ES2313883T3 - Procedimientos para el tratamiento de tumores y metastasis utilizando una combinacion de terapias antiangiogenicas e inmunoterapias. - Google Patents
Procedimientos para el tratamiento de tumores y metastasis utilizando una combinacion de terapias antiangiogenicas e inmunoterapias. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de un antagonista de alfa vbeta 3 seleccionado de entre el grupo constituido por un péptido que contiene RGD, un anticuerpo monoclonal anti-alfavbeta3, y un anticuerpo monoclonal de receptor anti-alfavbeta3 como agente inhibidor de angiogénesis y una proteína de fusión antígeno antitumoral/citocina como agente inmunoterapéutico antitumoral para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de una célula tumoral en un paciente, en la que dicho agente inhibidor de angiogénesis y el agente inmunoterapéutico antitumoral se administran en una cantidad que inhibe la proliferación de la célula tumoral a un paciente, en la que dicho antígeno antitumoral comprende por lo menos una parte que se une al antígeno de un anticuerpo dirigido hacia un antígeno tumoral.
Description
Procedimientos para el tratamiento de tumores y
metástasis utilizando una combinación de terapias antiangiogénicas e
inmunoterapias.
La presente solicitud reivindica prioridad para
la solicitud provisional US para la patente nº de serie 60/119.721,
presentada el 12 de febrero de 1999.
Alguno de los trabajos dados a conocer en la
presente memoria se ha financiado en parte por subvenciones de los
National Institutes of Health (NIH) actuando en nombre de los
Estados Unidos de América. El gobierno de los Estados Unidos de
América puede poseer determinados derechos sobre la invención.
La invención se refiere a la inhibición de
tumores primarios y de las metástasis utilizando una terapia basada
en la administración combinada de una terapia antiangiogénica y una
inmunoterapia antitumoral dirigida.
La generación de nuevos vasos sanguíneos, o
angiogénesis, desempeña una función principal en el desarrollo de
enfermedades malignas y ha generado mucho interés en el desarrollo
de agentes que inhiben la angiogénesis (véase por ejemplo Holmgren,
L., O'Reilly, M.S. & Folkman, J. (1995) "Dormancy of
micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the
presence of angiogenesis supresión", Nature Medicine 1,
149-153; Folkman, J. (1995) "Angiogenesis in
cancer, vascular, rheumatoid and other disease", Nature
Medicine 1, 27-31; O'Reilly, M.S., et
al., (1994) "Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that
mediates the supresión of metastases by a Lewis lung carcinoma",
Cell 79, 315-328; Kerbel, R.S. (1997) "A
cancer therapy resistant to resistance", Nature 390,
335-336; Boehm, T., et al., (1997)
"Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce
acquired drug resistance", Nature 390,
404-7; y Volpert, O.V., et al., (1998) "A
human fibrosarcoma inhibits systemic angiogenesis and the growth of
experimental metastases vía thrombospondin-1",
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 95,
6343-6348).
La utilización de antagonistas
\alpha_{v}\beta_{3} de la integrina para inhibir la
angiogénesis es conocida en los procedimientos para inhibir el
desarrollo del tumor sólido por reducción del aporte sanguíneo al
tumor sólido. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.753.230 (Brooks
& Cheresh) y la patente US nº 5.766.591 (Brooks & Cheresh)
que describen la utilización de antagonistas
\alpha_{v}\beta_{3} como polipéptidos sintéticos,
anticuerpos monoclonales y miméticos de \alpha_{v}\beta_{3}
que se unen al receptor \alpha_{v}\beta_{3} e inhiben la
angiogénesis.
Además, se han descrito terapias de la proteína
de fusión anticuerpo-citocina que favorecen la
inhibición mediada por la respuesta inmunitaria de tumores probados
tales como las metástasis de carcinoma. Por ejemplo, la citocina
interleucina 2 (IL-2) se ha fusionado a una cadena
pesada del anticuerpo monoclonal inmunorreactiva, en dos proteínas
de fusión independientes, con la molécula de adhesión a la célula
epitelial de antígenos asociados al tumor (Ep-CAM,
KSA, KS1/4 antígeno) o el disialogangliósido GD_{2} mediante la
utilización de los anticuerpos KS1/4 y ch14.18, respectivamente,
para formar las proteínas de fusión
ch14.18-IL-2 y
KS1/4-IL-2, respectivamente. Véase,
por ejemplo, la patente US nº 5.650.150 (Gillies).
La identificación de inhibidores específicos del
sistema vascular de la angiogénesis que son sinérgicos con terapias
que dirigen especialmente el compartimento tumoral, permitirán
ajustar óptimamente el tratamiento eficaz del cáncer.
La angiogénesis está caracterizada porque
presenta la invasión, migración y proliferación de células
endoteliales, procesos que dependen de interacciones celulares con
componentes de la matriz extracelular. En este contexto, el
receptor de adhesión endotelial de \alpha_{v}\beta_{3} de
integrina se demuestra que es una pieza clave para proporcionar la
diana específica del sistema vascular para las estrategias del
tratamiento antiangiogénico (Brooks, P.C., Clark, R.A. &
Cheresh, D.A. (1994) "Requirement of vascular integrin alpha v
beta 3 for angiogenesis", Science 264,
569-571; Friedlander, M., et al., (1995)
"Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v
integrins", Science 270, 1500-1502). El
requisito para la \alpha_{v}\beta_{3} vascular de la
integrina en la angiogénesis se demostró por varios modelos in
vivo donde la generación de nuevos vasos sanguíneos por tumores
humanos trasplantados fue inhibida completamente por la
administración generalizada de antagonistas peptídicos
\alpha_{v}\beta_{3} de la integrina o del anticuerpo LM609
anti-\alpha_{v}\beta_{3}. (Brooks, P.C.,
et al., (1994) Science supra; Brooks, P.C., et
al., (1994) "Integrin alpha v beta 3 antagonists promote
tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood
vessels", Cell 79, 1157-1164). El
hibridoma murino LM609 se ha depositado en la American Type Culture
Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA) como autoridad depositaria
internacional bajo el Tratado de Budapest y asignada con la
designación HB 9537 de la ATCC, el 15 de septiembre de 1987. Dichos
antagonistas bloquean la ligadura de \alpha_{v}\beta_{3} de
la integrina que favorece la apoptosis de las células vasculares
angiogénicas proliferantes y de este modo destruyen la maduración
de vasos sanguíneos recién formados, un caso esencial para la
proliferación de los tumores.
Se ha identificado el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) como un factor de crecimiento angiógeno
selectivo que puede estimular la mitogénesis celular endotelial. Las
biopsias de tumor humano presentan el aumento de expresión de los
ARNm de VEGF por células malignas y los ARNm del receptor de VEGF en
células endoteliales adyacentes. La expresión de VEGF parece que es
mayor en las zonas de los tumores adyacentes a las áreas avasculares
de la necrosis (para estudio véase Thomas et al., (1996)
"Vascular Endothelial Growth Factor, a Potent and Selective
Angiogenic Agent", J. Biol. Chem. 271 (2):
603-606). Las terapias antitumorales eficaces
pueden utilizar la dirección del receptor de VEGF para la inhibición
de la angiogénesis utilizando anticuerpos monoclonales. (Witte L.
et al., (1998) "monoclonal antibodies targeting the VEGF
receptor-2 (Flk1/KDR) as an antiangiogenic
therapeutic strategy", Cancer Metastasis Rev.
17(2):155-61.
Un obstáculo mayor para el tratamiento eficaz de
los cánceres diseminados incluye la enfermedad mínima residual
caracterizada por micrometástasis que carecen de aporte vascular muy
demostrado para la administración de agentes terapéuticos. En este
contexto, una nueva estrategia inmunoterapéutica eficaz probada en
la utilización de anticuerpos monoclonales específicos del
compartimento tumoral para dirigir citocinas al micromedio tumoral.
Esto se consiguió mediante proteínas de fusión anticuerpo
recombinante-citocina, generadas para mantener la
capacidad de dirección específica para el tumor único de los
anticuerpos monoclonales y las funciones inmunomoduladoras de las
citocinas. La utilización de una proteína de fusión
anticuerpo-IL-2 para dirigir
IL-2 en el compartimento del tumor produjo la
activación de células efectoras que invaden el micromedio del tumor
y dieron como resultado la erradicación eficaz de micrometástasis
demostradas en tres modelos diferentes de tumor de ratón isogénico.
(Becker, J.C., et al. (1996), "T
cell-mediated eradication of murine metastatic
melanoma induced by targeted interleukin 2 therapy", J. Exp.
Med. 183, 1361-2366; Xiang, R., et al.,
(1997) "Elimination of established murine colon carcinoma
metastases by antibody-interleukin 2 fusion protein
therapy", Cancer Res. 57, 4948-4955;
Lode, H.N., et al., (1998) "Natural killer
cell-mediated eradication of neuroblastoma
metastases to bone marrow by targeted interleukin-2
therapy", Blood 91, 1706-1715). Aunque muy
eficaz en las etapas iniciales de la metástasis tumoral, esta
estrategia dirigida al compartimento del tumor podría solamente
retardar el desarrollo de las metástasis en las etapas finales del
crecimiento tumoral caracterizadas por un compartimento vascular
totalmente desarrollado. Aquí, los autores estudiaron la cuestión de
si existe una ventaja complementaria de estrategias vasculares
específicas y dirigidas al compartimento del tumor que sean
sinérgicas cuando se utilicen en combinaciones sucesivas y
simultáneas.
Esto se probó en tres modelos de tumor murino
isogénicos de carcinoma de colon, melanoma y neuroblastoma, este
último caracterizado por metástasis hepáticas espontáneas. Los tres
modelos presentan similitudes próximas a las enfermedades en seres
humanos. Los modelos de melanoma y neuroblastoma expresan el
disialoganglósido GD2, un antígeno asociado al tumor bien
demostrado en dichos cánceres neuroendotérmicos (Irie, R.F.,
Matsuki, T. & Morton, D.L. (1989) "Human monoclonal antibody
to ganglioside GM2 for melanoma treatment", Lancet 1,
786-787; Handgretinger, R., et al., (1995)
"A phase I study of human/Mouse chimeric antiganglioside GD2
antibody ch14.18 in patients with neuroblastoma", Eur. J.
Cancer 31A, 261-267) y el modelo de carcinoma
de colon se caracteriza por la expresión de la molécula de adhesión
a células epiteliales (Ep-CAM, KSA, antígeno
KS1/4), una molécula diana aprovechada con éxito para la
inmunoterapia pasiva en el hombre (Riethmuller G., et al.
(1994) "Randomised trial of monoclonal antibody for adyuvante
therapy of resected Duke's C colorrectal carcinoma", Lancet 343,
1177-1183). Estos antígenos delinean específicamente
el compartimento tumoral en estos modelos dirigidos por la
proteínas de fusión
anticuerpo-interleucina-2 con
anticuerpo GD2 de híbrido humano/de ratón
(ch14.18-IL-2) (Gillies, S.D., et
al., (1992) "Antibody-targeted interleukin 2
stimulates T-cell killing of autologous tumor
cells", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 892,
1428-1432) y
anti-Ep-CAM humanizado
(anti-KSA, antígeno anti-DS1/4)
anticuerpo KS1/4-IL-2 (Xiang, R.,
et al. (1997) supra; Gillies, S., et al.,
(1998) "Antibody-IL-12 fusion
proteins are effective in SCID Mouse models of prostrate and colon
carcinoma metastases", J. Immunol. 160,
6195-6203). El compartimento vascular de estos
modelos de tumor, como se describió en varios modelos de animales,
se define por la expresión de \alpha_{v}\beta_{3} de
integrina, en los vasos sanguíneos recién formados. (Brooks, P.C.,
et al. (1994) supra). Los datos presentados en la
presente memoria demuestran una eficacia sinérgica de tratamientos
simultáneos y sucesivos que dirigen específicamente los
compartimentos tumoral y vascular de los tumores primarios en
metástasis distantes. Un mecanismo para este sinergismo lo
proporciona una disminución en la formación de vasos sanguíneos y un
aumento en la inflamación solamente en animales tratados con la
terapia de combinación. Estas observaciones acentúan el efecto
beneficioso de combinar estrategias inmunoterapéuticas
antiangiogénicas con las inmunoterapéuticas antitumorales
específicas para el tumor.
