ES2322234T3 - Citocinas modificadas para su utilizacion en la terapia del cancer. - Google Patents

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Abstract

Producto de conjugación de una citocina seleccionada de entre TNF o IFNgamma y un péptido que contiene el motivo NGR, en el que dicho péptido es un ligando del receptor CD13.

Description

Citocinas modificadas para su utilización en la terapia del cáncer.
La presente invención se refiere a citocinas modificadas para su utilización en el tratamiento del cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a derivados de citocinas capaces de "albergar" vasos tumorales y células presentadoras de antígenos.
La actividad antitumoral de algunas citocinas es bien conocida y se ha descrito. Algunas citocinas se han utilizado ya terapéuticamente también en seres humanos (29). Por ejemplo, citocinas tales como la interleucina-2 (IL-2) y el interferón \alpha(IFN\alpha) han demostrado actividad antitumoral positiva en pacientes con diferentes tipos de tumores, tales como el carcinoma renal metastásico, la tricoleucemia, el sarcoma de Kaposi, el melanoma, el melanoma múltiple y similares. Otras citocinas como IFN\beta, el factor \alpha de la necrosis tumoral (TNF), TNF\beta, IL-1, 4, 6, 12, 15 y los factores de estimulación de colonias (CFS) han demostrado una cierta actividad antitumoral en algunos tipos de tumores y por consiguiente son objeto de estudios adicionales.
En general, la utilización terapéutica de citocinas está muy limitada por su toxicidad generalizada. El TNF, por ejemplo, fue originalmente descubierto por su capacidad de provocar la necrosis hemorrágica de algunos tumores (1) y por su efecto citotóxico in vitro en diferentes estirpes tumorales (2), pero esto demostró posteriormente que tiene actividad proinflamatoria fuerte, que puede, en caso de condiciones de sobreproducción, afectar peligrosamente al cuerpo humano (3).
Ya que la toxicidad generalizada es un problema fundamental en la utilización de cantidades farmacológicamente activas de citocinas en los seres humanos, los nuevos derivados y las estrategias terapéuticas están actualmente en evaluación, con la intención de reducir los efectos tóxicos de esta clase de efectores biológicos conservando su eficacia terapéutica.
Algunas nuevas estrategias se refieren a:
a)
el desarrollo de proteínas de fusión que pueden liberar TNF en el tumor y aumentar la concentración local. Por ejemplo, las proteínas de fusión constituidas por TNF y los anticuerpos específicos para el tumor se han producido (4);
b)
el desarrollo de mutantes de TNF que mantienen la actividad antitumoral y tienen una toxicidad generalizada reducida. Por consiguiente, mutantes capaces de reconocer selectivamente solamente un receptor (p55 o p75) se han preparado ya (5);
c)
la utilización de anticuerpos anti-TNF capaces de reducir algunos efectos tóxicos de TNF sin comprometer su actividad antitumoral. Dichos anticuerpos se han descrito ya en la bibliografía (30);
d)
la utilización de derivados de TNF con una vida media mayor (por ejemplo conjugados de TNF con polietilenglicol).
La preparación de derivados del TNF capaces de dirigirse selectivamente a las zonas tumorales se ha descrito recientemente. Por ejemplo, se ha descrito una proteína de fusión, obtenida fusionando el gen de la cadena pesada de un mAb receptor de anti-transferrina y el gen del TNF (4), o una proteína de fusión del TNF con la zona "bisagra" de un anticuerpo monoclonal contra el antígeno TAG72 asociado al tumor (6) o una proteína de fusión Fv-TNF (6).
El documento EP 251 494 describe un sistema para administrar un agente para diagnóstico o terapéutico, que comprende: un anticuerpo conjugado con avidina o estreptavidina, un agente capaz de acomplejar el anticuerpo conjugado y un compuesto constituido por el agente para diagnóstico o terapéutico conjugado con biotina, que se administran sucesivamente y están retardados de manera adecuada, a fin de permitir la localización del agente terapéutico o para diagnóstico mediante la interacción biotina-estreptavidina en la célula diana reconocida por el anticuerpo. Los agentes terapéuticos o para diagnóstico descritos comprenden quelatos metálicos, en particular quelatos de radionúclidos y agentes antitumorales de bajo peso molecular tales como cis-platino, doxorrubicina, etc.
El documento EP 496 074 da a conocer un procedimiento que proporciona la administración sucesiva de un anticuerpo biotinilado, avidina o estreptavidina y un agente biotinilado para diagnóstico o terapéutico. Aunque los agentes citotóxicos como el ricino se mencionan genéricamente, la aplicación relativa a los compuestos radiomarcados está descrita en su mayor parte.
El documento WO 95/15979 da a conocer un procedimiento para localizar agentes muy tóxicos en las dianas celulares, basado en la administración de un primer conjugado que comprende la molécula diana específica conjugada con un ligando o un anti-ligando seguido de la administración de un segundo conjugado constituido por el agente tóxico unido a un anti-ligando o al ligando.
Los documentos WO 99/13329 y WO 98/10795 dan a conocer un procedimiento para dirigir una molécula a los vasos angiogénicos tumorales, basado en la conjugación de dicha molécula con ligandos de receptores de NGR. Se han sugerido numerosas moléculas como posibles candidatos, pero solamente la doxorrubicina está descrita específicamente. No se da a conocer ninguna utilización de ligandos de receptores de NGR como vehículos de citocinas para provocar respuestas inmunitarias.
Se ha descubierto actualmente de manera sorprendente que puede mejorarse notablemente el índice terapéutico de determinadas citocinas y sus propiedades inmunoterapéuticas pueden mejorarse acoplándose con un ligando del receptor de aminopeptidasa-N (CD13). CD13 es una glucoproteína transmembranaria de 150 kDa muy conservada en varias especies. Se expresa en las células normales así como en las estirpes tumorales mieloides, en el endotelio angiógeno y en algunos epitelios. El receptor CD13 se identifica normalmente como receptor "NGR", porque sus ligandos peptídicos comparten el motivo "NGR" aminoácido.
Según un primer aspecto, la invención proporciona un producto de conjugación de una citocina seleccionada de entre TNF e IFN\gamma y un péptido que con tiene el motivo NGR, en el que dicho péptido es un ligando del receptor CD13.
El péptido es preferentemente un péptido lineal o cíclico que comprende el motivo NGR, tales como CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, GVLNGRMEC o cicloCNGRC, o, más preferentemente, el péptido CNGRC. El péptido puede acoplarse directamente a la citocina o indirectamente mediante un espaciador, que puede ser un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos o un resto orgánico, tal como 6-aminocapril-N-hidroxisuccinimida. Los procedimientos de acoplamiento son conocidos por los expertos en la materia y comprenden técnicas de ingeniería genética o de síntesis química.
