JP2001516055A - 腫瘍中の血管形成血管系にホーミングする分子を同定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 実質的に純粋なＮＧＲレセプターを１つ以上の分子と接触させること、および該ＮＧＲレセプターに対する分子の特異的結合を測定することにより、血管形成血管系にホーミングする腫瘍ホーミング分子を同定する方法であって、特異的結合の存在が、該分子を、血管形成血管系にホーミングする腫瘍ホーミング分子として同定する。本発明はまた、被験体に、ＮＧＲレセプターに対する特異的結合を示す腫瘍ホーミング分子に連結された成分を含む結合体を投与し、それによって該成分を血管形成血管系に向けることにより、被験体において血管形成血管系に成分を向ける方法を提供する。さらに、本発明は、被験体に、ＮＧＲレセプターに対して特異的結合を示す腫瘍ホーミング分子に連結された検出可能な成分を有する結合体を投与すること、および該結合体を検出することにより、被験体中の腫瘍の血管形成血管系を造影する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９７年９月１０日に出願された米国特許出願第０８／９２６，
９１４号（これは、１９９６年９月１０日に出願された米国特許出願第０８／７
１０，０６７号から変更された米国仮出願番号６０／０６０，９４７号の優先権
の利益を主張する）の一部係属出願であり、その全内容を、本明細書に参考とし
て援用する。

【０００２】 本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられるＣＡ ４２５０７、ＣＡ
６２０４２、ＣＡ７４２３８−０１、およびガン研究所支援助成金ＣＡ ３０１
９９のもとで政府支援が行われた。政府は、本発明において、特定の共有権を有
する。

【０００３】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、一般的にはガン生物学および薬物送達の分野、およびより詳細には
、選択的に腫瘍、特に悪性腫瘍にホーミングするペプチド、このような腫瘍ホー
ミング分子に結合された治療薬剤のような薬剤を含む組成物、および薬剤を腫瘍
に標的化するためにこのような分子を使用する方法に関する。

【０００４】 （背景情報） この四半世紀にわたる連続した開発により、医者が患者においてガンを診断す
るための能力において実質的な改善をもたらした。例えば、前立腺特異的抗原に
対する抗体のような抗体ベースのアッセイは、現在、前立腺ガンのようなガンの
早期診断を可能にする。より最近は、遺伝子スクリーニング方法が、特にガンを
発生することに感受性であり得るヒトを同定するために利用可能になっている。
遺伝子スクリーニング方法は、ガンの発生に関連する遺伝子における１つ以上の
変異の同定に基づく。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２のような遺伝子の同
定は、いくつかの場合、乳ガンを発生する感受性に関連し得るこれらの遺伝子に
おける変異のさらなる同定を可能にした。

【０００５】 不運にも、ガンを処置する方法は、病気を診断する方法についていけなかった
。したがって、種々のガンからの死亡率は、医者が初期の段階で病気を検出する
能力のために減少したが、より進行した疾患がある患者を処置する能力は、最小
限でしか進行していない。

【０００６】 ガンを処置することにおける進歩に対する主な障害は、ガンを選択的に標的化
し得るが、正常組織に危害を加えない薬剤の相対的な欠如である。例えば、一般
的に処置に集中される放射線治療および外科的手術は、処置範囲において正常組
織に実質的損傷を引き起こし得、瘢痕、および重篤な症例では、正常組織の機能
の喪失を生じる。比較して、一般的に全身投与される化学療法は、骨髄、粘膜、
皮膚、および小腸などの器官に実質的な損傷を引き起こし得、これらは迅速な細
胞代謝回転および連続的細胞分割を受ける。結果として、吐き気、毛髪の喪失、
および血液細胞数の低下のような望ましくない副作用が、化学療法剤でガン患者
を全身的処置する結果として生じる。このような望ましくない副作用は、しばし
ば、投与され得る処置の量を制限する。したがって、ガンは、患者の罹患率およ
び死亡の主要な原因のままである。

【０００７】 種々の薬物の標的特異性を増加させるための努力が行われている。例えば、独
特の細胞表面マーカーが、腫瘍を構成する細胞の集団によって発現される場合、
抗体が独特のマーカーに対して惹起され得、そして薬物が抗体に連結され得る。
薬物／抗体複合体の患者への投与の際、抗体のマーカーへの結合は、比較的高い
濃度の薬物の腫瘍への送達をもたらす。特定のガン細胞もしくは支持細胞または
マトリクスが、独特の細胞表面レセプターまたは特定のレセプターに対するリガ
ンドを発現する場合、同様の方法が使用され得る。これらの場合では、薬物は、
それぞれ特異的リガンドまたはレセプターに連結され得、したがって、比較的高
い濃度の薬物を腫瘍に送達する手段を提供する。

【０００８】 腫瘍は、一部で比較的高いレベルの活性血管形成によって特徴づけられ、それ
は増殖する腫瘍を支持するための新しい血管の連続的形成を生じる。このような
血管形成血管は、成熟血管系とは区別可能である。血管形成血管系の区別される
特徴の１つは、独特の内皮細胞表面マーカーが発現されることである。したがっ
て、腫瘍における血管は、腫瘍に化学療法剤を指向させるための可能性のある標
的を提供し、それによって薬剤が感受性正常組織を殺す可能性を減少する。さら
に、腫瘍において血管形成血管系を標的化する薬剤が同定され得るならば、この
ような薬剤によって認識され、腫瘍細胞に特異的なレセプターではない血管形成
血管系における標的分子であるので、薬剤が種々の異なるタイプの腫瘍に対して
有用であり得る可能性がある。しかし、腫瘍血管系に特異的に結合しそして腫瘍
に化学療法剤を標的化し得る分子の使用は実証されていない。

【０００９】 腫瘍にホーミングする分子に薬物を連結することが、薬物単独の使用を超えて
、処置に顕著な利点を提供し得るが、この方法の使用は、腫瘍で発現される有用
な細胞表面マーカーの不足によって厳しく限定される。したがって、腫瘍に、特
に腫瘍を支持する血管系に選択的にホーミングし得る分子を同定する必要性が存
在する。本発明は、この必要性を満たし、そしてさらに関連する利点を提供する
。

【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、腫瘍の血管形成血管系にホーミングする腫瘍ホーミング分子を同定
する方法を提供する。この方法は、実質的に純粋なＮＧＲレセプターを、１つ以
上の分子と接触させる工程、および該ＮＧＲレセプターに対する分子の特異的結
合を測定する工程であって、ここで特異的結合の存在が、該分子を、血管形成血
管系にホーミングする腫瘍ホーミング分子として同定する工程を包含する。本発
明の方法では、実質的に精製されたＮＧＲレセプターは、例えば、ＣＤ１３／ア
ミノペプチダーゼＮであり得る。所望であれば、この実質的に精製されたＮＧＲ
レセプターは、プレートまたはビーズのような支持体上に固定化され得る。

【００１１】 本発明はまた、実質的に精製されたＮＧＲレセプターを用いて血管形成血管系
にホーミングするホーミング分子を同定する方法を提供する。この方法は、実質
的に純粋なＮＧＲレセプターを、１つ以上の分子と接触させる工程、および該Ｎ
ＧＲレセプターに対する分子の特異的結合を測定する工程であって、ここで特異
的結合の存在が、該分子を、血管形成血管系にホーミングするホーミング分子と
して同定する工程を包含する。本発明は、非腫瘍血管形成血管系にホーミングす
るホーミング分子を提供する。

【００１２】 本発明はまた、該被験体に、ＮＧＲレセプターに対して特異的結合を示す腫瘍
ホーミング分子に連結された成分を含む結合体を投与し、それによって該成分を
腫瘍の血管形成血管系に向ける工程により、被験体における腫瘍の血管形成血管
系に成分を向ける方法を提供する。本発明の方法において、この腫瘍ホーミング
分子は、例えば、配列ＮＧＲを含むペプチドであり、そして、所望であれば、そ
の成分が細胞傷害剤、薬物または癌の治療剤、例えば、ドキソルビシンである結
合体の一部分であり得る。この配列ＮＧＲを含む腫瘍ホーミングペプチドは、例
えば、配列ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番
号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）、またはＣＮＧＲＣ（配列番号８）
を有し得る。被験体において腫瘍の血管形成血管系に成分を向ける本発明の方法
では、腫瘍ホーミング分子はまた、例えば、ベスタチン、ｏ−フェナントロリン
、アクチノニン、アマスタチン、２，２’−ジピリジルまたはフマギリンのよう
なアミノペプチダーゼインヒビターであり得、そして所望であれば、薬物成分に
連結され得る。

【００１３】 本明細書は、さらに、被験体に、ＮＧＲレセプターに対して特異的結合を示す
腫瘍ホーミング分子に連結された検出可能な成分を有する結合体を投与し、それ
によって該結合体が、該血管形成血管系に選択的に結合する工程、および該結合
体を検出する工程により、被験体における腫瘍の血管形成血管系を造影する方法
を提供する。血管形成血管系を造影する検出可能な成分は、例えば、放射線核種
であり得る。血管形成血管系を造影するために有用な腫瘍ホーミング分子は、例
えば、配列ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番
号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）、またはＣＮＧＲＣ（配列番号８）
を含むペプチドのような、配列ＮＧＲを含むペプチドであり得る。血管形成血管
系を造影するための腫瘍ホーミング分子は、例えば、ベスタチン、ｏ−フェナン
トロリン、アクチノニン、アマスタチン、２，２’−ジピリジル、フマギリンま
たはアミノペプチダーゼを阻害する別の分子のようなアミノペプチダーゼインヒ
ビターであり得る。

【００１４】 本発明はまた、ＮＧＲレセプター結合分子である、血管形成のインヒビターを
提供する。このようなインヒビターは、例えば、ＮＧＲレセプター抗体、または
ベスタチン、ｏ−フェナントロリン、アクチノニン、アマスタチン、２，２’−
ジピリジルまたはフマギリン、あるいはこのような血管形成インヒビターの薬物
またはトキシンへの結合体であり得る。

【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、血管形成性血管系への分子のホーミングを担う標的分子の同定に関
する。同定された標的分子は、例えば、腫瘍の血管形成性血管系へホーミングす
る腫瘍ホーミング分子に対するレセプターとして作用し得る。本明細書において
開示されるように、種々の腫瘍ホーミング分子は、インビボパニングを用いて単
離され；腫瘍ホーミングペプチドのいくつかに存在するコア結合モチーフが配列
ＮＧＲであると同定された（実施例ＩＶを参照のこと）。特に、ペプチドＣＮＧ
ＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）およびＣＶ
ＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）を発現するファージは、ヒト乳ガン、ヒトカポー
ジ肉腫およびこれらの腫瘍を有するマウスにおいてマウス黒色腫にホーミングし
た。さらに、このようなホーミングは、ＮＧＲ含有ペプチドＣＮＧＲＣ（配列番
号８）を含むことによってインビボで競合阻害されたが、無関連のペプチドによ
っては阻害されなかった。従って、本明細書において開示される結果は、ＮＧＲ
を含む腫瘍ホーミングペプチドが、異なる型および種起源の腫瘍にホーミングし
得、そして特異的に結合することを示す。

【００１６】 本明細書においてさらに開示されるように、ＮＧＲモチーフを含む腫瘍ホーミ
ング分子に特異的に結合するレセプターが同定された（実施例ＩＸおよびＸを参
照のこと）。ＮＧＲレセプターの特徴付けによって、この分子がＣＤ１３抗体と
免疫反応すること、および単離したレセプターがＮＧＲモチーフに特異的に結合
することが明らかになった。さらに、ＮＧＲレセプターは、腫瘍血管系を含む血
管形成性血管系において発現した。そして、これは、血管形成において機能的に
重要である。血管形成性血管系において発現されるＮＧＲレセプターのような標
的分子の同定を、インビトロで有利に使用して、新たなホーミング分子（ＮＧＦ
レセプターの高親和性リガンドを含む）を同定し得、そして腫瘍ホーミング分子
および結合部分（例えば、薬物）の、インビボでの腫瘍の血管形成性血管系への
標的化をし得る。

