CN102718869A - 一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球及其制备方法，包括疏水性的纳米级或微米级的微球，微球表面上呈递有递免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通过亲脂蛋白或疏水结合结构域与微球相连接。既可作为一种新型人工抗原提呈系统的共刺激分子呈递部分，也可以单独的作为提高机体免疫激活效果的固定化免疫共刺激因子使用。

Description

一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及人工抗原递呈技术领域，涉及一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球及其制备方法。

背景技术

癌症是世界范围内仅次于心血管疾病的第二大严重威胁人类健康和生命的疾病，随着分子生物学、免疫学和生物工程技术的快速发展，肿瘤免疫治疗正成为继肿瘤手术治疗和放化疗之后的另一种新的治疗手段，免疫治疗的目的在于使机体产生有效的细胞介导的免疫反应从而治愈疾病，对感染性疾病和抗肿瘤而言是一种非常有前景的治疗方法。

一般认为机体抗肿瘤免疫反应中起重要作用的是细胞免疫，以T淋巴细胞为核心。T细胞的活化、增殖及分化为效应细胞需要接受来自抗原提呈细胞（antigen-presenting cells,APC）所提供的双重刺激信号：一是T细胞受体（T cell receptor,TCR）与APC表面的MHC-抗原肽复合物的特异性识别和结合；二是APC和T细胞表面的多种共刺激分子和黏附分子之间（如B7/CD28，LFA-1/ICAM-1，CD2/LFA-3或4-1BBL/4-1BB等）的相互作用。这些共刺激分子及其受体在T细胞与APC相互作用时，以TCR:MHC-抗原肽复合体为中心聚集在一起，形成一种称为免疫突触的超分子结构，成为T细胞活化信号传递的通道。

免疫共刺激分子是诱发机体有效的细胞免疫反应所必需的，目前已知的有B7-1、B7-2、B7-H4分子等，肿瘤细胞常常缺失B7这一类共刺激分子。B7-1和B7-2作为表达在抗原呈递细胞表面的主要的共刺激因子，均可与表达在淋巴细胞表面的配体CD28或CTLA-4结合来发挥作用。很多具有正常免疫力的宿主并不能有效排除体内的高免疫原性肿瘤，可能是由于肿瘤细胞缺乏T细胞活化的共刺激信号，如肿瘤细胞常常缺失B7这一类共刺激分子，从而使CTLs不能有效地对肿瘤产生免疫应答，如果给该肿瘤细胞转染B7基因（CD80/CD86），则可有效地激发T细胞介导的抗肿瘤免疫。研究表明，肿瘤细胞本身可通过减少B7-1、B7-2的表达，使得T细胞克隆无能；通过上调抑制性B7-H4分子的表达，诱导肿瘤的免疫逃逸。

因此，进行免疫共刺激因子的有效呈递是激活肿瘤免疫反应的一个关键。游离性基因工程表达的免疫共刺激分子同样可以参与免疫活化过程，但游离的蛋白在体内血浆清除率高，且作用缺乏特异性。

树突状细胞（dendritic cells,DC）是体内主要的抗原呈递细胞之一，作为免疫系统中最强的APC，其可在体内或体外作为免疫共刺激分子的天然载体参与免疫活化过程。但DC细胞的使用也有诸多局限性，如DC分离培养困难，耗时长、成本高，获得DC的数量和质量往往也不够稳定，且由于其表面的免疫共刺激因子种类多样，因此其表面共刺激分子的特异性和复杂性都难于控制。有学者采用胞外体（exosome，ES）代替DC细胞，但同样由于其表达多种T细胞共刺激分子，无法保持共刺激分子的特异性，增加了提呈的复杂性，降低了其特异性和稳定性。为解决这一问题，近年来建立的人工抗原提呈技术利用表面携带有特定共刺激分子的人工抗原提呈细胞（artificial antigen presenting cells，AAPC）为抗原特异性T细胞提供刺激信号，有效的刺激了T细胞的活化增殖。

