SK3532000A3 - Dna sequence coding for kay ligand, method for the preparation of kay ligand, pharmaceutical composition containing said ligand and the use thereof - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nového ligandu Kay, ktorý je členom rodiny nádorového nekrotického faktora. Tento proteín alebo jeho receptory majú protinádorové a/alebo imunoregulačné využitie. Okrem toho bunky transfekované génmi pre tento nový ligand sa môžu použiť v génovej terapii na liečenie nádorov, autoimunitných a zápalových ochorení alebo dedičných genetických porúch, a tiež protilátky blokujúce tieto proteíny môžu mať imunoregulačné využitie.

Doterajší stav techniky

Cytokíny príbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, Tumor Necrosis Factor) sú mediátormi hostiteľskej obrannej a imunitnej regulácie. Členovia tejto proteínovej rodiny sa vyskytujú vo forme ukotvenej na bunkovú membránu, kde pôsobia lokálne prostredníctvom vzájomného kontaktu medzi bunkami, alebo sa vyskytujú ako sekretované proteíny, ktoré sú schopné difundovať k vzdialenejším cieľom. Paralelná rodina receptorov upozorňuje na výskyt týchto molekúl spôsobujúcich iniciáciu bunkovej smrti alebo bunkovej proliferácie a diferenciácie v cieľovom tkanive. V súčasnosti rodina TNF ligandov a receptorov obsahuje najmenej 11 známych párov receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-α/β:Ι/Γ-β-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 a 4-1BBL:4-1BB. Sekvencie DNA kódujúce tieto ligandy majú identitu iba na 25 až 30%, a to dokonca aj v prípade najvyššej príbuznosti, aj keď príbuznosť na úrovni aminokyselinovej sekvencie je približne 50%.

Určujúcou vlastnosťou tejto rodiny cytokínových receptorov je extracelulárna doména bohatá na cysteín, ktorá bola objavená pri molekulovom klonovaní dvoch rôznych receptorov TNF^{1). Táto génová rodina kóduje glykoproteíny s vlastnosťami transmembránových proteínov typu I s extracelulárnou väzbovou doménou viažucou ligand, jednou transmembránovou doménou a cytoplazmatickým 'úsekom, ktorý sa podieľa na aktivácii bunkových funkcií. Úsek bohatý na cysteín, ktorý je súčasne väzbovým úsekom pre ligand, má centrálnu doménu z pevne spojených disulfidovými mostíkmi, ktorá sa niekoľkokrát opakuje, čo závisí od konkrétneho člena rodiny. Väčšina receptorov má štyri domény, aj keď sú receptory iba s tromi doménami, alebo naopak až so šiestimi doménami.

Proteíny z rodiny TNF ligandov sú charakteristické na svojom N-konci krátkym úsekom normálne krátkych hydrofilných aminokyselín, ktorý často obsahuje niekolko lyzínových alebo arginínových zvyškov, ktoré zrejme slúžia ako stop-sekvencie prenosu. Potom majú transmembránový úsek a extracelulárny úsek s premenlivou dĺžkou, ktorý oddeľuje doménu viažucu receptor na C-konci od bunkovej membrány. Tento úsek sa niekedy nazýva stopka. Väzbový úsek C-konca predstavuje väčšiu časť proteínu a často, aj keď nie vždy, obsahuje glykozylačné miesta. Tieto gény neobsahujú klasické signálne sekvencie charakteristické pre membránové proteíny typu I, skôr zodpovedajú membránovým proteínom typ II, ktoré majú C-koniec zasahujúci mimo bunky a krátky N-koniec zasahujúci do cytoplazmy. V niektorých prípadoch, ako sú TNF a LT-α, sa môže objaviť počas skorého opracovania proteínu štiepenie v úseku stopky a ligand potom existuje predovšetkým v sekretovanej forme. Väčšina ligandov sa vyskytuje v membránovej forme a sprostredkováva tak lokalizovaný prenos signálov.

Štruktúra týchto ligandov bola definovaná kryštalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Štruktúra TNF a lymfotoxínu alfa (LT-α) je „sendvičová, t.j. skladá sa z dvoch antiparalelných β-skladaných listov s topológiou tzv. meandru („Greek key alebo „jelly roll⁽¹¹⁾). Odchýlka rms medzi zvyškami reťazcov Ca a β je 0,61 C, čo vedie k domnienke o vysokom stupni podobnosti ich molekulovej topografie. Štruktúrnou črtou, ktorá zjavne vyplýva z molekulových štúdií CD40L, TNF a LT-α, je tendencia týchto ligandov vytvárať oligomérne komplexy. Charakteristické pre oligomérnu štruktúru je vytváranie väzbových miest pre receptor v mieste spojenia medzi susednými podjednotkami, čím sa vytvára multivalentný ligand. Analýzou kryštálovej štruktúry sa skúmala kvartérna štruktúra CD40L, TNF a LT-α a ukázalo sa, že CD40L, TNF a LT-α existujú ako triméry. Mnoho aminokyselín konzervatívnych pre tieto ligandy sa vyskytuje práve v oblasti úsekov kostry štruktúry β-listu. Je pravdepodobné, že základná sendvičová štruktúra je zachovaná medzi rôznymi členmi celej rodiny. Kvartérna štruktúra sa zrejme tiež udržuje, pretože konformácia podjednotiek pravdepodobne tiež ostáva podobná.

Členov rodiny TNF je možné najlepšie opísať ako hlavné prepínače v imunitnom systéme ovládajúce prežívanie buniek a diferenciáciu. V súčasnosti sú známe sekretované cytokiny, a to TNF a LT-α, na rozdiel od väčšiny ostatných členov rodiny TNF zakotvených v membráne. Zatiaľ čo membránové formy TNF boli dobre charakterizované a pravdepodobne majú jedinečnú biologickú funkciu, funkciou sekretovaných TNF je všeobecná signalizácia „poplachu bunkám vzdialeným od miesta udalosti, ktorá príslušnú udalosť vyvolala. Sekrécia TNF môže znásobiť udalosť vedúcu k dobre známym zmenám vo výstelke ciev a v bunkách v mieste zápalu. Oproti tomu členovia TNF rodiny viazané na membránu predávajú signál prostredníctvom receptora typu TNF iba bunkám v priamom kontakte. Napr. pomocné T-bunky poskytujú „pomoc sprostredkovanú CD40 iba takým B-bunkám, s ktorými sa dostanú do priameho kontaktu prostredníctvom interakcií TCR. Podobné obmedzenia na bezprostredný bunkový kontakt sa týkajú schopnosti indukovať bunkovú smrť u dobre preskúmaného systému Fas.

Ligandy TNF sa môžu rozdeliť do troch skupín na základe ich schopnosti indukovať bunkovú smrť. V prvej skupine sú ligandy TNF, Fas a TRAIL, ktoré môžu účinne indukovať bunkovú smrť v mnohých bunkových líniách a ich receptory majú väčšinou potvrdené „smrtiace domény. Ligand DR-3 (TRAMP/WSL-1) by tiež pravdepodobne patril do tejto kategórie. Druhú skupinu tvoria také ligandy, ktoré spúšťajú slabší signál obmedzený iba na niektoré bunkové typy. Do tejto druhej skupiny patria napr. TWEAK, ligand CD30 a LTalb2. Zaujímavou otázkou je, ako členovia tejto skupiny môžu spúšťať mechanizmus vedúci k bunkovej smrti, keď nemajú potvrdenú „smrtiacu doménu. Neprítomnosť tejto domény vedie k domnienke, že v mechanizme bunkovej smrti *> existuje ešte iný, slabší spôsob signalizácie. Do poslednej skupiny patria tí členovia, ktorí nie sú schopní prenášať žiadny ' signál vedúci k bunkovej smrti. Ale pravdepodobne členovia všetkých skupín môžu pôsobiť antiproliferačne na niektoré typy buniek ako následok indukcie diferenciácie, ako napr. CD40 (Funakoshi a kol., 1994).

Rodina TNF sa v poslednom čase dramaticky rozrástla a obsahuje teraz 11 rôznych signálnych dráh zahrnujúcich reguláciu imunitného systému. Všeobecne rozšírené expresné vzorce TWEAK a TRAIL ukazujú, že v tejto rodine existuje značná funkčná variabilita, doteraz nepoznaná. To vyniklo predovšetkým novým objavom dvoch receptorov, ktoré ovplyvňujú replikačnú schopnosť vírusu Rousovho sarkómu a vírusu Herpes simplex, a tiež historicky významnými objavmi, že TNF má antivírusovú aktivitu a vírus kiahní kóduje návnadové” TNF receptory (decoy TNF receptors) (Brojatsch a kol., 1996, Montgomery a kol., 1996, Smith 1994, Vassali 1992).

TNF je mediátor septického šoku a kachexie¹¹¹¹¹ a zúčastňuje sa regulácie vývoja hematopoetických buniek^(lv). Zdá sa, že hrá

Λ hlavnú úlohu ako mediátor v zápalovej reakcii a v obrane proti bakteriálnym, vírusovým a parazitárnym infekciám^(v), a navyše má t

zrejme protinádorovú aktivitu^(vl). TNF sa podieľa tiež na rôznych autoimunitných chorobách^(vll). TNF sa vytvára rôznymi typmi buniek, napr. sú to makrofágy, fibroblasty, T-bunky cytotoxické NK-bunky (natural killer) ^(V111). TNF sa viaže na dva rôzne receptory, z ktorých každý pôsobí prostredníctvom odlišných špecifických signálnych molekúl vo vnútri bunky, čo výsledné spôsobuje odlišné účinky TNF^(1X). TNF môže existovať jednak vo forme viazanej na membránu, ale aj ako volný sekretovaný cytokín'*’.

LT-α má s TNF mnoho spoločných aktivít, ako napr. väzbu na TNF receptory^1x11, ale na rozdiel od TNF je sekretovaný hlavne aktivovanými T-bunkami a niektorými β-lymfoblastoidnými nádormi ^(X11). Heteromérny komplex LT-α a LT-β je komplex viazaný na membránu, kde sa viaže na LT-β receptory^(X111). Systém LT (t.j. LT s receptorom LT-R) sa podiela na vývoji periférnych lymfoidných orgánov, pretože genetické porušenie LT-β spôsobuje poruchy T- a B-buniek v slezine a zmiznutie lymfatických uzlín^txlv) . Systém LT-β sa tiež podieľa na bunkovej smrti u niektorých adenokarcinómových buniek^(xv).

Fas-L, ďalší člen rodiny TNF, je exprimovaný prednostne na aktivovaných T-bunkách^(XV1). Indukuje smrť buniek nesúcich príslušný receptor, nádorových buniek a buniek infikovaných HIV, a to mechanizmom, ktorý je známy ako programovaná bunková smrť alebo apoptóza^(xvll>. Okrem toho je známe, že nedostatok Fas alebo Fas-L spôsobuje lymfoproliferatívne poruchy, čo potvrdzuje úlohu systému Fas v regulácii imunitnej odpovede^(XV111). Fas systém sa tiež podiela na poškodení pečene v dôsledku chronickej infekcie vírusovej hepatitídy^(X1X) a na autoimunitnej odpovedi u pacientov infikovaných HIV^(XX). Systém Fas sa tiež zúčastňuje deštrukcie Tbuniek u pacientov infikovaných HIV^(XX1>.

