PT1255845E - Citocinas modificadas para utilização na terapia do cancro - Google Patents

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DESCRIÇÃO "CITOCINAS MODIFICADAS PARA UTILIZAÇÃO NA TERAPIA DO CANCRO" A presente invenção refere-se a citocinas modificadas para utilização no tratamento do cancro. De um modo mais particular, a invenção refere-se a derivados de citocinas capazes de "alcançar" vasos tumorais e células apresentadoras de antigénios. A actividade antitumoral de algumas citocinas é bem conhecida e descrita. Algumas citocinas já foram terapeuticamente utilizadas, também, em humanos (29). Por exemplo, citocinas, tais como a interleucina 2 (IL-2) e o interferão α (IFNa), mostraram actividade antitumoral positiva em doentes com diferentes tipos de tumores, tais como carcinoma metastático do rim, leucemia de tricoleucócitos, sarcoma de Kaposi, melanoma, mieloma múltiplo e semelhantes. Outras citocinas como ο ΙΕΝβ, o Factor de Necrose Tumoral (TNF) a, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 e os Factores Estimuladores de Colónias (CFS) mostraram uma certa actividade antitumoral em alguns tipos de tumores e, por conseguinte, são objecto de estudos adicionais.

Em geral, a utilização terapêutica de citocinas está fortemente limitada pela sua toxicidade sistémica. 0 TNF, por exemplo, foi originariamente descoberto pela sua capacidade de induzir a necrose hemorrágica de alguns tumores (1) e pelo seu efeito citotóxico in vitro em diferentes linhas tumorais (2) mas, subsequentemente, provou ter forte actividade 1 pró-inflamatória que pode, no caso de condições de sobreprodução, afectar perigosamente o corpo humano (3).

Como a toxicidade sistémica é um problema fundamental com a utilização de quantidades farmacologicamente activas de citocinas em humanos, estão agora em avaliação novos derivados e estratégias terapêuticas, com vista à redução dos efeitos tóxicos desta classe de efectores biológicos mantendo, simultaneamente, a sua eficácia terapêutica.

Algumas abordagens novas são dirigidas: a) ao desenvolvimento de proteínas de fusão que possam distribuir o TNF em direcção ao interior do tumor e aumentar a concentração local. Por exemplo, foram produzidas as proteínas de fusão consistindo em TNF e anticorpos específicos de tumor (4); b) ao desenvolvimento de mutantes de TNF que mantenham a actividade antitumoral e tenham uma reduzida toxicidade sistémica. Consequentemente, foram já preparados mutantes capazes de reconhecerem selectivamente apenas um receptor (p55 ou p75) (5) ; c) à utilização de anticorpos anti-TNF capazes de reduzirem alguns efeitos tóxicos de TNF sem comprometerem a sua actividade antitumoral. Tais anticorpos já foram descritos na literatura (30); d) à utilização de derivados de TNF com uma meia-vida superior (por exemplo TNF conjugado com polietilenoglicol). 2

Foi recentemente referida a preparação de derivados de TNF capazes de visarem selectivamente os sítios tumorais. Por exemplo, foi descrita uma proteína de fusão, obtida por fusão do gene da cadeia pesada de um mAb receptor de anti-transferrina e o gene de TNF (4) ou uma proteína de fusão de TNF com a região de "articulação" de um anticorpo monoclonal contra o antigénio TAG72 associado ao tumor (6), ou uma proteína de fusão Fv-TNF (6) . 0 documento EP 251494 divulga um sistema para administrar um agente de diagnóstico ou terapêutico que compreende: um anticorpo conjugado com avidina ou estreptavidina, um agente capaz de complexar o anticorpo conjugado e um composto consistindo no agente de diagnóstico ou terapêutico conjugado com biotina, que são administrados sequencialmente e adequadamente retardados, de modo a permitir a localização do agente terapêutico ou de diagnóstico por meio da interacção biotina-estreptavidina na célula alvo reconhecida pelo anticorpo. Os agentes terapêuticos ou de diagnóstico descritos compreendem quelatos metálicos, em particular quelatos de radionuclidos e agentes antitumorais de baixo peso molecular, tais como cis-platina, doxorrubicina, etc. 0 documento EP 496074 divulga um método que proporciona a administração sequencial de um anticorpo biotinilado, avidina ou estreptavidina e um agente de diagnóstico ou terapêutico biotinilado. Embora agentes citotóxicos, como a ricina, sejam genericamente mencionados, é maioritariamente divulgada a aplicação relativa a compostos marcados radioactivamente. O documento WO 95/15979 divulga um método para localizar agentes altamente tóxicos em alvos celulares, baseado na 3 administração de um primeiro conjugado compreendendo a molécula alvo especifica conjugada com um ligando ou um anti-ligando, seguido pela administração de um segundo conjugado consistindo no agente tóxico ligado a um anti-ligando ou ao ligando.

Os documentos WO 99/13329 e WO 98/10795 divulgam um método para o direccionamento de uma molécula para vasos angiogénicos tumorais, baseado na conjugação da referida molécula com ligandos de receptores de NGR. Foi sugerido um certo número de moléculas como possíveis candidatos, mas apenas a doxorrubicina é descrita especificamente. Não é divulgada qualquer utilização de ligandos de receptores de NGR como veículos de citocinas para a indução de respostas imunitárias.

Foi agora surpreendentemente verificado que o índice terapêutico de certas citocinas pode ser notavelmente melhorado e as suas propriedades imunoterapêuticas podem ser melhoradas por conjugação com um ligando do receptor aminopeptidase-N (CD13) . 0 CD13 é uma glicoproteína transmembranar de 150 kDa altamente conservada em diversas espécies. É expressa em células normais, assim como em linhas tumorais mielóides, no endotélio angiogénico e em alguns epitélios. O receptor CD13 é usualmente identificado como receptor "NGR", na medida em que os seus ligandos peptídicos partilham o motivo aminoacídico "NGR".

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção proporciona um produto de conjugação de uma citocina seleccionada a partir de TNF e IFNy e um péptido contendo o motivo NGR, em que o referido péptido é um ligando do receptor CD13. O péptido é, de um modo preferido, um péptido linear ou cíclico compreendendo o motivo NGR, tal como CNGRCVSGCAGRC, 4 NGRAHA, GNGRG, ciclo-CVLNGRMEC ou ciclo-CNGRC, ou, de um modo mais preferido, o péptido CNGRC. 0 péptido pode ser conjugado directamente à citocina, ou indirectamente por meio de um espaçador, que pode ser um único aminoácido, uma sequência de aminoácidos ou um resíduo orgânico, tal como o 6-aminocapril-N-hidroxisuccinimida. Os processos de conjugação são conhecidos dos especialistas na técnica e compreendem técnicas de engenharia genética ou de síntese química.

De um modo preferido, o ligando peptídico é ligado à extremidade N da citocina minimizando, deste modo, qualquer interferência na ligação da citocina modificada ao seu receptor. Alternativamente, o péptido pode ser ligado a resíduos de aminoácidos que sejam aceitadores de ligações amido ou carboxílicas, de ocorrência natural na molécula ou artificialmente inseridos com técnicas de engenharia genética. A citocina modificada é preparada, de um modo preferido, por utilização de um ADNc compreendendo uma sequência contígua 5' codificando o péptido.

De acordo com uma forma de realização preferida, é proporcionado um produto de conjugação entre o TNF e a sequência CNGRC. De um modo mais preferido, a extremidade amino de TNF é ligada ao péptido CNGRC por meio do espaçador G (glicina). 0 produto resultante (NGR-TNF) provou ser mais activo do que o TNF em modelos animais de linfoma RMA-T. Além disso, os animais tratados com NGR-TNF foram capazes de rejeitar doses tumorigénicas adicionais de células RMA-T ou RMA. 0 aumento na actividade antitumoral, em comparação com TNF normal, pôde ser observado em animais imunocompetentes mas não em animais imunodeficientes. Isto indica que o aumento na actividade 5 antitumoral de TNF conjugado com péptidos "NGR" se deve a uma resposta imunitária melhorada e não a uma actividade citotóxica directa do conjugado.

