CN1269832A - K－配体－新的免疫系统蛋白 - Google Patents

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Abstract

K－配体,肿瘤坏死因子家族(TNF)的新成员,修饰的K－配体及含有它们的药物组合物。

Description

K-配体—新的免疫系统蛋白
发明领域：
本发明涉及新的配体，K(Kay)，它是肿瘤坏死因子家族的成员。此蛋白或其受体可能具有抗癌和/或免疫调节应用。并且，转染了此新配体的基因的细胞可用于基因治疗中以治疗肿瘤、自身免疫和炎症疾病或可遗传的遗传障碍，并且这些蛋白的封闭性抗体具有免疫调节应用。
发明背景：
肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞因子是宿主防卫和免疫调节的介质。此家族的成员以锚定在膜上的形式存在，通过细胞间接触在局部起作用，或者作为能扩散到更远的靶位的分泌蛋白。受体的类似家族用信号报告导致靶组织中细胞死亡或细胞增殖和分化起始的这些分子的存在。目前，配体和受体的TNF家族具有至少11个可识别的受体-配体对，包括：TNF：TNF-R；LT-α：TNF-R；LT-α/β：LT-β-R；FasL：Fas；CD40L：CD40；CD30L：CD30；CD27L：CD27；OX40L：OX40和4-1BBL：4-1BB。编码这些配体的DNA序列即使在最相关的情况下也仅有约25％到约30％的一致性，尽管氨基酸的相关性是约50％。
细胞因子受体的此家族的确定特征是在通过两个不同的TNF受体的分子克隆首次揭示出的富含半胱氨酸的细胞外结构域中发现的。i此家族的基因编码I型跨膜蛋白所特有的糖蛋白，该蛋白具有细胞外配体结合结构域，单个的跨膜区和与活化细胞功能相关的胞质区。富含半胱氨酸的配体结合区表现出紧密结合的二硫键连接的核心结构域，它依赖于特定的家族成员而重复多次。大多数受体具有四个结构域，尽管也可能少至3个，或多至6个。
配体的TNF家族中的蛋白的特征在于，一般较短的亲水氨基酸的短N-末端序列经常含有认为是作为终止转移序列的几个赖氨酸或精氨酸残基。接下来是跨膜区和具有可变长度的胞外区，它将C-末端受体结合结构域与膜分开。此区域有时称作“柄”。C-末端受体结合结构域包含蛋白主体，并经常但不总是，含有糖基化位点。这些基因缺乏I型膜蛋白，C末端位于细胞之外，而较短的N末端结构域位于胞质之内的II型膜蛋白所特有的经典的信号序列，在一些情况下，例如TNF和LT-α，在柄区中的裂解可发生在蛋白加工早期并且发现配体主要是分泌形式的。然而，大多数介导定位发信号的配体以膜的形式存在。
这些配体的结构已通过TNF、LT-α和CD40L的晶体学分析得到充分确定。TNF和淋巴毒素-α(LT-α)的结构均是两个反向平行的β-折叠片与“涂果子冻的薄卷饼”组成的三明治结构或Greek主要拓扑结构。C-α和C-β残基间的均方根偏差是0.61C，表明在它们的分子拓扑图中有高度的相似性。从CD40L、TNF和LT-α的分子研究显示出的结构特征是它们聚集为寡聚复合物的倾向。寡聚结构的内在特征是在形成多价配体的相邻的亚基之间的接点处形成受体结合位点。通过TNF、CD40L和LT-α的晶体结构分析表明它们的四级结构是以三聚体的形式存在。许多在不同的配体之间保守的氨基酸是在具有支架结构的β-折叠的序列中。可能是基本的三明治结构在所有这些分子中保存下来，这是因为这些支架结构序列的部分在多种家族成员之间是保守的。四级结构也可以得到维持是因为亚基的构象可能会保持相似。
TNF家族成员可最适当地描述为控制细胞存活和分化的免疫系统的总开关。与其它主要锚定在膜上的TNF家族成员相比仅有TNF和LT-α现在被认为是分泌的细胞因子。尽管膜形式的TNF已得到充分表征并可能具有独特的生物学作用，分泌的TNF还可作为一般的报警器起作用，向那些距离触发事件的位点较远的细胞发信号。因此，TNF分泌可增强导致血管系统衬里和细胞的炎症状态的得到充分描述的变化的事件。相反，家族中与膜结合的成员通过TNF型受体仅将信号发送给直接接触的细胞。例如T细胞仅对那些经相关TCR相互作用导致直接接触的B细胞提供CD40介导的“帮助”。相似的细胞间接触对诱导细胞死亡的能力的限制因素适用于得到充分研究的Fas系统。
看来我们可基于TNF配体诱导细胞死亡的能力将它们分为三组(表III)。首先，TNF、Fas配体和TRAIL能在多种细胞系中有效诱导细胞死亡并且它们的受体最可能具有十分规范的死亡结构域。可能DR-3的配体(TRAMP/WSL-1)也会全部归入此类。其次，还有那些仅在少数细胞类型中触发较弱的死亡信号的配体和TWEAK，CD30配体和LTa1b2是这一类的例子。这组配体如何在缺乏规范的死亡结构域的情况下能够触发细胞死亡是令人感兴趣的问题并表明存在着独立的较弱死亡信号发送机制。最后，还有那些不能有效发送死亡信号的成员。可能所有的组均能对某些细胞类型具有抗增殖作用继而诱导细胞分化例如CD40(Funakoshi等，1994)。
TNF家族在近年来快速扩充已包括有调节免疫系统在内的至少11个不同的发送信号途径。TWEAK和TRAIL的广泛表达模式表明在此家族中仍有更多的功能性种类未被覆盖。由于两个影响劳斯肉瘤和单纯疱疹病毒复制的受体的发现及以前的发现，即TNF具有抗病毒活性和痘病毒编码假TNF受体(Brojatsch等，1996；Montgomery等，1996；Smith，1994；Vassalli，1992)使这一方面受到特别的关注。
TNF是败血性休克和恶质病的介体iii，并与造血细胞发育的调节有关iv。看来TNF是作为炎症的介体起主要作用并防御细菌、病毒和寄生虫感染v以及具有抗肿瘤活性vi。TNF也与不同的自身免疫疾病有关vii。TNF可由几种类型的细胞，包括巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞和自然杀伤细胞产生viii。TNF可与两种不同的受体结合，每种受体通过特异性的细胞内信号分子发挥作用，因此导致不同的TNF效应ik。TNF能够以与膜结合的形式或作为可溶性的分泌细胞因子存在x。
LT-α的许多活性与TNF相同，即与TNF受体结合xi，但与TNF不同的是，看来它主要是由活化的T细胞和一些β-类淋巴母细胞肿瘤分泌的xii。LT-α和LT-β的异数复合物是与膜结合的复合物，它与LT-β受体结合xiii。LT系统(LTs和LT-R)看来与周围淋巴器官的发育有关，因为LT-β的遗传破坏导致脾中T和B细胞的瓦解及淋巴结的缺失xiv。LT-β系统也与一些腺癌细胞系的细胞死亡有关xv。
