CN1853730A - 用于治疗癌症的修饰细胞因子 - Google Patents

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Abstract

能自动靶向肿瘤血管和抗原呈递细胞的细胞因子衍生物及其作为抗肿瘤药物的应用。

Description

用于治疗癌症的修饰细胞因子
本申请是申请日为2001年2月13日，申请号为01807712.9，发明名称为“用于治疗癌症的修饰细胞因子”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及用于治疗癌症的修饰细胞因子。更详细地讲，本发明涉及能够“归巢”肿瘤血管和抗原呈递细胞的细胞因子衍生物。
部分细胞因子的抗肿瘤活性是众所周知的并已有描述。部分细胞因子也已经应用于人类治疗(29)。已经证实诸如白介素-2(IL-2)和α干扰素(IFNα)的细胞因子对不同类型肿瘤(例如肾转移癌、毛细胞白血病、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤(multiple mieloma)等)患者具有可靠的抗肿瘤活性。其它细胞因子如IFNβ、肿瘤坏死因子(TNF)α、TNFβ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15和集落刺激因子(CFS)对某些类型的肿瘤具有一定的抗肿瘤活性，因此将其作为进一步研究的目标。
一般来说，细胞因子的治疗性应用主要受限于其全身性毒性。例如最初发现TNF能够诱导某些肿瘤出血性坏死(1)，对不同肿瘤系具有体外细胞性作用(2)，但是随后证实它具有强烈促炎活性，在过量产生的情况下严重危害人类身体健康(3)。
因为所述全身性毒性是细胞因子人类药理活性剂量的基本问题，所以旨在减少这种生物学效应物的毒性作用而维持其治疗效力的新的衍生物和治疗策略现正在评定中。
一些新的方法涉及：
a)研制能够将TNF传递到肿瘤并增加局部浓度的融合蛋白。例如，已生产出由TNF和肿瘤特异性抗体组成的融合蛋白(4)；
b)研制保持抗肿瘤活性而全身性毒性降低的TNF突变体。因此，已制备出仅能选择性识别一种受体(p55或p75)的突变体(5)；
c)能够降低TNF部分毒性作用而不影响抗肿瘤活性的抗TNF抗体的应用。该抗体在文献中已有描述(30)；
d)具有较长半衰期的TNF衍生物的应用(例如与与聚乙二醇缀合的TNF)。
关于能够选择性地靶向肿瘤位点的TNF衍生物的制备最近已有报道。例如关于融合蛋白已有描述，将抗转铁蛋白受体的单克隆抗体重链基因和TNF基因融合获得融合蛋白(4)，或者将TNF和针对肿瘤相关抗原TAG72的单克隆抗体铰链区融合获得的融合蛋白(6)，或者Fv-TNF融合蛋白(6)。
EP 251 494公开了一种给予诊断试剂或治疗药物的体系，该体系包括：一种缀合有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的抗体，一种能够使所述缀合抗体和缀合有生物素的诊断试剂或治疗药物组成的化合物复合的试剂，它们序贯给予而且适当延迟，以便让所述诊断试剂或治疗药物通过生物素-链霉抗生物素蛋白在抗体识别的靶细胞上相互作用而定位。所述诊断试剂或治疗药物包括金属螯合物，特别是放射性核素和低分子量抗肿瘤药物(例如顺铂、阿霉素等)的螯合物。
EP 496 074公开了一种提供序贯给予生物素化抗体、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白以及生物素化诊断试剂或治疗药物的方法。尽管一般性列举了细胞毒性药物如蓖麻蛋白，但关于放射性同位素标记化合物的应用公开最多。
WO 95/15979公开了一种用于将高毒性药物定位在细胞靶上的方法，该方法基于给予包含缀合配体或抗配体的的特异性靶分子的第一缀合物，接着给予包含与抗配体或配体结合的毒性药物的第二缀合物。
WO 99/13329公开了一种将分子靶向肿瘤生血管血管的方法，该方法基于所述分子与NGR受体配体缀合。许多分子已被认为是可能的候补物质，但仅有阿霉素被明确描述。没有NGR受体配体作为细胞因子载体诱导免疫应答的用途被公开。
现在令人惊讶的发现是，某些细胞因子的治疗指数能被显著提高并且其免疫治疗特性能通过与氨基肽酶-N受体(CD13)的配体偶联而增强。CD13是一种在不同物种中高度保守的150kDa的跨膜糖蛋白。它在正常的细胞中表达，也在骨髓性肿瘤系、生血管内皮以及一些上皮细胞中表达。CD13受体通常称为“NGR”受体，因为它的肽配体共有“NGR”氨基酸基元。
按照第一个方面，本发明提供选自TNF及IFNγ的细胞因子和CD13受体配体的缀合制品。所述配体可以是抗体或其片段(例如Fab、Fv、单链Fv)、肽或肽模拟物(即能够结合CD13受体的肽样分子，任选包含修饰而非天然存在的氨基酸)。所述配体优选包含所述NGR基元的直链或环肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环肽CVLNGRMEC或环肽CNGRC，或者更优选CNGRC肽。所述肽可直接与细胞因子结合或通过一个间隔物(可以是单个氨基酸、氨基酸序列或有机残基(例如6-氨基癸酰基-N-羟基琥珀酰亚胺))与细胞因子间接结合。所述结合方法是本领域技术人员所周知的，包括遗传工程技术或化学合成技术。
所述肽配体最好与细胞因子N末端连接，从而最小化所述修饰细胞因子与其受体结合时的任何干扰。另一方面，所述肽能连接到氨基酸残基上，所述氨基酸残基是天然存在于所述分子或用遗传工程技术人工插入的酰胺键或羧基键接受者。所述修饰细胞因子最好使用包含编码所述肽的5’连续序列的cDNA来制备。
按照一个优选实施方案，提供TNF和CNGRC序列的缀合制品。更优选TNF的氨基末端通过间隔物G(甘氨酸)连接到肽CNGRC。