人工抗原提呈细胞是将MHC-抗原肽复合物及共刺激分子或者粘附分子展现在某种载体表面，通过与T细胞表面的受体有效识别和结合达到活化淋巴细胞的目的。目前制备的AAPC可分为以细胞性的AAPC和非细胞性的AAPC。细胞性AAPC主要是以细胞为载体，通过基因改造的方法在细胞表面偶联共刺激分子，引发特异性免疫反应，活化T细胞。常用的有K562细胞、K32细胞、鼠成纤维细胞等。但是，由于细胞性的AAPC在制备过程中对细胞基因的改造过程繁琐，多采用逆转录病毒转染技术而存在一定的安全隐患，且其载体细胞也多为异种细胞，因而目前细胞性APCC仅适合于体外应用，体内运用的远期效果和安全性评价还有待进一步研究。

非细胞性的AAPC则指的是在人工载体表面交联不同的MHC-抗原肽复合物及共刺激分子。目前常用的人工载体包括磁珠、脂质体和乳胶微球等。其表面可直接或间接交联各种共刺激分子。由于磁珠的制备比较昂贵，也有人用细胞大小的聚乙烯乳胶微球外包被抗体层偶联相应的肽四聚体或二聚体及共刺激分子作为人工APC。但目前非细胞性人工载体进行共刺激分子的呈递也有其局限性。其制备过程需要采用化学交联或生物素亲和素修饰，工艺过程相对复杂，且容易有化学物残留等安全问题。脂质体是另一种可用于免疫共刺激分子呈递的非细胞载体。脂质体是由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成的纳米级颗粒。1998年van Rensen等率先以脂质体为载体融人HSP65-鼠MHC Ⅱ复合物，构建成人工APC，不仅能特异性地激活T细胞，还能诱导IL-2分泌。2000年Prakken等研究发现，脂质体构建的人工APC能与T细胞作用形成免疫突触，可鉴别和活化T细胞，提示脂质体人工APC可用于肿瘤的免疫治疗。以脂质体为载体构建的人工APC可在体外大量制备，易于控制质量。但脂质体的使用在包封率、稳定性及靶向分布等方面存在一些问题，而且由于常规工艺生产规模难以放大，且需要大量使用有机溶剂，难以保证产品的安全性，导致其大量应用受到限制。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球及其制备方法，利用负载免疫共刺激分子的疏水颗粒与目标细胞的有效识别与结合，实现免疫激活作用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球，包括疏水性的纳米级或微米级的微球，微球表面上呈递有递免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通过亲脂蛋白或疏水结合结构域与微球相连接。

所述的免疫共刺激分子与亲脂蛋白或疏水结合结构域是由融合基因表达并纯化的融合蛋白，免疫共刺激分子与亲脂蛋白或疏水结合结构域之间还设有连接肽；

融合蛋白通过亲脂蛋白或疏水结合结构域与疏水性的微球表面的相互作用，将免疫共刺激分子固定化呈递于微球表面。

所述的微球是由疏水性高分子材料制备的，疏水性高分子微球材料为PHA，由聚羟基丁酸酯、聚羟基辛酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯、羟基丁酸-羟基己酸共聚酯、羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯、羟基丁酸-羟基戊酸-羟基己酸共聚酯中的一种或几种聚合而成；

或者疏水性高分子微球材料为聚乳酸、羟基己酸和乳酸共聚物中的一种；

或者疏水性高分子微球材料为聚己内酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酯、聚己二醇中的一种或几种聚合物组成。

所述的亲脂蛋白为PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一种，所述的疏水结合结构域为PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中疏水结合结构域中的一种。

所述的免疫共刺激分子选自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、ICOS中的一种或几种。

所述的连接肽的长度为10～15个氨基酸残基。

所述的微球为由可降解的疏水性PHA材料制成，所述的融合蛋白为B7-2-PhaP，连接肽为G4SG3SG2S。

一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球的制备方法，包括以下步骤：

1）免疫共刺激分子-亲脂蛋白融合蛋白的构建：分别扩增待呈递的免疫共刺激分子、亲脂蛋白的核苷酸序列，并通过PCR扩增技术将两者通过连接肽连接得到融合基因；然后通过基因的剪切和连接，构建成表达载体并在转染宿主细胞，诱导表达载体在宿主细胞中表达；裂解细胞并通过蛋白提纯得到免疫共刺激分子-亲脂蛋白融合蛋白；