【００１７】 従って、本発明は、この分子を同定するために実質的に精製されたＮＧＲレセ
プターを使用することによって、腫瘍を血管形成性血管系へホーミングする腫瘍
ホーミング分子を同定する方法を提供する。この方法は、実質的に精製されたＮ
ＧＲレセプターを、１以上の分子と接触させる工程およびそのＮＧＲレセプター
への分子の特異的結合を決定する工程であって、ここで特異的な結合の存在が、
その分子を腫瘍の血管形成性血管系へのホーミングをする腫瘍ホーミング分子で
あると同定する、工程を包含する。腫瘍の抗原形成性血管系へホーミングをする
腫瘍ホーミング分子を同定することに関する本発明の方法は、さらに、インビボ
でＮＧＲ結合分子を投与する工程、および血管形成性血管系へのＮＧＲ結合分子
の結合を決定する工程を包含する。所望であれば、実質的に精製されたＮＧＲレ
セプターは、プレートまたはビーズのような支持体上に固定され得る。

【００１８】 本発明の方法において、実質的に精製されたＮＧＲレセプターは、例えば、Ｃ
Ｄ１３／アミノペプチダーゼＮ（図１２、また、Ｌｏｏｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．８３：１２９９−１３０７（１９８９）を参照のこと。これは、本
明細書において参考として援用される）であり得る。約１５０ｋＤのこの高度に
保存された膜貫通型糖タンパク質は、Ｎ末端疎水性セグメントを介して細胞膜に
取り込まれる（Ｌｏｏｋら、前出、１９８９；Ｘｕら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ
，２５；５２１−５２９（１９９７）、これは本明細書において参考として援用
される）。この大きな細胞外カルボキシ末端ドメインは、多くの亜鉛依存性メタ
ロプロテアーゼの特徴であるペンタペプチドを含む（Ｌｏｏｋら、前出、１９８
９）。いくつかの異なる種からのＣＤ１３のホモログは、良好に保存されている
（Ｌｏｏｋら、前出、１９８９；Ｘｕら，前出、１９９７；Ｔｕｒｎｅｒら、Ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ Ｅｃｔｏｅｎｚｙｍｅｓ、ＫｅｎｎｙおよびＴｕｒｎｅｒ編
、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２１１頁（１９８７））。

【００１９】 ＣＤ１３は、骨髄系統の正常細胞および悪性細胞（Ａｍｏｓｃａｔｏら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１２４５−１２５２（１９８９）；Ｆａｖａｌｏｒｏ
ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６９：１６３−１７１（１９８８）；Ｍａｋ
ｒｙｎｉｋｏｌａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：１１７３−１１７９（１
９９５））ならびに多くの上皮細胞型、内皮細胞型、および腫瘍細胞型（Ａｍｏ
ｓｃａｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０４１：３１７
−３１９（１９９０）；ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｊ．２９０：２０５−２１８（１９９３）；Ｍｅｃｈｔｅｒｓｈｅｉｍｅｒお
よびＭｏｌｌｅｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７：１２１５−１２２２（１
９９０）；Ｍｅｎｒａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：１４５０−１４５５
（１９９３）；Ｒｉｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３４２５−３
４３２（１９９７））において発現する。ＣＤ１３は、その位置に依存して異な
って機能し得る。シナプス膜において、ＣＤ１３は、エンケファリンおよびエン
ドルフィンを代謝する（Ｍａｔｓａｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１７５：１２４
−１２８（１９８４））；腸刷子縁において、ＣＤ１３は、調節性ペプチドを分
解し、そしてアミノ酸をスカベンジする（Ｔｕｒｎｅｒら、前出、１９９７；Ｒ
ａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔ、前出、１９９３）；リンパ球において、Ｃ
Ｄ１３の細胞表面活性は、有糸分裂活性、抗原プロセシングに関連する（Ｍｏｕ
ｒｉｔｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１９８７−１９９３（１９９２
）；Ｆａｌｋら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：２３０−２４２（１９
９４））；細胞接着、および移動（Ｍｅｎｒａｄら、前出、１９９３；Ｓａｉｋ
ｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５４：１３７−１４３（１９９３）；Ｋｏｃ
ｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１６５−１７３（１９９１））。さら
に、ＣＤ１３はまた、腫瘍浸潤（Ｓａｉｋｉら、前出、１９９３、Ｆｕｊｉｉら
、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｔｉｓ １３：３３７−３４４（１９９５
））、シグナル伝達（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ
．２１：３８２６−３８２７（１９８９））、細胞周期制御および分化（Ｍａｋ
ｒｙｎｉｋｏｌａら、前出、１９９５）；Ｒｉｅｍａｎｎら、前出、１９９７）
；ならびにウイルスについてのレセプターとして（Ｄｅｌｍａｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３５７：４１７−４２０（１９９２）；Ｙｅａｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
５７：４２０−４２２（１９９２））において関連付けられている。

【００２０】 ＣＤ１３の発現レベルおよび酵素活性は、生理的に調節されており、ＣＤ１３
の活性および基質特異性は、配座変化と関連しており、そして増殖シグナルのよ
うな細胞に対する種々の刺激によって誘導される。モノクローナル抗体を用いた
研究もまた、ＣＤ１３が潜在性の部位の曝露をもたらし得、そして酵素活性を調
節し得る調節性分子内変化を受けることを示している。特定のエピトープの存在
はまた、急性骨髄性白血病の予後に関連付けられている（Ｘｕら、前出、１９９
７；Ｆａｖａｌｏｒｏら、前出、１９８８；Ｍａｋｒｙｎｉｋｏｌａら、前出、
１９９５）。

【００２１】 細胞表面ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮ酵素活性は、ベスタチン、ｏ−フェ
ナントロリンおよびアクチノニンによって強力にブロックされ得る（Ｔａｙｌｏ
ｒ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：２９０−２９８（１９９３）；Ｒａｗｌｉｎｇｓおよ
びＢａｒｒｅｔ、前出、１９９３；Ｓａｉｋｉら、前出、１９９３）。さらに、
ベスタチンは、免疫調節効果を有することが示されており、そして高用量のベス
タチンの投与は、実験的および自発的な転移の顕著な抑制ならびに腫瘍細胞浸潤
の阻害をもたらす（Ｂｒｕｌｅｙ−Ｒｏｓｓｅｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：７
５−８３（１９７９）；ｖａｎ Ｈａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：２７
１８−２７２８（１９９４）；Ｓａｉｋｉら、前出、１９９３；Ｆｕｊｉｉら、
前出、１９９５）。ＣＤ１３は、血管系の外側で発現するが、本明細書において
開示された結果は、抗ＣＤ１３抗体との免疫反応性を有するＮＧＲレセプターが
腫瘍血管における循環に曝露されるのみであることを示す（実施例ＸＩＩを参照
のこと）。

【００２２】 本明細書において使用される用語「ＮＧＲレセプター」とは、血管形成性血管
系において発現され、そしてＮＧＲモチーフを特異的に結合する標的分子を意味
する。以下ならびに実施例ＩＸおよびＸに記載されるように、ＮＧＲレセプター
が実質的に精製され、そしていくつかのＮＧＲ含有ペプチドに特異的に結合する
が無関連のコントロールペプチドには結合しないことが実証された。本明細書に
おいて開示されるＮＧＲレセプターは、高度に保存された、ＣＤ１３／アミノペ
プチダーゼＮ（ＣＤ１３／ＡＰＮ）と称する膜貫通アミノペプチダーゼの特徴を
示す。本明細書において開示されるように、ＮＧＲレセプターは、膜貫通型レセ
プターであり得る。ＮＧＲレセプターはまた、抗ＣＤ１３モノクローナル抗体と
免疫反応し、そしてアミノペプチダーゼ活性を有する分子であり得る。例えば、
ＮＧＲレセプターは、ＣＤ１３／ＡＰＮ（配列番号２０１）のアミノ酸配列に実
質的に類似するアミノ酸配列を有し得る。このようなＮＧＲレセプターは、ＣＤ
１３／ＡＰＮの配列（配列番号２０１）に同一であるアミノ酸配列を有し得るか
、または、そのレセプターが血管形成性血管系に発現し、そして特定のＮＧＲ結
合活性を保持する限り、１以上の改変（例えば、欠失、挿入または置換、これら
は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換を含む）を有し得る。用語
「ＮＧＲレセプター」はまた、例えば、改変された形態の天然に存在するアミノ
酸（例えば、Ｄ−立体異性体）、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログ
および模倣体を含むポリペプチドを、そのようなポリペプチドが上記に規定され
るような機能的活性を保持する限り、包含することが意図される。

【００２３】 ＮＧＲレセプターの機能的フラグメントもまた、本発明の方法において例えば
、腫瘍の血管形成性血管系にホーミングをする腫瘍ホーミング分子を同定するた
めに有用であり得る。本明細書において使用される場合、用語「機能的フラグメ
ント」は、ＮＧＲレセプターに言及して使用されるときには、ホーミング分子に
対するいくつかまたは全ての結合活性を保持するＮＧＲレセプターの一部をいう
。このような機能的フラグメントは、例えば、ＮＧＲモチーフを結合するドメイ
ン（例えば、ＮＧＲレセプターの細胞外ドメインまたは抗体と特異的に反応性で
あるエピトープ）であり得る。腫瘍ホーミング分子を同定するにおいて有用なＮ
ＧＲレセプターの機能的フラグメントは、例えば、ＣＤ１３／アミノペプチダー
ゼＮのドメイン細胞外カルボキシ末端ドメインであり得る（Ｌｏｏｋら、前出、
１９８９）。

【００２４】 本明細書において使用される場合、用語「特異的結合」とは、非特異的相互作
用とは測定可能なほどに相違する結合を意味する。特異的結合は、コントロール
分子の結合と比べて、分子の結合を決定することによって、測定され得る。この
コントロール分子は、一般的に、結合活性を有しない類似の構造の分子、例えば
、ＮＧＲを欠く類似のサイズのペプチドである。この場合、特異的結合は、その
分子が、コントロール分子よりも、ＮＧＲレセプターについて、測定可能なほど
に、より高親和性を有する場合に示される。結合の特異性は、例えば、標的と結
合することが公知のコントロール分子との競合によって決定され得る。例えば、
ＮＧＲペプチドの特異的結合は、同じＮＧＲペプチドまたはＮＧＲモチーフを含
む異なるペプチドとの結合について競合させることによって実証され得る。この
場合、特異的結合は、分子との結合がペプチドを含む第二のＮＧＲによって競合
的に阻害される場合に示される。

【００２５】 用語「特異的結合」は、本明細書において使用される場合、低親和性および高
親和性の両方の特異的結合を包含する。特異的結合は、例えば、少なくとも約１
０^-4ＭのＫｄを有する低親和性ホーミング分子によって示され得る。例えば、ホ
ーミング分子に対するレセプターが１を超える結合部位を有する場合、低親和性
を有するホーミング分子は、血管形成性血管系を標的化するために有用であり得
る。特異的結合はまた、高親和性ホーミング分子（例えば、少なくとも約１０^-7 Ｍ、少なくとも約１０^-8Ｍ、少なくとも約１０^-9Ｍ、少なくとも約１０^-10Ｍ、 のＫｄを有するホーミング分子）によって示され得るか、あるいは、少なくとも
約１０^-11Ｍ、または少なくとも約１０^-12Ｍ以下のＫｄを有し得る。低親和性お
よび高親和性のホーミング分子は、血管形成性血管系を標的化するのに有用であ
る。

【００２６】 腫瘍内の血管系は、一般に、活発な血管形成を行い、これは増殖しつつある腫
瘍を支持する新たな血管の継続的形成をもたらす。このような血管形成血管は、
血管形成血管系が独特の内皮細胞表面マーカー（α_vβ₃インテグリン（Ｂｒｏｏ
ｋｓ、Ｃｅｌｌ ７９：１１５７−１１６４ （１９９４）、これは本明細書に
おいて参考として援用される；ＷＯ ９５／１４７１４、国際出願日１９９４年
１１月２２日）、および血管形成増殖因子に対するレセプター（Ｍｕｓｔｏｎｅ
ｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２９：８９５−８
９８ （１９９５）；Ｌａｐｐｉ、Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．
６：２７９−２８８（１９９５））を含む）を発現する点で成熟血管系と区別し
得る。さらに、腫瘍血管系は、腫瘍血管系が有窓性である点で、一般的に血管と
組織学的に区別し得る（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １：２７−
３１（１９９５）；Ｒａｋら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ６：３−１
８（１９９５））。従って、血管形成性血管系は、主要ホーミング分子を標的化
するための，特に魅力的な標的である。このような腫瘍ホーミング分子は、薬剤
が正常で健康な器官または組織に対する毒性効果を有する可能性を低減しながら
、薬剤（例えば、化学療法薬）を腫瘍に指向するために有用であり得る（実施例
ＶＩＩＩおよびＸＶ）。さらに、血管形成性血管系に選択的にホーミングする分
子はまた、例えば、炎症組織、再生組織または創傷組織に存在する新血管系の他
の型の標的化において使用し得る。本明細書において使用される場合、用語「腫
瘍の血管形成性血管系へのホーミングをする腫瘍ホーミング分子」とは、腫瘍の
血管形成性血管系において発現する標的分子に対して特異的に結合し得る分子を
意味する。同様に、用語「血管形成性血管系にホーミングするホーミング分子」
とは、血管形成性血管系に発現した標的分子に対して特異的に結合し得る分子を
意味する。ホーミング分子は、腫瘍ホーミング分子であり得ることが理解される
。

