KR20010023892A - Ｋａｙ-신규 면역계 단백질 - Google Patents

Ｋａｙ-신규 면역계 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20010023892A
KR20010023892A KR1020007002576A KR20007002576A KR20010023892A KR 20010023892 A KR20010023892 A KR 20010023892A KR 1020007002576 A KR1020007002576 A KR 1020007002576A KR 20007002576 A KR20007002576 A KR 20007002576A KR 20010023892 A KR20010023892 A KR 20010023892A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ligand
kay
seq
sequence
dna
Prior art date
Application number
KR1020007002576A
Other languages
English (en)
Inventor
취오프주르크
Original Assignee
베레이, 헨리
아포테크 알 앤드 디 에스에이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베레이, 헨리, 아포테크 알 앤드 디 에스에이 filed Critical 베레이, 헨리
Publication of KR20010023892A publication Critical patent/KR20010023892A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 계열(TNF)의 신규 구성원인 Kay-리간드, 변형된 Kay-리간드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

ＫＡＹ- 신규 면역계 단백질{KAY-A NOVEL IMMUNE SYSTEM PROTEIN}
종양 괴사 인자(TNF) 관련 시토킨은 숙주 방어 및 면역 조절의 매개인자이다. 이 계열의 구성원은 세포 대 세포 접촉을 통해서 국부적으로 작용하거나 또는 더 원거리에 있는 표적으로 확산할 수 있는 분비 단백질로서 막 고착된 형태로 존재한다. 유사 계열의 수용체는 표적 조직내 세포 사멸 또는 세포 증식 및 분화의 개시를 유도하는 이들 분자의 존재에 대해 신호를 보낸다. 현재, 리간드 및 수용체의 TNF 계열로는 11개 이상의 인식된 수용체-리간드 쌍, 예컨대 TNF:TNF-R, LT-α:TNF-R, LT-α/β:LT-β-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 및 4-1BBL:4-1BB 등이 있다. 이들 리간드를 암호화하는 DNA 서열은 최대로 관련된 경우에도 동일성은 겨우 약 25∼약 30% 이지만, 아미노산 관련도는 약 50%이다.
이 계열의 시토킨 수용체에 있어서 명백한 특징은 2개의 특징적인 TNF 수용체의 분자 클로닝으로 초기에 밝혀진 시스테인 풍부 세포외 도메인에서 발견된다i. 이 계열의 유전자는 세포 기능을 활성화시키는데 관련된 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막 스패닝(spanning) 영역 및 세포질 영역이 있는 I형 경막 단백질의 당단백질 특성을 암호화한다. 시스테인 풍부 리간드 결합 영역은 치밀하게 밀착된 디설피드 결합 코어 도메인을 나타내는데, 특정 계열 구성원에 따라 수회 반복된다. 대부분의 수용체는 4개의 도메인을 보유하지만, 3개 정도로 적은 수의 도메인을 보유하거나 또는 6개 정도의 많은 수의 도메인을 보유할 수도 있다.
리간드의 TNF 계열내 단백질은, 종종 종지 전달 서열로서 작용하는 것으로 생각되는 일부 리신 또는 아르기닌 잔기를 함유하는 정상적으로 짧은 친수성 아미노산의 짧은 N-말단 연신물을 특징으로 한다. 그 다음에는 경막 영역 및 가변 길이의 세포외 영역이 있는데, 세포외 영역은 막으로부터 C-말단 수용체 결합 도메인을 분리한다. 이 영역은 때로는 "스턱(stalk)"이라고 부른다. C-말단 결합 영역은 거대한(bulk) 단밸질을 포함하며, 항상은 아니지만 대부분 글리코실화 부위를 포함한다. 이들 유전자는 I형 막 단백질, II형 막 단백질의 고유 신호 서열 특성이 결핍되어 있으며 C 말단은 세포외에 위치하고 짧은 N 말단 도메인은 세포질내에 존재한다. 일부 경우, 예컨대 TNF 및 LT-α에서 스턱 영역내 절단은 단백질 프로세싱 초기 과정에서 발생할 수 있으며, 그 후 리간드는 주로 분비된 형태로 발견된다. 그러나, 대부분의 리간드는 막 형태내에 존재하여 국부화된 신호를 매개한다.
이들 리간드의 구조는 TNF, LT-α 및 CD40L의 결정학 분석으로 명확히 특성규명되어 있다. TNF 및 림포톡신-α(LT-α)는 모두 "젤리 롤" 또는 그리스 양식 형태학(Greek key topology)를 보유한 2개의 역평행 β-주름 시이트의 샌드위치로 구조화된다ii. Cα 및 β 잔기 사이의 rms 편차는 0.61C인데, 이는 분자 형태학에서의 고도의 유사도를 나타내는 것이다. CD40L, TNF 및 LTα의 분자 연구로부터 밝혀진 구조적 특징은 올리고머 복합체내로의 회합 성향이다. 올리고머 구조의 본질은 다가 리간드를 형성하는 인접 서브유닛사이의 연결부에서 수용체 결합 부위를 형성하는 것이다. TNF, CD40L, 및 LT-α의 4차 구조는 결정 구조의 분석에 의해 삼량체로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 상이한 리간드 사이에 보존된 다수의 아미노산이 골격 β시이트의 연신물내에 있다. 이들 분자에서 기본 샌드위치 구조가 보존되는 것으로 보이는데, 그 이유는 골격 서열의 일부가 각종 계열의 구성원에 걸쳐 보존되기 때문이다. 4차 구조는 서브 유닛 형태가 유사하게 남아있기 때문에 유지될 수 있다.
TNF 계열 구성원은 세포 생존 및 분화를 제어하는 면역계에서 가장 좋은 주요 스위치로서 설명될 수 있다. 현재 기타의 주로 막 고착된 TNF 계열의 구성원과는 대조적으로 TNF 및 LTα만이 분비 시토킨으로 알려져 있다. TNF의 막 형태는 특성규명되어 있고 고유의 생물학적 역할을 할 것 같지만, 분비된 TNF는 촉발 작용의 부위로부터 더 이격되어 있는 세포에 대한 일반적인 경고 신호로서 작용한다. 따라서, TNF 분비는 세포의 염증 상태 및 맥관구조 내면에서의 잘 알려진 변화를 유도하는 현상을 증폭시킬 수 있다. 대조적으로,이 계열의 막 결합된 구성원은 직접 접촉시 세포에만 TNF형 수용체를 통해 신호를 보낸다. 예를 들어, T 세포는 동기원의 TCR 상호작용을 통해서 직접 접촉하는 B 세포에만 CD40 매개된 "도움"을 제공한다. 세포 사멸을 유도하는 능력에 대한 유사한 세포-세포 접촉 한계를, 연구되어 있는 Fas계에 적용한다.
TNF 리간드를 세포 사멸을 유도하는 능력을 기초로하여 3개의 그룹으로 나눌 수 있다(표 3). 제1 군은 TNF, Fas 리간드 및 TRAIL로 여러 주에서 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있고, 이의 수용체는 가장 우수한 표준 사멸 도메인을 갖는 것 같다. 아마도 DR-3(TRAMP/WSL-1)에 대한 리간드는 모두 이 카테고리에 포함될 것이다. 제2 군은 일부 세포 유형에만 한정된 약한 사멸 신호를 촉발하는 리간드로서, 예로는 TWEAK, CD30 리간드, 및 LTa1b2가 있다. 이 군의 구성원들이 표준 사멸 도메인의 부재하에 세포 사멸을 촉발하는 방법은 관심의 대상인데, 이는 별도의 더 약한 사멸 발신 메카니즘이 존재한다는 것을 제안한다. 마지막으로, 제3 군은 사멸 신호를 효과적으로 전달할 수 없는 구성원들로 되어 있다. 아마, 모든 군(예, CD40)은 일부 세포 유형에 대한 증식 억제 효과와, 이에 따른 세포 분화를 유도한다(Funakoshi et al., 1994).
TNF 계열은 최근 몇년 동안 급격히 증가하여 면역계의 조절과 관련된 11개 이상의 상이한 발신 경로를 포함한다. TWEAK 및 TRAIL의 널리 보급된 발현 패턴은 이 계열에 포함되지 않은 더 많은 작용성 변형체가 있음을 제시하는 것이다. 이러한 측면은 라우스 육종 및 헤르페스 심플렉스 바이러스가 복제하는 능력에 영향을 주는 2개의 수용체의 발견 뿐 아니라 TNF가 항바이러스 활성을 보유하고 폭스 바이러스가 유인성 TNF 수용체를 암호화한다는 관찰 결과에서 최근 강조되었다(Brojatsch et al., 1996; Montgomery et al., 1996; Smith, 1994; Vassalli, 1992).