Foi, também, demonstrado gue os efeitos imunitários in vivo induzidos por NGR-TNF estão directamente relacionados com o receptor CD13. Foi, por exemplo, observado que o anticorpo contra o receptor CD13, assim como o ligando GNGRC, competem com o NGR-TNF in vivo, sugerindo, deste modo, um mecanismo de direccionamento de receptor por NGR-TNF. 0 índice terapêutico dos conjugados TNF/ligando CD13 pode ser adicionalmente melhorado por utilização de uma forma mutante de TNF capaz de se ligar selectivamente a um dos dois receptores de TNF, p75TNFR e p55TNFR. 0 referido mutante de TNF pode ser obtido por mutagénese dirigida pontual (5; 7). A farmacocinética das citocinas modificadas de acordo com a invenção pode ser melhorada por preparação de derivados de polietilenoglicol, o que permite prolongar a meia-vida plasmática das próprias citocinas.

Um forma de realização adicional da invenção é proporcionada por derivados bifuncionais nos quais as citocinas modificadas com o ligando CD13 são conjugadas com anticorpos, ou seus fragmentos, contra antigénios tumorais ou outros marcadores angiogénicos tumorais, e. g., integrinas αν, metaloproteases ou o factor de crescimento vascular, ou anticorpos ou fragmentos destes dirigidos contra componentes da matriz extracelular, tais como anticorpos anti-tenascina ou domínio EDB anti-fibronectina. A preparação de um produto de fusão entre TNF e a região de articulação de um mAb contra o antigénio TAG72 associado ao 6 tumor expresso por adenocarcinoma gástrico e do ovário foi recentemente referida (6).

Uma forma de realização adicional da invenção é proporcionada pelo pré-direccionamento tumoral com o sistema biotina/avidina. De acordo com esta abordagem, é obtido um complexo ternário no sitio antigénico tumoral, em diferentes fases, que é formado por 1) mAb biotinilado, 2) avidina (ou estreptavidina) e 3) citocina bivalente modificada com o ligando CD13 e biotina. Um certo número de artigos provou que a abordagem de pré-direccionamento, comparada com o direccionamento convencional com imunoconjugados, pode aumentar efectivamente, a razão molécula activa chegada ao alvo/molécula activa livre, reduzindo, deste modo, a toxicidade do tratamento (11, 10, 9, 8). Esta abordagem produziu resultados favoráveis com TNF biotinilado, o qual foi capaz de induzir citotoxicidade in vitro e diminuir o crescimento das células tumorais em

condições nas quais o TNF normal era inactivo (14, 26). A abordagem de pré-direccionamento pode ser, também, efectuada com um processo de duas fases utilizando um anticorpo bioespecifico que se ligue, simultaneamente, ao antigénio tumoral e à citocina modificada. A utilização de um anticorpo bioespecifico dirigido contra um antigénio carcinoembrionário e TNF foi recentemente descrita como um meio para o pré-direccionamento tumoral de TNF (31) .

De acordo com uma forma de realização adicional, a invenção compreende uma molécula de TNF conjugada tanto a um péptido contendo um motivo NGR como a um anticorpo, ou um seu fragmento (directamente ou indirectamente por meio de uma ponte biotina- avidina) , em diferentes subunidades de TNF, onde o anticorpo ou os seus fragmentos são dirigidos contra um antigénio expresso em 7 células tumorais ou outros componentes do estroma tumoral, e. g., tenascina e domínio EDB de fibronectina. Isto resulta num melhoramento adicional das propriedades de alcance tumoral da citocina modificada e na libertação lenta desta última no microambiente tumoral por meio de transições trímero-monómero-trímero. Como mostrado em trabalhos anteriores, de facto, as subunidades modificadas de conjugados de TNF podem dissociar-se dos complexos de direccionamento e reassociar-se de modo a formarem moléculas de TNF triméricas não modificadas que se difundem, depois, no microambiente tumoral. Demonstrou-se que a libertação de TNF bioactivo ocorre no espaço de 24-48 horas após o direccionamento (21).

Para utilização em terapia, as citocinas modificadas da invenção irão ser adequadamente formuladas em preparações farmacêuticas para a administração oral ou parentérica. São preferidas as formulações para a administração parentérica e estas compreendem soluções ou suspensões injectáveis e líquidos para infusões. Para a preparação das formas parentéricas, uma quantidade eficaz do ingrediente activo irá ser dissolvida ou suspensa num veículo esterilizado, adicionando, opcionalmente, excipientes, tais como solubilizantes, agentes de isotonicidade, conservantes, estabilizantes, emulsionantes ou agentes dispersantes e irá ser, subsequentemente, distribuída em frasquinhos de vidro selados ou ampolas. A preparação de citocinas na forma de lipossomas pode melhorar a sua actividade biológica. Foi, de facto, observado que a acilação dos grupos amino de TNF induz um aumento na sua hidrofobicidade sem perda de actividade biológica in vitro. Além disso, foi referido que o TNF ligado a lípidos tem 8 citotoxicidade nao afectada in vitro, efeitos imunomoduladores e toxicidade reduzida in vivo (12, 13) . A dose máxima tolerada de bólus de TNF em humanos é de 218-410 pg/m2 (32), cerca de 10 vezes inferior à dose eficaz em animais. Com base em dados de modelos murinos pensa-se que é necessária uma dose, pelo menos, 10 vezes superior para alcançar efeitos antitumorais em seres humanos (15). No primeiro estudo clínico sobre perfusão hipertérmica de membro isolado foram obtidas elevadas taxas de resposta com a dose única de 4 mg de TNF, em combinação com melfalano e interferão γ (16). Outros trabalhos mostraram que o interferão γ pode ser omitido e que até, mesmo, doses inferiores de TNF podem ser suficientes para induzir uma resposta terapêutica (17, 18). Visto que as duas citocinas exercem efeitos sinérgicos em células endoteliais, é provável que o seu direccionamento combinado e selectivo resulte em actividade antitumoral mais forte, permitindo, deste modo, superar os problemas da toxicidade sistémica usualmente encontrada na terapia do cancro com as mesmas citocinas utilizadas em combinação. Além disso, sabe-se que o TNF pode diminuir a função de barreira dos vasos de revestimento endotelial, aumentando, deste modo, a sua permeabilidade às macromoléculas. Tirando partido da toxicidade inferior do tratamento com as moléculas de TNF modificadas de acordo com a invenção e das suas propriedades de alcance de vasos tumorais, uma aplicação alternativa é a sua utilização para aumentar a permeabilidade de vasos tumorais para outro composto, para fins terapêuticos ou de diagnóstico. Por exemplo, o TNF modificado pode ser utilizado para aumentar a absorção tumoral de anticorpos ou hormonas marcados radioactivamente (compostos de imagiologia tumoral) em radioimunocintigrafia ou radioimunoterapia de tumores. Alternativamente, a absorção de 9 fármacos quimioterapêuticos, transportando fármacos ou genes lipossomas ou outros fármacos imunotoxinas, anticancerígenos também poderia ser aumentada, de modo que os seus efeitos antitumorais sejam melhorados.

Consequentemente, as citocinas da invenção podem ser utilizadas em preparações combinadas, separadas ou sequenciais, também com outras substâncias de diagnóstico ou terapêuticas, no tratamento ou no diagnóstico do cancro.