【００２７】 ホーミング分子は、腫瘍または非腫瘍組織において血管形成性血管系に結合し
得る。腫瘍および非腫瘍の血管系生成血管系の両方に結合するホーミング分子は
また、腫瘍または非腫瘍の組織に対する優先的な結合を示し得る。例えば、腫瘍
ホーミングペプチド（例えば、ＮＧＲペプチド）は、非腫瘍血管形成性血管系と
比較して、腫瘍の血管形成性血管系において優先的に蓄積し得る。

【００２８】 本発明はまた、実質的に純粋なＮＧＲレセプターを用いて血管形成性血管系へ
のホーミングをするホーミング分子を同定する方法を提供する。この方法は、実
質的に生成されたＮＧＲレセプターを１以上の分子と接触させる工程、およびＮ
ＧＲレセプターに対する分子の特異的な結合を決定する工程であって、ここで、
特異的結合の存在によって、その分子が血管形成性血管系へのホーミングをする
ホーミング分子であると同定される、工程を包含する。

【００２９】 本発明のホーミング分子を同定するための方法はまた、ＮＧＲ結合分子をイン
ビボで投与する工程、および血管形成性血管系へのそのＮＧＲ結合分子の結合を
決定する工程を包含する。従って、本発明は、非腫瘍組織において血管形成性血
管系に結合するホーミング分子および腫瘍の血管形成性血管系へホーミングする
ホーミング分子を同定するための方法を提供する。本明細書に開示されるように
、実質的に精製されたＮＧＲレセプターを使用して、被験体の非腫瘍新血管形成
された組織へのホーミングをするホーミング分子を同定し得、そして腫瘍ホーミ
ング分子を同定し得る。

【００３０】 血管形成性血管系へとホーミングするホーミング分子または腫瘍の血管形成性
血管系へとホーミングする腫瘍ホーミング分子は、１以上の分子、例えば、分子
のライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。本明細書におい
て使用される場合、用語「ライブラリー」とは、分子の収集物を意味する。ライ
ブラリーは、少数または多数の異なる分子を含み得、これは、約１０分子から数
十分子以上にまで変動する。所望である場合、分子は、タグに連結され得、これ
はその分子の回収または同定を容易にし得る。本明細書において開示されるよう
に、血管形成性血管系へホーミングするホーミング分子は、実質的に精製された
ＮＧＲレセプターに対するインビトロスクリーニングによって同定され得る。

【００３１】 本明細書中で使用される場合、用語「分子」は、薬物のような有機化学薬品；
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドのような核酸分子；改変体もしく
は改変されたペプチドまたはペプチド様分子（本明細書中ではペプチド模倣物と
いい、これはペプチドの活性を模倣する）を含むペプチド；あるいは抗体または
増殖因子レセプターまたはそのフラグメント（例えば、結合ドメインを含む抗体
のＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＦｄまたはＦａｂフラグメント）のようなタン
パク質を意味するために広く使用される。便宜上、用語「ペプチド」は、例えば
、環状配座または直鎖配座を有し得る、ペプチド、タンパク質、タンパク質のフ
ラグメントなどを意味するために本明細書中で広く使用される。分子はまた、天
然に生じないが、インビトロ方法の結果として産生される天然に存在しない分子
であり得るか、あるいはｃＤＮＡライブラリーもしくはペプチド模倣物から発現
されるタンパク質またはそのフラグメントのような天然に存在する分子であり得
る。

【００３２】 本発明の方法に従って実質的に精製されたＮＧＲレセプターに対してスクリー
ニングされる分子は、「ペプチド模倣物」であり得、これは、腫瘍ホーミングペ
プチドの結合活性を有するペプチド様分子（例えば、ＮＧＲペプチドのペプチド
模倣物アナログ）を意味するために広く使用される。従って、化学的に改変され
たペプチド、天然に存在しないアミノ酸を含むペプチド様分子、ペプトイドなど
を含むペプチド模倣物、特にＮＧＲ含有ペプチドのペプチド模倣物、は、ＮＧＲ
レセプターに特異的に結合する能力について、血管形成性血管系へホーミングす
る際の活性について、スクリーニングされ得る（例えば、「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅ
ｒｙ」第５版，第１−３巻（Ｍ．Ｅ． Ｗｏｌｆｆ編； Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ １９９５を参照のこと）、これは参考として本明細書中に援
用される）。ペプチド模倣物は、ペプチドを越える種々の利点、例えば消化管の
通過中の安定性の増加を提供し、従って経口投与に有利に使用される。

【００３３】 ペプチド模倣物の収集物またはライブラリーは、当該分野で周知である（例え
ば、可能性のあるペプチド模倣物のライブラリーを含むデータベース）。例えば
、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、公知の結
晶構造を有する３００，０００より多くの化合物の収集物を含む（Ａｌｌｅｎら
， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｂ項， ３５：２３３１ （１９７
９））。この構造寄託は、新しい結晶構造が決定されるにつれて絶えず更新され
、そして適切な形状、例えば、腫瘍ホーミング分子（例えば、ＮＧＲペプチド）
と同じ形状を有する化合物について、ならびに腫瘍ホーミングペプチドによって
結合された標的分子への可能性のある幾何学的および化学的相補性を有する化合
物についてスクリーニングされ得る。腫瘍ホーミングペプチド，または腫瘍ホー
ミング分子を結合する標的分子の結晶構造が利用可能でない場合、構造は、例え
ば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎ
ｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ． ２９：２５１ （１９８９））を使用して生
成され得る。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄ
ｉｒｅｃｔｏｒｙ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ，
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ； Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ ＣＡ
）は、市販されている約１００，０００化合物を含み、そしてまた腫瘍ホーミン
グ分子または本発明の方法に従って、血管形成性血管系へホーミングするホーミ
ング分子を同定するためにスクリーニングされ得る。

【００３４】 ペプチド、ペプトイド、およびペプチド模倣物のような分子の種々のタイプの
異なる集団を含むライブラリーを調製する方法は、当該分野で周知であり、そし
て種々のライブラリーが市販されている（例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋ
ｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１−３６０（１９９５）、なら
びにＢｌｏｎｄｅｌｌｅら，Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３−
９２（１９９５）、およびそこに引用される参考文献を参照のこと、そのそれぞ
れは参考として本明細書中に援用される；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ，Ｐｅｐｔ
ｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，「Ｂｕｒｇｅｒ’
ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏ
ｖｅｒｙ」第１巻 （Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ １９９５），８０３−８６１頁、ならびにＧｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１ （１９９４）も参照のこと、それらのそ
れぞれは参考として本明細書中に援用される）。分子が、ペプチド、タンパク質
、またはそのフラグメントである場合、分子は、インビトロで直接生成され得る
か、またはインビトロで生成され得る核酸から発現され得る。合成ペプチドおよ
び核酸化学の方法は当該分野で周知である。

【００３５】 分子のライブラリーはまた、例えば、目的の細胞、組織、器官、または生物か
ら集められたｍＲＮＡからｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築することによって産
生され得る。このようなライブラリーを産生する方法は当該分野で周知である（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）、これは参考として本明細
書中に援用される）。好ましくは、ｃＤＮＡによってコードされるペプチドは、
ｃＤＮＡを含む細胞またはウイルスの表面で発現される。例えば、ｃＤＮＡは、
融合５（実施例Ｉ）のようなファージベクター中にクローン化され得、ここで、
発現の際、コードされたペプチドは、ファージの表面で融合タンパク質として発
現される。

【００３６】 さらに、分子のライブラリーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのアナロ
グであり得る核酸分子のライブラリーを含み得る。例えば、細胞表面レセプター
に結合する核酸分子は周知である（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら， Ｐｒｏｃ
． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９３：５８８３−５８８７
（１９９６）；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５
−５１０ （１９９０）；Ｇｏｌｄら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ
． ６４：７６３−７９７ （１９９５）を参照のこと、それらのそれぞれは参
考として本明細書中に援用される）。従って、核酸分子のライブラリーは、実質
的に精製されたＮＧＲレセプターと接触して、腫瘍ホーミング分子または血管形
成性血管系へホーミングするホーミング分子を同定し得る。所望であれば、核酸
分子は、例えば、ヌクレアーゼによる攻撃に対してあまり感受性ではない核酸ア
ナログであり得る（例えば、Ｊｅｌｉｎｅｋら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３４：１１３６３−１１３７２ （１９９５）；Ｌａｔｈａｍら， Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２８１７−２８２２ （１９９４）；Ｔａｍら
， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：９７７−９８６ （１９９４）
；Ｒｅｅｄら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：６５６５−６５７０ （１９
９０）を参照のこと、それらのそれぞれは参考として本明細書中に援用される）
。

【００３７】 ＮＧＲレセプターに対する特異的結合について、およびそれゆえ、血管形成性
血管系へのホーミングにおける活性についてスクリーニングされる分子の特に有
用なライブラリーは、ファージディスプレーライブラリーを含む。分子のこのよ
うなファージディスプレーライブラリーは、種々の状況において、二次ライブラ
リー（これは、環状ファージディスプレイペプチドライブラリー（例えば、Ｘ₂ ＣＮＧＲＣＸ₂（配列番号２２２）、ＣＸ₂（Ｃ／Ｘ）ＮＧＲ（Ｃ／Ｘ）Ｘ₂Ｃ（ 配列番号２２３）、およびＣＮＧＲＣＸ₆（配列番号２２４））（ここで、「Ｃ 」は、システインであり、そして「Ｘ」は、任意のアミノ酸である）；実施例Ｘ
を参照のこと）を含む）を含む。スクリーニングされる分子のライブラリーはま
た、抗体あるいはＦｖ、単鎖ＦｖまたはＦａｂフラグメントのような抗体フラグ
メントのライブラリーであり得；実施例Ｘにおいて開示されるように、このよう
なライブラリーは、例えば、ヒト腫瘍異種移植片で免疫したウサギから調製され
たコンビナトリアルｓｃＦｖライブラリーであり得る。このような抗体は、抗Ｃ
Ｄ１３抗体Ｆ２３およびＭＹ７によって認識される同じエピトープに結合し得る
か、または異なるエピトープに結合し得る。

【００３８】 当業者は、実質的に精製されたＮＧＲレセプターを特異的に結合する分子がＮ
ＧＲレセプターを結合し得、そしてその活性を調節し得るか、あるいは、ＮＧＲ
レセプターの活性に影響を与えるその能力に関して不活性であり得ることを理解
する。本明細書において開示されるように、例えば、ＮＧＲレセプターは、血管
形成において機能的に重要である。実質的に精製されたＮＧＲレセプターと特異
的に結合する分子は、アゴニストまたはそのレセプターのインヒビターであり得
、従って、血管形成を増強し得るかまたは阻害し得る。

【００３９】 ＮＧＲレセプターのインヒビターは、ＮＧＲレセプターに対して高度に特異的
であり得る。例えば、特異的インヒビターは、ＮＧＲレセプターにして高度な特
異性で結合する抗体であり得る。その抗体は、この抗体の結合の際にＮＧＲレセ
プター活性を阻害する固有の特性を有し得る。あるいは、阻害性ではないがＮＧ
Ｒレセプターに特異的に結合する抗体は、薬物または標的に結合体化されて、特
異的インヒビターを生成し得る。この抗体は、モノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体であり得、あるいは、Ｆｖ、単鎖ＦｖまたはＦａｂフラグメントの
ような機能的抗体フラグメントであり得る。

【００４０】 従って、ＮＧＲレセプターへの特異的な結合を示すモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって産生され得る。（Ｈａｒｌ
ｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａ
ｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ １９８８）、これは本明細書において参考として援用される）。ある
いは、機能的フラグメントのライブラリー（これは、ＮＧＲレセプターに結合し
得る）はまた、ＮＧＲレセプターに結合するホーミング分子を同定するためにス
クリーニングされ得る。例えば、ヒト腫瘍異種移植片または実質的に精製された
ＮＧＲレセプターで免疫することによって生成した、コンビナトリアルｓｃＦｖ
ライブラリーは、ＮＧＲレセプターに対する結合についてスクリーニングされ得
る（実施例Ｘを参照のこと）。

