CZ299486B6 - Konjugacní produkt, jeho použití, cDNA kódující cytokin a farmaceutický prostredek - Google Patents

Konjugacní produkt, jeho použití, cDNA kódující cytokin a farmaceutický prostredek Download PDF

Info

Publication number
CZ299486B6
CZ299486B6 CZ20023093A CZ20023093A CZ299486B6 CZ 299486 B6 CZ299486 B6 CZ 299486B6 CZ 20023093 A CZ20023093 A CZ 20023093A CZ 20023093 A CZ20023093 A CZ 20023093A CZ 299486 B6 CZ299486 B6 CZ 299486B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tnf
tumor
ngr
cytokine
conjugation product
Prior art date
Application number
CZ20023093A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20023093A3 (cs
Inventor
Corti@Angelo
Original Assignee
Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor filed Critical Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor
Publication of CZ20023093A3 publication Critical patent/CZ20023093A3/cs
Publication of CZ299486B6 publication Critical patent/CZ299486B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • C08L89/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
    • C08L89/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin, e.g. gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/412—Microsized, i.e. having sizes between 0.1 and 100 microns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

Podstatu rešení tvorí konjugacní produkt, který vznikl mezi cytokinem vybraným z TNF nebo IFN.gama.a peptidem, obsahujícím motiv NGR. Soucást rešenítvorí rovnež cDNA, kódující tento produkt a farmaceutický prostredek s obsahem tohoto konjugacního produktu pro lécení zhoubného bujení.

Description

Konjugační produkt, jeho použití, cDNA kódující cytokin a farmaceutický prostředek
Oblast techniky
Vynález popisuje upravené cytokiny vhodné pro použití při léčbě zhoubného bujení. Zvláště se popisuje deriváty cytokinů, jejichž cílem jsou cévy nádorů a buňky prezentující antigen.
Dosavadní stav techniky
Protinádorová aktivita některých cytokinů je dobře známá a v literatuře popsána. Některé cytokiny se už v minulosti použily při léčbě lidí (popisuje se v publikaci Fiers, W. Biologie therapy with THF: preclinical studies. In V. De Vita, S. Hellman, and S. Rosenberg Eds.). Biologie therapy of cancer: principles and practice. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1995. P. 295— 327). Takové cytokiny, jako je například interleukin-2 (IL—2) a interferon a(IFNa) vykazují pozitivní protinádorovou aktivitu u pacientů s různými typy nádorů, jako jsou metastázující karcinom ledviny, leukémie vlasových buněk, Kaposiho sarkom, melanom, vícenásobný mielom a podobně. Jiné cytokiny jako je IFNP, faktor nekrózy nádoru (TNFa), TNF3, IL—1,4, 6, 12, 15 a faktory stimulující kolonie (CFS) vykazují jistou protinádorovou aktivitu u některých typů nádorů a proto jsou předmětem dalších studií.
V obecném případě terapeutické použití cytokinů je silně omezeno jejich systémovou toxicitou. Například TNF se používá v důsledku jeho kapacity vyvolat hemoragickou nektrózu některých nádorů (popisuje se v publikaci Carswell, E.A., et al., An endotoxin-induced sérum factor that causes necrosis of tumors. Proč. Nati., Acad. Sci. USA 1975, 72: 3666-70.) a in vitro cytotoxický účinek u různých nádorových linií (popisuje se v publikaci Helson, L, et al., Effect of tumor necrosis factor on cultured human melanoma cells. Nátuře 1975. 258: 731-732). Následně se potvrdilo, že vykazuje silnou protizánětlivou aktivitu, což může v případě podmínek nadměrné produkce, nebezpečně ovlivnit lidské tělo (popisuje se v publikaci Tracey, K.J., and A. Cerami. Tumor necrosis factor, other cytokines and disease. Ann. Rev. Cell Biol., 1993, 9: 317—43).
Vzhledem k tomu, že systémová toxicita je základní problém při použití farmakologicky aktivního množství cytokinů u lidí, vyvíjející se nové deriváty a léčebné strategie, kdy se redukují toxické účinky uvedené třídy biologických efektorů, zatímco si zachovávají léčebnou účinnost. Některé nové přístupy jsou následující:
a) vývoj fúzních proteinů, které mohou zavést TNF do nádoru a tak zvýšit lokální koncentraci. Tak se například produkují fúzní proteiny obsahující TNF a nádorově specifické protilátky (popisuje se v publikaci Hoogenboom, H. R., et al., Construction and expression of antibody tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995. 32: 873-81.).
b) vývoj mutantů TNF, které udržují protinádorovou aktivitu a redukují systémovou toxicitu. Připravily se mutanti, kteří jsou schopni selektivně rozeznat pouze jeden receptor (p55 nebo p75 (popisuje se v publikaci Loetscher, H ., et al., Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specifity for the 55-kDa or 75 kDA TNF receptors. J. Biol. Chem. 1993,268:26 350-7).
c) použití protilátek proti TNF schopných redukovat některé toxické účinky TNF, aniž snižují svou protinádorovou aktivitu. Takové protilátky se popisují v publikaci Rathjen, D. A., et al., 1992. Selective enhancement of the tumour necrotic activity TNF alpha with monoclonal antibody. Brit. J. Cancer 65: 852.
d) použití derivátů TNF s vyšším poločasem rozpadu (například TNF konjugovaný spolyetylenglykolem).
Popisuje se příprava derivátů TNF schopných selektivně cílit místa nádorů. Popisuje se například fúzní protein získaný fúzí genu těžkého řetězce monoklonálních protilátek proti receptorů transferinu a genu TNF (popisuje se v publikaci Hoogenboom, H.R., et al., Construction and expression of antibody tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995. 32: 873-81). nebo fúzní protein TNF s kloubní oblastí monoklonální protilátky proti antigenů TAG72 spojenému s nádorem (popisuje se v publikaci Zang, J., et al., A genetically engineered single-chain FV/tnf molecule prossesses the anti-tumor immunoreactivity of FV as well as the cytotoxic activity of tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995. 32: 873-81).
Dokument EP 251 494 popisuje systém aplikace diagnostického nebo léčebného činidla, které zahrnuje protilátku konjugovanou s avidinem nebo streptavidinem, činidlo schopné tvořit komplexy konjugovaných protilátek a sloučeniny obsahující diagnostické nebo terapeutické činidlo konjugované s biotinem, které se aplikuje postupně a s odpovídajícím zpožděním tak, aby umožnilo lokalizaci terapeutického nebo diagnostického činidla prostřednictvím interakce biotin-streptavidin nebo cílové buňce rozeznané protilátkou. Popsaná léčebná nebo diagnostická činidla obsahují cheláty kovů, v určitých chelátech jsou obsaženy radionukleotidy a nízkomolekulová protinádorová činidla, jako je cis-platina, doxorubicin, atd.
Dokument EP 496 074 popisuje způsob, který zahrnuje postupnou aplikaci biotinylových protilátek, avidin nebo streptavidin a biotinem značené diagnostické nebo terapeutické činidlo. Ačkoli se zmiňují cytotoxická činidla podobná ricinu, většinou se popisuje aplikace radioaktivně značených sloučenin.
Dokument 95/15979 popisuje způsob lokalizace vysoce toxických činidel na buněčných cílech založených na aplikaci prvního konjugátu, který obsahuje specificky cílenou molekulu konjugovanou s ligandem nebo anti-ligandem, pak následuje aplikace druhého konjugátu, který obsahuje toxické činidlo vázané na anti-ligand nebo ligand.
Dokument WO 99/13 329 popisuje způsob cílení molekuly do nádorových angiogenních cév, založených na konjugování uvedené molekuly s ligandy receptorů NGR. Rada molekul se navrhla jako možný kandidát, ale specificky se popisuje pouze doxorubicin. Nebylo však popsáno žádné použití ligandů receptorů NGR jako cytokinů za účelem vyvolání imunitní odezvy.
Překvapivě se zjistilo, že terapeutický index jistých cytokinů se může znatelně vylepšit ajejich imunoterapeutické vlastnosti se mohou zesílit spojením s ligandem receptorů aminopeptidázy-N (CD13). CD13 je trans-membránový glykoprotein o molekulové hmotnosti 150 000, který je vysoce konzervativní v různých živočišných druzích, Exprimuje se na normálních buňkách stejně jako v liniích myeloidních nádorů v angiogením endoteliu a v některém epitelu. Receptor CD 13 se obvykle identifikoval jako receptor „NGR“, kde jeho peptidové ligandy sdílí aminokyselinový motiv „NGR“.
Vynález popisuje konjugační produkt cytokinů vybraný z TNF a IFNy a ligandu receptorů CD13. Uvedený ligand může být protilátka nebo její fragment, jako je Fab, Fv, jediný řetězec FV, peptid nebo molekula napodobující peptid, jmenovitě molekula podobná peptidu schopná vázat se na receptor CD13, která může obsahovat upravené nebo přirozeně se vyskytující aminokyseliny. Ligandem je přednostně přímý nebo cyklický peptid obsahující motiv NGR, jako je CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRC, cycloCVLNGRMEC nebo cycloCNGRC nebo výhodný je peptid CNGRC. Peptid může být spojen s cytokinem přímo nebo nepřímo prostřednictvím mezemíku, kterým může být jediná aminokyselina, aminokyselinová sekvence nebo organický zbytek, jako je 6-aminokyselinová sekvence nebo organický zbytek, jako je 6-aminokapryl-Nhydroxysukcinimid. Postupy spojování jsou dobře známy v oboru a zahrnují metody rekombinace molekul nebo chemickou syntézu.