2）疏水性微球的构建：将PVA溶液至于冰浴中，然后加入溶解有高分子疏水材料聚合物的氯仿溶液，超声处理5～10min后，再在磁力搅拌器上温和搅拌5～10h，离心收集微球，并用水充分洗涤；最后用水重悬微球；

3）负载结合：将融合蛋白用水溶解后，加入到微球的悬浮液中，混匀，4℃搅拌过夜；离心，收集微球，得到融合蛋白负载的微球。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，是利用生物可降解的疏水性高分子材料制备微米或纳米微球，将亲脂蛋白与目标免疫共刺激分子进行融合表达，通过亲脂蛋白与疏水材料颗粒表面的相互作用，将免疫共刺激分子固定化表达呈递于疏水材料颗粒表面，既可作为一种新型人工抗原提呈系统的共刺激分子呈递部分，也可以单独的作为提高机体免疫激活效果的固定化免疫共刺激因子使用。

本发明提供的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，选用人工可降解的、生物相容性高的高分子材料制备微球，所以得该系统具有良好的生物相容性和生物安全性；而将亲脂蛋白的编码基因和各种免疫共刺激分子编码基因通过基因工程操作分别进行融合表达，这样通过融合基因的构建，就可以实现多种免疫共刺激分子的递呈，实现递呈分子的多样化；进一步，还可以在同一微球表面上递呈多种免疫共刺激分子，提高对免疫细胞的刺激。

本发明利用能与疏水性高分子材料很好结合的亲脂蛋白，通过其与免疫共刺激分子融合表达，可以有效的将免疫共刺激分子固定化呈递在高分子材料微球表面。这样就省去了化学交联法的繁琐工艺，避免了交联过程中可能造成的蛋白质变性或化学物质残留的问题。也不需要对载体或融合蛋白进行生物素或亲和素的修饰后再进行融合蛋白固定化，因此具有简便、快捷、低成本的特点。

在优选的实施方案中，本发明采用的疏水性PHA材料作为微球载体进行免疫共刺激分子的固定化，由于PHA是一种具有良好生物相容性的生物可降解材料，其在生物体内可被完全降解成二氧化碳和水，不存在体内长期蓄积的隐患，因此，具有良好的安全性，具备体内应用前景。

在另一些优选的实施方案中，本发明利用聚乳酸(PLA)，羟基己酸和乳酸共聚物(PLGA)，聚己内酯(PCL)等常见的疏水性材料作为免疫共刺激分子固定化呈递载体，因其价格更为低廉且更易获得，可以使本发明所述的免疫共刺激分子固定化呈递系统具有更广泛的应用前景。

附图说明

图1是免疫共刺激分子固定化呈递系统模式图；

图2中的A、B、C分别是B7-2、PhaP、B7-2-PhaP基因的扩增图谱；

图3是表达载体pGEX-B72-P的质粒图谱；

图4中的A、B分别是B7-2-PhaP基因表达后的PCR鉴定结果和双酶切鉴定结果图；

图5为B7-2-PhaP融合蛋白表达SDS-PAGE检测图；

图6为B7-2-PhaP融合蛋白表达后Western Blot鉴定图；

图7为B7-2-PhaP融合蛋白与PHA纳米颗粒结合情况的Western Blot检测图；

图8为负载B7-2-PhaP蛋白的PHA纳米颗粒对人淋巴细胞体外增殖的影响图。

具体实施方式

本发明提供的一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球。参见图1，首先亲脂性蛋白和免疫共刺激分子通过基因工程表达成为一个一段亲脂性的融合蛋白，然后通过亲脂蛋白结构域与疏水性材料的吸附作用黏附在可降解微纳米颗粒表面，成为免疫共刺激分子固定化表达呈递的载体。以固定化的T细胞活化第二信号参与免疫激活过程，利用负载免疫共刺激分子的疏水颗粒与目标细胞的有效识别与结合，实现免疫激活作用。

