SK11512002A3 - Modifikované cytokíny pre použitie pri terapii rakoviny - Google Patents

Modifikované cytokíny pre použitie pri terapii rakoviny Download PDF

Info

Publication number
SK11512002A3
SK11512002A3 SK1151-2002A SK11512002A SK11512002A3 SK 11512002 A3 SK11512002 A3 SK 11512002A3 SK 11512002 A SK11512002 A SK 11512002A SK 11512002 A3 SK11512002 A3 SK 11512002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
tnf
tumor
ngr
conjugation product
cytokine
Prior art date
Application number
SK1151-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK287550B6 (sk
Inventor
Angelo Corti
Original Assignee
Fondanzione Centro San Raffaele Del Monte Tabor
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondanzione Centro San Raffaele Del Monte Tabor filed Critical Fondanzione Centro San Raffaele Del Monte Tabor
Publication of SK11512002A3 publication Critical patent/SK11512002A3/sk
Publication of SK287550B6 publication Critical patent/SK287550B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • C08L89/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
    • C08L89/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin, e.g. gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/412—Microsized, i.e. having sizes between 0.1 and 100 microns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa týka modifikovaných cytokínov pre použitie pri liečbe rakoviny. Vynález sa týka najmä cytokínových derivátov schopných „zacieľovania“ nádorových ciev a buniek predstavujúcich antigén.
Doterajší stav techniky
Protinádorová aktivita niektorých cytokínov je dobre známa a popísaná. Niektoré cytokíny už boli terapeuticky použité aj u ľudí (Fiers, W. Biologická terapia s TNF: predklinické štúdie. In V. de Vitá, S. Hellman a S. Rosenberg Eds). Biologická terapia rakoviny: princípy a prax. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1995. P. 295-327). Napríklad, také cytokíny ako interleukín-2 (IL-2) a interferón oc(IFNa) ukazujú pozitívnu protinádorovú aktivitu u pacientov s rôznymi typmi nádorov, ako je metastázový karcinóm ľadvín, leukémia vlasových buniek, Kaposi sarkóm, melanóm, mnohopočetný mielóm a podobne. Iné cytokíny ako IFNp, faktor nádorovej nekrózy (TNF)a, TNFp, IL-1, 4, 6, 12, 15 a faktory stimulujúce kolónie (CFS) ukazujú určitú protinádorovú aktivitu na niektoré typy nádorov, a teda sú predmetom ďalších štúdií.
Vo všeobecnosti terapeutické použitie cytokínov je silne obmedzené ich systémovou toxicitou. Napríklad, TNF bol pôvodne objavený pre svoju kapacitu vyvolania hemoragickej nekrózy niektorých nádorov (Carswell, E.A., et al., Endotoxínom vyvolaný sérový faktor, ktorý spôsobuje nekrózu nádorov. Proc, Natl. Acad. Sci. USA 1975, 72:3666-70), a pre svoj in vitro cytotoxický efekt na rôzne nádorové línie (Helson, L., et al., Efekt faktora nádorovej nekrózy na kultivované ľudské melanómové bunky. Náture 1975. 258:731-732), ale následne sa dokázalo, že má silnú prozápalovú aktivitu, ktorá môže v prípade nadprodukčných podmienok, nebezpečne pôsobiť na ľudský organizmus (Tracey, K.L., and A. Cerami. Faktor nádorovej nekrózy, iné cytokíny a ochorenia. Ann. Rev. Celí Biol, 1993, 9:317-43).
Keďže systémová toxicita je základným problémom použitia farmakologicky aktívnych množstiev cytokínov u ľudí, teraz sú vo vývoji deriváty a terapeutické stratégie zamerané na redukovanie toxických efektov tejto triedy biologických efektorov pri udržiavaní ich terapeutickej účinnosti.
Niektoré prístupy sú zamerané na:
a) rozvoj zmesových proteínov, ktoré môžu dodávať TNF do nádoru a zvýšenie miestnej koncentrácie. Napríklad, boli vyrobené zmesové proteíny obsahujúce TNF a pre nádor špecifické protilátky (Hoogenboom, H. R., et al., Konštrukcia a expresia protilátky faktora nádorovej nekrózy alebo spojených proteínov. Mol. Immunol. 1991.28:1027-37),
b) rozvoj TNF mutantov, ktoré udržujú protinádorovú aktivitu a majú redukovanú systémovú toxicitu. Podľa toho, boli už pripravené mutanty schopné selektívne rozoznávať len jeden receptor (p55 alebo p75) (Loetscher, H., et al., Mutanty ľudského faktora nádorovej nekrózy alfa (TNF alfa) s výlučnou špecifickosťou pre 55-kDaTNF receptory. J. Biol. Chem. 1993. 268:26350-7),
c) použitie anti-TNF protilátok schopných redukovať niektoré toxické efekty TNF bez ohrozenia ich protinádorovej aktivity. Také protilátky už boli popísané v literatúre (Rathjen, D.A., et al,, 1992. Selektívne zvýšenie nádorovej nekrotickej aktivity TNF alfa s monoklonálnou protilátkou. Brit. J. Cancer 65:852),
d) použitie TNF derivátov s vyšším polčasom rozpadu (napríklad TNF konjugované s polyetylénglykolom).
Nedávno bola zaznamenaná príprava TNF derivátov schopných selektívne pôsobiť na nádorové miesta. Napríklad, bol popísaný zmesový protein získaný spojením génu veľkého reťazca antitransferinového receptoru mAb a TNF génu (Hoogenboom, H. R., et al., Konštrukcia a expresia protilátky faktora nádorovej nekrózy alebo zmesových proteínov. Mol. Immunol. 1991. 28:1027-37), alebo zmesový protein TNF so „závesovou“ oblasťou monoklonálnej protilátky proti s nádorom spojeným TAG72 antigénom (Yang, J., et al., Geneticky vybudovaná jednoreťazcová Fv/TNF molekula majúca protinádorovú imunreaktivitu Fv, ako aj cytotoxická aktivita faktora nádorovej nekrózy. Mol. Immunol. 1995. 32:873-81), alebo Fv-TNF zmesový protein (Yang, J., et al., Geneticky vybudovaná jednoreťazcová Fv/TNF molekula majúca protinádorovú imunreaktivitu Fv, ako aj cytotoxická aktivita faktora nádorovej nekrózy. Mol. Immunol. 1995. 32:873-81).
EP 251 494 popisuje systém pre podávanie diagnostického alebo terapeutického činidla, ktoré zahrňuje: protilátku konjugovanú s avidínom alebo streptavidínom, činidlo schopné komplexovania konjugovanej protilátky a zlúčeniny obsahujúcej diagnostické alebo terapeutické činidlo konjugované s biotínom, ktoré sú podávané postupne a primerane postupne tak, aby umožňovali lokalizáciu terapeutického alebo diagnostického činidla prostredníctvom interakcie biotínstreptavidín na bunky pôsobenia rozoznávané protilátkou. Popísané terapeutické alebo diagnostické činidlá zahrňujú cheláty kovov, najmä cheláty rádionuklidov a protinádorové činidlá s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je cis-platina, doxorubicín, atď.
EP 496 074 popisuje spôsob, ktorý uskutočňuje postupné podávanie biotinylovanej protilátky, avidín alebo streptavidín a biotinylované diagnostické alebo terapeutické činidlo. Hoci cytotoxické činidlá, ako ricín, sú genericky uvádzané, väčšinou je popísaná aplikácia týkajúca sa rádiooznačených zlúčenín.
WO 95/15979 popisuje spôsob lokalizovania vysoko toxických činidiel na bunky pôsobenia, na základe podávania prvého konjugátu zahrňujúceho špecifickú molekulu pôsobenia konjugovanú s ligandom alebo antiligandom, po čom nasleduje podávanie druhého konjugátu zloženého z toxického činidla viazaného na antiligand alebo na ligand.
WO 99/13329 popisuje spôsob pôsobenia molekuly na nádorové angiogénne cievy na základe konjugácie tejto molekuly s ligandami NGR receptorov. Bolo navrhnutých veľa molekúl ako možných kandidátov, ale špecificky popísaný je len doxorubicín. Nie je popísané žiadne použitie NGR receptorov ako vehikulov cytokínov pre vyvolanie imunitnej reakcie.
Podstata vynálezu
Teraz bolo prekvapujúco zistené, že terapeutický index určitých cytokínov môže byť značne zlepšený a ich imunoterapeutické vlastnosti môžu byť zvýšené spojením s ligandom aminopeptidáza-N receptora (CD13). CD13 je transmembránový glykoprotein s 150 kDa, vysoko zachovaný u rôznych druhov. Je expresovaný na normálnych bunkách, ako aj v myeloidných nádorových líniách, vangiogénnom endotele a v niektorých epiteloch. CD13 receptor je bežne označovaný ako „NGR“ receptor, pretože jeho peptidové ligandy majú rovnaký prvok „NGR“ ako aminokyseliny.
Podľa prvého aspektu vynález uskutočňuje konjugačný produkt cytokínu vybraný z TNF a IFNy a ligandu CD13 receptora. Tento ligand môže byť protilátka alebo jej fragment, ako je Fab, Fv, jednoreťazcová Fv, peptid alebo peptido mymetická, konkrétne peptidu podobná molekula schopná viazať CD13 receptor, prípadne obsahujúca modifikované, nie prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny. Ligand je prednostne priamy alebo cyklický peptid zahrňujúci NGR prvok, ako je CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cykloCVLNGRMEC alebo cykloCNGRC, alebo prednostnejšie peptid CNGRC. Peptid môže byť spojený priamo s cytokínom alebo nepriamo prostredníctvom vložky, ktorou môže byť jedna aminokyselina, aminokyselinová sekvencia alebo organické rezíduum, ako je 6-aminokapryl-Nhydroxysukcínimid. Spájacie postupy sú známe odborníkom v stave techniky a zahrňujú techniky genetického inžinierstva alebo chemickej syntézy.