【００４１】 ＮＧＲレセプターに対して高度に特異性であるインヒビターに加えて、インヒ
ビターはまた、ＮＧＲレセプターに関連するが同一ではない他の分子に対する阻
害性活性を示し得る。例えば、アミノペプチダーゼインヒビターは、アミノペプ
チダーゼについて特異的な活性を示し得るか、またはいくつかのアミノペプチダ
ーゼに対する阻害性活性を示し得る。ＮＧＲレセプターに結合し、そしてアミノ
ペプチダーゼであるホーミング分子は、そのインヒビターが標的の血管新生され
た組織におけるＮＧＲレセプターへの優先的な結合を示す場合に、特に有用であ
る。

【００４２】 従って、実質的に精製されたＮＲＧレセプターを特異的に結合するに際の活性
についてスクリーニングされる分子のライブラリーは、アミノペプチダーゼの天
然の基質の構造アナログおよびアミノペプチダーゼインヒビターの構造アナログ
を含む。このようなライブラリーは、Ａｌａ−ＰＮＡのような基質の構造アナロ
グ；Ｌｅｕ−エンケファリン；Ｍｅｔ−エンケファリンまたはツフシン（Ｘｕら
、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２５：５２１−５２９（
１９９７）、これは、本明細書において参考として援用される）を含み得る。こ
のようなライブラリーはまた、アミノペプチダーゼインヒビターの構造アナログ
、例えば、アクチノニン；アマスタチン；ベスタチン；１，１０−フェナントロ
リンもしくはｏ−フェナントロリン；または２，２’−ジピリジル；あるいはＰ
ｈｅ−Ｌｅｕのアナログ（Ｘｕら、前出、１９９７）を含む。このようなライブ
ラリーは、さらに、フマジリン（Ｓｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９４：６０９９−６１０３（１９９７）、これは、本明細書にお
いて参考として援用される）を含み得る。上記より、実質的に精製されたＮＧＲ
レセプターを特異的に結合する分子は、Ｐｈｅ−Ｌｅｕの天然に存在する構造ア
ナログまたは天然に存在しない構造アナログであり得る。

【００４３】 上記のようなファージおよびＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに
加えて、コンビナトリアル化学ライブラリーもまた、本発明の方法に従って実質
的に精製されたＮＧＲレセプターを用いてインビトロでスクリーニングされ得る
。コンビナトリアルライブラリーを生成するための方法は、例えば、以下に記載
されるように当該分野で周知である：Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ／３７：１２０３−１２５１（１９９４）；ならびにＷｉｌｓｏｎおよびＣｚ
ａｒｎｉｋ編、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）、これらは各々が、
本明細書において参考として援用される。

【００４４】 分子のライブラリー内でＮＲＧレセプターを特異的に結合する腫瘍ホーミング
分子またはホーミング分子の存在は、当該分野で周知の種々の方法を用いて同定
され得る。一般的に、ライブラリーにおける化合物は、個々に、例えば、高処理
能力スクリーニングを用いて試験され得る。所望であれば、個々の化合物は、そ
の分子の回収まはた同定を容易にするためにタグ化され得る。このようなタグ化
ライブラリーは、インビボおよびインビトロのスクリーニングについて有用であ
る。

【００４５】 本明細書において使用される場合、用語「タグ（化）」とは、そのライブラリ
ーの分子に連結している物理的、化学的または生物学的な部分（例えば、それぞ
れ、プラスチックビーズ、オリゴヌクレオチドまたはバクテリオファージ）を意
味する。分子をタグ化する方法は、当該分野で周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ
、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ １９９６）、これは、本明細書において参考として援用される）。

【００４６】 特異的なタグが、血管形成性血管系にホーミングする腫瘍ホーミング分子また
はホーミング分子を同定するために、本発明の方法において、特に有用であり得
る。本明細書において使用される場合、用語「特異的なタグ（化）」とは、ライ
ブラリーの特定の分子に連結し、そしてその特定の分子に独特である、物理的、
化学的または生物学的なタグをいう。特異的なタグは、それが容易に同定可能で
ある場合、特に有用である。ライブラリーの特定の分子に独特なヌクレオチド配
列は、特異的なタグの例である。例えば、独特のヌクレオチド配列でタグ化され
たペプチドを合成する方法は、それぞれヌクレオチド配列を決定する際に、その
ペプチドの同一性が公知であるような特異的タグを含む分子のライブラリーを提
供する（ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３ （１９９２）を参照
のこと、これは参考として本明細書中に援用される）。ペプチドまたは他の型の
分子に特異的なタグとしてのヌクレオチド配列の使用は、試料中の分子の存在を
同定するための単純な手段を提供する。なぜなら、ＰＣＲのような非常に感度の
ある方法が、特異的タグのヌクレオチド配列を決定し、それによって連結される
分子の配列を同定するために使用され得るからである。同様に、特異的タグの配
列決定が発現されたペプチドのアミノ酸配列を同定するので、ファージで発現さ
れるペプチドをコードする核酸配列は、特異的タグのもう１つの例である。

【００４７】 同定された腫瘍ホーミング分子は、例えば、薬物、毒素または検出可能な標識
のような所望の分子（これは、その分子に連結され得る）を腫瘍に標的化するた
めに有用である。さらに、腫瘍ホーミング分子は、腫瘍においてそのホーミング
分子が結合する標的分子を同定するために有用である。一旦標的分子、例えば、
本明細書において開示されるＮＧＲレセプターが同定されると、その標的分子は
、さらなる腫瘍ホーミング分子を同定するために使用され得る。

【００４８】 本発明はまた、その被験体に対して、ＮＲＧレセプターに特異的な結合を示す
腫瘍ホーミング分子に結合された分子を含む結合体を投与して、それにより、そ
の結合体が腫瘍の血管形成性血管系に対して指向させることにより、被験体にお
ける腫瘍の血管形成性血管系に対して部分を指向させる方法を提供する。本発明
の方法において、腫瘍ホーミング分子は、例えば、配列ＮＧＲを含むペプチドで
あり得、そして所望であれば、その部分が細胞傷害性因子、薬物または化学療法
剤（例えば、ドキソルビシン）である結合体の部分であり得る。配列ＮＧＲを含
む腫瘍ホーミングペプチドは、例えば、配列ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列
番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）、
またはＣＮＧＲＣ（配列番号８）を有し得る。被験体における腫瘍の血管形成性
血管系に部分を指向させるための本発明の方法において、腫瘍ホーミング分子は
また、例えば、アミノペプチダーゼインヒビター（例えば、ベスタチン、ｏ−フ
ェナントロリン、アクチノニン、アマスタチン、２，２’−ジピリジルまたはフ
マジリン）であり得、そして所望であれば、ドキソルビシン部分に連結され得る
。

【００４９】 本発明はさらに、ＮＧＲレセプターへの特異的な結合を示す腫瘍ホーミング分
子に対して連結された部分を含む結合体を被験体に投与することによって、その
結合体を腫瘍の血管形成性血管系に指向させることによる、被験体における血管
新生を阻害する方法を提供する。本発明の方法において、腫瘍ホーミング分子は
、例えば、配列ＮＧＲを含むペプチドであり得、そして所望であれば、その部分
が細胞傷害性剤、薬物または化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）である結合
体の部分であり得る。配列ＮＧＲを含む腫瘍ホーミングペプチドは、例えば、配
列ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）、
ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）、またはＣＮＧＲＣ（配列番号８）を有し得
る。被験体における腫瘍の血管形成性血管系へ部分を指向させるための本発明の
方法において、腫瘍ホーミング分子はまた、例えば、アミノペプチダーゼインヒ
ビター（例えば、ベスタチン、ｏ−フェナントロリン、アクチノニン、アマスタ
チン、２，２’−ジピリジルまたはフマジリンであり得、そして所望であれば、
ドキソルビシン部分に連結され得る。

【００５０】 本発明はまた、非腫瘍組織において血管形成を阻害する方法を提供する。この
方法は、ＮＧＲレセプターに特異的な結合を示すホーミング分子に連結された部
分を含む結合体を投与することによって、その結合体が非腫瘍組織の血管形成性
血管系に指向される工程を包含する。非腫瘍組織において血管形成を阻害するこ
とは、例えば、黄斑変性における網膜血管新生のような血管新生された組織およ
び糖尿病ならびに慢性関節リウマチ滑膜における血管新生を含む疾患を処置する
ために有用である。

【００５１】 開示されるように、腫瘍ホーミング分子は、腫瘍に対して薬物または毒素を標
的化するためにその薬物または毒素のような部分に結合体化し得る。例えば、Ｎ
ＧＲ含有ペプチド、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ
（配列番号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）、またはＣＮＧＲＣ（配列
番号８）の１つのような腫瘍ホーミング分子は、血管形成性血管系に対して部分
を指向させるために使用され得る。インビボまたはインビトロで上記のように同
定されるＮＧＲレセプターに結合するさらなる腫瘍ホーミング分子はまた、腫瘍
の血管形成性血管系に対して部分を指向させるために使用され得る。

【００５２】 ＮＧＲを含む腫瘍ホーミング分子に加えて、ＮＧＲレセプターに特異的に結合
する他の腫瘍ホーミング分子もまた、血管形成性血管系を標的化するのに有用で
ある。以下に記載されるように、ＮＧＲレセプターは、アミノペプチダーゼ活性
を示し、そしてこのアミノペプチダーゼ活性は、ベスタチン、ｏ−フェナントロ
リンおよびアクチノニンのような公知のインヒビターによって阻害され得る。従
って、ＮＧＲ含有ペプチドに加えて、ＮＧＲレセプターに結合する他の分子もま
た、腫瘍ホーミング分子として機能し得る。例えば、アミノペプチダーゼインヒ
ビター（例えば、ベスタチン、ｏ−フェナントロリン、アクチノニン、アマスタ
チン、２，２’−ジピリジルまたはフマジリン）が、薬物または毒素を有する結
合体として、血管形成性血管系へとホーミングさせるのに使用され得る。

【００５３】 本発明は、さらに、被験体に、ＮＧＲレセプターに対して特異的な結合を示す
ホーミング分子に連結した部分を含む結合体を投与する（ここでその部分が血管
形成性血管系へと指向される）ことによって、その被験体における血管形成性血
管系へと部分を指向させる方法を提供する。従って、本発明は、例えば、薬物ま
たは毒素の結合体を、非腫瘍組織の血管形成性血管系へと指向させる方法を提供
する。非腫瘍組織の血管形成性血管系への結合体の標的化は、例えば、黄斑変性
における網膜血管新生および糖尿病ならびに慢性関節リウマチ滑膜における血管
新生のような血管新生された組織を含む疾患を処置するために有用である。

【００５４】 種々の部分が本発明の方法において血管形成性血管系に指向され得る。本明細
書において使用される場合、用語「部分」とは、広く使われて、腫瘍ホーミング
分子によって認識される標的分子を発現する腫瘍または血管形成性血管系へと、
インビボで標的化される目的のための腫瘍ホーミング分子が連結されている物理
的、化学的、または生物学的物質を意味する。特に、部分は、治療的部分、診断
的部分または薬物送達ビヒクルのような生物学的に有用な部分である。従って、
部分は、治療的薬剤であり得、例えば、ガン化学療法剤（例えば、ドキソルビシ
ン、これは、腫瘍ホーミング分子に連結される場合、被験体におけるガンを処置
するために有用な結合体を提供する）であり得る。さらに、部分は、チャンバー
化されたマイクロデバイス、細胞、リポソームまたはウイルスのような薬物送達
ビヒクル（これは、薬物または核酸のような薬剤を含み得る）であり得る。