在上述三个环节中，微球要求是疏水性、良好生物相容性、可降解的材料即可。其中，疏水性一方面是为了能够与亲脂蛋白黏附，另一方面是为了在接近细胞时能够与细胞膜相互作用，便于抗原递呈。而生物相容性、可降解是为了提高安全性的考虑。在具体的材料选择上可以为：PHA、聚乳酸(PLA)、羟基己酸和乳酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)；

PHA，由聚羟基丁酸酯、聚羟基辛酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯、羟基丁酸-羟基己酸共聚酯、羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯、羟基丁酸-羟基戊酸-羟基己酸共聚酯中的一种或几种聚合而成；

聚乳酸、羟基己酸和乳酸共聚物中的一种；

聚己内酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酯、聚己二醇中的一种或几种聚合组成。

免疫共刺激分子选自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、ICOS中的一种或几种，请说明免疫共刺激分子选择的理由

亲脂蛋白为PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一种，这些蛋白含有能够和疏水性高聚物非特异结合的疏水结合结构域，可作为蛋白固定化呈递于高聚物表面的介导分子。

下面结合具体的PHA、B7-2、PhaP组合的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本领域技术人员能够对满足三个环节的要求的材料进行组合。

1、免疫共刺激分子-亲脂蛋白融合蛋白表达载体的构建

1.1PCR扩增人B7-2基因和phaP序列

根据NCBI上登陆号为NC_000003.11和AM260479.1的人B7-2基因和phaP基因DNA序列设计引物p1/p2、p3/p4，分别扩增编码人B7-2胞外端的基因(52-672bp)和编码PhaP的基因(10-580bp)。

根据重叠延伸法设计引物：在B7-2胞外端的下游引物p2和phaP的基因上游引物p3之间有16bp的重复序列，包含一个由36个碱基编码的12个氨基酸的柔性linker(G4SG3SG2S)，使phaP基因和B7-2基因用该linker连接在一起。引物如下所示：

P 1：GCGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC；

P2：ACCAGAGCCACCTCCTGAACCGCCTCCACCTGTAATCCAAGGAATG；

P3：GGTTCAGGAGGTGGCTCTGGTGGATCGCTCACCCCGGAACAAGTT；

P4：CGCTCGAGAGCCGTCGTCTTCTTTGCCGT；

PCR反应体系（25μl）：5×Primer STAR buffer 5μl，dNTP Mix 2μl，p10.5μl，p20.5μl，Primer STAR0.3μl，DDW15.7μl，B7-2(IgV+C)/TEasy1μl。

以含人B7-2序列的B7-2(IgV+C)/TEasy质粒为模板，克隆B7-2胞外区。

B7-2胞外区亚克隆PCR反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性1min、76.9℃退火1min、72℃延伸1min，扩增30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。

以提取到的带有phaP基因的pP'PI-EGFP（由清华大学生命科学院陈国强教授惠赠）为模板扩增phaP基因。

phaP基因亚克隆PCR反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性1min、83℃退火1min、72℃延伸1min，扩增30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。

1.2重叠延伸PCR法拼接B7-2和phaP编码序列

分别回收纯化的上述PCR扩增的B7-2和phaP片段，然后按1∶1的摩尔比例混合物互为模板和引物，利用重叠延伸PCR扩增全长的B7-2-PhaP。

PCR反应体系（25μl）为：5×Primer STAR buffer 5μl，dNTP Mix 2μl，B7-21μl，phaP 1μl，Primer STAR 0.3μl，DDW 15.7μl；

PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃30s，61℃1.5min，72℃延伸1.5min，4个循环；第一次循环后两个片段在互补的部位会准确拼接并且延伸得到编码B7-2和phaP的两条完整的链，在后续的循环中以这两条链为模板，以p1/p4为引物，大量扩增B7-2-PhaP基因完整的编码序列。