El ligando peptídico preferentemente está unido al terminal N de la citocina minimizando de este modo cualquier interferencia en la unión de la citocina modificada a su receptor. Alternativamente, el péptido puede estar unido a restos de aminoácido que son receptores de enlaces amido o carboxílico, que se producen de forma natural en la molécula o artificialmente insertados con técnicas de ingeniería genética. La citocina modificada se prepara preferentemente mediante la utilización de un ADNc que comprende una secuencia 5' contigua que codifica el péptido.
Según una forma de realización preferida, se proporciona un producto de conjugación entre TNF y la secuencia CNGRC. Más preferentemente, el terminal amino de TNF está unido al péptido CNGRC mediante el espaciador G (glicina).
El producto resultante (NGR-TNF), demostró ser más activo que el TNF en modelos animales de linfoma RMA-T. Además, los animales tratados con NGR-TNF fueron capaces de rechazar más dosis tumorígenas de células RMA-T o RMA. El aumento de la actividad antitumoral, en comparación con el TNF normal, pudo observarse en animales inmunocompetitivos pero no en animales inmunodeficientes. Esto indica que el aumento en la actividad antitumoral de TNF conjugado con péptidos "NGR" es debido a un aumento de la respuesta inmunitaria en lugar de a una actividad citotóxica directa del conjugado.
Se ha demostrado también que los efectos inmunitarios in vivo provocados por NGR-TNF están relacionados directamente con el receptor CD13. Se ha observado, por ejemplo, que el anticuerpo contra el receptor CD13 así como el ligando GNGRC compiten con NGR-TNF in vivo, sugiriendo de este modo un mecanismo de dirección del receptor por NGR-TNF.
El índice terapéutico de los conjugados del ligando TNF/CD13 puede mejorarse más utilizando una forma mutante de TNF capaz de unirse selectivamente a uno de los dos receptores de TNF, p75TNFR y p55TNFR. Dicho mutante de TNF puede obtenerse por mutagénesis dirigida a la zona (5; 7).
El índice farmacocinético de las citocinas modificadas según la invención puede mejorarse preparando derivados de polietilenglicol, que permiten ampliar la vida media plasmática de las propias citocinas.
Una forma de realización adicional de la invención es proporcionada por derivados bifuncionales en los que las citocinas modificadas con el ligando CD13 están conjugadas con anticuerpos, o sus fragmentos, contra los antígenos tumorales u otros marcadores angiógenos tumorales, p. ej., integrinas \alphav, metaloproteasas o el factor de crecimiento vascular, o anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra los componentes de la matriz extracelular, tales como los anticuerpos anti-tenascina o el dominio EDB de la anti-fibronectina. Se ha descrito recientemente la preparación de un producto de fusión entre TNF y la zona bisagra de un mAb contra el antígeno TAG72 asociado al tumor expresado por el adenocarcinoma gástrico y de ovario (6).
Una forma de realización adicional de la invención es proporcionada por el predireccionamiento tumoral con el sistema biotina/avidina. Según esta estrategia, se obtiene un complejo ternario en la zona antigénica tumoral, en diferentes etapas, que está formada por 1) mAb biotinilado, 2) avidina (o estreptavidina) y 3) citocina bivalente modificada con el ligando CD13 y biotina. Numerosos artículos demostraron que la estrategia de predireccionamiento, en comparación con el direccionamiento convencional con inmunoconjugados, puede aumentar realmente la relación de molécula activa contenida en la diana a molécula activa libre, reduciendo de este modo la toxicidad del tratamiento (11, 10, 9, 8). Esta estrategia produjo resultados favorables con el TNF biotinilado, que fue capaz de provocar citotoxicidad in vitro y disminuir el crecimiento de las células tumorales en condiciones en las que el TNF normal era inactivo (14, 26). La estrategia de predireccionamiento puede realizarse también con un procedimiento en dos fases utilizando un anticuerpo biespecífico que al mismo tiempo se une al antígeno tumoral y a la citocina modificada. La utilización de un anticuerpo biespecífico dirigido contra el antígeno carcionoembrionario y el TNF se ha descrito recientemente como un medio para el predireccionamiento tumoral del TNF (31).
Según una forma de realización adicional, la invención comprende una molécula de TNF conjugada tanto con un péptido que contiene un motivo NGR como con un anticuerpo, o un fragmento de la misma (directa o indirectamente mediante un puente biotina-avidina), en diferentes subunidades de TNF, donde el anticuerpo o sus fragmentos están dirigidos contra un anticuerpo expresado en las células tumorales u otros componentes del estroma tumoral, p. ej. el dominio EDB de tenascina y fibronectina. Esto da como resultado una mejora adicional del tumor que alberga las propiedades de la citocina modificada y en la liberación lenta de este último en el micromedio tumoral mediante las transiciones trímero-monómero-trímero. Como se demuestra en los trabajos anteriores, de hecho, las subunidades modificadas de los conjugados de TNF pueden disociarse de los complejos de direccionamiento y reasociarse con el fin de formar moléculas de TNF triméricas inalteradas, que a continuación se difunden en el microentorno del tumor. Se ha demostrado que la liberación del TNF bioactivo se produce entre las 24 y 48 horas después del direccionamiento (21).
Para su utilización en terapia, las citocinas modificadas de la invención se formularán de manera adecuada en preparaciones farmacéuticas para administración oral o parenteral. Se prefieren las formulaciones para administración parenteral, y comprenden soluciones inyectables o suspensiones y líquidos para infusiones. Para la preparación de las formas parenterales, se disolverá o se pondrán en suspensión una cantidad eficaz del ingrediente activo en un vehículo esterilizado, añadiendo opcionalmente excipientes tales como disolventes, agentes de isotonicidad, conservantes, estabilizantes, emulsionantes o agentes dispersantes, y se distribuirá sucesivamente en viales sellados o ampollas.
La preparación de citocinas en forma de liposomas puede mejorar la actividad biológica de las mismas. Se ha observado, de hecho, que la acilación de los grupos amino del TNF provoca un aumento en su hidrofobia sin pérdida de actividad biológica in vitro. Además, se ha descrito que el TNF unido a lípidos tiene citotoxicidad inalterada in vitro, efectos de inmunomodulación y toxicidad reducida in vivo (12, 13).
