BR112021010297A2 - Edição de genomas multiplexadores de células imunes para aumentar a funcionalidade e resistência ao ambiente supressivo - Google Patents

Edição de genomas multiplexadores de células imunes para aumentar a funcionalidade e resistência ao ambiente supressivo Download PDF

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Abstract

EDIÇÃO DE GENOMAS MULTIPLEXADORES DE CÉLULAS IMUNES PARA AUMENTAR A FUNCIONALIDADE E RESISTÊNCIA AO AMBIENTE SUPRESSIVO. A presente invenção refere-se a métodos para a produção de células imunes com desrupção de múltiplos genes. São ainda fornecidos métodos para inserir um receptor de antígeno quimérico em um lócus do gene de uma célula imune.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EDIÇÃO
DE GENOMAS MULTIPLEXADORES DE CÉLULAS IMUNES PARA AUMENTAR A FUNCIONALIDADE E RESISTÊNCIA AO AMBIENTE SUPRESSIVO". ANTECEDENTES
[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de série 62/772.406, depositado em 28 de novem- bro de 2018, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
1. Campo Técnico
[002] A presente invenção refere-se de uma forma geral aos campos da imunologia, biologia celular, biologia molecular e medicina. Mais particularmente, diz respeito à edição multiplex de células imunes e métodos de uso das mesmas.
2. Descrição da Técnica Relacionada
[003] A imunoterapia celular se mantém muito promissora para o tratamento do câncer. No entanto, a maioria das abordagens imunote- rapêuticas quando aplicadas isoladamente são de valor limitado contra a maioria das doenças malignas, especialmente tumores sólidos. As razões para este sucesso limitado incluem a expressão reduzida de antígenos tumorais na superfície das células tumorais, o que reduz sua detecção pelo sistema imunológico, a expressão de ligantes para receptores inibidores tais como PD1, NKG2A, TIGIT ou CISH que in- duzem a inativação de células imunes; e a indução de células (por exemplo, células T reguladoras ou células supressoras derivadas de mieloide) no microambiente que liberam substâncias tais como o fator de transformação do crescimento transformante-β (TGFβ) e adenosina que suprimem a resposta imune e promovem a proliferação e sobrevi- vência de células tumorais. Assim, existe uma necessidade não aten- dida com relação a métodos melhorados de imunoterapia celular.
SUMÁRIO
[004] A descrição fornece composições e métodos relacionados à imunoterapia contra o câncer, particularmente incluindo células imunes projetadas. As modalidades específicas tratam de certas células imu- nes que foram modificadas pela mão do homem para não terem ex- pressão ou terem expressão reduzida de um, dois ou mais genes e, em casos específicos, as células com tais modificações também ex- pressam uma ou mais proteínas heterólogas, incluindo proteínas não naturais tais como receptores de antígenos. Também estão incluídos métodos de produção de células imunes não naturais. Em certos ca- sos, a introdução do receptor de antígeno heterólogo ocorre no lócus genômico de um gene sendo reduzido ou eliminado na expressão.
[005] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um mé- todo in vitro para a disrupção de pelo menos dois genes em uma célu- la imune, em que pelo menos dois genes são selecionados do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, e uma combinação dos mes- mos. Em aspectos específicos, três, quatro, cinco ou seis ou mais ge- nes são interrompidos. Em aspectos específicos, a disrupção de dois ou mais genes é simultânea, tal como na mesma etapa do método. O método pode compreender a introdução de um RNA guia (gRNA) para cada gene na célula imune.
[006] O método pode compreender a redução da expressão de combinações particulares de genes, tais como os seguintes, por exemplo: (a) NKG2A e CISH, (b) NKG2A e TGFBRII, (c) CISH e TGFBRII, (d) TIGIT e FOXO1, (e) TIGIT e TGFBRII, (f) CD96 e FO- XO1, (g) CD96 e TGFBRII, (h) FOXO1 e TGFBRII, (i) CD96 e TIGIT, (j) CISH e TIGIT, (k) TIM3 e CISH, (l) TIM3 e TGFBRII, (m) FOXO1 e TGFBRII, (n) TIM3 e TIGIT, (o) SIGLEC7 e CISH, (p) SIGLEC7 e
TGFBRII, (q) CD47 e CISH, (r) CD47 e TGFBRII, (s) SIRPA e CISH, (t) SIRPA e TGFBRII, (u) CD47 e TIGIT, (v) CD47 e SIRPA, (w) A2AR e CISH, (x) A2AR e TGFBRII, (y) ADAM17 e CISH, (z) TGFBRII e ADAM17, (a) A2AR e TIGIT, (b) SHP1 e CISH, (c) CISH e TGFBRII, (d) SHP1 e TGFBRII, (e) SHP1 e TIGIT ou (f) SHP1 e TIM3. O método pode compreender a redução da expressão de (1) NKG2A, CISH e TGFBRII, (2) TIGIT, FOXO1 e TGFBRII, (3) TGFBRII, CD96 e TIGIT, (4) TGFBR2, CISH e TIGIT, (5) TIM3, CISH e TGFBRII, (6) CD96, FO- XO1 e TGFBRII, (7) TGFBRII, TIM3 e TIGIT, (8) SIGLEC7, CISH e TGFBRII, (9) CD47, CISH e TGFBRII, (10) SIRPA, CISH e TGFBRII, (11) TGFBRII, CD47 e TIGIT, (12) TGFBRII, CD47 e SIRPA, (13) A2AR, CISH e TGFBRII, (14) TGFBRII, CISH e ADAM17, (15) TGFBRII, TIM3 e TIGIT, (16) TGFBRII, A2AR e TIGIT, (17) SHP1, CISH e TGFBRII, (18) TGFBRII, CISH e SHP1, (19) TGFBRII, SHP1 e TIGIT ou (20) TGFBRII, SHP1 e TIM3. Qualquer um dos subgrupos acima pode ser combinado com um segundo subgrupo conforme di- vulgado acima. Por exemplo, qualquer um dos subgrupos a-j1 pode ser combinado com qualquer um ou mais dos outros subgrupos a-j1, qualquer um ou mais dos subgrupos a-j1 podem ser combinados com qualquer um ou mais dos outros subgrupos 1-23, ou qualquer um ou mais dos subgrupos 1-23 podem ser combinados com qualquer um ou mais dos outros subgrupos 1-23.
[007] Em alguns aspectos, o método ainda compreende a intro- dução na célula de uma endonuclease guia de RNA, tal como Cas9. A introdução da endonuclease guiada por RNA pode compreender a in- trodução de um ácido nucleico, tal como mRNA, que codifica a endo- nuclease guiada por RNA na célula imune.
[008] Em certos aspectos, a célula imune é uma célula T, célula NK, célula B, macrófago, célula T NK ou célula tronco. Em casos alter- nativos, a célula imune não é uma célula T, não incluindo uma célula T do CAR. Em alguns aspectos, a célula imune é projetada para expres- sar um ou mais receptores de antígenos quiméricos (CAR) e/ou um ou mais receptores de células T (TCR). A célula imune pode ser específi- ca do vírus, tal como uma célula T específica do vírus. A célula T pode ser uma célula T reguladora. A célula B pode ser uma célula B regula- dora. Em alguns aspectos, a célula tronco é uma célula tronco mesen- quimal (MSC) ou uma célula tronco pluripotente induzida (iPS). Em aspectos particulares, a célula T é uma célula T CD8+, célula T CD4+ ou célula T gama-delta. A célula imune pode ser isolada do sangue periférico, sangue do cordão umbilical, medula óssea ou uma mistura dos mesmos. Em alguns aspectos, o sangue do cordão umbilical é co- letado de 2 ou mais unidades individuais de sangue do cordão umbili- cal.
[009] Em alguns aspectos, uma etapa de introdução compreende a transfecção ou transdução. Por exemplo, a introdução compreende eletroporação que pode ser executada mais de uma vez, tal como du- as ou três rodadas de eletroporação. Em alguns aspectos, um primeiro grupo de gRNAs de CRISPR é introduzido em uma primeira eletropo- ração e um segundo grupo de gRNAs de CRISPR é introduzido em uma segunda rodada de eletroporação. Em casos específicos, o pri- meiro grupo de gRNAs de CRISPR é diferente do segundo grupo de gRNAs de CRISPR. Em aspectos particulares, o primeiro grupo e/ou o segundo grupo de gRNAs de CRISPR compreende 1, 2, 3 ou 4 ou mais gRNAs de CRISPR. Em alguns aspectos, dois gRNAs de CRISPR são introduzidos em uma primeira eletroporação e dois gRNAs de CRISPR diferentes são introduzidos em uma segunda ro- dada de eletroporação. Nas modalidades específicas, um grupo de gRNAs de CRISPR compreende um grupo de gRNAs, pelo menos dois dos quais têm como alvo genes diferentes; em modalidades parti- culares, cada grupo de gRNAs tem como alvo genes diferentes.
[0010] Nos aspectos particulares, o método compreende a disrup- ção de NKG2A, CD47, TGFβR2 e CISH; NKG2A, CISH, TGFβR2 e ADORA2; NKG2A, TGFβR2 e CISH; TIGIT, CD96, CISH e ADORA2; ou ADAM17, TGFβR2, NKG2A e SHP1.
[0011] Em alguns aspectos, a disrupção resulta em citotoxicidade antitumoral aumentada, proliferação in vivo, persistência in vivo e/ou função melhorada da célula imune. Em aspectos particulares, a célula imune aumentou a secreção de IFN-γ, CD107 e/ou TNFα, em compa- ração com a ausência das modificações. Em alguns aspectos, a célula imune aumentou a produção de perforina e/ou granzima B, em compa- ração com a ausência das modificações.
[0012] Em aspectos adicionais, o método ainda compreende a in- trodução de um CAR e/ou TCR a uma célula imune, tal como a intro- dução de um ácido nucleico que codifica o CAR e/ou TCR na célula imune. Em alguns aspectos, o ácido nucleico está em um vetor de ex- pressão, tal como um vetor retroviral. Em certos aspectos, o vetor é um vetor viral adeno-associado, tal como AAV6. Em alguns aspectos, o vetor ainda compreende uma sequência gênica inibidora, tal como uma sequência gênica inibidora selecionada do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, e uma combinação dos mesmos. Nos aspec- tos particulares, o vetor ainda compreende um RNA guia para o gene inibidor. O CAR pode ser flanqueado por ramificações de homologia para o gene inibidor. Em alguns aspectos, a introdução do vetor que compreende a sequência de CAR resulta na inserção do CAR em um lócus do gene inibidor, como um éxon de um gene inibidor, na célula imune, de modo que o CAR esteja sob o controle do promotor endó- geno do gene inibidor. Nos aspectos particulares, a introdução do ve-
tor interrompe ainda mais a expressão do gene inibidor.
[0013] Em outra modalidade, é fornecida uma célula imune, tal como uma célula imune das modalidades divulgadas, com expressão interrompida de pelo menos dois genes na célula imune, produzida pelo menos através da etapa que compreende a introdução de um RNA guia de CRISPR (gRNA) para cada gene à dita célula imune, em que pelo menos dois genes são selecionados do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, e uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, três, quatro, cinco ou seis ou mais genes são interrompidos.
[0014] Em certos aspectos, a célula imune é uma célula T, célula NK, célula B ou célula tronco. Em alguns aspectos, a célula imune é projetada para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou receptor de células T (TCR). A célula imune pode ser específica do vírus, tal como uma célula T específica do vírus. A célula T pode ser uma célula T reguladora. A célula B pode ser uma célula B regula- dora. Em alguns aspectos, a célula tronco é uma célula tronco mesen- quimal (MSC) ou uma célula tronco pluripotente induzida (iPS). Em aspectos particulares, a célula T é uma célula T CD8+, célula T CD4+ ou célula T gama-delta. A célula imune pode ser isolada do sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou medula óssea. Em alguns aspectos, o sangue do cordão umbilical é coletado de 2 ou mais uni- dades individuais de sangue do cordão umbilical.
[0015] Nos aspectos particulares, o método compreende interrom- per grupos específicos de genes, tais como NKG2A, CD47, TGFβR2 e CISH; NKG2A, CISH, TGFβR2 e ADORA2; NKG2A, TGFβR2 e CISH; TIGIT, CD96, CISH e ADORA2; ou ADAM17, TGFβR2 NKG2A e SHP1.
[0016] Em alguns aspectos, a disrupção resulta em citotoxicidade antitumoral aumentada, proliferação in vivo, persistência in vivo e/ou função melhorada da célula imune. Nos aspectos particulares, a célula imune aumentou a secreção de IFN-γ, CD107 e/ou TNFα. Em alguns aspectos, a célula imune aumentou a produção de perforina e/ou granzima B.
[0017] Em alguns aspectos, a célula é projetada para expressar um CAR e/ou TCR. O CAR pode ser inserido em um lócus do gene inibidor endógeno da célula, e o lócus do gene inibidor é selecionado do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL- 2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, e uma combi- nação dos mesmos. Em alguns aspectos, o CAR está sob o controle do promotor endógeno do gene inibidor. Em certos aspectos, o CAR é inserido no lócus do gene inibidor através da edição do gene mediada por CRISPR.
[0018] Em alguns aspectos, o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno selecionado do grupo que consiste em F(ab')2, Fab', Fab, Fv e scFv. Em certos aspectos, o CAR tem como alvo um ou mais antígenos associados ao tumor selecionados do grupo que consiste em CD19, CD319 (CS1), ROR1, CD20, antígeno carcinoem- brionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epiteli- al, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação a folato, glicoproteína do en- voltório de HIV-1 gp120, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp41, GD2, CD5, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, cadeia capa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, TRAIL/DR4, VEGFR2, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA, CD99, e uma combinação dos mesmos. Nos aspectos particulares, o CAR compreende pelo menos um domínio de sinalização selecionado do grupo que consiste em CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL- 2RG/CD132, DAP12, CD70, CD40 e uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a célula imune compreende uma ou mais citoci- nas heterólogas, tais como uma ou mais de IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL- 18 e IL-21. Em certos aspectos, o CAR ainda compreende um gene suicida, tal como um gene mutante do TNF-alfa não secretável ligado à membrana ou caspase 9 induzível.
[0019] É ainda aqui fornecido um vetor de expressão que codifica pelo menos um CAR e/ou TCR, pelo menos uma sequência de gene inibidor e pelo menos um gRNA. Em alguns aspectos, a sequência do gene inibidor é de um gene inibidor selecionado do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7. Nos aspectos particulares, o gRNA é espe- cífico para o gene inibidor. Em alguns aspectos, o vetor é um vetor vi- ral, tal como um vetor AAV. O CAR pode ser flanqueado por ramifica- ções de homologia para o gene inibidor. Também é fornecida nesta descrição uma célula hospedeira, tal como uma célula das modalida- des, projetada para expressar o vetor das modalidades. Nos aspectos, a célula é uma célula T, célula NK, célula B ou célula tronco.
[0020] Também é aqui fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma população de células imunes das modalidades divulgadas. Outra modalidade fornece uma composição que compre- ende uma população de células das modalidades divulgadas para o tratamento de um distúrbio relacionado ao sistema imunológico, doen- ça infecciosa e/ou câncer.
[0021] Em uma outra modalidade, é fornecido um método de tra-
tamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, compreenden- do a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de células imunes das modalidades divulgadas. Em alguns aspectos, a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa, câncer, tal como um câncer só- lido ou uma malignidade hematológica ou um distúrbio relacionado ao sistema imunológico. O distúrbio relacionado ao sistema imunológico pode ser um distúrbio autoimune, doença de enxerto versus hospedei- ro, rejeição do aloenxerto ou condição inflamatória, por exemplo. Em alguns aspectos, o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é uma condição inflamatória e as células imunes essencialmente não possuem nenhuma expressão do receptor de glicocorticoide. Em cer- tos aspectos, as células imunes são autólogas ou alogênicas em rela- ção a um indivíduo receptor.
[0022] Em aspectos adicionais, o método ainda compreende a administração de pelo menos um segundo agente terapêutico ao indi- víduo que recebe as células imunes. Em alguns aspectos, o pelo me- nos um segundo agente terapêutico compreende quimioterapia, imu- noterapia, cirurgia, radioterapia, terapia hormonal ou bioterapia. Em certos aspectos, as células imunes e/ou o pelo menos um segundo agente terapêutico são administrados por via intravenosa, por via in- traperitoneal, por via intratraqueal, por via intratumoral, por via intra- muscular, por via endoscópica, por via intralesional, por via percutâ- nea, por via subcutânea, por via regional ou por injeção direta ou per- fusão.
[0023] Outra modalidade fornece um método para a preparação de uma célula imune para expressar um CAR compreendendo o uso de um gRNA de CRISPR para inserir o CAR em um lócus do gene inibi- dor da célula imune. Em alguns aspectos, o CAR é codificado por um vetor de expressão, tal como um vetor retroviral, plasmídeo, vetor len- tiviral, vetor adenoviral, vetor viral adeno-associado e assim por diante.
Em certos aspectos, o vetor viral é um vetor viral adeno-associado, tal como AAV6.
[0024] Em alguns aspectos, o vetor ainda compreende uma se- quência gênica inibidora, tal como uma sequência gênica inibidora é selecionada do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7 e uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, o gRNA de CRISPR é para o gene inibidor. Em certos aspectos, o CAR é flanqueado por ra- mificações de homologia para o gene inibidor. Nos aspectos particula- res, o CAR é inserido em um lócus do gene inibidor em qualquer parte do gene, tal como um éxon do gene inibidor. O CAR pode estar sob o controle do promotor endógeno do gene inibidor. Em aspectos especí- ficos, o CAR interrompe a expressão do gene inibidor.
[0025] Em alguns aspectos, o CAR tem como alvo um ou mais an- tígenos associados ao tumor selecionados do grupo que consiste em CD19, CD319 (CS1), ROR1, CD20, antígeno carcinoembrionário, alfa- fetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação a folato, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp120, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp41, GD2, CD5, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, ca- deia capa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, TRAIL/DR4, VEGFR2, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA, CD99, e uma combinação dos mesmos. Em aspectos particu- lares, o CAR compreende pelo menos um domínio de sinalização se- lecionado do grupo que consiste em CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4- 1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP12, CD70 e CD40. Em alguns aspectos, um vetor que codifica o
CAR também codifica uma citocina, tal como IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL- 18, IL-21, ou uma combinação dos mesmos. Em casos alternativos, a citocina está em um vetor separado do vetor que codifica o CAR. Em certos aspectos, uma construção de expressão que codifica o CAR ainda compreende um gene suicida, tal como a caspase 9 induzível ou um mutante do TNF-alfa não secretável ligado à membrana.
[0026] É ainda aqui fornecida uma célula imune com pelo menos um CAR inserido em um gene inibidor da célula imune, tal como uma célula imune produzida pelos presentes métodos. Também é aqui for- necida uma composição que compreende uma população de células imunes de modalidades da descrição, tal como uma população de cé- lulas T, células B, células NK, células T NK, macrófagos, células- tronco, suas misturas e assim por diante.
[0027] Outra modalidade fornece uma composição que compreen- de uma população de células das modalidades e, em certas modalida- des, a população é utilizada para o tratamento de uma condição médi- ca de qualquer tipo, incluindo, pelo menos, para o tratamento de um distúrbio relacionado ao sistema imunológico, doença infecciosa e/ou câncer.
[0028] Uma outra modalidade fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo compreendendo a admi- nistração de uma quantidade eficaz de células imunes das modalida- des ao indivíduo. Em alguns aspectos, a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa; câncer, tal como um câncer sólido ou uma maligni- dade hematológica; e/ou um distúrbio relacionado ao sistema imunoló- gico. O distúrbio relacionado ao sistema imunológico pode ser um dis- túrbio autoimune, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição do aloenxerto e/ou condição inflamatória, em alguns casos. Em alguns aspectos, o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é uma condi- ção inflamatória e as células imunes essencialmente não possuem ex-
pressão do receptor de glicocorticoide. Em certos aspectos, as células imunes são autólogas ou alogênicas em relação a um indivíduo recep- tor.
[0029] Nos aspectos adicionais, o método ainda compreende a administração de pelo menos um segundo agente terapêutico a um indivíduo. Em alguns aspectos, o pelo menos um segundo agente te- rapêutico compreende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radiotera- pia, terapia hormonal ou bioterapia. Em certos aspectos, as células imunes e/ou o pelo menos um segundo agente terapêutico são admi- nistrados por via intravenosa, por via intraperitoneal, por via intratra- queal, por via intratumoral, por via intramuscular, por via endoscópica, por via intralesional, por via percutânea, por via subcutânea, por via regional ou por injeção direta ou perfusão. As células imunes e o pelo menos um segundo agente terapêutico podem ser administrados ao mesmo tempo ou em momentos diferentes, e quando são administra- dos em momentos diferentes ou ao mesmo tempo, mas não na mes- ma formulação, podem ou não ser administrados pela mesma via.
[0030] Outros objetivos, características e vantagens da presente descrição se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição deta- lhada. Deve ficar entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades particulares da descrição, são fornecidos apenas a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0031] Os seguintes desenhos fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a des-
crição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.
[0032] FIG. 1: CRISPR/Cas9 medeia a disrupção eficiente de múl- tiplos genes (NKG2A, CD47, TGFBR2 e CISH) nas células NK. Neste conjunto de genes, NKG2A e CD47 foram inativados na primeira roda- da de eletroporação e na segunda rodada de eletroporação CISH e TGFBR2 foram direcionados. A eficiência de inativação foi validada com sucesso utilizando a PCR e citometria de fluxo para ambas as ro- dadas de eletroporação. Os histogramas vermelho (picos à direita) e azul (picos à esquerda) nos painéis de fluxo representam a expressão da proteína antes e depois CRISPR KO, respectivamente.
[0033] FIG. 2: Validação da edição de genes multiplex em células NK utilizando outro conjunto de genes (TIGIT (T), CD96 (C), CISH (CH), Adenosina (A)). Neste conjunto de genes, TIGIT e CD96 foram inativados na primeira rodada de eletroporação e na segunda rodada de eletroporação CISH e Adenosina foram direcionados. A eficiência de inativação foi validada com sucesso utilizando a PCR e citometria de fluxo para ambas as rodadas de eletroporação. Os histogramas vermelho (picos à direita) e azul (picos à esquerda) nos painéis de flu- xo representam a expressão da proteína antes e depois de CRISPR KO, respectivamente.
[0034] FIG. 3: A disrupção de vários genes (NKG2A, CD47, TGFBR2 e CISH) em células NK leva a uma funcionalidade aprimora- da contra células tumorais alvo. Houve aumento da secreção de IFN-γ, TNFα e CD107 após estimulação com linhagens celulares alvo. A aná- lise citométrica de fluxo da produção de IFN-γ, TNFα e CD107 foi exe- cutada com células NK variáveis (Editado vs Cas9 isoladamente) co- estimuladas com linhagens celulares alvo durante 5 horas na presença de Brefeldin A.
[0035] FIGS. 4A-4B: A disrupção de múltiplos genes (NKG2A, CD47, TGFBR2 e CISH) em células NK leva à citotoxicidade antitumo-
ral aumentada. (FIG. 4A) A atividade citotóxica de células NK editadas por genes vs Cas9 apenas células NK foi medida pelo ensaio de libe- 51 ração de Cr, contra K562. (FIG. 4B) Após 30 minutos de tratamento com TGF-B recombinante (50 ng/ml), a atividade de pSMAD foi medi- do por citometria de fluxo. A adição de TGF-β exógeno falhou em in- duzir a ativação de pSMAD nas células NK do KO CAR.
[0036] FIG. 5: As células NK perdem a expressão de CD16 e CD62L após estimulação de citocinas ou reconhecimento do alvo, con- forme representado pela análise CyTOF.
[0037] FIG. 6: A inativação de ADAM17 em células NK evita o desprendimento de CD16 e CD62L.
[0038] FIG. 7: A inativação de ADAM17 em células NK melhora ADCC e citotoxicidade contra alvos K562.
[0039] FIG. 8: Rastreamento genético baseado em FACS da efici- ência de inativação de SHP1 em células NK em 72 h.
[0040] FIG. 9: A disrupção de SHP1 em células NK leva a uma efi- cácia antitumoral aumentada. As células NK foram cocultivadas com células K562 ou Raji em uma relação de 1:1 durante 4 horas. Após a incubação, as células foram coradas com anexina V e as células vivas e mortas foram analisadas. As células K562 são sensíveis à morte de células NK e as células Raji são resistentes à morte de células NK.
[0041] FIGS. 10A-10B: A disrupção de SHP1 em células NK leva a eficácia antitumoral aumentada (FIG. 10A). As células NK foram cocul- tivadas com células K562 ou Raji em uma relação de 2:1 durante 5 horas (FIG. 10B). A porcentagem de lise em várias relações de efe- tor:alvo, a porcentagem de IFNγ, TNFα e CD107a e a porcentagem de células vivas ou mortas, são mostradas.
[0042] FIG. 11: A disrupção de SHP1 em células NK-CAR leva a eficácia antitumoral aumentada conforme avaliado através do ensaio de apoptose.
[0043] FIGS. 12A-12C: (FIG. 12A) Eficiência de inativação de NKG2A baseada em FACS no dia 7. (FIG. 12B) A disrupção de NKG2A em células NK expandidas leva ao aumento da eficácia anti- tumoral. (FIG. 12C) A disrupção de NKG2A em células NK-CAR leva ao aumento da eficácia antitumoral contra alvos Raji.
[0044] FIG. 13: A abordagem foi validada com outro conjunto de genes - TIGIT (T), CD96 (C), CISH (CH) e Adenosina (ADORA2A) (A). Para este conjunto de genes, TIGIT e CD96 foram inativados em um conjunto de células NK durante a primeira rodada de eletroporação. CISH e Adenosina (ADORA2A) foram direcionadas para a segunda rodada de inativação nas células TIGIT e CD96 KO. A eficiência de neutalização foi validada com sucesso utilizando a PCR e citometria de fluxo para ambas as rodadas de eletroporação. Os histogramas vermelho (picos à direita) e azul (picos à esquerda) nos painéis de flu- xo representam a expressão da proteína antes e após CRISPR KO, respectivamente.
[0045] FIG. 14: A disrupção de vários genes em células NK leva a uma eficácia antitumoral aumentada. Para avaliar isso, células nocaute de múltiplos genes (NKG2A, CISH, TGFBRII e Adenosina (ADO- RA2A)) e células eletroporadas apenas com cas9 foram utilizadas co- mo o controle com as células K562 (NK sensível) e Raji (NK resisten- te) durante 5 horas. A função das células NK foi avaliada através da medição de citometria de fluxo e observou-se aumentos no TNFα, IFNγ e CD107a nas células KO após estimulação da linhagem celular alvo.
[0046] FIG. 15: A disrupção de vários genes em células NK leva a uma eficácia antitumoral aumentada. Para avaliar isso, células nocaute de múltiplos genes (NKG2A, CISH, TGFBRII) e células eletroporadas apenas com cas9 foram utilizadas como o controle. A expressão de NKG2A foi confirmada pela citometria de fluxo. A adição de TGF-β exógeno falhou em induzir a ativação de pSMAD nas células KO CAR- NK.
[0047] FIG. 16: A disrupção de vários genes (NKG2A, TGFβR2 e CISH) em células NK-CAR leva a uma eficácia antitumoral aumentada.
[0048] FIG. 17: TGFβR2 KO protege as células NK-CAR do efeito supressor de TGFβ.
[0049] FIG. 18: A edição de genes multiplex é reproduzível com diferentes construtos NK-CAR e contra diferentes alvos.
