KR100888761B1 - 암 치료용 변형 사이토카인 - Google Patents

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Abstract

종양 혈관 및 항원 제시 세포에 호밍(homing)가능한 사이토카인 유도체 및 이들의 항종양제로서의 용도가 개시된다.
종양, 암, 사이토카인, TNF, CD13

Description

암 치료용 변형 사이토카인{MODIFIED CYTOKINES FOR USE IN CANCER THERAPY}
본 발명은 암 치료에 사용되는 변형 사이토카인에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 종양 혈관(tumor vessels) 및 항원제시세포(antigen presenting cells)를 "호밍(homing)"할 수 있는 사이토카인 유도체에 관한 것이다.
일부 사이토카인의 항종양 활성은 잘 알려져 있으며 기술되어있다. 일부 사이토카인은 또한 인체에 이미 치료적으로 사용되어왔다. 예를들어, 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론 α(IFNα)와 같은 사이토카인은 신장 전이성 암, 헤어리 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 카포시 육종, 흑색종, 다중 마이엘로마(multiple mieloma) 등과 같은 다른 타입의 종양을 가진 환자에서 양성적인 항종양 활성을 나타낸다. IFNβ, 종양 괴사 인자(TNF) α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 및 콜로니 자극 인자(CFSs)와 같은 다른 사이토카인은 일부 타입의 종양에 대하여 특정 항종양 활성을 나타내며, 따라서 계속적인 연구 대상이다.
일반적으로, 사이토카인의 치료적 사용은 이들의 전신성 독성에 의해 매우 제한된다. 예를들어, TNF는 본래 일부 종양의 출혈성 괴사를 유도하는 능력 및 시험관에서 다른 종양주에 대한 세포독성 영향이 있는 것으로 발견되었으나(1), 하지만 이것은 후속적으로 과생산 조건의 경우에는 인체에 위험한 영향을 줄 수 있는 강한 전-염증 활성(pro-inflammatory activity)을 갖는 것으로 알려져 있다(3).
전신성 독성은 사이토카인의 약학적 활성량을 인체에 사용하는데 기본적인 문제이기때문에, 생물학적 효과인자의 부류의 독성 영향을 감소시키는 한편 이들의 치료 효능을 유지시키는 새로운 유도체 및 치료 전략이 현재 연구중에 있다.
몇몇 새로운 시도는 다음에 관한 것이다:
a) TNF를 종양내로 운반하고 국부 농도를 증가시킬 수 있는 융합 단백질의 개발. 예를들어, TNF와 종양 특이-항체로 구성된 융합단백질이 제조되었다(4);
b) 항종양 활성을 유지하며 감소된 전신성 독성을 갖는 TNF 돌연변이체의 개발. 이에 따라, 단지 하나의 수용체를 선택적으로 인지할 수 있는 돌연변이체가 이미 제조되었다(5);
c) 항종양 활성을 함유하지않고 TNF의 일부 독성 영향을 감소시킬 수 있는 항-TNF 항체의 사용. 이러한 항체는 이미 문헌에 기술되어 있다(30);
d) 보다 높은 반감기를 갖는 TNF 유도체의 사용(예, 폴리에틸렌 글리콜과 접합된 TNF).
종양부를 선택적으로 표적할 수 있는 TNF 유도체의 제조는 최근에 보고된 바 있다. 예를들어, 항-트랜스페린 수용체 mAb의 헤비 체인의 유전자와 TNF 유전자를 융합시켜 획득된 융합 단백질 또는 종양-관련 TAG72 항원에 대한 단일클론 항체의 "힌지(hinge)" 부분을 갖는 TNF의 융합 단백질(6) 또는 Fv-TNF 융합 단백질(6)이 기술되어 있다.
EP 251 494에는 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘이 접합된 항체, 상기 접 합된 항체를 착화시킬 수 있는 약제 및, 연속적으로 투여되고 적절히 지연되어 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 항체에 의해 인지된 표적 세포상에 진단 또는 치료제의 국소화가 이루어질 수 있도록 하는, 바이오틴이 접합된 진단 또는 치료제로 구성된 화합물을 포함하는 진단 또는 치료제를 투여하는 시스템이 개시되어 있다.
상술한 치료 또는 진단제는 금속 킬레이트, 특히 방사성 핵종과 시스-플라티늄, 독소루비신 등과 같은 저분자량의 항종양제의 킬레이트를 포함한다.
EP 496 074에는 바이오티닐레이티드 항체, 아비딘 또는 스트렙타비딘 및 바이오티닐레이티드 진단 또는 치료제의 연속적 투여를 제공하는 방법이 기술되어 있다. 라이신과 같은 세포독성제가 일반적으로 언급됨에도 불구하고, 방사성표지된 화합물과 관련된 적용이 대부분 기술되어 있다.
WO 95/15979에는 리간드 또는 항-리간드가 접합된 특정 표적 분자를 포함하는 제1 접합물을 투여한 다음 항-리간드 또는 리간드가 결합된 독성 약제로 구성된 제2 접합물을 투여하는 것에 기초하여 세포 표적물상에 고 독성 약제를 국소화시키는 방법이 기술되어 있다.
WO 99/13329에는 분자를 종양 맥관유래(angiogenic) 관에 표적하는 방법이 기술되어 있으며, 분자를 NGR 수용체의 리간드와 접합하는 것에 기초한다. 다수의 분자들은 가능한 후보자로 제시되어왔지만, 단지 독소루비신만이 특이적으로 기술되어 있다. 면역 반응을 유도하기위한 사이토카인 운반체로서 NGR 수용체의 리간드의 사용은 개시된 바 없다.
본 발명자들은 특정 사이토카인의 치료 지수가 현저히 향상될 수 있으며 그리고 이들의 면역치료 특성은 아미노펩티다아제-N 수용체(CD13)의 리간드와 결합시킴으로써 증강될 수 있음을 예기치않게 발견하였다. CD13은 여러 종에서 고 보존된 150kDa의 트랜스-멤브레인 글리코단백질이다. 이것은 정상적인 세포에서 뿐만아니라 골수성 종양주에서, 맥관유래 내피에서 그리고 일부 내피에서 발현된다. CD13 수용체는 그 펩티드 리간드가 아미노산의 "NGR" 모티프를 공유하는 점에서 보통 "NGR" 수용체로 확인된다.
본 발명의 제 1 견지에 의하면, TNF 및 IFNγ로 부터 선택된 사이토카인과 CD13 수용체의 리간드의 접합 생성물이 제공된다. 상기 리간드는 Fab, Fv, 단일 사슬 Fv, 펩티드 또는 펩티도-미메틱(peptido-mymetic), 즉, CD13 수용체를 결합할 수 있는 펩티도-성 분자와 같은 항체 또는 그 분절일 수 있으며, 임의로 변형된, 자연적으로 발생하지않는 아미노산을 함유할 수 있다. 상기 리간드는 바람직하게 CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, 시클로CVLNGRMEC 또는 시클로CNGRC와 같은 NGR 모티프를 포함하는 선형 또는 고리형 펩티드이며, 또는 보다 바람직하게 펩티드 CNGRC이다. 상기 펩티드는 사이토카인에 직접 결합되거나 또는 단일 아미노산, 아미노산 서열 또는 δ-아미노카프릴-N-히드록시숙신이미드와 같은 유기 잔기일 수 있는 스페이서를 통해 간접적으로 결합될 수 있다. 그 결합 방법은 이 기술분야에 숙련된 자에게 잘 알려져 있으며 유전공학 또는 화학 합성 기술을 포함한다.