Peptidový ligand je přednostně spojen s N-koncem cytokinu, tak se minimalizují libovolné interference při navázání upraveného cytokinu na jeho receptor. V jiném případě se může peptid spojit s aminokyselinovými zbytky, které jsou akceptory amidové nebo karboxylové vazby přirozeně se vyskytující na molekule nebo jsou uměle začleněny postupy rekombinace. Upravený cytokin se přednostně připravil použitím cDNA obsahující sekvenci sousedící s 5'-koncem, která obsahuje peptid.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří konjugační produkt, který vznikl mezi cytokinem vybraným z TNF nebo IFNy a peptidem, obsahujícím motiv NGR.
Prokázalo se na zvířecích modelech lymfomu RMA-T, že výsledný produkt (NGR-TNF) je aktivní než TNF. Dále zvířata ošetřená NGR-TNF jsou schopna potlačit další tumorogenní dávky buněk RMA-T nebo RMA. Růst protinádorové aktivity ve srovnání s normálním TNF je možné pozorovat u imunokompetentních zvířat, ale nikoli u imunodeficientních zvířat. To naznačuje, že růst protinádorové aktivity TNF konjugované s peptidy „NGR“ je způsoben zesílením imunitní odezvy spíše než přímé cytotoxické aktivity konjugátu.
Ukázalo se, že imunitní účinky in vivo vyvolané NGR-TNR jsou přímo vztaženy vůči receptoru CD13. Pozorovalo se například, že protilátky proti receptoru CD 13 stejně jako ligand GNGRC soutěží in vivo s NGR-TNF, což naznačuje mechanizmus cílení receptoru pomocí NGR-TNF.
Terapeutický index konjugátů ligandů TNF/CD13 se může dále zlepšit použitím mutantní formy TNF schopné se selektivně vázat najeden ze dvou receptorů TNR, p75TNFR a p55TNFR. Uvedený mutant TNF se může získat místně řízenou mutagenezi (popisuje se v publikaci Loetscher, H., et al., Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specifíty for the 55-kDa or 75 kDa TNF receptors. J. Biol. Chem. 1993.268:26 350-7, Van Ostade, X., et al., Human THF mutans with selective activity on the receptor p55. Nátuře 1993. 361: 266-9).
Farmakokinetika upravených cytokinů podle vynálezu se může zlepšit přípravou polyetylenglykolových derivátů, které umožňují prodloužit plazmatický poločas rozpadu samotných cytokinů.
Vynález dále popisuje bifunkční deriváty, kde cytokiny upravené ligandem CD 13 se konjugují s protilátkami nebo s jejich fragmenty určenými k proti nádorovým antigenům nebo jiným nádorovým angiogenním markérům, jako jsou αν integriny, metaloproteázy nebo vaskulázní růstový faktor, nebo protilátky nebo jejich fragmenty řízené proti komponentům extracelulámí matrice, jako jsou protilátky proti tenaskinu nebo oblast určená proti fibronektinu EDB. Popisuje se příprava fúzního produktu mezi TNF a kloubní oblastí monoklonálních protilátek proti antígenu TAG72 spojenému s nádorem, které se exprimují v adenokarcinomu žaludku a vaječníků (Zang,
J., et al, A genetically engineered single-chain FV/TNF molekule possess the anti-tumor immunoreactivity of FV as well as the cytotoxic activity of tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995.32:873-81).
Vynález dále popisuje pre-cílení nádoru použitím systému biotin/avidin. Podle tohoto systému se získá v různých stádiích temámí komplex na antigenním místě nádoru, který je tvořen 1) biotinem značenou monoklonální protilátkou, 2) avidinem (nebo streptavidinem) a 3) bivalentním cytokinem, upraveným ligandem CD13 a biotinem. Řada článků prokázala, že předchozí cílení ve srovnání s běžným cílením s imunologickými konjugáty může ihned zvýšit poměr aktivní molekuly směrované k cíli ku volné aktivní molekule, čímž se snižuje toxicita léčby (popisuje se v publikacích Colombo, P., et al., Immunoscintigraphy with anti-chromogranin A antibodies in patients with endocrine/neuroendocrine tumors. J. Endocr. Invest. 1993.16: 841-3, Modorati, G., i
et al., Immunoscintigraphy with three step monoclonal pretargeting technique in diagnosis of uveal melanoma: preliminary results. Br. J. Ophtalm. 1994: 78: 19-23, Paganelli, G., et al., Clinical application of the avidin-biotin systém for tumor targeting. In D. Goldenberg (Ed. Cancer Therapy with radiolabeled antibodies. CRC Press, Boča Raton, 1995. P. 239-253, Paganelli, G., et al., Three-strep monoclonal antibody tumor targeting in carcinoembryonic antigenpositive patients. Cancer Res.1991. 51: 5960-6). Tento přístup dává nejlepší výsledky s TNF značeným biotinem, který byl schopen vázat cytotoxicitu in vitro a potlačit růst nádorových buněk za podmínek, pří kterých normální TNF nebyl aktivní (popisuje se v publikaci Moro, M. et al., Tumor cell targeting with antibody-avidin complexes and biotinylated tumor necrosis factor alpha. cancer Res. 1997. 57: 1922-8, Gasparri, A. et al., Tumor pretargeting with avidin improves the therapeutic index of botinylated tumor necrosis factor-alpha and the comparison with other cytokines: Industion of tumor-specific immunity. J. Immunol. 1987. 138: 4023-32). Přístup pre-cílení se může provést postupem ve dvou fázích použitím bispecifické pritilátky, která se ve stejný okamžik váže na nádorový antigen a upravený cytokin. Popisuje se použití bispecifické protilátky určené proti karcinoembryonálnímu antigenů a TNF jako způsoby předchozího cílení TNF do nádoru (popisuje se v publikaci Robert, b., et al., 1996. Cytokine targeting in tumors using a bispecific antibody directed against carcinoembryonic antigen and tumor necrosis factor alpha. cancer Res. 56: 4758).
Vynález dále popisuje molekulu TNF konjugovanou s ligandem CD13 a protilátkou nebo jeho fragmentem (přímo nebo nepřímo prostřednictvím můstku biotin-avidin) na různých podjednotkách TNF, kde protilátka nebo její fragmenty jsou řízeny přímo proti antigenů exprimovaném na nádorových buňkách nebo jiných komponentech nádorového stromatu, například tenaskin a oblast EDB fibronektinu. To vede k dalšímu zlepšení vlastností cílení upraveného cytokinů do nádoru a k pozdějšímu pomalému uvolňování v mikroprostředí nádoru pomocí transice trimermonomer-trimer. Jak je uvedeno v předcházejících pracích ve skutečnosti upravené podjednotky konjugátů TNF se mohou disociovat z cílových komplexů a znovu spojovat za vzniku neupravených trimerových molekul TNF, které pak difúzují v mikroprostředí nádoru. Ukazuje se, že k uvolnění bioaktivního TNF dochází 24 až 48 hodin po cílení (popisuje se v publikaci Corti,
A., et al., Tumor targeting with biotinylated tumor necrosis factor alpha: Structure activity relationships and mechanism of action on avidin pretargeted tumor cells. Cancer Res. 1998. 58: 3866-3872).
Při léčbě se upravené cytokiny podle vynálezu vhodně zavedly do farmaceutických přípravků, které jsou vhodné pro orální nebo parenterální aplikaci. Výhodné jsou prostředky pro parenterální aplikaci a obsahují roztoky nebo suspenze, které je možné zavést injekcí, a tekutiny vhodné pro infúzi. Při přípravě parenterálních forem účinné množství aktivní složky se rozpustí nebo suspenduje ve sterilním nosiči, je možné přidat pomocné látky, jako je například rozpouštědla, izotonická činidla, konzervační činidla, stabilizátory, emulzifikační činidla nebo dispergační činidla a následně se rozdělí do zatavených zkumavek nebo ampulí.
Příprava cytokinů ve formě lipozomů může zlepšit jejich biologickou aktivitu. Ve skutečnosti se pozorovalo, že acylace aminoskupin TNF vyvolává růst hydrofobicity aniž dojde ke ztrátě biologické aktivity in vitro. Dále se popisuje, že TNF vázané na lipidy vykazuje nedotčenou cytotoxicitu in vitro, imunomodulační účinky a sníženou toxicitu in vivo (Debs, R. J., et al., Liposomeassociated tumor necrosis factor retains bioactivity in the presence of neutralizing anti-tumor necrosis factor antibodies. J. Immunol. 1989. 143: 1192-7, Debs, R. J., et al., Immunomodulatory and toxic effects of free and liposome-encapsulated tumor necrosis factor alpha in rats. Cancer Res. 1990.50:375-80).