TRAIL, ďalší člen rodiny TNF, sa zrejme tiež podiela na bunkovej smrti rôznych transformovaných bunkových línií rôznorodého pôvodu^(XX11).

CD40, ďalší člen rodiny TNF, je exprimovaný na povrchu Tbuniek a indukuje reguláciu B-buniek nesúcich CD40^lxxlll). Okrem toho je známe, že zmeny v géne pre CD40-L sú príčinou choroby známej ako syndróm hyper-IgM viazanej na X^(xxlv>. Systém CD40 je tiež spojený s mnohými rôznymi autoimunitnými chorobami^(xxv) a CD40-L má tiež antivírusové vlastnosti^(XXV1). Aj keď sa systém CD40 podiela tiež na záchrane apoptických B buniek^(xxvll), u iných buniek ako buniek imunitného systému indukuje apoptózu ^(XXV111>. Mnohí ďalší členovia lymfocytovej rodiny TNF sa podieľajú na kostimulácii^(xxlxl.

Všeobecne sa dá zhrnúť, že členovia rodiny TNF hrajú základnú regulačnú úlohu v riadení imunitného systému a v aktivácii akútneho obranného systému hostiteľa. Vzhladom na súčasný pokrok v ovplyvňovaní členov rodiny TNF s cieľom terapeutického prospechu je pravdepodobné, že členovia tejto rodiny môžu poskytnúť jedinečné prostriedky proti chorobám. Niektoré ligandy rodiny TNF môžu priamo indukovať apoptickú smrť mnohých transformovaných buniek, napr. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata 1997) . Aktivácia receptora Fas a zrejme aj TNF a CD30 môžu indukovať bunkovú smrť netransformovaných lymfocytov, čo môže mať dôležitú imunoregulačnú funkciu (Amakawa a kol., 1996, Nagata 1997, Sytwu a kol., 1996, Zheng a kol., 1995). Všeobecne je známe, že bunková smrť sa spustí po agregácii „smrtiacich domén, ktoré sú umiestnené na cytoplazmatickej strane receptorov TNF. Tieto „smrtiace domény organizujú usporiadanie rôznych zložiek signálnej transdukcie, čo nakoniec spôsobí aktiváciu celej kaskády (Nagata 1997). Niektoré receptory neobsahujú potvrdené „smrtiace domény, napr. receptor LTb a CD30 (Browning a kol., 1996, Lee a kol., 1996) a napriek tomu môžu indukovať bunkovú smrť, aj keď podstatne slabšie. Tieto receptory pravdepodobne fungujú primárne tak, že indukujú bunkovú diferenciáciu a bunková smrť je aberantným dôsledkom u niektorých transformovaných bunkových línií, aj keď celý obrázok je doteraz nejasný, pretože na základe štúdie s myšami „CD30 null sa predpokladá smrtiaca úloha v negatívnej selekcii v týmuse (Amakawa a kol., 1996). Oproti tomu, prenos signálov inými dráhami, ako napr. práve prostredníctvom CD40, je vyžadované na udržiavanie a prežívanie buniek. Z uvedeného vyplýva teda potreba charakterizovať ďalšie členy rodiny TNF a poskytnúť tak ďalšie prostriedky na liečenie chorôb a ovplyvňovanie imunitného systému.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka polypeptidu zvaného ligand Kay, ktorý v podstate rieši rad problémov, vyskytujúcich sa vďaka obmedzeniam a nevýhodám doterajších riešení známych zo stavu techniky. Autori objavili nový člen cytokínovej rodiny TNF a určili aminokyselinovú sekvenciu tak myšacieho ako aj ľudského proteinu, vrátane príslušných sekvencii DNA kódujúcich tieto proteíny. Vynález sa môže použiť na identifikáciu nových prípravkov na diagnózu a liečenie mnohých chorôb a stavov, čo je ďalej podrobnejšie opísané, a tiež na získanie ďalších informácií o imunitnom systéme a na vlastné ovplyvňovanie imunitného systému a imunitných procesov. Okrem toto sa predkladaný vynález tiež týka indukcie bunkovej smrti v karcinómoch.

Ďalšie vlastnosti a výhody predkladaného vynálezu budú opísané podrobnejšie v nasledujúcom opise, pritom čiastočne z opisu vyplynú a čiastočne sa budú môcť rozpoznať pri využití vynálezu. Ciele vynálezu a jeho výhody sa môžu dosiahnuť pomocou prípravkov a spôsobov, ktoré sú osobitne zdôraznené v opise a v patentových nárokoch, a tiež v sprievodných obrázkoch.

V súlade s cieľom vynálezu, aby sa dosiahli výhody vynálezu, ako je v opise a príkladoch uskutočnenia vynálezu uvedené, vynález zahrňuje DNA sekvencie kódujúce ligand Kay. Špecificky sa vynález týka DNA sekvencie kódujúcej ľudský ligand Kay (t.j. sekvencie SEQ ID NO: 1). Okrem toho sa vynález týka tiež aminokyselinovej sekvencie nového ligandu. Aminokyselinová sekvencia ľudského ligandu Kay je tu uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 2. Okrem toho je tu čiastočne opísaná sekvencia myšacieho ligandu Kay uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 3 a protein kódovaný sekvenciou SEQ ID NO: 3 je tu uvedený ako sekvencia SEQ ID NO: 4. Ďalšie uskutočnenie vynálezu sa týka sekvencii, ktoré majú aspoň 50% homológiu so sekvenciou DNA kódujúcou 5'-koncovú väzbovú doménu pre receptor, a pritom hybridizujú so sekvenciou podľa vynálezu alebo jej fragmentom, a ktorá kóduje ligand Kay so sekvenciou tu uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo sekvencia SEQ ID NO: 4.

Niektoré uskutočnenia vynálezu sa týkajú sekvencii DNA kódujúcich ligand Kay, kde sekvencie sú operatívne spojené so sekvenciou kontrolujúcou expresiu. Na použitie podľa vynálezu je vhodná akákoľvek sekvencia na kontrolu expresie a vhodná sekvencia sa môže odborníkom ľahko vybrať.

Predkladaný vynález sa ďalej týka rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje sekvenciu DNA kódujúcu ligand Kay alebo jeho fragment, a tiež hostiteľov, ktorí majú sekvenciu ligandu Kay trvalo integrovanú v genóme alebo ju obsahujú v podobe epizomálneho elementu. Podľa vynálezu sa môže použiť akýkoľvek vhodný hostiteľ, ktorý sa môže ľahko vybrať odborníkom bez potreby nadmerného experimentovania.

Ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka spôsobu prípravy v podstate čistých ligandov Kay, ktorý obsahuje kroky, keď sa kultivuje transformovaný hostiteľ, a ďalej sa týka ligandu Kay v podstate bez všetkých živočíšnych proteínov, ktoré sú s ním normálne asociované.

Vynález sa tiež týka ligandov Kay, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu tu uvedenú ako SEQ ID NO: 2 alebo ich fragmentov či homológov. V rôznych uskutočneniach vynálezu sekvencie aminokyselín alebo sekvencie DNA môžu obsahovať konzervatívne inzercie, delécie a substitúcie, ako bude ukázané ďalej, alebo môžu obsahovať fragmenty uvedených sekvencií.

V inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka rozpustného konštruktu ligandu Kay, ktorý sa môže použiť na priame spustenie farmakologickej udalosti sprostredkované ligandom Kay. Takáto udalosť môže mať terapeutický účinok pri stimulácii rastu, na liečenie rakoviny a nádorov alebo v manipulácii s imunitným systémom na liečenie imunologických ochorení. Rozpustné formy ligandu podľa vynálezu sa môžu metódami génového inžinierstva upraviť tak, aby obsahovali ľahko rozpoznateľnú značku, a tým umožnili identifikáciu receptorov pre tieto ligandy.

Ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týkajú protilátok namierených proti ligandu Kay, ktoré sa môžu použiť napr. na liečenie rakoviny, nádorov, alebo na ovplyvňovanie imunitného systému pri liečení imunologických chorôb.

Ešte ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka spôsobov génovej terapie pomocou génov pre ligand Kay podlá predkladaného vynálezu.

Farmaceutický prípravok podľa predkladaného vynálezu môže prípadne obsahovať tiež farmaceutický prijateľný nosič, adjuvans, plnidlo alebo iné farmaceutické prípravky, a môže sa podávať akýmkoľvek spôsobom známym v odbore.

Tak predchádzajúci stručný prehľad, ako aj nasledujúci podrobný opis vynálezu je treba považovať za vysvetlenie vynálezu a iba za príklady uskutočnenia vynálezu, ktoré slúžia na podrobnejšie vysvetlenie predkladaného vynálezu.

Takisto obrázky, ktoré slúžia na lepšie porozumenie vynálezu a tvoriace súčasť opisu vynálezu, sú určené na to, aby ilustrovali niektoré uskutočnenia vynálezu a spoločne s opisom slúžili na vysvetlenie princípu predkladaného vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1. Porovnanie aminokyselinovej sekvencie ľudského a myšacieho ligandu Kay. Myšacia sekvencia uvedená v hornom riadku sa získala priamym klonovaním cDNA. Ľudská sekvencia sa získala zložením čiastočnej cDNA so stanovením metódou 5'RAČE. Tretia sekvencia, uvedená na spodnom riadku, ukazuje potvrdenú sekvenciu.

Obr. 2. Fragment ľudského cDNA ligandu Kay (KayL cDNA) sa použil ako sonda na analýzu northernovým prenosom RNA z rôznych ľudských tkanív. Je vidieť, že KayL RNA s veľkosťou 2,4 kb sa exprimovala predovšetkým v slezine a lymfocytoch periférnej krvi, to znamená v sekundárnych lymfoidných orgánoch.

Podrobný opis vynálezu

Opis sa bude týkať podrobného opisu výhodných uskutočnení predkladaného vynálezu. Predkladaný vynález sa týka sekvencii

DNA, ktoré kódujú ludské alebo myšacie Ugandy Kay, ich fragmenty alebo homológy, a ďalej sa týka expresie týchto DNA v hostiteloch transformovaných týmito DNA. Vynález sa ďalej týka použitia týchto DNA sekvencii a peptidov, ktoré sú týmito sekvenc'iami kódované. Okrem toho sa vynález týka tak ľudskej ako aj myšacej aminokyselinovéj sekvencie ligandu Kay, alebo jeho fragmentov či homológov, a ďalej sa týka farmaceutického prípravku obsahujúceho tieto sekvencie alebo z týchto sekvencii odvodeného.