La presente invención se refiere a una
utilización de un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3}
seleccionado de entre el grupo constituido por un péptido que
contiene RGD, un anticuerpo monoclonal
anti-\alpha_{v}\beta_{3} y un anticuerpo
monoclonal de receptor
anti-\alpha_{v}\beta_{3} como agente
inhibidor de angiogénesis y una proteína de fusión antígeno
antitumoral/citocina como agente inmunoterapéutico antitumoral para
la preparación de una composición farmacéutica destinada a tratar
una célula tumoral en un paciente; en la que dicho agente inhibidor
de angiogénesis y el agente inmunoterapéutico antitumoral se
administran en una cantidad que inhibe la proliferación de la
célula tumoral en un paciente, en la que dicho agente antitumoral
comprende por lo menos una parte que se une al antígeno de un
anticuerpo dirigido hacia un antígeno tumoral.
La inhibición de la proliferación de la célula
tumoral puede comprender la inhibición del crecimiento de las
células tumorales en el tumor existente o en la metástasis del
tumor, la inhibición de la formación de metástasis tumorales
adicionales e incluso la muerte de la célula tumoral. El agente
inhibidor de la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico
antitumoral pueden administrarse sustancialmente a la vez así como
sucesivamente.
El paciente puede recibir las composiciones
terapéuticas mencionadas anteriormente antes, durante o después de
la intervención quirúrgica para eliminar todo el tumor o parte del
mismo. La administración puede realizarse por vía de inmersión
directa; intravenosa (i.v.) generalizada o localizada,
intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.) o
por inyección directa en una masa tumoral; y/o por administración
oral de las formulaciones apropiadas.
Un agente inhibidor de angiogénesis adecuado
para su utilización según la invención es el que puede inhibir la
formación de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización) o
ensanchamiento de las redes de capilares existentes en los tejidos
próximos a una célula tumoral. Los agentes inhibidores de
angiogénesis incluyen polipéptidos lineales o que contienen
ciclo-RGB.
Un anticuerpo monoclonal preferido que se une a
una integrina \alpha_{v}\beta_{3} es el anticuerpo
monoclonal identificado como LM609 (ATCC HB 9537).
La forma de realización más preferida de un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} es el péptido sintético
que contiene RGD ciclo(RGDfN-MeV) (SEC. ID.
nº: 11). Los péptidos cíclicos de este tipo general se describen en
la patente US nº 5.262.520 (Plow et al.).
Los antígenos asociados al tumor que pueden
utilizarse para dianas de los agentes inmunoterapéuticos incluyen
un antígeno asociado al tumor seleccionado de entre el grupo
constituido por AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptor
de EGF, GD_{2}, GD_{3}, GM1, GM2, Her-2/Neu,
Ep-CAM (KSA), receptor de IL-2,
Lewis-Y, Lewis-X (CD15),
proteoglucano MCSP asociado al melanoma, PSA y receptor de
transferrina.
El agente inmunoterapéutico preferido tiene un
componente efector que es un polipéptido de citocina unido a un
componente de dirección que es una cadena de polipéptido
inmunoglobulina (Ig). La cadena de polipéptido Ig comprende una
zona variable que se une a un antígeno asociado al tumor. Resulta
preferido que dicha cadena de inmunoglobulina, cuando se combina
con la cadena complementaria apropiada (es decir, una cadena pesada
complementa a una cadena ligera) defina un punto activo del
anticuerpo que es específico para un antígeno asociado al
tumor.
tumor.
La parte de Ig que se dirige al tumor del agente
inmunoterapeutico puede comprender una secuencia de aminoácidos de
la cadena completa de inmunoglobulina, o por lo menos el fragmento
que comprende la parte de la proteína con especificidad que se une
al antígeno que es específico para un antígeno asociado al
tumor.
Un anticuerpo y las cadenas polipeptídicas de
éste, adecuados para su utilización en la invención, tendrán una
secuencia de aminoácidos que puede ser de cualquier origen de
mamífero. Cuando dicha proteína del anticuerpo no es del mismo
origen que la del paciente previsto, pueden utilizarse los
fragmentos de la proteína del anticuerpo, tales como
F(ab')_{2}, Fab, Fv o la proteína del anticuerpo
monocatenaria Fv modificada genéticamente. Para reducir más la
antigenicidad de la proteína del anticuerpo, puede realizarse la
modificación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo para
reducir tal haciendo que la proteína parezca más similar a los
componentes normales del anticuerpo de los pacientes. Por ejemplo,
las secuencias de aminoácidos del anticuerpo murino monoclonal
pueden modificarse para que parezcan más humanas, para la
administración a pacientes humanos mediante una variedad de
procesos para la humanización del anticuerpo.
Alternativamente, el anticuerpo puede ser de
origen humano (codificado genéticamente para genes con Ig humana)
pero producido en un animal transgénico transformado para expresar
los genes con Ig humana en lugar de sus propios genes con Ig
natural. Por ejemplo pueden prepararse ratones transgénicos que
expresan el ADN de origen humano que codifica proteínas de Ig
humana. La generación del anticuerpo monoclonal de dichos ratones
transgénicos producirá en hibridomas de linfocito B murino que
expresan ADN humano que codifican anticuerpos que tienen secuencias
de aminoácidos de origen humano. Esto reducirá en gran medida la
inmunogenicidad de dichos anticuerpos para su utilización en el
tratamiento de pacientes humanos.
Para el tratamiento de pacientes humanos, los
anticuerpos preferidos para su utilización en la invención son el
anticuerpo ch14.18 monoclonal del antígeno asociado al tumor
anti-GD2 humanizado y el antígeno asociado al tumor
anti-KS1/4 (conocido también como
Ep-CAM y KSA) anticuerpo KS1/4 monoclonal.
Un componente efector de la célula de un agente
inmunoterapéutico adecuado para su utilización en la presente
invención es una citocina seleccionada preferentemente de entre el
grupo constituido por IL-2, IL-12 e
IL-15. La parte de citocina del agente
inmunoterapéutico mencionado anteriormente puede ser la secuencia de
aminoácidos de la proteína citocina completa o un fragmento de
dicha proteína suficiente para provocar una respuesta biológica
específica para la citocina.
En una forma de realización preferida, la parte
de la citocina del agente inmunoterapéutico tiene actividad
biológica de IL-2.
En un agente inmunoterapéutico que comprende un
polipéptido de citocina unido a un polipéptido de Ig, una unión
adecuada entre una cadena polipeptídica de citocina y una cadena
polipeptídica de Ig incluye un enlace polipeptídico directo y una
unión que tiene un enlazador polipeptídico entre las dos
cadenas.
El enlace directo permite la expresión del
agente inmunoterapéutico como proteína de fusión individual,
procedente de una célula hospedadora transformada con un vector de
expresión adecuado que codifica el agente inmunoterapéutico de la
proteína de fusión.
De este modo un agente inmunoterapéutico
preferido para su utilización en la invención es una proteína de
fusión bifuncional que tiene un componente de citocina y un
componente que dirige al antígeno asociado al tumor en el que el
componente de dirección es una cadena polipeptídica de Ig que tiene
especificidad para un antígeno asociado al tumor. Los ejemplos de
dichos agentes inmunoterapéuticos preferidos incluyen la proteína
de fusión ch14.18-IL2 dirigida a GD2 y la proteína
de fusión KS1/4-IL2 dirigida al antígeno asociado al
tumor KS1/4 (conocido también como Ep-CAM y
KSA).
Otro aspecto de la invención comprende una
composición terapéutica para tratar un tumor o una metástasis
tumoral que comprende por lo menos un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} seleccionado de entre el grupo
constituido por un péptido que contiene RGD, un anticuerpo
monoclonal anti-\alpha_{v}\beta_{3} y un
anticuerpo monoclonal del receptor
anti-\alpha_{v}\beta_{3} como agente
inhibidor de angiogénesis y por lo menos una proteína de fusión
antígeno antitumoral/citocina como agente inmunoterapéutico
antitumoral, en el que dicho antígeno antitumoral comprende por lo
menos la parte que se une al antígeno de un anticuerpo dirigido a
un antígeno tumoral.
Resulta preferido que el agente
inmunoterapéutico antitumoral se dirija al tumor o a las células de
metástasis tumorales. En una composición terapéutica preferida de
la invención el agente inmunoterapéutico antitumoral es una
proteína bifuncional que tiene un componente efector que es un
polipéptido de citocina unido a un componente que se dirige al
tumor que es una cadena polipeptídica de inmunoglobulina (Ig), donde
dicha cadena de Ig comprende una zona variable que se une a un
antígeno asociado al tumor.
Incluso otro aspecto de la invención consiste en
un kit para tratar una célula tumoral en un tumor o metástasis
tumoral que comprende un envase que contiene: a) un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} seleccionado de entre el grupo
constituido por un péptido que contiene RGD, un anticuerpo
monoclonal anti-\alpha_{v}\beta_{3} y un
anticuerpo monoclonal del receptor
anti-\alpha_{v}\beta_{3} como agente
inhibidor de angiogénesis capaz de inhibir la angiogénesis en dicho
tumor o dicha metástasis tumoral; y b) una proteína de fusión
antígeno antitumoral/citocina como agente inmunoterapéutico
antitumoral, en el que dicho agente antitumoral comprende por lo
menos la parte que se une al antígeno de un anticuerpo dirigido a un
antígeno tumoral.
Las formas de realización preferidas de la
invención se describen a continuación haciendo referencia a los
dibujos adjuntos siguientes en los que:
La Figura 1 representa gráficamente el efecto de
una terapia combinada con antagonista de integrina \alpha_{v}
antiangiogénico e inmunoterapia específica para el compartimento
antitumoral con proteínas de fusión
anticuerpo-IL-2 en tumores
primarios. La Figura 1A representa los resultados de los tumores
primarios provocados por inyección subcutánea (2\times10^{6})
de neuroblastoma N\timesS2. La Figura 1B representa los resultados
de los tumores primarios provocados por la inyección subcutánea
(2\times10^{6}) del carcinoma de colon CT26-KSA.
La Figura 1C representa los resultados de los tumores primarios
provocados por la inyección subcutánea (2\times10^{6}) de
células de melanoma B78-D 14.
La Figura 2 representa gráficamente el efecto de
las terapias antivascular y antitumoral sobre la vascularización y
la respuesta inmunitaria antitumoral. La Figura 2A representa los
resultados de la densidad del vaso sanguíneo de tumores primarios
después del tratamiento del compartimento vascular y tumoral con el
antagonista \alpha_{v} de la integrina, la proteína de fusión
chl4.18-IL-2 y una combinación de la
misma (*P<0,001, prueba de la T de Student). La Figura 2B
representa los resultados de la infiltración de leucocitos de
tumores primarios después de los tratamientos del compartimento
vascular y tumoral, respectivamente (*P<0,001, prueba de la T de
Student).