Um aspecto final da invenção refere-se ao ADNc codificando para as citocinas conjugadas aqui divulgadas, as quais podem ser preparadas a partir dos ADNc das citocinas por adição de uma sequência de ADN contígua 5' ou 3', codificando para o péptido contendo o motivo NGR, de um modo preferido para os péptidos de alcance descritos anteriormente. 0 ADNc combinado pode ser utilizado, enquanto tal, ou após inserção em vectores para terapia génica. A preparação e aplicações terapêuticas de vectores adequados são divulgadas em (19), que é por este meio, incorporado por referência.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Efeito de TNF e NGR-TNF no crescimento de linfomas RMA-T (a e b) e no peso de animal (c e d). 5 Animais/grupo foram tratados com uma dose única de TNF ou NGR-TNF (i.p.), 10 dias após a implantação tumoral. Os valores de área de tumor no dia 14 em função da dose (b) e a perda de peso após tratamento (média dos dias 11 e 12) (d) foram interpolados a partir de curvas logarítmicas. Os 10 efeitos antitumorais induzidos por 1 pg ou 9 pg de NGR-TNF no dia 14 foram superiores aos induzidos por quantidades comparáveis de respectivamente), tratamentos foi extrapoladas de comparáveis. TNF (P = 0,024 e P 0,032, enquanto a perda de peso após estes semelhante. As setas indicam doses TNF e NGR-TNF que induzem efeitos

Figura 2: Efeito de mAb R3-63 e CNGRC na actividade antitumoral de NGR-TNF (a) e TNF (b). O mAb R3-63 ou CNGRC foram misturados com NGR-TNF ou TNF e administrados a animais transportando o tumor RMA-T, 12 dias após a implantação tumoral (n = 5 animais/grupo) . Numa experiência separada (c) TNF e NGR-TNF foram co-administrados com CNGRC ou CARAC (um péptido de controlo) a animais transportando tumores de 11 dias de idade (n = 5) . O efeito antitumoral de 1 pg de NGR-TNF foi mais forte do que o de 9 pg de TNF (P = 0,009, teste t no dia 20) e foi significativamente inibido por CNGRC (P = 0,035) e por mAb R3-63 (P = 0,011).

Figura 3: Efeito de digestão triptica limitada de NGR-TNF e TNF na sua massa (a) e actividade antitumoral (b). A tripsina-agarose foi preparada por conjugação de 1 mg de tripsina a 1 mL de Activated CH Sepharose (Pharmacia-Upjohn), de acordo com as instruções do fabricante. O NGR-TNF e TNF (170 pg cada em 300 pL de cloreto de sódio a 0,15 M, fosfato de sódio a 0,05 M, pH 7,3) foram misturados com 15 pL de suspensão de resina (1:4) ou apenas tampão e a 37 rodados, pelas extremidades, a 37 °C durante o tempo 11 indicado. Os quatro produtos foram filtrados através de um dispositivo de 0,22 pm Spin-X (Costar, Cambridge, MA) e armazenados a -20 °C até à sua utilização, (a) Análise de espectrometria de massa de electrospray. Os valores de massa molecular e os produtos correspondentes (sequências N-terminais) são indicados em cada pico. As setas nas sequências indicam o sitio de clivagem, (b) Efeito de 1 ou 3 pg de NGR-TNF e TNF, incubados sem (painéis superiores) ou com (painéis inferiores) tripsina, no crescimento de tumores RMA-T e peso de animal (médialSE de grupos tratados com doses de 1 e 3 pg) . Os animais foram tratados 13 dias após implantação tumoral (n = 5 animais/grupo).

Figura 4: SDS-PAGE e actividade antitumoral de NGR-TNF humano antes e após desnaturação/re-enrolamento. SDS-PAGE sob condições não redutoras (A) de TNF humano (a), NGR-TNF antes (b) e após (c) o processo de desnaturação/re-enrolamento descrito no Exemplo V.

Efeito de TNF e NGR-TNF não re-enrolado no crescimento de linfomas RMA-T (B) e no peso corporal (C) . Efeito de TNF humano (D) e NGR-TNF re-enrolado (consistindo em >95% de trimeros com dissulfuretos intra-cadeia) (E) no crescimento tumoral. Os animais (15 ou 5 murganhos/grupo como indicado em cada painel) foram tratados com uma dose i.p. de TNF ou NGR-TNF, 10 dias após a implantação tumoral.

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a invenção. 12

Exemplo I

Preparação de TNF e NGR-TNF murinos

Os TNF e Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF) recombinantes murinos foram produzidos por expressão citoplasmática de ADNc em E. coli. 0 ADNc codificando para Met-TNFi-156 murino (20) foi preparado por reacção de polimerização em cadeia de transcritase reversa (RT-PCR) em ARNm isolado a partir de células de macrófagos monocitários RAW-264.7 murinos estimulados por lipopolissacarideos, utilizando 5'-C T GGAT CC T CACAGAGCAATGAC TCCAAAG-3' e 5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3' como iniciadores 3' e 5'. 0 fragmento amplificado foi digerido com NdeI e BamEI (New England Biolabs, Beverley, MA) e clonado em pET-llb (Novagen, Madison, WI), anteriormente digerido com as mesmas enzimas (pTNF). O ADNc codificando para Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNFi_i56 foi amplificado por PCR em pTNF, utilizando 5'-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' como iniciador 5' e o iniciador 3' anterior. O fragmento amplificado foi digerido e clonado em pET-llb como descrito anteriormente e utilizado para transformar células BL21(DE3) de E. coli (Novagen). A expressão de TNF e NGR-TNF foi induzida com isopropil-p-D-tiogalactosideo, de acordo com as instruções do fabricante de pETllb. Os TNF e NGR-TNF solúveis foram recuperados a partir de culturas de dois litros por sonicação bacteriana em ácido etilenodiaminotetracético a 2 mM, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0, seguida de centrifugação (15000 x g, 20 min, 4 °C). Ambos os extractos foram misturados com sulfato de amónio 13 e (25% de saturação) , deixados durante 1 h a 4 °C, adicionalmente centrifugados, como anteriormente. 0 sulfato de amónio nos sobrenadantes foi, depois, ajustado para 65% de saturação, deixado a 4 °C durante 24 h e adicionalmente centrifugado. Cada sedimento foi dissolvido em 200 mL de sulfato de amónio a 1 M, Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, e purificado por cromatografia de interacção hidrófoba em Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (gradiente de eluição, tampão A: fosfato de sódio a 50 mM, pH 8,0, contendo sulfato de amónio a 1 M; tampão B: glicerol a 20%, metanol a 5%, fosfato de sódio a 50 mM, pH 8,0). As fracções contendo material imunorreactivo TNF (por transferência Western) foram agregadas, dialisadas contra ácido etilenodiaminotetracético a 2 mM, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0 e adicionalmente purificadas por cromatografia de permuta iónica em DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (gradiente de eluição, tampão A: Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0; tampão B: cloreto de sódio a 1 M, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0) . As fracções contendo imunorreactividade de TNF foram agregadas e purificadas por cromatografia de filtração em gel em Sephacryl-S-150 HR (Pharmacia-Upjohn), pré-equilibradas e eluidas com cloreto de sódio a 150 mM, tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH 7,3 (PBS) . As fracções correspondendo a produtos de 40000-50000 Mr foram agregadas, aliquotadas e armazenadas congeladas a -20 °C.