所述合成制品(NGR-TNF)在RMA-T淋巴瘤动物模型上证明比TNF更有效。而且，用NGR-TNF处理的动物能够更进一步地抵制致瘤剂量的RMA-T或RMA细胞。同通常TNF相比，能够在免疫正常动物观测到这种抗肿瘤活性增加而在免疫缺陷动物观测不到这种作用。说明所述缀合“NGR”肽的TNF抗肿瘤活性增加是由于免疫应答的增强而不是缀合物的直接细胞毒性作用。
还证实NGR-TNF的体内免疫作用与CD13受体直接相关。例如已观察到，抗CD13受体及GNGRC配体的抗体在体内与NGR-TNF竞争，从而提示NGR-TNF靶向受体的机制。
应用能够选择性结合两种TNF受体(p75TNFR和p55TNFR)中的一种受体的突变型TNF能更进一步改善所述TNF/CD13配体缀合物的治疗指数。所述TNF突变体能通过定点诱变获得(5；7)。
本发明修饰细胞因子的药物代谢动力学能通过制备聚乙二醇衍生物得到改善，聚乙二醇衍生物可延长所述细胞因子本身的血浆半衰期。
本发明再一实施方案为双功能衍生物，其中用所述CD13配体修饰的细胞因子同针对肿瘤抗原或其它肿瘤血管形成标记物(如αv整联蛋白、金属蛋白酶或血管生长因子)的抗体或其片段或者针对胞外基质组分的抗体或其片段(如抗肌腱蛋白抗体或抗纤连蛋白EDB结构域)相结合。TNF与针对胃腺癌和卵巢腺癌表达的肿瘤相关性TAG72抗原的单克隆抗体铰链区的融合产物的制备近来已有报道(6)。
本发明另一实施方案是以生物素/抗生物素蛋白系统预靶向肿瘤。按照这种途径，一种三元复合物在不同阶段的肿瘤抗原位点上，其组成为1)生物素化单克隆抗体，2)抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)，3)用所述CD13配体和生物素修饰的二价细胞因子。许多论文证实，与用免疫缀合物常规靶向相比，所述预靶向方法能确实增加在靶部位结合的活性分子与游离活性分子的比率，从而减少治疗毒性(11，10，9，8)。这种方法利用生物素化TNF产生了良好结果，该生物素化TNF能够在体外诱导细胞毒性并在正常TNF不起作用的情况下降低肿瘤细胞生长(14，26)。所述预靶向方法还可以通过使用双特异性抗体(同时结合所述肿瘤抗原和所述修饰细胞因子)的两相程序来实现。针对癌胚抗原和TNF的双特异性抗体用作TNF肿瘤预靶向的手段近来已有报道(31)。
按照再一实施方案，本发明包含在不同TNF亚基上同时与CD13配体和抗体或其片段缀合(直接缀合或通过生物素-抗生物素蛋白桥间接缀合)的TNF分子，，所述抗体或其片段针对肿瘤细胞表达的抗原或其它肿瘤基质组分(如肌腱蛋白和纤连蛋白EDB结构域)。使得所述修饰细胞因子的肿瘤寻靶特性更进一步改善以及后者在肿瘤微环境中通过三聚体-单体-三聚体的转变得到缓慢释放。实际上以前的研究工作证实，所述TNF缀合物的修饰亚基能与靶向复合物解离并再缔合，形成未修饰的三聚体TNF分子，然后扩散在肿瘤微环境中。已证明所述生物活性TNF的释放在靶向后24-48小时内发生(21)。
治疗应用时，本发明修饰细胞因子适合制备成用于口或肠道外给予的药物制剂。优选肠道外给予的制剂，它们包括注射溶液剂或混悬液剂以及输注用液体剂。对于所述肠道外型制剂，将有效剂量的所述活性组分溶解或悬浮在无菌媒介物中，任选添加赋形剂如助溶剂、等渗剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂或分散剂，随后将其分装在密封管形瓶或安瓿中。
脂质体形式的所述细胞因子制剂能改善它的生物学活性。事实上在体外已观测到所述TNF的氨基基团酰基化使其疏水性增加而不损失生物学活性。而且据报导，结合脂类的TNF的体外细胞毒性不受影响、体内免疫调节作用不受影响而体内毒性减低(12，13)。
人体快速浓注TNF的最大耐受剂量为218-410μg/m2(32)，比在动物中的有效剂量低约10倍。根据来自小鼠模型的数据认为，要在人类中达到抗肿瘤效果至少高十倍的剂量是必需的(15)。对肢体高温隔离灌注的首个临床研究中，以4mg TNF与苯丙氨酸氮芥和干扰素γ联合应用获得了高反应率(16)。其它研究表明，可以不要干扰素γ，更低剂量的TNF也能充分引起治疗性反应(17，18)。因为所述两种细胞因子对内皮细胞上发挥协同作用，它们的联合选择性靶向可能导致更强的抗肿瘤活性，从而克服相同细胞因子联合应用在癌症治疗中通常遇到的全身性毒性问题。此外，已知TNF能降低内皮性血管的屏障功能，从而提高它们对大分子的通透性。利用本发明修饰TNF分子的治疗毒性降低和它们的肿瘤血管寻靶特性，另一个可供选择的应用是它们增加肿瘤血管对其它化合物的通透性，无论是治疗目的或还是诊断目的。例如在肿瘤的放射免疫闪烁成像法或放射免疫治疗中所述修饰TNF可用以增加肿瘤摄取放射性标记抗体或放射性标记激素(肿瘤成像化合物)。另一方面，还可增强化学治疗药物、免疫毒素、携带药物或基因的脂质体或者其它抗癌药物的摄取也能增加，从而增强其抗肿瘤作用。
所以，癌症治疗或诊断时，本发明细胞因子也可与其它诊断或治疗物质一起以组合、分开或贯序的制剂形式应用。
本发明最后一个方面涉及编码本文公开的缀合细胞因子的cDNA，它可由所述细胞因子的cDNA增加编码所述CD13配体、优选上述寻靶肽的5’-或3’-连续DNA序列制备。所述联合cDNA可原样用于基因治疗或插入载体后用于基因治疗。所述合适载体的制备和治疗性应用在(19)中公开，其通过引用结合到本文中。
附图描述
图1：TNF和NGR-TNF对RMA-T淋巴瘤生长(a和b)以及动物体重(c和d)的作用。
5只动物/组，在肿瘤移植10天后用单一剂量的TNF或NGR-TNF(腹腔内注射)治疗。根据对数曲线内推不同剂量(b)的第14天的肿瘤面积值和治疗后体重的降低(第11天和第12天的平均值)(d)。在第14天1μg或9μg的NGR-TNF的抗肿瘤作用比相当剂量的TNF作用的更强(分别P＝0.024和P＝0.032)，而治疗后体重降低是相似的。箭头指示产生类似作用的TNF和NGR-TNF外推剂量。