TNF는 패혈증 쇼크 및 악액질의 매개인자이며iii, 조혈 세포 형성의 조절에 관련되어 있다iv. TNF는 항종양 활성vi뿐 아니라 박테리아, 바이러스 및 기생충 감염v에 대한 염증 및 방어의 매개인자로서 중요한 역할을 나타낸다. TNF는 여러 자가면역 질병에도 관련되어 있다vii. TNF는 대식세포, 섬유아세포, T 세포 및 천연 킬러 세포를 비롯한 여러 유형의 세포가 생성할 수 있다viii. TNF는 2개의 다른 수용체에 결합하는데, 각각은 특정 세포내 발신 분자를 통해서 작용하며, 따라서 상이한 TNF 효과를 초래한다ix. TNF는 막 결합 형태로서 또는 가용성 분비 시토킨으로서 존재할 수 있다x.
LT-α는 TNF와 여러 가지 활성, 즉 TNF 수용체에 대한 결합 활성xi을 공유하지만, TNF와는 달리 활성화된 T 세포 및 일부 β-림프구아세포 종양에 의해 주로 분비되는 것으로 보인다xii. LT-α 및 LT-β의 헤테로량체 복합체는 LT-β 수용체에 결합하는 막 결합 복합체이다xiii. LT계(LTs 및 LT-R)는 말초 림프구 기관의 형성과 관련되어 있는 것으로 보이는데, 그 이유는 LT-β의 유전자 파열이 비장내 T 및 B 세포의 분열과 림프절의 부재를 유도하기 때문이다xiv. LT-β계는 일부 아데노암종 세포주의 세포 사멸과 관련이 있다xv.
Fas-L은 또 다른 TNF 계열의 구성원으로서, 활성화된 T 세포상에서 주로 발현된다xvi. 프로그래밍된 세포 사멸 또는 고사로서 알려진 기작에 의해서 Fas-L은 종양 세포 및 HIV-감염된 세포를 비롯하여 수용체를 보유하는 세포 사멸을 유도한다xvii. 또한 Fas 또는 Fas-L의 결함은 림프증식성 질병을 유도할 수 있는데, 이로서 면역 반응의 제어에 있어서 Fas계의 역할을 확인할 수 있다xviii. Fas계은 간염 만성 감염으로부터 생긴 간 손상xix및 HIVxx감염된 환자의 자가면역과 관련되어 있다. Fas계은 HIV 환자내 T 세포 파괴와 연관되어 있다xxi. TNF 계열의 또 다른 일원인 TRAIL은 다양한 기원의 각종 형질전환된 세포주의 사멸과 연관되어 있는 것 같다xxii.
CD40-L은 TNF 계열의 또 다른 구성원으로서 T 세포에서 발현되고 CD-40 보유 B 세포를 유도한다xxiii. 또한, CD40-L 유전자에 있어서의 변경은 X-결합형 고-IgM 증으로서 알려진 질병을 초래한다xxiv. CD계는 여러 자가면역 질병xxv과 관련되어 있고 CD40-L은 항바이러스 특성을 보유하는 것으로 알려져있다xxvi. CD40계는 고사 B 세포의 구제와 관련되어 있고xxvi, 비면역 세포에서 고사를 유도한다xxviii. TNF 계열의 여러 추가의 림프구 구성원은 동시자극과 연관되어 있다xxix.
일반적으로, TNF 계열의 구성원은 면역계를 제어하고 급성 숙주 방어계를 활성화시키는데 기본적인 조절 역할을 한다. 치료 유용성을 위해 TNF 계열의 구성원을 조작하는데 있어서의 현재 진척이 이루어져, TNF 계열의 구성원이 질병을 제어하는데 고유의 수단을 제공할 수 있을 것 같다. 이 계열의 일부 리간드는 다수의 형질전환된 세포, 예컨대 LT, TNF, Fas 리간드 및 TRAIL의 고사 사멸을 직접 유도할 수 있다(Nagata, 1997). Fas 및 가능하게는 TNF 및 CD30 수용체 활성화는 면역조절 작용을 수행할 수 있는 비형질전환된 림프구의 세포 사멸을 유도할 수 있다(Amakawa et al., 1996; Nagata, 1997; Sytwu et al, 1996; Zheng et al., 1995). 일반적으로, 사멸은 TNF 수용체의 세포질 측에 존재하는 사멸 도메인의 집합부 뒤에서 촉발된다. 사멸 도메인은 카스파제 캐스케이드의 활성화를 초래하는 각종 신호 형질도입 성분의 회합체를 결집시킨다(Nagata, 1997). 표준 사멸 도메인이 결핍되어 있는 일부 수용체, 예컨대 LTb 수용체 및 CD30(Browning et al., 1996; Lee et al., 1996)는 비록 약하기는 하지만 세포 사멸을 유도할 수 있다. 세포 분화 및 사멸을 주로 유도하는 이들 수용체 작용은 일부 형질전환된 세포주의 이상 결과이지만, 이 상황은 CD30 눌 마우스에서의 연구가 흉선내 음성 선별에서의 사멸 역할을 제안한 것과 같이 명확하지 않은 것 같다(Amakawa et al., 1996). 역으로, CD40과 같은 기타 경로를 통한 신호는 세포 생존을 유도하는데 필요하다. 따라서, TNF 계열의 구성원인 추가의 분자를 확인 및 특성규명하여 질병을 제어하고 면역계를 조작하는데 추가의 수단을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 종양 괴사 인자 계열의 일원인 신규 리간드 Kay에 관한 것이다. 이 단백질 또는 수용체는 항암 및/또는 면역조절 용도를 보유할 수 있다. 또한, 신규 리간드를 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포를 유전자 치료에 사용하여 종양, 자가면역 및 염증성 질병 또는 유전되는 유전 질환을 치료할 수 있으며, 이들 단백질에 대한 항체를 차단하여 면역조절 용도를 보유할 수 있다.
도 1: 쥐 및 인간 Kay-리간드의 아미노산 서열의 배열. 윗줄의 쥐 서열은 cDNA를 직접 클로닝하여 얻었다. 인간의 서열은 부분적 cDNA 및 5'RACE 결정의 복합체를 반영한 것이다. 아래에 있는 세번째 줄은 공통 서열을 나타낸다.
도 2: 인간 KayL cDNA의 단편을 사용하여 각종 인간 조직으로부터 얻은 RNA의 노던 블롯을 조사하였다. 대체로 2.4 Kb KayL RNA는 비장 및 말초 혈액 림프구, 즉 2차 림프구 기관에서 주로 발현된다는 것을 알 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 바람직한 양태들을 참고로 상세히 설명할 것이다. 본 발명은 인간 또는 마우스 Kay-리간드, 이의 단편 및 상동체를 암호화하는 DNA 서열과 이들로 형질전환시킨 숙주내에서의 이들 DNA 서열의 발현에 관한 것이다. 본 발명은 이들 DNA 서열 및 이 서열이 암호화하는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 Kay-리간드 또는 이의 단편에 대한 인간 및 마우스 아미노산 서열과 이 서열로부터 유도되거나 또는 이 서열을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
A. 정의
본 명세서에서 사용된 "상동성"은 비교하고자 하는 분자사이의 서열 유사성을 의미한다. 2개의 비교되는 서열내에서의 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 차지하는 경우, 예컨대 아데닌이 2개의 DNA 분자의 각각의 위치를 점유하고 있는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이 있다. 2개의 서열 사이의 상동률은 2개의 서열이 공유하는 정합 또는 상동성 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나눈 후 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어 2개의 서열내 10개 중 6개의 위치에서 정합성 또는 상동성이면, 2개의 서열은 60% 상동성이 있다. 일례로서, DNA 서열이 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로 2개의 서열이 정렬되어 최대 상동성을 제공하도록 비교한다.
본 명세서에서 폴리펩티드의 "정제된 제제" 또는 "실질적으로 순수한 제제"는 자연 발생적인 기타 단백질, 지질 및 핵산에서 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는, 예컨대 항체, 매트릭스 등 정제하는데 사용된 기타 물질로부터 분리하는 것이 바람직하다.
"형질전환된 숙주"는 게놈내로 도입되어 안정하게 통합된 서열, 즉 Kay-리간드 서열을 보유한 임의의 숙주 또는 서열, 즉 리간드를 암호화하는 에피좀 성분을 보유하는 숙주를 포함한다.
"처리"는 임의의 치료학적 처리, 예컨대 치료제 또는 물질(예, 약물)의 투여를 포함한다.