[0050] FIG. 19: A edição de genes multiplex de vários genes inibi- tórios mantém a arquitetura NK e protege as células NK da exaustão induzida por TFGβ.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS
[0051] Em certas modalidades, a presente descrição fornece uma nova abordagem utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9 para redução da expressão simultânea (ou inativação) de dois ou mais genes (por exemplo, genes (tais como aqueles listados na Tabela 1, incluindo re- ceptor de adenosina 2a, TGFβR2, NKG2A, TIGIT e/ou CISH) em célu- las imunes humanas (por exemplo, células T, células NK, células T transduzidas por CAR ou células NK transduzidas por CAR). As célu- las imunes podem ser derivadas de sangue periférico ou sangue do cordão umbilical ou uma combinação dos mesmos.
[0052] Os presentes estudos demonstraram que a expressão di- minuída dessas proteínas se correlaciona com a função melhorada, proliferação e persistência in vivo e citotoxicidade de células T e célu- las NK. Esta estratégia também protege as células T, células NK, célu- las T NK e células iNKT do microambiente tumoral imunossupressor, que é principalmente impulsionado por TGFβ e adenosina. Assim, os presentes métodos podem ser utilizados para melhorar a eficácia de vários produtos de terapia celular adotiva (por exemplo, células NK, células T, tais como células T específicas do vírus e células T regula-
doras, células B, tais como células B reguladoras, células NK transdu- zidas por CAR, células CAR-T e células T e NK projetadas por TCR, células iNKT, células NKT). Os produtos de terapia celular adotiva po- dem ser utilizados para tratar várias doenças que vão desde o câncer (por exemplo, malignidades hematológicas ou sólidas), até doenças infecciosas e distúrbios imunológicos, por exemplo.
[0053] Nas modalidades particulares, as células imunes expres- sam pelo menos um CAR, e a engenharia do CAR tem visto vários avanços nos últimos anos. Na verdade, o CAR-CD19 mostrou resulta- dos clínicos impressionantes em pacientes com leucemia de células B e linfoma, levando à aprovação do FDA em dois produtos CAR T no ano passado. Embora as células T transduzidas por CAR tenham lide- rado o caminho nos últimos anos, uma panóplia de estudos pré- clínicos, assim como o ensaio CAR NK de Fase I/II liderado pelos Re- querentes, também mostraram a eficácia das células CAR-NK contra o câncer. Apesar dos avanços na engenharia de CAR, os CARs ainda são transduzidos principalmente em células T ou células NK utilizando vetores virais, que se integram aleatoriamente no DNA da célula e po- dem resultar em expansão clonal, transformação oncogênica, expres- são de transgene alterada ou silenciamento transcricional. Assim, en- contrar uma maneira de direcionar a inserção do CAR em um lócus de DNA específico seria valioso.
[0054] Consequentemente, em uma modalidade, a presente des- crição fornece métodos para a inserção de um CAR em um lócus gê- nico específico, tal como no lócus de um gene inibidor ou proteína do ponto de controle, utilizando CRISPR/Cas9. A inserção do CAR no ló- cus do gene também pode ser utilizada para interromper simultanea- mente a expressão do gene, enquanto opcionalmente também o colo- ca sob o controle do promotor desse gene, quando desejado. Especifi- camente, os presentes métodos podem direcionar a inserção de um
CAR no lócus de um gene inibidor, tal como aqueles listados na Tabe- la 1, incluindo, mas não limitado a NKG2A, CISH, PD-1, TIGIT, TIM3, SHP1 ou TGFβR2, por exemplo, utilizando um vetor AAV6 e tecnolo- gia CRISPR/Cas9. A inserção do CAR no lócus do gene inibidor pode interromper o efeito inibidor de uma molécula do ponto de controle (por exemplo), enquanto também permite que a expressão do CAR fique sob a regulação do promotor do ponto de controle e regulada positi- vamente no microambiente tumoral. Isso é útil para as aplicações da terapia de CAR em tumores sólidos, onde a suprarregulação das mo- léculas do ponto de controle pode impactar negativamente o sucesso da terapia de CAR. Assim, outros métodos são fornecidos para a pro- dução de terapias celulares adotivas, tais como células T, células B, células NK, NKT ou iNKT, utilizando o método de inserção de CAR que pode ter um perfil de segurança aumentado. I. Definições
[0055] Conforme utilizado nesta invenção, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é aqui utilizado para signi- ficar que nenhum dos componentes especificados foi propositalmente formulado em uma composição e/ou está presente apenas como um contaminante ou em quantidades vestigiais. A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não intencional de uma composição está, portanto, bem abaixo de 0,05%, de preferência abaixo de 0,01%. O mais preferível é uma composição em que nenhuma quantidade do componente especificado possa ser detectada com métodos analíticos padrão.
[0056] Conforme utilizado neste relatório descritivo, "um" ou "uma" pode significar um ou mais. Conforme utilizado nesta invenção nas rei- vindicações, quando utilizado em conjunto com a palavra "compreen- dendo", as palavras "um" ou "uma" podem significar um ou mais de um. Como aqui utilizado, "outro" pode significar pelo menos um se-
gundo ou mais. Além disso, os termos "tendo", "incluindo", "contendo" e "compreendendo" são intercambiáveis e uma pessoa de habilidade na técnica está ciente de que esses termos são termos abertos. Nas modalidades específicas, aspectos da descrição podem "consistir es- sencialmente em" ou "consistir em" uma ou mais sequências da des- crição, por exemplo. Algumas modalidades da descrição podem con- sistir em ou consistir essencialmente em um ou mais elementos, eta- pas do método e/ou métodos da descrição. Contempla-se que qual- quer método ou composição aqui descrito pode ser implementado em relação a qualquer outro método ou composição aqui descrito. O es- copo do presente pedido não se destina a ser limitado às modalidades particulares do processo, máquina, fabricação, composição da maté- ria, meios, métodos e etapas descritos no relatório descritivo. Confor- me utilizado nesta invenção, os termos "ou" e "e/ou" são utilizados pa- ra descrever vários componentes em combinação ou exclusivos entre si. Por exemplo, "x, y e/ou z" pode se referir a "x" isoladamente, "y" isoladamente, "z" isoladamente, "x, y e z", "(x e y) ou z" “X ou (y e z)” ou “x ou y ou z.” É especificamente contemplado que x, y ou z podem ser especificamente excluídos de uma modalidade.
[0057] O uso do termo "ou" nas reivindicações é utilizado para sig- nificar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir apenas as alternativas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a descrição suporte uma definição que se refere apenas a al- ternativas e “e/ou.” Conforme aqui utilizado, "outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais. Os termos “cerca de”, “substancialmente” e “aproximadamente” significam, em geral, o valor declarado mais ou menos 5%.
[0058] Referência ao longo deste relatório descritivo a "uma moda- lidade", "uma modalidade", "uma modalidade particular", "uma modali- dade relacionada", "uma determinada modalidade", "uma modalidade adicional" ou "uma outra modalidade" ou combinações das mesmas, significa que um determinado recurso, estrutura ou característica des- crita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente descrição. Assim, as aparições das frases an- teriores em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não se referem todas necessariamente à mesma modalidade. Além disso, os aspectos, estruturas ou características particulares podem ser combi- nados de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.
[0059] Um "distúrbio imunológico", "distúrbio relacionado ao siste- ma imunológico" ou "distúrbio mediado pelo sistema imunológico " re- fere-se a um distúrbio no qual a resposta imune desempenha um pa- pel fundamental no desenvolvimento ou progressão da doença. Os distúrbios mediados pelo sistema imunológico incluem distúrbios au- toimunes, rejeição de aloenxerto, doença de enxerto versus hospedei- ro e condições inflamatórias e alérgicas.
[0060] Uma "resposta imune" é uma resposta de uma célula do sistema imunológico, tal como uma célula B, ou uma célula T, ou uma célula imune inata a um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um determinado antígeno (uma "resposta específica ao antígeno").
[0061] O termo "gene inibidor" como aqui utilizado, refere-se a um gene cujo produto gênico é direta ou indiretamente deletério para a atividade, proliferação e/ou persistência de um ou mais tipos de célu- las imunes.
[0062] Uma "doença autoimune" refere-se a uma doença em que o sistema imunológico produz uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de uma célula B ou uma célula T) contra um antígeno que faz parte do hospedeiro normal (isto é, um autoantígeno), com consequen- te lesão dos tecidos. Um autoantígeno pode ser derivado de uma célu- la hospedeira ou pode ser derivado de um organismo comensal, tal como os microrganismos (conhecidos como organismos comensais) que normalmente colonizam as superfícies da mucosa.
[0063] O termo "projetado" conforme utilizado nesta invenção refe- re-se a uma entidade que é gerada pela mão do homem, incluindo uma célula, ácido nucleico, polipeptídeo, vetor, e assim por diante. Em pelo menos alguns casos, uma entidade projetada é sintética e com- preende elementos que não estão naturalmente presentes ou configu- rados da maneira em que ela é utilizada na descrição.
[0064] "Tratar" ou tratamento de uma doença ou condição refere- se à execução de um protocolo, que pode incluir a administração de um ou mais fármacos a um paciente, em um esforço para aliviar os sinais ou sintomas da doença. Os efeitos desejáveis do tratamento in- cluem a diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou ali- vio do estado doentio e remissão ou melhora do prognóstico. O alívio pode ocorrer antes do aparecimento dos sinais ou sintomas da doença ou condição, assim como após o seu aparecimento. Assim, "tratar" ou "tratamento" pode incluir "prevenir" ou "prevenção" de doença ou con- dição indesejável. Além disso, "tratar" ou "tratamento" não requer o alívio completo dos sinais ou sintomas, não requer uma cura e inclui, especificamente, protocolos que possuem apenas um efeito marginal no paciente.
[0065] O termo "benefício terapêutico" ou "terapeuticamente efi- caz" conforme utilizado em todo este pedido refere-se a qualquer coisa que promova ou melhore o bem-estar do indivíduo com relação ao tra- tamento médico desta condição. Isso inclui, mas não está limitado a uma redução na frequência ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença. Por exemplo, o tratamento do câncer pode envolver, por exemplo, uma redução no tamanho de um tumor, uma redução na ca- pacidade de invasão de um tumor, redução na taxa de crescimento do câncer ou prevenção de metástases. O tratamento do câncer também pode referir-se ao prolongamento da sobrevivência de um indivíduo com câncer.
[0066] "Indivíduo" e "paciente" referem-se a um ser humano ou não humano, tal como primatas, mamíferos e vertebrados. Nas moda- lidades particulares, o indivíduo é um ser humano.
[0067] Como utilizado nesta invenção, um "mamífero" é um indiví- duo apropriado para o método da presente invenção. Um mamífero pode ser qualquer membro da classe de vertebrados superiores Mammalia, incluindo seres humanos; caracterizado por nascimento, pelos no corpo e glândulas mamárias nas fêmeas que secretam leite para alimentar os filhotes. Adicionalmente, os mamíferos são caracte- rizados por sua capacidade de manter uma temperatura corporal cons- tante, apesar das mudanças nas condições climáticas. Exemplos de mamíferos são seres humanos, gatos, cães, vacas, camundongos, ra- tos, cavalos, cabras, ovelhas e chimpanzés. Os mamíferos podem ser referidos como “pacientes” ou “indivíduos”.
[0068] As frases "farmacêutico ou farmacologicamente aceitável" referem-se ás entidades moleculares e composições que não produ- zem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, tal como um ser humano, conforme apro- priado. A preparação de uma composição farmacêutica compreenden- do um anticorpo ou ingrediente ativo adicional será conhecida daque- les de habilidade na técnica à luz da presente descrição. Além disso, para a administração em animais (por exemplo, seres humanos), ficará entendido que as preparações devem atender aos padrões de esterili- dade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, conforme exigido pelo FDA Office of Biological Standards.
[0069] Como aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes aquosos (por exemplo, água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenterais,
tais como cloreto de sódio, dextrose de Ringer, etc.), solventes não aquosos (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal e ésteres orgânicos injetáveis, tais como etiloleato), meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos ou antifúngicos, antioxidantes, agentes que- lantes e gases inertes), agentes isotônicos, agentes de retardo de ab- sorção, sais, fármacos, estabilizantes de fármacos, géis, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes adoçan- tes, agentes aromatizantes, corantes, renovadores de fluidos e nutrien- tes, tais como materiais e combinações dos mesmos, como seria co- nhecido por uma pessoa de habilidade prática na técnica. O pH e a concentração exata dos vários componentes em uma composição farmacêutica são ajustados de acordo com parâmetros bem conheci- dos.
[0070] Como aqui utilizado, uma "disrupção" de um gene refere-se à eliminação ou redução da expressão de um ou mais produtos gêni- cos codificados pelo gene em questão em uma célula, em comparação com o nível de expressão do produto gênico na ausência da disrup- ção. Produtos gênicos exemplares incluem mRNA e produtos protéi- cos codificados pelo gene. A disrupção em alguns casos é transitória ou reversível e em outros casos é permanente. A disrupção em alguns casos é de uma proteína funcional ou de comprimento total ou mRNA, apesar do fato de que um produto truncado ou não funcional pode ser produzido. Em algumas modalidades nesta descrição, a atividade ou função do gene, em oposição à expressão, é interrompida. A disrup- ção do gene é geralmente induzida por métodos artificiais, isto é, pela adição ou introdução de um composto, molécula, complexo ou compo- sição e/ou pela disrupção do ácido nucleico ou associado com o gene, tal como no nível do DNA. Métodos exemplares para a disrupção do gene incluem técnicas de silenciamento, redução da expressão, inati-
vação e/ou de disrupção do gene, tais como a edição de genes. Os exemplos incluem tecnologia antissenso, tal como RNAi, siRNA, shR- NA e/ou ribozimas, que geralmente resultam na redução transitória da expressão, assim como técnicas de edição de genes que resultam na inativação ou disrupção direcionada do gene, por exemplo, através da indução de quebras e/ou recombinação homóloga. Os exemplos inclu- em inserções, mutações e deleções. As disrupções resultam tipica- mente na repressão e/ou ausência completa de expressão de um pro- duto normal ou do "tipo selvagem" codificado pelo gene. Exemplos de tais disrupções gênicas são inserções, mutações por deslocamento do quadro de leitura e de sentido trocado, deleções, substituição gênica e inativação do gene ou parte do gene, incluindo deleções de todo o ge- ne. Tais disrupções podem ocorrer na região de codificação, por exemplo, em um ou mais éxons, resultando na incapacidade de pro- duzir um produto de comprimento completo, produto funcional ou qualquer produto, tal como através da inserção de um códon de para- da. Tais disrupções também podem ocorrer através das disrupções no promotor ou intensificador ou outra região que afeta a ativação da transcrição, de modo a prevenir a transcrição do gene. As disrupções gênicas incluem o direcionamento do gene, incluindo a inativação do gene direcionado através da recombinação homóloga. II. Edição do Gene Multiplex
[0071] Em certas modalidades, a presente descrição se refere à edição de genes multiplex de qualquer tipo de células imunes. CRISPR é um exemplo que pode ser utilizado para interromper a ex- pressão de dois ou mais genes, tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais genes em uma célula imune. Os genes podem ser selecionados dos genes listados na Tabela 1, tais como Receptor de Células NK A (NKG2A), Lectina Semelhante a Ig de Ligação a Ácido Siálico 7 (SI- GLEC-7, CD328), Ativação de Linfócitos 3 (LAG3), Membro da família de Imunoglobulina Mucina 3 de Célula T (TIM3, CD366, HAVCR2), Proteína Contendo SH2 Induzível por Citocina (CISH, CIS-1, SOCS), Forkhead Box O1 (FOXO1), Receptor 2 do Fator de Crescimento Transformante Beta (TGFβR2), Imunorreceptor de Células T com Do- mínios de Ig e ITIM (TIGIT), CD96, Receptor de Adenosina 2A (ADO- RA2), Membro do Grupo C 1 da Subfamília de Receptor Nuclear 3 (NR3C1), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante 1 da Morte Celu- lar Programada 1 (PDL-1), Ligante 2 da Morte Celular Programada 1 (PDL-2), CD47, Proteína Alfa Reguladora de Sinal (SIRPA), Inositol 5- Fosfatase 1 Contendo Domínio SH2 (SHIP1), Domínio ADAM Metalo- peptidase 17 (ADAM17), Proteína Ribossômica S6 (RPS6), Proteína 1 de Ligação ao Fator de Iniciação da Translação Eucariótica 4E (4EBP1), CD25, CD40, Receptor da Interleucina 21 (IL21R), Molécula de Aderência Intercelular 1 (ICAM1), CD95, CD80, CD86, Receptor da Interleucina 21 (IL10R), CD5, CD7, ou podem haver outros genes ini- bidores. A edição de genes leva em conta a disrupção simultânea da expressão de vários genes.
[0072] Em algumas modalidades, a disrupção do gene é realizada através da execução de uma disrupção no gene, tal como uma inativa- ção, inserção, mutação de sentido trocado ou por deslocamento do quadro de leitura, tal como mutação por deslocamento do quadro de leitura bialélica, deleção de todo ou parte do gene, por exemplo, um ou mais éxons ou suas partes, portanto, e/ou substituição gênica. Por exemplo, a disrupção pode ser efetuada por nucleases específicas da sequência ou direcionadas, incluindo nucleases direcionadas de liga- ção ao DNA, tais como nucleases de dedo de zinco (ZFN) e nucleases efetoras semelhantes ao ativador de transcrição (TALENs), e nuclea- ses guiadas por RNA tais como um nuclease associada a CRISPR (Cas), especificamente projetada para ser direcionada á sequência do gene ou uma parte do mesmo.
[0073] Em algumas modalidades, a disrupção é transitória ou re- versível, de tal modo que a expressão do gene seja restaurada poste- riormente. Em outras modalidades, a disrupção não é reversível ou transitória, por exemplo, é permanente.
[0074] Em algumas modalidades, a disrupção do gene é realizada através da indução de uma ou mais quebras de fita dupla e/ou uma ou mais quebras de fita simples no gene, tipicamente de forma direciona- da. Em algumas modalidades, as quebras de fita dupla ou de fita sim- ples são efetuadas por uma nuclease, por exemplo, uma endonu- clease, tal como uma nuclease direcionada ao gene. Em alguns as- pectos, as quebras são induzidas na região de codificação do gene, por exemplo, em um éxon. Por exemplo, em algumas modalidades, a indução ocorre perto da parte N-terminal da região de codificação, por exemplo, no primeiro éxon, no segundo éxon ou em um éxon subse- quente.
[0075] A célula imune pode ser introduzida em um RNA guia e en- zima CRISPR, ou mRNA que codifica a enzima CRISPR. Em alguns aspectos, a célula é introduzida em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais RNAs guia simultaneamente. Por exemplo, a célula pode ser introduzida em 1, 2 ou 3 RNAs guia durante uma primeira eletroporação e, em seguida, ainda introduzida em 1, 2 ou 3 RNAs guia adicionais durante uma se- gunda eletroporação, e assim por diante.
[0076] Em algumas modalidades, a disrupção do gene é alcança- da utilizando técnicas antissenso, tais como através da interferência por RNA (RNAi), RNA interferente pequeno (siRNA), RNA em grampo curto (shRNA) e/ou ribozimas são utilizados para suprimir ou reprimir seletivamente a expressão de o gene. A tecnologia de siRNA é o RNAi que emprega uma molécula de RNA de fita dupla tendo uma sequên- cia homóloga à sequência de nucleotídeo do mRNA que é transcrita do gene, e uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo.
O siRNA geralmente é homólogo/complementar com uma região do mRNA que é transcrita do gene, ou pode ser siRNA incluindo uma plu- ralidade de moléculas de RNA que são homólogas/complementares com diferentes regiões. Em alguns aspectos, o siRNA é compreendido em um construto policistrônico.
[0077] Em algumas modalidades, a disrupção é alcançada utili- zando uma molécula de direcionamento de DNA, tal como uma proteí- na de ligação ao DNA ou ácido nucleico de ligação ao DNA, ou com- plexo, composto ou composição contendo o mesmo, que se liga ou hibridiza especificamente no gene. Em algumas modalidades, a molé- cula de direcionamento de DNA compreende um domínio de ligação de DNA, por exemplo, um domínio de ligação de DNA de proteína de- do de zinco (ZFP), uma proteína semelhante ao ativador de transcri- ção (TAL) ou domínio de ligação de DNA efetor de TAL (TALE), um domínio de ligação a DNA de repetições palindrômicas curtas regular- mente interespaçadas aglomeradas (CRISPR) ou um domínio de liga- ção a DNA de uma meganuclease. Domínios de ligação dedo de zin- co, TALE e do sistema CRISPR podem ser projetados para se ligarem a uma sequência de nucleotídeo predeterminada, por exemplo, atra- vés da engenharia (alterando um ou mais aminoácidos) da região de hélice de reconhecimento de uma proteína dedo de zinco ou TALE de ocorrência natural. As proteínas de ligação de DNA projetadas (dedos de zinco ou TALEs) são proteínas que não são de ocorrência natural. Os critérios racionais para o projeto incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP e/ou TALE existentes e dados de ligação.
[0078] Para a disrupção mediada por CRISPR, o RNA guia e a endonuclease podem ser introduzidos nas células imunes por qualquer meio conhecido na técnica para permitir a liberação dentro das células ou compartimentos subcelulares, e agentes/produtos químicos e/ou moléculas (proteínas e ácidos nucleicos) que podem ser utilizados in- cluem meios de liberação lipossômica, veículos poliméricos, veículos químicos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, nanopartículas, emul- são, endocitose natural ou via de fagocitose como exemplos não limi- tativos, assim como métodos físicos, tais como eletroporação. Nos as- pectos específicos, a eletroporação é utilizada para introduzir o RNA guia e a endonuclease, ou ácido nucleico que codifica a endonuclease.
[0079] Em um método específico exemplar, o método para inativa- ção de CRISPR de múltiplos genes pode compreender o isolamento de células imunes, tais como células NK, do sangue do cordão umbili- cal ou sangue periférico. As células NK podem ser isoladas e semea- das em placas de cultura com células alimentadoras irradiadas, tais como na relação de 1:2, por exemplo. As células podem então ser ele- troporadas com gRNA e Cas9 na presença de IL-2, tal como em uma concentração de 200 IU/ml. O meio pode ser alterado a cada dois dias, por exemplo. Após 1 a 3 dias, as células NK são isoladas para remo- ver as células alimentadoras e podem então ser transduzidas com um construto de CAR. As células NK podem então ser submetidas a uma segunda inativação de CRISPR Cas9 para genes adicionais. Após a eletroporação, as células NK podem ser semeadas com células ali- mentadoras, por exemplo, durante 5 a 9 dias. Tabela 1: Genes para edição multiplex ou substituição gênica de CAR. Localizações exemplares para a substituição gênica são indicadas. Células NK, células T ou células MSC NKG2A Éxon 4 SIGLEC-7 Éxon 1 LAG3 Éxon 1 TIM3 Éxon 2 CISH Éxon 5 FOXO1 Éxon 1
TGFBR2 Éxon 5 TIGIT Éxon 2 CD96 Éxon 2 ADORA2 Éxon 2 NR3C1 Éxon 2 PD1 Éxon 1 PDL-1 Éxon 3 PDL-2 Éxon 3 CD47 Éxon 2 SIRPA Éxon 2 SHIP1 Éxon 1 ADAM17 Éxon 1 B2M Éxon 2 CD16 Células B ou células T RPSS6 Éxon 2 4EBP1 Éxon 4 CD25 Éxon 3 CD40 Éxon 3 IL21R Éxon 1 ICAM1 Éxon 4 CD95 Éxon 2 CD80 Éxon 3 CD86 Éxon 1 IL10R Éxon 3 CD5 CD7 Éxon 2
Tabela 2: Sequências de gRNA Exemplares para a Inativação do Ge- ne. CISH (Éxon 4) AGGCCACATAGTGCTGCACA (gRNA1); SEQ ID NO:1 TGTACAGCAGTGGCTGGTGG (gRNA2); SEQ ID NO:2 NKG2A (Éxon 4) AACAACTATCGTTACCACAG; SEQ ID NO:3 A2AR (Éxon 3) CTCCTCGGTGTACATCACGG (gRNA1); SEQ ID NO:4 AGTAGTTGGTGACGTTCTGC (gRNA2); SEQ ID NO:5 TIGIT (Éxon 3) ACCCTGATGGGACGTACACT; SEQ ID NO:6 CD96 (Éxon 2) AGGCACAGTAGAAGCCGTAT; SEQ ID NO:7 TIM3 (Éxon 2) AGACGGGCACGAGGTTCCCT; SEQ ID NO:8 SHP1 (Éxon 4) TCACGCACAAGAAACGTCCA; SEQ ID NO:9 PD1 (Éxon 2) CCCCTTCGGTCACCACGAGC; SEQ ID NO:10 PDL1 (Éxon 3) ATTTACTGTCACGGTTCCCA; SEQ ID NO:11 PDL2 (Éxon 3) CCCCATAGATGATTATGCAT; SEQ ID NO:12 TGFBR2 (Éxon 5) GACGGCTGAGGAGCGGAAGA (gRNA1); SEQ ID NO:13 TGTGGAGGTGAGCAATCCCC (gRNA2); SEQ ID NO:14
[0080] Em algumas modalidades, as células imunes da presente descrição são modificadas para ter expressão alterada de dois ou mais genes. Em algumas modalidades, a expressão do gene alterada é rea- lizada através da execução de uma disrupção no gene, tal como uma inativação, inserção, mutação de sentido trocado ou por deslocamento do quadro de leitura, tal como mutação por deslocamento do quadro de leitura bialélica, deleção de todo ou parte do gene, por exemplo, um ou mais éxon ou parte, portanto, e/ou substituição gênica. Nas modali- dades específicas, a expressão do gene alterada pode ser efetuada por nucleases específicas da sequência ou direcionadas, incluindo nu- cleases direcionadas de ligação a DNA, tais como nucleases guiadas por RNA, tais como uma nuclease associada a CRISPR (Cas), especi- ficamente projetada para ser direcionada à sequência do gene ou uma parte da mesma.
[0081] Em algumas modalidades, a alteração da expressão, ativi- dade e/ou função do gene é realizada pela disrupção do gene. Em al- guns aspectos, o gene é modificado de modo que sua expressão seja reduzida em pelo menos ou ao redor de 10, 20, 30 ou 40%, geralmen- te pelo menos ou ao redor de 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% em comparação com a expressão na ausência da modificação do gene ou na ausência dos componentes introduzidos para efetuar a modificação.
[0082] Em algumas modalidades, a alteração é transitória ou re- versível, de tal modo que a expressão do gene seja restaurada poste- riormente, se desejado. Em outras modalidades, a alteração não é re- versível ou transitória, por exemplo, é permanente.
[0083] Em algumas modalidades, a alteração do gene é realizada através da indução de uma ou mais quebras de fita dupla e/ou uma ou mais quebras de fita simples no gene, normalmente de uma maneira direcionada. Em algumas modalidades, as quebras de fita dupla ou de fita simples são efetuadas por uma nuclease, por exemplo, uma endo- nuclease, tal como uma nuclease direcionada a um gene. Em alguns aspectos, as quebras são induzidas na região de codificação do gene, por exemplo, em um éxon. Por exemplo, em algumas modalidades, a indução ocorre perto da parte N-terminal da região de codificação, por exemplo, no primeiro éxon, no segundo éxon ou em um éxon subse- quente.
