のペプチドリンカーが、個別に、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４もしくはＣＬ抗体ドメイン、またはそれらの断片を含む、請求項４６に記載のＳＡＲ。
  48. 前記第１および／または第２のペプチドリンカーが、個別に、Ｃα、Ｃβ、ＣγもしくはＣδ ＴＣＲドメイン、またはその断片を含む、請求項４６に記載のＳＡＲ。
  49. 前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖が、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結されている、請求項４４または４５に記載のＳＡＲ 。
  50. 第１および／または第２のペプチドリンカーが、２つのポリペプチド鎖の発現、親和性および／または対合を増加させる変異を含む、請求項４５に記載のＳＡＲ 。
  51. 、配列番号３５３６～３５６９および９６２７～９６３１のいずれか１つに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、請求項４５に記載のＳＡＲ 。
  52. 前記第１のポリペプチドが、前記第１のＭＡＭのＮ末端側に第１のヒンジドメインまたはその断片をさらに含む、請求項４４に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチドは、第２のＭＡＭのＮ末端に第２のヒンジドメインまたはその断片をさらに含む。
  53. 前記第１のＭＡＭと前記第２のＭＡＭの残基、および／または前記第１のヒンジドメインの残基と前記第２のヒンジドメインの残基との間のジスルフィド結合を含む、請求項４４に記載のＳＡＲ。
  54. 前記第１のポリペプチドが、前記第１のヒンジドメインのＮ末端側に第１の相同抗原結合ドメインまたはその断片をさらに含む、および／または前記第２のポリペプチドが、前記第１のヒンジドメインのＮ末端側に第２の相同抗原結合ドメインまたはその断片をさらに含む、請求項４４に記載のＳＡＲ。第２のヒンジドメインでは、２つの相同抗原結合ドメインは、対応するヒンジドメインと同じ天然に存在する非Ｔ細胞受容体に由来する。
  55. が、第１のＭＡＭを含む第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端に任意の活性化ドメインを含む第１のサイトゾルドメインをさらに含む、請求項４４に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチドは、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端に任意の活性化ドメインを含む第２のサイトゾルをさらに含む。
  56. 前記第１のポリペプチド鎖が、前記第１のＭＡＭの第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側にある共刺激ドメイン配列を含む第１のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含む、請求項４４に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチド鎖は、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に共刺激ドメイン配列を含む第２のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含む。
  57. 前記共刺激ドメインが、 CD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEMもしくはICOS、または変異体もしくはその断片。
  58. 前記第１および／または第２のＭＡＭおよびＮＴＣＲＭが、非Ｔ細胞受容体の膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメインおよび／または任意の細胞外ドメインから構成される、請求項４４に記載のＳＡＲ。または信号アダプター。
  59. 前記第１および／または第２のＭＡＭおよびＮＴＣＲＭが、すべて単一の非結合ドメインに由来する、膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメイン、および／または任意の細胞外ドメインから構成される、請求項５８に記載のＳＡＲ。 T細胞受容体および/またはシグナル伝達アダプターまたはその変異体。
  60. 前記第１および／または第２のＭＡＭおよびＮＴＣＲＭが、異なる非Ｔ細胞に由来する膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメイン、および／または任意の細胞外ドメインから構成される、請求項５８に記載のＳＡＲ。受容体および／またはシグナル伝達アダプターまたはそれらの変異体。
  61. 、および／または任意の細胞外ドメインが配列において同一であり、同じタンパク質に由来する、請求項５８に記載のＳＡＲ。
  62. 前記２つの膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意の共刺激ドメイン、任意のヒンジドメイン、および／または任意の細胞外ドメインが、配列が異なり、かつ／または異なるタンパク質に由来する、請求項５８に記載のＳＡＲ。
  63. 請求項５８に記載のＳＡＲであって、
    a) T細胞受容体は天然に存在する受容体であり、CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4からなる群から選択される。 、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、 TNFR －ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＲＴＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ、ＩＬＴ２、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、前述のいずれかの変異体、およびそれらの断片；と
    b) 前述のいずれかの変異体、およびそれらの断片からなる群から選択される。
  64. 請求項４４に記載のＳＡＲであって、
    a) 第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３εから選択されるＣＤ３鎖の膜貫通ドメインおよび場合によりサイトゾルドメインを含まない。および/または
    b) 第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、ＴＣＲ鎖およびＣＤ３鎖の膜貫通ドメインを含まない。および/または
    c) 第一のMAMと第二のMAMはCD3ζの膜貫通ドメインを含まない。
  65. 前記ＭＡＭのうちの１つだけが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、およびプレＴＣＲαからなる群から選択されるＴ細胞受容体に由来する、請求項４４に記載のＳＡＲ。
  66. 少なくとも２つの鎖を含み、
    ａ）第１のポリペプチド鎖は、ｖＬドメインを含む第１の抗原結合ドメインと、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδまたはその変異体から選択される第１のＴＣＲ定常鎖とを含み；と
    ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ｖＨドメインと、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδまたはその変異体から選択される第２のＴＣＲ定常鎖とを含む第２の抗原結合ドメインを含み；
    ここで、最初の TCR 定常鎖は TCRα の定常鎖であり、2 番目の TCR 定常鎖は TCRβ の定常鎖、または
    ここで、最初の TCR 定常鎖は TCRβ の定常鎖であり、2 番目の TCR 定常鎖は TCRα の定常鎖、または
    ここで、最初の TCR 定常鎖は TCRγ の定常鎖であり、2 番目の TCR 定常鎖は TCRδ の定常鎖、または
    ここで、最初の TCR 定常鎖は TCRδ の定常鎖であり、2 番目の TCR 定常鎖は TCRγ の定常鎖、または
    ここで、第１のＴＣＲ定常鎖および／または第２のＴＣＲ定常鎖は、そのＮ末端領域のアミノ酸残基を欠いている
    ここで、vLおよびvHドメインは、標的抗原に特異的に結合するFv様抗原結合モジュールを形成し；と
    ここで、第１のＴＣＲ定常鎖および第２のＴＣＲ定常鎖は、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員することができるＴ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を形成する。
  67. 請求項６６に記載のＳＡＲであって、
    a) ＴＣＲα定常鎖は、配列番号（ＰＲＴ）：７８６３～７９６３のアミノ酸配列、またはそれと８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。と
    b) ＴＣＲβ定常鎖は、 ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ（ＰＲＴ）：７９６４～８０８９のアミノ酸配列、またはそれに対して８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。と
    c) ＴＣＲγ定常鎖は、配列番号（ＰＲＴ）：８０９１～８１９１のアミノ酸配列、またはそれに対して８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。と
    d) ＴＣＲδ定常鎖は、ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ（ＰＲＴ）：８１９２～８２９２のアミノ酸配列、またはそれに対して８０～９９％の相同性を有する配列によって表される。
  68. 前記第１および／または第２のポリペプチド鎖が、第１および／または第２のポリペプチド鎖のＮ末端またはＮ末端付近に結合する１つまたは複数の自律抗原結合ドメイン（ＡＡＢＤ）をさらに含む、請求項４４または６６に記載のＳＡＲ 。 2番目の抗原結合ドメイン。
  69. 前記ＡＡＢＤが、単一ｖＨドメイン（ＳＶＨ）、単一ｖＬドメイン（ＳＶＬ）、ｖＨＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＴＣＲの単一可変ドメイン（ｓｖｄ）のうちの１つ以上から選択される、請求項６８に記載のＳＡＲ。 -TCR)、非免疫グロブリン抗原結合足場、受容体のリガンド結合ドメイン、リガンドの受容体結合ドメイン、自己抗原、アダプター結合ドメイン、Fc結合ドメイン、その断片、および/またはその変形。
  70. １つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含むモジュールが、ａ）細胞表面タンパク質抗原、ｂ）ペプチド／ＭＨＣ複合体、およびｃ）脂質からなる群から選択される１つまたは複数の標的抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のＳＡＲ。抗原。