Maximální tolerovaná dávka TNF u lidí je 218—410 pg/m2 (popisuje se v publikaci Fraker, D.L., Alexander, H.R. and Pass. Η. I., 1995. Biologie therapy with TNF: systemic administration and carcinoembryonic antigen and tumor necrosis factor alpha. Cancer Res. 56: 4758), což je přibližně desetkrát nižší ve srovnání s účinnou dávkou u zvířat. Na základě dat získaných z myších modelů je nutná desetkrát vyšší dávka, aby se dosáhlo protinádorových účinků u lidí (popisuje se v publikaci Schraffordt Koops, et al., Hyperthermic isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan as treatment fo locally advanced or recurrent soft tissue sarcomas of the extremities. Radiothepray and Oncology 1998. 48: 1-4). Při první klinické studii se získaly vysoké odezvy při použití jediné dávky 4 mg TNF v kombinaci s melfalanem a inteferonem γ (popisuje se v publikaci Lienard, D., et al., In transit metastasis of malignant melanoma treated by high dose rTNF alpha in combination with interferon-gamma and melphalan in isolation perfusion. World Journal of Surgery 1992. 16: 234^40). Jiné práce ukazují, že interferon γ může být vynechán a že dokonce nižší dávky TNF mohou dostatečně vyvolat léčebnou odezvu (popisuje se v publikaci Hill, S. et al., Low-dose tumor necrosis factor alpha and melphalan in hyperthermic issolated limb perfusion. Br. J. Sugr. 1993. 80: 995-7, Eggermont, A.M. et al., Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan for limb salvaga in 186 patients with locally advanced soft tissue extremity sarcomas. The cumulative multicenter European experience. Ann. Surg., 1996. 224: 756-65). Stejně jako dva cytokiny vykazují synergické účinky na endoteliální buňky, jejich kombinované selektivní cílení podobně vede k silnější proti nádorové aktivitě, což umožňuje překonat problémy spojené se systémovou toxicitou, s kterou je obvykle spojena léčba zhoubného bujení, když se použije kombinace stejných cytokinů. Dále je známo, že TNF může snížit bariérovou funkci endoteliálií cév, čímž se zvýší jejich prostupnost makromolekul. Vzhledem k nižší toxicitě léčby upravenými molekulami TNF podle vynálezu a jejich schopnosti cílit cévy nádoru, je možné je dále použít za účelem zvýšení prostupnosti dalších látek do nádorových cév ať už pro terapeutické, tak diagnostické účely. Upravené TNF se mohou použít například při zvýšení pohlcení radioaktivně značených protilátek nebo hormonů nádorem (látky sloužící k zobrazení nádoru) při radioimunoscientigrafíi nebo radioimunoterapii nádorů. V jiném případě mohou také zesílit pohlcení chemoterapeutických léků, imunotoxinů, lipozomů nesoucích léky nebo genů nebo jiných léků proti zhoubnému bujení tak, že se zesílí jejich protinádorový účinek.
Cytokiny podle vynálezu se mohou použít v kombinovaných, oddělených nebo po sobě jdoucích prostředcích a také sjinými diagnostickými nebo léčebnými prostředky při léčbě nebo diagnostice zhoubného bujení.
Vynález dále popisuje cDNA kódující zde popsané konjugované cytokiny, které se mohou připravit z cDNA cytokinů adicí sekvence DNA sousedící s 3'-koncem nebo 5'-koncem, která kóduje ligand CD13, s výhodou pro cíleni peptidy popsané shora v textu. Kombinovaná cDNA se může použít jako taková nebo se může začlenit do vektorů a použít při genové terapii. Příprava a terapeutické aplikace vhodných vektorů se popisují v publikaci Mizuguchi, H. et al., Tumor necrosis factor alphamediated tumor regression by the in vivo transfer of genes into the artery that leads to tumor. Cancer Res, 1988. 58: 5725-30).
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek č. 1: Účinek TNF a NGR-TNF na růst lymfomů RMA-T (a a b) a na tělesnou hmotnost zvířete (c a d)
Pět zvířat ve skupině se ošetřilo jedinou dávkou TNF nebo NGR-TNF (i.p.) deset dní po implantaci nádoru. Hodnoty oblasti nádoru 14. den jako funkce dávky (b) a ztráty tělesné hmotnosti po léčbě (průměr hodnot získaných 11. a 12. den) (d) se získaly z logaritmických křivek. Protinádorové účinky vyvolané 1 pg nebo 9 pg NG-TNF 14. den byly větší než ty vyvolané srovnatelným množstvím TNF (P=0,024 a P=0,032), zatímco ztráta tělesné hmotnosti po této léčbě byla podobná. Šipky označují extrapolované dávky TNF a NGR-TNF, které vyvolávají srovnatelné účinky.
Obrázek č. 2: Účinek monoklonálních protilátek R3-63 a CNGRC na protindorovou aktivitou NGR-TNF (a) a TNF (b)
Monoklonální protilátky R3-63 nebo CNGRC se smíchal s NGR-TNF nebo TNF a aplikovaly se zvířeti nesoucí nádor RMA-T 12 dní po implantaci nádoru (n=5 zvířat ve skupině). V dalším experimentu (c) se TNF a NGR-TNF se společně aplikovaly s CNGRC nebo CARAC (kontrolní peptid) zvířatům, které nesou nádory staré 11 dní (n=5). Proti nádorový účinek 1 pg NGR-TNF byl silnější než účinek 9 pg TNF (P-0,009, t-test v den 20) a podstatně se inhiboval pomocí CNGRC (P=0,035) a monoklonálními protilátkami R3-63 (P=0,011).
Obrázek č. 3: Účinek omezeného tryptického štěpení NGR-TNF a TNF na jejich hmotnost (a) a protinádorovou aktivitu (b).
Agaróza obsahující trypsin se připravila přidáním 1 mg trypsinu do 1 ml aktivované sefarózy CH (od firmy Pharmaciaúpjohn) podle instrukcí výrobce. NGR-TNF a TNF (170 pg každé látky se přidalo do 300 pl 0,15 M chloridu sodného, 0,05 M fosforečnan sodný, pH 7,3) se smíchaly s 15 pl suspenze pryskyřice (1:4) nebo samotného pufru a nechaly se rotovat při teplotě 37 °C po určenou dobu. Čtyři produkty se filtrovaly pomocí zařízení Spin-X s velikostí pórů 0,22 pm (od firmy Costar, Cambridge, MA) a uchovávaly se při teplotě -20 °C až od okamžiku použití.
(a) Elektrosprejová hmotnostní spektrometrická analýza. Hodnoty molekulové hmotnosti a odpovídající produkty (N-terminální sekvence) jsou uvedeny na každém píku. Šipky na sekvencích vykazují místo štěpení, (b) Účinek 1 nebo 3 pg NGR-TNF a TNF inkubovaných bez (horní panel) nebo s (nižší panel) tiypsinem na růst nádorů RMA-T a tělesnou hmotnost zvířete (průměr +/- střední odchylka ve skupině ošetřené dávkou 1 a 3 pg). Zvířata se ošetřila 13 dní po implantaci nádoru (n=5 zvířat ve skupině).
Obrázek č. 4: SDS-PAGE a protinádorová aktivita lidského NGR-TNF před a po denaturaci/opěmém sbalení
SDS-PAGE za neredukčních podmínek (A) lidského TNF (a), NGR-TNF před (b) a po (c) denaturaci a opětném sbalení se popisuje v příkladu 5.
Účinek TNF a nesbaleného NGR-TNF na růst lymfonů RMA-T (B) a tělesnou hmotnost (C). Účinek lidského TNF (D) a opětně sbaleného NGR-TNF (obsahující více jak 95 % trimerů s disulfidy uvnitř řetězce) (E) na růst nádoru. Zvířata (15) nebo 5 myší ve skupině, jak se uvádí v každém panelu) se ošetřilo jednou dávkou TNF nebo NGR-TNF aplikovanou i.p. deset dní po implantaci nádoru.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava myšího TNF a NGR-TNF
Myší rekombinant TNF a Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF) se produkoval cytoplazmatickou expresí cDNA v mikroorganizmu E.coli. cDNA kódující myší Met-TNFi„i56 (popisuje se v publikaci Pennica, D., et al., Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA for murine tumor necrosis factor. Proč. Nati. Sci. USA 1985, 82: 6060-4) se připravil polymerázovou řetězcovou reakcí za použití reverzní transkriptázy (RT-PCR) mRNA izolované z myších buněk monocytmakrofág RAW-2647 stimulovaných lipopolysacharidem za použití
5'-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAG-3'a
5-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3' jako3' a5' primerů.
Amplifikovaný fragment se štěpil restrikčními enzymy Ndel a BamHI (New England Biolabs, Beverley, MA) a klonoval se do vektoru pET-llb (Novagen, Madison, WI), který se předem štěpil stejnými enzymy (pTNF).
cDNA kódující CysAsn-GIy-Arg-Cys-Gly-TNF| 156 se amplifikoval pomocí PCR na pTNF za použití 5-GCAGATCATATGTGCAACGGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' jako primerů 5' a primerů 3', který se popisuje shora v textu. Amplifikovaný fragment se štěpil a klonoval do vektoru pEt-1 lb, jak se popisuje shora v textu a použil se k transformaci buněk E. coli BL21(DE3) (od firmy Novagen). Exprese TNF a NGR-TNF se vyvolala Ísopropyl-β-Οthiogalaktosidem podle instrukcí výrobce pETllb. Rozpustný TNF a NGR-TNF se získal ze dvou litrů kultury sonifikací bakterií v 2 mM kyselině etylendiamintetraoctové, 20 mM Tris-HCl, pH8,0. Pak následovala centrifugace při 15 OOOxg po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Oba extrakty se smíchaly síranem amonným (25 % saturace), nechaly se stát po dobu jedné hodiny při teplotě 4 °C a dále se centrifugovaly, jak se popisuje shora v textu. Síran amonný obsažený v supernatantech se pak z 65 % saturoval a nechal se stát při teplotě 4 °C po dobu 24 hodin a pak proběhla další centrifugace. Každý pelet se rozpustil v 200 ml 1M síranu amonného, 50 mM Tris-HCl, pH8,0 a čistil se chromatografií s hydrofóbními intrakcemi na koloně PhenylSepharose 6 Fast Flow (od firmy Pharmacia-Upjohn) (použila se eluce gradientem pufru A; 50 mM fosforečnan sodný, pH 8,0 obsahující 1M síran amonný, pufr B: 20% glycerol, 5% metanol, 50mM fosforečnan sodný, pH8,0). Frakce obsahující imunoreaktivní materiál TNF (westernovým přenosem) se spojily dialyzovaly se proti 2mM kyselině etylendiamintetraoctové, 20 mM Tris-HCl, pH8,0 a dále se čistily chromatografií s výměnou iontů na koloně DEAE-Sepharose Fast Flow (firma Pharmacia-Upjohn) (použila se eluce gradientem pufru A; 20 mM Tris-HCl, pH8,0, pufru Β: 1M chlorid sodný, 20 mM Tris-HCl, pH8,0). Frakce vykazující TNF-imunoreaktivitu se spojily a čistily se gelovou filtrační chromatografií na koloně Seiphacryl-2-300 HR (od firmy Pharmacia-Upjohn), která se předem uvedla do rovnovážného stavu a eluovala se 150mM chloridem sodným, 50 mM pufrem fosforečnanu sodného s hodnotou pH 7,3 (PBS). Frakce odpovídající produktům o molekulové hmotnosti 40 000 až 50 000 se spojily s rozdělily se do alikvótů a uchovávaly se při teplotě -20 °C. Všechny roztoky používané v chromatografickém kroku se připravily použitím sterilní vody, která neobsahuje toxiny (Salf, Bergamo, Itálie). Konečný výtěžek byl 45 mg TNF a 34,5 mg NGR-TNF.