Peptidový ligand je prednostne viazaný s N-ukončením cytokínu, takto minimalizujúc všetky prekážky pri viazaní modifikovaného cytokínu s jeho receptorom. Alternatívne, peptid môže byť viazaný na aminokyselinové rezíduum, ktorým sú amidové alebo karboxylové väzbové receptory, prirodzene sa vyskytujúce na molekule alebo umelo vsunuté technikami genetického inžinierstva. Modifikovaný cytokín je prednostne pripravený použitím cDNA zahrňujúcej 5'-združujúcu sekvenciu kódujúcu peptid.
Podľa prednostného uskutočnenia je uskutočnená konjugačný produkt TNF a CNGRC sekvencie. Prednostnejšie, amino-ukončenie TNF je viazané s CNGRC peptidom prostredníctvom vložky G (glycín).
Výsledný produkt (NGR-TNF) dokázal, že je aktívnejší než TNF na RMA-T lymfóm zvieracích modelov. Ďalej, zvieratá liečené NGR-TNF boli schopné neprijať ďalšie nádorotvorné dávky RMA-T alebo RMA buniek. Zvýšenie protinádorovej aktivity, v porovnaní s normálnym TNF, mohlo byť pozorované u imunity schopných zvierat, ale nie u zvierat s chýbajúcou imunitou. Toto ukazuje, že zvýšenie protinádorovej aktivity TNF konjugovaného s „NGR“ peptidmi je viac vďaka imunitnej reakcii než priamej cytotoxickej aktivite konjugátu.
Tiež bolo ukázané, že in vivo imunitné efekty vyvolané prostredníctvom NGRTNF sú priamo vo vzťahu k CD13 receptoru. Bolo napríklad pozorované, že protilátka proti CD13 receptoru, ako aj GNGRC ligand konkuruje NGR-TNF in vivo, takto naznačujúc receptorový mechanizmus pôsobenia pomocou NGR-TNF.
Terapeutický index TNF / CD13 ligandových konjugátov môže byť ďalej zlepšený použitím mutantnej formy TNF schopnej selektívneho viazania na jeden alebo dva TNF receptory, p75TNFR a p55TNFR. Tento TNF mutant môže byť získaný prostredníctvom na miesto zameranej mutagenézy (Loetscher, H., et al.,
Mutanty ľudského faktora nádorovej nekrózy alfa (TNF alfa) s výlučnou špecifickosťou pre 55-kDa TNF receptory. J. Biol. Chem. 1993. 268:26350-722; Van
Ostade, X., et al., Ľudské TNF mutanty s elektívnou aktivitou na p55 receptor.
Náture 1993. 361:266-9).
Farmakokinetika modifikovaných cytokinov podľa vynálezu môže byť zlepšená pripravením polyetylénglykolových derivátov, ktoré umožňujú rozšíriť plazmatický polčas rozpadu samotných cytokinov.
Ďalšie uskutočnenie vynálezu je uskutočnené difunkčnými derivátmi, v ktorých sú cytokíny modifikované sCD13 ligandom konjugované s protilátkami, alebo ich fragmentmi, proti nádorovým antigénom alebo iným nádorovým angiogénnym markerom, napríklad αν integríny, metaloproteázy alebo vaskulárny rastový faktor, alebo protilátky alebo ich fragmenty zamerané proti zložkám mimobunkovej materskej pôdy, ako sú antitenaskínové protilátky alebo antifibronektínová EDB doména. Nedávno bola zaznamenaná príprava zmesového produktu medzi TNF a závesovou oblasťou mAb proti š nádorom spojeným TAG72 antigénom expresovaným žalúdočným a vaječníkovým adenokarcinómom (Yang, J., et al., Geneticky vybudovaná jednoreťazcová FvfTNF molekula majúca protinádorovú imunreaktivitu Fv, ako aj cytotoxická aktivita faktora nádorovej nekrózy. Mol. Immunol. 1995. 32:873-81).
Ďalšie uskutočnenie vynálezu je uskutočnené predpôsobiacim systémom biotín / avidín na nádory. Podľa tohto prístupu je získaný ternárny komplex na nádorovom antigénnom mieste, v rôznych štádiách, ktorý je vytvorený 1) biotinylovaným mAb, 2) avidínom (alebo streptavidínom) a 3) divalentným cytokínom modifikovaným CD13 ligandom a biotínom. Množstvo publikácií dokázalo, že prístup predpôsobenia, v porovnaní s konvenčným pôsobením imunokonjugátmi môže súčasne zvýšiť pomer aktívnej molekuly cielenej na pôsobenie na neviazanú aktívnu molekulu, takto redukujúc toxicitu liečby (Colombo, P., et al., Imunoscitigrafia s anti-chromogranín A protilátkou u pacientov s endokrinnými / neuroendokrinnými nádormi. J. Endocr. Invest. 1993. 16:841-3; Paganelli, G., et al., Trojstupňovvá monoklonálna protilátka pôsobenia na nádor u karcinoembryonálnych antigénpozitívnych pacientov. Cancer Res. 1991.51:59606; Modorati, G., et al., Imunoscitigrafia s trojstupňovou monoklonálnou predpôsobiacou technikou pri diagnóze uveálneho melanómu: predbežné výsledky.
Br. J. Opthalm. 1994. 78:19-23; Paganelli, G et al., Klinická aplikácia avidín-biotín systému pri pôsobení na nádor. In D. Goldenberg (Ed. Cancer therapy with radiolabeled antibodies. CRC Press, Boca Raton, 1995. P. 293-253). Tento prístup produkoval priaznivé výsledky pri biotinylovanom TNF, ktorý je schopný vyvolať cytotoxicitu in vitro a zníženie rastu nádorových buniek pri podmienkach, v ktorých normálne TNF bolo neaktívne (Moro, M., et al., Nádorové bunky pôsobiace s protilátkou avidínových komplexov a biotinylovaný faktor nádorovej nekrózy alfa. Cancer Res. 1997. 57:1922-8; Ljunggren, H. G., a K. Karre. Hostiteľská odolnosť zameraná selektívne proti Η-2-deficitných lymfómovým variantám. Analýza mechanizmu. J. Exp. Med. 1985. 162:1745-59). Prístup predpôsobenia môže byť tiež uskutočnený dvojfázovým postupom použitím dvojšpecifickej protilátky, ktorá súčasne viaže nádorový antigén a modifikovaný cytokín. Nedávno bolo popísané použitie dvojšpecifickej protilátky zameranej proti karcinoembryonálnemu antigénu a TNF ako prostriedok pre TNF nádorové predpôsobenie (Róbert, B., et al., 1996. Cytokínové pôsobenie u nádorov použitím dvojšpecifickej protilátky zameranej proti karcinoembryonálnemu antigénu a faktoru nádorovej nekrózy alfa. Cancer Res. 56:4758).
Podľa ďalšieho uskutočnenia vynález zahrňuje TNF molekulu konjugovanú s CD13 ligandom ako aj protilátkou, alebo jej fragmentom (priamo alebo nepriamo cez mostík biotín-avidín), na rôznych TNF podjednotkách, kde protilátka alebo jej fragmenty sú zamerané proti antigénu expresovanému na nádorových bunkách alebo iných zložkách nádorovej stromy, napríklad tenaskínovej a fibronektínovej EDB domény. Toto vyúsťuje do ďalšieho zlepšenia cieľových vlastností modifikovaných cytokínov u nádoru a do pomalého uvoľňovania posledne uvedených v nádoroch mikroprostredia cez prechodné štádiá trimér-monomértrimér. Ako je ukázané v predchádzajúcich prácach, v skutočnosti, modifikované podjednotky TNF konjugátov môžu disociovať z pôsobiacich komplexov a znovu asociovať tak, aby vytvárali nemodifikované trimérne TNF molekuly, ktoré potom vykonávajú difúziu v nádorovom prostredí. Bolo ukázané, že uvoľňovanie bioaktívneho TNF sa vyskytuje v rámci 24-48 hodín po pôsobení.
Pre použitie v terapii budú modifikované cytokíny podľa vynálezu vhodne formulované vo farmaceutických prípravkoch pre orálne alebo parenterálne podávanie. Formulácie pre parenterálne podávanie sú preferované a zahrňujú injektovateľné roztoky alebo suspenzie a tekutiny pre infúzie. Na prípravu parenterálnych foriem bude aktívna zložka rozpustená a suspenzovaná v sterilnom nosiči, prípadne pridaním excipientov, ako sú rozpúšťacie látky, izotonické činidlá, konzervačné látky, stabilizátory, emulzifikátory alebo disperzné činidlá, a následne budú distribuované v liekovkách alebo ampulách.
Príprava cytokínov vo forme lipozómov môže zlepšiť ich biologickú aktivitu. V skutočnosti bolo pozorované, že acylácia TNF aminoskupín vyvoláva zvýšenie hydrofóbnosti bez straty biologickej aktivity in vitro. Ďalej bolo zaznamenané, že TNF viazané na lipidy nespôsobilo cytotoxicitu in vitro, imunomodulačné efekty a redukovalo toxicitu in vivo (Debs, R.J., et al., S lipozómom spojený faktor nádorovej nekrózy zachováva bioaktivitu v prítomnosti neutralizujúcich protilátok faktora nádorovej nekrózy. J. Immunol. 1989. 143:1192-7; Debs, R.J., et al., Imunomodulačné a toxické efekty samostatného a lipozómom opúzdreného faktora nádorovej nekrózy alfa u potkanov. Cancer Res. 1990. 50:375-80).