【００５５】 部分はまた、ポリペプチドまたは核酸のような分子であり得る。これに、腫瘍
ホーミング分子が、そのポリペプチドまたは核酸を選択した腫瘍に指向させる目
的のために移植される（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２
７８８−３２７９５（１９９４）；Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
１５：１４４７−１４５１（１９９７）、これら各々は本明細書において参考と
して援用される）。例えば、ペプチド腫瘍ホーミング分子は、そのペプチドが移
植されたポリペプチドを選択した腫瘍に標的化するように所望のポリペプチドと
ともに融合タンパク質として発現され得る。このような所望のポリペプチドは、
腫瘍ホーミングペプチドへと移植され、これは、細胞死経路を惹起することに関
与するポリペプチド（例えば、カスパーゼ８）であり得る。従って、これは、腫
瘍へカスパーゼ８を指向させる手段を提供し、ここで、これは、腫瘍細胞または
腫瘍を供給する血管系のアポトーシスを誘発し得る。腫瘍ホーミングペプチドは
また、ウイルスによって発現されるポリペプチド、例えば、アデノウイルスペン
トン塩基被覆タンパク質へと移植され得、従って、腫瘍へとウイルスを標的化す
る手段を提供し得る（Ｗｉｃｋｎａｍら、Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２：７５０−７
５６（１９９５）；Ｗｅｉｔｚｍａｎら、「Ｇｅｎｅ Ｔｈｙｅｒａｐｙ ａｎ
ｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ」２：１７−２５（１９９７）、各々は本明
細書において参考として援用される；実施例ＩＩＩもまた参照のこと）。このよ
うな移植されたウイルスは、遺伝子治療の方法において有用である外因性遺伝子
を含有し得る。従って、本発明は、腫瘍ホーミング分子／部分結合体を含む合成
物を提供する。

【００５６】 部分は、放射標識のような検出可能な標識であり得るか、または細胞傷害性因
子（毒素（例えば、リシン）または薬物（例えば、化学療法剤）を含む）であり
得るか、あるいは物理的、化学的もしくは生物学的物質（例えば、リポソーム、
マイクロカプセル、マイクロポンプまたは他のチャンバー化されたマイクロデバ
イス）であり得、これは、例えば、薬物送達系として使用され得る。一般的に、
このようなマイクロデバイスは、非毒性であるべきであり、所望であれば、生体
分解性であるべきである。マイクロカプセルを含む種々の部分（薬剤を含み得る
）およびチャンバー化されたマイクロデバイスを含む部分を本発明の分子に連結
させる方法は、当該分野で周知であり、そして市販されている（例えば、「Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１
８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９０）、第８９−９１節；
ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）を参照のこと、これは本明細書において参考とし
て援用される；Ｈｅｒｍａｓｏｎ、前出、１９９６もまた、参照のこと）。

【００５７】 本明細書において開示されるように、部分は、例えば、腫瘍ホーミング分子／
部分結合体を産生するための、腫瘍ホーミング分子に連結されたガン化学療法で
あり得る。細胞傷害性化学療法は、播種性悪性腫瘍の全身処置の基礎である。し
かし、現在使用される化学療法剤の主要な限定は、これらの薬物が全ての医薬に
おいて極狭の治療インデックスを有することである。それ自体、ガン化学療法療
剤の用量は、処置される患者に対して所望されない毒性によって限定される。従
って、本発明の腫瘍ホーミングペプチドが薬物を腫瘍へと標的化する能力が試験
された。本明細書に開示されるように、ガン化学療法剤であるドキソルビシンの
腫瘍ホーミング分子への連結は、そのドキソルビシンの全身毒性を減少させ、そ
してその薬剤の抗腫瘍活性を増強した（実施例ＶＩＩＩおよびＸＶを参照のこと
）。

【００５８】 本発明の結合体は、本明細書において、種々の腫瘍ホーミングペプチドと連結
したドキソルビシンによって例示される（実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩを参照の
こと）。種々の腫瘍ホーミングペプチドにドキソルビシンを連結する例示された
方法および本発明のこのような結合体の開示された効力を参照すれば、当業者は
、種々の他の化学療法剤もまた、本発明の結合体を作製するための腫瘍ホーミン
グ分子へと連結され得る。ガン化学療法剤は、例えば、その抗体によって認識さ
れる抗原を発現する腫瘍細胞のような細胞へと、その薬剤を標的化するための目
的のために、抗体に連結され得る。さらに、このような抗体／薬物結合体におい
て、この薬剤は、その治療的機能を維持し得、そしてその抗体はその抗原結合特
異性を維持し得る。例えば、アントラサイクリン、ドキソルビシンは、抗体に連
結され、そしてその抗体／ドキソルビシン結合体は、腫瘍を処置するに治療的に
有効であった（Ｓｉｖａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２３５２〜２３５
６（１９９５）；Ｌａｕら、Ｂｉｏｏｒｇ，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：１２９９−
１３０４（１９９５）；Ｓｈｉｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｈｅｒ．３８：９２−９８（１９９４））。同様に、他のアントラサイク
リン（イダルビシンおよびダウノルビシンを含む）が抗体に化学的に結合体化さ
れ、これは、腫瘍へその薬剤の有効用量を送達した（Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：１９５−２０２（１９
９３）；Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３
８：６４１−６４８（１９８９））。

【００５９】 アントラサイクリンに加えて、アルキル化剤（例えば、メルファランおよびク
ロラムブシル）は、治療的に有効な結合体を生成するために、ビンカアルカロイ
ド（例えば、ビンデシンおよびビンブラスチン）においてなされたよう（Ａｂｏ
ｕｄ−Ｐｉｒａｋら、前出、１９８９；Ｓｔａｒｌｉｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．
Ｃｈｅｍ．３：３１５−３２１（１９９２））に、抗体に連結された（Ｒｏｗｌ
ａｎｄら、前出、１９９４；Ｓｍｙｔｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．６５：３１５−３２１（１９８７））。同様に、抗体および抗代謝物（例え
ば、５−フルオロウラシル、５−フルオロウリジンおよびそれらの誘導体）は、
腫瘍を処置するに有効である（Ｋｒａｕｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：
１３２−１３７（１９９２）；Ｈｅｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１５
７０−１５７９（１９９３））。他の化学治療剤（シスプラチン（Ｓｈｃｅｃｈ
ｔｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４８：１６７−１７２（１９９１）、メ
トトレキサート（Ｓｈａｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．７：６
０８−６１８（１９８８）；ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋおよびＧａｒｎｅｔｔ、Ａ
ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１０：１１−２４（１９９５））、お
よびマイトマイシンＣ（Ｄｉｌｌｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｈｅｒ．１：２５
０−２５５（１９８９））もまた、種々の異なる抗体との結合体として投与され
る場合に治療的に有効である。

【００６０】 抗体／薬物結合体を用いて得られた結果は、化学療法剤が抗体の抗原結合特異
性およびその薬剤の治療機能を維持する結合体を生成するために、抗体に連結さ
れ得る。本明細書において開示されるように、ドキソルビシンおよび腫瘍ホーミ
ングペプチドを含む結合体は、その腫瘍ホーミングペプチドの腫瘍ホーミング特
異性およびその化学療法剤の治療効力を維持する（実施例ＶＩＩＩおよびＸＶを
参照のこと）。このような結果は顕著である。なぜなら、ドキソルビシン／ＣＮ
ＧＲＣ（配列番号８）結合体において、例えば、そのドキソルビシン成分が、そ
のペプチドよりもほんの少し少ない分子量を有し、そしてその結合体の分子量の
約４６％を含むからである。

【００６１】 腫瘍ホーミング分子／部分結合体の部分成分は、腫瘍ホーミング分子が腫瘍に
対してホーミングする能力に悪影響を与えることなくその結合体の実質的な部分
を含み得るので、さらなる成分が所望に応じて、その結合体の部分として含有さ
れ得る。例えば、いくつかの場合、腫瘍ホーミングペプチドとその部分との間の
オリゴペプチドスペーサーを利用することが所望され得る（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉ
ｃｋおよびＧａｒｎｅｔｔ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１０：
１−９（１９９５））。この方法において、部分／スペーサー複合体のパネルが
構築され得、ここで、共通のスペーサ−が種々の異なる部分に連結される。この
ような部分／スペーサ−結合体のパネルは、選択された腫瘍ホーミングペプチド
のような腫瘍ホーミング分子に対するその部分の連結を容易にし得る。

【００６２】 ドキソルビシンは、最も一般的に使用されるガン化学療法剤の一つであり、そ
して特に、乳ガンの治療に対して使用される（ＳｔｅｗａｒｔおよびＲａｔａｉ
ｎ；「Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ
ｏｎｃｏｌｏｇｙ：第５版、第１９章（ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．ら編；Ｊ．Ｐ．
Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ １９９７）；Ｈａｒｒｉｓら、「Ｃｎａｃｅｒ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ」前出、
１９９７）。さらに、ドキソルビシンは、抗血管形成活性を有し（Ｆｏｌｋｍａ
ｎら、前出、１９９７；Ｓｔｅｒｉｎｅｒ、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｋｅ
ｙ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
ｍｅｄｉｃｉｎｅ」４４９〜４５４頁（Ｓｔｅｉｎｅｒら編；Ｂｉｒｋｈａｕｓ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９２）、これは、ガンを処置するにおいてその有効性
に寄与し得る。従って、ドキソルビシンを用いたマウスにおけヒト乳ガン異種移
植片の処置が本発明を例示するためのモデルとして選択された。

【００６３】 本明細書において使用される場合、用語「腫瘍」とは、少なくとも部分的に、
血管形成性血管系を含むことによって特徴付けられる細胞の塊を意味する。用語
「腫瘍」は、広く使用されて、腫瘍実質細胞および支持性間質を含み、これには
、腫瘍実質細胞塊に浸潤する血管形成性血管が含まれる。腫瘍は、一般的に、悪
性腫瘍、すなわち、「ガン」であるが、腫瘍はまた、血管新生がその腫瘍に関連
する限り、非悪性であり得る。用語「正常」および「非腫瘍」組織は、腫瘍では
ない組織というために使用される。本明細書において開示されるように、腫瘍ホ
ーミング分子は、それが腫瘍にホーミングするが、対応する非腫瘍組織にはホー
ミングしない能力に基づいて同定され得る。

【００６４】 本明細書において使用される場合、用語「対応（する）」とは、腫瘍または組
織あるいは両方に関して用いられるときには、２以上の腫瘍または２以上の組織
あるいは、腫瘍および組織が同じ組織型であることを意味する。当業者は、組織
の組織型が、その組織を含む細胞の関数であることを認識する。従って、当業者
は、例えば、乳腫瘍に対応する非腫瘍組織が正常胸部組織であり、他方、黒色腫
に対応する非腫瘍組織が、メラノサイトを含む皮膚であると認識する。さらに、
本発明の目的のために、腫瘍ホーミング分子が腫瘍における血管系によって発現
される標的分子に特異的に結合し得、この腫瘍が血管新生を受ける血管を全般に
含み、そしてこの場合、腫瘍に対応する組織が活性な血管新生を受けていない血
管を含む非腫瘍組織を含むことが理解される。

【００６５】 用語「対応（する）」はまた、本明細書において、例えば、ヒトに比較してマ
ウスにおいて腫瘍において発現される、標的分子の進化的に保存された性質に関
して使用される。従って、例えば、ヒト血管系に比較してマウスの腫瘍血管系に
おいて対応する標的分子との言及は、類似の機能、特に腫瘍ホーミング分子を特
異的に結合する能力を有する標的分子を意味する。

【００６６】 本明細書においてはさらに、ＮＧＲレセプターに対して特異的な結合を示す分
子に連結された検出可能な分子を有する結合体を、被験体に投与することによっ
て、その結合体が血管形成性血管系に選択的に結合させる工程およびその結合体
を検出する工程によって、被験体における腫瘍または他の病理学的組織の血管形
成性血管系を画像化する方法が提供される。血管形成性血管系を画像化するため
の検出可能部分は、例えば、放射性核種であり得る。血管形成性血管系を画像化
するために有用なホーミング分子は、例えば、配列ＮＧＲを含有するペプチド（
例えば、配列ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列
番号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）、またはＣＮＧＲＣ（配列番号８
））であり得る。血管形成性血管系を画像化するための腫瘍ホーミング分子はま
た、例えば、アミノペプチダーゼインヒビター（例えば、ベスタチン、ｏ−フェ
ナントロリン、アクチノニン、アマスタチン、２，２’−ジピリジルまたはフマ
ジリン）であり得る。検出可能な部分を腫瘍ホーミング分子に結合させるための
方法は、以下に記載される。従って、本明細書において記載されるようなＮＧＲ
レセプターを結合する腫瘍ホーミング分子の同定は、診断および予後目的のため
の腫瘍の画像化のために有用な試薬を提供する。