上述B7-2、PhaP、B7-2-PhaP基因的扩增图谱分别如图2中的A、B、C、所示，其中泳道1为扩增的条带，泳道2为mark。

1.3重组基因B7-2-PhaP表达质粒pGEX-B72-P的构建

将扩增得到的B7-2-PhaP编码序列DNA片段用凝胶分离纯化后，经BamHI、XhoI限制性内切酶双酶切。同时用BamHI、XhoI双酶切表达载体pGEX-4T-3。胶回收PCR产物及线性表达载体酶切产物。将回收到的PCR产物和表达载体16℃连接过夜，构建表达载体pGEX-B72-P，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并对转化菌株做PCR及双酶切鉴定。

所构建的表达载体pGEX-B72-P的质粒图谱如图3所示，其中：LacPromoter：Lac启动子；GST Tag：GST标签；B7-2：免疫共刺激分子B7-2；PhaP：亲脂蛋白；Amp：氨苄青霉素抗性基因。免疫共刺激分子B7-2编码基因和亲脂蛋白PhaP编码基因插入到GST标签下游，在Lac启动子启动下表达出B7-2-PhaP融合蛋白。

1.3.1将pGEX-B72-P载体转化大肠杆菌DH5α：

取100μl感受态细胞，加入2μl待转连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。

将离心管42℃热激90s。快速将离心管放入到冰上，使其冷却2min。

每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，于37℃摇床低速培养1h。

低速离心，弃去约500μl上清，取剩余100μl菌液直接涂布于含50μg/mlAmp的LB固体培养皿上。

平板于37℃正向放置至液体被吸收，置平板于37℃培养12-16h。

1.3.2重组阳性克隆质粒的筛选

用灭菌牙签挑取转化平板中的菌落10个，接种于含有50μg/ml Amp的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。

碱裂解法提取质粒。

重组pGEX-B72-P质粒的PCR鉴定：以提取的质粒为模板，p1、p4为引物，做PCR扩增检测，反应条件和体系同重叠延伸PCR法扩增B7-2-PhaP融合基因。0.7%琼脂糖凝胶泳分析PCR结果。PCR鉴定结果如图4中的A所示，其中泳道1为Marker，泳道2为B7-2-PhaP扩增产物，其大小为1290bp。

酶切鉴定：对pGEX-B72-P质粒用限制性内切酶BamHI、XhoI做双酶切鉴定。室温酶切过夜，0.7%琼脂糖凝胶电泳分析双酶切结果。酶切验证电泳图如图4中的B所示，其中泳道1为BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，泳道2为Marker；重组质粒pGEX-B72-P经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后，得到大小为1290bp和4900bp左右的两条带，和质粒理论大小一致。

1.3.5重组质粒pGEX-B72-P的序列测定及分析

PCR及双酶切初步鉴定正确后，将含重组质粒pGEX-B72-P的阳性菌株送上海奥科生物技术公司进行测序。融合基因的序列如SEQ.ID.NO.1所示测序结果表明所构建的载体序列正确。

2、B7-2-PhaP融合蛋白的原核表达及分离纯化

2.1在表达宿主E.coIi BL21(DE3)内的诱导表达

含pGEX-B72-P质粒的表达载体在宿主菌中被异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，将构建成功的重组质粒pGEX-B72-P通过常规CaCl₂法转化到表达宿主大肠杆菌E.coIi BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，37℃2×YT培养至OD600值0.6左右，加入IPTG至终浓度0.4mM\L，237rpm30℃摇床培养5h，裂解菌体，SDS-PAGE检测，观察目的蛋白表达情况。

2.2B7-2-PhaP蛋白的SDS-PAGE检测及鉴定

收集0.5ml菌体，加入20ulPBS重悬，与20ul 2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，煮沸10min，进行8%SDS-PAGE全菌蛋白电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：安装Bio-Rad电泳装置，灌制5%积层胶和下层8%分离胶，各需凝固约1h。将上述已制备好了的样品依顺序加样，每孔约20μl。电泳起始，调电压为90V，当染料前沿达分离胶后，调电压至110V，继续电泳至溴酚蓝染料前沿到达分离胶底部时，停止电泳。取下凝胶置于考马斯亮蓝染液中室温染色2-4小时，放入脱色液中脱色直至凝胶条带清晰、背景透明为止，观察电泳结果。