Maximálna tolerovaná dávka bolusu TNF u ľudí je 218-410 pg/m2 (Fraker, D.L., Alexander, H.R. & Pass, H.I., 1995. Biologická terapia s TNF: systémové podávanie a izolačné premývanie. In Biológie teraphy of cancer: principles and practice, De Víta, V., Hellman, S. & Rosenberg, S. (eds) p.329-345, J. B. Lippincott Company: Philadelphia) asi 10-násobne nižšia než efektívna dávka u zvierat. Na základe údajov od myších modelov sa uvažuje, že aspoň 10-krát vyššia dávka je potrebná pre dosiahnutie protinádorového efektu u ľudí (Schraffordt Koops, et al., Hypertermické premývanie izolovanej končatiny faktorom nádorovej nekrózy a melfalánom ako liečba lokálne postupujúcich a obvyklých sarkómov mäkkých tkanív končatín. Radiotherapy & Oncology 1998. 48:1-4). V prvých klinických štúdiách pre hypertermické premývanie izolovanej končatiny boli získané vysoké rýchlosti odpovede pri špecifickej dávke 4 mg TNF v kombinácii s melfalánom a interferónom γ (Lienard, D., et al., Pri prechodných metastázach malígneho melanómu liečeného vysokou dávkou rTNF alfa v kombinácii s interferón-gama a melfalán pri izolačnom premývaní. World Journal of Surgery 1992. 16:234-40). Ďalšie práce ukázali, že interferón γ môže byť vypustený a že aj nižšie dávky TNF môžu byť dostatočné pre vyvolanie terapeutickej odpovede (Hill, S., et al., Faktor nádorovej nekrózy alfa s nízkou dávkou a melfalán pri hypertermickom premývaní izolovanej končatiny. Br. J. Surg. 1993. 80:995-7; Eggermont, A. M., et al., Premývanie izolovanej končatiny s faktorom nádorovej nekrózy a melfalán pre záchranu končatiny u 186 pacientov s lokálne postupujúcoim sarkómom mäkkých tkanív končatiny. The cumulative multicenter European experience. Ann. Surg. 1996. 224:756-65). Keďže tieto dva cytokíny vykazujú synergické efekty na endotelové bunky, ich kombinované, selektívne pôsobenie pravdepodobne vyústi do silnejšej protinádorovej aktivity, takto umožňujúc prekonať problémy systémovej toxicity, s ktorou sa obvykle stretáva pri terapii rakoviny s týmito istými cytokínmi použitými v kombinácii. Ďalej je známe, že TNF môže znížiť bariérovú funkciu ciev endotelových línií, takto zvyšujúc ich priepustnosť do makromolekúl. Berúc výhodu nižšej toxicity liečby s modifikovanými TNF molekulami podľa vynálezu a ich cieľové vlastnosti nádorových ciev, alternatívnou aplikáciou je ich použitie na zvýšenie priepustnosti nádorových ciev do iných zlúčenín, buď na terapeutické alebo diagnostické účely. Napríklad, modifikované TNF môže byť použitý na zvýšenie nádorového príjmu rádiooznačených protilátok alebo hormónov (nádor predstavujúce zlúčeniny) v rádioimunoscintigrafii alebo rádioimunoterapii nádorov. Alternatívne, príjem chemoterapeutických liečiv, imunotoxínov, lipozómov nesúcich liečivá alebo gény, alebo ich protirakovinové liečivá by mohol byť tiež zvýšený tak, že ich protinádorové účinky sú zosilnené.
Podľa toho, cytokíny podľa vynálezu môžu byť použité pri liečbe alebo diagnostikovaní rakoviny v kombinovaných, oddelených alebo po sebe nasledujúcich prípravkoch, tiež s inými diagnostickými alebo terapeutickými látkami.
Konečný aspekt vynálezu sa týka cDNA kódujúcej konjugované cytokíny tu objavené, ktoré môžu byť pripravené z cytokínov cDNA pridaním 5'- alebo 3'združujúcej sekvencie kódujúcej CD13 ligand, prednostne cieľové peptidy popísané vyššie. Kombinovaná cDNA môže byť použitá ako taká, alebo po vsunutí vo vektoroch pre génovú terapiu. Príprava a terapeutické aplikácie vhodných vektorov je popísaná v (Mizuguchi, H., et al., Faktorom nádorovej nekrózy alfasprostredkovaná regresia nádoru pomocou in vivo prenosu génov do artérie, ktorá vedie k nádoru. Cancer res. 1998. 58:5725-30), ktoré sú týmto zahrnuté referenciou.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 : Efekt TNF a NGR-TNF na rast RMA-T lymfómov (a a b) a na hmotnosť zvierat (c a d).
zvierat / skupina bolo liečených jednou dávkou TNF alebo NGR-TNF (i.p.), 10 dní po implantácii nádoru. Hodnoty nádorovej oblasti na 14. deň ako funkcia dávky (b) a strata hmotnosti po liečbe (stred 11. a 12. dňa) (d) bola interpolovaná z logaritmickej krivky. Protinádorové efekty vyvolané 1 pg alebo 9 pg NGR-TNF na
14. deň boli väčšie než tie, ktoré boli vyvolané porovnateľnými množstvami TNF (P=0,024, resp. P=0,032), pričom strata hmotnosti po týchto liečbach bola podobná. Šírky označujú extrapolované dávky TNF a NGR-TNF, ktoré vyvolajú porovnateľné efekty.
Obr. 2 : Efekt mAb R3-63 a CHGRC na protinádorovú aktivitu NGR-TNF (a) a TNF (b).
MAb R3-63 alebo CNGRC bolo zmiešané s NGR-TNF alebo TNF a podávané zvieratám s RMA-T nádorom, 12 dní po implantácii nádoru (n=5 zvierat / skupiny). V oddelených experimentoch (c) bolo TNF a NGR-TNF spolupodávané s CNGRC alebo CARAC (kontrolný peptid) zvieratám s 11-dňovým nádorom (n=5). Protinádorový efekt 1 pg NGR-TNF bol silnejší než 9 pg TNF (P=0,009, t-test na 20. deň) a bol výrazne inhibovaný CNGRC (P=0,035) a mAb R3-63 (P=0,011).
Obr. 3 : Efekt obmedzenej trypsínovej digescie NGR-TNF a TNF na ich hmotnosť (a) a protinádorová aktivita (b).
Trypsín-agaróza bola pripravená spojením 1 mg trypsínu s 1 ml Activated CH Sepharose (Pharmacia-Upjohn), podľa výrobných inštrukcií. NGR-TNF a TNF (170 pg každého v 300 pl 0,15 M chloridu sodného, 0,05 M fosfátu sodného, pH 7,3) bolo zmiešané s 15 pl živicovej suspenzie (1:4) alebo pufra samotného a otáčané cez oba konce pri 37°C po určený čas. Štyri produkty bolo filtrované cez 0,22 pm Spin-X zariadenie (Costar, Cambridge, MA) a uložené pri -20°C až do použitia.
(a) Analýza elektrosprejovej hmotnostnej spektrometrie. Hodnoty molekulovej hmotnosti a zodpovedajúcich produktov (sekvencie s N-ukončením) sú označené na každom vrchole. Šípky na sekvenciách označujú miesto štiepenia, (b) Efekt 1 alebo 3 pg NGR-TNF a TNF, inkubovaných bez (vrchné bloky) alebo s (dolné bloky) trypsínu, na rast RMA-T nádorov a hmotnosti zvierat (stredná hodnota±SE skupín liečených 1 a 3 pg dávkami). Zvieratá boli liečené 13 dní po implantácii nádoru (n=5 zvierat / skupina).
Obr. 4 : SDS-PAGE a protinádorová aktivita ľudského NGR-TNF pred a po denaturácii / preskladaní.
SDS-PAGE pri neredukujúcich podmienkach (A) ľudského TNF (a) NGR-TNF pred (b) a po (c) procese denaturácie / preskladania popísané v príklade V.
Efekt TNF a nepreskladaného NGR-TNF na rast RMA-T lymfómov (B) a na telesnú hmotnosť (C). Efekt na ľudský TNF (D) a preskiadaného NGR-TNF (obsahujúci > 95% trimérov s vnútroreťazcovými disulfidmi) (E) na rast nádorov. Zvieratá (15 alebo 5 myší / skupina ako je označené v každej skupine) boli liečené jednou i.p. dávkou TNF alebo NGR-TNF, 10 dní po implantácii nádoru.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad I
Príprava myšieho TNF a NGR-TNF
Myší rekombinant TNF a Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF) boli produkované cytoplazmovou cDNA expresiou v E. coli. cDNA kódujúca myší Met-TNFv-156 (Pennica, D., et al., Klonovanie a expresia u Escheríchia coli z cDNA u myšieho faktoru nádorovej nekrózy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985. 82:6060-4) bola pripravená r eťazovou reakciou reverzne j transkriptázy-polymerázy (RT-PCR) na mRNA izolovanej z lipopolysacharidom stimulovaného myšieho RAW-264,7 monocytových-makrofágových buniek, použitím 5'-CTGGATCCTČACAGAGCAATGACTCCAAAG-3' a 5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3', ako 3' a 5' primery.
Rozšírený fragment bol digerovaný Nde I a Bam Hl (New England Biolabs, Beverley, MA) a klonovaný v pET-11b (Novagen, Madison, Wl), predtým bol digerovaný tými istými enzýmami (pTNF).