[0084] Em alguns aspectos, as quebras de fita dupla ou de fita simples passam por reparo através de um processo de reparo celular, tal como através da junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (HDR). Em alguns aspectos, o pro-
cesso de reparo é sujeito a erros e resulta na disrupção do gene, tal como uma mutação por deslocamento do quadro de leitura, por exem- plo, mutação por deslocamento do quadro de leitura bialélica, que po- de resultar na inativação completa do gene. Por exemplo, em alguns aspectos, a disrupção compreende a indução de uma deleção, muta- ção e/ou inserção. Em algumas modalidades, a disrupção resulta na presença de um códon de parada precoce. Em alguns aspectos, a presença de uma inserção, deleção, translocação, mutação por deslo- camento do quadro de leitura e/ou um códon de parada prematuro re- sulta na disrupção da expressão, atividade e/ou função do gene.
[0085] Em algumas modalidades, a alteração é realizada utilizando um ou mais ácidos nucleicos de ligação ao DNA, tal como a alteração por meio de uma endonuclease guiada por RNA (RGEN). Por exem- plo, a alteração pode ser realizada utilizando repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR) e proteínas associadas a CRISPR (Cas). Em geral, "sistema CRISPR" refere-se coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expres- são ou direcionamento da atividade de genes associados a CRISPR ("Cas"), incluindo sequências que codificam um gene Cas, uma se- quência tracr (CRISPR de transativação) (por exemplo, tracrRNA ou um tracrRNA parcial ativo), uma sequência tracr-mate (abrangendo uma "repetição direta" e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno), uma se- quência guia (também referida como uma "espaçador" no contexto de um sistema CRISPR endógeno) e/ou outras sequências e transcrições de um lócus de CRISPR.
[0086] A nuclease CRISPR/Cas ou sistema de nuclease CRISPR/Cas pode incluir uma molécula de RNA não codificante (guia), cuja sequência se liga especificamente ao DNA, e uma proteína Cas (por exemplo, Cas9), com funcionalidade de nuclease (por exem-
plo, dois domínios de nuclease). Um ou mais elementos de um siste- ma CRISPR podem derivar de um sistema CRISPR tipo I, tipo II ou tipo III, por exemplo, derivado de um organismo particular compreen- dendo um sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyoge- nes.
[0087] Em alguns aspectos, uma nuclease Cas e gRNA (incluindo uma fusão de crRNA específico para a sequência alvo e tracrRNA fixo) são introduzidos na célula. Em geral, os locais alvo na extremidade 5' do gRNA direcionam a nuclease Cas para o sítio alvo, por exemplo, o gene, utilizando emparelhamento de base complementar. O sítio alvo pode ser selecionado com base em sua localização imediatamente a 5' de uma sequência de motivo adjacente de protoespaçador (PAM), tal como tipicamente NGG ou NAG. A este respeito, o gRNA é direciona- do para a sequência desejada mediante a modificação dos primeiros 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 ou 10 nucleotídeos do RNA guia para corresponder à sequência de DNA alvo. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no sítio de uma sequência alvo. Tipicamente, "sequência alvo" geralmente se refere a uma sequência para a qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, onde a hibridização entre a sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Complementaridade total não é necessariamente requerida, contanto que haja complementaridade su- ficiente para provocar a hibridização e promover a formação de um complexo CRISPR.
[0088] O sistema CRISPR pode induzir quebras de fita dupla (DSBs) no sítio alvo, seguidas por disrupções ou alterações conforme examinado nesta invenção. Em outras modalidades, as variantes de Cas9, consideradas "nickases", são utilizadas para cortar uma fita simples no sítio alvo. As nickases emparelhadas podem ser utilizadas,
por exemplo, para melhorar a especificidade, cada uma direcionada por um par de sequências de direcionamento de gRNAs diferentes, de modo que após a introdução dos cortes simultaneamente, uma saliên- cia 5' é introduzida. Em outras modalidades, a Cas9 cataliticamente inativa é fundida a um domínio efetor heterólogo tal como um repres- sor ou ativador transcricional, para afetar a expressão gênica.
[0089] A sequência alvo pode compreender qualquer polinucleotí- deo, tal como polinucleotídeos de DNA ou RNA. A sequência alvo po- de estar localizada no núcleo ou citoplasma da célula, tal como dentro de uma organela da célula. Geralmente, uma sequência ou molde que pode ser utilizado para recombinação no lócus alvo compreendendo as sequências alvo é referido como um "molde de edição" ou "polinu- cleotídeo de edição" ou "sequência de edição". Em alguns aspectos, um polinucleotídeo molde exógeno pode ser referido como um molde de edição. Em alguns aspectos, a recombinação é uma recombinação homóloga.
[0090] Tipicamente, no contexto de um sistema CRISPR endóge- no, a formação do complexo CRISPR (compreendendo a sequência guia hibridizada com a sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta na clivagem de uma ou ambas as fitas na ou próximo (por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 ou mais pares de bases) da sequência alvo. A sequência tracr, que pode compreender ou consistir de toda ou uma parte de uma sequên- cia tracr de tipo selvagem (por exemplo, ao redor ou mais do que cer- ca de 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ou mais nucleotídeos de uma sequência tracr do tipo selvagem), também pode fazer parte do com- plexo CRISPR, tal como por hibridização ao longo de pelo menos uma parte da sequência tracr para toda ou uma parte de uma sequência tracr mate que está ligada de maneira operável à sequência guia. A sequência tracr possui complementaridade suficiente para uma se-
quência tracr mate para hibridizar e participar na formação do comple- xo CRISPR, tal como pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de complementaridade de sequência ao longo o comprimento da sequência tracr mate quando alinhada de forma otimizada.
[0091] Um ou mais vetores que direcionam a expressão de um ou mais elementos do sistema CRISPR podem ser introduzidos na célula de modo que a expressão dos elementos do sistema CRISPR direcio- ne a formação do complexo CRISPR em um ou mais sítios alvo. Os componentes também podem ser liberados nas células como proteí- nas e/ou RNA. Por exemplo, uma enzima Cas, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr-mate e uma sequência tracr podem estar ligadas de maneira operável a elementos reguladores separados em vetores separados. Alternativamente, dois ou mais dos elementos ex- pressos a partir dos mesmos ou diferentes elementos reguladores po- dem ser combinados em um único vetor, com um ou mais vetores adi- cionais fornecendo quaisquer componentes do sistema CRISPR não incluídos no primeiro vetor. O vetor pode compreender um ou mais sí- tios de inserção, tais como uma sequência de reconhecimento de en- donuclease de restrição (também referida como um "sítio de clona- gem"). Em algumas modalidades, um ou mais sítios de inserção estão localizados a montante e/ou a jusante de um ou mais elementos de sequência de um ou mais vetores. Quando múltiplas sequências guias diferentes forem utilizadas, um único construto de expressão pode ser utilizado para direcionar a atividade de CRISPR para várias sequên- cias alvo correspondentes diferentes dentro de uma célula.
[0092] Um vetor pode compreender um elemento regulador ligado de maneira operável a uma sequência de codificação de enzima que codifica a enzima de CRISPR, tal como uma proteína Cas. Exemplos não limitativos de proteínas Cas incluem Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecida como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, seus homólogos ou versões mo- dificadas das mesmas. Essas enzimas são conhecidas; por exemplo, a sequência de aminoácido da proteína Cas9 de S. pyogenes pode ser encontrada no banco de dados SwissProt sob o número de acesso Q99ZW2.
[0093] A enzima de CRISPR pode ser Cas9 (por exemplo, de S. pyogenes ou S. pneumonia). A enzima de CRISPR pode direcionar a clivagem de uma ou ambas as fitas no local de uma sequência alvo, tal como dentro da sequência alvo e/ou dentro do complemento da se- quência alvo. O vetor pode codificar uma enzima de CRISPR que é mutada em relação a uma enzima do tipo selvagem correspondente, de tal modo que a enzima CRISPR mutada não possua a capacidade de clivar uma ou ambas as fitas de um polinucleotídeo alvo contendo uma sequência alvo. Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes converte Cas9 de uma nuclease que cliva ambas as fitas em uma nickase (cliva uma fita simples). Em algumas modalidades, uma Cas9 nickase pode ser utilizada em combinação com sequências guia, por exemplo, duas sequências guia, que direcionam, respectivamente, as fitas senso e antissenso do DNA alvo. Esta combinação permite que ambas as fitas sejam cortadas e utilizadas para induzir NHEJ ou HDR.
[0094] Em algumas modalidades, uma sequência de codificação de enzima que codifica a enzima de CRISPR é otimizada por códons para expressão em células específicas, tais como células eucarióticas. As células eucarióticas podem ser aquelas ou derivadas de um orga- nismo particular, tal como um mamífero, incluindo, mas não limitado a ser humano, camundongo, rato, coelho, cão ou primata não humano.
Em geral, a otimização de códons se refere a um processo de modifi- cação de uma sequência de ácido nucleico para expressão intensifica- da nas células hospedeiras de interesse, mediante a substituição de pelo menos um códon da sequência nativa por códons que são mais frequentemente ou o mais frequente utilizados nos genes dessa célula hospedeira, mantendo a sequência de aminoácidos nativa. Várias es- pécies apresentam tendência particular para certos códons de um de- terminado aminoácido. A influência de códons (diferenças no uso de códons entre organismos) muitas vezes se correlaciona com a eficiên- cia da translação do RNA mensageiro (mRNA), que por sua vez é considerado dependente, entre outras coisas, das propriedades dos códons sendo trasladados e da disponibilidade das moléculas de RNA de transferência (tRNA) particulares. A predominância de tRNAs sele- cionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons utiliza- dos com mais frequência na síntese de peptídeo. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para a expressão gênica ideal em um determinado organismo com base na otimização de códons.
[0095] Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de po- linucleotídeo tendo complementaridade suficiente com uma sequência de polinucleotídeo alvo para hibridar com a sequência alvo e ligação direta específica de sequência direta do complexo CRISPR à sequên- cia alvo. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade en- tre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente, quando alinhada de forma otimizada utilizando um algoritmo de alinhamento adequado, é ao redor ou mais do que cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais.
[0096] O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para o alinhamento de sequências, exemplo não limitativo dos quais incluem o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na Burrows-
Wheeler Transform (por exemplo, o Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illu- mina, San Diego, Calif.), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn), and Maq (disponível em maq.sourceforge.net).
[0097] A enzima de CRISPR pode ser parte de uma proteína de fusão que compreende um ou mais domínios de proteína heteróloga. Uma proteína de fusão de enzima de CRISPR pode compreender qualquer sequência de proteína adicional e, opcionalmente, uma se- quência de ligação entre quaisquer dois domínios. Exemplos de domí- nios de proteína que podem ser fundidos a uma enzima de CRISPR incluem, sem limitação, marcadores de epitopo, sequências de gene repórter e domínios de proteína tendo uma ou mais das seguintes ati- vidades: atividade de metilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação de transcrição, atividade de repressão de transcrição, ativida- de do fator de liberação de transcrição, atividade de modificação de histonas, atividade de clivagem de RNA e atividade de ligação de áci- do nucleico. Exemplos não limitativos de marcadores de epitopo inclu- em marcadores de histidina (His), marcadores V5, marcadores FLAG, marcadores de hemaglutinina (HA) da influenza, marcadores Myc, marcadores VSV-G e marcadores de tiorredoxina (Trx). Exemplos de genes repórter incluem, mas não são limitados a estes, glutationa-5- transferase (GST), peroxidase de raiz-forte (HRP), cloranfenicol acetil- transferase (CAT) beta galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), HcRed, DsRed, proteína ciano fluo- rescente (CFP), proteína amarela fluorescente (YFP) e proteínas auto- fluorescentes incluindo proteína azul fluorescente (BFP). Uma enzima de CRISPR pode ser fundida em uma sequência de gene que codifica uma proteína ou um fragmento de uma proteína que se liga a molécu- las de DNA ou se liga a outras moléculas celulares, incluindo, mas não se limitando a proteína de ligação de maltose (MBP), S-tag, fusões de domínio de ligação de DNA Lex A (DBD), fusões de domínio de liga- ção de DNA GAL4A e fusões de proteína BP16 do vírus herpes sim- plex (HSV). Domínios adicionais que podem fazer parte de uma prote- ína de fusão compreendendo uma enzima de CRISPR são descritos na US 20110059502, aqui incorporada por referência. III. Inserção de CAR e/ou TCR no Lócus do Gene Inibidor
[0098] Em algumas modalidades, a presente descrição se refere à inserção de CAR e/ou TCR em um lócus do gene específico de células imunes. O CAR e/ou TCR pode ser inserido em um lócus do gene ini- bidor, tal como um gene selecionado do grupo que consiste em NKG2A, Siglec 7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, Receptor de Adenosina 2A, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIR- Pa, SHIP1, ADAM17, pS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5, CD7, e uma combinação dos mes- mos.
[0099] A inserção de um ou mais CARs e/ou TCRs em qualquer um dos métodos divulgados nesta invenção pode ser específica do sítio. Por exemplo, um ou mais CARs e/ou TCRs podem ser inseridos adjacentes ou próximos a um promotor. Em outro exemplo, um ou mais transgenes podem ser inseridos adjacente, próximo ou dentro de um éxon de um gene (por exemplo, um gene inibidor). Tais inserções podem ser utilizadas para substituição gênica de um CAR e/ou TCR enquanto simultaneamente interrompe a expressão do gene. Em outro exemplo, um ou mais CARs e/ou TCRs podem ser inseridos adjacen- tes, próximos ou dentro de um íntron de um gene. Um CAR e/ou TCR pode ser introduzido por um vetor viral adeno-associado (AAV) e inte- grado em um local genômico direcionado. Em alguns casos, um vetor rAAV pode ser utilizado para direcionar a inserção de um transgene em um determinado local. Por exemplo, em alguns casos, um CAR e/ou TCR pode ser integrado em pelo menos uma parte de um gene
NKG2A, Siglec 7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, Receptor de Adenosina 2A, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIR- Pa, SHIP1, ADAM17, pS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 ou CD7 por um rAAV ou um vetor AAV.
[00100] A modificação de um lócus direcionado de uma célula pode ser produzida pela introdução de DNA nas células, onde o DNA possui homologia com o lócus alvo. O DNA pode incluir um gene marcador, que leva em conta a seleção de células que compreendem a constru- ção integrada. O DNA complementar em um vetor alvo pode se re- combinar com um DNA cromossômico em um lócus alvo. Um gene marcador pode ser flanqueado por sequências de DNA complementa- res, uma ramificação de recombinação 3' e um ramificação de recom- binação 5'. Vários locais dentro de uma célula podem ser direcionados. Por exemplo, os transgenes com ramificações de recombinação espe- cíficos para 1 ou mais locais alvo podem ser introduzidos de uma só vez, de modo que múltiplas modificações genômicas ocorram em uma única etapa. As ramificações de homologia podem ter cerca de 0,2 kb a cerca de 5 kb de comprimento, tal como de cerca de 0,2 kb, 0,4 kb 0,6 kb, 0,8 kb, 1,0 kb, 1,2 kb, 1,4 kb, 1,6 kb, 1,8 kb, 2,0kb, 2,2 kb, 2,4 kb, 2,6 kb, 2,8 kb, 3,0 kb, 3,2 kb, 3,4 kb, 3,6 kb, 3,8 kb, 4,0 kb, 4,2 kb, 4,4 kb, 4,6kb, 4,8 kb a cerca de 5,0kb de comprimento, por exemplo.
[00101] Em um método, o RNA guia pode ser projetado para direci- onar uma região de um lócus de gene inibidor, tal como o adjacente ao promotor, um éxon ou íntron do gene. O RNA guia pode ter como alvo a extremidade 5' de um éxon, tal como o primeiro, segundo ou terceiro éxon, de um gene inibidor. O RNA guia pode ser compreendido em uma matriz de reparo de vetor AAV. O vetor AAV pode codificar um peptídeo 2A autoclivável, tal como um peptídeo P2A, seguido pelo cDNA do CAR. O cassete de CAR e a sequência de RNA guia podem ser flanqueados por ramificações de homologia com o gene inibidor. A célula imune pode então ser introduzida, tal como eletroporada com, ao vetor AAV e Cas9, tal como mRNA Cas9. IV. Células Imunes
[00102] Certas modalidades da presente descrição referem-se a células imunes que são projetadas para ter inativação de múltiplos ge- nes e/ou para ter substituição gênica de um CAR em um lócus de ge- ne inibidor. As células imunes podem ser células T (por exemplo, célu- las T reguladoras, células T CD4+, células T CD8+ ou células T gama- delta), células NK, células NK invariantes, células NKT, células B, célu- las-tronco (por exemplo, células-tronco mesenquimais (MSCs) ou célu- las-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)). As células imunes podem ser específicas do vírus, expressar um CAR e/ou expressar um TCR. Em algumas modalidades, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células den- dríticas, mastócitos, eosinófilos e/ou basófilos. Também são fornecidos nesta descrição métodos de produção e engenharia das células imu- nes, assim como métodos de uso e administração das células para terapia celular adotiva, caso em que as células podem ser autólogas ou alogênicas. Assim, as células imunes podem ser utilizadas como imunoterapia, tal como para direcionar as células cancerosas.
[00103] As células imunes podem ser isoladas de indivíduos, parti- cularmente indivíduos humanos. As células imunes podem ser obtidas de um indivíduo de interesse, tal como um indivíduo suspeito de ter uma doença ou condição específica, um indivíduo suspeito de ter uma predisposição para uma doença ou condição particular, ou um indiví- duo que está sob terapia para uma doença ou condição particular. As células imunes podem ser coletadas de qualquer local em que residam no indivíduo, incluindo, mas não limitado a sangue, sangue do cordão umbilical, baço, timo, nódulos linfáticos e medula óssea. As células imunes isoladas podem ser utilizadas diretamente ou podem ser ar- mazenadas durante um período de tempo tal como por congelamento.
[00104] As células imunes podem ser enriquecidas/purificadas de qualquer tecido onde residem, incluindo, mas não limitado a sangue (incluindo sangue coletado por bancos de sangue ou bancos de san- gue do cordão umbilical), baço, medula óssea, tecidos removidos e/ou expostos durante procedimentos cirúrgicos e tecidos obtidos por meio de procedimentos de biópsia. Tecidos/órgãos a partir dos quais as cé- lulas imunes são enriquecidas, isoladas e/ou purificadas podem ser isolados de indivíduos vivos e não vivos, em que os indivíduos não vi- vos são doadores de órgãos. Nas modalidades particulares, as células imunes são isoladas do sangue, tal como sangue periférico ou sangue do cordão umbilical ou uma mistura dos mesmos. Em alguns aspectos, as células imunes isoladas do sangue do cordão umbilical aumenta- ram a capacidade de imunomodulação, tal como medida por supres- são de células T CD4-positivas ou CD8-positivas. Em aspectos especí- ficos, as células imunes são isoladas do sangue acumulado, particu- larmente sangue do cordão umbilical acumulado, para aumentar a ca- pacidade de imunomodulação. O sangue acumulado pode ser de 2 ou mais fontes, tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais fontes (por exem- plo, indivíduos doadores).
[00105] A população de células imunes pode ser obtida de um indi- víduo com necessidade de terapia ou que sofre de uma doença asso- ciada à redução da atividade das células imunes. Assim, as células podem ser autólogas para o indivíduo com necessidade de terapia. Alternativamente, a população de células imunes pode ser obtida de um doador, de preferência um doador de histocompatibilidade compa- tível. A população de células imunes pode ser colhida do sangue peri- férico, sangue do cordão umbilical, medula óssea, baço ou qualquer outro órgão/tecido em que as células imunes residam no indivíduo ou doador. As células imunes podem ser isoladas de um grupo de indiví- duos e/ou doadores, tal como do sangue do cordão umbilical acumu- lado.
[00106] Quando a população de células imunes é obtida de um do- ador distinto do indivíduo, o doador é de preferência alogênico, contan- to que as células obtidas sejam compatíveis com o indivíduo na medi- da em que podem ser introduzidas no indivíduo. As células alogênicas do doador podem ou não ser compatíveis com antígeno leucocitário humano (HLA). A. Células T
[00107] Em algumas modalidades, as células imunes são células T. Várias abordagens básicas para a derivação, ativação e expansão de células efetoras antitumorais funcionais foram descritas nas últimas duas décadas. Estas incluem: células autólogas, tais como linfócitos infiltrantes de tumor (TILs); células T ativadas ex vivo utilizando DCs autólogas, linfócitos, células apresentadoras de antígenos artificiais (APCs) ou grânulos revestidos com ligantes de células T e anticorpos de ativação, ou células isoladas em virtude da captura da membrana da célula alvo; células alogênicas que expressam naturalmente o re- ceptor de células T tumorais anti-hospedeiro (TCR); e células autólo- gas ou alogênicas não específicas de tumor geneticamente reprogra- madas ou "redirecionadas" para expressar o TCR reativo ao tumor ou moléculas de TCR quiméricas que apresentam capacidade de reco- nhecimento de tumor semelhante a anticorpo conhecida como "T- corpos". Estas abordagens deram origem a numerosos protocolos pa- ra a preparação e imunização de células T que podem ser utilizados nos métodos aqui descritos.
[00108] Em algumas modalidades, as células T são derivadas do sangue, medula óssea, linfa, cordão umbilical ou órgãos linfoides. Em alguns aspectos, as células são células humanas. As células são tipi-
camente células primárias, tais como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas. Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos de células, tais como populações de células T intei- ras, células CD4+, células CD8+ e subpopulações das mesmas, tais como aquelas definidas por função, estado de ativação, maturidade, potencial para capacidades de diferenciação, expansão, recirculação, localização e/ou persistência, especificidade do antígeno, tipo de re- ceptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento particu- lar, perfil de secreção de marcador ou citocina e/ou grau de diferencia- ção. Com referência ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas e/ou autólogas. Em alguns aspectos, tais como para as tecnologias disponíveis no mercado, as células são pluripotentes e/ou multipotentes, tais como células-tronco, tais como células-tronco pluri- potentes induzidas (iPSCs). Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e/ou planejá-las, conforme descrito nesta invenção e reintroduzi-las no mesmo paciente, antes ou após a criopreservação.
[00109] Entre os subtipos e subpopulações de células T (por exem- plo, células T CD4+ e/ou CD8+) estão células T virgens (TN), células T efetoras (TEFF), células T de memória e seus subtipos, tais como célu- las T de memória da célula tronco (TSCM), T de memória central (TCM), T de memória efetora (TEM) ou T de memória efetoras diferen- ciadas terminalmente, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliadoras, células T citotóxi- cas, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T de ocorrência natural e reguladoras adaptativas (Treg), células T auxilia- doras, tais como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliadoras foliculares, células T alfa/beta e células T delta/gama.
[00110] Em algumas modalidades, uma ou mais das populações de células T são enriquecidas ou debilitadas de células que são positivas para um marcador específico, tais como marcadores de superfície, ou que são negativas para um marcador específico. Em alguns casos, esses marcadores são aqueles que estão ausentes ou expressos em níveis relativamente baixos em certas populações de células T (por exemplo, células de não memória), mas estão presentes ou expressos em níveis relativamente mais elevados em certas outras populações de células T (por exemplo, células de memória).
[00111] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC através da seleção negativa de marcadores expressos em células não T, tais como células B, monócitos ou outros glóbulos brancos, tais como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção de CD4+ ou CD8+ é utilizada para separar células T auxiliado- ras CD4+ e citotóxicas CD8+. Essas populações CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações através da seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau re- lativamente mais elevado em uma ou mais subpopulações de células T virgens, de memória e/ou efetoras.
[00112] Em algumas modalidades, as células T CD8+ são ainda en- riquecidas ou esgotadas de células-tronco virgens, de memória cen- tral, de memória efetora e/ou de memória central, tais como por sele- ção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associ- ados à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enri- quecimento para células T de memória central (TCM) é realizado para aumentar a eficácia, tal como para melhorar a sobrevivência de longo prazo, expansão e/ou enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto em tais subpopulações.
[00113] Em algumas modalidades, as células T são células T autó- logas. Neste método, amostras de tumor são obtidas de pacientes e uma única suspensão de células é obtida. A única suspensão de célu- las pode ser obtida de qualquer maneira adequada, por exemplo, me- canicamente (desagregando o tumor utilizando, por exemplo, um gen- tleMACS™ Dissociator, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.) ou enzimatica- mente (por exemplo, colagenase ou DNase). As únicas suspensões de células de digestão enzimática de tumor são cultivadas em interleuci- na-2 (IL-2).
[00114] As células T cultivadas podem ser agrupadas e expandidas rapidamente. A expansão rápida fornece um aumento no número de células T específicas do antígeno de pelo menos cerca de 50 vezes (por exemplo, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 vezes ou mais) ao longo de um período de cerca de 10 a cerca de 14 dias. Mais preferivelmente, a expansão rápida fornece um aumento de pelo menos cerca de 200 vezes (por exemplo, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou mais) ao longo de um período de cerca de 10 a cerca de 14 dias.
[00115] A expansão pode ser executada por qualquer um de vários métodos como são conhecidos na técnica. Por exemplo, as células T podem ser expandidas rapidamente utilizando estimulação não especí- fica do receptor de células T na presença de linfócitos alimentadores e interleucina-2 (IL-2) ou interleucina-15 (IL-15), com IL-2 sendo a prefe- rível. O estímulo do receptor de células T não específico pode incluir cerca de 30 ng/ml de OKT3, um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD3 (disponível da Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.). Alternativamen- te, as células T podem ser rapidamente expandidas através da estimu- lação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) in vitro com um ou mais antígenos (incluindo partes antigênicas dos mesmos, tal como epitopos ou uma célula) do câncer, que podem ser opcional- mente expressos a partir de um vetor, tal como um peptídeo de ligação ao antígeno leucocitário humano A2 (HLA-A2), na presença de um fa- tor de crescimento de células T, tal como 300 IU/ml IL-2 ou IL-15, com
IL-2 sendo preferível. As células T induzidas in vitro são rapidamente expandidas pela re-estimulação com os mesmos antígenos do câncer pulsados nas células apresentadoras de antígeno que expressam HLA-A2. Alternativamente, as células T podem ser re-estimuladas com linfócitos autólogos irradiados ou com linfócitos alogênicos HLA-A2+ irradiados e IL-2, por exemplo.
[00116] As células T autólogas podem ser modificadas para ex- pressar um fator de crescimento de células T que promove o cresci- mento e ativação das células T autólogas. Fatores de crescimento de células T adequados incluem, por exemplo, interleucina (IL)-2, IL-7, IL- 15 e IL-12. Métodos adequados de modificação são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Nos aspectos particulares, células T autólogas modificadas expressam o fator de crescimento de células T em níveis elevados. As sequências de codificação do fator de crescimento de células T, tais como aquelas de IL-12, estão facilmente disponíveis na técnica, assim como estão os promotores, a ligação operável dos quais a uma sequência de codifi- cação do fator de crescimento de células T promove expressão de alto nível. B. Células NK
[00117] Em algumas modalidades, as células imunes são células exterminadoras naturais (NK). As células NK são uma subpopulação de linfócitos que possuem citotoxicidade espontânea contra uma vari- edade de células tumorais, células infectadas por vírus e algumas cé- lulas normais da medula óssea e do timo. As células NK se diferenci- am e amadurecem na medula óssea, nódulos linfáticos, baço, amígda- las e timo. As células NK podem ser detectadas por marcadores de superfície específicos, tais como CD16, CD56 e CD8 em seres huma- nos. As células NK não expressam receptores de antígenos de células T, o marcador pan T CD3 ou receptores de células B de imunoglobuli- na de superfície.