Molekulová hmotnost čištěného TNF a NGR-TNF se měřila elektrosprejovou hmotnostní spektrometrií. Obsah proteinu se měřil za použití běžně dostupných sad pro testování proteinů (Pierce, Rockford, IL). Obsah endotoxinu NGR-TNF a TNF byl 0,75 jednotek na jeden mikrogram a 1,38 jednotek najeden mikrogram, jak se stanovilo kvantitativním chromogenním testem lyzátu amoebocytu lymulu (LAL) (firma BioWhittaker).
Polyakrylamidová gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) a analýza westernovým přenosem se provedly použitím 12,5 nebo 15% polyakrylamidových gelů a standardních postupů.
Malé množství TNF a NGR-TNF se dále čistilo afinitní chromatografií na rozpustném receptoru p55-TNF (sTNF-Rl)-Sepharose následujícím způsobem. 5 mg rekombinantu sTNF-Rl se připravilo způsobem popsaným v publikaci Corti, A., et al., Up-regulation of p75 Tumor necrosisi factor alpha receptor in Mycobacterium avium-infecter mice. Infect. Immun. 1999, 67:5762— 5767) a nanesl se na kolonu Activated-CH-Sepharose o objemu 2 ml (firma Pharmacia) podle instrukcí výrobce. Dvě oddělené kolony (každá měla objem 1 ml) se extenzivně promyly sterilním roztokem, který neobsahuje toxiny, a nanesly se spolu s čištěným TNF nebo NGR-TNF obsaženým v PBS a vymyly se gradientovou eluci (eluce trvala 1 hodinu a použil se pufr A: PBS, pufr. B: 0,5 M chlorid sodný, 0,2 M glycin-HCl). Frakce obsahující TNF-antigen se neutralizovaly a dialyzovaly proti sterilnímu fyziologickému roztoku. Aby se zabránilo adsorbci proteinů na membrány přidal se před dialýzou lidský sérový albumin (0,5 mg/ml), který neobsahuje toxin. Obsah TNF v každé frakci se měřil testem ELISA a cytolytickým testem.
Neredukující SDS-PAGE TNF zobrazila jediný pruh odpovídající velikosti 17 000 až 18 000, jak se očekává v případě monomemího TNF (nebo zobrazeno). Neredukující SDS-PAGE a analýza westernovým přenosem NGR-TNF ukázala, že různé imunoreaktivní formy s molekulovou hmotností 18 000, 36 000 a 50 000 pravděpodobně odpovídají monomerům, dimerům atrimerům. Za redukujících podmínek většina pruhů odpovídající molekulové hmotnosti 50 000 a 36 000 se převedly na formu odpovídající molekulové hmotnosti 18 000, což naznačuje přítomnost molekul NGR-TNF obsahující disulfidové můstky uvnitř řetězce. Pruh s molekulovou hmotností 18 000 odpovídal přibližně 2/3 celkového materiálu, zatímco pruh s molekulovou hmotností 36 000 odpovídal většině ze zbývajících částí. Tyto elektroforetické patemy naznačují, že NGR-TNF je směs trimerů vytvořených ze tří monomemích podjednotek se správnými disulfidy uvnitř řetězce (alespoň 50 %) a zbývající část tvoří většinou trimery obsahující jeden nebo více disulfidů uvnitř řetězce. Při SDS-PAGE za redukčních podmínek je možné stále vidět pruh s molekulovou hmotností 36 000, což naznačuje, že NGR-TNF obsahuje také nevratně denaturovaný dimér (tvoří přibližně 10 % celkového množství).
Molekulová hmotnost monomerů TNF a NGR-TNF stanovená elektrosprejovou hmotnostní spektrometrií byla 17 386,1 +/- hmotnosti očekávané pro Met-TNFi_i56 (17 386,7 Da) a v případě CNGRCG-TNF,_156 (17 844,2 Da).
Příklad 2: Cytotoxická aktivita in vitro myšího TNF a NGR-TNF
Bioaktivita TNF a NGR-TNF se odhadla na základě standardního cytologického testu založeného na L-M myších fiubrioblastech (ATCC CCL1.2) jak se popisuje v publikaci Corti, A., et al., Tumor necrosis factor (TNF) alhpha quantification by ELISA and Bioassay: effects ofTNF alpha-soluble TNF receptor (p55) complex dissociation during assay incubations. J. Immunol. Meth. 1994. 177:191-198). Cytolytická aktivita TNF a NGR-TNF vůči buňkám RMA-T se testovala v přítomnosti 30 ng/ml aktinomycinu D. Každý vzorek se analyzoval ve dvou provedeních ve třech různých ředěních. Výsledky se exprimují jako průměr +/- střední odchylka dvou až tří nezávislých testů.
Cytotoxická aktivita TNF a NGR-TNF in vitro byla 1,2 +/- 0,14 x 108 jednotek na jeden miligram a 1,8 +/- 0,7 x 108 jednotek najeden miligram, což se stanovilo standardním cytolytickým testem s buňkami L-M. Tyto výsledky ukazují, že části CNGRCG v molekule NGR-TNF nebrání balení, oligomerizaci a navázání na receptor TNF.
V předchozí studii se ukázalo, že buňky RMA-T mohou být usmrceny TNF v přítomnosti 30 ng/ml aktinomycinu D, zatímco v přítomnosti inhibitorů transkripce jsou tyto buňky rezistentní vůči TNF, dokonce po několika dnech inkubace. Cytotoxická aktivita NGR-TNF in vitro vůči buňkám RMA-T v přítomnosti aktinomycinu D byla 1,4 +/- 0,8 x 108 jednotek najeden miligram, což se stanovilo použitím TNF jako standardu (1,2 +/- 0,14 x 108 jeden miligram). Pak cytotoxické aktivity NGR-TNF a TNF byly podobné v případě buněk L-M a RMA-T.
Příklad 3: Charakterizace léčebné a toxické aktivity myšího TNF a NGR-TNF
RMA lymfom pocházející z myší C57BL/6 vyvolaný Rauscherovým virem se udržoval in vitro v kultivačním médiu obsahujícím RPMI 1640, 5% fetální bovinní sérum (FBS), 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 0,25 pg/ml amfotericinu B, 2 mM glutaminu a 50 pM
2-merkaptoetanolu. RMA-T se získal z buněčné linie RMA transfekcí s konstrukcí kódující alelu Thy 1.1 a kultivoval se způsob popsaným v publikaci Moro, M., et al., Tumor cell targeting with antibody-avidin complexes and biotinylated tumor necrosis factor alpha. Cancer Res. 1997. 57: 1922-8).
Buňky melanomu B16F1 se kultivovaly v kultivačním médiu obsahujícím RPMI 1640, 5% FBS, 100 U/rnl penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 0,25 pg/ml amfotericinu B, 2 mM glutaminu, 1% MEM neesenciální aminokyselinu (BioWhittaker Europe, Verviers, Belgie).
In vivo studie provedené na zvířecích modelech byly schváleny etickou komisí instituce San Raffaele H Scientific Institute a provedly se podle popisu. C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Itálie) (16 až 18 g) se imunizovaly živými buňkami RMA-T nebo B16F1 v počtu 5xl04 podkožně do levého boku. Deset až dvanáct dní po implantaci nádoru na myši ošetřily injekcí i.p. 250 pl roztoků TNF nebo NGR-TNF ředěných 0,9% chloridem sodným, který neobsahuje toxiny. Předchozí experimenty ukázaly, že proti nádorová aktivita se přidáním lidského sérového albuminu v TNF a NGR-TNF nezměnila. Lidský sérový albumin sloužil jako nosič. Každý experiment se provedl ve skupině, která obsahuje pět myší. Růst nádoru se monitoroval denně měřením velikosti nádoru posuvným měřidlem. Obsah nádoru se odhadla výpočtem rlxr2, zatímco objem nádoru se odhadl výpočtem rlxr2xr3x4/3, kde rl a r2 jsou délka a šířka a r3 je tloušťka nádorů vystupující z normální kůže. Zvířata byla usmrcena dříve než nádor dosáhl průměru 1 až
1,3 cm. Velikosti nádoru jsou zobrazeny jako průměr +/- střední odchylka (5 až 10 zvířat v jedné skupině, jak je označeno v popisu obrázku) a porovnaly se pomocí t-testu.
Protinádorová aktivita a toxicita NGR-TNF se porovnaly s aktivitou a toxicitou lymfomu RMA-T a s modely melanomu B16F1 u myší C57BL6. Protože model RMA-T se už dříve charakterizoval a používal se ke studiu protinádorové aktivity TNF s různými cílovými protokoly (popisuje se v publikaci Gasparri, A., et al., Tumor pretargeting with avidin improves the therapeutic index of biotinylated tumor necrosis factor alpha in mouše models. cancer Res. 1999. 59: 2917-23), bylo rozhodnuto použít tento model také v této studii.