펩티드 리간드는 바람직하게 사이토카인 N-말단에 연결되어 변형 사이토카인과 그 수용체의 결합에 있어서 어떠한 방해를 최소화한다. 택일적으로, 상기 펩티드는 분자상에 자연적으로 발생하거나 또는 유전공학기술을 이용하여 인공적으로 삽입된 아미도- 또는 카르복실- 결합 수용체인 아미노산 잔기에 연결될 수 있다. 변형 사이토카인은 바람직하게 상기 펩티드를 암호하는 5'-연속 서열을 포함하는 cDNA를 사용하여 제조된다.
바람직한 구체화로, TNF와 CNGRC 서열 사이의 접합 생성물이 제공된다. 보다 바람직하게, TNF의 아미노-말단은 스페이서 G(글리신)를 통해 CNGRC에 연결된다.
그 결과물인 생성물(NGR-TNF)은 RMA-T 림프종 동물 모델에서 TNF보다 활성적임을 입증하였다. 게다가, NGR-TNF로 처리된 동물은 RMA-T 또는 RMA 세포의 발암성 복용량을 거절할 수 있었다. 정상 TNF와 비교하여 면역적격 동물에서 항종양 활성의 증가가 관찰될 수 있으나, 면역결핍 동물에서는 관찰될 수 없다. 이는 "NGR" 펩티드로 접합된 TNF의 항종양 활성의 증가는 접합체의 직접적인 세포독성 활성보다 증강된 면역반응에 기인함을 나타낸다.
또한 NGR-TNF에 의해 유도된 생체내(in vivo) 면역 효과는 CD13 수용체와 직접적으로 관련되는 것으로 나타났다. 예를들어, GNGRC 리간드 뿐만아니라 CD13 수용체에 대한 항체가 생체내에서 NGR-TNF와 경쟁하는 것으로 관찰되어, 따라서 NGR-TNF에 의한 수용체 표적화 메카니즘을 제시한다.
TNF/CD13 리간드 접합체의 치료지수는 두 TNF 수용체, p75TNFR 및 p55TNFR중 하나에 선택적으로 결합할 수 있는 돌연변이 형태의 TNF를 사용하여 더욱 향상될 수 있다. 상기 TNF 돌연변이는 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 획득될 수 있다(5; 7).
본 발명에 따른 변형 사이토카인의 약동학은 사이토카인 자체의 플라스마 반감기를 연장시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 제조함으로써 향상될 수 있다.
본 발명의 다른 구체화는 이작용성 유도체에 의해 제공되며, 여기서 CD13 리간드로 변형된 사이토카인은 종양 항원에 대한 항체, 또는 그 분절 또는 예를들어, αv 인테그린, 메탈로프로테아제 또는 혈관 성장인자와 같은 다른 종양 맥관유래 마커, 또는 항-테나신 항체 또는 항-피브로넥틴 EDB 도메인과 같은 세포외 매트릭스의 성분에 대한 직접적인 항체 또는 그 분절과 접합된다. TNF와, 위장관 및 난소 선암에 의해 발현되는 종양-관련 TAG72 항원에 대한 mAB의 힌지 부분 사이의 융합 생성물의 제조는 최근에 보고되었다(6).
본 발명의 다른 구체화는 바이오틴/아비딘 시스템을 이용한 종양의 전-표적화(pre-targeting)로 제공된다. 이러한 시도에 따라, 3성분 복합체가 종양 항원 부위에 획득되며, 각 스테이지는 1)바이오티닐레이티드 mAb, 2)아비딘(또는 스트렙타비딘) 및 3) CD13 리간드와 바이오틴으로 변형된 2가 사이토카인으로 형성된다. 다수의 논문은 면역접합체를 이용한 통상의 표적화에 비하여, 전-표적화 시도는 표적으로 찾아가는 활성 분자 대 자유 활성 분자의 비율을 실제로 증가시킬 수 있어, 따라서 치료 독성을 감소시킨다(11, 10, 9, 8). 이러한 시도는 정상 TNF가 비활성적인 조건하에서 시험관내에서 세포독성을 유도하여 종양 세포 성장을 감소시킬 수 있는 바이오티닐레이티드 TNF를 이용하여 호의적인 결과를 생성하였다(14, 26). 또한, 전-표적화 시도는 종양 항원 및 변형 사이토카인에 동시에 결합하는 이중특이적 항체를 사용하여 2-단계 방법으로 수행될 수 있다. 암배(carcinoembryonic) 항원 및 TNF에 대하여 직접적인 이중특이적 항체의 사용은 최근에 TNF 종양 전-표적화를 위한 수단으로 기술되었다(31).
다른 구체화로, 본 발명은 다른 TNF 서브유니트상에 CD13 리간드 및 항체 모두에 또는 그 분절(바이오틴-아비딘 결합을 통해 직접 또는 간접적으로)에 접합된 TNF 분자를 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 그 분절은 종양 세포 또는 예를들어, 테나신 및 피브로넥틴 EDB 도메인과 같은 다른 성분의 종양 스트로마상에 발현된 항원에 대한것이다. 이것은 변형 사이토카인의 종양 호밍 특성을 더욱 향상시키며 그리고 그 종양 미세환경에서 삼량체-단량체-삼량체 전이를 통해 후자의 느린 방출을 이끈다. 이전 연구에서 보여진 바와 같이, 실제로, TNF 접합체의 변형 서브유니트는 표적 복합체로부터 분리되고 리폴딩되어 변형되지않은 삼량체의 TNF 분자를 형성한 다음 종양 미세환경에서 확산될 수 있다. 생물활성 TNF의 방출은 표적후 24-48시간내에 일어나는 것으로 보여진다(21).
치료용으로서, 본 발명의 변형 사이토카인은 경구 또는 비경구 투여용 약학 조제로 적절히 배합될 것이다. 비경구 투여용 배합물이 바람직하며, 그리고 이들은 주입을 위해 주입가능한 용액 또는 분산물 및 액체를 포함한다. 비경구형 제조에 있어서, 활성 성분의 유효량이 무균 캐리어에 용해되거나 분산될 것이며, 임의로 용해제, 등장제, 보존제, 안정화제, 에멀션화제 또는 분산제와 같은 부형제가 첨가 될 수 있으며 후속적으로 밀봉된 바이알 또는 앰플에 분배될 것이다.
리포좀 형태의 사이토카인 제조는 이들의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다. 실제로, TNF 아미노기의 아실화는 시험관내에서 생물학적 활성을 잃지않고 소수성이 증가하는 것을 유도하는 것으로 관찰되었다. 더욱이, 지질에 결합된 TNF는 시험관내에서 세포독성이 없으며, 생체내에서 면역조절 효과 및 감소된 독성을 갖는 것으로 보고되었다(12,13).
인체에서 볼러스 TNF의 최대 허용 투여량은 동물에서 효과적인 투여량보다 약 10-배 낮은 218-410㎛/㎡이다(32). 쥐 모델의 데이타에 기초하여, 최소 10배 높은 복용량이 인체에서 항-종양 효과를 달성하는데 필요한 것으로 여겨진다(15). 과열 분리-지 살포(hyperthermic isolated-limb perfusion)에 대한 일차 임상 연구에서, 멜팔란과 인터페론 γ와 함께 TNF 4mg의 단일 투여량으로 높은 반응률이 얻어졌다(16). 다른 연구에서 인터페론 γ는 생략될 수 있으며 보다 낮은 투여량의 TNF도 치료 반응을 유도하기에 충분한 것으로 나타내었다(17,18). 이들의 결합된 두 사이토카인이 내피세포에 상승 효과를 발휘함에따라, 선택적인 표적화는 즉시 보다 강한 항-종양 활성을 이끌며 따라서 보통 결합하여 사용되는 동일한 사이토카인을 이용한 암 치료에 관련된 전신성 독성의 문제를 극복한다. 더욱이, TNF는 내피 주관의 방벽 기능을 감소시켜, 거대분자에 대한 이들의 투과성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 변형 TNF 분자를 이용한 보다 낮은 독성 처리 및 이들의 종양 관 호밍 특성의 잇점을 취하여, 택일적인 적용으로 치료 또는 진단 목적으로 종양 관의 다른 화합물에 대한 투과성을 증가시키는데 사용된다. 예를들어 변 형 TNF는 종양의 래디오이뮤노신티그래피(radioimmnoscintigraphy) 또는 방사능면역치료에 방사능표지된 항체 또는 호르몬(종양-이미징 화합물)의 종양 업테이크를 증가시키는데 사용될 수 있다. 택일적으로, 화학치료 약, 면역독소, 약이나 유전자를 운반하는 리포좀, 또는 다른 항암 약의 업테이크가 증가되어 이들의 항종양 효과가 증진될 수 있다.
