JP2022169574A - 最適化されたレンチウイルス移入ベクターおよびその使用 - Google Patents

最適化されたレンチウイルス移入ベクターおよびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】細胞に導入しようとする異種核酸を含むレンチウイルス移入ベクターを提供する。【解決手段】レンチウイルス移入ベクターは、以下の特性：（ａ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むこと、（ｂ）ＲＮＡの核外輸送の制限を低減させる変異型ＩＮＳ１阻害性配列を含む部分的ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むこと、（ｃ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４阻害性配列をコードするポリヌクレオチドを含まないこと、（ｄ）ＳＶ４０複製起点および／またはｆ１複製起点を含まないこと、（ｅ）スプライス部位を含有するｃＰＰＴ配列を含むこと、（ｆ）インタクトなスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するＥＦ１アルファプロモーターを含むこと、ならびに（ｇ）Ｘタンパク質のＯＲＦの開始コドンに変異を有するＢ型肝炎ＰＲＥを含むことによって特徴付けられ得る。【選択図】なし

Description

本発明は、レンチウイルス移入ベクターおよびそのようなベクターを使用する方法に関
する。
細胞における異種遺伝子の発現は、多くの治療関連用途にとって望ましい。異種遺伝子
を細胞に導入する１つの方法は、移入ベクターの使用を伴うが、この移入ベクターは、宿
主細胞にトランスフェクトされると、宿主細胞による異種遺伝子を含んだウイルス粒子の
産生を誘導する。次いで、このウイルス粒子を使用して、標的細胞を感染させ、それによ
って、標的細胞が異種遺伝子を発現するように誘導される。このような方法において有用
なウイルスとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが挙
げられる。いくつかの既存のレンチウイルスベクターは、低い遺伝子発現レベルを呈し、
極めて大型であり得る。加えて、そのようなベクターに関連する生物学的安全性および毒
性の問題が存在し得る。このため、そのようなベクターを使用したトランスフェクション
およびウイルス産生は、時間がかかり、非効率的で、手間がかかり、高価であり得る。し
たがって、標的細胞において異種遺伝子の発現を誘導するのに有用な、高速かつ効率的な
ウイルス産生に好適な改善されたレンチウイルスベクターが必要とされている。
第１の態様において、本発明は、任意選択で１つまたは複数の異種核酸配列（任意選択
で、コザック配列の下流にある）を含み、以下の特性：（ａ）サイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）プロモーターを含むこと、（ｂ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制
限を低減させる変異型ＩＮＳ１阻害性配列を含むｇａｇタンパク質の少なくとも一部分を
コードするポリヌクレオチドを含むこと、（ｃ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩ
ＮＳ４阻害性配列をコードするポリヌクレオチドを含まないこと、ならびに（ｄ）ＳＶ４
０複製起点および／またはｆ１複製起点を含まないことのうちの少なくとも２つによって
特徴付けられる、レンチウイルス移入ベクターを提供する。様々な実施形態において、本
レンチウイルス移入ベクターは、特性（ａ）～（ｄ）のうちの少なくとも３つまたは４つ
すべてによって特徴付けられる。
様々な例において、本レンチウイルス移入は、（ｉ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡ
の核外輸送の制限を低減させる変異型ＩＮＳ１阻害性配列を含む、（ｉｉ）フレームシフ
トおよび成熟前終結（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）をもたらす２つの
ヌクレオチド挿入を含有する、ならびに／または（ｉｉｉ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３
、およびＩＮＳ４阻害性配列を含まない、ｇａｇタンパク質の１５０～２５０（例えば、
１６８）ヌクレオチド部分をコードするポリヌクレオチドを含む。
さらなる例において、本レンチウイルス移入ベクターは、パッケージングシグナル（プ
シー）、プシーに隣接するかまたはそれと部分的にオーバーラップする部分的ｇａｇ配列
、ｒｅｖ応答エレメント、部分的ｅｎｖ配列、およびｐｏｌ由来のｃＰＰＴ配列からなる
群から選択される１つまたは複数のエレメントをさらに含み、それらの配列は、任意選択
で、ＨＩＶ－１分離株（isolate）ＮＬ４－３またはＳＦ３を起源とする。様々な例にお
いて、ｃＰＰＴ配列は、約１５０～２５０（例えば、１７８～１８１）ヌクレオチドを含
み、スプライスアクセプターＳＡ１配列を含む。
本レンチウイルス移入ベクターは、任意選択で、ベクターのエレメント間に位置する１
つまたは複数の制限部位を含み得る（例えば、例示的な位置については、以下の表３～５
参照）。
さらに、本レンチウイルス移入ベクターは、任意選択で、転写後制御エレメント（ｐｏ
ｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（Ｐ
ＲＥ）を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ、例えば、配
列番号７８に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１０
０％の配列同一性を有する）またはＢ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６ ＰＲＥ（ＨＰＲＥ
、例えば、配列番号７９に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
もしくは１００％の配列同一性を有する）があり、任意選択で、ＨＰＲＥは、Ｘタンパク
質コーディング配列に不活性化変異を含む。
本レンチウイルス移入ベクターは、導入遺伝子の発現を作動させるために使用すること
ができる、サブゲノムプロモーターをさらに含み得る。一例において、このプロモーター
は、ＥＦ１ａプロモーター（例えば、配列番号７１に対して少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を有するＥＦ１ａプ
ロモーター）である。ＥＦ１ａプロモーターは、任意選択で、完全長であり、インタクト
なスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列（それぞれ、配列番号７２お
よび７３）を含む（例えば、配列番号９５参照）。
本レンチウイルス移入ベクターのレンチウイルス成分は、任意選択で、ＨＩＶ－１（例
えば、ＨＩＶ－１株ＮＬ４－３またはＳＦ３）を起源とし得る。様々な実施形態では、本
レンチウイルス移入ベクターにおいて、部分的ｇａｇタンパク質をコードする配列は、本
レンチウイルス移入ベクターとともに使用されるパッケージングプラスミド（例えば、ｐ
ＭＤＬｇｐＲＲＥパッケージングプラスミド）によってコードされるｇａｇタンパク質の
対応する領域に対して、９０％未満の配列同一性を有する。
別の態様において、本発明は、以下の特性：（ｉ）配列番号５２に対して少なくとも９
５％の同一性を有する核酸配列を含むＣＭＶプロモーター、（ｉｉ）配列番号５３に対し
て少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ Ｒ領域、（ｉｉｉ）配列番
号５４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ Ｕ５領域、（
ｉｖ）配列番号５５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むプライマ
ー結合部位、（ｖ）配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を
含むパッケージングシグナル、（ｖｉ）配列番号５７に対して少なくとも９５％の同一性
を有する核酸配列を含み、パッケージングシグナル内にある、主要スプライスドナー部位
、（ｖｉｉ）配列番号５８に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部
分的ｇａｇ配列、（ｖｉｉｉ）配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する
核酸配列を含む部分的ｅｎｖ配列、（ｉｘ）配列番号６２に対して少なくとも９５％の同
一性を有する核酸配列を含むＲｅｖ応答エレメント、（ｘ）配列番号６４に対して少なく
とも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部分的ｅｎｖ配列、（ｘｉ）配列番号６５に
対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、（ｘ）部の部分的ｅｎｖ配列
内にある、スプライスアクセプター部位、（ｘｉｉ）配列番号６７、９２、または９３に
対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むセントラルポリプリントラクト
、（ｘｉｉｉ）配列番号６８または９４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸
配列を含み、セントラルポリプリントラクト内にある、スプライスアクセプター部位、（
ｘｉｖ）配列番号７１または９５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＥＦ１
アルファプロモーター、（ｘｖ）配列番号７２に対して少なくとも９５％の同一性を有す
る核酸配列を含み、ＥＦ１アルファプロモーター内にある、構成的スプライスドナー（Ｃ
Ｄ）部位、（ｘｖｉ）配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列
を含み、ＥＦ１アルファプロモーター内にある、構成的スプライスアクセプター（ＣＡ）
部位、（ｘｖｉｉ）配列番号７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を
含むＥＧＦＰをコードするポリヌクレオチドおよび／または導入遺伝子配列、（ｘｖｉｉ
ｉ）配列番号７８または７９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を
含むＰＲＥ配列、（ｘｉｘ）配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有す
る核酸配列を含む部分的ｎｅｆ配列、（ｘｘ）配列番号８４に対して少なくとも９５％の
配列同一性を有する核酸配列を含むｄＵ３配列、（ｘｘｉ）配列番号８５に対して少なく
とも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ Ｒ領域、ならびに（ｘｘｉｉ）配列
番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、ＬＴＲ Ｕ５領域
のうちの１つまたは複数（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、
１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、
２０個、２１個、または２２個）を含む、レンチウイルス移入ベクターを含む。これらの
成分の配列同一性は、任意選択で、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％で
あり得る。組合せの例としては、ｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、ｉｘ、ｘ、ｘｉｉ、ｘｉｖ、お
よびｘｖｉｉｉを含むものが挙げられ、ここで、ｘは、任意選択で、ｘｉを含み、ｘｉｉ
は、任意選択で、ｘｉｉｉを含み、ｘｉｖは、任意選択で、ｘｖおよびｘｖｉを含む。加
えて、組合せには、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ、ｘｉｘ、ｘｘ、ｘｘｉ、および／またはｘ
ｘｖも含まれ得、任意選択で、ｖはｖｉを含む。さらに、これらの組合せのいずれも、ｘ
ｖｉｉをさらに含んでもよい。
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、任意選択で、タンパク質、例えば、ＥＧＦＰ
および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする異種核酸配列を含み得る。ＣＡ
Ｒの事例において、ＣＡＲは、任意選択で、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗原結合性ドメ
イン（例えば、ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数のシグナル伝達ド
メイン（例えば、１つもしくは複数の一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼー
タ刺激ドメイン）および／または１つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例え
ば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、
ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１
（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫ
Ｇ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０
、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共
刺激タンパク質から選択される細胞内ドメイン））を含む。
様々な例において、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３
０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３；上皮成長因子受容体バ
リアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシド
ＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ
Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）
；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナー
ゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６
；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）
；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２；メ
ソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原
（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；
Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベー
タ）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；
受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞
表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ
）；プロスターゼ（Prostase）；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異
型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；イ
ンスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プ
ロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；
糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソ
ンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパ
ク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシ
ルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグ
ルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル
－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（Ｔ
ＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７－関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（Ｃ
ＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラス
Ｃグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６
１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；
ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（
ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型
肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３
）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リ
ンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）
；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（TCR gamma Alternate Reading Fr
ame Protein）（ＴＡＲＰ）；ウイルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１
（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡ
ＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、１２ｐ染色体に位置（ＥＴＶ６－ＡＭＬ
）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１
）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原－１
（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原
１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン(survi
ving)；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１
；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座
切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、
セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トラン
スフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンド
ロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃニワトリ骨芽球腫ウイルスがん遺伝子神経芽
細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；
チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１
Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ－結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞によって認識
される扁平上皮細胞癌腫抗原３（ＳＡＲＴ３）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ－５（Ｐ
ＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的
タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－
４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓
偏在１（ＲＵ１）；腎臓偏在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（
ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸内カルボキシルエス
テラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９
ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；Ｉｇ
ＡのＦｃフラグメントの受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受
容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバ
ーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１
２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受
容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；
Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧ
ＬＬ１）からなる群から選択される抗原に結合する。
特定の例において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、４－１ＢＢ（
ＣＤ１３７）膜貫通ドメイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
別の態様において、本発明は、５’から３’に、作動可能なつながりで、以下のエレメ
ント：プロモーター、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル
（プシー）、部分的ｇａｇ配列、部分的ｅｎｖ配列、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
スプライスアクセプター部位（ＳＡ７）を含む部分的ｅｎｖ配列、スプライスアクセプタ
ー部位（ＳＡ１）を含むセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、構成的スプライス
ドナー部位（ＣＤ）および構成的スプライスアクセプター部位（ＣＤ）を含むＥＦ１ａプ
ロモーター、任意選択で、ＥＧＦＰをコードする遺伝子および／または異種核酸配列、な
らびに転写後制御エレメントのうちの１つまたは複数（例えば、すべて）を含む、レンチ
ウイルス移入ベクターを含む。
一例において、本発明は、５’から３’に、作動可能なつながりで、以下のエレメント
：ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ Ｒ領域、ＬＴＲ Ｕ５領域、プライマー結合部位（ＰＢ
Ｓ）、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル（プシー）、部
分的ｇａｇ配列、部分的ｅｎｖ配列、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、スプライスアク
セプター部位（ＳＡ７）を含む部分的ｅｎｖ配列、スプライスアクセプター部位（ＳＡ１
）を含むセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ＥＦ１ａプロモーター、任意選択
で、ＥＧＦＰをコードする遺伝子および／または異種核酸配列、転写後制御エレメント、
ＬＴＲ Ｒ領域、ＬＴＲ Ｕ５領域、ＳＶ４０ポリＡ尾部、カナマイシン耐性遺伝子（ｎ
ｐｔＩＩ）、ならびにｐＵＣ複製起点のうちの１つまたは複数を含む、レンチウイルス移
入ベクターを含む。
様々な例において、転写後制御エレメントは、本明細書に記載されるように、ウッドチ
ャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６ ＰＲＥ
（ＨＰＲＥ）である。
さらなる例において、異種核酸配列は、本明細書に記載されるように、キメラ抗原受容
体（ＣＡＲ）をコードする。一例において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグ
メント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達
ドメインを含み得る。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるレンチウイルス移入ベクターを含
む宿主細胞（例えば、２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、または初代ヒトＴ細胞）を
含む。任意選択で、宿主細胞は、１つまたは複数のレンチウイルスパッケージングベクタ
ーをさらに含み得る。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるレンチウイルス移入ベクター
および１つまたは複数のパッケージングベクターを含む、組成物を含む。
さらなる態様において、本発明は、異種核酸配列を発現することができるレンチウイル
スを産生する方法を含む。これらの方法は、任意選択で、（ａ）細胞（例えば、２９３Ｔ
細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、または初代ヒトＴ細胞）に、（ｉ）本明細書に記載される
レンチウイルス移入ベクター、および（ｉｉ）１つまたは複数のレンチウイルスパッケー
ジングベクターを導入するステップと、（ｂ）細胞において、レンチウイルス移入ベクタ
ーおよび／またはパッケージングベクターによってコードされるウイルスタンパク質を発
現させ、それによって、レンチウイルス移入ベクターの異種核酸配列を含むレンチウイル
スを産生するステップとを含み得る。
定義
「キメラ抗原受容体」または代替として「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細
胞に入れられると、この細胞に、標的細胞、典型的にはがん細胞に対する特異性を与え、
細胞内シグナル生成をもたらす、ポリペプチドのセット、最も単純な実施形態においては
典型的に２つのポリペプチドのセットを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲは、少な
くとも、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに以下に定義される刺激分
子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナ
ル伝達ドメイン（本明細書において、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を
含む。一部の態様において、ポリペプチドのセットは、互いに近接している。一部の実施
形態において、ポリペプチドのセットには、二量体化分子が存在する場合に、ポリペプチ
ドを互いに結合させることができる、例えば、抗原結合性ドメインを細胞内シグナル伝達
ドメインに結合させることができる、二量体化スイッチが含まれる。一態様において、刺
激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に付随するゼータ鎖である。一態様において、細胞質シグ
ナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまた
は複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様において、共刺激分子は、本
明細書に記載される共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２
７、および／またはＣＤ２８から選択される。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結
合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイ
ンを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様にお
いて、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激分子に由
来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイ
ンを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様にお
いて、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数
の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび１つの刺激分子に由来
する１つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメ
ラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫
通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シ
グナル伝達ドメインおよび１つの刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメイン
を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様におい
て、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に、任意選択のリーダー配
列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインのＮ末端にリーダー配
列をさらに含み、リーダー配列は、任意選択で、細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡ
Ｒの局在化の際に抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
本明細書に記載されるものなど、特異的腫瘍マーカーＸを標的とする抗原結合性ドメイ
ン（例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、
ＣＤ１９を標的とする抗原結合性ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内で情報を伝達することによって、第２
のメッセンジャーを生成するか、またはそのようなメッセンジャーに応答することによっ
てエフェクターとして機能することで、所定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を制御
するように作用する、タンパク質の機能的部分を指す。
「抗体」という用語は、本明細書において使用されるとき、抗原に特異的に結合する、
免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポ
リクローナルもしくはモノクローナル、多重鎖もしくは一本鎖、またはインタクトな免疫
グロブリンであり得、天然の供給源または組換えの供給源に由来し得る。抗体は、免疫グ
ロブリン分子の四量体であってもよい。
「抗体フラグメント」という用語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例え
ば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により）能力を保持する、抗体の少な
くとも一部分を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）
２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合型Ｆｖ（ｓｄＦｖ
）、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線形抗体、単一ドメ
イン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬもしくはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、
ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価
フラグメントなどの抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体、ならびに抗体の単
離ＣＤＲまたは他のエピトープ結合性フラグメントが挙げられるが、これらに限定されな
い。抗原結合性フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナ
ノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、
およびビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Hollinger and Hudson, Nature
Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照）。抗原結合性フラグメントはまた、ＩＩＩ型
フィブロネクチン（Ｆｎ３）など、ポリペプチドに基づく足場にグラフトすることができ
る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している、米国特許第６，７
０３，１９９号明細書参照）。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメント
および重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを含む、融合タンパク質
を指し、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い可動
性ポリペプチドリンカーを介して近接して結合されており、一本鎖ポリペプチドとして発
現され得、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。指定され
ない限り、本明細書において使用されるとき、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末
端およびＣ末端に関して、ＶＬ可変領域およびＶＨ可変領域をいずれの順序で有してもよ
く、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを
含んでもよい。
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメイン
が、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒ
ト化抗体、または二重特異性抗体を含む、近接ポリペプチド鎖の一部として発現された、
様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Harlow et al., 1989, In: Antibo
dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York、Houston et al., 1988, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、Bird et al., 1988, Science 242:423-426）
。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合性ドメインは、抗体フラグメントを
含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。所与
のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), "Sequences of Protein
s of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes
of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Al-Lazikani et al., (199
7) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）に記載されているもの、または
これらの組合せを含む、多数の周知のスキームのうちのいずれかを使用して決定すること
ができる。
本明細書において使用されるとき、「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語
は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免
疫グロブリン鎖またはそのフラグメントを指す。「結合性ドメイン」または「抗体分子」
という用語は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施形態において、抗体分
子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン
配列を含み、これら複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピト
ープに対する結合特異性を有し、これら複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン
配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、多重特異
性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つを上回らない抗原に
対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を
有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異
性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメイン
が、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒ
ト化抗体、または二重特異性抗体を含む、近接ポリペプチド鎖の一部として発現された、
様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、Harlow et al., 1989, In: Antibo
dies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York、Houston et al., 1988, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883、Bird et al., 1988, Science 242:423-426）
。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合性ドメインは、抗体フラグメントを
含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
「抗体重鎖」という用語は、その天然に存在する立体構造において抗体分子に存在する
２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、これが、通常、抗体が属するクラスを
決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、その天然に存在する立体構造において抗体分子に存在する
２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）
軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって
発現された抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成された抗体を指す。この用語はま
た、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体であり、そのＤＮＡ分子
が、抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、そのＤＮＡまたはア
ミノ酸配列が、当該技術分野において利用可能かつ周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配
列技術を使用して得られたものである、抗体を意味すると解釈されるべきである。
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘起する分子を指す。この免疫応答
は、抗体産生もしくは特定の免疫学的に適合性の細胞の活性化のいずれか、またはその両
方を伴い得る。当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含め、い
ずれの巨大分子も、抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組
換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者であれば、免疫応答を誘起するタン
パク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡ
が、したがって、この用語が本明細書において使用される場合の「抗原」をコードするこ
とを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が、必ずしも、遺伝子の完全長ヌ
クレオチド配列だけによってコードされるわけではないことを理解するであろう。本発明
が、１つを上回る遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されないこ
と、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望される免疫応答を誘起するポリペプチドを
コードするように様々な組合せで配置されることは、容易に明らかである。さらに、当業
者であれば、抗原が、「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するで
あろう。抗原が、生成、合成されてもよく、または生物学的サンプルに由来してもよく、
またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことは、容易に明らかである。このよ
うな生物学的サンプルとしては、他の生物学的成分を有する組織サンプル、腫瘍サンプル
、細胞、または流体が挙げられるがこれらに限定されない。
「自家」という用語は、後に材料が再び導入される個体（例えば、細胞または生物）と
同じ個体に由来する任意の材料を指す。「異種」という用語は、材料が導入される個体（
例えば、細胞または生物）とは別の個体に由来する任意の材料を指し得る。一部の事例に
おいて、「異種」という用語は、材料が導入されるある種の個体（例えば、細胞または生
物）とは別の種の個体に由来する任意の材料を指し得る。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるとき、分
子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡ
ＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞
において、免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性、およびサイトカインの分
泌を含むヘルパー活性が挙げられる。
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメ
インを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗
原依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態において、細胞内シ
グナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナ
ル伝達ドメインとしては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子に由来する
ものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの事例においては、一次細胞内シグナル伝達ドメイ
ンは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受
容体または共刺激分子由来の細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡ
Ｍとして公知のシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝
達配列の例としては、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、Ｆｃガン
マＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、Ｃ
Ｄ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２に由来するも
のが挙げられるが、これらに限定されない。
「ゼータ」または代替として「ゼータ鎖」、「ＣＤ３ゼータ」、もしくは「ＴＣＲゼー
タ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタン
パク質、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等
の残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」または代替として「ＣＤ３ゼータ刺激ド
メイン」もしくは「ＴＣＲゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナル
を機能的に伝達するのに十分な、ゼータ鎖の細胞質ドメインまたはその機能的誘導体に由
来するアミノ酸残基として定義される。一態様において、ゼータの細胞質ドメインは、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２から１６４、またはその機能的オ
ルソログである非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等
の残基を含む。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、増殖
などであるがこれに限定されないＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の
結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体または
それらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子
、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、
ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）
、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。このような
共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶ
ＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ
３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、Ｉ
Ｌ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ
、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ
、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧ
ＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ
１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／
ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８
４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）
、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬ
ＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－
３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、
ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３に特異的に結合
するリガンドが挙げられる。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分
子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパ
ク質、サイトカイン受容体、インテグリン、リンパ球活性化シグナル伝達分子（ＳＬＡＭ
タンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体で表され得る。このような分子の例としては
、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、Ｃ
Ｄ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（
ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ
２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、
Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子、またはその機能的フラグメント
もしくは誘導体の、細胞内部分全体または天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体を含み
得る。
「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提
供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿など
に由来する同等の残基を有する、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－
１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残
基２１４～２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由
来する同等の残基として定義される。
「コードする」という用語は、所定のヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ
、およびｍＲＮＡ）または所定のアミノ酸配列のいずれかを有し、それによりもたらされ
る生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーまたは巨大分子の合成
のための鋳型として機能する、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍ
ＲＮＡにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤ
ＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により細胞また
は他の生物系においてタンパク質が生じる場合、そのタンパク質をコードする。ヌクレオ
チド配列が、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供される、コーディング鎖、お
よび遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される、非コーディング鎖の両
方が、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称され得
る。
「発現」という用語は、プロモーターによって作動される特定のヌクレオチド配列の転
写および／または翻訳を指す。
「移入ベクター」という用語は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するた
めに使用され得る組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性
化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定
されない多数のベクターが、当該技術分野において公知である。したがって、「移入ベク
ター」という用語には、自律複製プラスミドが含まれる。この用語はまた、導入遺伝子の
細胞への移入を促進する非プラスミド化合物および非ウイルス化合物をさらに含むとみな
されるべきである。一部の事例において、移入ベクターは、宿主ゲノムへのパッケージン
グおよび挿入に必要とされる導入遺伝子およびレンチウイルスシス－エレメントをコード
する、プラスミドＤＮＡコンストラクトである。
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルスファミリーの属を指す。レンチウイ
ルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でも固有で
あり、これらは、相当な量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができ、そのた
め、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩ
Ｖは、すべて、レンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分
に由来する１つまたは複数の核酸配列を含むベクターを指す。レンチウイルスベクターは
、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）に由来する１つまたは複数のタンパク質の非コ
ーディング配列を含み得る。「レンチウイルス移入ベクター」は、例えば、細胞に移入し
ようとする異種核酸配列を含み得、さらに、例えば、１つまたは複数のレンチウイルス遺
伝子またはその部分を含み得る。「レンチウイルスパッケージングベクター」は、レンチ
ウイルスタンパク質またはその部分をコードする１つまたは複数の遺伝子を含み得る。例
えば、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ｅｎｖタンパク質またはその一部分を
コードする遺伝子を含み得る。ウイルスを産生させ、それを使用して、標的細胞を感染さ
せて、標的細胞内で異種核酸配列内に含まれる１つまたは複数の導入遺伝子を発現させる
ために、移入ベクターおよび１つまたは複数のパッケージングベクターの宿主細胞へのト
ランスフェクションが行われ得る。「導入遺伝子」は、したがって、例えば、本発明のレ
ンチウイルス移入ベクターを使用して、標的細胞に移入される異種遺伝子を指す。本明細
書に記載されるある特定の例において、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体、例えば、本明
細書に記載されるものをコードする遺伝子である。
「単離」されたという用語は、天然の状態から変化しているか、取り出されていること
を意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離」
されていないが、同じ核酸またはペプチドがその天然の状態の共存する材料から部分的ま
たは完全に分離されている場合は、「単離」されている。単離された核酸またはタンパク
質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然の環