Myší TNF aplikované zvířatům nesoucím RMA-T nádory způsobuje o 24 hodin později redukci hmotnosti nudoru a hemoragickou nekrózu v centrální části nádoru, pak následuje podstatné zpomalení růstu trvající několik dní (popisuje se v publikaci Gasparri, A., et al., Tumor pretargeting with avidin improves the therapeutic index of biotinylated tumor necrosis factor alpha in mouše models. cancer Res. 1999. 59: 2917-23). Léčba s TNF nevyvolává úplnou regresi tohoto nádoru, dokonce ani při dávce blízké LD50, kolem nekrotické oblasti zůstávají živé buňky a několik dní po léčbě začínají opět růst.
Při první sadě experimentů se zkoumal účinek různých dávek (i.p.) TNF nebo NGR-TNF na přežití zvířat. Aby se zabránilo velkému utrpení, zvířata se usmrtila, když průměr nádoru byl větší než 1 až 1,3 cm. Úmrtnost při aplikaci TNF a NGR-TNF 3 dní po léčbě byla podobná (LD50, 60 pg respektive 45 pg), zatímco jejich protinádorová aktivita byla znatelně odlišná (Tabulka č. 1).
Tabulka č. 1: Přežití myší s lymfomem RMA-T léčených myším TNF nebo NGR-TNF
léčba zvířata (n) dávka (pg) přeživší (%) ia! po léčbě
den 3 den 7 den 14 den 21 den 30 den 38 (2. im.)b den 62 (3. im. )b den 92
žádná 18 0 100 0
TNF 4 1 100 20 0
9 3 100 55 0
9 9 100 55 22 11 0
14 27 100 57 14 7 0
9 54 55 55 0
9 108 0
NGR- TNF 10 1 100 70 10 10 0
10 3 100 80 20 20 0
9 9 100 88 55 22 11 11 11
13 27 100 85 30 23 15 15 15 11
9 54 33 33 0
9 108 0
a) Zvířata s nádorem ošetřená TNF nebo NGR-TNF (i.p.) 10 dní po implantaci nádoru. Zvířata se usmrtila, když průměr nádoru přesáhl 1 až 1,3 cm.
b) Přeživší zvířata se v uvedeném čase opět imunizovala buňkami RMA-T v množství 50 000 (druhá imunizace nebo RMA v množství 50 000 (třetí imunizace). Tumorogenicita buněk zavedených injekcí se sledoval v každém určeném čase u 5-ti normálních zvířat. U všech kontrolních zvířat se vyvinul nádor během 10-ti dní (data nejsou uvedena).
Například 1 nebo 3 pg NGR-TNF zpomalí růst nádoru účinněji než 27 pg TNF, což ukazuje, že NGR-TNF je alespoň o jeden řád aktivnější. Je zajímavé, že některá zvířata se léčila dávkami NGR-TNF nižšími než je LD50, zatímco žádná zvířata se neléčila TNF. Léčená zvířata potlačila další imunizaci tumorogenní dávkou buněk RMA-T nebo buněk RMA divokého typu, což naz15 načuje, že jediná aplikace NGR-TNF byla schopna vyvolat ochrannou imunitu. Za zmínku stojí, že zvýšení dávky TNF nebo NGR-TNF nad 9 až 27 pg znatelně zvyšuje toxicitu a velmi málo nebo vůbec terapeutickou aktivitu.
Ztráta tělesné hmotnosti po aplikaci TNF je dobře známým signálem systémové toxicity (Gasparri, A., et al., Tumor pretargeting with avidin improves the therapeutic index of botinylated tumor necrosis factor-alpha and the comparison with other cytokines: Induction oftumor-specific immunity. J. Immunol. 1987. 138: 4023-32). Za účelem dalšího porovnání TNF a NGR-TNF se sledoval růst nádoru a tělesná hmotnost zvířat po léčbě. Účinek 1 pg NGR20
TNF na růst nádoru byl podobný nebo vyšší ve srovnání s 9 pg TNF (zobrazeno na obrázku č. la), zatímco ztráta tělesné hmotnosti jeden až dva dni po léčbě se porovnávala s dávkou 1 pg TNF (zobrazeno na obrázku ě. lc). Když se interpolovaly data s logaritmickou křivkou v grafu závislosti na dávce, zjistilo se, že terapeutický účinek 9 pg TNF po 14 dnech je stejně malý jako se získal s dávkou 0,6 pg NGR-TNF (zobrazeno na obrázku č. lb). Naopak dávka 8,5 pg byla nezbytná, aby se vyvolal porovnatelný toxický účinek (zobrazeno na obrázku č. Id). Tímto způsobem vypočtený poměr účinnost/toxicita NGR-TNF za daných podmínek je 14 krát vyšší než poměr v případě TNF.
Podobné výsledky se získaly v modelu melanomu B16F1. Léčba jedním mikrogramem NGRTNF v den 11 a 17 vyvolala v den 19 protinádorovou odezvu vyšší než se získala použitím 4 pg TNF a podobnou odezvě vyvolanou 12 pg TNF (data nejsou uvedena). Naopak ztráta tělesné hmotnosti způsobená 1 pg NGR-TNF byla znatelně nižší než ztráta způsobená 4 a 12 pg TNF. Léčba 12 pg NGR-TNF způsobila dokonce silnější protinádorový účinek, zatímco toxický účinek byl podobný účinku získanému aplikací 12 pg TNF.
Když se v den 19 aplikovala třetí imunizace ve všech skupinách se zaznamenalo o 1 až 2 dni později úmrtí některých zvířat (2 zvířata mimo skupinu 5-ti zvířat ošetřené íyziologickým roztokem a 12 pg NGR-TNF a 1 zvíře mimo 5 zvířat ve zbývajících skupinách). Jedno zvíře ošetřené 12 pg NGR-TNF zcela potlačilo vznik nádoru. Když se toto zvíře imunizovalo druhou tumorogenní dávkou buněk B16F1 po 18-ti dnech se vyvinul hmatatelný nádor, zatímco u kontrolních zvířat se nádor vyvinul během 6 až 7 dní.
Tyto výsledky dohromady naznačují, že účinnost NGR-TNF při inhibici růstu nádorů je 10 až 15 vyšší než v případě TNF, zatímco toxicita je podobná. NGR-TNF mohou vyvolat účinnější ochranou imunitní odezvu ve srovnání s TNF.
Příklad 4: Mechanizmus působení NGR-TNF
Monoklonální protilátky proti myšímu CD 13 R3-63 se izolovaly zascitických tekutin chromatografií za použití saferózy s proteinem G (firma Pharmacia-Upjoh, Uppsala, Švédsko) a dialyzovaly se proti 0,9 % chloridu sodnému.
Králičí polyklonální antisérum se získalo z Primm srl (Milan, Itálie) a čistilo se afinitní chromatografií na sefaróze s proteinem A (firma Pharmacia-Upjohm, Uppsala, Švédsko). Peptidy CNGRC a CARAC se připravily způsobem popsaným dříve v textu (popisuje se v publikaci Arap, W., et al, Cancer treatment by targated drug delivary to tumor vasculature in a mouše model. Science 1998: 279: 377-80).
Aby se získaly důkazy, že lepší aktivita NGR-TNF je závislá na cílení nádoru prostřednictvím části NGR, zkoumalo se zda in vivo aktivita NGR-TNF může částečně konkurovat sNCGRC. Myším nesoucím nádor RMAT-T se aplikovalo NGR-TNF (1 pg) smolámím nadbytkem CNGRC nebo bez molámího nadbytku. Paralelně se jiná zvířata ošetřila pomocí TNF (3 nebo 9 pg)opět, kde CNGRC může nebo nemusí být v nadbytku. Jak se očekávalo CNGRC podstatně snižuje proti nádorovou aktivitu NGR-TNF (zobrazeno na obrázku č. 2a). ale nikoli aktivitu TNF (zobrazeno na obrázku č. 2b). Kontrolní peptid (CARAC) nebyl schopen způsobit podstatné snížení aktivity NGR-TNF (zobrazeno na obrázku č. 2c). Tyto výsledky naznačují, že CNGRC soutěží o navázání NGR-TNF na receptor CNGRC a podporuje hypotézu, že mechanizmus cílení zlepšuje aktivitu. Je nutné poznamenat, že CNGRC není schopen snížit cytotoxickou aktivitu NGR-TNF in vitro (data nejsou uvedena).
Protože se publikovalo, že aminopeptidáza N (CD13) je receptor peptidů CNGRC, zkoumala se úloha tohoto receptoru v mechanismu cílení NGR-TNF. Studoval se účinek monoklonálních protilátek proti CD-I3 (R3-63) na proti nádorovou aktivitu NGR-TNF a TNF. Monoklonální protilátky R3-63 podstatně inhibovaly protinádorovou aktivitu NGR-TNF (zobrazeno na obrázku č. 2a), ale nikoli aktivitu TNF (zobrazeno na obrázku) ukazuje, že CD 13 se kritickým způsobem podílí na protinádorové aktivitě NGR-TNF. Za použití analýzy FACS se pozorovala žádná exprese CD 13 na povrchu buněk RMA-T, které se kultivovaly s monoklonálními protilátkami R3-63 (není zobrazeno), což naznačuje, že protilátky rozeznávají jiné buňky in vivo.
Ačkoli tyto data ukazují, že CD13 je důležitý receptor v případě NGR-TNF, můžeme zcela vyloučit, že na mechanizmu cílení se také podílí navázání na jiné ještě neidentifikované receptory, i když v menší míře.
Předchozí experimenty částečně proteolýzy ukázaly, že Arg-Ser vázaný na N-terminální segment TNF (zbytky 2-3) je velmi citlivý na trypsin, zatímco zbytek molekuly je daleko více rezistentní. Aby se získal další důkaz, že zlepšená aktivita NGR-TNF je spojena sjeho částí NGR, z N-terminální oblasti muteinu se odštěpila doména NGR částečným štěpením s imobilizovaným trypsinem. Tato léčba převedla NGR-TNF a NTF na molekulu odpovídající fragmentu TNF3-156 (očekávaná hmotnost je 16 986,2, na obrázku č. 3a je zobrazená hmotnost a očekávané sekvence).