La dosis máxima tolerada de TNF en inyección intravenosa en embolada en seres humanos es de 218 a 410 \mug/m^{2} (32) aproximadamente 10 veces inferior a la dosis eficaz en animales. Basándose en los datos de los modelos murinos se cree que una dosis superior de por lo menos 10 veces es necesaria para conseguir efectos antitumorales en seres humanos (15). En el primer estudio clínico sobre perfusión hipertérmica aislada en las extremidades, se obtuvieron cantidades altas de respuesta con la dosis única de 4 mg de TNF en combinación con melfalán e interferón \gamma (16). Otros trabajos demostraron que el interferón \gamma puede omitirse y que incluso dosis inferiores de TNF pueden ser suficientes para provocar una respuesta terapéutica (17, 18). Dado que las dos citocinas ejercen efectos sinérgicos sobre las células endoteliales, su direccionamiento combinado y selectivo en las mismas es probable que produzca una actividad antitumoral más potente permitiendo de este modo superar los problemas de toxicidad generaliza encontrados normalmente en la terapia del cáncer con las mismas citocinas utilizadas en combinación. Además, es sabido que el TNF puede disminuir la función de barrera de los vasos con recubrimiento endotelial, aumentando de este modo su permeabilidad a las macromoléculas. Aprovechándose de la menor toxicidad del tratamiento con las moléculas de TNF modificadas según la invención, y sus vasos tumorales que contienen propiedades, una aplicación alternativa consiste en su utilización para aumentar la permeabilidad de los vasos tumorales a otro compuesto, para fines terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo puede utilizarse el TNF modificado para aumentar la absorción del tumor de los anticuerpos u hormonas radiomarcados (compuestos para detección por la imagen del tumor) en radioinmunoescintigrafía o radioinmunoterapia de los tumores. Alternativamente, la absorción de fármacos quimioterapéuticos, inmunotoxinas, liposomas que llevan fármacos o genes, u otros fármacos anticancerosos podría aumentarse también, de modo que sus efectos antitumorales aumenten.
Por consiguiente, las citocinas de la invención pueden utilizarse en preparaciones combinadas, por separado o sucesivas, asimismo con otras sustancias para diagnóstico o terapéuticas, en el tratamiento o en el diagnóstico del cáncer.
Un aspecto final de la invención con respecto al ADNc que codifica las citocinas conjugadas dadas a conocer en la presente memoria, que pueden prepararse a partir del ADNc de citocinas por adición de una secuencia de ADN contigua a 5' ó 3' que codifica el péptido que contiene el motivo NGR, preferentemente para los péptidos de autoguiado descritos anteriormente. El ADNc combinado puede utilizarse como tal o tras la inserción en vectores para terapia génica. La preparación de aplicaciones terapéuticas de vectores adecuados se da a conocer en (19), que está incorporado a la presente memoria como referencia.
Descripción de las Figuras
Figura 1
Efecto del TNF y NGR-TNF sobre el crecimiento de linfomas RMA-T (a y b) y sobre el peso del animal (c y d)
Se trataron 5 animales/grupo con una única dosis de TNF o NGR-TNF (i.p.), 10 días después de la implantación del tumor. Los valores del área tumoral el día 14 en función de la dosis (b) y la pérdida de peso después del tratamiento (media de los días 11 y 12) (d), se interpolaron en curvas logarítmicas. Los efectos antitumorales provocados por 1 \mug o 9 \mug de NGR-TNF el día 14 fueron mayores que los provocados por cantidades comparables de TNF (P = 0,024 y P = 0,032, respectivamente), mientras que la pérdida de peso después de estos tratamientos fue similar. Las flechas indican dosis extrapoladas de TNF y NGR-TNF que provocan efectos comparables.
Figura 2
Efecto del mAb R3-63 y de CNGRC sobre la actividad antitumoral de NGR-TNF (a) y TNF (b)
Se mezclaron mAb R3-63 o CNGRC con NGR-TNF o TNF y se administraron a animales con tumor RMA-T, 12 días después de la implantación del tumor (n = 5 animales/grupo). En un experimento por separado (c) TNF y NGR-TNF se administraron conjuntamente con CNGRC o CARAC (péptido de referencia) a animales que llevan tumores de 11 días (n = 5). El efecto antitumoral de 1 \mug de NGR-TNF fue más potente que el de 9 \mug de TNF (P = 0,009, prueba de la t el día 20) y fue inhibido de manera significativa por CNGRC (P = 0,035) y por mAb R3-63 (P = 0,011).
Figura 3
Efecto de la digestión tríptica limitada de NGR-TNF y de TNF sobre su masa (a) y actividad antitumoral (b)
Se preparó tripsina-agarosa acoplando 1 mg de tripsina a 1 ml de CH Sepharosa activada (Pharmacia-Upjohn), según las instrucciones del fabricante. Se mezclaron NGR-TNF y TNF (170 \mug de cada uno en 300 \mul de cloruro sódico 0,15 M, fosfato sódico 0,05 M, pH 7,3) con 15 \mul de suspensión de resina (1:4) o tampón solo y se hizo girar en un tambor vertical a 37ºC durante el tiempo indicado. Se filtraron los cuatro productos a través de un dispositivo Spin-X de 0,22 \mum (Costar, Cambridge, MA) y se almacenaron a -20ºC hasta su utilización. (a) Análisis de espectrometría de masas con electroatomización. Los valores de la masa molecular y los productos correspondientes (secuencias N-terminales) están indicados en cada pico. Las flechas en las secuencias indican la zona de escisión. (b) Efecto de 1 ó 3 \mug de NGR-TNF y TNF, incubados sin (paneles superiores) o con (paneles inferiores) tripsina, sobre el crecimiento de tumores RMA-T y el peso del animal (media \pm SE de grupos tratados con dosis de 1 a 3 \mug). Se trataron los animales 13 días después de la implantación del tumor (n = 5 animales/grupo).
Figura 4
SDS-PAGE y actividad antitumoral de NGR-TNF humano antes y después de desnaturalización/replegamiento
SDS-PAGE en condiciones no reductoras (A) de TNF humano (a), antes de NGR-TNF (b) y después de (c) el proceso de desnaturalización/replegamiento descrito en el Ejemplo V.
Efecto de TNF y NGR-TNF sin replegar sobre el crecimiento de los linfomas RMA-T (B) y sobre el peso corporal (C). El efecto de TNF humano (D) y de NGR-TNF replegado (constituido por >95% de trímeros con disulfuros dentro de la cadena) (E) sobre el crecimiento del tumor. Se trataron animales (15 ó 5 ratones/grupo como se indica en cada panel) con una dosis i.p. de TNF o de NGR-TNF, 10 días después de la implantación del tumor.
Los ejemplos siguientes ilustran con mayor detalle la invención.
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Ejemplo I
Preparación de TNF y NGR-TNF murinos
TNF murino recombinante y Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF) se produjeron por expresión del ADNc citoplásmico en E. coli. La codificación del ADNc para Met-TNF_{1-156} murino (20) se preparó por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) en el ARNm aislado de células de monocito-macrófago RAW-264.7 murinas estimuladas por lipopolisacáridos, utilizando 5'-CTGGATCCTCACA-GAGCAATGACTCCAAAG-3' y 5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3' como cebadores 3' y 5'.
El fragmento ampliado se digirió con Nde I y Bam HI (New England Biolabs, Beverly, MA) y se clonaron en el pET-11b (Novagen, Madison, WI), digeridos previamente con las mismas enzimas (pTNF).