境において存在し得る。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）また
はリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態のそれらのポリマーを指す
。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然に
存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知の類似体
を含有する核酸を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾
されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、およ
び相補配列、ならびに明確に示されている配列を暗に包含する。具体的には、縮重コドン
置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混合
塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって
達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)、Ohtsuka et al., J
. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:
91-98 (1994)）。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換可能に使
用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す
。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならないが、
タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に関しては制限がない。
ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意
のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用されるとき、この用語は、当
該技術分野では一般的に例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称され
る短い鎖、ならびに多数の種類が存在し当該技術分野では一般的にタンパク質と称される
長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性なフラ
グメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、
ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含ま
れる。ポリペプチドには、天然のポリペプチド、組換えポリペプチド、またはこれらの組
合せが含まれる。
「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認
識される、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を指す
。
「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結
された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の事例において、この配列は、コ
アプロモーター配列であり得、他の事例においては、この配列はまた、遺伝子産物の発現
に必要なエンハンサー配列および他の制御エレメントも含み得る。プロモーター／制御配
列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
本明細書において使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮ
Ａに結合された一連のアデノシンである。一過的発現のためのコンストラクトの好ましい
実施形態において、ポリＡは、長さが５０～５０００ヌクレオチドであり、好ましくは６
４ヌクレオチドを上回り、より好ましくは１００ヌクレオチドを上回り、最も好ましくは
３００または４００ヌクレオチドを上回る。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または
翻訳の効率性など、ｍＲＮＡ機能を調節するように、化学的または酵素的に修飾され得る
。
本明細書において使用されるとき、「ポリアデニル化」は、ポリアデニリル（polyaden
ylyl）部分またはその修飾バリアントと、メッセンジャーＲＮＡ分子との共有結合を指す
。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端に
おいてポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、ポリアデニル化ポリメラーゼ
酵素の作用を通じて前ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチド（数百であることが多
い）の長い配列である。より高等な真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は、特異的な配列であ
るポリアデニル化シグナルを含む転写産物に付加される。ポリ（Ａ）尾部およびそれに結
合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエクソヌクレアーゼによる分解から保護することに役立
つ。ポリアデニル化はまた、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送、および翻訳にも重要で
ある。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核で生じるが、追加として、
後で細胞質において生じることもある。転写が終結された後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリ
メラーゼに付随するエンドヌクレアーゼ複合体の作用を通じて切断される。切断部位は、
通常、切断部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが
切断された後、アデノシン残基が、切断部位の遊離３’末端に付加される。
「対象」という用語は、生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことが意図される。一
部の事例において、対象は、免疫応答が誘起され得る対象であり得る。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」とい
う用語は、外来性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフ
ェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来性核酸
がトランスフェクトされたか、形質転換されたか、または形質導入されたものである。細
胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。「感染」細胞は、病原体、例えば、ウ
イルス（例えば、レンチウイルス）がトランスフェクトされたか、形質転換されたか、ま
たは形質導入されたものである。一部の事例において、１つまたは複数のウイルス核酸エ
レメントは、感染細胞のゲノムに組み込まれ得る。
本発明は、いくつかの利点を提供する。例えば、本発明のウイルス移入ベクターを使用
して、パッケージング細胞におけるウイルスゲノムＲＮＡの産生の増加、ＲＮＡの核外輸
送の増加、およびウイルス力価の増加を達成することができる。加えて、ウイルス移入ベ
クターは、以前のベクターと比較して比較的小さいサイズであり得、このことにより、使
用の容易さが促進され、より大きな異種配列の挿入が許容される。
本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から
明らかであろう。
ｐＣＩＮＳレンチウイルス移入ベクターの特性マップを示す概略図である。Ｐ－ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、Ｒ＝ＬＴＲ Ｒ領域、Ｕ５＝ＬＴＲ Ｕ５領域、ＰＢＳ＝プライマー結合部位、ＳＤ＝主要スプライスドナー部位、プシー＝パッケージングシグナル、ＲＲＥ＝Ｒｅｖ応答エレメント、ＳＡ７＝スプライスアクセプター部位、ｃＰＰＴ＝セントラルポリプリントラクト、ＳＡ１＝スプライスアクセプター部位、ＥＦ１Ａ＝ヒトＥＦ１アルファプロモーター、ＥＧＦＰ＝ＧＦＰレポーターオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント、ＳＶ４０ポリＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ｎｐｔＩＩ＝カナマイシン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点＝ｐＵＣ由来の複製起点。 ベクター配列内のそれぞれの制限部位の位置を含む、ｐＣＩＮＳレンチウイルス移入ベクターの制限マップを示す概略図である。 ｐＮＯＸレンチウイルス移入ベクターの特性マップを示す概略図である。Ｐ－ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、Ｒ＝ＬＴＲ Ｒ領域、Ｕ５＝ＬＴＲ Ｕ５領域、ＰＢＳ＝プライマー結合部位、ＳＤ＝主要スプライスドナー部位、プシー＝パッケージングシグナル、ＲＲＥ＝Ｒｅｖ応答エレメント、ＳＡ７＝スプライスアクセプター部位、ｃＰＰＴ＝セントラルポリプリントラクト、ＳＡ１＝スプライスアクセプター部位、ＥＦ１Ａ＝ヒトＥＦ１アルファプロモーター、ＥＧＦＰ＝ＧＦＰレポーターオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＨＰＲＥ－ＮｏＸ＝Ｂ型肝炎転写後制御エレメント、Ｘタンパク質をコードするＯＲＦなし、ｄＵ３＝短縮型ＬＴＲ Ｕ３領域、ＳＶ４０ポリＡ＝ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ｎｐｔＩＩ＝カナマイシン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点＝ｐＵＣ由来の複製起点。 ベクター配列内のそれぞれの制限部位の位置を含む、ｐＮＯＸレンチウイルス移入ベクターの制限マップを示す概略図である。 ＧＦＰをコードするｐＣＩＮＳベクターおよびｐＮＯＸベクターの性能を、互いとの比較でおよび他のレンチウイルスベクターとの比較で示す、一連のグラフである。以下のパッケージングベクターを、これらの実験において使用した：ｐＮＶＳ－ＭＤＧ－ＶＳＶＧ－Ｋａｎ、ｐＮＶＳ－ＭＤＬｇｐ－ＲＲＥ、ｐＮＶＳ ＲＳＶ Ｒｅｖ－Ｋａｎ。（Ａ）ｐＣＩＮＳ移入ベクターの使用は、最適化前の親移入ベクターを使用して得られたものよりも数倍高いウイルス力価をもたらす。（Ｂ）ｐＣＩＮＳベクターおよびｐＮＯＸベクターは、２９３Ｔ細胞において、類似したウイルス力価をもたらす。（Ｃ）ｐＮＯＸは、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ｐＣＩＮＳと比較して高いウイルス力価をもたらした。（Ｄ）初代ヒトＴ細胞へのｐＣＩＮＳまたはｐＮＯＸの形質導入により、類似した割合のＧＦＰ発現Ｔ細胞の生成がもたらされ、ｐＣＩＮＳおよびｐＮＯＸは、初代ヒトＴ細胞において、類似した感染力価をもたらすことを示す。（Ｅ）ＨＰＲＥ転写後制御エレメントを含むｐＮＯＸを形質導入したＴ細胞の集団は、レンチウイルスベクター配列の組込み後に、ＷＰＲＥ転写後制御エレメントを含むｐＣＩＮＳを形質導入したＴ細胞の集団と比較して類似した数量のＧＦＰ＋細胞を示した。 レンチウイルス産生系を最適化するためにとった戦略において修飾がなされたある特定の特性を示す概略図である。 親移入ベクターおよびｐＮＬＶ移入ベクターの性能を、互いとの比較で示すグラフのセットである。（Ａ）Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲによって測定すると、ｐＮＬＶレンチウイルス骨格の使用により、対照ＧＦＰベクターレンチウイルス骨格よりも多くのパッケージングされたレンチウイルスゲノムＲＮＡが産生される。（Ｂ）ｑＰＣＲを使用してプロウイルス組込みアッセイによって測定すると、２９３Ｔ細胞へのｐＮＬＶベクターの形質導入により、対照移入ベクターと比較してより高いウイルス力価が得られた。 導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）を発現するｐＣＩＮＳまたはｐＮＬＶレンチウイルスベクターを形質導入したＳｕｐＴ１細胞における導入遺伝子発現のＦＡＣＳ測定を示す、一連のプロットである。（Ａ）ＰＥコンジュゲート抗体を表面上の導入遺伝子の検出試薬として使用した、導入遺伝子を含むｐＣＩＮＳレンチウイルスベクターを形質導入した細胞のＦＡＣＳプロットである。（Ｂ）ＰＥコンジュゲート抗体を導入遺伝子の検出試薬として使用した、導入遺伝子を含むｐＮＬＶレンチウイルスベクターを形質導入した細胞のＦＡＣＳプロットである。（Ｃ）（Ａ－Ｂ）のＦＡＣＳ分析において測定されたＭＦＩを比較するプロットであり、ｐＮＬＶ移入ベクターを形質導入した細胞におけるより高い導入遺伝子の表面発現を示す。 市販の移入ベクターと最適化前のＧＦＰコーディングＳＩＮ移入ベクターである対照ベクター、ならびにｐＣＩＮＳ移入ベクターとｐＮＬＶ移入ベクターのウイルス力価を比較する一連のグラフである。（Ａ）第２世代のｐＬＶＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）レンチウイルスベクターを、Ｔａｔ発現コンストラクトを用いて産生させ、２９３Ｔ細胞に形質導入したが、これは、対照移入ベクターよりもわずかに高いウイルス力価を有することが見出された。（Ｂ）ｐＬｅｎｔｉ６．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）レンチウイルスベクターを、細胞に形質導入したが、これは、対照移入ベクターと比較してウイルス力価に大幅な減少を有することが見出された。（Ｃ）ｐＤ２１０９（ＤＮＡ２．０）レンチウイルスベクターを、細胞に形質導入したが、これは、対照移入ベクターと比較してウイルス力価に少しの減少を有することが見出された。（Ｄ）ｐＣＩＮＳレンチウイルスベクターを、細胞に形質導入したが、これは対照移入ベクターよりも相当に高いウイルス力価を有することが見出された。（Ｅ）ｐＮＬＶレンチウイルスベクターを、細胞に形質導入したが、これは、ｐＣＩＮＳ移入ベクターよりも高いウイルス力価を有することが見出された。 対照である最適化されていない移入コンストラクトにおける様々なスプライス部位変異の、ウイルス力価に対する影響を比較する、概略図およびプロットである。（Ａ）パネルＡは、後続のウイルス力価判定のために変異させたスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位の位置を示す矢尻記号でラベル付けした、レンチウイルス骨格を示す概略図である。（Ｂ）示される移入ベクターの様々なスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の変異体を、細胞に形質導入し、ウイルス力価を、変異体のパネル全体にわたり、対照移入ベクターと比較した。すべての変異が、ウイルス力価に大幅な減少をもたらし、ＳＡ７ｍｕｔおよびＥ－ＳＡｍｕｔ移入ベクターが、わずかに改善された力価を有した。 ｇａｇおよび／またはｅｎｖ由来の配列の欠失を有する移入ベクター骨格の概略図およびプロットであり、結果として生じるウイルス力価への影響を比較する。（Ａ）パネルＡは、ｇａｇおよびまたはｅｎｖ欠失のおよその位置を示す、注釈付きのレンチウイルス骨格の概略図を示す。（Ｂ）ｅｎｖ領域および／またはｇａｇ領域に欠失を有する移入ベクターコンストラクトを、細胞に形質導入し、ウイルス力価を判定した。対照移入ベクターと比較して、－ｅｎｖ３’および－ｇａｇ３’－ｅｎｖ５’変異体は、ウイルス力価の減少を有したが、－ｅｎｖ５’および－ｇａｇ３’は、ウイルス力価にほとんど差を示さなかった。 図１２は、ｐＮＬＶ移入ベクターとｐＲＲＬＳＩＮ移入ベクターとの間の、重要なウイルスシスエレメントにわたる、いくつかの配列アライメントを表す一連の概略図である。（Ａ）パネルＡは、２つのベクターのプシー領域間でのアライメントの概略図を示し、網掛けの領域は、配列変動の場所を示す。 （Ｂ）パネルＢは、２つのベクターのｇａｇ領域間でのアライメントの概略図を示し、網掛けの領域は、配列変動の場所を示す。 （Ｃ）パネルＣは、２つのベクターのｅｎｖ領域間でのアライメントの概略図を示し、網掛けの領域は、配列変動の場所を示す。 （Ｄ）パネルＤは、２つのベクターのＲＰＥ領域間でのアライメントの概略図を示し、網掛けの領域は、配列変動の場所を示す。 （Ｅ）パネルＥは、２つのベクターのｅｎｖ（主要スプライスアクセプター部位７を有する）領域間でのアライメントの概略図を示し、網掛けの領域は、配列変動の場所を示す。 （Ｆ）パネルＦは、２つのベクターのｐｏｌ（ｃＰＰＴおよび主要スプライスアクセプター部位１を有する）領域間でのアライメントの概略図を示し、網掛けの領域は、配列変動の場所を示す。＃＝単一ヌクレオチド置換。上の行＝ｐＮＬＶ、下の行＝ｐＲＲＬＳＩＮ。ｐＲＲＬＳＩＮ配列は、ｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＰＧＫ－ＧＦＰ．ＷＰＲＥベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１２２５２）の配列に対応する。ｐＮＬＶ ｃＰＰＴ配列は、配列番号９２のものである。 ｐＮＬＶレンチウイルス移入ベクターの特性マップを示す概略図である。 ベクター配列内のそれぞれの制限部位の位置を含む、ｐＮＬＶレンチウイルス移入ベクターの制限マップを示す概略図である。
本発明は、レンチウイルス移入ベクターおよびその使用を提供する。概して、本発明の
レンチウイルス移入ベクターは、異種核酸配列、例えば、導入遺伝子（例えば、キメラ抗
原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子、以下参照）をコードする配列などを含む。本レ
ンチウイルス移入ベクターは、さらに、以下に記載されるように、２つ以上の追加の所望
される特性の組合せを含む。
本発明のレンチウイルスベクターは、例えば、ウイルスにパッケージングするための異
種核酸配列を宿主細胞に提供するのに有用であり、これを使用して、所望される標的細胞
において異種核酸配列内の導入遺伝子を発現させることができる。例えば、本レンチウイ
ルス移入ベクターは、例として、宿主細胞がレンチウイルスを産生するように、１つまた
は複数のパッケージングベクターと組み合わせて、宿主細胞に導入され得る。次いで、レ
ンチウイルスを使用して、所望される標的細胞を感染させることができる。ある特定の事
例において、所望される標的細胞がレンチウイルスに感染することにより、レンチウイル
ス移入ベクターから所望される標的細胞（例えば、Ｔ細胞）のゲノムへの、１つまたは複
数の核酸配列（例えば、導入遺伝子をコードする異種核酸）の組込みが生じ得る。したが
って、形質導入された細胞は、異種核酸および／またはウイルスエレメントに存在する１
つまたは複数の遺伝子（例えば、ＣＡＲ遺伝子）を発現することが可能であり得、この能
力は、形質導入された細胞の子孫にも受け継がれ得る。
宿主細胞において生成されたレンチウイルスを介した、本発明のレンチウイルス移入ベ
クターから標的細胞への核酸配列の導入は、標的細胞による、レンチウイルス移入ベクタ
ー由来のエレメント（例えば、導入遺伝子をコードする異種核酸）の発現を可能にし得る
。
移入ベクターのエレメント
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、レンチウイルス移入ベクターに存在する異種
核酸の、細胞（例えば、レンチウイルス移入ベクター、および任意選択で１つまたは複数
の追加のベクター、例えば、パッケージングベクターがトランスフェクトされた細胞）へ
の移入を可能にするのに好適なエレメントを含む。特に、本発明のレンチウイルス移入ベ
クターは、概して、以下の特性：（ａ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを
含むこと、（ｂ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減させる変異型
ＩＮＳ１阻害性配列を含むｇａｇタンパク質の少なくとも一部分をコードするポリヌクレ
オチドを含むこと、（ｃ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４阻害性配列をコ
ードするポリヌクレオチドを含まないこと、ならびに（ｄ）ＳＶ４０複製起点および／ま
たはｆ１複製起点を含まないことのうちの少なくとも２つによって特徴付けられる。一部
の事例において、本発明のレンチウイルス移入ベクターは、約１７８ヌクレオチド（例え
ば、約１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１
７５、１７８、１８０、１９０、２００、２２５、または２５０ヌクレオチド）の長さを
有するｃＰＰＴエレメントを含む。一事例において、ｃＰＰＴエレメントは、１７８ヌク
レオチドの長さを有する。ある特定の事例において、ベクターは、宿主細胞に移入しよう
とする異種核酸または導入遺伝子の上流（例えば、すぐ上流）に位置するコザック配列を
含む。
一部の事例において、本レンチウイルス移入ベクターは、以下：１つまたは複数のウイ
ルス配列の発現を作動させるプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、またはＥＦ１ａプ
ロモーター）、長い末端反復（ＬＴＲ）領域（例えば、Ｒ領域またはＵ５領域）、プライ
マー結合部位（ＰＢＳ）、パッケージングシグナル（プシー）（例えば、主要スプライス
ドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル）、部分的ｇａｇ配列（例えば、本明
細書に記載されるような）、部分的ｅｎｖ配列、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、追加
の部分的ｅｎｖ配列（任意選択でスプライスアクセプター部位（例えば、ＳＡ７スプライ
スアクセプター）を含む）、部分的ｐｏｌ配列（セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰ
Ｔ）（例えば、スプライスアクセプター部位、例えば、ＳＡ１を含むｃＰＰＴ）を含む）
、サブゲノムプロモーター（例えば、Ｐ－ＥＦ１ａ）、異種核酸（例えば、ＥＧＦＰをコ
ードする遺伝子および／または目的の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ遺伝子）を含む異種核
酸）、転写後制御エレメント（例えば、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、任意選択でＸタンパク
質変異を含む）、ポリＡ配列（例えば、ＳＶ４０ポリＡ尾部）、選択的マーカー（例えば
、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、アンピシリン耐性遺伝子、またはクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子）、ならびに複製起点（例えば、ｐＵＣ複製起点、ＳＶ４０複製起
点、またはｆ１複製起点）のうちの１つまたは複数を含み得る。上述のように、本レンチ
ウイルス移入ベクターは、ＥＦ１ａプロモーターを含み得、これは、導入遺伝子の発現を
作動させるために使用することができる。特定の事例において、ＥＦ１ａプロモーターは
、配列番号９５の核酸配列を有する野生型ＥＦ１ａプロモーター配列を含む。一部の事例
において、本発明のレンチウイルス移入ベクターおよび／または本明細書に記載されるパ
ッケージングベクターがトランスフェクトされた細胞は、レンチウイルスＲＮＡを産生し
、これは、主としてスプライシングされている。本発明のレンチウイルスベクターは、当
該技術分野において周知のものなど、追加の配列（例えば、ベクター骨格配列）も含み得
る。ある特定の事例において、本発明のレンチウイルスベクターは、本明細書に記載され
るベクター（例えば、ｐＮＯＸ、ｐＣＩＮＳ、および／またはｐＮＬＶ）由来の配列を含
み得るか、または組み込み得る。特定の事例において、本発明のレンチウイルスベクター
は、本明細書に記載されるベクター（例えば、ｐＮＯＸ、ｐＣＩＮＳ、および／またはｐ
ＮＬＶ）の由来のベクター骨格配列またはその部分を含み得るか、または組み込み得る。
一例において、本発明のレンチウイルスベクターは、ｐＮＬＶ由来のベクター骨格配列ま
たはその部分を組み込む。
本レンチウイルス移入ベクターはまた、細胞において異種タンパク質の発現を作動させ
るのに好適なエレメントも含み得る。ある特定の事例において、コザック配列は、異種タ
ンパク質のオープンリーディングフレームの上流に位置している。例えば、本レンチウイ
ルス移入ベクターは、異種核酸の発現を制御するプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ
、またはＥＦ１ａプロモーター）を含み得る。本レンチウイルス移入ベクターにおいて使
用するのに好適な他のプロモーターとしては、例えば、構成的プロモーターまたは組織／
細胞型特異的プロモーターが挙げられる。一部の事例において、本レンチウイルス移入ベ
クターは、異種核酸（例えば、目的の遺伝子産物）の少なくとも一部分によってコードさ
れる遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡ）を選択的に作製する手段を含む。
例えば、本レンチウイルス移入ベクターは、マーカー遺伝子（例えば、選択的マーカー、
例えば、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒ
ｙ、またはそれらの任意の誘導体）をコードする遺伝子）を含み得る。マーカー遺伝子は
、目的の遺伝子産物とは独立して、発現され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、目的の
遺伝子産物と共発現され得る。例えば、マーカー遺伝子は、目的の遺伝子産物と同じプロ
モーターまたは異なるプロモーターの制御下にあってもよい。別の例において、マーカー
遺伝子は、目的の遺伝子産物に融合され得る。本発明のレンチウイルス移入ベクターのエ
レメントは、一般に、移入ベクターが、１つまたは複数のパッケージングベクターととも
にトランスフェクトされた細胞においてレンチウイルスの形成に関与することを可能にす
るように、互いに作動可能な関係にある。
ウイルスタンパク質
一部の事例において、本発明のレンチウイルス移入ベクターは、ウイルスタンパク質ま
たはその部分をコードする１つまたは複数の遺伝子を含み得る。例えば、本レンチウイル
ス移入ベクターは、ｇａｇタンパク質（例えば、ＨＩＶ－１ ｇａｇタンパク質）の少な
くとも一部分をコードするポリヌクレオチドを含み得る。様々な例において、ｇａｇタン
パク質をコードする配列は、２５０以下のヌクレオチド、例えば、２００以下のヌクレオ
チド、１７５以下のヌクレオチド、または１５０以下のヌクレオチドを含む。一例におい
て、ｇａｇタンパク質をコードする配列は、１６８ヌクレオチドを含むかまたはそれから
なる。ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、ＩＮＳ１配列（例えば、以下に明記され
る変異を有する）を含み得るが、ＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４配列が欠如してい
る。ｇａｇタンパク質またはその部分をコードするポリヌクレオチドは、例えば、本明細
書に記載される１つまたは複数の阻害性配列を不活性化する変異を含み得る。ＩＮＳ１領
域の、以下のヌクレオチドのうちの１つまたは複数（例えば、すべて）における変異：Ｇ
９８９、Ｇ９９２、Ｃ９９５、Ｇ９９８、Ｃ９９９、Ｇ１００４、Ｃ１００７Ｔ、および
Ｃ１０１０（図１２ＢのｐＮＬＶ配列を参照（ｐＮＬＶ）として使用）が、含まれ得る。
特定の例において、これらの変異は、以下の通りである：Ｇ９８９Ａ、Ｇ９９２Ａ、Ｃ９
９５Ｔ、Ｇ９９８Ａ、Ｃ９９９Ｔ、Ｇ１００４Ａ、Ｃ１００７Ｔ、およびＣ１０１０Ａ。
さらに、ｇａｇをコードする配列は、フレームシフトおよび望ましくないｇａｇタンパク
質産生の成熟前終結（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）をもたらす挿入を
含んでもよい（例えば、以下の図１２Ｂ参照）。ある特定の事例において、本レンチウイ
ルス移入ベクターは、部分的ｇａｇ配列（例えば、本レンチウイルス移入ベクターにおい
てパッケージングシグナルに隣接するおよび／またはそれとオーバーラップする位置にあ
る部分的ｇａｇ配列）、部分的ｅｎｖ配列、ならびに／または部分的ｐｏｌ配列（例えば
、ｐｏｌ由来のセントラルポリプリントラクト）を含み得る。部分的ｇａｇ配列、部分的
ｅｎｖ配列、および／または部分的ｐｏｌ配列は、ある特定の事例において、ＨＩＶ－１
（例えば、ＨＩＶ－１分離株ＮＬ４－３またはＳＦ３）を起源とし得る。一例において、
本レンチウイルス移入ベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下においてｇａｇ配列を含
み得る。
転写後制御エレメント（ＰＲＥ）
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、転写後制御エレメント（ＰＲＥ）を含み得る
。ＰＲＥは、ＰＲＥが位置するＤＮＡ配列の発現の制御に寄与する核酸配列である。例え
ば、ＰＲＥは、残りのＤＮＡ配列とともに転写され得る。ＰＲＥから転写された、結果と
して得られるｍＲＮＡ分子の部分は、遺伝子産物の発現を強化する３次構造を形成し得る
。ＰＲＥは、一部の事例において、３つの成分（アルファ、ベータ、およびガンマ）を含
み得る。ＰＲＥの活性は、これらの成分のうち、いくつ存在しているかに依存し得る。例
えば、完全な三部構成のＰＲＥは、アルファ成分単独のものよりも活性であり得る。本発
明のレンチウイルス移入ベクターに含めるのに好適なＰＲＥとしては、例えば、ウッドチ
ャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）および／またはＢ型肝炎ウイルスＰＲＥ（ＨＰＲ
Ｅ）が挙げられる。ある特定の事例において、ＨＰＲＥには、天然のＨＰＲＥ配列（例え
ば、Ｂ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６、完全ゲノムに由来する天然のＨＰＲＥ配列；Ｇｅ
ｎＢａｎｋ：ＫＰ３４１００７．１）が含まれ得る。一部の事例において、本発明のレン
チウイルス移入ベクターにおけるＰＲＥは、本明細書に記載されるように、Ｘタンパク質
を不活性化するように修飾されていてもよい。
省略されたエレメント
本発明は、既存のベクターと比べて最適化されているレンチウイルス移入ベクターを特
徴とする。一部の事例において、本発明のレンチウイルス移入ベクターなどのベクターの
サイズを低減することが望ましい。例えば、冗長な配列またはエレメントを、ベクターか
ら除去して、そのサイズを低減させることができる。ある特定の事例において、不必要な
複製起点（例えば、ＳＶ４０複製起点配列および／またはｆ１複製起点配列）が、レンチ
ウイルスベクターから除去され得る。したがって、様々な例において、本発明のレンチウ
イルス移入ベクターは、長さが８０００ヌクレオチド未満、例えば、長さが７９００ヌク
レオチド未満、７８００ヌクレオチド未満、または７７００ヌクレオチド未満であり得る
。
一部の事例において、ベクターによってコードされるエレメントまたは遺伝子の部分が
、ベクターから欠失していてもよい。例えば、タンパク質をコードする遺伝子は、阻害性
配列を含み得る。そのような阻害性配列は、遺伝子の発現、プロセシング、および／また
は機能を阻害し得る。例えば、ＨＩＶ－１ ｇａｇタンパク質は、ＩＮＳエレメントとし
て知られる一連の阻害性ＲＮＡエレメント（例えば、ＩＮＳ１、ＩＮＳ２、ＩＮＳ３、お
よびＩＮＳ４）を含む。そのようなＩＮＳエレメントは、例えば、それぞれ参照により本
明細書に組み込まれる、J. Virol. 71(7):4892-4903, 1997、J. Virol. 66(12):7176-718
2, 1992、およびJ. Virol. 68(6):3784-3793, 1994に記載されている。一例において、Ｉ
ＮＳ１は、スプライシングされていないウイルスＲＮＡの核外輸送を制御することに関与
する（例えば、J. Virol. 66(12):7176-7182, 1992参照）。したがって、これらの阻害性
配列のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の、遺伝子（例
えば、ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子、またはその一部分）からの除去または変異
（例えば、特定のＩＮＳエレメントを形成するヌクレオチドの変異によるもの、例として
、上記参照）により、遺伝子の発現、プロセシング、および／もしくは機能、またはその
遺伝子産物が増加し得る。一例において、ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子またはそ
の一部分におけるＩＮＳ１エレメントの変異は、スプライシングされていないウイルスＲ
ＮＡの核外輸送の増加をもたらす。
一部の事例において、ベクターによってコードされるエレメントまたは遺伝子の全体が
、ベクターから欠失していてもよい。例えば、ＷＰＲＥなどの一部の転写後制御エレメン
トは、Ｘタンパク質またはその一部分をコードするポリヌクレオチドを含む。Ｘタンパク
質は、肝臓がんの発生に関係付けられている（例えば、参照により本明細書に組み込まれ
る、Gene Ther. 12(1):3-4, 2005参照）。このため、バイオセーフティの観点から、本発
明のレンチウイルス移入ベクターのＰＲＥからのＸタンパク質の活性、機能、および／ま
たは発現を防止することが、有益である可能性がある。例えば、Ｘタンパク質をコードす
る遺伝子を、ベクターから欠失させることができる。あるいは、Ｘタンパク質をコードす
る遺伝子の開始コドンを変異させ（例えば、ＡＴＧからＡＧＧへ）、それによって、Ｘタ
ンパク質の翻訳を防止してもよい。別の代替法として、Ｘタンパク質の機能を防止する１
つまたは複数の不活性化変異を、Ｘタンパク質のアミノ酸配列に導入してもよい。Ｘタン
パク質を不活性化するためのさらなるアプローチには、当該技術分野において周知の変異
方法が含まれる。
パッケージングベクター
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、１つまたは複数の追加のベクターとともに、
細胞に同時にトランスフェクトしてもよい。一部の事例において、１つまたは複数の追加
のベクターには、レンチウイルスパッケージングベクターが含まれ得る。ある特定の事例
において、１つまたは複数の追加のプラスミドは、エンベローププラスミド（例えば、ｐ
ＭＤ．ＧなどのＶＳＶ－Ｇをコードするエンベローププラスミド）を含み得る。一般に、
パッケージングベクターには、レンチウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅ
ｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、および／もしくはｎｅｆタンパク質、
またはそれらの誘導体、組合せ、もしくは部分）をコードする１つまたは複数のポリヌク
レオチド配列が含まれ得る。本発明のレンチウイルス移入ベクターとともに細胞に同時に
トランスフェクトされるパッケージングベクターは、レンチウイルス移入ベクターによっ
てコードされない１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質をコードする配列を含み得
る。例えば、レンチウイルス移入ベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌをコードする第１のパ
ッケージングベクター、ならびにｒｅｖをコードする第２のパッケージングベクターとと
もに、同時にトランスフェクトされ得る。したがって、レンチウイルス移入ベクターとそ
のようなパッケージングベクターとの同時トランスフェクションにより、結果として、ウ
イルス粒子の形成に必要なすべての遺伝子を細胞に導入することができ、それによって、
細胞がウイルス粒子を産生することが可能となり、これを単離することができる。本発明
において使用するのに適切なパッケージングベクターは、当業者によって、例えば、本発
明のレンチウイルス移入ベクターに選択された特性を考慮して、選択され得る。本発明に
おいて使用することができるか、または本発明における使用に適合され得る、パッケージ
ングベクターの例については、例えば、国際公開第０３／０６４６６５号パンフレット、
同第２００９／１５３５６３号パンフレット、米国特許第７，４１９，８２９号明細書、
国際公開第２００４／０２２７６１号パンフレット、米国特許第５，８１７，４９１号明
細書、国際公開第９９／４１３９７号パンフレット、米国特許第６，９２４，１２３号明
細書、同第７，０５６，６９９号明細書、国際公開第９９／３２６４６号パンフレット、
同第９８／５１８１０号パンフレット、および同第９８／１７８１５号パンフレット参照
。一部の事例において、パッケージングプラスミドは、ｇａｇおよび／またはｐｏｌタン
パク質をコードし得、任意選択で、ＲＲＥ配列を含み得る（例えば、ｐＭＤＬｇｐＲＲＥ
ベクター、例えば、Dull et al., J. Virol. 72(11):8463-8471, 1998参照）。ある特定
の事例において、パッケージングベクターは、ｒｅｖタンパク質をコードし得る（例えば
、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖベクター）。
レンチウイルス産生のための宿主細胞
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、宿主細胞（パッケージング細胞）に導入され
得る。本レンチウイルス移入ベクターは、概して、１つまたは複数の追加のベクター（例
えば、１つまたは複数のパッケージングベクター）とともに、宿主細胞に同時にトランス
フェクトされる。１つまたは複数の追加のベクターは、ウイルスタンパク質および／また
は制御性タンパク質をコードし得る。本レンチウイルス移入ベクターおよび１つまたは複
数の追加のベクターの同時トランスフェクションにより、宿主細胞が、レンチウイルス（
例えば、レンチウイルス移入ベクター由来の異種核酸配列をコードするレンチウイルス）
を産生することが可能となる。本明細書に記載されるように宿主細胞によって産生された
レンチウイルスは、別の細胞を感染させるために使用することができる。異種核酸および
／または１つまたは複数の追加のエレメント（例えば、プロモーターおよびウイルスエレ
メント）が、感染細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、この細胞およびその子孫が
、レンチウイルス移入ベクターを起源とする遺伝子を発現することが可能となり得る。
レンチウイルス移入ベクター（および１つまたは複数のパッケージングベクター）をト
ランスフェクトするのに好適なパッケージング細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物
細胞であり得る。宿主細胞は、細胞株（例えば、不死化細胞株）を起源とするものであっ
てもよい。例えば、宿主細胞は、ＨＥＫ ２９３細胞（例えば、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を含
む２９３Ｔ細胞）であってもよい。レンチウイルスが形質導入される細胞に関する情報は
、以下に提供される。
標的細胞は、目的の導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクター（レンチウイルス
）を感染させた（形質導入した）細胞である。形質導入後に、目的の導入遺伝子は、標的
細胞のゲノムに安定に挿入され、ＰＣＲおよびサザンブロッティングなどの分子生物学方
法によって検出することができる。導入遺伝子は、標的細胞において発現され得、フロー
サイトメトリーまたはウエスタンブロッティングによって検出することができる。一部の
事例において、標的細胞は、ヒト細胞である。ある特定の事例において、宿主細胞は、目
的とされる特定の細胞型、例えば、初代Ｔ細胞、ＳｕｐＴ１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ま
たは２９３Ｔ細胞である。
レンチウイルスを産生する方法
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細
胞）において、レンチウイルスを産生するのに有用であり得る。本明細書に記載されるレ
ンチウイルス移入ベクターを使用して、レンチウイルスを産生する方法は、概して、レン
チウイルス移入ベクターおよび１つまたは複数の追加のベクター（例えば、レンチウイル
スパッケージングベクター）を細胞に導入することを伴うであろう。ベクターは、当該技
術分野において周知のトランスフェクション方法を使用して細胞に導入され得る。トラン
スフェクション後、細胞は、（例えば、当該技術分野において公知のウイルス遺伝子発現
を誘導するための標準的な条件下において細胞をインキュベートすることによって）レン
チウイルス移入ベクターおよび／または１つもしくは複数の追加のベクターによってコー
ドされるウイルスタンパク質を発現することが可能となり得る。一部の事例において、ウ
イルス遺伝子は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターの制御下において発現さ
れる。後者の事例では、ウイルス遺伝子発現は、誘導的プロモーターを活性化するのに好
適な条件下において細胞をインキュベートすることによって、選択的に誘導され得る。細
胞によって産生されたウイルスタンパク質は、続いて、ウイルス粒子を形成し得、これが
、細胞表面から出芽し、（例えば、当該技術分野において周知の方法に従って）溶液から
単離することができる。ウイルスの形成の際に、異種核酸の配列を含むポリヌクレオチド
が、ウイルス粒子に組み込まれ得る。したがって、このプロセスにより、レンチウイルス
移入ベクターを起源とする異種核酸を含むレンチウイルスが得られる。
異種核酸
本発明は、異種核酸を含むレンチウイルス移入ベクターを特徴とする。異種核酸は、細
胞において発現させようとする目的の導入遺伝子（例えば、ポリペプチドをコードする遺
伝子または非コーディングＲＮＡの遺伝子）を含み得る。一部の事例において、異種タン
パク質のＯＲＦは、コザック配列の下流に位置する。目的の遺伝子は、ある特定の事例に
おいて、本明細書に記載されるマーカー遺伝子と会合（例えば、それに融合）していても
よい。一部の事例において、レンチウイルス移入ベクターの異種核酸は、レンチウイルス
移入ベクターおよび任意選択で１つまたは複数の追加のベクター（例えば、パッケージン
グベクター）をトランスフェクトした細胞において産生されたレンチウイルスに存在する
ことになる。ある特定の事例において、異種核酸は、レンチウイルスを感染させた細胞の
ゲノムに組み込まれ得る。そのような細胞のゲノムへの異種核酸の組込みにより、この細
胞およびその子孫が、目的の遺伝子を発現することが可能となり得る。目的の遺伝子は、
当該技術分野において公知の任意の遺伝子であり得る。目的の遺伝子の例としては、限定
することなく、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、結合性部分（例えば、抗体および抗体フラ
グメント）、シグナル伝達タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、Ｔ細胞受容体）、
疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、神経障害、もしくは当該技術分野において公知の任
意の他の疾患）に関与するタンパク質、またはそれらの任意の誘導体もしくは組合せをコ
ードする遺伝子が挙げられる。
キメラ抗原受容体
本発明のレンチウイルス移入ベクターは、細胞におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の
産生を誘導するために使用することができる。ＣＡＲは、（ｉ）細胞外抗原結合性ドメイ
ン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、膜
貫通タンパク質であり得る。本発明のレンチウイルス移入ベクターによってコードされる
ＣＡＲは、当該技術分野において公知の任意のＣＡＲであり得る。一実施形態において、
ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ド
メイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
抗原結合性ドメイン
本発明は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を望ましくない細胞（
例えば、がん細胞）に指向する、１つまたは複数のＣＡＲを含むように操作された、免疫
エフェクター細胞を作製するために使用することができる。これは、ＣＡＲ上のがん関連
抗原に特異的な抗原結合性ドメインを通じて達成される。本発明のＣＡＲによって標的と
することができるがん関連抗原（腫瘍抗原）には、（１）がん細胞の表面上に発現される
がん関連抗原、および（２）がん関連抗原自体は細胞内にあるが、その抗原のフラグメン
ト（ペプチド）が、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）によってがん細胞の表面上に提示され
るもの、の２つのクラスがある。
一部の事例において、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ
３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３；上皮成長因子受容体
バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシ
ドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ
Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ
）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナ
ーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ
６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６
）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２；
メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗
原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）
；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベ
ータ）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ
；受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細
胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡ
Ｍ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異型（ＥＬＦ
２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様
成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソー
ム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク
質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白
血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃ
ｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；
シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナー
ゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガ
ングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／Ｃ
Ｄ２４８）；腫瘍内皮マーカー７－関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）
；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ
５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯ
ＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル
酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（Ｇｌｏｂｏ
Ｈ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイル
ス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネ
キシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原
６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガ
ンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウイルムス腫瘍タンパク質（Ｗ
Ｔ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）
；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、１２ｐ染色体
に位置（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、
メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）
；黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－Ｃ
Ｔ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロス
テイン；サバイビン(surviving)；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によっ
て認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素
（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲ
Ｇ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチ
ルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ
－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃニワトリ骨芽球腫
ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓホモログファミリー
メンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ
４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ－結合因子（ジンクフィンガータンパク質
）様、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原３（ＳＡＲＴ３）；対合ボックス
タンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－Ｔ
ＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカー
タンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容
体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓偏在１（ＲＵ１）；腎臓偏在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒト
パピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７
）；腸内カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異型（ｍｕｔ ｈ
ｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容
体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡのＦｃフラグメントの受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３０
０分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１
２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュー
ル含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリ
ピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラム
ダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原に特異的に結合するこ
とができる。
本明細書に記載されるＣＡＲは、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書に記載される腫瘍支
持抗原）に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲ
またはＴＣＲフラグメント）を含み得る。一部の実施形態において、腫瘍支持抗原は、間
質細胞または骨髄系細胞由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に存在する抗原である。間質
細胞は、成長因子を分泌して、微小環境において細胞分裂を促進し得る。ＭＤＳＣ細胞は
、Ｔ細胞の増殖および活性化を阻害し得る。理論に束縛されることを望むものではないが
、一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、腫瘍支持細胞を破壊し、それによって、
腫瘍の成長および生存を間接的に阻害する。
複数の実施形態において、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽
細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、およびテネイシンのうちの１つまたは複数から選択さ
れる。ある実施形態において、ＦＡＰ特異性抗体は、シブロツズマブ（sibrotuzumab）と
結合に関して競合するか、またはそれと同じＣＤＲを有する。複数の実施形態において、
ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ６６ｂのうちの
１つまたは複数から選択される。したがって、一部の実施形態において、腫瘍支持抗原は
、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、またはテ
ネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ６６ｂのうちの１つま
たは複数から選択される。
抗原結合性ドメインの構造
ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、例えば、当該技術分野において公知の任意のポリペプ
チド結合性部分を含み得る。例えば、抗原結合性ドメインは、抗体または抗体フラグメン
ト（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）
、ＶＨもしくはＶＬドメイン、ラクダ科ＶＨＨドメイン、または二官能性（例えば、二重
特異性）ハイブリッド抗体）を含み得る。好ましい事例において、抗原結合性ドメインは
、ｓｃＦｖを含む。一部の事例において、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ
）、またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。ある特定の
事例において、抗原結合性ドメインは、二重特異性分子または多重特異性分子（例えば、
多重特異性抗体分子）である。一部の事例において、抗原結合性ドメインは、目的とされ
る１つまたは複数の特定の標的分子を認識する。目的の標的分子は、例えば、疾患または
その発症と関連し得る。
一部の事例において、ｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の方法に従って調製する
ことができる（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al.
, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照）。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポ
リペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域およびＶＬ領域を一緒に連結させることによっ
て産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適な長さおよび／またはアミノ酸組成を有
するリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖ
の可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響を及ぼし得る。実際
に、短いポリペプチドリンカーを用いた場合（例えば、５～１０個のアミノ酸）、鎖内の
折りたたみが防止される。鎖間の折りたたみは、２つの可変領域を一緒にして、機能的エ
ピトープ結合性部位を形成するためにも必要である。リンカーの配向およびサイズの例に
ついては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hollinger et al. 1993 Proc N
atl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号
明細書、同第２００５／０１７５６０６号明細書、同第２００７／００１４７９４号明細
書、ならびにＰＣＴ国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレットおよび同第２００
７／０２４７１５号パンフレット参照。
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域との間に少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、
６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、
１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、
またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の天然に存
在するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシ
ンおよびセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、グリシンおよびセリン
のセットの繰り返し、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは、１または１を上回る
正の整数である（配列番号２２）。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ
）４（配列番号２９）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）であり得る。リンカ
ーの長さの変動は、活性を保持することもあれば、活性を強化して、活性研究においてよ
り優れた有効性をもたらすこともある。
別の態様において、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）またはそのフ
ラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。このようなＴＣＲを作製する
方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy
7: 1369-1377 (2000)、Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004)、Aggen
et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照（参考文献は、その全体が本明細書に組み
込まれる）。例えば、リンカー（例えば、可動性ペプチド）によって連結されたＴ細胞ク
ローンから、Ｖα遺伝子およびＶβ遺伝子を含有するｓｃＴＣＲを操作することができる
。このアプローチは、がん関連標的自体は細胞内にあるが、そのような抗原のフラグメン
ト（ペプチド）がＭＨＣによってがん細胞の表面上に提示されるものに対して、非常に有
用である。
ある特定の実施形態において、コードされる抗原結合性ドメインは、１０－４Ｍ～１０
－８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。
一実施形態において、コードされるＣＡＲ分子は、標的抗原に対して、１０－４Ｍ～１
０－８Ｍ、例えば、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、例えば、１０－６Ｍまたは１０－７Ｍの結
合親和性ＫＤを有する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態において、抗原結合性ドメ
インは、参照抗体、例えば、本明細書に記載される抗体の大きくても５分の１、１０分の
１、２０分の１、３０分の１、５０分の１、１００分の１、または１，０００分の１の結
合親和性を有する。一実施形態において、コードされる抗原結合性ドメインは、参照抗体
（例えば、抗原結合性ドメインが由来する抗体）の大きくても５分の１の結合親和性を有
する。一態様において、そのような抗体フラグメントは、当業者には理解されるように、
免疫応答の活性化、その標的抗原を起源とするシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性の阻害
などを含み得るがこれらに限定されない生物学的応答を提供するという点で、機能性であ
る。
一態様において、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、それが由来するｓｃＦｖマウス配列
と比較してヒト化されている、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
一態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、哺乳
動物細胞における発現に関して配列がコドン最適化されている核酸分子によってコードさ
れる。一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクト全体は、哺乳動物細胞における発
現に関して配列全体がコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドン最
適化は、コーディングＤＮＡにおける同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードする
コドン）の発生頻度に、異なる種では偏りがあることを発見することを指す。このような
コドン縮重により、同一のポリペプチドを様々なヌクレオチド配列によってコードするこ
とが可能となる。様々なコドン最適化方法が、当該技術分野において公知であり、例えば
、米国特許第５，７８６，４６４号明細書および同第６，１１４，１４８号明細書に開示
されている方法が挙げられる。
特異的な抗原抗体対
一実施形態において、ＣＤ２２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Haso et al.,
Blood, 121(7): 1165-1174 (2013)、Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903
(2010)、Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013)、Creative BioMart (creativebio
mart.net): MOM-18047-S(P)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態において、ＣＳ－１に対する抗原結合性ドメインは、エロツズマブ（ＢＭＳ
）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲであり、例えば、Tai et al., 2008, Blood 112(4)
:1329-37、Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63参照。
一実施形態において、ＣＬＬ－１に対する抗原結合性ドメインは、Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体、例えば、ＰＥ－ＣＬＬ１－ｈｕカタロ
グ番号３５３６０４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥ－ＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ）カ
タログ番号５６２５６６（ＢＤ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Bross et al.
, Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001)（ゲムツズマブオゾガマイシン、ｈＰ６７．
６）、Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992)（リンツズマブ、ＨｕＭ１９
５）、Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012)（ＡＶＥ９６３３）
、Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013)（ＡＭＧ３３０、ＣＤ３３ Ｂｉ
ＴＥ）、Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012)、およびPizzitola et al., L
eukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mujoo et al.,
Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987)、Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1
985)、Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987)、Cheung et al., J Clin O
ncol 16(9):3053-3060 (1998)、Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(
3):199-204 (1992)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一
部の実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、ｍＡｂ １４．１８、１
４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６
０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１、および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合性部分で
あり、例えば、国際公開第２０１２０３３８８５号パンフレット、同第２０１３０４０３
７１号パンフレット、同第２０１３１９２２９４号パンフレット、同第２０１３０６１２
７３号パンフレット、同第２０１３１２３０６１号パンフレット、同第２０１３０７４９
１６号パンフレット、および同第２０１３８５５５２号パンフレット参照。一部の実施形
態において、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、米国特許出願公開第２０１００１５
０９１０号明細書またはＰＣＴ国際公開第２０１１１６０１１９号パンフレットに記載さ
れている抗体の抗原結合性部分である。
一実施形態において、ＢＣＭＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２
０１２１６３８０５号パンフレット、同第２００１１２８１２号パンフレット、および同
第２００３０６２４０１号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば
、ＣＤＲである。
一実施形態において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８
，４４０，７９８号明細書、Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)、および
Stone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)に記載されている抗体の抗原結合性
部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＳＭＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Parker et al
., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)、米国特許出願公開第２０１１０２６８６
５６号明細書（Ｊ５９１ ＳｃＦｖ）、Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223
-2232 (2013)（ｓｃＦｖＤ２Ｂ）、国際公開第２００６１２５４８１号パンフレット（ｍ
Ａｂｓ ３／Ａ１２、３／Ｅ７、および３／Ｆ１１）に記載されている抗体、ならびに一
本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ Ａ５およびＤ７）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ
である。
一実施形態において、ＲＯＲ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hudecek et a
l., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)、国際公開第２０１１１５９８４７号パ
ンフレット、および米国特許出願公開第２０１３０１０１６０７号明細書に記載されてい
る抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＬＴ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２
０１１０７６９２２号パンフレット、米国特許第５７７７０８４号明細書、欧州特許第０
７５４２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９７５２９号明細書に記載され
ている抗体、およびいくつかの市販のカタログの抗体（Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、Ａｂｃａｍ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hombach et
al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)に記載されている抗体およびＡｂｃａ
ｍ ａｂ６９１の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＡＰに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Ostermann et a
l., Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)（ＦＡＰ５）、米国特許出願公開第
２００９／０３０４７１８号明細書に記載されている抗体、シブロツズマブ（例えば、Ho
fheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003参照）、およびTran et
al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３８に対する抗原結合性ドメインは、例えば、ダラツムマブ
（例えば、Groen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)参照）、ＭＯＲ２０２（例え
ば、米国特許第８，２６３，７４６号明細書参照）、または米国特許第８，３６２，２１
１号明細書に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Casucci
et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＥＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Chmielewski et
al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)に記載されている抗体の抗原結合性部
分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＭＴ１１０
、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ａｂ（例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635
596参照）、エドレコロマブ、３６２２Ｗ９４、ＩＮＧ－１、およびアデカツムマブ（Ｍ
Ｔ２０１）から選択される抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合性ドメインは、米国特許第８，０
８０，６５０号明細書に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＭＧＡ２７１（Ｍ
ａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＫＩＴに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７９
１５３９１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号明細書に記載されて
いる抗体、およびいくつかの市販のカタログの抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態において、ＩＬ－１３Ｒａ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際
公開第２００８／１４６９１１号パンフレット、同第２００４０８７７５８号パンフレッ
トに記載されている抗体、いくつかの市販のカタログの抗体、および国際公開第２００４
０８７７５８号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態において、ＣＤ３０に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７
０９０８４３号明細書および欧州特許第０８０５８７１明細書に記載されている抗体の抗
原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７２
５３２６３号明細書、同第８，２０７，３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１２０
２７６０４６号明細書、欧州特許第１０１３７６１号明細書、国際公開第２００５０３５
５７７号パンフレット、および米国特許第６４３７０９８号明細書に記載されている抗体
の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ１７１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hong et al
., J Immunother 37(2):93-104 (2014)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば
、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｃａｍ（カ
タログ番号ａｂ５５２６２）またはＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カタログ番号
ＥＰＲ５４４６）から入手可能な抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。別の実
施形態において、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合性ドメインは、ペプチドであり、例え
ば、Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)参照。
一実施形態において、ＰＳＣＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Morgenroth e
t al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)（ｓｃＦｖ ７Ｆ５）、Nejatollahi et al.,
J of Oncology 2013(2013), article ID 839831（ｓｃＦｖ Ｃ５－ＩＩ）、および米国
特許出願公開第２００９０３１１１８１号明細書に記載されている抗体の抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Chinnasa
my et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)に記載されている抗体の抗原結合
性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＬｅｗｉｓＹに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Kelly et
al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)（ｈｕ３Ｓ１９３ Ａｂ（ｓｃ
Ｆｖｓ））、Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)（ＮＣ１０ ｓ
ｃＦｖ）に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ２４に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Maliar et al
., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012)に記載されている抗体の抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＤＧＦＲ－ベータに対する抗原結合性ドメインは、抗体Ａｂｃ
ａｍ ａｂ３２５７０の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＳＳＥＡ－４に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＭＣ８１３（
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）または他の市販入手可能な抗体の抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ２０に対する抗原結合性ドメインは、抗体リツキシマブ、オ
ファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、またはＧＡ１０１の抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、葉酸受容体アルファに対する抗原結合性ドメインは、抗体ＩＭＧ
Ｎ８５３、または米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号明細書、米国特許第４８
５１３３２号明細書（ＬＫ２６）、同第５９５２４８４号明細書に記載されている抗体の
抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）に対する抗原結合性ドメインは
、抗体トラスツズマブまたはペルツズマブの抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＵＣ１に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５
８の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合性ドメインは、抗体セツキシマブ、パ
ニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、またはマツズマブの抗原結合性部分、例えば
、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＮＣＡＭに対する抗原結合性ドメインは、抗体クローン２－２Ｂ
：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態において、エフリンＢ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Abengoza
r et al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＧＦ－Ｉ受容体に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国
特許第８３４４１１２号明細書、欧州特許出願公開第２３２２５５０号明細書、国際公開
第２００６／１３８３１５号パンフレット、またはＰＣＴ出願第２００６／０２２９９５
号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＡＩＸに対する抗原結合性ドメインは、抗体クローン３０３１
２３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＭＰ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７
，４１０，６４０号明細書または米国特許出願公開２００５０１２９７０１号明細書に記
載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ｇｐ１００に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＨＭＢ４５、Ｎ
ＫＩｂｅｔａＢ、または国際公開第２０１３１６５９４０号パンフレットもしくは米国特
許出願公開第２０１３０２９５００７号明細書に記載されている抗体の抗原結合性部分、
例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、チロシナーゼに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許
第５８４３６７４号明細書または米国特許出願公開第１９９５０５０４０４８号明細書に
記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Yu et al.,
Mol Ther 22(1):102-111 (2014)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤ
Ｒである。
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７２
５３２６３号明細書、同第８，２０７，３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１２０
２７６０４６号明細書、欧州特許出願公開第１０１３７６１号明細書、２０１２０２７６
０４６、国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット、または米国特許第６４３７０
９８号明細書に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特
許出願公開第２０１００２９７１３８号明細書または国際公開第２００７／０６７９９２
号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ｓＬｅに対する抗原結合性ドメインは、抗体Ｇ１９３（ｌｅｗｉ
ｓ Ｙ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲであり、Scott AM et al, Cancer Res 60: 3
254-61 (2000)参照、Neeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supple
ment) 177.10にも記載されている。
一実施形態において、ＧＭ３に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＣＡ ２５２３４４
９（ｍＡｂ １４Ｆ７）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Kmiecik
et al., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014) (PMID: 24575382)（ｍＡｂ９．２．２７）
、米国特許第６５２８４８１号明細書、国際公開第２０１００３３８６６号パンフレット
、または米国特許出願公開２０１４０００４１２４号明細書に記載されている抗体の抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ｏ－アセチル－ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、抗体８Ｂ
６の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合性ドメインは、例えば、
Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006)、Zhao et al., J Immunol Methods
363(2):221-232 (2011)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである
。
一実施形態において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＩＭＡＢ０２７
（Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤ
Ｒであり、例えば、clinicaltrial.gov/show/NCT02054351参照。
一実施形態において、ＴＳＨＲに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８
，６０３，４６６号明細書、同第８，５０１，４１５号明細書、または同第８，３０９，
６９３号明細書に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合性ドメインは、抗体ＦＡＢ６３０
０Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＬＳ－Ａ４１８０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ９７に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第６
，８４６，９１１号明細書、de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)に記
載されている抗体、またはＲ＆Ｄからの抗体ＭＡＢ３７３４の抗原結合性部分、例えば、
ＣＤＲである。
一実施形態において、ＡＬＫに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mino-Kenudson
et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)に記載されている抗体の抗原結合性部
分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ポリシアル酸に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Nagae et
al., J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)に記載されている抗体の抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Ghods et a
l., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177に記載されている抗体の抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合性ドメインは、抗体ＶＫ９、また
は例えばKudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9 ( 1998)、Lou et al., Proc Na
tl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014)、MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259
:14773-14777 (1984)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＮＹ－ＢＲ－１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Jager
et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)に記載されている抗体
の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＷＴ－１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Dao et al.,
Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)または国際公開第２０１２／１３５８５４号パン
フレットに記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Willem
sen et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)（ＴＣＲ様ｓｃＦｖ）に記載されてい
る抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、精子タンパク質１７に対する抗原結合性ドメインは、例えば、So
ng et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313)、Song et al., Med Oncol 29(
4):2923-2931 (2012)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、Ｔｉｅ ２に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＡＢ３３（Ｃｅ
ｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ
である。
一実施形態において、ＭＡＤ－ＣＴ－２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＭ
ＩＤ：２４５０９５２、米国特許第７６３５７５３号明細書に記載されている抗体の抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合性ドメインは、抗体１２Ｆ９
（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、メランＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合性ドメインは、欧州特許
出願公開第２５１４７６６号明細書または米国特許第７，７４９，７１９号明細書に記載
されている抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、肉腫転座切断点に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Luo et
al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＲＰ－２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Wang et al
, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例えば、
ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Maecker
et al, Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)に記載されている抗体の抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＲＡＧＥ－１に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＭＡＢ５３２
８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合性ドメインは、抗
体カタログ番号ＬＳ－Ｂ９５－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の
抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、腸内カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合性ドメインは、
抗体４Ｆ１２：カタログ番号ＬＳ－Ｂ６１９０－５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２に対する抗原結合性ドメインは、抗体Ｌ
ｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：モノクローナル：カタログ番号ＬＳ－Ｃ１３
３２６１－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７９ａに対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｃａｍから入手
可能な抗体である抗ＣＤ７９ａ抗体［ＨＭ４７／Ａ９］（ａｂ３１２１）；Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な抗体であるＣＤ７９Ａ抗体＃
３３５１；またはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なウサギにおいて産生された
抗体であるＨＰＡ０１７７４８－抗ＣＤ７９Ａ抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態において、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合性ドメインは、Dornan et al., "Th
erapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE
, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma" Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9.