A. Definície

Termín „homologický v tomto texte opisuje podobnosť medzi sekvenciami porovnávaných molekúl. Pokial je istá pozícia v obidvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou bázou alebo aminokyselinou, napr. ak je rovnaká pozícia v každej z dvoch molekúl obsadená adenínom, potom tieto molekuly sú homologické v danej pozícii. Homológia medzi dvoma sekvenciami vyjadrená v percentách je funkcia počtu rovnakých teda homologických pozícií, ktoré majú obidve sekvencie, delená počtom všetkých porovnávaných pozícií a vynásobená 100. Ak napr. u dvoch sekvencii je 6 pozícií z 10 rovnakých alebo homologických, potom tieto sekvencie majú 60% homológiu. Alebo napr. dve sekvencie ATTGCC a TATGGC majú 50% homológiu. Všeobecne sa uskutočňuje porovnanie tak, že sekvencie sa k sebe navzájom „priložia, aby poskytli maximálnu homológiu.

Termíny „purifikovaný preparát alebo „v podstate čistý preparát polypeptidu slúžia na označenie polypeptidu, ktorý sa oddelil od ostatných proteínov, lipidov a nukleových kyselín, s ktorými sa spoločne prirodzene vyskytuje. Výhodne je purifikovaný polypetid oddelený tiež od iných látok, ako napr. protilátok alebo matrixu, ktoré sa použili na purifikáciu.

Termín „transformovaný hostiteľ zahrňuje hostiteľa so sekvenciou, t.j. sekvenciou ligandu integrovanou do genómu.

akéhokoľvek Kay, trvalé

Termín „ošetrenie alebo akékoľvek terapeutické ošetrenie, ,liečenie sa tu používa na napr. podávanie terapeutického činidla alebo látky, napr. lieku.

Termín „v podstate čistá nukleová kyselina, napr. v podstate čistá DNA, znamená nukleovú kyselinu, ktorá 1) nie je bezprostredne spojená s jednou alebo dvoma sekvenciami (jedna na 5'-konci a jedna na 3'-konci), napr. kódujúcimi sekvenciami, s ktorými susedí v prirodzene sa vyskytujúcom genóme príslušného organizmu, z ktorého nukleová kyselina pochádza, alebo 2) je v podstate bez sekvencií nukleových kyselín, ktoré sa vyskytujú v organizme, z ktorého uvedená nukleová kyselina pochádza. Tento termín zahrňuje teda napr. rekomblnantnú DNA vloženú do vektora, napr. do autonómne sa replikujúceho plazmidu alebo vírusu, alebo do genómovej DNA prokaryotického alebo eukaryotického organizmu, alebo ktorá existuje ako samostatná molekula (napr. cDNA alebo fragment genómovej DNA vytvorený pomocou PCR alebo pôsobením reštrikčných endonukleáz) nezávislá na iných sekvenciách DNA. V podstate čistá DNA tiež zahrňuje rekomblnantnú DNA, ktorá je súčasťou hybridného génu kódujúceho ligand Kay.

Termíny „peptidy, „proteíny a „polypeptidy sa používajú navzájom zameniteľným spôsobom.

Termín „biologicky aktívny sa používa v zmysle mať aktivitu, buď in vitro alebo in vivo, ktorá sa prejavuje priamo alebo nepriamo. Napr. biologicky aktívny fragment ligandu Kay môže mať napr. 70% homológiu aminokyselinovéj sekvencie s aktívnym miestom ligandov, výhodnejšie aspoň 80% homológiu a najvýhodnejšie aspoň 90% homológiu. Identita alebo homológia vzhladom na ligandy je definovaná ako percento aminokyselinových zvyškov v príslušnej vybratej sekvencii, ktoré sú identické s aminokyselinovými zvyškami sekvencie ligandu Kay SEQ ID NO: 2.

Uskutočnenie predkladaného vynálezu vyžaduje, pokial nie je uvedené inak, použitie techník zvyčajných v bunkovej biológii, bunkových a tkanivových kultúrach, molekulovej biológii, transgénnej biológii, mikrobiológii, technikách rekombinantnéj DNA a imunologických metódach, ktoré sú v odbore známe. Tieto techniky sú opísané v príslušnej odbornej literatúre.

B. Sekvencie DNA podľa vynálezu

Jedným aspektom predkladaného vynálezu je v podstate čistá (alebo rekombinantné) nukleová kyselina, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu ligand Kay, ako je napr. sekvencia DNA uvedená tu ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a/alebo ekvivalenty takýchto nukleových kyselín. Termín „nukleová kyselina” tu zahŕňa tiež fragmenty alebo ekvivalenty, ako sú napr. sekvencie kódujúce funkčne ekvivalentné polypeptidy. Ekvivalentné nukleotidové sekvencie môžu obsahovať sekvencie, ktoré sa líšia jednou alebo niekoľkými nukleotidovými substitúciami, adíciami alebo deléciami, ako sú napr. alelické varianty, mutácie atď., a môžu tiež obsahovať nukleotidové sekvencie, ktoré sa líšia od sekvencie kódujúcej ligand Kay uvedenej tu ako sekvencia SEQ ID NO: 1, vďaka degenerácii genetického kódu.

Predkladaný vynález sa opisuje všeobecne vzhľadom na sekvencie ľudského génu, aj keď odborníkovi je zrejmé, že sa týka aj myšacej sekvencie. Ľudský proteín má, zdá sa, všetky charakteristiky rodiny TNF, t.j. usporiadanie membránového proteínu typu II a konzervatívne sekvenčné motívy podieľajúce sa na usporiadaní proteínu do štruktúry anti-paralelného β-listu, ktorá je typická pre TNF.

Nukleotidová sekvencia ligandu Kay sa tu uvádza ako sekvencia SEQ ID NO: la aminokyselinová sekvencia ligandu Kay sa tu uvádza ako sekvencia SEQ ID NO: 2.

Sekvencie podía predkladaného vynálezu sa môžu použiť na prípravu série DNA sond, ktoré sú vhodné na testovanie rôznych sád prirodzených alebo syntetických DNA na prítomnosť sekvencií príbuzných ligandu Kay alebo jeho fragmentov alebo derivátov. Odborníkovi je zrejmé, že termín „ligand Kay” sa tu používa v takom zmysle, že zahŕňa aj jeho biologicky aktívne deriváty, fragmenty a homológy.

Sekvencia podľa predkladaného vynálezu kódujúca ligand Kay sa môže použiť na expresiu peptidu podía vynálezu v rôznych prokaryotických alebo eukaryotických hostiteloch transformovaných takýmito sekvenciami. Peptidy sa môžu použiť ako protirakovinové alebo imunoregulačné činidlá. Všeobecne to znamená, že jedným z krokov aplikácie je kultivácia hostiteľa transformovaného molekulou DNA obsahujúca kódujúcou sekvenciu ligandu Kay, operatívne spojenú so sekvenciou riadiacou expresiu.

Sekvencia DNA a rekombinantné molekuly DNA podía predkladaného vynálezu môžu byť exprimované pomocou širokého spektra kombinácií hostitel/vektor. Tak napr. užitočné vektory môžu obsahovať segmenty chromozómových alebo syntetických sekvencii DNA. Expresné vektory podľa vynálezu sú charkateristické tým, že obsahujú aspoň jednu expresnú kontrolnú sekvenciu, ktorá je operatívne spojená so sekvenciou kódujúcou ligand Kay vloženou do vektora, aby bolo možné regulovať či riadiť expresiu sekvencie DNA.

V rámci každého expresného vektora sa môžu vybrať rôzne miesta na vloženie sekvencie ligandu Kay podľa predkladaného vynálezu. Miesta sa väčšinou navrhli podľa reštrikčných endonukleáz, ktoré v príslušnom mieste štiepia, a tieto miesta i endonukleázy sú odborníkovi dobre známe. Odborníkovi je tiež zrejmé, že vektor na použitie podľa predkladaného vynálezu nemusí obsahovať miesta pre reštrikčné endonukleázy na vloženie požadovaného fragmentu DNA. Miesto toho sa môže fragment klonovať do vektora alternatívnym spôsobom. Výber expresného vektora, a najmä miest vhodných na vloženie vybraného fragmentu DNA a jeho spojenie s expresnou kontrolnou sekvenciou, závisí na mnohých faktoroch. K týmto faktorom patrí napr. velkosť proteínu, ktorý sa má exprimovať, citlivosť tohto proteínu na proteolytickú degradáciu enzýmami hostiteľskej bunky, počet miest pre príslušný reštrikčný enzým, kontaminácia alebo väzba exprimovaného proteínu proteínmi hostitelskej bunky, ktoré sú ťažko odstrániteľné v priebehu purifikácie a pod.. Ďalšie faktory, ktoré je treba vziať do úvahy, sú expresné charakteristiky ako je napr. poloha štartovacieho a terminačného kodónu vzhľadom na sekvencie vektora, a ďalšie faktory, ktoré sú odborníkovi zrejmé. Výber vektora a vhodných miest na vloženie sekvencie DNA podľa predkladaného vynálezu je teda výsledkom zváženia všetkých týchto faktorov, pričom nie všetky riešenia sú rovnako účinné pre požadované aplikácie. Ale pre odborníka je analýza všetkých týchto faktorov rutinnou záležitosťou a výber vhodného systému potom závisí predovšetkým na konkrétnom použití.

Odborník je lahko schopný modifikovať expresné kontrolné sekvencie tak, aby sa získala vyššia úroveň proteínovej expresie, napr. substitúciou kodónov alebo výberom kodónov určitých zvláštnych aminokyselín, ktoré sú prednostne užívané konkrétnym organizmom, s cielom zmenšiť proteolýzu alebo zmeniť vzorec glykozylácie. Podobne môžu byť nahradené cysteínové zvyšky inými aminokyselinami, aby sa uľahčila produkcia alebo usporiadanie proteínu, alebo aby sa predišlo problémom so stabilitou.

Takže nie všetky kombinácie hostiteľ/expresný vektor fungujú s rovnakou účinnosťou čo sa týka expresie sekvencie DNA podľa predkladaného vynálezu. Avšak výber konkrétnej vhodnej kombinácie hostiteľ/expresný faktor môže odborník lahko uskutočniť. K faktorom, ktoré je treba vziať do úvahy, patrí napr. kompatibilita hostiteľa a vektora, toxicita proteínov kódovaných sekvenciami DNA vektora pre hostiteľa, jednoduchosť izolácie požadovaného proteínu, expresné charakteristiky sekvencií DNA a expresných kontrolných sekvencií s nimi operatívne spojených, biologická bezpečnosť, potreba energie na usporiadanie štruktúry proteínu, forma proteínu a prípadne modifikácie požadovaného proteínu, ktoré nastávajú po expresii.

Ligand Kay a jeho homology produkované hostiteľmi transformovanými sekvenciami DNA podľa predkladaného vynálezu, rovnako ako natívny ligand Kay purifikovaný spôsobom podlá vynálezu, alebo vytvorený na základe aminokyselinovej sekvencie podľa vynálezu, sú užitočné pre rad protirakovinových a imunoregulačných aplikácií. Sú tiež užitočné v terapii a spôsoboch týkajúcich sa aj iných chorôb.

