EA007838B1

EA007838B1 - Конъюгированные цитокины, используемые для терапии опухолей

Info

Publication number: EA007838B1
Application number: EA200200808A
Authority: EA
Inventors: Анджело Корти
Original assignee: Фондазионе Чентро Сан Раффаэле Дель Монте Табор
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2007-02-27
Also published as: NO20023833D0; SK11512002A3; HK1048649B; SI1255845T1; HUP0300005A2; CZ20023093A3; BG106999A; US20030157055A1; WO2001061017A3; ITMI20000249A0; AU4413501A; ATE424461T1; AU784173B2; ITMI20000249A1; UA85365C2; US20050265965A1; US7150869B2; PL362670A1; IL150984A0; CN1446261A

Abstract

В изобретении описаны конъюгированный продукт, обладающий противоопухолевой активностью, включающий цитокин, выбранный из TNF или IFNγ, и лиганд, содержащий NGR-мотив; кДНК, кодирующая этот конъюгированный продукт, предназначенный для генной терапии вектор, включающий указанную кДНК, а также фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгированного продукта в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Кроме того в ней раскрыто применение конъюгированного продукта для приготовления противоопухолевых лекарственных средств или диагностических агентов и применение кДНК для приготовления лекарственных средств или диагностических агентов, предназначенных для применения в терапии опухоли.

Description

Настоящее изобретение относится к модифицированным цитокинам, предназначенным для применения в терапии рака. Более конкретно изобретение относится к производным цитокинов, которые обладают способностью воздействовать (возвращать в исходное состояние) на сосуды опухоли и антигенпрезентирующие клетки (хоминг-цитокины).

Противоопухолевая активность некоторых цитокинов хорошо известна и описана. Некоторые цитокины уже применяются для лечения, в том числе людей (29). Например, для некоторых цитокинов, таких как интерлейкин-2 (1Ь-2) и интерферон α (ΙΝΡα). выявлена позитивная противоопухолевая активность при лечении пациентов с различными типами опухолей, такими как почечная метастатическая карцинома, лейкемический ретикулез, саркома Капоши, меланома, множественная миелома и т.п. Установлено, что другие цитокины, такие как ΙΕΝβ, фактор некроза опухоли (ΤΝΡ)α, ΤΝΡβ, 1Ь-1, 4, 6, 12, 15 и колониестимулирующие факторы (СБ8), обладают определенной противоопухолевой активностью в отношении некоторых типов опухолей и вследствие этого являются объектом дополнительных исследований.

В целом, терапевтическое применение цитокинов в значительной степени ограничено их системной токсичностью. Для ΤΝΡ, например, первоначально была выявлена способность индуцировать геморрагический некроз некоторых опухолей (1) и его цитотоксическое действие ίη νίίτο на различные линии опухолей (2), однако, затем была обнаружена выраженная противоспалительная активность, которая в случае условий, обеспечивающих сверхпродуктивность, может оказывать вредное воздействие на человеческий организм (3).

Поскольку системная токсичность является основной проблемой при применении фармакологически активных количеств цитокинов для лечения людей, в настоящее время исследуются новые производные и терапевтические стратегии, способствующие снижению токсических воздействий этого класса биологических эффекторов с сохранением их терапевтической эффективности. Некоторые новые подходы включают:

а) создание слитых протеинов, которые могут переносить ΤΝΡ в опухоль и повышать его локальную концентрацию. Например, были созданы слитые протеины, включающие ΤΝΡ и специфические для опухоли антитела (4);

б) создание мутантов ΤΝΡ, которые сохраняют противоопухолевую активность и обладают уменьшенной системной токсичностью. Так, уже созданы мутанты, которые обладают избирательной способностью распознавать только один рецептор (р55 или р75) (5);

в) применение антител к ΤΝΡ, которые обладают способностью снижать некоторые токсические воздействия ΤΝΡ без потери его противоопухолевой активности. Такие антитела уже описаны в литературе (30);

г) применение производных ΤΝΕ, обладающих большим временем полужизни (например, ΤΝΕ, конъюгированных с полиэтиленгликолем).

В настоящее время описано получение производных ΤΝΡ, которые обладают способностью к избирательному направленному переносу к месту расположения опухоли. Например, описан слитый протеин, полученный слиянием гена тяжелой цепи МАт к рецептору трансферрина и гена ΤΝΕ (4), или слитый протеин ΤΝΡ с шарнирной областью моноклонального антитела к опухолеспецифическому антигену ΤΑΟ72 (6) или слитый протеин Ρν-ΤΝΕ (6).

В ЕР 251494 описана система, предназначенная для введения диагностического или терапевтического агента, которая включает антитело, конъюгированное с авидином или стрептавидином, агент, который обладает способностью образовывать комплекс с конъюгированным антителом, и соединение, которое включает диагностический или терапевтический агент, конъюгированный с биотином, их вводят последовательно и с соответствующим запаздыванием так, чтобы посредством взаимодействия биотинстрептавидин позволить локализовать терапевтический или диагностический агент на клетке-мишени, распознаваемой антителом. Описанные терапевтические или диагностические агенты включают хелаты металлов, в частности хелаты радионуклидов и низкомолекулярных противоопухолевых агентов, таких как цис-платин, доксорубицин и т. д.

В ЕР 496074 описан способ, заключающийся в последовательном введении биотинилированного антитела, авидина или стрептавидина и биотинилированного диагностического или терапевтического агента. Хотя в этом документе в качестве примера упоминаются цитотоксические агенты типа рицина, главным образом, описаны соединения, меченные с помощью радиоактивных изотопов.

В АО 95/15979 описан способ локализации высокотоксичных агентов на клеточных мишенях, который предусматривает введение первого конъюгата, который включает специфическую молекулумишень, конъюгированную с лигандом или антилигандом, и последующее введение второго конъюгата, который включает токсический агент, связанный в антилигандом или лигандом.

В АО 99/13329 описан способ направленного переноса молекулы к опухолевым ангиогенным сосудам, основанный на конъюгации указанной молекулы с лигандами рецепторов ΝΟΚ. В качестве возможных кандидатов рассматривался целый ряд молекул, но конкретно описан только доксорубицин. Не описано применение лигандов рецепторов ΝΟΚ в качестве носителей цитокинов с целью индукции иммунных ответов.

- 1 007838

При создании изобретения неожиданно было установлено, что можно существенно улучшить терапевтический индекс некоторых цитокинов и увеличить их иммунотерапевтические свойства путем слияния с лигандом рецептора, такого как аминопептидаза-Ν (ΟΌ13). СЭ13 представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 150 кДа, который обладает высокой консервативностью у различных видов. Он экспрессируется на поверхности здоровых клеток, а также линий клеток миелоидных опухолей, в ангиогенном эндотелии и в некоторой степени является эпителиальным. Рецептор ΟΌ13, как правило, обозначают как ΝΟΚ/'-рецептор, поскольку его пептидные лиганды несут аминокислотный мотив ΝΟΚ.

Таким образом, первым объектом изобретения является конъюгированный продукт, обладающий противоопухолевой активностью, включающий цитокин, выбранный из ΤΝΡ и ΙΕΝγ, и лиганд, содержащий ΝΟΚ-мотив. Этот лиганд может представлять собой лиганд рецептора СЭ13. который выбирают из группы, включающей антитела или их фрагменты, такие как ЕаЬ, Εν, одноцепочечный Εν, пептиды или миметики пептидов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лиганд представляет собой пептид, такой как ΟΝΟΚΟνδΟΟΑΟΒΟ, ΝΟΚΑΗΑ, ΟΝΟΒΟ, циклоСУБ-НСЕМЕС и линейный или циклический ΟΝΟΚΟ ΟΝΟΚΟ. Пептид может быть сшит с цитокином непосредственно или посредством спейсера, который может представлять собой одну аминокислоту, аминокислотную последовательность или органический остаток, такой как б-аминокаприл-Ы-гидроксисукцинимид. Методы создания сшивок таких молекул известны специалистам в данной области и включают методы генной инженерии или химического синтеза.

Пептидный лиганд предпочтительно связывают с Ν-концом цитокина, минимизируя тем самым любое воздействие на связывание модифицированного цитокина с его рецептором. В альтернативном варианте пептид можно связывать с аминокислотными остатками, представляющими собой акцепторы амидо- или карбоксильных связей, которые встречаются в молекуле в естественных условиях или которые искусственно встраивают с помощью методов генной инженерии. Модифицированный цитокин предпочтительно получают с помощью кДНК, включающей примыкающую к 5'-концу последовательность, которая кодирует пептид.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является продукт, полученный в результате конъюгации различных субъединиц ΤΝΕ с лигандом рецептора ΟΌ13, так и либо антителом или его фрагментом, либо с биотином. Более предпочтительно Ν-конец ΤΝΕ связывают с пептидом ΟΝΟΚΟ посредством спейсера Ο (глицин).

С использованием в качестве моделей животных установлено, что образовавшийся продукт (ΝΟΚΤΝΕ) более активен в отношении лимфом КМА-Т, чем ΤΝΕ. Кроме того, животные, обработанные ΝΟΒΤΝΕ, оказались способны отторгать дополнительные онкогенные дозы КМА-Τ- или КМА-клеток. Повышение противоопухолевой активности по сравнению с активностью обычного ΤΝΕ было обнаружено у иммунокомпетентных животных, но не выявлено у животных с иммунодефицитом. Этот факт свидетельствует о том, что повышение противоопухолевой активности ΤΝΕ, конъюгированного с ΝΟΚпептидами, связано с более выраженным иммунным ответом, а не с непосредственной цитотоксической активностью конъюгата.