CDNA kódujúca Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNFMse bola rozšírená pomocou PCR na pTNF, použitím 5'-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' ako 5' primer, a navyše 3' primer. Rozšírený fragment bol digerovaný a klonovaný v pET-11b ako je popísané vyššie a použitý na transformovanie BL31(DE3) E.coli buniek (Novagen). Expresia TNF a NGR-TNF bola vyvolaná izopropyl-3-Dtiogalaktozid, podľa pET11b výrobnej inštrukcie. Rozpustný TNF a NGR-TNF boli regenerované dvojlitrovej kultúry ultrazvukovej vibrácie baktérií v 2 mM etyléndiamíntetraoctovej kyseline, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, po čom nasledovala centrifugácia (15 000 x g, 20 min., 4°C). Oba extrakty boli zmiešané so sulfátom amónnym (25% nasýtenie), ponechané 1 hodinu pri 4°C, a ďalej centrifugované ako vyššie. Sulfát amónny v supernatantoch bol potom nasýtený na 65%, ponechaný pri 4°C 24 hodín a ďalej centrifugovaný. Každá granula bola rozpustená v 200 ml 1
M sulfátu sodného, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, a čistená hydrofóbnou interakčnou
I chromatografiou na Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharacia-Upjohn) (spádová elúcia, pufor A: 50 M fosfát sodný, pH 8,0, obsahujúci 1 M sulfát amónny; pufor B: 20% glycerol, 5% metanol, 50 mM fosfát sodný, pH 8,0). Frakcie obsahujúce TNF imunoreaktívny materiál (pomocou western blotting) boli zozbierané, dialyzované proti 2 mM etyléndiamíntetraoctovej kyseline, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 a ďalej čistené chromatografiou s iónovou výmenou na DEAE-Sepharose fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (spádová elúcia, pufor A: 20 mM Tris-HCI, pH 8,0; pufor B: 1 M chlorid sodný, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0). Frakcie obsahujúce TNF imunoreaktivitu boli zozbierané a čistené gelovou filtračnou chromatografiou na Sepharyl-S-300 HR (Pharmacia-Upjohn), vopred uvedené do rovnováhy a eluované 150 mM chloridom sodným, 50 mM pufrom fosfátu sodného, pH 7,3 (PBS). Frakcie zodpovedajúce molekulovej hmotnosti produktov 40 000-50 000 boli zozbierané, rozdelené na podiely a zmrazené pri -20°C. Všetky roztoky zapojené v chromatografických krokoch boli pripravené so sterilnou a endotoxín neobsahujúcou vodou (Salf, Bergamo, Taliansko). Výsledné výťažky boli 45 mg TNF a 34,5 mg NGR-TNF.
Molekulová hmotnosť čistených TNF a NGR-TNF bola meraná elektrošprejovou hmotnostnou spektrometriou. Obsah proteínov bol meraný použitím komerčnej sady analýzy proteínov (Pierce, Rockford, IL). Obsah endotoxínu v NGR-TNF a TNF bol 0,75 jednotiek/pg, resp. 1,38 jednotiek/pg, čo bolo namerané kvantitatívnym chromogénovým testom lymulusového amébocytového lyzátu (LAL) (Bio Whittaker).
Gelová elektroforéza dodecylsulfát-polyakrylamid sodného (SDS-PAGE) a western blot analýza bola uskutočnená použitím 12,5 alebo 15% polyakrylamidových gélov, štandardnými postupmi.
Malé množstvo TNF a NGR-TNF bolo ďalej čistené afinitnou chromatografiou na rozpustný p55-TNF receptor (sTNF-RI)-Sepharose nasledovne: bolo pripravené 5 mg rekombinantu s TNF-R1, ako bolo popísané (Corti, A., et al., Horná regulácia p75 receptora faktora nádorovej nekrózy alfa u myší infikovaných Mycobacterium avium. Infect. Immunol. 1999. 67:5762-5767), a spojené s 2 ml Activated-CH Sepharose (Pharmacia), podľa výrobnej inštrukcie. Dva oddelené stĺpce (každý 1 ml) boli premyté viac ráz sterilnými a endotoxín neobsahujúcimi roztokmi, zriedené čisteným TNF alebo NGR-TNF v PBS a desorbované spádovou elúciou (1 hod. pufor A: PBS; pufor B: 0,5 M chlorid sodný, 0,2 M glycín-HCI) proti sterilnému fyziologickému roztoku. Endotoxín neobsahujúci ľudský albumín v sére bol pridaný pred dialýzou (0,5 mg/ml) pre zabránenie adsorpcii proteínov na membránach. Obsah TNF v každej frakcii bol meraný pomocou ELISA a cytolytickou analýzou.
Neredukujúca SDS-PAGE u TNF ukázala jeden pás so 17-18 kDa, ako sa očakávalo pre monomérne TNF (neukázané). Na rozdiel od toho, neredukujúca SDS-PAGE a western blot analýza u NGR-TNF ukázala rozdielne imunoreaktívne formy s 18, 36 a 50 kDa pravdepodobne zodpovedajúce monomérom, dimérom a trimérom. Pri redukujúcich podmienkach boli 50 a 36 kDa pásy konvertované na 18 kDa formu, ukazujúc smerom k prítomnosti NGR-TNF molekúl s vnútroreťazcovými disulfidovými mostíkmi, 18 kDa pás robilo až asi 2/3 celkového materiálu, zatiaľ čo 36 kDa tvorila väčšina ostávajúcej časti. Tieto elektroforetické profily naznačujú, že NGR-TNF bolo zmesou trimérov vytvorených troma monomérnymi podjednotkami s presnými vnútroreťazcovými disulfidmi (aspoň 50%) a ostávajúca časť väčšinou primermi s jedným alebo viac vnútroreťazcovými disulfidmi. 36 kDa pás doteraz pozorovaný pomocou redukujúcou SDS-PAGE naznačoval, že NGR-TNF obsahoval aj ireverzibilný denaturovaný dimér (asi 10% celkového).
Molekulové hmotnosti TNF a NGR-TNF monomérov boli 17386,1 ±2,0 Da, resp. 17843,7±2,5 Da elektrosprejovou hmotnostnou spektrometriou. Tieto hodnoty zodpovedajú veľmi dobre hmotnosti očakávanej u met-TNFi.i56 (17386,7 Da) au CNGRCG-TNFi.i56 (17844,2 Da).
Príklad 2
In vitro cytotoxická aktivita myšieho TNF a NGR-TNF
Bioaktivita TNF a NGR-TNF bola predbežne vypočítaná štandardnou cytologickou analýzou založenou na L-M fibroblastoch myší (ATCC CCL1.2) ako je popísané v (Corti, A., et al., Kvantifikácia faktora nádorovej nekrózy (TNF) alfa pomocou ELISA a biorozbory: TNF efekty komplexnej disociácie alfa-rozpustného
TNF receptora (p55) pri rozborových inkubáciách. J. Immunol. Meth. 1994. 177:191198). Cytologická aktivita TNF a NGR-TNF na RMA-T bunkách bola testovaná v prítomnosti 30 ng/ml aktinomycínu D. Každá vzorka bola analyzovaná dvojmo, v troch rozdielnych zriedeniach. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota ±SD dvoch-troch nezávislých rozborov.
In vitro cytologická aktivita TNF a NGR-TNF bola (1,2±,014) x 108 jednotiek/mg, resp. (1,8±0,7) x 108 jednotiek/mg prostredníctvom štandardnej cytologickej analýzy s L-M bunkami. Tieto výsledky uvádzajú, že CNGRCG podiely v NGRTNF molekule nezabraňujú skladaniu, oligomerizácii a viazaniu s TNF receptormi.
V predchádzakúcej štúdii bolo ukázané, že RMA-T bunky môžu byť zničené prostredníctvom TNF v prítomnosti 30 ng/ml aktinomycínu D, pričom v neprítomnosti transkripčných inhibítorov tieto bunky sú rezistentné na TNF, aj po niekoľkých dňoch inkubácie. In vitro cytotoxická aktivita NGR-TNF na RMA-T bunkách v prítomnosti aktinomycínu D bola (1,4±0,8) x 108 jednotiek/mg, pri meraní s použitím TNF ((1,2±0,14) x 108 jednotiek/mg) ako štandardu. Teda, cytotoxické aktivity NGR-TNF a TNF boli podobné na L-M aj na RMA-T bunkách.
Príklad III
Charakterizácia terapeutickej a toxickej aktivity myšieho TNF a NGR-TNF
Rauscherovým vírusom vyvolané RMA lymfómy pôvodu C57BL/6, boli udržované in vitro v RMPI 1640, 5% fetálne kravské sérum (FBS), 100 jednotiek/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycín, 0,25 pg/ml amfotericín B, 2 mM glutamín a 50 μΜ 2-merkaptoetanol. RMA-T bol odvodený z RMA bunkovej línie transfékciou s konštruktom kódujúcim Thy 1,1 alely a kultivované, ako bolo popísané (Moro, M., et al., Nádorové bunky pôsobiace s protilátkou avidínových komplexov a biotinylovaný faktor nádorovej nekrózy alfa. Cancer Res. 1997. 57:1922-8).
B16F1 melanómové bunky boli kultivované v RMPI 1640, 5% FRBS, 100 jednotiek/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycín, 0,25 pg/ml amfotericín B, 2 mM glutamín, 1% MEM nezákladnej aminokyseliny (BioWhittaker Európe, Verviers, Belgicko).
In vivo štúdie na zvieracích modeloch boli schválené Ethical Committee of the San Raffaele H Scientific Inštitúte a vykonané podľa predpísaných smerníc. C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Taliansko) (16-18 g) boli imunnologicky testované s 5 x 10 RMA-T, respektíve B16F1 živými bunkami, s.c. na ľavom boku. Desať-dvanásť dní po implantácii nádoru dostali myši i.p. 250 μΙ TNF alebo NGR-TNF roztokov, zriedených endotoxín neobsahujúcim 0,9% chloridom sodným.