  71. 前記標的抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ１９、およびＣＤ１９からなる群から選択される、請求項１に記載のＳＡＲ。 CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 サブセット 1、CRACC、SLAMF7、CD319、および 19A24 とも呼ばれます)。 C型レクチン様分子-1 (CLL-1またはCLECL1); CD33;上皮成長因子受容体バリアント III (EGFRviii);ガングリオシド G2 (GD2);ガングリオシドGD3; TNF 受容体ファミリーメンバー B 細胞成熟 (BCMA); Tn 抗原 ((Tn Ag); 前立腺特異的膜抗原 (PSMA); 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体 1 (ROR1); FmsLike チロシンキナーゼ 3 (FLT3); 腫瘍関連糖タンパク質 72 (TAG72); CD38; CD44v6;急性白血病またはリンパ腫で発現するが造血前駆細胞では発現しないグリコシル化 CD43 エピトープ、非造血系癌で発現するグリコシル化 CD43 エピトープ、癌胎児性抗原 (CEA)、上皮細胞接着分子 (EPCAM)、B7H3 (CD276)、KIT (CD117) ; インターロイキン 13 受容体サブユニット アルファ-2 (IL-13Ra2 または CD213A2); メソセリン; インターロイキン 11 受容体アルファ (IL-11Ra); 前立腺幹細胞抗原 (PSCA); プロテアーゼ セリン 21 (テスティシンまたは PRSS21); 血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2); ルイス (Y) 抗原; CD24; 血小板由来成長因子受容体ベータ (PDGFR-ベータ); 胎児期特異的抗原-4 (SSEA-4); CD20; 葉酸受容体アルファ; 受容体チロシンタンパク質キナーゼ ERBB2 (Her2/neu); ムチン 1、細胞表面関連 (MUC1); 上皮成長因子受容体 (EGFR);神経細胞接着分子 (NCAM);プロスターゼ;前立腺酸性ホスファターゼ (PAP);伸長因子 2 変異 (ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ (FAP);インスリン様成長因子 1 受容体 (IGF-1 受容体)、炭酸脱水酵素 IX (CA1X)。プロテアソーム (プロソーム、マクロペイン) サブユニット、ベータ タイプ、9 (LMP2);糖タンパク質 100 (gpl00);ブレークポイントクラスター領域 (BCR) とアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ 1 (Abl) (bcr-abl) からなる癌遺伝子融合タンパク質。チロシナーゼ;エフリン A 型受容体 2 (EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子 (sLe);ガングリオシドGM3;トランスグルタミナーゼ 5 (TGS5);高分子量黒色腫関連抗原 (HMWMAA); o-アセチル-GD2 ガングリオシド (OAcGD2);葉酸受容体ベータ。腫瘍内皮マーカー 1 (TEM1/CD248)。腫瘍内皮マーカー 7 関連 (TEM7R);クローディン 6 (CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）; G タンパク質共役受容体クラス C グループ 5、メンバー D (GPRC5D)。染色体 X オープン リーディング フレーム 61 (CXORF61); CD97; CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ (ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的 1 (PLAC1); globoH グリコセラミド (GloboH) の六糖部分。乳腺分化抗原 (NY-BR-1);ウロプラキン 2 (UPK2); A 型肝炎ウイルス細胞受容体 1 (HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ 3 (ADRB3);パネキシン 3 (PANX3); G タンパク質共役受容体 20 (GPR20);リンパ球抗原 6 複合体、遺伝子座 K 9 (LY6K)。嗅覚受容体 51E2 (OR51E2); TCR ガンマ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質 (WT1);がん/精巣抗原 1 (NY-ES0-1);癌/精巣抗原 2 (LAGE-1a);黒色腫関連抗原 1 (MAGE-A1); MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、PRAME、PSA、ETS 転座バリアント遺伝子 6、染色体 12p 上に位置 (ETV6-AML)。精子タンパク質 17 (SPA17); Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体 2 (Tie 2);黒色腫癌精巣抗原-1 (MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2 (MAD-CT-2); Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質 p53 (p53); p53 変異体。プロステイン;生き残っている。テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1 (PCT A-1 またはガレクチン 8)、T 細胞によって認識される黒色腫抗原 1 (MelanA または MARTI)。ラット肉腫 (Ras) 変異体。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）;肉腫転座ブレークポイント;黒色腫アポトーシス阻害剤 (ML-IAP); ERG (膜貫通プロテアーゼ、セリン 2 (TMPRSS2) ETS 融合遺伝子); N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ V (NA17);ペアボックスタンパク質Pax-3 (PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリン B1; v-myc 鳥骨髄細胞腫症ウイルス性腫瘍遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ (MYCN); Ras ホモログファミリーメンバー C (RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質 2 (TRP-2);シトクロム P450 1B 1 (CYP1B 1); CCCTC 結合因子 (ジンクフィンガータンパク質) 様 (BORIS またはインプリント部位調節因子の兄弟)、T 細胞 3 (SART3) によって認識される扁平上皮癌抗原。ペアボックスタンパク質 Pax-5 (PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32 (OY-TES1);リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（LCK）;キナーゼアンカータンパク質 4 (AKAP-4)。滑膜肉腫、X ブレークポイント 2 (SSX2)。最終糖化生成物 (RAGE-1) の受容体。腎臓ユビキタス 1 (RU1);腎臓ユビキタス 2 (RU2);レグマイン。ヒトパピローマウイルス E6 (HPV E6);ヒトパピローマウイルス E7 (HPV E7);腸のカルボキシルエステラーゼ。熱ショックタンパク質 70-2 変異 (mut hsp70-2)。 CD79a; CD79b; CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体 1 (LAIR1); IgA 受容体の Fc フラグメント (FCAR または CD89)。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリー A メンバー 2 (LILRA2); CD300 分子様ファミリーメンバー f (CD300LF); C 型レクチンドメインファミリー 12 メンバー A (CLEC12A);骨髄間質細胞抗原 2 (BST2); EGF 様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様 2 (EMR2)。リンパ球抗原 75 (LY75);グリピカン-3 (GPC3); Fc受容体様5 (FCRL5);免疫グロブリン ラムダ様ポリペプチド 1 (IGLL1)、MPL、ビオチン、c-MYC エピトープ タグ、CD34、LAMP1 TROP2、GFRalpha4、CDH17、CDH6、NYBR1、CDH19、CD200R、Slea (CA19.9; シアリル ルイス抗原) フコシル- GM1、PTK7、gpNMB、CDH1-CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL11Ra、IL13Ra2、CD179b-IGLl1、ALK TCRガンマデルタ、NKG2D、CD32 (FCGR2A)、Tn ag、CSPG4-HMW-MAA、Tim1-/HVCR1、 CSF2RA (GM-CSFR-alpha)、TGFbetaR2、VEGFR2/KDR、Lews Ag、TCR-beta1 鎖、TCR-beta2 鎖、TCR-γ 鎖、TCR-δ 鎖、FITC、黄体形成ホルモン受容体 (LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体（FSHR）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（CGHR）、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、HIV1エンベロープ糖タンパク質、HTLV1-Tax、CMV pp65、EBV-EBNA3c、インフルエンザA型ヘマグルチニン（HA）、GAD、PDL1、グアニリルシクラーゼC (GCC)、デスモグレイン 3 に対する自己抗体 (Dsg3)、デスモグレイン 1 に対する自己抗体 (Dsg1)、HLA、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA 、HLA-DOB、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-G、IGE、CD99、RAS G12V、組織因子 1 (TF1)、AFP、GPRC5D、claudin18.2 (CLD18A2 OR CLDN18A.2)、P-糖タンパク質、 STEAP1、LIV1、NECTIN-4、CRIPTO、GPA33、BST1/CD157、低コンダクタンス塩素チャネル、および SARS-CoV2 スパイクタンパク質。
  72. コードされたＳＡＲポリペプチドが、以下からなる群から選択される１つまたは複数の異種抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載のＳＡＲ。
    (i) 配列番号2682～2918のいずれかに記載の配列もしくはそれと少なくとも80%の同一性を有する配列、または3つの相補性決定において少なくとも80%の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域(vH)配列番号２６８２～２９１８のいずれか１つ以上に示される配列、または配列番号２６８２のいずれか１つ以上に示される配列の３つのＣＤＲにおいて３つ未満の置換を有する配列に対する領域（ＣＤＲ） -2918、またはvHに属し、それぞれ配列番号11593～11829、11830～12066、12067～12303で示されるCDR1、CDR2およびCDR3に3つ未満の置換を有する配列、または結合する配列配列番号２６８２～２９１８のいずれか１つ以上に記載され、その抗原に結合するポリペプチドをコードする配列として、同じ標的抗原または標的抗原上の同じエピトープに対して；
    番号２４４０～２６７６のいずれか１つに示される配列、または配列番号２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に示される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域（ｖＬ） ： ２４４０～２６７６、または配列番号２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に記載の配列と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において少なくとも８０％の同一性を有する配列、または３つの配列のうち３つ未満の置換を有する配列配列番号１２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に示される配列のＣＤＲ、またはｖＬに属し、配列番号１０８８２～１１１１８に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に３つ未満の置換を有する配列のＣＤＲ 、１１１１９～１１３５５および１１３５６～１１５９２をそれぞれコードする配列、または配列番号２４４０～２６７６のいずれか１つ以上に示される配列として同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列。その抗原に結合するポリペプチド。