Было продемонстрировано также, что иммунные ответы, индуцированные ΝΟΚ-ΤΝΕ ίη νίνο, непосредственно связаны с рецептором ΟΌ13. Например, было установлено, что антитело к рецептору ΟΌ13, а также лиганд ΟΝΟΚΟ конкурируют с ΝΟΚ-ΤΝΕ ίη νίνο, что позволяет предположить участие рецептора в механизме направленного переноса при использовании ΝΟΚ-ΤΝΕ.

Терапевтический индекс конъюгатов ΤΝΕ/лиганд ΟΌ13 можно дополнительно повышать путем применения мутантной формы ΤΝΕ, которая обладает способностью избирательно связываться с одним из двух рецепторов ΤΝΕ, т.е. с ρ75ΤΝΕΚ и ρ55ΤΝΕΚ. Такой мутант ΤΝΕ можно получать путем сайтнаправленного мутагеназа (5; 7).

Фармакокинетические свойства модифицированных цитокинов по изобретению можно улучшать путем дериватизации полиэтиленгликольным или ацильным фрагментомпроизводных, что позволяет удлинять период полужизни в плазме самих цитокинов.

Кроме того, объектами изобретения являются кДНК, кодирующая заявленный конъюгированный продукт, предназначенный для генной терапии вектор, включающий указанную кДНК, а также фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество описанного в данной заявке конъюгированного продукта в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Предпочтительно композиция имеет форму инъецируемого раствора, или суспензии, или жидкости для инфузий, наиболее предпочтительно форму липосом.

Еще одним объектом изобретения является применение конъюгированного продукта для приготовления противоопухолевых лекарственных средств или диагностических агентов. Предпочтительно этот продукт можно использовать в сочетании с другими противораковыми или диагностическими агентами, предназначенными для визуализации опухоли.

Так же объектом изобретения является применение кДНК для приготовления лекарственных средств или диагностических агентов, предназначенных для применения в терапии рака, предпочтительно в сочетании с другими противораковыми или диагностическими агентами, предназначенными для

- 2 007838 визуализации опухоли.

Итак, в заявке описаны конъюгированные продукты, в которых цитокины, модифицированные с помощью лиганда СЭ13. дополнительно конъюгируют с антителом или его фрагментом к опухолевому антигену, опухолевому ангиогенному маркеру, например, таким как αν-интегрины, металлопротеазы или сосудистый фактор роста, или с антителом или их фрагментом к компоненту внеклеточного матрикса, такими как антитела к тенасцину или ΕΌΒ-домену фибронектина, или с биотином. Ранее описано получение слитого продукта, включающего ΤΝΕ и шарнирную область МАт к опухолеспецифическому антигену ΤΑΟ72, экспрессируемому аденокарциномой желудка и яичника (6).

Описанные в заявке конъюгаты можно применять в способе предварительного обеспечения направленного переноса в опухоль с использованием системы биотин/авидин. Согласно этому подходу в опухолевом антигенном сайте на разных стадиях создают тройной комплекс, образованный с помощью 1) биотинилированного МАт, 2) авидина (или стрептавидина) и 3) бивалентного цитокина, модифицированного с помощью лиганда СО13 и биотина. В многочисленных публикациях представлены данные о том, что подход, основанный на применении предварительного направленного переноса, по сравнению с общепринятым направленным переносом с использованием иммуноконъюгатов, может в значительной степени повышать соотношение между активными молекулами, достигшими мишени, и свободными активными молекулами, снижая, тем самым, токсичность лечения (11, 10, 9, 8). Этот подход позволил получить очень хорошие результаты при использовании биотинилированного ΤΝΡ, который обладал способностью индуцировать цитотоксичность ίη νίΐτο и снижать рост опухолевых клеток в условиях, когда обычный ΤΝΡ был неактивным (14, 26). Подход, основанный на предварительном направленном переносе, можно осуществлять также с помощью двухстадийной процедуры с использованием биспецифического антитела, которое одновременно связывается с опухолевым антигеном и модифицированным цитокином. Применение биспецифического антитела к карциноэмбриональному антигену и ΤΝΡ в настоящее время описано как средство для предварительного направленного переноса ΤΝΕ в опухоль (31).

Получение молекул ΤΝΡ, в которой различные субъединицы ΤΝΡ конъюгированы как с лигандом СО13, так и с антителом или его фрагментом (прямо или косвенно через мостик биотин-авидин), при этом антитело или его фрагменты направлены к антигену, экспрессирующемуся на поверхности опухолевых клеток, или к другим компонентам стромы опухоли, например тенасцину и ΕΌΒ-домену фибронектина, обеспечивает дополнительное повышение способности модифицированного цитокина воздействовать (возвращать в исходное состояние) на опухоль и замедляет высвобождение цитокина в микросреду опухоли в результате переходов тример-мономер-тример. Как установлено в предыдущих исследованиях, фактически модифицированные субъединицы конъюгатов ΤΝΡ могут диссоциировать из комплексов, предназначенных для направленно переноса, и повторно диссоциировать с образованием немодифицированных тримерных молекул ΤΝΡ, которые далее диффундируют в микросреду опухоли. Установлено, что высвобождение биологически активного ΤΝΡ происходит через 24-48 ч после направленного переноса (21).

Для применения модифицированных цитокинов по изобретению в терапии необходимо получить соответствующие фармацевтические композиции для перорального или парентерального введения. Композиции для парентерального введения являются предпочтительными, и они представляют собой инъецируемые растворы или суспензии и жидкости для инфузий. Для приготовления парентеральных форм эффективное количество действующего вещества растворяют или суспендируют в стерильном носителе, необязательно добавляют эксципиенты, такие как солюбилизаторы, агенты, придающие изотоничность, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы или диспергирующие агенты, и затем расфасовывают в запечатываемые пузырьки или ампулы.

Приготовление цитокинов в форме липосом может повысить их биологическую активность. Так, было установлено, что ацилирование аминогрупп ΤΝΡ приводит к повышению его гидрофобности без потери биологической активности ίη νίίτο. Кроме того, имеются данные о том, что связанный с липидами ΤΝΡ обладает неизмененной цитотоксичностью ίη νίίτο, иммуномодулирующими свойствами и пониженной токсичностью ίη νινο (12, 13).

Максимальная переносимая для людей доза ΤΝΕ при применении в виде болюса составляет 218-410 мкг/м² (32), что примерно в 10 раз ниже эффективной дозы для животных. Основываясь на данных, полученных при использовании в качестве моделей мышей, предсказано, что для достижения противоопухолевых действий для людей дозу необходимо увеличивать по меньшей мере в 10 раз (15). В первом клиническом исследовании при использовании ограниченной перфузии в конечность в условиях повышенных температур установлено, что высокая эффективность достигается при применении одной дозы (4 мг) ΤΝΡ в сочетании с мелфаланом и интерфероном γ (16). В других исследованиях установлено, что интерферон γ может быть исключен и даже еще более низкая доза ΤΝΡ может оказаться достаточной для индуцирования терапевтического действия (17, 18). Поскольку комбинация двух цитокинов обладает синергетическим действием в отношении эндотелиальных клеток, их избирательный направленный перенос, вероятно, должен приводить к более выраженной противоопухолевой активности, что позволяет устранить проблемы, связанные с системной токсичностью, характерные для терапии рака при использо

- 3 007838 вании комбинации этих же цитокинов. Кроме того, известно, что ΤΝΤ может снижать барьерную функцию эндотелиальной выстилки сосудов, повышая, тем самым, их проницаемость для макромолекул. Принимая во внимание преимущество, связанное с низкой токсичностью при лечении модифицированными молекулами ΤΝΕ по изобретению, и их способность воздействовать (возвращать в исходное состояние) на сосуды опухоли, предложен еще один путь их применения для повышения проницаемости сосудов опухоли для других соединений в терапевтических или диагностических целях. Например, модифицированный ΤΝΕ можно применять для повышения проникновения в опухоль меченных радиоактивными изотопами антител или гормонов (визуализирующих опухоль соединений) при радиоиммуносцинтиграфии или радиоиммунотерапии опухолей. В альтернативном варианте можно также увеличивать проникновение химиотерапевтических лекарственных средств, иммунотоксинов, липосом, несущих лекарственные средства или гены, или других противораковых лекарственных средств, в результате чего повышается их противораковая активность. Таким образом, композиции на основе цитокинов по изобретению можно применять вместе, по отдельности или последовательно, а также в сочетании с другими диагностическими или терапевтическими субстанциями, предназначенными для лечения или диагностики рака.

И, наконец, кДНК, кодирующую конъюгированные цитокины по изобретению, можно получать из кДНК цитокинов путем добавления примыкающей к 5'- или З'-концу последовательности ДНК, кодирующей лиганд СЭ13. предпочтительно описанные выше хоминг-пептиды. Комбинированную кДНК можно применять индивидуально или после встраивания в векторы, предназначенные для генной терапии. Получение и терапевтические применения приемлемых векторов известно из литературы (19), публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Описание чертежей

Фиг. 1 - воздействие ΤΝΕ и Ν6Κ.-ΤΝΕ на рост лимфом ΚΜΑ-Τ (а и б) и на вес животных (в и г).

Группы животных, состоящие из 5 особей, обрабатывали однократной дозой ΤΝΤ или Ν6Κ.-ΤΝΕ (внутрибрюшинно, ί.ρ.) через 10 дней после имплантации опухоли. Зависимости площади опухоли от дозы на 14 день (б) и потерю веса после лечения (средние значения для дней 11 и 12) (г) интерполировали с помощью логарифмических кривых. Противоопухолевые действия, вызванные 1 или 9 мкг ΝΟΚΤΝΤ на 14-й день, оказались выше, чем действие аналогичных количеств ΤΝΤ (Р=0,024 и Р=0,032 соответственно), в то время как потеря веса после указанных обработок оказалась аналогичной. Стрелками показаны экстраполированные дозы ΤΝΡ и ΝΟΒ-ΤΝΤ, вызывающие сопоставимые действия.