La Figura 3 representa el efecto de una
combinación sucesiva de antagonista de la integrina \alpha_{v}
antiangiogénico y de la inmunoterapia específica para el
compartimento antitumoral con la proteína de fusión
anticuerpo-IL-2 en metástasis
espontánea de neuroblastoma hepático. El número de metástasis
hepáticas espontáneas fue determinado mediante recuentos
macroscópicos de focos hepáticos (n=8) (**P<0,01, prueba del
orden de la suma de Wilcoxon).
La Figura 4 representa gráficamente el efecto de
la combinación sustancialmente simultánea de un antagonista de
integrina \alpha_{v} antiangiogénico y una inmunoterapia
específica para el compartimento antitumoral con la proteína de
fusión anticuerpo-IL-2 en metástasis
espontáneas del neuroblastoma hepático. Se presentan los resultados
del tratamiento con integrina o, antagonista (17,5 \mug/h) y la
proteína de fusión chl4.18-IL-2
específica para el tumor (5 \mug\times5) iniciados antes (Figura
4A) o después (Figura 4B) de la eliminación del tumor primario. Se
determinaron metástasis de hígado espontáneas mediante recuentos
macroscópicos de focos hepáticos (n=8) (*P<0,01, prueba del
orden de la suma de Wilcoxon).
La supresión y erradicación de tumores primarios
y metástasis distantes es un objetivo principal de las estrategias
de tratamiento alternativo para el cáncer, tal como la inhibición de
la angiogénesis y la inmunoterapia dirigida.
Se ha descubierto que existe una sinergia
inesperada en la efectividad en el tratamiento de células en tumores
y metástasis tumorales mediante la utilización combinada de las dos
modalidades terapéuticas mencionadas en la presente memoria como
(1) terapia de inhibición de la angiogénesis (antiangiogénica) y (2)
inmunoterapia antitumoral. En particular, se describen la terapia
del antagonista \alpha_{v} combinada y la terapia antitumoral
de la proteína de fusión antígeno-citocina.
Se descubrió que se produce una sinergia entre
las dos monoterapias únicas dirigidas contra los compartimentos
vascular y tumoral; respectivamente, un antagonista \alpha_{v}
de integrina antiangiogénico específico para el sistema vascular
del tumor y las proteínas de fusión anticuerpo específico para el
tumor-interleucina 2.
La combinación simultánea y sucesiva de estas
monoterapias erradicaron de manera efectiva las metástasis
espontáneas del hígado en un modelo isogénico poco inmunógeno de
neuroblastoma. Esto contrastaba con las referencias sometidas a
monoterapias con un antagonista \alpha_{v} de integrina
antiangiogénico o con las proteínas de fusión
anticuerpo-IL-2, que eran solamente
parcialmente eficaces a las concentraciones de las dosis
aplicadas.
Además, los tratamientos simultáneos con el
antagonista \alpha_{v} de integrina y las proteínas de fusión
anticuerpo-IL-2 específicas para el
tumor produjeron regresiones drásticas del tumor primario en tres
modelos de tumor isogénicos murinos, es decir, melanoma, carcinoma
de colon y neuroblastoma. Sin embargo, cada agente utilizado como
monoterapia solo, produjo solamente un retardo en el crecimiento del
tumor.
La respuesta antitumoral estaba acompañada por
una reducción simultánea del 50% en la densidad del vaso tumoral y
un aumento de cinco veces en las células inflamatorias en el
micromedio tumoral. Posteriormente, se demostró la necrosis tumoral
solamente en los animales que reciben terapia de combinación, pero
no cuando cada agente se aplicaba como monoterapia. Los resultados
demuestran que estas modalidades de tratamiento sinérgicas
proporcionan una herramienta nueva y eficaz para terapias futuras
del cáncer metastásico.
La invención describe el tratamiento de tumores
y de metástasis tumorales, composiciones terapéuticas y kits
terapéuticos (sistemas envasados) útiles para poner en práctica las
terapias sinérgicas descritas en la presente memoria.
Se describen una variedad de composiciones
terapéuticas que son útiles en la puesta en práctica de la
invención.
Se utilizan según la invención inhibidores de la
angiogénesis que inhiben la angiogénesis en los tejidos tratados
con éstos. El inhibidor de angiogénesis es un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} que inhibe la angiogénesis
(antiangiogénesis) que puede ser un péptido que contiene RGD, un
anticuerpo anti-\alpha_{v}\beta_{3} o un
anticuerpo receptor de
anti-\alpha_{v}\beta_{3}. A título de
ejemplos de antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3} se
describen en las directrices de la patente US nº 5.753.230 (Brooks y
Cheresh) y en la patente US nº 5.766.591 (Brooks y Cheresh), cuyas
descripciones que se refieren a la preparación y utilización de un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} están incorporadas
específicamente a la presente memoria como referencia.
Los antagonistas preferidos son péptidos que
contienen RGD, tal como el péptido cíclico
ciclo(RGDfN-MeV) (SEC. ID. nº: 11).
Los análisis para la identificación de un
antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} adecuado para su
utilización como antagonista se describen en las patentes US
mencionadas y por consiguiente se considera que pueden identificarse
fácilmente antagonistas alternativos para poner en práctica la
presente invención.
El anticuerpo monoclonal
anti-\alpha_{v}\beta_{3} adecuado puede
modificarse para que comprenda fragmentos de unión al antígeno de
éste, incluyendo F(ab)_{2}, Fab y Fv modificado
genéticamente o el anticuerpo monocatenario (SCA). Los
procedimientos para preparar dichos fragmentos son conocidos en la
técnica (véase por ejemplo Hermanson, G.T., Bioconjugate
Techniques, Academic Press, 1996). Las formas de realización de
la invención que describen la utilización del anticuerpo también
incorporan la modificación adecuada del anticuerpo completo contra
el antígeno que se une a fragmentos de éste. Un anticuerpo
monoclonal adecuado se identifica como LM609 (ATCC HB 9537).
Se ha demostrado que otros antagonistas del
receptor \alpha_{v}\beta_{3} son eficaces en la inhibición
de la angiogénesis. Por ejemplo, los antagonistas del receptor
químico tal como el ácido
(S)-10,11-dihidro-3-[3-(piridin-2-ilamino)-1-propiloxi]-5H-dibenzo[a,d]ciclohepteno-10-acético
(conocido como SB-265123) se ha probado en varios
sistemas de modelo de mamífero (véase por ejemplo, Keenan, R.M.
et al., (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(22):
3171-6; Ward, K.W. et al., (1999) Drug
Metab. Dispos. 27(11): 1232-41).
Se ha identificado el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) como factor de crecimiento angiógeno
selectivo. De este modo, un agente inhibidor de la angiogénesis
adicional puede ser un inhibidor de la actividad de VEGF suficiente
para inhibir el crecimiento antiangiogénico. Dicho inhibidor podría
ser un inhibidor competitivo o una molécula de unión/inactivadora
de VEGF o un antagonista receptor de VEGF. Por ejemplo, posibles
inhibidores podrían ser un mímico químico no angiógeno de VEGF que
compita en la unión a la diana/receptor VEGF, un derivado
modificado de VEGF no angiógeno, un anticuerpo que une
específicamente VEGF suficiente para inhibir la actividad angiógena
o posiblemente otra proteína específica que se une a VEGF (tal como
la proteína receptora de VEGF aislada) o el anticuerpo que se une
al receptor VEGF y bloquea la interacción con VEGF.
Se han identificado otros compuestos basándose
en la capacidad del compuesto para inhibir la angiogénesis, por
ejemplo el antígeno PSA asociado al tumor aislado.
La invención completa la administración
combinada de por lo menos un agente terapéutico que inhibe la
angiogénesis (antiangiogénesis) con por lo menos un agente
inmunoterapéutico antitumoral. El agente inmunoterapéutico
antitumoral combina un componente que se dirige al tumor con un
componente efector de la célula que es una citocina. El componente
que se dirige al tumor comprende por lo menos una parte que se une
al antígeno de un anticuerpo dirigido a un antígeno asociado al
tumor.
Los antígenos asociados al tumor son la diana
mediante la cual el agente inmunoterapéutico es dirigido por último
a la célula tumoral. Los antígenos asociados al tumor son conocidos
en la técnica por estar correlacionados con determinados tipos de
cáncer. En la mayoría de todos los casos los antígenos asociados al
tumor son antígenos de la superficie celular que se expresan de
manera no observada normalmente en las células normales asociadas
al origen del tumor canceroso. Otros antígenos asociados al tumor
son las moléculas segregadas o los componentes relacionados con la
matriz extracelular que no se encuentran normalmente en asociación
con el tejido maduro
normal.
normal.
Algunos antígenos asociados al tumor son
proteínas expresadas en las etapas iniciales del desarrollo del
tejido, y normalmente no están asociados a los tejidos maduros
(denominados a veces proteínas oncofetales). Otros antígenos
asociados al tumor son expresados por las células maduras normales,
pero son expresados en cantidades mayores por las células
cancerosas. Los antígenos asociados al tumor pueden ser formas
mutadas de marcadores de células expresadas normalmente o
componentes extracelulares. Incluso otros antígenos asociados al
tumor están relacionados con formas alteradas o poco frecuentes de
glucosilación de proteínas, lípidos o componentes extracelulares o
nuevos grupos de carbohidrato.
Por lo tanto, los antígenos asociados al tumor
pueden variar extensamente y definen, por lo menos en parte, el
tipo de tumor que debe ser tratado por la presente invención. La
variedad de tipos de tumor y de antígenos tumorales que son
expresados por éstos es diversa y sin embargo bien estudiada en las
técnicas del cáncer.
Muchos marcadores adicionales para tumores están
en investigación, y una vez identificados y caracterizados como
antígenos asociados al tumor, son también un antígeno diana adecuado
para la dirección inmunoterapéutica a un tumor deseado o a una zona
de las metástasis.
Se ha descrito la dirección de vectores de
terapia génica a células cancerosas utilizando antígenos
anti-Lewis-Y monoclonales (Kurane,
S. et al., Jpn. J. Cancer Res. 89 (11):
1212-9 (1998)). Asimismo, también se ha descrito la
dirección de liposomas utilizando anticuerpo GM3 antigangliósido o
anticuerpo del antígeno
anti-Lewis-X (Nam, S.M., et
al., Oncol. Res. 11(1):9-16
(1999)).
Como se expone a continuación, los
procedimientos en la técnica son conocidos por tomar un antígeno
identificado para generar los anticuerpos apropiados que se unirán
específicamente a este antígeno. De este modo, pueden identificarse
antígenos tumorales y pueden prepararse anticuerpos monoclonales que
son útiles en la presente invención. Para un estudio de la
preparación de antígenos tumorales véanse lo dado a conocer en Human
Cancer Makers, The Humana Press Inc., eds. Sell and Wahren, 1982.
Las técnicas bioquímicas y biológicas moleculares habituales
aplicables para preparar antígenos y/o citocinas y similares pueden
encontrarse, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989)
Molecular Cloning 2ª ed. (Cold Spring Harbor Press, CSH
NY).
Los antígenos de la superficie de la célula
tumoral pueden ser específicos para una clase de tumores, o para un
tipo individual de tumor. Muchas de las secuencias de ácido nucleico
y/o aminoácido relacionadas con los antígenos asociados al tumor y
que codifican los mismos están disponibles en las bases de datos
públicas para ordenador a las que puede accederse a través de
Internet mediante varios servicios, es decir, la NCBI (National
Center for Biotechnology Information; www3.ncbi.nlm.nih.gov)
y están identificadas generalmente por la denominación y el número
de registro (unos pocos, ejemplos no limitativos de los tipos de
información de la secuencia accesible se citan por el comentario
"see Accession number").