    （ｉｉｉ）配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つに記載の配列もしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列、または６つの相補性において少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つ以上に示される配列、または配列番号２９２４～３１６０のいずれか１つ以上に示される配列の６つのＣＤＲにおいて６個未満の置換を有する配列に対する決定領域（ＣＤＲ）と、 ２９２４～３１６０、またはｓｃＦＶを含むｖＨに属し、それぞれ配列番号１１５９３～１１８２９、１１８３０～１２０６６、１２０６７～１２３０３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に３つ未満の置換を有する配列およびそれ以下を含むvLに属する軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の3つの置換よりも、 ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１０８８２～１１１１８、１１１１９～１１３５５および１１３５６～１１５９で示されるか、またはいずれか１つ以上の配列として同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列である。配列番号２９２４～３１６０の、その抗原に結合するポリペプチドをコードするもの；
    (iv)配列番号3210～3353、10695～10713のいずれか1つに記載の配列、または少なくとも70 %の同一性を有する配列を含む、単一ドメイン抗体、vHHドメイン、SVH、および/またはFHVHドメイン配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上に示される配列、および／または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）においていずれか１つまたは複数に示される配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３、または配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上に記載の配列の３つのＣＤＲに３つ未満の置換を有する配列、または配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上の配列配列番号３２１０～３３５３、１０６９５～１０７１３のいずれか１つ以上に示される配列として同じ標的抗原または標的抗原上の同じエピトープに結合し、その抗原に結合するポリペプチドをコードするもの；
    配列番号3366～3377のいずれか1つのポリヌクレオチド、または配列番号3366～3377のいずれか1つもしくは複数に記載の配列と少なくとも70%の同一性を有する配列によってコードされる非免疫グロブリン足場配列番号３３６６～３３７７のいずれか１つ以上に示される配列と同じ標的抗原または標的抗原上の同じエピトープに結合するもの；
    （ｖｉ）配列番号３３７８～３３９５、３８８０、３８８２、３８８６、３８９３、３８９６、３８９７のいずれか１つに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む受容体のリガンド結合ドメインであって、その同族体に結合するポリペプチドをコードする。
    (vii)配列番号3396～3406、10786～10787のいずれか1つに記載の配列、またはそれと少なくとも70%の同一性を有する配列を含み、その同族体に結合するポリペプチドをコードするリガンドの受容体結合ドメイン;
    （ｖｉｉｉ）配列番号３４０７～３４３５、１０７７１～１０７８０のいずれか１つに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含み、そのアダプターに結合するポリペプチドをコードするアダプター結合ドメイン；
    （ｉｘ）配列番号１０７８８～１０７９１のいずれか１つに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含み、その自己抗体または自己抗体産生細胞に結合するポリペプチドをコードする自己抗原；
    （ｘ）配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれかに記載の配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むＴＣＲ可変領域（Ｖａ、Ｖｂ、ＶｇまたはＶｄ）、または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において、配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれか１つ以上に記載の配列、または３つ未満の置換を有する配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列。配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれか１つ以上に示される配列、または配列セットと同じ標的抗原もしくは標的抗原上の同じエピトープに結合する配列の３つのＣＤＲ第４に、配列番号３３５７～３３６４、９６０６～９６１４、１０７８１～１０７８２のいずれか１つ以上において、その抗原に結合するポリペプチドをコードするもの；と
    （ｘｉ）配列番号９６１３～９６１４のいずれかに記載の配列、またはそれに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列、または３つの相補性において７０～９９％の同一性を有する配列を含む単一可変ＴＣＲドメイン（ｓｖｄ－ＴＣＲ）配列番号９６１３～９６１４のいずれか１つ以上に示される配列、または配列番号９６１３のいずれか１つ以上に示される配列の３つのＣＤＲにおいて３つ未満の置換を有する配列に対する決定領域（ＣＤＲ） -9614、または配列番号9613～9614のいずれか1つまたは複数に記載の配列と同じ標的抗原または標的抗原上の同じエピトープに結合し、その抗原に結合するポリペプチドをコードする配列。
  73. 天然に存在する受容体および／またはシグナル伝達アダプターもしくはその断片が、配列番号３７４３～３９６６、３３８５、３３９４、７８１８～７８２２、９６３３～９８５９から選択される配列、または配列から選択される配列を含む、請求項２または５８に記載のＳＡＲ 。それに対する配列に対して７０％の相同性を有する。
  74. 受容体のヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインおよび／またはシグナル伝達アダプターを含むポリペプチドが、配列番号９６６９～９７０４、３８１３、８７２１、８７３３および８７４６、またはそれに対する配列に対して７０％の相同性を有する配列。
  75. 天然に存在する受容体および／またはシグナル伝達アダプターの膜関連ドメインが、配列番号３９１４～３９２８、９７４１～９７７６、９８５２～９８５５から選択される配列、または配列から選択される配列を含む、請求項１、２、または５８に記載のＳＡＲ 。それに対する配列に対して７０％の相同性を有する。
  76. 天然に存在する受容体および／またはシグナル伝達アダプターのサイトゾルドメインが、配列番号３９４４～３９５８、９７７７～９８１２、９８５６～９８５９から選択される配列、または７０を有する配列を含む、請求項１、２または５８に記載のＳＡＲ 。配列に対する相同性％。
  77. 天然に存在する受容体および／またはシグナル伝達アダプターの活性化ドメインが、配列番号９８５６～９８５９および９７７７から選択される配列、またはその配列に対して７０％相同性を有する配列を含む、請求項１６または５５に記載のＳＡＲ 。
  78. 前記共刺激ドメインが、配列番号９８０７～９８１０から選択される配列、またはその配列に対して７０％の相同性を有する配列を含む、請求項９、４８ 、および５６に記載のＳＡＲ 。
  79. 各鎖のＮ末端に存在するリーダー配列またはシグナルペプチドをさらに含み、場合により配列番号２４２５～２４３０からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のＳＡＲ。
  80. 前記ＳＡＲがＳＡＲヘテロ二量体を含む、請求項１に記載の単離されたＳＡＲポリペプチド。
  81. 切断可能なリンカーによって連結された２つのＳＡＲ鎖を含む、請求項１または８０に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  82. 前記切断可能リンカーが自己切断性切断可能リンカーである、請求項８１に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  83. 前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはそれらの機能的等価物のいずれか１つ以上である、請求項８２に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  84. 前記切断可能なリンカーが、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａリンカー、またはそれらの機能的等価物のいずれか１つ以上である、請求項８３に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  85. 前記切断可能なリンカーが、配列番号３６２７～３６３２のいずれか１つ以上の配列を含む、請求項８４に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  86. 前記切断可能なリンカーが、必要に応じて、フリン切断部位、フリン様切断部位、またはそれらの機能的等価物によって先行される、請求項８４に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  87. 前記切断可能リンカーに先行するフリン切断部位が、配列番号３６３５～３６３６のいずれか１つ以上の配列を含む、請求項８６に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  88. 前記切断可能なリンカーの前に柔軟なリンカーが存在する、請求項８６～８７のいずれか一項に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  89. 切断可能なリンカーに先行する柔軟なリンカーが、１つ以上のＳｅｒ－Ｇｌｙリンカーまたはその機能的等価物をコードする、請求項８８に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  90. 切断可能なリンカーに先行する柔軟なリンカーが配列番号３６３３～３６３４の配列を含む、請求項８９に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  91. フリン切断部位－フレキシブルリンカーの順序となるように、フリン切断部位の後にフレキシブルリンカーが続き、その次に切断可能なリンカーが続く、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。 -切断可能なリンカー。
  92. 前記ＳＡＲが、選択された抗原に対して所望の結合親和性を有するように設計されている、請求項１または８０に記載の単離された合成抗原受容体（ＳＡＲ）ポリペプチドまたはポリペプチドヘテロ二量体。
  93. からなる群から選択されるポリペプチドを含むアクセサリーモジュールをさらに発現する、請求項１に記載のＳＡＲ：
    a) サイトカインまたはその変異体;
    b) 膜アンカー型サイトカイン。
    c) エピトープタグを有する膜アンカー型サイトカイン。