Predbežné experimenty ukázali, že protinádorová aktivita nebola zmenená pridaním ľudského albumínu v sére, ako nosiča, k TNF a NGR-TNF roztokom. Každý experiment bol uskutočnený s 5 myšami v skupine. Rast nádoru bol monitorovaný denne meraním veľkosti nádoru posuvným meradlom. Oblasť nádoru bola odhadnutá vypočítaním η x Γ2, pričom objem nádoru bol odhadnutý vypočítaním η x r2 x r3 x 4/3, kde n a d sú pozdĺžne a priečne polomery, a β je hrúbka nádoru vyčnievajúca z povrchu normálnej kože. Zvieratá boli usmrtené predtým, než nádor dosiahol priemer 1,0-1,3 cm. Veľkosti nádorov sú ukázané ako stredná hodnota ± SE (5-10 zvierat v skupine, ako je uvedené v číselnej legende) a porovnané t-testom.
Protinádorová aktivita a toxicita NGR-TNF boli porovnané s protinádorovou aktivitou a toxicitou TNF použitím modelov RMA-T lymfómu a B16F1 melanómu u C57BL6 myší. Keďže RMA-T model bol predtým charakterizovaný a použitý na štúdiu protinádorovej aktivity TNF s rôznymi postupmi pôsobenia (Gasparri, A., et al., Predpôsobenie na nádor s avidínom zlepšuje terapeutický index biotinylovaného faktora nádorovej nekrózy alfa u myších modelov. Cancer Res. 1999. 59:2917-23), rozhodli sme sa tiež použiť tento model v tejto štúdii.
Myší TNF podávaný zvieratám, ktoré s.c. získali RMA-T nádor, spôsobuje po 24 hodinách redukciu nádorovej hmotnosti a hemoragickú nekrózu v strednej časti nádoru, po čom nasledoval po niekoľkých dňoch výrazný rast (Gasparri, A., et al., Predpôsobenie na nádor s avidínom zlepšuje terapeutický index biotinylovaného faktora nádorovej nekrózy alfa u myších modelov. Cancer Res. 1999. 59:2917-23). Jedna liečba s TNF nevyvoláva celkovú regresiu nádoru, aj pri dávkach blízkych LD50, lebo živé bunky ostávajúce okolo nekrotickej oblasti opäť začínajú rásť niekoľko dní po liečbe.
V prvej sérii experimentov sme prešetrovali efekt rôznych dávok (i.p.) TNF alebo NGR-TNF na prežitie zvierat. Aby sme sa vyhli nadmernému utrpeniu, zvieratá boli usmrtené, keď priemer nádoru bol väčší než 1-1,3 cm. Úmrtnosť po trojdňovej liečbe s TNF a NGR-TNF bola podobná (LD50, 60 pg, resp. 45 pg), pričom, ich protinádorová aktivita bola značne rozdielna (Tabuľka 1).
Tabuľka 1 Prežitie myší s RMA-Tlymfómom liečených myším TNF alebo NGR-TNF
Liečba Zvieratá (n) Dávka (pg) Prežitie (%)a> po liečbe
dni 3 dni 7 dni 14 dni 21 dni 30 dni 38 (2.nap.)b) dni dni 62 92 (3.nap)b)
žiadna 18 0 100 0
TNF 4 1 100 20 0
9 3 100 55 0
9 9 100 55 22 11 0
14 27 100 57 14 7 0
9 54 55 55 0
9 108 0
NGR-TNF 10 1 100 70 10 10 10 0
10 3 100 80 20 20 20 0
9 9 100 88 55 22 11 11 11
13 27 100 85 30 23 15 15 15 11
9 54 33 33 0 15
9 108 0
a) Zvieratá s nádorom boli liečené TNF alebo NGR-TNF (i.p.) 10 dní po implantácii nádoru. Zvieratá boli usmrtené, keď priemer nádoru prekročil 1-1,3 cm.
b) Prežijúce zvieratá boli opätovne naočkované 50 000 RMA-T bunkami (druhé naočkované) alebo 50 000 (tretie) v určenom čase. Vytvorenie nádoru injektovaných buniek bolo monitorované v každom čase u 5 normálnych zvierat. U všetkých kontrolných zvierat sa rozvinul nádor do 10 dní (údaje neukázané).
Napríklad, 1 alebo 3 pg NGR-TNF oneskorilo rast nádoru účinnejšie než 27 pg TNF, naznačujúc, že NGR-TNF bolo aspoň v jednom ráde veličiny aktívnejšie. Zaujímavo, niektoré zvieratá boli liečené dávkami NGR-TNF nižšími než LD50, zatiaľ čo vôbec žiadne zvieratá neboli liečené s TNF. Liečené zvieratá neprijali ďalšie naočkovanie nádorotvornými dávkami buď RMA-T alebo prirodzeným typom RMA buniek, zdôvodňujúc, že jedna liečba s NGR-TNF bola schopná vyvolať ochrannú imunitu. Je pozoruhodné, že zvyšovanie dávky TNF alebo NGR-TNF nad 9-27 pg značne zvýšilo toxicitu a slabo alebo vôbec terapeutickú aktivitu.
Strata hmotnosti v dôsledku TNF liečby je dobre známym znakom systémovej toxicity (Gasparri, A., et al., Predpôsobenie na nádor s avidínom zlepšuje terapeutický index biotinylovaného faktora nádorovej nekrózy alfa u myších modelov. Cancer Res. 1999. 59:2917-23). Teda, pre ďalšie porovnanie pomeru účinnosť / toxicita TNF a NGR-TNF sme monitorovali rast nádoru a hmotnosť zvierat po liečbe. Efekt 1 pg NGR-TNF na rast nádoru bol podobný alebo vyšší než je efekt 9 pg TNF (Obr. 1a), pričom strata hmotnosti jeden-dva dni po liečbe bola porovnateľná so stratou hmotnosti pri 1 pg TNF (Obr. 1c). Po interpolovaní údajov logaritmickou krivkou v grafe dávka-odpoveď sme zistili, terapeutický efekt 9 pg na
14. deň môže byť získaný len s 0,6 pg NGR-TNF (Obr. 1b). Naopak, 8,5 pg bolo potrebné pre vyvolanie porovnateľného toxického efektu (Obr. 1d). Teda, vypočítaný pomer účinnosť / toxicita NGR-TNF pri týchto podmienkach je 14-krát vyšší než tento pomer u TNF.
Podobné výsledky boli získané s modelom B16F1 melanómu. Liečba s 1 pg NGR-TNF na 11. a 17. deň vyvolala protinádorovú odpoveď na 19. deň väčšiu bež bola získaná s 4 pg TNF a podobnú tej, ktorá bola získaná s 12 pg TNF (údaje nie sú ukázané). Naopak, strata hmotnosti spôsobená 1 pg NGR-TNF bola značne nižšia než strata hmotnosti spôsobená 4 a 12 pg TNF. Liečba s 12 pg NGR-TNF spôsobila aj silnejší protinádorový efekt, pričom toxický efekt bol podobný efektu s 12 pg TNF.
Po tretej injekcii, ktoré dostali zvieratá, na 19. deň niektoré uhynuli, čo sa vyskytlo o 1 -2 dni neskôr vo všetkých skupinách (okrem 2 z 5 v skupine liečenej fyziologickým roztokom a 12 pg NGR-TNF a okrem 1 z 5 v ostávajúcich skupinách). Významne, jedno zviera liečené 12 pg NGR-TNF úplne neprijalo nádor. Keď bolo toto zviera naočkované druhou nádorotvornou dávkou B16F1 buniek, palpačný nádor sa rozvinul po 18 dňoch, pričom u kontrolných zvierat sa rozvinul nádor do 6-7 dní.
Tieto výsledky úplne naznačujú, že účinnosť NGR-TNF pri inhibovaní rastu nádoru je 10-15 krát väčšia než je to u TNF, pričom toxicita je podobná. Navyše, NGR-TNF môže vyvolať ochranné imunitné odpovede účinnejšie než TNF.
Príklad IV
Mechanizmus pôsobenia NGR-TNF
Proti-myší CD13 mAb R3-63 čistený zascitických tekutín pomocou protein-G Sepharose chromatografie (Pharmacia-Upjohn, Uppsala, Švédsko) a dialyzovaný proti 0,9% chloridu sodnému.
Králičie polyklonálne protisérum bolo kúpené od Primm srl (Milan, Taliansko) a čistené afinitnou chromatografiou na protein-A-Sepharose (Pharmacia, Upjohn). CNGRC a CARAC peptidy boli pripravené ako už bolo popísané ( Arap, W., et al., Liečba rakoviny pôsobením dodávania liečiv do svaloviny nádoru u myšieho modelu. Science 1998. 279:377-80).
Pre uskutočnenie dôkazu, že zlepšená aktivita NGR-TNF je závislá na pôsobení na nádor prostredníctvom NGR-TNF podielu, sme prešetrili, či môže byť in vivo aktivita NGR-TNF čiastočne konkurovať CNGRC. Nakoniec sme podávali NGR-TNF (1 pg) myšiam majúcim RMA-T nádor, s a bez molárneho nadbytku CNGRC. Paralelne, iné zvieratá boli liečené s TNF (3 alebo 9 pg), znovu s alebo bez CNGRC: Ako sa očakávalo, CNGRC výrazne znížilo protinádorovú aktivitu NGR-TNF (Obr. 2a), ale nie protinádorovú aktivitu TNF (Obr. 2b). Na rozdiel od toho, kontrolný peptid (CARAC) nebol schopný spôsobiť výrazné zníženie NGRTNF aktivity (Obr. 2c). Tieto výsledky naznačujú, že CNGRC konkuruje vo viazaní NGR-TNF na CNGRC receptor, a podporuje hypotézu mechanizmu pôsobenia u zlepšenej aktivity. Významne, CNGRC nebol schopný znížiť in vitro cytotoxickú aktivitu NGR-TNF (údaje nie sú ukázané).