Zatímco štěpení nesnížilo cytolytickou aktivitu NGR-TNF in vitro u buněk L-M +/- 1,4) x 108 u/mg)), jeho protinádorová aktivita in vivo se snížila na hodnotu dosaženou TNF (zobrazeno na obrázku č. 3b). Je nutné zmínit, že toxicita NGR-TNF a TNF byly podobné před a po štěpení, jak se usuzovalo ze ztráty tělesné hmotnosti zvířat jeden den po aplikaci (zobrazeno na obrázku č. 3b, na pravém panelu), což naznačuje, že mechanizmus cílení závislý na NGR nemění toxicitu.
Příklad 5: Příprava a charakterizace lidského TNF a NGR-TNF.
Lidský rekombinantní TNF a NGR-TNF (obsahující lidský TNF1-157 fúzoval sC-koncem CNGRG) se připravily technologií rekombinace DNA a podstatně se čistily, jak se popisuje v případě myšího TNF a NGR-TNF. cDNA kódující lidský NGR-TNF se připravila PCR použitím plazmidů pETllb/hTNF, který obsahuje kódující sekvenci hTNF (popisuje se v publikaci Pennica, D. et al., 1984. Human tumor necrosis factor: precursor, structure, expression and homology to lymphotoxin. Nátuře, 321, 724-729) použitím následujících primerů:
- NGR-hTNF/1 (sense): 5Ά TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCDT TCT CG3'.
- NGR-hTNF/2 (antisense): 5'TGA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAT 3'.
Amplifikovaný fragment se štěpil a klonoval do pET-llB (Ndel/BamHI) a použil se k transformaci buněk mikroorganizmu E. coli BL21 (firma Novagen). Exprese NGR-hTNF se vyvolala isopropyl-3-D-thiogalaktosidem podle instrukcí výrobce pETUB. Rozpustný NGRTNF se získal z kultur o objemu 2 1 sonikací bakterií v 2 mM kyselině ethylendiamintetraoctové, 20 mM Tris-HCl, pH8,0, pak následovala centrifugace (15 000 x g, doba 20 minut, teplota 4 °C).
Extrakt se smíchal se síranem amonným (35 % saturace), nechal se stát po dobu 1 hodiny při teplotě 4 °C a dále se centrifugoval, jak se uvádí shora v textu. Síran amonný v supematantech se pak saturoval ze 65 % a nechal se stát při teplotě 4 °C po dobu 24 hodin a dále se centrifugoval. Každý pelet se rozpustil v 1 M síranu amonném, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a čistil se hydrofobní interakční chromatografií na koloně „Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow“ (od firmy PharmaciaUpjohn), eluce proběhla gradientem, Pufr A: 100 mM fosforečnan sodný, pH8,0 obsahující 1 M síran amonný, pufr B: 70 % ethylenglykol, 5 % metanol, 100 mM fosforečnan sodný, pH 8,0). Frakce obsahující pTHF imunoreaktivní materiál (stanoveno testem ELISA) se spojil, dialyzoval se proti 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 a dále se čistil chromatografií s výměnou iontů na koloně „DEAE-Sepharose Fast Flow (firma Pharmacia-Upjohn) (eluce proběhla gradientem, pufr A: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). Všechny roztoky používané v kroku chromatografíe se připravily se sterilní vodou, která neobsahuje endotoxin (Salf, Bergamo, Itálie).
V tomto případě se z kultur o objemu 2 litry získalo přibližně 30 mg TNF a 32 mg NGR-TNF. Neredukující SDS-PAGE zobrazily pruhy odpovídající monomerům, dimérům a trimérům, které naznačují, že také lidské NGR-TNF je směs trimerů se správnými disulfidy uvnitř řetězce atrimery sjedním nebo více disulfidovými můstky uvnitř řetězce (zobrazeno na obrázku č. 4A, dráha b), jak se pozorovalo u myšího NGR-TNF.
Triméry se správnými disulfidovými můstky uvnitř řetězce se izolovaly z této směsi čtyřstupňovým denaturačním balicím postupem, jehož popis následuje. Čištěný lidský NGR-TNF se denaturoval 7 M močovinou a filtroval se přes kolonu HR Sephacryl S—300 (o objemu 1 025 ml) (firma Pharmacia), která se předem uvedla do rovnováhy 7 M močovinou, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0. Frakce se odpovídající monomerickému TNF se spojily, proběhla ultrafiltrace přes membránu YM MWCO 10 kDa (Amicon) se opětně se sbalily dialýzou proti 33 objemů 2,33 M močoviny, 100 mM Tris-HCl, pH8 při teplotě 4 °C (po dobu 140 minut), pak následuje 1,55 M močovina, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 (po dobu 140 minut). Nakonec se produkt dialyzoval proti 80-ti objemům 100 mM Tris-HCl (po dobu 16 hodin) a pak proběhla centrifugace při 13 000 x g (po dobu 30 minut) a filtrace přes membránu SFCA s velikosti pórů 0,45 pm (firma Nalgene) a dále filtrace na koloně HR Sephacryl S—300 (o objemu 1 020 ml), která se uvedla do rovnováhy 0,15M chloridem sodným, 0,05 M fosforečnanem sodným (PBS). Z9skalo se přibližně 23 mg opětně sbaleného proteinu.
Konečný produkt se ve většině případů po neredukující SDS-PAGE monomer (zobrazeno na obrázku č. 4A, dráha č), který měl hydrodynamický objem podobný objemu trimerového lidského TNF, což se stanovilo analytickou gelovou filtrací na HPCL na koloně Superdex 75 HR (data nejsou zobrazena), a jeho molekulová hmotnost byla 17 937,8 + 1,8 (očekávaná molekulová hmotnost v případě CNGRCG.TNF1-157 je 17 939,4), což se stanovilo elektrosprejovou hmotnostní spektroskopií. Cytolytické aktivity in vitro nesbaleného a sbaleného NGR-TNF v myších buňkách L-M byly (6,11 x 107 + 3,1 jednotky na miligram. Tyto výsledky vyznačují, že proces denaturace-opětné sbalení neovlivňuje interakci lidského NGR-TNF s myším receptorem p55.
Protinádorová aktivita in vivo lidského NGR-TNF v množství 1 pg (nesbalený) byla větší než TNF v množství 10 pg (zobrazeno na obrázku č. 4B), zatímco toxicita, tak se odhaduje na základě ztráty hmotnosti zvířat, byla podstatně nižší (zobrazeno na obrázku ě. 4C). Po opětném sbalení 0,3 pg NGR-TNF bylo podstatné vyvolat protinádorový účinek, který bude silnější než se dosáhne použitím 10 pg TNF (zobrazeno na obrázku č. 4D, 4E).
Tyto výsledky ukazují, že protinádorová aktivita lidského NGR-TNF je větší než se dosáhlo použitím TNF.
Dále se pozorovalo, že opětně sbalený lidský a myší NGR-TNF může vyvolat podstatné protinádorové účinky v případě myší nesoucích RMA-T dokonce ve velmi nízkých dávkách (1 až 10 ng/myš), aniž se prokážou toxické účinky, zatímco TNF nebyl schopen vyvolat podstatné účinky při těchto dávkách (není zobrazeno).
Příklad 6: Příprava a charakterizace myšího NGR-IFNy
Rekombinantní myší interferon (IFN)y fúzovaný s CNGRCG (NGR-IFNy) se připravil technologií rekombinace DNA v podstatě stejným způsobem, jak se popisuje v případě NGR-TNF. Oblast CNGRC se fúzovala sC-koncem IFNy. Cystein v poloze 134 se nahradil serinem.
Methionin se zavedl do polohy -1 za účelem exprese v buňkách E. coli. Primery PCR používané při produkci cDNA RGR-IFNy byly 5'-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C (sense) a 5'-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC. cDNA se klonovala do pET-1 lb (Nde I/BamH I) a používala se k transformování buněk E. coli BL21(DE3) (Novagen). Exprese proteinu se vyvolala isopropyl-P-D-thiogalaktosidem podle instrukcí výrobce plazmidů pETl lb. Produkt se izoloval z extraktů mikroorganizmu E. coli imunoafinitní chromatigrafií za použití monoklonálních protilátek proti myším IFNy (ANI8) imobilizovaných na agaróze za použití standardních metod. Redukční a neredukční SDS-PAGE finálního produktu ukázala jediný pruh o molekulové hmotnosti 16 000. Elektrosprejová hmotnostní spektrometrie ukázala molekulovou hmotnost 16 223 + 3,6 (očekávaná molekulová hmotnost je 1 625,5), což odpovídá myšímu MetIFNy-l 34(C 134S)CNGRC(NGR-IFNy).
Schopnost NGR-IFNy a NGR-TNF soutěžit o navázání protilátek proti CD 13 na cévy spojené s nádorem se zkoumaly použitím imunohistochemického přístupu.