图2：单克隆抗体R3-63和CNGRC对NGR-TNF(a)和TNF(b)的抗肿瘤活性的作用。
肿瘤移植12天后，用混合NGR-TNF或TNF的单抗R3-63或CNGRC对具有RMA-T肿瘤的动物给药(n＝5只动物/组)。在一个单独的实验(c)中对具有11天大的肿瘤的动物用TNF和NGR-TNF与CNGRC或CARAC(对照肽)联合给药(n＝5)。1μg NGR-TNF的抗肿瘤作用比9μg TNF的抗肿瘤作用强(P＝0.009，第20天t-检验)并且抗肿瘤活性被CNGRC(P＝0.035)和单抗R3-63(P＝0.011)显著抑制。
图3：NGR-TNF和TNF的限制性胰蛋白酶消化对它们的分子量(a)和抗肿瘤活性(b)的作用。
按照厂商说明书将1mg胰蛋白酶偶联到1ml活化CH琼脂糖凝胶(Pharmacia-Upjohn)上制备出胰蛋白酶-琼脂糖。NGR-TNF和TNF(在300μl 0.15M氯化钠和0.05M磷酸钠中各170μg，pH7.3)与15μl树脂混悬液(1∶4)或单独的缓冲液混合并且在37℃端对端旋转持续所示时间。所述四种产物通过0.22μm Spin-X仪器(Costar，Cambridge，MA)过滤并在使用之前保存在-20℃。(a)电喷雾质谱分析。每一个峰指出分子量大小和相应的产物(N-末端序列)。序列上的箭头指示裂解位点。(b)1μg或3μg的NGR-TNF和TNF(没用胰蛋白酶温育(上图)或用胰蛋白酶温育(下图))对RMA-T肿瘤生长和动物体重的作用(用1μg和3μg剂量治疗的组平均值±SE)。在肿瘤移植13天后治疗动物(n＝5只动物/组)。
图4：变性/再折叠前后人NGR-TNF的SDS-PAGE和抗肿瘤活性。
人TNF(a)、NGR-TNF在实施例V所述变性/再折叠过程前(b)和后(c)在非还原条件下的SDS-PAGE(A)。
TNF和未再折叠的NGR-TNF对所述RMA-T淋巴瘤的生长(B)和对体重(C)的作用。人TNF(D)和再折叠的NGR-TNF(包含＞95％的具有链内二硫键的三聚体)(E)对肿瘤生长的作用。在肿瘤移植10天后用一个剂量的TNF或NGR-TNF腹腔内注射治疗动物(如图所示，15或5只小鼠/组)。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例I
小鼠TNF和NGR-TNF的制备
细胞质cDNA在大肠杆菌中表达制备小鼠重组TNF和Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)。用5′-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′和5′-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3′作为3′和5′引物，对分离自脂多糖刺激的小鼠RAW-264.7单核巨噬细胞的mRNA通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)制备编码小鼠Met-TNF1-156的cDNA(20)。
将所述扩增片段用Nde I和Bam HI(New England Biolabs，Beverley，MA)酶切并克隆到预先用相同的酶酶切得到的pET-11b(Novagen，Madison，WI)中(pTNF)。
用5′-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3′作为5′引物和上述的3′引物，通过对pTNF的PCR扩增编码Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1-156的所述cDNA。将扩增片段如上所述酶切并克隆到pET-11b中并用来转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。按照所述pET-11b的厂商说明书，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导TNF和NGR-TNF的表达。在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液中经过超声处理细菌，接着离心(15000×g，20分钟，4℃)从两升培养物中回收可溶性的TNF和NGR-TNF。两种提取液都与硫酸铵混合(饱和度25％)，4℃放置1小时，如上所述再离心。使上清液中的硫酸铵达到65％的饱和度，4℃放置24小时并再离心。将各沉淀物溶于200ml缓冲液(1M硫酸铵，50mM Tris-HCl，pH8.0)中，在Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上经疏水层析纯化(梯度洗脱，缓冲液A：50mM磷酸钠，pH8.0，含1M硫酸铵；缓冲液B：20％甘油，5％甲醇，50mM磷酸钠，pH8.0)。合并含TNF免疫活性物的流分(蛋白质印迹法)，用2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH8.0的缓冲液透析，并在DEAE-Sepharose FastFlow(Pharmacia-Upjohn)上经离子交换层析进一步纯化(梯度洗脱，缓冲液A：20mM Tris-HCl，pH8.0；缓冲液B：1M氯化钠，20mM Tris-HCl，pH8.0)。合并含TNF免疫活性的流分并在Sephacryl-S-300HR(Pharmacia-Upjohn)上经凝胶过滤层析纯化，用150mM氯化钠，50mM磷酸钠，pH7.3的缓冲液(PBS)预平衡并洗脱。合并相当于40000-50000Mr产物的流分，等分并冻存于-20℃。用于所述层析步骤中的所有溶液都是用无菌无内毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)制备的。最后产量为45mg TNF和34.5mg NGR-TNF。