    d)自殺、生存、マーカー機能として機能する多目的スイッチ。
    e) シグナル伝達アダプター分子。と
    f) キルスイッチ。
  94. 請求項９３に記載のアクセサリモジュールであって、
    a) サイトカインは、配列番号７８３３～７８４２の配列、またはそれに対して最大７０％の配列相同性を有する変異体を含み、そして
    b) 膜アンカー型サイトカインは、配列番号７８２５～７８３２の配列、またはそれに対して最大７０％の配列相同性を有する変異体を含み、
    c) 多目的スイッチは、配列番号７８４３～７８５０の配列、またはそれに対して７０％の配列相同性を有する変異体を含み、
    d) アダプターは、CD3ζ、FcRγ、DAP10、および DAP12 のグループから選択されます。
  95. 式： を有する、請求項９４に記載の多目的スイッチを含むポリペプチド：
    SP-D1-L1-D2-L2-D3-L3-D4;ここで
    SP は、多目的スイッチの細胞表面輸送を可能にするオプションのシグナルペプチドであり、切断されて成熟ペプチドが生成されます。
    D1は細胞の生存を促進する受容体に結合する受容体結合ドメインであり、
    D2 はマーカー/自殺ドメインであり、
    は、D1 および D2 ドメインが標的細胞の表面から突き出ることを可能にするヒンジ ドメイン/ストーク ドメインです。
    D4 は多目的スイッチを細胞膜に固定する膜結合ドメインです。
    L1、L2、および L3 はオプションのリンカーです。
  96. 前記多目的スイッチポリペプチドが、第１のモジュール（Ｄ１）、（Ｄ２）、（Ｄ３）および（Ｄ４）のインフレーム融合を含む、請求項９５に記載のポリペプチド。
  97. 請求項９６に記載のポリペプチドであって、
    a) D3 モジュールと D4 モジュールは同じ内因性タンパク質に由来します。また
    b) D2、D3、および D4 モジュールは、異なる内因性タンパク質に由来します。また
    c) D3 と D4 は同じ内因性タンパク質に由来します。また
    d) D3 と D4 は、異なる内因性タンパク質に由来します。
  98. 第１のモジュール（Ｄ１）が細胞表面上で発現される受容体に結合する、請求項９５に記載のポリペプチド。
  99. 前記受容体が結合すると、生存促進および／または増殖シグナルを細胞に伝達する、請求項９８に記載のポリペプチド。
  100. シスで前記受容体に結合する、および／または前記第１のモジュールが前記受容体にトランスで結合する、請求項９８に記載のポリペプチド。
  101. 第１のモジュール（Ｄ１）が、サイトカイン、ケモカイン、リガンド、またはそれらの変異体もしくは断片の受容体結合ドメインを含む、請求項９５に記載のポリペプチド。
  102. 前記Ｄ１が、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８ 、 IL21 、CD40L、4-1BBL、CD30L、OX40L、FLT3-L、APRIL、BAFF、Rantes、MIP、エリスロポエチン、トロンボポエチン、SCF（幹細胞因子）、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、のバリアント前述のいずれか、および前述のいずれかの断片。
  103. 前記Ｄ１が、配列番号７８３３～７８４２で表される配列を有するポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する変異体を含む、請求項１０１に記載のポリペプチド。
  104. 前記Ｄ１が、受容体に結合できる抗体、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、または非免疫グロブリン抗原結合モジュールを含む、請求項９５に記載のポリペプチド。
  105. 前記D1が、IL2R、IL6R、IL7R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL15R、IL18、IL21 CCR1、CCR3、CCR5、MIP-1Rからなる群から選択される受容体に結合する、請求項95または104に記載のポリペプチド。 、PF4 受容体、エリスロポエチン受容体 (Epo-R)、TPO-R/MPL、GSF-R、c-Kit、および M-CSF 受容体。
  106. Ｄ２が非内因性ポリペプチドを含む、請求項９５に記載のポリペプチド。
  107. 前記Ｄ２が、内在性タンパク質の細胞外ドメインまたはその変異体もしくは断片を含む、請求項９５に記載のポリペプチド。
  108. 前記Ｄ２が、以下の内因性タンパク質またはその変異体もしくは断片のうちの１つ以上の細胞外ドメインを含む、請求項９５に記載のポリペプチド。 CD19; CD123; CD22; CD30; CD38、CD52、CD171; CS1 (SLAMF7、CD319); C型レクチン様分子-1 (CLL-1またはCLECL1); CD33;上皮成長因子受容体バリアント III (EGFRviii);ガングリオシド G2 (GD2);ガングリオシドGD3; BCMA; Tn 抗原 (Tn Ag);前立腺特異的膜抗原 (PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体 1 (ROR1)。 FMS 様チロシンキナーゼ 3 (FLT3);腫瘍関連糖タンパク質 72 (TAG72); CD38; CD44v6;癌胎児性抗原 (CEA);上皮細胞接着分子 (EPCAM); B7H3 (CD276);キット (CD117);インターロイキン 13 受容体サブユニット アルファ 2 (IL-13Ra2 または CD213A2)。メソテリン;インターロイキン 11 受容体アルファ (IL-11Ra);前立腺幹細胞抗原 (PSCA);プロテアーゼ セリン 21 (テスティシンまたは PRSS21);血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2);ルイス(Y)抗原; CD24;血小板由来増殖因子受容体ベータ (PDGFR-ベータ);段階特異的胚抗原-4 (SSEA-4); CD20;葉酸受容体アルファ (FRα または FR1);葉酸受容体ベータ (FRb);受容体チロシンプロテインキナーゼ ERBB2 (Her2/neu);ムチン 1、細胞表面関連 (MUC1)。上皮成長因子受容体 (EGFR);神経細胞接着分子 (NCAM);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ (FAP);インスリン様成長因子 1 受容体 (IGF-1 受容体)、炭酸脱水酵素 IX (CA1X)。エフリン A 型受容体 2 (EphA2);シアリルルイス接着分子 (sLe);ガングリオシドGM3;高分子量黒色腫関連抗原 (HMWMAA); o-アセチル-GD2 ガングリオシド (OAcGD2);腫瘍内皮マーカー 1 (TEM1/CD248)。腫瘍内皮マーカー 7 関連 (TEM7R);クローディン 6 (CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）; G タンパク質共役受容体クラス C グループ 5、メンバー D (GPRC5D)。 CD97; CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ (ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的 1 (PLAC1); globoH グリコセラミド (GloboH) の六糖部分。乳腺分化抗原 (NY-BR-1);ウロプラキン 2 (UPK2); A 型肝炎ウイルス細胞受容体 1 (HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ 3 (ADRB3);パネキシン 3 (PANX3); G タンパク質共役受容体 20 (GPR20);リンパ球抗原 6 複合体、遺伝子座 K 9 (LY6K)。嗅覚受容体 51E2 (OR51E2); TCR ガンマ代替リーディング フレーム タンパク質 (TARP);アンドロゲン受容体; T 細胞によって認識される扁平上皮癌抗原 3 (SART3); CD79a; CD79b; CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1 (LAIR1); IgA 受容体の Fc フラグメント (FCAR または CD89)。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリー A メンバー 2 (LILRA2); CD300 分子様ファミリーメンバー f (CD300LF); C 型レクチンドメインファミリー 12 メンバー A (CLEC12A);骨髄間質細胞抗原 2 (BST2); EGF 様モジュールを含むムチン様ホルモン受容体様 2 (EMR2)。リンパ球抗原 75 (LY75);グリピカン-3 (GPC3); Fc受容体様5 (FCRL5);免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＭＰＬ、ＣＤ３４、ＬＡＭＰ１ ＴＲＯＰ２、ＧＦＲα４、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ６、ＮＹＢＲ１、ＣＤＨ１９、ＣＤ２００Ｒ、Ｓｌｅａ（ＣＡ１９．９；シアリルルイス抗原）；フコシル-GM1、PTK7、gpNMB、CDH1/CD324、DLL3、CD276/B7H3、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL11Ra、IL13Ra2、IL-17R、CD179b-IGLl1、TCRガンマデルタ、NKG2D、CD32 ( FCGR2A)、Tim1-/HVCR1、CSF2RA (GM-CSFR-alpha)、TGFbetaR2、Lews Ag、TCR-beta1 鎖、TCR-beta2 鎖、TCR-γ 鎖、TCR-δ 鎖、FITC、黄体ホルモン受容体 (LHR) 、卵胞刺激ホルモン受容体 (FSHR)、性腺刺激ホルモン受容体 (CGHR または GR)、CCR4、SLAMF6、SLAMF4、CD99、Ras G12V、組織因子 1 (TF1)、GPRC5D、Claudin18.2 (CLD18A2 または CLDN18A.2)、P -糖タンパク質、STRAP1、Liv1、ネクチン-4、Cripto、gpA33、BST1/CD157、低コンダクタンスクロライドチャネル（LCCC）、TAJ/TROY、MPL（TPO-R）、KIR3DL2、CD32b、CD229、Toso、PD-1、 PD-L1、PD-L2、TNFR1、TRAIL-R1 (DR4)、TRAIL-R2 (DR5)、CTLA4、IL-36R、CD25、LAG3、VEGF-A、MASP-2、胸腺間質リンホポエチン、組織因子、IFNAR1 、IL5、IL-6、IL-12、IL-23、IL-17A、IL-13、アンジオポエチン様3、CGRP、IL-23p19、vWF、C5、IFNγ、CD4、CD8、CD7、NKp30、NKp44、 NKp46、NKG2D、PDGRFα、α4β7インテグリン、α4インテグリン、VEGF、GPIIb/IIIa PCSK9、Blys、およびBAFF-R。
  109. 前記Ｄ２は、前記多目的スイッチを発現する細胞を検出、富化および／または死滅させるために使用できる薬剤によって結合され得る、請求項９５に記載のポリペプチド。
  110. 前記薬剤が、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン、抗体薬物複合体、二重特異性抗体、またはその断片または細胞。
  111. Ｄ２に結合する薬剤がインビボまたはエクスビボでのヒト臨床使用が承認されている、請求項１１０に記載のポリペプチド。
  112. 前記薬剤が、リツキシマブ、ハーセプチン、エンヘルツ、エルビトラックス、アドセトリス、エンブレル、トレメリムマブ、モスネツズマブ、テクリスタマブ、ドナネマブ、スペソリマブ、ファリシマブ、ベランタマブ マフォドチン、ティスレリズマブ、ロンカツキシマブ テシリン、タファシタマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、Qbend10。
  113. 前記Ｄ３が、長さ５～１００アミノ酸のストーク（ヒンジドメイン）配列を含む、請求項９５に記載のポリペプチド。