Fas-L，TNF家族的另一个成员，主要在活化的T细胞上表达xvi。它通过被称为程序性细胞死亡或凋亡的机制诱导带有其受体的细胞死亡，包括肿瘤细胞和HIV-感染的细胞xvii。并且，Fas或Fas-L中的缺陷可导致淋巴组织增生症，这证实了Fas系统在免疫应答调节中的作用xviii。Fas系统还与由肝炎慢性感染引起的肝脏损伤xix及HIV-感染的病人中的自身免疫xx有关。Fas系统还与HIV病人中的T细胞破坏xxi有关。TRAIL，此家族的另一个成员，似乎也与不同来源的多种转化细胞系的死亡有关xxii。
CD40-L，TNF家族的另一个成员，在T细胞上表达并诱导带有CD40的B细胞的调节xxiii。并且，CD40-L基因的改变导致被称为X-连锁的高IgM综合症的疾病xxiv。CD40系统还与不同的自身免疫疾病xxv有关并且已知CD40-L具有抗病毒的特性xxvi。尽管CD40系统与凋亡性B细胞的拯救有关xxvii，但在非免疫细胞中它诱导凋亡xxviii。TNF家族的许多其它淋巴细胞成员还与共同刺激有关xxix。
一般地，TNF家族的成员在控制免疫系统和活化急性宿主防御系统中具有基本的调节作用。假设目前在操纵TNF家族成员用于治疗中取得了进展，可能此家族的成员可以提供控制疾病的独特手段。此家族中的一些配体例如LT、TNF、Fas配体和TRAIL能直接诱导许多转化细胞的凋亡性死亡(Nagata，1997)。Fas及可能的TNF和CD30受体的活化能在可以发挥免疫调节功能的非转化的淋巴细胞中诱导细胞死亡(Amakawa等，1996；Nagata，1997；Sytwu等，1996；Zheng等，1995)。一般地，死亡在位于TNF受体胞质一侧的死亡结构域聚集之后得到触发。死亡结构域引导各种信号转导成分的聚集，这些成分导致caspase级联的活化(Nagata，1997)。一些受体缺乏规范的死亡结构域，例如LTb受体和CD30(Browning等，1996；Lee等，1996)仍可诱导细胞死亡，尽管其作用较弱。可能这些受体的主要功能是诱导细胞分化并且死亡是在一些转化细胞系中的异常结果，尽管这种描述是不清楚的，因为对CD30裸鼠的研究显示出在胸腺的负选择中的死亡作用(Amakawa等，1996)。相反，需要通过其它途径如CD40发信号来维持细胞存活。因此，需要鉴定和表征作为TNF家族成员的其它分子从而提供控制疾病和操纵免疫系统的其它手段。
发明概述：
因此，本发明涉及称为K-配体的新的多肽，它基本上消除了由于相关领域的限制和缺点引起的一种或多种问题。本发明人已经发现细胞因子TNF家族的新成员，并确定了人的该蛋白的氨基酸序列，及编码这些蛋白的DNA序列。所要求的发明可用于鉴定针对如下更为详述的多种疾病和病症的新的诊断剂和治疗剂，及用于获得关于免疫系统的信息和操纵免疫系统的方法。此外，本发明可能与诱导癌中的细胞死亡有关。
本发明的其它特征和优点将在下面加以描述，其中一部分内容可从描述中了解，或者可通过本发明的实践获悉。本发明的目的和其它优点将通过书面描述及其权利要求书，及在附图中特别指出的组合物和方法来实现和达到。
因此，为获得这些和其它优点，并为了达到本发明的目的，如这里所体现和广泛描述的，本发明包括编码K-配体的DNA序列。具体地，本发明涉及编码人K-配体的DNA序列，SEQ.ID.NO.：1。此外，所要求保护的发明涉及此新配体的氨基酸序列。人K-配体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.：2中所描述。申请人还部分地提供了小鼠的K-配体的DNA序列，SEQ.ID.NO.：3，并且由SEQ.ID.NO.：3编码的蛋白在SEQ.ID.NO.：4中提供。在其它的实施方案中，本发明涉及与编码配体的C末端受体结合结构域的DNA序列有至少50％同源性并与所要求的DNA序列或其片段杂交的序列，并且它们编码具有SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.4中所描述的序列的K-配体。
本发明在某些实施方案中进一步涉及编码K-配体的DNA序列，该序列与表达控制序列可操作地连接。任何适当的表达控制序列在所要求保护的本发明中都是有用的，并易于由本领域技术人员进行选择。
本发明还考虑到包含编码K-配体或其片段的序列的重组DNA，及稳定整合的K-配体序列引入它们的基因组内或带有附加型元件的宿主。任何适当的宿主均可用于本发明中，并易于由本领域技术人员进行选择而无须过多的实验。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括培养转化宿主步骤的生产基本上纯的K-配体的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及基本上不含一般相关的动物蛋白的K-配体。
本发明包括具有SEQ.ID.NO.2中所述的氨基酸序列及片段或其同系物的K-配体。在不同的实施方案中，氨基酸序列和/或DNA序列可包含如下面所进一步说明的保守的插入、缺失和置换，或包含上述序列的片段。
在其它的实施方案中本发明涉及包含可用于直接触发K-配体介导的药理学事件的K-配体的可溶性构建体。这些事件在癌症、肿瘤的治疗或免疫系统的操纵以治疗免疫性疾病中可能具有有用的治疗益处。所要求保护的配体的可溶性形式可进行遗传工程操作以掺入易于识别的标记，从而有利于鉴定这些配体的受体。
此外，在其它实施方案中本发明涉及针对K-配体的抗体，它们可用于，例如，治疗癌症，及操纵免疫系统以治疗免疫性疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所公开的和所要求的用K-配体的基因进行基因治疗的方法。
本发明的药物制剂可选择性地包括药物上可接受的载体、佐剂、填充物或其它药物组合物，并可用本领域所知的多种形式或途径中的任一种进行给药。
应该明白前面的一般描述和后面的详述都是作为范例和解释，并致力于提供如所要求保护的本发明的进一步的阐述。
所包括的附图有助于进一步理解本发明，并在这里引用作为本说明书的一部分，说明本发明的几个实施方案，并与描述一起说明本发明的原理。
附图简述：
图1：鼠和人K配体的氨基酸序列的序列对比。上边行中的鼠序列是通过cDNA的直接克隆获得的。人的序列反映了部分cDNA序列和5’RACE测定的组合。第三行，最下面一行序列表示共有序列。