따라서, 본 발명의 사이토카인은 암의 치료 혹은 진단시 다른 진단 또는 치료 물질과 함께 결합, 분리 혹은 연속 조제로 사용될 수 있다.
본 발명의 최종 견지는 상기 CD13 리간드를 암호하는, 바람직하게 전술된 호밍 펩티드를 암호하는 5'- 또는 3'-연속 DNA 서열의 첨가에 의해 사이토카인 cDNA로부터 제조될 수 있는 본 명세서에 개시된 접합 사이토카인을 암호하는 cDNA와 관련된다. 결합된 cDNA는 그대로 사용되거나 또는 유전자 치료용 벡터에 삽입후 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 제조 및 치료 적용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된 (19)에 기술되어 있다.
도 1a-d: RMA-T 림프종(a 및 b)의 성장 및 동물의 무게(c 및 d)에 대한 TNF 및 NGR-TNF의 영향.
5 동물/그룹이 종양 이식 10일후 단일 투여량의 TNF 또는 NGR-TNF(i.p.)로 처리되었다. 14일에 투여량(b)의 작용으로서 종양 면적 값 및 치료후 무게의 감소(11일과 12일의 중간)를 로그 곡선으로 나타내었다. 14일에 1㎍ 또는 9㎍의 NGR-TNF로 유도된 항-종양 효과는 이에 상응하는 양의 TNF로 유도된 경우보다 우수하였으며(각각, P=0.024 및 P=0.032), 한편 이러한 처리후 무게의 감소는 유사하였다. 화살표는 상응할만한 효과를 유도하는 TNF 및 NGR-TNF의 추정된 투여량를 나타낸다.
도 2a-c: NGR-TNF(a) 및 TNF(b)의 항-종양 활성에 대한 mAb R3-63 및 CNGRC의 영향.
MAb R3-63 또는 CNGRC를 NGR-TNF 또는 TNF와 혼합하고 종양 이식 12일 후, RMA-T 종양을 가진 동물에 투여하였다(n=5 동물/그룹). 별도 시험으로(c), TNF 및 NGR-TNF를 CNGRC 또는 CARAC(대조군 펩티드)와 함께 11일된 종양을 갖는 동물에 동시투여하였다(n=5). NGR-TNF 1㎍ 의 항-종양 효과는 TNF 9㎍ 의 항-종양 효과보다 강하였으며(P=0.009, t=20일에서 시험) 그리고 CNGRC(P=0.035)에 의해 그리고 mAb R3-63(P=0.011)에 의해 현저히 억제되었다.
도 3a-b: NGR-TNF 및 TNF의 질량(a) 및 항-종양 활성(b)에 대한 제한된 트립신 분해의 영향.
트립신 1mg대 활성 CH 세파로즈(Pharmacia-Upjohn) 1mg을 결합하여 제조회사의 지시에 따라 트립신-아가로즈를 제조하였다. NGR-TNF 및 TNF( 300㎕의 0.15M 소디움 클로라이드, 0.05M 소디움 포스페이트, pH 7.3에 각각 170㎍씩)를 15㎕의 수지 서스펜션과 혼합하거나 또는 완충액 단독으로 하여 37℃에서 표시된 시간동안 회전하면서 교반하였다. 상기 4개의 생성물을 0.22㎛ Spin-X 장치(Costar, Cambridge, MA)를 통해 여과하고 사용전까지 -20℃에 보관하였다. (a) 전기분무 질 량 분광분석법. 분자량 값과 이에 상응하는 생성물(N-말단 서열)이 각 피크에 나타내어진다. 서열상의 화살표는 분할 자리를 나타낸다. (b) 트립신없이(상위 패널) 또는 트립신과 함께(하위 패널) 배양된 1 또는 3㎍의 NGR-TNF 및 TNF의 RMA-T 종양의 성장 및 동물 무게에 미치는 영향(1 및 3㎍의 투여량으로 처리된 그룹의 평균±SE). 동물들은 종양 이식후 13일에 처리되었다(n=5 동물/그룹).
도 4a-e: 변성/리폴딩 전 및 후, 인체 NGR-TNF의 SDS-PAGE 및 항-종양 활성
인간 TNF(a), 실시예 5에 기술된 변성/리폴딩 공정 전 NGR-TNF(b) 및 후 NGR-TNF(c)의 비 환원 조건하 SDS-PAGE.
TNF 및 리폴딩되지않은 NGR-TNF의 RMA-T 림프종 성장(B) 및 체중(C)에 미치는 영향. 인간 TNF(D) 및 리폴딩된 NGR-TNF(내부-사슬 이황화물을 가진 삼량체 >95%로 이루어짐)(E)의 종양 성장에 미치는 영향. 동물들(각 패널에 표시된 바와 같은 15 또는 5마리의 마우스)은 종양 이식후 10일에, 1 i.p. 투여량의 TNF 또는 NGR-TNF로 처리되었다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
실시예 I
뮤린 TNF 및 NGR-TNF의 제조
뮤린 재조합 TNF 및 Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)를 이. 콜라이(E. coli)에서 세포질 cDNA 발현으로 제조하였다. 지질다당류-자극된 뮤린 RAW-264.7 모노사이트-마크로파아지 세포로부터 분리된 mRNA상에서 3' 및 5' 프라이머로서,
5'-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3' 및
5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3'
를 이용하여 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 뮤린 Met-TNF1-156을 암호하는 cDNA(20)를 제조하였다.
증폭된 프레그먼트는 Nde I 및 Bam HI(New England Biolabs, Beverley, MA)로 절단되고 동일한 효소로 이미 절단된 pET-11b(Novagen, Madison, WI)에서 클론되었다(pTNF).
Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1-156을 암호하는 cDNA는 5' 프라이머로서
5'-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' 및
상기 3' 프라이머를 이용하여 pTNF상에서 PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 프레그먼트는 상기한 바와 같이 절단되고 pET-11b에서 클론되었으며 BL21(DE3) E.coli 세포(Novagen)를 형질변환시키는데 사용되었다. TNF 및 NGR-TNF의 발현은 pET11b 제조회사 지시에 따라 이소프로필-β-D-티오갈락토시드를 이용하여 유도되었다. 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 20mM Tris-HCl, pH 8.0내에서 세균 초음파처리후 원심분리(15000xg, 20분, 4℃)에 의해 2-리터 배양물로부터 용해가능한 TNF 및 NGR-TNF이 회수되었다. 추출물 모두는 암모늄 설페이트와 혼합되고(포화도 25%), 4℃에서 1시간동안 두고, 상기한 바와 같이 추가적으로 원심분리되었다. 그 후 상층액내 암모늄 설페이트는 포화도 65%로 되었으며, 이를 4℃에서 24시간동안 두고 추가적으로 원심분리되었다. 각 펠렛은 1M 암모늄 설페이트, 50mM Tris-HCl, pH 8.0 200ml에 용해되고 Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제되었다(구배 용출, 버퍼 A: 50mM 소디움 포스페이트, pH 8.0, 1M 암모늄 설페이트 함유; 버퍼 B: 20% 글리세롤, 5% 메탄올, 50mM 소디움 포스페이트, pH 8.0). (웨스턴 블롯팅에 의해)TNF 면역반응성 물질을 함유하는 분획이 장입되고, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 20mM Tris-HCl, pH 8.0에 대하여 투석되고 DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)상에서 이온교환 크로마토그래피에 의해 더욱 정제되었다(구배 용출, 버퍼 A: 20mM Tris-HCl, pH 8.0; 버퍼 B: 1M 소디움 클로라이드, 20mM Tris-HCl, pH 8.0). TNF-면역반응성을 함유하는 분획이 장입되고 Sephacryl-S-300 HR(Pharmacia-Upjohn)상에서 겔 투과 크로마토그래피에 의해 정제되고, 예비-평형되고 150mM 소디움 클로라이드, 50mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7.3(PBS)로 용출되었다. 40000-50000 Mr 생성물에 상응하는 분획이 장입되고, 분배하고 -20℃에 냉동보관되었다. 크로마토그래프 단계에 이용된 모든 용액들은 멸균되고 내독소가 없는 물(Salf, Bergamo, Italy)로 준비되었다. 최종 수득물은 TNF 45mg 및 NGR-TNF 34.5mg이었다.
정제된 TNF 및 NGR-TNF의 분자량은 전기분무 질량 분광분석으로 측정되었다. 단백질 함량은 상업용 단백질 어세이 키트(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 측정되었다. NGR-TNF 및 TNF의 내독소 함량은 분량 색원체 라미멀러스 아메보사이트 라이세이트(quantitative chromogenic Lymulus Amoebocyte Lysate)(LAL) 시험(BioWhittaker)으로 측정시, 각각 0.75units/㎍ 및 1.38units/㎍이었다.
소디움 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석은 표준 방법에 의해 12.5 또는 15% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 수행되었다.
소량의 TNF 및 NGR-TNF는 다음과 같이 가용성 p55-TNF 수용체(sTNF-R1)-Sepharose상에서 친화 크로마토그래피에 의해 더욱 정제되었다: 재조합체 sTNF-R1 5mg을 상기한 바와 같이 제조하고(22) 제조회사의 지시에 따라 Activated-CH-Sepharose(Pharmacia) 2ml과 결합시켰다. 두 분리 컬럼(각각 1ml)을 멸균되고 내독소가 없는 용액으로 광범위하게 세척하고, 여기에 PBS에 용해된 정제 TNF 또는 NGR-TNF를 적재하고 구배 용출(1h, 버퍼 A: PBS; 버퍼 B: 0.5M 소디움 클로라이드, 0.2M 글리신-HCl)에 의해 탈착하였다. TNF-항원을 함유하는 분획은 중화되고 멸균 생리액에 대하여 투석되었다. 내독소가 없는 인간 혈청 알부민을 투석전에 첨가하여(0.5mg/ml) 멤브레인상에 단백질 흡착을 방지하였다. 각 분획내 TNF 함량은 ELISA 및 사이토리틱(cytolytic) 어세이에 의해 측정되었다.
TNF의 비 환원 SDS-PAGE는 단량체 TNF로 예측되는 17-18kDa의 단일 밴드를 나타내었다. 비 환원 SDS-PAGE와 NGR-TNF의 웨스턴 블롯은 차이가 있어 단량체, 이량체 및 삼량체에 상응하는 것으로 보이는 다른 면역반응 형태의 18, 36 및 50kDa 를 나타내었다. 환원 조건하에서 대부분의 50 및 36kDa 밴드는, 내부사슬 이황화물 결합을 갖는 NGR-TNF의 존재를 가리키는, 18kDa 형태로 변환되었다. 18kDa은 총 물질의 약 2/3, 그리고 36kDa은 그 나머지 부분의 대부분이었다. 이러한 전기영동 패턴은 NGR-TNF이 적절한 내부사슬 이황화물을 가진 3개의 단량체 서브유니트로 구성된 삼량체(최소 50%)와, 하나 또는 그 이상의 내부사슬 이황화물을 가진 삼량체가 대부분 차지하는 잔존부, 의 혼합물임을 제시한다. 36kDa 밴드는 환원 SDS-PAGE에 의해 여전히 관찰되었으며 이는 NGR-TNF 역시 비가역 변성 이량체를 함유(전체의 약 10%)함을 제시한다.
TNF 및 NGR-TNF 단량체의 분자량은 전기분무 질량 분광분석시, 각각 17386.1±2.0 Da 및 17843.7±2.5 Da이었다. 이러한 값은 Met-TNF1-156(17386.7 Da) 및 CNGRCG-TNF1-156(17844.2 Da)에 대하여 기대되는 질량과 매우 상응하는 것이다.
실시예 II
뮤린 TNF 및 NGR-TNF의 시험관내 세포독성 활성
TNF 및 NGR-TNF의 생물활성은 기술된 바와 같이(23) L-M 마우스 섬유아세포(ATCC CCL1.2)에 기초하여 표준 세포독성 시험에 의해 측정되었다. RMA-T 세포에 대한 TNF 및 NGR-TNF의 세포독성 활성은 액티노마이신 D 30ng/ml의 존재하에 시험되었다. 각 시료는 3개의 다른 희석액에서 두번 분석되었다. 그 결과는 2-3 인디펜던트 어세이의 평균±SD로 나타내었다.
TNF 및 NGR-TNF의 시험관내 세포독성 활성은 L-M 세포를 이용한 표준 사이토리틱 어세이에 의해 각각 (1.2±0.14) x 108 units/mg 및 (1.8±0.7) x 108 units/mg이었다. 이러한 결과는 NGR-TNF 분자에서 CNGRCG 부는 폴딩, 올리고머화 및 TNF 수용체와의 결합을 억제하지않는 것을 나타낸다.
앞선 연구에서 본 발명자들은 RMA-T 세포가 액티노마이신 D 30ng/ml의 존재하에서 TNF에 의해 사멸될 수 있으나, 전사 억제제의 부재하에서는 여러 배양일 후 에도 TNF에 내성적임을 나타내었다. 액티노마이신 D의 존재하에서 RMA-T 세포에 대한 NGR-TNF의 시험관내 세포독성 활성은 표준 방법으로서 TNF((1.2±0.14)x108 units/mg)를 사용하여 측정시 (1.4±0.8)x108 units/mg이었다. 따라서, NGR-TNF 및 TNF의 세포독성 활성은 L-M 및 RMA-T 세포에 모두 유사하였다.
실시예 III
뮤린 TNF 및 NGR-TNF의 치료 활성 및 독성 활성의 특성화
C57BL/6 오리진의 로스쳐(Rauscher) 바이러스-유도 RMA 림프종을 시험관내에서, RPMI 1640, 5% 소 태아 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 0.25㎍/ml 앰포테리신 B, 2mM 글루타민 및 50ｕM 2-머캅토에탄올내에서 유지시켰다. RMA-T는 Thy 1.1 대립유전자를 암호하는 구조물로 트랜스펙션하여 RMA 세포주로부터 유도되고 기술된 바와 같이 배양되었다(14).
B16F1 흑색종 세포를 RPMI 1640, 5% FBS, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 0.25㎍/ml 앰포테리신 B, 2mM 글루타민, 1% MEM 비필수 아미노산(BioWhittaker Europe, Verviers, Belgium)에서 배양하였다.