[00118] Em certas modalidades, as células NK são derivadas de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), produ- tos de leucaferese não estimulada (PBSC), células-tronco embrioná- rias humanas (hESCs), células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), sangue da medula óssea ou cordão umbilical por métodos bem co- nhecidos na técnica. Particularmente, o CB umbilical é utilizado para derivar células NK. Em certos aspectos, as células NK são isoladas e expandidas pelo método anteriormente descrito de expansão ex vivo de células NK (Spanholtz et al., 2011; Shah et al., 2013). Neste méto- do, as células mononucleares CB são isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll e cultivadas em um biorreator com IL-2 e células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs). Após 7 dias, a cultura de células é esgotada de quaisquer células que expressam CD3 e recultivadas por mais 7 dias. As células são novamente esgota- das por CD3 e caracterizadas para determinar a porcentagem de célu- las CD56+/CD3- ou células NK. Em outros métodos, o CB umbilical é utilizado para derivar células NK pelo isolamento de células CD34+ e diferenciação em células CD56+/CD3- através do cultivo em meio con- tendo SCF, IL-7, IL-15 e IL-2.
[00119] Nas modalidades específicas, as células NK são expandi- das em algum ponto durante sua preparação. Em casos específicos, a expansão das células NK compreende: estimulação de células mono- nucleares (MNCs) do sangue do cordão umbilical na presença de célu- las apresentadoras de antígenos (APCs) e IL-2; e re-estimular as célu- las com APCs para produzir células NK expandidas, em que em pelo menos em alguns casos o método é executado em um biorreator. A etapa de estimulação pode direcionar as MNCs para as células NK. A etapa de re-estimulação pode ou não compreender a presença de IL-
2. Em aspectos particulares, o método não compreende a remoção ou adição de quaisquer componentes do meio durante uma etapa de es- timulação. Em aspectos particulares, o método é executado dentro de um determinado período de tempo, tal como em menos de 15 dias, por exemplo, em 14 dias.
[00120] Em uma certa modalidade, as células NK são expandidas por um método ex vivo para a expansão que compreende: (a) obter uma população inicial de células mononucleares (MNCs) do sangue do cordão umbilical; (b) estimular as MNCs na presença de células apre- sentadoras de antígeno (APCs) e IL-2; e (c) re-estimular as células com APCs para produzir células NK expandidas, em que o método é executado em um biorreator e é compatível com as boas práticas de fabricação (GMP). A estimulação da etapa (b) pode direcionar as MNCs para as células NK. A etapa (c) pode ou não compreender a presença de IL-2. Em aspectos particulares, o método não compreen- de a remoção ou adição de quaisquer componentes de mídia durante a etapa (b). Nos aspectos particulares, o método é executado em me- nos de 15 dias, tal como em 14 dias.
[00121] Em alguns aspectos, o método ainda compreende a deple- ção de células positivas para um ou mais marcadores particulares, tais como CD3, por exemplo. Em certos aspectos, a etapa de depleção é executada entre as etapas (b) e (c). Em alguns aspectos, as células são removidas do biorreator para a depleção de CD3 e colocadas no biorreator para a etapa (c).
[00122] Em certos aspectos, a obtenção da população inicial de MNCs do sangue do cordão umbilical compreende o descongelamento do sangue do cordão umbilical na presença de dextrano, albumina de soro humano (HSA), DNAse e/ou cloreto de magnésio. Em aspectos particulares, a obtenção da população inicial de MNCs do sangue do cordão umbilical compreende o descongelamento do sangue do cor- dão umbilical na presença de dextrano e/ou DNase. Em aspectos es- pecíficos, o sangue do cordão umbilical é lavado na presença de 5 a 20%, tal como 10% de dextrano. Em certos aspectos, o sangue do cordão umbilical é colocado em suspensão na presença de cloreto de magnésio, tal como em uma concentração de 100 a 300 mM, particu- larmente 200 mM. Em alguns aspectos, a obtenção compreende a execução da centrifugação de gradiente de densidade Ficoll para obter células mononucleares (MNCs).
[00123] Em certos aspectos, o biorreator é um biorreator permeável a gás. Em aspectos particulares, o biorreator permeável a gás é G- Rex100M ou G-Rex100. Em alguns aspectos, a estimulação da etapa (b) é executada em 3 a 5 L de meio, tal como 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 L.
[00124] Em alguns aspectos, as APCs são irradiadas com radiação gama. Em certos aspectos, as APCs são projetadas para expressar IL- 21 ligada à membrana (mbIL-21). Nos aspectos particulares, as APCs são projetadas para expressar IL-21, IL-15 e/ou IL-2. Em alguns as- pectos, as MNCs e APCs são cultivadas em uma relação de 1:2. Em alguns aspectos, a IL-2 está em uma concentração de 50 a 200 IU/ml, tal como 100 IU/ml. Nos aspectos particulares, a IL-2 é reabastecida a cada 2 a 3 dias.
[00125] Em aspectos particulares, a etapa (b) é executada durante 6 a 8 dias, tal como 7 dias. Em alguns aspectos, a etapa (c) é execu- tada durante 6 a 8 dias, tal como 7 dias. Em alguns aspectos, a etapa (c) não compreende a divisão das células. Nos aspectos particulares, as células são alimentadas duas vezes com IL-2 durante a etapa (c) e, em casos específicos, nenhum outro componente do meio é adiciona- do ou removido durante a etapa (c).
[00126] Em alguns aspectos, o método compreende o uso de 3, 4,
5 ou 6 biorreatores. Nos aspectos particulares, o método compreende o uso de menos de 10 biorreatores.
[00127] Em aspectos específicos, as células NK são expandidas pelo menos 500 vezes, 800 vezes, 1000 vezes, 1200 vezes, 1500 ve- zes, 2000 vezes, 2500 vezes, 3000 vezes ou 5000 vezes. Em aspec- tos particulares, o cultivo das células NK no biorreator produz células NK mais de 1000 vezes em comparação com a cultura líquida estática.
[00128] Em certos aspectos, o método não compreende a corres- pondência de antígeno leucocitário humano (HLA). Em alguns aspec- tos, a população inicial de células NK não é obtida de um doador ha- ploidêntico.
[00129] Em alguns aspectos, as células NK expandidas possuem atividade antitumoral aumentada assim como compreende as células NK expandidas do sangue periférico. Em certos aspectos, as células NK expandidas possuem maior expressão de um ou mais genes do ciclo celular, um ou mais genes de divisão celular e/ou um ou mais ge- nes de replicação de DNA, em comparação com células NK expandi- das do sangue periférico. Em alguns aspectos, as células NK expandi- das possuem maior capacidade proliferativa em comparação com as células NK expandidas do sangue periférico. Em alguns aspectos, as células NK expandidas não apresentam exaustão. Em certos aspec- tos, a exaustão é detectada através da medição da expressão de per- forina, granzima, CD57, KLRG1 e/ou PD1. Em alguns aspectos, as células NK expandidas possuem alta expressão de perforina e/ou granzima. Em certos aspectos, as células NK expandidas possuem baixa ou nenhuma expressão de CD57, KLRG1 e/ou PD1.
[00130] Em alguns aspectos, as células NK expandidas compreen- dem uma dose clinicamente relevante. Em certos aspectos, o sangue do cordão umbilical é sangue do cordão umbilical congelado. Nos as- pectos particulares, o sangue do cordão umbilical congelado foi testa-
do com relação a uma ou mais doenças infecciosas, tais como hepati- te A, hepatite B, hepatite C, Trypanosoma cruzi, HIV, vírus T- linfotrópico humano, sífilis, vírus Zika, e assim por diante. Em alguns aspectos, o sangue do cordão umbilical é sangue do cordão umbilical acumulado, tal como de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 unidades individuais de san- gue do cordão umbilical.
[00131] Em alguns aspectos, as células NK não são autólogas, tais como em relação a um indivíduo receptor. Em certos aspectos, as cé- lulas NK não são alogênicas, tais como em relação a um indivíduo re- ceptor.
[00132] Em alguns aspectos, as APCs são células apresentadoras de antígenos universais (uAPCs). Em certos aspectos, as uAPCs são projetadas para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleuci- na-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL). Em alguns aspectos, as uAPCs expressam CD48. Em certos aspectos, as uAPCs expressam CS1. Nos aspectos particulares, as uAPCs expres- sam CD48 e CS1. Em alguns aspectos, as uAPCs não possuem es- sencialmente nenhuma expressão de moléculas de HLA classe I, II e/ou CD1d endógenas. Em certos aspectos, as uAPCs expressam ICAM-1 (CD54) e/ou LFA-3 (CD58). Nos aspectos particulares, as uA- PCs são ainda definidas como aAPCs derivadas de células de leuce- mia, tais como células K562. C. Células-tronco
[00133] Em algumas modalidades, as células imunes da presente descrição podem ser células-tronco, tais como células-tronco pluripo- tentes induzidas (PSCs), células-tronco mesenquimais (MSCs) ou cé- lulas-tronco hematopoiéticas (HSCs).
[00134] As células-tronco pluripotentes aqui utilizadas podem ser células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), células iPS comumente abreviadas ou iPSCs. Com exceção das células germinativas, qual-
quer célula pode ser utilizada como ponto de partida para iPSCs. Por exemplo, os tipos de células podem ser queratinócitos, fibroblastos, células hematopoiéticas, células mesenquimais, células do fígado ou células do estômago. Não há limitação no grau de diferenciação celu- lar ou na idade de um animal do qual as células são coletadas; mesmo células progenitoras indiferenciadas (incluindo células-tronco somáti- cas) e finalmente células maduras diferenciadas podem ser utilizadas como fontes de células somáticas nos métodos aqui divulgados.
[00135] As células somáticas podem ser reprogramadas para pro- duzir células iPS utilizando métodos conhecidos de uma pessoa de habilidade na técnica. Geralmente, os fatores de reprogramação nu- clear são utilizados para produzir células-tronco pluripotentes a partir de uma célula somática. Em algumas modalidades, pelo menos três ou pelo menos quatro de Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog e Lin28 são utilizados. Em outras modalidades, Oct3/4, Sox2, c-Myc e Klf4 são uti- lizados ou Oct3/4, Sox2, Nanog e Lin28.
[00136] Uma vez derivadas, as iPSCs podem ser cultivadas em um meio suficiente para manter a pluripotência. Em certas modalidades, condições indefinidas podem ser utilizadas; por exemplo, células pluri- potentes podem ser cultivadas em células alimentadoras de fibroblas- tos ou um meio que foi exposto às células alimentadoras de fibroblas- tos, a fim de manter as células-tronco em um estado indiferenciado. Em algumas modalidades, a célula é cultivada na copresença de fi- broblastos embrionários de camundongo tratados com radiação ou um antibiótico para encerrar a divisão celular, como células alimentadoras. Alternativamente, as células pluripotentes podem ser cultivadas e mantidas em um estado essencialmente indiferenciado utilizando um sistema definido de cultura independente do alimentador, tal como um meio TESR™ ou meio E8™/ Essential 8™. V. Receptores de Antígenos Geneticamente Modificados
[00137] As células imunes da presente descrição podem ser geneti- camente modificadas para expressar receptores de antígenos tais co- mo TCRs, CARs, receptores de citocinas quiméricos, receptores de quimiocinas, uma combinação dos mesmos, e assim por diante. Por exemplo, as células imunes são modificadas para expressar um CAR e/ou TCR tendo especificidade antigênica para um antígeno de câncer. Múltiplos CARs e/ou TCRs, tais como para diferentes antígenos, po- dem ser adicionados às células imunes. Em alguns aspectos, as célu- las imunes são projetadas para expressar o CAR ou TCR através da substituição gênica do CAR ou TCR em um lócus de gene inibidor uti- lizando CRISPR.
[00138] Métodos adequados de modificação são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook and Ausubel, supra. Por exem- plo, as células podem ser transduzids para expressar um TCR tendo especificidade antigênica para um antígeno de câncer utilizando técni- cas de transdução descritas em Heemskerk et al., 2008 e Johnson et al., 2009.
[00139] A eletroporação de codificação de RNA para as cadeias α e β de TCR de comprimento total (ou γ e δ) pode ser utilizada como al- ternativa para superar problemas de longo prazo com autorreatividade provocada pelo emparelhamento de cadeias de TCR retroviralmente transduzidas e endógenas. Mesmo que tal emparelhamento alternativo ocorra na estratégia de transfecção transitória, as células T autorreati- vas possivelmente geradas perderão esta autorreatividade após algum tempo, visto que as cadeias α e β de TCR introduzidas são expressas apenas transitoriamente. Quando a expressão das cadeias α e β de TCR introduzidas é diminuída, apenas as células T autólogas normais são deixadas. Este não é o caso quando cadeias de TCR de compri- mento total são introduzidas através da transdução retroviral estável, que nunca perderá as cadeias de TCR introduzidas, provocando uma autorreatividade constantemente presente no paciente.
[00140] Em algumas modalidades, as células compreendem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos por meio de engenharia genética que codificam um ou mais receptores de antígeno e produtos de en- genharia genética de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, isto é, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, tal como aquela obtida de outro organismo ou célula, que, por exemplo, não é normal- mente encontrada na célula sendo planejada e/ou um organismo do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nu- cleicos não são de ocorrência natural, tal como um ácido nucleico não encontrado na natureza (por exemplo, quimérico).
[00141] Em algumas modalidades, o CAR contém um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que se liga especificamente a um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno é uma proteína expressa na superfície das células. Em algumas modalidades, o CAR é um CAR semelhante ao TCR e o antígeno é um antígeno peptídico processado, tal como um antígeno peptídico de uma proteína intrace- lular, que, como um TCR, é reconhecido na superfície celular no con- texto de uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
[00142] Receptores de antígeno exemplares, incluindo os CARs e TCRs recombinantes, assim como métodos para o planejamento e in- trodução dos receptores nas células, incluem aqueles descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedido de patente internacio- nal WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, números de publicação do pedido de patente US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patente U.S. Nos.:
6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179,
6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353 e
8.479.118, e o número de pedido de patente européia EP2537416, e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., 2013; Davila et al., 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012. Em alguns aspectos, os receptores de antígenos geneticamente modificados incluem um CAR conforme descrito na Patente U.S. No.: 7.446.190, e aqueles descritos na Publi- cação do Pedido de Patente Internacional No.: WO/2014055668 A1. A. Receptores de Antígenos Quiméricos
[00143] Em algumas modalidades, o CAR compreende: a) um ou mais domínios de sinalização intracelular, b) um domínio transmem- brana e c) um domínio extracelular compreendendo uma região de li- gação ao antígeno.
[00144] Em algumas modalidades, os receptores de antígenos pro- jetados incluem CARs, incluindo CARs ativadores ou estimuladores, CARs coestimuladores (ver a WO2014/055668) e/ou CARs inibidores (iCARs, ver Fedorov et al., 2013). Os CARs geralmente incluem um domínio de ligação de antígeno extracelular (ou ligante) ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, em alguns aspectos por meio de ligantes e/ou domínios transmembrânicos. Essas moléculas tipicamente mimetizam ou aproximam um sinal através de um receptor de antígeno natural, um sinal através de um tal receptor em combina- ção com um receptor coestimulador e/ou um sinal através de um re- ceptor coestimulador isoladamente.
[00145] Certas modalidades da presente descrição se referem ao uso de ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo do CAR específico do antígeno, incluindo um CAR que foi humanizado para reduzir a imunogenicidade (hCAR), compreendendo um domínio de sinalização intracelular, um domínio transmembrânico, e um domínio extracelular compreendendo um ou mais motivos de si- nalização. Em certas modalidades, o CAR pode reconhecer um epito-
po que compreende o espaço compartilhado entre um ou mais antíge- nos. Em certas modalidades, a região de ligação pode compreender regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo mono- clonal, regiões variáveis de um anticorpo monoclonal e/ou fragmentos de ligação ao antígeno das mesmas. Em outra modalidade, essa es- pecificidade é derivada de um peptídeo (por exemplo, citocina) que se liga a um receptor.
[00146] Contempla-se que os ácidos nucleicos do CAR humano podem ser genes humanos utilizados para melhorar a imunoterapia celular para pacientes humanos. Em uma modalidade específica, a descrição inclui um cDNA de CAR de comprimento total ou região de codificação. As regiões ou domínio de ligação ao antígeno podem compreender um fragmento das cadeias VH e VL de um fragmento va- riável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal humano particular, tal como aqueles descritos na Patente U.S.
7.109.304, aqui incorporada por referência. O fragmento também pode ser qualquer número de diferentes domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo específico do antígeno humano. Em uma modalidade mais específica, o fragmento é um scFv específico do antígeno codifi- cado por uma sequência que é otimizada para uso de códon humano para expressão em células humanas.
[00147] A disposição pode ser multimérica, tal como um anticorpo bivalente com duas especificidades ou multímeros. Os multímeros são provavelmente formados por emparelhamento cruzado da parte variá- vel das cadeias leve e pesada em um anticorpo bivalente com duas especificidades. A parte de dobradiça do construto pode ter múltiplas alternativas de ser totalmente deletada, para ter a primeira cisteína mantida, para uma substituição de prolina em vez de serina, para ser truncada até a primeira cisteína. A parte Fc pode ser excluída. Qual- quer proteína estável e/ou dimerizada pode servir a esse propósito.
Pode-se utilizar apenas um dos domínios Fc, por exemplo, o domínio CH2 ou CH3 da imunoglobulina humana. Também se pode utilizar a região CH2 e CH3 da dobradiça de uma imunoglobulina humana que foi modificada para melhorar a dimerização. Também se pode utilizar apenas a parte da dobradiça de uma imunoglobulina. Também se po- de utilizar partes de CD8alfa.
[00148] Em algumas modalidades, o ácido nucleico do CAR com- preende uma sequência que codifica outros receptores coestimulado- res, tais como um domínio transmembrânico e um domínio de sinaliza- ção intracelular de CD28 modificado. Outros receptores coestimulado- res incluem, mas não são limitados a estes, um ou mais de CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12 e 4-1BB (CD137). Além de um sinal primário iniciado por CD3, um sinal adicional fornecido por um receptor coestimulador humano inserido em um CAR humano é impor- tante para a ativação completa das células NK e pode ajudar a melho- rar a persistência in vivo e o sucesso terapêutico da imunoterapia ado- tiva.
[00149] Em algumas modalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um antígeno particular (ou marcador ou ligante), tal como um antígeno expresso em um tipo de célula particular a ser direcionado através da terapia adotiva, por exemplo, um marcador de câncer e/ou um antígeno destinado a induzir uma moderação de res- posta, tal como um antígeno expresso em um tipo de célula normal ou não doente. Assim, o CAR tipicamente inclui em sua parte extracelular uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno, tal como um ou mais fragmentos, domínios ou partes de ligação ao antígeno, ou um ou mais domínios variáveis de anticorpo e/ou moléculas de anticorpo. Em al- gumas modalidades, o CAR inclui uma parte de ligação ao antígeno ou partes de uma molécula de anticorpo, tal como um fragmento de anti- corpo de cadeia única (scFv) derivado das cadeias pesadas variáveis
(VH) e leves variáveis (VL) de um anticorpo monoclonal (mAb).
[00150] Em certas modalidades do receptor de antígeno quimérico, a parte específica do antígeno do receptor (que pode ser referida co- mo um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação ao antígeno) compreende um antígeno associado ao tumor ou um domí- nio de ligação ao antígeno específico do patógeno. Os antígenos in- cluem antígenos de carboidrato reconhecidos por receptores de reco- nhecimento padrão, tais como Dectina-1. Um antígeno associado ao tumor pode ser de qualquer tipo, contanto que seja expresso na super- fície celular das células tumorais. Modalidades exemplares de antíge- nos associados ao tumor incluem CD19, CD20, antígeno carcinoem- brionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, antígeno de tumor epitelial, antígeno associado a mela- noma, p53 mutado, ras mutado, e assim por diante. Em certas modali- dades, o CAR pode ser coexpresso com uma citocina para melhorar a persistência quando há uma baixa quantidade de antígeno associado ao tumor. Por exemplo, o CAR pode ser coexpresso com uma ou mais citocinas, tais como IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21, ou uma com- binação das mesmas.
[00151] A sequência do quadro de leitura aberto que codifica o re- ceptor quimérico pode ser obtida a partir de uma fonte de DNA genô- mico, uma fonte de cDNA ou pode ser sintetizada (por exemplo, por meio de PCR), ou suas combinações. Dependendo do tamanho do DNA genômico e do número de íntrons, pode ser desejável utilizar cDNA ou uma combinação dos mesmos, visto que os íntrons estabili- zam o mRNA. Da mesma forma, pode ser ainda mais vantajoso utilizar regiões não codificantes endógenas ou exógenas para estabilizar o mRNA.
[00152] É contemplado que o construto quimérico pode ser introdu- zido nas células imunes como DNA nu ou em um vetor adequado. Os métodos de transfecção estável de células por eletroporação utilizando DNA nu são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.410.319. DNA nu geralmente se refere ao DNA que codifica um receptor quimérico contido em um vetor de expressão de plasmídeo na orientação apropriada para expressão.
[00153] Alternativamente, um vetor viral (por exemplo, um vetor re- troviral, vetor adenoviral, vetor viral adeno-associado ou vetor lentivi- ral) pode ser utilizado para introduzir o construto quimérico nas células imunes. Os vetores adequados para uso de acordo com o método da presente descrição são não replicantes nas células imunes. Um gran- de número de vetores é conhecido que são baseados em vírus, onde o número de cópias do vírus mantido na célula é baixo o suficiente para manter a viabilidade da célula, tal como, por exemplo, vetores basea- dos em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV.
[00154] Em alguns aspectos, a ligação específica ao antígeno ou componente de reconhecimento está ligada a um ou mais domínios de sinalização transmembrana e intracelular. Em algumas modalidades, o CAR inclui um domínio transmembrânico fundido ao domínio extrace- lular do CAR. Em uma modalidade, o domínio transmembrânico que naturalmente está associado a um dos domínios no CAR é utilizado. Em alguns casos, o domínio transmembrânico é selecionado ou modi- ficado através da substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrânicos das mesmas ou dife- rentes proteínas de membrana de superfície para minimizar as intera- ções com outros membros do complexo receptor.
[00155] O domínio transmembrânico em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou sintética. Quando a fonte é natural, o domínio em alguns aspectos é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembranares incluem aquelas derivadas de (isto é, compreendem pelo menos as regiões transmembranares da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, moléculas CD28, CD3 zeta, CD3 epsílon, CD3 gama, CD3 delta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D e DAP. Alternativamente, o domínio transmembrânico em al- gumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio trans- membrânico sintético compreende resíduos predominantemente hidro- fóbicos tais como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrânico sintético.
[00156] Em certas modalidades, as tecnologias de plataforma divul- gadas nesta invenção para geneticamente modificar as células imu- nes, tais como células NK, compreendem (i) transferência de genes não virais utilizando um dispositivo de eletroporação (por exemplo, uma tecnologia nucleofetora), (ii) CARs que sinalizam através en- dodomínios (por exemplo, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ, ou outras combinações), (iii) CARs com comprimentos variáveis de domínios ex- tracelulares conectando o domínio de reconhecimento de antígeno à superfície celular e, em alguns casos, (iv) células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPC) derivadas de K562 para serem capazes de expandir robusta e numericamente as células imunes CAR+ (Singh et al., 2008; Singh et al., 2011). B. Receptor de Células T (TCR)
[00157] Em algumas modalidades, os receptores de antígenos ge- neticamente modificados incluem TCRs recombinantes e/ou TCRs clonados de células T de ocorrência natural. Um "receptor de células T" ou "TCR" refere-se a uma molécula que contém cadeias α e β vari- áveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou cadeias γ e δ variáveis (também conhecidas como TCRγ e TCRδ, res- pectivamente) e que é capaz de se ligar especificamente a um peptí-
deo de antígeno ligado a um receptor de MHC. Em algumas modalida- des, o TCR está na forma αβ.
[00158] Tipicamente, os TCRs que existem nas formas αβ e γδ são de uma forma geral estruturalmente semelhantes, mas as células T que os expressam podem ter funções ou localizações anatômicas dis- tintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma solúvel. Geralmente, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsável pelo reco- nhecimento de antígenos ligados às moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmem- brânico e/ou uma extremidade citoplasmática curta (ver, por exemplo, Janeway et al, 1997). Por exemplo, em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode possuir um domínio variável de imunoglobulina N- terminal, um domínio constante de imunoglobulina, uma região trans- membranar e uma extremidade citoplasmática curta na extremidade C- terminal. Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteí- nas invariantes do complexo CD3 envolvido na mediação da transdu- ção de sinal. A menos que indicado de outra forma, o termo "TCR" de- ve ser entendido como de abranger seus fragmentos funcionais de TCR. O termo também abrange TCRs intactos ou de comprimento to- tal, incluindo TCRs na forma αβ ou forma γδ.
[00159] Assim, para propósitos nesta invenção, a referência a um TCR inclui qualquer TCR ou fragmento funcional, tal como uma parte de ligação ao antígeno de um TCR que se liga a um peptídeo antigêni- co específico ligado a uma molécula de MHC, isto é, complexo MHC- peptídeo. Uma "parte de ligação ao antígeno" ou "fragmento de ligação ao antígeno" de um TCR, que pode ser utilizado de modo trocável, re- fere-se a uma molécula que contém uma porção dos domínios estrutu- rais de um TCR, mas que se liga ao antígeno (por exemplo, complexo
MHC-peptídeo) ao qual o TCR completo se liga. Em alguns casos, uma parte de ligação ao antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, tal como uma cadeia variável e uma cadeia β variável de um TCR, suficiente para formar um sítio de ligação para ligação a um complexo específico MHC-peptídeo, tal como geralmente onde cada cadeia contém três regiões determinantes de complementaridade.
[00160] Em algumas modalidades, os domínios variáveis das ca- deias de TCR se associam para formar loops, ou regiões determinan- tes de complementaridade (CDRs) análogas às imunoglobulinas, que conferem reconhecimento de antígeno e determinam a especificidade do peptídeo através da formação do sítio de ligação da molécula de TCR e determinam a especificidade do peptídeo. Tipicamente, como as imunoglobulinas, os CDRs são separados por regiões framework (FRs) (ver, por exemplo, Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Le- franc et al., 2003). Em algumas modalidades, a CDR3 é a principal CDR responsável por reconhecer o antígeno processado, embora a CDR1 da cadeia alfa também tenha mostrado interagir com a parte N- terminal do peptídeo antigênico, enquanto que a CDR1 da cadeia beta interage com a parte C-terminal do peptídeo. Acredita-se que a CDR2 reconheça a molécula de MHC. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia β pode conter uma região de hipervariabilidade adi- cional (HV4).
[00161] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR contêm um domínio constante. Por exemplo, como as imunoglobulinas, a porção extracelular das cadeias de TCR (por exemplo, cadeia α, cadeia β) po- de conter dois domínios de imunoglobulina, um domínio variável (por exemplo, Va ou Vp; tipicamente aminoácidos 1 a 116 com base na numeração de Kabat Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) no N-terminal, e um domínio constante (por exemplo, domínio constante de cadeia a ou Ca, tipicamente aminoácidos 117 a 259 com base em Kabat, domínio constante de cadeia β ou Cp, tipicamente aminoácidos 117 a 295 com base em Kabat) adjacente à membrana celular. Por exemplo, em al- guns casos, a porção extracelular do TCR formado pelas duas cadeias contém dois domínios constantes proximais à membrana e dois domí- nios variáveis distais à membrana contendo CDRs. O domínio cons- tante do domínio TCR contém sequências de conexão curtas nas quais um resíduo de cisteína forma uma ligação de dissulfeto, fazendo uma ligação entre as duas cadeias. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo de cisteína adicional em cada uma das ca- deias α e β de tal modo que o TCR contenha duas ligações de dissul- feto nos domínios constantes.
[00162] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR podem con- ter um domínio transmembrânico. Em algumas modalidades, o domí- nio transmembrânico é carregado positivamente. Em alguns casos, as cadeias de TCR contêm uma extremidade citoplasmática. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas como o CD3. Por exemplo, um TCR contendo domínios constantes com uma região transmembranar pode ancorar a proteína na mem- brana celular e se associar com as subunidades invariantes dos me- canismos ou complexo de sinalização de CD3.