El ADNc que codifica Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF_{1-156} fue ampliado por PCR en pTNF, utilizando 5'-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTC-TC-3' como cebador 5' y el cebador 3' anterior. El fragmento ampliado se digirió y se clonó en el pET-11b como se describió anteriormente y se utilizó para transformar células BL21(DE3) de E. coli (Novagen). Se provocó la expresión de TNF y de NGR-TNF con isopropilo-\beta-D-tiogalactósido, según las instrucciones del fabricante del pET11b. Se recuperaron TNF y NGR-TNF solubles de los cultivos de dos litros por tratamiento con ultrasonidos de las bacterias en ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 seguido de centrifugación (15.000 \times g, 20 min., 4ºC). Se mezclaron ambos extractos con sulfato amónico (25% de saturación, se dejaron durante 1 h. a 4ºC y se centrifugaron más, como anteriormente. El sulfato amónico en los sobrenadantes se llevó a continuación al 65% de saturación, se dejó a 4ºC durante 24 h. y se centrifugó más. Se disolvió cada sedimento en 200 ml de sulfato amónico 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y se purificó por cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, que contiene sulfato amónico 1 M; tampón B: glicerol al 20%, metanol al 5%, fosfato sódico 50 mM, pH 8,0). Las fracciones que contenían material inmunorreactivo TNF (por inmunotransferencia Western) se mezclaron, se dializaron frente a ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y se purificaron más por cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; tampón B: cloruro sódico 1 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0). Se mezclaron las fracciones que contenían inmunorreactividad a TNF y se purificaron por cromatografía con filtración en gel en Sephacryl-S-300 HR (Pharmacia-Upjohn), se equilibraron previamente y se eluyeron con cloruro sódico 150 mM, tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,3 (PBS). Se agruparon las fracciones correspondientes a los productos de p.m. 40.000 a 50.000, se tomaron alícuotas y se almacenaron congeladas a -20ºC. Todas las soluciones empleadas en las etapas cromatográficas se prepararon con agua esterilizada y exenta de endotoxinas (Salf, Bérgamo, Italia). Los rendimientos finales fueron de 45 mg de TNF y 34,5 mg de NGR-TNF.
El peso molecular del TNF y NGR-TNF purificados se midieron por espectrometría de masas con electroatomización. Se midió el contenido en proteínas utilizando un kit de análisis de proteínas comercial (Pierce, Rockford, IL). El contenido en endotoxinas de NGR-TNF y de TNF fue de 0,75 unidades/\mug y de 1,38 unidades/\mug, respectivamente, medidas por la prueba cromógena Lymulus Amoebocyte Lysate (LAL) (BioWhittaker).
Se llevaron a cabo electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) y análisis de inmunotransferencia Western utilizando geles de poliacrilamida al 12,5 ó 15%, por los procedimientos habituales.
Una pequeña cantidad de TNF y de NGR-TNF se purificó más por cromatografía por afinidad en el receptor soluble p55-TNF (sTNF-R1)-Sepharosa de la forma siguiente: se prepararon 5 mg de sTNF-RI recombinante tal como se describe (22) y se acopló a 2 ml de CH-Sepharose activada (Pharmacia), según las instrucciones del fabricante. Se lavaron extensamente dos columnas por separado (de un ml cada una), con soluciones esterilizadas y exentas de endotoxinas, se cargaron con TNF o NGR-TNF purificados en PBS y se desabsorbieron por elución con gradiente (1 h., tampón A: PBS; tampón B: cloruro sódico 0,5 M, glicina-HCl 0,2 M). Las fracciones que contienen TNF-antígeno se neutralizaron y se dializaron frente a la solución fisiológica esterilizada. Se añadió albúmina de suero humano exenta de endotoxinas antes del análisis (0,5 mg/ml) para evitar la adsorción de proteínas en las membranas. El contenido de TNF en cada fracción se determinó por ELISA y análisis citolítico.
SDS-PAGE no reductor del TNF presentaba una sola banda de 17 a 18 kDa, como cabía esperar para el TNF monomérico (no mostrado). En desacuerdo, la SDS-PAGE no reductora y el análisis por transferencia Western de NGR-TNF presentaron diferentes formas inmunorreactivas de 18, 36 y 50 kDa probablemente correspondientes a monómeros, dímeros y trímeros. En condiciones reductoras la mayoría de las bandas de 50 y 36 kDa se convirtieron en la forma de 18 kDa, apuntando la presencia de moléculas NGR-TNF con puentes disulfuro dentro de la cadena. La banda de 18 kDa contaba con aproximadamente 2/3 del material total, mientras que la de 36 kDa totalizaba la mayoría de la parte restante. Estos modelos electroforéticos sugieren que NGR-TNF era una mezcla de trímeros preparada por tres subunidades monoméricas con sulfuros correctos dentro de la cadena (por lo menos el 50%) y la mayor parte restante por trímeros con uno o más disulfuros dentro de la cadena. La banda de 36 kDa todavía observada reduciendo SDS-PAGE sugiere que NGR-TNF contenía también un dímero desnaturalizado irreversible (aproximadamente 10% del total).
Las masas moleculares de los monómeros de TNF y de NGR-TNF fueron de 17.386,1\pm2,0 Da y de 17.843,7+2,5 Da, respectivamente, por espectrometría de masas con electroatomización. Estos valores corresponden muy bien a la masa esperada para Met-TNF_{1-156} (17.386,7 Da) y para CNGRCG-TNF_{1-156} (17.844,2 Da).
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Ejemplo II
Actividad citotóxica in vitro de TNF y NGR-TNF murinos
Se estimó por análisis citolítico normal la bioactividad de TNF y NGR-TNF basándose en fibroblastos de ratón L-M (ATCC CCL1.2) como se describe (23). Se determinó la actividad citolítica de TNF y NGR-TNF en células RMA-T en presencia de 30 ng/ml de actinomicina D. Cada muestra se analizó por duplicado a tres diluciones diferentes. Los resultados se expresan como media \pm SD de dos a tres análisis independientes.
La actividad citotóxica in vitro de TNF y NGR-TNF fue (1,2+0,14) \times 10^{8} unidades/mg y de (1,8\pm0,7) \times 10^{8} unidades/mg, respectivamente, por análisis citolítico normal con células L-M. Estos resultados indican que los restos CNGRCG en la molécula NGR-TNF no impiden el plegamiento, la oligomerización ni la fijación a receptores de
TNF.
En un estudio anterior los autores demostraron que las células RMA-T pueden ser destruidas por TNF en presencia de 30 ng/ml de actinomicina D, mientras que en ausencia de inhibidores de transcripción estas células son resistentes a TNF, incluso después de varios días de incubación. La actividad citotóxica in vitro de NGR-TNF sobre las células RMA-T en presencia de actinomicina D fue de (1,4\pm0,8) \times 10^{8} unidades/mg, medida utilizando TNF ((1,2\pm0,14) \times 10^{8} unidades/mg) como patrón. De este modo, las actividades citotóxicas de NGR-TNF y de TNF fueron similares tanto en células L-M como RMA-T.