"실질적으로 순수한 핵산", 예컨대 실질적으로 순수한 DNA는 (1) 하나 또는 두개의 서열, 예컨대 암호화 서열이 바로 인접하여 있지 않고, 핵산이 유도된 유기체의 자연 발생적 게놈내에 직접 인접하거나(즉 5' 말단에서 하나 및 3' 말단에서 하나), 및/또는 (2) 핵산이 유도된 유기체내에서 발생하는 핵산 서열이 거의 없는 핵산이다. 이 용어는 벡터, 예컨대 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스내로, 또는 원핵 세포나 진핵 세포의 게놈 DNA 내로 도입되거나, 또는 기타 DNA 서열과 무관한 별개의 분자(예, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 실질적으로 순수한 DNA는 Kay-리간드를 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환하여 사용된다.
"생물학적 활성"은 직접 또는 간접적으로 수행할 수 있는 생체내 또는 시험관내 활성을 의미한다. Kay-리간드의 생물학적 활성 단편은 리간드의 활성 부위에 대해, 예컨대 70% 이상의 아미노산 상동성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상의 상동성이 있을 수 있다. 리간드에 대한 동일성 또는 상동성은 서열 번호 2의 Kay-리간드 잔기와 동일한 후보 서열에 있는 아미노산의 비율로서 정의한다.
기타의 언급이 없으면 본 발명의 실시는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 돌연변이 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기법을 사용하며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기법은 문헌에 개시되어 있다.
B. 본 발명의 DNA 서열
본 명세서에서 개시한 바와 같이, 본 발명의 제1 측면은 서열 번호 1에 개시된 DNA와 같이 Kay-리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 거의 순수한 (또는 재조합) 핵산 및/또는 이 핵산의 등가물을 특징으로 한다. 본원에서 사용된 핵산은, 예컨대 작용적으로 등가인 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 단편 및 등가물을 포함할 수 있다. 등가 뉴클레오티드 서열은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 상이한 서열, 예컨대 대립유전자 변형체, 돌연변이 등을 포함하고, 유전자 암호의 축퇴성에 기인하여 서열 번호 1에 개시된 Kay-리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 다른 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 인간 서열을 개시하고 있다. 본 발명은 일반적으로 인간 서열에 대하여 기술할 것이지만, 당업자라면 마우스 서열이 본원에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 인간 단백질은 TNF 계열의 모든 특성, 즉 II형 막 단백질 조직화 및 TNF 역평행 β시이트 구조로 중첩시키는데 관련된 서열 모티프의 보존과 같은 특성을 가지는 것으로 보인다.
Kay-리간드에 대한 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 개시되어 있다. Kay-리간드에 대한 이 아미노산 서열은 서열 번호 2에 개시되어 있다.
본 발명의 서열을 사용하여 Kay-리간드, 이의 단편이나 유도체에 밀접하게 관련된 DNA 서열의 존재에 대해 천연 및 합성 DNA의 각종 수거물을 검색하는데 유용한 일련의 DNA 프로브를 제조할 수 있다. 당업자는 본원에서 Kay-리간드라고 하면 이의 생물학적 활성 유도체, 단편 또는 상동체를 언급하는 것임을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열을 사용하여 이 서열로 형질전환된 각종 원핵 숙주 및 진핵 숙주에서 발현시 본 발명의 펩티드를 생성할 수 있다. 이들 펩티드는 항암 용도, 및 면역 조절 용도로 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 방법은 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 Kay-리간드를 암호화하는 서열을 함유하는 DNA 분자로 형질전환시킨 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 각종 숙주/벡터 조합체를 사용하여 발현할 수 있다. 예를 들어, 유용한 벡터는 염색체, 비염색체 또는 합성 DNA 서열의 분절로 구성할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 벡터내로 삽입된 Kay-리간드 DNA 서열에 작동가능하게 결합되어 DNA 서열의 발현을 제어 및 조절할 수 있는 하나 이상의 발현 제어 서열을 특징으로 한다.
또한, 각 발현 벡터내에서 본 발명의 Kay-리간드 서열의 삽입체에 대해 각종 부위를 선별할 수 있다. 이 부위는 이를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 명명되는 것이 일반적이며, 이들 부위 및 엔도뉴클레아제는 당업자라면 알 수 있을 것이다. 본 발명에 유용한 발현 벡터는 소정의 DNA 단편의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가질 필요가 없다는 것을 이해해야 한다. 대신, 벡터는 별도의 수단으로 그 단편에 클로닝할 수 있다. 발현 벡터, 특히 선택된 DNA 단편의 도입을 위해 그 벡터 내부에서 선택되는 부위와, 그 내부에서 발현 제어 서열에의 작동가능한 결합은 각종 인자에 의해 결정된다. 이들 인자의 비제한적인 예로는, 발현하고자 하는 단백질의 크기, 숙주 세포 효소에 의한 단백질의 분해에 대한 목적하는 단백질의 감수성, 특정 제한 효소에 대해 감수성인 다수의 부위, 정제 과정에서 제거되기 어려운 것으로 판명된 숙주 세포 단백질에 의해 나타나는 단백질 오염 또는 결합이 있다. 고려할 수 있는 추가의 인자로는 벡터 서열에 대한 개시 및 종지 코돈의 위치와 같은 발현 특성 및 당업자들이 알 수 있는 기타 인자가 있다. 본 발명의 DNA 서열에 대한 벡터 및 삽입 부위는 이들 인자의 균형을 고려하여 선택하며, 모든 선별이 소정의 목적에 따라 동일하게 효과적이지는 않다. 그러나, 이들 인자를 분석하고 특정 용도에 따라 적절한 계를 선택하여 분석하는 것은 당업자들에게는 자명할 것이다.
당업자라면 고레벨의 단백질 발현을 얻기 위해서 발현 제어 서열을 적절히 변형, 즉 코돈 치환하거나, 또는 특정 유기체가 선호하여 사용하는 특정 아미노산에 대한 코돈을 선별하여 단백질 분해를 최소화하거나 또는 글리코실화 조성을 변화시킨다. 유사하게, 시스테인을 기타 아미노산으로 변화시켜 생성, 리폴딩 및 안정성 문제를 단순화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모든 숙주/발현 벡터 조합체가 동일한 효과를 나타내는 것은 아니다. 그러나, 숙주/발현 벡터 조합체를 당업자가 특별히 선별할 수 있다. 고려할 수 있는 인자로는, 예컨대 숙주 및 벡터의 적합성, DNA 서열이 암호화하는 단백질의 숙주에 대한 독성, 소정 단백질의 회수 용이성, DNA 서열의 발현 특성 및 이에 작동가능하게 결합된 발현 제어 서열, 생체안전성, 비용 및 폴딩, 형태 또는 소정 단백질의 기타 필요한 발현후 변형을 고려할 수 있다.
본 발명의 서열로 형질전환된 숙주가 생성한 Kay-리간드 및 이의 상동체, 뿐 아니라 본 발명의 과정으로 정제하거나 또는 본 발명의 아미노산 서열로부터 생성된 천연 Kay-리간드는 각종 조성물과 항암, 항종양 및 면역 조절 용도에 유용하다. 또한, 이들 Kay-리간드는 기타 질병에 대해 유도된 치료 및 방법에도 유용하다.
또한, 본 발명은 비정상적인 증상하에서 리간드를 발현하기 위한, 유전자 치료 세팅에서의 본 발명의 DNA 서열의 용도에 관한 것이다. Kay-리간드는 이러한 용도로 적절한 프로보터의 유도하게 종양 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 발현은 항종양 면역 반응을 증가시키거나 또는 종양의 생존에 직접 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 리간드는 국부 면역 반응을 변경하여 기관 이식의 생존에 영향을 줄 수 있다. 이 경우, 이식편 자체 또는 그 주변 세포는 Kay-리간드를 암호화하는 유전자 조작된 유전자로 변형시킨다.
본 발명의 또 다른 측면은 "안티센스" 요법에서 Kay-리간드를 암호화하는 분리된 핵산의 용도에 관한 것이다. "안티센스" 요법은 해당 리간드를 암호화하는 세포 mRNA 및/또는 DNA와 세포 조건하에 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 투여 또는 동일계 생성하여 전사 및/또는 해독을 억제하여 암호화된 단백질의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다. 종래의 염기쌍 상보성, 또는 예컨대 DNA 이중체에 결합한 경우 이중 나선의 주요 홈내 특정 상호작용을 통해 결합할 수 있다. 일반적으로, "안티센스" 요법은 당업계에 일반적으로 사용되는 기술 범위를 의미하며, 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특정 결합에 좌우되는 임의의 치료를 포함한다.
본 발명의 안티센스 작제물은, 예컨대 세포내 전사될 때 Kay-리간드를 암호화하는 세포 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 RNA를 생성하는 발현 플라스미드로서 전달할 수 있다. 대안적으로, 안티센스 작제물은 생체외 생성된 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 내인성 뉴클레아제에 내성이 있는 변형된 올리고뉴클레오티드가 바람직하고, 따라서, 생체내에서 안정하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위한 핵산의 예로는 DNA의 포스포아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체가 있다(예컨대, 5,176,996, 5,264,564, 및 5,256,775 참조). 또한, 안티센스 요법에 유용한 올리고머를 작제하는데 있어서 일반적인 방법은, 예컨대 본원에서 참고로 인용한 문헌[Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; and Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668]에 검토되어 있다.