纯化的TNF和NGR-TNF的分子量用电喷雾质谱测定法测定。蛋白质含量用市售蛋白测定试剂盒(Pierce，Rockgord，IL)测定。用定量产色鲎变形细胞溶解产物(LAL)检验法(Bio Whittaker)测定NGR-TNF和TNF的内毒素含量分别是0.75单位/μg和1.38单位/μg。
按照标准程序，用12.5％或15％的聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析。
少量TNF和NGR-TNR在如下可溶性p55-TNF受体(sTNF-R1)-Sepharose(按照文献(22)所述制备5mg重组sTNF-R1并按厂商说明书结合到2ml Activated-CH-Sepharose(Pharmacia))上经亲和层析进一步纯化。用无菌无内毒素的溶液彻底清洗两个单独的柱子(每个柱子1ml)，用PBS中纯化的TNF或NGR-TNF上样并经梯度洗脱解除吸附(1h，缓冲液A：PBS；缓冲液B：0.5M氯化钠，0.2M甘氨酸-盐酸)。中和包含TNF-抗原的组分的流分并用无菌生理盐水透析。在透析前加入无内毒素的人血清白蛋白(0.5mg/ml)防止蛋白吸附在膜上。用ELISA和细胞溶解试验测定每一流分的TNF含量。
与预期的TNF单体(未显示)一样，TNF的非还原性SDS-PAGE显示出17-18kDa的单一条带。相矛盾的是，NGR-TNF的非还原性SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示出可能相当于单体、二聚体和三聚体的不同免疫活性型的18、36和50kDa。在还原条件下大多数50和36kDa的条带转变为18kDa的形式，说明存在具有链间二硫键的NGR-TNF分子。所述18kDa条带占总物质的2/3，而所述36kDa的条带占剩余部分的大多数。这些电泳图谱表明NGR-TNF是由具有正确的链内二硫键(至少50％)的三个单体亚基组成的三聚体和其余部分(大多数为具有一个或多个链间二硫键的三聚体)的混合物。还原性SDS-PAGE仍然观察到36kDa条带表明NGR-TNF还包含不可逆变性的二聚体(大约为总数的10％)。
通过电喷雾质谱测定法测定TNF和NGR-TNF单体的分子量分别是17386.1±2.0Da和17843.7±2.5Da。所述检测值与Met-TNF1- 156(17386.7Da)和CNGRCG-TNF1-156(17844.2Da)的预期分子量非常接近。
实施例II
小鼠TNF和NGR-TNF的体外细胞毒性活性
如文献(23)所述，通过基于L-M小鼠成纤维细胞(ATCC CCL1.2)的标准细胞溶解试验测定TNF和NGR-TNF的生物学活性。在30ng/ml放线菌素D存在的条件下测定TNF和NGR-TNF对RMA-T细胞的细胞溶解活性。每一样品在三种不同浓度下以双份试验进行分析。结果用2-3个独立试验的平均值±SD表示。
按照L-M细胞的标准细胞溶解试验，所述TNF和NGR-TNF的体外细胞毒性活性分别为(1.2±0.14)×108单位/mg和(1.8±0.7)×108单位/mg。这些结果表明所述NGR-TNF分子中的CNGRCG部分未阻止其折叠、寡聚化和缀合TNF受体。
在先前的研究中我们已证明，在30ng/ml放线菌素D存在的条件下RMA-T细胞能被TNF杀死，然而在缺少转录抑制剂的条件下，甚至在培育几天后这些细胞对TNF仍然有抵抗力。根据用TNF((1.2±0.14)×108单位/mg)作为标准品进行的测定，在放线菌素D存在的条件下NGR-TNF对RMA-T细胞的体外细胞毒性活性为(1.4±0.8)×108单位/mg。
实施例III
小鼠TNF和NGR-TNF的治疗活性和毒性的表征
Rauscher病毒引起的C57BL/6RMA淋巴瘤在体外用RPMI1640、5％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、2mM谷酰氨和50μM 2-巯基乙醇维持。RMA-T是由编码Thy1.1等位基因的构建物转染RMA细胞系衍生来的，按照文献(14)所述培养。
B16F1黑素瘤细胞培养在RPMI 1640、5％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、2mM谷酰氨、1％无必需氨基酸的MEM中(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)。
在动物模型的体内研究得到the Ethical Committee of the SanRaffaele H Scientific Institute批准并按照规定方针执行。在左肋侧分别用5×104 RMA-T或B16F1活细胞皮下注射攻击C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Calco，Italy)(16-18g)。肿瘤移植12天后，腹腔内注射250μlTNF或NGR-TNF溶液(0.9％的无内毒素氯化钠稀释)治疗小鼠。初步实验表明添加人血清白蛋白(作为载体)到TNF和NGR-TNF溶液中没有改变所述抗肿瘤活性。每组用5只小鼠进行每个实验。每天用卡尺测量肿瘤大小监测肿瘤生长。通过计算r1×r2估计肿瘤面积，而通过计算r1×r2×r3×4/3估计肿瘤体积，r1和r2是纵向半径和横向半径，r3是从正常皮肤表面凸起的肿瘤厚度。在肿瘤直径达到1.0-1.3cm前杀死动物。肿瘤大小以平均值±SE表示(每组5-10只动物，如图例说明所示)并通过t-检验比较。
用在C57BL6小鼠中的RMA-T淋巴瘤和B16F1黑素瘤模型比较NGR-TNF和TNF的抗肿瘤活性和毒性。因为所述RMA-T模型以前已经进行了特征鉴定并用研究不同靶向草案(26)的TNF抗肿瘤活性，所以我们决定在本文的研究中也使用这个模型。