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Ejemplo III
Caracterización de la actividad terapéutica y tóxica de TNF y NGR-TNF murinos
El linfoma RMA provocado por el virus de Rauscher de origen C57BL/6 se mantuvo in vitro en RPMI 1640, 5% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 50 \muM. RMA-T procedía de la estirpe de células RMA por transfección con un montaje que codifica el alelo Thy 1.1 y se cultivó como se describe (14).
Se cultivaron B16F1 de melanoma en RPMI 1640, FBS al 5%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, MEM al 1% de aminoácidos no esenciales (BioWhittaker Europa, Verviers, Bélgica).
El Comité Ético del Instituto Científico del H. San Raffaele aprobó estudios in vivo en modelos animales y se llevaron a cabo según las directrices prescritas. C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Italia) (16 a 18 g) se sometieron a la prueba de provocación con 5 \times 10^{4} células vivas RMA-T o B16F1, respectivamente, s.c. en el flanco izquierdo. Diez a doce días después de la implantación del tumor, se trataron los ratones, i.p. con 250 \mul de soluciones de TNF o NGR-TNF, diluidas con cloruro sódico al 0,9% exento de endotoxinas. Los experimentos preliminares demostraron que la actividad antitumoral no cambió por adición de albúmina de suero humano a soluciones de TNF y NGR-TNF, como vehículo. Se realizó cada experimento en 5 ratones por grupo. El crecimiento del tumor se controló a diario midiendo el tamaño del tumor con calibres. Se estimó el área del tumor calculando r_{1}\timesr_{2}, mientras que el volumen del tumor se estimó calculando r_{1}\timesr_{2}\timesr_{3}\times4/3, donde r_{1} y r_{2} son los radios longitudinal y lateral y r_{3} es el espesor de los tumores que sobresalen de la superficie de la piel normal. Se sacrificaron los animales antes de que el tumor alcanzase un diámetro entre 1,0 y 1,3 cm. Los tamaños del tumor se presentan como media \pm SE (5 a 10 animales por grupo como se indica en las leyendas de la figura) y se compararon por la prueba de la t.
La actividad antitumoral y la toxicidad de NGR-TNF se compararon con las de TNF utilizando los modelos de linfoma RMA-T y de melanoma B16F1 en ratones C57BL6. Dado que el modelo RMA-T se ha caracterizado y utilizado anteriormente para estudiar la actividad antitumoral de TNF con diferentes protocolos de direccionamiento (26), los autores decidieron utilizar este modelo también en este estudio.
El TNF murino administrado a animales que llevan tumores de RMA-T s.c. probados, produce 24 horas después una reducción en la masa del tumor y necrosis hemorrágica en la parte central del tumor, seguido de un retardo de crecimiento significativo durante pocos días (26). Un solo tratamiento con TNF no provoca la regresión completa de este tumor, incluso a dosis próximas a la LD_{50}, ya que las células vivas que permanecen alrededor del área necrótica vuelven a surgir para crecer pocos días después del tratamiento.
En una primera serie de experimentos los autores investigaron el efecto de varias dosis (i.p.) de TNF o de NGR-TNF en la supervivencia animal. Para impedir sufrimiento excesivo, los animales se sacrificaron cuando el diámetro del tumor era mayor de 1 a 1,3 cm. La letalidad del TNF y de NGR-TNF, 3 días después del tratamiento, fue similar (LD_{50}, 60 \mug y 45 \mug, respectivamente) mientras que su actividad antitumoral fue notablemente diferente (Tabla 1).
TABLA 1 Supervivencia de ratones con linfoma RMA-T tratados con TNF o NGR-TNF murinos
1 
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Por ejemplo, 1 ó 3 \mug de NGR-TNF retardaron el crecimiento del tumor más eficazmente que 27 \mug de TNF, lo que indica que NGR-TNF era por lo menos un orden de magnitud más activo. Significativamente, algunos animales se curaron con dosis de NGR-TNF inferiores a las de la LD_{50}, mientras que ningún animal se curó con TNF. Los animales curados rechazaron más pruebas de provocación con dosis tumorígenas de células RMA-T o RMA naturales, lo que sugiere que un solo tratamiento con NGR-TNF era capaz de provocar inmunidad protectora. Es digno de mención que aumentando la dosis de TNF o de NGR-TNF aproximadamente 9 a 27 \mug aumentó notablemente la toxicidad y escasamente o nada la actividad terapéutica.
La pérdida de peso consiguiente al tratamiento con TNF es un signo bien conocido de toxicidad generalizada (26). De este modo, para comparar más la relación eficacia/toxicidad de TNF y de NGR-TNF se controló el crecimiento del tumor y el peso del animal después del tratamiento. El efecto de 1 \mug de NGR-TNF sobre el crecimiento del tumor fue similar o mayor que el de 9 \mug de TNF (Fig. 1a), mientras que la pérdida de peso uno a dos días después del tratamiento fue comparable a la de 1 \mug de TNF (Fig. 1c). Cuando se interpola los datos en una curva logarítmica en una representación de la respuesta a la dosis los autores descubrieron que el efecto terapéutico de 9 \mug de TNF el día 14 puede obtenerse con apenas 0,6 \mug de NGR-TNF (Fig. 1b). En cambio, fueron necesarios 8,5 \mug para provocar un efecto tóxico comparable (Fig. 1d). De este modo, la relación eficacia/toxicidad calculada de NGR-TNF en estas condiciones es 14 veces mayor que la de TNF.
Se obtuvieron resultados similares con el modelo de melanoma B16F1. El tratamiento con 1 \mug de NGR-TNF el día 11 y el día 17, provocó una respuesta antitumoral el día 19 superior a la obtenida con 4 \mug de TNF y similar a la obtenida con 12 \mug de TNF (datos no mostrados). En cambio, la pérdida de peso producida por 1 \mug de NGR-TNF fue notablemente inferior que la producida por 4 y 12 \mug de TNF. El tratamiento con 12 \mug de NGR-TNF produjo un efecto antitumoral aún más potente, mientras que el efecto tóxico fue similar al de 12 \mug de TNF.
Cuando se puso una tercera inyección el día 19 se produjeron algunas muertes de animales 1 a 2 días después en todos los grupos (2 de cada 5 en el grupo tratado con solución salina y 12 \mug de NGR-TNF y 1 de cada 5 en los grupos restantes). A destacar que, un animal tratado con 12 \mug de NGR-TNF rechazó completamente el tumor. Cuando este animal se sometió a la prueba de provocación con una segunda dosis tumorígena de células B16F1, se desarrolló un tumor palpable tras 18 días, mientras que los animales de referencia desarrollaron un tumor a los 6 a 7 días.
Estos resultados, en conjunto, sugieren que la eficacia de NGR-TNF en la inhibición del crecimiento del tumor es 10 a 15 veces mayor que la del TNF mientras la toxicidad es similar. Sin embargo, NGR-TNF puede provocar respuestas inmunoprotectoras con más eficacia que TNF.