Predkladaný vynález sa tiež týka použitia sekvencií DNA podlá vynálezu pre expresiu tohto ligandu v zvláštnych podmienkach, t.j. pri génovej terapii. Navyše, ligand Kay môže byť exprimovaný v nádorových bunkách, kde je jeho expresia riadená promótormi vhodnými na tento účel. Taká expresia môže posilniť protinádorovú imunitnú odpoveď alebo priamo ovplyvniť prežívanie nádoru. Ligand podlá vynálezu môže tiež ovplyvniť prežívanie orgánových štepov tým, že zmení lokálnu imunitnú odpoveď. V takom prípade by bol sám štep alebo bunky, ktoré ho obklopujú, modifikovaný génom APRÍL upraveným metódami génového inžinierstva.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je použitie izolovanej nukleovej kyseliny kódujúcej ligand Kay na tzv. „antisense terapiu. Termín „antisense terapia sa týka podávania alebo vytvorenia in situ oligonukleotidov alebo ich derivátov, ktoré špecificky hybridizujú v normálnych bunkových podmienkach s bunkovou mRNA a/alebo DNA kódujúcou požadovaný ligand Kay, aby tak inhibovali expresiu kódovaného proteinu tým, že inhibujú transkripciu a/alebo transláciu. Spomenutá väzba môže byť konvenčná komplementarita párov báz alebo napr. v prípade väzby na duplexy DNA môže ísť o väzbu prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnom (veľkom) záreze dvojzávitnicovej DNA. Všeobecne sa „antisense terapia týka celého radu techník v odbore používaných a patrí sem v podstate akákoľvek terapia založená na špecifickej väzbe oligonukleotidovej sekvencie.

„Antisense konštrukt podľa predkladaného vynálezu sa môže podať napr. vo forme expresného plazmidu, ktorý pri transkripcii v bunke tvorí RNA, ktorá je komplementárna k bunkovej mRNA kódujúcej ligand Kay alebo aspoň k jeho časti. Alternatívne môže byť „antisense konštruktom tiež oligonukleotidová sonda pripravená ex vivo. Také oligonukleotidové sondy sú výhodne modifikované oligonukleotidy, ktoré sú rezistentné na endogénne nukleázy a sú preto stabilné in vivo. Príkladom takýchto molekúl nukleových kyselín vhodných ako „antisense oligonukleotidy sú fosforamidátové, fosfothioátové a metylfosfonátové analógy DNA (pozri patentové prihlášky US 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775). Okrem toho všeobecný postup ako konštruovať oligoméry vhodné na „antisense terapiu boli prehľadne uvedené v publikáciách Van Der Krol a kol., 1988, Biotechniques 6:958=976 a Stein a kol., 1988, Cancer Res. 48:2659-2668, ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu.

C. Ligand Kay a jeho aminokyselinová sekvencia

Ligand Kay je, ako už sa diskutovalo, členom rodiny TNF. Proteín sám, alebo jeho fragmenty či homológy, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použitia, ako sa podrobnejšie bude diskutovať ďalej.

Ligand Kay sa vyskytuje najmä v slezine a v lymfocytoch periférnej krvi, čo významne ukazuje na regulačnú úlohu v imunitnom systéme. Porovnanie sekvencie ligandu Kay podľa vynálezu s ostatnými členmi ľudskej rodiny TNF ukazuje značnú štruktúrnu podobnosť. Všetky tieto proteíny majú spoločných niekolko konzervatívnych sekvencií v extracelulárnej doméne.

Hoci nie je doposial presná trojrozmerná štruktúra ligandu podľa vynálezu, je možné predpokladať, že ako člen rodiny TNF má spoločné určité štruktúrne charakteristiky s ostatnými členmi rodiny.

Nový polypeptid reaguje s receptorom, peptidy a spôsoby podľa predkladaného vynálezu špecificky ktorý sa doposial neidentifikoval. Avšak podía predkladaného vynálezu umožňujú identifikovať receptory, ktoré špecificky reagujú s ligandom Kay alebo s jeho fragmentmi.

Určité uskutočnenia podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú peptidy odvodené z ligandu Kay, ktoré majú schopnosť viazať sa na jeho receptory. Fragmenty ligandu je možné pripraviť rôznymi spôsobmi, napr. rekombinantnou technológiou, pomocou PCR, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou. Vnútorné alebo koncové fragmenty polypeptidu sa môžu pripraviť odstránením jedného alebo niekoľkých nukleotidov z jedného alebo z oboch koncov nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid.

Fragmenty polypeptidu je možné pripraviť expresiou mutovanej

DNA.

Polypeptidové fragmenty sa môžu tiež chemicky syntetizovať pomocou konvenčnej techniky známej ako syntéza na pevnej fáze, ktorá používa biochemický postup s f-moc a t-boc podlá Merriffielda. Tak napr. peptidy a sekvencie DNA podľa predkladaného vynálezu je možné v podstate ľubovoľne rozdeliť na fragmenty požadovanej dĺžky, ktoré sa neprekrývajú, alebo na prekrývajúce sa fragmenty požadovanej dĺžky. Príslušné metódy sú podrobnejšie opísané v nasledujúcom texte.

D. Príprava rozpustných foriem ligandu Kay a nádorového ligandu

Rozpustné formy ligandu Kay môžu byť veľmi účinné v prenose signálu a môžu sa teda podávať ako liek, ktorý napodobňuje prirodzenú membránovú formu. Je možné, že ligand Kay podľa predkladaného vynálezu je prirodzene sekretovaný ako rozpustný cytokín, ale pokial to tak nie je, je možné prispôsobiť gén metódami génového inžinierstva tak, aby sa zosilnilo vylučovanie. Na prípravu rozpustnej sekretovanej formy APRÍL je treba odstrániť na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a niektoré úseky „stopky a nahradiť ich vedúcimi sekvenciami typu I alebo alternatívne vedúcu sekvenciu typu IZ, ktorá umožňuje účinné proteolytické štiepenie v príslušnom hostiteľskom systéme. Odborník je schopný meniť rozsah „stopkových úsekov ponechaných v expresnom konštrukte tak, aby sa dosiahli optimálne väzbové vlastnosti k receptoru a sekrečnej účinnosti. Tak napr. skracovaním N-konca je možné pripraviť konštrukty obsahujúce všetky možné dĺžky „stopky, takže vzniknú proteíny, ktoré budú začínať aminokyselinou 81 až 139. Týmto typom analýzy je možné stanoviť optimálnu dĺžku sekvencie „stopky.

E. Príprava potilátok reagujúcich s ligandom Kay

Predkladaný vynález sa tiež týka protilátok špecificky reagujúcich s ligandom Kay alebo jeho receptorom. Antiséra typu anti-proteín/anti-peptid alebo monoklonálne protilátky je možné pripraviť štandardnými spôsobmi (pozri napr. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor press, 1988). Cicavec, ako napr. myš, škrečok alebo králik, sa môže imunizovať imunogénnou formou peptidu. Spôsoby, ako spraviť proteín imunogénnym, napr. tým, že sa konjuguje s nosičom alebo iné spôsoby, sú v odbore známe.

Imunogénna časť ligandu Kay alebo jeho receptora sa môže podať spoločne s adjuvans. Postup imunizácie je možné monitorovať pomocou detekcie titru protilátok v plazme alebo v sére. Štandardný test ELISA alebo iné imunotesty sa môžu použiť s imunogénom ako antigénom na hodnotenie hladín protilátok.

Vo výhodnom prevedení predkladaného vynálezu sú protilátky imunošpecifické na antigénne determinanty ligandu Kay alebo jeho receptora, t.j. antigénne determinanty polypeptidu so sekvenciou SEQ ID NO: 2, alebo pre blízko príbuzný ľudský, cicavčí, iný ako ľudský, homológ (s homológiou 70, 80, alebo 90 %, najvýhodnejšie s homológiou aspoň 95 %). V ešte ďalšom výhodnom prevedení predkladaného vynálezu protilátky anti-ligand Kay alebo receptor ligandu Kay v podstate krížovo nereagujú (tzn. reagujú iba špecificky) s proteínom, ktorý je napr. menej než z 80 % homologický so sekvenciou SEQ ID NO: 2, výhodne menej než z z 95 % homologický so sekvenciou SEQ ID NO: 2. Tým, že „v podstate krížovo nereagujú sa mieni to, že protilátka má väzbovú afinitu k nehomológnemu proteínu menšiu než 10 %, výhodnejšie menšiu ako 5 % a ešte výhodnejšie menšiu ako 1 % väzbovej afinity k proteínu so sekvenciou SEQ ID NO: 2.

Termín „protilátka sa v tomto texte používa tak, že zahŕňa aj fragmenty protilátky, ktoré tiež špecificky reagujú s ligandom Kay alebo jeho receptormi. Protilátky je možné fragmentovať pomocou obvyklých postupov, ktoré sú v odbore známe, a možnosti využitia fragmentov je potom možné otestovať rovnakými spôsobmi ako sa opísalo pre celé protilátky. Tak napr. fragment F(ab')₂ je možné pripraviť pôsobením pepsínu. Výsledný fragment sa potom disulfidové mostíky, podlá predkladaného môže ošetriť tak, aby sa redukovali čím vznikne fragment Fab'. K protilátkam vynálezu ďalej patria biošpecifické a chimérické molekuly, ktoré majú aktivitu namierenú proti ligandu Kay alebo proti jeho receptoru. Takže na blokovanie ligandu Kay alebo jeho receptora je možné využiť ako monoklonálne, tak polyklonálne protilátky (Ab) namierené proti ligandu Kay, nádorovému ligandu a ich receptorom, a tiež protilátkové fragmenty ako napr. Fab' alebo F(ab')₂ sa môžu použiť na zablokovanie ligandu a jeho receptora.

Rôzne formy protilátok je možné pripraviť štandardnými technikami rekombinantnej DNA (Winter a Milstein, Náture 349:293-299, 1991). Napr. je možné skonštruovať také chimérické protilátky, kde väzbová doména pre antigén z protilátky zvieraťa je spojená s ľudskou konštantnou doménou (Cabilly a kol., patent U.S. 4 816 567). Chimérické protilátky redukujú imunitnú odpoveď vyvolanú zvieracími protilátkami, keď sa použijú v klinických aplikáciách pre ľudských pacientov.

Okrem toho sa môžu syntetizovať rekombinanté „humanizované protilátky, rozpoznávajúce ligand Kay alebo jeho receptor. Humanizované protilátky sú chimérické protilátky, ktoré obsahujú väčšinou sekvencie ľudského IgG, do ktorých sa vložili sekvencie zodpovedné za špecifickú väzbu k antigénu. Zvieratá sa imunizujú požadovaným génom, potom sa izoluje príslušná protilátka a odstráni sa z nej časť variabilného úseku zodpovedná za špecifickú väzbu antigénu. Úsek viažuci antigén zo zvieraťa sa potom klonuje do vhodného miesta génu ľudskej protilátky, z ktorého sa odstránil úsek viažuci antigén. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterológnych (t.j. medzidruhových) sekvencii v ľudských protilátkach, a tak znižujú pravdepodobnosť vyvolania imunitnej odpovede u ošetrovaného pacienta.