小鼠TNF给予带有皮下注射建立的RMA-T肿瘤的动物，24h后引起肿瘤质量减少和肿瘤中心部位的出血性坏死，继之显著生长抑制持续数天(26)。用单一TNF治疗不能引起肿瘤完全消退(甚至在剂量接近LD50时)，因为在治疗后数天肿瘤坏死区域附近残存的活细胞重新开始生长。
在第一套实验中我们研究TNF或NGR-TNF的各种剂量(腹腔内注射)对动物存活率的影响。为避免过多的痛苦当所述肿瘤直径大于1-1.3cm时杀死动物。治疗后3天，TNF和NGR-TNF的致死率相似(LD50分别为60μg和45μg)而它们的抗肿瘤活性显著不同(表1)。
                               表1.用小鼠TNF和NGR-TNF治疗带有RMA-T淋巴瘤的小鼠的存活率
  治疗   动物(数量)   剂量(μg)   治疗后存活率(％)a)
  第3天   第7天   第14天   第21天   第30天   第38天(2ndch)b)   第62天(3o ch)b)   第92天
  无TNFNGR-TNF   184991499101091399   013927541081392754108   100100100100100550100100100100330   020555557557080888533 0022140102055300 11710202223 0010201115 001115 1115 1115
a)肿瘤移植10天后用TNF或NGR-TNF(腹腔内注射)治疗带肿瘤的动物。当肿瘤直径超过1-1.3cm时杀死动物。
b)存活动物在指示的时间再用50,000RMA-T细胞(第二次攻击)或50,000RMA(第三次)攻击。在每个时间用5只正常动物监测注射细胞的致肿瘤性。所有对照动物10天内生长出肿瘤(数据未列出)。
例如，1或3μg的NGR-TNF比27μg的TNF更有效延迟肿瘤生长，说明NGR-TNF更有效至少1个数量级。有趣的是，一些动物用低于LD50的剂量NGR-TNF治愈，而用TNF根本没有动物被治愈。治愈动物抵制致瘤剂量的RMA-T或野生型RMA细胞的进一步攻击，表明用NGR-TNF单一治疗能诱导保护性免疫。值得注意的是，增加TNF或NGR-TNF剂量至9-27μg以上毒性显著增加而治疗活性很少或没有增加。
伴随TNF治疗的体重减少是众所周知的全身性毒性表现(26)。因此为进一步比较TNF和NGR-TNF的效力/毒性比，我们监测治疗后肿瘤生长和动物体重。1μg NGR-TNF对肿瘤生长的效果相似或高于9μg TNF的(图1a)，而治疗后1-2天的体重减少效果与1μg TNF治疗类似(图1c)。当我们内推以剂量-反应作图的对数曲线数据时发现，9μg TNF第14天的治疗效果能用少到0.6μg的NGR-TNF获得（图1b)。相反，必需8.5μg才引起类似的毒性作用(图1d)。因此，在这些条件下计算出的NGR-TNF效力/毒性比比TNF大14倍。
用B16F1黑素瘤模型获得了相似的结果。在第11天和17天用1μgNGR-TNF治疗，在第19天引起的抗肿瘤反应大于用4μgTNF获得的反应而与12μgTNF获得的相似(数据未列出)。相反，1μgNGR-TNF引起的体重减少显著地低于由4μg和12μgTNF引起的体重减少。用12μg NGR-TNF治疗产生强得多的抗肿瘤效果，而毒性效果与12μgTNF相似。
当在第19天第三次注射时，1-2天后所有组中有一些动物死亡(盐水和12μgNGR-TNF治疗组中5只中2只死亡，其它组中5只中1只死亡)。值得注意的是，用12μgNGR-TNF治疗的一只动物彻底消除了肿瘤。当用第二剂致瘤剂量的B16F1细胞第二次攻击这个动物时，18天后生长出可扪及的肿瘤，而对照动物在6-7天内生长出肿瘤。
总而言之，这些结果表明NGR-TNF抑制肿瘤生长的效力比TNF大10-15倍而毒性是相似的。此外，NGR-TNF比TNF能更有效地诱导保护性免疫应答。
实施例IV
NGR-TNF的作用机理
经蛋白-G琼脂糖层析(Pharmacia-Upjohn，Uppsala，Sweden)从腹水中纯化抗小鼠CD13单克隆抗体R3-63，并用0.9％氯化钠透析。
兔多克隆抗血清从Primm srl(Milan，Italy)购买并在蛋白-A-琼脂糖(Pharmacia-Upjohn)上亲和层析纯化。肽CNGRC和CARAC如前所述制备(28)。
为提供NGR-TNF的改良活性是依赖借助于NGR部分的肿瘤靶向的证据，我们研究NGR-TNF的体内活性是否能被CNGRC部分竞争。为这个目的我们给予带RMA-T肿瘤的小鼠NGR-TNF(1μg)(含或不含过摩尔量的CNGRC)。平行地，其它动物用TNF(3或9μg)治疗(也含或不含CNGRC)。正如所料，CNGRC显著降低了NGR-TNF的抗肿瘤活性(图2a)但没有降低TNF的抗肿瘤活性(图2b)。相矛盾的是，对照肽(CARAC)不能引起NGR-TNF活性显著降低(图2c)。这些结果表明CNGRC竞争NGR-TNF与CNGRC受体的缀合，并支持改善活性的靶向机制假说。值得注意的是，CNGRC不能降低NGR-TNF的体外细胞毒性作用(数据未列出)。
因为近来报道氨肽酶N(CD13)是肽CNGRC的受体，于是我们研究这个受体在NGR-TNF靶向机制中的贡献。为这个目的，我们研究了抗-CD13单克隆抗体(R3-63)对NGR-TNF和TNF抗肿瘤活性的作用。单克隆抗体R3-63显著抑制NGR-TNF的抗肿瘤活性(图2a)但没有抑制TNF的抗肿瘤活性(图2b)，表明所述CD13确实决定性地涉及NGR-TNF的抗肿瘤活性。通过用单克隆抗体R3-63对培养细胞的FACS分析观测到在RMA-T细胞表面没有CD13的表达(未列出)，表明所述抗体识别其它体内细胞。
虽然这些数据表明CD13是NGR-TNF的重要受体，我们不能完全排除缀合其它尚未识别的NGR受体也对所述靶向机制有贡献(即使较低程度)。