동물 모델에 대한 생체내 연구가 Ethical Committee of the San Raffaele H Scientific Institute에 의해 승인되었으며 규정된 가이드라인에 따라 수행되었다. C57BL/6(Charles River Laboratories, Calco, Italy)(16-18g)가 5 x 104 RMA-T 또는 B16F1 생세포로 각각, 좌측면에 s.c.로 챌린지되었다. 종양 이식후 10-12일에 마우스들은 내독소가 없는 0.9% 소디움 클로라이드로 희석된 TNF 또는 NGR-TNF 용액 250㎕으로 i.p. 처리되었다. 예비실험은 캐리어로서 TNF 및 NGR-TNF 용액에 인간 혈청 알부민을 첨가하는 것에 의해 항-종양 활성이 변하지않았음을 보여주었다. 모든 실험은 그룹당 5 마우스로 수행되었다. 종양 성장은 캘리퍼로 종양 크기를 측정함으로써 매일 검사되었다. 종양 면적은 r1 x r2를 계산하여 측정되었으며, 종양 크기는 r1 x r2 x r3 x 4/3를 계산하여 측정되었다(여기서 r1 및 r2는 세로반경 및 가로반경이며, 그리고 r3은 정상 피부의 표면으로부터 돌출된 종양의 두께임). 동물들은 종양이 1.0-1.3cm 직경에 이르기전에 죽었다. 종양 크기는 평균±SE(도 설명에 나타낸 바와 같이 그룹당 5-10 동물)로 나타내었으며 t-테스트로 비교되었다.
C57BL6 마우스에서 RMA-T 림프종 및 B16F1 흑색종 모델을 이용하여 NGR-TNF의 항-종양 활성 및 독성을 TNF의 항-종양 활성 및 독성과 비교하였다. RMA-T 모델이 이미 특성화되어왔고 다른 표적 프로토콜을 이용한 TNF의 항-종양 활성을 연구하는데 사용되어왔기때문에(26), 본 발명자들은 본 연구에서 역시 이 모델을 사용하기로 결정하였다.
뮤린 TNF를 확립된 s.c. RMA-T 종양을 가진 동물에 투여하는 경우, 24시간 후 종양 덩어리의 감소 및 종양 중심부의 출혈성 괴사가 야기되며, 그 후 며칠동안 현저한 성장 지연이 일어난다. TNF를 이용한 단독 처리는 괴사 지역주변에 남아있는 생존 세포가 처리후 며칠내에 다시 성장하는 것과 같이, LD50에 가까운 투여량일지라도, 이러한 종양의 완전한 퇴화를 유도하지못한다.
일차 실험 세트로, 본 발명자들은 여러가지 투여량의 TNF 또는 NGR-TNF(i.p.)가 동물 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 심한 고통을 줄이기위해, 동 물들은 종양 직경이 1-1.3cm이상인 경우 희생되었다. 처리후 3일, TNF 및 NGR-TNF의 치사율은 유사하였으나(LD50, 각각 60㎍ 및 45㎍), 이들의 항-종양 활성은 현저히 차이가 있었다(표 1).
뮤린 TNF 또는 NGR-TNF로 처리된 RMA-T 림프종을 가진 마우스의 생존율
처리 동물 (n) 투여량 (㎍) 처리후 생존율(%)a)
3일 7일 14일 21일 30일 38일 (2nd ch)b) 62일 (3°ch)b) 92일
무 18 0 100 0
TNF 4 1 100 20 0
9 3 100 55 0
9 9 100 55 22 11 0
14 27 100 57 14 11 0
9 54 55 55 0
9 108 0
NGR-TNF 10 1 100 70 10 10 10 0
10 3 100 80 20 20 20 0
9 9 100 88 55 22 11 11 11
13 27 100 85 30 23 15 15 11
9 54 33 33 0
9 108 0
a) 종양을 가진 동물들은 종양 이식후 10일에 TNF 또는 NGR-TNF(i.p.)로 처리되었다. 동물들은 종양 직경이 1-1.3cm를 초과하는 경우 희생되었다.
b) 생존 동물들은 표시된 시기에 50,000 RMA-T 세포(2차 챌린지) 또는 50,000 RMA(3차)로 다시 챌린지되었다. 주입된 세포의 발암성은 각 시기에서 5 정상 동물과 함께 검사되었다. 모든 대조 동물들은 10일내에 종양이 발달되었다.
예를들어, 1 또는 3㎍의 NGR-TNF는 27㎍의 TNF보다 효과적으로 종양 성장을 지연시켰으며, 이는 NGR-TNF가 적어도 보다 활성적인 등급임을 나타낸다. 흥미롭게 도, 일부 동물들은 LD50미만의 NGR-TNF 투여량으로 치료되었으나, 한편 TNF를 이용한 경우에는 동물들이 전혀 치료되지않았다. 치료된 동물들은 종양형성 투여량의 RMA-T 또는 야생형 RMA 세포를 이용한 추가 챌린지를 물리쳤으며, 이는 NGR-TNF를 이용한 단일 치료가 보호적인 면역성을 유도할 수 있음을 제시하는 것이다. TNF 또는 NGR-TNF 투여량을 9-27㎍이상으로 증가시킨 경우 그 독성이 현저히 증가하였고 치료 활성은 미약하거나 없어진 것은 주목할 만한 것이다.
TNF 치료의 결과로 일어나는 체중 감소는 잘 알려진 전신성 독성의 징후이다(26). 따라서, TNF와 NGR-TNF의 효능/독성비를 더욱 비교하기위해, 본 발명자들은 치료후 종양 성장 및 동물 체중을 관찰하였다. NGR-TNF 1㎍이 종양 성장에 미치는 영향은 TNF 9㎍과 비슷하거나 높았으며(도. 1a), 치료후 1-2일 체중 감소는 TNF 1㎍과 비교할만한 것이었다(도. 1c). 본 발명자들은 이러한 데이타를 투여량-반응 플롯에 로그 커브로 편입시킨 경우 14일에 TNF 9㎍의 치료 효과는 NGR-TNF 0.6㎍만큼 적게 얻어질 수 있음을 발견하였다(도. 1b). 대조적으로, 8.5㎍은 비교할만한 독성 효과를 유도하는데 필수적이었다(도. 1d). 따라서, 이러한 조건하에서 NGR-TNF의 계산된 효능/독성 비는 TNF보다 14배 우수하였다.
이와 유사한 결과가 B16F1 흑색종 모델로 획득되었다. NGR-TNF 1㎍를 이용한 치료 11일 및 17일에, 항-종양 반응을 유도하였으며, 19일에 TNF 4㎍으로 획득된 효과보다 우수하였으며 TNF 12㎍으로 획득된 효과와 유사하였다(데이타로 나타내지않음). 반대로, NGR-TNF 1㎍에 기인한 체중 감소는 4㎍ 및 12㎍의 TNF에 기인한 체중 감소보다 현저히 낮았다. NGR-TNF 12㎍을 이용한 치료는 보다 강한 항-종양 효 과를 일으켰으나, 독성 효과는 TNF 12㎍과 유사하였다.
3차 주입이 19일에 수행된 경우 일부 동물들은 모든 그룹에서 1-2일 후에 사멸하였다(식염수와 NGR-TNF 12㎍으로 처리된 그룹에서 5마리중 2마리 그리고 나머지 그룹에서 5마리중 1마리). 주목할만하게, NGR-TNF 12㎍으로 처리된 한 동물은 종양을 완전히 물리쳤다. 이러한 동물들이 이차 종양형성 투여량의 B16F1 세포로 챌린지된 경우, 18일후 명백한 종양이 발달되었으나 대조 동물들은 6-7일내에 종양이 발달되었다.
이러한 결과는 종양 성장을 억제하는데 있어 NGR-TNF의 효과는 TNF보다 10-15배 우수하며 그 독성은 유사함을 나타내는 것이다. 또한, NGR-TNF는 TNF보다 효과적으로 보호적인 면역 반응을 유도할 수 있다.