C. Kay-리간드 및 이의 아미노산 서열.
전술한 바와 같이 본 발명의 Kay-리간드는 TNF 계열의 구성원이다. 단백질, 단편 또는 이의 상동체에는 광범위한 진단 용도 및 치료 용도가 있다.
Kay-리간드는 비장 및 말초 혈액 림프구에 주로 존재하는데, 이는 Kay-리간드가 면역계에서 제어 역할을 함을 강력하게 제시하는 것이다. 본 발명의 Kay-리간드 서열을 인간 TNF 계열의 기타 구성원과 비교하여 상당한 구조적 유사성을 밝혔다. 모든 단백질은 세포외 도메인에서 서열 보존의 일부 영역을 보유한다.
본 발명의 리간드의 정확한 3차원 구조는 알려지지 않았지만, TNF 계열의 구성원으로서 이 계열의 기타 구성원과 특정 구조적 특성을 공유할 수 있는 것으로 추정된다.
본 발명의 신규 폴리펩티드는 아직 확인되지 않은 수용체와 특이적으로 상호작용한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 펩티드 및 방법으로 Kay-리간드 또는 이의 단편과 특이적으로 상호작용하는 수용체를 확인할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 수용체에 결합하는 능력이 있는 Kay-리간드로부터 유래된 펩티드를 포함한다. Kay-리간드의 단편은 일부 방법, 예컨대 재조합, PCR, 단백질 분해 또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단으로부터 1 이상의 뉴클레오티드를 제거하여 생성할 수 있다. 돌연변이화된 DNA의 발현으로 폴리펩티드 단편을 생성한다.
폴리펩티드 단편은 종래의 Merrifield 고상 f-moc 또는 t-boc 화학과 같은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 DNA 서열은 임의로 단편이 중첩되지 않는 소정 길이의 단편으로 분할하거나, 또는 소정의 길이의 중첩 단편으로 분할할 수 있다. 이와 같은 방법은 후술되어 있다.
D. Kay-리간드 및 종양 리간드의 가용성 형태 생성
Kay-리간드의 가용성 형태는 종종 효과적으로 신호를 발생하여 천연 막 형태를 모방하는 약물로서 투여할 수 있다. 본 명세서에서 청구한 Kay-리간드는 가용성 시토킨으로서 자연적으로 분비될 수 있지만, 만일 그렇지 않다고 해도 유전자를 재조작하여 분비하게 할 수 있다. Kay-리간드의 가용성 분비형을 형성하기 위해서, DNA 레벨에서 N-말단 경막 영역 및 스턱 영역의 일부분을 제거하고, 선택된 발현계에서 효과적인 단백질 절단을 허용하는 I형 리더 또는 대안적으로 II형 리더 서열로 이를 대체한다. 당업자는 분비 단백질 작제물에 보유된 스턱 영역의 양을 다양하게 하여 수용체 결합 특성 및 분비 효과를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 모든 가능한 스턱 길이를 포함하는 작제물, 즉 N 말단 절두물을 제조하여 아미노산 81 내지 139에서 개시하는 단백질을 산출할 수 있다. 최적 길이의 스턱 서열은 이 유형의 분석으로부터 산출된다.
E. Kay-리간드와 반응성이 있는 항체의 생성
또한, 본 발명은 청구된 Kay-리간드 또는 이의 수용체와 특이적으로 반응하는 항체를 포함할 수도 있다. 단백질 억제/펩티드 억제 항혈청 또는 모노클론 항체를 표준 프로토콜에 의해 만들수 있다[예컨대 Antibodies: A Laboratory Manual ed., Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유류를 펩티드의 면역원성 형태로 면역화시킬 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 방법으로는 당업계에 공지된 담체에의 접합법, 또는 기타 방법이 있다.
청구된 Kay-리간드 또는 이의 수용체의 면역원성 부분은 보조제의 존재하에 투여할 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가의 검출로 모니터링할 수 있다. 항원으로서 면역원과 함께 표준 ELISA 또는 기타 면역분석법을 이용하여 항체 레벨을 평가할 수 있다.
바람직한 양태에서, 해당 항체는 Kay-리간드 또는 이의 수용체의 항원성 결정인자, 예컨대 서열 번호 2의 폴리펩티드의 항원성 결정인자, 또는 밀접하게 관련된 인간이나 비인간 포유류 상동체(예, 70, 80 또는 90% 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성)에 대해 면역특이적이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항-Kay-리간드 또는 항-Kay-리간드-수용체 항체는, 예컨대 서열 번호 2 또는 서열 번호 6의 서열에 대해 80% 미만의 상동성, 바람직하게는 서열 번호 2의 서열에 대해 90% 미만의 상동성, 가장 바람직하게는 서열 번호 2의 서열에 대해 95% 미만의 상동성이 있는 단백질과 거의 교차 반응(즉, 특이적으로 반응)하지 않는다. "실질적으로 교차 반응하지 않는다"는 것은 항체가 서열 번호 2의 단백질의 결합 친화도의 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 1% 미만인 비상동성 단백질에 대한 결합 친화도를 가진다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 항체는 Kay-리간드 또는 이의 수용체와 특이적으로 반응하는 이의 단편을 포함하고자 하는 것이다. 항체를 종래 기법으로 단편화하고, 그 단편을 전체 항체에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 검색할 수 있다. 예를 들어, F(ab')2단편은 펩신으로 항체를 처리하여 생성할 수 있다. 그 결과 생성된 F(ab')2단편을 처리하여 디설파이드 가교를 환원시켜 Fab' 단편을 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항-Kay-리간드 또는 항-Kay-리간드-수용체 활성이 있는 생체특이적인 키메라 분자를 포함하고자 한다. 따라서, Kay-리간드, 종양-리간드 및 이의 수용체에 대해 유도된 모노클론 및 폴리클론 항체와, Fab' 및 F(ab')2와 같은 항체 단편을 사용하여 리간드 및 이의 각각의 수용체의 작용을 차단할 수 있다.
각종 형태의 항체는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 만들 수 있다[본원에서 참고로 인용된 Winter and Milstein, Nature 349:293-299 (1991)]. 예를 들어, 동물 항체로부터 유래한 항원 결합 도메인을 인간 불변 도메인에 결합시킨 키메라 항체를 작제할 수 있다[예컨대 문헌(Cabilly et al., 미국 특허 4,816,567호) 참조]. 키메라 항체는 인간 임상 치료에 사용되는 경우 동물 항체가 유발하는 관찰된 면역원성 반응을 감소시킬 수 있다.
또한, Kay-리간드 또는 이의 수용체를 인식하는 재조합 "인간화된 항체"를 합성할 수 있다. 인간화된 항체는 특정 항원 결합을 담당하는 영역이 삽입된 대부분의 인간 IgG 서열을 포함하는 키메라이다. 소정의 항원으로 동물을 면역화시키고, 해당 항체를 분리하여, 특정 항원 결합을 담당하는 가변 영역 서열의 일부를 제거한다. 동물에서 유래된 항원 결합 영역을, 항원 결합 영역이 결실된 인간 항체 유전자의 적절한 위치내로 클로닝한다. 인간화된 항체는 인간 항체내에서 이종 서열(즉, 종간 서열)의 사용을 최소화하고, 따라서 치료 대상에서 면역 반응을 덜 유발한다.
상이한 부류의 면역글로불린으로부터 분리한 가변 도메인 및 인간 불변 도메인(CH1, CH2, CH3)을 포함하는 키메라 또는 인간화된 항체를 제조함으로써 상이한 부류의 재조합 항체를 작제할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 부위 수가가 증가한 항체는 항원 결합 부위를 인간:쇄 불변부를 보유하는 벡터내로 클로닝하여 재조합적으로 생성할 수 있다[참고로 인용된 문헌(Arulanandam et al., J.Exp.Med., 177:1439-1450(1993)].
또한, 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 항원 결합 부위 부근의 아미노산 잔기를 변경하여 항원과 재조합 항체의 결합 친화도를 변경시킬 수 있다. 인간화된 항체의 항원 결합 친화도는 분자 모델링을 기초로 한 돌연변이 유발로 증가시킬 수 있다[참고로 인용한 문헌(Queen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 86:10029-33(1989)].
F. 유사체 형성: 변경된 DNA 및 펩티드 서열의 생성
본 발명에서 청구하고 있는 Kay-리간드의 유사체는 아미노산 서열, 서열을 포함하지 않는 방식, 또는 상기 2가지 점 모두에 있어서 자연 발생적 Kay-리간드와 다를 수 있다. 비서열 변형은 Kay-리간드의 생체내 또는 시험관내 화학 유도체화를 포함한다. 비서열 변형의 비제한적인 예로는, 아세틸화, 메틸화, 인산화, 카르복실화 또는 글리코실화 변화가 있다.