【００６７】 本発明はまた、配列ＮＧＲを含むペプチドを結合するＮＧＲレセプターを含む
、実質的に精製された標的分子であって、ただし、そのＮＧＲレセプターがＣＤ
１３／アミノペプチダーゼＮ（配列番号２０１）のアミノ酸配列を有さない標的
分子を提供する。従って、ＣＤ１３／アミノペプチダーゼ（配列番号２０１）の
配列と比較してアミノ酸の１以上の改変を有するＮＧＲレセプター（これは、例
えば、欠失、挿入または置換（これは、保存的および非保存的アミノ酸置換を含
む）を含み、そして配列ＮＧＲを特異的に結合する）は、本発明によって提供さ
れる。

【００６８】 本発明は、腫瘍に対して選択的にホーミングする分子に関する。例えば、本発
明は、ペプチドＣＧＲＥＰＲＬＣＱＳＳＣ（配列番号２）およびＣＮＧＲＣＶＳ
ＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）のような腫瘍ホーミングペプチド（これらは、それ
らが乳ガンへホーミングする能力をもとに同定された）、ならびにペプチドＣＬ
ＳＧＳＬＳＣ（配列番号４、これは、それが黒色腫へホーミングする能力に基づ
いて同定された）を提供する。このような腫瘍ホーミングペプチドは、インビボ
パニング（１９９７年４月２２日に発行された、米国特許第５，６２２，６９９
号；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３８０
：３６４−３６６ （１９９６）を参照のこと（それぞれは参考として本明細書
中に援用される））を用いて同定された。

【００６９】 開示された腫瘍ホーミングペプチドは、種々の特定の腫瘍へのそれらのホーミ
ングに基づいて同定された。例えば、インビボパニングを、ヒト乳ガン腫異種移
植片を有するマウスを使用して行い、そして乳腫瘍にホーミングするペプチドを
同定した。しかし、本明細書中に開示したように、このような腫瘍ホーミングペ
プチドは、一般的に、マウス黒色腫およびヒトカポジ肉腫を含む他のタイプの腫
瘍にホーミングした。したがって、腫瘍ホーミングペプチドＣＮＧＲＣＶＳＧＣ
ＡＧＲＣ（配列番号３）は、インビボで乳腫瘍へホーミングする能力によって同
定されるが、このペプチドはまた、インビボで黒色腫およびカポージ肉腫へホー
ミングするが、非腫瘍組織にホーミングしなかった。

【００７０】 同様に、腫瘍ホーミングペプチドＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４）を、メラノ
ーマへのホーミングに基づいて同定した。しかし、このペプチドのさらなる実験
は、乳腫瘍およびカポージ肉腫へもホーミングすることを示した。免疫組織学的
分析は、このような腫瘍ホーミングペプチドが、最初に種々の腫瘍の血管系に結
合するが、後の時点で分子が腫瘍実質細胞に結合することを明らかにした。した
がって、本発明の腫瘍ホーミング分子の一般的腫瘍ホーミング能力は、少なくと
も一部は、腫瘍に関連する血管形成血管系を標的化する腫瘍ホーミング分子の能
力による。これらの結果は、特異的標的分子が、非腫瘍組織における血管系によ
って発現される細胞表面分子と比較して、腫瘍における血管系を含む細胞によっ
て発現されることを示す。本明細書中に開示されるような方法を使用して、当業
者は、腫瘍ホーミング分子が、一般的に、腫瘍に関連した血管形成血管系にホー
ミングするか、または特定の型の腫瘍細胞に特異的にホーミングするか否かを、
容易に決定し得る。

【００７１】 同定された腫瘍ホーミング分子は、例えば、薬物、毒素、または検出可能な標
識（これは、この分子に連結され得る）のような所望の部分を腫瘍に標的化する
ために有用である。従って、本発明は、腫瘍ホーミング分子／部分結合体を提供
する。この結合体は、上記の部分を腫瘍に標的化するために有用である。従って
、本発明はまた、部分を腫瘍に標的化する方法、従って腫瘍の重篤度を低減する
方法、およびガンを有する被験体を処置する方法を提供する（実施例ＶＩＩＩお
よびＸＶを参照のこと）。さらに、腫瘍ホーミング分子は、標的分子を同定する
ために有用であり、このホーミング分子は腫瘍中でその標的分子に結合する。

【００７２】 分子ライブラリー内の腫瘍ホーミング分子を同定するための方法が、本明細書
中上記に記載されている。一般に、腫瘍中の腫瘍ホーミング分子の存在は、その
ライブラリー中に存在する分子に共通する１つ以上の特徴に基づいて同定され、
次いで特定の腫瘍ホーミング分子の構造が同定される。例えば、質量分析法のよ
うな高感度の検出法を、単独またはガスクロマトグラフィーのような方法と組み
合わせて使用して、腫瘍中の腫瘍ホーミング分子を同定し得る。従って、ライブ
ラリーが薬物のような有機分子の構造に一般に基づく異なる分子を含む場合、腫
瘍ホーミング分子は、特定の分子についての親ピークの存在を決定することによ
って同定され得る。

【００７３】 所望であれば、腫瘍が収集され得、次いで、例えば、ライブラリーを含む分子
の一般的特徴に依存して、規定の範囲の分子量または極性もしくは非極性の特徴
などを有する分子に富化された画分を提供し得る、ＨＰＬＣのような方法を使用
して処理され得る。ＨＰＬＣについての条件は、特定の分子の化学に依存し、そ
して当業者に周知である。同様に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、または
炭水化物のような潜在的に妨害性の細胞性物質の大量除去の方法は、例えば、選
択的抽出の方法を使用して、有機分子を含む画分を富化するための方法と同様に
当該分野で周知である。特異的分子がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し
てオリゴヌクレオチド配列を決定することによって同定され得るように、ライブ
ラリーが特異的オリゴヌクレオチドタグにそれぞれ連結された異なる有機化学分
子の集団を含む場合、ゲノムＤＮＡは、バックグラウンドＰＣＲ反応に対する可
能性を減少させるために、収集された腫瘍のサンプルから除去され得る。さらに
、ライブラリーは、共通の共有されたタグにそれぞれ連結された有機化学分子の
ような異なる分子の集団を含み得る。共有されたタグの存在および特性に基づい
て、腫瘍に選択的にホーミングするライブラリーの分子は、腫瘍のサンプルから
実質的に単離され得る。これらおよび他の方法は、特定の腫瘍ホーミング分子に
ついて収集された腫瘍のサンプルを富化し、それによって収集された腫瘍サンプ
ルから潜在的に夾雑する物質を除去し、そして分子を検出する感度を増加させる
ために有用であり得る。

【００７４】 本明細書中に提供される証拠は、十分な数の腫瘍ホーミング分子が、分子が容
易に同定され得るように、インビボパニング中に腫瘍に選択的にホーミングする
ことを示す。例えば、同じペプチドを発現する種々の独立したファージを、移植
されたヒト乳ガン細胞から（表１）、マウス黒色腫細胞から（表２）、またはヒ
トカポジ肉腫細胞から（表３）形成された腫瘍において同定した。

【００７５】 同定された腫瘍ホーミング分子の実質的な画分は同じ構造を有するが、単離さ
れたファージの少数のみのペプチド挿入物を決定した。しかし、器官ホーミング
ペプチドを発現する数十万から数百万のファージが、器官ホーミング分子につい
てのインビボパニングの後に回収されたことが認識されるべきである（例えば、
米国特許第５，６２２，６９９号；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈ
ｔｉ， 前出， １９９６を参照のこと）。これらの結果は、特異的腫瘍ホーミ
ング分子が、インビボホーミング後に腫瘍において実質的な数で存在し、それに
よって分子が同定され得る容易さを増加させることを示す。

【００７６】 腫瘍ホーミング分子、特にタグ化されていない分子の同定の容易さは、潜在的
に夾雑するバックグラウンド細胞性物質の存在を含む、種々の因子に依存する。
したがって、腫瘍ホーミング分子がタグ化されていないペプチドである場合、細
胞性タンパク質のバックグラウンドに対して特定のペプチドを同定するために、
より多数が腫瘍にホーミングしなければならない。対照的に、このような分子は
、正常には、身体に存在しないかまたは身体に少数のみ存在するので、薬物のよ
うなタグ化されていない有機化学ホーミング分子の非常に少数が同定可能である
。このような場合には、質量分析法のような高感度の方法が、腫瘍ホーミング分
子を同定するために使用され得る。当業者は、分子を同定する方法が、一部には
、特定の分子の化学に依存することを認識する。

【００７７】 数回のインビボホーミングは、数回のスクリーニング間に標的組織を抽出する
ことによるライブラリー分子の部分的精製とともに実施され得る。最終回のスク
リーニングの後に、十分な数のホーミング分子の回収を確実にするために、材料
は、より早い回のスクリーニングにおいて使用されるいく匹かの動物からプール
され得、そして次の回のスクリーニングにおいてより少ない数の動物に注入され
得る。あるいは、より大きな動物は、次の回のスクリーニングにおいてよりも早
い回に使用され得る。介在する工程なしでのスクリーニングの可能性は、ファー
ジを用いて実証されている。

【００７８】 腫瘍ホーミング分子が核酸であるかまたは核酸でタグ化される場合、原則とし
て、ＰＣＲは単一の核酸分子の存在を検出し得るので、ＰＣＲのようなアッセイ
は、分子の存在を同定するために特に有用であり得る（例えば、Ｅｒｌｉｃｈ，
ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｓｔｏｃ
ｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９８９）を参照のこと、これは参考として本明細書中
に援用される）。予備研究は、マウスへの１０ｎｇの約６０００塩基対プラスミ
ドの静脈内注射および循環中で２分の後、プラスミドが、肺のサンプルでのＰＣ
Ｒによって検出可能であることを実証した。これらの結果は、インビボパニング
が腫瘍へ選択的にホーミングする核酸分子を同定するために使用され得るように
、循環中に投与した場合、核酸は十分に安定であることを示す。

【００７９】 ライブラリーの分子は、タグ化され得、これは分子の回収または同定を容易に
し得る。本明細書中で使用される用語「タグ」とは、そのライブラリーの分子に
連結される、それぞれプラスチックマイクロビーズ、オリゴヌクレオチド、また
はバクテリオファージのような物理学的、化学的、または生物学的部分を意味す
る。分子をタグ化する方法は当該分野で周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，前出
（１９９６）、これは参考として本明細書中に援用される）。

【００８０】 共有されたタグまたは特異的タグであり得るタグは、ライブラリーの腫瘍ホー
ミング分子の存在または構造を同定するために有用であり得る。本明細書中で使
用される用語「共有されたタグ」とは、ライブラリー中のそれぞれの分子に共通
である、物理学的、化学的、または生物学的部分を意味する。例えば、ビオチン
は、ライブラリー中の各分子に連結される共有されたタグであり得る。共有され
たタグは、サンプル中のライブラリーの分子の存在を同定するために有用であり
得、そしてまた、サンプルから分子を実質的に単離するために有用であり得る。
例えば、共有されたタグがビオチンである場合、ライブラリー中のビオチンタグ
化された分子は、ストレプトアビジンへの結合によって実質的に単離され得るか
、あるいはその存在は、標識されたストレプトアビジンとの結合によって同定さ
れ得る。ライブラリーがファージ提示ライブラリーである場合、ライブラリーの
各ペプチドがファージに連結されるので、ペプチドを発現するファージは、共有
されたタグの別の例である。さらに、赤血球凝集素抗原のようなペプチドは、ラ
イブラリー中の各分子に連結される共有されたタグであり得、それによって、選
択された腫瘍のサンプルからライブラリーの分子を実質的に単離するために、赤
血球凝集素抗原に特異的な抗体の使用を可能にする。

【００８１】 共有されたタグはまた、サンプル中のライブラリーの分子の存在を同定するた
めに、またはサンプルからのライブラリーの分子を実質的に単離するために有用
であり得る核酸配列であり得る。例えば、ライブラリーの分子のそれぞれは、そ
の共有されたタグを構成する同じ選択されたヌクレオチド配列に連結され得る。
次いで、その共有されたタグに相補的なヌクレオチド配列を含むアフィニティー
カラムは、その共有されたタグを含むライブラリーの分子をハイブリダイズする
ために使用され得、従って腫瘍サンプルから分子を実質的に単離する。共有され
たヌクレオチド配列タグの一部に相補的なヌクレオチド配列はまた、共有された
タグを含む分子の存在が、ＰＣＲによってサンプル中で同定され得るように、Ｐ
ＣＲプライマーとして使用され得る。

【００８２】 ライブラリーの分子は、タグ化され得、これは分子の回収または同定を容易に
し得る。本明細書中で使用される場合、用語「タグ」とは、ライブラリーの分子
に連結される、それぞれプラスチックマイクロビーズ、オリゴヌクレオチド、ま
たはバクテリオファージのような物理的、化学的、または生物学的部分を意味す
る。分子をタグ化する方法は当該分野で周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂ
ｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ １９９６）、これは参考として本明細書中に援用される）。