Western检测方法：首先进行8%SDS-PAGE，步骤同前，电泳结束后取出凝胶，依照彩虹Marker位置切取目的凝胶，利用Bio-Rad蛋白转印系统，依次序安装转印装置：阳极→垫片→滤纸→硝酸纤维素滤膜（NC膜）→凝胶→滤纸→垫片→阴极。安装过程中修整滤纸和NC膜，两边滤纸不能接触，凝胶最好大一些。内槽加入电转缓冲液，外槽加入部分冰块，转印电压70V，电流200mA，转印2h。转印结束后拆卸装置，NC膜用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2h,（为检查蛋白转印是否完全可将凝胶继续置于考马斯亮蓝染液中染色、脱色）用TBST缓冲液1：1000稀释的抗GST的小鼠IgG 4℃孵育过夜。孵育结束用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，之后用羊抗鼠IgG二抗室温孵育2h，TBST同样条件洗膜3次。最后在酶联生色底物中孵育1min，曝光。

2.3B7-2-PhaP蛋白的分离纯化

常规方法裂解菌体，12000g高速离心20min取上清备用。

利用GS4B（Glutathione Sepharose 4B）树脂纯化目的蛋白。

GS4B树脂的准备：取1.33ml GS4B树脂移入15ml离心管中，500g离心5min，弃上清。加入10倍体积预冷的PBS，清洗树脂，500g离心5min，弃上清。重复1次。加入1mlPBS，制备50％树脂悬液。

将菌体裂解离心后收集的上清液移入已准备好的树脂中，室温旋转孵育0.5h，500g离心5min，弃上清。

加入10倍体积预冷的PBS，轻柔混匀，洗涤树脂。500g离心5min，弃上清。重复2次。

加入2ml谷胱甘肽洗涤液，重悬树脂，室温轻柔混匀10min。500g离心5min，收集上清。重复三次。

将用透析袋承装的蛋白洗脱液放入1L 0.9%NaCl溶液中置于搅拌器上4℃透析，每隔3-4h换液一次，至少透析24h。之后将透析袋放入PEG20000浓缩，得到纯化后的融合蛋白B7-2-PhaP，置于冷冻干燥机冷冻干燥备用。

图5及图6显示了B7-2-PhaP融合蛋白的表达、分离纯化及Western鉴定情况。图5中泳道1为含pGEX-B72-P质粒的阳性克隆经诱导表达后菌体裂解蛋白电泳条带；泳道2为含pGEX-4T-3空载体菌株GST纯化条带；泳道3、4为阳性克隆菌体裂解后上清蛋白经GS4B树脂纯化产物电泳条带；泳道5为空白E.coli BL21裂解后蛋白纯化条带；泳道6为蛋白Marker条带。可见泳道3，4纯化得到单一的条带，且大小与目的蛋白相符。由图3所示，诱导菌体及经GST柱纯化后的样品中存在一条相对分子质量约80000的蛋白富集条带，可知有目的蛋白表达。只含空质粒pGEX-4T-3的阴性对照E.coIiBL21可见一条相对分子量约26000的蛋白条带，表明GST表达正常。

图6中泳道1、2为含pGEX-B72-P质粒的阳性克隆经诱导表达后菌体裂解物与抗GST标签抗体孵育后检测得到的条带；泳道3为空白E.coli BL21菌体裂解物与抗GST标签抗体孵育后的检测结果。泳道1、2中可见明显的杂交条带，说明其中含有B7-2-PhaP融合蛋白。

上述检测表明，在对pGEX-B72-P质粒的阳性克隆经诱导表达后产生了B7-2-PhaP融合蛋白，经过菌体裂解后上清蛋白分离纯化后得到了纯度较高的B7-2-PhaP融合蛋白。