바람직한 유사체는 Kay-리간드의 생물학적 활성 단편으로서, 이 서열은 하나 이상의 보존성 아미노산 치환, 또는 Kay-리간드의 활성을 없애지 않는 하나 이상의 비보존성 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 서열 번호 2에 제공된 서열과는 다르다.
통상적으로 보존성 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특징이 있는 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대 다음 군내에서의 치환을 포함한다. 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소로이신, 로이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
보존성 아미노산 치환
아미노산 코드 치환가능한 아미노산
알라닌 A D-Ala, Gly, β-Ala, L-Cys, D-Cys
아르기닌 R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
아스파라긴 N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln.
아스파르트산 D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인 C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
글루타민 Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루탐산 E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
글리신 G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Ala, Acp
이소로이신 I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
로이신 L D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
리신 K D-Lys, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
메티오닌 M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
페닐알라닌 F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp,트랜스-3, 4, 또는 5-페닐프롤린, 시스-3, 4, 또는 5-페닐프롤린
프롤린 P D-Pro, L-I-티아졸리딘-4-카르복실산, D-1-옥사졸리딘-4-카르복실산, L-1-옥사졸리딘-4-카르복실산
세린 S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
트레오닌 T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
티로신 Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
발린 V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
유용한 돌연변이 유발 방법으로는 후술할 PCR 돌연변이 유발법 및 포화 돌연변이 유발법이 있다. 무작위 아미노산 서열 변형체의 라이브러리는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열의 세트 합성으로 생성할 수 있다.
PCR 돌연변이 유발법
PCR 돌연변이 유발법에서, 감소된 Taq 폴리머라제 충실도를 사용하여 DNA의 클로닝된 단편내로 무작위 돌연변이를 도입할 수 있다(Leung et al., 1989, Technique 1:11-15). 이는 무작위 돌연변이를 유발하는 매우 강력하고 상대적으로 신속한 방법이다. 돌연변이화하고자 하는 DNA 영역을, Taq DNA 폴리머라제로 DNA 합성의 충실도를 감소시키는 조건하에서, 예컨대 5의 dGTP/dATP 비율을 이용하고 PCR 반응물에 Mn2+을 첨가하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킬 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 푸울을 적절한 클로닝 벡터내로 삽입하여 무작위 돌연변이 라이브러리를 제공할 수 있다.
포화 돌연변이 유발법
포화 돌연변이 유발법은 다수의 단일 염기 치환체를 클로닝된 DNA 단편내로 신속하게 도입할 수 있다(Mayers et al., 1985, Science 229:242). 이 기법은, 예컨대 시험관내 1본쇄 DNA의 화학 처리 또는 조사에 의한 돌연변이 생성 및 상보성 DNA쇄의 합성을 포함한다. 돌연변이 빈도는 처리의 경중을 조절함으로써 조정가능하며, 거의 모든 가능한 염기 치환체를 얻을 수 있다. 이 절차는 돌연변이 단편에 대한 유전자 선별을 포함하지 않기 때문에, 중성 치환체를 얻을 수 있을 뿐 아니라 작용을 변경한 DNA의 무작위 돌연변이 유발법으로 단백질의 중성 치환체도 제조할 수 있다. 점 돌연변이의 분포는 보존된 서열 성분 쪽으로 편중되지 않는다.
축퇴성 올리고뉴클레오티드
상동체 라이브러리는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 형성할 수 있다. 축퇴성 서열의 화학 합성은 자동화 DNA 합성기에서 수행한 다음, 합성 유전자를 적절한 발현 벡터내로 결찰시킨다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다xxx. 이러한 기법은 기타 단백질의 지향성 진화에 사용하였다xxxi.
비무작위 또는 지향성 돌연변이 유발법을 사용하여 특정 영역에 특정 서열 또는 돌연변이를 제공할 수 있다. 이들 기법을 사용하여, 예컨대 단백질의 공지된 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 변형체를 생성할 수 있다. 돌연변이 부위를, 예컨대 (1) 보존된 아미노산으로 먼저 치환한 다음 얻은 결과에 따라 더 많은 라디칼을 선택하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 위치된 부위로 인접한 동일하거나 상이한 부류의 잔기를 삽입하거나, 또는 (1) 내지 (3)을 조합하여 개별적으로 또는 연속하여 변형시킬 수 있다.
알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법
알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법은 돌연변이 유발에 바람직한 위치 또는 도메인인 소정의 단백질의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법이다[Cunningham 및 Wells의 문헌(Science 244:1081-1085, 1989)) 참조]. 알라닌 스캐닝법에서, 표적 잔기의 기 또는 잔기를 확인하고(예, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환한다. 아미노산의 치환은 세포 안 또는 밖에서 아미노산과 주변의 수성 환경의 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 치환체에 대해 작용성 감수성을 나타내는 이들 도메인은, 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 기타 변형체를 도입하여 개조할 수 있다. 따라서, 아미노산 변형체의 도입 부위를 미리 정하지만, 돌연변이 그 자체의 특성을 미리 정할 필요는 없다. 예를 들어, 제공된 부위에서 돌연변이의 성능을 최적화하기 위해서, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이법을 표적 코돈 또는 영역에서 수행할 수 있고, 발현된 소정의 단백질 서브 유닛 변형체를 소정의 활성의 최적 조합에 대해 검색한다.
올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이 유발법
올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이 유발법은 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변형체를 제조하는데 유용한 방법이다[예컨대 Adelman 등의 문헌(DNA 2:183, 1983) 참조]. 간단히 요약하면, DNA 주형에 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화시켜 소정의 DNA를 변경하는데, 상기 주형은 소정 단백질의 비변경 또는 천연 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 1본쇄 형태이다. 하이브리드화 후에, DNA 폴리머라제를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입하고 소정의 DNA 단백질에서 선택된 변경을 암호화할 주형의 완전한 제2 상보성 가닥을 합성한다. 일반적으로, 길이가 25 이상의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 최적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드(들) 쪽에 주형에 완전히 상보적인 12∼15 뉴클레오티드를 가진다. 이로서 올리고뉴클레오티드가 1본쇄 DNA 주형 분자에 적절히 하이브리드화한다는 것이 확인된다. 올리고뉴클레오티드는 참고로 인용한 Crea 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 75:5765(1978)]에 개시된 기법을 사용하여 쉽게 합성한다.
카세트 돌연변이 유발법
변형체를 제조하는 또 다른 방법인 카세트 돌연변이 유발법은 본원에서 참고로 인용한 Well 등의 문헌[Gene, 34:315(1985)]에 개시된 기법을 기초로 한다. 출발 물질은 돌연변이시키고자 하는 단백질 서브유닛 DNA를 포함하는 플라스미드(또는 기타 벡터)일 수 있다. 돌연변이시키고자 하는 단백질 서브 유닛 DNA내 코돈(들)을 확인한다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각 측면에 고유의 제한 엔도뉴클레아제 부위가 있어야 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 소정의 단백질 서브 유닛 DNA내 적절한 위치에서 부위를 도입하는 전술한 올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이 유발법을 사용하여 제한 부위를 생성할 수 있다. 제한 부위를 플라스미드내로 도입한 후에, 플라스미드를 이들 부위에서 절단하여 선형화한다. 제한 부위 사이의 DNA 서열을 암호화하지만 소정의 돌연변이(들)를 포함하는 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 표준 절차로 합성한다. 2개의 쇄를 별도로 합성하여 표준 기법으로 함께 하이브리드화한다. 이 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 카세트라고 칭한다. 이 카세트는 선형화된 플라스미드의 말단과 비교하여 3' 및 5' 말단을 가지도록 고안하여, 플라스미드에 직접 결찰시킬 수 있다. 이제 이 플라스미드는 돌연변이된 소정의 단백질 서브유닛 DNA 서열을 포함하게 된다.
조합 돌연변이 유발법
조합 돌연변이 유발법을 사용하여 돌연변이를 형성할 수 있다. 예컨대 상동성 그룹 또는 기타 관련 단백질에 대한 아미노산 서열을 정렬하여, 바람직하게는 최대 상동성 확률을 높인다. 정렬된 서열의 제공된 위치에서 나타나는 모든 아미노산을 선택하여 조합 서열의 축퇴성 세트를 형성할 수 있다. 변화를 가한 변형체의 라이브러리는 핵산 레벨에서 조합 돌연변이 유발하여 생성하고, 변형된 유전자 라이브러리가 암호화한다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열내로 효소적으로 결찰시켜 유효 서열의 축퇴성 세트가 개별적인 펩티드로서 발현가능하거나, 또는 대안적으로 축퇴성 서열 세트를 포함하는 더 큰 융합 단백질 세트로서 발현가능하게 한다.