Keďže bolo nedávno zaznamenané, že aminopeptidáza N (CD13) je receptor u CNGRC peptidov, potom sme prešetrili príspevok tohto receptora k mechanizmu pôsobenia NGR-TNF. Nakoniec sme študovali efekt anti-CD13 mAb (R3-63) na protinádorovú aktivitu NGR-TNF a TNF. mAb R3-63 výrazne inhiboval protinádorovú aktivitu NGR-TNF (Obr. 2a), ale nie protinádorovú aktivitu TNF (Obr. 2b) naznačujúc, že CD13 je iste kriticky zahrnutý v protinádorovej aktivite NGRTNF. Nebola pozorovaná žiadna expresia CD13 na povrchu RMA-T buniek prostredníctvom analýzy kultivovaných buniek s mAb R3-63 (neukázané), naznačujúc, že iné bunky boli rozoznané protilátkou in vivo.
Hoci tieto údaje uvádzajú, že CD13 je dôležitý receptor u NGR-TNF, nemôžeme celkom vylúčiť, že viazanie na iné, ešte neidentifikované NGR receptory tiež prispieva, hoci v nižšej miere, mechanizmu pôsobenia.
Predbežné experimenty čiastočnej proteolýzy ukázali, že Arg-Ser väzba v segmente TNF s N-ukončením (rezíduá 2-3) je veľmi citlivá na trypsín, pričom zvyšok molekuly je oveľa viac rezistentný. Teda, pre uskutočnenie ďalšieho dôkazu, že zlepšená aktivita NGR-TNF sa týka NGR podielu sme sa pokúsili odštiepiť NGR doménu z oblasti N-ukončenia muteinu pomocou čiastočnej digescie imobilizovaným trypsínom. Táto úprava premenila NGR-TNF aj TNF na molekulu zodpovedajúcu TNF3.156 fragmentu (očakávaná hmotnosť 16986,2 Da; viď Obr. 3a pre meranú hmotnosť a očakávané sekvencie).
Zatiaľ čo digescia neznížila in vitro cytolytickú aktivitu NGR-TNF na L-M bunkách (2,3±1,4) x 108 jednotiek/mg), jej in vivo protinádorová aktivita bola znížená na úroveň TNF (Obr. 3b). Významne, toxicita NGR-TNF a TNF bola podobná tak isto pred aj po digescii, posúdením vzhľadom na stratu hmotnosti zvierat jeden deň po liečbe (Obr. 3b, pravý blok), naznačujúc, že na NGR závislý mechanizmus pôsobenia nemení toxicitu.
Príklad V
Príprava a charakterizácia ľudského TNF a NGR-TNF
Ľudský rekombinant TNF a NGR-TNF (obsahujúci ľudský TNF1-157 spojený s CNGRCG s C-ukončením) boli pripravené technológiou rekombinantu DNA a čistené v podstate ako je popísané u myších TNF a NGR-TNF. cDNA kódujúca ľudský NGR-TNF bola pripravená pomocou PCR na plazmid pET11b / hTNF obsahujúci hTNF kódujúcu sekvenciu (Pennica, D., et al., 1984. Ľudský faktor nádorovej nekrózy: prekurzor, štruktúra, expresia a homológia s lymfotoxínom. Náture, 321, 724-729), použitím nasledujúcich primérov:
- NGR-hTNF/1 (v zmysle): 5Ά TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3'.
- NGR-hTNF/2 (v protizmysle): 5' TCA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC 3’.
Rozšírený fragment bol digerovaný a klonovaný vpET-11b (Nde I / BamH I a použitý pre transformovanie BL12 (DE3) E. coli buniek (Novagen). Expresia NGR-hTNF bola vyvolaná izopropyl-p-D-tiogalaktozidom, podľa pET11b výrobnej inštrukcie. Rozpustný TNF a NGR-TNF boli regenerované dvojlitrovej kultúry ultrazvukovej vibrácie baktérií v 2 mM etyléndiamíntetraoctovej kyseline, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, po čom nasledovala centrifugácia (15 000 x g, 20 min., 4°C).
Extrakt bol zmiešaný so sulfátom amónnym (35% nasýtenie), ponechaný 1 hodinu pri 4°C, a ďalej centrifugované ako vyššie. Sulfát amónny v supernatantoch bol potom nasýtený na 65%, ponechaný pri 4°C 24 hodín a ďalej centrifugovaný. Každá granula bola rozpustená v 200 ml 1 M sulfátu sodného, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, a čistená hydrofóbnou interakčnou chromatografiou na Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharacia-Upjohn) (spádová elúcia, pufor A: 100 M fosfát sodný, pH 8,0, obsahujúci 1 M sulfát amónny; pufor B: 70% etylénglyckol, 5% metanol, 100 mM fosfát sodný, pH 8,0). Frakcie obsahujúce hTNF imunoreaktívny materiál (pomocou
ELISA) boli zozbierané, dialyzované proti 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 a ďalej čistené chromatografiou s iónovou výmenou na DEAE-Sepharose fast Flow (PharmaciaUpjohn) (spádová elúcia, pufor A: 20 mM Tris-HCI, pH 8,0; pufor B: 1 M chlorid sodný, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0). Všetky roztoky zapojené v chromatografických krokoch boli pripravené so sterilnou a endotoxín neobsahujúcou vodou (Salf,
Bergamo, Taliansko).
V tomto bode bolo asi 30 mg TNF a 32 mg NGR-TNF regenerované z dvojlitrových kultúr. Neredukujúca SDS-PAGE ukázala pásy zodpovedajúce monomérom, dimérom a trimérom, naznačujúc, že aj ľudský NGR-TNF bol zmesou trimíérov s presnými vnútroreťazcovými disulfidmi a trimérmi s jedným alebo viacerými vnútroreťazcovými disulfidovými mostíkmi (Obr. 4A, časť b), ako bolo pozorované u myšieho NGR-TNF.
Triméry s presnými vnútroreťazcovými disulfidovými mostíkmi boli izolované z tejto zmesi štvorstupňovým denaturačno-preskladacím procesom nasledovne; čistený ľudský NGR-TNF bol denaturovaný 7 M močovinou a gelovo filtrovaný cez HR Sephacryl S-300 stĺpec (1025 ml) (Pharmacia) vopred uvedený do rovnováhy s 7 M močoviny, 100 mM Tris-HCI, pH 8,0. Frakcie zodpovedajúce monomérnemu TNF boli zozbierané, ultrafiltrované cez YMMWCO 10 kDa membránu (Amicon) a preskladané dialýzou proti 33 objemom 2,33 M močoviny, 10 mM Tris-HCI, pH 8 pri 4°C (140 min.), po čom nasledovalo 1,55 M močovinou, 100 mMTris-HCI, pH 8 (140 min.) a 1 M močovinou, 100 mM Tris-HCI, pH 8 (140 min.). Nakoniec bol produkt dialyzovaný proti 80 objemom 100 mM Tris-HCI (16 hod.), centrifugovaný pri 13 000 x g (30 min.), prefiltrovaný cez SFCA 0,45 pm membránu (Nalgene) a gelovo filtrovaný cez HR Sephacryl S-300 stĺpec (1020 ml), vopred uvedený do rovnováhy s 0,15 M chloridom sodným, 0,05 M fosfátom sodným (PBS). Asi 23 mg preskladaného proteínu bolo znovu získané.
Výsledný produkt bol väčšinou monomérny po néredukujúcej SDS-PAGE (Obr. 4A, časť c), mal hydrodynamický objem podobný tomu, ktorý má trimérny ľudský TNF prostredníctvom analytickej delovej filtrácie HPLC na Superdex 75 HR stĺpci (nie je ukázané), a mal molekulovú hmotnosť 17937,8 + 1,8Da (očakávané u CNGRCGTNF1-157, 17939,4 Da) pomocou elektrosprejovej hmotnostnej spektrometrie. In vitro cytotoxické akktivity nepreskladaných a preskladaných NGR-TNF na myších LM bunkách boli (6,11 x 107) + 4,9 a (5,09 x 107) + 0,3 jednotiek/mg, pričom cytotoxické aktivita čisteného ľudského TNF bola (5,45 x 107) + 3,1 jednotiek/mg.
Tieto výsledky naznačujú, že denaturačno-preskladací proces nepôsobí na interakciu ľudského NGR-TNF s myším p55 receptorom.
In vivo protinádorová aktivita 1 pg ľudského NGR-TNF (nepreskladaného) bola väčšia než je protinádorová aktivita 10 pg TNF (Obr. 4B), pričom toxicita, posúdením vzhíadom na stratu hmotnosti zvierat, bola výrazne nižšia (Obr. 4C). Po preskladaní 0,3 pg NGR-TNF bol dostatočný pre vyvolanie protinádorového efektu silnejšieho než bol dosiahnutý s 10 pg TNF (Obr. 4D, 4E).
Tieto výsledky uvádzajú, že protinádorová aktivita ľudského NGR-TNF je väčšia než u ľudského TNF.
Ďalej sme pozorovali, že preskladaný ľudský a myší NGR-TNF môže vyvolať výrazné protinádorové efekty na RMA-T myší, ak pri veľmi nízkych dávkach (1-10 ng/myš) bez žiadnych dôkazov toxických efektov, pričom TNF nebolo schopné vyvolať výrazné efekty pri týchto dávkach (nie je ukázané).