doi: 10.1182/blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24に記載されている抗ＣＤ７９ｂ
抗体ポラツズマブベドチン、または"4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-De
pendent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Mal
ignancies" Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, C
A December 6-9 2014に記載されている二重特異性抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３抗体の抗原結合
性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７２に対する抗原結合性ドメインは、Myers, and Uckun, "A
n anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic
leukemia." Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22に記載されている抗体Ｊ３－１０
９、またはPolson et al., "Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodg
kin’s Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection" Cancer Res March 15, 2009 69;
2358に記載されている抗ＣＤ７２（１０Ｄ６．８．１、ｍＩｇＧ１）の抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合性ドメインは、ＰｒｏＳｐｅｃから
入手可能な抗体であるＡＮＴ－３０１ ＬＡＩＲ１抗体、またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから
入手可能な抗ヒトＣＤ３０５（ＬＡＩＲ１）抗体の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲであ
る。
一実施形態において、ＦＣＡＲに対する抗原結合性ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｉｎｃから入手可能な抗体であるＣＤ８９／ＦＣＡＲ抗体（カタログ番号１
０４１４－Ｈ０８Ｈ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｎｏｖａから
入手可能な抗体であるＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体（Ｍ１７）クローン３Ｃ７、また
はＬｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なマウス抗ＬＩＬＲＡ２抗体
、モノクローナル（２Ｄ７）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合性ドメインは、抗ＢｉｏＬｅｇ
ｅｎｄから入手可能な抗体であるマウス抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［
ＵＰ－Ｄ２］、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なラット抗ＣＭＲＦ３５様分
子１抗体、モノクローナル［２３４９０３］の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合性ドメインは、Noordhuis et a
l., "Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates
and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody" 53rdASH Annual Meeting and Exposition, D
ecember 10-13, 2011に記載されている抗体である二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂ
ｉＴＥ）ｓｃＦｖ－抗体およびＡＤＣ、ならびにＭＣＬＡ－１１７（Ｍｅｒｕｓ）の抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＢＳＴ２（ＣＤ３１７とも称される）に対する抗原結合性ドメイ
ンは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗体であるマウス抗ＣＤ３１
７抗体、モノクローナル［３Ｈ４］、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウ
ス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［６９６７３９］の抗原結合性部分、例えば、ＣＤ
Ｒである。
一実施形態において、ＥＭＲ２（ＣＤ３１２とも称される）に対する抗原結合性ドメイ
ンは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体であるマウス抗Ｃ
Ｄ３１２抗体、モノクローナル［ＬＳ－Ｂ８０３３］、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓか
ら入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［４９４０２５］の抗原結合性部
分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＹ７５に対する抗原結合性ドメインは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅから入手可能な抗体であるマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［ＨＤ
３０］、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なマウス抗リンパ球抗
原７５抗体、モノクローナル［Ａ１５７９７］の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである
。
一実施形態において、ＧＰＣ３に対する抗原結合性ドメインは、Nakano K, Ishiguro T
, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR gr
afting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916に記
載されている抗体ｈＧＣ３３、またはいずれもFeng et al., "Glypican-3 antibodies: a
new therapeutic target for liver cancer." FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):377-82
に記載されているＭＤＸ－１４１４、ＨＮ３、もしくはＹＰ７の抗原結合性部分、例えば
、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合性ドメインは、Elkins et al., "Fc
RL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myelom
a" Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32に記載されている抗ＦｃＲＬ５抗体の抗
原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合性ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体であるマウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリ
ペプチド１抗体、モノクローナル［ＡＴ１Ｇ４］、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能なマ
ウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＨＳＬ１１］の抗
原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態において、抗原結合性ドメインは、上記に列挙した抗体に由来する１つ、２
つ、３つ（例えば、３つすべて）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およ
びＨＣ ＣＤＲ３を含む、かつ／または上記に列挙した抗体に由来する１つ、２つ、３つ
（例えば、３つすべて）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ
ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合性ドメインは、上記に列挙した抗体の重
鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
別の態様において、抗原結合性ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントを含む
。一部の態様において、非ヒト抗体は、ヒト化されるが、その場合、抗体の特定の配列ま
たは領域は、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはそのフラグメントに対する類似性
が増加するように修飾される。一態様において、抗原結合性ドメインは、ヒト化されてい
る。
二重特異性ＣＡＲ
ある特定の実施形態において、抗原結合性ドメインは、二重特異性分子または多重特異
性分子（例えば、多重特異性抗体分子）である。ある実施形態において、多重特異性抗体
分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つを上回らない抗原に対する
特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する
第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異性を有
する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。ある実施形態にお
いて、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク
質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態において、第１の
エピトープおよび第２のエピトープは、オーバーラップする。ある実施形態において、第
１のエピトープおよび第２のエピトープは、オーバーラップしない。ある実施形態におい
て、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパ
ク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態において
、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイ
ン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第２のエピトープに対する結合特異性を有
する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある実施形態において、
二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体および第２
のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体を含む。ある実施形態において、二重特
異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグ
メントおよび第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメン
トを含む。ある実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結
合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第２のエピトープに対する結合
特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
ある特定の実施形態において、抗体分子は、多重特異性（例えば、二重特異性または三
重特異性）抗体分子である。そのような分子としては、二重特異性融合タンパク質、例え
ば、例として米国特許第５６３７４８１号明細書に記載されている、間に親水性ヘリック
スペプチドリンカーを有する２つのｓｃＦｖおよび完全な定常領域を含む発現コンストラ
クト；例えば、米国特許第５８３７８２１号明細書に記載されている、結合したＶＬ鎖お
よびＶＨ鎖がさらにペプチドスペーサーによって抗体のヒンジ領域およびＣＨ３領域に接
続され、これが二量体化して二重特異性／多重特異性分子が形成され得る、ミニボディコ
ンストラクト；例えば、米国特許第５８６４０１９号明細書に記載されている、ＶＨドメ
インの一部（またはファミリーメンバーではＶＬドメイン）がペプチド結合によってＣ末
端で架橋性基と接続され、さらにＶＬドメインと会合して、一連のＦＶ（またはｓｃＦｖ
）を形成したもの；ならびに、例えば、米国特許第５８６９６２０号明細書に記載されて
いる、ＶＨおよびＶＬドメインの両方がペプチドリンカーによって結合した一本鎖結合性
ポリペプチドを、非共有結合または化学的架橋によって合わせて多価構造体にして、ｓｃ
ＦＶまたはダイアボディ型の両方の形式を使用して、例えば、ホモ一価、ヘテロ二価、三
価、および四価の構造体を形成したものが挙げられる。上記で参照した出願の内容は、参
照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
二重特異性分子のそれぞれの抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）内で、
ＶＨは、ＶＬの上流にあっても下流にあってもよい。一部の実施形態において、上流の抗
体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（Ｖ
Ｌ１）の上流に配置されており、下流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ
）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流に配置されており、結果として、
全体的な二重特異性抗体分子は、ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２の配置を有するように
なっている。他の実施形態において、上流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃ
Ｆｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流に配置されており、下流の抗
体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（Ｖ
Ｌ２）の上流に配置されており、結果として、全体的な二重特異性抗体分子は、ＶＬ１－
ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２の配置を有するようになっている。任意選択で、２つの抗体また
は抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖｓ）の間、例えば、コンストラクトがＶＨ１－Ｖ
Ｌ１－ＶＬ２－ＶＨ２として配置されている場合はＶＬ１とＶＬ２との間、またはコンス
トラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置されている場合はＶＨ１とＶＨ２
との間に、リンカーが配置される。リンカーは、本明細書に記載されるリンカー、例えば
、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーであってもよく、ここで、ｎは、１、２、３、４、５
、または６、好ましくは４である（配列番号２９）。一般に、２つのｓｃＦｖ間のリンカ
ーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を回避するのに十分に長くなければならない
。任意選択で、リンカーは、第１のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置される。任意選択
で、リンカーは、第２のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置される。複数のリンカーを有
するコンストラクトの場合、リンカーのうちの任意の２つ以上は、同じであっても異なっ
てもよい。したがって、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＶＬ、ＶＨ、お
よび任意選択で１つまたは複数のリンカーを、本明細書に記載される配置で含む。
膜貫通ドメイン
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、このドメインの一方の端部が、例えば、細胞外抗原結合性
ドメインに結合し、他方の端部が、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに結合するよう
に、リン脂質二重層を横断することができる任意のポリペプチドドメインであり得る。膜
貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫
通部分が由来するタンパク質の細胞外領域に関連する１つもしくは複数のアミノ酸（例え
ば、細胞外領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、最
大１５個のアミノ酸）および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領
域に関連する１つもしくは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１個、２個、３
個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、最大１５個のアミノ酸）を含み得る
。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインのうちの１つに関連するものであり得る。一
部の事例において、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作
用を最小限に抑えるために、そのようなドメインが同じかまたは異なる表面膜タンパク質
の膜貫通ドメインと結合することを回避するように、選択され得るか、アミノ酸置換によ
って修飾され得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の表面上の別の
ＣＡＲとホモ二量体化することができる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ
酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合性ドメインとの相
互作用を最小限に抑えるように、修飾または置換され得る。本発明において特に有用な膜
貫通ドメインには、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、または
ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８
、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、
ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域が含まれ得る。一部の実施形態におい
て、膜貫通ドメインには、少なくとも、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ
２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（Ｃ
Ｄ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ
７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｃ
Ｄ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ
４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴ
ＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、
ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２
、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡ
ＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ
１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１
００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭ
Ｆ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１
６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域が含まれ得る
。
一部の事例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒン
ジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合性ドメインに、結合するこ
とができる。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒン
ジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）、ＧＳリンカー（例えば、本明細書に記載
されるＧＳリンカー）、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであり得る。一実
施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む（例えば
、それからなる）。一態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の膜貫通ドメイン
を含む（例えば、それからなる）。
ある特定の実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ
酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０個を上回る、１０
個を上回る、もしくは５個を上回る修飾は有さない、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配
列、または配列番号１２のアミノ酸配列に９５～９９％の同一性を有する配列を含む。一
実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列を含む。
他の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸分子は、例えば、配列番号１３の配列
またはそれに９５～９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレ
オチド配列を含む。
ある特定の実施形態において、コードされる抗原結合性ドメインは、ヒンジ領域によっ
て膜貫通ドメインに接続される。一実施形態において、コードされるヒンジ領域は、ＣＤ
８ヒンジ、例えば、配列番号４のアミノ酸配列、またはＩｇＧ４ヒンジ、例えば、配列番
号６のアミノ酸配列、または配列番号４もしくは６に９５～９９％の同一性を有する配列
を含む。他の実施形態において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、それぞれがＣＤ８
ヒンジもしくはＩｇＧ４ヒンジに対応する、配列番号５もしくは配列番号７の配列、また
は配列番号５もしくは７に９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施
形態において、ヒンジまたはスペーサーは、以下のアミノ酸配列のヒンジを含む。
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥ
ＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ
ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫ
ＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡ
ＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱ
ＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＭ（配列番号６）。一部
の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、以下のヌクレオチド配列によってコー
ドされるヒンジを含む。
Figure 2022169574000001
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形
態において、ヒンジまたはスペーサーは、以下のアミノ酸配列のヒンジを含む。
ＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧ
ＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱ
ＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧ
ＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰ
ＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧ
ＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳ
ＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴ
ＤＨ（配列番号８）。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、以下のヌク
レオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
Figure 2022169574000002
一態様において、膜貫通ドメインは、組換えであってもよく、その場合は、主として、
ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。一態様において、フェニルアラニン、ト
リプトファン、およびバリンのトリプレットが、組換え膜貫通ドメインの各末端に見出さ
れ得る。
任意選択で、長さが２～１０個のアミノ酸である短いオリゴペプチドリンカーまたはポ
リペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間の連結部を形成し得
る。グリシン－セリンのダブレットが、特に好適なリンカーをもたらす。例えば、一態様
において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）を含む。一
部の実施形態において、リンカーは、ヌクレオチド配列ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴ
ＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号１１）によってコードされる。
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインのリガンドへの結合に応答して、１つまたは複数
の細胞内シグナル伝達経路を活性化および／または阻害し得る、１つまたは複数の細胞内
シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の事例において、細胞内シグナル伝達ドメインは
、免疫応答を誘導することが可能であり得る。例えば、Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲ
の細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原結合性ドメインが目的とされるその同種標的分子
に結合すると、Ｔ細胞の活性化を誘導し得る。
細胞内シグナル伝達ドメインを有する本発明の実施形態において、そのようなドメイン
は、例えば、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインのう
ちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメイン
は、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。一部の実施形態において、細胞
内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態におい
て、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝
達ドメインを含む。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または特
定の順序で互いに連結され得る。任意選択で、例えば、長さが２～１０個のアミノ酸（例
えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸）で
ある短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配
列間の連結部を形成してもよい。一実施形態において、グリシン－セリンのダブレットが
、好適なリンカーとして使用され得る。一実施形態において、単一のアミノ酸、例えば、
アラニン、グリシンが、好適なリンカーとして使用され得る。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４
つ、５つ、またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある
実施形態において、２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の共刺
激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、本明細書に記載されるリンカー分子
によって分離されている。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの
共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、リンカー分子は、グリシ
ン残基である。一部の実施形態において、リンカーは、アラニン残基である。
一次シグナル伝達ドメイン
一次シグナル伝達ドメインは、刺激様式または阻害様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一
次活性化を制御する。刺激様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容
体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含み得る
。
本発明において特に有用なＩＴＡＭを含む一次細胞内シグナル伝達ドメインの例として
は、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、Ｆｃ
Ｒベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、
ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２が挙げられる。一実施形態にお
いて、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３－ゼータの一次
シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、コードされる一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能
的シグナル伝達ドメインを含む。コードされるＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは
、配列番号１８もしくは配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは
３つの修飾を有するが、２０個を上回る、１０個を上回る、もしくは５個を上回る修飾は
有さないアミノ酸配列、または配列番号１８もしくは配列番号２０のアミノ酸配列に９５
～９９％の同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態において、コードされる一次
シグナル伝達ドメインは、配列番号１８または配列番号２０の配列を含む。他の実施形態
において、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９もしくは配
列番号２１の配列、またはそれに９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン
一部の実施形態において、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナ
ル伝達ドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメ
インおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態において、コードさ
れる共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、
ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦ
Ａ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に
結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨ
ＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、Ｉ
ＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬ
Ａ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、
ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ
１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮ
ＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、
ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２
２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９
、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、Ｉ
ＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、Ｌ
ＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６
、またはＮＫＧ２Ｄのうちの１つまたは複数から選択されるタンパク質の機能的シグナル
伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態において、コードされる共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号
１４もしくは配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾
を有するが、２０個を上回る、１０個を上回る、もしくは５個を上回る修飾は有さないア
ミノ酸配列、または配列番号１４もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に９５～９９％の
同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる共刺激シグナル伝達ドメ
インは、配列番号１４または配列番号１６の配列を含む。他の実施形態において、共刺激
シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１５もしくは配列番号１７の配
列、またはそれに９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
他の実施形態において、コードされる細胞内ドメインは、配列番号１４または配列番号
１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ド
メインを構成する配列は、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
ある特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、
配列番号１５もしくは配列番号１７の配列またはそれに９５～９９％の同一性を有する配
列、および配列番号１９もしくは配列番号２１の配列またはそれに９５～９９％の同一性
を有する配列を含む。
一部の実施形態において、核酸分子は、さらに、リーダー配列をコードする。一実施形
態において、リーダー配列は、配列番号２の配列を含む。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメ
インおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、
細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１Ｂ
Ｂのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、４－１ＢＢのシグ
ナル伝達ドメインは、配列番号１４のシグナル伝達ドメインである。一態様において、Ｃ
Ｄ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のシグナル伝達ドメインである。
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメ
インおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、
ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳ
ＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号１６）のアミノ酸配列
を含む。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、以下の核酸配列によって
コードされる。
ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡ
ＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡ
ＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣ
ＴＣＣ（配列番号１７）。
ＣＡＲ発現のための宿主細胞
上述のように、一部の態様において、本発明は、本明細書に記載される核酸分子、ＣＡ
Ｒポリペプチド分子、またはベクターを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例
えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞集団）に関する。
本開示のある特定の態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃ
ｏｌｌ（商標）分離など、当業者に公知の任意の多数の技法を使用して、対象から採取さ
れた血液単位から得ることができる。１つの好ましい態様において、個体の循環血液由来
の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的に、Ｔ細胞
、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有
する。一態様において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を
除去し、任意選択で、後続の処理ステップに適した緩衝液または培地に入れてもよい。一
実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な実施形
態において、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、かつマグネシウム不含であり得るか、ま
たはすべてではないものの多くの二価カチオン不含であり得る。
カルシウム不在下における初期活性化ステップにより、活性化の拡大をもたらされ得る
。当業者には容易に理解されるように、洗浄ステップは、半自動化「フロースルー」遠心
分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、
またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造業者の説明書に従っ
て使用するなど、当業者に公知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、
Ｃａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝液ありもしくはなし
の他の生理食塩水など、様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させてもよい。あるいは、ア
フェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁して
もよい。
本出願の方法は、５％以下、例えば、２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を用いる
ことができ、公知の培養培地条件および組成、例えば、Smith et al., "Ex vivo expansi
on of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Imm
une Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; d
oi:10.1038/cti.2014.31に記載されているものを採用し得ることが理解される。
一態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配
遠心分離または向流遠心分離溶出により単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球
から単離される。
本明細書に記載される方法は、例えば、例として本明細書に記載される、例えば、ネガ
ティブセレクション技法を使用して、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の特定の部
分集団（制御性Ｔ細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である）を選択することを含み得る
。好ましくは、制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、
１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２
５＋細胞を含有する。
一実施形態において、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体も
しくはそのフラグメント、またはＣＤ２５結合性リガンドＩＬ－２を使用して、集団から
除去される。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメント、またはＣ
Ｄ２５結合性リガンドは、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートされているか、または
それ以外の場合では基質、例えば、ビーズにコーティングされている。一実施形態におい
て、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントは、本明細書に記載される基質にコンジュゲ
ートされている。
一実施形態において、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して、集団から除去される。一実施形態において
、細胞とＣＤ２５枯渇試薬との比は、１ｅ７個の細胞に対して２０ｕＬ、または１ｅ７個
の細胞に対して１５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して１０ｕＬ、または１ｅ７個の細
胞に対して５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に対して２．５ｕＬ、または１ｅ７個の細胞に
対して１．２５ｕＬである。一実施形態において、例えば、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ
２５＋枯渇に関しては、５億個を上回る細胞／ｍｌが使用される。さらなる態様において
、６億個、７億個、８億個、または９億個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。
一実施形態において、枯渇させようとする免疫エフェクター細胞の集団には、約６×１
０９個のＣＤ２５＋Ｔ細胞が含まれる。他の態様において、枯渇させようとする免疫エフ
ェクター細胞の集団には、約１×１０９～１×１０１０個、およびこれらの間の任意の整
数値のＣＤ２５＋Ｔ細胞が含まれる。一実施形態において、結果として得られる制御性Ｔ
細胞枯渇細胞集団は、２×１０９個またはそれ未満の制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋
細胞（例えば、１×１０９個、５×１０８個、１×１０８個、５×１０７個、１×１０７
個、またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する。
一実施形態において、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣシ
ステムを枯渇用チューブセット、例えば、チューブ１６２－０１などとともに使用して、
集団から除去される。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムは、例えば、ＤＥ
ＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定で動作させる。
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、アフェレーシスの前またはＣＡＲ
発現細胞産物の作製中に、対象における免疫細胞の負の制御因子のレベルを減少させるこ
と（例えば、望ましくない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）によ
り、対象の再発の危険性が低減され得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当
該技術分野において公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、シクロホスフ
ァミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書に記載される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５枯渇、およ
びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、作製方法は、ＣＡＲ発現細胞の作製前に、ＴＲＥＧ細胞の数
を減少させるステップ（例えば、枯渇させるステップ）を含む。例えば、作製方法は、例
えば、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の作製前に、ＴＲＥＧ細胞を枯
渇させるために、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルを、抗ＧＩＴＲ抗体および
／または抗ＣＤ２５抗体（またはそのフラグメントもしくはＣＤ２５結合性リガンド）と
接触させるステップを含む。
ある実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物作製のための細胞を収集する前に
、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１つまたは複数の治療法による予備処置を受け、それによっ
て、ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の再発の危険性を減少させる。ある実施形態におい
て、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ
抗体、ＣＤ２５枯渇、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数の投与が挙げられる
が、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、また
はこれらの組合せのうちの１つまたは複数の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物の注入の前、最
中、またはその後に起こり得る。
ある実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物作製のための細胞を収集する前に
、シクロホスファミドによる予備処置を受け、それによって、ＣＡＲ発現細胞治療に対す
る対象の再発の危険性を減少させる。ある実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産
物作製のための細胞を収集する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で予備処置を受け、それによって、
ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の再発の危険性を減少させる。
一実施形態において、除去しようとする細胞集団は、制御性Ｔ細胞でも腫瘍細胞でもな
く、除去しなければＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に負の影響を及ぼす細胞、例
えば、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または可能性として免疫抑制細胞に
よって発現される他のマーカーを発現する細胞である。一実施形態において、このような
細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時に、または該枯渇の後に、または別
の順序で、除去されることが想定される。
本明細書に記載される方法は、１つを上回る選択ステップ、例えば、１つを上回る枯渇
ステップを含み得る。ネガティブセレクションによるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、ネガ
ティブセレクションが行われる細胞に固有な表面マーカーに指向される抗体の組合せによ
り達成することができる。１つの方法は、ネガティブセレクションが行われる細胞上に存
在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免
疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞のソーティングおよび／または選択である
。例えば、ネガティブセレクションによりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナ
ル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、および
ＣＤ８に対する抗体を含み得る。
本明細書に記載される方法はさらに、腫瘍抗原、例えば、例としてＣＤ１９、ＣＤ３０
、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂである腫瘍抗原を発現
する細胞を、ＣＤ２５を含まない集団から除去して、それによって、ＣＡＲ、例えば、本
明細書に記載されるＣＡＲの発現に好適な制御性Ｔ細胞枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇か
つ腫瘍抗原枯渇の細胞集団を得るステップを含み得る。一実施形態において、腫瘍抗原発
現細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ
２５抗体もしくはそのフラグメント、および抗腫瘍抗原抗体もしくはそのフラグメントは
、同じ基質、例えば、ビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去しても
よく、あるいは抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメント、または抗腫瘍抗原抗体もしく
はそのフラグメントは、別個のビーズに付着させることができ、それらの混合物を使用し
て細胞を除去してもよい。他の実施形態において、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細
胞の除去、および腫瘍抗原発現細胞の除去は、逐次的であり、例えば、いずれかの順序で
起こり得る。
チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書に記載されるチェックポイント阻害剤を発
現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞のうちの１
つまたは複数を、集団から除去して、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇、例えば、ＣＤ２
５＋枯渇かつチェックポイント阻害剤枯渇の細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、およ
び／またはＴＩＭ３＋枯渇の細胞集団を得るステップを含む、方法もまた、提供される。
例示的なチェックポイント阻害剤としては、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ
、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ
－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴ
ＬＡ、およびＬＡＩＲ１が挙げられる。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発
現細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ
２５抗体もしくはそのフラグメント、および抗チェックポイント阻害剤抗体もしくはその
フラグメントは、同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去しても
よく、または抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメント、および抗チェックポイント阻害
剤抗体もしくはそのフラグメントは、別個のビーズに付着させることができ、それらの混
合物を使用して細胞を除去してもよい。他の実施形態において、制御性Ｔ細胞、例えば、
ＣＤ２５＋細胞の除去、およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり
、例えば、いずれかの順序で起こり得る。
本明細書に記載される方法は、ポジティブセレクションステップを含み得る。例えば、
Ｔ細胞は、所望されるＴ細胞のポジティブセレクションに十分な期間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ
２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商
標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとともにインキュベートすることによって、単離
することができる。一実施形態において、この期間は、約３０分間である。さらなる実施
形態において、この期間は、３０分間～３６時間またはそれ以上、ならびにこれらの間の
すべての整数値の範囲にわたる。さらなる実施形態において、この期間は、少なくとも１
時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間である。さらに別の実施形態にお
いて、この期間は、１０～２４時間、例えば、２４時間である。腫瘍組織からまたは免疫
無防備状態の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するなど、他の細胞型と比較し
て存在するＴ細胞がわずかである任意の状況では、Ｔ細胞を単離するために、より長いイ
ンキュベーション時間を使用してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間を使
用することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率が増加し得る。したがって、単純にＴ細胞をＣ
Ｄ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を短縮もしくは延長することにより、および／ま
たはビーズとＴ細胞との比を増加もしくは減少させることにより（本明細書でさらに説明
される）、Ｔ細胞の部分集団は、培養開始時もしくはプロセス中の他の時点で、いずれに
も優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３抗体およ
び／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の部分集団は
、培養開始時または他の所望される時点で、いずれにも優先的に選択するこができる。
一実施形態において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、Ｉ
Ｌ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、およびパーフォリン
、または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの１つまたは複数を発現する
Ｔ細胞集団が、選択され得る。細胞発現に関してスクリーニングするための方法は、例え
ば、ＰＣＴ国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載されている方法によ
って決定され得る。
所望される細胞集団をポジティブセレクションまたはネガティブセレクションによって
単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させること
ができる。ある特定の態様において、細胞およびビーズを確実に最大限に接触させるため
に、ビーズおよび細胞を一緒に混合する体積を大幅に減少させる（例えば、細胞の濃度を
増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様において、１００億個の細胞／
ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍｌ、または５０
億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、１０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用さ
れる。さらなる一態様において、７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００
万個、９５００万個、または１億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様にお
いて、１億２５００万個または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。
高い濃度を使用することにより、細胞収率、細胞活性化、および細胞増殖の増加をもた
らすことができる。さらに、高い細胞濃度を使用することにより、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞な
ど、目的の標的抗原を微弱に発現し得る細胞、または多数の腫瘍細胞が存在するサンプル
（例えば、白血病血、腫瘍組織など）からの、より効率的な捕捉が可能となる。このよう
な細胞集団は、治療的価値を有し得るため、得ることが望ましいであろう。例えば、高い
細胞濃度を使用することにより、通常、微弱なＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞のよ
り効率的な選択が可能となる。
関連する態様において、より低い細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細
胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することにより、粒子
と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これは、これらの粒子に結合する所望さ
れる抗原を多量に発現する細胞に選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベ
ルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度ではＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一態様