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Ejemplo IV
Mecanismo de acción de NGR-TNF
El mAb R3-63 de CD13 anti-ratón se purifico en fluidos ascíticos por cromatografía en proteína-G Sefarosa (Pharmacia-Upjohn, Uppsala, Suecia) y se dializó frente a cloruro sódico al 0,9%.
El antisuero policlonal de conejo se adquirió en Primm srl (Milán, Italia) y se purificó por cromatografía de afinidad en proteína-A-Sefarosa (Pharmacia-Upjohn). Se prepararon los péptidos CNGRC y CARAC como se describió anteriormente (28).
Para proporcionar pruebas de que la actividad mejorada de NGR-TNF depende del direccionamiento del tumor por el resto NGR los autores han investigado si la actividad in vivo de NGR-TNF puede ser parcialmente competida por CNGRC. Hasta este extremo los autores han administrado NGR-TNF (1 \mug) a ratones con tumor RMA-T, con o sin un exceso molar de CNGRC. En paralelo, se trataron otros animales con TNF (3 ó 9 \mug), otra vez con o sin CNGRC. Como era de esperar, CNGRC disminuyó significativamente la actividad antitumoral de NGR-TNF (Fig. 2a) pero no la de TNF (Fig. 2b). En desacuerdo, un péptido de referencia (CARAC) fue incapaz de producir una disminución significativa de la actividad de NGR-TNF (Fig. 2c). Estos resultados sugieren que CNGRC compite por la fijación de NGR-TNF a un receptor de CNGRC, y apoya la hipótesis de un mecanismo de direccionamiento para la actividad mejorada. A destacar que 
\hbox{CNGRC fue incapaz de disminuir la actividad citotóxica
 in vitro   de NGR-TNF (datos no
mostrados).}
Como se ha descrito recientemente que la aminopeptidasa N (CD13) es un receptor para los péptidos CNGRC, los autores investigaron a continuación la contribución de este receptor en el mecanismo de direccionamiento de NGR-TNF. Hasta este extremo, los autores estudiaron el efecto de un mAb anti-CD13 (R3-63) sobre la actividad antitumoral de NGR-TNF y TNF. El mAb R3-63 inhibió de manera significativa la actividad antitumoral de NGR-TNF (Fig. 2a) pero no la del TNF (Fig. 2b) lo que indica que CD13 está de hecho críticamente implicado en la actividad antitumoral de NGR-TNF. No se observó ninguna expresión de CD13 sobre la superficie de las células RAM-T por análisis FACS de las células cultivadas con el mAb R3-63 (no mostrado), lo que sugiere que otras células fueron reconocidas por el anticuerpo in vivo.
Aunque estos datos indican que CD13 es un receptor importante para NGR-TNF, no se puede excluir completamente que la fijación a otros receptores de NGR no identificados todavía contribuye también, no obstante en menor extensión, al mecanismo de direccionamiento.
Los experimentos preliminares de la proteólisis parcial demostraron que el enlace Arg-Ser en el segmento N-terminal de TNF (restos 2 a 3) es muy sensible a la tripsina, mientras que el resto de la molécula es mucho más resistente. De este modo, para proporcionar más pruebas de que la actividad mejorada de NGR-TNF está relacionada con su resto NGR, los autores trataron de escindir el dominio NGR en la zona N-terminal de la muteína mediante digestión parcial con tripsina inmovilizada. Este tratamiento convirtió tanto a NGR-TNF como a TNF en una molécula correspondiente al fragmento TNF3-156 (masa esperada 16986,2 Da; véase la Fig. 3a para la masa medida y las secuencias esperadas).
Aunque la digestión no disminuyó la actividad citolítica in vitro de NGR-TNF sobre las células L-M (2,3\pm1,4)\times10^{8} U/mg) su actividad antitumoral in vivo disminuyó hasta el nivel del TNF (Fig. 3b). A destacar que la toxicidad de NGR-TNF y de TNF eran similares tanto antes como después de la digestión, como se interpreta a partir de la pérdida de peso del animal un día después del tratamiento (Fig. 3b, panel derecho), lo que sugiere que el mecanismo de direccionamiento dependiente de NGR no altera la toxicidad.
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Ejemplo V
Preparación y caracterización de TNF y NGR-TNF humanos
Se prepararon TNF y NGR-TNF recombinantes humanos (constituidos por TNF1-157 humano fusionado con el terminal C de CNGRCG) por tecnología de ADN recombinante y se purificaron esencialmente como se describe para TNF y NGR-TNF murinos. La codificación del ADNc para NGR-TNF humano fue preparada por PCR en el plásmido pET11b/hTNF que contenía la secuencia de codificación hTNF (33), utilizando los cebadores siguientes:
-
NGR-hTNF/1 (transcrito): 5'A TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3'.
-
NGR-hTNF/2 (complementario): 5'TCA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC 3'.
El fragmento ampliado se digirió y se clonó en el pET11b (Nde I/BamH I) y se utilizó para transformar las células BL21 (DE3) de E. coli (Novagen). La expresión de NGR-hTNF fue provocada con isopropilo-\beta-D-tiogalactósido, según la instrucción del fabricante del pET11b. Se recuperó el NGR-TNF soluble de los cultivos de dos litros por tratamiento con ultrasonidos de las bacterias en ácido etilendiamintetraacético 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, seguido de centrifugación (15.000 \times g, 20 min., 4ºC).
El extracto se mezcló con sulfato amónico (35% de saturación), se dejó durante 1 h. a 4ºC y se centrifugó más, como anteriormente. El sulfato amónico en los sobrenadantes se llevó a continuación hasta el 65% de saturación, se dejó a 4ºC durante 24 h. y se centrifugó más. Se disolvió cada sedimento en sulfato amónico 1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y se purificó por cromatografía de interacción hidrófoba en Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: fosfato sódico 100 mM, pH 8,0, que contiene sulfato amónico 1 M; tampón B: etilenglicol al 70%, metanol al 5%, fosfato sódico 100 mM, pH 8,0). Las fracciones que contenían material inmunorreactivo de TNFh (por ELISA) se mezclaron, se dializaron frente a Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 y se purificaron más por cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Upjohn) (elución con gradiente, tampón A: Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; tampón B: cloruro sódico 1 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0). Todas las soluciones empleadas en las etapas cromatográficas se prepararon con agua esterilizada y exenta de endotoxinas (Salf, Bérgamo,
Italia).
En este punto, aproximadamente 30 mg de TNF y 32 mg de NGR-TNF se recuperaron de los cultivos de dos litros. SDS-PAGE no reductor presentó bandas correspondientes a los monómeros, dímeros y trímeros, lo que sugiere que también NGR-TNF humano era una mezcla de trímeros con disulfuros en el interior de la cadena correctos y trímeros con uno o más puentes de disulfuro dentro de la cadena (Fig. 4A, banda b), observados con NGR-TNF
murino.