Todas as soluções empregadas nas etapas cromatográficas foram preparadas com água esterilizada e livre de endotoxinas (Salf, Bergamo, Itália) . Os rendimentos finais foram de 45 mg de TNF e 34,5 mg de NGR-TNF. 0 peso molecular de TNF e NGR-TNF purificados foi medido por espectrometria de massa de electrospray. O teor de proteína foi medido utilizando um kit de ensaio de proteína comercial

(Pierce, Rockford, IL) . O teor de endotoxina de NGR-TNF e TNF 14 foi de 0,75 unidades/yg e 1,38 unidades/yg, respectivamente, como medido pelo teste cromogénico quantitativo Lymulus Amoebocyte Lysate (LAL) (BioWhittaker). A electroforese em gel de dodecilssulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e a análise de transferência Western foram efectuadas utilizando géis de poliacrilamida de 12,5 ou 15% por processos padrão.

Uma pequena quantidade de TNF e NGR-TNF foi adicionalmente purificada por cromatografia de afinidade no receptor solúvel p55-TNF (sTNF-Rl)-Sepharose, como se segue: 5 mg de sTNF-Rl recombinante foram preparados como descrito (22) e conjugados a 2 mL de Activated-CH-Sepharose (Pharmacia), de acordo com as instruções do fabricante. Duas colunas separadas (um mL cada) foram lavadas extensivamente com soluções esterilizadas e livres de endotoxinas, carregadas com TNF ou NGR-TNF purificados em PBS e desorvidos por eluição de gradiente (1 h, tampão A: PBS; tampão B: cloreto de sódio a 0,5 M, glicina-HCl a 0,2 M) . As fracções contendo TNF-antigénio foram neutralizadas e dialisadas contra solução fisiológica esterilizada. Albumina sérica humana livre de endotoxinas foi adicionada antes da diálise (0,5 mg/mL) de modo a prevenir a adsorção de proteína nas membranas. O teor de TNF em cada fracção foi medido por ELISA e ensaio citolítico. O SDS-PAGE não redutor de TNF mostrou uma única banda de 17-18 kDa, como esperado para o TNF monomérico (não mostrado) . Pelo contrário, o SDS-PAGE não redutor e a análise de transferência Western de NGR-TNF mostraram diferentes formas imunorreactivas de 18, 36 e 50 kDa correspondendo, provavelmente, a monómeros, dímeros e trímeros. Sob condições redutoras, a maior parte das bandas de 50 e 36 kDa foram 15 convertidas na forma de 18 kDa, apontando para a presença de moléculas de NGR-TNF com pontes dissulfureto intercadeia. A banda de 18 kDa contribuiu para cerca de 2/3 do material total, ao passo que a de 36 kDa contribuiu para a maioria da parte restante. Estes padrões electroforéticos sugerem que o NGR-TNF era uma mistura de trímeros composta por três subunidades monoméricas com dissulfuretos intra-cadeia correctos (pelo menos 50%) e a parte restante maioritariamente por trímeros com um ou mais dissulfuretos intercadeia. A banda de 36 kDa observada ainda por SDS-PAGE redutor sugere que o NGR-TNF continha, também, um dímero desnaturado irreversível (cerca de 10% do total) . A massa molecular dos monómeros de TNF e NGR-TNF era de 17386,1+2,0 Da e 17843,7+2,5 Da, respectivamente, por espectrometria de massa de electrospray. Estes valores correspondem muito bem à massa esperada para Met-TNFi_i56 (17386, 7 Da) e para CNGRCG-TNFi_i56 ( 17844,2 Da).

Exemplo II

Actividade citotóxica in vitro de TNF e NGR-TNF murinos A bioactividade de TNF e NGR-TNF foi estimada por ensaio citolítico padrão baseado em fibroblastos L-M de murganho (ATCC CCL1.2) como descrito (23). A actividade citolítica de TNF e NGR-TNF em células RMA-T foi testada na presença de 30 ng/mL de actinomicina D. Cada amostra foi analisada em duplicado, a três diluições diferentes. Os resultados são expressos como média ± SD de dois-três ensaios independentes. 16 A actividade citotóxica in vitro de TNF e NGR-TNF foi de (1,2+0,14) x 108 unidades/mg e de (1,8 ± 0,7) x 108 unidades/mg, respectivamente, por ensaio citolitico padrão com células L-M. Estes resultados indicam que as fracções CNGRCG na molécula NGR-TNF não impedem o enrolamento, oligomerização e ligação a receptores de TNF.

Num estudo anterior mostrou-se que as células RMA-T podem ser mortas por TNF na presença de 30 ng/mL de actinomicina D, ao passo que na ausência de inibidores de transcrição estas células são resistentes ao TNF, mesmo após vários dias de incubação. A actividade citotóxica in vitro de NGR-TNF em células RMA-T na presença de actinomicina D foi de (1,4 ±0,8) x 108 unidades/mg, como medida utilizando TNF ((1,2 ± 0,14) x 108 unidades/mg) como padrão. Deste modo, as actividades citotóxicas de NGR-TNF e TNF foram semelhantes tanto em células L-M como RMA-T.

Exemplo III

Caracterização da actividade terapêutica e tóxica de TNF e NGR-TNF murinos O linfoma RMA induzido por virus de Rauscher de origem C57BL/6, foi mantido in vitro em RPMI 1640, soro bovino fetal a 5% (FBS), penicilina a 100 U/mL, estreptomicina a 100 pg/mL, anfotericina B a 0,25 pg/mL, glutamina a 2 mM e 2-mercaptoetanol a 50 pM. RMA-T foi derivado da linha celular RMA por transfecção com uma construção codificando o alelo Thy 1.1 e cultivado como descrito (14) . 17 Células de melanoma B16F1 foram cultivadas em RPMI 1640, FBS a 5%, penicilina a 100 U/mL, estreptomicina a 100 pg/mL, anfotericina B a 0,25 pg/mL, glutamina a 2 mM, aminoácido não essencial MEM a 1% (BioWhittaker Europe, Verviers, Bélgica).

Os estudos in vivo em modelos animais foram aprovados pela Comissão Ética do San Raffaele H Scientific Institute e realizados de acordo com directrizes determinadas. C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Itália) (16-18 g) foram provocados com 5 x 104 células vivas RMA-T ou B16F1, respectivamente, s.c., no flanco esquerdo. Dez-doze dias após implantação tumoral, os murganhos foram tratados, i.p., com 250 pL de soluções de TNF ou NGR-TNF, diluídas com cloreto de sódio a 0,9% livre de endotoxinas. As experiências preliminares mostraram que a actividade antitumoral não foi alterada pela adição de albumina sérica humana a soluções de TNF e NGR-TNF, como um veículo. Cada experiência foi efectuada com 5 murganhos por grupo. O crescimento tumoral foi monitorizado diariamente por medição do tamanho de tumor com compassos de espessura. A área de tumor foi estimada calculando r! x r2, ao passo que o volume de tumor foi estimado calculando rT x r2 x r3 x 4/3, onde r2 e r2 são os raios longitudinal e lateral, e r3 é a espessura de tumores formando uma protuberância a partir da superfície de pele normal. Os animais foram mortos antes de o tumor ter alcançado 1,0-1,3 cm de diâmetro. Os tamanhos de tumor são mostrados como média ± SE (5-10 animais por grupo como indicado nas legendas da figura) e comparados por teste t. A actividade e toxicidade antitumorais de NGR-TNF foram comparadas às de TNF utilizando os modelos de linfoma RMA-T e de melanoma B16F1 em murganhos C57BL6. Visto que o modelo RMA-T foi anteriormente caracterizado e utilizado para estudar a 18 actividade antitumoral de TNF com diferentes protocolos de direccionamento (26), decidiu-se utilizar este modelo também neste estudo. 0 TNF murino administrado a animais transportando tumores RMA-T s.c. estabelecidos causa, 24 h mais tarde, uma redução na massa tumoral e necrose hemorrágica na parte central do tumor, seguida de um atraso significativo do crescimento durante alguns dias (26) . Um único tratamento com TNF não induz a regressão completa deste tumor, mesmo a doses próximas do LD50, visto que as células vivas permanecendo em torno da área necrótica recomeçam a crescer alguns dias após o tratamento.