Фиг. 2 - воздействие МАт К3-63 и СЫСКС на противоопухолевую активность ΝΟΒ-ΤΝΤ (а) и ΤΝΡ (б).

МАт К3-63 или СЫСКС смешивали с ΝΟΚ.-ΤΝΡ или ΤΝΤ и вводили животным, несущим опухоль линии ΚΜΑ-Τ, через 12 дней после имплантации опухоли (п=5 животных/группу). В другом эксперименте (в) ΤΝΡ и ΝΟΚ.-ΤΝΡ вводили совместно с СЫСКС или САКАС (контрольный пептид) животным, несущим 11-дневные опухоли (п=5). Противоопухолевое действие 1 мкг ΝΟΒ-ΤΝΤ оказалось более сильным, чем действие 9 мкг ΤΝΡ (Р=0,009, ΐ-критерий, день 20) и в значительной степени ингибировалось СХСКС (Р=0,035) и МАт К3-63 (Р=0,011).

Фиг. 3 - воздействие ограниченного расщепления трипсином ΝΟΒ-ΤΝΡ и ΤΝΤ на их массу (а) и противоопухолевую активность (б).

Комплекс трипсин-агароза получали путем связывания 1 мг трипсина с 1 мл активированной СН Сефарозы (фирма Ρΐιαηηαοία-υρίοΐιη) согласно инструкциям производителя. ΝΟΒ-ΤΝΡ и ΤΝΤ (по 170 мкг каждого в 300 мкл 0,15М хлорида натрия, 0,05М фосфата натрия, рН 7,3) смешивали с 15 мкл суспензии смолы (1:4) или только буфера и переворачивали вверх-вниз при 37°С в течение определенного времени. Все 4 продукта фильтровали с помощью устройства типа δρίη-Χ (фирма Сойат, Кэмбридж, штат Массачусетс) с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°С до применения.

(а) Масс-спектрометрический анализ на основе электроспрея. Для каждого пика определяли значения молекулярных масс и соответствующие им продукты (Ν-концевые последовательности). Стрелками на последовательностях обозначены сайты расщепления.

(б) Воздействие 1 или 3 мкг ΝΟΒ-ΤΝΡ и ΤΝΤ при инкубации без трипсина (верхние панели) или с трипсином (нижние панели) на рост опухолей линии ΚΜΑ-Τ и вес животных (средние значения ± СКО для групп, обработанных дозами 1 и 3 мкг). Животных обрабатывали через 13 дней после имплантации опухолей (п=5 животных/группу).

Фиг. 4 - ДСН-ПААГ и противоопухолевая активность человеческого ΝΟΒ-ΤΝΤ до и после денатурации/восстановления складчатости.

ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (А) человеческого ΤΝΤ (а) и ΝΟΒ-ΤΝΡ до (б) и после (в) процесса денатурации/восстановления складчатости описан в примере V.

На панели Б показано воздействие ΤΝΡ и нескладчатого ΝΟΒ-ΤΝΡ на рост лимфом ΚΜΑ-Τ, а на панели В - на вес тела. На панели Г показано воздействие человеческого ΤΝΡ, а на панели Д - ΝΟΒ-ΤΝΤ с восстановленной складчатостью (включающего >95% тримеров с дисульфидными мостиками внутри цепи) на рост опухоли. Животных (15 или 5 мышей/группу, что указано для каждой панели) обрабатывали одной дозой ΤΝΤ или ΝΟΒ-ΤΝΡ ί.ρ. через 10 дней после имплантации опухоли.

Ниже изобретение проиллюстрировано с помощью примеров.

Пример I. Получение мышиного ΤΝΡ и Ν6Β-ΤΝΡ.

- 4 007838

Мышиный рекомбинантный ΤΝΡ и Су8-А8и-61у-Агд-Су8-61у-ТМЕ (Ν6Κ-ΤΝΡ) получали путем цитоплазматической экспрессии кДНК в Е. со11. кДНК, кодирующую мышиный Μοΐ-ΤΝΕι.ι₅₆ (20) получали путем полимерной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на основе мРНК, выделенной из стимулированной липополисахаридом клеточной линии моноцитов-макрофагов ВАЭД 264.7, с использованием 5'-СТ66АТССТСАСА6А6СААТ6АТСССААА6-3' и 5'-Т6ССТСАСАТАТ6СТСА6АТСАТ СТТСТС-3' в качестве 3'- и 5'-праймеров.

Амплифицированный фрагмент расщепляли с помощью ΝάοΙ и ВатН1 (фирма Νο\ν Епд1апб Вю1аЬз, Беверли, штат Массачусетс) и клонировали в плазмиде рЕТ-11Ь (фирма Νονα^οη. Мэдисон, Висконсин), предварительно расщепленной этими же ферментами (рЮТ).

кДНК, кодирующую Су8-А8п-61у-Атд-Су8-61у-ТМР_1-156, амплифицировали с помощью ПЦР на основе рЮТ с использованием 5'-6СА6АТСАТАТ6Т6СААС66СС6ТТ6С66ССТСА6АТСАТСТТСТС3' в качестве 5'-праймера и указанного выше З'-праймера. Амплифицированный фрагмент расщепляли и клонировали в плазмиде рЕТ-11Ь, как описано выше, и применяли для трансформации клеток Е. со11 ВБ21(ЭЕ3) (фирма Νονα^οη). Экспрессию Т№ и ΝΟΒ-ЮТ индуцировали изопропил-β-Όтиогалактозидом согласно инструкции производителя плазмиды рЕТ-11Ь. Растворимый ЮТ и ΝΟΒ-ЮТ выделяли из двухлитровых культур путем облучения бактерий ультразвуком в 2 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоте, 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0 с последующим центрифугированием (15000 х д, 20 мин, 4°С). Оба экстракта смешивали с сульфатом аммония (25%-ное насыщение), выдерживали в течение 1 ч при 4°С и дополнительно центрифугировали в описанных выше условиях. Сульфат аммония в супернатантах затем доводили до 65%-ного насыщения, выдерживали в течение 24 ч при 4°С и затем центрифугировали. Каждый дебрис растворяли в 200 мл 1М сульфата аммония, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0 и очищали с помощью основанной на гидрофобном взаимодействии хроматографии на Рйепу1-8ерйатозе 6 Раз! Ε1ον (фирма Рйагтас1а-ир)ойп) (градиентное элюирование, буфер А: 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0, содержащий 1М сульфат аммония; буфер Б: 20% глицерина, 5% метанола, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0). Фракции, содержащие иммунореактивный в отношении ЮТ продукт (что установлено методом Нозернблоттинга) объединяли, подвергали диализу в противотоке 2 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты, 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0 и далее очищали с помощью ионообменной хроматографии на ПЕАЕ-8ерйатозе 6 Раз! Р1о\у (фирма Рйаттас1а-ир)ойп) (градиентное элюирование, буфер А: 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0; буфер Б: 1 мМ хлорид натрия, 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0). Фракции, содержащие ТБ1Е-иммунореактивность, объединяли и очищали гель-фильтрацией на 8ерйасту1-8-300 НВ фирма Рйаттас1а-ир)ойп) с предварительным уравновешиванием и элюировали 150 мМ хлоридом натрия, 50 мМ натрий-фосфтаным буфером, рН 7,3 (ЗФР). Объединяли фракции, соответствующие продуктам с Мг 40000-50000, разделяли на аликвоты и хранили в замороженном состоянии при -20°С. Все растворы, применяемые на хроматографических стадиях, готовили с использованием стерильной и не содержащей эндотоксинов воды (фирма 8а1£, Бергамо, Италия). Конечные выходы составили: 45 мг ЮТ и 34,5 мг ΝΟΒ-ЮТ.

Молекулярную массу очищенных ЮТ и ΝΟΒ-ЮТ оценивали с помощью масс-спектрометрического анализа на основе электроспрея. Содержание протеина измеряли с помощью имеющего в продаже набора для анализа протеина (фирма Р1егсе, Рокфорд, штат Иллинойс). Содержание эндотоксина в ΝΟΡЮТ и ТИР составляло 0,75 ед./мкг и 1,38 ед./мкг соответственно, что установлено с помощью хромогенной пробы с лизатом амебоцитов (БАБ) (фирма ВюЭДЫйакет).

Гель-электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия (ДСН-ПАА) и анализ методом Вестерн-блоттинга осуществляли с использованием 12,5 или 15%-ных полиакриламидных гелей с помощью стандартных методов.

Небольшое количество ЮТ и ΝΟΒ-ЮТ дополнительно очищали с помощью аффинной хроматографии на рецепторе ЮТ р55 (8ТНЕ-Р1)-8ерйаго5е следующим образом: 5 мг рекомбинантного зЮТ-В1 получали согласно описанному ранее методу (22) и связывали с 2 мл активированной СН-сефарозы (Ас11уа!еб-СН-8ерйагозе) (фирма Рйатташа) согласно инструкции производителя. Две различные колонки (каждая объемом 1 мл) интенсивно промывали стерильными и несодержащими эндотоксинов растворами, вносили очищенный ЮТ или ΝΟΒ-ЮТ в ЗФР и осуществляли десорбцию путем градиентного элюирования (1 ч, буфер А: ЗФР; буфер Б: 0,5М хлорид натрий, 0,2М глицин-НС1). Фракции, содержащие антиген ΈΝΕ нейтрализовали и подвергали диализу в противотоке стерильного физиологического раствора. Перед диализом вносили несодержащий эндотоксин человеческий сывороточный альбумин (0,5 мг/мл) для предотвращения адсорбции протеина на мембранах. Содержание ЮТ в каждой фракции оценивали с помощью ЕБ18А и цитолитического анализа.