【００８３】 特異的タグは、血管形成性血管系へホーミングする腫瘍ホーミング分子を同定
するための本発明の方法において特に有用であり得る。本明細書中で使用される
用語「特異的タグ」とは、ライブラリー中で特定の分子に連結され、そしてその
特定の分子に対して独特である物理学的、化学的、または生物学的タグを意味す
る。特異的タグは、それが容易に同定可能である場合、特に有用である。ライブ
ラリーの特定の分子に独特であるヌクレオチド配列は、特異的タグの例である。
例えば、独特のヌクレオチド配列でタグ化されたペプチドを合成する方法は、そ
れぞれヌクレオチド配列を決定する際に、ペプチドの同一性が公知であるように
、それぞれ特異的タグを含む分子のライブラリーを提供する（Ｂｒｅｎｎｅｒお
よびＬｅｒｎｅｒ， 前出（１９９２）、これは参考として本明細書中に援用さ
れる）。ＰＣＲのような非常に感度のある方法が、特異的タグのヌクレオチド配
列を決定し、それによって連結される分子の配列を同定するために使用され得る
ので、ペプチドまたは他のタイプの分子に特異的なタグとしてのヌクレオチド配
列の使用は、サンプル中の分子の存在を同定するための簡単な手段を提供する。
同様に、特異的タグの配列決定が、発現されたペプチドのアミノ酸配列を同定す
るので、ファージで発現されるペプチドをコードする核酸配列は、特異的タグの
別の例である。

【００８４】 共有されたタグまたは特異的タグの存在は、インビボパニング後に本発明の腫
瘍ホーミング分子を同定または回収するための手段を提供し得る。さらに、共有
されたタグと特異的タグとの組み合わせは、腫瘍ホーミング分子を同定するため
に特に有用であり得る。例えば、ペプチドのライブラリーは、それぞれが特異的
ヌクレオチド配列タグに連結されるように調製され得（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ
およびＬｅｒｎｅｒ， 前出， １９９２）、ここで各特異的ヌクレオチド配列
タグは、ビオチンのような共有されたタグをそこに組み込んでいる。腫瘍へのホ
ーミングの際、特定の腫瘍ホーミングペプチドは、共有されたタグに基づいて腫
瘍のサンプルから実質的に単離され得、そして特定のペプチドは、例えば、特異
的タグのＰＣＲによって同定され得る（Ｅｒｌｉｃｈ， 前出， １９８９を参
照のこと）。

【００８５】 タグはまた、支持体として役立ち得る。本明細書中で使用される場合、用語「
支持体」とは、分子が付着され得る所定の表面を有するタグを意味する。一般に
、支持体として有用なタグは、共有されたタグである。例えば、支持体は、ウイ
ルスまたはバクテリオファージのようなウイルス様粒子（「ファージ」）；Ｅ．
ｃｏｌｉのような細菌；あるいは酵母、昆虫、または哺乳動物細胞のような真
核生物細胞のような生物学的タグであり得；あるいはリポソームまたはマイクロ
ビーズのような物理学的タグであり得、これは、プラスチック、アガロース、ゼ
ラチン、または他の生物学的もしくは不活性物質から構成され得る。所望であれ
ば、支持体として有用な共有されたタグは、特異的タグをそこに連結し得る。し
たがって、例示された方法に使用されるファージ提示ライブラリーは、ファージ
（これは支持体でもある共有されたタグである）、および発現されたペプチドを
コードする核酸配列（この核酸配列は特異的タグである）からなると考えられ得
る。

【００８６】 一般的に、支持体は、その支持体が、被験体に存在するキャピラリーベッドを
通して比較的妨害されずに通過し得、そして循環を塞ぎ得ないように、その最短
の寸法で約１０μｍ未満から約５０μｍの直径を有するべきである。さらに、支
持体は、非毒性であり得、そのため、細胞表面分子の正常発現または被験体の正
常生理状態を混乱させず、そして特にインビボパニングに使用される被験体が選
択された腫瘍を収集するために屠殺されない場合には、生分解性である。

【００８７】 分子が支持体に連結される場合、タグ化された分子は、支持体の表面に付着さ
れた分子を含み、その結果、被験体において細胞中の標的分子と相互作用し得る
疑いのある分子の一部が、相互作用に関与し得るように配置される。例えば、腫
瘍ホーミング分子が増殖因子レセプターのリガンドである疑いがある場合、支持
体に付着された分子の結合部分は、腫瘍における細胞上の増殖因子レセプターと
相互作用し得るように配置される。所望であれば、適切なスペーサー分子が、分
子と支持体との間に配置され得、その結果、可能性のある腫瘍ホーミング分子が
標的分子と相互作用する能力は妨害されない。スペーサー分子はまた、反応性基
を含み得、これは分子を支持体に連結する便利かつ効率的な手段を提供し、そし
て所望であれば、分子の回収または同定を容易にし得るタグを含み得る（Ｈｅｒ
ｍａｎｓｏｎ， 前出， １９９６を参照のこと）。

【００８８】 本明細書中で例示されるように、乳ガンまたは黒色腫のような選択された腫瘍
にホーミングし得る疑いのあるペプチドは、融合タンパク質のＮ末端として発現
され、ここでＣ末端はファージコートタンパク質からなった。融合タンパク質の
発現の際、Ｃ末端コートタンパク質は、Ｎ末端ペプチドが腫瘍において標的分子
と相互作用する位置にあるように、ファージの表面に対して融合タンパク質を連
結した。したがって、共有されたタグを有する分子を、ペプチドのファージへの
連結によって形成し、ここでファージは生物学的支持体を提供し、このペプチド
分子は融合タンパク質として連結され、融合タンパク質のファージコード部分は
スペーサー分子として作用し、そしてペプチドをコードする核酸は、腫瘍ホーミ
ングペプチドの同定を可能にする特異的タグを提供した。

【００８９】 本明細書中で使用される場合、腫瘍ホーミング分子の同定に関して使用される
場合に、用語「インビボパニング」とは、ライブラリーを被験体に投与する工程
、および被験体において腫瘍に選択的にホーミングする分子を同定する工程によ
って、ライブラリーをスクリーニングする方法を意味する（米国特許第５，６２
２，６９９号を参照のこと）。分子のライブラリーまたはこのようなライブラリ
ーの一部に関して使用される場合、用語「被験体に投与する工程」は、ライブラ
リーが、一般的に脊椎動物、特にヒトのような哺乳動物である被験体において腫
瘍に送達されることを意味するために、その最も広い意味で使用される。

【００９０】 ライブラリーは、例えば、分子が腫瘍を透過するように被験体の循環中にライ
ブラリーを注射することによって被験体に投与され得；適切な時間の後、循環は
、被験体を屠殺することによって、または腫瘍のサンプルを取り出すことによっ
て終結される（実施例Ｉ；米国特許第５，６２２，６９９号；Ｐａｓｑｕａｌｉ
ｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ， 前出， １９９６も参照のこと）。あるいは
、カニューレが被験体の血管中に挿入され得、その結果、ライブラリーは適切な
時間の灌流によって投与され、その後、循環を終結するために、ライブラリーは
カニューレを通して循環から取り出され得るか、または被験体は腫瘍を収集する
ために屠殺され得るか、あるいは腫瘍はサンプリングされ得る。同様に、ライブ
ラリーは、被験体における適切な血管のカニュレーションによって、腫瘍を含む
１つまたはいくつかの器官を通して分流され得る。ライブラリーがまた単離され
た潅流した腫瘍に投与され得ることが認識される。単離された潅流した腫瘍にお
けるこのようなパニングは、腫瘍に結合する分子を同定するために有用であり得
、そして所望であれば、ライブラリーの最初のスクリーニングとして使用され得
る。

【００９１】 腫瘍ホーミング分子を同定するためのインビボパニングの使用は、腫瘍を有す
るマウスにおいてファージペプチド提示ライブラリーをスクリーニングすること
、および乳房腫瘍または黒色腫腫瘍に選択的にホーミングする特異的ペプチドを
同定することによって、本明細書中で例示される（実施例Ｉ）。しかし、例えば
、抗体または抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆｄ、またはＦａｂ
フラグメント）；増殖因子レセプターのようなホルモンレセプター；またはイン
テグリンまたはセレクチンのような細胞接着レセプターを含む、タンパク質レセ
プター分子を提示するファージライブラリーはまた、本発明を実施するために使
用され得る。このような分子の改変体は、ランダム、部位特異的、またはコドン
に基づく変異誘発のような周知の方法を使用して構築され得（Ｈｕｓｅ， １９
９３年１１月２３日に発行された米国特許第５，２６４，５６３号を参照のこと
、これは本明細書中で参考として援用される）、そして所望であれば、ペプチド
は、ファージの発現後であるが被験体への投与の前に、化学的に改変され得る。
したがって、種々のタイプのファージ提示ライブラリーは、インビボパニングに
よってスクリーニングされ得る。

【００９２】 ファージ提示技法は、ランダムまたは選択的にランダムにされたペプチドの異
なる集団を発現する手段を提供する。ファージ提示の種々の方法およびペプチド
の異なる集団を産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｄｎｅｒ
ら（１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、これ
は本明細書中で参考として援用される）は、ファージの表面上の結合ドメインの
異なる集団を調製する方法を記載する。特に、Ｌａｄｎｅｒらは、ファージ提示
ライブラリーを産生するために有用なファージベクター、ならびに可能性のある
結合ドメインを選択しそしてランダムにまたは選択的に変異した結合ドメインを
産生する方法を記載する。

【００９３】 同様に、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１
７：２２８−２５７ （１９９３）；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４９：３８６−３９０ （１９９０）もまた参照のこと、その各々は
本明細書中で参考として援用される）は、ベクターを含むファージペプチド提示
ライブラリーを産生する方法、および発現されるペプチドの集団を多様化させる
方法を記載する（Ｈｕｓｅ， ＷＯ ９１／０７１４１およびＷＯ ９１／０７
１４９もまた参照のこと、その各々は本明細書中で参考として援用される；実施
例Ｉもまた参照のこと）。ファージ提示技法は、例えば、コドンに基づく変異誘
発法とともに使用される場合、特に強力であり得、これはランダムペプチドまた
はランダムにもしくは所望して偏ったペプチドを産生するために使用され得る（
Ｈｕｓｅ， 米国特許第５，２６４，５６３号， 前出， １９９３）。これら
または他の周知の方法は、ファージ提示ライブラリーを産生するために使用され
得、これは、腫瘍にホーミングするペプチドを同定するために、本発明のインビ
ボパニング方法に供され得る。

【００９４】 ファージ提示ライブラリーをスクリーニングすることに加えて、インビボパニ
ングは、例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡライブラリーまたは化学的ライブラリー
を含む種々の他のタイプのライブラリーをスクリーニングするために使用され得
る。所望であれば、腫瘍ホーミング分子は、タグ化され得、これは腫瘍からの分
子の回収または腫瘍中の分子の同定を容易にし得る。例えば、共有されたタグを
それぞれ含む有機分子のライブラリーがスクリーニングされる場合、タグは、ビ
オチンのような部分であり得、これは分子に直接連結され得るかまたは分子を含
む支持体に連結され得る。ビオチンは、アビジンまたはストレプトアビジンアフ
ィニティーマトリクスを使用して、選択された腫瘍サンプルから分子を回収する
ために有用な共有されたタグを提供する。さらに、分子または分子を含む支持体
は、４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン（ｐ
ｈＯｘ）のようなハプテンに連結され得、これは分子を回収する手段として磁性
ビーズに連結された抗ｐｈＯｘ抗体によって結合され得る。ビオチンまたはｐｈ
Ｏｘ標識された結合体を精製する方法は、当該分野で公知であり、そしてこれら
の手順を行うための物質は市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ；およびＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏ
ｎ ＷＩ）。ファージライブラリーがスクリーニングされる場合には、ファージ
は、実施例Ｉに開示されるような方法を使用して回収され得る。

【００９５】 インビボパニングは、腫瘍へ選択的にホーミングし得る分子を直接同定する方
法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ホーミングする」または「
選択的にホーミングする」とは、特定の分子が、被験体への投与後に腫瘍中に存
在する標的分子に比較的特異的に結合することを意味する。一般に、選択的ホー
ミングは、コントロール器官または組織と比較して、腫瘍への分子の少なくとも
２倍大きな特異的結合を検出することによって、一部特徴づけられる。