3、负载B7-2-PhaP的PHA（聚羟基脂肪酸酯）纳米颗粒的制备

3.1PHA纳米颗粒的制备

称取2g分子量10000的PVA（聚乙烯醇），溶解在200ml双蒸水中，配成1%PVA（w/v），0.45μm滤器过滤，备用。

将20mg的聚合物PHA加入1ml氯仿中，搅拌溶解。

取5ml 1%PVA冰浴中超声，用注射器缓慢加入1ml溶解有PHA的氯仿溶液，超声处理5min后（20kHz，40%最大功率），将分散的溶液在磁力搅拌器上温和搅拌6h。

18000g下离心10min收集纳米颗粒，并用双蒸水洗涤两次后重悬于5ml双蒸水中。0.45μm滤器过滤，定容。

3.2纯化B7-2-PhaP融合蛋白与PHA纳米颗粒结合

将冻干粉状B7-2-PhaP融合蛋白用双蒸水溶解，终浓度为90μg/ml，将4ml融合蛋白溶液加入到1ml浓度为2mg/ml的PHA颗粒溶液中，轻柔混匀，4℃搅拌过夜。

将搅拌过夜的混合液12000g离心30min，弃上清，沉淀用双蒸水洗两次，即得负载B7-2-PhaP蛋白的PHA纳米颗粒。

将所得负载B7-2-PhaP蛋白的PHA纳米颗粒与SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5min，12000g离心3min，取上清进行SDS-PAGE电泳及Western检测。

检测结果如图7所示，泳道1，2为与PHA颗粒共同孵育之前的B7-2-PhaP蛋白样品；泳道3，4为B7-2-PhaP与PHA纳米颗粒孵育后颗粒表面结合的蛋白条带；泳道5，6为B7-2-PhaP与PHA纳米颗粒孵育后上清中蛋白条带；泳道7为彩虹Marker条带。泳道3、4中可见明显的杂交条带，而泳道5、6中没有检测到明显的条带，说明融合蛋白经透析除盐后全部与颗粒结合，每毫克纳米颗粒至少可以结合180μg重组目的蛋白。

4、固定化免疫共刺激分子对淋巴细胞的免疫激活作用。

4.1淋巴细胞的分离培养

淋巴细胞的分离使用淋巴细胞分离液（PAN Biotech,Aidenbach,德国）。具体方法为：取2-3ml肝素抗凝静脉血，用PBS稀释1倍，混匀。沿管壁缓缓加入到10ml淋巴细胞分离液中，2000g水平离心20min。吸取中间灰白色层即单个核细胞层，移入另一离心管中。加入5倍以上体积的PBS液混匀，离心1500g，10min，弃上清。同样方法重复洗一次。最后用1640营养液配制成1-2×10⁶/ml细胞悬液。

4.2固定化免疫共刺激分子对淋巴细胞增殖的影响

取96孔板每孔加100μl(1-2×10⁵细胞)细胞悬液进行淋巴细胞培养（培养基为1640营养液），置37℃、5%CO₂培养箱培养，各孔分别加入植物血凝素，anti-CD3抗体，anti-CD3+GST，B7-2-PhaP，anti-CD3+B7-2-PhaP，B7-2-PhaP-NP，anti-CD3+B7-2-PhaP-NP和不携带B7-2-PhaP融合蛋白的空白纳米颗粒（NP）对淋巴细胞进行处理。

培养72h后每孔加MTT溶液20μl，继续孵育4h，终止培养。500g离心10min，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加200μl DMSO，于微孔板振荡器振荡10min，使结晶物充分融解。选择570nm波长，并以630nm作为参考波长在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。

淋巴细胞增殖情况如图8所示，体外分离培养的人外周血淋巴细胞按1×10⁴个/孔接种于96孔板中，分别进行不同处理后并在体外培养72小时后进行MTT检测。1组为体外培养的对照组淋巴细胞，将其设为100%；2组添加了植物血凝素（1/256稀释）培养的淋巴细胞相对增殖活力，其作为阳性对照，说明体外分离培养的淋巴细胞经适当刺激能够发生体外增殖；3组添加了抗CD3抗体；4组添加了PHA纳米颗粒；5组添加了负载B7-2-PhaP的PHA纳米颗粒；6组添加了负载B7-2-PhaP的PHA纳米颗粒+抗CD3抗体。**代表P≤0.01