실시예 IV
NGR-TNF 활성화의 메카니즘
단백질 G Sepharose 크로마토그래피(Pharmacia-Uppsala, Sweden)에 의해 복수액으로부터 항-마우스 CD13 mAb R3-63을 정제하였으며 0.9% 소디움 클로라이드에 대하여 투석하였다.
토끼 다중클론 항혈청을 Primm srl(Milan, Italy)로부터 구입하고 단백질-A-Sepharose(Pharmacia-Upjohn)상에서 친화 크로마토그래피로 정제하였다. CNGRC 및 CARAC 펩티드가 이미 기술된 바와 같이 제조되었다(28).
NGR-TNF의 향상된 활성은 NGR 부분을 통한 암 표적화에 의존함을 입증하기위해, 본 발명자들은 생체내에서 NGR-TNF의 활성이 CNGRC에 의해 부분적으로 경쟁될 수 있는지 조사하였다. 결국, 본 발명자들은 RMA-T 종양 생성 마우스에 1몰 초과의 CNGRC와 함께 또는 없이, NGR-TNF(1㎍)를 투여하였다. 이와 대응하여, 다른 동물들은 CNGRC와 함께 또는 없이, TNF(3 또는 9㎍)로 처리되었다. 예측된 바와 같이, CNGRC는 NGR-TNF의 항-종양 활성을 현저히 감소시켰으며(도. 2a) 그러나 TNF의 항-종양 활성은 감소시키지못했다(도. 2b). 이와 비교하여, 대조 펩티드(CARAC)는 NGR-TNF 활성의 현저한 감소를 일으킬 수 없었다(도. 2c). 이러한 결과는 NGR-TNF와 CNGRC 수용체의 결합에 대하여 CNGRC가 경쟁하는 것을 제시하며, 그리고 향상된 활성에 대한 표적 메카니즘의 가설을 지지하는 것이다. 주목할만하게, CNGRC는 생체내에서 NGR-TNF의 세포 독성 활성을 감소시킬 수 없었다(데이타로 나타내지않음).
아미노펩티다제 N(CD13)은 CNGRC 펩티드에 대한 수용체임이 최근에 보고되었기때문에, 본 발명자들은 그 다음 NGR-TNF의 표적화 메카니즘에서 이 수용체의 기여에 대하여 조사하였다. 결국, 본 발명자들은 항-CD13mAb(R3-63)이 NGR-TNF 및 TNF의 항-종양 활성에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. MAb R3-63은 NGR-TNF의 항-종양 활성을 현저히 억제하였으나(도. 2a), TNF의 항-종양 활성은 억제하지못하였으며, 이는 NGR-TNF의 항-종양 활성에 CD13이 실로 중요하게 관련됨을 나타낸다. mAb R3-63과 함께 배양된 세포의 FACS 분석에 의해 RMA-T 세포 표면상에 CD13이 발현되지않았음이 관찰되었으며, 이는 다른 세포들은 생체내에서 항체에 의해 인지되었음을 나타낸다.
이러한 데이타는 CD13이 NGR-TNF에 대한 중요한 수용체임을 나타냄에도 불구 하고, 본 발명자들은 비록 보다 낮은 정도이긴 하나 아직 확인되지않은 NGR 수용체에 대한 결합이 또한 표적화 메카니즘에 기여한다는 것을 완전히 배제할 수 없다.
일부 단백질분해의 예비 실험은 TNF의 N-말단 부분(잔부 2-3)에서 Arg-Ser 결합은 트립신에 매우 민감한 한편, 그 분자의 나머지는 상당히 보다 내성적임을 보여주었다. 따라서, NGR-TNF의 향상된 활성은 NGR 부분과 관련됨을 더욱 입증하기위해, 본 발명자들은 고정된 트립신을 이용한 부분 절단에 의해 뮤테인의 N-말단부로부터 NGR 도메인을 잘라내어 제거하는 시도를 행하였다. 이러한 처리로 NGR-TNF 및 TNF는 모두 TNF3-156 프레그먼트에 상응하는 분자로 전환되었다(예상 질량 16986.2 Da; 측정된 질량 및 예상 서열에 대하여 도. 3a 참조).
절단으로 L-M 세포(2.3±1.4)x108U/mg)에 대한 NGR-TNF의 시험관내 세포독성 활성을 감소되지않은 한편, 생체내 항-종양 활성은 TNF의 수준을 감소시켰다(도. 3b). 주목할만하게, NGR-TNF 및 TNF의 독성은 처리후 1일 동물 체중 감소로부터 판단되는 바와 같이, 절단 전 및 후에 모두 유사하였으며(도. 3b, 오른쪽 패널), 이는 NGR-의존성 표적화 메카니즘은 독성을 변화시키지않는다는 것을 나타낸다.
실시예 V
인간 TNF 및 NGR-TNF의 제조 및 특성화
인간 재조합 TNF 및 NGR-TNF(CNGRCG의 C 말단과 융합된 인간 TNF1-157로 구성)를 재조합 DNA 기술에 의해 제조하였으며 그리고 뮤린 TNF 및 NGR-TNF에 대하여 기술된 바와 같이 본질적으로 정제하였다. 인간 NGR-TNF를 암호하는 cDNA를 하기 프라이머를 이용하여 hTNF 암호 서열을 함유하는 플라스미드 pET11b/hTNF에서 PCR을 통해 제조하였다:
- NGR-hTNF/1(센스): 5'A TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3'
- NGR-hTNF/2(안티센스): 5'TCA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC 3'.
증폭된 프레그먼트는 pET-11b(Nde I/BamH I)에서 절단되고 클론되어 BL21(DE3) E.coli 세포(Novagen)를 형질변환시키는데 사용되었다. NGR-hTNF의 발현은 pET11b 제조회사의 지시에 따라 이소프로필-β-D-티오갈락토시드로 유도되었다. 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 20mM Tris-HCl, pH 8.0에서 세균 초음파처리한 다음 원심분리(15000xg, 20분, 4℃)에 의해 가용성 NGR-TNF가 2리터 배양물로부터 회수되었다.
추출물은 암모늄 설페이트와 혼합되고(포화 35%), 4℃에서 1시간동안 두고 상기한 바와 같이 더욱 원심분리되었다. 그 후 상층액내 암모늄 설페이트는 65%의 포화도를 가졌으며, 이를 4℃에서 24시간동안 두고 더욱 원심분리되었다. 각 펠렛은 1M 암모늄 설페이트, 50mM Tris-HCl, pH 8.0에 용해되고 Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제되었다(구배 용출, 버퍼 A: 100mM 소디움 포스페이트, pH 8.0, 1M 암모늄 설페이트 함유; 버퍼 B: 70% 에틸렌 글리콜, 5% 메탄올, 100mM 소디움 포스페이트, pH 8.0). hTNF 면역반응성 물질(ELISA에 의한)을 함유하는 분획이 장입되고, 20mM Tris-HCl, pH 8.0에 대하여 투석되고 DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 더욱 정제되었다(구배 용출, 버퍼 A: 20mM Tris-HCl, pH 8.0; 버퍼 B: 1M 소디움 클로라이드, 20mM Tris-HCl, pH 8.0). 크로마토그래피 단계에 사용된 모든 용액들은 멸균된 내독소가 없는 물(Salf, Bergamo, Italy)로 제조되었다.
이 시점에서 2리터 배양물로부터 약 30mg의 TNF 및 32mg의 NGR-TNF가 회수되었다. 비환원 SDS-PAGE는 뮤린 NGR-TNF로 관찰된 바와 같이 인간 NGR-TNF가 올바른 내부-사슬 이황화물을 갖는 삼량체와 하나 또는 그 이상의 사슬간 이황화 결합을 갖는 삼량체의 혼합물이었음을 또한 제시하는 단량체, 이량체 및 삼량체에 상응하는 밴드를 나타내었다(도. 4a, 래인 b).
올바른 내부사슬 이황화물 결합을 갖는 삼량체는 하기와 같이 4-단계 변성-리폴딩 공정에 의해 이 혼합물로부터 분리되었다: 정제된 인간 NGR-TNF는 7M 우레아로 변성되고 7M 우레아, 100mM Tris-HCl, pH 8.0으로 예비-평형된 HR Sephacryl S-300 컬럼(1025ml)(Pharmacia)을 통해 겔여과되었다. 단량체성 TNF에 상응하는 분획을 장입하고 YM MWCO 10 kDa 멤브레인(Amicon)을 통해 한외여과하고 4℃(140분)에서 33체적의 2.33 M 우레아, 100 mM Tris-HCl, pH 8 그 다음 1.55M 우레아, 100mM Tris-HCl, pH 8(140분) 그리고 1M 우레아, 100mM Tris-HCl, pH 8(140분)에 대한 투석에 의해 리폴딩되었다. 최종적으로 생성물은 80체적의 100mM Tris-HCl에 투석(16시간)되고, 13000 x g(30분) 원심분리되고, SFCA 0.45㎛ 멤브레인(Nalgene)을 통해 여과되고, 그리고 0.15 M 소디움 클로라이드, 0.05M 소디움 포스페이트(PBS)로 예비-평형된 HR Sephacryl S-300 컬럼(1020ml)을 통해 겔여과되었다. 리폴딩된 단백질 약 23mg이 회수되었다.
최종 생성물은 비환원 SDS-PAGE후 거의 대부분 단량체이었으며(도. 4a, 래인 c), Superdex 75 HR 컬럼에서 분석 겔-투과 HPLC에 의한 삼량체성 인간 TNF와 유사한 유체역학적 용적을 가졌으며(나타내지 않음), 그리고 전기분무 질량 분광분석에 의해 17937.8 + 1.8 Da의 분자량을 가졌다(CNGRCG-TNF1-157에 대한 예상치는 17939.4 Da임). 리폴딩되지않은 NGR-TNF 및 리폴딩된 NGR-TNF의 마우스 L-M 세포에 대한 시험관내 세포독성 활성은 각각 (6.11 x 107) + 4.9 및 (5.09 x 107) + 0.3 units/mg이었으며, 한편 정제된 인간 TNF의 세포독성 활성은 (5.45 x 107) + 3.1 units/mg이었다. 이러한 결과는 변성-리폴딩 공정은 인간 NGR-TNF와 뮤린 p55 수용체의 상호작용에 영향을 주지못함을 나타낸다.
인간 NGR-TNF 1㎍(리폴딩되지않은)의 생체내 항-종양 활성은 TNF 10㎍보다 우수하였으며(도. 4b), 한편 그 독성은 동물 체중 감소에 의한 판단시 현저히 보다 낮았다(도. 4c). 리폴딩후 NGR-TNF 0.3㎍은 TNF 10㎍으로 달성되는 것보다 강한 항-종양 효과를 유도하기에 충분하였다(도. 4d, 4e).
이러한 결과는 인간 NGR-TNF의 항-종양 활성은 인간 TNF보다 우수함을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 리폴딩된 인간 NGR-TNF 및 마우스 NGR-TNF는 독성 효과의 증거없이 매우 적은 투여량으로도(1-10ng/마우스) RMA-T-생성 마우스에 현저한 항-종양 효과를 유도할 수 있으나 TNF는 이러한 투여량으로 현저한 효과를 유도할 수 없는 것을 관찰하였다(나타내지 않음).
실시예 VI
마우스 NGR-IFNγ의 제조 및 특성화
CNGRCG(NGR-IFNγ)와 융합된 재조합 뮤린 인터페론 (IFNγ)을 본질적으로 NGR-TNF에 대하여 기술된 바와 같은 재조합 DNA 기술에 의해 제조하였다. CNGRC 도메인은 IFNγ의 C 말단과 융합되었다. 또한 포지션 134내에 있는 시스테인은 세린으로 대체되고; 메티오닌이 E.coli 세포에서 발현을 위해 포지션 -1내에 도입되었다. NGR-IFNγcDNA 제조를 위해 사용된 PCR 프라이머는: 5'-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C(센스) 및 5'-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC이었다. cDNA는 pET-11b(Nde I/BamH I)에서 클론되고 BL21(DE3) E.coli 세포(Novagen)를 형질변환시키는데 사용되었다. 단백질 발현은 pET11b 제조회사 지시에 따라 이소프로필-β-D-티오갈락토시드로 유도되었다. 그 생성물은 표준 기술에 따라 아가로즈상에 고정화된 항-마우스 IFNγmAb(AN18)를 이용하여 면역친화 크로마토그래피에 의해 E.coli 추출물로부터 정제되었다. 최종 생성물의 환원 및 비환원 SDS-PAGE는 16kDa의 단일 밴드를 나타내었다. 전기분무 질량 분광분석은 뮤린 Met-IFNγ-134(C134S)CNGRC(NGR-IFNγ)에 상응하는 16223 + 3.6 Da의 분자량(예상치, 1625.5 Da)을 나타내었다.
항-CD13 항체의 종양 관련 혈관에 대한 결합을 경쟁하는 NGR-IFNγ과 NGR-TNF의 능력은 면역조직학적인 방법으로 조사되었다.
인간 신장 세포 암종의 새로운 수술 표본을 Histopathology Department of the San Raffaele H Scientific Institute로부터 획득하였다. Bouin-고정(4-6시간) 파라핀에 심어진 표본 섹션을 제조하고 폴리라이신-코팅된 슬라이드에 흡착시켰다. CD13 항원은 하기와 같이 아비딘-바이오틴 복합체 방법을 이용하여 검출되었다: 조직 섹션은 표준 방법에 따라 자일렌 및 등급화된 알코올 시리즈를 이용하여 재수화되었다. 조직 섹션은 1mM EDTA를 함유하는 용기내에 방치되고 전자파 오븐(1000W)을 사용하여 7분동안 가열되었다. 그 다음 상기 용기를 1mM EDTA로 다시 채우고 다시 5분간 가열하였다. 조직 섹션을 냉각하고 0.3% 과산화수소를 함유하는 PBS내에 15분간 배양하고 내생 페록시다제로 담금질되었다. 그 시료는 그 다음 PBS로 세정되고 PBS-BSA 100-200㎕(실온 1시간)로 배양된 후 PBS-BSA내에 용해된 mAb WM15(항-hCD13) 단독 또는 여러 경쟁자 시약(참조 표 2)과 혼합된 mAb WM15(항-hCD13)로 배양(4℃ 밤새 방치)하였다. 그 다음 상기 슬라이들은 PBS로 3회(각 3분씩) 세정되고 2% 노말 호스 시럼을 함유하는 PBS-BSA(PBS-BSA-NHS)(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 5분간 배양되었다. 그 다음 그 용액은 PBS-BSA-NHS내에 용해된 3㎍/ml 바이오티닐레이티드 호스 항-마우스 IgG(H+L)(Vector Laboratories, Bulingame, CA)로 대체되고 실온에서 1시간동안 더 배양되었다. 슬라이드는 다시 세정되고 PBS에 1:100으로 희석된 Vectastain Elite Reagent(Vector Laboratories, Bulingame, CA)로 30분동안 배양되었다. 그 다음 3,3'-디아미노-벤지딘-테트라히드로클로라이드 태블렛(Merck, Darmstadt, Germany)을 0.03% 과산화수소를 함유하는 탈이온수 10ml에 용해한 다음 0.2㎛ 멤브레인을 통해 여과하고 조직 섹션상에 5-10분간 놓았다. 슬라이드를 상기한 바와 같이 세정하고 Harris' 헤 마톡실린으로 카운터스테인하였다. 종양 관련 혈관은 항-CD31 mAb(mAb JC/70A, 항-인간 CD31, IgG1, DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용하여 조직 섹션을 연속으로 염색함으로써 확인되었다.