Rôzne triedy rekombinantných protilátok sa môžu vytvárať tiež tak, že sa pripravia chimérické alebo humanizované protilátky obsahujúce variabilné domény a ludské konštantné izolované z rôznych tried môžu pripraviť rekombinantným domény (CH1, CH2 a CH3) imunoglobulínov. Tak napr. sa spôsobom protilátky so zvýšenou valenciou väzbových miest pre antigén, a to tak, že sa klonuje väzbové miesto pre antigén do vektora nesúceho konštantný úsek reťazca ľudskej protilátky (Arulandam a kol., J.Exp.Med. 177:1439-1450, 1993).

Okrem toho je možné použiť štandardné techniky rekombinantých DNA na zmenu väzbovej afinity rekombinantých protilátok s ich antigénmi tým, že sa zmenia zvyšky aminokyselín v blízkosti väzbového miesta pre antigén. Väzbová afinita pre antigén u humanizovanej protilátky sa môže zvýšiť mutagenézou založenou na molekulovom modelovaní (Quenn a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33, 1989).

F. Vytváranie analógov peptidových sekvencii

Príprava zmenených sekvencii DNA a

Analógy ligandu Kay podľa nálezu sa môžu líšiť od prirodzene sa vyskytujúceho ligandu v sekvencii aminokyselín, alebo iným spôsobom než aminokyselinovou sekvenciou, alebo obidvoma spôsobmi. K iným modifikáciám než je modifikácia sekvencie patrí ako in vitro tak in vivo chemická derivatizácia ligandu Kay. K týmto nesekvenčným modifikáciám patria zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii, pričom tento výpočet nie je limitujúci.

K výhodným analógom ligandu Kay patria jeho biologicky aktívne fragmenty, ktorých sekvencia sa líši od sekvencie uvedenej tu ako sekvencia SEQ ID NO: 2 jednou alebo niekolkými konzervatívnymi substitúciami, deléciami alebo inzerciami aminokyselín, ktoré nenarušujú biologickú aktivitu ligandu Kay. Ku konzervatívnym substitúciám typicky patrí substitúcia jednej aminokyseliny inou aminokyselinou s podobnými vlastnosťami, napr. substitúcia v rámci nasledujúcich skupín valín - glycín, glycín - alanín, valín - izoleucín - leucín, kyselina asparágová - kyselina glutámová, asparagín - glutamín, serín - treonín, lyzín arginín a fenylalanín - tyrozín.

Konzervatívne zmeny aminokyselín sú prehľadne uvedené v tabuľke 1.

Tabulka 1

Konzervatívne zámeny aminokyselín

Aminokyselinu	kód	možno nahradiť lubovolnou z:
Alanín	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginín	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo- -Arg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagín	A	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparágová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cysteín	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D- -Thr
Glutamín	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kyselina glutámová	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycín	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, -Ala, Acp
Izoleucín	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucín	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lyzín	K	D-Lys, Arg, D-Arg, hcmo-Arg, D-homo- Arg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Orn, D- -Orn
Metionín	M	D-Met, S-Me-Cys, íle, D-Ile, Leu, D- -Leu, Val, D-Val

Fenylalanín	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D- -His, Trp, D-Trp, trans-3,4 alebo 5- -fenylprolín, cis-3,4 alebo 5-fenyl- prolín
Prolín	P	D-Pro, L-l-tioazolidín-4-karboxylová kyselina, D- alebo L-l-0xazolidin-4- karboxylová kyselina
Serín	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D- -Met, Met(O), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Treonín	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D- -Met, Met(O), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrozín	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D- -His
Valín	V	D-Val, Leu, D-Leu, íle, D-lle, Met, D-Met

K užitočným metódam mutagenézy patrí mutagenéza pomocou PCR a saturačná mutagenéza, ktoré budú podrobne opísané v nasledujúcej časti. Tiež je možné vytvoriť knižnicu variantov náhodných sekvencii aminokyselín pomocou syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencii.

PCR mutagenéza

B

Pri mutagenéze pomocou PCR sa využíva malá presnosť Taq • polymerázy na zavedenie náhodných mutácií do klonovaného fragmentu DNA (Leung a kol., Technique 1: 11-15, 1989). Je to velmi účinná a pritom velmi rýchla metóda na vnesenie náhodných mutácií. Úsek DNA, ktorý sa má mutovať, sa amplifikuje pomocou polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR) v podmienkach, ktoré znižujú presnosť Taq polymerázy, napr. ak je pomer dGTP/dATP približne rovný 5 a pridá sa Mn²* do reakčnej zmesi pre PCR. Celá sada amplifikovaných fragmentov sa potom klonuje do vhodných vektorov a vytvorí sa tak knižnica náhodných mutantov.

Saturačná mutagenéza

Saturačná mutagenéza dovoľuje rýchle vnesenie veľkého počtu mutácií typu substitúcie jednej bázy do klonovaného fragmentu DNA (Mayers a koľ., Science 229:242, 1985). Táto technika zahŕňa vytvorenie mutácií, napr. chemickým ošetrením alebo ožiarením jednoreťazcovej DNA in vitro, a potom syntézu komplementárneho reťazca DNA. Frekvencia mutácií môže byť ovplyvnená silou pôsobiaceho účinku a v podstate je možné dosiahnuť substitúcie všetkých možných báz. Keďže celý tento proces nezahŕňa žiadnu genetickú selekciu mutovaných fragmentov, získajú sa tak fragmenty ako s neutrálnymi substitúciami, tak náhodne mutované fragmenty DNA, z ktorých sa môžu pripraviť proteíny so zmenenou funkciou. Distribúcia bodových mutácií nie je pritom nijak ovplyvnená vzhľadom na konzervatívne sekvenčné prvky.

Degenerované oligonukleotidy

Knižnicu homológov je možné pripraviť pomocou sady degenerovaných oligonukleotidov. Chemická syntéza degenerovaných sekvencií sa môže uskutočniť na zariadení na automatickú syntézu DNA, a syntetické gény sa potom ligujú do vhodného expresného vektora. Syntéza degenerovaných oligonukleotidov je spôsob v odbore dobre známy^(xxx) a tento spôsob sa už využil na cielený vývoj iných proteínov ^(XXX1).

Spôsoby nenáhodnej alebo cielenej mutagenézy sa môžu využiť na prípravu špecifických sekvencií alebo mutácií v určitých špecifických úsekoch. Tieto spôsoby sa môžu využiť na vytvorenie variantov, ktoré obsahujú delécie, inzercie alebo substitúcie aminokyselinových zvyškov v známej aminokyselinovej sekvencii proteínu. Miesta mutácií sa môžu modifikovať individuálne alebo v sériách napr. tak, že sa 1) najskôr substituujú konzervatívne aminokyseliny a potom sa uskutočnia radikálnejšie zmeny v závislosti od získaných výsledkov 2) deletujú sa cieľové zvyšky a 3) inzertujú sa zvyšky rovnakej alebo inej triedy do susedstva príslušného miesta, alebo sa kombinujú všetky uvedené spôsoby 1 až 3.

Mutagenéza nahradzovaním alanínom

Mutagenéza nahradzovaním alanínom („alanin scanning) je metóda vhodná na identifikáciu určitých zvyškov alebo úsekov požadovaných proteínov, ktoré sú vhodnými miestami alebo doménami pre mutagenézu. (Cunningham a Wells, Science 244: 10811085, 1989). Pri tejto metóde sa identifikujú zvyšky alebo skupiny zvyškov (napr. nabité aminokyselinové zvyšky ako Arg, Asp, His, Lys, Glu) a nahradia sa neutrálnou alebo negatívnou aminokyselinou (najvýhodnejšie alanínom alebo polyalanínom). Tieto náhrady aminokyselín môžu ovplyvniť interakciu aminokyselín s okolitým vodným prostredím vo vnútri alebo vonku bunky. Domény, u ktorých sa prejaví funkčná citlivosť na substitúcie, sa môžu ďalej spresňovať vnášaním ďalších zmien alebo zmenami už substituovaných miest. Takže, zatial čo miesto na vloženie variácie aminokyselinovej sekvencie je dopredu určené, povaha mutácie sama o sebe dopredu určená nie je. Tak napr. na optimalizáciu účinnosti mutácie v určitom mieste je možné uskutočniť nahradzovacou mutagenézu alanínom alebo náhodnou mutagenézou na cieľovom kodóne alebo úseku a exprimovať varianty podjednotiek požadovaného proteínu, a tie potom testovať na optimálnu kombináciu a požadovanú aktivitu.

Mutagenéza sprostredkovaná oligonukleotidmi

Mutagenéza sprostredkovaná oligonukleotidmi je metóda vhodná na prípravu substitučných, delečných a inzerčných variantov DNA (pozri napr. Adelman a kol., DNA 2:183, 1983).

Požadovaná DNA sa môže zmeniť tým, že hybridizuje s oligonukleotidom, ktorý obsahuje mutáciu DNA templátu, kde templátom je jednoreťazcová forma plazmidu alebo bakteriofága obsahujúca nezmenenú alebo natívnu sekvenciu DNA pre požadovaný proteín. Po hybridizácii sa použije DNA polymeráza na syntézu celého komplementárneho reťazca, takže templát potom obsahuje vložený oligonukleotidový primér a teda kóduje vybrané zmeny v DNA pre daný proteín. Všeobecne sa používajú oligonukleotidy velkosti najmenej 25 nukleotidov. Optimálny oligonukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidov, ktoré sú plne komplementárne k templátu na oboch stranách od nukleotidu (prípadne nukleotidov) kódujúceho mutáciu. To zaistí, že oligonukleotid bude správne hybridizovať s jednoreťazcovou templátovou DNA. Oligonukleotidy je možné jednoducho syntetizovať spôsobmi známymi v odbore (pozri napr. Crea a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5765, 1978).

Kazetová mutagenéza

Ďalším spôsobom, ako pripraviť varianty, je kazetová mutagenéza, ktorá je založená na technike, ktorú opísali Wells a kol. (Gene 34: 315, 1985). Východiskovým materiálom je plazmid (alebo iný vektor), ktorý obsahuje DNA pre proteínovú podjednotku, ktorá má byť mutovaná. Najskôr je treba identifikovať kodón (prípadne kodóny), ktoré sa majú v proteínovej podjednotke mutovať. Je treba, aby na každej strane od mutovaného miesta bolo jedinečné miesto pre reštrikčnú endonukleázu. Pokial také reštrikčné miesto neexistuje, je treba ho v požadovanej lokalizácii vytvoriť pomocou už opísanej mutagenézy sprostredkovanej oligonukleotidom. Potom, ako sa do plazmidu vložia reštrikčné miesta, plazmid sa v týchto miestach naštiepi, a teda linearizuje. Potom sa štandardným spôsobom syntetizuje dvojreťazcový oligonukleotid, ktorý kóduje sekvenciu DNA medzi dvoma reštrikčnými miestami a obsahuje požadovanú mutáciu. Každý oligonukleotidový reťazec sa syntetizuje samostatne a potom spolu hybridizujú opäť štandardným spôsobom v odbore známym. Tento dvojreťazcový oligonukleotid sa nazýva kazetou. Kazeta je pritom navrhnutá tak, aby obsahovala 3'-koniec a 5'-koniec kompatibilný s koncami linearizovaného plazmidu, takže sa môže priamo do plazmidu ligovať. Plazmid potom obsahuje mutovanú sekvenciu DNA požadovaného proteínu.