Невосстанавливающий ДСН-ПААГ ЮТ показал наличие одной полосы, соответствующей 17-18 кДа, характерной для мономерного ЮТ (данные не приведены). В противоположность этому при анализе ΝΟΒ-ЮТ с помощью невосстанавливающего ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга выявлены различные иммунореактивные формы с молекулярной массой 18, 36 и 50 кДа, соответствующие мономерам, димерам и тримерам. В восстанавливающих условиях большая часть полос, соответствующих 50 и 36 кДа, превращалась в форму с молекулярной массой 18 кДа, что свидетельствует о наличии молекул ΝΟΒ-ЮТ с дисульфидными мостиками между цепями. На долю полосы, соответствующей 18 кДа, приходилось примерно 2/3 общего продукта, в то время как на долю 36 кДа приходилась большая часть остального

- 5 007838 продукта. Эти электрофоретические схемы позволяют предположить, что ΝΟΚ-ΤΝΕ представляет собой смесь тримеров, состоящих из трех мономерных субъединиц с правильными дисульфидными мостиками внутри цепи (по меньшей мере 50%), а оставшаяся часть, в основном, представлена тримерами с одним или несколькими дисульфидными мостиками между цепями. Сохранение полосы 36 кДа при применении восстанавливающего ДСН-ПААГ позволяет предположить, что ΝΟΚ-ΤΝΕ также содержит необратимо денатурированный димер (примерно 10% от общего количества).

По данным масс-спектрометрии на основе электроспрея молекулярная масса мономеров ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ составила 17386,1±2,0 Да и 17843,7±2,5 Да соответственно. Эти величины очень хорошо соответствуют ожидаемой массе МеЫКЕм^ (17386,7 Да) и ΟΝ6ΚΟ-ΤΝΕι_-ι₅₆ (17844,2 Да).

Пример II. Цитотоксическая активность ίη νίΐτο мышиных ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ.

Биологическую активность ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ оценивали с помощью стандартного цитолитического анализа, основанного на использовании мышиных фибробластов линии Ь-М (ΛΤΕΕ ССИ1.2), согласно описанному ранее методу (23). Цитолитическую активность ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ в отношении клеток линии КМЛ-Τ тестировали в присутствии 30 нг/мл актиномицина И. Каждый образец анализировали с дублированием в трех различных разведениях. Результаты выражали в виде среднего значения ± СКО, полученного по 2-3 независимым анализам.

Цитотоксическая активность ίη νίΐτο при оценке ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ стандартным цитолитическим анализом с использованием Ь-М-клеток составила (1,2±0,14) х 10⁸ ед./мг и (1,8±0,7)х10⁸ ед./мг соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том, что фрагменты СЫСКСС в молекуле ΝΟΚ-ΤΝΕ не препятствуют образованию складок, олигомеризации и связыванию с рецепторами ΤΝΕ.

В предыдущем исследовании установлено, что клетки линии ΚΜΑ-Τ можно уничтожать с помощью ΤΝΕ в присутствии 30 нг/мл актиномицина И, однако, в отсутствие ингибиторов транскрипции эти клетки устойчивы к ΤΝΕ даже после нескольких дней инкубации. Цитотоксическая активность ΝΟΚ-ΤΝΕ ίη νίΐτο в отношении клеток линии ΚΜΑ-Τ в присутствии актиномицина И составила (1,4±0,8)х10⁸ ед./мг, эти исследования проводились с использованием ΤΝΕ ((1,2±0,14)х10 ед./мг) в качестве стандарта. Таким образом, цитотоксические активности ΝΟΚ-ΤΝΕ и ΤΝΕ оказались аналогичными как в отношении Ь-М-, так и в отношении КМА-Е-клеток.

Пример III. Характеристика терапевтической и токсической активности мышиных ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ.

Индуцированную вирусом ΚαιΐδΙκΓ лимфому ΚΜΑ, полученную в мышах линии С57ВИ/6, поддерживали ίη νίΐτο в среде ΚΡΜI 1640, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В, 2 мМ глутамин и 50 мкМ 2меркаптоэтанол. ΚΜΑ-Τ получали из клеток линии ΚΜΑ путем трансфекции конструкцией, кодирующей аллель Τΐιν 1.1 и культивировали согласно описанному ранее методу (14).

Клетки меланомы Β16Ε1 культивировали в среде ΚΡΜI 1640, содержащей 5% ФБС, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В, 2 мМ глутамин, 1% содержащей незаменимые аминокислотами среды МЕМ (фирма Вю\У1Ш1акег Еигоре, Вервиерс, Бельгия).

Опыты ίη νΐνο на модельных животных были разрешены комитетом по этике научного института Сан Раффаэля (Е11иса1 СотпиНее οί Фе 8аи ΚαίαοΕ Н ЗОеаиНс ШвйШе) и их осуществляли согласно установленным правилам. Мышей линии С57ВИ/6 (Сйат1е8 ΚΚόγ ^аЬο^аΐο^^е8, Калко, Италия) (16-18 г) подвергали контрольному заражению, используя 5х10⁴ живых клеток ΚΜΑ-Τ или Β16Ε1 соответственно, подкожно (з.с.) в левый бок. Через 10-12 дней после имплантации опухоли мышей обрабатывали 250 мкл (ί.ρ.) растворов ΤΝΕ или ΝΟΚ-ΤΝΕ, разведенных несодержащим эндотоксина 0,9%-ным хлоридом натрия.

С помощью предварительных экспериментов было установлено, что противоопухолевая активность не изменяется при добавлении к растворам ΤΝΕ и ΝΟΚ-ΤΝΕ человеческого сывороточного альбумина в качестве носителя. Для каждого эксперимента использовали по 5 мышей на группу. Рост опухоли оценивали ежедневно, измеряя размер опухоли с помощью кронциркуля. Площадь опухоли рассчитывали как г1хг2, а объем опухоли как г1х2 хг3х4/3, где г1 и г2 обозначают продольный и поперечный радиусы, а г3 обозначает толщину опухолей, выступающих над поверхностью здоровой кожи. Животных умерщвляли до того, как опухоли достигали 1,0-1,3 см в диаметре. Размеры опухолей представлены в виде среднего значения ± СКО (5-10 животных в группе, что указано в надписях на чертежах), сравнение проводили с использованием ΐ-критерия.

Противораковую активность и токсичность ΝΟΚ-ΤΝΕ сравнивали с указанными характеристиками ΤΝΕ, используя модели ΚΜΑ-Τ-лимфомы и Β16Ε1- меланомы на мышах линии С57ВИ/6. Поскольку модель ΚΜΑ-Τ ранее была охарактеризована и применялась для изучения противоопухолевой активности ΤΝΕ с использованием различных протоколов направленного переноса (26), то эта модель также была использована в данном исследовании.

Введение мышиного ΤΝΕ животным, несущим созданные путем подкожной имплантации ΚΜΑ-Τопухоли, через 24 ч приводило к снижению массы опухоли и к геморрагическому некрозу центральной части опухоли с последующим заметным замедлением роста через несколько дней (26). Однократная обработка ΤΝΕ даже в дозе, близкой к величине ИИ₅₀, не приводила к полному регрессу опухоли указан

- 6 007838 ного типа, поскольку живые клетки, сохранившиеся вокруг области некроза, возобновляли рост через несколько дней после обработки.

При создании изобретения в первой серии экспериментов оценивали воздействие различных доз (ί.ρ.) ΤΝΡ и ΝΟΚ-ΤΝΡ на выживаемость животных. Для того чтобы избежать избыточных страданий животных, их умерщвляли, когда диаметр опухоли превышал 1-1,3 см. Летальное действие ΤΝΡ и ΝΟΚΤΝΡ через 3 дня после обработки оказалось аналогичным (ЬП₅₀ 60 и 45 мкг соответственно), в то время как противоопухолевая активность существенно различалась (табл. 1).

Таблица 1

Выживаемость мышей с ΚΜΑ-Τ-лимфомой, обработанных ΤΝΡ или ΝΟΚ-ΤΝΡ

Обработка	Животные (п)	Доза (мкг)	Процент выживших животных'	после обработки
			день	день	день	день	день	день	день	день
			3	7	14	21	30	38 (2е заражение)⁶	62 (3е заражение)⁶	92
нет	18	0	100	0
ΤΝΡ	4	1	100	20	0
	9	3	100	55	0
	9	9	100	55	22	11	0
	14	27	100	57	14	7	0
	9	54	55	55	0
	9	108	0
ΝΟΚΤΝΡ	10	1	100	70	10	10	10	0
	10	3	100	80	20	20	20	0
	9	9	100	88	55	22	11	11	И
	13	27	100	85	30	23	15	15	15	11
	9	54	33	33	0	23				15
	9	108	0

^а Животных, несущих опухоль, обрабатывали ΤΝΡ или ΝΟΚ-ΤΝΡ (ί.ρ.) на 10 день после имплантации опухоли. Животных умерщвляли, когда диаметр опухоли превышал 1-1,3 см.

^б Выживших животных повторно заражали 50000 ΚΜΑ-Τ-клеток (второе заражение) или 50000 ΚΜΑ (третье заражение) в указанные моменты времени. Онкогенность инъецируемых клеток оценивали в каждый момент времени с использованием 5 здоровых животных. У всех контрольных животных опухоль развилась в течение 10 дней (данные не приведены).