생성된 돌연변이 유전자 생성물을 검색하는데 있어서의 각종 기법이 공지되어 있다. 다수의 유전자 라이브러리에 대한 기법은 종종, 유전자 라이브러리를 복제성 발현 벡터내로 클로닝하는 단계, 벡터의 생성 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키는 단계, 및 소정의 활성의 검출, 예컨대 이 경우에는 Kay-리간드 또는 이의 수용체에 대한 결합은 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터를 상대적으로 쉽게 분리하게 하는 조건하에서 유전자를 발현하는 단계를 포함한다. 전술한 각각의 기법은, 예컨대 무작위 돌연변이 유발법에 의해서 형성된 다수 서열을 검색하는데 있어서 고 작업 처리량으로 분석할 수 있다.
본 발명은 청구된 폴리펩티드 또는 이의 수용체의 단백질 결합 도메인을 환원시켜 모조물, 예컨대 펩티드 또는 비펩티드 제제를 형성한다. 펩티드 모조물은 Kay-리간드와 그의 수용체의 결합을 파괴할 수 있다. 하방 세포내 단백질 또는 수용체 폴리펩티드의 분자 인식과 관련된 Kay-리간드의 주요 잔기를 결정하고 Kay-리간드와 수용체의 결합을 경쟁적으로 또는 비경쟁적으로 억제하는 Kay-리간드 또는 이의 수용체 유도된 펩티드모조물을 형성할 수 있다. [예컨대 본원에서 참고로 인용한 "Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene proetin" 유럽 특허 출원 EP-412,762 및 EP-B31,080].
G. 약학 조성물
이용가능한 정제된 재조합 Kay-리간드를 제조함으로써, 본 발명은 정상 세포 작용, 이 경우에는 Kay-리간드 또는 이의 수용체의 작동물질 또는 길항물질인 약물 후보를 선별하는데 사용할 수 있는 분석법을 제공한다. 일양태에서, 이 분석법은 Kay-리간드와 이의 수용체 사이의 결합을 조절하는 화합물의 능력을 평가한다. 각종 분석 형태가 있지만, 본 발명의 견지에서 당업자가 이해할 수 있을 것이다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 여러 약물 검색 프로그램에서, 주어진 기간동안 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해서 높은 작업 처리량 분석법이 바람직하다. 정제 단백질 또는 반정제 단백질을 이용하여 유도될 수 있는 무세포계에서 수행되는 분석은, 시험 화합물이 매개하는 분자 표적내 변경을 급속하게 형성하여 상대적으로 쉽게 검출되도록 형성할 수 있다는 점에서 종종 "1차" 검색으로서 선호된다. 더구나, 시험 화합물의 세포 독성 및/또는 생체 적합성의 영향은 일반적으로 시험관내 계에서는 무시되며, 대신에 이 분석은 주로 분자 표적의 효소 특성의 변화 또는 기타 단백질과의 결합 친화도 변경에서 명백히 알 수 있는 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 집중되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 Kay-리간드나 이의 수용체, 또는 이의 단편이나 모조물의 치료학적 유효량을 포함할 수 있으며, 임의로 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적 유효량의 본 발명의 화합물이나 약학적 허용 염 또는 유도체를 투여하여 암 치료법, 면역계 또는 이의 일부를 자극하는 방법, 특정 경우에는 억제하는 방법을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 각종 치료에 대한 기타 요법과 함께 사용할 수 있음은 당연하다.
조성물은 전신, 국소 또는 국부화된 투여를 비롯하여 각종 투여 경로용으로 제형화할 수 있다. 전신 투여용으로, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 주사가 바람직하며, 본 발명의 조성물은 액체 용액, 바람직하게는 헹크스액 또는 링거액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액내에서 제형화할 수 있다. 또한, 조성물은 고체 형태로 제형화할 수 있고, 임의로 사용 직전에 재용해 또는 현탁시킨다. 동결건조된 형태도 본 발명에 포함된다.
조성물은 경구 투여하거나, 또는 경점막 또는 경피 수단으로 투여할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해서, 스며들게 하고자 하는 배리어에 적절한 침투물을 조제시 사용할 수 있다. 이러한 침투물은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 경점막 투여의 경우에는 담즙염, 푸시드산 유도체 및 세정제가 있다. 경점막 투여는 비강 분무 또는 좌약을 사용할 수 있다. 경구 투여용으로서, 캡슐, 정제 및 강장제와 같은 종래의 경구 투여 형태로 조성물을 제형화할 수 있다. 국소 투여를 위해서, 본 발명의 조성물을 당업계에 공지된 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단위 용량의 형태인 것이 바람직하며, 1일 1회 이상 투여한다. 1회 또는 치료 기간에 걸쳐 투여되는 활성 화합물의 양은 여러 인자, 예를 들어, 대상의 연령 및 크기, 치료하고자 하는 질병의 경중 및 경과, 투여 방식 및 형태와 치료 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 유효량은 1일 1kg당 약 0.005∼약 5 ㎎, 바람직하게는 약 0.05∼약 0.5 ㎎이다. 당업자라면 이 범위보다 더 낮거나 또는 높은 용량이 유용할 수도 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 유전자 작제물은 Kay-리간드 폴리펩티드의 작동물질 또는 길항물질 형태를 암호화하는 핵산을 전달하기 위한 유전자 치료 프로토콜의 일부로서 사용할 수 있다.
청구한 Kay-리간드의 발현 작제물을 임의의 생물학적 유효 담체내에서, 예컨대 생체내에서 Kay-리간드에 대한 유전자를 세포내로 효과적으로 전달할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물로 투여할 수 있다. 세포를 직접 형질감염시킬 수 있는 바이러스 벡터내 유전자를 삽입하거나, 또는 예컨대 리포좀 또는 세포내 담체의 보조하에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법 뿐 아니라, 바이러스 벡터내 유전자 작제물을 직접 주입한 방법도 포함한다. 바이러스 벡터 전달 방법이 바람직하다.
유전자 치료 작제물의 약학 제제는 허용가능한 희석제내 주로 유전자 전달계로 구성될 수 있고, 유전자 전달 매개체가 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달계가 재조합 세포(예, 레트로바이러스 벡터)로부터 완전하게 생성될 수 있는 경우, 약학 제제는 그 유전자 전달계를 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
치료에 사용하는 것외에, 본 발명의 올리고머를 진단 시약으로서 사용하여 이들 올리고머가 특이적으로 결합하는 표적 DNA, RNA 또는 아미노산 서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 또 다른 양태에서, 청구된 본 발명을 이용하여 Kay-리간드 또는 이의 단편과의 결합 또는 물리적 회합과 같은 상호작용 능력에 대한 화학적 실체를 평가할 수 있다. 이 방법은 Kay-리간드와 화학적 실체를 접촉하는 단계, Kay-리간드와 상호작용하는 실체의 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 Kay-리간드를 자연 발생적 Kay-리간드 또는 Kay-리간드의 수용체를 평가하는 방법, 뿐 아니라 Kay-리간드 수용체와 회합 또는 결합하는 화학적 실체를 평가하는 방법에도 사용할 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 Kay-리간드 및 이의 수용체 사이의 상호작용을 조절하는 능력에 대해 화학적 실체를 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 쌍이 상호작용하는 조건하에 Kay-리간드와 Kay-리간드 수용체를 조합하는 단계, 평가하고자 하는 화학적 실체를 첨가하는 단계 및 복합체의 형성 또는 용해를 검출하는 단계를 포함한다. 이들 조절제는, 예컨대 무세포계내 활성을 시험하고, 임의로 세포 또는 동물에 화합물을 투여하고 그 효과를 평가하여 시험관내에서 추가로 평가할 수 있다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 Kay-리간드로서 불리워지는 신규 폴리펩티드에 관한 것으로서, 관련 분야의 한계 및 단점으로 인한 하나 이상의 문제점을 실질적으로 해결한다. 본 발명자는 시토킨의 TNF 계열의 신규 구성원을 발견하였으며, 단백질의 인간 아미노산 서열 뿐 아니라 이들 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 밝혀냈다. 청구한 본 발명을 이용하여 하기에 상세하게 설명한 여러 질병 및 증상의 신규 진단법 및 치료법을 확인할 수 있을 뿐 아니라 면역계 및 그 과정에 관한 정보를 얻어 이를 조작할 수 있다. 또한, 본 발명은 암종의 세포 사멸을 유도하는 것과 관련되어 있을 수 있다.