において、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用
される濃度は、約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ、およびこれらの間の任意の整数
値であり得る。
他の態様において、細胞は、２～１０℃または室温のいずれかで、様々な速度で様々な
長さの期間、ローテーター上でインキュベートしてもよい。
また、刺激のためのＴ細胞を、洗浄ステップの後に凍結させてもよい。理論に束縛され
ることを望むものではなく、凍結ステップおよび後続の解凍ステップは、細胞集団中の顆
粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な生成物をもたらす。洗浄
ステップにより血漿および血小板を除去した後、細胞を、凍結溶液中に懸濁させてもよい
。多くの凍結溶液およびパラメーターが当該技術分野において公知あり、この文脈におい
て有用であるが、１つの方法としては、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを
含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト
血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－
Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０お
よび５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯを含有する
培養培地、または例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好
適な細胞凍結培地の使用を伴い、細胞は、次いで、１分間当たり１°の速度で－８０℃に
凍結され、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相で保管される。他の制御された凍結方法が、－２
０℃または液体窒素中での制御されない即時凍結と同様に使用され得る。
ある特定の態様において、凍結保存細胞は、本明細書に記載されるように解凍し、洗浄
して、室温で１時間静置させた後、本発明の方法を使用して活性化させる。
本明細書に記載される増殖細胞が必要となり得る前の時点における、対象からの血液サ
ンプルまたはアフェレーシス産物の収集もまた、本発明の文脈において企図される。その
ため、増殖させようとする細胞の供給源は、任意の必要な時点で収集することができ、所
望される細胞、例えば、Ｔ細胞を、本明細書に記載されるものなどの免疫エフェクター細
胞療法により利益が得られるであろう任意の多数の疾患または状態のための免疫エフェク
ター細胞療法における今後の使用のために単離し、凍結させることができる。一態様にお
いて、血液サンプルまたはアフェレーシスは、全般的に健常な対象から取得される。ある
特定の態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症する危険性があ
るが、まだ疾患を発症していない、全般的に健常な対象から取得され、今後の使用のため
に目的の細胞を単離し、凍結させる。ある特定の態様において、Ｔ細胞を、増殖させ、凍
結させ、後の時点で使用してもよい。ある特定の態様において、サンプルは、本明細書に
記載される特定の疾患の診断直後であるが、いかなる治療よりも前に、患者から収集され
る。さらなる態様において、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化
学療法、照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサー
ト、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡ
ＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、
ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、ならびに放射線照射
など、作用物質での治療を含むがこれらに限定されない、任意の多数の関連する治療モダ
リティの前に、対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシスから単離される。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞は、対象に機能性Ｔ細胞を残す治療の直後に、
患者から得られる。この点に関して、ある特定のがん治療の後、特に、免疫系を損傷する
薬物での治療の後は、患者が通常であれば治療から回復している最中であろう治療後間も
ない時点で、得られるＴ細胞の品質が、エキソビボで増殖する能力の点で最適であり得る
か、または向上している可能性があることが、観察されている。同様に、本明細書に記載
される方法を使用したエキソビボ操作後には、これらの細胞は、生着強化およびインビボ
増殖に好ましい状態であり得る。したがって、この回復段階中に、Ｔ細胞、樹状細胞、ま
たは他の造血系細胞を含む、血液細胞を収集することが、本発明の文脈において企図され
る。さらに、ある特定の態様において、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦでの動員）および調
整レジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生成、および／または増殖に
とって有利な状態を、特に、治療法の後の所定の時間枠の間に、対象において作り出すこ
とができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の免疫系細
胞が挙げられる。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る免疫エフェクター細胞は、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤を受容した対象から得ら
れる。ある実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作しようとする免疫エフェクタ
ー細胞、例えば、Ｔ細胞の集団は、対象におけるかまたは対象から採取されたＰＤ１陰性
免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細
胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なく
とも一過的に増加した状態となるように、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤から十分な
時間の後、またはその十分な投薬の後に、採取される。
他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されているか、またはこれから操
作される免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター
細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるか、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例
えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量の
ｍＴＯＲ阻害剤と接触させることによって、エキソビボで処置することができる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）が欠損して
いる。ＤＧＫ欠損細胞には、ＤＧＫ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、または
ＤＧＫ活性が低減もしくは阻害されている、細胞が含まれる。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学
的アプローチによって、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ
ＲＮＡを投与して、ＤＧＫ発現を低減または防止することによって、生成することができ
る。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載されるＤＧＫ阻害剤での処置によって
生成することができる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、Ｉｋａｒｏｓが欠損している。Ｉｋａｒｏｓ欠損
細胞には、Ｉｋａｒｏｓ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、またはＩｋａｒｏ
ｓ活性が低減もしくは阻害されている細胞が含まれ、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、遺伝学的
アプローチによって、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲ
ＮＡを投与して、Ｉｋａｒｏｓ発現を低減または防止することによって、生成することが
できる。あるいは、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマ
イドでの処置によって生成することができる。
複数の実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫが欠損しておりかつＩｋａｒｏｓが欠
損している、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないか、またはＤＧＫ活性およ
びＩｋａｒｏｓ活性が低減もしくは阻害されている。このようなＤＧＫおよびＩｋａｒｏ
ｓが欠損している細胞は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって生成する
ことができる。
ある実施形態において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。別の実施形態において、ＮＫ
細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ－９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
発現されるさらなる作用物質
別の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、さ
らに、別の作用物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質を発現し得る。
例えば、一実施形態において、作用物質は、阻害性分子を阻害する作用物質であり得る。
阻害性分子の例としては、例えば、本明細書に記載される、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴ
ＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、
および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、
ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態にお
いて、阻害性分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子が、
正のシグナルを細胞に提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞
内シグナル伝達ドメインに会合したものを含む。一実施形態において、作用物質は、例え
ば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡ
ＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩ
ＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、もしくはＴＧＦＲベ
ータなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかのフラグメントである、第１のポ
リペプチド、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺
激ドメイン（例えば、例として本明細書に記載される４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２
８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼ
ータシグナル伝達ドメインを含む）である、第２のポリペプチドを含む。一実施形態にお
いて、作用物質は、ＰＤ－１またはそのフラグメントである第１のポリペプチド、および
本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ
２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、または４－ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／または本明
細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む
。
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第２
のＣＡＲ、例えば、例として同じ標的（例えば、上述の標的）または異なる標的に対する
異なる抗原結合性ドメインを含む第２のＣＡＲをさらに含み得る。一実施形態において、
第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの標的と同じがん細胞型に発現される標的に対する抗原結
合性ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第１の
抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有
さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲ、ならびに第２の異なる抗原を
標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない
細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。
理論に束縛されることを望むものではないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、
４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ－４０を第１のＣＡＲに配置し、一次シグ
ナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを第２のＣＡＲに配置することにより、ＣＡＲ
活性を、両方の標的が発現される細胞に限定することができる。一実施形態において、Ｃ
ＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば、上述の標的を標的とする抗原結合性ドメイン
、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含む第１のＣＡＲ、第１のＣＡＲによって標
的とされる抗原以外の抗原（例えば、第１の標的と同じがん細胞型に発現される抗原）を
標的とし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含
む、第２のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、
例えば、上述の標的を標的とする抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグ
ナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ、ならびに第１のＣＡＲによって標的とされる抗原
以外の抗原（例えば、第１の標的と同じがん細胞型に発現される抗原）を標的とし、その
抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激シグナル伝達ドメイン
を含む、第２のＣＡＲを含む。
一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載されるＣＡ
Ｒ、例えば、上述の標的に対するＣＡＲ、および阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態におい
て、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、同様に標的を発現する正常細胞には見出される
ががん細胞には見出されない抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態にお
いて、阻害性ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および阻害性分子の細胞
内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、Ｃ
ＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３
、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ
、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、またはＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る
。
一実施形態において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細
書に記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む第１のＣＡＲ、およびＰＤ
１細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む第２のＣＡＲを含む。
一実施形態において、細胞は、上述の阻害性分子をさらに含む。
一実施形態において、細胞における第２のＣＡＲは、阻害性ＣＡＲであり、阻害性ＣＡ
Ｒは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および阻害性分子の細胞内ドメインを含む
。阻害性分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳ
ＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥ
ＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、およびＣＥＡＣＡＭ－５のうちの１つまたは複数から
選択され得る。一実施形態において、第２のＣＡＲ分子は、ＰＤ１の細胞外ドメインまた
はそのフラグメントを含む。
実施形態において、細胞における第２のＣＡＲ分子は、一次シグナル伝達ドメインおよ
び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含
む。
他の実施形態において、細胞における細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの
機能性ドメインを含む一次シグナル伝達ドメイン、および４－１ＢＢの機能性ドメインを
含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、細胞における第２のＣＡＲ分子は、配列番号２６のアミノ酸配列
を含む。
ある特定の実施形態において、第１のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを
含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。例えば、第１の
ＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合性ド
メインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリッ
トＣＡＲアプローチは、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレットおよび同第２
０１４／０５５６５７号パンフレットにおいてより詳細に記載されている。簡単に述べる
と、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合性ドメインおよび共刺激ドメイン（例えば、
４１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞はまた、第２の抗原結
合性ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）を有する第２
のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細
胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化、
細胞殺滅活性が開始される。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ
完全に活性化される。
複数のＣＡＲ発現
一態様において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば、例
として同じ標的または異なる標的（例えば、本明細書に記載されるがん関連抗原以外の標
的、または本明細書に記載される別のがん関連抗原）に対する異なる抗原結合性ドメイン
を含む第２のＣＡＲをさらに含み得る。一実施形態において、第２のＣＡＲは、がん関連
抗原と同じがん細胞型に発現される標的に対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態
において、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有
するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第１の
ＣＡＲ、ならびに第２の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが共
刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲ
を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例
えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ－４０を第１のＣＡＲに配置し、一
次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを第２のＣＡＲに配置することにより、
ＣＡＲ活性を、両方の標的が発現される細胞に限定することができる。一実施形態におい
て、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、
膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインを含む第１のがん関連抗原ＣＡＲ、ならびに異な
る標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞型に発現される抗原）を標的とし、
抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第２の
ＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載される標的抗
原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを
含む第１のＣＡＲ、第１の標的抗原以外の抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞
型に発現される抗原）を標的とし、その抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、および共刺激シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲを含む。
一部の実施形態において、特許請求される発明は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを
含み、該第１のＣＡＲ、該第２ＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、可変軽鎖ド
メインおよび可変重鎖ドメインを含まない。一部の実施形態において、該第１のＣＡＲ、
該第２のＣＡＲののうちの一方の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃ
Ｆｖではない。一部の実施形態において、該第１のＣＡＲ、該第２のＣＡＲのうちの一方
の抗原結合性ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメ、もしくはヤツメウ
ナギの単一ＶＨドメイン、またはヒトもしくはマウスの配列に由来する単一ＶＨドメイン
を含む。一部の実施形態において、該第１のＣＡＲ、該第２のＣＡＲのうちの一方の抗原
結合性ドメインは、ナノボディを含む。一部の実施形態において、該第１のＣＡＲ、該第
２のＣＡＲのうちの一方の抗原結合性ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
テロメラーゼ発現
いかなる理論によっても束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態におい
て、治療用Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアに起因して、患者における存続
性が短期的である。したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションにより、Ｔ
細胞のテロメアを延長させ、患者におけるＴ細胞の存続性を改善することができる。Carl
June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical I
nvestigation, 117:1466-1476 (2007)参照。したがって、ある実施形態において、免疫エ
フェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼ
の触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所的に発現する。一
部の態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法であって、細胞を、テロメ
ラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、
例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させるステップを含む、方法を提供する。細
胞は、ＣＡＲをコードするコンストラクトと接触させる前、それと同時に、またはその後
で、核酸と接触させることができる。
増殖および活性化
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、一般に、例えば、それぞれ参照により本明細書
に組み込まれる、米国特許第６，３５２，６９４号明細書、同第６，５３４，０５５号明
細書、同第６，９０５，６８０号明細書、同第６，６９２，９６４号明細書、同第５，８
５８，３５８号明細書、同第６，８８７，４６６号明細書、同第６，９０５，６８１号明
細書、同第７，１４４，５７５号明細書、同第７，０６７，３１８号明細書、同第７，１
７２，８６９号明細書、同第７，２３２，５６６号明細書、同第７，１７５，８４３号明
細書、同第５，８８３，２２３号明細書、同第６，９０５，８７４号明細書、同第６，７
９７，５１４号明細書、同第６，８６７，０４１号明細書、および米国特許出願公開第２
００６０１２１００５号明細書に記載されている方法を使用して、活性化および増殖させ
ることができ得る。
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団は、ＣＤ３／Ｔ
ＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激す
るリガンドを結合させた表面との接触によって、増殖させることができる。特に、Ｔ細胞
集団は、本明細書に記載されるように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もし
くはその抗原結合性フラグメント、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシ
ウムイオノフォアと併せてタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）
との接触によって、刺激され得る。Ｔ細胞の表面上の補助分子の共刺激については、補助
分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激す
るのに適した条件下において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。
ＣＤ４＋ＴまたはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体およ
び抗ＣＤ２８抗体が使用され得る。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、Ｘ
Ｒ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該
技術分野において一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., T
ransplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):131913
28, 1999、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。
ある特定の態様において、Ｔ細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なる
プロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中の
ものであってもよく、または表面に結合していてもよい。表面に結合している場合、これ
らの作用物質は、同じ表面に連結されてもよく（すなわち、「シス」構成）または別個の
表面に連結されてもよい（すなわち、「トランス」構成）。代替として、一方の作用物質
が表面に結合しており、他方の作用物質が溶液中にあってもよい。一態様において、共刺
激シグナルを提供する作用物質が、細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを提供
する作用物質が、溶液中にあるかまたは表面に結合している。ある特定の態様において、
両方の作用物質が溶液中にあってもよい。一態様において、作用物質は、可溶性形態であ
ってもよく、次いで、表面、Ｆｃ受容体を発現する細胞、または作用物質に結合する抗体
もしくは他の結合剤などに架橋されてもよい。この点に関しては、例えば、本発明におい
てＴ細胞の活性化および増殖での使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）につい
て、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同第２００６００３４８
１０号明細書参照。
一態様において、２種類の作用物質は、同じビーズに、すなわち「シス」、または別個
のビーズに、すなわち「トランス」のいずれかで、ビーズに固定化される。例として、一
次活性化シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性フラグメン
トであり、共刺激シグナルを提供する作用物質は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性
フラグメントであり、これらの作用物質はいずれも、同等な分子数で同じビーズに共固定
化される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＴ細胞成長のためにビーズに結合
させる各抗体は１：１の比で使用される。本発明のある特定の態様において、ビーズに結
合させる抗ＣＤ３抗体：抗ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を使用して観察される増殖と
比較してＴ細胞増殖に増加が観察されるようなものが使用される。１つの特定の態様にお
いて、１：１の比を使用して観察される増殖と比較して約１倍～約３倍の増加が観察され
る。一態様において、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１
～１：１００の範囲およびこれらの間のすべての整数値に及ぶ。一態様において、抗ＣＤ
３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子に結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８
の比が１未満となる。ある特定の態様において、ビーズに結合させる抗ＣＤ２８抗体と抗
ＣＤ３抗体との比は、２：１よりも大きい。１つの特定の態様において、ビーズに結合さ
せるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：１００が使用される。一態様において、ビーズに
結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：７５が使用される。さらなる態様において
、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：５０が使用される。一態様にお
いて、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：３０が使用される。１つの
好ましい態様において、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：１０が使
用される。一態様において、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比１：３が
使用される。さらなる１つの態様において、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗
体の比３：１が使用される。
Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために、粒子と細胞との比１：５００～５００：
１およびこれらの間の任意の整数値が使用され得る。当業者であれば容易に理解すること
ができるように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子のサイズに依存し得る。例
えば、サイズの小さいビーズは、数個の細胞にしか結合することができないが、大きなビ
ーズは、多数に結合することができる。ある特定の態様において、細胞と粒子との比は、
１：１００～１００：１の範囲およびそれらの間の任意の整数値に及び、さらなる態様に
おいて、比は、１：９～９：１およびそれらの間の任意の整数値を含み、同様にＴ細胞を
刺激するために使用することができる。Ｔ細胞刺激をもたらす、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２
８が結合した粒子とＴ細胞との比は、上述のように多様であり得るが、ある特定の好まし
い値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：
９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：
１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１が挙
げられ、１つの好ましい比は、Ｔ細胞１つ当たりの粒子が少なくとも１：１である。一態
様において、粒子と細胞との比１：１またはそれ以下が使用される。１つの特定の態様に
おいて、粒子：細胞の好ましい比は、１：５である。さらなる態様において、粒子と細胞
との比は、刺激の日に応じて多様であり得る。例えば、一態様において、粒子と細胞の比
は、初日では１：１～１０：１であり、その後最大１０日間、毎日または１日おきにさら
なる粒子が追加され、最終的な比は１：１～１：１０である（追加日における細胞計数に
基づく）。１つの特定の態様において、粒子と細胞との比は、刺激の初日では１：１であ
り、刺激の３日目および５日目に１：５に調節される。一態様において、粒子は、毎日ま
たは１日おきに追加され、最終的な比は、初日で１：１、ならびに刺激の３日目および５
日目で１：５である。一態様において、粒子と細胞との比は、刺激の初日では２：１であ
り、刺激の３日目および５日目に１：１０に調節される。一態様において、粒子は、毎日
または１日おきに追加され、最終的な比は、初日で１：１、ならびに刺激の３日目および
５日目で１：１０である。当業者であれば、様々な他の比が、本発明における使用に好適
であり得ることを理解するであろう。特に、比は、粒子のサイズならびに細胞のサイズお
よび種類に応じて多様であろう。一態様において、使用するための最も典型的な比は、初
日で１：１、２：１、および３：１付近である。
さらなる態様において、細胞、例えばＴ細胞を、作用物質がコーティングされたビーズ
と合わせ、その後、ビーズと細胞を分離した後に、細胞を培養する。代替的な態様におい
て、培養の前に、作用物質がコーティングされたビーズおよび細胞を分離するのではなく
、一緒に培養する。さらなる態様において、ビーズおよび細胞を、まず、磁力などの力を
印加することによって濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションの増加をもたらし、そ
れによって、細胞刺激を誘導する。
例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ
細胞に接触させることによって、細胞表面タンパク質をライゲーションすることができる
。一態様において、細胞（例えば、１０４～１０９個のＴ細胞）およびビーズ（例えば、
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ、１：
１の比）を、緩衝液、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオ
ンを含まない）中で合わせる。ここでも、当業者であれば、任意の細胞濃度が使用され得
ることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞が、サンプル中にほとんど見ら
れず、サンプルのわずか０．０１％を構成するだけでもよく、または全サンプル（すなわ
ち、１００％）が、目的の標的細胞で構成されてもよい。したがって、あらゆる細胞数が
、本発明の文脈に含まれる。ある特定の態様において、細胞および粒子を確実に最大限に
接触させるために、粒子および細胞を一緒に混合する体積を大幅に減少させる（すなわち
、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様において、約１０
０億個の細胞／ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍ
ｌ、５０億個／ｍｌ、または２０億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。一態様において
、１億個を上回る細胞／ｍｌが、使用される。さらなる態様において、１０００万個、１
５００万個、２０００万個、２５００万個、３０００万個、３５００万個、４０００万個
、４５００万個、または５０００万個の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる一
態様において、７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万
個、または１億個の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様において、１億２５０
０万個または１億５０００万個の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高い濃度を使用する
ことにより、細胞収率、細胞活性化、および細胞増殖の増加をもたらすことができる。さ
らに、高い細胞濃度を使用することにより、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原を
微弱に発現し得る細胞のより効率的な捕捉が可能となる。このような細胞集団は、ある特
定の態様において、治療的価値を有し得るため、得ることが望ましいであろう。例えば、
高い細胞濃度を使用することにより、通常、微弱なＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞
のより効率的な選択が可能となる。
一実施形態において、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸
が形質導入された細胞を、例えば、本明細書に記載される方法によって、増殖させる。一
実施形態において、細胞を、数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時
間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）から約１４日
間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日
間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、または１４日間）の期間、培養液中で増
殖させる。一実施形態において、細胞を、４～９日間の期間、増殖させる。一実施形態に
おいて、細胞を、８日間またはそれ未満、例えば、７日間、６日間、または５日間の期間
、増殖させる。一実施形態において、細胞を、５日間培養液中で増殖させ、その結果得ら
れた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞よりも強力で
ある。効力は、例えば、様々なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞殺滅、サイトカイン
産生、活性化、遊走、またはこれらの組合せによって、定義することができる。一実施形
態において、細胞を５日間増殖させると、抗原刺激時に、同じ培養条件下において９日間
培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、細胞倍増の少なくとも１倍、２倍、３倍、ま
たは４倍の増加を示す。一実施形態において、細胞を、５日間培養液中で増殖させ、その
結果得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比
較して、より高い炎症促進性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ－γおよび／またはＧＭ
－ＣＳＦレベルを呈する。一実施形態において、５日間増殖させた細胞は、同じ培養条件
下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、ｐｇ／ｍｌ単位での炎症促
進性サイトカイン産生、例えば、ＩＮＦ－γおよび／またはＧＭ－ＣＳＦレベルの少なく
とも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上の増加を示す。
Ｔ細胞の培養時間が６０日またはそれ以上となり得るように、複数サイクルの刺激が所
望される場合もある。Ｔ細胞培養に適した条件としては、血清（例えば、ウシ胎児血清ま
たはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－
４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、および
ＴＮＦ－α、または当業者に公知の細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖お
よび生存に必要な要素を含有し得る、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ
培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の成長のた
めの他の添加物としては、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えば、Ｎ－ア
セチル－システインおよび２－メルカプトエタノールが挙げられるが、これらに限定され
ない。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加された、
血清不含であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは所定のセットのホル
モンおよび／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインが補充された、Ｒ
ＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖ
ｏ １５、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生
物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養液にのみ含まれ、対象
に注入される細胞培養液には含まれない。標的細胞は、成長を補助するのに必要な条件下
、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気に加えて５％ＣＯ
２）で維持される。
一実施形態において、細胞は、１つまたは複数のインターロイキンを含む適切な培地（
例えば、本明細書に記載される培地）において増殖され、これにより、例えば、フローサ
イトメトリーなど、本明細書に記載される方法によって測定した場合に、１４日間の増殖
期間にわたって、細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、
３５０倍）の増加をもたらす。一実施形態において、細胞は、ＩＬ－１５および／または
ＩＬ－７（例えば、ＩＬ－１５およびＩＬ－７）の存在下において増殖される。
複数の実施形態において、本明細書に記載される方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞の製造
方法は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラ
グメント、またはＣＤ２５に結合するリガンドであるＩＬ－２を使用して、細胞集団から
除去するステップを含む。制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、細胞集団から除
去する方法は、本明細書に記載されている。複数の実施形態において、方法、例えば、製
造方法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞などの制御性Ｔ細胞が枯渇している細胞
集団、または前もって抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント、またはＣＤ２５に結合するリ
ガンドと接触させた細胞集団）を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７と接触させるステ
ップをさらに含む。例えば、細胞集団（例えば、前もって抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメ
ント、またはＣＤ２５に結合するリガンドと接触させたもの）を、ＩＬ－１５および／ま
たはＩＬ－７の存在下において増殖させる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を、例えばエキソビボ
で、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、
インターロイキン－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、またはＩＬ－
１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩ
Ｌ－１５を含む組成物と接触させる。複数の実施形態において、本明細書に記載されるＣ
ＡＲ発現細胞を、例えばエキソビボで、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、ＩＬ－１５ポリペプ
チドを含む組成物と接触させる。複数の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ
発現細胞を、例えばエキソビボでのＣＡＲ発現細胞の製造時に、ＩＬ－１５ポリペプチド
およびＩＬ－１５ Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。複数の
実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を、例えばエキソビボで、ＣＡ
Ｒ発現細胞の製造時に、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を、エキソビボでの増殖中
に、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。ある実施形態において、本明細書に記
載されるＣＡＲ発現細胞を、エキソビボでの増殖中に、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組
成物と接触させる。ある実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を、エ
キソビボでの増殖中に、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両
方を含む組成物と接触させる。一実施形態において、接触により、リンパ球部分集団、例
えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖がもたらされる。
様々な回数の刺激に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血
液またはアフェレーシスで得た末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細
胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも多くのヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する
。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエキソビボ増殖では
、約８～９日目よりも前には主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団が生じるが、約８～９日目
よりも後にはＴ細胞の集団は、次第に多くのＴＣ細胞集団で構成される。したがって、治
療の目的に応じて、ＴＨ細胞を主に含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合が
ある。同様に、抗原特異的なＴＣ細胞サブセットが単離されている場合、このサブセット
をさらに増殖させることが有益な場合がある。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが、細胞増殖プロ
セスの過程において、著しく変動するが、大部分は再現的に変動する。したがって、この
ような再現性により、活性化Ｔ細胞産物を特定の目的に合わせることが可能となる。
本明細書に記載されるＣＡＲが構築されると、様々なアッセイを使用して、抗原刺激後
にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の不在下においてＴ細胞増殖を維持する能力、ならび
にインビトロおよび動物モデルにおいて適切な抗がん活性などであるがこれらに限定され
ない分子の活性を評価することができる。本発明のＣＡＲの作用を評価するためのアッセ
イは、以下にさらに詳細に説明される。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウエスタンブロット分析を使用して、単量体および二
量体の存在を検出することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8)
: 1453-1464 (2009)参照。非常に簡単に述べると、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ
細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を、１０日間を上回ってインビトロで増殖さ
せた後、溶解させ、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ－ζ細胞質ドメ
インおよび内因性ＴＣＲ－ζ鎖を含むＣＡＲは、ＴＣＲ－ζ鎖に対する抗体を使用してウ
エスタンブロットによって検出される。同じＴ細胞サブセットを、共有結合による二量体
形成の評価を許容するように非還元条件下においてＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロでの増殖は、フローサイトメトリーによって
測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣ
Ｄ３／αＣＤ２８ａＡＰＣと接触させた後、分析しようとするプロモーターの制御下にお
いて、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入する。例示的なプロモーター
としては、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナ
ーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ＧＦＰ蛍光を、フローサイトメトリーによっ
て、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいて、培養の６日目に評価す
る。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。代替と
して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目に、αＣＤ３／αＣＤ２
８でコーティングした磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボソームスキッピング配列
を使用して、ｅＧＦＰとともにＣＡＲを発現するバイシストロンのレンチウイルスベクタ
ーを使用してＣＡＲの形質導入を行う。培養物を、洗浄後に、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ
２８抗体（Ｋ５６２－ＢＢＬ－３／２８）の存在下において、本明細書に記載されるがん
関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明細書に記載されるＫ５６２を発現するがん関連抗原）、野
生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、またはｈＣＤ３２および４－１ＢＢＬを発現する
Ｋ５６２細胞のいずれかで、再刺激する。外因性ＩＬ－２を、１００ＩＵ／ｍｌで１日お
きに培養物に添加する。ビーズに基づく計数を使用して、フローサイトメトリーによって
ＧＦＰ＋Ｔ細胞を数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-146
4 (2009)参照。
再刺激の不在下において持続されるＣＡＲ＋Ｔ細胞の増殖も、測定することができる。
例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡単に述べ
ると、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングした磁気ビーズで刺激し、１日目に
、示されるＣＡＲを形質導入した後、平均Ｔ細胞量（ｆｌ）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌ
ｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ粒子計数装置、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉ
ｓｉｏｎ、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して、培養の８日目に測定
する。
動物モデルもまた、ＣＡＲＴ活性を測定するために使用することができる。例えば、免
疫欠損マウスにおける原発性ヒト前ＢＡＬＬを治療するための本明細書に記載されるヒト
がん関連抗原特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用した異種移植片モデルを、使用してもよい。例
えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。非常に簡単に
述べると、ＡＬＬの確立後に、マウスを、ランダムに処置群に分ける。様々な数のがん関
連抗原特異的ＣＡＲ操作Ｔ細胞を、１：１の比で、Ｂ－ＡＬＬを保持するＮＯＤ－ＳＣＩ
Ｄ－γ－／－マウスに共注射する。マウス由来の脾臓ＤＮＡにおけるがん関連抗原特異的
ＣＡＲベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後の様々な時点で評価する。動物を、１週間に
１回の間隔で、白血病に関して評価する。本明細書に記載される末梢血がん関連抗原＋Ｂ
－ＡＬＬ芽細胞計数を、本明細書に記載されるがん関連抗原－ζ ＣＡＲ＋Ｔ細胞または
偽形質導入Ｔ細胞を注射したマウスにおいて、測定する。群ごとの生存曲線を、ログラン
ク試験を使用して比較する。加えて、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ－／－マウスにＴ細胞を注射
してから４週間後の末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数もまた、分析す
ることができる。マウスに白血病細胞を注射し、３週間後に、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲ
をコードするバイシストロンなレンチウイルスベクターによってＣＡＲを発現するように
操作したＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注射前に、偽形質導入細胞と混合することによっ
て、４５～５０％投入のＧＦＰ＋Ｔ細胞に対して正規化し、フローサイトメトリーによっ
て確認する。動物を、１週間間隔で、白血病に関して評価する。ＣＡＲ＋Ｔ細胞群の生存
曲線を、ログランク試験を使用して比較する。
用量依存的なＣＡＲ処置応答を、評価することができる。例えば、Milone et al., Mol
ecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、末梢血を、２１日目にＣＡＲ
Ｔ細胞を注射したか、同数の偽形質導入Ｔ細胞を注射したか、またはＴ細胞を注射しなか
ったマウスにおいて、白血病を確立した３５～７０日後に、得る。各群からのマウスを、
本明細書に記載されるがん関連抗原＋末梢血ＡＬＬ芽細胞計数の判定のためにランダムに
採血し、３５日目および４９日目に殺処分する。残りの動物は、５７日目および７０日目
に評価する。
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、これまでに、例えば、Milone et al., Mol
ecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡単に述べるとＣＡＲに媒
介される増殖の評価は、洗浄したＴ細胞と、本明細書に記載されるがん関連抗原（Ｋ１９
）またはＣＤ３２およびＣＤ１３７（ＫＴ３２－ＢＢＬ）を発現するＫ５６２細胞とを、
最終的なＴ細胞：Ｋ５６２の比２：１で混合することによって、マイクロタイタープレー
トにおいて行う。Ｋ５６２細胞は、使用前に、ガンマ線を照射する。Ｔ細胞増殖の刺激に
関する陽性対象として機能する抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）モノクローナル抗体および
抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、ＫＴ３２－ＢＢＬ細胞とともに培
養液に添加するが、これは、これらのシグナルが、エキソビボで長期ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖
を支持するためである。Ｔ細胞を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびフローサイトメトリーを、製造業者に
よって説明されるように使用して、計数する。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ－２Ａ連結型
ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターにより操作したＴ細胞を使用して、ＧＦＰ発現によっ
て特定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋Ｔ細胞については、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、本明細
書に記載されるビオチン化組換えがん関連抗原タンパク質および二次アビジン－ＰＥコン
ジュゲートで検出する。Ｔ細胞におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋の発現もまた、特異的モ
ノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で同時に検出する。サイトカイン測
定は、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリーアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、再刺
激の２４時間後に採取した上清に行う。蛍光を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメ
ーターを使用して評価し、データを、製造業者の説明書に従って分析する。
細胞毒性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価することができる。例えば、
Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡単に述べると、標
的細胞（Ｋ５６２株および初代前Ｂ－ＡＬＬ細胞）に、３７℃で２時間、頻繁にかき混ぜ
ながら、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂ
ｏｓｔｏｎ、ＭＡ）をロードし、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレート
に蒔く。エフェクターＴ細胞を、ウェルで、完全ＲＰＭＩにおいて、様々なエフェクター
細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比で標的細胞と混合する。培地のみ（自発的放出、ＳＲ）ま
たは１％トリトン－Ｘ １００界面活性剤（全放出、ＴＲ）を含む追加のウェルも、調製
する。３７℃で４時間インキュベートした後、各ウェルから上清を採取する。放出された
５１Ｃｒを、次いで、ガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
Ｃｏ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定する。各条件を、少なくとも３連に行い
、溶解の割合を、式：溶解％＝（ＥＲ－ＳＲ）／（ＴＲ－ＳＲ）を使用して計算する（式
中、ＥＲは、それぞれの実験条件で放出された平均５１Ｃｒを表す）。
撮像技術を使用して、腫瘍保持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評
価することができる。そのようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene The
rapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡単に述べると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ
－／－（ＮＳＧ）マウスに、Ｎａｌｍ－６細胞を静脈内注射し、７日間経った後、ＣＡＲ
コンストラクトをエレクトロポレーションした４時間後にＴ細胞を静脈内注射する。Ｔ細
胞に、ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルスコンストラクトを安定にトランス
フェクトし、マウスを、生物発光に関して撮像する。あるいは、Ｎａｌｍ－６異種移植片
モデルにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回注射の治療効果および特異性を、以下のように測定
してもよい：ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入し
たＮａｌｍ－６を注射し、続いて、７日後に、本発明のＣＡＲをエレクトロポレーション
したＴ細胞の単回尾静脈注射を行う。動物を、注射後の様々な時点で撮像する。例えば、
５日目（処置の２日前）および８日目（ＣＡＲ＋ＰＢＬの２４時間後）に、代表的なマウ
スにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを生成してもよい。
本明細書の実施例の節に記載されているもの、ならびに当該技術分野において公知のも
のを含む、他のアッセイを使用して、本明細書に記載されるＣＡＲを評価することもでき
る。
治療の方法／組合せ療法
別の態様において、本発明は、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子
、またはＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子をコードする核酸を含む
細胞を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、対象は、本明細
書に記載される障害を有し、例えば、対象は、がんを有し、例えば、対象は、本明細書に
記載される標的抗原を発現するがんを有する。一実施形態において、対象は、ヒトである
。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾
患を有する対象を治療する方法であって、対象に、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載
されるＣＡＲ分子を含む有効量の細胞を投与するステップを含む、方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載される抗原）
の発現と関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、対象に、ＣＡＲ分子を含む
有効量の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞集団）を
投与するステップを含み、ＣＡＲ分子が、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および
細胞内ドメインを含み、該細胞内ドメインが、共刺激ドメインおよび／または一次シグナ
ル伝達ドメインを含み、該抗原結合性ドメインが、疾患と関連する腫瘍抗原、例えば、本
明細書に記載される腫瘍抗原に結合する、方法を特徴とする。
関連する態様において、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患を有する対象を治療
する方法を特徴とする。本方法は、対象に、ＣＡＲ分子を含む有効量の細胞、例えば、免
疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞集団）を、免疫細胞の有効性を増加
させる作用物質と組み合わせて投与するステップを含み、
免疫細胞の有効性を増加させる作用物質は、
（ｉ）タンパク質ホスファターゼ阻害剤、
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤、
（ｉｉｉ）サイトカイン、
（ｉｖ）免疫阻害性分子の阻害剤、または
（ｖ）ＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を減少させる阻害剤
のうちの１つまたは複数から選択される。
別の態様において、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書に記
載される障害を有する対象の治療において使用するための、ＣＡＲ分子（例えば、本明細
書に記載されるＣＡＲ分子）を含む免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細
胞集団）を含む、組成物を特徴とする。
前述の方法または使用のいずれかのある特定の実施形態において、腫瘍抗原、例えば、
本明細書に記載される腫瘍抗原と関連する疾患は、増殖性疾患、例えば、がんもしくは悪
性腫瘍、または前がん状態、例えば、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病
から選択されるか、または本明細書に記載される腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適
応症である。一実施形態において、疾患は、本明細書に記載されるがん、例えば、本明細
書に記載される標的と関連付けられている本明細書に記載されるがんである。一実施形態
において、疾患は、血液がんである。一実施形態において、血液がんは、白血病である。
一実施形態において、がんは、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性
急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに
限定されない１つまたは複数の急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性
白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の慢性白血病；Ｂ細胞前
リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細
胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型もしくは大細胞型
濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、
辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ
腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュ
トレーム型マクログロブリン血症、ならびに骨髄血液細胞の無効な産生（もしくは異形成
）によってまとめられる多様な血液状態の集合である「前白血病」、ならびに本明細書に
記載される腫瘍抗原を発現する非定型および／または非古典的ながん、悪性腫瘍、前がん
状態、または増殖性疾患を含むがこれらに限定されない本明細書に記載される腫瘍抗原の
発現と関連する疾患を含むがこれらに限定されないさらなる血液がんまたは血液状態；な
らびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される。別の実施形態において、本明細
書に記載される腫瘍抗原と関連する疾患は、固形腫瘍である。
ある特定の実施形態において、本方法または使用は、免疫エフェクター細胞の有効性を
増加させる作用物質、例えば、本明細書に記載される作用物質と組み合わせて行われる。
前述の方法または使用のいずれかにおいて、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、腫瘍抗
原の発現と関連する増殖性疾患、前がん状態、がん、および非がん関連の適応症からなる
群から選択される。
がんは、血液がん、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ
性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ
性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽
球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、
濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型もしくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リ
ンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発
性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫
、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレーム型マクログロ
ブリン血症、または前白血病のうちの１つまたは複数から選択されるがんであり得る。
がんはまた、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌腫、肝臓がん、肺の非小細胞癌腫、小腸の
がん、食道のがん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼
内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、
子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジ
キン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎の
がん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓ま
たは尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、
腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮がん、扁平上
皮細胞がん、Ｔ細胞性リンパ腫、環境によって誘発されるがん、該がんの組合せ、ならび
に該がんの転移病変から選択され得る。
本明細書に記載される方法または使用のある特定の実施形態において、ＣＡＲ分子は、
免疫エフェクター細胞の有効性を増加させる作用物質、例えば、タンパク質ホスファター
ゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、免疫阻害性分子の阻害剤のうちの１つもしく
は複数、またはＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を減少させる作用物質と組み合わせて
投与される。
本明細書に記載される方法または使用のある特定の実施形態において、タンパク質ホス
ファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－１阻害剤および／またはＳＨＰ－２阻害剤である。
本明細書に記載される方法または使用の他の実施形態において、キナーゼ阻害剤は、Ｃ
ＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、ＢＴＫ阻害剤（例えば
、イブルチニブもしくはＲＮ－４８６）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシンもしく
はエベロリムス（ＲＡＤ００１））、ＭＮＫ阻害剤、またはＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害
剤のうちの１つまたは複数から選択される。一実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、イン
ターロイキン－２－誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減または阻害しない。
本明細書に記載される方法または使用の他の実施形態において、免疫阻害性分子を阻害
する作用物質は、阻害性分子の発現を阻害する、抗体もしくは抗体フラグメント、阻害性
核酸、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）
、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガー
エンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。
本明細書に記載される方法または使用の他の実施形態において、ＴＲＥＧ細胞のレベル
または活性を減少させる作用物質は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯
渇、またはこれらの組合せから選択される。
本明細書に記載される方法または使用のある特定の実施形態において、免疫阻害性分子
は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬ
Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ－１
、ＣＥＡＣＡＭ－３、およびＣＥＡＣＡＭ－５からなる群から選択される。
他の実施形態において、阻害性分子を阻害する作用物質は、阻害性分子もしくはそのフ
ラグメントを含む第１のポリペプチドと、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプ
チドとを含み、第１および第２のポリペプチドは、ＣＡＲ含有免疫細胞において発現され
、（ｉ）第１のポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡ
Ｇ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲ
ベータ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、およびＣＥＡＣＡＭ－５、もしくはそれ
らのフラグメントを含む、ならびに／または（ｉｉ）第２のポリペプチドが、一次シグナ
ル伝達ドメインおよび／もしくは共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達
ドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機
能性ドメインを含む、および／または共刺激シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＣＤ２
７、およびＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能性ドメインを含む。
他の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１
、または両方から選択される。
他の実施形態において、ＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞、および第２のもの、
例えば、本明細書に開示される組合せ療法（例えば、免疫エフェクター細胞の有効性を増
加させる作用物質）は、実質的に同時または逐次的に投与される。
他の実施形態において、ＣＡＲ分子を含む免疫細胞は、ＧＩＴＲを標的とするおよび／
またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態にお
いて、ＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子は、ＣＡＲ発現
細胞もしくは細胞集団の前に、またはアフェレーシスの前に、投与される。
一実施形態において、リンパ球注入、例えば、同種リンパ球注入が、がんの治療におい
て使用され、リンパ球注入は、少なくとも１つの本発明のＣＡＲ発現細胞を含む。一実施
形態において、自家リンパ球注入が、がんの治療において使用され、自家リンパ球注入は
、少なくとも１つの本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞を含む。
一実施形態において、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（
ＤＧＫ）が欠損している。一実施形態において、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、Ｉｋ
ａｒｏｓが欠損している。一実施形態において、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、ＤＧ
ＫおよびＩｋａｒｏｓの両方が欠損している。
一実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲ分子を発現する
細胞を、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質と組み合わせて投与するステップを含
み、この作用物質は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ
－２１、またはこれらの組合せである。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与と組み合
わせて、例えば、同時または直後に送達され得る。あるいは、サイトカインは、ＣＡＲ発
現細胞の投与後、長期間の後に、例えば、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に
、送達してもよい。一実施形態において、サイトカインは、対象に、請求項６１から８０
のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団の投与と同時に投与される（例えば、同じ日
に投与される）か、またはその直後に投与される（例えば、投与の１日後、２日後、３日
後、４日後、５日後、６日後、もしくは７日後の投与）。他の実施形態において、サイト
カインは、請求項６１から８０のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団の投与後、長
期間（例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、もしく
はそれ以上）の後に、または細胞に対する対象の応答の評価後に、投与される。
他の実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投
与に付随する１つまたは複数の副作用を緩和する作用物質と組み合わせて投与される。Ｃ
ＡＲ発現細胞に付随する副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または血球貪食性
リンパ組織球症（ＨＬＨ）から選択され得る。
前述の方法または使用のいずれかの実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、
腫瘍抗原の発現と関連する疾患を治療する作用物質、例えば、本明細書に開示される第２
または第３の治療法と組み合わせて投与される。さらなる例示的な組合せとしては、以下
のうちの１つまたは複数が挙げられる。
別の実施形態において、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、別
の作用物質、例えば、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイ
ント阻害剤と組み合わせて投与され得る。ある実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する
細胞は、さらに、別の作用物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質を発
現し得る。
例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質は、阻害性分
子（例えば、免疫阻害性分子）を阻害する作用物質であり得る。阻害性分子の例としては
、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡ
Ｍ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴ
Ａ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦＲベータが
挙げられる。
一実施形態において、阻害性分子を阻害する作用物質は、阻害性核酸であるｄｓＲＮＡ
、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡであり得る。複数の実施形態において、阻害性核酸は、
ＣＡＲ分子の成分をコードする核酸に関連している。例えば、阻害性分子は、ＣＡＲ発現
細胞上に発現され得る。
別の実施形態において、阻害性分子を阻害する作用物質は、例えば、本明細書に記載さ
れる分子であり、例えば、第１のポリペプチド、例として阻害性分子が、細胞に正のシグ
ナルを提供する第２のポリペプチド、例として本明細書に記載される細胞内シグナル伝達
ドメインに会合したものを含む、作用物質である。一実施形態において、作用物質は、阻
害性分子、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（
例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／もしくはＣＥＡＣＡＭ－５）、
ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ま
たはＴＧＦＲベータ、またはこれらのうちのいずれかのフラグメント（例えば、これらの
うちのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの一部分）である第１のポリペプチド、なら
びに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例え
ば、例として本明細書に記載される４１ＢＢ、ＣＤ２７、もしくはＣＤ２８）および／ま
たは一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝
達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。一実施形態において、作用物質は、ＰＤ
１またはそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部分）であ
る第１のポリペプチド、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例
えば、本明細書に記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記
載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。
一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞また
はＮＫ細胞は、これまでに幹細胞移植、例えば、自家幹細胞移植を受けた対象に投与され
る。
一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞また
はＮＫ細胞は、これまでにメルファランの投与を受けた対象に投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ分子を発現する細
胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効性を増加させる作用物質、例えば、本明細書に記
載される作用物質と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞は、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。理論に束縛さ
れることを望むものではないが、低い免疫強化用量（例えば、免疫系を完全に抑制するに
は不十分であるが、免疫機能を向上させるには十分である用量）での処置には、ＰＤ－１
陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ－１陰性細胞の増加が付随すると考えられる。ＰＤ－１陽性
Ｔ細胞は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２を発現する細胞との
結合によって、疲弊され得るが、ＰＤ－１陰性Ｔ細胞は疲弊されない。
ある実施形態において、このアプローチを使用して、対象における本明細書に記載され
るＣＡＲ細胞の性能を最適化することができる。理論に束縛されることを望むものではな
いが、ある実施形態において、内因性非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞また
はＮＫ細胞の性能が向上すると考えられる。理論に束縛されることを望むものではないが
、ある実施形態において、標的抗原ＣＡＲ発現細胞の性能が向上すると考えられる。他の
実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されているか、またはこれから操作され
る細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、
Ｔ細胞の数を増加させるか、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／
ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤
と接触させることによって、エキソビボで処置することができる。
ある実施形態において、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック
阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒阻害剤の投与は、本明細書に記載されるＣＡ
Ｒ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与の前に開始される。ある実施形態にお
いて、ＣＡＲ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細
胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫
エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過的に増加した状態となるよう
に、ｍＴＯＲ阻害剤から十分な時間の後、またはその十分な投薬の後に、投与される。
ある実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作しようとする細胞、例えば、Ｔ細
胞またはＮＫ細胞は、対象におけるかまたは対象から採取されたＰＤ１陰性免疫エフェク
ター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、
Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過的に
増加した状態となるように、低い免疫強化用量のｍＴＯＲ阻害剤から十分な時間の後、ま
たはその十分の投薬の後に、採取される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に付随する１つまたは複数の副作用を緩和す
る作用物質、例えば、本明細書に記載される作用物質と組み合わせて投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞は、本明細書に記載されるがん関連抗原と関連する疾患を治療する作用物質、例え
ば、本明細書に記載される作用物質と組み合わせて投与される。
一実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような、２つ以上のＣＡＲ分子を
発現する細胞は、がんを治療するために、それを必要とする対象に投与される。一実施形
態において、例えば、本明細書に記載されるような、ＣＡＲ発現細胞を含む細胞の集団は
、がんを治療するために、それを必要とする対象に投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞は、本明細書に記載される用量および／または投薬スケジュールで、投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、例えば、インビトロ転写を使用して、免疫エフェ
クター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入され、対象（例えば、ヒト）は、ＣＡＲ
分子を含む細胞の初回投与、およびＣＡＲ分子を含む細胞の１回または複数回の後続投与
を受け、１回または複数回の後続投与は、前回の投与後、１５日未満、例えば、１４日未
満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満
、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または２日未満で施される。一実施形態に
おいて、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回を上回る投与は、１週間単位で対象（例えば、ヒト
）に施され、例えば、１週間につき２回、３回、または４回のＣＡＲ分子を含む細胞の投
与が、施される。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１週間につき１回
を上回るＣＡＲ分子を含む細胞の投与（例えば、１週間につき２回、３回、または４回の
投与）（本明細書においてサイクルとも称される）を受けた後、ＣＡＲ分子を含む細胞の
投与なしの１週間が続き、その後、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回または複数回の追加の投
与（例えば、１週間につき１回を上回るＣＡＲを含む細胞の投与）が、対象に施される。
別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１サイクルを上回るＣＡＲ分子を
含む細胞を受容し、各サイクル間の時間は、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満
、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満である。一実施形態において、ＣＡＲ
分子を含む細胞は、１週間につき１日おきに３回の投与で投与される。一実施形態におい
て、ＣＡＲ分子を含む細胞は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７
週間、８週間、またはそれ以上投与される。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞は、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書に記載されるがんのファーストライン
の治療として投与される。別の実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載
されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書に記載され
るがんの第２、第３、第４選択肢の治療として投与される。
一実施形態において、本明細書に記載される細胞集団が、投与される。
別の態様において、本発明は、医薬品として使用するための、本発明のＣＡＲをコード
する単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベク
ター、および本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する疾患の治
療において使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲ
の単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクター、および本発明のＣＡＲを含む
細胞に関する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるサイトカイン、例えば、ＩＬ－７
、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２１と組み合わせて医薬品として使用するための、
本明細書に記載されるＣＡＲの分子を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明
は、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて医薬品として使用す
るための、本明細書に記載されるサイトカインに関する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチ
ェックポイント阻害剤と組み合わせて医薬品として使用するための、本明細書に記載され
るＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、本明細書に記載さ
れるＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて医薬品として使用するための、本明細書に
記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤に関する。
別の態様において、本発明は、ＣＡＲによって標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の
治療において、本明細書に記載されるサイトカイン、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、お
よび／またはＩＬ－２１と組み合わせて使用するための、本明細書に記載されるＣＡＲ分
子を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、ＣＡＲによって標的とされる
腫瘍抗原を発現する疾患の治療において、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細
胞と組み合わせて使用するための、本明細書に記載されるサイトカインに関する。
別の態様において、本発明は、ＣＡＲによって標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の
治療において、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻
害剤と組み合わせて使用するための、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞に
関する。別の態様において、本発明は、ＣＡＲによって標的とされる腫瘍抗原を発現する
疾患の治療において、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて使
用するための、本明細書に記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻
害剤に関する。
別の態様において、本発明は、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子
、またはＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子をコードする核酸を含む
細胞を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、対象は、本明細
書に記載される障害を有し、例えば、対象は、がんを有し、例えば、対象は、がんを有し
かつ本明細書に記載される腫瘍支持抗原を発現する腫瘍支持細胞を有する。一実施形態に
おいて、対象は、ヒトである。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される腫瘍支持抗原の発現と関連する疾
患を有する対象を治療する方法であって、対象に、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書に記載
されるＣＡＲ分子を含む有効量の細胞を投与するステップを含む、方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患を有する対象
を治療する方法であって、対象に、ＣＡＲ分子を含む有効量の細胞、例えば、免疫エフェ
クター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞集団）を投与するステップを含み、ＣＡＲ分
子が、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、該細胞内ド
メインが、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含み、該抗原結合
性ドメインが、疾患と関連する腫瘍支持抗原、例えば、本明細書に記載される腫瘍支持抗
原に結合する、方法を特徴とする。
別の態様において、本発明は、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書
に記載される障害を有する対象の治療において使用するための、ＣＡＲ分子（例えば、本
明細書に記載されるＣＡＲ分子）を含む免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクタ
ー細胞集団）を含む、組成物を特徴とする。
前述の方法または使用のいずれかにおいて、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患は、腫
瘍支持抗原の発現と関連する増殖性疾患、前がん状態、がん、および非がん関連の適応症
からなる群から選択される。ある実施形態において、本明細書に記載される腫瘍支持抗原
と関連する疾患は、固形腫瘍である。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、ＣＡＲ分子は、別の作用
物質と組み合わせて投与される。一実施形態において、この作用物質は、キナーゼ阻害剤
、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、または
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤、およびこれらの組合せであり得る。一実施形態において
、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書に記載されるＣＤＫ４阻害剤、
例えば、ＣＤ４／６阻害剤、例えば、６－アセチル－８－シクロペンチル－５－メチル－
２－（５－ピペラジン－１－イル－ピリジン－２－イルアミノ）－８Ｈ－ピリド［２，３
－ｄ］ピリミジン－７－オン塩酸塩（パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも称さ
れる）などである。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、本
明細書に記載されるＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなどである。一実施形態におい
て、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるｍＴＯＲ阻害剤
、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ－０２７などである。ｍＴＯＲ阻
害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、本明
細書に記載されるｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一
実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、本明細書に記載されるＭ
ＮＫ阻害剤、例えば、４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－
ｄ］ピリミジンなどである。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ
２ａ、および／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤は、
例えば、ＰＦ－０４６９５１０２であり得る。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、アロ
イシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ－１２７５、２－（２－クロロフェニル）－５
，７－ジヒドロキシ－８－［（３Ｓ，４Ｒ）－３－ヒドロキシ－１－メチル－４－ピペリ
ジニル］－４－クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６；２－（２－クロロ
フェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）
－１－メチル－３－ピロリジニル］－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン塩酸塩（Ｐ２７
６－００）；１－メチル－５－［［２－［５－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－イミダゾ
ール－２－イル］－４－ピリジニル］オキシ］－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェ
ニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７
０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；ジ
ナシクリブ（dinaciclib）（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ－［５－［［（５－ｔｅｒｔ－ブ
チルオキサゾール－２－イル）メチル］チオ］チアゾール－２－イル］ピペリジン－４－
カルボキサミド（ＢＭＳ ３８７０３２）；４－［［９－クロロ－７－（２，６－ジフル
オロフェニル）－５Ｈ－ピリミド［５，４－ｄ］［２］ベンザゼピン－２－イル］アミノ
］－安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５－［３－（４，６－ジフルオロ－１Ｈ－ベンズイミ
ダゾール－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル］－Ｎ－エチル－４－メチル－３
－ピリジンメタンアミン（ＡＧ－０２４３２２）；４－（２，６－ジクロロベンゾイルア
ミノ）－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸Ｎ－（ピペリジン－４－イル）アミド（ＡＴ
７５１９）；４－［２－メチル－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－
イル］－Ｎ－［４－（メチルスルホニル）フェニル］－２－ピリミジンアミン（ＡＺＤ５
４３８）；ならびにＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択される、ＣＤＫ４阻害剤
である。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤ
Ｋ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブは
、約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０
５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（
例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎日、例え
ば、２８日サイクルの１４～２１日間毎日、または２１日サイクルの７～１２日間毎日、
投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブが投与される。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イブ
ルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）、ＧＤＣ－０８３４、ＲＮ－４８６、ＣＧＩ－５６０、
ＣＧＩ－１７６４、ＨＭ－７１２２４、ＣＣ－２９２、ＯＮＯ－４０５９、ＣＮＸ－７７
４、およびＬＦＭ－Ａ１３から選択される、ＢＴＫ阻害剤である。一実施形態において、
ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン－２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）を低減または阻害せず
、ＧＤＣ－０８３４、ＲＮ－４８６、ＣＧＩ－５６０、ＣＧＩ－１７６４、ＨＭ－７１２
２４、ＣＣ－２９２、ＯＮＯ－４０５９、ＣＮＸ－７７４、およびＬＦＭ－Ａ１３から選
択される。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴ
Ｋ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）であり、イブルチニブは、約２
５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ
、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００
ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ、または５６０ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎
日、例えば、２１日のサイクルの間毎日、または２８日のサイクルの間毎日投与される。
一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または
それ以上のサイクルのイブルチニブが投与される。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＩＴ
Ｋのキナーゼ活性を阻害しないＢＴＫ阻害剤、例えば、ＲＮ－４８６であり、ＲＮ－４８
６は、約１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、
１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍ
ｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ（例えば、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または２
５０ｍｇ）の用量で、ある期間の間毎日、例えば、２８日のサイクルの間毎日投与される
。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のサイクルのＲＮ
－４８６が投与される。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、テム
シロリムス、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知の（１
Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８
Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１
，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５
－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４
－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，
２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホス
フィネート、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）、シマピ
モド、（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２
，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５
５）、２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］
－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジ
ン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２）、Ｎ２－［１，４－ジオキソ－４－［［
４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム
－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパルチルＬ－
セリン－、分子内塩（ＳＦ１１２６）、ならびにＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害
剤である。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴ
ＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンは、約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ
、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で、ある期間の
間毎日、例えば、２１日のサイクルの間毎日、または２８日のサイクルの間毎日投与され
る。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、ま
たはそれ以上のサイクルのラパマイシンが投与される。一実施形態において、キナーゼ阻
害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスは、約２ｍｇ、２
．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１
ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量で、ある期
間の間毎日、例えば、２８日のサイクルの間毎日投与される。一実施形態において、１、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のサイクルのエベ
ロリムスが投与される。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧ
Ｐ０５２０８８、４－アミノ－３－（ｐ－フルオロフェニルアミノ）－ピラゾロ［３，４
－ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）、セルコスポラミド、ＥＴＣ－１７８０４４５－
２、および４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミ
ジンから選択される、ＭＮＫ阻害剤である。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、２－
アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６
－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８
Ｈ）－オン（ＰＦ－０４６９１５０２）；Ｎ－［４－［［４－（ジメチルアミノ）－１－
ピペリジニル］カルボニル］フェニル］－Ｎ’－［４－（４，６－ジ－４－モルホリニル
－１，３，５－トリアジン－２－イル）フェニル］尿素（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫ
Ｉ－５８７）；２－メチル－２－｛４－［３－メチル－２－オキソ－８－（キノリン－３
－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］フェ
ニル｝プロパンニトリル（ＢＥＺ－２３５）；アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０、ＲＧ７
４２２）；２，４－ジフルオロ－Ｎ－｛２－（メチルオキシ）－５－［４－（４－ピリダ
ジニル）－６－キノリニル］－３－ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＧＳＫ２１２
６４５８）；８－（６－メトキシピリジン－３－イル）－３－メチル－１－（４－（ピペ
ラジン－１－イル）－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５
－ｃ］キノリン－２（３Ｈ）－オンマレイン酸（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）；３－［４－（
４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イ
ル］フェノール（ＰＩ－１０３）；５－（９－イソプロピル－８－メチル－２－モルホリ
ノ－９Ｈ－プリン－６－イル）ピリミジン－２－アミン（ＶＳ－５５８４、ＳＢ２３４３
）；およびＮ－［２－［（３，５－ジメトキシフェニル）アミノ］キノキサリン－３－イ
ル］－４－［（４－メチル－３－メトキシフェニル）カルボニル］アミノフェニルスルホ
ンアミド（ＸＬ７６５）から選択される、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（Ｐ
Ｉ３Ｋ）およびｍＴＯＲの二重阻害剤である。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、本明細書に記載されるＣ
ＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、
本明細書に記載されるタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて、対象に
投与される。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ
－１阻害剤、例えば、本明細書に記載されるＳＨＰ－１、例えば、スチボグルコン酸ナト
リウムなどである。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、
ＳＨＰ－２阻害剤である。
本明細書に記載される方法または使用の一実施形態において、ＣＡＲ分子は、別の作用
物質と組み合わせて投与され、この作用物質は、サイトカインである。サイトカインは、
例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはこれらの組合せであり得る。別の実
施形態において、ＣＡＲ分子は、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書に記載され
るチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。例えば、一実施形態において、チ
ェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣ
ＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５
）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４
、およびＴＧＦＲベータから選択される阻害性分子を阻害する。
一態様において、本発明のＣＡＲは、本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する正常細
胞を根絶させるために使用することができ、そのため、細胞移植前の細胞調整療法として
の使用に適用可能である。一態様において、本明細書に記載される腫瘍抗原を発現する正
常細胞は、正常幹細胞であり、細胞移植は、幹細胞移植である。
治療適用
別の態様において、対象を治療する方法、例えば、対象における過剰増殖性状態または
障害（例えば、がん）、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍、または転移病変を低減または緩
和する方法が、提供される。本明細書において使用されるとき、「がん」という用語は、
組織病理学的種類または侵襲の段階に関係なく、すべての種類のがん性成長もしくは発が
んプロセス、転移組織、または悪性形質の細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味す
る。固形腫瘍の例としては、様々な器官系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌、および癌腫
、例えば、肝臓、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖器（例えば、腎
臓、尿路上皮細胞）、前立腺、および咽頭に罹患するものが挙げられる。腺癌には、ほと
んどの結腸がん、直腸がん、腎細胞癌腫、肝臓がん、肺の非小細胞癌腫、小腸のがん、食
道のがんなどの悪性腫瘍が含まれる。一実施形態において、がんは、黒色腫、例えば、進
行期の黒色腫である。前述のがんの転移病変もまた、本発明の方法および組成物を使用し
て、治療または予防することができる。治療することができる他のがんの例としては、骨
がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵
巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内
膜の癌腫、子宮頸の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、
食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん
、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性
リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児期の固形
腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経
系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠
腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮がん、扁平上皮細胞がん、Ｔ細胞性リンパ腫、アスベ
ストによって誘発されるものを含む環境によって誘発されるがん、ならびに該がんの組合
せが、挙げられる。転移がん、例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現する転移がんの治療は（Iwai e
t al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144）、本明細書に記載される抗体分子を使用して
達成することができる。
成長を阻害することができる例示的ながんとしては、典型的に免疫療法に対して応答性
であるがんが挙げられる。治療のためのがんの非限定的な例としては、黒色腫（例えば、
転移悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞癌腫）、前立腺がん（例えば、ホルモン不
応性前立腺癌）、乳がん、結腸がん、および肺がん（例えば、非小細胞肺がん）が挙げら
れる。加えて、不応性または再発性の悪性腫瘍が、本明細書に記載される分子を使用して
治療され得る。
一態様において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細
胞）における発現のための、プロモーターに作動可能に連結されたＣＡＲを含むベクター
に関する。一態様において、本発明は、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現するが
んの治療において使用するための、本発明のＣＡＲを発現する組換え免疫エフェクター細
胞を提供する。一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞が、がん細
胞を標的とし、がんの成長が阻害されるように、少なくとも１つのがん関連抗原を表面に
発現する腫瘍細胞と接触させることができる。
一態様において、本発明は、がんの成長を阻害する方法であって、ＣＡＲＴが抗原に応
答して活性化され、がん細胞を標的とするように、がん細胞を、本発明のＣＡＲ発現細胞
と接触させるステップを含み、腫瘍の成長が阻害される、方法に関する。
一態様において、本発明は、対象におけるがんを治療する方法に関する。本方法は、が
んが対象において治療されるように、本発明のＣＡＲ発現細胞を対象に投与するステップ
を含む。一態様において、本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連するがんは、