Las dianas preferidas de antígeno asociadas al
tumor incluyen, y no se limitan a, AFP (véase el registro NP
001125), CA125 (véase el registro NP 005890), CEA (véase el registro
AAA62835), CD19 (véase el registro P15391), CD20 (véase el registro
P11836), CD44 (véase el registro P16070), CD45 (véase el registro
P08575), receptor de EGF (véase el registro P00533), GD_{2},
GD_{3}, GM1, GM2, Her-2/Neu (véase el registro
AAA58637), Ep-CAM (KSA) (véase el registro P16422,
AAA36151), receptor de IL-2 (véase el registro
P14784, NP 000197, P01589), Lewis-Y,
Lewis-X (CD 15), proteoglucano MCSP asociado al
melanoma (véase el registro NP 001888), PSA (véase el registro
P07288), PMSA, receptor de transferrina (véase el registro NP
003218, NP 003225, AAF04564), proteína GA733-1 del
marcador de carcinoma pancreático (véase el registro P09758),
receptor de folato (véase el registro NP 000793), L6 (véase el
registro P30408) y CO-29 (véase el registro A36056,
P19075).
Las dianas de antígeno asociadas al tumor
particularmente preferidas para la dirección de agentes
inmunoterapéuticos son GD_{2} y KSA (Ep-CAM;
antígeno KS1/4), como se describe en la presente memoria.
Las proteínas del antígeno asociadas al tumor
están disponibles en el mercado o pueden generarse utilizando ADN
recombinante normal y cultivo celular, las técnicas de expresión de
proteínas conocidas en la materia. Por ejemplo, las listas de Sigma
(St. Louis, MO) para comercializar el disialoganglósido GD2 (G
0776), disialoganglósidos GD3 (G 5904), el monosialogangliósido GM1
(G 7641), el monosialogangliósido GM2 (G 4651), el antígeno Ca
19-9 del tumor gastrointestinal (G 8660, G 8535),
el antígeno CEA carcinoembrionario (C4835), el trisacárido
X-Lewis (L 5152) y Lewis-Y (L
7401).
Los anticuerpos específicos para muchos de estos
antígenos asociados al tumor están disponibles en el mercado. (por
ejemplo, USB, RDI, Accurate Chemical and Scientific Corp., Zymed
Lab.). Por ejemplo, Sigma (St. Louis, MO) comercializa muchos
anticuerpos monoclonales tales como anti-AFP (A
8452), anti-CEA (C2331), receptor
anti-EGF (E 3138), receptor soluble
anti-IL-2, (I 5652, I 5777, I 5902),
anti-CD19 (F 3899), anti-CD20
(C8080), anti-CD44 (C7923) y
anti-CD45 (C7556).
Incluso si no está disponible en el mercado,
utilizando procedimientos conocidos de preparación de anticuerpos
monoclonales, pueden generarse anticuerpos específicos para los
antígenos asociados al tumor utilizando el antígeno como
inmunógeno. Por ejemplo, se han descrito dominios variables de
cadena pesada y ligera del anticuerpo murino para el antígeno
anti-Lewis-Y (véanse los registros
AAB25798 y AAB25799). Asimismo, los dominios variables de cadena
pesada y ligera del anticuerpo murino del gangliósido GM1
anti-asialo (véanse los registros AAD09194 y
AAD09195). Se ha resuelto una estructura cristalina para una cadena
pesada y ligera del anticuerpo monoclonal del gangliósido
anti-GD2 (véanse los registros 2554841 y 2554842).
Se han descrito anticuerpos que se unen al receptor de folato
(proteína de unión), identificados como un marcador para el cáncer
de ovario (véase el registro NP 000793). La secuencia de ácido
nucleico de la cadena pesada y ligera de la zona variable monoclonal
anti-CA125 se ha descrito también y se ha utilizado
para la inserción en un vector de casete (véanse los registros
AAB33454 y 33455).
Los anticuerpos particularmente preferidos son
los anticuerpos ch14.18 y KS1/4 descritos en la presente
memoria.
Desde la llegada de los procedimientos para
generar anticuerpos monoclonales publicados en primer lugar por
Kohler y Milstein, los procedimientos mejorados han llegado a ser
bien conocidos en la técnica. (Véase por ejemplo, Dean, C.J. en
Methods in Molecular Biology vol. 80: Immunochemical
Protocols, 2ª ed. (Pound, J.D. editor, Humana Press, Inc., Totowa,
NJ, 1998) capítulo 4; y Ausbel, F.M. et al., Short
Protocols in Molecular Biology, 2ª ed. (Current Protocols, John
Wiley & Sons, NY NY, 1992) capítulo 11). Actualmente es una
práctica rutinaria generar el anticuerpo monoclonal que se une a un
antígeno específico. Se han mejorado los protocolos de
identificación para la selección de anticuerpos que se unen con gran
afinidad, si se desea.
Por lo general el hospedador para la producción
de hibridomas procede de ratón o de otros roedores.
Una barrera para el tratamiento repetido con
monoclonales murinos para pacientes humanos es el HAMA (anticuerpos
antirratón humanos) generados por el paciente en respuesta al
tratamiento. Los procedimientos para superar esta barrera incluyen
la humanización de proteínas del anticuerpo murino sustituyendo los
aminoácidos antigénicos de la proteína del ratón por secuencias de
proteínas humanas, que se suponen que son menos antigénicas. Otros
procedimientos implican el injerto de la especificidad de unión que
determina restos de aminoácidos o zonas en los marcos de proteínas
humanas.
La capacidad para expresar la proteína del
anticuerpo en sistemas de presentación del fago permite la selección
de anticuerpos que han sido sometidos a mutagénesis para mejorar la
unión o para reducir la inmunogenicidad (véase por ejemplo Antibody
Engineering (McCafferty, J. et al. editores, Oxford
University Press, 1996). Recientemente, la sustitución de genes de
inmunoglobulina humana en ratones transgénicos ha permitido la
utilización de hospedadores murinos para generar anticuerpos y por
lo tanto anticuerpos monoclonales, que son de origen de la
secuencia del ácido nucleico humano.
Los anticuerpos pueden también reducirse de
tamaño por fragmentación para permitir la antigenicidad reducida o
para crear moléculas terapéuticas más pequeñas. Por ejemplo, una
proteína de anticuerpo completa puede reducirse, ya sea por
digestión con los enzimas apropiados o produciendo la proteína más
pequeña mediante procedimientos de ADN recombinante. Los fragmentos
adecuados incluirán por lo menos una parte que se une al antígeno de
la molécula completa y pueden comprender montajes con Fab,
F(ab)_{2}, F(ab)_{3}, Fv o Fv
monocatenario (anticuerpo monocatenario; SCA).
Está previsto que todos los componentes a base
de anticuerpo monoclonal de los agentes terapéuticos para su
utilización según la invención para tratar seres humanos, puedan
beneficiarse de la modificación para reducir la inmunogenicidad y
el HAMA potencial, como se describió anteriormente.
Los montajes inmunoterapéuticos antitumorales
utilizados según la invención incorporan una parte del efector
celular que es una citocina.
El componente efector de los agentes
terapéuticos antitumorales utilizados según la invención puede
comprender cualquiera de varias citocinas para provocar una
respuesta biológica específica para la citocina mediante una célula
que lleva un receptor para la citocina. Las citocinas están bien
caracterizadas, y por consiguiente, la invención no debe
considerarse por lo tanto limitada. Las citocinas incluyen como una
subclase las moléculas denominadas quimiocinas. En el contexto de
la presente invención, una quimiocina se considera un miembro de la
superfamilia de las citocinas. Por consiguiente el término citocina
tal como se utiliza en la presente memoria se refiere genéricamente
tanto a las citocinas como a las quimiocinas. Para una descripción
de las técnicas de citocina, véase Callard y Gearing, The Cytokine
Facts Book, Academic Press, Inc., 1994. Para una descripción de las
técnicas de quimiocina, véase Vaddi et al., The Chemokine
Facts Book, Academic Press, Inc., 1997. Muchas de las secuencias de
ácido nucleico y de aminoácidos relacionadas con las citocinas están
disponibles en las bases de datos públicas a las que puede
accederse por internet mediante varios servicios, es decir, la NCBI
(National Center for Biotechnology Information;
www3.ncbi.nlm.nih.gov) e identificados generalmente por la
denominación y el número de registro (unos pocos, ejemplos no
limitativos de acceso a la información de la secuencia citados en
la presente memoria se refieren a ésta mediante el comentario "see
Accession" con relación al número de identificación).
Las citocinas de mamíferos pueden ser
específicas para la especie, y pueden variar también dentro de una
especie debido a una mutación y/o variación alélica. La citocina
adecuada puede seleccionarse para su utilización según las especies
de mamífero que han de tratarse. Cuando existen múltiples alelos, la
selección puede realizarse según la actividad de la citocina, o una
mezcla de variantes alélicas puede emplearse como citocina de
elección. Por lo tanto la utilización veterinaria de la invención
puede ajustarse a las especies del animal que ha de tratarse, o una
selección de una citocina procedente de una especie más íntimamente
relacionada seleccionada si una de las especies diana no está
disponible. Para el tratamiento humano, resulta preferido utilizar
el homólogo humano cuando se conozca.
Las citocinas adecuadas para su utilización en
la presente invención incluyen, y no se limitan a,
IL-2, IL-12 e IL-15
(véanse los registros P01585, P29459, P46658 y P40933).
Las citocinas preferidas para su utilización en
la presente invención incluyen IL-2 e
IL-12, o fragmentos biológicamente activos de las
mismas, que conservan por lo menos una parte de la actividad del
efector de la molécula intacta completa.
Una citocina preferida para su utilización en la
invención es IL-2.
Las citocinas adecuadas, para su utilización
según la invención pueden prepararse a partir de la secuencia de
ácido nucleico apropiada utilizando técnicas de biología molecular
habituales. Los procedimientos para la expresión génica son
conocidos en la materia (por ejemplo véase Goeddel, D.V. editor,
Methods in Enzymology vol. 185: Gene Expression Technology
(Academic Press, Inc., NY, 1991). Las citocinas resultan también
disponibles en proveedores comerciales (es decir, Sigma, St. Louis
MO).
Estos agentes inmunoterapéuticos antitumorales
adecuados para poner en práctica la invención incorporan un
componente de la célula efectora que es una citocina, unido a un
componente que se dirige al tumor. La unión de un componente que se
dirige al tumor con el componente efector puede realizarse por
varios procedimientos.
Se han descrito reactivos inmunoterapéuticos
anticancerosos que dirigen la función de la citocina a una célula o
a tejidos que llevan antígenos tumorales y mediante la utilización
de citocina para seleccionar de este modo una respuesta inmunitaria
contra las células que llevan, o están asociadas al antígeno
tumoral. Estos agentes inmunoterapéuticos se denominan proteínas de
fusión antígeno antitumoral/citocina porque la proteína de fusión
comprende una fusión de una citocina con una cadena polipeptídica de
inmunoglobulina (Ig) recombinante que inmunorreacciona con un
antígeno asociado al tumor preseleccionado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
agente de la proteína de fusión antígeno/citocina antitumoral
inmunoterapéutico comprende los montajes de fusión entre los
fragmentos de la proteína del anticuerpo que comprenden por lo
menos una parte de la unión del antígeno, y las citocinas que
comprenden por lo menos una parte del efector de la citocina
suficiente para conservar la función de señalización biológica de la
citocina. Las proteínas de fusión utilizadas según la invención
pueden ser directas o pueden estar formando un puente mediante un
péptido o péptidos enlazadores.
Las proteínas de fusión antígeno/citocina
antitumorales son conocidas en la técnica, y en particular están
descritas, por ejemplo, en la patente US nº 5.650.150 (Gillies),
cuyas descripciones que se refieren a la preparación y utilización
de las proteínas de fusión están incorporadas expresamente en la
presente memoria como referencia.