본 발명의 추가의 특징 및 장점은 다음에 설명되어 있고, 부분적으로는 설명으로부터 명백해지거나 또는 본 발명의 실시로부터 알 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 기타 장점은 개시된 상세한 설명 및 청구범위 뿐 아니라 첨부된 도면에서 특별히 지적한 조성물 및 방법으로 실현 및 달성할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 구체화되고 광범위하게 개시된 이들 및 기타 장점을 달성하고, 본 발명의 목적에 따라서, 본 발명은 Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 서열 번호 1의 인간 Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 신규 리간드의 아미노산 서열에 관한 것이다. 인간 Kay-리간드의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 개시되어 있다. 출원인은 또한 서열 번호 3의 쥐 Kay-리간드의 DNA 서열을 부분적으로 제공하고, 서열 번호 3이 암호화하는 단백질은 서열 번호 4에 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 리간드의 C 말단 수용체 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열과 50% 이상의 상동성이 있고 이의 DNA 서열 또는 단편에 하이브리드화하며, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4에서 확인된 서열을 보유한 Kay-리간드를 암호화하는 서열에 관한 것이다.
특정 실시 양태에서 본 발명은 추가로 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 임의의 적절한 발현 제어 서열은 본 발명에 유용하며, 당업자가 쉽게 선택할 수 있다.
또한 본 발명은 Kay-리간드 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 뿐 아니라, 게놈내로 도입되어 안정하게 통합된 Kay-리간드 서열을 가지거나 또는 에피좀 성분을 보유하는 숙주에 관한 것이다. 임의의 적절한 숙주를 본 발명에 사용할 수 있으며, 당업자라면 과도한 실험없이 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
기타 양태에서, 본 발명은 형질전환된 숙주의 배양 단계를 포함하는 실질적으로 순수한 Kay-리간드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 정상적으로 회합된 동물 단백질이 거의 없는 Kay-리간드에 관한 것이다.
본 발명은 서열 번호 2의 아미노산을 보유한 Kay-리간드와 이의 단편 또는 상동체를 포함한다. 각종 양태에서, 후술하는 바와 같이 아미노산 및/또는 DNA 서열은 보존성 삽입부, 결실부 및 치환부를 포함하거나, 또는 상기 서열의 단편을 포함할 수 있다.
기타 양태에서 본 발명은 Kay-리간드 매개된 약리학 작용을 직접 촉발하는데 사용할 수 있는 Kay-리간드를 포함하는 가용성 작제물에 관한 것이다. 이러한 작용은 암, 종양 치료 또는 면역 질병을 치료하기 위한 면역계 조작에 있어서 치료적 유용성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 리간드의 가용성 형태는 유전자적으로 재조작되어 쉽게 인식가능한 태그를 도입시킴으로써 이들 리간드에 대한 수용체의 확인을 용이하게 한다.
또한, 기타 양태에서 본 발명은 Kay-리간드에 대해 유도된 항체에 관한 것이며, 예를 들어, 암 치료 및 면역 질병을 치료하기 위한 면역계 조작에 사용할 수 있다.
또 다른 기타 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시되고 청구된 Kay-리간드에 대한 유전자를 사용한 유전자 치료법에 관한 것이다.
본 발명의 약학 제제는, 임의적으로 약학적 허용 담체, 보조제, 충전제 또는 기타 약학 조성물을 포함할 수 있으며, 공지된 임의의 다수 형태 또는 경로로 투여할 수 있다.
전술한 개설 내용 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시 및 설명적인 것으로서, 청구된 본 발명을 추가로 설명하려는 것이다.
첨부된 도면은 본 발명을 상세히 이해할 수 있도록 제공하며, 본 명세서의 일부로서 본 발명의 일부 양태를 예시하며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
실시예
c) Kay-리간드에 대한 수용체 결합의 분리
TNF 계열의 리간드를 사용하여 수용체를 확인하고 클로닝할 수 있다. 개시된 Kay-리간드 서열을 이용하여 마커에 대한 수용체 결합 서열 또는 태그 서열을 구성하는 Kay-리간드의 세포외 도메인의 5' 말단을 융합한 다음, 다수의 임의 발현계에서 Kay-리간드를 분비시키는 리더 서열을 첨가한다. 이 기법의 일례는 Browning 등의 문헌[(1996) (JBC 271, 8618-8626)]에 개시되어 있으며, 여기서 LT-β 리간드는 그러한 형태로 분비된다. VCAM 리더 서열은 짧은 myc 펩티드 태그와 LT-β의 세포외 도메인에 차례로 커플링시켰다. VCAM 서열을 사용하여 정상적으로 막 결합된 LT-β 분자를 분비시켰다. 분비된 단백질은 수용체에 결합하는 능력이 손상되지 않은 N-말단상에 myc 태그를 보유한다. 이러한 분비 단백질은 일시적으로 형질감염된 Cos 세포 또는 유사계, 예컨대 EBNA 유도된 벡터, 곤충세포/바큘로바이러스, 피치아(picchia) 등에서 발현될 수 있다. 비정제 세포 상청액을 태그된 리간드의 공급원으로서 사용할 수 있다.
수용체 발현 세포는 태그된 리간드에 이 세포를 노출시켜 확인할 수 있다. 결합된 리간드를 보유한 세포는, myc 태그를 항-myc 펩티드 항체(9E10)와 피코에리트린(또는 유사한 라벨)으로 표지된 항-마우스 면역글로불린으로 차례로 표지하여 FACS 실험에서 확인한다. FACS 양성 세포를 쉽게 동정할 수 있으며, 이는 수용체를 암호화하는 RNA의 공급원으로 작용가능하다. 그 다음 발현 라이브러리를 표준 기법으로 RNA로부터 제조하고 푸울내로 분리하였다. 클론의 푸울을 적절한 숙주 세포내로 형질감염시키고, 수용체 양성 형질감염된 세포에 태그된 리간드의 결합은 효소 표지된 항-마우스 Ig 시약, 즉 갈락토시다제, 알카리 포스파타제 또는 루시퍼라제 표지된 항체로 결합된 myc 펩티드 태그를 표지한 다음 현미경 검사를 통해 결정하였다. 일단 양성 푸울이 확인되면, 푸울 크기는 수용체를 암호화하는 cDNA가 확인될 때까지 감소시킨다. 이 절차는 수용체를 더 용이하게 유도할 수 있는 한 마우스 또는 인간 Kay-리간드로 수행할 수 있다.
본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 본 발명의 신규 Kay-리간드, 조성물 및 방법에 있어서 각종 변형예 및 변화예가 가능하다는 것은 당업자에게는 자명한 일이다. 따라서, 첨부된 청구범위 및 그 등가 범위에 포함되는 한 본 발명은 변형예 및 변화예를 포함한다.
서열 번호 1
서열 번호 2
서열 번호 3
서열 번호 4

Claims (35)

  1. Kay-리간드 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열.
  2. 서열이 주로 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열로 구성된 것이 특징인 Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열.
  3. DNA가 폴리펩티드를 암호화하고, 이 폴리펩티드가 주로 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 서열로 구성된 것이 특징인, 주로 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 구성된 DNA 서열.
  4. 단편이 20개 이상의 연속적인 염기를 포함하고, DNA 서열이 Kay-리간드의 활성 부위와 30% 이상 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것이 특징인 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 하나 이상의 서열 단편에 하이브리드화하는 DNA 서열.
  5. 제2항에 있어서, 상기 서열이 주로 보존성 치환, 변경 또는 결실된 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 구성된 것이 특징인 DNA 서열.
  6. 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된, Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  8. 제6항 또는 제7항에 기재된 재조합 DNA 분자로 형질전환시킨 단세포 숙주.
  9. 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 보유한 Kay-리간드를 암호화하는 DNA 서열.
  10. 제8항에 기재된 단세포 숙주를 배양하는 단계를 포함하여 실질적으로 순수한 Kay-리간드를 생성하는 방법.
  11. 정상적으로 회합된 동물 단백질이 거의 없는 Kay-리간드.
  12. 제11항에 있어서, 주로 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 서열로 구성된 Kay-리간드.
  13. Kay-리간드 또는 이의 활성 단편의 치료학적 유효량과 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  14. 제13항에 기재된 약학 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 자가면역 질병의 심화를 예방 또는 감소시키는 방법.
  15. 제13항에 있어서, Kay-리간드 또는 이의 활성 단편이 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  16. 제13항에 기재된 약학 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 조직 이식편에 대한 면역 반응의 심화를 예방 또는 감소시키는 방법.
  17. 제13항에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 면역계를 자극하는 방법.
  18. 제13항에 기재된 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 면역계를 억제하는 방법.
  19. 제13항에 기재된 약학 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 암을 치료하는 방법.
  20. a. Kay-리간드 또는 이의 단편을 제공하는 단계,
    b. 검출가능한 표지로 Kay-리간드 또는 이의 단편을 표지하는 단계,
    c. 조성물을 검색하여 단계 b의 검출가능하게 표지된 Kay-리간드에 결합하는 수용체를 검출하는 단계를 포함하여 Kay-리간드에 대한 수용체를 확인하는 방법.