血液がんである。一態様において、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。一態様に
おいて、本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連するがんとしては、例として、
例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（
「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない１つまた
は複数の急性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬ
Ｌ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の慢性白血病を含むがこれらに限定さ
れない、がんおよび悪性腫瘍が挙げられる。本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と
関連するさらなるがんまたは血液状態としては、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽
球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、
濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞型もしくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リ
ンパ球増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発
性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リン
パ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、および
骨髄血液細胞の無効な産生（または血液異形成）などによってまとめられる血液状態の多
様な集合である「前白血病」が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本明細書
に記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患としては、例えば、本明細書に記載され
るがん関連抗原の発現と関連する、非定型および／または非古典的ながん、悪性腫瘍、前
がん状態、または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞で治療することができるがんは、多
発性骨髄腫である。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーによると、本明細書に
記載されるがん関連抗原に関して陰性であると考えられる。したがって、一部の実施形態
において、例えば、本明細書に記載されるＣＤ１９ ＣＡＲを使用して、骨髄腫細胞を標
的とすることができる。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲ療法は、１つまたは複
数の追加の治療法、例えば、レナリドマイド治療と組み合わせて使用することができる。
本発明は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、キメラ抗原受容体
（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子修飾され、そのＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、
それを必要とするレシピエントに注入される、一種の細胞療法を含む。注入された細胞は
、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡ
Ｒ修飾免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、インビボで複製すること
ができるため、持続的な腫瘍制御につながり得る長期存続性が得られる。様々な態様にお
いて、患者に投与される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）またはそれ
らの子孫は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を患者に投与した後、少なくとも４ヶ月間、５ヶ月間
、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１
３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間
、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、または
５年間、患者において存続する。
本発明はまた、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、例えば、イン
ビトロ転写されたＲＮＡによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過的に発現するよう
に修飾され、そのＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、それを必要とするレシピエントに注
入される、一種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を
殺滅させることができる。したがって、様々な態様において、患者に投与される免疫エフ
ェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を患者に投与した
後、１ヶ月未満、例えば、３週間未満、２週間未満、１週間未満存在する。
いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、ＣＡＲ修飾免疫
エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）によって誘起される抗腫瘍免疫応答は、
能動的もしくは受動的免疫応答であり得るか、または代替として、直接的対間接的免疫応
答に起因するものであってもよい。一態様において、ＣＡＲを形質導入した免疫エフェク
ター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現す
るヒトがん細胞に応答して、特異的炎症促進性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解活
性を呈し、本明細書に記載される可溶性がん関連抗原阻害に抵抗し、バイスタンダー殺滅
を媒介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、異種の本明細書に記載される
がん関連抗原を発現する腫瘍の分野内では、抗原のない腫瘍細胞は、以前に隣接する抗原
陽性がん細胞に対して反応した、本明細書に記載されるがん関連抗原を再指向する免疫エ
フェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）による間接的な破壊を受けやすい可能性が
ある。
一態様において、本発明の完全ヒトＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞
、ＮＫ細胞）は、哺乳動物におけるエキソビボ免疫化および／またはインビボ療法のため
の一種のワクチンであり得る。一態様において、哺乳動物は、ヒトである。
エキソビボ免疫化に関して、以下のうちの少なくとも１つが、細胞を哺乳動物に投与す
る前にインビトロで生じる：ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）細胞へのＣＡＲをコードする核酸の
導入、またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
エキソビボ手順は、当該技術分野において周知であり、以下により詳細に説明されてい
る。簡単に述べると、細胞を、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本明細書に開示さ
れるＣＡＲを発現するベクターにより遺伝子修飾する（すなわち、インビトロで形質導入
またはトランスフェクトする）。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、
治療的利点を得ることができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってもよく、ＣＡＲ修
飾細胞は、レシピエントに対して自家であり得る。代替として、細胞は、レシピエントに
対して同種、同系、または異種であってもよい。
造血幹細胞および造血前駆細胞のエキソビボ増殖の手順は、米国特許第５，１９９，９
４２号明細書に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれ、この手順は、
本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法は、当該技術分野において公知で
あり、したがって、本発明は、細胞のエキソビボ増殖を行う任意の特定の方法に限定され
ない。簡単に述べると、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）のエキソビ
ボでの培養および増殖は、（１）哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞および造血前駆細
胞を末梢血採取または骨髄外植により採取すること、ならびに（２）そのような細胞をエ
キソビボで増殖させることを含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載されて
いる細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、およびｃ－ｋｉｔリガ
ンドなどの他の因子を、細胞の培養および増殖に使用することができる。
エキソビボ免疫化に関して細胞に基づくワクチンを使用することに加えて、本発明はま
た、患者において抗原を指向する免疫応答を誘起するためのインビボ免疫化のための組成
物および方法も提供する。
一般に、本明細書に記載されるように活性化され増殖させた細胞は、免疫無防備状態の
個体において発生する疾患の治療および予防において利用され得る。特に、本発明のＣＡ
Ｒ修飾免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、本明細書に記載されるが
ん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、および状態の治療において使用される。ある特
定の態様において、本発明の細胞は、本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連す
る疾患、障害、および状態を発症する危険性にある患者の治療において使用される。した
がって、本発明は、本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、お
よび状態の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量
の本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与するス
テップを含む、方法を提供する。
一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患
、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前がん状態を治療する
ために使用され得る。さらに、本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患
はとしては、例えば、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する、非定型および／ま
たは非古典的ながん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患が挙げられるが、これら
に限定されない。本明細書に記載されるがん関連抗原の発現と関連する非がん関連の適応
症としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよ
び喘息）、ならびに移植が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、単独でか
、または希釈剤および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団など
の他の成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで、投与され得る。
血液がん
血液がん状態は、血液、骨髄、およびリンパ系に罹患する、白血病、リンパ腫、および
悪性リンパ球増殖性状態などの種類のがんである。
白血病は、急性白血病および慢性白血病として分類することができる。急性白血病は、
さらに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）として分類す
ることができる。慢性白血病には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血
病（ＣＬＬ）が含まれる。他の関連状態としては、骨髄血液細胞の無効な産生（または異
形成）およびＡＭＬへの転換の危険性によってまとめられる、血液状態の多様な集合であ
る、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病」として知られていた）が挙げられる
。
リンパ腫は、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍の群である。例示的なリンパ腫として
は、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫が挙げられる。
本発明はまた、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞集団の増殖を阻害す
るかまたはその細胞集団を低減させるための方法であって、本明細書に記載されるがん関
連抗原を発現する細胞を含む細胞集団を、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する
細胞に結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞と接触させるステップを含む、
方法を提供する。特定の態様において、本発明は、本明細書に記載されるがん関連抗原を
発現するがん細胞集団の増殖を阻害するかまたはその細胞集団を低減させるための方法で
あって、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現するがん細胞集団を、本明細書に記載
されるがん関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞
と接触させるステップを含む、方法を提供する。一態様において、本発明は、本明細書に
記載されるがん関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するかまたはその細胞集団
を低減させるための方法であって、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現するがん細
胞集団を、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＣＡＲ
発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞と接触させるステップを含む、方法を提供する。ある特定の態
様において、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、骨髄性白血病または本明細書
に記載されるがん関連抗原と関連する別のがんを有する対象またはその動物モデルにおい
て、陰性対照と比較して、細胞および／またはがん細胞の数量、数、量、または割合を、
少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくと
も６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも
９９％低減させる。一態様において、対象は、ヒトである。
本発明はまた、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する疾患（例
えば、血液がんまたは本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する非定型がん）を予防
、治療、および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細
書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＣＡＲ Ｔ細胞またはＮ
Ｋ細胞を投与するステップを含む、方法を提供する。一態様において、対象は、ヒトであ
る。本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する障害の非限定的な例と
しては、自己免疫障害（ループスなど）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、ならび
にがん（血液がん、または本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する非定型のがん）
が挙げられる。
本発明はまた、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する疾患を予
防、治療、および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、本明
細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＣＡＲ Ｔ細胞または
ＮＫ細胞を投与するステップを含む、方法を提供する。一態様において、対象は、ヒトで
ある。
本発明は、本明細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連するがんの再発を
予防するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載されるがん関連
抗原を発現する細胞に結合する本発明のＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を投与するステッ
プを含む、方法を提供する。一態様において、本方法は、それを必要とする対象に、本明
細書に記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合する有効量の本明細書に記載される
ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、有効量の別の治療薬と組み合わせて投与するステッ
プを含む。
医薬組成物および治療
本発明の医薬組成物は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数の本明細書に記載されるＣＡＲ
発現細胞を、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または
賦形剤と組み合わせて含み得る。このような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水
、リン酸緩衝食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、ま
たはデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、
グリシン、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント
（例えば、水酸化アルミニウム）、ならびに保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態
様において、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）しようとする疾患に適した様式で、投与さ
れ得る。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度
などの因子によって決定されるが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得る。
一実施形態において、医薬組成物は、混入物質、例えば、内毒素、マイコプラズマ、複
製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、抗
ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズの残留物、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、
ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラ
スミド成分、細菌および真菌からなる群から選択されるものを実質的に含まず、例えば、
混入物質は検出可能なレベルでは存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲ
ネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albica
ns）、大腸菌（Escherichia coli）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus infl
uenza）、ナイセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitides）、シュードモナス
・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphy
lococcus aureus）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumonia）、
およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ａ群から選択される
少なくとも１つである。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害に有効な量」、または「治療量」
が示される場合、投与しようとする本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、
体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個々の相違を考慮して、
医師によって決定され得る。一般に、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞（例え
ば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物は、１０４～１０９個の細胞／体重ｋｇの投薬
量で投与され得、一部の事例においては、１０５～１０６個の細胞／体重ｋｇで投与され
得、これらの範囲内のすべての整数が含まれる。Ｔ細胞組成物または、これらの投薬量で
複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において一般に公知の注入技法を使用して投与
することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参
照）。
ある特定の態様において、活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ
細胞）を対象に投与した後、続いて、血液を再び採取し（またはアフェレーシスを行い）
、そこから得られた本発明による免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を
活性化させ、これらの活性化させ増殖させた免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞）を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複
数回行われ得る。ある特定の態様において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｎ
Ｋ細胞）は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採取血から活性化され得る。ある特定の態様におい
て、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０
ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取血
から活性化される。
本主題の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、埋込み、または移
植によるものを含む、任意の便宜的な様式で実行され得る。本明細書に記載される組成物
は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈注射により（ｉ．ｖ．）
、または腹腔内で、患者に投与され得る。一態様において、本発明のＴ細胞組成物は、皮
内または皮下注射によって患者に投与される。一態様において、本発明のＴ細胞組成物は
、静脈内注射によって投与される。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）
の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
特定の例示的な態様において、対象は、白血球を採取し、濃縮し、エキソビボで枯渇さ
せて、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離する、白血球アフェレーシ
スを受ける場合がある。これらの単離Ｔ細胞は、当該技術分野において公知の方法によっ
て増殖させ、１つまたは複数の本発明のＣＡＲコンストラクトを導入し、それによって本
発明のＣＡＲ Ｔ細胞を作製することができるように、処置され得る。それを必要とする
対象は、続いて、高用量化学療法による標準的な治療を受けた後、末梢血幹細胞移植を受
け得る。ある特定の態様において、移植後または移植と同時に、対象は、本発明の増殖Ｃ
ＡＲ Ｔ細胞の注入を受ける。追加の態様において、増殖させた細胞は、外科処置の前ま
たは後に投与される。
患者に投与しようとする上述の治療薬の投薬量は、治療されている状態および治療のレ
シピエントの正確な性質に応じて変動するであろう。ヒトへの投与のための投薬量の増減
は、当該技術分野において許容されている慣例に従って行うことができる。例えば、ＣＡ
ＭＰＡＴＨの用量は、一般に、成人患者では１～約１００ｍｇの範囲内となり、通常は１
～３０日間の期間で毎日投与される。好ましい１日用量は、１日当たり１～１０ｍｇであ
るが、一部の事例では、１日当たり最大４０ｍｇまでのより高用量が使用され得る（米国
特許第６，１２０，７６６号明細書に記載されている）。
一実施形態において、ＣＡＲは、例えば、インビトロ転写を使用して、免疫エフェクタ
ー細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入され、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＣ
ＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の初回投与、および本発明のＣ
ＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回または複数回の後続投与
を受け、１回または複数回の後続投与は、前回の投与後、１５日未満、例えば、１４日未
満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満
、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または２日未満で施される。一実施形態に
おいて、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回を上
回る投与は、１週間単位で対象（例えば、ヒト）に施され、例えば、１週間につき２回、
３回、または４回の本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）
の投与が、施される。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１週間につき
１回を上回るＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の投与（例えば
、１週間につき２回、３回、または４回の投与）（本明細書においてサイクルとも称され
る）を受けた後、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の投与なし
の１週間が続き、その後、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の
１回または複数回の追加の投与（例えば、１週間につき１回を上回るＣＡＲ免疫エフェク
ター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の投与）が、対象に施される。別の実施形態にお
いて、対象（例えば、ヒト対象）は、１サイクルを上回るＣＡＲ免疫エフェクター細胞（
例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を受容し、各サイクル間の時間は、１０日未満、９日未満、
８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満である。一実施形
態において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、１週間につ
き１日おきに３回の投与で投与される。一実施形態において、本発明のＣＡＲ免疫エフェ
クター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週
間、６週間、７週間、８週間、またはそれ以上投与される。
一態様において本発明のＣＡＲ発現細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイ
ルスベクターを使用して生成される。そのようにして生成された細胞、例えば、ＣＡＲＴ
は、安定なＣＡＲ発現を有する。
一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ガンマレトロウイルスベクタ
ー、例えば、本明細書に記載されるガンマレトロウイルスベクターなどのウイルスベクタ
ーを使用して生成される。これらのベクターを使用して生成されたＣＡＲＴは、安定なＣ
ＡＲ発現を有し得る。
一態様においてＣＡＲＴは、形質導入の後４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、
９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、ＣＡＲベクタ
ーを一過的に発現する。ＣＡＲの一過的発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクター送達によって達
成することができる。一態様においてＣＡＲ ＲＮＡは、エレクトロポレーションによっ
てＴ細胞に形質導入される。
ＣＡＲを一過的に発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）（特に
、マウスｓｃＦｖを保持するＣＡＲＴ）を使用して治療されている患者において生じ得る
潜在的な問題は、複数回の処置の後のアナフィラキシーである。
この理論によって束縛されるものではないが、そのようなアナフィラキシー応答は、患
者が体液性抗ＣＡＲ応答、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を生じ
ることによって、引き起こされる可能性があると考えられる。抗原への曝露に１０日～１
４日の休止が存在すると、患者の抗体産生細胞が、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシ
ーをもたらさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
患者が、一過的ＣＡＲ療法（ＲＮＡ形質導入によって生成されるもの）の過程で抗ＣＡ
Ｒ抗体応答を生じる危険性が高い場合、ＣＡＲＴ注入の休止は、１０日～１４日を上回っ
て継続すべきではない。
ＣＡＲ発現細胞を作製する方法
別の態様において、本発明は、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）
を作製する方法であって、細胞、例えば、本明細書に記載されるＴ細胞またはＮＫ細胞に
、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸、またはＣＡＲ分子、
例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを導入（例えば、
形質導入）するステップを含む、方法に関する。
本方法における細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、ま
たはそれらの組合せ）である。一部の実施形態において、本方法における細胞は、ジアグ
リセロールキナーゼ（ＤＧＫ）および／またはＩｋａｒｏｓが欠損している。
一部の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸分子の導入は、ＣＡＲをコードする
核酸分子を含むベクターを形質導入するか、またはＣＡＲをコードする核酸分子をトラン
スフェクトすることを含み、ここで、核酸分子は、インビトロ転写されたＲＮＡである。
一部の実施形態において、本方法は、
ａ．免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を提供するステップ
、および
ｂ．この集団から制御性Ｔ細胞を除去し、それによって、制御性Ｔ細胞枯渇細胞集団を提
供するステップ
をさらに含み、
ステップａ）およびｂ）は、ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前に行われる。
本方法の複数の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含み、抗ＣＤ
２５抗体またはそのフラグメントを使用して、細胞集団から除去される。抗ＣＤ２５抗体
またはそのフラグメントは、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートしていてもよい。
他の実施形態において、ステップ（ｂ）によって得られた制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団
は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未
満、３％未満、２％未満、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
さらに他の実施形態において、本方法は、ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前
に、腫瘍抗原を発現する細胞を、ＣＤ２５を含まない集団から除去して、制御性Ｔ細胞枯
渇かつ腫瘍抗原枯渇の細胞集団を得るステップをさらに含む。腫瘍抗原は、ＣＤ１９、Ｃ
Ｄ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、もしくはＣＤ１１ｂ、またはそれ
らの組合せから選択され得る。
他の実施形態において、本方法は、ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前に、チ
ェックポイント阻害剤を発現する細胞を集団から除去して、制御性Ｔ細胞枯渇かつ阻害性
分子枯渇の細胞集団を得るステップをさらに含む。チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１
、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（例
えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＴＩ
ＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、およびＬＡＩＲ１から選択され得る。
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、免疫エフェクター細胞の集団を提供するこ
とを包含する。提供される免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、
ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＤ４５ＲＯのうちの１つまたは複数の発現に基
づいて選択され得る。ある特定の実施形態において、提供される免疫エフェクター細胞の
集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
本方法のある特定の実施形態において、本方法は、ＣＡＲをコードする核酸分子が導入
された後に、細胞集団を増殖させるステップをさらに含む。
複数の実施形態において、細胞集団を、８日間またはそれ未満の期間、増殖させる。
ある特定の実施形態において、細胞集団を、５日間培養液中で増殖させ、結果として得
られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞よりも強力
である。
他の実施形態において、細胞集団を５日間増殖させると、抗原刺激時に、同じ培養条件
下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して、細胞倍増の少なくとも１倍
、２倍、３倍、または４倍の増加を示す。
さらに他の実施形態において、細胞集団を、５日間培養液中で増殖させ、結果として得
られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養液中で増殖させた同じ細胞と比較して
、より高い炎症促進性ＩＦＮ－γおよび／またはＧＭ－ＣＳＦレベルを呈する。
他の実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作
用物質および細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドの存在下において、細胞を培
養することによって増殖される。作用物質は、抗ＣＤ３抗体もしくはそのフラグメントお
よび／または抗ＣＤ２８抗体もしくはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズであ
り得る。
他の実施形態において、細胞の集団を、１つまたは複数のインターロイキンを含む適切
な培地において増殖させ、これは、フローサイトメトリーによって測定すると、１４日間
の増殖期間にわたって、細胞の少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍、または３５０
倍の増加をもたらす。
他の実施形態において、細胞集団を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７の存在下にお
いて増殖させる。
ある特定の実施形態において、本方法は、適切な増殖期間の後に、細胞集団を凍結保存
するステップをさらに含む。
さらに他の実施形態において、本明細書に開示される作製方法は、免疫エフェクター細
胞集団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させ
るステップをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡであり
得る。
本発明はまた、外因性ＲＮＡを一過的に発現する、ＲＮＡ操作細胞、例えば、本明細書
に記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の集団
を生成する方法を提供する。本方法は、インビトロ転写したＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細
胞に導入するステップを含み、ＲＮＡは、本明細書に記載されるＣＡＲ分子をコードする
核酸を含む。
別の態様において、本発明は、対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、対象
に、ＣＡＲ分子を含む有効量の細胞、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞を投与するステップを含む、方法に関する。一実施形態において、細胞は、自家Ｔ
細胞またはＮＫ細胞である。一実施形態において、細胞は、同種Ｔ細胞またはＮＫ細胞で
ある。一実施形態において、対象は、ヒトである。
一態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるような、ＣＡＲ分子をコー
ドする核酸分子を含むベクターがトランスフェクトまたは形質導入された自家細胞集団を
含む。一実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態に
おいて、ベクターは、本明細書の他の箇所に記載される自己不活性化レンチウイルスベク
ターである。一実施形態において、ベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に
（例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって）送達され、ベ
クターは、本明細書に記載される本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を含み、これが、
ｍＲＮＡ分子として転写され、本発明のＣＡＲが、ＲＮＡ分子から翻訳され、細胞表面に
発現される。
別の態様において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター
細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を提供する。一部の実施形態において、Ｃ
ＡＲ発現細胞集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態
において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）集団は、
本明細書に記載される第１の腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発
現する第１の細胞、および本明細書に記載される第２の腫瘍抗原に結合する異なる抗原結
合性ドメインを有するＣＡＲを発現する第２の細胞を含み得る。別の例として、ＣＡＲ発
現細胞の集団には、本明細書に記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む
ＣＡＲを発現する第１の細胞、および本明細書に記載される腫瘍抗原以外の標的に対する
抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれ得る。一実施形態におい
て、ＣＡＲ発現細胞の集団には、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ
を発現する第１の細胞、および二次シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達
ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞が含まれる。
別の態様において、本発明は、集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載され
る腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞は別の作
用物質、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する作用物質を発現する、細胞集団を提供
する。例えば、一実施形態において、作用物質は、阻害性分子を阻害する作用物質であり
得る。阻害性分子の例としては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、Ｃ
ＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡ
Ｍ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、
２Ｂ４、およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態において、阻害性分子を阻害す
る作用物質は、例えば、本明細書に記載される分子であり、例えば、第１のポリペプチド
、例として阻害性分子が、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例として
本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインに会合したものを含む、作用物質であ
る。一実施形態において、作用物質は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１６
０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、Ｃ
ＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、２Ｂ４、およびＴＩＧＩＴなどの
阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかのフラグメントである、第１のポリペプチド
、ならびに本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン
（例えば、例として本明細書に記載される４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）および
／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ゼータシグナ
ル伝達ドメインを含む）である、第２のポリペプチドを含む。一実施形態において、作用
物質は、ＰＤ－１またはそのフラグメントである第１のポリペプチド、および本明細書に
記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されるＣＤ２８、ＣＤ
２７、ＯＸ４０、または４－ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／または本明細書に記載
されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。
一実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような本発明のＣＡＲ分子をコー
ドする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子として発現される。一実施形態において、本発明の遺伝
子修飾されたＣＡＲを発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、
ＮＫ細胞）は、所望されるＣＡＲをコードするＲＮＡ分子（例えば、ベクター配列なし）
を、細胞にトランスフェクトまたはエレクトロポレーションすることによって生成するこ
とができる。一実施形態において、本発明のＣＡＲ分子は、組換え細胞に組み込まれ、そ
の表面に発現されると、ＲＮＡ分子に翻訳される。
トランスフェクションにおいて使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、特別
に設計したプライマーを用いた鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、続いて、ポリＡ付加に
より、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書に記載される３’お
よび／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書に記載される５’キャップ
）、ならびに／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書に記載
されるＩＲＥＳ）、発現させようとする核酸、ならびに典型的に長さが５０～２０００塩
基であるポリＡ尾部を含有するコンストラクトを産生することを伴う。このようにして産
生されたＲＮＡは、様々な種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることが可能である
。一実施形態において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ
ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションによって細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細
胞に形質導入される。
本発明のＣＡＲの様々な成分の一部の例の配列は、表１に列挙されており、ここで、ａ
ａはアミノ酸を表し、ｎａは、対応するペプチドをコードする核酸を表す。
Figure 2022169574000003
Figure 2022169574000004
Figure 2022169574000005
Figure 2022169574000006
Figure 2022169574000007
Figure 2022169574000008
Figure 2022169574000009
Figure 2022169574000010
Figure 2022169574000011
以下の実施例は、本発明を制限するのではなく、例示することを意図する。
＜実施例１＞
ｐＣＩＮＳベクターの生成
親レンチウイルス移入ベクターｐＲＲＬ．ＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＥＦ１ａ．ＥＧＦＰ．Ｗ
ＰＲＥを、ＤＮＡ２．０によって、Ｄｕｌｌら（参照により本明細書に組み込まれる、J.
Virol. 72: 8463-8471, 1998）によって作製されたｐＲＲＬ．ＳＩＮベクターの骨格に
由来する配列を使用して、デノボ合成した。ｐＣＩＮＳの特性マップは図１に記載されて
おり、一方でベクターの制限マップは図２に記載されている。
ｐＣＩＮＳベクターの生成の際、親ベクターに対して以下の修飾を行った。
１．５’シスエレメントを、ＨＩＶ－１分離株ＮＬ４－３由来の対応する天然の配列と置
き換えた。置き換えた５’シスエレメントには、パッケージングシグナル（プシー）、プ
シーに隣接する部分的ｇａｇ配列、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）およびその周囲の部
分的ｅｎｖ配列、ならびにｐｏｌ由来のセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）配列
が含まれた。
２．ＳＶ４０およびｆ１の複製起点は冗長であったため除去し、プラスミドサイズを減少
させた。
３．いくつかの制限部位を、シスエレメント間に導入して、ＤＮＡ操作を促進した。
４．スプライシングされていないウイルスＲＮＡの核外輸送を制限するｇａｇにおけるＩ
ＮＳ１阻害性配列（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、J. Virol. 71(7):4892
-4903, 1997、J. Virol. 66(12):7176-7182, 1992）を変異させ、それによって、ベクタ
ーによってコードされるウイルスＲＮＡの核外輸送の制限を低減させた。
５．阻害性配列ＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４を含む、ヌクレオチド１６８より後
ろのｇａｇ配列の部分（参照により本明細書に組み込まれる、J. Virol. 68(6):3784-379
3, 1994）を、除去した。
６．ＲＳＶおよびＣＭＶのいずれのプロモーターも、ＳＩＮ ＬＶ発現に使用することが
できるため、ＲＳＶプロモーターをＣＭＶプロモーターと置き換えた（それぞれ参照によ
り本明細書に組み込まれる、Science 272(5259):263-267, 1996、J. Virol. 72(11):8463
-8471, 1998）。
ｐＣＩＮＳ－ＥＧＦＰ配列は、以下に記載されており、表３に詳述されている。ＥＧＦ
Ｐ配列は、任意選択で、所望される場合、当該技術分野における標準的な方法を使用して
、別の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子）の配列と置き換えてもよい。
ｐＣＩＮＳ－ＥＧＦＰ配列（配列番号５０）
Figure 2022169574000012
Figure 2022169574000013
Figure 2022169574000014
Figure 2022169574000015
＜実施例２＞
ｐＮＯＸベクターの生成
実施例１において生成したｐＣＩＮＳベクターをさらに修飾して、ｐＮＯＸベクターを
産生した。特に、ｐＣＩＮＳに存在していたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の
転写後制御エレメント（ＰＲＥ）を、Ｂ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６、完全ゲノムの天
然の配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＰ３４１００７．１）を含むＢ型肝炎ウイルス由来のＰＲ
Ｅ（ＨＰＲＥ）を置き換えた。ＷＰＲＥは、導入遺伝子の効率的な発現を確実にするため
に、親ベクターに存在していた。しかしながら、ＷＰＲＥは、Ｘタンパク質コーディング
配列を含む。ＷＰＲＥにおけるＸタンパク質ＯＲＦの存在により、レンチウイルスベクタ
ーの組込みに関して、安全性の問題が生じ得る。例えば、Ｘタンパク質は、肝臓がんの発
生に関係している（参照により本明細書に組み込まれる、Gene Ther. 12(1):3-4, 2005）
。ｐＮＯＸベクターにおいて、Ｘタンパク質の開始コドンに点変異を導入した（ＡＴＧか
らＡＧＧ）。結果として、組換えＨＰＲＥは、Ｘタンパク質のＯＲＦを含まない。ｐＮＯ
Ｘの特性マップを図１３に示し、一方でベクターの制限マップを図１４に示す。
ｐＮＯＸ－ＥＧＦＰ配列は、以下に記載されており、表４に詳述されている。ＥＧＦＰ
配列は、任意選択で、所望される場合、当該技術分野における標準的な方法を使用して、
別の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子）の配列と置き換えてもよい。
ｐＮＯＸ－ＥＧＦＰ配列（配列番号５１）
Figure 2022169574000016
Figure 2022169574000017
Figure 2022169574000018
Figure 2022169574000019
＜実施例３＞
ｐＣＩＮＳおよびｐＮＯＸベクターを使用して生成したウイルスの力価
ｐＣＩＮＳおよびｐＮＯＸレンチウイルス移入ベクターの有効性を判定するために、一
連の実験を行い、移入ベクターのうちの一方を、パッケージング細胞の一過的トランスフ
ェクションを使用して細胞に導入した。簡単に述べると、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を、５ｍｌｎ／ｍｌの濃度で、５ｍｌのフリースタイル（
ＦＳ）培地において、２００ｒｐｍ、３７℃、および８％ＣＯ２、湿度８０％で、成長さ
せた。ＰＥＩＰｒｏ移入試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）を使用し、３μｇのｐＮＶＳ－ＭＤＬ
ｇｐ－ＲＲＥ、３μｇのｐＮＶＳ ＲＳＶ Ｒｅｖ－Ｋａｎ、０．７５μｇのｐＮＶＳ－
ＭＤＧ－ＶＳＶＧ－Ｋａｎ、および６μｇの移入ベクター（ｐＣＩＮＳまたはｐＮＯＸ）
を使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後に、ウ
イルス上清を収集し、力価分析（すなわち、感染力価の測定）に供した。
２９３Ｔ細胞において、ｐＣＩＮＳプラスミド移入ベクターは、親ベクターによって生
成されたものよりもおよそ５倍高いウイルス力価をもたらした（図５Ａ）。力価は、ＧＦ
Ｐ陽性細胞の割合に基づいて評価した。この予想外に強力なウイルス産生は、パッケージ
ング細胞においてＣＭＶプロモーターにより媒介される転写によって生成されたレンチウ
イルスゲノムＲＮＡの高い数量（ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定）、および核内保持の不在に
よるＬＶ ＲＮＡの核からのより効率的な輸送に起因し得る。
ｐＮＯＸ移入ベクターは、ｐＣＩＮＳと比較して類似したまたはより高い力価をもたら
すことができた（図５Ｂ～５Ｄ）。感染力価は、形質導入した２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａ
ｔ Ｔ細胞、および初代ヒトＴ細胞におけるＧＦＰ発現によって測定した。特に、ｐＮＯ
Ｘは、２９３Ｔ細胞（図５Ｂ）および初代ヒトＴ細胞（図５Ｄ）において、ｐＣＩＮＳに
類似したレベルのＧＦＰ発現をもたらしたが、実際には、ｐＣＩＮＳと比較して実質的に
多くの数量のＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をもたらした（図５Ｃ）。
レンチウイルス移入ベクター由来のエレメントのゲノム組込み後の導入遺伝子発現のレ
ベルもまた、試験した。ウイルスエレメントがＴ細胞ゲノムに組み込まれるように、Ｔ細
胞に、ｐＮＯＸまたはｐＣＩＮＳ移入ベクターを使用して産生したウイルスを感染させた
。ＨＰＲＥを含むレンチウイルスベクター、ｐＮＯＸは、ＷＰＲＥを含むレンチウイルス
ベクターｐＣＩＮＳと比較して類似したレベルの導入遺伝子の発現をもたらした（図５Ｅ
）。これらの結果は、ＷＰＲＥ（ｐＣＩＮＳにおいて）がＨＰＲＥよりも強力であるとい
うこれまでの報告に基づくと、驚くべきことであった（例えば、それぞれ参照により本明
細書に組み込まれる、J. Virol. 72: 5085-5092, 1998、Gene Therapy 14, 1298-1304, 2
007参照）。
本発明は、ｐＣＩＮＳベクター、ならびにｐＣＩＮＳベクターの部分および／またはｐ
ＣＩＮＳの１つもしくは複数の配列と同一性（例えば、ｐＣＩＮＳとの少なくとも９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を共有する配
列を含む、関連ベクターを含む。そのような関連ベクターに含まれ得る配列としては、す
べてのｐＣＩＮＳ配列、または例えばウイルスプロモーター（すなわち、ウイルスタンパ
ク質の発現を作動させるプロモーター）、部分的ｇａｇ（例えば、ＩＮＳ２、３、および
４を欠く、および／または本明細書に記載されるＩＮＳ１変異を含む）、部分的ｅｎｖ、
ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、サブゲノムプロモーター（例えば、ＥＦ１アルファプロモーター、任
意選択で、本明細書に記載される構成的スプライスドナー部位およびスプライスアクセプ
ター部位を含む）、ならびにＰＲＥ（任意選択で、本明細書に記載されるＸタンパク質不
活性化変異を含む）（これらの配列は、それぞれ、任意選択で、上述の配列同一性を有す
る）の様々な組合せを含むサブセットが挙げられる。そのようなベクターは、導入遺伝子
（例えば、本明細書に記載されるような、ＣＡＲまたはＥＧＦＰをコードする遺伝子）を
含み得る。
Figure 2022169574000020
Figure 2022169574000021
Figure 2022169574000022
Figure 2022169574000023
Figure 2022169574000024
本発明は、ｐＮＯＸベクター、ならびにｐＮＯＸベクターの部分および／またはｐＮＯ
Ｘの１つもしくは複数の配列と同一性（例えば、ｐＮＯＸとの少なくとも９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を共有する配列を含む
、関連ベクターを含む。そのような関連ベクターに含まれ得る配列としては、すべてのｐ
ＮＯＸ配列、または例えばウイルスプロモーター（すなわち、ウイルスタンパク質の発現
を作動させるプロモーター）、部分的ｇａｇ（例えば、ＩＮＳ２、３、および４を欠く、
および／または本明細書に記載されるＩＮＳ１変異を含む）、部分的ｅｎｖ、ＲＲＥ、ｃ
ＰＰＴ、サブゲノムプロモーター（例えば、ＥＦ１アルファプロモーター、任意選択で、
本明細書に記載される構成的スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を
含む）、ならびにＰＲＥ（任意選択で、本明細書に記載されるＸタンパク質不活性化変異
を含む）（これらの配列は、それぞれ、任意選択で、上述の配列同一性を有する）の様々
な組合せを含むサブセットが挙げられる。そのようなベクターは、導入遺伝子（例えば、
本明細書に記載されるような、ＣＡＲまたはＥＧＦＰをコードする遺伝子）を含み得る。
Figure 2022169574000025
Figure 2022169574000026
Figure 2022169574000027
Figure 2022169574000028
Figure 2022169574000029
＜実施例４＞
ｐＮＬＶ移入ベクターの生成
実施例２において生成したｐＮＯＸベクターをさらに修飾して、ｐＮＬＶベクターを産
生した。ｐＮＬＶの特徴マップおよび制限マップは、それぞれ、図１３および図１４に示
す。ｐＮＯＸのｃＰＰＴエレメントを、配列番号９２に示されるｃＰＰＴ配列と置き換え
た。ｃＰＰＴは、ｐｏｌ配列２６９８～２８５０位を表す（配列番号９２および９３参照
）。コザック配列が、導入遺伝子をコードする遺伝子のすぐ上流に含まれる（例えば、表
５に示されるＥＧＦＰ）。最後に、配列番号９５の野生型ＥＦ１ａプロモーター（Ｐ－Ｅ
Ｆ１ａ）を利用した。ｐＮＬＶベクターは、増加したウイルス力価および改善されたバイ
オセーフティプロファイルを有する。
ｐＮＬＶベクターの配列およびｐＮＬＶベクターに含まれるエレメントの配列を、以下
に示す。一部の事例において、ベクター骨格およびｐＮＬＶベクターに含まれるエレメン
ト、ならびにそれらの部分は、本明細書に記載されるベクターのいずれかにおいて使用す
ることができる。ベクター骨格配列および機能性エレメントは、当該技術分野において周
知のクローニング方法によって、別のベクターに挿入され得るおよび／または別のベクタ
ーの部分と置き換わってもよい。
ｐＮＬＶ－ＥＧＦＰ配列は、以下に記載されており、表５に詳述されている。ＥＧＦＰ
配列は、任意選択で、所望される場合、当該技術分野における標準的な方法を使用して、