그 결과를 표 2에 요약하였다. 나타낸 바와 같이, WM15와 종양 관련 혈관의 결합은 과도한 NGR-TNF, NGR-IFNγ 및 CNGRC에 의해 억제되었나, NGR 모티프가 결여된 다른 대조 시약에 의해서는 억제되지않았다. 이것은 CD13상의 NGR 결합 부위가 WM15 에피토프와 입체적으로 겹쳐짐을 나타낸다. 반대로, NGR-TNF는 13C03에 대한 상피 세포의 결합을 경쟁할 수 없었다.
본 발명자들은 NGR-IFNγ및 NGR-TNF의 NGR 부분은 종양 관련 혈관상의 mAb WM15에 의해 인지되는 CD13 형태와 상호작용할 수 있다는 결론을 내린다. 또한, 이러한 결과는 CNGRC 모티프는 사이토카인의 N-말단 또는 C-말단과 결합되는 경우 기능적임을 나타낸다.
여러 경쟁인자의 존재하에서 신장 세포 암 섹션에 대한 WM15의 결합
경쟁인자 종양 관련 혈관에 대한 WM15의 결합
무 +
NGR-TNF(25㎍/ml) -
NGR-IFNγ(50㎍/ml) -
CNGRC(100㎍/ml) -
TNF(25㎍/ml) +
인간 혈청 알부민(25㎍/ml) +
합성 CgA(60-68)(100㎍/ml) +
a 2% BSA 함유 PBS내에 용해된 경쟁인자가 블록킹 단계에서 첨가되고 일차 항체와 혼합되었다.
b mAb WM15(항-인간 CD13, IgG1)은 Pharmingen(San Diego, CA)로부터 구입된 것이었다.
합성 펩티드 CgA(60-68)는 크로모그라닌 A 프레그먼트 60-68에 상응하는 것이다.
실시예 VII
항-종양 항체 및 아비딘(예비-표적화)을 이용한 바이오티닐레이티드 NGR-TNF의 표적화된 종양으로의 운반
하기 실시예는 종양 호밍 항체와 펩티드 CNGRC의 조합에 기초한 TNF의 "이중" 표적화의 가능성을 나타내는 것이다.
바이오틴-NGR-TNF 접합체는 NGR-TNF를, 1M 소디움-카보네이트 버퍼, pH 6.8에 용해된 D-바이오티닐-6-아미노카프로산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(Societa Prodotti Antibiotici S.p.A, Milan, Italy)와 혼합(실온 3시간)하여 제조하였다(21). 반응은 1M Tris-HCl, pH 7.5로 블록킹되었다.
접합체는 질량 분광분석으로 특성화되었으며 1 바이오틴/삼량체(평균)를 함유하는 것으로 발견되었다. 그 다음 C57BL/6(Charles River Laboratories, Calco, Italy)가 5 x 104 RMA-T 생존 세포로 s.c. 좌측면으로 챌린지되었다. 종양 부위가 40mm2에 이르렀을때, 마우스는 이미 기술된 바와 같이 "3일" 프로토콜에 따라(26), 바이오티닐레이티드 항체, 아비딘 및 바이오틴-TNF의 연속 주입을 처리되었다. 바이오틴-mAb19E12 40㎍(i.p., 단계 I), 18 및 19시간 후에 각각 아비딘 60㎍ 및 스 트렙타비딘 60㎍(i.p., 단계 II) 및 24시간 후에 바이오틴-NGR-TNF 3㎍(i.p., 단계 III)을 주입하였다. 각 화합물은 멸균된 0.9% 소디움 클로라이드 용액으로 희석되었다. 대조 실험으로, 아비딘 및 스트렙타비딘을 생략하였다. 각 실험은 5마우스/그룹으로 수행하였다. 종양 성장은 캘리퍼로 종양 크기를 측정하여 매일 검사되었다. mAb 19E12-바이오틴/아비딘/스트렙타비딘/바이오틴-NGR-TNF로 처리된 그룹에서(5 동물, 평균±SE) 처리전 종양 부위와 처리후 10 종양 부위는 각각 39±4mm2 및 8±5mm2이었다. 대조 그룹에서(mAb 19E12-바이오틴/바이오틴-NGR-TNF 단독으로 처리된) 그룹에서, 처리전 종양 부위 및 처리후 10일 종양 부위는 각각 40±4mm2 및 20±6mm2이었으며, 이는 종양 호밍 항체 및 아비딘을 이용한 예비-표적화가 NGR-TNF의 활성을 증가시켰음을 나타낸다.
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  17. TNF 또는 IFNγ로부터 선택된 사이토카인과 CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, 시클로CVLNGRMEC, 선형 또는 시클릭 CNGRC로 구성되는 그룹으로부터 선택된 펩티드 사이의 접합 생성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNFα또는 TNFβ임을 특징으로 하는 접합 생성물.
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  20. 제 17항에 있어서, 상기 접합 생성물은 TNF와 선형 또는 시클릭 CNGRC 사이의 접합 생성물이며, 여기서 상기 TNF의 아미노말단은 스페이서 G를 통해 상기 펩티드에 연결되는 것을 특징으로 하는 접합 생성물.
  21. 삭제
  22. 제 17항에 있어서, 상기 사이토카인은 폴리에틸렌 글리콜 또는 아실기로 유도됨을 특징으로 하는 접합 생성물.
  23. 제 17항에 있어서, 상기 사이토카인은 나아가 종양 항원, 종양 맥관유래(angiogenic) 마커 또는 세포외 매트릭스의 성분에 대한 항체 또는 이들의 프레그먼트와 접합됨을 특징으로 하는 접합 생성물.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNF이며 여기서 상기 TNF의 일 서브유니트는 상기 NGR 모티프를 함유하는 펩티드와 접합되며 상기 TNF의 다른 서브 유니트는 항체, 이의 프레그먼트와 접합되는 것을 특징으로 하는 접합 생성물.
  25. CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, 시클로CVLNGRMEC, 선형 또는 시클릭 CNGRC로 구성되는 그룹으로부터 선택된 펩타이드를 암호하는 5' 혹은 3' 인접 서열을 생성하는 TNF 및 IFNγ로부터 선택된 사이토카인을 암호하는 cDNA.
  26. 삭제
  27. 제 20항의 접합 생성물을 암호하는 cDNA.
  28. 삭제
  29. 제 25항 또는 27항의 cDNA를 함유하는 유전자 치료용 벡터.
  30. 약학적으로 수용가능한 운반체 및 부형제와 함께, 제 17항, 18항, 20항, 22항 내지 24항 중 어느 한 항에서 청구하는 접합 생성물의 유효량을 포함하는 암 치료용 의약품 제조에 사용되는 약학 조성물.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 조성물은 주입가능한 용액 또는 서스펜션 또는 주입용 액체의 형태임을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀의 형태임을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 17항, 18항, 20항, 22항 내지 24항 중 어느 한 항에서 청구하는 접합 생성물, 제 25항 또는 27항에 따른 cDNA 또는 제 25항 또는 27항에 따른 cDNA를 함유하는 유전자 치료용 벡터를 포함하는 암 치료를 위한 의약품 제조에 사용되는 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 접합 생성물은 다른 항종양제와 결합하여 사용됨을 특징으로하는 조성물.
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