Num primeiro conjunto de experiências, investigou-se o efeito de várias doses (i.p.) de TNF ou NGR-TNF na sobrevivência animal. De modo a evitar sofrimento excessivo, os animais foram mortos quando o diâmetro de tumor era superior a 1-1,3 cm. A letalidade de TNF e NGR-TNF, 3 dias após tratamento, foi semelhante (LD50, 60 pg e 45 pg, respectivamente) ao passo que a sua actividade antitumoral foi vincadamente diferente (Tabela 1). 19

Tabela 1. Sobrevivência de murganhos com linfoma RMA-T tratados com TNF ou NGR-TNF murinos

Trata- Animais mento (n) Dose (pg) Sobrevivência tratamento (%)a> após Dia 3 Dia 7 Dia Dia Dia 14 21 30 Dia 38 Dia 62 Dia (2a (3o 92 ch) b) ch. ) b) Nenhum 18 0 100 0 TNF 4 1 100 20 0 9 3 100 55 0 9 9 100 55 22 11 0 14 27 100 57 14 7 0 9 54 55 55 0 9 108 0 NGR-TNF 10 1 100 70 10 10 10 0 10 3 100 80 20 20 20 0 9 9 100 88 55 22 11 11 11 13 27 100 85 30 23 15 15 15 11 9 54 33 33 0 15 9 108 0 a) Os animais com tumor foram tratados com TNF ou NGR-TNF (i.p.) 10 dias após a implantação tumoral. Os animais foram mortos quando o diâmetro de tumor excedeu 1-1,3 cm. b) Os animais sobreviventes foram re-provocados com 50000 células RMA-T (segunda provocação) ou 50000 RMA (terceira) no tempo indicado. A tumorigenicidade de células injectadas foi monitorizada em cada tempo com os 5 animais normais. Todos os animais de controlo desenvolveram um tumor no espaço de 10 dias (dados não mostrados). 20

Por exemplo, 1 ou 3 pg de NGR-TNF retardaram o crescimento tumoral mais eficientemente que 27 pg de TNF, indicando que o NGR-TNF foi, pelo menos, uma ordem de grandeza mais activo. Interessantemente, alguns animais foram curados com doses de NGR-TNF inferiores ao LD50, ao passo que com TNF não foram curados quaisquer animais de modo algum. Os animais curados rejeitaram provocações adicionais com doses tumorigénicas de células RMA-T ou RMA de tipo selvagem, sugerindo que um único tratamento com NGR-TNF foi capaz de induzir imunidade protectora. É digno de nota que aumentando a dose de TNF ou NGR-TNF acima de 9-27 pg aumentou vincadamente a toxicidade e não aumentou, ou aumentou fracamente, a actividade terapêutica. A perda de peso em consequência do tratamento de TNF é um sinal bem conhecido de toxicidade sistémica (26). Deste modo, para comparar adicionalmente a razão eficácia/toxicidade de TNF e NGR-TNF, monitorizou-se o crescimento tumoral e o peso de animal após tratamento. 0 efeito de 1 pg de NGR-TNF no crescimento tumoral foi semelhante ou superior ao de 9 pg de TNF (Fig. la) , ao passo que a perda de peso, um-dois dias após o tratamento, foi comparável à de 1 pg de TNF (Fig. lc). Quando se interpolaram os dados com uma curva logarítmica numa representação gráfica de dose-resposta verificou-se que o efeito terapêutico de 9 pg de TNF no dia 14 pode ser obtido com não mais de 0,6 pg de NGR-TNF (Fig. lb). Em contraste, foram necessários 8,5 pg para induzir um efeito tóxico comparável (Fig. ld) . Deste modo, a razão eficácia/toxicidade calculada de NGR-TNF nestas condições é 14 vezes superior à de TNF.

Foram obtidos resultados semelhantes com o modelo de melanoma B16F1. O tratamento com 1 pg de NGR-TNF no dia 11 e dia 17 induziu uma resposta antitumoral no dia 19 superior à obtida 21 com 4 yg de TNF e semelhante à obtida com 12 yg de TNF (dados não mostrados) . Em contraste, a perda de peso causada por 1 yg de NGR-TNF foi vincadamente inferior à causada por 4 e 12 yg de TNF. 0 tratamento com 12 yg de NGR-TNF causou um efeito antitumoral ainda mais forte, ao passo que o efeito tóxico foi semelhante ao de 12 yg de TNF.

Quando uma terceira injecção foi realizada no dia 19 ocorreram algumas mortes de animais 1-2 dias mais tarde em todos os grupos (2 de 5 no grupo tratado com solução salina e 12 yg de NGR-TNF e 1 de 5 nos restantes grupos). De notar, um animal tratado com 12 yg de NGR-TNF rejeitou completamente o tumor. Quando este animal foi provocado com uma segunda dose tumorigénica de células B16F1, desenvolveu-se um tumor palpável após 18 dias, ao passo que os animais de controlo desenvolveram um tumor no espaço de 6-7 dias.

Estes resultados, no seu conjunto, sugerem que a eficácia de NGR-TNF na inibição do crescimento tumoral é 10-15 vezes superior à de TNF, ao passo que a toxicidade é semelhante. Além disso, o NGR-TNF pode induzir respostas imunitárias protectoras mais eficientemente que o TNF.

Exemplo IV

Mecanismo de acção de NGR-TNF mAb CD13 anti-murganho, R3-63, purificado a partir de fluidos asciticos por cromatografia de proteína-G Sepharose (Pharmacia-Upjohn, Uppsala, Suécia) e dialisado contra cloreto de sódio 0,9%. 22 0 anti-soro policlonal de coelho foi adquirido à Primm srl (Milão, Itália) e purificado por cromatografia de afinidade em proteína-A-Sepharose (Pharmacia-Upjohn). Os péptidos CNGRC e CARAC foram preparados como descrito anteriormente (28).

De modo a proporcionar provas de que a actividade melhorada de NGR-TNF está dependente do direccionamento tumoral por meio da fracção NGR, investigou-se se a actividade in vivo de NGR-TNF pode competir parcialmente com CNGRC. Para o efeito, foi administrado NGR-TNF (1 pg) a murganhos transportando o tumor RMA-T, com ou sem um excesso molar de CNGRC. Em paralelo, outros animais foram tratados com TNF (3 ou 9 pg) , de novo com ou sem CNGRC. Como esperado, o CNGRC diminuiu significativamente a actividade antitumoral de NGR-TNF (Fig. 2a) mas não a de TNF (Fig. 2b) . Pelo contrário, um péptido de controlo (CARAC) foi incapaz de causar diminuição significativa de actividade de NGR-TNF (Fig. 2c) . Estes resultados sugerem que o CNGRC compete pela ligação de NGR-TNF a um receptor de CNGRC e apoiam a hipótese de um mecanismo de direccionamento para a actividade melhorada. De notar, o CNGRC foi incapaz de diminuir a actividade citotóxica in vitro de NGR-TNF (dados não mostrados).

Visto que foi recentemente referido que a aminopeptidase N (CD13) é um receptor para péptidos CNGRC, foi então investigado o contributo deste receptor no mecanismo de direccionamento de NGR-TNF. Para o efeito, estudou-se o efeito de um mAb anti-CD13 (R3-63) na actividade antitumoral de NGR-TNF e TNF. 0 mAb R3-63 inibiu significativamente a actividade antitumoral de NGR-TNF (Fig. 2a) mas não a de TNF (Fig. 2b) indicando que o CD13 está, de facto, envolvido criticamente na actividade antitumoral de NGR-TNF. Não foi observada qualquer expressão de CD13 na superfície de células RMA-T por análise FACS de células 23 cultivadas com o mAb R3-63 (nao mostrado) , sugerindo que outras células foram reconhecidas pelo anticorpo in vivo.