別の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子）の配列と置き換えてもよい。
ｐＮＬＶ－ＥＧＦＰ配列（配列番号９０）
Figure 2022169574000030
Figure 2022169574000031
Figure 2022169574000032
ｐＮＬＶベクター内に存在する機能性エレメントを、以下の表４に示す。完全ｐＮＬＶ
配列の部分は、ベクター骨格配列を含み得る。そのようなベクター骨格配列は、本明細書
に記載されるベクターのいずれにおいても（例えば、ｐＣＩＮＳ、ｐＮＯＸ、およびｐＮ
ＬＶ）、ベクター骨格配列またはその部分として使用され得るおよび／またはそれと置き
換わり得る。
本発明は、ｐＮＬＶベクター、ならびにｐＮＬＶベクターの部分および／またはｐＮＬ
Ｖの１つもしくは複数の配列と同一性（例えば、ｐＮＬＶとの少なくとも９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性）を共有する配列を含む
、関連ベクターを含む。そのような関連ベクターに含まれ得る配列としては、すべてのｐ
ＮＬＶ配列、または例えばウイルスプロモーター（すなわち、ウイルスタンパク質の発現
を作動させるプロモーター）、部分的ｇａｇ（例えば、ＩＮＳ２、３、および４を欠く、
および／または本明細書に記載されるＩＮＳ１変異を含む）、部分的ｅｎｖ、ＲＲＥ、ｃ
ＰＰＴ、サブゲノムプロモーター（例えば、ＥＦ１アルファプロモーター、任意選択で、
本明細書に記載される構成的スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を
含む）、ならびにＰＲＥ（任意選択で、本明細書に記載されるＸタンパク質不活性化変異
を含む）（これらの配列は、それぞれ、任意選択で、上述の配列同一性を有する）の様々
な組合せを含むサブセットが挙げられる。そのようなベクターは、導入遺伝子（例えば、
本明細書に記載されるような、ＣＡＲまたはＥＧＦＰをコードする遺伝子）を含み得る。
Figure 2022169574000033
Figure 2022169574000034
Figure 2022169574000035
Figure 2022169574000036
Figure 2022169574000037
Figure 2022169574000038
＜実施例５＞
レンチウイルス産生のための移入ベクターの最適化
ウイルス力価が高く、バイオセーフティ特性が強化され、形質導入の効率性が改善され
、導入遺伝子発現が持続する、改善されたレンチウイルス移入ベクター系を、開発した。
いくつかのシスエレメントを再操作して、ｐＮＬＶ移入ベクター骨格を生成した（図６）
。ＧＦＰコーディングｐＣＩＮＳ移入ベクターと比較したＧＦＰコーディングｐＮＬＶレ
ンチウイルス移入ベクターの有効性を判定するために、一連の実験を行い、移入ベクター
のうちの一方を、パッケージング細胞の一過的トランスフェクションによって細胞に導入
した。簡単に述べると、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を
、５ｍｌｎ／ｍｌの濃度で、５ｍｌのフリースタイル（ＦＳ）培地において、２００ｒｐ
ｍ、３７℃、および８％ＣＯ２、湿度８０％で、成長させた。ＰＥｌＰｒｏ移入試薬（Ｐ
ｏｌｙＰｌｕｓ）を使用し、３μｇのｐＮＶＳ－ＭＤＬｇｐ－ＲＲＥ、３μｇのｐＮＶＳ
２０ ＲＳＶ Ｒｅｖ－Ｋａｎ、０．７５μｇのｐＮＶＳ－ＭＤＧ－ＶＳＶＧ－Ｋａｎ
、および６μｇの移入プラスミドを使用して、トランスフェクションを行った。トランス
フェクションの４８時間後に、ウイルス上清を収集し、力価分析（すなわち、感染力価の
測定）に供した。
ｐＮＬＶ移入ベクターは、対照親（すなわち、最適化前の）ベクターによって得られた
ものよりもおよそ２～３倍高いウイルス力価をもたらした（図７Ａ）。物理的力価は、ウ
イルスＲＮＡコピー数（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される）に基づいて評価し
、感染力価は、プロウイルス組込み力価アッセイによって判定される感染単位に基づいて
判定した（図７Ｂ）。
次いで、導入遺伝子発現のレベルを、ｐＮＬＶベクターからのエレメントのゲノム組込
み後に、ｐＣＩＮＳ移入ベクターと比較して試験した。ウイルスエレメントがＴ細胞に組
み込まれるように、Ｔ細胞に、ｐＣＩＮＳまたはｐＮＬＶレンチウイルスベクターを使用
して産生したウイルスを感染させた。ｐＮＬＶベクターは、ｐＣＩＮＳと比較してより高
いレベルの導入遺伝子発現（ＦＡＣＳによって測定される）を有することが見出された（
図８Ａ～８Ｃ）。
また、ｐＮＬＶおよびｐＣＩＮＳベクターを、相対感染力価に関して、いくつかの市販
の移入ベクターとも比較した。市販のベクターのそれぞれ、およびｐＣＩＮＳベクターを
、別個に、ＧＦＰコーディング対照（親）ベクターと比較し、ｐＣＩＮＳベクターは、さ
らに、ｐＮＬＶと比較した。ｐＬＶＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）移入ベクターを、２９３Ｔ細
胞に形質導入したが、これは、対照ベクターよりもわずかに高いウイルス力価を有するこ
とが見出された（図９Ａ）。ｐＬｅｎｔｉ６．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）移入ベクターを、細胞に形質導入したが、これは、対照ベクターと比較してウイルス力
価に大幅な減少を有することが見出された（図９Ｂ）。ｐＤ２１０９（ＤＮＡ２．０）移
入ベクターを、細胞に形質導入したが、これは、対照ベクターと比較して、ウイルス力価
に少しの減少を有することが見出された（図９Ｃ）。ｐＣＩＮＳ移入ベクターを、細胞に
形質導入したが、これは、対照ベクターよりも実質的に高いウイルス力価を有することが
見出された（図９Ｄ）。ｐＮＬＶ移入ベクターもまた、細胞に導入したが、これは、ｐＣ
ＩＮＳベクターよりも高いウイルス力価を有することが見出された（図９Ｅ）。これらの
結果は、ｐＣＩＮＳおよびｐＮＬＶを使用して作製したウイルスはいずれも、市販入手可
能なレンチウイルス移入ベクターを使用して作製したものよりも、全体的に有意に高く感
染性であり、ｐＮＬＶベクターを使用して作製したウイルスが、最も高いウイルス力価を
呈することを示す。
感染力価に対するスプライシングの影響を調査するために、一連のスプライスドナー部
位およびスプライスアクセプター部位を、後続のウイルス力価判定のために変異させた（
図１０Ａ）。ｐＣＩＮＳ移入ベクターの様々なスプライスドナー部位およびスプライスア
クセプター部位の変異体を、パッケージング細胞にトランスフェクトし、ウイルス力価を
、変異体のパネル全体にわたり、対照移入ベクターと比較した（図１０Ｂ）。変異のすべ
てが、ウイルス力価に大幅な減少をもたらし、移入ベクター骨格におけるスプライス部位
の存在が、最大限のウイルス力価には必要であることが示された。これらの観察結果は、
スプライス部位の存在が、レンチウイルスＲＮＡ核外輸送にとって重要であることを示す
。レンチウイルスゲノムＲＮＡの核外への輸送は、スプライソソームおよびＲｅｖタンパ
ク質との相互作用を必要とし得る。パッケージングベクターからＲｅｖタンパク質が高い
レベルで発現されることにより、完全サイズのＲＮＡが、スプライシングから保護され、
パッケージングのために輸送されることが確実になり得る。
最後に、移入ベクター骨格のｇａｇ領域およびｅｎｖ領域を、新たに操作した一連の移
入ベクターコンストラクトから除去して、感染ウイルス力価に対するｇａｇエレメントお
よびｅｎｖエレメントの重要性を判定した。３’および５’にｇａｇおよびｅｎｖの欠失
を有する移入ベクター（すなわち、－ｇａｇ３’、－ｇａｇ５’、－ｅｎｖ３’、および
－ｅｎｖ５’変異体）を、作製し（図１１Ａ）、各ベクターを、次いで、別個の細胞セッ
トに形質導入した。ｇａｇおよび／またはｅｎｖ欠失変異体のそれぞれについて、ウイル
ス力価を判定し、対照レンチウイルス移入ベクターと比較した（図１１Ｂ）。－ｅｎｖ３
’および－ｇａｇ３’－ｅｎｖ５’変異体は、対照ベクターと比較してウイルス力価に減
少を呈したが、－ｅｎｖ５’および－ｇａｇ３’は、ウイルス力価にほとんど差を示さな
かったことが見出された。これらの結果は、３’ｇａｇ領域および５’ｅｎｖ領域は、ウ
イルス力価にわずかな影響しか有さず個別に改変することができるが、他のｇａｇおよび
ｅｎｖ短縮は、移入ベクターの有効性にとって有害であることを示す。
＜実施例６＞
ｐＮＬＶとｐＲＲＬＳＩＮとの間の配列の相違
ｐＲＲＬＳＩＮ移入ベクターを修飾して、ｐＮＬＶベクターを生成した。これらのヌク
レオチド置換および挿入は、レンチウイルス移入ベクターの有効性およびバイオセーフテ
ィプロファイルを改善するために導入した。一例において、ｐＮＬＶプシー配列は、ｐＲ
ＲＬＳＩＮ配列と比較して、以下の配列の相違を有する（図１２Ａ）：Ｔ７７１Ｃ、Ｔ７
８４Ｇ、Ａ７８５Ｇ、Ｇ７８８Ａ、ポリヌクレオチド配列「ＧＡＧ」の挿入（７９２～７
９４）、Ａ７９８Ｃ、およびＧ９２４Ａ。ｐＮＬＶは、９０７位で開始して１０７４位ま
での部分的ｇａｇ配列を有する。加えて、ｐＮＬＶは、この領域に、ｐＲＲＬＳＩＮと比
較して、以下の配列の相違を有する（図１２Ｂ）：以下のヌクレオチドの挿入：Ａ９６８
およびＡ９６９（終止コドンをもたらす）、ならびに以下の置換：Ｇ９２４Ａ、Ａ９４９
Ｃ、Ａ９５０Ｇ、Ｇ９８９Ａ、Ｇ９９２Ａ、Ｃ９９５Ｔ、Ｇ９９８Ａ、Ｃ９９９Ｔ、Ｇ１
００４Ａ、Ｃ１００７Ｔ、Ｃ１０１０Ａ、Ｔ１０５８Ｇ、およびＧ１０６４Ａ。ｐＮＬＶ
はまた、１０８３位で開始して１２２８位までの部分的ｅｎｖ配列を有する。この領域に
おいて、ｐＮＬＶは、ｐＲＲＬＳＩＮと比較して、以下の配列の相違を有する（図１２Ｃ
）：Ｃ１１０５Ａ。
ｐＮＬＶ ＲＲＥ領域は、ｐＲＲＬＳＩＮと比較して、以下の配列の相違を有する（図
１２Ｄ）：Ｇ１２９１Ｃ、Ａ１３３２Ｇ、およびＡ１４１４Ｇ。ｐＮＬＶは、１４７９位
で開始して１９６１位までの部分的ｅｎｖ領域（主要スプライスアクセプター部位７を含
有する）を有する。加えて、ｐＮＬＶは、この部分的ｅｎｖ領域に、ｐＲＲＬＳＩＮと比
較して、以下の配列の相違を有する（図１２Ｅ）：Ａ１５７１Ｃ、Ｔ１５７５Ｃ、および
Ｔ１８６６Ｃ。
ｐＮＬＶは、１９７１位で開始して２１１８位までのｃＰＰＴ領域、および１９７４位
で開始して２１５１位までの部分的ｐｏｌ配列（主要スプライスアクセプター部位１を含
有する）を有する（図１２Ｆ）。一部の事例において、ｃＰＰＴ領域は、１７８ヌクレオ
チドの配列を含む。一部の事例において、部分的ｇａｇ配列、部分的ｅｎｖ配列、および
／または部分的ｐｏｌ配列は、親ベクターと比較して、野生型ウイルス配列に対する相同
性の低減を示し、そのため、バイオセーフティプロファイルが改善されている。加えて、
ｐＮＬＶは、ｃＰＰＴ領域および部分的ｐｏｌ領域に、ｐＲＲＬＳＩＮと比較して、以下
の配列の相違、挿入を有する：＋Ａ１９７１、＋ＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧ（１９７４～１
９８４）、＋ＴＴＣＡＴＣＣ（１９８７～１９９３）、＋Ａ１９９６、＋Ａ１９９７、お
よび＋ＣＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧ（
２１１６～２１５１）。
ｐＮＬＶとｐＲＬＬＳＩＮとの間の上述の配列の相違は、ｃＰＰＴ領域の相違を除き、
ｐＲＬＬＳＩＮと比較して、それぞれ、ｐＣＩＮＳおよびｐＮＯＸに当てはまる。ｐＲＬ
ＬＳＩＮと比較して、ｐＣＩＮＳまたはｐＮＯＸとの間の相違の正確なヌクレオチドの位
置は、本明細書に提供される関連配列のアライメントによって特定することができる。
他の実施形態
上述の本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞ
れ個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると
示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および趣旨を
逸脱することなく、記載された本発明の方法、医薬組成物、およびキットの様々な修正形
および変化形が、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態と関連して記載
されているが、さらなる修正が可能であること、および特許請求される本発明はそのよう
な特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことが理解されるはずである。実際に
、当業者には明白である本発明を実施するための、記載された様式の様々な修正形は、本
発明の範囲に含まれることが意図される。本出願は、概して本発明の原理に従った本発明
のあらゆる変化形、使用、または適用を、本発明が関係する技術分野における公知の慣例
の範囲内であり、本明細書に上述されている本質的な特性に当てはまり得るような、本開
示からの逸脱を含めて網羅することを意図する。
他の実施形態
上述の本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、記載された本発明の方法、医薬組成物、およびキットの様々な修正形および変化形が、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態と関連して記載されているが、さらなる修正が可能であること、および特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことが理解されるはずである。実際に、当業者には明白である本発明を実施するための、記載された様式の様々な修正形は、本発明の範囲に含まれることが意図される。本出願は、概して本発明の原理に従った本発明のあらゆる変化形、使用、または適用を、本発明が関係する技術分野における公知の慣例の範囲内であり、本明細書に上述されている本質的な特性に当てはまり得るような、本開示からの逸脱を含めて網羅することを意図する。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．異種核酸配列を含み、以下の特性：
（ａ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むこと、
（ｂ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減させる変異型ＩＮＳ１阻害性配列を含むｇａｇタンパク質の少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチドを含むこと、
（ｃ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４阻害性配列をコードするポリヌクレオチドを含まないこと、ならびに
（ｄ）ＳＶ４０複製起点および／またはｆ１複製起点を含まないこと
のうちの少なくとも２つによって特徴付けられる、レンチウイルス移入ベクター。
２．特性（ａ）～（ｄ）のうちの少なくとも３つによって特徴付けられる、上記１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３．特性（ａ）～（ｄ）のすべてによって特徴付けられる、上記１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
４．（ｉ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減させる変異型ＩＮＳ１阻害性配列を含む、（ｉｉ）フレームシフトおよび成熟前終結をもたらす２つのヌクレオチド挿入を含有する、ならびに／または（ｉｉｉ）ＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４阻害性配列を含まない、ｇａｇタンパク質の１５０～２５０（例えば、１６８）ヌクレオチド部分をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１から３のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
５．パッケージングシグナル（プシー）、プシーに隣接するかまたはそれと部分的にオーバーラップする部分的ｇａｇ配列、ｒｅｖ応答エレメント、部分的ｅｎｖ配列、およびｐｏｌ由来のｃＰＰＴ配列からなる群から選択される１つまたは複数のエレメントをさらに含み、それらの配列は、任意選択で、ＨＩＶ－１分離株ＮＬ４－３またはＳＦ３を起源とする、上記１から４のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
６．前記ｃＰＰＴ配列が、約１５０～２５０（例えば、１７８～１８１）ヌクレオチドを含み、スプライスアクセプターＳＡ１配列を含む、上記５に記載のレンチウイルス移入ベクター。
７．前記ベクターのエレメント間に位置する１つまたは複数の制限部位をさらに含む、上記１から６のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
８．転写後制御エレメント（ＰＲＥ）をさらに含む、上記１から７のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
９．前記ＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である、上記８に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１０．前記ＷＰＲＥが、配列番号７８に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、上記９に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１１．前記ＰＲＥが、Ｂ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６ ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）である、上記８に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１２．前記ＨＰＲＥが、配列番号７９に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、任意選択で、前記ＨＰＲＥが、Ｘタンパク質コーディング配列に不活性化変異を含む、上記１１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１３．ＥＦ１ａプロモーターをさらに含み、任意選択で、前記ＥＦ１ａプロモーターが、配列番号７１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、かつ任意選択で完全長であり、インタクトなスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列（それぞれ、配列番号７２および７３）を含む（配列番号９５）、上記１から１２のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１４．前記レンチウイルス移入ベクターのレンチウイルス成分が、ＨＩＶ－１を起源とする、上記１から１３のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１５．前記異種核酸配列が、コザック配列の下流にある、上記１から１４のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１６．前記ｇａｇタンパク質の前記少なくとも一部分をコードする配列が、ｐＭＤＬｇｐＲＲＥパッケージングプラスミドによってコードされるｇａｇタンパク質の対応する領域に対して、９０％未満の配列同一性を有する、上記１から１５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１７．前記レンチウイルス移入ベクターが、
（ｉ）配列番号５２に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＣＭＶプロモーター、
（ｉｉ）配列番号５３に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ
Ｒ領域、
（ｉｉｉ）配列番号５４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ Ｕ５領域、
（ｉｖ）配列番号５５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むプライマー結合部位、
（ｖ）配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むパッケージングシグナル、
（ｖｉ）配列番号５７に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前記パッケージングシグナル内にある、主要スプライスドナー部位、
（ｖｉｉ）配列番号５８に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部分的ｇａｇ配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部分的ｅｎｖ配列、
（ｉｘ）配列番号６２に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＲｅｖ応答エレメント、
（ｘ）配列番号６４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部分的ｅｎｖ配列、
（ｘｉ）配列番号６５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、（ｘ）部の前記部分的ｅｎｖ配列内にある、スプライスアクセプター部位、
（ｘｉｉ）配列番号６７、９２、または９３に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むセントラルポリプリントラクト、
（ｘｉｉｉ）配列番号６８または９４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前記セントラルポリプリントラクト内にある、スプライスアクセプター部位、（ｘｉｖ）配列番号７１または９５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＥＦ１アルファプロモーター、
（ｘｖ）配列番号７２に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前記ＥＦ１アルファプロモーター内にある、構成的スプライスドナー（ＣＤ）部位、
（ｘｖｉ）配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前記ＥＦ１アルファプロモーター内にある、構成的スプライスアクセプター（ＣＡ）部位、（ｘｖｉｉ）配列番号７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＥＧＦＰをコードするポリヌクレオチドおよび／または導入遺伝子配列、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号７８または７９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むＰＲＥ配列、
（ｘｉｘ）配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む部分的ｎｅｆ配列、
（ｘｘ）配列番号８４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むｄＵ３配列、
（ｘｘｉ）配列番号８５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ Ｒ領域、ならびに
（ｘｘｉｉ）配列番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ Ｕ５領域
を含む、上記１から１６のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１８．前記異種核酸配列が、タンパク質をコードする、上記１から１７のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
１９．前記タンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、上記１８に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２０．前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、上記１９に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２１．前記シグナル伝達ドメインが、１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメインを含む、上記２０に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２２．前記シグナル伝達ドメインが、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、上記２０または２１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２３．前記１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメインのうちの１つが、ＣＤ３－ゼータ刺激ドメインを含む、上記２１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２４．前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つまたは複数が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメインを含む、上記２２または２３に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２５．前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの前記１つまたは複数が、前記４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインを含む、上記２４に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２６．前記共刺激ドメインのうちの前記１つまたは複数が、前記ＣＤ２８共刺激ドメインを含む、上記２４または２５に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２７．前記抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖである、上記２０から２６のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２８．前記抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７－関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウイルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、１２ｐ染色体に位置（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン(surviving)；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃニワトリ骨芽球腫ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ－結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原３（ＳＡＲＴ３）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓偏在１（ＲＵ１）；腎臓偏在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸内カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡのＦｃフラグメントの受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原に結合する、上記２０から２７のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
２９．前記抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、メソテリン、またはＣＤ１２３に結合する、上記２８に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３０．前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む、上記１９から２９のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３１．５’から３’に、作動可能なつながりで、以下のエレメント：
プロモーター、
主要スプライスドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル（プシー）、
部分的ｇａｇ配列、
部分的ｅｎｖ配列、
Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
スプライスアクセプター部位（ＳＡ７）を含む部分的ｅｎｖ配列、
スプライスアクセプター部位（ＳＡ１）を含むセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
構成的スプライスドナー部位（ＣＤ）および構成的スプライスアクセプター部位（ＣＤ）を含むＥＦ１ａプロモーター、
任意選択で、ＥＧＦＰをコードする遺伝子および／または異種核酸配列、ならびに
転写後制御エレメント
のうちの１つまたは複数を含む、レンチウイルス移入ベクター。
３２．５’から３’に、作動可能なつながりで、以下のエレメント：
ＣＭＶプロモーター、
ＬＴＲ Ｒ領域、
ＬＴＲ Ｕ５領域、
プライマー結合部位（ＰＢＳ）、
主要スプライスドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル（プシー）、
部分的ｇａｇ配列、
部分的ｅｎｖ配列、
Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
スプライスアクセプター部位（ＳＡ７）を含む部分的ｅｎｖ配列、
スプライスアクセプター部位（ＳＡ１）を含むセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、
ＥＦ１ａプロモーター、
任意選択で、ＥＧＦＰをコードする遺伝子および／または異種核酸配列、
転写後制御エレメント、
ＬＴＲ Ｒ領域、
ＬＴＲ Ｕ５領域、
ＳＶ４０ポリＡ尾部、
カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ならびに
ｐＵＣ複製起点
のうちの１つまたは複数を含む、上記３１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３３．前記転写後制御エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６ ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）を含む、上記３１または３２に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３４．前記異種核酸配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、上記３１から３３のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３５．前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む、上記３４に記載のレンチウイルス移入ベクター。
３６．上記１から３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクターを含む、宿主細胞。
３７．前記宿主細胞が、２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、または初代ヒトＴ細胞である、上記３６に記載の宿主細胞。
３８．１つまたは複数のレンチウイルスパッケージングベクターをさらに含む、上記３６または３７に記載の宿主細胞。
３９．上記１から３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクターおよび１つまたは複数のパッケージングベクターを含む、組成物。
４０．異種核酸配列を発現することができるレンチウイルスを産生する方法であって、
（ａ）細胞に、
（ｉ）上記１から３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター、および
（ｉｉ）１つまたは複数のレンチウイルスパッケージングベクター
を導入するステップと、
（ｂ）前記細胞において、前記レンチウイルス移入ベクターおよび／または前記パッケージングベクターによってコードされるウイルスタンパク質を発現させ、それによって、前記レンチウイルス移入ベクターの異種核酸配列を含むレンチウイルスを産生するステップと
を含む、方法。
４１．前記細胞が、２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、または初代ヒトＴ細胞である、上記４０に記載の方法。

Claims (41)

  1. 異種核酸配列を含み、以下の特性：
    （ａ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むこと、
    （ｂ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減させる変異型ＩＮＳ１阻
    害性配列を含むｇａｇタンパク質の少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチドを含
    むこと、
    （ｃ）ｇａｇのＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４阻害性配列をコードするポリヌクレ
    オチドを含まないこと、ならびに
    （ｄ）ＳＶ４０複製起点および／またはｆ１複製起点を含まないこと
    のうちの少なくとも２つによって特徴付けられる、レンチウイルス移入ベクター。
  2. 特性（ａ）～（ｄ）のうちの少なくとも３つによって特徴付けられる、請求項１に記載
    のレンチウイルス移入ベクター。
  3. 特性（ａ）～（ｄ）のすべてによって特徴付けられる、請求項１に記載のレンチウイル
    ス移入ベクター。
  4. （ｉ）野生型ＩＮＳ１と比較してＲＮＡの核外輸送の制限を低減させる変異型ＩＮＳ１
    阻害性配列を含む、（ｉｉ）フレームシフトおよび成熟前終結をもたらす２つのヌクレオ
    チド挿入を含有する、ならびに／または（ｉｉｉ）ＩＮＳ２、ＩＮＳ３、およびＩＮＳ４
    阻害性配列を含まない、ｇａｇタンパク質の１５０～２５０（例えば、１６８）ヌクレオ
    チド部分をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の
    レンチウイルス移入ベクター。
  5. パッケージングシグナル（プシー）、プシーに隣接するかまたはそれと部分的にオーバ
    ーラップする部分的ｇａｇ配列、ｒｅｖ応答エレメント、部分的ｅｎｖ配列、およびｐｏ
    ｌ由来のｃＰＰＴ配列からなる群から選択される１つまたは複数のエレメントをさらに含
    み、それらの配列は、任意選択で、ＨＩＶ－１分離株ＮＬ４－３またはＳＦ３を起源とす
    る、請求項１から４のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  6. 前記ｃＰＰＴ配列が、約１５０～２５０（例えば、１７８～１８１）ヌクレオチドを含
    み、スプライスアクセプターＳＡ１配列を含む、請求項５に記載のレンチウイルス移入ベ
    クター。
  7. 前記ベクターのエレメント間に位置する１つまたは複数の制限部位をさらに含む、請求
    項１から６のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  8. 転写後制御エレメント（ＰＲＥ）をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載
    のレンチウイルス移入ベクター。
  9. 前記ＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である、請求項８に記
    載のレンチウイルス移入ベクター。
  10. 前記ＷＰＲＥが、配列番号７８に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を
    含む、請求項９に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  11. 前記ＰＲＥが、Ｂ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６ ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）である、請求項
    ８に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  12. 前記ＨＰＲＥが、配列番号７９に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を
    含み、任意選択で、前記ＨＰＲＥが、Ｘタンパク質コーディング配列に不活性化変異を含
    む、請求項１１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  13. ＥＦ１ａプロモーターをさらに含み、任意選択で、前記ＥＦ１ａプロモーターが、配列
    番号７１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、かつ任意選択で完
    全長であり、インタクトなスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列（そ
    れぞれ、配列番号７２および７３）を含む（配列番号９５）、請求項１から１２のいずれ
    か一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  14. 前記レンチウイルス移入ベクターのレンチウイルス成分が、ＨＩＶ－１を起源とする、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  15. 前記異種核酸配列が、コザック配列の下流にある、請求項１から１４のいずれか一項に
    記載のレンチウイルス移入ベクター。
  16. 前記ｇａｇタンパク質の前記少なくとも一部分をコードする配列が、ｐＭＤＬｇｐＲＲ
    Ｅパッケージングプラスミドによってコードされるｇａｇタンパク質の対応する領域に対
    して、９０％未満の配列同一性を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載のレン
    チウイルス移入ベクター。
  17. 前記レンチウイルス移入ベクターが、
    （ｉ）配列番号５２に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＣＭＶプ
    ロモーター、
    （ｉｉ）配列番号５３に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴＲ
    Ｒ領域、
    （ｉｉｉ）配列番号５４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴ
    Ｒ Ｕ５領域、
    （ｉｖ）配列番号５５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むプライ
    マー結合部位、
    （ｖ）配列番号５６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むパッケー
    ジングシグナル、
    （ｖｉ）配列番号５７に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前記
    パッケージングシグナル内にある、主要スプライスドナー部位、
    （ｖｉｉ）配列番号５８に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部分
    的ｇａｇ配列、
    （ｖｉｉｉ）配列番号６０に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部
    分的ｅｎｖ配列、
    （ｉｘ）配列番号６２に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＲｅｖ
    応答エレメント、
    （ｘ）配列番号６４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む部分的ｅ
    ｎｖ配列、
    （ｘｉ）配列番号６５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、（ｘ
    ）部の前記部分的ｅｎｖ配列内にある、スプライスアクセプター部位、
    （ｘｉｉ）配列番号６７、９２、または９３に対して少なくとも９５％の同一性を有する
    核酸配列を含むセントラルポリプリントラクト、
    （ｘｉｉｉ）配列番号６８または９４に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配
    列を含み、前記セントラルポリプリントラクト内にある、スプライスアクセプター部位、
    （ｘｉｖ）配列番号７１または９５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＥＦ
    １アルファプロモーター、
    （ｘｖ）配列番号７２に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前記
    ＥＦ１アルファプロモーター内にある、構成的スプライスドナー（ＣＤ）部位、
    （ｘｖｉ）配列番号７３に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含み、前
    記ＥＦ１アルファプロモーター内にある、構成的スプライスアクセプター（ＣＡ）部位、
    （ｘｖｉｉ）配列番号７６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＥ
    ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドおよび／または導入遺伝子配列、
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号７８または７９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する
    核酸配列を含むＰＲＥ配列、
    （ｘｉｘ）配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む
    部分的ｎｅｆ配列、
    （ｘｘ）配列番号８４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むｄ
    Ｕ３配列、
    （ｘｘｉ）配列番号８５に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬＴ
    Ｒ Ｒ領域、ならびに
    （ｘｘｉｉ）配列番号８６に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むＬ
    ＴＲ Ｕ５領域
    を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  18. 前記異種核酸配列が、タンパク質をコードする、請求項１から１７のいずれか一項に記
    載のレンチウイルス移入ベクター。
  19. 前記タンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１８に記載のレンチウ
    イルス移入ベクター。
  20. 前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、お
    よび１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１９に記載のレンチウイルス
    移入ベクター。
  21. 前記シグナル伝達ドメインが、１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメインを含む、請
    求項２０に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  22. 前記シグナル伝達ドメインが、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、
    請求項２０または２１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  23. 前記１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメインのうちの１つが、ＣＤ３－ゼータ刺激
    ドメインを含む、請求項２１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  24. 前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つまたは複数が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４
    －１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦ
    ＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、Ｃ
    ＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫ
    ｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８
    ３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択され
    る細胞内ドメインを含む、請求項２２または２３に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  25. 前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの前記１つまたは複数が、前記４－１ＢＢ（Ｃ
    Ｄ１３７）共刺激ドメインを含む、請求項２４に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  26. 前記共刺激ドメインのうちの前記１つまたは複数が、前記ＣＤ２８共刺激ドメインを含
    む、請求項２４または２５に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  27. 前記抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２０から２６のいずれか一項に記
    載のレンチウイルス移入ベクター。
  28. 前記抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１
    ；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１、ＣＤ３３；上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ
    （ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ
    受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（
    ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシ
    ンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３
    ）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原
    （ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ
    １１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２；メソテリン；イン
    ターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；
    プロテアーゼセリン２１；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ
    ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ
    特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン
    －タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵ
    Ｃ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスター
    ゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリン
    Ｂ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体
    （ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、
    マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１
    ００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルスがん
    遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チ
    ロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉ
    ｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）
    ；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（Ｏ
    ＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍
    内皮マーカー７－関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホル
    モン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（
    ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ
    ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１
    （ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗
    原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（
    ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮ
    Ｘ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子
    座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディ
    ングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウイルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精
    巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原
    １（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座バリアント遺伝子６、１２ｐ染色体に位置（ＥＴＶ６
    －ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（Ｘ
    ＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣
    抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ
    関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビ
    ン(surviving)；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１、Ｔ細胞によって認識される黒色
    腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；
    肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテ
    アーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル
    －トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）
    ；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃニワトリ骨芽球腫ウイルスがん遺伝
    子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（Ｒｈ
    ｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（
    ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ－結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞によ
    って認識される扁平上皮細胞癌腫抗原３（ＳＡＲＴ３）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ
    －５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ
    球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（Ａ
    ＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１
    ）；腎臓偏在１（ＲＵ１）；腎臓偏在２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイル
    スＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸内カルボキ
    シルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；
    ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１
    ）；ＩｇＡのＦｃフラグメントの受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブ
    リン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリ
    ーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（Ｃ
    ＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホ
    ルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰ
    Ｃ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド
    １（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原に結合する、請求項２０から２７のいず
    れか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  29. 前記抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、メソテリン、またはＣＤ１２３に結合する、請
    求項２８に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  30. 前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜
    貫通ドメイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１９から２９
    のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  31. ５’から３’に、作動可能なつながりで、以下のエレメント：
    プロモーター、
    主要スプライスドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル（プシー）、
    部分的ｇａｇ配列、
    部分的ｅｎｖ配列、
    Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
    スプライスアクセプター部位（ＳＡ７）を含む部分的ｅｎｖ配列、
    スプライスアクセプター部位（ＳＡ１）を含むセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ
    ）、
    構成的スプライスドナー部位（ＣＤ）および構成的スプライスアクセプター部位（ＣＤ）
    を含むＥＦ１ａプロモーター、
    任意選択で、ＥＧＦＰをコードする遺伝子および／または異種核酸配列、ならびに
    転写後制御エレメント
    のうちの１つまたは複数を含む、レンチウイルス移入ベクター。
  32. ５’から３’に、作動可能なつながりで、以下のエレメント：
    ＣＭＶプロモーター、
    ＬＴＲ Ｒ領域、
    ＬＴＲ Ｕ５領域、
    プライマー結合部位（ＰＢＳ）、
    主要スプライスドナー部位（ＳＤ）を含むパッケージングシグナル（プシー）、
    部分的ｇａｇ配列、
    部分的ｅｎｖ配列、
    Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、
    スプライスアクセプター部位（ＳＡ７）を含む部分的ｅｎｖ配列、
    スプライスアクセプター部位（ＳＡ１）を含むセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ
    ）、
    ＥＦ１ａプロモーター、
    任意選択で、ＥＧＦＰをコードする遺伝子および／または異種核酸配列、
    転写後制御エレメント、
    ＬＴＲ Ｒ領域、
    ＬＴＲ Ｕ５領域、
    ＳＶ４０ポリＡ尾部、
    カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ならびに
    ｐＵＣ複製起点
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  33. 前記転写後制御エレメントが、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）または
    Ｂ型肝炎ウイルス分離株ｂｂａ６ ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）を含む、請求項３１または３２に
    記載のレンチウイルス移入ベクター。
  34. 前記異種核酸配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項３１から３３
    のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター。
  35. 前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜
    貫通ドメイン、およびＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項３４に記載の
    レンチウイルス移入ベクター。
  36. 請求項１から３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクターを含む、宿主細
    胞。
  37. 前記宿主細胞が、２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、または初代ヒトＴ細胞である
    、請求項３６に記載の宿主細胞。
  38. １つまたは複数のレンチウイルスパッケージングベクターをさらに含む、請求項３６ま
    たは３７に記載の宿主細胞。
  39. 請求項１から３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクターおよび１つまた
    は複数のパッケージングベクターを含む、組成物。
  40. 異種核酸配列を発現することができるレンチウイルスを産生する方法であって、
    （ａ）細胞に、
    （ｉ）請求項１から３５のいずれか一項に記載のレンチウイルス移入ベクター、および
    （ｉｉ）１つまたは複数のレンチウイルスパッケージングベクター
    を導入するステップと、
    （ｂ）前記細胞において、前記レンチウイルス移入ベクターおよび／または前記パッケー
    ジングベクターによってコードされるウイルスタンパク質を発現させ、それによって、前
    記レンチウイルス移入ベクターの異種核酸配列を含むレンチウイルスを産生するステップ
    と
    を含む、方法。
  41. 前記細胞が、２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、または初代ヒトＴ細胞である、請
    求項４０に記載の方法。
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