Príklad VI
Príprava a charakterizácia myšieho NGR-IFNy
Rekombinant myší interferón (IFN)y spojený s CNGRCG (NGR-IFN)y bol pripravený technológiou rekombinantu DNA, v podstate ako je popísané pre NGRTNF. CNGRC doména bola spojená s C-ukončením IFNy. Naviac cysteín v polohe 134 bol nahradený serínom; metionín bol zavedený do polohy -1 pre expresiu v E. coli bunkách. PCR primery použité pre produkciu NGR*IFNy c DNA boli: 5Ά TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C (v zmysle) a 5-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC. cDNA bola klonovaná vpET-11b (Nde I / BamH I) a použitá pre transformovanie BL21(DE3) E. coli buniek (Novagen). Expresia proteínov bola vyvolaná izopropyl-p-D-tiogalaktozidom, podľa pET11b výrobnej inštrukcie. Produkt bol čistený z E. coli extraktov imunoafinitnou chromatografiou použitím antimyšieho IFNy mAb (AN18) imobilizovaného na agaróze, podľa štandardných techník. Redukujúce a neredukujúce SDS-PAGE výsledného produktu ukázali jeden pás s 16 kDa. Elektrosprejová hmotnostná spektrometria ukázala molekulovú hmotnosť 16223 + 3,6 Da (očakávané 1625,5 Da) zodpovedajúcu myšiemu Met-IFNy1-134(CNGRC (NGR-IFNy).
Schopnosť NGR-IFNy a NGR-TNF konkurovať si pri viazaní anti-CD13 protilátky na cievy spojené s nádorom bola prešetrená použitím imunohistologického prístupu.
Čerstvé chirurgické vzorky rakoviny ľudských ľadvinových buniek boli získané z Histopathology Department of the San Raffaele H Scientific Inštitúte. Časti (5-6 pm hrubé) vzoriek v Bouine fixovaných (4-6 hod.) a uložených v parafíne boli pripravené a adsorbované na polylyzinom potiahnutých sklíčkach. CD13 antigén bol zistený použitím metódy avidín-biotín komplexu nasledovne:
časti tkaniva boli opätovne hydratované použitím xylénov a odstupňovanými sadami alkoholov, podľa štandardných postupov. Časti tkanív boli umiestnené v nádobe obsahujúcej 1 mM EDTA a varenej 7 min. použitím mikrovlnej rúry (1 000 W). Nádoba bola potom opätovne naplnená 1 mM EDTA a varená znovu 5 minút. Časti tkanív boli ponechané ochladiť a inkubované 15 min. v PBS obsahujúcom 0,3% peroxid vodíka, aby sa rýchle potlačila endogénna peroxidáza. Vzorky boli potom premyté s PBS a inkubované 100-200 pl PBS-BSA (1 hod. pri izbovej teplote), po čom nasledovalo mAb WM15 (anti-CD13), samotné alebo zmiešané s rôznymi konkurenčnými činidlami (viď Tabuľku 2) v PBS-BSA (cez noc pri 4°C). Sklíčka boli potom premyté 3-krát (3 min. každé) s PBS a inkubované s PBS-BSA obsahujúcom 2% normálne chrenové sérum (PBS-BSA-NHS) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) po dobu 5 min. Roztok bol potom umiestnený s 3 pg/ml biotinylovaného chrenového antimyšieho IgG (H+L) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) v PBS-BSA-NHS a ďalej inkubovaný 1 hod. pri izbovej teplote. Sklíčka boli premyté znovu a inkubované šVectastain Elite Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zriedenom 1:100 v PBS. Tableta s 3,3'diaminobenzidíntetrahydrochloridu (Merck, Darmstadt, SRN) bola potom rozpustená v 10 ml deionizovanej vody obsahujúcej 0,03% peroxidu vodíka, prefiltrovaná cez 0,2 pm membránu a preložená na časti tkanív na 5-10 minút. Sklíčka boli premyté ako vyššie a zafarbené kontrastnou farbou Harrisoým hematoxylínom. Cievy spojené s nádorom boli označené zafarbením častí tkanív s anti-CD13 mAb (Mab JC/70A, antiľudský CD31, lgG1, od DÁKO, Kodaň, Dánsko).
Výsledky sú sumarizované v Tabuľke 2. Ako je ukázané, viazanie WM15 na cievy spojené s nádormi bolo inhibované nadbytkom NGR-TNF, NGR-IFNy a CNGRC, ale nie inými kontrolnými reagentami s chýbajúcim NGR prvkom. Toto naznačuje, že NGR viazacie miesto na CD13 sa stéricky prekrýva sWM15 epitopom. Naopak, NGR-TNF nebolo schopné konkurovať viazaniu 13C03 na epitelové bunky.
Uzavierame, že NGR podiel z NGR-IFNy a NGR-TNF sa môžu vzájomne ovplyvňovať sCD13 formou rozoznávanou mAb WM15 na cievach spojených s nádormi. Navyše, tieto výsledky uvádzajú, že CNGRC prvok je funkčný buď keď je spojený s N-ukončením alebo C-ukónčením cytokínu.
Tabuľka 2 Viazanie WM15 na časti rakoviny ľadvinových buniek v prítomnosti rôznych konkurentov Konkurent Viazanie WM15 na cievy spojené s nádormi žiadny+
NGR-TNF (25 pg/ml) ,
NGR-IFNy (50 pg/ml)
CNGRC (100 pg/ml)
TNF (25 pg/ml)+ albumín v ľudskom sére (25 gg/ml)+ syntetický CgA(60-68) (100 gg/ml)+ aKonkurent, v PBS obsahujúci 2% BSA, bol pridaný v blokovacom kroku a zmiešaný s primárnou protilátkou.
bmAb WM15 (antiĽudský CD)13, lgG1) bol od Pharmingen (San Diego, CA), syntetický peptid (CgA(60-68) zodpovedá chromograninu A fragment 60-68.
Príklad VII
Pôsobiace dodávanie biotinylovaného NGR-TNF do nádorov použitím protinádorových protilátok a avidínu (predpôsobenie)
Nasledujúci príklad ilustruje možnosť „dvojitého“ pôsobenia TNF na základe kombinácie cieľovej protilátky nádoru a peptidu CNGRC.
Konjugát biotín-NGR-TNF bol pripravený zmiešaním NGR-TNF s D-biotinyl-6aminokaprónovej kyseliny N-hydroxysukcínimidesteru (Societá Prodotti Antibiotici
S.p.A., Miláno, Taliansko), v 1 M pufri uhličitanu sodného, pH 6,8 ( hod. pri izbovej teplote) (Corti, A., et al., Pôsobenia na nádor biotinylovaným faktorom nádorovej nekrózy alfa: Vzťahy štruktúrnej aktivity a mechanizmus pôsobenia na avidín predpôsobené nádorové bunky. Cancer res. 1998. 58:3866-3872). Reakcia bola blokovaná s 1 M Tris-HCI, pH 7,5.
Konjugát bol charakterizovaný hmotnostnou spektrometriou a zistilo sa, že obsahuje 1 biotín / trimér (v priemere). C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Taliansko) boli potom naočkované s 5 x 104 RMA-T živými bunkami, s.c. na ľavom boku. Keď oblasť nádoru dosiahla 40 mm2, myši boli liečené po sebe nasledujúcimi injekciami biotinylovanej protilátky, avidínmi a biotín-TNF podľa „trojdňového“ protokolu, ako už bolo popísané (Gasparri, A., et al., Predpôsobenie na nádor s avidínom zlepšuje terapeutický index biotinylovaného faktora nádorovej nekrózy alfa u myších modelov. Cancer Res. 1999. 59:2917-23). Injektovali sme: 40 pg biotínmAb19E12 (i.p., krok I), 60 pg avidín a 60 pg streptavidín po 18, resp. 19 hodinách (i.p., krok II), 3 pg biotín-NGR-TNF, 24 hodín neskôr (i.p., krok III). Každá zlúčenina bola zriedená sterilným 0,9% roztokom chloridu sodného. V kontrolnom experimente bol avidín a streptavidín vypustený. Každý experiment bol uskutočnený s 5 myšami / skupina. Rast nádoru bol monitorovaný denne meraním veľkosti nádoru posuvným meradlom. Oblasti nádoru pred a 10 dní po liečbe boli 39±4 mm2, resp. 8±5 mm2, v skupine liečenej s mAb19E12-biotín / avidín / streptavidín / biotín-NGR-TNF (5 zvierat, stredná hodnotatSE). V kontrolnej skupine (liečenej smAb 19E12-biotín / biotín-NGR-TNF samotný) boli oblasti nádoru pred a 10 dní po liečbe 40±4 mm2, resp. 20±6 mm2, uvádzajúc, že predpôsobenie s cieľovou protilátkou nádoru a avidínom zvyšujú aktivitu NGR-TNF.

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konjugačný produkt, vyznačujúci sa tým, že je medzi cytokínom vybraným z TNF alebo IFNy a ligandom CD13 receptora.
  2. 2. Konjugačný produkt podľa nároku l.vyznačujúci sa tým, že cytokín je TNFa alebo TNFp.
  3. 3. Konjugačný produkt podľa nárokov 1 až 2, vyznačujúci sa tým, že ligand CD13 receptora je vybraný zo skupiny obsahujúcej protilátky alebo ich aktívne fragmenty, peptidy alebo peptido-mymetiká.
  4. 4. Konjugačný produkt podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že ligandom je peptid obsahujúci NGR prvok.
  5. 5. Konjugačný produkt podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že peptid je vybraný zo skupiny obsahujúcej CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cykloCVLNGRMEC, lineárny alebo cyklický CNGRC.
  6. 6. Konjugačný produkt podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že cytokín vytvára derivát s polyetylénglykolom alebo acylovým rezíduom.