图2：将人的KL cDNA片段用于探测来自人不同组织的RNA的Northern印迹。可见约为2.4kb的KL RNA主要在脾脏和外周血淋巴细胞中表达，即在次级淋巴器官中表达。
详述：
现在将对本发明的优选实施方案进行详细的叙述。本发明涉及编码人或小鼠K-配体的DNA序列、片段及其同系物，和那些DNA序列在用它们转化的宿主中的表达。本发明涉及这些DNA序列的应用及由它们编码的肽。此外，本发明包括人和小鼠K-配体的氨基酸序列或其片段，及包含它们或从它们衍生的药物组合物。
A.定义
“同源的”，如这里所用到的，是指所比较分子的序列间的序列相似性。当两个进行比较的序列中的位置由相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置由腺嘌呤占据，则这两个分子在那个位置就是同源的。两个序列之间同源性的百分比是两个序列所共用的相配或同源的位置数除以所比较的位置数再×100所得出的函数。例如，如果两个序列中的10个位置有6个是相配或同源的，则这两个序列具有60％的同源性。举例说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。一般地，当两个序列进行序列对比给出最大同源性时进行比较。
多肽的“纯化的制剂”或“基本上纯的制剂”，如这里所用到的，是指已从其它蛋白、脂类和以此它自然产生的核酸中分离的多肽。优选地，多肽还可以从用于纯化它的其它物质例如抗体、基质等中分离。
“转化的宿主”，如这里所用到的，是指包括任何带有引入其基因组中的稳定整合的序列，即K-配体序列的宿主，或带有序列，即编码附加型元件的宿主。
“治疗”，如这里所用到的，包括任何治疗性处理，例如，将治疗剂或物质，例如药物给病人服用。
“基本上纯的核酸”，例如，基本上纯的DNA，是满足下面一点或两点的核酸：(1)不与核酸来源的生物体的天然存在的基因组中的序列，例如编码序列之一或两者紧密邻接(即一者在5’端一者在3’端)；或(2)基本上不含有核酸来源的生物体中存在的其它核酸序列。该术语包括，例如，掺入载体中的重组DNA，例如掺入自动复制的质粒或病毒中，或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，或作为独立于其它DNA序列的单独的分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。基本上纯的DNA还包括作为编码K-配体的杂合基因的一部分的重组DNA。
术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在这里交互使用。
“生物活性”，如这里所用到的，是指具有体内或体外活性，该活性的发挥可以是直接的或间接的。K-配体的生物活性片段与配体的活性位点可具有例如70％的氨基酸同源性，更优选地是具有至少80％的同源性，最优选地是具有至少90％的同源性。配体的一致性或同源性在这里定义为候选序列中的氨基酸残基与SEQ.ID.NO.2中的K-配体残基相一致的百分比。
本发明的实践除了特别指出，将使用本领域技术之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在文献中有所描述。
B.本发明的DNA序列
如这里所述的，本发明的一个方面的特征是包括编码K-配体的核苷酸序列，如SEQ.ID.NO.1中所描述的DNA的基本上纯的(或重组的)核酸和/或这些核酸的等价物。如这里用到的术语核酸可包括片段和等价物，例如编码功能上等价的肽的序列。等价的核苷酸序列可包括由于一个或多个核苷酸置换、添加或缺失而不同的序列，例如等位变体、突变等；还包括由于遗传密码的简并性而与SEQ.ID.NO.1中所示的编码K-配体的核苷酸序列不同的序列。
发明者在这里描述了人和序列；描述本发明时一般将提到人的序列，尽管本领域技术人员知道小鼠的序列也包括在本发明之内。人的蛋白看来具有TNF家族的所有特性，即，II型膜蛋白组构和该蛋白折叠成TNF反向平行的β-折叠结构中所涉及的序列基元的保守性。
K-配体的核苷酸序列在SEQ.ID.NO.1中描述；K-配体的氨基酸序列在SEQ.ID.NO.2中描述。
本发明的序列可用于制备一系列DNA探针，这些探针在从各种天然和合成的DNA收集物中筛选与K-配体密切相关的DNA序列或其片段或衍生物的存在时是有用的。本领域技术人员知道这里所用到的K-配体，还指其具有生物活性的衍生物、片段或同系物。
可使用本发明的编码K-配体的DNA序列通过在用它们转化的各种原核或真核宿主中表达生产所要求保护的肽。这些肽可用于抗癌及免疫调节应用中。一般地，这包括培养用含有编码K-配体的序列的DNA分子转化的宿主的步骤，编码K-配体的序列与表达控制序列可操作地连接。
本发明的DNA序列和重组DNA分子可用多种宿主/载体组合进行表达。例如，有用的载体可由染色体的、非染色体的或合成的DNA序列的片段组成。本发明的表达载体的特征在于至少一个表达控制序列与插入到载体中的K-配体DNA序列可操作地连接，从而控制并调节DNA序列的表达。
并且，在每个表达载体内，可选择用来插入本发明的K-配体序列的不同位点。这些位点经常以切割它们的限制性内切酶来命名，并且这些位点和内切酶易于为本领域技术人员所识别。当然可以理解用于本发明的表达载体无需具有插入所需DNA片段的限制性内切酶位点。相反，载体可通过交替方法克隆到片段中。表达载体，特别是其中所选的用于插入选择的DNA片段的位点，及其与表达控制序列的可操作的连接，是由多种因素决定的。这些因素包括，但不限于，所要表达蛋白的大小、所需蛋白对宿主细胞酶的蛋白水解降解作用的敏感性、对特定的限制性酶敏感的位点数目、可能在纯化过程中不易除去的宿主细胞蛋白对所要表达的蛋白的污染或结合。可考虑的其它因素包括表达特性如与载体序列相关的起始和终止密码子的位置，及本领域技术人员所了解的其它因素。载体和要求保护的DNA序列的插入位点的选择是由这些因素的平衡决定的，不是所有的选择对所需的应用同等有效。然而，一般情况下本领域技术人员会分析这些参数并根据具体的应用选择适当的系统。
本领域技术人员易于对表达控制序列进行适当的修饰以获得高水平的蛋白表达，即通过密码子的置换，或选择由特定的生物体优先使用的特定氨基酸的密码子，以最大限度地减少蛋白的水解或改变糖基化组成。同样，也可将半胱氨酸换成其它氨基酸以简化生产、重折叠或稳定性的问题。
因此，不是所有的宿主/表达载体组合在表达本发明的DNA序列中都以同等的效率起作用。然而，宿主/表达载体组合的具体选择可由本领域技术人员作出。所要考虑的因素包括，例如，宿主与载体的相容性、由DNA序列编码的蛋白对宿主的毒性、回收所需蛋白的容易程度、DNA序列及与其可操作地连接的表达控制序列的表达特性、生物安全性、花费和所需蛋白的表达后修饰所需要的折叠、形式或其它因素。