Se aislaron trímeros con puentes disulfuro dentro de la cadena correctos a partir de esta mezcla mediante un proceso de desnaturalización por replegamiento en cuatro etapas de la manera siguiente: se desnaturalizó NGR-TNF humano purificado con urea 7 M y se filtró en gel a través de una columna HR Sephacryl S-300 (1025 ml) (Pharmacia) equilibrada previamente con urea 7 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. Se mezclaron las fracciones correspondientes al TNF monomérico, se ultrafiltraron a través de una membrana YM MWCO de 10 kDa (Amicon) y se replegaron por diálisis frente a 33 volúmenes de urea 2,33 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8 a 4ºC (140 min.) seguido de urea 1,55 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8 (140 min.) y urea 1 M, Tris-HCl 100 mM, pH 8 (140 min.). Por último se dializó el producto frente a 80 volúmenes de Tris-HCl 100 mM (16 h.), se centrifugó a 13.000 \times g (30 min.), se filtró a través de una membrana SFCA de 0,45 \mum (Nalgene) y se filtró en gel a través de una columna HR Sephacryl S-300 (1020 ml) equilibrada previamente con cloruro sódico 0,15 M, fosfato sódico 0,05 M (PBS). Se recuperaron aproximadamente 23 mg de la proteína replegada.
El producto final era en su mayor parte monomérico después de SDS-PAGE no reductor (Fig. 4A, banda c), tenía un volumen hidrodinámico similar al del TNF humano trimérico por HPLC analítica con filtración en gel en una columna Superdex 75 HR (no mostrada) y tenía una masa molecular de 17937,8 + 1,8 Da (esperada para CNGRCG-TNF1-157, 17939,4 Da) por espectrometría de masas con electroatomización. Las actividades citolíticas in vitro de NGR-TNF sin replegar y replegado sobre las células L-M de ratón fueron (6,11 \times 107) + 4,9 y (5,09 \times 107) + 0,3 unidades/mg respectivamente, mientras que la del TNF humano purificado fue de (5,45 \times 107) + 3,1 unidades/mg. Estos resultados sugieren que el proceso de desnaturalización por replegamiento no afectó la interacción de NGR-TNF humano con el receptor p55 murino.
La actividad antitumoral in vivo de 1 \mug de NGR-TNF humano (sin replegar) fue superior a la de 10 \mug de TNF (Fig. 4B) mientras que la toxicidad, interpretada por la pérdida de peso del animal, fue significativamente inferior (Fig. 4C). Después del replegamiento de 0,3 \mug de NGR-TNF fue suficiente para provocar un efecto antitumoral más fuerte que el conseguido con 10 \mug de TNF (Fig. 4D, 4E).
Estos resultados indican que la actividad antitumoral del NGR-TNF humano es mayor que la del TNF humano.
Además, los autores han observado que el NGR-TNF humano replegado y de ratón pueden provocar efectos antitumorales significativos en los ratones con RMA-T incluso a dosis muy bajas (1 a 10 ng/ratón) sin pruebas de efectos tóxicos, mientras que TNF fue incapaz de provocar efectos significativos a estas dosis (no mostrado).
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Ejemplo VI
Preparación y caracterización de NGR-IFN\gamma DE RATÓN
Se preparó interferón murino recombinante (IFN)\gamma fusionado con CNGRCG (NGR-IFN\gamma) por tecnología de ADN recombinante, esencialmente como se describe para el NGR-TNF. El dominio de CNGRC se fusionó con el terminal C de IFN\gamma. Además la cisteína en la posición 134 se sustituyó con una serina; se introdujo una metionina en la posición -1 para la expresión en las células de E. coli. Los cebadores de PCR utilizados para la producción del ADNc de NGR-IFN\gamma fueron: 5'-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C (transcrito) y 5'-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC. Se clonó el ADNc en el pET-11b (Nde I/BamH I) y se utilizó para transformar células BL21 (DE3) de E. coli (Novagen). Se provocó la expresión de la proteína con isopropilo-\beta-D-tiogalactósido, según la instrucción del fabricante del pET11b. El producto se purificó a partir de los extractos de E. coli por cromatografía de inmunoafinidad utilizando un mAb (AN18) de IFN\gamma anti-ratón inmovilizado en agarosa, según las técnicas habituales. La SDS-PAGE reductora y no reductora del producto final presentaba una sola banda de 16 kDa. La espectrometría de masas con electroatomización presentaba un peso molecular de 16223 + 3,6 Da (esperado, 1625,5 Da) correspondiente al Met-IFN\gamma1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFN\gamma) murino.
La capacidad de NGR-IFN\gamma y NGR-TNF para competir en la fijación de un anticuerpo anti-CD13 con el tumor asociado a los vasos sanguíneos fue investigada utilizando un método inmunohistoquímico.
Muestras quirúrgicas recientes de carcinoma de células renales humanas se obtuvieron en el Departamento de Histopatología del San Raffaele H Scientific Institute. Se prepararon secciones (5 a 6 \mum de espesor) de muestras empapadas en parafina fijadas en Bouin (4 a 6 h.) y se adsorbieron en portaobjetos recubiertos con polilisina. Se detectaron antígenos CD13 utilizando el procedimiento del complejo avidina-biotina de la manera siguiente: las secciones de tejido se rehidrataron utilizando xilenos y series de alcohol graduado, según procedimientos habituales. Las secciones de tejido se colocaron en un vaso que contenía EDTA 1 mM y se hirvieron durante 7 min. utilizando una estufa a microondas (1.000 W). El recipiente se rellenó a continuación con EDTA 1 mM y se hirvió de nuevo durante 5 min. Las secciones de tejido se dejaron enfriar y se incubaron en PBS que contenía peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 15 min., para enfriar la peroxidasa endógena. Las muestras se a continuación y se enjuagaron con PBS y se incubaron con 100 a 200 \mul de PBS-BSA (1 h. a temperatura ambiente) seguido del mAb WM15 (anti-CD13h), solo o mezclado con varios agentes competitivos (véase la Tabla 2) en PBS-BSA (durante la noche a 4ºC). Los portaobjetos se lavaron a continuación tres veces (3 min. cada uno) con PBS y se incubaron con PBS-BSA que contenía suero de caballo normal al 2% (PBS-BSA-NHS) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 5 min. La solución se sustituyó a continuación por 3 \mug/ml de IgG (H+L) anti-ratón de caballo biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en PBS-BSA-NHS y se incubaron durante 1 h. más a temperatura ambiente. Se lavaron los portaobjetos de nuevo y se incubaron durante 30 min. con reactivo Vectastain Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) diluido 1:100 en PBS. Se disolvió a continuación un comprimido de 3,3'-diamino-benzidina-tetrahidrocloruro (Merck, Darmstadt, Alemania) en 10 ml de agua desionizada que contenía peróxido de hidrógeno al 0,03%, filtrado a través de una membrana de 0,2 \mum y cubierto sobre las secciones de tejido durante 5 a 10 min. Los portaobjetos se lavaron como anteriormente y se tiñeron por contraste con hematoxilina de Harris. Se identificaron los vasos asociados al tumor mediante secciones en serie de tinción del tejido con un mAb anti-CD31 (mAb JC/70A, CD31 anti-humano, IgG1, de DAKO, Copenhague, Dinamarca).