Например, обработка 1 или 3 мкг ΝΟΚ-ΤΝΡ замедляла рост опухоли более эффективно, чем обработка с помощью 27 мкг ΤΝΡ, что свидетельствует о том, что активность ΝΟΚ-ΤΝΡ выше, по меньшей мере, на порядок. Интересно отметить, что некоторые животные оказались исцеленными при использовании доз ΝΟΚ-ΤΝΡ более низких, чем значение ЬП₅₀, в то время, как ни одно из всех животных не было исцелено при использовании ΤΝΡ. Вылечившихся животных повторно заражали путем инъекции онкогенными дозами либо клеток ΚΜΑ-Τ, либо ΚΜΑ дикого типа, предполагая, что однократная обработка ΝΟΚ-ΤΝΡ может индуцировать защитный иммунитет. Следует отметить, что увеличение доз ΤΝΡ или ΝΟΚ-ΤΝΡ выше 9-27 мкг приводило к заметному повышению токсичности и незначительно увеличивало терапевтическую активность или не увеличивало ее вообще.

Снижение веса в результате обработки ΤΝΡ является хорошо известным симптомом системной токсичности (26). Поэтому для дополнительного сравнения соотношения эффективности/токсичности ΤΝΡ и ΝΟΚ-ΤΝΡ оценивали рост опухоли и вес животных после лечения. Воздействие 1 мкг ΝΟΚ-ΤΝΡ на рост

- 7 007838 опухоли оказалось таким же или более эффективным, чем воздействие 9 мкг ΤΝΡ (фиг. 1а), в то время как потеря веса через 1-2 дня после обработки соответствовало потери веса при использовании 1 мкг ΤΝΡ (фиг. 1в). При интерполяции данных с использованием логарифмической кривой зависимости реакции от дозы было установлено, что терапевтическое действие, соответствующе действию 9 мкг ΤΝΡ на 14-ый день, можно получить при использовании дозы Ν6Κ-ΤΝΕ всего лишь 0,6 мкг (фиг. 1б). В противоположность этому для получения сопоставимого токсического действия необходимо 8,5 мкг (фиг. 1г). Таким образом, в этих условиях рассчитанное соотношение эффективности/токсичности Ν6Κ-ΤΝΕ в 14 выше, чем этот показатель для ΤΝΡ.

Аналогичные результаты были получены при использовании модели меланомы Β16Ρ1. Обработка 1 мкг ΝΟΚ.-ΤΝΒ в день 11 и день 17 индуцировала более выраженное противоопухолевое действие на 19-й день, чем обработка 4 мкг ΤΝΡ и приводила к аналогичному действию, полученному при использовании 12 мкг ΤΝΡ (данные не приведены). В противоположность этому потеря веса, вызванная 1 мкг ΝΟΚ.-ΤΝΒ, оказалось существенно ниже, чем потеря веса, вызванная 4 и 12 мкг ΤΝΡ. Обработка 12 мкг ΝΟΚ.-ΤΝΒ вызывала еще более выраженное противоопухолевой действие, при этом токсическое действие соответствовало токсическому действию 12 мкг ΤΝΡ.

При введении на 19-й день третьей инъекции некоторые животные во всех группах погибли через 12 дня (2 из 5 в группе, обработанной физиологическим раствором и 12 мкг ΝΟΚ.-ΤΝΒ, и 1 из 5 в остальных группах). Следует отметить, что у одного животного, обработанного 12 мкг ΝΟΚ.-ΤΝΒ, наблюдали полное отторжение опухоли. Когда животных подвергали заражению второй онкогенной дозой клеток линии Β16Ρ1, то обнаруживаемая пальпацией опухоль развилась через 18 дней, в то время как у контрольных животных опухоль развилась через 6-7 дней.

Эти результаты, в целом, позволяют предположить, что эффективность ΝΟΚ.-ΤΝΡ в отношении ингибирования роста опухоли в 10-15 раз выше, чем эффективность ΤΝΡ, а токсичность является аналогичной. Кроме того, ΝΟΚ.-ΤΝΡ может индуцировать защитные иммунные реакции более эффективно, чем ΤΝΡ.

Пример IV. Механизм действия ΝΟΚ.-ΤΝΡ.

МАт к мышиному СО 13, т.е. К.3-63, выделяли из асцитической жидкости с помощью хроматографии на протеин-О-сефарозе (фирма Рйаттас1а-ир)ойп, Уппсала, Швеция) и подвергали диализу в противотоке 0,9%-ного раствора хлорида натрия.

Кроличью поликлональную антисыворотку получали от фирмы Ришт 5г1 (Милан, Италия) и очищали аффинной хроматографией на протеин-А-сефарозе (фирма Рйагтас1а-ир)ойп). Пептиды СИОКС и САКАС получали согласно описанному ранее методу (28).

Для доказательства того, что повышенная активность ΝΟΚ-ΤΝΡ связана с направленным переносом в опухоль, опосредованным фрагментом ΝΟΚ, был изучен вопрос о том, может ли активность ΝΟΚ-ΤΝΡ ίη νίνο частично конкурировать с СЫОКС. Для этой цели мышам, несущим опухоль КМА-Τ, вводили ΝΟΚ-ΤΝΡ (1 мкг) с добавлением молярного избытка СЫОКС или без него. В параллельных опытах других животных обрабатывали ΤΝΡ (3 или 9 мкг) и этом случае с добавлением ί,'ΝΟΚί.' или без него. Как и ожидалось, присутствие ί,'ΝΟΚί.' в значительной степени снижало противоопухолевую активность ΝΟΚΤΝΡ (фиг. 2а), но не влияло на активность ΤΝΡ (фиг. 2б). В противоположность этому, контрольный пептид САКАС не вызывал заметного снижения активности ΝΟΚ-ΤΝΡ (фиг. 2в). Эти результаты позволят предположить, что СЫОКС конкурирует за связывание ΝΟ^Τ^ с рецептором СЫОКС и подтверждает гипотезу о механизме направленного переноса, обуславливающего повышение активности. Следует отметить, что СЫОКС не обладает способностью снижать цитотоксическое действие ΝΟ^ΤΝΡ ίη νίίτο (данные не приведены).

Поскольку к настоящему времени известно, что аминопептидаза Ν (СО13) является рецептором пептидов СЫОКС, далее был изучен вклад этого рецептора в механизм направленного переноса ЦОКЮТ. Для этой цели изучено воздействие МАт к мышиному СО13 (К3-63) на противоопухолевую активность ΝΟΡ-ΤΝΡ и ΤΝΡ. МАт К3-63 в значительной степени ингибировало противоопухолевую активность ΝΟΡ-ΤΝΡ (фиг. 2а), но не влияло на активность ΤΝΡ (фиг. 2б), что свидетельствует о том, что СО13 действительно имеет решающее значение для проявления противоопухолевой активности КОКЮТ. С помощью ΡАС8-анализа (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) клеток, культивируемых в присутствии МАт К3-63 (данные не представлены) не выявлено экспрессии СО13 на поверхности клеток КМА-Τ, что позволяет предположить, что ίη νίνο антителом распознаются другие клетки.

Хотя приведенные данные свидетельствуют о том, что СО13 представляет собой важный рецептор для НОК-ЮТ, нельзя полностью исключить, что связывание с другими, еще не обнаруженными рецепторами ΝΟΡ. также играет роль (хотя и в меньшей степени) в механизм направленного переноса.

С помощью предварительных экспериментов по оценке частичного протеолиза установлено, что связь Агд-8ег в Ν-концевом сегменте ΤΝΡ (остатки 2-3) очень чувствительна к действию трипсина, в то время как остальная часть молекулы существенно более устойчива. Так, для получения дальнейшего доказательства того, что повышенная активность NΟΚ-ΤNΡ связана с его NΟΚ-фрагметом, была предпринята попытка отщепить NΟΚ-домен от Ν-концевой области мутеина путем частичного расщепления с помощью иммобилизованного трипсина. Эта обработка привела к превращению как NΟΚ-ΤNΡ, так и

- 8 007838

ΤΝΕ в молекулу, соответствующую ТХЕ3-15б-фрагменту (ожидаемая масса 16986,2 Да; данные о измеренной массе и ожидаемых последовательностях см. на фиг. 3а).

Хотя расщепление не понизило цитолитическую активность ίη νίίτο Ν6Κ-ΤΝΕ в отношении Ь-Мклеток (2,3±1,4)х10⁸ ед./мг), его противоопухолевая активность снизилась до уровня ΤΝΕ (фиг. 3б). Следует отметить, что токсичность Ν&Κ-ΤΝΕ была такой же, что и токсичность ΤΝΕ как до, так и после расщепления, что следует из данных о потере веса животных через 1 день после обработки (фиг. 3б, правая панель), что позволяет предположить, что связанный с ΝΟΚ. механизм направленного переноса не приводит к изменению токсичности.

Пример V. Получение и характеристики человеческих ΤΝΕ и ЫСК-ΤΝΕ.

Человеческие рекомбинантные ΤΝΕ и ЫСК-ΤΝΕ (включающий человеческий ΤΝΕ1-157, слитый с С-концом СЛСКСС) получали методом рекомбинантной ДНК и очищали в целом согласно методу, описанному для мышиных ΤΝΕ и Ν6Κ-ΤΝΕ. кДНК, кодирующую человеческий ΝϋΚ-ΤΝΕ, получали с помощью ПЦР с использованием плазмиды ρΕΤ11Β/ΗΤΝΡ, содержащей кодирующую последовательность 11ΤΝΕ (33), с помощью следующих праймеров:

Ν6Κ-ΗΤΝΡ/1 (смысловой): 5'-А ΤΑΤ βΑΤΑΤΟ Τ66 ААС ССС 6Τ Τ6С ССС ОТС АСА ТСА ΤСάΤ ЮТ СС 3',

Ν6Κ-ΗΤΝΕ/2 (антисмысловой): 5'-ТСА ССА ТСС ТСА САС ССС ΑΑΤ СΑΤ ССС ААА ОТА САС-3'.