Čerstvé chirurgické preparáty karcinomu buněk lidské ledviny se získaly z katedry histopatologie vědeckého ústavu „San Raffaele H scientific Institute“. Sekce (5 až 6 pg silné) fixované podle postupem podle Bouin (po dobu 4 až 6 hodin) zalité parafinem se připravily a adsorbovaly na sklíčkách potažených polylyzinem. Antigeny CD 13 se detekovaly za použití komplexu avidin-biotin následujícím způsobem: sekce tkání se opětně hydratovaly za použití xylenů a série zesilujících alkoholů za použití standardních postupů. Sekce tkání se umístily do nádoby obsahující 1 mM EDTA a vařily se po dobu 7 minut v mikrovlnné troubě (1 000 W). Nádoba se znovu naplnila 1 mM EDTA a opět se vařila po dobu 5 minut. Sekce tkání se nechaly ležet až se ochladily a inkubovaly se v PBS, který obsahuje 0,3 % peroxidu vodíku po dobu 15 minut. Reakce se zastavila endogenní peroxidázou. Vzorky se pak promyly PBS a inkubovaly se s 100 až 200 pg PGS-BSA (po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti) a pak se nanesly monoklonální protilátky WM15 (anti-hCD13) samotné nebo smíšené s různými kompetenčními činidly (uvedeno v tabulce č. 2) obsaženými v PBS-BSA (nechalo se stát přes noc při teplotě 4 °C). Sklíčka se pak promyla 3 krát (promytí každého sklíčka trvalo 3 minuty) s PBS a inkubovala se s PBS-BSA obsahujícím 2% normální horské sérum (PBS-BSA.NHS) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) po dobu 5 minut. Roztok se pak nahradil 3 μΙ/ml biotinem značeného koňského anti-myšího IgG (H+L) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) v PBS-BSA-NHS a dále se inkuboval po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Sklíčka se opět promyla a inkubovala se po dobu 30 minut s činidlem „Vectastain Elitě Reagent“ (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ředěnéml:100 v PBS. Tabulka 3,3f-diamino-benzidintetrahydrochloridu (Merck, Darmstadt, Německo) se pak rozpustila v 10 ml deionizované vody, která obsahuje 0,03 % peroxidu vodíku. Roztok se filtroval přes membránu s velikostí pórů 0,2 pm a přelila se přes sekce tkáně po dobu 5 až 10 minut. Sklíčka se promyla postupem popsaným shora v testu a k obarvení za účelem počítání se použil Harrisův hematoxylin. Cévy spojené nádorem se identifikovaly obarvením sériových sekcí tkáně s monoklonálními protilátkami proti CD31/monoklonální protilátky JC/70A, proti lidskému CD31, IgG 1, od firmy DAKO, Kodaň, Dánsko).
Výsledky se sumarizovaly do tabulky 2. Jak je zobrazeno, navázání WM15 na cévy spojené s nádorem re inhibovalo nadbytkem NGR-TNF, NGR-IFNy a CNGRC, ale nikoli dalšími kontrolními činidly, které neobsahují motiv NGR. To naznačuje, že vazebné místo NGR na CE13 prostorově přesahuje epitop WM15. Naopak NGR-TNF nebyl schopen soutěžit v navázání 13C03 na epiteliální buňky.
Ukazuje se, že část NGR NGR-IFNy a NGR-TNF může reagovat s formou CD 13 rozeznávanou monoklonálními protilátkami WM15 na cévách spojených s nádorem. Tyto výsledky ukazují, že motiv CNGRC je funkční ať už je spojen s N-koncem nebo C-koncem cytokinů.
Tabulka č. 2: Navázání WM15 buněčné sekce karcinomu ledviny v přítomnosti různých kompetitorů
kompetitor navázáni WM15 na cévy spojené s nádorem
žádný +
NGR-TNF (25 pg/ml) -
NGR-IFNy (50 pg/ml)
CNGRC (100 pg/ml)
TNF (25 pg/ml) lidský sérový albumin (25 +
pg/ml) syntetický CgA(60-68) (100 +
pg/ml) +
a do kroku blokace se přidal kompetitor v PBS obsahující 2% BSA a smíchal se s primární protilátkou.
b monoklonální protilátka WM15 (určená proti lidskému CD13, IgGl) se získala u firmy Pharmingen (San Diego, CA), syntetický peptid CgA (60-68) odpovídá fragmentu 60-68 chromograninu A
Příklad 7: Cílené zavedení biotinem značeného NGR-TNF do nádorů za použití protinádorových protilátek a avidinu (pre-cílení)
Následující příklad zobrazuje možnost „dvojího“ cílení TNF založeného na kombinaci protilátek určených protinádoru a peptidu CNGRC.
Konjugát biotin-NGR-TNF se připravil smícháním NGR-TNF s N-hydroxysulcinimidesterem D-biotinyl-6-aminokapronové kyseliny (Societá Prodotti Antibiotici S.p.A., Milán, Itálie) v 1M pufru uhličitanu sodném s hodnotou pH 6,8 (po dobu 3 hodiny, při teplotě místnosti) (popisuje se v publikaci Corti, A., et al., Tumor targetin with biotinylated tumor necrosis factor alpha: Structure activity relationships and mechanism of action on avidin pretargeted tumor cells. Cancer Res. 1998. 58: 3866-3872). Reakce se blokovala 1M Tris-HCl s hodnotou pH 7,5.
Konjugát se charakterizoval hmotnostní spektrometrií a zjistilo se, že obsahuje jednu molekulu biotinu najeden trimer (v průměru). Myší C57BL6 (Charles River Laboratories, Calco, Itálie se imunizovaly pomocí živých buněk RMA-T v množství 5 χ 104, které se aplikovaly podkožně do levého boku. Když oblast nádoru dosáhla velikosti 40 mm2, myši se ošetřily postupně aplikovanými injekcemi biotinem značených protilátek, avidiny a komplexem biotin-TNF podle třídenního protokolu, jak se popisuje shora v textu v publikaci Gasparri, A. et al., Tumor pretargeting with avidin improves the therapeutic index of botinylated tumor necrosis factor-alpha and the comparison with orthe cytokines: Industion of tumor-specific immunity. J. Immunol. 1987. 138: 4023-32). Injekcí se zavedlo 40 pg monoklonální protilátky 19E12 značené biotinem (i.p., krok
I), 60 pg avidinu a 60 pg streptavicinu po 18 respektive 19 hodinách (i.p., krok II) a o 24 hodin později 3 pg NGR-TNF značeného biotinem. Každá sloučenina se ředila sterilním roztokem 0,9% chloridu sodného. V kontrolním experimentu se vymezoval avidin a streptavidin. Každý experiment se provedl na skupinách myší, kdy každá skupina obsahovala 5 myší. Růst nádoru se zaznamenával denně měřením velikosti nádoru měřítkem. Oblast nádoru ve skupině, které se aplikovalo 19E12-biotin/avidin/streptavidin/biotin-NGR-TNF, před léčbou a deset dní po léčbě byla 39 +/- 4 mm2 respektive 8 +/- 5 mm2 (5 zvířat, průměr +/- standardní odchylka). V kontrolní skupině (ošetřené samotnými monoklonálními protilátkami 19E12-biotin/biotinNGR-TNF) oblasti nádoru před ošetřením a 10 dní po ošetření byly 40 +/- 4 mm2 respektive 20 +/- 6 mm2, což ukazuje, že pre-cílení s protilátkami mířícími k nádoru spolu s avidinem zvýšilo aktivitu NGR-TNF.
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka= „umělá sekvence“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ctggatcctc acagagcaat gactccaaag (2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka^ „umělá sekvence: primer PCR“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
tgcctcacat atgctcagat catcttctc (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 46 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka^ „umělá sekvence“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc 46 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka^ „umělá sekvence: primer PCR“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg 45 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka= „umělá sekvence: primer PCR“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac 3S (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOG1E:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka= „umělá sekvence: primer PCR“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 35 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 58 párů bází (B) TYP: nukleotidová sekvence (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(D) Jiné informace:
/poznámka= „umělá sekvence: primer PCR“/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc Ctttccgctt cttgaggc 58

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konjugační produkt, vyznačující se tím, že vznikl mezi cytokinem vybraným z TNF nebo IFNy a peptidem, obsahujícím motiv NGR.
  2. 2. Konjugační produkt podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že uvedený cytokin je TNFa nebo TNFp.
  3. 3. Konjugační produkt podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený peptid se vybral ze skupiny zahrnující CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cycloCVLNGRMEC, lineární nebo cyklický CNGRC.
  4. 4. Konjugační produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v y z n a č u j í c í se ť í m , že peptidem je lineární nebo cyklický CNGRC a cytokinem je TNF, přičemž aminoterminální konec TNF je vázán na CNGRC přes mezemík G (glycin).
  5. 5. Konjugační produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v y z n a č u j í c í se t í m, že cytokin je derivatizován polyethylenglykolem nebo acylovým zbytkem.
  6. 6. Konjugační produkt podle libovolného z nároků 1 až 5, v y z n a č u j í c í se t í m , že cytokin se derivatizoval polyetylenglykolem nebo acylovým zbytkem.
  7. 7. Konjugační produkt podle libovolného z nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m , že cytokin se dále spojuje s protilátkou řízenou na nádorový antigen nebo s jejím fragmentem, s nádorovým angiogenním markérem nebo komponentem extrabuněčné matrice nebo s biotinem.
  8. 8. Konjugační produkt podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tí m , že cytokin je TNF a je konjugovaný s peptidem, obsahujícím motiv NGR a v jiném případě s protilátkou, jejím fragmentem nebo biotinem na různých podjednotkách.
  9. 9. cDNA kódující cytokin vybraný z THF a IFNgamma nesoucí sekvenci přilehlou k 5' a 3' konci a kódující peptid, obsahující motiv NGR.
  10. 10. cDNA podle nároku 9, vy zn ač uj íc í se t í m, že uvedený peptid, obsahující motiv NGR je peptid podle nároku 3.
  11. 11. cDNA podle nároku 10, vyznač u j ící se t ím, že peptidem je lineární nebo cyklický CNGRC a cytokinem je TNF, přičemž amino-zakončení TNF je vázáno na CNGRC přes mezemík G (plycin).
  12. 12. Vektor vhodný pro genovou terapii obsahující cDNA podle nároků 9 až 11.