La proteína de fusión puede dirigirse a
cualquiera de una variedad de antígenos tumorales que son antígenos
de la superficie celular, y por eso la invención no debe
considerarse que está limitada. Por ejemplo la preparación de una
proteína de fusión utilizando una citocina y una cadena pesada de Ig
es conocida, ya que es la preparación de una cadena pesada de Ig
recombinante procedente de un anticuerpo monoclonal. Además, la
preparación de anticuerpos monoclonales es una técnica probada, y
se sabe cómo preparar dichos anticuerpos contra antígenos
tumorales. Las enseñanzas con respecto a la preparación de
anticuerpos monoclonales incluyen "Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., eds, Reisfeld and Sell,
1985.
Por lo general, la cadena polipeptídica de Ig es
un polipéptido con cadena pesada o ligera de Ig que comprende una
zona variable N-terminal específica para una célula
que lleva un antígeno tumoral de la superficie de la célula. La
proteína de fusión presenta generalmente el polipéptido Ig unido a
su terminal carboxi mediante un enlace peptídico al aminoácido del
terminal amino de la citocina. Cuando el polipéptido Ig es una
cadena pesada, la cadena pesada de Ig comprende por lo general los
dominios CH1 y CH2, y puede contener además opcionalmente un
dominio CH3. Sin embargo, si se desea, dichos dominios de la zona
constante pueden eliminarse para reducir inmunogenicidad, tamaño o
unión no específica del montaje de la proteína de fusión resultante.
Con el fin de facilitar la asociación del dominio de la cadena
pesada y ligera, puede ser deseable construir una molécula Fv
unida, en la que un Fv con cadena pesada está ligado a un Fv con
cadena ligera. La ligadura es entre el extremo carboxi de una
cadena con el terminal amino de la otra, y es lo suficientemente
larga a fin de no alterar de manera drástica estéricamente la bolsa
de unión al antígeno después de la asociación
replegamiento/dominio.
Una proteína de fusión preferida comprende la
citocina IL-2 y una cadena pesada de Ingrediente que
inmunorreacciona con el antígeno GD_{2} asociado al tumor. En
otra forma de realización, una proteína de fusión preferida
comprende la citocina IL-2 y una cadena pesada de
Ig2 que inmunorreacciona con el antígeno Ep-CAM
asociado al tumor (conocido también como KSA, antígeno KS1/4).
Ejemplos de proteínas de fusión de estos anticuerpos se describen a
continuación como ch14.18-IL-2 y
KS1/4-IL-2, respectivamente.
Según la presente invención una terapia para
tratar células tumorales en tumores y metástasis tumorales se basa
en la utilización combinada de la terapia de inhibición de la
angiogénesis (antiangiogénesis) y en la inmunoterapia tumoral. Más
de un tipo de agente inhibidor de angiogénesis puede utilizarse en
combinación con más de un tipo de agente de inmunoterapia
antitumoral. La utilización combinada puede tener lugar simultánea,
sucesivamente o con la intervención de un periodo de tiempo entre
los tratamientos. Cualquiera de los agentes terapéuticos
específicos puede administrarse más de una vez durante el transcurso
del tratamiento. La invención proporciona la utilización combinada
de agentes terapéuticos que inhiben la angiogénesis y agentes
inmunoterapéuticos antitumorales que pueden producir una
potenciación sinérgica del efecto de inhibición de la proliferación
de células tumorales de cada agente terapéutico individual,
proporcionando un tratamiento más eficaz que el encontrado
administrando un componente individual solo. Por lo tanto, en un
aspecto, la invención comprende la administración a un paciente, en
combinación, una cantidad de agente inhibidor de la angiogénesis y
un agente inmunoterapéutico antitumoral que puede no producir la
inhibición eficaz de la angiogénesis o actividad de la célula
antitumoral si se proporciona en esta cantidad solo.
La invención comprende varias modalidades para
la puesta en práctica de la invención desde el punto de vista de
las etapas. Por ejemplo, puede administrar el antagonista de un
agente inmunoterapéutico antitumoral después de la administración,
es decir, simultáneamente, o puede administrar sucesivamente, es
decir, por separado. Además, el antagonista y la proteína de fusión
pueden administrarse por separado dentro de un intervalo de tiempo
de aproximadamente 3 semanas entre las administraciones, es decir,
desde sustancialmente inmediatamente después de que se administra
el primer agente activo hasta aproximadamente 3 semanas después que
se administra el primer agente. Además, se contempla que puede
variarse el orden, es decir, que el antagonista
\alpha_{v}\beta_{3} puede administrarse antes de la
administración de la proteína de fusión o que la administración
puede realizarse en orden inverso.
En una forma de realización, la invención
también comprende administrar a un paciente necesitado del
tratamiento de tumores o de metástasis una cantidad inhibidora de
angiogénesis del agente inhibidor de la angiogénesis y una cantidad
de agente inmunoterapéutico antitumoral suficiente para provocar una
respuesta biológica. Por ejemplo, suficiente para provocar una
respuesta biológica específica para la citocina en la que dicha
proteína de fusión bifuncional que tiene una cadena polipeptídica
de inmunoglobulina (Ig) recombinante, en la que la cadena Ig
comprende una zona variable específica para una célula tumoral que
lleva un antígeno de la superficie celular asociado al tumor y en
el que la cadena de Ig está unida mediante un enlace peptídico a la
citocina.
En otra forma de realización, la invención puede
ponerse en práctica junto con procedimientos quirúrgicos en los que
se ha eliminado parte o toda la masa tumoral. A este respecto, la
invención puede ponerse en práctica después de un procedimiento
quirúrgico. Alternativamente, el procedimiento quirúrgico puede
ponerse en práctica durante el intervalo entre la administración
del primer agente activo y del segundo agente activo. A título de
ejemplo de esto es la combinación de la presente invención con la
eliminación quirúrgica del tumor descrita anteriormente.
El tratamiento según la invención comprenderá
por lo general la administración de las composiciones terapéuticas
en uno o más ciclos de administración. Por ejemplo, cuando se
practica una administración simultánea, una composición terapéutica
que comprende tanto un antagonista \alpha_{v}\beta_{3} y un
inmunoterapéutico antitumoral se administra durante un periodo de
aproximadamente 2 días a aproximadamente 3 semanas en un ciclo
único. Después, el ciclo de tratamiento puede repetirse según se
necesite según el criterio del médico en ejercicio. Asimismo,
cuando se contempla una aplicación sucesiva, el tiempo de
administración para cada agente terapéutico individual se ajustará
para cubrir por lo general el mismo periodo. El intervalo entre los
ciclos puede estar comprendido entre aproximadamente cero y 2
meses.
La administración puede realizarse mediante
dosis unitarias periódicas, por infusión continua, administración
peristáltica, por inyección intravenosa rápida y similares. Las vías
pueden incluir la aplicación intravenosa, subcutánea,
intramuscular, inyección ortotópica, infusión ortotópica, aplicación
oral y similares.
Una composición terapéutica utilizada según la
presente invención comprende el agente activo en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, como es bien conocido, y por
consiguiente la invención no se considera limitada con respecto a
la composición siempre que la concentración del o de los agentes
activos en la composición sea suficiente para suministro
(administración) del agente activo mencionado en las cantidades
descritas en la presente memoria.
Por lo general, la dosis de agente
inmunoterapéutico antitumoral es de 0,01 mg a 10 mg,
preferentemente de aproximadamente 0,1 a 1 mg y más preferentemente
de aproximadamente 0,6 mg por kilogramo de peso corporal al
día.
La dosis típica de un antagonista
\alpha_{v}\beta_{3} es de 10 mg a 1.000 mg, preferentemente
de aproximadamente 20 a 100 mg y más preferentemente de
aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal al día.
Se entiende que el cáncer se encuentra en todo
el reino animal y que los principios descritos en la presente
memoria se aplican a todos los animales en los que la angiogénesis
puede estar inhibida por un antagonista \alpha_{v}\beta_{3}
y las citocinas están presentes en el sistema inmunitario. De este
modo se considera que la invención puede ponerse en práctica en
todos los mamíferos y particularmente en los humanos.
Además, es sabido que existe una extensa
variedad de tumores que requieren vascularización para desarrollarse
y por consiguiente son candidatos para la modalidad de terapia
combinada de los presentes procedimientos. Los tumores que pueden
producir desarrollos que producen angiogénesis incluyen los tumores
que surgen de tejidos neuroectodérmicos, epiteliales y similares. A
título de ejemplo de tumores y metástasis tumorales se incluyen el
adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma,
glioblastoma, glioma, hamartoblastoma, hemangioendotelioma,
hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma,
meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma,
retinoblastoma, rhabdomiosarcoma, sarcoma, teratoma y tumores
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, la invención
contempla sistemas que comprenden el envase y/o kit que proporciona
los reactivos necesarios para poner en práctica la presente
invención. Un kit para tratar células tumorales en tumor o
metástasis tumoral comprende un paquete de:
- a)
- un agente inhibidor de angiogénesis como se describe en la presente memoria capaz de inhibir la angiogénesis en el tumor o en la metástasis tumoral;
- b)
- un agente inmunoterapéutico antitumoral como se describe en la presente memoria, tal como un reactivo de la proteína de fusión bifuncional que tiene una citocina y una cadena polipeptídica de inmunoglobulina (Ig) recombinante, en la que la cadena de Ig comprende una zona variable específica para una célula tumoral que lleva un antígeno de la superficie celular asociado al tumor, en el que la cadena de Ig está unida por un enlace peptídico a la citocina; y
- c)
- instrucciones para utilizar los reactivos destinados a tratar tumores y metástasis tumorales.
Un reactivo en un kit de la presente invención
se formula por lo general como composición terapéutica descrita en
la presente memoria, y por consiguiente puede estar en cualquiera de
una variedad de formas adecuadas para su distribución en un kit.
Dichas formas pueden incluir una formulación líquida, en polvo,
comprimido, suspensión y similares para proporcionar el antagonista
y/o la proteína de fusión utilizados según la presente invención.
Los reactivos pueden proporcionarse en recipientes independientes
adecuados para la administración por separado o alternativamente
pueden proporcionarse combinados en una composición en un solo
recipiente en el envase.
Asimismo, dicho envase puede contener además de
los componentes descritos anteriormente, cualquier otro agente
inmunoterapéutico antitumoral.
El envase puede contener una cantidad suficiente
para una o más dosis de reactivos según los tratamientos descritos
en la presente memoria. Por lo general, un envase contendrá una
cantidad suficiente para un ciclo de tratamiento descrito en la
presente memoria. El etiquetado del envase puede indicar la
utilización combinada o sucesiva de los reactivos contenidos para
el tratamiento terapéutico del tumor y/o las metástasis, según la
invención. Dicho etiquetado del envase puede fijarse a cada vial de
reactivo y/o al envase completo de los materiales.
Un kit de la presente invención contiene también
"instrucciones para la utilización" de los materiales
contenidos en el envase. Las instrucciones se refieren a la
utilización combinada del antagonista y de la proteína de fusión
para tratar un tumor o las metástasis tumorales según la invención.
Siempre que el tratamiento pueda variar ampliamente dependiendo del
tumor, el paciente y el estado de la enfermedad, las instrucciones
pueden variar para los procedimientos específicos destinados a la
administración de acuerdo con esto. La invención no debe
considerarse tan limitativa en cuanto a la naturaleza de las
instrucciones distintas de la particularidad con respecto a la
utilización combinada del antagonista y de la proteína de fusión
según la invención.