Kombinačná mutagenéza

Na vytvorenie mutácií je tiež možné použiť kombinačnú mutagenézu. Napr. aminokyselinové sekvencie skupiny homologic27 kých alebo inak príbuzných proteínových sekvencii sa priradia (usporiadajú), a to výhodne tak, aby sa dosiahlo maximálnej homológie. Všetky sekvencie, ktoré sa objavia v danej pozícii u všetkých usporiadaných sekvencii sa vyberú a vytvorí sa z nich degenerovaná sada kombinačných sekvencii. Kombinačnou mutagenézou sa vytvorí veľmi rôznorodá knižnica variantov na úrovni nukleových kyselín. Tak napr. zmes syntetických oligonukleotidov sa enzymatický liguje do génových sekvencii tak, že degenerovaná sada potenciálnych sekvencii sa môže exprimovať ako individuálne peptidy, alebo alternatívne, ako sada ďalších fúznych proteínov obsahujúcich sadu degenerovaných sekvencii.

Rôzne techniky sú v odbore známe na skríning produktov vytváraných mutovanými génmi. Techniky na skríning veľkých génových knižníc často zahŕňajú klonovanie knižnice do replikovateľných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek výslednou knižnicou vektorov, a expresiu génov v podmienkach, kedy detekcia požadovanej kvality, t.j. v tomto prípade väzba na ligand Kay alebo jeho receptor, umožňuje relatívne ľahko izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Každá z techník, ktoré sa opisujú v nasledujúcich odsekoch je vhodná na vysoko účinné a vysokokapacitné testovanie veľkého počtu sekvencii vytváraných napr. technikami náhodnej mutagenézy.

Vynález ďalej poskytuje možnosť pripravovať mimetiká na redukciu proteínových väzbových domén polypeptidu podľa vynálezu alebo jeho receptora, napr. peptidové činidlá alebo činidlá inej povahy než peptidy. Peptidové mimetiká sú schopné narušiť väzbu ligandu Kay a jeho receptora. Kritické zvyšky ligandu Kay zúčastňujúce sa procesu molekulového rozpoznávania receptorového polypeptidu alebo príslušného následného intracelulárneho proteínu v signálnej dráhe, môžu sa určiť a použiť na prípravu peptidových mimatík ligandu Kay alebo jeho receptora, ktoré kompetitívne alebo nekompetitívne inhibujú väzbu ligandu Kay a jeho receptora (pozri napr. „Peptide inhibitors of human papilloma vírus proteín binding to retinoblastoma gene proteín, patentové prihlášky EP 412 762 A a EP 831 080 A, ktoré sú zahrnuté formou odkazu).

G. Farmaceutické prípravky

Tým, že predkladaný vynález poskytuje purifikované a rekombinantné ligandy Kay, poskytuje tiež metódu testovania, ktorú je možné využiť na testovanie kandidátov liečiv, ktoré sú funkčne alebo agonistami alebo antagonistami normálnej bunkovej funkcie, v tomto prípade ligandu Kay alebo jeho receptora. V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu sa pomocou takéhoto testu hodnotí schopnosť zlúčeniny modulovať väzbu medzi ligandom Kay a jeho receptorom. Odborníkovi je zrejmé, že je možné vytvárať rôzne varianty testov podía predkladaného vynálezu.

V mnohých programoch na skríning liekov, ktoré sa užívajú na testovanie celej knižnice zlúčenín alebo prírodných extraktov, sa požadujú metódy s velkou účinnosťou a kapacitou spracovaných vzoriek, aby bolo možné maximalizovať počet zlúčenín otestovaných za jednotku času. Testy, ktoré sa uskutočňujú na bezbunkovom systéme, ako sú napr. purifikované alebo semipurifikované proteíny, sú často výhodné ako testy na tzv. primárny skríning, ktorý dovoľuje rýchly vývoj týchto zlúčenín, pretože umožňuje relatívne ľahkú detekciu zmien molekulového cieľa, ku ktorej dochádza pôsobením testovanej zlúčeniny. Avšak toxické pôsobenie na bunky a/alebo biologická dostupnosť testovanej zlúčeniny môžu ostať v takom in vitro systéme bez povšimnutia, pretože test je primárne zameraný na pôsobenie liečiva na molekulový ciel, kde sa prejavuje zmenou väzbovej afinity k iným proteínom alebo zmenami enzymatických vlastností molekulového cieľa.

Farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu obsahujú terapeuticky účinné množstvo ligandu Kay alebo jeho receptora, alebo ich fragmentov alebo mimetík, a prípadne obsahujú farmaceutický prijatelné nosiče a pomocné látky.

Vynález sa teda tiež týka spôsobu liečenia rakoviny a spôsobu stimulácie, alebo v určitých prípadoch naopak inhibície, imunitného systému, alebo jeho častí, ktoré spočívajú v podávaní farmaceutický účinného množstva zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu alebo ich farmaceutický účinných solí alebo derivátov. Pritom odborníkovi je zrejmé, že zlúčeniny a spôsoby podľa vynálezu sa môžu kombinovať s radom ďalších terapií.

Prípravky podlá predkladaného vynálezu sa môžu formulovať na rôzne spôsoby podávania, vrátane systémového, topického alebo lokálneho podávania. Na systémové podávanie je výhodné podávanie injekčné, vrátane intramuskulárnej, intravenóznej, intraperitoneálnej a subkutánnej injekcie, pričom prípravok podľa

predkladaného	vynálezu sa	môže	formulovať	ako	vodný	roztok,
výhodne	vo	fyziologickom	pufri	ako je	napr.	Hankov	alebo
Ringerov	roztok. Okrem	toho	prípravok	podľa	predkladaného
vynálezu	sa	môže formulovať	v pevnej	forme	na prípadné

rozpustenie alebo resuspendovanie bezprostredne pred použitím. Predkladaný vynález sa tiež týka lyofilizovaných foriem lieku.

Prípravok podľa predkladaného vynálezu sa môže podávať tiež perorálnym, transmukotickým alebo transdermálnym spôsobom. V prípravku na transmukotické alebo transdermálne podávanie sa použijú vhodné látky uľahčujúce penetráciu (penetranty) vzhladom na bariéru, ktorú je nutné prekonať. Také penetranty sú v odbore známe a patria k nim napr. na transmukotické podávanie soli žlčovej kyseliny, deriváty kyseliny fusidovej a detergenty. Transmukotické podávanie je možné uskutočňovať buď nosnou aerodisperziou (sprejom) alebo pomocou čapíkov. Na perorálne podávanie sa prípravok formuloval v obvyklej liekovej forme vhodnej na perorálne podávanie ako sú kapsle, tabletky a toniká. Na topické podávanie môže byť prípravok vo forme mastí, mazaní, gélov alebo krémov, ako je v odbore všeobecne známe.

Prípravky podľa vynálezu sú výhodne v jednotkovej dávkovej forme a podávajú sa jedenkrát alebo viackrát denne. Množstvo aktívnej látky podané buď v jednej dávke alebo V priebehu liečenia je závislé na mnohých rôznych faktoroch. Tak napr. na veku a veľkosti subjektu, závažnosti a priebehu ochorenia, ktoré sa lieči, spôsobe a forme podávania, a samozrejme na úsudku ošetrujúceho lekára. Avšak účinná dávka je v rozmedzí 0,005 až 5 mg/kg/deň, výhodne 0,05 až 0,5 mg/kg/deň. Odborník sám posúdi, kedy môžu byť prospešné nižšie alebo vyššie dávky.

Génové konštrukty podlá predkladaného vynálezu sa môžu použiť tiež ako súčasť protokolu génovej terapie na prenos nukleových kyselín kódujúcich buď agonistické alebo antagonistické formy polypeptidu ligandu Kay.

Expresné konštrukty ligandu Kay podľa vynálezu sa môžu podávať prostredníctvom akéhokolvek biologicky účinného nosiča, napr. akéhokolvek farmaceutického prípravku schopného účinne preniesť in vivo gén pre ligand Kay podľa vynálezu do bunky. Tento prístup znamená vložiť gén do vírusového vektora, ktorý môže priamo transfekovať bunku, alebo podať plazmidovú DNA, pomocou napr. lipozómov, alebo nejakého vnútrobunkového nosiča, alebo sa môže jednať o priamu injekciu génového konštruktu. Výhodnou metódou je prenos pomocou vírusového vektora.

Farmaceutický prípravok s génovým konštruktom na génovú terapiu sa skladá v podstate zo systému na prenos génov a vhodného riedidla, alebo sa môže jednať o matrix umožňujúci pomalé uvoľňovanie, do ktorého je systém prenášajúci gén zapustený. Alternatívne, pokial celý systém na prenos génov môže byť pripravený intaktný z rekombinantých buniek, napr. ako retrovírusový vektor, farmaceutický prípravok potom obsahuje jednu alebo niekolko buniek, ktoré produkujú systém na prenos génov.

Okrem použitia na terapiu sa oligoméry podlá predkladaného vynálezu môžu použiť ako diagnostické reagencie na detekciu prítomnosti či absencie cieľovej DNA, RNA alebo sekvencií aminokyselín, ku ktorým sa špecificky viažu. Iným aspektom predkladaného vynálezu je použitie na hodnotenie chemickej zlúčeniny z hladiska jej schopnosti reagovať, t.j. napr. viazať sa či inak fyzikálne asociovať, s ligandom Kay alebo s jeho fragmentmi. Spôsob obsahuje kontaktovanie chemickej látky s ligandom Kay a hodnotenie schopnosti látky reagovať s ligandom Kay. Okrem toho ligand Kay podľa predkladaného vynálezu sa môže použiť v metódach na hodnotenie prirodzene sa vyskytujúcich ligandov Kay alebo receptorov Kay, a tiež na hodnotenie chemických látok, ktoré sa asociujú alebo viažu s receptormi ligandu Kay.