蛋白质部分水解的初步实验表明TNF的N-末端部分(2-3个残基)中的Arg-Ser键对胰蛋白酶非常敏感，而该分子其余部分有非常强的抗性。因此，为了进一步提供NGR-TNF改善的活性与它的NGR部分有关系的证据，我们试图通过用固定的胰蛋白酶部分消化从突变型蛋白的N-末端区域切除NGR结构域。这个处理将NGR-TNF和TNF都转变为一个相当于TNF3-156片段的分子(预期分子量为16986.2Da；测定分子量和预期序列参见图3a)。
尽管消化作用不降低NGR-TNF在体外对L-M细胞的细胞溶解活性((2.3±1.4)×108U/mg)，它在体内的抗肿瘤活性降低到TNF的水平(图3b)。值得注意的是根据治疗后1天动物体重的减少判断（图3b，右图)，NGR-TNF和TNF的毒性在消化前后是相似的，表明所述NGR-依赖的靶向机制不改变毒性。
实施例V
人TNF和NGR-TNF的制备和表征
人重组TNF和NGR-TNF(包含融合有CNGRCG的C末端的人TNF1-157)通过重组DNA技术制备并基本如所述小鼠TNF和NGR-TNF纯化。用下列引物：
-NGR-hTNF/1(有义)：5’A TAT  CAT ATG TGC AAC GGC CGTTGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3’
-NGR-hTNF/2(反义)：5’TCA  GGA TCC TCA CAG GGC AATGAT CCC AAA GTA GAC 3’
对包含所述hTNF编码序列(33)的质粒pET11b/hTNF通过PCR制备编码人NGR-TNF的cDNA。
扩增片段经酶切克隆到pET-11b(Nde I/BamH I)中，并用于转化BL21(DE3)有义细胞(Novagen)。按照pET-11b厂商说明书用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导NGR-hTNF的表达。通过在2mM乙二胺四乙酸，20mM Tris-HCl，pH8.0中超声处理细菌接着离心(15000×g，20分钟，4℃)从两升培养物中回收可溶性的NGR-TNF。
所述提取液与硫酸铵混合(饱和度35％)，4℃放置1小时，如上再离心。然后使上清液中的硫酸铵达到65％的饱和度，4℃放置24小时并进一步离心。将各沉淀物溶于1M硫酸铵，50mM Tris-HCl，pH8.0中，通过在Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)上疏水层析纯化(梯度洗脱，缓冲液A：100mM磷酸钠，pH8.0，含有1M硫酸铵；缓冲液B：70％乙二醇，5％甲醇，100mM磷酸钠，pH8.0)。合并含有hTNF免疫活性物质(经ELISA)的流分，用20mM Tris-HCl，pH8.0透析，并进一步通过在DEAE-Sepharose Fast F1ow(Pharmacia-Upjohn)上离子交换层析纯化(梯度洗脱，缓冲液A：20mM Tris-HCl，pH8.0；缓冲液B：1M氯化钠，20mM Tris-HCl，pH8.0)。所述层析步骤中使用的所有溶液都用无菌无内毒素的水制备(Salf，Bergamo，Italy)。
这里从两升培养物中回收了大约30mgTNF和32mg NGR-TNF。非还原性SDS-PAGE显示相应于单体、二聚体和三聚体的条带，表明人NGR-TNF也是具有正确的链内二硫键的三聚体和具有一个或多个链间二硫键的三聚体的混合物(图4A，泳道b)(与用小鼠NGR-TNF观察的一样)。
具有正确的链内二硫键的三聚体经如下四个步骤的变性-再折叠过程从该混合物中分离出来：用7M尿素使纯化的人NGR-TNF变性，然后通过7M尿素，100mM Tris-HCl，pH8.0预平衡的HR Sephacryl S-300柱(1025ml)(Pharmacia)凝胶过滤。合并相应单体TNF的流分，经YM MWCO 10kDa膜(Amicon)超滤，然后用33倍体积2.33M尿素，100mM Tris-HCl，pH8在4℃透析(140分钟)，接着经1.55M尿素，100mM Tris-HCl，pH8透析(140分钟)和1M尿素，100mM Tris-HCl，pH8透析(140分钟)而再折叠。最后产物用80倍体积的100mM Tris-HCl透析(16小时)，在13000×g离心(30分钟)，经SFCA 0.45μm膜(Nalgene)过滤并用0.15M氯化钠，0.05M磷酸钠(PBS)预平衡的HRSephacryl S-300柱(1020ml)凝胶过滤。回收大约23mg再折叠蛋白。
在非还原性SDS-PAGE后最终产物大部分为单体(图4A，泳道c)，在Superdex 75HR柱上经分析性凝胶过滤HPLC，液体力学体积与三聚体人TNF相似(未列出)，电喷雾质谱测定法测定分子量17937.8+1.8Da(CNGRCG-TNF1-157预期分子量为17939.4Da)。未再折叠和再折叠的NGR-TNF对小鼠L-M细胞的体外细胞溶解活性分别是(6.11×107)+4.9和(5.09×107)+0.３单位/mg，而纯化的人TNF是(5.45×107)+3.1单位/mg。这些结果表明所述变性-再折叠过程不影响人NGR-TNF和小鼠p55受体的相互作用。
1μg人NGR-TNF(未再折叠)的体内抗肿瘤活性比10μgTNF更大(图4B)，而通过动物体重减少判断的毒性显著地较低(图4C)。0.3μgNGR-TNF再折叠后足以诱导比10μgTNF达到的更强烈的抗肿瘤作用(图4D，4E)。
这些结果说明人NGR-TNF的抗肿瘤活性比人TNF的抗肿瘤活性更大。
此外，我们观察到再折叠的人NGR-TNF和小鼠NGR-TNF对带有RMA-T的小鼠，即使以没有毒性作用证据的非常低的剂量(1-10ng/小鼠)也能引起显著的抗肿瘤作用，而TNF以这样的剂量不能引起显著作用(未列出)。
实施例VI
小鼠NGR-IFγ的制备和表征