通过用本发明的序列转化的宿主产生的K-配体及其同系物，及通过本发明的方法纯化出的天然K-配体，或从要求保护的氨基酸序列产生的K-配体，可用于多种用于抗癌、抗肿瘤和免疫调节的组合物和方法中。它们还可用于其它疾病的治疗和方法中。
本发明还涉及这里所公开的DNA序列在非正常的条件下，即在进行基因治疗环境中表达此配体的应用。K-配体可在适于此应用的启动子的指导下在肿瘤细胞中表达。这样的表达可增强抗肿瘤的免疫应答或直接影响肿瘤的存活。要求保护的配体还能通过改变局部免疫应答影响移植器官的存活。在此情况下，移植物本身或周围细胞将被编码K-配体的工程基因修饰。
本发明的另一方面涉及编码K-配体的分离的核酸在“反义”治疗中的应用。如这里所用到的，“反义”治疗是指在细胞条件下与细胞mRNA和/或编码所需配体的DNA特异性杂交的寡核苷酸或其衍生物的给药或原位产生，从而抑制所编码蛋白的表达，即通过抑制转录和/或翻译。结合可通过传统的碱基对互补，或者，例如，在与DNA双螺旋结合的情况下，是通过在双螺旋大沟中的特异性相互作用。一般地，“反义”治疗是指在本领域中一般应用的一系列技术，并包括依赖于特异性结合寡核苷酸序列的任何治疗。
本发明的反义构建体可作为例如表达质粒来传递，当其在细胞中转录时，产生与编码K-配体的细胞mRNA的至少一部分互补的RNA。或者，反义构建体可以是在体内产生的寡核苷酸探针。这样的寡核苷酸探针优选地是对内源性核酸酶具有抗性修饰，因此能在体内保持稳定的寡核苷酸。用作反义寡核苷酸的范例核酸分子是DNA的磷酰胺化物、硫代磷酸酯和甲基磷酸酯类似物(见例如，5,176,996；5,264,564；和5,256,775)。并且，构建用于反义治疗的寡聚物的一般方法已有评述，例如，由Van Der Krol等(1988)生物技术6：958-976；和Stein等(1988)癌症研究48：2659-2668所评述的，特别在这里引用作为参考。
C.K-配体及其氨基酸序列
本发明的K-配体，如上面所讨论的，是TNF家族的成员。该蛋白、其片段或同系物具有广泛的治疗和诊断应用。
K-配体主要存在于脾脏和外周血淋巴细胞中，强烈表明它在免疫系统中起到调节作用。要求保护的K-配体序列与人TNF家族其它成员的比较显示出大量的结构相似性。所有蛋白在细胞外结构域中共同具有几个序列保守性区域。
尽管尚不知道要求保护的配体的精确的三维结构，但可以预期，它作为TNF家族的成员，可能与家族的其它成员共同具有某些结构特点。
本发明的新多肽与受体发生特异性相互作用，该受体尚未得到鉴定。但是，这里所公开的肽和方法能鉴定出与要求保护的K-配体或其片段发生特异性相互作用的受体。
在某些实施方案中要求保护的本发明包括来自具有与其受体结合的能力的K-配体的肽。K-配体的片段可通过几种方法产生，例如重组技术、通过PCR、蛋白水解消化或通过化学合成。多肽的内部或末端片段可通过从编码多肽的核酸的一端或两端去除一个或多个核苷酸来产生。经诱变处理的DNA的表达产生多肽片段。
多肽片段也可以用本领域所知的技术如传统的Merrifield固相f-moc或t-boc化学合成法来进行化学合成。例如，可将本发明的肽和DNA序列任意分成没有重叠片段的所需长度的片段，或分成所需长度的重叠片段。诸如此类的方法在下面进行更详细的描述。
D.K-配体和肿瘤配体可溶性形式的产生
K-配体的可溶性形式能经常有效地发出信号并因此能作为模仿天然膜形式的药物进行给药。可能在这里要求保护的K-配体是作为可溶性细胞因子天然分泌的，但是，如果不是这样的话，可对基因进行再改造而使其分泌。为产生K-配体的可溶性分泌形式，可在DNA水平去除N末端跨膜区，和柄区的某一部分，并用能在所选的表达系统中有效进行蛋白水解切割的I型先导序列或II型先导序列替代它们。技术人员可以改变保留在分泌表达构建体中的柄区的量以优化受体结合特性和分泌效率。例如，可制备含有所有可能的柄长度的构建体，即N末端平截体，从而产生从氨基酸81开始到139的蛋白。最佳长度的柄序列将从此类分析中得到。
E.与K-配体反应的抗体的产生
本发明还包括与要求保护的K-配体或其受体进行特异性反应的抗体。抗蛋白/抗肽的抗血清或单克隆抗体可通过常规方法进行制备(见例如，抗体：实验室手册由Harlow和Lane编辑(冷泉港出版社：1988))。哺乳动物如小鼠、仓鼠或兔可用免疫原性形式的肽进行免疫。赋予蛋白或肽免疫原性的技术包括与载体的缀合，或其它技术，为本领域所熟知。
要求保护的K-配体或其受体的免疫原性部分可在佐剂存在的情况下进行给药。免疫进程可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测。可用免疫原作为抗原以常规的ELISA或其它免疫测定方法来评估抗体水平。
在优选的实施方案中，本主题抗体的免疫特异性针对K-配体的抗原决定基或其受体，例如SEQ.ID.NO.：2的多肽的抗原决定基或密切相关的人或非人的哺乳动物的同系物(例如，具有70％、80％或90％的同源性，更优选地具有至少95％的同源性)。在本发明另一优选的实施方案中，抗K-配体或抗K-配体的受体的抗体与蛋白基本上无交叉反应(即特异性反应)，该蛋白例如与SEQ.ID.NO.2或6具有少于80％的同源性，优选地与SEQ.ID.NO.：2具有少于90％的同源性；并且最优选地与SEQ.ID.NO.：2具有少于95％的同源性。“基本上无交叉反应”是指抗体与非同源性的蛋白具有结合亲合性，该蛋白与SEQ.ID.NO.2的蛋白具有少于10％，更优选地具有少于5％，并进一步更优选地具有少于1％的结合亲合性。
这里所用到的术语抗体应包括也与K-配体，或其受体发生特异性反应的抗体片段。可使用传统的技术将抗体片段化并且筛选出的片段可按照如上对完整抗体所述的方式加以利用。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体而产生F(ab’)2片段。得到的F(ab’)2片段可经处理还原二硫键以产生Fab’片段。本发明的抗体进一步应包括具有抗K-配体或抗K-配体的受体活性的生物特异性及嵌合分子。因此，针对K-配体、肿瘤配体及它们的受体的单克隆和多克隆抗体(Ab)及抗体片段如Fab’和F(ab’)2均可用于阻断配体及其各自受体的作用。
也可使用常规的重组DNA技术制备多种形式的抗体(Winter和Milstein，自然349：293-299(1991)，在这里特别引用作为参考)。例如，可构建嵌合抗体，其中来自动物抗体的抗原结合结构域与人的恒定区相连接(例如Cabilly等，U.S.4,816,567，在这里引用作为参考)。当将嵌合抗体用于人的临床治疗时可减弱观察到的由动物抗体引起的免疫原性应答。
此外，可合成识别K-配体或其受体的重组的“人源化抗体”。人源化抗体是包含大部分人的IgG序列的嵌合体，其中插入了特异性的抗原结合区。将动物用所需抗原免疫，分离相应的抗体，并去除与抗原特异性结合的可变区的序列部分。然后将来自动物的抗原结合区克隆至删除了抗原结合区的人抗体基因的适当位置上。人源化抗体最大限度地减少了人抗体中异源(即种间)序列的使用，并因此不太可能在接受治疗的对象中引起免疫应答。
不同类的重组抗体的构建还可通过制备包含可变区和从不同类的免疫球蛋白中分离的人的恒定区(CH1、CH2、CH3)的嵌合或人源化抗体来完成。例如，具有增加的抗原结合位点价的抗体可通过将抗原结合位点克隆到带有人的链恒定区的载体中而重组产生(Arulanandam等，实验医学杂志，177：1439-1450(1993)，在这里引用作为参考)。
并且，常规的重组DNA技术可通过改变抗原结合位点附近的氨基酸残基而用于改变重组抗体与其抗原的结合亲合性。人源化抗体的抗原结合亲合性可通过基于制作分子模型的诱变而增加(Queen等，美国国家科学院院报，86：10029-33(1989)，在这里引用作为参考)。
F.类似物的产生：改变的DNA和肽序列的产生
要求保护的K-配体的类似物可在氨基酸序列上与天然存在的K-配体有所不同，或者在序列以外的其它方面有所不同，或两方面均有不同。非序列修饰包括K-配体在体内或体外的化学衍生作用。非序列修饰包括，但不限于，乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化或糖基化的改变。
优选的类似物包括其K-配体的生物活性片段，它的序列与SEQ.ID.NO.2中给出的序列不同，这是由不消除K-配体活性的一个或多个保守氨基酸置换，或由一个或多个非保守氨基酸置换、缺失或插入造成的。保守置换典型地包括一个氨基酸置换具有相似特性的另一个氨基酸，例如下面组内的置换：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；及苯丙氨酸，酪氨酸。
                  表1
            保守性氨基酸置换
对于氨基酸 代码 以下列任一者置换：
丙氨酸 A D-Ala，Gly，β-Ala，L-Cys，D-Cys
精氨酸 R D-Arg，Lys，D-Lys，高-Arg，D-高-Arg，Met，Ile，D-Met，D-Ile，Orn，D-Orn
天冬酰胺 N D-Asn，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
天冬氨酸 D D-Asp，D-Asn，Asn，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
半胱氨酸 C D-Cys，S-Me-Cys，Met，D-Met，Thr，D-Thr
谷氨酰胺 Q D-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-Asp
谷氨酸 E D-Gln，D-Asp，Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-Gln
甘氨酸 G Ala，D-Ala，Pro，D-Pro，-Ala，Acp
异亮氨酸 I D-Ile，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met
亮氨酸 L D-Leu，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met
赖氨酸 K D-Lys，Arg，D-Arg，高-arg，D-高-Arg.Met，D-Met，Ile，D-Ile，Orn，D-Orn
甲硫氨酸 M D-Met，S-Me-Cys，Ile，D-Ile，Leu，D-Leu，Val，D-Val
苯丙氨酸 F D-Phe，Tyr，D-Thr，L-多巴，His，D-His，Trp，D-Trp，反式-3，4，或5-苯基脯氨酸，顺式-3，4或5-苯基脯氨酸
脯氨酸 P D-Pro，L-I-噻唑烷-4-羧酸，D-或L-1-噁唑烷-4-羧酸
丝氨酸 S D-Ser，Thr，D-Thr，别-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，L-Cys，D-Cys
苏氨酸 T D-Thr，Ser，D-Ser，别-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，Val，D-Val
酪氨酸 Y D-Tyr，Phe，D-Phe，L-多巴，His，D-His
缬氨酸 V D-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Met，D-Met
有用的诱变方法包括在下面进行更详细讨论的PCR诱变和饱和诱变。也可通过一组简并寡核苷酸序列的合成来产生随机的氨基酸序列变体的文库。
-PCR诱变
在PCR诱变中，减弱的Taq聚合酶忠实性可用于将随机的突变引入DNA的克隆片段中(Leung等，1989，技术1：11-15)。这是非常有效的并相对较快的引入随机突变的方法。要进行诱变的DNA区域可使用聚合酶链反应(PCR)在减弱通过Taq DNA聚合酶合成DNA的忠实性的条件下得到扩增，例如通过使用比率为5的dGTP/dATP并在PCR反应中加入Mn2+。可将扩增的DNA片段库插入适当的克隆载体以提供随机突变文库。
-饱和诱变
饱和诱变可实现将大量单个的碱基置换快速引入克隆的DNA片段(Mayers等，1985，科学229：242)。此技术包括突变的产生，例如，通过在体外对单链DNA进行化学处理或幅射，和互补DNA链的合成。突变频率可通过调整处理的严格性来进行调节，并且可获得基本上所有可能的碱基置换。由于此方法并不涉及对突变片段的遗传选择，因而可获得中性置换及可由DNA的随机诱变制备出的功能改变的蛋白。点突变的分布并不偏向保守的序列元件。
-简并寡核苷酸
也可由一组简并寡核苷酸序列产生同系物的文库。简并序列的化学合成可在自动DNA合成仪上进行，然后将合成的基因连接到适当的表达载体上。简并寡核苷酸的合成为本领域所知xxx。该技术已在其它蛋白的直接产生中使用xxxi。
非随机的或直接的，诱变技术可用于在特定区域中提供特异性序列或突变。这些技术可用于创造变体包括，例如，已知的蛋白氨基酸序列残基的缺失、插入或置换。突变位点可进行单独的或一系列的修饰，例如，通过(1)首先用保守的氨基酸置换，然后根据所获得的结果选择更多的基团来置换，(2)删去靶残基，或(3)靠近所处的位点插入相同或不同类的残基，或者通过1-3选项的组合。
-丙氨酸扫描诱变
丙氨酸扫描诱变是鉴定所需蛋白的特定残基或区域是否是诱变的优选位置或区域的有用方法，Cunningham和Wells(科学244：1081-1085，1989)，在这里特别引用作为参考。在丙氨酸扫描中，靶残基的残基或基团得到鉴定(例如带电荷的残基如Arg，Asp，His，Lys和Glu)并由中性的或带负电荷的氨基酸(最优选的是丙氨酸或多聚丙氨酸)进行置换。氨基酸的置换可影响氨基酸与细胞内或外的周围水环境的相互作用。然后那些证明对置换具有功能性敏感性的区域可通过在置换位点上引入进一步的或其它的变体得到精选。因此，尽管引入氨基酸序列变异的位点要预先确定，但是突变的性质本身不需预先确定。例如，为优化突变在给定位点的行为表现，可在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变并且筛选表达的所需蛋白亚基变体得到所需活性的最佳组合。
-寡核苷酸介导的诱变
寡核苷酸介导的诱变是制备DNA置换、缺失和插入变体的有用方法，见例如，Adelman等，(DNA 2：183，1983)，在这里引用作为参考。简言之，所需的DNA可通过编码突变的寡核苷酸与DNA模板的杂交来改变，其中该模板是含有所需蛋白的未改变的或天然DNA序列的质粒或噬菌体单链形式。杂交之后，用DNA聚合酶合成模板的完整的第二条互补链，它将掺入寡核苷酸引物并将编码所需蛋白的DNA中所选择的改变。一般地，使用至少有25个核苷酸长的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸具有12到15个在编码突变的核苷酸两侧与模板完全互补的核苷酸。这可确保寡核苷酸适当地与单链DNA模板分子进行杂交。使用本领域所知的技术例如由Crea等描述的(美国国家科学院院报，75：5765(1978))，在这里引用作为参考的技术使寡核苷酸易于合成。
-盒式诱变
制备变体的另一种方法，盒式诱变，是基于在这里引用作为参考的由Wells等(基因，34：315[1985])描述的技术。初始材料可以是包括要突变的蛋白亚基DNA的质粒(或其它载体)。鉴定要突变的蛋白亚基DNA中的密码子。在鉴定的突变位点的每一侧必须有唯一的限制性内切酶位点。如果没有这样的位点存在，可用上述的寡核苷酸介导的诱变方法来产生这些位点从而在所需的蛋白亚基DNA中的适当位置上引入它们。当将限制性位点引入质粒之后，在这些位点切割质粒使之线性化。使用常规方法合成编码限制性位点间的DNA序列同时含有所需突变的双链寡核苷酸。两条链分开合成然后用常规技术使它们杂交。此双链寡核苷酸称作盒。此盒设计为具有与线性化质粒的末端相似的3’和5’末端，因而它可与质粒直接连接。于是此质粒便含有突变的所需蛋白亚基DNA序列。
组合诱变
组合诱变也可用于产生突变体。例如，将一组同系物或其它相关蛋白的氨基酸序列进行序列对比，优选地促进可能的最高同源性。可选择所有出现在所排列序列的给定位置的氨基酸来建立一组简并的组合序列。变体的多样化文库通过组合诱变在核酸水平产生，并由多样化基因文库编码。例如，合成寡核苷酸的混合物可酶促连接到基因序列中，从而可能序列的简并组能作为单独的肽，或者，作为一组含有简并序列组的较大融合蛋白来表达。
筛选产生的突变基因产物的多种技术为本领域所知。筛选大基因文库的技术经常包括将基因文库克隆到能复制的表达载体中，用得到的载体文库转化适当的细胞，并在可检测所需活性的条件下表达基因，例如，在此情况中，与K-配体或其受体结合，可促进编码其产物得到检测的基因的载体的相对容易的分离。下面所描述的每种技术易于大量进行分析筛选所产生的大量序列，例如通过随机诱变技术产生的序列。
本发明还提供要求保护的多肽或其受体的蛋白结合结构域的减少，以产生模拟分子，例如肽或非肽药剂。肽模拟分子能破坏K-配体与其受体的结合。与受体多肽或下游细胞内蛋白的分子识别相关的K-配体的关键残基，可得到测定并用于产生能竞争性或非竞争性抑制K-配体与其受体结合的K-配体或其受体衍生的肽模拟分子(见例如，“抑制人乳头瘤病毒蛋白与成视网膜细胞瘤基因蛋白结合的肽抑制剂”欧洲专利申请EP-412,762A和EP-B31,080A)，在这里特别引用作为参考。
G.药物组合物
通过制备合用的纯化的及重组的K-配体，本发明提供可用于筛选候选药物的测定方法，这些候选药物是正常细胞功能的拮抗剂或拮抗物，在这一方面中，是K-配体或其受体的激动剂或拮抗剂。在一个实施方案中，测定方法可对化合物调节K-配体与其受体之间的结合能力作出评价。多种测定形式均可使用，并且按照本发明，本领域技术人员可以领会。
在许多测试化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，需要进行大量测定以使在给定时间范围内研究的化合物的数目最大。在无细胞体系，如可以从纯化的或半纯化的蛋白衍生出的体系中进行的测定，作为“初级”筛选方法常常是优选的，因为它们可快速地并相对容易地检测分子靶中由所测试的化合物所介导的变化。并且，所测试化合物的细胞毒性效应和/或生物利用性在体外系统中一般可忽略，相反测定主要集中在药物对分子靶的作用如表现在与其它蛋白的结合亲合性的改变上或分子靶的酶促特性的变化上。
本发明的药物组合物可包含治疗有效量的K-配体，或其受体，或其模拟分子的片段，并可选择性地包括药物上可接受的载体。因此，本发明提供治疗癌症的方法，及刺激，或在某些情况下抑制免疫系统的方法，或通过将药物有效量的本发明的化合物或其药物上可接受的盐或衍生物进行给药而实施的上述方法的一部分。显然应当理解本发明的组合物和方法可与其它各种治疗方法结合使用。
组合物可针对不同给药途径，包括全身的、局部的或定位的给药进行配方。对于全身给药，注射是优选的，包括肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下注射，本发明的组合物可配成液体溶液的形式，优选地配制在生理相容性缓冲液如Hank’s溶液或Ringer’s溶液中。并且，组合物可配制成固体的形式，并可选择地，在使用之前立即重新溶解或悬浮。冻干的形式也包括在本发明中。
组合物可口服给药，或通过跨粘膜的或跨皮肤的方法进行给药。对于跨粘膜或跨皮肤给药，在配方中使用适于透过屏障的渗透剂。这些渗透剂为本领域所知，并包括，例如，对于跨粘膜给药来说有胆盐、梭链孢酸衍生物和去污剂。跨粘膜给药可通过鼻腔喷雾剂或使用栓剂。对于口服给药，可将组合物配成常规的口服给药的形式如胶囊、片剂或补剂。对于局部给药，可将本发明的组合物配成本领域所知的软膏、油膏、凝胶或乳剂。
优选地，本发明的组合物可制成单位剂量的形式并且每天给药一次或多次。在治疗过程中一次给药的活性化合物的量依赖于许多因素。例如，接受治疗者的年龄和大小、所治疗疾病的严重程度和过程、给药的方式和形式以及治疗医生的判断。然而，有效剂量可以从约0.005到约5mg/kg/天，优选地从约0.05到约0.5mg/kg/天。本领域技术人员知道再低一些和再高一些的剂量也是有用的。
根据本发明所述的基因构建体也可用作基因治疗方案的一部分以传递编码K-配体多肽的激动剂或拮抗剂形式的核酸。
要求保护的K-配体的表达构建体可在任何具生物有效性的载体中进行给药，例如，任何能在体内将要求保护的K-配体的基因有效传递到细胞的配方或组合物。其方法包括将基因插入能直接转染细胞的病毒载体中，或在某些物质如脂质体，或细胞内载体的帮助下传递质粒DNA，以及直接注射基因构建体。病毒载体转移方法是优选的。
基因治疗构建体的药物制剂可基本上由可接受的稀释剂中的基因传递系统组成，或者可包括缓慢释放的基质，其中包埋有基因传递载体。此外，当完整的基因传递系统可从重组细胞，例如逆转录病毒载体中完整地产生时，药物制剂可包含产生基因传递系统的一个或多个细胞。
除了在治疗中的应用，本发明的寡聚物可用作诊断试剂以检测与之特异性结合的靶DNA、RNA或氨基酸序列的存在或缺失。在其它方面，要求保护的本发明可用于评价化学个体与要求保护的K-配体或其片段进行相互作用如与之结合或发生物理学关联的能力。方法包括使化学个体与K-配体接触，并评价该个体与K-配体相互作用的能力。此外，本发明的K-配体可用在评价天然产生的K-配体或K-配体的受体，以及评价与K-配体的受体缔合或结合的化学个体的方法中。
在某些方面，要求保护的本发明的特征在于评价化学个体调节K-配体及其受体之间相互作用的能力的方法。该方法包括使K-配体的受体与K-配体在它们能发生相互作用的条件下进行结合，加入要调节的化学个体并检测复合物的形成或离解。可进一步在体外对这些调节剂进行评价，例如通过在无细胞体系中检测其活性，然后，选择性地对细胞或动物进行化合物给药，并评价其作用。
H.实施例
c)与要求保护的K-配体结合的受体的分离
TNF家族的配体可用于鉴定及克隆受体。用上述K-配体序列，我们可将组成受体结合序列的K-配体胞外结构域的5’端与标记序列融合，然后加入先导序列，使K-配体在任一表达系统中分泌出来。此技术的一个例子由Browning等(1996)(JBC 271，8618-8626)描述，其中LT-β配体以该种形式分泌。VCAM先导序列与短的myc肽标记偶联其后是LT-β胞外结构域。VCAM序列用于使一般与膜结合的LT-β分子分泌出来。分泌的蛋白在N-末端保留有myc标记，这并不损害它与受体结合的能力。这样的分泌蛋白可在瞬时转染的Cos细胞或类似的系统，例如EBNA衍生的载体、昆虫细胞/杆状病毒、毕赤酵母等中表达。未纯化的细胞上清液可用作标记配体的来源。
表达受体的细胞可通过将它们暴露于标记的配体而得到鉴定。具有结合配体的细胞在FACS实验中通过用抗myc肽的抗体(9E10)标记myc标记，然后再用藻红蛋白(或类似的标记)标记的抗鼠免疫球蛋白标记而得到鉴定。FACS阳性的细胞易于鉴定并可作为编码受体的RNA的来源。然后可用常规技术从此RNA中制备出表达文库并分成集合体。将克隆的集合体转染到适当的宿主细胞中并使标记的配体与经显微镜检查确定为受体阳性的转染细胞结合，然后用酶标记的抗鼠Ig试剂，即半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或荧光素酶标记的抗体标记结合的myc肽标记。一旦鉴定出阳性的集合体，集合体的大小会减小直至鉴定出编码cDNA的受体。此方法可用小鼠或人的K-配体来实施，选择它们中更易导向受体的K-配体。
本领域技术人员可明显看出在不背离本发明精神或范围的情况下，可对本发明的新的K-配体、组合物和方法进行各种修饰和改变。因此，这表明本发明包括本发明的修饰和改变，条件是这些修饰和改变是在所附的权利要求书及它们的等价物的范围之内。SEQ.ID.NO.1
        1   TGCCAAGCCC TGCCATGTAG TGCACGCAGG ACATCAACAA ACACAGATAA
       51   CAGGAAATGA TCCATTCCCT GTGGTCACTT ATTCTAAAGG CCCCAACCTT
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      151   CCTTACTTCT TGCCTTAAGA AAAGAGAAGA AATGAAACTG AAGGAGTGTG
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      301   CACGGTGGTG TCTTTCTACC AGGTGGCCGC CCTGCAAGGG GACCTGGCCA
      351   GCCTCCGGGC AGAGCTGCAG GGCCACCACG CGGAGAAGCT GCCAGCAGGA
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     1051   TASEQ ID NO. 2
        1   MDDSTEREQS RLTSCLKKRE EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA
       51   TLLLALLSCC LTVVSFYQVA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA
      101   GLEEAPAVTA GLKIFEPPAP GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI
      151   ADSETPTIQK GSYTFVPWLL SFKRGSALEE KENKILVKET GYFFIYGQVL
      201   YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF GDELSLVTLF RCIQNMPETL PNNSCYSAGI
      251   AKLEEGDELQ LAIPRENAQI SLDGDVTFFG ALKLLSEQ.ID NO. 3
        1   GTGGTCACTT ACTCCAAAGG CCTAGACCTT CAAAGTGCTC CTCGTGGAAT
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     1301   CTCAGGATTT ACTCTCCCTT CTCATGCTAA GTACACACAC GCTCTTTTCC
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Claims (35)

1.一种编码K-配体的DNA序列或其片段。
2.一种编码K-配体的DAN序列，所述序列基本上由SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3组成。
3.一种基本上由SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3组成的DNA序列，所述DNA编码多肽，所述多肽基本上由SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.4组成。
4.一种至少与SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3的片段进行杂交的DNA序列，所述片段包含至少20个连续的碱基，所述DNA序列编码与K-配体的活性位点具有至少30％同源性的多肽。
5.根据权利要求2所述的DNA序列，其中所述序列基本上由具有保守置换、改变或缺失的SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3组成。
6.一种包含编码K-配体的DNA序列的重组DNA分子，所述序列可操作地与表达控制序列连接。
7.包含SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3的权利要求6所述的分子。
8.用权利要求6或7所述的重组DNA分子转化的单细胞宿主。
9.一种编码具有SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列的K-配体的DNA序列。
10.一种产生基本上纯的K-配体的方法，包括培养权利要求8所述的单细胞宿主的步骤。
11.基本上不含一般所结合的动物蛋白的K-配体。
12.权利要求11所述的K-配体，基本上由SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.4组成。
13.一种包含治疗有效量的K-配体或其活性片段，及药物上可接受的载体的药物组合物。
14.一种防止或减弱自身免疫疾病的严重程度的方法，包含将权利要求13所述的治疗有效量的药物组合物进行给药的步骤。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述K-配体或其活性片段包含SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.4，或其生物活性片段。
16.一种防止或减弱对移植组织免疫应答的严重程度的方法，包括将治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物进行给药的步骤。
17.一种刺激免疫系统的方法，包括将权利要求13所述的药物组合物进行给药的步骤。
18.一种抑制免疫系统的方法，包括将有效量的权利要求13所述的药物组合物进行给药的步骤。
19.一种治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物进行给药的步骤。
20.一种鉴定K-配体的受体的方法，包括以下步骤：
a.提供K-配体或其片段，
b.用可检测的标记来标记所述K-配体或其片段；
c.筛选组合物以检测与步骤b中可检测地标记的K-配体结合的受体。
21.一种权利要求11所述的K-配体的可溶性生物活性片段。
22.一种包含由选自下面组中的DNA编码的氨基酸序列的多肽，该组包括：
a.包括SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3的DNA序列；
b.与a.中所定义的DNA杂交并在表达上编码与权利要求12所述的K-配体具有至少40％同源性的多肽的DNA序列。
23.一种与K-配体或其受体或其生物活性片段反应的抗体制剂。
24.根据权利要求23所述的抗体制剂，包括单克隆抗体。
25.一种生产与K-配体或其受体反应的抗体制剂的方法，包括用K-配体或其受体，或其抗原片段免疫生物体的步骤。
26.一种针对K-配体的反义核酸，包含与SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.3的至少一部分进行杂交的核酸序列。
27.一种包含权利要求24所述的抗体制剂的药物组合物。
28.一种在哺乳动物细胞中表达基因的方法，包括以下步骤：
a.将编码K-配体的基因引入细胞；
b.使该细胞在所述基因在所述哺乳动物中表达的条件下存活。
29.一种治疗哺乳动物中与K-配体相关的紊乱的方法，包括
a.将治疗有效量的包含编码K-配体的基因的载体引入细胞；和
b.在所述哺乳动物细胞中表达所述基因。
30.根据权利要求29所述的方法，其中哺乳动物是人。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体是病毒。
32.一种诱导细胞死亡的方法，包括将能干扰K-配体与受体结合的药剂进行给药的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，进一步包括干扰素-γ的给药。
34.一种治疗、抑制或改变与K-配体及其受体之间的信号途径相关的免疫应答的方法，该方法包括将有效量的能干扰K-配体及其受体之间结合的药剂进行给药的步骤。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫应答与人的腺癌细胞相关。
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