Asimismo, los reactivos pueden incluir agentes
citotóxicos inmunoterapéuticos antitumorales, tal como el anticuerpo
que se une al antígeno tumoral unido al isótopo radiomarcado, o un
agente citotóxico tal como un péptido citotóxico o fármacos
citotóxicos y similares.
Los polipéptidos lineales y cíclicos presentados
en la Tabla 1 a continuación, se sintetizaron utilizando técnicas
de síntesis en fase sólida normalizadas como, por ejemplo, las
descritas por Merrifield, RB, (1969) "Solid-Phase
Peptide Synthesis", Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.,
32: 221-96; Merrifield, RB, (1969) "The synthesis
of biologycally active peptides and proteins", JAMA
210(7): 1247-54; y Fields, G.B. y Noble,
R.L., (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing
9-fluorenyl-methoxycarbonyl amino
acids", Int. J. Peptide Protein Res.,
35(3):161-214.
Dos gramos (g) de
BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe
(SEC. ID. nº: 1) se disolvieron en primer lugar en 60 mililitros
(ml) de metanol a lo que se añadieron 1,5 ml de solución 2 N de
hidróxido sódico para formar una mezcla. La mezcla se agitó a
continuación durante 3 horas a 20 grados C (20ºC). Después de la
evaporación, el residuo se absorbió en agua, se acidificó a pH 3
con HCl diluido y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se
secó sobre Na_{2}SO_{4}, se evaporó de nuevo y el
BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH
(SEC. ID. nº: 2) resultante se agitó a 20ºC durante 2 horas con 20
ml de HCl 2 N en dioxanos. La mezcla resultante se evaporó para
obtener
H-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH
(SEC. ID. nº: 3) que se disolvió posteriormente en una mezcla de
1.800 ml de diclorometano y 200 ml de dimetilformamida (DMF)
seguido de enfriamiento a 0ºC. A continuación, se añadieron
sucesivamente con agitación 0,5 g de diciclohexilcarbodiimida
(DCCI), 0,3 g de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y
0,23 ml de N-metilmorfolina.
La mezcla resultante se agitó durante 24 horas
más a 0ºC y a continuación a 20ºC durante otras 48 horas. Se
concentró la solución y se trató con un intercambiador iónico en
lecho mixto para liberarla de las sales. Una vez que retirada la
resina resultante por filtración, se evaporó la solución clarificada
y se purificó el residuo por cromatografía dando como resultado la
recuperación de
ciclo(Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val)
(SEC. ID. nº: 4).
Se obtuvieron de manera análoga los péptidos
siguientes, presentados en la Tabla 1 que utilizan las abreviaturas
de residuos de aminoácidos del código de una sola letra y se
identifican mediante una designación del número de péptido:
ciclo(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val)
(SEC. ID. nº: 5);
ciclo(Arg-Ala-Asp-DPhe-Val)
(SEC. ID. nº: 6);
ciclo(Arg-DAla-Asp-Phe-Val)
(SEC. ID. nº: 8);
ciclo(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal)
(SEC. ID. nº: 7); y
ciclo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)
(donde la metilación es en el nitrógeno alfa-amino
del enlace amida del resto de valina) (SEC. ID. nº: 11).
Un péptido denominado 66203, con una secuencia
idéntica a la del péptido 62184, solamente se diferenció de este
último porque contiene la sal de HCl en lugar de la sal de TFA
presente en 62184 (SEC. ID. nº: 5). Lo mismo es válido para los
péptidos 69601 y 62185 (SEC. ID. nº: 6) y para 85189 y 121974 (SEC.
ID. nº: 11).
Se sintetiza
Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa
(SEC. ID. nº: 14) utilizando los procedimientos de tipo Merrifield
en fase sólida añadiendo sucesivamente NMeVal, DPhe,
Asp(OBut), Gly y Fmoc-Arg (Mtr) en una etapa
a una resina de
4-hidroximetil-fenoximetil-poliestireno
(resina tipo Wang) (se aplican los procedimientos habituales de
tipo Merrifield de síntesis de péptidos). La resina de poliestireno
y los precursores de los residuos de aminoácidos están disponibles
en el mercado en las compañías químicas Aldrich, Sigma o Fluka.
Tras la terminación de la adición sucesiva de los restos de
aminoácidos, la resina se elimina a continuación de la cadena
peptídica utilizando una mezcla 1:1 de TFA/diclorometano que
proporciona el producto
Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH
(SEC. ID. nº: 15). El grupo Fmoc se elimina a continuación con una
mezcla 1:1 de piperidina/DMF que proporciona el precursor
Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH
en bruto (SEC. ID. nº: 16) que se purifica a continuación por HPLC
de la manera habitual.
Para la ciclación, una solución de 0,6 g de
Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH
(sintetizada anteriormente) (SEC. ID. nº: 16) en 15 ml de DMF
(dimetilformamida; Aldrich) se diluye con 85 ml de diclorometano
(Aldrich) y se añaden 50 mg de NaHCO_{3}. Después de enfriamiento
en una mezcla de nieve carbónica/acetona, se añaden 40 \mul de
difenilfosforil azida (Aldrich). Después de dejar reposar a
temperatura ambiente durante 16 horas, se concentra la
solución. El concentrado se filtra en gel (columna Sephadex G10 en
isopropanol/agua 8:2) y a continuación se purifica por HPLC de la
manera habitual. El tratamiento con TFA (ácido
trifluoroacético)/H_{2}O (98:2) proporciona
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)
(denominada también "ciclo (RGDfN-MeV)" en la
presente memoria; SEC. ID. nº: 11) \times TFA que se purifica a
continuación por HPLC de la manera habitual; T.A. = 19,5ºC;
FAB-MS (M+H): 589.
Se elimina la sal del TFA procedente del péptido
cíclico producido anteriormente poniendo en suspensión el
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)
(SEC. ID. nº: 11) \times TFA en agua, seguido de evaporación al
vacío para eliminar el TFA. El péptido cíclico formado se denomina
"sal interna" y se le da el nombre de
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)
(SEC. ID. nº: 11). La expresión "sal interna" se utiliza
debido a que el péptido cíclico contiene dos restos con cargas
opuestas que se contrarrestan intraelectrónicamente entre sí para
formar una molécula sin carga global. Uno de los restos cargados
contiene un resto ácido y el otro resto cargado contiene un resto
amino. Cuando el resto ácido y el resto amino están en íntima
proximidad uno a otro, el resto ácido puede ser desprotonado por el
resto amino que forma una especie salina de carboxilato/amonio con
una carga neutra global.
Se disuelven 80 mg de
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal
(SEC. ID. nº: 11) en HCl 0,01 M cinco a seis veces y se liofilizan
después de cada operación de disolución. La purificación posterior
por HPLC proporciona el
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal
(SEC. ID. nº: 11) \times HCl; FAB-MS (M+H):
589.
Se disuelven 80 mg de
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal
(SEC. ID. nº: 11) en MeSO_{3}H 0,01 M (ácido metansulfónico)
cinco a seis veces y se liofiliza después de cada operación de
disolución. La purificación posterior por HPLC proporciona
ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal
(SEC. ID. nº: 11) \times MeSO_{3}H; T.A. = 17,8;
FAB-MS (M+H): 589.
Los procedimientos de ciclación alternativos
incluyen la modificación de las cadenas laterales de entre el grupo
de un precursor peptídico acrílico con restos sulfhidrilo, y cuando
se exponen a condiciones ligeramente superiores al pH fisiológico
normal (pH 7,5), las formas intramoleculares de los enlaces
disulfuro con otros grupos sulfhidrilo presente en la molécula para
formar un péptido cíclico. Además, el resto carboxilato del
terminal C de un precursor peptídico acrílico pueden hacerse
reaccionar con un resto sulhidrilo libre presente dentro de la
molécula para producir péptidos ciclados de tioéster.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción y caracterización de las
proteínas de fusión ch14.18-IL-2 y
anticuerpo
huKS1/4-IL-2-citocina
se describieron anteriormente (Xiang, R., et al., (1997);
Gillies, S., et al., (1992) supra). Las
características de la unión al antígeno de ambos montajes eran
idénticas a las de sus respectivos anticuerpos y la actividad
específica para EL-2 era equivalente al
rhIL-2 disponible en el mercado. El péptido cíclico
121974 antagonístico de \alpha_{v}\beta_{3} de integrina
(ciclo (RGDfN-MeV)) (SEC. ID. nº: 11) y el péptido
de referencia 135981 (ciclo (RADfN-MeV) (SEC. ID.
nº: 13) se sintetizaron y caracterizaron.
Todas las estirpes celulares y los modelos
animales respectivos se crearon sustancialmente como se describió
anteriormente (Becker, J.C., et al., (1996); Xiang, R., et
al., (1996); Lode, H.N., et al., (1998) supra).
Se demostró la ausencia de \alpha_{v}\beta_{3} de integrina
en las células NXS2 y CT26-KSA utilizando
anticuerpo CD61 antirratón (cadena \beta_{3} de integrina)
(Pharmingen, La Jolla, CA). Ambas estirpes celulares pusieron de
manifiesto ausencia de señal (1 \mug de mAb de CD61
antirratón/10^{6} células) en el análisis por FACS en contraste
con B16FG3 positiva a \alpha_{v}\beta_{3} de integrina y las
células de melanoma murino B78-D14 utilizadas como
referencias positivas. Además, las células NXS2 fueron incapaces de
adherirse al plástico recubierto con mAb de CD61 antirratón (10
\mug/ml 4ºC, 24 h) en contraste con el anticuerpo
anti-GD_{2} ch14.18 (10 \mug/ml, 4ºC, 24 h)
utilizado como referencia positiva. Sin embargo, todas las células
tumorales expresan la integrina \alpha_{v} por FACS y se
adhieren sobre vitronectina, lo que indica la presencia de
\alpha_{v}\beta_{5} de integrina.
Para todos los procedimientos quirúrgicos, se
anestesiaron los ratones mediante inyección de ketamina (100 mg/kg
i.p.) e inhalación simultánea de Metofano
(Pitman-Moore, Mundelein, IL). Se utilizaron bombas
osmóticas (Alzet®, modelo 2001, Palo Alto, CA). Para la
administración del antagonista \alpha_{v} de integrina y se
utilizó el péptido de referencia a un ritmo de administración de
17,5 \mug/h. Estas bombas se manejaron según las directrices del
fabricante y se implantaron en el tejido subcutáneo dorsal en
condiciones estériles. Todas las bombas se sustituyeron el día 7
tras la implantación y se retiraron el día 10 del tratamiento
antivascular. Todos los experimentos animales se realizaron según
la NIH Guide para la Care and Use of Laboratory
Animals.
Se incubaron secciones congeladas de tumores
primarios, fijadas en acetona, con suero de cabra al 4% para
bloquear el enlace no específico. Las incubaciones con los mAb de
CD31 y de CD45 antirratón (Pharmingen, La Jolla, CA) (1:100) y la
tinción ulterior con anticuerpo-antirrata de cabra
marcado con rodamina se llevaron a cabo en una cámara humidificada
a temperatura ambiente. Cada incubación fue seguida de lavados con
PBS (\times3). Los recuentos de vasos y glóbulos blancos por el
campo de alta potencia (HPF) se determinaron al microscopio con una
ampliación de 200\times (Brooks, P.C., et al., (1995)
"Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast
cancer growth and angiogenesis in human skin", J. Clin.
Invest. 96, 1815-1822). Se fotografiaron las
áreas representativas a 200\times (vasos) y 800\times (glóbulos
blancos), respectivamente.
Se determinó el efecto sinérgico de la terapia
de inhibición de la angiogénesis (antagonista \alpha_{v} de
integrina) y la inmunoterapia (proteínas de fusión anticuerpo
IL-2) en ratones con tumores subcutáneos probados
(110-130 \mul) en los tres modelos isogénicos,
respectivamente.