Embora estes dados indiquem que o CD13 é um receptor importante para o NGR-TNF, não se pode excluir completamente que a ligação a outros receptores de NGR ainda não identificados contribui também, não obstante em menor escala, para o mecanismo de direccionamento.

Experiências preliminares de proteólise parcial mostraram que a ligação Arg-Ser no segmento N-terminal de TNF (residuos 2-3) é muito sensível à tripsina, ao passo que o resto da molécula é muito mais resistente. Deste modo, de modo a proporcionar provas adicionais de que a actividade melhorada de NGR-TNF está relacionada com a sua fracção NGR, tentou clivar-se o domínio NGR da região N-terminal da muteína por digestão parcial com tripsina imobilizada. Este tratamento converteu tanto o NGR-TNF como o TNF numa molécula correspondendo ao fragmento TNF3-156 (massa esperada de 16986,2 Da; ver a Fig. 3a para a massa medida e sequências esperadas).

Embora a digestão não diminuiu a actividade citolítica in vitro de NGR-TNF em células L-M (2,3 ± l,4)xl08 U/mg), a sua actividade antitumoral in vivo foi diminuída para o nível de TNF (Fig. 3b) . De notar, a toxicidade de NGR-TNF e TNF foi semelhante tanto antes como após a digestão, como avaliado a partir da perda de peso do animal um dia após o tratamento (Fig. 3b, painel direito), sugerindo que o mecanismo de direccionamento dependente de NGR não altera a toxicidade. 24

Exemplo V

Preparação e caracterização de TNF e NGR-TNF humanos

Os TNF e NGR-TNF recombinantes humanos (consistindo em TNF1-157 humano fundido com a extremidade C de CNGRCG) foram preparados por tecnologia de ADN recombinante e purificados essencialmente como descrito para TNF e NGR-TNF murinos. 0 ADNc codificando para NGR-TNF humano foi preparado por PCR no plasmídeo pETllb/hTNF contendo a sequência codificante hTNF (33), utilizando os seguintes iniciadores:

- NGR-hTNF/1 (sentido): 5Ά TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3'.

- NGR-hTNF/ 2 (ant i-sent ido) : 5 ' TCA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC 3'. 0 fragmento amplificado foi digerido e clonado em pET-llb (Nde I/BamH I) e utilizado para transformar células BL21(DE3) de E. coli (Novagen) . A expressão de NGR-hTNF foi induzida com isopropil-p-D-tiogalactosídeo, de acordo com as instruções do fabricante de pETllb. 0 NGR-TNF solúvel foi recuperado a partir de culturas de dois litros por sonicação bacteriana em ácido etilenodiaminotetracético a 2 mM, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0, seguida de centrifugação (15000 x g, 20 min, 4 °C). O extracto foi misturado com sulfato de amónio (35% de saturação), deixado durante 1 h a 4 °C e adicionalmente centrifugado, como anteriormente. O sulfato de amónio nos sobrenadantes foi, depois, ajustado para 65% de saturação, deixado a 4 °C durante 24 h e adicionalmente centrifugado. Cada 25 sedimento foi dissolvido em sulfato de amónio a 1 M, Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, e purificado por cromatograf ia de interacção hidrófoba em Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (gradiente de eluição, tampão A: fosfato de sódio a 100 mM, pH 8,0, contendo sulfato de amónio a 1 M; tampão B: etilenoglicol a 70%, metanol a 5%, fosfato de sódio a 100 mM, pH 8,0) . As fracções contendo material imunorreactivo hTNF (por ELISA) foram agregadas, dialisadas contra Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0 e adicionalmente purificadas por cromatografia de permuta iónica em DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (gradiente de eluição, tampão A: Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0; tampão B: cloreto de sódio a 1 M, Tris-HCl a 20 mM, pH 8,0) . Todas as soluções empregadas nas etapas cromatográficas foram preparadas com água esterilizada e livre de endotoxinas (Salf, Bergamo, Itália).

Nesta fase, cerca de 30 mg de TNF e 32 mg de NGR-TNF foram recuperados a partir de culturas de dois litros. O SDS-PAGE não redutor mostrou bandas correspondendo a monómeros, dímeros e trimeros sugerindo que o NGR-TNF humano era também uma mistura de trimeros com dissulfuretos intra-cadeia correctos e trimeros com uma ou mais pontes dissulfureto intercadeia (Fig. 4A, corredor b), como observado em NGR-TNF murino.

Os trimeros com pontes dissulfureto intracadeia correctas foram isolados a partir desta mistura por um processo de desnaturação-re-enrolamento de quatro etapas como se segue: o NGR-TNF humano purificado foi desnaturado com ureia a 7 M e filtrado em gel através de uma coluna HR Sephacryl S-300 (1025 mL) (Pharmacia) pré-equilibrada com ureia a 7 M, Tris-HCl a 100 mM, pH 8,0. As fracções correspondendo a TNF monomérico foram agregadas, ultrafiltradas através de uma membrana de 10 kDa YM MWCO (Amicon) e re-enroladas por diálise contra 33 26 volumes de ureia a 2,33 M, Tris-HCl a 100 mM, pH 8 a 4 0 C (140 min) i seguida de ureia a 1,55 M, Tris-HCl a 100 mM, pH 8 (140 min ) e ureia a 1 M, Tris-HCl a 100 mM, pH 8 (140 min) φ

Finalmente, o produto foi dialisado contra 80 volumes de Tris-HCl a 100 mM (16 h) , centrifugado a 13000 x g (30 min) , filtrado através de uma membrana de 0,45 pm SFCA (Nalgene) e filtrado em gel através de uma coluna HR Sephacryl S-300 (1020 mL) pré-equilibrada com cloreto de sódio a 0,15 M, fosfato de sódio (PBS) a 0,05 M. Foram recuperados cerca de 23 mg de proteína re-enrolada. O produto final era maioritariamente monomérico após SDS-PAGE não redutor (Fig. 4A, corredor c), tinha um volume hidrodinâmico semelhante ao do TNF humano trimérico por HPLC de filtração em gel analítico numa coluna Superdex 75 HR (não mostrado) e tinha uma massa molecular de 17937,8 + 1,8 Da (esperado para CNGRCG-TNF1-157, 17939,4 Da) por espectrometria de massa de electrospray. As actividades citolíticas in vitro de NGR-TNF não re-enrolado e re-enrolado em células L-M de murganho foram de (6,11 x 107) + 4, 9 e (5, 09 x 107) + 0,3 unidades/mg respectivamente, ao passo que as de TNF humano purificado foram de (5,45 x 107) +3,1 unidades/mg. Estes resultados sugerem que o processo de desnaturação-re-enrolamento não afectou a interacção de NGR-TNF humano com o receptor p55 murino. A actividade antitumoral in vivo de 1 pg de NGR-TNF humano (não re-enrolado) foi superior à de 10 pg de TNF (Fig. 4B) , ao passo que a toxicidade, como avaliada por perda de peso do animal, foi significativamente inferior (Fig. 4C) . Após re-enrolamento, 0,3 pg de NGR-TNF foram suficientes para induzir um efeito antitumoral mais forte do que o alcançado com 10 pg de TNF (Fig. 4D, 4E) . 27

Estes resultados indicam que a actividade antitumoral de NGR-TNF humano é superior à de TNF humano.

Além disso, observou-se que o NGR-TNF re-enrolado humano e de murganho pode induzir efeitos antitumorais significativos em murganhos transportando RMA-T, mesmo a doses muito baixas (1-10 ng/murganho) , sem quaisquer indícios de efeitos tóxicos, ao passo que o TNF foi incapaz de induzir efeitos significativos a estas doses (não mostrado).