由图中可以看出，体外培养的淋巴细胞经植物血凝素（1/256稀释）刺激能够得以增殖，说明淋巴细胞活力良好，而单独采用抗CD3抗体不能使淋巴细胞发生明显的体外增殖。空白PHA纳米颗粒、负载B7-2-PhaP的PHA纳米颗粒以及负载B7-2-PhaP的PHA纳米颗粒加抗CD3抗体共同刺激均可以使淋巴细胞在体外大量增殖，能够有效激活淋巴细胞。且负载B7-2-PhaP的PHA纳米颗粒加抗CD3抗体对淋巴细胞体外扩增的程度最高。

由结果可知，固定化呈递于PHA纳米颗粒上的免疫共刺激分子能够刺激淋巴细胞增殖，当使用抗CD3抗体作为T细胞活化的第一信号时，淋巴细胞的活化增殖被进一步加强。由此可以说明，本发明所述的免疫共刺激分子固定化表达呈递系统可以作为淋巴细胞活化的信号增强体外培养淋巴细胞的活化增殖。

Claims (8)

1.一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，包括疏水性的纳米级或微米级的微球，微球表面上呈递有递免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通过亲脂蛋白或疏水结合结构域与微球相连接。

2.如权利要求1所述的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的免疫共刺激分子与亲脂蛋白或疏水结合结构域是由融合基因表达并纯化的融合蛋白，免疫共刺激分子与亲脂蛋白或疏水结合结构域之间还设有连接肽；

融合蛋白通过亲脂蛋白或疏水结合结构域与疏水性的微球表面的相互作用，将免疫共刺激分子固定化呈递于微球表面。

3.如权利要求1或2所述的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的微球是由疏水性高分子材料制备的，疏水性高分子微球材料为PHA，由聚羟基丁酸酯、聚羟基辛酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯、羟基丁酸-羟基己酸共聚酯、羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯、羟基丁酸-羟基戊酸-羟基己酸共聚酯中的一种或几种聚合而成；

或者疏水性高分子微球材料为聚乳酸、羟基己酸和乳酸共聚物中的一种；

或者疏水性高分子微球材料为聚己内酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酯、聚己二醇中的一种或几种聚合物组成。

4.如权利要求1或2所述的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的亲脂蛋白为PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一种，所述的疏水结合结构域为PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中疏水结合结构域中的一种。

5.如权利要求1或2所述的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的免疫共刺激分子选自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、ICOS中的一种或几种。

6.如权利要求2所述的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的连接肽的长度为10～15个氨基酸残基。

7.如权利要求2所述的固定化呈递免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的微球为由可降解的疏水性PHA材料制成，所述的融合蛋白为B7-2-PhaP，连接肽为G4SG3SG2S。

8.一种固定化呈递免疫共刺激分子的微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）免疫共刺激分子-亲脂蛋白融合蛋白的构建：分别扩增待呈递的免疫共刺激分子、亲脂蛋白的核苷酸序列，并通过PCR扩增技术将两者通过连接肽连接得到融合基因；然后通过基因的剪切和连接，构建成表达载体并在转染宿主细胞，诱导表达载体在宿主细胞中表达；裂解细胞并通过蛋白提纯得到免疫共刺激分子-亲脂蛋白融合蛋白；

2）疏水性微球的构建：将PVA溶液至于冰浴中，然后加入溶解有高分子疏水材料聚合物的氯仿溶液，超声处理5～10min后，再在磁力搅拌器上温和搅拌5～10h，离心收集微球，并用水充分洗涤；最后用水重悬微球；

3）负载结合：将融合蛋白用水溶解后，加入到微球的悬浮液中，混匀，4℃搅拌过夜；离心，收集微球，得到融合蛋白负载的微球。

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