  13. 13. Farmaceutický prostředek, v y z n a č uj í c í se t í m, že obsahuje účinné množství konjugačního produktu podle nároků 1 až 8, cDNA podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11 nebo vektor podle nároku 12 spolu s farmaceuticky přijatelnými nosiči a pomocnými látkami.
  14. 14. Prostředek podle nároku 13, vy z n a č uj í c í se tím, že je ve formě roztoku nebo suspenze, které je možné aplikovat injekcí, nebo tekutiny, kteráje vhodná pro infúze.
  15. 15. Prostředek podle nároků 13 až 14, v y z n a č u j í c í se t í m , že je ve formě Iipozomů.
  16. 16. Použití konjugačního produktu podle nároků 1 až 8 nebo cDNA podle nároků 9 až 11, vektoru podle nároku 12 nebo prostředku podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15 při přípravě léčebných nebo diagnostických prostředků vhodných pro terapii zhoubného bujení.
  17. 17. Použití konjugačního produktu podle nároku 16 v kombinaci s jinými protinádorovými činidly nebo diagnostickými látkami, které umožňují zobrazení nádoru.
CZ20023093A 2000-02-15 2001-02-13 Konjugacní produkt, jeho použití, cDNA kódující cytokin a farmaceutický prostredek CZ299486B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2000MI000249A IT1317835B1 (it) 2000-02-15 2000-02-15 Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20023093A3 CZ20023093A3 (cs) 2003-02-12
CZ299486B6 true CZ299486B6 (cs) 2008-08-13

Family

ID=11444017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023093A CZ299486B6 (cs) 2000-02-15 2001-02-13 Konjugacní produkt, jeho použití, cDNA kódující cytokin a farmaceutický prostredek

Country Status (29)

Country Link
US (4) US7150869B2 (cs)
EP (2) EP1255845B1 (cs)
JP (1) JP4836384B2 (cs)
KR (1) KR100888761B1 (cs)
CN (2) CN1446261B (cs)
AT (1) ATE424461T1 (cs)
AU (1) AU784173C (cs)
BG (1) BG65931B1 (cs)
BR (1) BR0108391A (cs)
CA (1) CA2399986C (cs)
CY (1) CY1109034T1 (cs)
CZ (1) CZ299486B6 (cs)
DE (1) DE60137835D1 (cs)
DK (1) DK1255845T3 (cs)
EA (1) EA007838B1 (cs)
ES (1) ES2322234T3 (cs)
HK (1) HK1048649B (cs)
HU (1) HU227894B1 (cs)
IL (2) IL150984A0 (cs)
IT (1) IT1317835B1 (cs)
MX (1) MXPA02007899A (cs)
NO (1) NO330913B1 (cs)
PL (1) PL207263B1 (cs)
PT (1) PT1255845E (cs)
SI (1) SI1255845T1 (cs)
SK (1) SK287550B6 (cs)
UA (1) UA85365C2 (cs)
WO (1) WO2001061017A2 (cs)
ZA (1) ZA200206450B (cs)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
US7309694B2 (en) 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
ATE333900T1 (de) 2000-02-24 2006-08-15 Philogen Spa Zusamensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen
AU2006200762B2 (en) * 2000-02-24 2008-08-21 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
JP4490104B2 (ja) 2002-02-06 2010-06-23 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 脱髄性疾患における腫瘍壊死因子とインターフェロンの組み合わせ
EP1346729A1 (en) * 2002-03-19 2003-09-24 Cardiovascular Research Institute Maastricht Targeting of myocardial angiogenesis through CD13/APN
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US20050009740A1 (en) * 2003-03-31 2005-01-13 Greenville Hospital System Anti-tumor vasculature effects of human serum albumin derivatives
GB0312309D0 (en) * 2003-05-29 2003-07-02 Gaslini Children S Hospital G Targeted liposome
WO2006067633A2 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Molmed Spa Conjugation product
US7625555B2 (en) * 2007-06-18 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human interferon-like proteins
GB0803076D0 (en) * 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
SI2285416T1 (sl) * 2008-05-13 2012-10-30 Molmed Spa Konjugati za zdravljenje mezotelioma
CN108314741B (zh) * 2018-03-22 2021-08-03 中国人民解放军第四军医大学 一种肿瘤血管靶向抗癌肽nkl-dota及其制备方法
WO2020109625A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Fondazione Centro San Raffaele Combined treatment of primary central nervous system lymphoma
EP3882257A1 (en) 2020-03-20 2021-09-22 Ospedale San Raffaele S.r.l. Ngr conjugates and uses thereof
US20250215411A1 (en) 2022-03-09 2025-07-03 Ospedale San Raffaele Srl Fusion proteins and uses thereof
EP4647081A1 (en) 2024-05-07 2025-11-12 Hiroshi Arakawa Cell surface ig-aimed immune memory erasers and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010795A2 (en) * 1996-09-10 1998-03-19 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
WO1999013329A1 (en) * 1997-09-10 1999-03-18 The Burnham Institute Methods of identifying molecules that home to angiogenic vasculature in tumors

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3423234A1 (de) * 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4650674A (en) * 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4863713A (en) 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5091176A (en) 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
IT1245748B (it) 1990-12-21 1994-10-14 Mini Ricerca Scient Tecnolog Preparazione includente anticorpi monoclonali biotinilati, avidina e biotina, per la diagnosi di affezioni tumorali e suo impiego
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5811512A (en) 1991-08-22 1998-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-peptide peptidomimetics and related cyclic hexapeptides
US5258517A (en) 1992-08-06 1993-11-02 Sepracor, Inc. Method of preparing optically pure precursors of paroxetine
EP1346730A1 (en) 1993-12-07 2003-09-24 Neorx Corporation Pretargeting methods and novel pretargeting conjugates
US5888814A (en) 1994-06-06 1999-03-30 Chiron Corporation Recombinant host cells encoding TNF proteins
US5811388A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Cibus Pharmaceutical, Inc. Delivery of drugs to the lower GI tract
US5891418A (en) 1995-06-07 1999-04-06 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications
US6576239B1 (en) * 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
IT1317835B1 (it) 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010795A2 (en) * 1996-09-10 1998-03-19 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
WO1999013329A1 (en) * 1997-09-10 1999-03-18 The Burnham Institute Methods of identifying molecules that home to angiogenic vasculature in tumors

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Corti A. et al.: "Tumor Targeting with Biotinylated Tumor Necrosis Factor a: Structure-Activity Relationships and Mechanism of Action on Avidin Pretargeted Tumor Cells", Cancer Research 58, 3866-3872, 1998 *
Gasparri A. et al.: "Tumor Pretargeting with Avidin Improves the Therapeutic Index of Biotinylated Tumor Necrosis Factor a in Mouse Models", Cancer Res. 59, 2917-2923, 1999 *
Pasqualini R. et al.: "Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis", CANCER RESEARCH, 60(3), 722-727, 2000 *
Yang J. et al.: "A genetically engineered single-chain FV/TNF molecule possesses the anti-tumor immunoreactivity of FV as well as the cytotoxic activity of tumor necrosis factor", Mol. Immunol., 32(12):873-81, 1995 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2399986A1 (en) 2001-08-23
EA007838B1 (ru) 2007-02-27
US7150869B2 (en) 2006-12-19
IL150984A0 (en) 2003-02-12
AU4413501A (en) 2001-08-27
KR100888761B1 (ko) 2009-03-17
SK287550B6 (sk) 2011-01-04
KR20020089348A (ko) 2002-11-29
US20030157055A1 (en) 2003-08-21
WO2001061017A2 (en) 2001-08-23
EP1255845A2 (en) 2002-11-13
EP2080804A1 (en) 2009-07-22
HUP0300005A2 (hu) 2003-04-28
DK1255845T3 (da) 2009-06-22
DE60137835D1 (de) 2009-04-16
PL362670A1 (en) 2004-11-02
BG65931B1 (bg) 2010-05-31
ITMI20000249A0 (it) 2000-02-15
NO20023833D0 (no) 2002-08-13
US7622556B2 (en) 2009-11-24
MXPA02007899A (es) 2004-09-10
UA85365C2 (ru) 2009-01-26
NO330913B1 (no) 2011-08-15
CY1109034T1 (el) 2014-07-02
CN1446261B (zh) 2010-05-05
HUP0300005A3 (en) 2005-09-28
CN1853730B (zh) 2013-07-24
IL150984A (en) 2011-04-28
NO20023833L (no) 2002-10-15
EA200200808A1 (ru) 2003-02-27
BG106999A (bg) 2003-04-30
CN1446261A (zh) 2003-10-01
PL207263B1 (pl) 2010-11-30
US20070041939A1 (en) 2007-02-22
US7476721B2 (en) 2009-01-13
JP4836384B2 (ja) 2011-12-14
PT1255845E (pt) 2009-04-09
ITMI20000249A1 (it) 2001-08-15
HU227894B1 (en) 2012-05-29
IT1317835B1 (it) 2003-07-15
AU784173C (en) 2006-09-07
SK11512002A3 (sk) 2003-02-04
AU784173B2 (en) 2006-02-16
US20050265965A1 (en) 2005-12-01
HK1048649A1 (en) 2003-04-11
ES2322234T3 (es) 2009-06-18
WO2001061017A3 (en) 2002-01-31
HK1048649B (en) 2009-08-14
CA2399986C (en) 2012-10-02
CZ20023093A3 (cs) 2003-02-12
US20100196458A1 (en) 2010-08-05
ATE424461T1 (de) 2009-03-15
CN1853730A (zh) 2006-11-01
SI1255845T1 (sl) 2009-08-31
JP2004520801A (ja) 2004-07-15
BR0108391A (pt) 2003-03-11
EP1255845B1 (en) 2009-03-04
ZA200206450B (en) 2003-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100196458A1 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy
US7622105B2 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy
US7309694B2 (en) Modified cytokines for use in cancer therapy

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20190213