La Figura 1, representa gráficamente el efecto
de una terapia combinada con el antagonista de integrina
\alpha_{v} antiangiogénico y la inmunoterapia antitumoral
específica para el compartimento inmunoterapéutico con las
proteínas de fusión anticuerpo-IL-2
en tumores primarios. La Figura 1A representa los resultados de los
tumores primarios provocados por la inyección subcutánea
(2\times10^{6}) de neuroblastoma NXS2. La Figura 1B representa
los resultados de tumores primarios provocados por inyección
subcutánea (2\times10^{6}) de carcinoma de colon
CT26-KSA. La Figura 1C representa los resultados de
los tumores primarios provocados por inyección subcutánea
(2\times10^{6}) de células de melanoma B78-D 14.
Se inició el tratamiento de los tumores probados (110 - 130
mm^{3}) mediante inyecciones intravenosas diarias de las proteínas
de fusión de anticuerpo-IL-2
específicas para el tumor
huKS1/4-IL-2 (carcinoma de colon, 10
\mug) y chl4.18-IL-2 (5 \mug,
neuroblastoma, 10 \mug, melanoma) (\times5) y la infusión
subcutánea continua del antagonista \alpha_{v} de la integrina
específico para el sistema vascular o el péptido de referencia con
una bomba osmótica durante 7 días a 17,5 \mug/h (arriba). El
tiempo de inicio del tratamiento está indicado por una flecha negra.
El tamaño de los tumores primarios de los ratones en cada grupo
experimental (n=6) se determinó por mediciones con microcalibre
(ancho \times longitud \times ancho/2) (media \pm desviación
estándar). La regresión en el tamaño del tumor primario de los
ratones que reciben el tratamiento de combinación en comparación con
el tamaño de los tumores demostrados en el momento de la iniciación
del tratamiento fue estadísticamente significativa en los tres
modelos diferentes de tumor isogénico (P<0,001, prueba de la suma
en orden de Wilcoxon) en contraste con todas las referencias
(P>0,05).
En primer lugar, se establecieron las cantidades
subóptimas para cada modalidad terapéutica y su utilización
posterior en la combinación iniciada. Únicamente se trataron ratones
con el antagonista \alpha_{v} de integrina y las proteínas de
fusión IL-2 presentadas con una regresión del tumor
en los tres modelos que oscilan entre 50 y 90% (P<0,001). De
hecho, la mitad de los animales inoculados con células de
neuroblastoma y de carcinoma de colon rechazaron completamente sus
tumores primarios (datos no representados). Esto estaba en
contraste con cada estrategia que está siendo utilizada como
monoterapia que, en el mejor de los casos, retrasó el crecimiento
en comparación con el grupo de referencia, respectivamente. El
efecto de cada modalidad de tratamiento y su combinación en los
compartimentos vascular y tumoral se analizó posteriormente.
Se realizó la histología después de la
inmunoterapia antiangiogénica y específica para el tumor combinada
de tumores primarios de neuroblastoma demostrados, eliminada
quirúrgicamente 20 días después de la inoculación de la célula
tumoral. En resumen, los tumores primarios fijados con formalina se
sometieron a impregnación en parafina y posterior tinción con
hematoxilina/eosina. Se identificaron las áreas necróticas y los
infiltrados de leucocitos.
La Figura 2 representa gráficamente el efecto de
las terapias inmunoterapéuticas antivascular y antitumoral
combinadas sobre la vascularización y la respuesta inmunitaria
antitumoral. Ratones (n=6) con tumores primarios de neuroblastoma
creados recibieron el tratamiento combinado con el antagonista de
integrina cc específico para el sistema vascular, un péptido de
referencia no específico y la proteína de fusión
chl4.18-IL-2 específica para el
tumor, tal como se describe en la Figura 1, incluyendo referencias
que recibieron cada una la terapia sola. Al final del tratamiento,
se eliminaron quirúrgicamente los tumores s.c.. Las secciones
congeladas de cada tumor se analizaron por inmunohistoquímica
utilizando anticuerpos específicos para las células endoteliales de
los vasos sanguíneos (CD-31) y para la infiltración
de leucocitos (CD45), respectivamente. Este último es un marcador
bien probado para la respuesta inmunitaria específica para el
compartimento tumoral provocada por la proteína de fusión
chl4.18-IL-2 (Becker, J.C., et
al., (1996) supra; Xiang, R., et al., (1996)
supra; Lode, H.N., et al., (1998) supra).
La Figura 2A representa los resultados para la
densidad del vaso sanguíneo de tumores primarios después del
tratamiento del compartimento vascular y tumoral con la integrina a,
el antagonista, la proteína de fusión
chl4.18-IL-2 y una combinación de
los mismos (*P<0,001, prueba de la T de Student). La Figura 2B
representa los resultados de la infiltración de leucocitos de
tumores primarios después de los tratamientos en el compartimento
vascular y tumoral, respectivamente (*P<0,001, prueba de la T de
Student).
Los ratones que recibieron el antagonista de la
integrina \alpha_{v}, presentaban una disminución del 50% en la
vascularización (Figura 2) coincidente con un retardo en el
crecimiento de los tumores primarios, lo que demuestra la dirección
eficaz del compartimento vascular. En este caso, el compartimento
tumoral no fue afectado directamente (Figura 1). En cambio, los
ratones tratados solamente con la proteína
anti-GD2-IL-2,
pusieron de manifiesto un infiltrado de leucocitos distinto, una
característica bien demostrada de esta terapia dirigida al
compartimento antitumoral (Becker, J.C., et al., (1996)
supra; Xiang, R., et al., (1996) supra; Lode,
H.N., et al., (1998) supra), que conduce a una
reducción sustancial en el crecimiento del tumor s.c. (Figura
1).
Sin embargo, solamente los ratones tratados con
la combinación del antagonista de integrina \alpha_{v} y la
proteína de fusión
anti-GD2-IL-2
pusieron de manifiesto un aumento de cinco veces en la infiltración
de leucocitos en el tumor en comparación con los ratones tratados
con la proteína de fusión
anti-GD2-IL-2 sola
y presentaron una disminución similar en la vascularización. El
aumento en las células inflamatorias fue demostrado por histología
e inmunohistoquímica y se atribuyó a una entrada de macrófagos, un
modelo frecuentemente observado en los tejidos necróticos durante
la eliminación de desecho celular. De hecho, dichas áreas necróticas
estaban solamente presentes en los tumores después del tratamiento
de combinación en contraste con las referencias tratadas con cada
componente por separado.
Además de un tratamiento con éxito de los
tumores primarios, la cuestión más relevante es si las metástasis
distantes son afectadas por dicha estrategia combinada del
tratamiento antivascular y antitumoral específico. Esto se estudió
en el modelo de neuroblastoma, caracterizado por metástasis
hepáticas espontáneas. Con este objeto, el tratamiento del tumor
primario con el antagonista antiangiogénico de integrina
\alpha_{v} se combinó sucesivamente con una inmunoterapia
antitumoral mediante la proteína de fusión anticuerpo
IL-2.
La Figura 3 representa gráficamente el efecto de
una combinación sucesiva de antagonista de integrina \alpha_{v}
antiangiogénico y la inmunoterapia específica para el compartimento
antitumoral con la proteína de fusión
anticuerpo-IL-2 en metástasis
espontánea de neuroblastoma hepático. El tratamiento antivascular se
inició en los ratones con tumores primarios probados, tal como se
describe en la Figura 1 durante un total de 10 días. Tras la
eliminación quirúrgica de los tumores primarios, los ratones
recibieron inmunoterapia específica en el compartimento tumoral
mediante inyecciones i.v. diarias de 5 \mug de proteína de fusión
chl4.18-IL-2 (\times5). Se
determinó el número de metástasis hepáticas espontáneas mediante
recuentos macroscópicos de focos en el hígado (n=8) (**P<0,01,
prueba de la suma en orden de Wilcoxon).
Solamente los ratones tratados sucesivamente con
ambos agentes presentaban una disminución de 1,5-2
log en las metástasis hepáticas en contraste con todas las
referencias, donde el tratamiento con cada agente utilizado como
monoterapia fue ineficaz (P<0,01) (Figura 3). De hecho, 4/8
ratones sometidos a la terapia combinada pusieron de manifiesto una
ausencia completa de metástasis hepática, mientras que los restantes
animales presentaban solamente 1 a 5 pequeñas lesiones
metastásicas. En esencia, se obtuvieron resultados similares por
combinaciones simultáneas del antagonista de integrina
\alpha_{v} con la proteína de fusión
chl4.18-IL-2 (parte superior de la
Figura 4).
La Figura 4 representa gráficamente el efecto de
la combinación simultánea del antagonista antiangiogénico de
integrina \alpha_{v} y de la inmunoterapia específica para el
compartimento antitumoral con la proteína de fusión
anticuerpo-IL-2 en metástasis de
neuroblastoma hepática espontánea. Se provocaron metástasis
espontáneas tras la inducción de tumores primarios con
2\times10^{6} células NXS2 de neuroblastoma s.c. El tratamiento
con integrina o antagonista (17,5 \mug/h) y la proteína de fusión
chl4.18-IL-2 específica para el
tumor (5 \mug\times5) iniciado antes (Figura 4A) o después
(Figura 4B) de la eliminación del tumor primario. Se determinaron
las metástasis hepáticas espontáneas por recuentos macroscópicos de
focos en el hígado (n=8) (*P<0,01, prueba de la suma en orden de
Wilcoxon).
Solamente los ratones tratados con ambos agentes
pusieron de manifiesto una ausencia completa (Figura 4A) o una
disminución >1,5 log (Fig. 5B) en las metástasis hepáticas
(P<0,01), dependiendo de su administración antes o después de la
eliminación del tumor primario. Esto está en contraste con todas las
referencias en las que el tratamiento fue ineficaz cuando se
utilizaba cada agente como monoterapia.
La destrucción de los vasos sanguíneos en el
compartimento vascular de tumores malignos es una estrategia
potente para combatir el cáncer. Dirigiendo las células endoteliales
del sistema vascular del tumor, el tumor puede tratarse con éxito.
Un antagonista peptídico, que se dirige al sistema vascular mediante
interacción con las integrinas \alpha_{v} expresadas en los
vasos sanguíneos angiógenos (Brooks, P.C. et al., (1994)
Science supra; Friedlander, M., et al., (1995)
supra) suprimió la formación de vasos sanguíneos y el
crecimiento del tumor posterior empeoró drásticamente. Esto se
demostró tratando tres tumores primarios que crecen de forma
agresiva y un tumor que se metastasiza espontáneamente. Aunque el
antagonista de integrina \alpha_{v} se dirigió principalmente a
\alpha_{v}\beta_{3}, también se une a la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} íntimamente relacionada. El carcinoma
de colon y los tumores de neuroblastoma examinados están claramente
carentes de \alpha_{v}\beta_{3}, pero del mismo expresan
alguna \alpha_{v}\beta_{5}. El modelo de melanoma expresa
también a \alpha_{v}\beta_{3}. Sin embargo, el efecto de
este antagonista de integrina estaba claramente restringido al
sistema vascular tumoral en los tres modelos animales como se
demostró para el modelo de neuroblastoma (Figura 2). Resulta
importante que el efecto antitumoral de dirigir el conjunto de
vasos tumorales está ampliado por un ataque simultáneo en el
compartimento tumoral, que es eficaz tanto contra los tumores
primarios como las metástasis espontáneas. Esto es particularmente
relevante, ya que la eliminación del tumor primario antes del
tratamiento aumentó el crecimiento y la diseminación de metástasis
de neuroblastoma, un descubrimiento bien documentado en otros
modelos de tumor debido a una disminución en los niveles
circulantes de inhibidores de angiogénesis después de la escisión
del tumor primario (Holmgren, L., et al., (1995)
supra; Folkman, J., (1995) supra). La dirección
simultánea de los compartimentos vascular y tumoral probaron ser
muy eficaces, ya que combina una disminución en el sustento de la
célula tumoral con la destrucción activa de células tumorales, lo
que conduce a una regresión de los tumores primarios y a la
erradicación de metástasis distantes. Esto está en contraste con una
estrategia dirigida al compartimento vascular individual utilizando
dos estrategias diferentes de tratamiento antiangiogénico que
produjeron solamente la supresión del crecimiento del tumor s.c. en
un modelo isogénico (Mauceri, H.J., et al., (1998)
"Combined effects of angiostatin and ionizing radiation in
antitumor therapy", Nature 394,
287-291).