  7. 7. Konjugačný produkt podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že cytokín je ďalej konjugovaný s protilátkou, alebo jej i, fragmentom, zameranou na nádorový antigén, nádorový angiogénny marker alebo zložku mimobunkovej materskej pôdy, alebo s biotínom.
  8. 8. ' Konjugačný produkt podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že cytokín je
    TNF a je konjugovaný s CD13 ligandom a alternatívne aj protilátka, jej fragment, alebo biotín, na rôznych podjednotkách.
  9. 9. CDNA, vyznačujúca sa tým, že kóduje cytokín vybraný z TNF a IFN nesúcich 5' alebo 3' združujúcu sekvenciu kódujúcu CD13 ligand.
  10. 10. cDNA podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že CD13 ligand je peptid podľa nároku 5.
  11. 11 .Vektor pre génovú terapiu, vyznačujúci sa z nárokov 9 a 10.
  12. 12. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa množstvo konjugačného produktu podľa nárokov 1 prijateľnými nosičmi a expicientami.
    t ý m, že obsahuje cDNA t ý m, že zahrňuje efektívne až 8, spolu s farmaceutický
  13. 13. Prípravok podľa nároku 12, vyznačujúci injektovateľného roztoku alebo suspenzie alebo tekutiny pre infúzie.
    sa t ý m, že je vo forme
  14. 14. Prípravok podlá nárokov 12 a 13, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že je vo forme lipozómov.
  15. 15. Použitie konjugačného produktu podľa nárokov 1 až 8, alebo cDNA podľa nárokov 9a10, vyznačujúce sa tým, že je na prípravu liekov alebo diagnostík na terapiu rakoviny.
  16. 16. Použitie konjugačného produktu podľa nároku 15, v y z n a č u j ú c e sa t ý m, že je v kombinácii s inými protinádorovými činidlami alebo diagnostickými nádor predstavujúcimi zlúčeninami.
SK1151-2002A 2000-02-15 2001-02-13 Modifikované cytokíny na použitie pri terapii rakoviny SK287550B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2000MI000249A IT1317835B1 (it) 2000-02-15 2000-02-15 Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
PCT/EP2001/001543 WO2001061017A2 (en) 2000-02-15 2001-02-13 Modified cytokines for use in cancer therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK11512002A3 true SK11512002A3 (sk) 2003-02-04
SK287550B6 SK287550B6 (sk) 2011-01-04

Family

ID=11444017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1151-2002A SK287550B6 (sk) 2000-02-15 2001-02-13 Modifikované cytokíny na použitie pri terapii rakoviny

Country Status (29)

Country Link
US (4) US7150869B2 (sk)
EP (2) EP1255845B1 (sk)
JP (1) JP4836384B2 (sk)
KR (1) KR100888761B1 (sk)
CN (2) CN1853730B (sk)
AT (1) ATE424461T1 (sk)
AU (1) AU784173C (sk)
BG (1) BG65931B1 (sk)
BR (1) BR0108391A (sk)
CA (1) CA2399986C (sk)
CY (1) CY1109034T1 (sk)
CZ (1) CZ299486B6 (sk)
DE (1) DE60137835D1 (sk)
DK (1) DK1255845T3 (sk)
EA (1) EA007838B1 (sk)
ES (1) ES2322234T3 (sk)
HK (1) HK1048649B (sk)
HU (1) HU227894B1 (sk)
IL (2) IL150984A0 (sk)
IT (1) IT1317835B1 (sk)
MX (1) MXPA02007899A (sk)
NO (1) NO330913B1 (sk)
PL (1) PL207263B1 (sk)
PT (1) PT1255845E (sk)
SI (1) SI1255845T1 (sk)
SK (1) SK287550B6 (sk)
UA (1) UA85365C2 (sk)
WO (1) WO2001061017A2 (sk)
ZA (1) ZA200206450B (sk)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7309694B2 (en) 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
AU2006200762B2 (en) * 2000-02-24 2008-08-21 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
PT1257297E (pt) * 2000-02-24 2006-12-29 Philogen Spa Composições e método para tratamento da angiogénese em lesões patológicas
ATE373503T1 (de) 2002-02-06 2007-10-15 Ares Trading Sa Tumornekrosefaktor in kombination mit interferon in demyelinierungskrankheiten
EP1346729A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-24 Cardiovascular Research Institute Maastricht Targeting of myocardial angiogenesis through CD13/APN
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US20050009740A1 (en) * 2003-03-31 2005-01-13 Greenville Hospital System Anti-tumor vasculature effects of human serum albumin derivatives
GB0312309D0 (en) 2003-05-29 2003-07-02 Gaslini Children S Hospital G Targeted liposome
EP1831254B1 (en) 2004-12-23 2012-06-06 Molmed SpA Conjugation product
US7625555B2 (en) * 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
GB0803076D0 (en) * 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
ES2389474T3 (es) * 2008-05-13 2012-10-26 Molmed Spa Conjugados para el tratamiento del mesotelioma
CN108314741B (zh) * 2018-03-22 2021-08-03 中国人民解放军第四军医大学 一种肿瘤血管靶向抗癌肽nkl-dota及其制备方法
EP3882257A1 (en) 2020-03-20 2021-09-22 Ospedale San Raffaele S.r.l. Ngr conjugates and uses thereof
WO2023170209A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Ospedale San Raffaele Srl Fusion proteins and uses thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3423234A1 (de) * 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4650674A (en) * 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4863713A (en) 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5091176A (en) 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
IT1245748B (it) 1990-12-21 1994-10-14 Mini Ricerca Scient Tecnolog Preparazione includente anticorpi monoclonali biotinilati, avidina e biotina, per la diagnosi di affezioni tumorali e suo impiego
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5811512A (en) 1991-08-22 1998-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-peptide peptidomimetics and related cyclic hexapeptides
US5258517A (en) * 1992-08-06 1993-11-02 Sepracor, Inc. Method of preparing optically pure precursors of paroxetine
EP1346730A1 (en) 1993-12-07 2003-09-24 Neorx Corporation Pretargeting methods and novel pretargeting conjugates
US5888814A (en) 1994-06-06 1999-03-30 Chiron Corporation Recombinant host cells encoding TNF proteins
US5811388A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Cibus Pharmaceutical, Inc. Delivery of drugs to the lower GI tract
US5891418A (en) 1995-06-07 1999-04-06 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications
CA2265484C (en) * 1996-09-10 2008-12-02 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
US6576239B1 (en) * 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
EP1015884B1 (en) 1997-09-10 2008-08-06 The Burnham Institute Methods of identifying molecules that home to angiogenic vasculature in tumors
IT1317835B1 (it) 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.

Also Published As

Publication number Publication date
EA007838B1 (ru) 2007-02-27
NO20023833D0 (no) 2002-08-13
HK1048649B (zh) 2009-08-14
SI1255845T1 (sl) 2009-08-31
HUP0300005A2 (hu) 2003-04-28
CZ20023093A3 (cs) 2003-02-12
BG106999A (bg) 2003-04-30
US20030157055A1 (en) 2003-08-21
WO2001061017A3 (en) 2002-01-31
ITMI20000249A0 (it) 2000-02-15
AU4413501A (en) 2001-08-27
ATE424461T1 (de) 2009-03-15
AU784173B2 (en) 2006-02-16
ITMI20000249A1 (it) 2001-08-15
UA85365C2 (ru) 2009-01-26
US20050265965A1 (en) 2005-12-01
US7150869B2 (en) 2006-12-19
PL362670A1 (en) 2004-11-02
IL150984A0 (en) 2003-02-12
CN1446261A (zh) 2003-10-01
US7622556B2 (en) 2009-11-24
HUP0300005A3 (en) 2005-09-28
JP2004520801A (ja) 2004-07-15
ES2322234T3 (es) 2009-06-18
HK1048649A1 (en) 2003-04-11
EP1255845A2 (en) 2002-11-13
CN1853730A (zh) 2006-11-01
CA2399986C (en) 2012-10-02
EA200200808A1 (ru) 2003-02-27
DK1255845T3 (da) 2009-06-22
WO2001061017A2 (en) 2001-08-23
KR100888761B1 (ko) 2009-03-17
CY1109034T1 (el) 2014-07-02
CZ299486B6 (cs) 2008-08-13
ZA200206450B (en) 2003-04-24
CN1853730B (zh) 2013-07-24
EP1255845B1 (en) 2009-03-04
CN1446261B (zh) 2010-05-05
AU784173C (en) 2006-09-07
DE60137835D1 (de) 2009-04-16
EP2080804A1 (en) 2009-07-22
KR20020089348A (ko) 2002-11-29
BR0108391A (pt) 2003-03-11
MXPA02007899A (es) 2004-09-10
NO20023833L (no) 2002-10-15
US20100196458A1 (en) 2010-08-05
IL150984A (en) 2011-04-28
US20070041939A1 (en) 2007-02-22
HU227894B1 (en) 2012-05-29
SK287550B6 (sk) 2011-01-04
US7476721B2 (en) 2009-01-13
PL207263B1 (pl) 2010-11-30
CA2399986A1 (en) 2001-08-23
BG65931B1 (bg) 2010-05-31
PT1255845E (pt) 2009-04-09
JP4836384B2 (ja) 2011-12-14
IT1317835B1 (it) 2003-07-15
NO330913B1 (no) 2011-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7622556B2 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy
US7622105B2 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy
US7309694B2 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Assignment and transfer of rights

Owner name: OSPENDALE SAN RAFFAELE S.R.L., IN SHORTNED FOR, IT

Free format text: FORMER OWNER: FONDAZIONE CENTRO SAN RAFFAELE DEL MONTE TABOR, MILANO, IT

Effective date: 20121025

MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20190213