基本如NGR-TNF所述，与CNGRCG融合的重组小鼠干扰素(IFN)γ(NGR-IFNγ)经重组DNA技术制备。CNGRC结构域与IFNγ的C末端融合。此外134位的半胱氨酸被丝氨酸替换；甲硫氨酸被引入位点-1，用于在大肠杆菌细胞中表达。用于制作NGR-IFNγcDNA的PCR引物是：5’-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATTGAA AGC C(有义)和5’-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTTGCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC。在pET-11b(Nde I/BamH I)中克隆所述cDNA并用于转化BL21(DE3)有义细胞(Novagen)。按照pET-11b厂商说明书用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达。按照标准技术，通过固定在琼脂糖上的抗小鼠IFNγ单克隆抗体(AN18)免疫亲和层析从大肠杆菌提取液中纯化所述产物。最终产物的还原和非还原性SDS-PAGE显示出16Kda的单一条带。电喷雾质谱测定法测定显示相当于小鼠Met-IFNγ1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFNγ)的分子量为16223+3.6Da(预期1625.5Da)。
NGR-IFNγ和NGR-TNF与抗-CD13抗体竞争结合到肿瘤相关血管的能力通过使用免疫组织化学方法研究。
从the Histopathology Department of the San Raffaele H ScientificInstitute获得人肾脏细胞癌的新鲜外科标本。制备Bouin固定(4-6小时)的石蜡包埋标本的切片(5-6μm厚)并吸附到聚赖氨酸包被的玻片上。如下用抗生物素蛋白-生物素复合法检测CD13抗原：组织切片按照标准程序用二甲苯和分级乙醇系列再水合。将组织切片置于含有1mM EDTA的容器中并用微波炉(1000W)煮沸7分钟。然后往容器中再装1mM EDTA并再煮沸5分钟。将所述组织切片放置冷却，然后在含有0.3％的过氧化氢的PBS中孵育15分钟来抑制内源性过氧化物酶。然后用PBS漂洗所述标本并用100-200μl PBS-BSA孵育(室温1小时)，接着用单克隆抗体WM15(抗hCD13)(单独或与各种竞争剂混合(见表2))在PBS-BSA中孵育(4℃过夜)。然后用PBS洗涤玻片3次(每次3分钟)并用含2％普通马血清的PBS-BSA(PBS-BSA-NHS)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育5分钟。用3μg/ml生物素化马抗小鼠IgG(H+L)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的PBS-BSA-NHS代替上述溶液，然后室温再孵育1小时。再洗涤玻片，用PBS 1∶100稀释的Vectastain Elite Reagent(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育30分钟。然后将一片3，3’-二氨基-联苯胺-四盐酸盐(Merck，Darmstadt，Germany)溶于10ml含有0.03％过氧化氢的去离子水中，经0.2μm膜过滤并覆盖在组织切片上5-10分钟。如上所述洗涤玻片并用Harris’苏木紫复染。肿瘤相关血管用抗CD13单克隆抗体(mAb JC/70A，抗人CD31，IgG1，DAKO，Copenhagen，Denmark)经连续组织切片染色鉴定。
结果总结于表2。如表所示，WM15对肿瘤相关血管的结合被过量NGR-TNF、NGR-IFNγ和CNGRC所抑制，但没有被其它缺乏NGR基元的对照试剂所抑制。这表明CD13上的NGR结合位点与所述WM15抗原决定簇在空间上重叠。相反地，NGR-TNF不能与13C03竞争结合到上皮细胞上。
我们的结论是，NGR-IFNγ和NGR-TNF的NGR部分能和在肿瘤相关血管上由单克隆抗体WM15识别的CD13形式相互作用。此外，这些结果表明当被连接到细胞因子的N-末端或C-末端时CNGRC基元是有功能性的。
表2.在各种竞争剂存在的条件下WM15与肾脏细胞癌切片的结合
  竞争剂   WM15与肿瘤相关血管的结合
  无NGR-TNF(25μg/ml)NGR-IFNγ(50μg/ml)CNGRC(100μg/ml)TNF(25μg/ml)人血清白蛋白(25μg/ml)合成CgA(60-68)(100μg/ml)   +---+++
a在封闭步骤中在含有2％BSA的PBS中添加竞争剂并和最初的抗体混合。
b单克隆抗体WM15(抗人CD13，IgG1)来自Pharmingen(San Diego，CA)；合成肽CgA(60-68)相应于嗜铬粒蛋白A片段60-68。
实施例VII
用抗肿瘤抗体和抗生物素蛋白定向传递生物素化NGR-TNF到肿瘤(预导向)
下列实例阐明TNF(基于肿瘤自动靶向抗体和肽CNGRC的联合应用)的“双”靶向可能性。
通过将NGR-TNF和D-生物素基-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Societá Prodotti Antibiotici S.p.A，Milan，Italy)在1M碳酸钠缓冲液pH6.8中混合(室温3小时)，制备生物素-NGR-TNF缀合物(21)。用1MTris-HCl，pH7.5中断反应。