Амплифицированный фрагмент расщепляли и клонировали в рЕТ-11Ь (К6е1/ВашН1) и применяли для трансформации клеток Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3) (фирма №\^гадеп). Экспрессию Ν6Κ-ΗΤΝΕ индуцировали изопропил-Р-Э-тиогалактозидом согласно инструкции производителя плазмиды ρΕΤ11Ь. Растворимый Ν6Κ-ΤΝΕ выделяли из 2-литровых культур путем облучения бактерий ультразвуком в 2 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоте, 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0 с последующим центрифугированием (15000 х д, 20 мин, 4°С).

Экстракт смешивали с сульфатом аммония (35%-ное насыщение), выдерживали в течение 1 ч при 4°С и дополнительно центрифугировали в описанных выше условиях. Затем сульфат аммония в супернатантах доводили до 65%-ного насыщения, выдерживали в течение 24 ч при 4°С, после чего центрифугировали. Каждый дебрис растворяли в 1М сульфате аммония, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0 и очищали с помощью основанной на гидрофобном взаимодействии хроматографии на Рйепу1-8ерйато8е 6 Еа§1 Ε1ο_Α (фирма Р11агтас1а-ир]о1ш) (градиентное элюирование, буфер А: 100 мМ фосфат натрия, рН 8,0, содержащий 1М сульфат аммония; буфер Б: 70% этиленгликоля, 5% метанола, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0). Фракции, содержащие иммунореактивный в отношении 1ΤΝΕ продукт (что установлено методом ЕЫ8А), объединяли, подвергали диализу в противотоке 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0 и далее очищали с помощью ионообменной хроматографии на ЭЕАЕ-8ер11аго5е Еа§1 Е1о_А (фирма Р11агтас1а-ир]о1ш) (градиентное элюирование, буфер А: 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0; буфер Б: 1 мМ хлорид натрия, 20 мМ Трис-НС1, рН 8,0). Все растворы, применяемые на хроматографических стадиях, готовили с использованием стерильной и не содержащей эндотоксинов воде (фирма 8а1Г, Бергамо, Италия).

Этим методом из 2-литровых культур получали примерно 30 мг ΤΝΕ и 32 мг Ν&Κ-ΤΝΕ. Невосстанавливающий ДСН-ПААГ показал наличие полос, соответствующих мономерам, димерам и тримерам, что позволяет предположить, что человеческий Ν6Κ-ΤΝΕ также представляет собой смесь тримеров, несущих правильные дисульфидные мостики внутри цепи, и тримеров с одним или несколькими дисульфидными мостиками между цепями (фиг. 4А, полоса б), что ранее установлено для мышиного Ν6ΚΤΝΕ.

Тримеры с правильными дисульфидными мостиками внутри цепи выделяли из этой смеси с помощью следующего четырехстадийного процесса денатурации-восстановления складчатости: очищенный человеческий Ν6Κ-ΤΝΕ денатурировали 7М мочевиной и подвергали гель-фильтрации с использованием колонки типа НК 8ерНасгу1 8-300 (объем 1025 мл) (фирма Рйатташа), предварительно уравновешенной 7М мочевиной, 100 мМ Трис-НС1, рН 8,0. Фракции, соответствующие мономерному ΤΝΕ, объединяли, подвергали ультрафильтрации через мембрану типа ΥΜ М^СО, 10 кДа (фирма Аткоп) и восстанавливали складчатость путем диализа в противотоке 33 объемов 2,33М мочевины, 100 мМ Трис-НС1, рН 8 при 4°С (140 мин), а затем 1,55М мочевины, 100 мМ Трис-НС1, рН 8 (140 мин) и 1М мочевины, 100 мМ Трис-НС1, рН 8 (140 мин). И наконец, продукт подвергали диализу в противотоке 80 объемов 100 мМ Трис-НС1 (16 ч), центрифугировали при 13000 х д (30 мин), фильтровали через мембрану типа 8ΕСΑ, 045 мкм (фирма №11депе) и подвергали гель-фильтрации с использованием колонки типа НК 8ер1асгу1 8-300 (объем 1020 мл), предварительно уравновешенной 0,15М хлоридом натрия, 0,05М фосфатом натрия (ЗФР). Получали примерно 23 мг протеина с восстановленной складчатостью.

По данным невосстанавливающего ДСН-ПААГ (фиг. 4А, полоса в) конечный продукт, в основном, являлся мономерным, по данным аналитической гель-фильтрации ЖХВР на колонке типа 8ирет6ех 75 НК (данные не приведены) имел гидродинамический объем, аналогичный объему тримерного человеческого ΤΝΕ, и по данным масс-спектрометрического анализа на основе электроспрея имел молекулярную массу 17937,8±1,8 Да (ожидаемую для СNСКСС-ΤNΕ1-157, 17939,4 Да). Цитотоксическая активность ίη νίΙΐΌ в отношении мышиных Ь-М-клеток нескладчатого и складчатого Ν6Κ-ΤΝΕ составила

- 9 007838 (6,11х107)+4,9 и (5,09х107)+0,3 ед./мг соответственно, а очищенного человеческого ΤΝΡ-(5,45χ107)+3,1 ед./мг. Эти результаты позволяют предположить, что процесс денатурации-восстановления складчатости не влияет на взаимодействие человеческого ΝΟΚ-ΤΝΡ с мышиным рецептором р55.

Противоопухолевая активность ίη νίνο 1 мкг человеческого ΝΟΚ-ΤΝΡ (с невосстановленной складчатостью) оказалась выше, чем активность 10 мкг ΤΝΡ (фиг. 4Б), в то время как токсичность, оцененная по потере веса животных, оказалась значительно более низкой (фиг. 4В). Оказалось, что после восстановления складчатости 0,3 мкг ΝΟΚ-ΤΝΡ оказалось достаточно для индукции противоопухолевой активности более высокой, чем активность, достигаемая при использовании 10 мкг ΤΝΡ (фиг. 4Г, 4Д).

Эти результаты свидетельствуют о том, что противоопухолевая активность человеческого ΝΟΚΤΝΡ выше, чем человеческого ΤΝΡ.

Кроме того, было установлено, что человеческий и мышиный ΝΟΚ-ΤΝΡ с восстановленной складчатостью могут индуцировать выраженную противоопухолевую активность в отношении мышей, несущих ΚΜΑ-Τ, даже в очень низких дозах (1-10 нг/мышь) без проявления токсических действий, в то время как ΤΝΡ в этих дозах не обладает выраженной активностью (данные не приведены).

Пример VI. Получение и характеристики мышиного ΝΟΚ-ΙΡΝγ.

Рекомбинантный мышиный интерферон (ΙΡΝ) γ, слитый с ΟΝΟΚΟΟ (ΝΟΚ-ΙΡΝγ) получали методом рекомбинантной ДНК, в целом, согласно методу, описанному для ΝΟΚ-ΤΝΡ. ΟΝΟΚΟ-домен сливали с Сконцом ΙΡΝγ. Кроме того, цистеин в положении 134 заменяли серином; для экспрессии в клетках Е. οοΐί метионин интродуцировали с положение -1. Для получения кДНК ΝΟΚ-ΙΡΝγ применяли следующие ПЦР-праймеры: 5'-А ТАТ СТА ΟΑΤ ΑΤΟ САС ΟΟС АСА ΟΤС ΑΤΤ ΟΑΑ ΑΟС С (смысловой) и 5'-ТС ΟΟΑ ТСС ТСА ΟСΑ ΑΟ3 ССС ΟΤΤ ΟСΑ ССС ΟΟΑ Ο(Ο ΑСΤ ССТ ΤΤΤ ССС ОТ ССТ ΟΑΟ ΟΟ кДНК клонировали в рЕТ-11Ь (НбеКБатШ) и применяли для трансформации клеток Е. οοΐί ΒΕ21(ΌΕ3) (фирма Νονα^η). Экспрессию протеина индуцировали изопропил-Р-Э-тиогалактозидом согласно инструкции производителя плазмиды рЕТ11Ь. Продукт выделяли из экстрактов Е. οοΐί иммуноаффинной хроматографией, используя МАт к мышиному ΝΟΚ-ΙΡΝγ (ΑΝ18), иммобилизованный на агарозе согласно общепринятым методикам. Восстанавливающий и невосстанавливающий ДСН-ПААГ конечного продукта показал наличие одной полосы, соответствующей 16 кДа. С помощью масс-спектрометрического анализа на основе электроспрея установлено, что молекулярная масса составляет 16223+3,6 Да (ожидаемая 1625,5 Да), что соответствует мышиному Μеΐ-IΡNγ1-134(С134§)СNΟΚС (ΝΟΚ-ΙΡΝγ).

Способность ΝΟΚ-ΙΡΝγ и ΝΟΚ-ΤΝΡ конкурировать с антителом к СЭ13 за связывание с сосудами опухоли оценивали с помощью иммуногистохимического анализа.

Свежие полученные хирургическим путем образцы клеток карциномы почки человека получали из отделения гистопалогии научно-исследовательского института Сан-Раффаэля (ΗΕίοραΙΙιοΙοβν Эераг1теп1 οί 1Не Бап ΚαΗ^Ε Н Бшепййс !п811(и1е). Готовили срезы (толщиной 5-6 мкм) фиксированных по Боуину (4-5 ч) залитых в парафин образцов и наносили на покрытые полилизином предметные стекла. Антиген СЭ13 выявляли с использованием комплекса авидин-биотин, следующим методом: срезы ткани повторно гидрировали с помощью ксилолов и ступенчато изменяющихся серийных разведений спирта согласно стандартным методикам. Срезы ткани помещали в сосуд, содержащий 1мМ ЭДТК, и кипятили в течение 7 мин, используя микроволновую печь (1000 В). Затем в сосуд вновь вносили 1 мМ ЭДТК и кипятили в течение 5 мин. Срезам ткани давали охладиться и инкубировали в ЗФР, содержащем 0,3% перекиси водорода, в течение 15 мин для подавления эндогенной пероксидазы. Затем образцы промывали ЗФР и инкубировали с 100-200 мкл ЗФР-БСА (1 ч при комнатой температуре), а затем инкубировали только с МАт \УМ15 (к ЙСЭ13) или также с различными конкурентами (см. табл. 2) в ЗФР-БСА (в течение ночи при 4°С). Затем предметные стекла промывали трижды (каждый раз по 3 мин) ЗФР и инкубировали с ЗФР-БСА, содержащим 2% нормальной лошадиной сыворотки (ЗФР-БСА-ΝΗδ) (фирма Vесΐο^ ^аЬο^аΐοпез, Бурлингам, штат Калифорния) в течение 5 мин. Затем раствор заменяли раствором, содержащим 3 мкг/мл биотинилированного лошадиного антимышиного ΙβΟ (Н+Ь) (фирма Vесΐο^ ^аЬο^аΐο^^ез, Бурлингам, штат Калифорния) в ЗФР-БСА-ΝΗδ и далее инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Предметные стекла вновь промывали и инкубировали в течение 30 мин с реагентом Vесΐазΐаш Е1йе (фирма Vесΐο^ БаЮгаЮпез, Бурлингам, штат Калифорния), разбавленным в соотношении 1:100 ЗФР. Затем таблетку 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида (фирма Мегск, Дармштадт, Германия) растворяли в 10 мл деионизированной воды, содержащей 0,03% перекиси водорода, фильтровали через мембрану с размером пор 0,2 мкм и наносили на срезы ткани на 5-10 мин. Затем предметные стекла промывали, как описано выше и подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином Гарриса. Связанные с опухолью сосуды выявляли окрашиванием серийных срезов ткани с помощью МАт к СЭ31 (МАт ΙΟ/70Α, антитело к человеческому СЭ31. Ι§Ο1, фирма ΌΑΚΟ, Копенгаген, Дания).

Полученные результаты обобщены в табл. 2. Как видно из таблицы, связывание \УМ15 с сосудами опухоли ингибировалось избытком ΝΟΚ-ΤΝΡ, ΝΟΚ-ΙΡΝγ и СNΟΚС, но не ингибировалось другими реагентами, применяемыми в качестве контроля, у которых отсутствовал мотив ΝΟΚ. Это позволяет предположить, что сайт связывания ΝΟΚ на СЭ13 стерически перекрывается с эпитопом \УМ15. В противоположность этому ΝΟΚ-ΤΝΡ не может конкурировать с 13С03 за связывание с эпителиальными клетка

- 10 007838 ми.

Отсюда можно заключить, что фрагмент ΝΟΚ в ΝΟΚ-ΙΕΝγ и ΝΟΡ.-ΤΝΕ может взаимодействовать с формой ΟΌ13, распознаваемой МАт УМ15 сосудов, связанных с опухолью. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что мотив ΟΝΟΚΟ является функционально активным, когда он связан как с Νконцом, так и с С-концом цитокина.

Таблица 2 Связывание \УМ15 с клетками срезов рака почки в присутствии различных конкурентов

Конкурент ^а	Связывание УМ15 с сосудами опухоли ^б
Нет	+
ΝΟΡ-ΤΝΕ (25 мкг/мл)	-
ΧΟΗ-ΙΕΧγ (50 мкг/мл)	-
СХО1НС (100 мкг/мл)	-
ΤΝΕ (25 мкг/мл)	+
Человеческий сывороточный альбумин (25 мкг/мл)	+
Синтетический пептид СдА(60-68) (100 мкг/мл) ^в	+

^а Конкурент в ЗФР, содержащем 2% БСА, добавляли на стадии блокады и смешивали с первичным антителом.

^б МАт УМ15 (антитело к человеческому ΟΌ 13, 1§О1) получали от фирмы Рйаттшдеп (Сан Диего, штат Калифорния).

^в Синтетический пептид СдА(60-68) соответствует хромогранину А, фрагмент 60-68.

Пример VII. Направленный перенос биотинилированного ΝΟΡ.-ΤΝΕ в опухоли с использованием противоопухолевых антител и авидина (предварительный направленный перенос).

Ниже в примере проиллюстрирована возможность двухэтапного направленного переноса ΤΝΡ, основанного на использовании комбинации хоминг-антитела опухоли и пептида ί,'ΝΟΒί.'.

Конъюгат биотин-ΝΟΚ-ΤΝΡ получали, смешивая ΝΟΡ.-ΤΝΕ с Ν-гидроксисукцинимидиновым эфиром О-биотинил-6-аминокапроновой кислоты (фирма 8ос1е(а РгобоШ ΑηΙίΗίοΙίοί 8.р.А., Милан, Италия) в 1М натрий-карбонатном буфере, рН 6,8 (3 ч при комнатной температуре) (21). Реакцию блокировали, добавляя 1М Трис-НС1, рН 7,5.

Конъюгат характеризовали с помощью масс-спектрометрии, и было установлено, что он содержит (в среднем) 1 молекулу биотина на тример. Затем мышей линии С57ВБ (фирма Сйаг1ек Ктует ЕаЬота(о(1ек, Калко, Италия) подвергали контрольному заражению живыми клетками линии КМА-Τ (5х10⁴), к.с. в левый бок. Когда площадь опухоли достигала 40 мм², мышам последовательно путем инъекций вводили биотинилированное антитело, авидины и биотин-ΤΝΡ согласно описанному ранее трехдневному протоколу (26). Для инъекций использовали: 40 мкг комплекса биотин-МАт 19Е12 (1.р., стадия I), 60 мкг авидина и 60 мкг стрептавидина спустя 18 и 19 ч соответственно (1.р., стадия II), 3 мкг комплекса биотинΝΟΡ.-ΤΝΕ, через 24 ч (1.р., стадия III). Каждый компонент растворяли в стерильном 0,9%-ном растворе хлорида натрия. В контрольном эксперименте не применяли авидин и стрептавидин. Каждый эксперимент осуществляли, используя по 5 мышей/группу. Рост опухоли оценивали ежедневно, измеряя размер опухоли с помощью кронциркуля. Площади опухолей до обработки и через 10 дней после обработки составляли 39±4 и 8±5 мм² соответственно в группе, обработанной МАт 19Е12-биотин/авидин/ стрептавидин/биотин-НОК-ТНЕ (5 животных, среднее значение ± СКО). В контрольной группе (обработанной только МАт 19Е12-биотин/биотин-N^К.-ΤNΕ) площади опухолей до обработки и через 10 дней после обработки составляли 40±4 и 20±5 мм² соответственно, эти результаты свидетельствуют о том, что предварительный направленный перенос с использованием хоминг-антитела опухоли и авидина значительно повышает активность ΝΟΚ-ΤΝΕ.

Литература

1. Сатктее11 Е.А. и др., Ап епбо(охт-тбисеб кегит Гас(ог Ша( саикек песгокге о£ (итоге. Ргос. №111. Асаб. δα. И8А 1975. 72:3666-70.

2. Не1коп Ь. и др., ЕГГес( оГ (итог песгокге Гас(ог оп си1(игеб йитап те1апота се11к. №т.1ге 1975. 258:731-732.

3. ^сеу К.Т и А. СегатЕ Пипо!· песгокге Гас(ог, о(йег су(октек апб б1кеаке. Апп. Кеу. Се11 Вю1., 1993. 9:317-43.

4. НоодепЬоот Н.К. и др., С.’опк(гис(юп апб ехргеккюп оГ апбЬобу-Штог песгокге Гас(ог Гикюп рго(етк. Мо1. Iттииο1. 1991. 28:1027-37.

5. Ьое(ксйег Н. и др., Нитап (итог песгокге Гас(ог а1рйа (ΤΝΕ а1рйа) ти(ап(к тейй ехс1ик1уе кресШсйу Гог (Йе 55 кОа ог 75 кОа ΤΝΕ гесер(огк. I. Вю1. Сйет. 1993. 268:26350-7.

6. Уапд к и др., А депейсайу епщпеегеб ктд1е-сйат Εν/ΤΝΕ то1еси1е роккеккек (йе апй-(итог 1ттипогеасйуйу о£ Εν ак тее11 ак (йе су(о(охю асйуйу о£ (итог песгокге £ас(ог. Мо1. ^типок 1995. 32:873-81.

7. Vаи Ок(абе X. и др., Нитап ΤΝΕ ти(ап(к тейй ке1ес(|уе ас(М(у оп (йе р55 гесер(ог. №т.1ге 1993. 361:266-9.

- 11 007838

8. РадапеШ Ο. и др., ΤΙιΐΌοΜορ топос1опа1 апНЬобу (итог 1агдс(1пд ίη сагсшоетЬгуошс αηΐί^οηροκίίίνο райеп(к. Сапсег Гек. 1991. 51:5960-6.

9. РадапеШ Ο. и др., СНшса1 аррйсайоп оГ (Не а^абт-ЬюНп кук(ет Гог (итог (агдейпд. В Ό. 6о1бепЬегд (Еб. Сапсег (Негару νί(Γ габю1аЬе1еб апНЬоб1ек. СЕС Ргекк, Воса ВаГоп, 1995. стр. 239-253).

10. Мобогай Ο. и др., 1ттипокстйдгарНу \\ЙН (Нгее к(ер топос1опа1 рге(агде(1пд (есНпк|ие т б1адпок1к оГ 1.гсеа1 те1апота: ргейттагу геки1(к. Вг. Г ОрН(а1т. 1994.78:19-23.

11. Со1отЬо Р. и др., 1ттипокстйдгарНу \\ЙН апй-сНготодгапт Α ап(1Ьоб1ек ш ра(1еп(к \\ЙН епбосгте/пеигоепбосгте (итогк. Г Епбосг. РтсеМ. 1993. 16:841-3.

12. ЭеЬк Κ.Γ и др., Е1рокоте-аккос1а(еб (итог песгомк Гас(ог ге(атк Ь^οас(^ν^(у ш (Не ргекепсе оГ пеи(га11хлпд ап(1-(итог песгомк Гас(ог апНЬоб1ек. Г 1ттипо1. 1989. 143:1192-7.

13. ЭеЬк Κ.Γ, и др., 1ттипотоби1а(огу апб (ох1с еГГес(к оГ Ггее апб Нрокоте-епсарки1а(еб (итог песгоκίκ Гас(ог а1рНа т га(к. Сапсег Рек. 1990. 50:375-80.

14. Мого М. и др., ^тог се11 (агдейпд \νί(1ι апНЬобу-а^абт сотр1ехек апб Ь1о(1пу1а(еН (итог песгомк Гас(ог а1рНа. Сапсег Иек. 1997. 57:1922-8.

15. 8сНгаГГогб( Коорк и др., НурейНегтк 1ко1а(еб 11тЬ регГикюп \νί(1ι (итоиг песгомк Гас(ог апб те1рНа1ап ак (геа(теп( оГ 1оса11у аб\^гапсеб ог гесиггеп( коГ( Рккие кагсотак оГ (Не ех(гетШек. Габюбюргау & Опсо1оду 1998. 48:1-4.

16. Ь1епагб Ό. и др., 1п (гапкН те(ак(акек оГ тайдпап( те1апота (геа(еб Ьу ЫдН боке γΤΝΕ а1рНа ш сотЬтайоп \νί(1ι т(егГегоп-датта апб те1рНа1ап ш 1ко1а(юп регГикюп. \Уог1б 1опгпа1 оГ 8игдегу 1992. 16:234-40.

17. Н111 8. и др., Ьо^-боке (итоиг песгомк Гас(ог а1рНа апб те1рНа1ап т НурейНегтю 1ко1а(еб НтЬ регГикюп. Вг. I. 8идг. 1993. 80:995-7.

18. Еддегтоп( Α.Μ. и др., 1ко1а(еб 11тЬ регГикюп \\НН (итог песгомк Гас(ог апб те1рНа1ап Гог НтЬ ка1νаде ш 186 рабеп(к \νί(1ι 1оса11у абνаηсеб кой Рккие ех(гетйу кагсотак. Τίκ сити1а(Ке ти1йсеп(ег Еигореап ехрейепсе. Αηη. 8игд. 1996. 224:756-65.

19. М|/идисЫ Н. и др., ^тог песгомк Гас(ог а1рНа-теб1а(еб (итог гедгеккюп Ьу (Не ш νί\Ό (гапкГег оГ депек т(о (Не айегу (На( 1еабк (о (итог. Сапсег Йек. 1998. 58:5725-30.

20. Рептса Ό. и др., С1ошпд апб ехргеккюп ш ЕксНейсЫа со11 оГ (Не сЭНЛ Гог типпе (итог песгомк Гас(ог. Ргос. №(1. Αсаб. 8сг υ8Α 1985. 82:6060-4.

21. Согб А. и др., ^тог (агдейпд \νί(1ι Ью(ту1а(еб (итог песгок1к Гас(ог а1рНа: 8(гис(иге ас(М(у ге1а(юпкЫрк апб тесНаткт оГ асйоп оп а\абт рге(агде(еб (итог се11к. Сапсег Гек. 1998. 58:3866-3872.

22. Согб А. и др., ир-геди1а(юп оГ р75 ^тог Ыесгояк Еас(ог а1рНа гесер(ог т МусоЬас(ейит ηνίιιιη1пГес(еб тисе. 1пГес(. 1ттип. 1999, 67:5762-5767.

23. Сой1 А. и др., ^тог песгомк Гас(ог (ΤΝΡ) а1рНа сщапрПсаРоп Ьу ΕΕΙ8Α апб Ьюаккау: е(Гес(к оГ ΤΝΡ а1рНа-ко1иЬ1е ΤΝΡ гесер(ог (р55) сотр1ех б1ккоаа(юп биппд аккау тсиЬайопк. ί. 1ттипо1. Ме(Н. 1994. 177:191-198.

24. Ь_)ипддгеп Η.Ο. и К. Кагге. Нок( гек1к(апсе б1гес(еб ке1ес(йе1у адатк( Н-2-бейаеп( 1утрНота νηπап(к. Α^^Ε оГ (Не тесНаткт. Г Ехр. Меб. 1985. 162:1745-59.

25. Се11к С. и др., Оетопк(гаРоп оГ пптиподешсНу\\НН (Не роог1у 1ттиподешс В16 те1апота. Сапсег 1983. 43:3507-10.

26. Сакрат А. и др., ^тог рге(агде(тд \\НН а\'|бт ипргсл'ек (Не (Негареийс тбех оГ Ью(ту1а(еб (итог песгомк Гас(ог а1рНа ш тоике тобе1к. Сапсег ^8. 1999. 59:2917-23.

27. Ра11абто МА, 1г. и др., СНагас(епха(юп оГ (Не апШптог аскабек оГ Нитап (итог песгомк Гас(ога1рНа апб (Не сотрапкоп \\НН о(Нег су(октек: тбисйоп оГ (итог-кресШс 1ттиш(у. Г 1ттипо1. 1987. 138:4023-32.

28. Απί]} и др., Сапсег (геа(теп( Ьу (агде(еб бгид беГОегу (о (итог \'аксп1а(иге ш а тоике тобе1. 8сБ епсе 1998. 279:377-80.

29. Е^е^к Вю1одю (Негару \\НН ΤΝΡ: ргесНшса1 к(иб1ек. В V. Це У1(а, 8. Не11тап и 8. ЯокепЬегд (ред.). Вю1одю (Негару оГ сапсег: рппс1р1ек апб ргасйсе. ГВ. Ь1рр1псо(( Сотрапу, РЫ1абе1рЫа, 1995. стр. 295-327.

30. Габ^ем Ό. А. и др., 8е1ес(йе епНапсетеп( оГ (Не (итоиг песгойс ас(М(у оГ ΤΝΡ а1рНа νί(Η топос1опа1 апйЬобу. ВгН. Г Сапсег, 1992, 65:852.

31. ГоНеИ В. и др., Су(окте (агдейпд т (итогк иктд а ЫкресШс апйЬобу бйес(еб адатк( сагстоет-

Ьгуошс апйдеп апб (итог песгомк Гас(ог а1рНа. Сапсег 1996, 56:4758.

32. Е^аке^ Ό.Ε., Α1еxаηбе^ Η.Κ. и Ракк Η.Ι., Вю1одю (Негару νί(Ε ΤΝΡ: кук(етю абт1шк(га(юп апб 1ко1а(юп-регГикюп. В Вю1одю (Негару оГ сапсег: ргтс1р1ек апб ргасйсе, Це νίΕ! V., Не11тап 8. и ГокепЬегд 8. (ред.) 1995, стр. 329-345. ГВ. Ь1рртсо(( Сотрапу: РЫ1абе1рЫа.

33. Рептса Ό. и др., Нитап (итог песгомк Гас(ог: ргесигког, к(гис(иге, ехргеккюп апб Ното1оду (о 1утрНо(охт. Ыа(иге, 1984, 321, 724-729.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Конъюгированный продукт, обладающий противоопухолевой активностью, включающий цитокин, выбранный из ΤΝΡ или ΙΡΝγ, и лиганд, содержащий ΝΟΚ-мотив.
2. Конъюгированный продукт по п.1, где цитокин представляет собой ΤΝΡα или ΤΝΡβ.
3. Конъюгированный продукт по пп.1-2, где лиганд представляет собой лиганд рецептора СЭ13, который выбирают из группы, включающей антитела или их активные фрагменты, пептиды или миметики пептидов.
4. Конъюгированный продукт по п.3, где лиганд представляет собой пептид.
5. Конъюгированный продукт по п.4, где пептид выбирают из группы, включающей СХСКСУБССАСКС, ΝΟΚΑΗΑ, ΟΝΟΚΟ, циклоСУР-ХСКМЕС, линейный или циклический СNΟКС.
6. Конъюгированный продукт по любому из пп.1-5, где цитокин дериватизирован полиэтиленгликольным или ацильным фрагментом.
7. Конъюгированный продукт по любому из пп.1-6, где цитокин дополнительно конъюгирован с антителом или его фрагментом, которые направлены к опухолевому антигену, опухолевому ангиогенному маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, или с биотином.
8. Конъюгированный продукт по п.7, где цитокин представляет собой ΤΝΡ, различные субъединицы которого конъюгированы как с лигандом рецептора СЭ13, так и либо с антителом или его фрагментом, либо с биотином.
9. кДНК, кодирующая конъюгированный продукт по п.1.
10. кДНК по п.9, кодирующая конъюгированный продукт по п.5.
11. Предназначенный для генной терапии вектор, включающий кДНК по любому из пп.9-10.
12. Фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество конъюгированного продукта по любому из пп.1-8 в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями.
13. Композиция по п.12 в форме инъецируемого раствора или суспензии, или жидкости для инфузий.
14. Композиция по любому из пп.12-13 в форме липосом.
15. Применение конъюгированного продукта по любому из пп.1-8 для приготовления противоопухолевых лекарственных средств или диагностических агентов.
16. Применение конъюгированного продукта по любому из пп.1-8 в сочетании с другими противораковыми или диагностическими агентами, предназначенными для визуализации опухоли.
17. Применение кДНК по любому из пп.9-10 для приготовления лекарственных средств или диагностических агентов, предназначенных для применения в терапии рака.

- 14 007838
18. Применение кДНК по п.17 в сочетании с другими противораковыми или диагностическими агентами, предназначенными для визуализации опухоли.