En la presente estrategia, la respuesta
específica para el compartimento tumoral está mediada por células
inflamatorias que son activadas y dirigidas al microentorno del
tumor por las proteínas de fusión
anticuerpo-IL-2 específicas para el
tumor. Es importante, la estrategia antiangiogénica, aunque muy
eficaz en la supresión del crecimiento de los tumores primarios con
un aporte vascular bien demostrado, carece de una eficacia similar
contra las micrometástasis distantes cuando se utiliza como
monoterapia (Figs. 3 y 4). No obstante, en dicho escenario de la
enfermedad mínima residual con pequeñas cargas tumorales
caracterizada por una escasa vascularización, la rama del
tratamiento del compartimento antitumoral utilizada en la terapia de
combinación es muy eficaz cuando se utiliza como monoterapia
(Xiang, R., et al., (1997) anteriormente; Lode, H.N., et
al. (1998) anteriormente). En esta situación, una función del
tratamiento antiangiogénico consiste en suprimir la
neovascularización provocada por micrometástasis y el posterior
ensanchamiento de los focos metastásicos (Volpert, O.V., et
al., (1998) anteriormente). Esto, a su vez, facilita la
erradicación de dichas micrometástasis mediante terapias dirigidas
al compartimento tumoral, que son óptimamente eficaces en la
instalación de la enfermedad mínima residual (Becker, J.C., et
al., (1996) anteriormente).
Los tratamientos eficaces de los tumores
primarios y la metástasis diseminada continúan siendo un desafío
principal en oncología clínica. Los resultados en este informe
demuestran que las combinaciones de antiangiogénicos e
inmunoterapias sinergizan en la regresión de los tumores primarios y
en la erradicación de la micrometástasis. Ya que ambas modalidades
de tratamiento, es decir antagonistas de integrina \alpha_{v} y
proteínas de fusión
anticuerpo-interleucina-2, están
actualmente bajo evaluación clínica como monoterapias, la sinergia
de su combinación proporciona una nueva y eficaz herramienta para la
terapia del cáncer.
Los ejemplos anteriores que describen
determinadas formas de realización de la invención son ilustrativos
y, desde luego, no deberían considerarse como específicamente
limitativos de la invención. Además, dichas variaciones de la
invención, conocidas actualmente o desarrolladas posteriormente, que
resultarían evidentes para el experto en la materia deben
considerarse que están comprendidas dentro del alcance de la
presente invención reivindicada a continuación en la presente
memoria.
<110> Lode, Holger N
\hskip1cmGillies, Stephen D
\hskip1cmCheresh, David A
\hskip1cmReisfeld, Ralph A
\hskip1cmThe Scripps Research Institute
\hskip1cmLexigen Pharmaceuticals Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO
DE TUMORES Y METÁSTASIS UTILIZANDO UNA COMBINACIÓN DE TERAPIAS
ANTIANGIOGÉNICAS E INMUNOTERAPIAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> tsri6811pc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/119,721
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-02-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BLOCKED - BOC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN- OMe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: material de partida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BLOCKED - BOC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: primer producto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: segundo producto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (GrGDFV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo RGDfV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CHAIN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cyclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (RADfV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (RGDFv)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
ciclo (RaDFV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (ARGDfL)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (GRGDfL)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN, NMeVal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (RGDfmV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN, NMeVal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (RGEfmV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN, NMeVal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ciclo (RGEfmV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artifcial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FORMILACIÓN, FMOC, Mtr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OBut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN, NMeVal, -ONA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Producto Alt Syn.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FORMILACIÓN, FMOC, Mtr.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> -OBut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN, NMeVal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Producto Alt Syn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mtr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> -OBut
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN, NMeVal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Producto Alt Syn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
Claims (23)
1. Utilización de un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} seleccionado de entre el grupo
constituido por un péptido que contiene RGD, un anticuerpo
monoclonal anti-\alpha_{v}\beta_{3}, y un
anticuerpo monoclonal de receptor
anti-\alpha_{v}\beta_{3} como agente
inhibidor de angiogénesis y una proteína de fusión antígeno
antitumoral/citocina como agente inmunoterapéutico antitumoral para
la preparación de una composición farmacéutica destinada al
tratamiento de una célula tumoral en un paciente, en la que dicho
agente inhibidor de angiogénesis y el agente inmunoterapéutico
antitumoral se administran en una cantidad que inhibe la
proliferación de la célula tumoral a un paciente, en la que dicho
antígeno antitumoral comprende por lo menos una parte que se une al
antígeno de un anticuerpo dirigido hacia un antígeno
tumoral.
tumoral.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho agente inhibidor de angiogénesis y dicho agente
inmunoterapéutico antitumoral se administran sustancialmente
simultánea o sucesivamente en un intervalo de aproximadamente 3
semanas.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicho agente inhibidor de angiogénesis se administra antes que
dicho agente inmunoterapéutico antitumoral.
4. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicho agente inmunoterapéutico antitumoral se administra antes
que dicho agente inhibidor de angiogénesis.
5. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicho agente inhibidor de angiogénesis y dicho agente
inmunoterapéutico antitumoral se administran mientras se extrae
quirúrgicamente un tumor o metástasis tumorales de dicho paciente
durante dicho intervalo de tiempo.
6. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho agente inhibidor de angiogénesis y dicho agente
inmunoterapéutico antitumoral se administran después de extraer
quirúrgicamente un tumor o metástasis tumorales de dicho
paciente.
7. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho agente inhibidor de angiogénesis se administra a una
dosis de 10 mg a 1.000 mg por kilogramo de peso corporal al día.
8. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho agente inmunoterapéutico antitumoral se administra a una
dosis de 0,01 mg a 10 mg por kilogramo de peso corporal al día.
9. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha célula tumoral es neuroectodérmica o epitelial.
10. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha célula tumoral se selecciona de entre el grupo constituido
por adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial,
germinoma, glioblastoma, glioma, hamartoma, hemangioendotelioma,
hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma,
meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma,
retinoblastoma, rhabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma.
11. Composición terapéutica para tratar un tumor
o metástasis tumorales que comprende por lo menos un antagonista de
\alpha_{v}\beta_{3} seleccionado de entre el grupo
constituido por un péptido que contiene RGD, un anticuerpo
monoclonal anti-\alpha_{v}\beta_{3}, y un
anticuerpo monoclonal de receptor
anti-\alpha_{v}\beta_{3} como agente
inhibidor de angiogénesis y por lo menos una proteína de fusión
antígeno antitumoral/citocina como un agente inmunoterapéutico
antitumoral, en la que dicho antígeno antitumoral comprende por lo
menos una parte que se une al antígeno de un anticuerpo dirigido
hacia un antígeno tumoral.
12. Composición terapéutica según la
reivindicación 11, en la que:
- a)
- dicho por lo menos un agente inhibidor de angiogénesis está presente en la composición terapéutica en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis en un tumor o metástasis tumorales; y
- b)
- dicho por lo menos un agente inmunoterapéutico antitumoral está presente en la composición terapéutica en una cantidad suficiente para provocar una respuesta biológica específica para la citocina.
13. Kit para tratar una célula tumoral en un
tumor o metástasis tumorales que comprende un envase que
contiene:
- a)
- un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} seleccionado de entre el grupo constituido por un péptido que contiene RGD, un anticuerpo monoclonal anti-\alpha_{v}\beta_{3}, y un anticuerpo monoclonal del receptor anti-\alpha_{v}\beta_{3} como agente inhibidor de angiogénesis que puede inhibir la angiogénesis en dicho tumor o dichas metástasis tumorales; y
- b)
- una proteína de fusión antígeno antitumoral/citocina como agente inmunoterapéutico antitumoral, en el que dicho antígeno antitumoral comprende por lo menos la parte que se une al antígeno de un anticuerpo dirigido a un antígeno tumoral.
14. Utilización según la reivindicación 1,
composición según la reivindicación 11 o kit según la reivindicación
13, en los que dicho péptido que contiene RGD es un péptido que
presenta la secuencia del resto de aminoácidos
ciclo(RGDfN-MeV) (SEC. ID. nº: 11).
15. Utilización según la reivindicación 1,
composición según la reivindicación 11, o kit según la
reivindicación 13, en los que dicha citocina se selecciona de entre
el grupo constituido por IL-2, IL-12
e IL-15.
16. Utilización según la reivindicación 1,
composición según la reivindicación 11, o kit según la
reivindicación 13, en los que el antígeno antitumoral de dicho
agente inmunoterapéutico antitumoral es una cadena de
inmunoglobulina (Ig) que comprende una región variable que se une a
una diana del antígeno asociado al tumor.
17. Utilización, composición o kit según la
reivindicación 16, en los que dicha diana del antígeno asociado al
tumor se selecciona de entre el grupo constituido por AFP, CA 125,
CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptor de EGF, GD_{2}, GD_{3},
GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA),
receptor de IL-2, Lewis-Y,
Lewis-X (CD15), proteoglucano MCSP asociado al
melanoma, PSA y receptor de transferrina.
18. Utilización según la reivindicación 1,
composición según la reivindicación 11, o kit según la
reivindicación 13, en los que dicho agente inmunoterapéutico
antitumoral es una proteína de fusión que comprende citocina
IL-2 y una cadena pesada de Ig que inmunorreacciona
con el antígeno GD_{2} asociado al tumor.
19. Utilización según la reivindicación 1,
composición según la reivindicación 11, o kit según la
reivindicación 13, en los que dicho agente inmunoterapéutico
antitumoral es una proteína de fusión que comprende citocina
IL-2 y una cadena pesada de Ig que inmunorreacciona
con el antígeno KSA (Ep-CAM; KS ¼ antígeno) asociado
al tumor.
20. Kit según la reivindicación 13, en el que
dichos tumor o metástasis tumorales se seleccionan de entre el grupo
constituido por adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma
epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hamartoma,
hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma,
leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma,
osteosarcoma, retinoblastoma, rhabdomiosarcoma, sarcoma y
teratoma.
21. Kit según la reivindicación 13, en el que
dicho agente inhibidor de angiogénesis y dicho agente
inmunoterapéutico antitumoral están previstos en recipientes
separados o en un solo recipiente en dicho envase.
22. Utilización, composición o kit según la
reivindicación 16, en los que dicha diana del antígeno asociado al
tumor procede de una célula tumoral que es neuroectodérmica o
epitelial.
23. Utilización, composición o kit según la
reivindicación 16, en los que dicha diana del antígeno asociado al
tumor procede de una célula tumoral que se selecciona de entre el
grupo constituido por adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma
epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hamartoma,
hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma,
leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma,
osteosarcoma, retinoblastoma, rhabdomiosarcoma, sarcoma y
teratoma.
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