Exemplo VI

Preparação e caracterização de NGR-IFNy de murganho 0 interferão murino recombinante (IFN)y fundido com CNGRCG (NGR-IFNy) foi preparado por tecnologia de ADN recombinante, essencialmente como descrito para o NGR-TNF. O domínio CNGRC foi fundido com a extremidade C de IFNy. Além do mais, a cisteína na posição 134 foi substituída com uma serina; uma metionina foi introduzida na posição -1 para expressão em células de E. coli. Os iniciadores de PCR utilizados para a produção do ADNc de NGR-IFNy foram: 5'-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C (sentido) e 5'-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC. O ADNc foi clonado em pET-llb (Ndel/BamHI) e utilizado para transformar células BL21(DE3) de E. coli (Novagen). A expressão proteica foi induzida com isopropil-p-D-tiogalactosídeo, de acordo com as instruções do fabricante de pETllb. O produto foi purificado a partir de extractos de E. coli por cromatografia de imunoafinidade utilizando um mAb de IFN γ anti-murganho (AN18) imobilizado em agarose, de acordo com técnicas padrão. O SDS-PAGE redutor e não 28 redutor do produto final mostrou uma única banda de 16 kDa. A espectrometria de massa de electrospray mostrou um peso molecular de 16223 + 3,6 Da (esperado, 1625,5 Da) correspondendo a Met-IFNYl-134(C134S)CNGRC (NGR-IFNy) murino. A capacidade de NGR-IFNy e NGR-TNF competirem pela ligação de um anticorpo anti-CDl3 para vasos associados ao tumor foi investigada utilizando uma abordagem imunohistoquimica.

Espécimes cirúrgicos novos de carcinoma celular renal humano foram obtidos a partir do Histopathology Department do San Raffaele H Scientific Institute. Foram preparadas secções (5-6 pm de espessura) de espécimes embebidos em parafina fixos em Bouin (4-6 h) e adsorvidos sobre lâminas revestidas com polilisina. 0 antigénio CD13 foi detectado utilizando o método do complexo de avidina-biotina como se segue: secções de tecido foram reidratadas utilizando xilenos e séries alcoólicas graduadas, de acordo com processos padrão. As secções de tecido foram colocadas num recipiente contendo EDTA a 1 mM e fervidas durante 7 min utilizando um forno microondas (1000 W) . O recipiente foi depois reenchido com EDTA a 1 mM e fervido de novo durante 5 min. As secções de tecido foram deixadas arrefecer e incubadas em PBS contendo peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 15 min, de modo a atenuar a peroxidase endógena. As amostras foram, depois, enxaguadas com PBS e incubadas com 100-200 μΐ de PBS-BSA (1 h à temperatura ambiente) seguida do mAb WM15 (anti-hCD13), isoladamente ou misturado com diversos agentes competidores (ver a Tabela 2) em PBS-BSA (de um dia para o outro a 4 °C) . As lâminas foram, depois, lavadas 3 vezes (3 min cada) com PBS e incubadas com PBS-BSA contendo soro normal de cavalo a 2% (PBS-BSA-NHS) (Vector Laboratories,

Burlingame, CA) durante 5 min. A solução foi depois substituída 29 com 3 yg/mL de IgG (H+L) de cavalo anti-murganho biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA) em PBS-BSA-NHS e adicionalmente incubada durante 1 h à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas de novo e incubadas durante 30 min com Vectastain Elite Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) diluído 1:100 em PBS. Um comprimido de 3,3'-diamino-benzidina-tetra-hidrocloreto (Merck, Darmstadt, Alemanha) foi, depois, dissolvido em 10 mL de água desionizada contendo peróxido de hidrogénio a 0,03%, filtrada através de uma membrana de 0,2 ym e recoberta sobre secções de tecido durante 5-10 min. As lâminas foram lavadas como anteriormente e contrastadas com a hematoxilina de Harris. Os vasos associados ao tumor foram identificados por coloração de secções em série do tecido com um mAb anti-CD31 (mAb JC/70A, anti-humano CD31, IgGl, da DAKO, Copenhaga, Dinamarca).

Os resultados estão sumariados na Tabela 2. Como mostrado, a ligação de WM15 a vasos associados ao tumor foi inibida por um excesso de NGR-TNF, NGR-IFNy e CNGRC, mas não por outros reagentes de controlo carecendo do motivo NGR. Isto sugere que o sítio de ligação de NGR em CD13 sobrepõe-se esterioquimicamente ao epitopo de WM15. Em contraste, o NGR-TNF foi incapaz de competir pela ligação de 13C03 a células epiteliais.

Conclui-se que a fracção NGR de NGR-IFNy e NGR-TNF pode interagir com uma forma de CD13 reconhecida por mAb WM15 em vasos associados ao tumor. Além disso, estes resultados indicam que o motivo CNGRC é funcional quer quando ligado à extremidade N ou à extremidade C de uma citocina. 30

Tabela 2. Ligação de WM15 a secções de cancro celular renal na presença de diversos competidores

Competidor Ligação de WM15 a vasos associados ao tumor Nenhum + NGR-TNF (25 pg/mL) - NGR-IFNy (50 pg/mL) - GNGRC (100 pg/mL) - TNF (25 pg/mL) + Albumina sérica humana + (25 pg/mL) CgA(60-68) sintético + (100 pg/mL) a 0 competidor, em PBS contendo BSA a 2%, foi adicionado na etapa de bloqueio e misturado com o anticorpo primário. b 0 mAb WM15 (CD13 anti-humano, IgGl) era de Pharmingen (San Diego, CA); o péptido sintético CgA(60-68) corresponde ao fragmento 60-68 de cromogranina A. 31

Exemplo VII

Distribuição direccionada de NGR-TNF biotinilado a tumores utilizando anticorpos antitumorais e avidina (pré-direccionamento) 0 exemplo seguinte ilustra a possibilidade de direccionamento "dual" de TNF, baseado na combinação de um anticorpo de alcance tumoral e o péptido CNGRC.

Um conjugado de biotina-NGR-TNF foi preparado por mistura de NGR-TNF com o éster N-hidroxisuccinimida do ácido D-biotinil-6-aminocapróico (Societá Prodotti Antibiotici S.p.A, Milão, Itália), em tampão de carbonato de sódio a 1 M, pH 6,8 (3 h à temperatura ambiente) (21). A reacção foi blogueada com Tris-HCl a 1 M, pH 7,5. 0 conjugado foi caracterizado por espectrometria de massa e verificou-se conter 1 biotina/trimero (em média). C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Itália) foram depois provocados com 5 x 104 células vivas RMA-T, s.c., no flanco esquerdo. Quando a área de tumor alcançou 40 mm2, os murganhos foram tratados por injecções sequenciais de anticorpo biotinilado, avidinas e biotina-TNF de acordo com um protocolo de "três dias" como descrito anteriormente (26). Injectaram-se: 40 pg de biotina-mAbl9E12 (i.p., etapa I), 60 pg de avidina e 60 pg de estreptavidina após 18 e 19 h, respectivamente (i.p., etapa II), 3 pg de biotina-NGR-TNF, 24 h mais tarde (i.p, etapa III). Cada composto foi diluído com uma solução esterilizada de cloreto de sódio a 0,9%. Na experiência de controlo, a avidina e estreptavidina foram omitidas. Cada experiência foi efectuada 32 com 5 murganhos/grupo. 0 crescimento tumoral foi monitorizado diariamente medindo o tamanho de tumor com compassos de espessura. As áreas de tumor antes e 10 dias após o tratamento foram de 39 ± 4 mm e 8±5 mm , respectivamente, no grupo tratado com o mAb 19E12-biotina/avidina/estreptavidina/biotina-NGR-TNF (5 animais, médialSE) . No grupo de controlo (tratado com o mAb 19E12-biotina/biotina-NGR-TNF isoladamente) as áreas de tumor antes e 10 dias após o tratamento foram de 40 ± 4 mm2 e 20 ± 6 mm2 respectivamente, indicando que o pré-direccionamento com anticorpo e avidina de alcance tumoral aumentou a actividade de NGR-TNF.