[00163] Geralmente, CD3 é um complexo multiprotéico que pode possuir três cadeias distintas (γ, δ e ε) em mamíferos e a cadeia ζ. Por exemplo, nos mamíferos, o complexo pode conter uma cadeia CD3γ, uma cadeia CD3δ, duas cadeias CD3ε e um homodímero de cadeias CD3ζ. As cadeias CD3γ, CD3δ e CD3ε são proteínas de superfície ce- lular altamente relacionadas da superfamília de imunoglobulinas con- tendo um único domínio de imunoglobulina. As regiões transmembra- na das cadeias CD3γ, CD3δ e CD3ε são carregadas negativamente, o que é uma característica que permite que essas cadeias se associem às cadeias receptoras de células T positivamente carregadas. As ex- tremidades intracelulares das cadeias CD3γ, CD3δ e CD3ε contêm, cada um único motivo conservado conhecido como motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora ou ITAM, enquanto cada cadeia CD3ζ possui três. Geralmente, os ITAMs estão envolvidos na capaci- dade de sinalização do complexo de TCR. Essas moléculas acessó- rias possuem regiões transmembranares carregadas negativamente e desempenham um papel na propagação do sinal a partir do TCR para dentro da célula. As cadeias CD3 e ζ, juntamente com o TCR, formam o que é conhecido como complexo receptor de células T.
[00164] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodíme- ro de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser um construto de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodímero contendo duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que estão ligadas, tal como por uma ligação de dissulfe- to ou ligações de dissulfeto. Em algumas modalidades, um TCR para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de câncer) é identificado e introduzido nas células. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o TCR pode ser obtido a partir de uma variedade de fon- tes, tal como pela amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) de sequências de DNA de TCR publicamente disponíveis. Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, tal como de células, tais como de uma célula T (por exemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T ou outra fonte publicamente dispo- nível. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, um clone de célu- las T de alta afinidade pode ser isolado de um paciente e o TCR isola- do. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma ou clone de células T cultivadas. Em algumas modalidades, o clone de
TCR para um antígeno alvo foi gerado em camundongos transgênicos planejados com genes do sistema imunológico humano (por exemplo, o sistema de antígeno leucocitário humano, ou HLA). Ver, por exem- plo, antígenos tumorais (ver, por exemplo, Parkhurst et al., 2009 e Co- hen et al., 2005). Em algumas modalidades, a exibição de fago é utili- zada para isolar TCRs contra um antígeno alvo (ver, por exemplo, Va- rela-Rohena et al., 2008 e Li, 2005). Em algumas modalidades, o TCR ou parte de ligação ao antígeno do mesmo pode ser gerado sintetica- mente a partir do conhecimento da sequência do TCR. C. Células Apresentadoras de Antígeno
[00165] Células apresentadoras de antígeno, que incluem macrófa- gos, linfócitos B e células dendríticas, são distinguidas por sua expres- são de uma molécula de MHC particular. As APCs internalizam o antí- geno e reexpressam uma parte desse antígeno, juntamente com a mo- lécula de MHC em sua membrana celular externa. O MHC é um gran- de complexo genético com vários lócus. Os lócus de MHC codificam duas classes principais de moléculas de membrana do MHC, referidos como MHCs de classe I e classe II. Os linfócitos T auxiliares geralmen- te reconhecem o antígeno associado às moléculas do MHC de classe II e os linfócitos T citotóxicos reconhecem o antígeno associado às moléculas do MHC de classe I. Em seres humanos, o MHC é referido como o complexo HLA e em camundongos o complexo H-2.
[00166] Em alguns casos, aAPCs são úteis na preparação de com- posições terapêuticas e produtos de terapia celular das modalidades. Para obter orientação geral sobre a preparação e uso de sistemas de apresentação de antígeno, ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos.
6.225.042, 6.355.479, 6.362.001 e 6.790.662; Publicação do Pedido de Patente U.S. Nos. 2009/0017000 e 2009/0004142; e Publicação Internacional No. WO2007/103009.
[00167] Os sistemas aAPC podem compreender pelo menos uma molécula auxiliar exógena. Qualquer número e combinação adequa- dos de moléculas auxiliares podem ser empregados. A molécula auxi- liar pode ser selecionada a partir de moléculas auxiliares, tais como moléculas coestimuladoras e moléculas de aderência. Moléculas coes- timuladoras exemplares incluem CD86, CD64 (FcγRI), ligante 41BB e IL-21. As moléculas de aderência podem incluir glicoproteínas de liga- ção a carboidratos, tais como selectinas, glicoproteínas de ligação transmembrana, tais como integrinas, proteínas dependentes de cál- cio, tais como caderinas e proteínas da superfamília de imunoglobulina (Ig) transmembrana de passagem única, tais como moléculas de ade- rência intercelular (ICAMs), que promovem, por exemplo, contato célu- la a célula ou célula a matriz. Moléculas de aderência exemplares in- cluem LFA-3 e ICAMs, tais como ICAM-1. Técnicas, métodos e rea- gentes úteis para seleção, clonagem, preparação e expressão de mo- léculas auxiliares exemplares, incluindo moléculas coestimuladoras e moléculas de aderência, são exemplificados, por exemplo, nas Paten- tes U.S. Nos. 6.225.042, 6.355.479 e 6.362.001. D. Antígenos
[00168] Entre os antígenos direcionados pelos receptores de antí- genos geneticamente modificados estão aqueles expressos no contex- to de uma doença, condição ou tipo de célula a ser direcionado por meio da terapia celular adotiva. Entre as doenças e condições estão doenças e distúrbios proliferativos, neoplásicos e malignos, incluindo cânceres e tumores, incluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imunológico, tais como linfomas, leucemias e/ou mielomas, tais como leucemias B, T e mieloide, linfomas e mielomas múltiplos. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expresso ou superexpresso em células da doença ou condição, por exemplo, as células de tumor ou patogênicas, em comparação com células ou teci- dos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expresso em células normais e/ou é expresso nas células projeta- das.
[00169] Qualquer antígeno adequado pode ser direcionado no pre- sente método. O antígeno pode estar associado a certas células can- cerosas, mas não associado a células não cancerosas, em alguns ca- sos. Antígenos exemplares incluem, mas não são limitados a estes, moléculas antigênicas de agentes infecciosos, autoantígenos, antíge- nos associados a tumor/câncer e neoantígenos tumorais (Linnemann et al., 2015). Nos aspectos particulares, os antígenos incluem NY- ESO, EGFRvIII, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 e CEA. Nos aspectos particulares, os antíge- nos para os dois ou mais receptores de antígeno incluem, mas não são limitados a estes, CD19, EBNA, WT1, CD123, NY-ESO, EGFRvIII, MUC1, HER2, CA-125, WT1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRA- IL/DR4 e/ou CEA. As sequências para esses antígenos são conheci- das na técnica, por exemplo, no banco de dados GenBank®: CD19 (No. de Acesso NG_007275.1), EBNA (No. de Acesso NG_002392.2), WT1 (No. de Acesso NG_009272.1), CD123 (No. de Acesso NC_000023.11), NY-ESO (No. de Acesso NC_000023.11), EGFRvIII (No. de Acesso NG_007726.3), MUC1 (No. de Acesso NG_029383.1), HER2 (No. de Acesso NG_007503.1), CA-125 (No. de Acesso NG_055257.1), WT1 (No. de Acesso NG_009272.1), Mage-A3 (No. de Acesso NG_013244.1), Mage-A4 (No. de Acesso NG_013245.1), Mage-A10 (No. de Acesso NC_000023.11), TRAIL/DR4 (No. de Aces- so NC_000003.12) e/ou CEA (No. de Acesso NC_000019.10).
[00170] Antígenos associados ao tumor podem ser derivados de cânceres da próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal, mesotelioma, ovário, fígado, cérebro, osso, estômago, baço, testicular, cervical, anal, vesícula biliar, tireoide ou melanoma, como exemplos. Antígenos associados a tumor exemplares ou antígenos derivados de células tumorais incluem MAGE 1, 3 e MAGE 4 (ou outros antígenos MAGE, tais como aqueles divulgados na Publicação de Patente Inter- nacional No. WO 99/40188); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (também conhecido como NY ESO 1); SAGE; e HAGE ou GAGE. Estes exem- plos não limitativos de antígenos tumorais são expressos em uma am- pla faixa de tipos de tumor, tais como melanoma, carcinoma de pul- mão, sarcoma e carcinoma de bexiga. Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.544.518. Os antígenos associados ao tumor de câncer de próstata incluem, por exemplo, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno específico da próstata (PSA), fosfatos de ácido da próstata, NKX3.1 e antígeno epitelial transmembranar seis da próstata (STEAP).
[00171] Outros antígenos associados a tumor incluem Plu-1, HASH- 1, HasH-2, Cripto e Criptina. Adicionalmente, um antígeno tumoral po- de ser um auto-hormônio peptídico, tal como o hormônio liberador do hormônio gonadotrofina de comprimento total (GnRH), um peptídeo curto de 10 aminoácidos de comprimento, útil no tratamento de muitos cânceres.
[00172] Antígenos tumorais incluem antígenos tumorais derivados de cânceres que são caracterizados pela expressão de antígenos as- sociados a tumores, tais como a expressão de HER-2/neu. Os antíge- nos associados ao tumor de interesse incluem antígenos tumorais es- pecíficos de linhagem, tais como os antígenos da linhagem melanóci- to-melanoma MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinase e pro- teína relacionada à tirosinase. Antígenos associados a tumor ilustrati- vos incluem, mas não são limitados a estes, antígenos tumorais deri- vados ou compreendendo qualquer um ou mais de p53, Ras, c-Myc, serina/treonina cinases citoplasmáticas (por exemplo, A-Raf, B-Raf e C-Raf, cinases dependentes de ciclina), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE,
DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART- 1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, Tirosinase, TRP-1, TRP-2, ART-4, CA- MEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, Fosfoinositídeo 3-cinases (PI3Ks), receptores de TRK, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, antígeno tumoral de Wilms (WT1), AFP, - catenina/m, Caspase-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, Anexina II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, fator regulador de interferon 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, transdutor de sinal de cálcio associ- ado ao tumor 1 (TACSTD1) TACSTD2, receptor de tirosina cinases (por exemplo, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (em particular, EGFRvIII), receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascu- lar (VEGFR)), tirosina cinases citoplasmáticas (por exemplo, família src, família syk-ZAP70), cinase ligado à integrina (ILK), transdutores de sinal e ativadores da transcrição STAT3, STATS e STATE, fatores induzíveis por hipóxia (por exemplo, HIF-1 e HIF-2), Fator Nuclear- Kappa B (NF-B), receptores Notch (por exemplo, Notch1-4), c-Met, al- vos mamíferos de rapamicina (mTOR), WNT, cinases reguladas por sinal extracelular (ERKs) e suas subunidades reguladoras, PMSA, PR- 3, MDM2, Mesotelina, carcinoma de células renais-5T4, SM22-alfa, anidrases carbônicas I (CAI) e IX (CAIX) (também conhecido como G250), STEAD, TEL/AML1, GD2, proteinase3, hTERT, pontos de inter- rupção de translocação de sarcoma, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de an- drogênio, ciclina B1, ácido polissiálico, MYCN, RhoC, GD3, fucosil GM1, mesoteliano, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, proteína de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, legumaína, TIE2,
Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, antígeno relacionado a fos 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRN1 e idiótipo.
[00173] Os antígenos podem incluir regiões epitópicas ou peptídeos epitópicos derivados de genes mutados em células tumorais ou de ge- nes transcritos em diferentes níveis em células tumorais em compara- ção com as células normais, tais como enzima telomerase, survivina, mesotelina, ras mutado, rearranjo bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado ou do tipo selvagem, citocromo P450 1B1 e sequências de íntron expressas de forma anormal tais como N-acetilglucosaminiltransferase-V; rear- ranjos clonais de genes de imunoglobulina gerando idiótipos únicos em mieloma e linfomas de células B; antígenos tumorais que incluem regiões epitópicas ou peptídeos epitópicos derivados de processos oncovirais, tais como proteínas do vírus do papiloma humano E6 e E7; proteína do vírus Epstein bar LMP2; proteínas oncofetais não mutadas com uma expressão seletiva para tumor, tal como antígeno carci- noembrionário e alfafetoproteína.
[00174] Em outras modalidades, um antígeno é obtido ou derivado de um microrganismo patogênico ou de um microrganismo patogênico oportunista (também denominado nesta descrição um microrganismo de doença infecciosa), tal como um vírus, fungo, parasita e bactéria. Em certas modalidades, os antígenos derivados de um tal microrga- nismo incluem proteínas de comprimento total.
[00175] Organismos patogênicos ilustrativos cujos antígenos são contemplados para uso no método aqui descrito incluem vírus da imu- nodeficiência humana (HIV), vírus herpes simplex (HSV), vírus sincicial respiratório (RSV), citomegalovírus (CMV), vírus de Epstein-Barr (EBV), Influenza A, B e C, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da estomatite vesicular (VSV), poliomavírus (por exemplo, vírus BK e ví- rus JC), adenovírus, espécies Staphylococcus incluindo Staphylococ-
cus aureus resistente à meticilina (MRSA), e espécies Streptococcus incluindo Streptococcus pneumoniae. Como ficaria entendido pela pessoa versada, as proteínas derivadas destes e de outros microrga- nismos patogênicos para uso como antígeno conforme descrito nesta invenção e as sequências de nucleotídeo que codificam as proteínas podem ser identificadas em publicações e em bancos de dados públi- cos tais como GENBANK®, SWISS-PROT® e TREMBL®.
[00176] Os antígenos derivados do vírus da imunodeficiência hu- mana (HIV) incluem qualquer uma das proteínas estruturais do vírion HIV (por exemplo, gp120, gp41, p17, p24), protease, transcriptase re- versa ou proteínas do HIV codificadas por tat, rev, nef, vif, vpr e vpu.
[00177] Os antígenos derivados do vírus herpes simplex (por exemplo, HSV1 e HSV2) incluem, mas não são limitados a estes, pro- teínas expressas de genes tardios de HSV. O último grupo de genes predominantemente codifica as proteínas que formam a partícula do vírion. Essas proteínas incluem as cinco proteínas de (UL) que formam o capsídeo viral: UL6, UL18, UL35, UL38 e a proteína do capsídeo principal UL19, UL45 e UL27, cada um dos quais pode ser utilizado como um antígeno como aqui descrito. Outras proteínas de HSV ilus- trativas contempladas para uso como antígenos nesta invenção inclu- em as proteínas ICP27 (H1, H2), glicoproteína B (gB) e glicoproteína D (gD). O genoma do HSV compreende pelo menos 74 genes, cada um codificando uma proteína que pode ser potencialmente utilizada como um antígeno.
[00178] Os antígenos derivados de citomegalovírus (CMV) incluem proteínas estruturais de CMV, antígenos virais expressos durante as fases iniciais imediatas e iniciais da replicação do vírus, glicoproteínas I e III, proteína do capsídeo, proteína de revestimento, proteína de ma- triz inferior pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 e 1E2 (UL123 e UL122), produtos de proteína do agrupamento de genes de UL128-UL150
(Rykman, et al., 2006), glicoproteína B do envoltório (gB), gH, gN e pp150. Como ficaria entendido por uma pessoa versada, as proteínas do CMV para uso como antígenos aqui descritos podem ser identifica- das em bancos de dados públicos tais como GENBANK®, SWISS- PROT® e TREMBL® (ver, por exemplo, Bennekov et al., 2004; Loe- wendorf et al., 2010; Marschall et al., 2009).
[00179] Os antígenos derivados do vírus Epstein-Ban (EBV) que são contemplados para uso em certas modalidades incluem proteínas líticas de EBV gp350 e gp110, proteínas de EBV produzidas durante a infecção de ciclo latente, incluindo antígeno nuclear de Epstein-Ban (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, proteína líder EBNA (EBNA-LP) e proteínas de membrana latentes (LMP)-1, LMP-2A e LMP-2B (ver, por exemplo, Lockey et al., 2008).
[00180] Os antígenos derivados do vírus sincicial respiratório (RSV) que são contemplados para uso nesta descrição incluem qualquer uma das onze proteínas codificadas pelo genoma do RSV, ou frag- mentos antigênicos das mesmas: NS1, NS2, N (proteína do nucleoca- psídeo), M (proteína da matriz) SH, G e F (proteínas do revestimento viral), M2 (segunda proteína da matriz), M2-1 (fator de alongamento), M2-2 (regulação da transcrição), RNA polimerase e fosfoproteína P.
[00181] Os antígenos derivados do vírus da estomatite vesicular (VSV) que são contemplados para uso incluem qualquer uma das cin- co proteínas principais codificadas pelo genoma do VSV e seus frag- mentos antigênicos: proteína grande (L), glicoproteína (G), nucleopro- teína (N), fosfoproteína (P) e proteína da matriz (M) (ver, por exemplo, Rieder et al., 1999).
[00182] Os antígenos derivados de um vírus influenza que são con- templados para uso em certas modalidades incluem hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), nucleoproteína (NP), proteínas da matriz M1 e M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 e PB2.
[00183] Os antígenos virais exemplares também incluem, mas não são limitados a estes, polipeptídeos de adenovírus, polipeptídeos de alfavírus, polipeptídeos de calicivírus (por exemplo, um antígeno de capsídeo de calicivírus), polipeptídeos de coronavírus, polipeptídeos de vírus da cinomose, polipeptídeos de vírus Ebola, polipeptídeos de enterovírus, polipeptídeos flavivírus, polipeptídeos de vírus da hepatite (AE) (um núcleo ou antígeno de superfície da hepatite B, glicoproteí- nas E1 ou E2 do vírus da hepatite C, proteínas do núcleo ou não estru- turais), polipeptídeos de herpesvírus (incluindo um vírus herpes sim- plex ou glicoproteína do vírus varicela zoster), polipeptídeos do vírus da peritonite infecciosa, polipeptídeos do vírus da leucemia, polipeptí- deos do vírus de Marburg, polipeptídeos de ortomixovírus, polipeptí- deos do vírus do papiloma, polipeptídeos do vírus da parainfluenza (por exemplo, os polipeptídeos de hemaglutinina e neuraminidase), polipeptídeos de paramixovírus, polipeptídeos de parvovírus, polipep- tídeos de pestivírus, polipeptídeos do picornavírus (por exemplo, um polipeptídeo de capsídeo de poliovírus), polipeptídeos do poxvírus (por exemplo, um polipeptídeo de vírus da varíola), polipeptídeos do vírus da raiva (por exemplo, uma glicoproteína G do vírus da raiva), polipep- tídeos de reovírus, polipeptídeos de retrovírus e polipeptídeos de rota- vírus.
[00184] Em certas modalidades, o antígeno pode ser antígeno bac- teriano. Em certas modalidades, um antígeno bacteriano de interesse pode ser um polipeptídeo secretado. Em outras modalidades, os antí- genos bacterianos incluem antígenos que possuem uma parte ou par- tes do polipeptídeo exposto na superfície celular externa da bactéria.
[00185] Os antígenos derivados de espécies de Staphylococcus incluindo Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) que são contemplados para uso incluem reguladores de virulência, tais como o sistema Agr, Sar e Sae, o sistema Arl, homólogos de Sar (Rot,
MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ e TcaR), o sistema Srr e TRAP. Outras proteínas de Staphylococcus que podem servir como antígenos incluem proteínas Clp, HtrA, MsrR, aconitase, CcpA, SvrA, Msa, CfvA e CfvB (ver, por exemplo, Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay). Os geno- mas de duas espécies de Staphylococcus aureus (N315 e Mu50) fo- ram sequenciados e estão disponíveis ao público, por exemplo, em PATRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Cen- ter, Snyder et al., 2007). Como seria entendido pela pessoa versada, as proteínas de Staphylococcus para uso como antígenos também po- dem ser identificadas em outros bancos de dados públicos tal como GenBank®, Swiss-Prot® e TrEMBL®.
[00186] Os antígenos derivados de Streptococcus pneumoniae que são contemplados para uso em certas modalidades aqui descritas in- cluem pneumolisina, PspA, proteína A de ligação à colina (CbpA), Na- nA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht e proteínas pilin (RrgA; RrgB; RrgC). Proteínas antigênicas de Streptococcus pneumoniae também são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas como um antígeno em algumas modalidades (ver, por exemplo, Zysk et al., 2000). A se- quência completa do genoma de uma cepa virulenta de Streptococcus pneumoniae foi sequenciada e, como deve ficar entendido pela pessoa versada, as proteínas de S. pneumoniae para uso nesta invenção também podem ser identificadas em outras bancos de dados públicos tais como GENBANK®, SWISS-PROT® e TREMBL®. Proteínas de interesse particular para antígenos de acordo com a presente descri- ção incluem fatores de virulência e proteínas previstas para serem ex- postas na superfície dos pneumococos (ver, por exemplo, Frolet et al., 2010).
[00187] Exemplos de antígenos bacterianos que podem ser utiliza- dos como antígenos incluem, mas não são limitados a estes, polipep-
tídeos de Actinomyces, polipeptídeos de Bacillus, polipeptídeos de Bacteroides, polipeptídeos de Bordetella, polipeptídeos de Bartonella, polipeptídeos de Borrelia (por exemplo, B. burgdorferi OspA), polipep- tídeos de Brucella, polipeptídeos de Campylobacter, polipeptídeos de Capnocytophaga, polipeptídeos de Chlamydia, polipeptídeos de Corynebacterium, polipeptídeos de Coxiella, polipeptídeos de Derma- tophilus, polipeptídeos de Enterococcus, polipeptídeos de Ehrlichia, polipeptídeos de Escherichia, polipeptídeos de Francisella, polipeptí- deos de Fusobacterium, polipeptídeos de Haemobartonella, polipeptí- deos de Haemophilus (por exemplo, proteína da membrana externa tipo b de H. influenzae), polipeptídeos de Helicobacter, polipeptídeos de Klebsiella, polipeptídeos de bactérias L-forma, polipeptídeos de Leptospira, polipeptídeos de Listeria, polipeptídeos de Mycobacteria, polipeptídeos de Mycoplasma, polipeptídeos de Neisseria, polipeptí- deos de Neorickettsia, polipeptídeos de Nocardia, polipeptídeos de Pasteurella, polipeptídeos de Peptococcus, polipeptídeos de Peptos- treptococcus, polipeptídeos de Pneumococcus (isto é, polipeptídeos de S. pneumoniae) (ver a descrição nesta invenção), polipeptídeos de Proteus, polipeptídeos de Pseudomonas, polipeptídeos de Rickettsia, polipeptídeos de Rochalimaea, polipeptídeos de Salmonella, polipeptí- deos de Shigella, polipeptídeos de Staphylococcus, polipeptídeos de streptococcus do grupo A (por exemplo, proteínas M de S. pyogenes), polipeptídeos de streptococcus do grupo B (S. agalactiae), polipeptí- deos de Treponema e polipeptídeos de Yersinia polypeptides (por exemplo, antígenos F1 e V de Y pestis).
[00188] Exemplos de antígenos fúngicos incluem, mas não são limi- tados a estes, polipeptídeos de Absidia, polipeptídeos de Acremonium, polipeptídeos de Alternaria, polipeptídeos de Aspergillus, polipeptídeos de Basidiobolus, polipeptídeos de Bipolaris, polipeptídeos de Blas- tomyces, polipeptídeos de Candida, polipeptídeos de Coccidioides,
polipeptídeos de Conidiobolus, polipeptídeos de Cryptococcus, poli- peptídeos de Curvalaria, polipeptídeos de Epidermophyton, polipeptí- deos de Exophiala, polipeptídeos de Geotrichum, polipeptídeos de His- toplasma, polipeptídeos de Madurella, polipeptídeos de Malassezia, polipeptídeos de Microsporum, polipeptídeos de Moniliella, polipeptí- deos de Mortierella, polipeptídeos de Mucor, polipeptídeos de Pae- cilomyces, polipeptídeos de Penicillium, polipeptídeos de Phialemo- nium, polipeptídeos de Phialophora, polipeptídeos de Prototheca, poli- peptídeos de Pseudallescheria, polipeptídeos de Pseudomicrodo- chium, polipeptídeos de Pythium, polipeptídeos de Rhinosporidium, polipeptídeos de Rhizopus, polipeptídeos de Scolecobasidium, poli- peptídeos de Sporothrix, polipeptídeos de Stemphylium, polipeptídeos de Trichophyton, polipeptídeos de Trichosporon e polipeptídeos de Xylohypha.
[00189] Exemplos de antígenos de parasita protozoário incluem, mas não são limitados a estes, polipeptídeos de Babesia, polipeptí- deos de Balantidium, polipeptídeos de Besnoitia, polipeptídeos de Cryptosporidium, polipeptídeos de Eimeria, polipeptídeos de Encepha- litozoon, polipeptídeos de Entamoeba, polipeptídeos de Giardia, poli- peptídeos de Hammondia, polipeptídeos de Hepatozoon, polipeptídeos de Isospora, polipeptídeos de Leishmania, polipeptídeos de Microspo- ridia, polipeptídeos de Neospora, polipeptídeos de Nosema, polipeptí- deos de Pentatrichomonas, polipeptídeos de Plasmodium. Exemplos de antígenos de helmintos parasitas incluem, mas não são limitados a estes, polipeptídeos de Acanthocheilonema, polipeptídeos de Aeluros- trongylus, polipeptídeos de Ancylostoma, polipeptídeos de Angios- trongylus, polipeptídeos de Ascaris, polipeptídeos de Brugia, polipeptí- deos de Bunostomum, polipeptídeos de Capillaria, polipeptídeos de Chabertia, polipeptídeos de Cooperia, polipeptídeos de Crenosoma, polipeptídeos de Dictyocaulus, polipeptídeos de Dioctophyme, polipep-
tídeos de Dipetalonema, polipeptídeos de Diphyllobothrium, polipeptí- deos de Diplydium, polipeptídeos de Dirofilaria, polipeptídeos de Dra- cunculus, polipeptídeos de Enterobius, polipeptídeos de Filaroides, po- lipeptídeos de Haemonchus, polipeptídeos de Lagochilascaris, polipep- tídeos de Loa, polipeptídeos de Mansonella, polipeptídeos de Muelle- rius, polipeptídeos de Nanophyetus, polipeptídeos de Necator, polipep- tídeos de Nematodirus, polipeptídeos de Oesophagostomum, polipep- tídeos de Onchocerca, polipeptídeos de Opisthorchis, polipeptídeos deostertagia, polipeptídeos de Parafilaria, polipeptídeos de Paragoni- mus, polipeptídeos de Parascaris, polipeptídeos de Physaloptera, poli- peptídeos de Protostrongylus, polipeptídeos de Setaria, polipeptídeos de Spirocerca, polipeptídeos de Spirometra, polipeptídeos de Stepha- nofilaria, polipeptídeos de Strongyloides, polipeptídeos de Strongylus, polipeptídeos de Thelazia, polipeptídeos de Toxascaris, polipeptídeos de Toxocara, polipeptídeos de Trichinella, polipeptídeos de Trichos- trongylus, polipeptídeos de Trichuris, polipeptídeos de Uncinaria e po- lipeptídeos de Wuchereria, (por exemplo, circunsporozoíta de P. falci- parum (PfCSP)), proteína de superfície esporozoíta 2 (PfSSP2), termi- nal carboxila do antígeno de estado hepático 1 (c-termo de PfLSA1) e proteína exportada 1 (PfExp-1), polipeptídeos de Pneumocystis, poli- peptídeos de Sarcocystis, polipeptídeos de Schistosoma, polipeptídeos de Theileria, polipeptídeos de Toxoplasma e polipeptídeos de Trypa- nosoma.