Tento spôsob ligandu Kay

Iný aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob hodnotenia chemickej látky z hladiska jej schopnosti modulovať interakciu medzi ligandom Kay a jeho receptorom.

obsahuje zmiešanie ligandu Kay a receptora v podmienkach, kde taká dvojica je schopná interakcie, potom pridanie chemickej látky, ktorá sa testuje, a detekciu vytvorenia alebo naopak rozpadu komplexu. Takéto modulujúce činidlá sa môžu ďalej hodnotiť testami in vitro napr. testovaním ich aktivity v bezbunkovom systéme, prípadne ošetrením buniek týmito činidlami alebo podávaním týchto činidiel zvieratám a následným hodnotením účinkov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia receptora viažuceho ligand Kay

Na identifikáciu a kionovanie sa použili ligandy rodiny TNF. Pomocou opísaných sekvencií ligandu Kay bolo možné fúzovať 5'-koniec extracelulárnej domény, ktorý tvorí väzbovú sekvenciu pre receptor, k markerovej alebo značkovacej sekvencii a potom pridať vedúcu sekvenciu, ktorá podporuje sekréciu ligandu v niektorom z mnohých možných expresných systémov. Jeden príklad takého postupu sa opísal v práci Browning a kol. (JBC 271: 86188626, 1996), kedy sa ligand LT-β sekretoval v takej forme. Vedúca sekvencia VCAM sa pripojila ku krátkej značkovacej sekvencii peptidu myc s extracelulárnou doménou LT-β. Sekvencia VCAM sa použila preto, aby napomohla sekrécii molekuly LT-β, ktorá je normálne viazaná na membránu. Sekretovaný protein si ponechával značku myc na svojom N-konci, ktorá nijak neznižovala jeho schopnosť viazať sa na receptor. Taký sekretovaný protein sa potom exprimoval buď v prechodne transfekovaných bunkách COS alebo V podobnom systéme, napr. vektoroch odvodených od EBNA, systému hmyzej bunky a bakulovírusu alebo Pichia sp. a pod.. Ako zdroj označeného ligandu sa využil nepurifikovaný bunkový supernatant.

Bunky exprimujúce receptor bolo možné identifikovať tým, že sa exponovali označenému ligandu. Bunky s naviazaným ligandom sa potom identifikovali pomocou prietokovej cytometrie FACS, keď sa myc označil protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a potom fykoerytrínom (alebo podobnou značkou) značeným anti-myším imunoglobulínom. Bunky pozitívne na FACS sa lahko identifikovali a slúžili potom ako zdroj RNA kódujúci receptor. Z tejto RNA sa potom pripravila štandardným postupom expresná knižnica a rozdelila sa do podskupín („pools). Tieto podskupiny klonov sa potom transfekovali do vhodných hostitelských buniek a väzba označeného ligandu na transfekované bunky s receptorom sa identifikovala pomocou mikroskopického vyšetrenia potom, čo sa naviazaný myc peptid označil anti-myším imunoglobulínom označeným enzýmom, napr. galaktozidázou, alkalickou fosfatázou alebo luciferázou. Keď sa raz identifikovala pozitívna podskupina klonov, zmenšovala sa veľkosť podskupín dokiaľ nebola identifikovaná cDNA kódujúca receptor. Celá táto procedúra môže byť uskutočnená buď s myšacím alebo ľudským ligandom Kay, pričom jedna z nich povedie ľahšie k receptoru.

Odborníkovi je zrejmé, že je možné uskutočniť modifikácie prípravku APRÍL podía predkladaného vynálezu v rámci vynálezcovskej myšlienky vynálezu. Predkladaný vynález preto zahŕňa aj také modifikácie a variácie, pokial spadajú do predmetu vynálezu vymedzeného nasledujúcimi nárokmi, alebo pokiaľ ide o ekvivalentné riešenie.

ZOZNAM SEKVENCIÍ

Sekvencia SEQ ID NO: 1

TGCCAAGCCC TGCCATGTAG TGCACGCAGG ACATCAACAA ACACAGATAA 51 CAGGAAATGA TCCATTCCCT GTGGTCACTT ATTCTAAAGG CCCCAACCTT 101 CAAAGTTCAA GTAGTGATAT GGATGACTCC ACAGAAAGGG AGCAGTCACG 151 CCTTACTTCT TGCCTTAAGA AAAGAGAAGA AATGAAACTG AAGGAGTGTG 201 TTTCCATCCT CCCACGGAAG GAAAGCCCCT CTGTCCGATC CTCCAAAGAC 251 GGAAAGCTGC TGGCTGCAAC CTTGCTGCTG GCACTGCTGT CTTGCTGCCT 301 CACGGTGGTG TCTTTCTACC AGGTGGCCGC CCTGCAAGGG GACCTGGCCA 351 GCCTCCGGGC AGAGCTGCAG GGCCACCACG CGGAGAAGCT GCCAGCAGGA 401 GCAGGAGCCC CCAAGGCCGG CCTGGAGGAA GCTCCAGCTG TCACCGCGGG 451 ACTGAAAATC TTTGAACCAC CAGCTCCAGG AGAAGGCAAC TCCAGTCAGA 501 ACAGCAGAAA TAAGCGTGCC GTTCAGGGTC CAGAAGAAAC AGTCACTCAA 551 GACTGCTTGC AACTGATTGC AGACAGTGAA ACACCAACTA TACAAAAAGG 601 ATCTTACACA TTTGTTCCAT GGCTTCTCAG CTTTAAAAGG GGAAGTGCCC 651 TAGAAGAAAA AGAGAATAAA ATATTGGTCA AAGAAACTGG TTACTTTTTT 701 ATATATGGTC AGGTTTTATA TACTGATAAG ACCTACGCCA TGGGACATCT 751 AATTCAGAGG AAGAAGGTCC ATGTCTTTGG GGATGAATTG AGTCTGGTGA 801 CTTTGTTTCG ATGTATTCAA AATATGCCTG AAÄCACTACC CAATAATTCC 851 TGCTATTCAG CTGGCATTGC AAAACTGGAA GAAGGAGATG AACTCCAACT 901 TGCAATACCA AGAGAAAATG CACAAATATC ACTGGATGGA GATGTCACAT 951 TTTTTGGTGC ATTGAAACTG CTGTGACCTA CTTACACCAT GTCTGTAGCT 1001 ATTTTCCTCC CTTTCTCTGT ACCTCTAAGA AGAAAGAATC TAACTGAAAA

1051 TA

Sekvencia SEQ ID NO: 2

MDDSTEREQS RLTSCLKKRE EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA 51 TLLLALLSCC LTWSFYQVA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA 101 GLEEAPAVTA GLKIFEPPAP GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI 151 ADSETPTIQK GSYTFVPWLL SFKRGSALEE KENKILVKET GYFFIYGQVL 201 YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF GDELSLVTLF RCIQNMPETL PNNSCYSAGI

251 AKLEEGDELQ LAIPRENAQI SLDGDVTFFG ALKLL

Sekvencia SEQ ID NO: 3

GTGGTCACTT ACTCCAAAGG CCTAGACCTT CAAAGTGCTC CTCGTGGAAT 51 GGATGAGTCT GCAAAGACCC TGCCACCACC GTGCCTCTGT TTTTGCTCCG

101 AGAAAGGAGA AGATATGAAA GTGGGATATG ATCCCATCAC TCCGCAGAAG 151 GAGGAGGGTG CCTGGTTTGG GATCTGCAGG GATGGAAGGC TGCTGGCTGC 201 TACCCTCCTG CTGGCCCTGT TGTCCAGCAG TTTCACAGCG ATGTCCTTGT 251 ACCAGTTGGC TGCCTTGCAA GCAGACCTGA TGAACCTGCG CATGGAGCTG 301 CAGAGCTACC GAGGTTCAGC AACACCAGCC GCCGCGGGTG CTCCAGAGTT 351 GACCGCTGGA GTCAAACTCC TGACACCGGC AGCTCCTCGA CCCCACAACT 401 CCAGCCGCGG CCACAGGAAC AGACGCGCTT TCCAGGGACC AGAGGAAACA 451 GAACAAGATG TAGACCTCTC AGCTCCTCCT GCACCATGCC TGCCTGGATG 501 CCGCCATTCT CAACATGATG ATAATGGAAT GAACCTCAGA AACAGAACTT 551 ACACATTTGT TCCATGGCTT CTCAGCTTTA AAAGAGGAAA TGCCTTGGAG 601 GAGAAAGAGA ACAAAATAGT GGTGAGGCAA ACAGGCTATT TCTTCATCTA 651 CAGCCAGGTT CTATACACGG ACCCCATCTT TGCTATGGGT CATGTCATCC 701 AGAGGAAGAA AGTACACGTC TTTGGGGACG AGCTGAGCCT GGTGACCCTG 751 TTCCGATGTA TTCAGAATAT GCCCAAAACA CTGCCCAACA ATTCCTGCTA 801 CTCGGCTGGC ATCGCGAGGC TGGAAGAAGG AGATGAGATT CAGCTTGCAA 851 TTCCTCGGGA GAATGCACAG ATTTCACGCA ACGGAGACGA CACCTTCTTT 901 GGTGCCCTAA AACTGCTGTA ACTCACTTGC TGGAGTGCGT GATCCCCTTC 951 CCTCGTCTTC TCTGTACCTC CGAGGGAGAA ACAGACGACT GGAAAAACTA

1001 AAAGATGGGG AAAGCCGTCA GCGAAAGTTT TCTCGTGACC CGTTGAATCT 1051 GATCCAAACC AGGAAATATA ACAGACAGCC ACAACCGAAG TGTGCCATGT 1101 GAGTTATGAG AAACGGAGCC CGCGCTCAGA AAGACCGGAT GAGGAAGACC 1151 GTTTTCTCCA GTCCTTTGCC AACACGCACC GCAACCTTGC TTTTTGCCTT 1201 GGGTGACACA TGTTCAGAAT GCAGGGAGAT TTCCTTGTTT TGCGATTTGC 1251 CATGAGAAGA GGGCCCACAA CTGCAGGTCA CTGAAGCATT CACGCTAAGT 1301 CTCAGGATTT ACTCTCCCTT CTCATGCTAA GTACACACAC GCTCTTTTCC 1351 AGGTAACTAC TATGGGATAC TATGGAAAGG TTGTTTGTTT TTAAATCTAG 1401 AAGTCTTGAA CTGGCAATAG ACAAAAATCC TTATAAATTC AAGTGTAAAA 1451 TAAACTTAAT TAAAAAGGTT TAAGTGTG

Sekvencia	SEQ ID N
1	MDESAKTLPP
51	ATLLLALLSS
101	LTAGVKLLTP
151	CRHSQHDDNG
201	YSQVLYTDPI
251	YSAGIARLEE

D: 4

PCLCFCSEKG EDMKVGYDPI SFTAMSLYQL AALQADLMNL AAPRPHNSSR GHRNRRAFQG MNLRNRTYTF VPWLLSFKRG FAMGHVIQRK KVHVFGDELS GDEIQLAIPR ENAQISRNGD

TPQKEEGAWF GICRDGRLLA RMELQSYRGS ATPAAAGAPE PEETEQDVDL SAPPAPCLPG NALEEKENKI WRQTGYFFI LVTLFRCIQN MPKTLPNNSC DTFFGALKLL

Zoznam citovanej literatúry

i. Smith et al. 1990; Kohno et al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.

ii. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.

iii. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emereine Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A.