REFERENCIAS 1. Carswell, E. A., et al., An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1975. 72:3666-70. 2. Helson, L., et al., Effect of tumor necrosis factor on cultured human melanoma cells. Nature 1975. 258:731-732. 3. Tracey, K. J., e A. Cerami. Tumor necrosis factor, other cytokines and disease. Ann. Rev. Cell Biol, 1993. 9:317-43. 4. Hoogenboom, H. R., et al., Construction and expression of antibody-tumor necrosis factor fusion proteins. Mol. Immunol. 1991. 28:1027-37. 5. Loetscher, H., et al., Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75kDa TNF receptors. J. Biol. Chem. 1993. 268:26350-7. 6. Yang, J., et al., A genetically engineered single-chain FV/TNF molecule possesses the anti-tumor immunoreactivity 33 of FV as well as the cytotoxic activity of tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995. 32:873-81. 7. Van Ostade, X., et al., Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor. Nature 1993. 361:266-9. 8. Paganelli, G., et ai., Three-step monoclonal antibody tumor targeting in carcinoembryonic antigenpositive patients. Câncer Res. 1991. 51:5960-6. 9. Paganelli, G., et al., Clinicai application of the avidin-biotin system for tumor targeting. In D. Goldenberg (Ed. Câncer therapy with radiolabeled antibodies. CRC Press, Boca Raton, 1995 . P. 239-253. 10. Modorati, G., et al., Immunoscintigraphy with three step monoclonal pretargeting technique in diagnosis of uveal melanoma: preliminary results. Sr. J. Ophtalm. 1994. 78 :19-23. 11. Colombo, P., et al., Immunoscintigraphy with anti- chromogranin A antibodies in patients with endocrine/neuroendocrine tumors. J. Endocr. Invest. 1993. 16 :841-3. 12. Debs, R. J., et ai., Liposome-associated tumor necrosis factor retains bioactivity in the presence of neutralizing anti-tumor necrosis factor antibodies. J. Immunol. 1989. 143:1192-7. 13. Debs, R. J., et al., Immunomodulatory and toxic effects of free and liposome-encapsulated tumor necrosis factor alpha in rats. Câncer Res. 1990. 50:375-80. 14. Moro, M. , et al., Tumor cell targeting with antibody-avidin complexes and biotinylated tumor necrosis factor alpha. Câncer Res. 1997. 57:1922-8. 15. Schraffordt Koops, et al., Hyperthermic isolated limb perfusion with tumour necrosis factor and melphalan as treatment of locally advanced or recurrent soft tissue 34 sarcomas of the extremities. Radiothepray & Oncology 1998. 48:1-4. 16. Lienard, D., et ai., In transit metastases of malignant melanoma treated by high dose rTNF alpha in combination with interferon-gamma and melphalan in isolation perfusion. World Journal of Surgery 1992. 16:234-40. 17. Hill, S., et al. , Low-dose tumour necrosis factor alpha and melphalan in hyperthermic isolated limb perfusion. Br. J. Sugr. 1993. 80:995-7. 18. Eggermont, A. M., et al., Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan for limb salvage in 186 patients with locally advanced soft tissue extremity sarcomas. The cumulative multicenter European experience. Ann. Surg. 1996. 224:756-65. 19. Mizuguchi, H., et al., Tumor necrosis factor alpha-mediated tumor regression by the in vivo transfer of genes into the artery that leads to tumor. Câncer Res. 1998 . 58 :5725-30. 20. Pennica, D., et al., Cloning and expression in

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor <120> Citocinas modificadas para utilização na terapia do cancro

<13 0> <140> <141> modcyt <160> 7 <17 0> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR 37 <4 Ο 0> 1 ctggatcctc acagagcaat gactccaaag 30 <210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 2 tgcctcacat atgctcagat catcttctc 29 <210> 3 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 3 gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc 46 <210> 4 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR 38 <4Ο0> 4 atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg 45 <210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 5 tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac 36 <210> 6 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR <400> 6 atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 35 <210> 7 <211> 58 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador de PCR 39 <4Ο0> 7 tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc ttttccgctt cttgaggc 58

Lisboa, 31 de Março de 2009 40

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Produto de conjugação entre uma citocina seleccionada de TNF ou IFNy e um péptido contendo o motivo NGR, em que o referido péptido é um ligando do receptor CD13.
2. 2. Produto de conjugação como reivindicado na reivindicação 1, em que a referida citocina é o TNFa ou ο ΤΝΓβ.
3. 3. Produto de conjugação como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, em que o referido péptido é seleccionado do grupo consistindo em CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, ciclo-CVLNGRMEC, CNGRC linear ou cíclico.
4. 4. Produto de conjugação de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a citocina é ligada ao péptido por meio de um espaçador.
5. 5. Produto de conjugação de acordo com a reivindicação 4, em que o referido péptido é CNGRC linear ou cíclico e em que o referido péptido é ligado à citocina por meio de uma glicina espaçadora.
6. 6. Produto de conjugação como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a citocina é derivatizada com polietilenoglicol ou um resíduo acilo.
7. 7. Produto de conjugação como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a citocina é adicionalmente conjugada com um anticorpo ou um seu 1 fragmento, dirigido a um antigénio tumoral, um marcador angiogénico tumoral ou um componente da matriz extracelular.
8. 8. Produto de conjugação de acordo com a reivindicação 7, em que a citocina é TNF e é conjugada tanto a um péptido contendo o motivo NGR como a um anticorpo ou um fragmento deste, em diferentes subunidades de TNF, em que o anticorpo ou um seu fragmento é dirigido a um antigénio tumoral, um marcador angiogénico tumoral ou um componente da matriz extracelular e em que o referido péptido é um ligando do receptor CD13.
9. 9. ADNc codificando para uma citocina seleccionada de TNF e IFNy transportando uma sequência contígua 5' ou 3' codificando um péptido contendo o motivo NGR, em que o referido péptido é um ligando do receptor CD13.
10. 10. ADNc de acordo com a reivindicação 9, em que o referido péptido é um péptido de acordo com a reivindicação 3.
11. 11. ADNc de acordo com a reivindicação 9, codificando um produto de conjugação como reivindicado na reivindicação 5.
12. 12. Vector para terapia génica contendo o ADNc de qualquer uma das reivindicações 9 a 11.
13. 13. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um produto de conjugação como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um ADNc como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 9 ou 11, ou um vector como 2 reivindicado na reivindicação 12, juntamente com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
14. 14. Composição como reivindicada na reivindicação 13, na forma de uma solução ou suspensão injectável ou um líquido para infusões.
15. 15. Composição como reivindicada nas reivindicações 13 ou 14, na forma de lipossomas.
16. 16. Utilização de um produto de conjugação como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um ADNc como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 9 a 11 ou um vector como reivindicado na reivindicação 12 para a preparação de medicamentos ou diagnósticos para a terapia do cancro.
17. 17. Utilização de um produto de conjugação de acordo com a reivindicação 16, em combinação com outros agentes antitumorais ou compostos de imagiologia tumoral de diagnóstico.
18. 18. Produto de conjugação como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, um ADNc como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, ou um vector como reivindicado na reivindicação 12 para utilização no tratamento do cancro. Lisboa, 31 de Março de 2009 3