[00190] Exemplos de antígenos de ectoparasita incluem, mas não são limitados a estes, polipeptídeos (incluindo antígenos, assim como alérgenos) de pulgas; carrapatos, incluindo carrapatos duros e carra- patos moles; moscas, tais como mosquitos pólvora, mosquitos, mos- cas da areia, moscas negras, moscas dos cavalos, moscas dos chi- fres, moscas dos cervos, mosquitos tsé-tsé, moscas do estábulo, mos- cas causadoras de miíase e insetos picadores; formigas; aranhas, pio-
lhos; ácaros; e percevejos verdadeiros, tais como percevejos de cama e percevejos beijoqueiros. E. Genes Suicidas
[00191] Em alguns casos, quaisquer células da descrição são modi- ficadas para produzir um ou mais agentes diferentes de citocinas hete- rólogas, receptores planejados, e assim por diante. Nas modalidades específicas, as células, tais como células NK, são projetadas para abrigar um ou mais genes suicidas, e o termo "gene suicida" conforme utilizado nesta invenção é definido como um gene que, após a admi- nistração de um pró-fármaco, efetua a transição de um produto gênico para um composto que mata sua célula hospedeira. Em alguns casos, a terapia com células NK pode estar sujeita ao uso de um ou mais ge- nes suicidas de qualquer tipo quando um indivíduo recebendo a tera- pia com células NK e/ou tendo recebido a terapia com células NK mos- tra um ou mais sintomas de um ou mais eventos adversos, tais como síndrome de liberação de citocina, neurotoxicidade, anafilaxia/alergia e/ou toxicidades no/fora do tumor (como exemplos) ou é considerado em risco de ter um ou mais sintomas, incluindo iminentemente. O uso do gene suicida pode fazer parte de um protocolo planejado para uma terapia ou pode ser utilizado apenas quando for reconhecida a neces- sidade de seu uso. Em alguns casos, a terapia celular é encerrada pe- lo uso de agentes que direciona o gene suicida ou um produto gênico derivado, visto que a terapia não é mais necessária.
[00192] Exemplos de genes suicidas incluem polipeptídeos mutan- tes do fator de necrose tumoral (TNF)-alfa não secretável planejados (incluindo ligados à membrana) (ver PCT/US19/62009, que é aqui in- corporado por referência na sua totalidade), e eles podem ser direcio- nados mediante a liberação de um anticorpo que se liga ao mutante TNF-alfa. Exemplos de combinações de gene suicida/pró-fármaco que podem ser utilizadas são Vírus Herpes Simplex-timidina quinase (HSV-
tk) e ganciclovir, aciclovir ou FIAU; oxirredutase e cicloeximida; citosi- na desaminase e 5-fluorocitosina; timidina cinase timidilato cinase (Tdk::Tmk) e AZT; e desoxicitidina cinase e citosina arabinosídeo. A fosforilase do nucleosídeo purina de E. coli, um assim chamado gene suicida que converte o pró-fármaco 6-metilpurina desoxirribosídeo em 6-metilpurina purina tóxica, pode ser utilizada. Outros genes suicidas incluem CD20, CD52, caspase 9 induzível, purina nucleosídeo fosfori- lase (PNP), enzimas citocromo p450 (CYP), Carboxipeptidases (CP), Carboxilesterase (CE), Nitrorredutase (NTR), Guanina Ribosiltransfe- rase (XGRTP), enzimas Glycosidase, Metionina-α,γ-liase (MET) e Ti- midina fosforilase (TP), como exemplos. F. Métodos de Liberação
[00193] Um versado na técnica estaria bem equipado para construir um vetor por meio de técnicas recombinantes padrão (ver, por exem- plo, Sambrook et al., 2001 e Ausubel et al., 1996, ambos aqui incorpo- rados por referência) para a expressão dos receptores de antígeno da presente descrição. Os vetores incluem, mas não são limitados a es- tes, plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteriófagos, vírus de animais e vírus vegetais) e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs), tais como vetores retrovirais (por exemplo, derivados de vetores do vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV etc), vetores lentivirais (por exemplo, derivados de HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV etc.), vetores adenovirais (Ad) incluindo as formas de replica- ção competente, replicação deficiente e sem vigor, vetores virais ade- no-associados (AAV), vetores do vírus símio 40 (SV-40), vetores do vírus do papiloma bovino, vetores do vírus Epstein-Barr, vetores do vírus herpes, vetores do vírus da varíola, vetores do vírus do sarcoma murino Harvey, vetores do vírus do tumor mamário murino, vetores do vírus do sarcoma Rous, vetores do parvovírus, vetores do vírus da po- liomielite, vetores do vírus da estomatite vesicular, vetores do vírus maraba e vetores do adenovírus enadenotucirev do grupo B.
[00194] Nas modalidades específicas, o vetor é um vetor multicis- trônico, tal como descrito na PCT/US19/62014, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em tais casos, um único vetor pode codificar o CAR ou TCR (e o construto de expressão pode ser configu- rado em um formato modular para levar em conta a troca de partes do CAR ou TCR), um gene suicida e uma ou mais citocinas. a. Vetores Virais
[00195] Vetores virais que codificam um receptor de antígeno po- dem ser fornecidos em certos aspectos da presente descrição. Na ge- ração de vetores virais recombinantes, genes não essenciais são tipi- camente substituídos com um gene ou sequência de codificação por uma proteína heteróloga (ou não nativa). Um vetor viral é um tipo de construto de expressão que utiliza sequências virais para introduzir ácido nucleico e possivelmente proteínas em uma célula. A capacida- de de certos vírus de infectar células ou entrar nas células por meio de endocitose mediada por receptor e de se integrar em genomas de cé- lulas hospedeiras e expressar genes virais de forma estável e eficiente os tornou candidatos atraentes para a transferência de ácidos nuclei- cos estranhos para dentro das células (por exemplo, células de mamí- feros). Exemplos não limitativos de vetores virais que podem ser utili- zados para liberar um ácido nucleico de certos aspectos da presente descrição são descritos abaixo.
[00196] Lentivírus são retrovírus complexos, que, além dos genes retrovirais comuns gag, pol e env, contêm outros genes com função reguladora ou estrutural. Os vetores lentivirais são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 6.013.516 e 5.994.136).
[00197] Os vetores lentivirais recombinantes são capazes de infec- tar células que não se dividem e podem ser utilizados para a transfe- rência gênica tanto in vivo quanto ex vivo e expressão de sequências de ácido nucleico. Por exemplo, lentivírus recombinante capaz de in- fectar uma célula que não se divide - em que uma célula hospedeira adequada é transfectada com dois ou mais vetores que carregam as funções de acondicionamento, a saber gag, pol e env, assim como rev e tat - é descrito na Patente U.S. 5.994.136, aqui incorporado por refe- rência. b. Elementos Reguladores
[00198] Cassetes de expressão incluídos em vetores úteis na pre- sente descrição, em particular, contêm (em uma direção 5' para 3') um promotor transcricional eucariótico ligado de maneira operável a uma sequência de codificação de proteína, sinais de emenda incluindo se- quências intervenientes, e uma sequência de terminação transcricio- nal/poliadenilação. Os promotores e intensificadores que controlam a transcrição de genes de codificação de proteína em células eucarióti- cas são compostos de vários elementos genéticos. A maquinaria celu- lar é capaz de reunir e integrar as informações reguladoras transmiti- das por cada elemento, permitindo que diferentes genes desenvolvam padrões distintos e frequentemente complexos de regulação transcri- cional. Um promotor utilizado no contexto da presente descrição inclui promotores constitutivos, induzíveis e específicos de tecido. (i) Promotor/Intensificadores
[00199] Os construtos de expressão fornecidos nesta invenção compreendem um promotor para conduzir a expressão do receptor de antígeno. Um promotor geralmente compreende uma sequência que funciona para posicionar o local de início para a síntese de RNA. O exemplo mais conhecido disso é a caixa TATÁ, mas em alguns promo- tores sem uma caixa TATÁ, tal como, por exemplo, o promotor para o gene de desoxinucleotidil transferase terminal de mamífero e o promo- tor para os genes tardios de SV40, um elemento discreto sobreposto ao próprio local de início ajuda a fixar o local de iniciação. Elementos promotores adicionais regulam a frequência de iniciação da transcri- ção. Tipicamente, estes estão localizados na região 30110 pb a mon- tante do local de início, embora vários promotores tenham demonstra- do conter elementos funcionais a jusante do local de início igualmente. Para trazer uma sequência de codificação "sob o controle de" um pro- motor, posiciona-se a extremidade 5' do local de iniciação da transcri- ção do quadro de leitura da transcrição "a jusante" (isto é, 3') do pro- motor escolhido. O promotor “a montante” estimula a transcrição do DNA e promove a expressão do RNA codificado.
[00200] O espaçamento entre os elementos do promotor frequen- temente é flexível, de modo que a função do promotor é preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação entre si. No promotor tk, o espaçamento entre os elementos do promotor pode ser aumentado para 50 bp separadamente antes que a atividade co- mece a diminuir. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição. Um promotor pode ou não ser utilizado em conjunto com um "intensificador", que se refere a uma sequência regu- ladora de ação cis envolvida na ativação transcricional de uma se- quência de ácido nucleico.
[00201] Um promotor pode ser um naturalmente associado a uma sequência de ácido nucleico, como pode ser obtido pelo isolamento das sequências não codificantes 5' localizadas a montante do segmen- to de codificação e/ou éxon. Um tal promotor pode ser referido como "endógeno". Da mesma forma, um intensificador pode ser aquele natu- ralmente associado a uma sequência de ácido nucleico, localizado a jusante ou a montante dessa sequência. Alternativamente, certas van- tagens serão obtidas através do posicionamento do segmento de áci- do nucleico codificador sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não está normalmente associado a uma sequência de ácido nucleico em seu ambiente natu- ral. Um intensificador recombinante ou heterólogo também se refere a um intensificador normalmente não associado a uma sequência de ácido nucleico em seu ambiente natural. Tais promotores ou intensifi- cadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes e promotores ou intensificadores isolados de qualquer outro vírus ou célula procariótica ou eucariótica e promotores ou intensificadores que não "ocorrem de forma natural", isto é, contendo diferentes elementos de diferentes regiões reguladoras da transcrição, e/ou mutações que alteram a expressão. Por exemplo, os promotores que são mais co- mumente utilizados na construção de DNA recombinante incluem os sistemas promotores βlactamase (penicilinase), lactose e triptofano (trp). Além de produzir sequências de ácido nucleico de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequências podem ser produzidas utilizando tecnologia de clonagem recombinante e/ou de amplificação de ácido nucleico, incluindo PCR™, em conexão com as composições aqui divulgadas. Além disso, está contemplado que as sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências dentro das organelas não nucleares, tais como mitocôndrias, cloro- plastos e semelhantes, também podem ser empregadas.
[00202] Naturalmente, será importante empregar um promotor e/ou intensificador que direcione efetivamente a expressão do segmento de DNA na organela, tipo de célula, tecido, órgão ou organismo escolhido para a expressão. Aqueles de habilidade na técnica de biologia mole- cular geralmente conhecem o uso de promotores, intensificadores e combinações de tipos de células para a expressão de proteínas (ver, por exemplo, Sambrook et al. 1989, aqui incorporado por referência). Os promotores empregados podem ser constitutivos, específicos de tecido, induzíveis e/ou úteis sob as condições apropriadas para direci- onar a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido, tal como é vantajoso na produção em grande escala de proteínas e/ou peptídeos recombinantes. O promotor pode ser heterólogo ou endóge- no.
[00203] Adicionalmente, qualquer combinação promo- tor/intensificador (de acordo com, por exemplo, a Base de dados do promotor eucariótico EPDB, por meio da rede mundial de computado- res em epd.isb-sib.ch/) também pode ser utilizada para conduzir a ex- pressão. O uso de um sistema de expressão citoplasmática T3, T7 ou SP6 é outra modalidade possível. As células eucarióticas podem sus- tentar a transcrição citoplasmática de certos promotores bacterianos se a polimerase bacteriana apropriada for fornecida, como parte do complexo de liberação ou como um construto de expressão genética adicional.
[00204] Exemplos não limitativos de promotores incluem promoto- res virais precoces ou tardios, tais como, promotores precoces ou tar- dios de SV40, promotores imediatos de citomegalovírus (CMV), pro- motores percoces de vírus do sarcoma de Rous (RSV); promotores de células eucarióticas, tais como, por exemplo, promotor da beta actina, promotor GADPH, promotor da metalotioneína; e promotores de ele- mento de resposta concatenados, tais como promotores de elemento de resposta de AMP cíclico (cre), promotor de elemento de resposta de soro (sre), promotor de éster de forbol (TPA) e promotores de ele- mento de resposta (tre) perto de uma caixa TATA mínima. Também é possível utilizar sequências promotoras de hormônio do crescimento humano (por exemplo, o promotor mínimo de hormônio do crescimento humano descrito no GenBank® Accession No. X05244, nucleotídeo 283-341) ou um promotor de tumor mamário de camundongo (disponí- vel em ATCC, Cat. No. ATCC 45007). Em certas modalidades, o pro- motor é CMV IE, dectina-1, dectina-2, CD11c humano, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, beta-actina, promotor MHC classe I ou MHC classe II, no entanto, qualquer outro o promotor que é útil para condu- zir a expressão do gene terapêutico é aplicável na prática da presente descrição.
[00205] Em certos aspectos, os métodos da descrição também di- zem respeito a sequências intensificadoras, isto é, sequências de áci- do nucleico que aumentam a atividade de um promotor e que possuem o potencial de atuar em cis, e independentemente de sua orientação, mesmo em distâncias relativamente longas (até vários quilobases de distância do promotor alvo). No entanto, a função do intensificador não é necessariamente restrita a tais distâncias longas, pois eles também podem funcionar na proximidade de um determinado promotor. (ii) Sinais de Iniciação e Expressão Ligada
[00206] Um sinal de iniciação específico também pode ser utilizado nos construtos de expressão fornecidos na presente descrição para translação eficiente de sequências de codificação. Esses sinais inclu- em o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Pode ser ne- cessário fornecer sinais de controle de translação exógenos, incluindo o códon de iniciação ATG. Uma pessoa de habilidade prática na técni- ca seria facilmente capaz de determinar e fornecer os sinais necessá- rios. É bem conhecido que o códon de iniciação deve ser "estrutural" com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a translação de toda a inserção. Os sinais de controle de translação exógenos e códons de iniciação podem ser naturais ou sin- téticos. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensificadores da transcrição apropriados.
[00207] Em certas modalidades, o uso de elementos de locais de entrada de ribossomo internos (IRES) é utilizado para criar mensagens multigênicas ou policistrônicas. Os elementos IRES são capazes de contornar o modelo de varredura de ribossomo da translação depen- dente de Cap 5’ metilado e iniciar a translação em locais internos.
Elementos IRES de dois membros da família dos picornavírus (polio- mielite e encefalomiocardite) foram descritos, assim como um IRES de uma mensagem de mamífero. Os elementos IRES podem ser vincula- dos a quadros de leitura abertos heterólogos. Vários quadros de leitura abertos podem ser transcritos entre si, cada um separado por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Em virtude do elemento IRES, cada quadro de leitura aberto é acessível aos ribossomos para translação eficiente. Múltiplos genes podem ser expressos de forma eficiente utilizando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem.
[00208] Adicionalmente, certos elementos de sequência 2A podem ser utilizados para criar expressão ligada ou coexpressão de genes nos construtos fornecidos na presente descrição. Por exemplo, as se- quências de clivagem podem ser utilizadas para coexpressar genes através da ligação dos quadros de leitura abertos para formar um úni- co cistron. Uma sequência de clivagem exemplar é o F2A (vírus da febre aftosa 2A) ou uma sequência "semelhante a 2A" (por exemplo, vírus Thosea asigna 2A; T2A). (iii) Origens de Replicação
[00209] A fim de propagar um vetor em uma célula hospedeira, ele pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (frequente- mente denominados "ori"), por exemplo, uma sequência de ácido nu- cleico correspondente a oriP de EBV como descrito acima ou um oriP geneticamente modificado com uma função semelhante ou elevada na programação, que é uma sequência de ácido nucleico específica na qual a replicação é iniciada. Alternativamente, uma origem de replica- ção de outro vírus de replicação extracromossômica como descrito acima ou uma sequência de replicação autônoma (ARS) pode ser em- pregada. c. Marcadores de Seleção e Rastreáveis
[00210] Em algumas modalidades, as células contendo um constru- to da presente descrição podem ser identificadas in vitro ou in vivo in- cluindo um marcador no vetor de expressão. Tais marcadores devem conferir uma alteração identificável à célula, permitindo fácil identifica- ção de células contendo o vetor de expressão. Geralmente, um mar- cador de seleção é aquele que confere uma propriedade que leva em conta a seleção. Um marcador de seleção positivo é aquele em que a presença do marcador leva em conta sua seleção, enquanto que um marcador de seleção negativa é aquele em que sua presença impede sua seleção. Um exemplo de um marcador de seleção positiva é um marcador de resistência a medicamentos.
[00211] Geralmente, a inclusão de um marcador de seleção de fár- macos auxilia na clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores de sele- ção úteis. Além de marcadores que conferem um fenótipo que leva em conta a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, outros tipos de marcadores, incluindo marcadores ras- treáveis, tais como GFP, cuja base é a análise colorimétrica, também são contemplados. Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas rastreáveis como marcadores de seleção negativa, tais como timidina cinase do vírus herpes simplex (tk) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT). Uma pessoa de habilidade na técnica também saberia como empregar marcadores imunológicos, possivelmente em conjunto com a análise FACS. O marcador utilizado não é considerado importante, contanto que seja capaz de ser expresso simultaneamente com o áci- do nucleico que codifica um produto gênico. Outros exemplos de mar- cadores de seleção e rastreáveis são bem conhecidos de uma pessoa de habilidade na técnica. d. Outros Métodos de Liberação de Ácido Nucléico
[00212] Além da liberação viral dos ácidos nucleicos que codificam o receptor de antígeno, os seguintes são métodos adicionais de libera- ção do gene recombinante a uma determinada célula hospedeira e são, portanto, considerados na presente descrição.
[00213] A introdução de um ácido nucleico, tal como DNA ou RNA, nas células imunes da presente descrição pode utilizar quaisquer mé- todos adequados para a liberação de ácido nucleico para a transfor- mação de uma célula, como aqui descrito ou como seria conhecido de uma pessoa de habilidade prática na técnica. Tais métodos incluem, mas não são limitados a estes, liberação direta de DNA, tal como por transfecção ex vivo, por injeção, incluindo microinjeção; por eletropo- ração; por precipitação de fosfato de cálcio; pelo uso de DEAE- dextrano seguido de polietileno glicol; por carregamento sônico direto; por transfecção mediada por lipossomas e transfecção mediada por receptor; por bombardeamento de microprojéteis; por agitação com fibras de carboneto de silício; por transformação mediada por Agrobac- terium; por absorção de DNA mediada por dessecação/inibição, e qualquer combinação de tais métodos. Através da aplicação de técni- cas tais como essas, organelas, células, tecidos ou organismos podem ser transformados de forma estável ou transitória. VI. Métodos de Tratamento
[00214] As modalidades da descrição incluem métodos de trata- mento de um indivíduo para câncer, infecções de qualquer tipo e qual- quer distúrbio imunológico. O indivíduo pode utilizar o método de tra- tamento da descrição como um tratamento inicial ou após outro trata- mento ou durante outro tratamento. Os métodos de imunoterapia po- dem ser adaptados à necessidade de um indivíduo com câncer com base no tipo ou estágio do câncer e, pelo menos em alguns casos, a imunoterapia pode ser modificada durante o curso do tratamento para o indivíduo.
[00215] Em casos específicos, os métodos de tratamento são como se seguem: 1) Terapia celular adotiva com células T ou NK (ex vivo expandido ou expressando CARs ou TCRs) para tratar pacientes com câncer com qualquer tipo de malignidade hematológica, (2) Terapia celular adotivo com células T ou NK (ex vivo expandido ou expressan- do CARs ou TCRs) para tratar pacientes com câncer com qualquer tipo de câncer sólido, (3) Terapia celular adotiva (ex vivo expandido ou expressando CARs ou TCRs) com Tregs e células B reguladoras para tratar pacientes com distúrbios imunológicos, (4) Terapia celular adoti- va com células T ou NK (ex vivo expandido ou expressando CARs ou TCRs) para tratar pacientes com doenças infecciosas. A presente des- crição é a primeira a mostrar que a redução de expressão/inativação de múltiplos genes em células NK humanas contribui para a funciona- lidade aprimorada da célula e resistência ao microambiente tumoral. Nas modalidades específicas, isso tem implicações diretas no atendi- mento ao paciente utilizando uma nova abordagem imunoterapêutica que aumenta a função das próprias células imunes de um paciente ou células imunes transferidas de forma adotiva. As modalidades forne- cem uma nova abordagem para produzir células T, NK e B altamente funcionais (tanto ex vivo expandidas e CAR ou TCR projetadas) para imunoterapia. Estas incluem o direcionamento de cânceres – tumores tanto hematológicos quanto sólidos - (células NK e células T, também células T do CAR e células NK do CAR), distúrbios autoimunes e aloi- munes (células B, células B reguladoras e células T reguladoras) e tra- tamento de infecções (para células T específicas do patógeno).
[00216] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece métodos para imunoterapia compreendendo a administração de uma quantidade eficaz das células imunes da presente descrição. Em uma modalidade, uma doença ou distúrbio médico é tratado por transferên- cia da população de células NK imunes que induz uma resposta imu-
ne. Em certas modalidades da presente descrição, o câncer ou infec- ção é tratado através da transferência de uma população de células imunes que induz uma resposta imune. São aqui fornecidos métodos para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, com- preendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma terapia celular específica do antígeno. Os presentes métodos po- dem ser aplicados para o tratamento de distúrbios imunológicos, cân- ceres sólidos, cânceres hematológicos e infecções virais.
[00217] Tumores para os quais os presentes métodos de tratamen- to são úteis incluem qualquer tipo de célula maligna, tais como aquelas encontradas em um tumor sólido ou um tumor hematológico. Tumores sólidos exemplares podem incluir, mas não são limitados a estes, um tumor de um órgão selecionado do grupo que consiste em pâncreas, cólon, ceco, estômago, cérebro, cabeça, pescoço, ovário, rim, laringe, sarcoma, pulmão, bexiga, melanoma, próstata e mama. Tumores he- matológicos exemplares incluem tumores da medula óssea, maligni- dades de células T ou B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas, e semelhantes. Outros exemplos de cânceres que podem ser tratados utilizando os métodos fornecidos nesta invenção incluem, mas não são limitados a estes, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, adeno- carcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer de peritônio, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastroin- testinal e câncer estromal gastrointestinal), câncer pancreático, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, vários tipos de câncer de cabeça e pescoço e melanoma.
[00218] O câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histo-
lógico, embora não esteja limitado a estes: neoplasia, maligno; carci- noma; carcinoma indiferenciado; carcinoma de células gigantes e fusi- formes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carcinoma pilomatrix; carcinoma de células transicionais; carcinoma de células de transição papilar; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular e colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carci- noma cístico adenoide; adenocarcinoma em pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, polipose coli familiar; carcinoma sólido; tumor carci- noide, maligno; adenocarcinoma bronquíolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carci- noma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcino- ma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; car- cinoma cortical adrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apên- dice da pele; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadeno- carcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células em anel de sinete; carcinoma do duto infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de paget, mamária; carcinoma de células acinares; carcinoma ade- noescamoso; adenocarcinoma com metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor do estroma ovariano, maligno; tecoma, maligno; tumor de células da granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma ex- tramamário, maligno; feocromocitoma; glomangiossarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de dispersão superficial;
melanoma lentigo maligno; melanomas lentiginosos acrais; melano- mas nodulares; melanoma maligno em nevo pigmentado gigante; me- lanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrossar- coma; histiocitoma fibroso, maligno; mixossarcoma; lipossarcoma; lei- omiossarcoma; rabdomiossarcoma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma do estroma; tumor misturado, maligno; tumor misturado mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de brenner, malig- no; tumor phyllodes, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; teratoma, maligno; struma ova- rii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiossar- coma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de kaposi; hemangi- opericitoma, maligno; linfangiossarcoma; osteossarcoma; osteossar- coma justacortical; condrossarcoma; condroblastoma, maligno; con- drossarcoma mesenquimal; tumor de células gigantes do osso; sarco- ma de Ewing; tumor odontogênico, maligno; odontosarcoma amelo- blástico; ameloblastoma, maligno; fibrossarcoma ameloblástico; pinea- loma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmático; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodér- mico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblas- toma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfatório; meningioma, malig- no; neurofibrossarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células gra- nulares, maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; hodgkin's; pa- ragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeno; linfoma maligno, células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micose fungoide; outros linfomas não hodgkin especificados; linfoma de células B; linfo- ma não Hodgkin (NHL) de baixo grau/folicular; NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau interme- diário; NHL imunoblástico de alto grau; LNH linfoblástico de alto grau;
NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; Macroglobulinemia de Waldenstrom; histiocitose maligna; mieloma múltiplo; sarcoma de mastócitos; doença imunoproliferativa do intesti- no delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáti- cas; eritroleucemia; leucemia de células de linfossarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocí- tica; leucemia de mastócitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; leucemia de células pilosas; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); e leucemia mieloblástica crônica.
[00219] As modalidades particulares envolvem os métodos de tra- tamento de leucemia. A leucemia é um câncer do sangue ou da medu- la óssea e é caracterizada por uma proliferação anormal (produção por multiplicação) de células sanguíneas, geralmente glóbulos brancos (leucócitos). Faz parte de um amplo grupo de doenças chamadas ne- oplasias hematológicas. Leucemia é um termo amplo que cobre um espectro de doenças. A leucemia é clínica e patologicamente dividida em suas formas aguda e crônica.
[00220] Em certas modalidades da presente descrição, as células imunes são liberadas a um indivíduo com sua necessidade, tal como um indivíduo que tem câncer ou uma infecção. As células, então, au- mentam o sistema imunológico do indivíduo para atacar o respectivo câncer ou as células patogênicas. Em alguns casos, o indivíduo é su- prido com uma ou mais doses das células imunes. Nos casos em que o indivíduo é suprido com duas ou mais doses das células imunes, a duração entre as administrações deve ser suficiente para permitir o tempo de propagação no indivíduo e, nas modalidades específicas, a duração entre as doses é de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias.
[00221] Certas modalidades da presente descrição fornecem méto-
dos para tratar ou prevenir um distúrbio imunomediado.
Em uma mo- dalidade, o sujeito possui uma doença autoimune.
Exemplos não limi- tativos de doenças autoimunes incluem: alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, doença de Addison autoimu- ne, doenças autoimunes da glândula adrenal, anemia hemolítica au- toimune, hepatite autoimune, ooforite e orquite autoimune, trombocito- penia autoimune, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, pen- figoide bolhoso, cardiomiopatia, dermatite da série celíaca, síndrome da disfunção imune por fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmie- linizante inflamatória crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome CREST, doença da aglutinina fria, doença de Crohn, lúpus discoide, crioglobulinemia misturada essencial, fibromial- gia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, Guillain-Barré, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura tromboci- topenia idiopática (ITP), neuropatia por IgA, artrite juvenil, líquen plano, lúpus eritematoso, doença de Meniere, doença misturada do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes melito tipo 1 ou imunomediada, miastenia gravis, síndrome nefrótica (tal como doença de alteração mínima, glomeruloesclerose focal ou nefropatia mebranosa), pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artrite reuma- toide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome da pessoa rígida, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso, colite ulcerativa, uveíte, vasculites (tais como poliarterite nodosa, arterite ta- kayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, ou vasculite de dermatite herpetiforme), vitiligo e granulomatose de Wegener.