所述缀合物用质谱测定法检定发现含有1个生物素/三聚体(平均)。然后用5×104 RMA-T活细胞左肋皮下注射攻击C57BL/6(CharlesRiver Laboratories，Calo，Italy)。当肿瘤面积达到40mm2时，按照如前(26)所述的“3天”方案相继注射生物素化抗体、抗生物素蛋白和生物素-TNF。我们注射：40μg生物素-mAb19E12(腹腔内注射，步骤I)，分别在18和19小时后60μg抗生物素蛋白和60μg链霉抗生物素蛋白(腹腔内注射，步骤II)，在24小时后3μg生物素-NGR-TNF(腹腔内注射，步骤III)。每种化合物用无菌的0.9％氯化钠溶液稀释。在对照实验中，省略抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。每个实验用5只小鼠/组完成。通过每日用卡尺测量肿瘤大小监测肿瘤生长。在用mAb19E12-生物素/抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/生物素-NGR-TNF(5只动物，平均±SE值)治疗的组中，肿瘤面积在治疗前和治疗10天后分别是39±4mm2和8±5mm2。在对照组中(只用mAb 19E12-生物素/生物素-NGR-TNF治疗)肿瘤面积在治疗前和治疗10天后分别是40±4mm2和20±6mm2，表明用肿瘤自动靶向抗体和抗生物素蛋白预靶向提高了NGR-TNF活性。
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                           序列表
<110>Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
<120>用于治疗癌症的修饰细胞因子
<130>modcyt
<140>
<141>
<160>7
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>1
ctggatcctc acagagcaat gactccaaag                                   30
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>2
tgcctcacat atgctcagat catcttctc                                    29
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>3
gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc          46
<210>4
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>4
atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg           45
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>5
tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac                     36
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>6
atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc                      35
<210>7
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PCR引物
<400>7
tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc ttttccgctt cttgaggc 58

Claims (16)

1.一种缀合制品，该缀合制品为选自TNF或IFNγ的细胞因子和CD13受体配体的缀合物。
2.权利要求1要求保护的缀合制品，其中所述细胞因子是TNFα或TNFβ。
3.权利要求1-2要求保护的缀合制品，其中所述CD13受体配体选自抗体或其活性片段、肽或肽模拟物。
4.权利要求3要求保护的缀合制品，其中所述配体是一种包含NGR基元的肽。
5.权利要求4要求保护的缀合制品，其中所述肽选自CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环形CVLNGRMEC、线性或环形CNGRC。
6.任一项前述权利要求要求保护的缀合制品，其中所述细胞因子是用聚乙二醇或酰基残基衍化的细胞因子。
7.任一项前述权利要求要求保护的缀合制品，其中所述细胞因子进一步与抗体或其片段或者与生物素缀合，所述抗体或其片段为针对肿瘤抗原、肿瘤血管形成标记物或胞外基质组分的抗体。
8.权利要求7的缀合制品，其中所述细胞因子是TNF，并且在不同亚基上与CD13配体和抗体或其片段或生物素缀合。
9.一种编码选自TNF和IFN的细胞因子的cDNA，该cDNA带有编码CD13配体的5’或3’连续序列。
10.权利要求9的cDNA，其中所述CD13配体是权利要求5的肽。
11.一种包含权利要求9-10的cDNA的基因治疗载体。
12.一种药物组合物，它包含有效量的权利要求1-8保护的缀合制品和制药学允许的载体及赋形剂。
13.权利要求12要求保护的组合物，该组合物为注射溶液或悬混液或用于输注的液体形式。
14.权利要求12-13要求保护的组合物，它为脂质体形式。
15.权利要求1-8要求保护的缀合制品或权利要求9-10的cDNA在制备用于治疗癌症的药物或诊断试剂中的应用。
16.权利要求15的缀合制品用途，它可与其它抗肿瘤药物或诊断性肿瘤成像化合物联合应用。
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