Waage, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emereine Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

iv. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emereine Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).

v. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emereine Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emereine Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emereine Role in

Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emereine Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emereine Role in

Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 371 (1992).

vi. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emereine Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).

vii. D. A. Fox, Am. J. Med.,99. 82 (1995).

viii. D. Goeddel et al., Cold Sprine Harbor Symposium Ouant. Biol.. 51,597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, N Y, p 515 (1992).

ix. L. A. Tartaglia et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 88,9292 (1991); L.A. Tanaglia and D. V. Goeddel, Immunol. Today. 13,151 (1992).

x. B. Luettig et al., J. Immunol.. 143,4034 (1989); M. Kriegler et al., Celí. 53,45 (1988).

xi. C. F. Ware et al., in Pathwavs for Cvtolvsis. G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag, Berlín, Heidelberg, p 175-218 (1995).

xii. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol..6.407 (1988).

xiii. P.D. Crowe et al., Science. 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Celí. 72, 847 (1993); J. Browning et al., J. Immunol.. 154,33 (1995).

xiv. P. De Togni et al., Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol.. 155, 1685 (1995).

xv. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol..143.1859 (1989); J. Browning et al., J, Exp. Med.. 183. 867 (1996).

xvi. T. Suda et al., J, Immunol.. 154, 3806 (1995)(T. Suda et al., J. Irnmunol., 154, 3806(1995).

xvii. B.C. Trauth et al., Science. 245,301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med.. 169,1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science. 267,1449 (1995); M. H. Falk et al., Blood. 19, 3300 (1992).

xviii.F. Rieux-Laucat et al., Science. 268,1347 (1995); T. Takahashi et al., Celí. 76,969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Náture, 356,314 (1992).

xix. P. R. Galie and al., J. Exp. Med.. 182,1223 (1995).

xx. F. Silvestris and al., Clin, Immunol. Imrnunopathol.. 75,197 (1995).

xxi. P.D. Katsikis et al., J. Exp. Med.,181.2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol..70. 199 (1996).

xxii. S. Wiley et al., Immunitv. 3,673 (1995).

xxiii. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett.. 315,259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood, 83, 2787 (1994).

xxiv. R. C. Alien et al., Sciencg. 259, 990 (1993).

xxv. L. Biancone et al., Kidnev-Int.,48.458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol.. 154,1470(1995).

xxvi. J. Ruby and al., Náture Medicíne. 1,437 (1995).

xxvii. Z. Wang et al., J. Immunol.. 155,3722 (1995); A. M. Cleary and al., J. Immunol.. 155,3329(1995).

xxviii. S. Hess and H. Engelman, J, Exp. Med..183. 159 (1996).

xxix. R. G. Goodwin et al, Celí. 73,447 (1993); Goodwin et al, Eur. J. Immunol.. 23,2631 (1993); C. A. Smith et al., Celí, 73, 1349 (1993).

xxx. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA. Proc 3rd Cleveland Svmpos. Macromolecules. ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

xxxi. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al.

(1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406;

Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346, and 5,096,815.

33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent inďuction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand. J. Immunol. 155:4147-4154,1995.

34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Mori, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B celí IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.'

35. R. Amakawa, A. Hakem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak. Impaired negatíve selection of T cells in Hodgkin=s disease antigén CD30-defícient mice. Celí 84:551-562,1996.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bomand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosismediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor and fas (apo-l/CD95). Immunitv 6: 79-88,1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFR-related protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosissarcoma viruses and mediates apoptosis. Celí 87: 845-855,1996.

38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33-kDa glycoprotein are expresed on the surface of an activated human T celí hybridoma. J, Immunol, 147: 1230-7,1991.

39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffíths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J, Biol. Chem. 271: 8618-26, 1996.

40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W. Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negatíve selection of thymocytes. Immunitv 5: 617-627,1996.

41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20:465-470, 1995.

42. Y. Chicheponiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouse macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which » shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim,

Biophvs. Res. Comm. 209: 1076-1081,1995.

43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Gentz, J. Ni and V.M. Dixit. Signál transduction by DR3 a deathdomain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274: 990992, 1996.

44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice defícient in lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.

45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S.

Kwon and T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181:985-992, 1995.

46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth airest in A375 melanoma cells. J. Immunol. 158: 1756-1762, 1997.

47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its ligand gp39. Ann. Rev. Immunol, 14:591-617, 1996.

48. H.J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R.J. Armitage, C.A. Smith and R.G.

_e Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and Iymphoma celí Iines. Blood 83: 2045-56,1994.

49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Náture 384: 372-375,1996.

51. S. Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T celí receptor-dependent celí death of T celí hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J. Exp. Med. 183: 669-674, 1996.

52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Celí 87: 427-436, 1996.

53. S. Nagata. Apoptosis by death factor. Celí 88: 355-365, 1997.

54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem. 1996.

55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Celí 76: 95962,1994.

56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol. 3: 81-88,1994.

57. E.Strueber and W. Strober. The T cell-B celí interaction via OX40-OX40L is necessary for the T celí independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989,1996.

58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programmed celí death in T celí receptor trangenic mice. Immunitv 5: 17-30,1996.

59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452, 1992.

60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Náture 377: 348-351, 1995.

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sekvencia DNA kódujúca ligand Kay alebo jej fragment.
2. 2. Sekvencia DNA kódujúca ligand Kay, ktorá je tvorená v podstate sekvenciou SEQ ID NO: 1 alebo sekvenciou SEQ ID NO: 3.
3. 3. Sekvencia DNA tvorená v podstate sekvenciou SEQ ID NO: 1 alebo SEQ ID NO: 3, ktorá kóduje polypeptid tvorený v podstate sekvenciou SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4.
4. 4. Sekvencia DNA, ktorá hybridizuje aspoň s fragmentom sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo SEQ ID NO: 3, pričom fragment obsahuje súvislý úsek aspoň 20 po sebe idúcich báz a DNA sekvencia kóduje polypeptid aspoň na 30% homologický s aktívnym miestom ligandu Kay.
5. 5. Sekvencia DNA podlá nároku 2, ktorá je tvorená v podstate sekvenciou SEQ ID NO: 1 alebo SEQ ID NO: 3 s konzervatívnymi substitúciami, alteráciami alebo deléciami.
6. 6. Rekombinantné molekula DNA obsahujúca sekvenciu kódujúcu ligand Kay, ktorá je operatívne spojená s expresnou kontrolnou sekvenciou.
7. 7. Molekula podľa nároku 6, ktorá obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 1 alebo SEQ ID NO: 3.
8. 8. Jednobunkový hostite! transformovaný molekulou rekombinantnej DNA podľa nároku 6 alebo 7.
9. 9. Sekvencia DNA kódujúca ligand Kay, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4.
10. 10. Spôsob prípravy v podstate čistého ligandu Kay, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok, keď sa kultivuje jednobunkový hostiteľ podľa nároku 8.
11. 11. Ligand Kay v podstate bez živočíšnych proteínov, s ktorými je normálne asociovaný.
12. 12. Ligand Kay podľa nároku 11 tvorený v podstate sekvenciou SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4.

    * t
13. 13. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, • že obsahuje terapeuticky účinné množstvo ligandu Kay alebo jeho aktívneho fragmentu a farmaceutický prijateľný nosič.
14. 14. Spôsob prevencie alebo redukcie vážnosti autoimunitnej choroby, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania terapeuticky účinného množstva farmaceutického prípravku podlá nároku 13.
15. 15. Farmaceutický prípravok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že ligand Kay alebo jeho aktívny fragment obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 alebo ich biologicky aktívny fragment.
16. 16. Spôsob prevencie alebo redukcie miery autoimunitnej reakcie na tkanivový štep, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania terapeuticky účinného množstva farmaceutického prípravku podlá nároku 13.
17. 17. Spôsob stimulácie imunitného systému, vyznačujúci » s a t ý m, že obsahuje krok podania prípravku podlá nároku 13.

    i •
18. 18. Spôsob potlačenia imunitného systému, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania účinného množstva farmaceutického prípravku podlá nároku 13.
19. 19. Spôsob liečenia rakoviny, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania účinného množstva farmaceutického prípravku podlá nároku 13.
20. 20. Spôsob identifikácie receptora pre ligand Kay, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď:

    a) sa poskytne ligand Kay alebo jeho fragment,

    b) ligand Kay alebo jeho fragment sa označí detegovateľnou značkou,

    c) uskutoční sa skríning zlúčenín, aby sa detegovali receptory, ktoré sa viažu na detegovatelne označený ligand Kay z kroku b).
21. 21. Rozpustný biologicky aktívny fragment ligandu Kay podlá nároku 11.
22. 22. Polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná DNA vybratou zo skupiny obsahujúcej:

    a) sekvenciu DNA obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 1 alebo SEQ ID NO: 3

    b) sekvenciu DNA, ktorá hybridizuje s DNA definovanou v a) a ktorá kóduje polypeptid aspoň na 40% homologický s ligandom Kay podľa nároku 12.
23. 23. Protilátkový preparát, ktorý je reaktívny s ligandom Kay alebo s jeho receptorom alebo ich biologicky aktívnymi fragmentmi.
24. 24. Protilátkový preparát podlá nároku 23, ktorý obsahuje monoklonálnu protilátku.
25. 25. Spôsob prípravy protilátkového preparátu reaktívneho s ligandom Kay alebo jeho receptorom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok, keď sa organizmus imunizuje ligandom Kay alebo jeho receptorom alebo ich antigénnym fragmentom.
26. 26. „Antisense nukleová kyselina proti ligandu Kay, ktorá obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny hybridizujúca aspoň s časťou sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo sekvencie SEQ ID NO: 3.
27. 27. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje protilátkový preparát podía nároku 24.
28. 28. Spôsob expresie génu v bunke cicavca, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje kroky, keď:

    a) gén kódujúci ligand Kay sa vnesie do bunky

    b) bunka sa ponechá žiť v takých podmienkach, že gén sa exprimuje v cicavcovi.
29. 29. Spôsob liečenia chorôb spojených s ligandom Kay u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že

    a) do bunky sa vnesie terapeuticky účinné množstvo vektora obsahujúceho gén kódujúci ligand Kay, a

    b) gén sa exprimuje v bunke cicavca.
30. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že cicavec je človek.
31. 31. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že vektor je vírus.
32. 32. Spôsob indukcie bunkovej smrti, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie činidla schopného rušiť väzbu ligandu Kay na jeho receptor.
33. 33. Spôsob podlá nároku 32, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje podanie interferónu-γ.
34. 34. Spôsob liečenia, potlačenia alebo zmenenia imunitnej reakcie zahrňujúci signálnu dráhu medzi ligandom Kay a jeho receptorom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok podania účinného množstva činidla schopného rušiť väzbu medzi ligandom Kay a jeho receptorom.
35. 35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým že imunitná reakcia zahrňuje bunky ľudského adenokarcinómu.