Assim, alguns exemplos de uma doença autoimune que pode ser tratada utili- zando os métodos aqui divulgados incluem, mas não são limitados a estes, esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistê- mico, diabetes melito tipo I, doença de Crohn; colite ulcerativa, miaste- nia gravis, glomerulonefrite, espondilite anquilosante, vasculite ou pso- ríase. O indivíduo também pode ter um distúrbio alérgico tal como as- ma.
[00222] Em mais outra modalidade, o indivíduo é o receptor de um órgão transplantado ou células-tronco e células imunes são utilizadas para prevenir e/ou tratar a rejeição. Em modalidades particulares, o indivíduo possui ou está em risco de desenvolver doença de enxerto versus hospedeiro. A GVHD é uma possível complicação de qualquer transplante que utiliza ou contenha células-tronco de um doador rela- cionado ou não relacionado. Existem dois tipos de GVHD, aguda e crônica. A GVHD aguda aparece nos primeiros três meses após o transplante. Os sinais de GVHD agudo incluem erupção cutânea avermelhada nas mãos e nos pés, que pode se espalhar e se tornar mais grave, com descamação ou formação de bolhas na pele. A GVHD aguda também pode afetar o estômago e os intestinos, nesse caso cólicas, náuseas e diarréia estão presentes. O amarelecimento da pele e dos olhos (icterícia) indica que a GVHD aguda afetou o fíga- do. A GVHD crônica é classificada com base em sua gravidade: o es- tágio/grau 1 é leve; estágio/grau 4 é grave. A GVHD crônica se desen- volve três meses ou mais tarde após o transplante. Os sintomas da GVHD crônica são semelhantes àqueles da GVHD aguda, mas, além disso, a GVHD crônica também pode afetar as glândulas mucosas dos olhos, as glândulas salivares da boca e as glândulas que lubrificam o revestimento do estômago e os intestinos. Qualquer uma das popula- ções de células imunes aqui divulgadas pode ser utilizada. Exemplos de um órgão transplantado incluem um transplante de órgão sólido, tal como rim, fígado, pele, pâncreas, pulmão e/ou coração, ou um trans- plante celular, tal como ilhotas, hepatócitos, mioblastos, medula óssea ou células-tronco hematopoiéticas ou outras. O transplante pode ser um transplante compósito, tal como tecidos da face. As células imunes podem ser administradas antes do transplante, simultaneamente com o transplante ou após o transplante. Em algumas modalidades, as cé- lulas imunes são administradas antes do transplante, tal como pelo menos 1 hora, pelo menos 12 horas, pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, ou pelo menos 1 mês an- tes do transplante. Em um exemplo específico não limitativo, a admi- nistração da quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes ocorre 3 a 5 dias antes do transplante.
[00223] Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser administra- do com quimioterapia de linfodepleção não mieloablativa antes da te- rapia com células imunes. A quimioterapia de linfodepleção não mielo- ablativa pode ser qualquer terapia adequada, que pode ser adminis- trada por qualquer via adequada. A quimioterapia de linfodepleção não mieloablativa pode compreender, por exemplo, a administração de ci- clofosfamida e fludarabina, particularmente se o câncer for melanoma, que pode ser metastático. Uma via exemplar de administração de ci- clofosfamida e fludarabina é por via intravenosa. Da mesma forma, qualquer dose adequada de ciclofosfamida e fludarabina pode ser ad- ministrada. Nos aspectos particulares, cerca de 60 mg/kg de ciclofos- famida são administrados durante dois dias após os quais cerca de 25 mg/m2 de fludarabina são administrados durante cinco dias.
[00224] Em certas modalidades, um fator de crescimento que pro- move o crescimento e a ativação das células imunes é administrado ao indivíduo concomitantemente com as células imunes ou subse- quentemente às células imunes. O fator de crescimento de células imunes pode ser qualquer fator de crescimento adequado que promo-
va o crescimento e a ativação das células imunes. Exemplos de fato- res de crescimento de células imunes adequados incluem interleucina (IL)-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, que podem ser utilizadas isola- damente ou em várias combinações, tais como IL-2 e IL-7, IL-2 e IL- 15, IL-7 e IL-15, IL-2, IL-7 e IL-15, IL-12 e IL-7, IL-12 e IL-15 ou IL-12 e IL2.
[00225] Quantidades terapeuticamente eficazes de células imunes podem ser administradas por várias vias, incluindo administração pa- renteral, por exemplo, injeção ou infusão intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal ou intraarticular.
[00226] A quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes para uso na terapia de células adotivas é aquela quantidade que atin- ge um efeito desejado em um indivíduo a ser tratado. Por exemplo, esta pode ser a quantidade de células imunes necessárias para inibir o avanço ou para provocar a regressão de uma doença autoimune ou aloimune, ou que é capaz de aliviar os sintomas provocados por uma doença autoimune, tal como dor e inflamação. Pode ser a quantidade necessária para aliviar os sintomas associados com a inflamação, tais como dor, edema e temperatura elevada. Também pode ser a quanti- dade necessária para diminuir ou prevenir a rejeição de um órgão transplantado.
[00227] A população de células imunes pode ser administrada em regimes de tratamento consistentes com a doença, por exemplo, uma única ou algumas doses ao longo de um a vários dias para melhorar um estado doentio ou doses periódicas ao longo de um tempo prolon- gado para inibir a progressão da doença e prevenir a recorrência da doença. A dose precisa a ser empregada na formulação também de- penderá da via de administração e da gravidade da doença ou distúr- bio, e deve ser decidida de acordo com a avaliação do médico e as circunstâncias de cada paciente. A quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes dependerá do indivíduo a ser tratado, da gravidade e do tipo de doença e da forma de administração. Em algumas moda- lidades, as doses que podem ser utilizadas no tratamento de seres humanos variam de pelo menos 3,8 × 104, pelo menos 3,8 × 105, pelo menos 3,8 × 106, pelo menos 3,8 × 107, pelo menos 3,8 × 108, pelo menos 3,8 × 109 ou pelo menos 3,8 × 1010 células imunes/m2. Em uma certa modalidade, a dose utilizada no tratamento de seres humanos varia de cerca de 3,8 × 109 a cerca de 3,8 × 1010 células imunes/m2. Nas modalidades adicionais, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes pode variar de cerca de 5 × 106 células por kg de peso corporal a cerca de 7,5 × 108 células por kg de peso corporal, tal como cerca de 2 × 107 células a cerca de 5 × 108 células por kg de pe- so corporal peso ou cerca de 5 × 107 células a cerca de 2 × 108 células por kg de peso corporal. A quantidade exata de células imunes é fa- cilmente determinada por uma pessoa de habilidade na técnica com base na idade, peso, sexo e condição fisiológica do indivíduo. As do- ses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00228] As células imunes podem ser administradas em combina- ção com um ou mais outros agentes terapêuticos para o tratamento do distúrbio mediado imunologicamente. As terapias de combinação po- dem incluir, mas não são limitadas a estas, um ou mais agentes anti- microbianos (por exemplo, antibióticos, agentes antivirais e agentes antifúngicos), agentes antitumorais (por exemplo, fluorouracila, meto- trexato, paclitaxel, fludarabina, etoposídeo, doxorrubicina ou vincristi- na), agentes de depleção imune (por exemplo, fludarabina, etoposí- deo, doxorrubicina ou vincristina), agentes imunossupressores (por exemplo, azatioprina ou glicocorticoides, tais como dexametasona ou prednisona), agentes anti-inflamatórios (por exemplo, glicocorticoides tais como hidrocortisona, dexametasona ou prednisona, ou agentes anti-inflamatórios não esteroides tais como ácido acetilsalicílico, ibuprofeno ou naproxeno sódico), citocinas (por exemplo, interleucina- 10 ou fator de crescimento transformador-beta), hormônios (para exemplo, estrogênio) ou uma vacina. Além disso, agentes imunossu- pressores ou tolerogênicos incluindo, mas não limitado a inibidores da calcineurina (por exemplo, ciclosporina e tacrolimus); inibidores de mTOR (por exemplo, Rapamicina); micofenolato de mofetil, anticorpos (por exemplo, reconhecendo células CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG ou B); agentes quimioterapêuticos (por exemplo, Metotrexato, Treossulfano, Bussulfano); irradiação; ou quimiocinas, interleucinas ou seus inibidores (por exemplo, BAFF, IL-2, anti-IL-2R, IL-4, inibidores da cinase JAK) podem ser administrados. Esses agentes farmacêuti- cos adicionais podem ser administrados antes, durante ou após a ad- ministração das células imunes, dependendo do efeito desejado. Esta administração das células e do agente pode ser feita pela mesma via ou por vias diferentes, e no mesmo local ou em um local diferente. A. Composições Farmacêuticas
[00229] Também são fornecidas nesta invenção composições e formulações farmacêuticas compreendendo células imunes (por exemplo, células T, células B ou células NK) e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
[00230] As composições e formulações farmacêuticas como aqui descritas podem ser preparadas através da mistura dos ingredientes ativos (tais como um anticorpo ou um polipeptídeo) tendo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitá- veis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos pa- ra os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas e in- cluem, mas não são limitados a estes: tampões tais como fosfato, ci-
trato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; ressorcinol; cicloexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpir- rolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidi- na, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros car- boidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como polietileno glicol (PEG). Os veículos farmaceutica- mente aceitáveis exemplares nesta invenção incluem ainda agentes de dispersão de fármacos instersticiais tais como glicoproteínas hialu- ronidase neutras-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoprote- ínas hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos sHASEGPs exempla- res e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publica- ções de Patente US Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um as- pecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminogli- canases adicionais tais como condroitinases. B. Terapias de Combinação
[00231] Em certas modalidades, as composições e métodos das presentes modalidades envolvem uma população de células imunes em combinação com pelo menos uma terapia adicional. A terapia adi- cional pode ser radioterapia, cirurgia (por exemplo, lumpectomia e mastectomia), quimioterapia, terapia genética, terapia de DNA, terapia viral, terapia de RNA, imunoterapia, transplante de medula óssea, na- noterapia, terapia de anticorpo monoclonal, ou uma combinação das anteriores. A terapia adicional pode estar na forma de terapia adjuvan- te ou neoadjuvante.
[00232] Em algumas modalidades, a terapia adicional é a adminis- tração de um inibidor enzimático de molécula pequena ou agente an- timetastático. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a admi- nistração de agentes limitantes de efeitos colaterais (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou a gravidade dos efei- tos colaterais do tratamento, tais como agentes antináusea, etc.). Em algumas modalidades, a terapia adicional é a terapia de radiação. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é uma combinação de radioterapia e cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a irradiação gama. Em algumas modalidades, a terapia adicional é terapia direcio- nada à via PBK/AKT/mTOR, inibidor de HSP90, inibidor de tubulina, inibidor de apoptose e/ou agente quimiopreventivo. A terapia adicional pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos conhecidos na técnica.
[00233] Uma terapia de células imunes pode ser administrada an- tes, durante, após ou em várias combinações em relação a uma tera- pia de câncer adicional, tal como a terapia de ponto de controle imuno- lógico. As administrações podem ser em intervalos que variam de si- multaneamente a minutos até dias a semanas. Nas modalidades em que a terapia de células imunes é fornecida a um paciente separada- mente de um agente terapêutico adicional, deve-se geralmente garan- tir que um período de tempo significativo não expire entre o tempo de cada liberação, de tal modo que os dois compostos ainda sejam capa- zes de exercer um efeito vantajosamente combinado no paciente. Em tais casos, contempla-se que se pode suprir um paciente com a tera-
pia de anticorpos e a terapia anticâncer dentro de cerca de 12 a 24 ou 72 h entre si e, mais particularmente, dentro de cerca de 6 a 12 h entre si. Em algumas situações, pode ser desejável prolongar o período de tempo para o tratamento significativamente onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) passam entre as res- pectivas administrações.
[00234] Várias combinações podem ser empregadas. Para o exem- plo abaixo, uma terapia de células imunes é "A" e uma terapia anticân- cer é "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[00235] A administração de qualquer composto ou terapia das pre- sentes modalidades a um paciente seguirá os protocolos gerais para a administração de tais compostos, levando em consideração a toxicida- de, se houver, dos agentes. Portanto, em algumas modalidades, há uma etapa de monitoramento da toxicidade que é atribuível à terapia de combinação.
1. Quimioterapia
[00236] Uma ampla variedade de agentes quimioterápicos pode ser utilizada de acordo com as presentes modalidades. O termo “quimiote- rapia” refere-se ao uso de fármacos para tratar o câncer. Um "agente quimioterápico" é utilizado para conotar um composto ou composição que é administrado no tratamento do câncer. Esses agentes ou fárma- cos são categorizados por seu modo de atividade dentro de uma célu- la, por exemplo, se afetam e em que estágio eles afetam o ciclo celu- lar. Alternativamente, um agente pode ser caracterizado com base na sua capacidade de reticular DNA diretamente, intercalar em DNA ou induzir aberrações cromossômicas e mitóticas afetando a síntese de ácido nucleico.
[00237] Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes al- quilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquone, meturedopa e uredopa; etileniminas e meti- lamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosfo- ramida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin e bullatacinone); uma camptotecina (incluin- do o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (in- cluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesi- na); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolas- tatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongista- tina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, co- lofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, pred- nimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosouréias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranim- nustina; antibióticos, tais como os antibióticos enedine (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamalI e caliqueamicina ômegaI1); dnemicina, incluindo dinemicin A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; assim como cromóforo de neocarzinos- tatina e cromóforos antiobióticos de cromoproteína enedina relaciona- dos, aclacinomisinas, actinomicina, autrarnicina, azasserina, bleomici- nas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomi- cina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomor- folino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, es-
treptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zor- rubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5- FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, pteropterina e trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dide- soxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepiti- ostano e testolactona; antiadrenais, tais como mitotano e trilostano; renovador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosí- deo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestra- bucil; bisantrene; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinoides, tais como mai- tansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; ni- traerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido po- dofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de PSK polissacarí- deo; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente to- xina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gaci- tosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; taxoides, por exemplo, paclitaxel e docetaxel gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; com- plexos de coordenação de platina, tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mito- xantrona; vincristina; vinorrelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (por exemplo, CPT-11); inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometi- lornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinóico; capecitabina; carboplatina, procarbazina, plicomicina, gencitabina, navelbina, inibido-
res da proteína farnesil tansferase, transplatina, e sais, ácidos ou deri- vados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
2. Radioterapia
[00238] Outros fatores que provocam danos ao DNA e têm sido uti- lizados extensivamente incluem o que é comumente conhecido como raios-γ, raios-X e/ou a liberação direcionada de radioisótopos nas célu- las tumorais. Outras formas de fatores de dano ao DNA também são contempladas, tais como microondas, irradiação por feixe de prótons e irradiação UV. É mais provável que todos esses fatores afetem uma ampla faixa de danos no DNA, nos precursores do DNA, na replicação e reparo do DNA e na montagem e manutenção dos cromossomos. As faixas de dosagem para raios-X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens durante períodos prolongados de tempo (3 a 4 semanas), até doses únicas de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem dos radioisótopos variam amplamente e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo de radiação emitida e da captação pelas células neoplásicas.
3. Imunoterapia
[00239] O versado entenderá que as imunoterapias adicionais po- dem ser utilizadas em combinação ou em conjunto com métodos das modalidades. No contexto do tratamento do câncer, os imunoterapêu- ticos, geralmente, dependem do uso de células e moléculas efetoras do sistema imunológico para direcionar e destruir células cancerosas. Rituximab (RITUXAN®) é um exemplo. O efetor imune pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para algum marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo isoladamente pode servir como um efetor da terapia ou pode recrutar outras células para realmente afetar a morte celular. O anticorpo também pode ser conjugado a um fárma- co ou toxina (quimioterapêutico, radionuclídeo, cadeia de ricina A, to- xina da cólera, toxina pertussis, etc.) e servir como um agente de dire-
cionamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito que car- rega uma molécula de superfície que interage, direta ou indiretamente, com uma célula tumoral alvo. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK.
[00240] Conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) compreendem anticorpos monoclonais (MAbs) que estão covalentemente ligados a fármacos para matar células e podem ser utilizados em terapias com- binadas. Esta abordagem combina a alta especificidade dos MAbs contra seus alvos de antígeno com fármacos citotóxicos altamente po- tentes, resultando em MAbs “equipados” que liberam a carga útil (fár- maco) às células tumorais com níveis enriquecidos do antígeno. A libe- ração direcionada do fármaco também minimiza sua exposição em te- cidos normais, resultando em diminuição da toxicidade e melhora do índice terapêutico. Fármacos ADC exemplares incluem ADCETRIS® (brentuximab vedotin) e KADCYLA® (trastuzumab emtansine ou T- DM1).
[00241] Em um aspecto da imunoterapia, a célula tumoral deve con- ter algum marcador que seja receptivo de direcionamento, isto é, não esteja presente na maioria das outras células. Existem muitos marca- dores tumorais e qualquer um deles pode ser adequado para o direci- onamento no contexto das presentes modalidades. Os marcadores tumorais comuns incluem CD20, antígeno carcinoembrionário, tirosi- nase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Antígeno Sialyl Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erb B e p155. Um aspecto alterna- tivo da imunoterapia é combinar os efeitos anticâncer com os efeitos estimuladores do sistema imunológico. Moléculas imunoestimulantes também existem, incluindo: citocinas tais como IL-2, IL-4, IL-12, GM- CSF, gama-IFN, quimiocinas, tais como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento, tais como o ligante FLT3.
[00242] Exemplos de imunoterapias incluem adjuvantes imunológi-
cos, por exemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dini- troclorobenzeno e compostos aromáticos); terapia com citocinas, por exemplo, interferons α, β e γ, IL-1, GM-CSF e TNF; terapia gênica, por exemplo, TNF, IL-1, IL-2 e p53; e anticorpos monoclonais, por exem- plo, anti-CD20, anti-gangliosídeo GM2 e anti-p185. Contempla-se que uma ou mais terapias anticâncer podem ser empregadas com as tera- pias de anticorpo aqui descritas.
[00243] Em algumas modalidades, a imunoterapia pode ser um ini- bidor do ponto de controle imunológico. Os pontos de controle imuno- lógicos aumentam um sinal (por exemplo, moléculas coestimulatórias) ou reduzem um sinal. Os pontos de controle imunológicos inibidores que podem ser direcionados pelo bloqueio do ponto de controle imuno- lógico incluem o receptor de adenosina A2A (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), proteí- na associada a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4, também conhecido como CD152), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), imunoglobulina de células exterminadoras (KIR), gene de ativação de linfócitos-3 (LAG3), morte programada 1 (PD-1), domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina 3 (TIM-3) e supressor de Ig de domínio V de ativa- ção de células T (VISTA). Em particular, os inibidores do ponto de con- trole imunológico têm como alvo o eixo PD-1 e/ou CTLA-4.
[00244] Os inibidores do ponto de controle imunológico podem ser fármacos tais como pequenas moléculas, formas recombinantes de ligante ou receptores, ou, em particular, são anticorpos, tais como an- ticorpos humanos. Os inibidores conhecidos das proteínas de ponto de controle imunológico ou seus análogos podem ser utilizados, em parti- cular formas quimerizadas, humanizadas ou humanas de anticorpos podem ser utilizadas. Como a pessoa versada irá saber, nomes alter- nativos e/ou equivalentes podem estar em uso para certos anticorpos mencionados na presente descrição. Esses nomes alternativos e/ou equivalentes são intercambiáveis no contexto da presente descrição. Por exemplo, sabe-se que lambrolizumab também é conhecido sob os nomes alternativos e equivalentes MK-3475 e pembrolizumab.
[00245] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD- 1 é uma molécula que inibe a ligação do PD-1 aos seus parceiros de ligação ao ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação ao ligante PD-1 são PDL1 e/ou PDL2. Em outra modalidade, um anta- gonista de ligação ao PDL1 é uma molécula que inibe a ligação do PDL1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação a PDL1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modalida- de, o antagonista de ligação ao PDL2 é uma molécula que inibe a liga- ção do PDL2 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específi- co, um parceiro de ligação a PDL2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma imu- noadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.
[00246] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo que consiste em nivolumab, pembrolizumab e CT-011. Em algumas modalidades, o an- tagonista de ligação a PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina compreendendo uma porção de ligação extracelular ou PD-1 de PDL1 ou PDL2 fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é AMP-224. Nivolu- mab, também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 e OPDIVO®, é um anticorpo anti-PD-1 que pode ser uti- lizado. Pembrolizumab, também conhecido como MK-3475, Merck 3475, lambrolizumab, KEYTRUDA® e SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1 exemplar. CT-011, também conhecido como hBAT ou hBAT-
1, também é um anticorpo anti-PD-1. AMP-224, também conhecido como B7-DCIg, é um receptor solúvel de fusão PDL2-Fc.
[00247] Outro ponto de controle imune que pode ser direcionado nos métodos fornecidos nesta invenção é a proteína associada a linfó- citos T citotóxicos 4 (CTLA-4), também conhecida como CD152. A se- quência de cDNA completa de CTLA-4 humana possui o número de acesso no Genbank L15006. CTLA-4 é encontrada na superfície das células T e atua como um interruptor “desligado” quando ligado ao CD80 ou CD86 na superfície das células apresentadoras de antígeno. CTLA4 é um membro da superfamília das imunoglobulinas que se ex- pressa na superfície das células T auxiliadoras e transmite um sinal inibidor às células T. CTLA4 é semelhante à proteína coestimuladora de células T, CD28, e ambas as moléculas se ligam a CD80 e CD86, também chamadas de B7-1 e B7-2, respectivamente, nas células apresentadoras de antígeno. CTLA4 transmite um sinal inibidor para as células T, enquanto que a CD28 transmite um sinal estimulador. A CTLA4 intracelular também é encontrada nas células T reguladoras e pode ser importante para sua função. A ativação de células T através do receptor de células T e CD28 leva ao aumento da expressão de CTLA-4, um receptor inibidor para moléculas B7.
[00248] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de controle imunológico é um anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico), um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.
[00249] Anticorpos anti-CTLA-4 humano (ou domínios VH e/ou VL derivados dos mesmos) adequados para uso nos presentes métodos podem ser gerados utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, anticorpos anti-CTLA-4 reconhecidos na técnica po- dem ser utilizados. Um exemplo de anticorpo anti-CTLA-4 é o ipilimu-
mab (também conhecido como 10D1, MDX-010, MDX-101 e Yervoy®) ou fragmentos de ligação ao antígeno e variantes do mesmo. Em ou- tras modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve ou VRs de ipilimumab. Consequentemente, em uma modalida- de, o anticorpo compreende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH do ipilimumab e os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL do ipilimumab. Em outra modalidade, o anticorpo compete pela ligação com e/ou se liga ao mesmo epitopo em CTLA-4 que os anticorpos mencionados acima. Em outra modalidade, o anticorpo possui pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de ami- noácido da região variável com os anticorpos mencionados acima (por exemplo, pelo menos ao redor de 90%, 95% ou 99% de identidade de região variável com ipilimumab).
4. Cirurgia
[00250] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a cirurgia de algum tipo, que inclui cirurgia preventiva, di- agnóstica ou de determinação dos estágios, curativa e paliativa. A ci- rurgia curativa inclui a ressecção na qual todo ou parte do tecido can- ceroso é fisicamente removido, cortado e/ou destruído e pode ser utili- zada em conjunto com outras terapias, tais como o tratamento das presentes modalidades, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia genética, imunoterapia e/ou terapias alternativas. A ressecção do tumor refere-se à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção do tumor, o tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia microscopicamente contro- lada (cirurgia de Mohs).
[00251] Após a excisão de parte ou de todas as células cancerosas, tecido ou tumor, uma cavidade pode ser formada no corpo. O trata- mento pode ser executado por perfusão, injeção direta ou aplicação local da área com uma terapia anticâncer adicional. Tal tratamento po-
de ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a ca- da 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Esses tratamentos também podem ser de dosagens varia- das.
5. Outros Agentes
[00252] Contempla-se que outros agentes podem ser utilizados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Estes agentes adicio- nais incluem agentes que afetam a suprarregulação de receptores de superfície celular e junções GAP, agentes citostáticos e de diferencia- ção, inibidores da aderência celular, agentes que aumentam a sensibi- lidade das células hiperproliferativas a indutores apoptóticos ou outros agentes biológicos. Aumentos na sinalização intercelular pela elevação do número de junções GAP aumentariam os efeitos anti- hiperproliferativos na população de células hiperproliferativas adjacen- tes. Em outras modalidades, os agentes citostáticos ou de diferencia- ção podem ser utilizados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia anti-hiperproliferativa dos tratamentos. Os inibidores da aderência celular são contemplados para melhorar a eficácia das presentes modalidades. Exemplos de ini- bidores da aderência celular são inibidores de cinase de adesão focal (FAKs) e Lovastatina. É ainda contemplado que outros agentes que aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apoptose, tal como o anticorpo c225, podem ser utilizados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia do tratamento. VII. Artigos de Produção ou Kits
[00253] Um artigo de produção ou um kit é fornecido compreenden- do células imunes também é fornecido nesta invenção. O artigo de produção ou kit pode compreender ainda uma bula que compreende instruções para uso das células imunes para tratar ou retardar a pro- gressão do câncer em um indivíduo ou para aumentar a função imune de um indivíduo com câncer. Qualquer uma das células imunes espe- cíficas do antígeno aqui descritas pode ser incluída no artigo de pro- dução ou kits. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garra- fas, frascos, sacos e seringas. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais tais como vidro, plástico (tal como cloreto de polivinila ou poliolefina) ou liga metálica (tal como aço inoxidável ou Hastelloy). Em algumas modalidades, o recipiente contém a formula- ção e o rótulo no ou associado ao recipiente pode indicar instruções de uso. O artigo de produção ou kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, inclu- indo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso. Em algumas modalidades, o artigo de produção ainda inclui um ou mais de outros agentes (por exemplo, um agente quimioterápico e um agente antineoplásico). Recipientes adequados para um ou mais agentes incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sa- cos e seringas. VIII. Exemplos
[00254] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado por aqueles de habilidade na especialidade que as técnicas divulgadas nos exem- plos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar de modo satisfatório na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas de constituir os modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles de habilidade na técnica devem, à luz da presente descrição, observar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um re- sultado parecido ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da descrição.
Exemplo 1 – Edição do Gene Multiplex
[00255] Para testar a eficácia de interromper simultaneamente a expressão de vários genes nas células imunes, tais como células T e células NK, vários estudos foram executados para testar a disrupção de diferentes combinações de genes utilizando CRISPR. Em um pri- meiro estudo, CRISPR/Cas9 foi utilizada para interromper a expressão de NKG2A, CD47, TGFBR2 e CISH nas células NK. Neste conjunto de genes, NKG2A e CD47 foram inativados na primeira rodada de eletro- poração e na segunda rodada de eletroporação CISH e TGFBR2 fo- ram direcionados. A eficiência de inativação foi validada com sucesso utilizando PCR e citometria de fluxo para ambas as rodadas de eletro- poração (FIG. 1).
[00256] O método de interromper múltiplos genes foi validado em conjuntos adicionais de genes, incluindo TIGIT, CD96, CISH, Adenosi- na (FIG. 2) e NKG2A, CD47, TGFBR2 e CISH (FIG. 3). Observou-se que a disrupção dos múltiplos genes resulta em funcionalidade intensi- ficada contra células tumorais alvo. A análise citométrica de fluxo da produção de IFN-γ, TNFα e CD107 foi executada com células NK vari- áveis (Editado vs Cas9 isoladamente) coestimuladas com linhagens celulares alvo durante 5 horas na presença de Brefeldin A. Houve au- mento da secreção de IFN-γ, TNFα e CD107 após estimulação com linhagens celulares alvo (FIG. 3).
[00257] Esta funcionalidade aumentada foi confirmada pela disrup- ção de NKG2A, CD47, TGFBR2 e CISH em células NK que mostraram citotoxicidade antitumoral aumentada (FIG. 4A), conforme medido pelo 51 ensaio de liberação de Cr, contra células K562. Além disso, após 30 minutos de tratamento com TGF-B recombinante (50 ng/ml), a ativida- de de pSMAD foi medida por citometria de fluxo (FIG. 4B). Também foi observado que as células NK perdem a expressão de CD16 e CD62L após estimulação de citocinas ou reconhecimento de alvo (FIG. 5) e a inativação de ADAM17 em células NK evita o desprendimento de CD16 e CD62L (FIG. 6) e melhora ADCC e citotoxicidade contra alvos K562 (FIG. 7).
[00258] Outros estudos mostraram que a disrupção de SHP1 em células NK leva a uma eficácia antitumoral aumentada (FIGS. 9 e 10). As células NK foram cocultivadas com células K562\Raji em uma rela- ção de 1:1 durante 4 horas. Após a incubação, as células foram cora- das com anexina V e as células vivas e mortas foram analisadas. As células K562 são sensíveis à morte de células NK e as células Raji são resistentes à morte de células NK. Além disso, a disrupção de NKG2A em células NK-CAR levou a uma eficácia antitumoral aumen- tada contra alvos Raji (FIG. 12).
[00259] A presente abordagem foi ainda validada com conjuntos adicionais de genes - TIGIT, CD96, CISH e ADENOSINA, assim como NKG2A, CISH, TGFBRII e ADENOSINA. A função das células NK foi avaliada através da medição citométrica de fluxo e um aumento foi ob- servado em TNFα, IFNγ e CD107a nas células após estimulação da linhagem celular alvo (FIGS. 13-14).
[00260] Assim, os presentes métodos podem ser utilizados para interromper simultaneamente a expressão de vários genes nas células imunes para aumentar sua funcionalidade. Exemplo 2 - Métodos
[00261] Pré-complexação de sgRNA-Cas9 e eletroporação: 1 ou 2 sgRNAs transpondo regiões próximas foram projetados e utilizados para cada gene. As reações de cas9 (PNA Bio) 1 ug e sgRNA 500 ng (soma de todos os sgRNAs) foram efetuadas para cada gene e incu- badas em gelo durante 20 minutos. Após 20 minutos, 250.000 células NK foram colocadas novamente em suspensão em tampão T* (incluí- do com Neon Electroporation Kit, Invitrogen, o volume total incluindo complexo RNP e as células devem ser 14 ul) e eletroporadas com ponta de eletroporação de 10 ul utilizando Neon Transfection System. As condições de eletroporação são 1600 V, 10 ms e 3 pulsos* para células NK. As células foram então adicionadas à placa de cultura com APCs (1 NK: 2 APCs), meio SCGM (de preferência sem antibiótico), 200 UI/ml de IL2 e deixadas se recuperar na incubadora a 37 oC.
[00262] Pré-complexação de crRNA e eletroporação: A duplexação de crRNA e tracrRNA foi misturada com uma pipeta e centrífugas. A mistura foi incubada a 95 oC durante 5 min em um termociclador e, em seguida, deixada esfriar para a temperatura ambiente na bancada. Tabela 3. Duplexação de crNRA e tracrRNA. volume concen- volume concen- tração tração crRNA # 1 2,2 ul 100 uM crRNA # 2 2,2 ul 100 uM tracrRNA 2,2 ul 100 uM tracrRNA 2,2 ul 100 uM Tampão IDTE 5,6 ul IDTE Buffer 5,6 ul volume total 10 ul 44 uM volume total 10 ul 44 uM A concentração inicial de crRNA e tracrRNA é de 100 uM. A concen- tração final após misturá-los em concentração equimolar é de 44 µM. Tabela 4. Cas9 Nuclease. volume Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS (61 uM) 3 ul tampão T 7 ul volume total 10 ul concentração final 18 uM Tabela 5. Combinação da mistura de crRNA:tracrRNA e Cas9 nu- clease. volume duplexação de crRNA # 1: tracrRNA (Etapa 1) 2 ul Cas9 (Etapa 2) 2 ul volume total 4 ul
[00263] A duplexação de crRNA: tracrRNA foi combinada com a Cas9 Nuclease Mix com pipeta e incubada na temperatura ambiente durante 15 min. A mistura foi então combinada com crRNA. Tabela 6. crRNA # 1 e crRNA # 2. volume crRNA # 1 + tracrRNA + cas9 (Etapa 3) 2,25 ul crRNA # 2 + tracrRNA + cas9 (Etapa 3) 2,25 ul volume total 4,5 ul
[00264] A eletroporação foi executada através da preparação em primeiro lugar das placas de cultura com APCs (1 NK: 2 APCs), meio SCGM (de preferência sem antibióticos) e 200 UI/ml de IL-2. Para a preparação, 250.000 células por cavidade foram colocadas novamente em suspensão em 7,5 ul de tampão T imediatamente antes do uso. As condições de eletroporação foram 1600 V, 10 ms e 3 pulsos*. As célu- las foram então adicionadas à placa de cultura e deixadas recuperar em uma incubadora a 37 oC.
[00265] Expansão de células NK: isolar células NK do sangue do cordão umbilical ou sangue periférico utilizando o kit de isolamento de células NK da Miltenyi (130-092-657). Colocar as células NK com célu- la alimentadora na relação de 1:2 (1 célula NK 2 células alimentado- ras) na presença de IL2 (200 UI\ml) em meio SCGM. Trocar de meio a cada dois dias com IL2. No dia 4, selecionar novamente as células NK utilizando o KIT de isolamento de células NK para remover as células de alimentação ou esperar pelo dia 7 até que todas as células alimen- tadoras tenham desaparecido. Transduzir com receptor de antígeno quimérico ou eletroporar Crispr-Cas9.
[00266] Todos os métodos divulgados e reivindicados nesta inven- ção podem ser efetuados e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora as composições e métodos desta descrição tenham sido descritos em termos de modalidades preferi- das, será evidente para aqueles de habilidade na técnica que varia- ções podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método aqui descrito, sem se afastar do conceito, espíri-
to e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará evidente que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados po- dem ser substituídos pelos agentes descritos nesta invenção enquanto que os mesmos resultados ou resultados semelhantes seriam alcan- çados. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evidentes para aqueles versados na técnica são considerados de estar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas rei- vindicações anexas.
REFERÊNCIAS
[00267] As seguintes referências, na medida em que fornecem pro- cedimentos exemplares ou outros detalhes complementares àqueles aqui apresentados, são especificamente aqui incorporadas por refe- rência. Austin-Ward and Villaseca, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845, 1998. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Gre- ene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Bennekov et al., Mt. Sinai J. Med. 71 (2): 86-93, 2004. Bukowski et al., Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347,
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Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método in vitro para a disrupção de pelo menos dois ge- nes em uma célula imune, caracterizado pelo fato de que os pelo me- nos dois genes são selecionados do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADO- RA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7.
    2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a disrupção compreende a introdução de um RNA guia (gRNA) para cada gene na referida célula imune.
    3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que os pelo menos dois genes são selecionados do grupo que consiste em (a) NKG2A e CISH, (b) NKG2A e TGFBRII, (c) CISH e TGFBRII, (d) TIGIT e FOXO1, (e) TIGIT e TGFBRII, (f) CD96 e FOXO1, (g) CD96 e TGFBRII, (h) FOXO1 e TGFBRII, (i) CD96 e TI- GIT, (j) CISH e TIGIT, (k) TIM3 e CISH, (l) TIM3 e TGFBRII, (m) FO- XO1 e TGFBRII, (n) TIM3 e TIGIT, (o) SIGLEC7 e CISH, (p) SIGLEC7 e TGFBRII, (q) CD47 e CISH, (r) CD47 e TGFBRII, (s) SIRPA e CISH, (t) SIRPA e TGFBRII, (u) CD47 e TIGIT, (v) CD47 e SIRPA, (w) A2AR e CISH, (x) A2AR e TGFBRII, (y) ADAM17 e CISH, (z) TGFBRII e ADAM17, (a1) A2AR e TIGIT, (b1) SHP1 e CISH, (c1) CISH e TGFBRII, (d1) SHP1 e TGFBRII, (e1) SHP1 e TIGIT e (f1) SHP1 e TIM3.
    4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos 3 genes são subme- tidos à disrupção.
    5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos 3 genes são selecionados do grupo que consiste em (1) NKG2A, CISH e TGFBRII, (2) TIGIT, FOXO1 e
    TGFBRII, (3) TGFBRII, CD96 e TIGIT, (4) TGFBR2, CISH e TIGIT, (5) TIM3, CISH e TGFBRII, (6) CD96, FOXO1 e TGFBRII, (7) TGFBRII, TIM3 e TIGIT, (8) SIGLEC7, CISH e TGFBRII, (9) CD47, CISH e TGFBRII, (10) SIRPA, CISH e TGFBRII, (11) TGFBRII, CD47 e TIGIT, (12) TGFBRII, CD47 e SIRPA, (13) A2AR, CISH e TGFBRII, (14) TGFBRII, CISH e ADAM17, (15) TGFBRII, TIM3 e TIGIT, (16) TGFBRII, A2AR e TIGIT, (17) SHP1, CISH e TGFBRII, (18) TGFBRII, CISH e SHP1, (19) TGFBRII, SHP1 e TIGIT e (20) TGFBRII, SHP1 e TIM3.
    6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a introdução de uma endonu- clease guia de RNA.
    7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a endonuclease guiada por RNA é Cas9.
    8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a introdução da endonuclease guiada por RNA com- preende a introdução de um ácido nucleico que codifica a endonu- clease guiada por RNA na célula imune.
    9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é mRNA.
    10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que três, quatro, cinco ou seis genes são submetidos à disrupção.
    11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que os genes compreendem dois dos subgrupos de (a) a (j1).
    12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que os genes compreendem um subgrupo de (a) a (j1) e um subgrupo de 1 a 23.
    13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza-
    do pelo fato de que os genes compreendem dois dos subgrupos de 1 a
    23.
    14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a desrupção é simultânea.
    15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célu- la T, célula NK, célula T NK, célula B ou célula-tronco.
    16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um re- ceptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou receptor de célula T (TCR).
    17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um CAR.
    18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um TCR.
    19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um CAR e um TCR.
    20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune é específica do vírus.
    21. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula T é uma célula T específica do vírus.
    22. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula T é uma célula T reguladora.
    23. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula B é uma célula B reguladora.
    24. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco mesenquimal (MSC) ou uma célula-tronco pluripotente induzida (iPS).
    25. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a célula T é uma célula T CD8+, célula T CD4+, cé- lula T gama-delta ou uma mistura das mesmas.
    26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a célula imune é isolada do sangue periférico, sangue do cordão umbilical, medula óssea ou uma mistura dos mesmos.
    27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a célula imune é isolada do sangue do cordão umbilical.
    28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteriza- do pelo fato de que o sangue do cordão é processado em pool a partir de 2 ou mais unidades individuais de sangue do cordão umbilical.
    29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 28, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende a transfecção ou transdução.
    30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 28, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende eletroporação.
    31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que a eletroporação é executada mais de uma vez.
    32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que duas rodadas de eletroporação são executadas.
    33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que um primeiro grupo de gRNAs de CRISPR é intro- duzido em uma primeira eletroporação e um segundo grupo de gRNAs de CRISPR é introduzido em uma segunda rodada de eletroporação.
    34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o primeiro grupo e/ou o segundo grupo de gRNAs de CRISPR compreende 1, 2, 3 ou 4 gRNAs de CRISPR.
    35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que dois gRNAs de CRISPR são introduzidos em uma primeira eletroporação e dois gRNAs de CRISPR são introduzidos em uma segunda rodada de eletroporação.
    36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o método compreende a disrupção de NKG2A, CD47, TGFβR2 e CISH.
    37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o método compreende a disrupção de NKG2A, CISH, TGFβR2 e ADORA2.
    38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o método compreende a disrupção de NKG2A, TGFβR2 e CISH.
    39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o método compreende a disrupção de TIGIT, CD96, CISH e ADORA2.
    40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o método compreende a disrupção de ADAM17, TGFβR2, NKG2A e SHP1.
    41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 40, caracterizado pelo fato de que a desrupção resulta em citotoxicidade antitumoral aumentada, proliferação in vivo, persistência in vivo e/ou função melhorada da célula imune.
    42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune possui secreção aumentada de IFN-γ, CD107 e/ou TNFα.
    43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que a célula imune aumentou a produção de perforina e/ou granzima B.
    44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
    ções 1 a 43, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a intro- dução de um CAR ou TCR na referida célula imune.
    45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a introdução compreende introduzir um ácido nu- cleico que codifica dito CAR ou TCR em dita célula imune.
    46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que o ácido nucleico está em um vetor de expressão.
    47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor retroviral.
    48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor viral adeno-associado.
    49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral adeno-associado é AAV6.
    50. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que o vetor ainda compreende uma sequência de gene inibidor.
    51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracteriza- do pelo fato de que a sequência do gene inibidor é selecionada do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FO- XO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7.
    52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracteriza- do pelo fato de que o vetor ainda compreende um RNA guia para o dito gene inibidor.
    53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que o CAR é flanqueado por ramificações de homolo- gia para dito gene inibidor.
    54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que a introdução do vetor que compreende a sequên-
    cia de CAR resulta na inserção do CAR no lócus do gene inibidor na referida célula imune.
    55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que o CAR é inserido em um éxon do referido gene inibidor.
    56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que o CAR está sob o controle do promotor endógeno do gene inibidor.
    57. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que a introdução do vetor ainda interrompe a expres- são de dito gene inibidor.
    58. Célula imune com expressão interrompida de pelo me- nos dois genes na célula imune, caracterizada pelo fato de que os pelo menos dois genes são selecionados do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7.
    59. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula é produzida, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 57.
    60. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que três, quatro, cinco ou seis genes são submetidos à disrupção.
    61. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T, célula NK, célula T NK, célula B ou célula-tronco.
    62. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um recep- tor de antígeno quimérico (CAR) e/ou um receptor de célula T (TCR).
    63. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um CAR.
    64. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um TCR.
    65. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é projetada para expressar um CAR e um TCR.
    66. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é específica do vírus.
    67. Célula, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T específica do vírus.
    68. Célula, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T reguladora.
    69. Célula, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a célula B é uma célula B reguladora.
    70. Célula, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco mesenquimal (MSC) ou uma célula-tronco pluripotente induzida (iPS).
    71. Célula, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T CD8+, célula T CD4+ ou cé- lula T gama-delta.
    72. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é isolada do sangue periférico, sangue do cordão umbilical, medula óssea ou uma mistura dos mesmos.
    73. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune é isolada do sangue do cordão umbili- cal.
    74. Célula, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o sangue do cordão umbilical é processado em pool a partir de 2 ou mais unidades individuais de sangue do cordão umbili-
    cal.
    75. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune interrompeu NKG2A, CD47, TGFβR2 e CISH.
    76. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune interrompeu NKG2A, CISH, TGFβR2 e ADORA2.
    77. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune interrompeu NKG2A, TGFβR2 e CISH.
    78. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune interrompeu TIGIT, CD96, CISH e ADORA2.
    79. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune interrompeu ADAM17, TGFβR2 NKG2A e SHP1.
    80. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune possui citotoxicidade antitumoral au- mentada, proliferação in vivo, persistência in vivo e/ou função melho- rada.
    81. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune possui secreção aumentada de IFN-γ, CD107 e/ou TNFα.
    82. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula imune aumentou a produção de perforina e/ou granzima B.
    83. Célula, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que a célula é projetada para expressar um CAR e/ou TCR.
    84. Célula, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que o CAR é inserido em um lócus do gene inibidor endó-
    geno da referida célula.
    85. Célula, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o lócus do gene inibidor é selecionado do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7.
    86. Célula, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o CAR está sob o controle do promotor endógeno de dito gene inibidor.
    87. Célula, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o CAR foi inserido no lócus do gene inibidor através da edição de genes mediada por CRISPR.
    88. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 87, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um domí- nio de ligação ao antígeno selecionado do grupo que consiste em F(ab')2, Fab', Fab, Fv e scFv.
    89. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 88, caracterizada pelo fato de que o CAR direciona um ou mais antígenos associados a tumor selecionados do grupo que consiste em CD19, CD319 (CS1), ROR1, CD20, antígeno carcinoembrionário, alfa- fetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação a folato, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp120, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp41, GD2, CD5, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralfa, ca- deia capa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, TRAIL/DR4, VEGFR2, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA e CD99.
    90. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    83 a 90, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende pelo me- nos um domínio de sinalização selecionado do grupo que consiste em CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP12, CD70 e CD40.
    91. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 90, caracterizada pelo fato de que a célula é projetada para ex- pressar uma citocina heteróloga selecionada do grupo que consiste em IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21, e uma combinação das mes- mas.
    92. Célula, de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que a célula compreende ainda um gene suicida.
    93. Célula, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que o gene suicida é um fator de necrose tumoral ligado à membrana gene mutante (TNF)-alfa.
    94. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que co- difica um CAR, sequência de gene inibidor e gRNA.
    95. Vetor, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a sequência de gene inibidor é de um gene inibidor selecionado do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7.
    96. Vetor, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o gRNA é específico para o dito gene inibidor.
    97. Vetor, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor retroviral.
    98. Vetor, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor AAV.
    99. Vetor, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o CAR é flanqueado por ramificações de homologia para o gene inibidor.
    100. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é projetada para expressar o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 94 a 99.
    101. Célula, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zada pelo fato de que a célula é uma célula T, célula NK, célula B ou célula-tronco.
    102. Célula, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zada pelo fato de que a célula é uma célula, como definida em qual- quer uma das reivindicações 58 a 83.
    103. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células imunes, como definida em qualquer uma das reivindicações 58 a 93.
    104. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma população de células, como definida em qualquer uma das reivindicações 58 a 93, para o tratamento de um distúrbio relacionado ao sistema imunológico, doença infecciosa ou câncer.
    105. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a adminis- tração de uma quantidade eficaz de células imunes, como definida em qualquer uma das reivindicações 58 a 93, ao indivíduo.
    106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracteri- zado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa, câncer ou distúrbio relacionado ao sistema imunológico.
    107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é um distúrbio autoimune, doença do enxerto versus hospedeiro, rejei- ção de aloenxerto ou condição inflamatória.
    108. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é uma condição inflamatória e as células imunes não possuem essenci- almente nenhuma expressão do receptor de glicocorticóide.
    109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 108, caracterizado pelo fato de que as células imunes são autólogas ao indivíduo.
    110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 108, caracterizado pelo fato de que as células imunes são alogênicas ao indivíduo.
    111. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é um câncer.
    112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é um câncer sólido ou uma malignida- de hematológica.
    113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 105 a 112, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um segundo agente tera- pêutico.
    114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que o pelo menos um segundo agente terapêutico compreende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radioterapia ou bio- terapia.
    115. Método, de acordo com a reivindicação 113 ou 114, caracterizado pelo fato de que as células imunes e/ou o pelo menos um segundo agente terapêutico são administrados por via intravenosa, por via intraperitoneal, por via intratraqueal, por via intratumoral, por via intramuscular, por via endoscópica, por via intralesional, por via percutânea, por via subcutânea, por via regional ou através da injeção direta ou perfusão.
    116. Método, para a preparação de uma célula imune para expressar um CAR, dito método caracterizado pelo fato de que com- preende o uso de um gRNA de CRISPR para inserir o CAR em um ló- cus do gene inibidor da referida célula imune.
    117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o CAR é codificado por um vetor de expressão.
    118. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracteri- zado pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor retroviral.
    119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que o vetor retroviral é um vetor viral adeno- associado.
    120. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracteri- zado pelo fato de que o vetor viral adeno-associado é AAV6.
    121. Método, de acordo com a reivindicação 117, caracteri- zado pelo fato de que o vetor ainda compreende uma sequência de gene inibidor.
    122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de gene inibidor é de um gene ini- bidor selecionado do grupo que consiste em NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, CD5 e CD7.
    123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 122, caracterizado pelo fato de que o gRNA de CRISPR é para dito gene inibidor.
    124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 123, caracterizado pelo fato de que o CAR é flanqueado por ramificações de homologia para dito gene inibidor.
    125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 124, caracterizado pelo fato de que o CAR é inserido em um éxon de dito gene inibidor.
    126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 125, caracterizado pelo fato de que o CAR está sob o con- trole do promotor endógeno do gene inibidor.
    127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 126, caracterizado pelo fato de que o CAR interrompe a expressão do referido gene inibidor.
    128. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 127, caracterizado pelo fato de que o CAR direciona um ou mais antígenos associados a tumor selecionados do grupo que consis- te em CD19, CD319 (CS1), ROR1, CD20, antígeno carcinoembrioná- rio, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial, antí- geno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação a folato, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp120, glicoproteína do envoltório de HIV-1 gp41, GD2, CD5, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, mesotelina, GD3, HERV-K, IL- 11Ralfa, cadeia capa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, TRA- IL/DR4, VEGFR2, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF- R, BCMA e CD99.
    129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 128, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende pelo menos um domínio de sinalização selecionado do grupo que con- siste em CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP12, CD70, CD40 e uma combinação dos mesmos.
    130. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 129, caracterizado pelo fato de que a célula é projetada para expressar pelo menos uma citocina heteróloga selecionada do grupo que consiste em IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 e uma com- binação das mesmas.
    131. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 130, caracterizado pelo fato de que a célula ainda compre- ende um gene suicida.
    132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracteri- zado pelo fato de que o gene suicida é um gene mutante do fator de necrose tumoral ligado à membrana (TNF)-alfa.
    133. Célula imune, caracterizada pelo fato de que está com um CAR inserido em um gene inibidor de dita célula imune.
    134. Célula imune de acordo com a reivindicação 133, ca- racterizada pelo fato de que a célula é produzida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 116 a 132.
    135. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma população de células imunes, como definido na reivindica- ção 133 ou 134.
    136. Composição, de acordo com a reivindicação 135, ca- racterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T, célula B ou célula NK.
    137. Composição, caracterizada pelo fato de que compre- ende uma população de células, como definida em qualquer uma das reivindicações 133 a 136, para o tratamento de um distúrbio relaciona- do ao sistema imunológico, doença infecciosa ou câncer.
    138. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a adminis- tração de uma quantidade eficaz de células, como definida em qual- quer uma das reivindicações 58 a 93, 100 ou de 133 a 134 ao indiví- duo.
    139. Método, de acordo com a reivindicação 138, caracteri- zado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença infecciosa, câncer ou distúrbio relacionado ao sistema imunológico.
    140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracteri-
    zado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é um distúrbio autoimune, doença do enxerto contra hospedeiro, rejeição de aloenxerto ou condição inflamatória.
    141. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é uma condição inflamatória e as células imunes não possuem essenci- almente nenhuma expressão do receptor de glicocorticóide.
    142. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 138 a 141, caracterizado pelo fato de que as células são autólo- gas para o indivíduo.
    143. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 138 a 141, caracterizado pelo fato de que as células são alogêni- cas.
    144. Método, de acordo com a reivindicação 138, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao sistema imunológico é um câncer.
    145. Método, de acordo com a reivindicação 144, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é um câncer sólido ou uma malignida- de hematológica.
    146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 138 a 145, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a administração ao indivíduo de pelo menos um segundo agente tera- pêutico.
    147. Método, de acordo com a reivindicação 146, caracteri- zado pelo fato de que pelo menos um segundo agente terapêutico compreende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radioterapia ou bio- terapia.
    148. Método, de acordo com a reivindicação 146 ou 147, caracterizado pelo fato de que as células imunes e/ou o pelo menos um segundo agente terapêutico são administrados por via intravenosa,
    por via intraperitoneal, por via intratraqueal, por via intratumoral, por via intramuscular, por via endoscópica, por via intralesional, por via percutânea, por via subcutânea, por via regional ou através de injeção direta ou perfusão.
    Inativação da multiplexação de NKG2A(N), CD47 (C), TGFBRIN(T), CISH (CH)
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 146/188 1/38
    Contagem Contagem
    Inativação da multiplexação de TIGIT (T), CD96 (C), CISH (CH), ADENOSINA (A)
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 147/188 Adenosina 2/38
    Contagem Contagem
    Multiplexação*
    Continuação.
    Multiplexação*
    Multiplex®Genes Nocaute
    Relação efetor:alvo
    Citotoxicidade (%)
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 151/188 Célula NK isoladamente
    Célula NK-CCRF-CEM 6/38
    Célula NK isoladamente
    Célula NK-Raji
    Célula NK isoladamente Célula NK+Alvo Célula NK-Rituximab
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 152/188 7/38
    Célula NK isoladamente Célula NK+Alvo Célula NK-Rituximab
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 153/188 8/38
    Continuação.
    Continuação.
    Pós-KO Pré-KO
    Sequência alvo Éxon 2
    Éxon 4 Éxon 4 Éxon 2
    Éxon 2 Éxon 4
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 157/188 Anexina V Anexina V Anexina V Live Dead Live Dead Live Dead 12/38
    Anexina V Anexina V Anexina V
    Live Dead Live Dead Live Dead
    Éxon 2 Éxon 4
    Éxon 2 Éxon 4
    Continuação.
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 160/188 % de lise específica Relação de efetor:alvo 15/38
    Porcentagem Porcentagem de células
    Células vivas Anexina V+ Células mortas
    Live Dead
    Live Dead Anexina V Anexina V Live Dead
    Live Dead
    Anexina V Anexina V
    Não transduzido
    Pós-KO Pré-KO
    Doador 1
    Continuação.
    Doador 2
    Células NK transduzidas por IL15 20/38
    Continuação.
    Células CD19 NK
    Continuação.
    Células CD19 NK
    Continuação.
    Células CD19 NK
    Continuação.
    Contagem
    Contagem Adenosina
    Múltiplos
    Continuação.
    Multiplexação Citotoxicidade (%)
    Relação de efetor:alvo
    Multiplexação
    Multiplexação+TGFb
    Continuação.
    Eficiência de inativação Eficiência de inativação de NKG2A/ com base na PCR do dia 3 TGFBR2 com base em FACS do dia 7
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 173/188 Eficiência de inativação de CISH com base na proteína do dia 7 28/38
    Citocina %
    NK isoladamente Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 175/188 Contagem Contagem Perforina Perforina 30/38 a B rin a fo im er nz P ra Contagem Contagem
    G Granzima B Granzima B Continuação.
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 176/188 Citotoxicidade (%) Relação de efetor:alvo 31/38
    Anexina V Anexina V Anexina V
    Live Dead Live Dead Live Dead Continuação.
    Não tratado Anexina V
    Live Dead Anexina V Live Dead Anexina V
    Anexina V
    Live Dead Live Dead Anexina V
    Anexina V
    Live Dead Live Dead
    Citotoxicidade (%)
    Relação de efetor:alvo
    Continuação.
    CD19 CAR-NK de murino + Raji
    CD19 CAR-NK de murino + Raji
    Continuação.
    Continuação.
    NK isoladamente
    Chave de cor e histograma Mapa de calor médio de aglomeradoX
    Contagem
    Petição 870210054009, de 16/06/2021, pág. 183/188 Valor 38/38
    Perforina Granzima B
    Continuação.
    Aglomerado 6 e 8 mais perforina, granzima B e não existe nenhuma expressão de NKG2A.
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