  21. 제11항에 기재된 Kay-리간드의 가용성 생물학적 활성 단편.
  22. a. 서열 번호 1 또는 서열 번호 3을 포함하는 DNA 서열;
    b. a에서 정의한 DNA에 하이브리드화하고 제12항에 기재된 Kay-리간드와 40% 이상 상동성이 있는 폴리펩티드에 대한 발현을 암호화하는 DNA 서열로 구성된 군에서 선택된 DNA가 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  23. Kay-리간드 또는 이의 수용체, 또는 이의 생물학적 활성 단편에 반응성이 있는 항체 제제.
  24. 제23항에 있어서, 모노클론 항체를 포함하는 항체 제제.
  25. Kay-리간드 또는 이의 수용체, 또는 이의 항원성 단편으로 유기체를 면역화시키는 단계를 포함하여 Kay-리간드 또는 이의 수용체에 대해 반응성이 있는 항체 제제를 제조하는 방법.
  26. 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 적어도 일부에 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는 Kay-리간드에 대한 안티센스 핵산.
  27. 제24항에 기재된 항체 제제를 포함하는 약학 조성물.
  28. a. 세포내로 Kay-리간드를 암호화하는 유전자를 도입하는 단계,
    b. 유전자가 포유류내에서 발현되도록 하는 조건하에서 세포를 살아있게 하는 단계를 포함하여 포유류 세포내에서 유전자를 발현하는 방법.
  29. a. Kay-리간드를 암호화하는 유전자를 포함하는 치료학적 유효량의 벡터를 세포내로 도입하는 단계, 및
    b. 포유류 세포내에서 유전자를 발현하는 단계를 포함하여 포유류내 Kay-리간드와 관련된 질병을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 포유류가 인간인 것이 특징인 포유류내 Kay-리간드와 관련된 질병을 치료하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 벡터가 바이러스인 것이 특징인 포유류내 Kay-리간드와 관련된 질병을 치료하는 방법.
  32. 수용체에 대한 Kay-리간드의 결합을 저해할 수 있는 제제의 투여 단계를 포함하여 세포 사멸을 유도하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 인터페론-γ의 투여를 추가로 포함하는 것이 특징인 세포 사멸 유도 방법.
  34. Kay-리간드와 수용체 사이의 회합을 저해할 수 있는 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, Kay-리간드와 그의 수용체 사이의 발신 경로에 관여하는 면역 반응을 치료, 억제 또는 변경하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역 반응에 인간의 아데노암종 세포가 관여하는 것이 특징인 면역 반응의 치료, 억제 또는 변경 방법.
KR1020007002576A 1997-09-12 1998-09-11 Ｋａｙ-신규 면역계 단백질 KR20010023892A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5878697P 1997-09-12 1997-09-12
US60/058,786 1997-09-12
PCT/US1998/019037 WO1999012964A2 (en) 1997-09-12 1998-09-11 Kay - a novel immune system protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010023892A true KR20010023892A (ko) 2001-03-26

Family

ID=22018915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007002576A KR20010023892A (ko) 1997-09-12 1998-09-11 Ｋａｙ-신규 면역계 단백질

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP1012270A2 (ko)
JP (1) JP2001515711A (ko)
KR (1) KR20010023892A (ko)
CN (1) CN1269832A (ko)
AU (1) AU9315298A (ko)
BR (1) BR9812433A (ko)
CA (1) CA2303424A1 (ko)
EA (1) EA200000311A1 (ko)
EE (1) EE200000148A (ko)
HU (1) HUP0004034A3 (ko)
IL (1) IL134480A0 (ko)
IS (1) IS5375A (ko)
NO (1) NO20001240L (ko)
PL (1) PL339740A1 (ko)
SK (1) SK3532000A3 (ko)
TR (1) TR200000654T2 (ko)
WO (1) WO1999012964A2 (ko)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
WO1999026463A2 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Eli Lilly And Company Tnf ligand family gene
US6297367B1 (en) 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
WO1999033980A2 (en) * 1997-12-30 1999-07-08 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
HUP0105283A3 (en) 1999-01-25 2004-08-30 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response
US6475986B1 (en) 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
NZ513290A (en) * 1999-02-23 2004-05-28 Human Genome Sciences Inc Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EE05673B1 (et) * 1999-08-17 2013-08-15 Biogen, Inc. BAFF-retseptor (BCMA), immunoregulatoorne agens
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3495301A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Biogen Inc Heterologous polypeptide of the tnf family
DE60028830T2 (de) 2000-02-16 2007-01-18 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-april antikörper und hybridomazellen
WO2001087979A2 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
KR101287395B1 (ko) 2000-06-16 2014-11-04 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
AU2001288260A1 (en) * 2000-08-15 2002-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
EP2292655B1 (en) 2001-05-11 2012-03-14 Amgen SF, LLC Peptides and related molecules that bind to tall-1
AR035119A1 (es) 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
CA2520097C (en) 2003-03-28 2014-10-07 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
JP2007526220A (ja) 2003-06-05 2007-09-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂ細胞疾患の併用療法
KR20070001880A (ko) 2003-10-20 2007-01-04 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｂαｆｆ 길항제를 위한 치료 섭생법
EP1709072A1 (en) * 2004-01-29 2006-10-11 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
EP1812060A2 (en) 2004-10-05 2007-08-01 Genentech, Inc. Method for treating vasculitis
CA2583900A1 (en) 2004-10-13 2006-04-27 The Washington University Use of baff to treat sepsis
AU2005318086B2 (en) 2004-12-23 2011-07-07 Merck Serono Sa BCMA polypeptides and uses thereof
EP1922079A2 (en) 2005-08-09 2008-05-21 ZymoGenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
KR20080056714A (ko) 2005-08-09 2008-06-23 지모제넥틱스, 인코포레이티드 ＴＡＣＩ―Ｉｇ 융합 분자를 사용하여 Ｂ―세포 악성종양을치료하는 방법
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
CN101489573B (zh) 2006-05-15 2013-05-22 阿雷斯贸易股份有限公司 用TACI-Ig融合分子治疗自身免疫疾病的方法
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
MX353186B (es) 2009-09-03 2018-01-05 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
EP2680884B1 (en) 2011-02-28 2018-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Biological markers and methods for predicting response to b-cell antagonists
US9963513B2 (en) 2013-02-05 2018-05-08 Engmab Sàrl Method for the selection of antibodies against BCMA
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JP6577958B2 (ja) 2014-04-11 2019-09-18 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング スピロ［３Ｈ−インドール−３，２’−ピロリジン］−２（１Ｈ）−オン誘導体およびＭＤＭ２−ｐ５３阻害剤としてのそれらの使用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0682705A1 (en) * 1993-02-03 1995-11-22 N.V. Innogenetics S.A. Tnf-alpha muteins and a process for preparing them
AU6166396A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Biogen, Inc. Complexes of modified lymphotoxins as pharmaceutical prepara tions
PT939804E (pt) * 1996-10-25 2005-11-30 Human Genome Sciences Inc Neutroquina alfa
AU5705898A (en) * 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
CA2232743A1 (en) * 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5

Also Published As

Publication number Publication date
EA200000311A1 (ru) 2000-10-30
NO20001240L (no) 2000-05-10
EP1012270A2 (en) 2000-06-28
WO1999012964A3 (en) 1999-05-27
AU9315298A (en) 1999-03-29
CA2303424A1 (en) 1999-03-18
JP2001515711A (ja) 2001-09-25
BR9812433A (pt) 2000-09-26
NO20001240D0 (no) 2000-03-09
HUP0004034A2 (en) 2001-03-28
EE200000148A (et) 2001-02-15
TR200000654T2 (tr) 2000-07-21
CN1269832A (zh) 2000-10-11
WO1999012964A2 (en) 1999-03-18
HUP0004034A3 (en) 2002-08-28
PL339740A1 (en) 2001-01-02
SK3532000A3 (en) 2001-12-03
IS5375A (is) 2000-02-11
IL134480A0 (en) 2001-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010023892A (ko) Ｋａｙ-신규 면역계 단백질
KR100618492B1 (ko) 성장 효과가 있는 단백질 ａｐｒｉｌ
JP4411330B2 (ja) 腫瘍壊死因子関連リガンド
US7695934B2 (en) Tumor necrosis factor related ligand
AU2003213481A1 (en) APRIL - A Novel Protein With Growth Effects
AU2004212622B2 (en) A Tumor Necrosis Factor Related Ligand
CZ2000867A3 (cs) Sekvence DNA kódující ligand Kay, způsob přípravy ligandu Kay a farmaceutický přípravek obsahující tento ligand
MXPA00002407A (en) April- a novel protein with growth effects

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid