CN104593372B

CN104593372B - 一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN104593372B
Application number: CN201510066356.XA
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 赵子龙; 武晓秋; 叶茂; 白华荣
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2035-02-09
Also published as: CN104593372A

Abstract

一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法。所述核酸适配体序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明的可识别胰腺导管癌细胞株PL45的核酸适配体均能特异性且高亲和力的识别胰腺导管癌细胞株PL45，且结合能力强。利用本发明的核酸适配体可从分子角度对肿瘤的危险性进行分层；其对肿瘤转移灶的特异性识别、结合，对靶标的鉴定，可为转移灶的诊断和治疗提供很好的手段，这对于胰腺导管癌的早期检测具有重要意义。

Description

一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法。

背景技术

胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是发生于胰腺的癌症，可发生于胰腺的头、体、尾部及整个胰腺。胰腺癌在病理上有胰导管腺癌、特殊类型导管起源的癌、腺泡细胞癌、小腺体癌、大嗜酸性颗粒细胞性癌和小细胞癌等分型，其中胰腺导管腺癌占胰腺癌病例的80-90％。近年来，胰腺癌发病率在我国呈明显上升趋势。据<<2012中国肿瘤登记年报>>统计，胰腺癌发病率已位居我国所有恶性肿瘤发病率的第九位。目前，根治性手术切除是治疗胰腺癌最有效的手段，其疗效与患者所处分期密切相关，直径≤1cm的胰腺癌患者术后5年生存率可达67％。然而，胰腺癌位置隐蔽、临床表现极不典型，且无有效的肿瘤标志物。同时，核磁共振成像(MRI)、计算机X射线层析扫描技术(CT)、内镜逆行胰胆管造影(ERCP)和超声内镜(EUS)等常规影像技术的敏感性不能满足胰腺癌早期诊断的需求。90％胰腺癌患者确诊时已处于中晚期，不能进行根治性手术切除。同时，胰腺癌患者对传统的放射和化学治疗易产生抗性。这些原因使胰腺癌患者中位生存期仅为6-9个月，五年生存率不足5％。因此，胰腺癌的早期诊断和预后是目前亟需建立和发展高灵敏和高特异性的分子探针是改善胰腺癌预后的重要手段。

随着人类基因组学、蛋白质组学和表观遗传学的发展，人们逐步了解基因遗传学和表观遗传学的变异会导致肿瘤细胞与正常细胞之间产生分子差异。这些反映肿瘤细胞存在的分子差异(肿瘤标志物)可能与肿瘤的发生发展密切相关。目前研究肿瘤等重大疾病的主要分子探针为蛋白质抗体。然而，一方面，抗体具有制备周期长、成本高、容易失活、具有免疫原性和不易进行化学修饰等多种缺陷；另一方面，胰腺癌临床肿瘤标志物(如糖抗原CA19-9、CA-50和癌胚抗原)缺乏特异性。另外上述肿瘤标志物对早期胰腺癌也缺乏敏感性。这些问题限制了基于抗体的靶向分子探针在胰腺癌早期诊断和治疗中的应用。因此，发展识别胰腺癌发生发展过程中关键蛋白的分子探针将有助于我们从分子水平上了解胰腺癌的发病机制，为实现胰腺癌早期诊断和靶向治疗提供新的分子工具。

在发展识别癌变细胞/组织与正常细胞/组织之间分子差异的分子探针技术中，基于以完整肿瘤细胞为靶标的指数富集配体系统进化技术(Cell-SELEX)有着无与伦比的优势。Cell-SELEX是指以活性细胞为靶标，通过DNA/RNA文库在细胞表面重复吸附分配、洗脱回收及聚合酶链扩增三个基本步骤，从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的、能够高亲合性高特异性结合靶细胞的单链寡核苷酸(即核酸适配体，又称适配体，适配子)。活细胞作为筛选靶标具有以下优点：细胞表面膜蛋白保持天然构象和生物学功能；不需要了解蛋白分子信息即可筛选获得能识别肿瘤细胞的核酸适配体；通过以正常细胞作为反筛靶标，可以获取区分正常细胞和病变细胞之间分子差异的核酸适配体；整个筛选过程是在细胞膜上进行，细胞膜上蛋白的多样性使同时筛选得到识别不同蛋白的核酸适配体成为可能。核酸适配体的亲和力与抗体相当甚至高于抗体。而且与蛋白质分子探针相比，核酸适配体具有以下优点：体外筛选且周期短、容易合成和进行化学修饰、不同批次之间差异小、稳定性好、可常温运输、免疫原性小和快速的组织穿透能力。因此，核酸适配体已成为蛋白质科学和细胞生物学等研究领域的一个重要分子工具。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述检测胰腺导管癌的核酸适配体序列如SEQ ID NO.1所示，命名为核酸适配体XQ-2。所述核酸适配体的序列还可以是将核酸适配体XQ-2的5'端14个碱基及3’端10个碱基截去后所得的保守序列(结合靶细胞的核心序列)，保守序列如SEQ ID NO.2所示，所述核酸适配体命名为核酸适配体XQ-2d，核酸适配体XQ-2d与核酸适配体XQ-2功能相同。

核酸适配体XQ-2:

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTAT GAGC GAGCCTGGCG-3’(SEQ ID NO.1)；

在保持XQ-2保守序列(下划线部分)不变的情况下可将核酸适配体进行修饰和改造，得到核酸适配体的衍生物，核酸适配体的衍生物可以为：

a)对所述核酸适配体XQ-2的两端的核苷酸进行删减，得到与XQ-2功能相同的核酸适配体的衍生物，如核酸适配体XQ-2d：

5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’(SEQ IDNO.2)。

b)对所述核酸适配体XQ-2两端核苷酸的碱基进行人工碱基替换，得到与XQ-2功能相同的核酸适配体的衍生物。

c)将上述核酸适配体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记等物质后，得到的与所述核酸适配体具有相同结合能力的核酸适配体衍生物。

所述检测胰腺导管癌的试剂盒中含有权利要求1或/和2所述的核酸适配体。

筛选权利要求1或2所述核酸适配体的方法包括如下步骤：

(1)合成序列如SEQ ID NO.3所示的随机单链DNA文库，以及序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物，SEQ ID NO.4所示序列的5’端被异硫氰酸荧光素标记，SEQ IDNO.5所示序列的5’端被生物素标记；

(2)将随机单链DNA文库与靶细胞胰腺导管癌细胞株PL45孵育；孵育完成后收集胰腺导管癌细胞株PL45；95℃加热变性分离结合胰腺导管癌细胞株PL45的核酸适配体，作为第一次筛选出的核酸文库；

(3)以步骤(1)所述的引物对第一次筛选出的核酸文库进行PCR扩增，得到扩增产物；

(4)用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记PCR扩增产物；然后利用0.2M氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库；

(5)将DNA单链文库与非靶细胞HPNE细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，排除掉非特异性结合的核酸序列；

(6)将步骤(5)所得的上清液与靶细胞胰腺导管癌细胞株PL45孵育，洗脱结合在胰腺导管癌细胞株PL45表面的核酸适配体，作为第二次筛选出的核酸文库；

(7)用第二次筛选出的核酸文库取代步骤(3)所得到的扩增产物，并重复步骤(4)～

(6)的筛选过程，筛选得到与靶细胞PL45细胞株结合的最终核酸文库；

(8)将最终核酸文库进行高通量测序，利用流式细胞术检测最终核酸文库中DNA序列与PL45细胞株的结合选择性和亲和力，确定核酸适配体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。采用本发明的核酸适配体进行前列腺癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

本发明的可识别胰腺导管癌细胞株PL45的核酸适配体均能特异性且高亲和力的识别胰腺导管癌细胞株PL45，且结合能力强。利用本发明的核酸适配体可从分子角度对肿瘤的危险性进行分层；其对肿瘤转移灶的特异性识别、结合，对靶标的鉴定，可为转移灶的诊断和治疗提供很好的手段，这对于胰腺导管癌的早期检测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例筛选过程中适配体文库的富集过程：峰形代表PL45细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的初始文库和第8轮、12轮、15轮筛选产物结合后的荧光强度；

图2为本发明实施例中核酸适配体(SEQ ID NO.1)与靶细胞PL45及非靶细胞HPNE结合能力的流式检测结果；

图3为本发明实施例中核酸适配体(SEQ ID NO.1)的序列优化分析及与靶细胞结合的拟合曲线及解离常数(Kd)；

图4为本发明实施例中核酸适配体(SEQ ID NO.2)在完全培养基中稳定性的分析；

图5为本发明实施例中核酸适配体(SEQ ID NO.2)与胰腺导管正常组织、胰腺导管癌组织染色荧光强度差异比较；

图6为本发明实施例中核酸适配体(SEQ ID NO.2)在胰导管腺癌裸鼠模型中的识别作用。

具体实施方式

细胞来源：

本实验筛选所用两种细胞株(胰导管腺癌PL45株和HPNE细胞株)来自美国ATCC细胞库。实验其它所用细胞系来自湘雅医院细胞库。

本发明利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，以胰腺导管腺癌PL45细胞株为正筛靶标，以胰腺导管永生化HPNE细胞株为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库中筛选出与所述胰腺导管癌细胞株PL45特异结合的核酸适配体。

实施例1：胰腺导管癌细胞特异性核酸适配体的筛选

(1)所用核酸文库和引物的设计：

随机单链DNA文库：

5’-ACCGACCGTGCTGGACTCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTATGAGCGAGCCTGGCG-3’(N代表A、T、C和G四种碱基)(SEQ ID NO.3)，即，该随机单链DNA文库理论库容量为4⁴²条DNA；

上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-ACCGACCGTGCTGGACTCA-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物：5’-生物素-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3’(SEQ ID NO.5)；

(2)正筛选：

2.1孵育：用结合缓冲液(D-PBS，5mM氯化镁)溶解上述的随机核酸文库，95℃恒温变性5分钟，迅速放入冰中；然后与已经培养和预处理好的胰腺导管癌细胞株PL45在4℃孵育1小时。

2.2解离：孵育完成后移除孵育培养皿中溶液，用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)洗涤孵育培养皿中的细胞；用1mL无菌水刮取孵育培养皿中细胞，置于1.5mL离心管，95℃加热变性10分钟，5500转每秒离心后取上清，分离结合PL45细胞的核酸序列，即为PL45细胞的第一轮筛选的核酸文库。

(3)进行PCR扩增文库：取步骤2中筛选所得的核酸文库进行常规PCR扩增，上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-ACCGACCGTGCTGGACTCA-3’；下游引物：5’-生物素-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3’；扩增条件为：95℃，3分钟；95℃，30秒；58.5℃，30秒，72℃，30秒，经合适循环轮数，72℃，5min。第一轮筛选后将全部所得的PL45细胞的第一轮筛选的核酸文库进行预扩增8个循环，然后以扩增产物为模板再进行大量扩增。

(4)制备DNA单链文库：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤(3)中的PCR扩增产物；然后利用0.2M氢氧化钠使双链DNA变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA单链文库；

(5)反筛：将步骤(4)所得到的DNA单链文库与非靶细胞HPNE细胞株孵育，然后收集细胞孵育后的上清，即排除掉非特异性结合的核酸序列；

(6)正筛：将步骤(5)中所制上清液与靶细胞孵育，洗脱保留结合靶细胞的核酸序列，即为第二次筛选的核酸文库；

(7)核酸适配体循环筛选：以步骤(6)所得的核酸文库取代步骤(2)所得到的扩增产物，并重复步骤(4)～(6)的筛选过程，直到筛选得到与靶细胞PL45细胞株结合能力强的核酸文库；

(8)将筛选获得的最终核酸文库进行高通量测序，利用流式细胞术检测所得测序所得DNA序列与PL45细胞株的结合选择性和亲和力，确定核酸适配体。

核酸适配体XQ-2序列为:

核酸适配体XQ-2d序列为：

5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’(SEQ IDNO.2)

实施例2：胰腺导管癌细胞特异性核酸适配体的筛选

将得到的核酸适配体在5’端标记荧光分子制成分子探针，分别取0nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM、140nM、160nM、200nM、300nM、400nM、500nM的分子探针溶液，与3×10⁵个PL45细胞进行冰上孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤两次，用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。如细胞能结合荧光标记的核酸适配体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式Y＝BmaxX/(Kd+X)计算核酸适配体的平衡解离常数Kd。结果表明，核酸适配体的平衡解离常数均在纳摩尔范围内。

实施例3：核酸适配体(SEQ ID NO.2)在完全培养基中稳定性的分析

3微摩异硫氰酸荧光素标记的核酸适配体(SEQ ID NO.2)分别置于200微升含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基中。在不同考察时间点，将样品置于干冰－乙醇中快速冷却后置于－80度冰箱保存。当所有时间点样品收集完毕，将样品置于4度，待其溶解后，取20微升样品于4％的琼脂糖凝胶中进行分离，然后进行成像分析。如图4可见：核酸适配体(SEQ IDNO.2)能在上述培养基稳定存在6小时。

实施例4：3-吲哚菁类染料(Cy5)标记的核酸适配体在临床胰岛管腺癌组织切片中的应用测试

(1)临床样本组织切片于60℃烤箱中烘烤1小时后，立刻置于第一缸二甲苯中15分钟，而后置入第二缸二甲苯中15分钟进行脱蜡；再将已脱蜡的组织切片依次放置于无水乙醇中10分钟，95％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟；蒸馏水润组织切片后对将其置于TE buffer(pH 8.0)，将切片放入盛有修复液的容器中，于微波炉内加热至沸腾，然后停止加热，使其温度保持在95℃～98℃之间。15分钟后，取出切片，蒸馏水冲洗后，再用PBS(0.01M，pH7.4)浸泡3次，每次5分钟(保证第一次浸泡的是新配的PBS)。

(2)将已抗原修复的组织切片与含20％FBS和1mg/ml鲱鱼精DNA的结合缓冲溶液室温孵育60分钟；洗涤后与200微升含0.25微摩Cy5标记的核酸适配体(SEQ ID NO.2)或起始文库于室温孵育60分钟。用洗涤缓冲液洗涤三次后，将组织切片晾干，并用20％甘油封片，观察。由图5可见：核酸适配体(SEQ ID NO.2)具有对胰腺导管癌细胞的特异性结合能力，在临床实际标本切片的检测中可看到核酸适配体(SEQ ID NO.2)对胰导管腺癌肿瘤具有良好的识别检测能力，能够区分正常胰腺组织和胰导管腺癌肿瘤组织。正常胰腺组织和胰导管腺癌肿瘤组织均不能与单链DNA文库(SEQ ID NO.3)结合。

实施例5：Cy5标记的核酸适配体在裸鼠模型中的应用测试

购买四周裸鼠，待裸鼠适应新环境后，每只裸鼠皮下注射5百万个PL45细胞，使裸鼠成瘤，约2周裸鼠长成瘤。通过尾静脉注射的方法，给裸鼠注射Cy5标记的核酸适配体(SEQID NO.2)或起始文库和文库4.5nmol后，用小动物成像仪进行拍照观察。由图6可见：在胰导管腺癌裸鼠模型中通过尾部静脉注射核酸适配体(SEQ ID NO.2)5分钟后，肿瘤位置就出现荧光信号；1小时后，该位置的荧光信号强度达到最强，2小时后，荧光信号明显降低；3小时时，荧光信号几乎完全消失。然而在注射单链DNA文库(SEQ ID NO.3)的胰腺癌裸鼠模型中，在整个考察过程中，肿瘤位置都没有可观察到的荧光信号。

Claims

1.一种检测胰腺导管癌的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列如SEQ IDNO.1所示，命名为核酸适配体XQ-2。

2.一种检测胰腺导管癌的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列是将权利要去1所述的核酸适配体XQ-2的5'端14个碱基及3’端10个碱基截去后所得的保守序列，保守序列如SEQ ID NO.2所示，所述核酸适配体命名为核酸适配体XQ-2d，核酸适配体XQ-2d与核酸适配体XQ-2功能相同。

3.一种检测胰腺导管癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1或/和2所述的核酸适配体。

4.筛选权利要求1或2所述核酸适配体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）合成序列如SEQ ID NO.3所示的随机单链DNA 文库，以及序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示的引物，SEQ ID NO.4所示序列的5’端被异硫氰酸荧光素标记，SEQ ID NO.5所示序列的5’端被生物素标记；

（2）将随机单链DNA 文库与靶细胞胰腺导管癌细胞株PL45孵育；孵育完成后收集胰腺导管癌细胞株PL45；95 ^oC加热变性分离结合胰腺导管癌细胞株PL45的核酸适配体，作为第一次筛选出的核酸文库；

（3）以步骤（1）所述的引物对第一次筛选出的核酸文库进行PCR扩增，得到扩增产物；

（4）用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记PCR扩增产物；然后利用2 M氢氧化钠使双链DNA 变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的DNA 单链文库；

（5）将DNA单链文库与非靶细胞HPNE细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，排除掉非特异性结合的核酸序列；

（6）将步骤（5）所得的上清液与靶细胞胰腺导管癌细胞株PL45孵育，洗脱结合在胰腺导管癌细胞株PL45表面的核酸适配体，作为第二次筛选出的核酸文库；

（7）用第二次筛选出的核酸文库取代步骤（3）所得到的扩增产物，并重复步骤（4）～（6）的筛选过程，筛选得到与靶细胞PL45细胞株结合的最终核酸文库；

（8）将最终核酸文库进行高通量测序，利用流式细胞术检测最终核酸文库中DNA序列与PL45细胞株的结合选择性和亲和力，确定核酸适配体。