En la Tabla 2 se resumen los resultados. Como se muestra, la fijación de WM15 a los vasos asociados al tumor fue inhibida por un exceso de NGR-TNF, NGR-IFN\gamma y CNGRC, pero no por otros reactivos de control que carecen del motivo NGR. Esto sugiere que el punto de fijación de NGR en CD13 se solapa estéricamente con el epítopo WM15. En cambio, NGR-TNF fue incapaz de competir por la fijación de 13C03 con las células epiteliales.
Los autores llegan a la conclusión de que el resto NGR de NGR-IFN\gamma y NGR-TNF puede interactuar con la forma CD13 reconocida por el mAb WM15 en los vasos asociados al tumor. Además, estos resultados indican que el motivo CNGRC es funcional cuando se une al terminal N o al terminal C de una citocina.
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TABLA 2 Fijación de WM15 a las secciones con cáncer de células renales en presencia de varios competidores
2 
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Ejemplo VII
Suministro dirigido de NGR-TNF biotinilado a tumores utilizando anticuerpos antitumorales y avidina (direccionamiento previo)
El ejemplo siguiente, ilustra la posibilidad de "doble" direccionamiento de TNF, basándose en la combinación de un anticuerpo que contiene el tumor y un péptido CNGRC.
Se preparó un conjugado de biotina-NGR-TNF mezclando NGR-TNF con el éster N-hidroxisuccinimida del ácido D-biotinil-6-aminocaproico (Societá Prodotti Antibiotici S.p.A., Milán, Italia), en tampón de carbonato sódico 1 M, pH 6,8 (3 h. a temperatura ambiente) (21). Se bloqueó la reacción con Tris-HCl 1 M, pH 7,5.
Se caracterizó el conjugado por espectrometría de masas y se encontró que contenía 1 biotina/trímero (de promedios). Los C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Italia) se sometieron a continuación a la prueba de provocación con células vivas 5 \times 10^{4} RMA-T, s.c. en el costado izquierdo. Cuando el área del tumor alcanzó 40 mm^{2}, se trataron los ratones con inyecciones sucesivas de anticuerpo biotinilado, avidinas y biotina-TNF según un protocolo de "tres días" como se describió anteriormente (26). Se inyectó: 40 \mug de biotina-mAb19E12 (i.p., etapa I), 60 \mug de avidina y 60 \mug de estreptavidina después de 18 y 19 h., respectivamente (i.p., etapa II), 3 \mug de biotina-NGR-TNF, 24 h. después (i.p., etapa III). Se diluyó cada compuesto con una solución esterilizada de cloruro sódico al 0,9%. En el experimento de referencia, se omitieron la avidina y la estreptavidina. Cada experimento se realizó con 5 ratones/grupo. Se controló el crecimiento del tumor a diario midiendo el tamaño del tumor con calibres. Las áreas del tumor antes y 10 días después del tratamiento fueron 39\pm4 mm^{2} y 8\pm5 mm^{2}, respectivamente, en el grupo tratado con mAb 19E12-biotina/avidina/estreptavidina/biotina-NGR-TNF (5 animales, media\pmSE). En el grupo de referencia (tratado con mAb 19E12-biotina/biotina-NGR-TNF solo) las áreas del tumor antes y 10 días después del tratamiento fueron 40\pm4 mm^{2} y 20\pm6 mm^{2} respectivamente, lo que indica que el direccionamiento previo con el anticuerpo que contiene el tumor y avidina ha aumentado la actividad de NGR-TNF.
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<110> Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
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<120> Citocinas modificadas para su utilización en la terapia del cáncer
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<130> modcyt
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<140>
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<141>
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<160> 7
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<170> PatentIn en versión 2.1
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<210> 1
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador para PROCARIÓTIC
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<400> 1
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ctggatcctc acagagcaat gactccaaag 
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30 
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<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador para PROCARIÓTIC
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador para PROCARIÓTIC
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<212> ADN
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atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 
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35 
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Claims (18)

1. Producto de conjugación de una citocina seleccionada de entre TNF o IFN\gamma y un péptido que contiene el motivo NGR, en el que dicho péptido es un ligando del receptor CD13.
2. Producto de conjugación según la reivindicación 1, en el que dicha citocina es TNF\alpha o TNF\beta.
3. Producto de conjugación según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido se selecciona de entre el grupo constituido por CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, ciclo GVLNGRMEC o CNGRC lineal o cíclico.
4. Producto de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la citocina está unida al péptido mediante un espaciador.
5. Producto de conjugación según la reivindicación 4, en el que dicho péptido es CNGRC lineal o cíclico y en el que dicho péptido está unido a la citocina mediante el espaciador glicina.
6. Producto de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la citocina se modifica con polietilenglicol o un resto acilo.
7. Producto de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la citocina está conjugada asimismo con un anticuerpo, o un fragmento del mismo, dirigido contra un antígeno tumoral, un marcador angiógeno tumoral o un componente de la matriz extracelular.
8. Producto de conjugación según la reivindicación 7, en el que la citocina es el TNF y está conjugada tanto con un péptido que contiene el motivo NGR como con un anticuerpo o un fragmento del mismo, en diferentes subunidades de TNF, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo se dirige a un antígeno tumoral, a un marcador angiógeno tumoral o a un componente de la matriz extracelular y en el que dicho péptido es un ligando del receptor CD13.
9. ADNc que codifica una citocina seleccionada de entre TNF e IFN\gamma que contiene una secuencia 5' ó 3' contigua que codifica un péptido que contiene el motivo NGR, en el que dicho péptido es un ligando del receptor CD13.
10. ADNc según la reivindicación 9, en el que dicho péptido es un péptido según la reivindicación 3.
11. ADNc según la reivindicación 9, que codifica un producto de conjugación según la reivindicación 5.
12. Vector para terapia génica que contiene el ADNc según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un producto de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un ADNc según cualquiera de las reivindicaciones 9 u 11 o un vector según la reivindicación 12, junto con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. Composición según la reivindicación 13, en forma de solución o suspensión inyectable o un líquido para infusiones.
15. Composición según las reivindicaciones 13 ó 14, en forma de liposomas.
16. Utilización de un producto de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de un ADNc según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 o de un vector según la reivindicación 12 para la preparación de medicamentos o diagnósticos destinados a la terapia del cáncer.
17. Utilización de un producto de conjugación según la reivindicación 16, en combinación con otros agentes antitumorales o de compuestos para el diagnóstico por la imagen del tumor.
18. Producto de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ADNc según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 o un vector según la reivindicación 12 para su utilización en el tratamiento del cáncer.
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