  114. 配列番号（ＰＲＴ）：７８４３～７８５０、配列番号（ＰＲＴ）：９６２５、および配列番号：９６２０～９６２４によって表されるアミノ酸配列を含む、請求項９５に記載のポリペプチド、またはそれらに対して少なくとも８０％の相同性を有する変異体。 。
  115. 配列番号７８４３～７８４９として示される配列、または配列番号７８４３～７８４９として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有し、（ｉ）結合するその変異体を含む、請求項９５に記載のポリペプチド。 J6M0; (ii) ベランタマブ マフォドチンに結合し、(iii) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると生存を促進します。 (v) T 細胞または NK 細胞の表面で発現すると、ベランタマブ マフォドチンの存在下で細胞の死滅を誘導します。
  116. 配列番号９６２０～９６２４として示される配列、または配列番号９６２０～９６２４として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有し、（ｉ）結合するその変異体を含む、請求項９５に記載のポリペプチド。 Qベンド10; (ii) リツキシマブに結合し、(iii) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると生存を促進します。 (v) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると、リツキシマブの存在下で補体を介した細胞の死滅を誘導します。
  117. 配列番号９６２５として示される配列、または配列番号９６２５として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有し、（ｉ）ハーセプチンに結合するその変異体を含む、請求項９５に記載のポリペプチド。 (ii) Enhertu に結合し、(iii) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると、生存を促進します。 (v) T 細胞または NK 細胞の表面に発現すると、ハーセプチンまたはエネヘルツの存在下で細胞の死滅を誘導します。
  118. 請求項１に記載のＳＡＲおよび／または請求項９３に記載の１つ以上のアクセサリーモジュールの第１および／または第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸。
  119. アクセサリーと共発現される、請求項１１８に記載の組換えポリヌクレオチドを含む組換え発現系であって、前記アクセサリーモジュールが、短縮型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、短縮型上皮成長因子受容体ｖｉｉｉ（ｔＥＧＦＲｖｉｉｉ）からなる群から選択される、組換え発現システム。 )、短縮型 CD30 (tCD30)、短縮型 BCMA (tBCMA)、短縮型 CD19 (tCD19)、CD34、チミジンキナーゼ、シトシン デアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン-グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ、ヒト カスパーゼ 8、ヒト カスパーゼ 9、誘導性カスパーゼ 9 (icaspase9) 、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ/リナマリン/グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)/インドール-3-酢酸(IAA)、ガンマ-グルタミルシステインシンテターゼ、CD20/アルファCD20、CD34/チミジンキナーゼキメラ、dox依存性カスパーゼ- 2、変異型チミジンキナーゼ（HSV-TKSR39）、AP1903/Fasシステム、キメラサイトカイン受容体（CCR）、選択マーカー、多目的スイッチ、vFLIP-K13、vFLIP-MC159、4-1BBL-CD40L、DAP10、 DAP12、NKG2C、CD94、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、FcRγ、ジヒドロキシ葉酸受容体（DHFR）、変異型DHFR、メチル化DNAタンパク質システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼII（IMDHP2）、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（PAC）、ブラストサイジン耐性遺伝子、変異体カルシニューリン a/b (Can/b)、CNa12、CNb30、およびそれらの組み合わせ。
  120. ＳＡＲの１つまたは２つの鎖および１つまたは複数のアクセサリーモジュールをコードする組換えポリヌクレオチドが、任意の柔軟なリンカー、任意のフリン切断部位またはフリン様切断部位、およびフリン様切断部位をコードするヌクレオチド配列によって連結されている、請求項１１９に記載の組換え発現システム。切断可能なリンカー。
  121. ＳＡＲの１つまたは２つの鎖および１つまたは複数のアクセサリーモジュールをコードする組換えポリヌクレオチドが、以下を使用して発現される、請求項１２０に記載の組換え発現システム。
    i) 1つ以上のプロモーターと、
    ii) 1 つ以上の内部リボソーム侵入部位 (IRES);
    iii) １つ以上の切断可能なリンカー；
    iv) i、ii、iii の任意の組み合わせ。
  122. 請求項１２１に記載の組換え発現システムであって、
    a) プロモーターは、MNDU3プロモーター、EF1αプロモーター、EFSプロモーター（配列番号8505）、EFS2プロモーター（配列番号8506）、RSVプロモーター（配列番号8507）、またはmutRSVプロモーター（配列番号8508）である。またはそれと70%の同一性を有する配列；と
    b) ＩＲＥＳは、Ｋ－ＩＲＥＳ（配列番号８５０４）、またはそれと７０％の同一性を有する配列である。
  123. 請求項１１８に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項１１９に記載の組換え発現系を含む少なくとも１つのベクターであって、前記ベクターが、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターからなる群から選択される、少なくとも１つのベクター。 、バキュロウイルスベクター、スリーピングビューティートランスポゾンベクター、およびピギーバックトランスポゾンベクター。
  124. １つ以上の構成的プロモーターまたは調節可能なプロモーターを含む、請求項１２３に記載のベクター。
  125. 前記プロモーターが、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、 ＥＦＳプロモーター（配列番号８５０５）、ＥＦＳ２プロモーター（配列番号８５０６）、ＲＳＶプロモーター（配列番号８５０７）、またはｍｕｔＲＳＶプロモーター（配列番号８５０８） 、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１ａプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ＭＳＣＶ ＬＴＲプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、または合成Ｎｏｔｃｈ（ＳｙｎＮｏｔｃｈ）プロモーター。
  126. 前記ベクターがインビトロ転写ベクターであるか、または前記ベクターがポリ(A)テールもしくは3'UTRをさらに含む、請求項123に記載のベクター。
  127. 請求項１に記載の少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドまたはヘテロ二量体、請求項１１８に記載の核酸、任意のアクセサリーモジュール、請求項１１９に記載の組換え発現系、および請求項１２３に記載のベクターを含む、エフェクター細胞または幹細胞。
  128. 前記細胞が複数の一本鎖または二本鎖ＳＡＲポリペプチドを含む、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  129. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つの単鎖または二本鎖ＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる抗原を標的とする、請求項１２８に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  130. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが同じ抗原を標的とする、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  131. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる抗原に対する結合親和性を含む、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  132. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる天然受容体またはシグナル伝達アダプターを含む、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  133. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドとは異なる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、サイトゾルドメインを有する、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  134. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの少なくとも１つのＳＡＲポリペプチドが活性化受容体であり、少なくとも１つの他のＳＡＲポリペプチドが抑制性受容体である、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  135. 前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの２つ以上のＳＡＲポリペプチドが活性化受容体であるか、または前記複数のＳＡＲポリペプチドのうちの２つ以上のＳＡＲポリペプチドが阻害性受容体である、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  136. うちの２つ以上のＳＡＲポリペプチドが、異なるシグナル伝達アダプターを動員し、および／または異なるシグナル伝達経路を活性化する、請求項１２７に記載のエフェクター細胞または幹細胞。
  137. 前記エフェクター細胞が、α/β T細胞、γ/δ T細胞、CD8 + T細胞、CD4 + T細胞、メモリーT細胞、ナイーブ細胞である、請求項127～136のいずれか一項に記載のエフェクター細胞または幹細胞。 T細胞、T幹細胞、Treg細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞、iNKT（先天性ナチュラルキラー細胞）、NK細胞、g-NK細胞、記憶様NK細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（CIK）、iPSC、改変型HLA欠損iPSC、iPSC由来NK細胞、iPSC由来T細胞、B細胞、マクロファージ/単球、顆粒球、樹状細胞、不死化細胞株、不死化NK細胞株、NK92細胞株、NK92MI細胞株、ＹＴＳ細胞またはその誘導体。
  138. 複数の多様なＳＡＲポリペプチドを含む、請求項１２７～１３７のいずれか一項に記載のエフェクター細胞の集団。
  139. 前記複数の多様なＳＡＲポリペプチドが異なる配列を含むが、同じ標的抗原または異なる抗原に結合する、請求項１３８に記載の免疫細胞またはエフェクター細胞の集団。
  140. 請求項１２３に記載の少なくとも１つのベクターまたは請求項１１８に記載の少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを、エフェクター細胞、細胞株、造血幹細胞、前駆細胞、または細胞に導入することを含む、請求項１２７に記載のＳＡＲ発現エフェクター細胞を作製する方法。 SARポリペプチドおよび任意のアクセサリーモジュールが発現されるような条件下で、エフェクター細胞を生じさせることができるIPSC。
  141. 前記エフェクター細胞が、機能的ＴＣＲ、機能的ＨＬＡ、β２マクログロブリン、 ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲαもしくはβの発現を欠いているか、または発現が低い、請求項１２７に記載のエフェクター細胞。定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、または染色体6p21領域内の任意の遺伝子;および／またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ９４、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、 PDL1、A2AR、Fc受容体、エンゲージャー、または二重特異性または多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体。
  142. 第１の内因性ＴＣＲサブユニットおよび／または第２の内因性ＴＣＲサブユニットの発現を遮断または減少させるようにエフェクター細胞が修飾されている、請求項１２７に記載のエフェクター細胞。
  143. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δを発現せず、非ＴＣＲ抗原認識ドメインおよびＴ細胞受容体を含む組換え二本鎖ＳＡＲを発現するように組換え発現によって修飾されている、請求項１２７に記載のエフェクター細胞。細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）において、前記細胞はＣＤ３鎖ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、 ＣＤ３εおよびＣＤ３εを発現し、ＣＤ３鎖およびＳＡＲは細胞の表面に位置する機能的ＣＤ３－ＳＡＲ複合体を形成する。
  144. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現せず、および／またはＣＤ３ε、ＣＤ３γもしくはＣＤ３δを発現せず、細胞にとって外因性の組換え二本鎖ＴＣＲを発現するように組換え発現によって修飾されている、請求項１２７に記載のエフェクター細胞であって、前記組換え細胞が、二本鎖TCRは、a) VαおよびVβドメイン、またはb) VγおよびVδドメインを含むTCR抗原認識ドメインと非T細胞受容体モジュール(NTCRM)を含むSARである。
  145. 非Ｔ細胞受容体および／またはシグナル伝達に由来する第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭを含む非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）に任意のリンカーを介して作動可能に連結されたＴＣＲ抗原認識モチーフを含む、請求項１４４に記載のエフェクター細胞。アダプターを含み、さらに任意のサイトゾル共刺激ドメインを含む。
  146. ＮＫ細胞、ｇ－ＮＫ細胞、記憶様ＮＫ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、ｉＰＳＣ、修飾ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来ＮＫからなる群から選択される、請求項１４３～１４５に記載のエフェクター細胞。細胞、B細胞、顆粒球、マクロファージ/単球、樹状細胞、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3δ、CD3εまたはCD3ζ鎖のうちの1つまたは複数が欠損しているT細胞、不死化細胞株、不死化ＮＫ細胞株、ＮＫ９２細胞株、ＮＫ９２ＭＩ細胞株、ＹＴＳ細胞またはそれらの誘導体。
  147. 請求項１２７に記載のエフェクター細胞を生成する方法であって、インビトロ転写されたＲＮＡ（単数または複数）または合成ＲＮＡ（単数または複数）を細胞または細胞集団に導入することを含み、前記ＲＮＡ（単数または複数）が請求項１１８に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
  148. 請求項１２７～１４６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞を生じさせることができる有効量の免疫エフェクター細胞または幹細胞を対象に投与することを含む、対象に抗疾患免疫を提供する方法であって、前記細胞は、自己Ｔ細胞もしくは同種Ｔ細胞、または自己ＮＫ細胞もしくは同種ＮＫ細胞、または自己マクロファージもしくは同種マクロファージ、または自己顆粒球もしくは同種顆粒球、または自己樹状細胞もしくは同種樹状細胞、または、エフェクター細胞を生じさせることができる自己造血幹細胞もしくは同種造血幹細胞、あるいは自己もしくは同種異系iPSC。
  149. ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５の発現を欠いているか、または発現が低い、請求項１４８に記載の方法。 、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRαまたはβ定常領域、NKG2A、NKG2D、CD38、CD5、CD52、CD33、CD123、CLL-1、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3 、TIGIT、または染色体 6p21 領域内の任意の遺伝子。および／またはＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ９４、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、 PDL1、A2AR、Fc受容体、エンゲージャー、または二重特異性または多重特異性またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体。
  150. 標的抗原を提示する標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を請求項１２７に記載のエフェクター細胞と接触させることを含み、ＳＡＲが標的抗原に特異的に結合する方法。
  151. 前記標的細胞を、前記ＳＡＲ発現エフェクター細胞上に発現される１つ以上の抗原および標的細胞上に発現される１つ以上の抗原に結合する１つ以上の薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記薬剤が、ＳＡＲ発現エフェクター細胞を、前記薬剤によって標的化される抗原を発現する標的細胞に向け直すことができる、請求項１５１に記載の方法。
  153. 前記薬剤が、抗体、抗体、抗体、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン断片、自律的抗原結合ドメイン、二重特異性エンゲージャー、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)、二重特異性キラーエンゲージャー（BiKE）、三重特異性エンゲージャー、三重特異性T細胞エンゲージャー、もしくは三重特異性キラーエンゲージャー（TRiKE）、またはそれらの組み合わせ。
  154. 前記エフェクター細胞が、１つ以上の天然受容体の細胞外ドメインを含むＳＡＲを発現する、請求項１５１に記載の方法。
  155. が、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１の群から選択される１つ以上の天然受容体の細胞外ドメインを含む、請求項１５４に記載の方法。 、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、 CD5 、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、CRTAM、TIGIT、CD96、SLAMF6、SLAMF7、CD100、CD160、CEACAM、ILT2、KLRG1、LAIR1、および CD161。
  156. 請求項１５１に記載の方法、 ここで、薬剤は、抗体、抗体、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン断片、自律的抗原結合ドメイン、二重特異性エンゲージャー、二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）、二重特異性キラーエンゲージャー（BiKE）であり、 ＳＡＲを構成する天然受容体またはその変異体もしくは断片の１つまたは複数の細胞外ドメインに特異的に結合することができる少なくとも１つのドメインを含む、三重特異性エンゲージャー、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）。
  157. 作用物質が以下に特異的に結合する、請求項151または156に記載の方法。
    a) ＳＡＲを構成する１つ以上の天然受容体またはその変異体もしくは断片の細胞外ドメイン；および/または
    b) SAR の一部ではない1 つ以上の天然に存在する受容体の細胞外ドメイン。
  158. 前記薬剤が、１つ以上の天然に存在する共刺激受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することができる、請求項１５１または１５７に記載の方法。
  159. 前記薬剤が、１つ以上の天然に存在する活性化受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することができる、請求項１５１または１５７に記載の方法。
  160. 前記薬剤が、共刺激ドメインを含むSARの細胞外ドメインに特異的に結合することができる、請求項151または157に記載の方法。
  161. 前記薬剤が、活性化ドメインおよび共刺激ドメインを含むSARの細胞外ドメインに特異的に結合することができる、請求項151または157に記載の方法。
  162. し、前記薬剤が抗体、抗体、抗原結合ドメイン、非免疫グロブリン抗原結合ドメイン断片、自律的抗原結合ドメイン、二重特異性エンゲージャーである、請求項１５４または１５５に記載の方法。 、Ｆｃドメインを含む、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性エンゲージャー、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または三重特異性キラーエンゲージャー（ＴＲｉＫＥ）。
  163. 前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、またはその変異体もしくは断片のうちの１つ以上である、請求項１６２に記載の方法。
  164. 標的抗原が、表Bに列挙される抗原のうちの1つまたは複数である、請求項151に記載の方法。
  165. 生存、増殖、分化を調節する薬剤と組み合わせて、合成抗原受容体（ＳＡＲ）分子を含む、請求項１２３～１４６のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞の有効量が対象に投与される、請求項１４８または１４９に記載の方法。および／または免疫細胞の有効性、ここで作用物質は、以下の１つ以上から選択される：
    a) プロテインホスファターゼ阻害剤。
    b) キナーゼ阻害剤。
    c) Lckキナーゼ阻害剤。
    d) ＳＡＲ発現エフェクター細胞上に発現される１つ以上の抗原および標的細胞上に発現される１つ以上の抗原に結合する薬剤；
    e) サイトカイン。
    f) 免疫阻害分子の阻害剤；
    g) TREG細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤。
    h) SAR修飾細胞の増殖および/または存続を増加させる薬剤。
    i) ケモカイン。
    j) SARの発現を増加させる薬剤。
    k) SARの発現または活性の調節を可能にする薬剤;
    l) SAR修飾細胞の生存および/または持続の制御を可能にする薬剤。
    m) SAR 修飾細胞の副作用を制御する薬剤。
    n) Brd4阻害剤。
    o) 治療薬または予防薬を疾患の部位に送達する薬剤。
    p) SARの対象となる標的抗原の発現を増加させる薬剤。
    q) SAR と同時発現される多目的スイッチに結合するエージェント。と
    r) アデノシンA2a受容体アンタゴニスト。
  166. 請求項１に記載のＳＡＲポリペプチド分子、請求項１１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１１９に記載のベクター、請求項１２７～１４６のいずれか一項に記載の細胞、および／または請求項１５１および１６５に記載の薬剤と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。 。
  167. 有効量の請求項１６６に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における標的抗原関連疾患を予防または治療する方法。
  168. 前記標的抗原関連疾患が、増殖性疾患、前がん状態、癌、免疫疾患、アレルギー性疾患、変性疾患、感染症、および非抗原性疾患からなる群から選択される、請求項１６７に記載の方法。 -がん関連の適応症。
  169. 前記癌が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、 T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、B細胞性前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、MALT リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫 (PEL)、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストローム マクログロブリン血症、または前白血病。
  170. 前記癌が、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、腸管の癌からなる群から選択される、請求項１６８に記載の使用または方法。食道、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌腺、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂がん、中枢腫瘍神経系（CNS）、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、メルケル細胞がん、類表皮がん、扁平上皮がん、T細胞リンパ腫、環境誘発がん、上記の組み合わせ癌、および前記癌の転移病変。
  171. 前記疾患が、コロナウイルス、SARS-CoV2およびその変異体、HIV1、HIV2、HTLV1、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、BKウイルス、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス8型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、MERSおよびSARSコロナウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、ジカウイルス、RSV、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ライノウイルス、水痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型および2型、水痘帯状疱疹ウイルス、HIV-1、HTLV1、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、肝炎B ウイルス、C 型肝炎ウイルス、ニパおよびリフトバレー熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、または結核菌、非定型抗酸菌種、ニューモシスティス ジロベシ、トキソプラズマ症、リケッチア、ノカルジア、アスペルギルス、ムコール、またはカンジダの感染に関連している。
  172. 前記疾患が、糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎、星本甲状腺炎、ＳＬＥ、サルコイドーシス、強皮症、混合結合組織からなる群から選択される免疫疾患または変性疾患である、請求項１６８に記載の使用または方法。病気、移植片対宿主病、またはアルツハイマー病。
  173. ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の表面上の多目的スイッチの発現を検出するステップを含む、請求項９３に記載のＳＡＲをコードするベクターおよび多目的スイッチの形質導入効率を調べる方法。
  174. 請求項９５に記載のＳＡＲを発現する細胞を選択するための方法であって、以下のステップを含む方法： ｉ）請求項１４０に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の表面上の多目的スイッチの発現を検出するステップ；と
    (ii) 多目的スイッチを表現していると識別されたセルを選択します。
  175. 請求項１７４に記載の方法を使用して、細胞集団からＳＡＲを発現する細胞を選択するステップを含む、ＳＡＲを発現する細胞が濃縮された精製細胞集団を調製する方法。
  176. 以下のステップを含む、請求項１７５に記載の方法。
    (i) エクスビボで単離された細胞集団に、請求項１４０に記載のベクターを形質導入またはトランスフェクトするステップと、と
    (ii) 請求項１７４に記載の方法により、形質導入／トランスフェクトされた細胞集団からＳＡＲを発現する細胞を選択するステップ。
  177. 請求項９４～１１７に記載の多目的スイッチポリペプチドを発現する細胞が濃縮され、従ってＳＡＲを発現する細胞が濃縮された細胞集団。
  178. における請求項１７３のいずれかに記載の多目的スイッチポリペプチドの発現を検出するステップを含む、インビボで形質導入された細胞を追跡するための方法。
  179. 前記多目的スイッチを備える前記アクセサリモジュールに結合する薬剤に前記セルをさらすステップを含む、請求項１２７に記載のセルを削除する方法。
  180. 請求項１７９に記載の方法であって、
    a) 多目的スイッチは、配列番号７８４３～７８５０の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はベランタマブ・マフォドチンである。
    b) 多目的スイッチは、配列番号９６２０～９６２４の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はリツキシマブまたはＣＤ２０抗体であり、
    c) 多目的スイッチは配列番号９６２５の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はハーセプチン、エンヘルツ、またはＨｅｒ２標的化抗体である。と
    d) 多目的スイッチは、配列番号７８５０の配列またはそれと８０％の相同性を有する変異体を含み、薬剤はアドセトリスまたはＣＤ３０標的化抗体である。
  181. 請求項１に記載の少なくとも１つのＳＡＲポリペプチド分子、請求項９３に記載のアクセサリーモジュール、請求項９４に記載の多目的スイッチ、請求項１１８に記載の組換えポリヌクレオチド、請求項１１９に記載の組換え発現系、請求項１２３に記載のベクター、または請求項１２７に記載の細胞、請求項１５１および／または１６５に記載の薬剤、および請求項１６６に記載の組成物。
  182. 実施される、請求項１４０に記載の方法。 b)生体内;または c) ex vivoとin vivoの両方。
  183. 少なくとも２つの鎖を含み、
    ａ）第１のポリペプチド鎖は、ＶαまたはＶγドメインを含む第１の抗原結合ドメインおよび第１の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含む；と
    ｂ）第２のポリペプチド鎖は、ＶβまたはＶδドメインを含む第２の抗原結合ドメインおよび第２の膜関連モジュール（ＭＡＭ）を含む；
    第１の抗原結合ドメインのＶαまたはＶγドメインと第２の抗原結合ドメインの相補的ＶβまたはＶδドメインは、標的抗原に特異的に結合するＴＣＲ－Ｆｖ様抗原結合モジュールを形成し；と
    ここで、第１のＭＡＭおよび第２のＭＡＭは、少なくとも１つのシグナル伝達経路を活性化する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員できる非Ｔ細胞受容体モジュール（ＮＴＣＲＭ）を形成する。
  184. 前記第１のポリペプチド鎖が、前記第１の抗原結合ドメインと前記第１のＭＡＭとの間に第１のペプチドリンカーをさらに含み、前記第２のポリペプチド鎖が、前記第２の抗原結合ドメインと前記第２のＭＡＭとの間に第２のペプチドリンカーをさらに含む、請求項１８３に記載のＳＡＲ 。ママ。
  185. 前記第１および／または第２のペプチドリンカーが、個別に、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体サブユニットに由来する定常ドメインまたはその断片を含む、請求項１８４に記載のＳＡＲ。
  186. 前記第１のポリペプチドが、前記第１のＭＡＭを含む第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に第１のサイトゾルドメインをさらに含む、請求項１８３に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチドは、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に第２のサイトゾルドメインをさらに含む。
  187. 前記第１のポリペプチド鎖が、前記第１のＭＡＭの第１の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側にある共刺激ドメイン配列を含む第１のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含む、請求項１８３に記載のＳＡＲ。および／または第２のポリペプチド鎖は、第２のＭＡＭを含む第２の膜貫通／膜アンカードメインのＣ末端側に共刺激ドメイン配列を含む第２のアクセサリー細胞内ドメインをさらに含む。
  188. 前記共刺激ドメインが、 CD28、4-1BB、OX40、2B4、CD27、CD81、CD2、CD5、BAFF-R、CD30、CD40、HVEMもしくはICOS、または変異体もしくはその断片。
  189. 前記第１および／または第２のＭＡＭおよびＮＴＣＲＭが、非Ｔ細胞受容体の膜貫通／膜アンカードメイン、任意のサイトゾルドメイン、任意のヒンジドメインおよび／または任意の細胞外ドメインから構成される、請求項１８３に記載のＳＡＲ。または信号アダプター。
  190. 請求項１８９に記載のＳＡＲにおいて、
    a) 非T細胞受容体は、 CD16A、CD16B、CD64、CD32、NKp30、NKp44、NKp46、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL4、KIR2DL4、KIR2DS1、 KIR2DS2、KIR2からなる群から選択される。 DS3 、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、NKG2D、NKG2C、NKG2A、NKG2E、NKG2F、DNAM-1、2B4、OX40、CD28、4-1BB、CD27、CD81、CD2、CD5、TNFR-I、TNFR-II、Fas、 CD30 、ＣＤ４０、ＣＲＴＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＥＡＣＡＭ、ＩＬＴ２、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６１、前述のいずれかの変異体およびその断片；および/または
    b) 前述のいずれかの変異体、およびそれらの断片からなる群から選択される。
  191. 非Ｔ細胞において発現されると、非Ｔ細胞にＴ細胞受容体様の標的結合認識及び／又は少なくとも１つのシグナル伝達アダプターの動員及び／又は少なくとも１つのシグナル伝達経路の活性化を与える、請求項１８３に記載のＳＡＲ。
  192. 前記対象がさらに治療有効量のチロシンキナーゼ阻害剤を投与される、請求項１６７に記載の方法。
    a) ＳＡＲ発現エフェクター細胞を含む医薬組成物の投与による毒性を予防または逆転させる。および/または
    b) SAR を発現するエフェクター細胞の枯渇を防止または逆転します。
  193. 前記チロシンキナーゼ阻害剤がＬｃｋ阻害剤である、請求項１９２に記載の方法。
  194. 前記チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブまたはポナチニブである、請求項１９２に記載の方法。
  195. 治療により、前記対象におけるＴ細胞によるＩＬ－２の分泌が増加する、請求項１９２に記載の方法。
  196. 治療により、前記対象におけるＴ細胞のアポトーシスが減少する、請求項１９２に記載の方法。
  197. 治療が、PD-1、TIM-3、およびLAG-3からなる群から選択される少なくとも1つのT細胞枯渇マーカーの発現を減少させる、請求項192に記載の方法。
  198. 治療によりＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７の発現が増加する、請求項１９２に記載の方法。
  199. 複数サイクルの治療が前記対象に施される、請求項１９２に記載の方法。
  200. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が断続的に投与される、請求項１９２に記載の方法。
  201. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、少なくとも部分的なＴ細胞機能を回復するのに十分な期間投与され、その後中止される、請求項１９２に記載の方法。
  202. 前記チロシンキナーゼ阻害剤が経口投与される、請求項１９２に記載の方法。
  203. 対象に投与される遺伝子操作されたＴ細胞に関連する毒性がサイトカイン放出症候群である、請求項１９２に記載の方法。
  204. 対象に投与される遺伝子操作されたＴ細胞に関連する毒性がオンターゲットオフ腫瘍毒性またはオフターゲットオフターゲット腫瘍毒性である、請求項１９２に記載の方法。
  205. 前記対象がヒトである、請求項１９２に記載の方法。
  206. T細胞の標的認識特性および機能を有するT細胞ではない細胞であって、
    a) ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、またはプレＴＣＲの群から選択される１つまたはすべてのＴＣＲ定常鎖またはその断片の発現を欠き、および/または
    b) CD3ε、CD3γ、および/またはCD3δの群から選択される1つまたは複数のCD3鎖の発現を欠いている。および/または
    c) 機能的な TCR モジュール (TCRM) を形成する能力がありません。
  207. ＴＣＲＭを含み、Ｔ細胞の細胞標的認識特性を与える二重鎖受容体を発現する、請求項２０６に記載の細胞。
  208. 標的抗原に特異的に結合するＴＣＲ－Ｆｖ抗原結合モジュールを形成することができる受容体を細胞表面上に発現することができる、請求項２０７に記載の細胞。
  209. TCR-Fvを構成する2つの可変ドメインが単一のポリペプチド鎖の一部ではない、請求項208に記載の受容体。
  210. TCR-Fvを構成する2つの可変ドメインが、
    a) VαとVβ、または
    b) VγとVδ。
  211. 標的抗原を提示する標的細胞を死滅させる方法であって、標的細胞を請求項２０６に記載のエフェクター細胞と接触させることを含み、細胞が標的抗原を特異的に認識する方法。
  212. 標的ペプチド抗原を発現する標的細胞を死滅させることができる、請求項２１０に記載の細胞。
  213. 請求項２０６に記載の細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
  214. 有効量の請求項２０６に記載の細胞または請求項２１３に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、それを必要とする個体における標的抗原関連疾患を予防または治療する方法。
  215. Ｔ細胞受容体様抗原認識を有する、請求項２０６に記載の非Ｔ細胞を作製する方法。
  216. ＴＣＲ様抗原認識を有する非Ｔ細胞が、ＴＣＲ様抗原認識を発現しない、請求項２１５に記載の方法。
    a) TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδおよびpreTCRα鎖、または
    b) TCRα鎖とTCRβ鎖の二量体、または
    c) TCRγ鎖とTCRδ鎖の二量体、または
    d) preTCRα鎖とTCRβ鎖の二量体。
  217. 請求項２１５に記載の方法であって、前記方法は、
    a) TCR鎖の外因性発現、または
    b) CD3ε、CD3γ、およびCD3δの群から選択されるCD3鎖の外因性発現。
  218. 単一の遺伝子改変を含む、請求項２１５に記載の方法。
  219. 二本鎖受容体をコードする１つまたは２つの組換えポリヌクレオチドの導入を含む、請求項２１５に記載の方法。
  220. ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ（先天性ナチュラルキラー細胞）、ｇ－ＮＫ細胞、メモリー様ＮＫ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、ｉＰＳＣ、改変型ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来ＮＫである、請求項２１０に記載の細胞。細胞、Ｂ細胞、マクロファージ／単球、顆粒球、樹状細胞、不死化細胞株、不死化ＮＫ細胞株、ＮＫ９２細胞株、ＮＫ９２ＭＩ細胞株、ＹＴＳ細胞、ＮＫＧ細胞株、またはそれらの誘導体。
  221. II型膜貫通タンパク質とI型膜貫通タンパク質またはN末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質との間の単離された融合タンパク質。
  222. Ｉ型膜貫通タンパク質またはＮ末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の細胞外ドメインと融合したＩＩ型タンパク質のサイトゾル、膜貫通、および部分的または全体の細胞外ドメインを含む、請求項２２１に記載の単離された融合タンパク質。
  223. Ｉ型膜タンパク質またはＮ末端シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の全部または一部の細胞外ドメインをコードするポリペプチドのＮ末端が、Ｉ型膜タンパク質のＣ末端に機能的に連結されている、請求項２２１に記載の単離された融合タンパク質。 N 末端から C 末端への配向の II 型タンパク質。
  224. 請求項２２１に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
    ａ）Ｎ末端シグナルペプチドを有するＩ型膜タンパク質または分泌タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端を、ＩＩ型タンパク質の部分的または全体の細胞外ドメインをコードするヌクレオチドの３’末端にインフレームで融合させる工程；と
    ｂ）融合タンパク質の発現を可能にするために、適切な細胞に組換えポリヌクレオチドを導入するステップ。
  225. 特定の抗原を標的とするキメラ抗原受容体または合成抗原受容体をコードする、請求項２２１に記載の単離された融合タンパク質。
  226. 請求項２２１に記載の融合タンパク質を発現する、請求項２２４によって作製された細胞、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  227. 請求項２２６に記載の組成物を使用する治療方法。
  228. 配列番号１６００～２３２８、４８５１～５１２９、５４５１～６２８２、７１６０～７１７０、７６０１～７７４７、８７６８～９６０２および１０８１７～１０８３０からなる群から選択される配列を含む合成免疫受容体をコードする組換えポリヌクレオチド、または上記のいずれか１つに記載の合成免疫受容体をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列。
  229. 配列番号３９９４～４７２２、５１５１～５４２９、６２８３～７１１４、７８５２～７８６２、８２９３～８４３９、９８６０～１０６９４、１０８３２～１０８４１、１２３０４～からなる群から選択される合成免疫受容体ポリペプチドをコードするアミノ酸配列。 １２３１１、または上記のいずれか１つに記載の合成免疫受容体をコードするアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列。
  230. アミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端までの以下の一般式を有する２つ以上の鎖を含む非天然タンパク質（すなわち、合成タンパク質）を生成するための方法：
    チェーン 1: SP1-A1-L1-H1-M1-(C1)n
    チェーン 2: SP2-A2-L2-H2-M2-(C2)n
    ここで、SP1およびSP2は、成熟ポリペプチド鎖から切断される任意のシグナルペプチドであり、 A1 と A2 は相互作用できる 2 つのタンパク質ドメイン、L1 と L2 はオプションのリンカー、H1 と H2 はオプションのヒンジ ドメインまたはスペーサー ドメイン、M1 と M2 は膜アンカーまたは膜貫通ドメイン、C1 と C2 はオプションのサイトゾル ドメインです。
  231. Ａ１およびＡ２ドメインが抗体に由来せず、抗体断片でもない、請求項２３０に記載の方法。
  232. A1およびA2ドメインがM1およびM2ドメインに対して異種である、請求項230に記載の方法。
  233. 前記Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインは自律ドメインではないことを特徴とする請求項２３０に記載の方法。
  234. 前記Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインが、無関係なタンパク質に対するそれらの親和性よりも大きい互いに対する親和性を有する、請求項２３０に記載の方法。
  235. Ａ１およびＡ２ドメインが互いに結合して抗原結合ドメインを生成し得る、請求項２３０に記載の方法。
  236. 前記Ｌ１およびＬ２リンカーが、ａ）長いリンカーである、請求項２３０に記載の方法。 b) Ig様リンカー；または c) 免疫グロブリンに由来するリンカー。 ｄ）ＴＣＲ定常鎖に由来するリンカー。
  237. Ｌ１リンカーおよびＬ２リンカーが１つまたは複数のジスルフィド結合によって結合される、請求項２３０に記載の方法。
  238. Ｍ１およびＭ２ドメインが膜貫通ドメインである、請求項２３０に記載の方法。
  239. 前記Ｍ１およびＭ２ドメインが、ａ）同じタンパク質に由来する、請求項２３８に記載の方法。 b) 異なるタンパク質。または c) 配列が同一である、および/または 70% を超えるアミノ酸配列相同性を有する
  240. Ｍ１ドメインとＭ２ドメインが互いに関連する、請求項２３０に記載の方法。
  241. 前記Ｍ１およびＭ２ドメインがジスルフィド結合によって結合されている、請求項２３０に記載の方法。
  242. Ｍ１および／またはＭ２ドメインが１つまたは複数のシグナル伝達アダプターを動員できる、請求項２３０に記載の方法。
  243. Ｃ１およびＣ２ドメインが、少なくとも１つのシグナル伝達アダプターを動員する、および／または少なくとも１つのシグナル伝達経路を開始することができる、請求項２４２に記載の方法。
  244. 両方の鎖が細胞表面上で発現される、請求項２３０に記載の方法。
  245. Ａ１－Ｌ１－Ｈ１セグメントおよびＡ２－Ｌ２－Ｈ２セグメントが細胞外側に位置する、請求項２３０に記載の方法。
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