【００９６】 いくつかの場合には、分子は、腫瘍を含む器官または組織に非特異的に局在し
得ることが認識されるべきである。例えば、ファージ提示ライブラリーのインビ
ボパニングは、肝臓および脾臓のような器官（これは細網内皮組織系（ＲＥＳ）
の顕著な成分を含む。）において高いバックグラウンドを生じ得る。したがって
、例えば肝臓に腫瘍が存在する場合、ＲＥＳによる取り込みに起因する分子の非
特異的結合は、腫瘍ホーミング分子を同定することをより困難にし得る。

【００９７】 しかし、選択的ホーミングは、異なる個々のファージが腫瘍へホーミングする
能力の差を検出することによって、非特異的結合から区別され得る。例えば、選
択的ホーミングは、大過剰の非感染ファージ、または約５倍過剰の選択されない
ペプチドを発現するファージと、ファージ上で発現されたペプチドのような推定
腫瘍ホーミング分子とを合わせる工程、被験体に混合物を注射する工程、および
腫瘍の試料を収集する工程によって同定され得る。後者の場合には、例えば、腫
瘍ホーミングペプチドを発現する注射されたファージの数が、標的分子に対して
飽和されないように十分に低いならば、腫瘍中の約２０％より多いファージが推
定腫瘍ホーミング分子を発現するという決定は、ファージによって発現されるペ
プチドが特異的腫瘍ホーミング分子である例証的証拠である。さらに、非特異的
局在化は、例えば、過剰量の「遊離」ペプチドと組み合わせて推定腫瘍ホーミン
グペプチドを発現するファージを使用して、競合実験を行うことによって、選択
的ホーミングと区別され得る（実施例Ｖ）。

【００９８】 さらに、種々の方法が、ＲＥＳの成分を含む器官への分子の非特異的結合を防
止するために使用され得る。例えば、ＲＥＳの成分を含む器官に存在する腫瘍へ
選択的にホーミングする分子は、最初に、例えば、ポリスチレンラテックス粒子
またはデキストラン硫酸を使用してＲＥＳをブロックする工程（Ｋａｌｉｎら、
Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：１７１−１７４（１９９３）；Ｉｌｌｕｍ
ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７５：１６−２２（１９８６）；Ｔａｋｅｙａら
、Ｊ．Ｇｅｎ．ＭＩｃｒｏｂｉｏｌ．１００：３７３−３７９（１９７７）を参
照のこと、そのそれぞれは本明細書中で参考として援用される）、次いで被験体
にライブラリーを投与する工程によって得られ得る。例えば、試験物質の投与前
のデキストラン硫酸５００またはポリスチレンミクロスフェアの前投与が、肝臓
のＲＥＳ成分であるクッパー細胞による試験物質の非特異的取り込みをブロック
するために使用されている（Ｉｌｌｕｍら， 前出， １９８６）。同様に、Ｒ
ＥＳによる薬剤の非特異的取り込みは、炭素粒子またはシリカ（Ｔａｋｅｙａら
， 前出， １９７７）またはゼラチンコロイド（Ｋａｌｉｎら， 前出， １
９９３）を使用してブロックされている。したがって、ＲＥＳによる非特異的取
り込みをブロックするために有用な種々の薬剤は公知であり、そして慣用的に使
用される。

【００９９】 ＲＥＳまたは他の部位へのファージの非特異的結合はまた、非感染性になった
同じファージとともに特異的ファージ提示ライブラリーを、例えばマウスに同時
注射することによって防止され得る（Ｓｍｉｔｈら， 前出， １９９０， １
９９３）。さらに、ＲＥＳ成分を含む器官において腫瘍へホーミングするペプチ
ドは、特定の器官への低いバックグラウンド結合を示すファージを使用して、フ
ァージ提示ライブラリーを調製することによって同定され得る。例えば、Ｍｅｒ
ｒｉｌｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９３：３１８
８−３１９２（１９９６）、これは本明細書中で参考として援用される）は、Ｒ
ＥＳによって取り込まれず、そして結果として延長された時間にわたり循環中に
残る、λタイプファージを選択した。例えば、糸状ファージ改変体は、類似の方
法を使用して選択され得る。

【０１００】 選択的ホーミングは、コントロール器官または組織と比較して、腫瘍に対する
腫瘍ホーミング分子の特異性を決定することによって証明され得る。選択的ホー
ミングはまた、インビボパニングの１ラウンドによって同定されるような、腫瘍
へホーミングする分子が、インビボパニングのそれに続くラウンドで腫瘍ホーミ
ング分子について富化されることを示すことによって、証明され得る。例えば、
メラノーマ腫瘍に選択的にホーミングするペプチドを発現するファージを、イン
ビボパニングによって単離し、次いでインビボパニングのさらなるラウンドにか
けた。スクリーニングの第２ラウンドの後、腫瘍から回収されたファージは、脳
と比較して、腫瘍へのホーミングにおいて３倍富むことを示した。スクリーニン
グの第３ラウンド後に腫瘍から回収されたファージは、脳と比較して、腫瘍への
ホーミングにおいて平均１０倍富むことを示した。選択的ホーミングはまた、イ
ンビボパニングの１ラウンドによって同定されるように、選択された腫瘍へホー
ミングする分子が、インビボパニングのその後のラウンドで腫瘍ホーミング分子
について富化されることを示すことによって、証明され得る。

【０１０１】 腫瘍ホーミング分子は、例えば、移植された腫瘍を含むマウスを使用して、イ
ンビボパニングによって同定され得る。このような移植された腫瘍は、例えば、
ヌードマウスのような免疫不全マウスに移植されたヒト腫瘍、あるいは組織培養
またはマウスにおける継代によって維持されるマウス腫瘍であり得る。細胞レセ
プターの保存された性質および特定のレセプターに結合するリガンドの保存され
た性質のため、種々の種において血管形成血管系および組織学的に類似の腫瘍細
胞が、腫瘍ホーミング分子の標的分子として有用な共通の細胞表面マーカーを有
し得ることが予測される。したがって、当業者は、例えば、メラノーマのような
所定の組織学的タイプのマウス腫瘍を有するマウスにおけるインビボパニングを
使用して同定される腫瘍ホーミング分子はまた、ヒトまたは他の種において腫瘍
中の対応する標的分子に結合することを認識する。同様に、実験動物において増
殖する腫瘍は、まさにヒトまたは他の種において増殖する腫瘍に必要とされるよ
うに、関連する血管形成を必要とする。したがって、マウスで増殖した腫瘍中の
血管系に存在する標的分子と結合する腫瘍ホーミング分子はまた、同様に、ヒト
または他の哺乳動物被験体における腫瘍の血管系において対応する標的分子に結
合し得る。例えば、ヒト乳ガンにホーミングすることによって同定された腫瘍ホ
ーミング分子が、ヒトカポジ肉腫またはマウスメラノーマにもホーミングする一
般的能力は、標的分子が多くの腫瘍によって共有されることを示す。実際、本明
細書中に開示された結果は、標的分子が、宿主組織である血管形成血管系で発現
されることを証明する（実施例ＶおよびＶＩＩＩを参照のこと）。

【０１０２】 マウスのような実験動物におけるインビボパニングを使用して同定された腫瘍
ホーミング分子は、例えば、この分子がヒト患者から得られた腫瘍試料にも特異
的に結合し得ることを証明することによって、そのヒト患者において対応する腫
瘍に結合する能力について、容易に検査され得る。例えば、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤ
ＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージおよびＮＧＲペプチドは、ヒト腫瘍の顕
微鏡切片中で血管に結合することが示されているが、非腫瘍組織の血管では結合
はほとんどまたは全く生じない。したがって、慣用方法は、実験動物においてイ
ンビボパニングを使用して同定された腫瘍ホーミング分子がまた、ヒト腫瘍にお
いて標的分子と結合し得ることを確認するために使用され得る。

【０１０３】 被験体にライブラリーを投与する工程、選択された腫瘍を収集する工程、およ
び腫瘍にホーミングする分子を同定する工程は、インビボパニングの単一のラウ
ンドを包含する。必要ではないが、インビボパニングの１つ以上の追加のラウン
ドが、一般的に実施される。インビボパニングの追加のラウンドが行われる場合
、それまでのラウンドにおいて腫瘍から回収された分子が、被験体に投与され、
この被験体は、腫瘍の一部のみが収集された先のラウンドで使用された同じ被験
体であり得る。

【０１０４】 インビボパニングの第２ラウンドを行うことによって、第１ラウンドから回収
された分子の相対的な結合選択性は、同定された分子を被験体に投与する工程、
腫瘍を収集する工程、および第１ラウンド後に回収されたものと比較して、多く
のファージが、スクリーニングの第２ラウンド後に腫瘍から回収されるかどうか
を決定する工程によって決定され得る。必要ではないが、コントロールの器官ま
たは組織もまた収集され得、そして腫瘍から回収された分子は、コントロールの
器官から回収された分子と比較され得る。理想的には、分子は、インビボパニン
グの第２またはその後のラウンド後にコントロールの器官または組織から回収さ
れない。しかし、一般には、一定の割合の分子は、コントロールの器官または組
織にも存在する。この場合には、コントロールの器官と比較したときの選択され
た腫瘍における分子の比（選択された：コントロール）が決定され得る。例えば
、インビボパニングの第１ラウンド後にメラノーマにホーミングするファージは
、パニングの２回の追加ラウンド後にコントロールの器官（脳）と比較して、選
択された腫瘍へのホーミングが３倍富むことを証明した（実施例ＶＩ）。

【０１０５】 インビボパニングの追加ラウンドは、特定の分子が、選択された腫瘍にのみホ
ーミングするのか、あるいは被験体において１つ以上の正常器官もしくは組織で
も発現されるか、または腫瘍上の標的分子に十分に類似する腫瘍上の標的を認識
し得るのかを決定するために使用され得る。インビボパニング法は、選択された
腫瘍にホーミングする分子のみを選択するので、腫瘍ホーミング分子が、対応す
る正常組織にもホーミングすることはありそうにない。腫瘍ホーミング分子が、
腫瘍の他に１つ以上の正常器官または組織へのホーミングをも指向する場合、そ
の器官または組織は、選択された器官または組織のファミリーを構成すると考え
られる。インビボパニング法を使用して、選択された腫瘍のみにホーミングする
分子が、１つ以上の選択された器官または組織にもホーミングする分子と区別さ
れ得る。このような同定は、インビボパニングのその後のラウンド中に種々の器
官または組織を収集することによって促進される。

【０１０６】 用語「コントロールの器官または組織」は、腫瘍ホーミング分子の同定が所望
される腫瘍以外の器官または組織を意味するために使用される。コントロールの
器官または組織は、腫瘍ホーミング分子がコントロールの器官に選択的にホーミ
ングしない点で特徴づけられる。コントロールの器官または組織は、例えば、腫
瘍ホーミング分子の非特異結合を同定するため、またはこの分子のホーミングの
選択性を決定するために収集され得る。さらに、非特異結合は、例えば、腫瘍へ
ホーミングしないことが公知であるが可能性のある腫瘍ホーミング分子に化学的
に類似するコントロール分子を投与することによって同定され得る。あるいは、
投与される分子が支持体に連結される場合、支持体単独の投与もまた、非特異結
合を同定するために使用され得る。例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質単独を発現
するがペプチド融合タンパク質を含まないファージは、ファージ支持体の非特異
結合のレベルを決定するために、インビボパニングによって研究され得る。

【０１０７】 本明細書中に開示されるように、腫瘍ホーミング分子の特異的ホーミングは、
選択された腫瘍組織を、対応する非腫瘍組織ならびにコントロールの器官または
組織と比較して検査することによって、容易に同定され得る。例えば、免疫組織
学的分析は、腫瘍ホーミングペプチドを提示するために使用されるファージに特
異的な抗体を使用して、腫瘍組織および対応する非腫瘍組織について行われ得る
（実施例Ｖを参照のこと）。あるいは、ペプチドと共に発現された共有されるタ
グ（例えば、ＦＬＡＧエピトープなど）に特異的な抗体が使用され得る。このよ
うな検出系は市販されている。

【０１０８】 一般に、ランダムなまたは選択的にランダム化された目的分子の多様な集団を
含む分子ライブラリーが調製され、次いで被験体に投与される。投与後の選択さ
れた時間で、被験体は屠殺され、そして腫瘍が収集され、その結果、腫瘍に存在
する分子が同定され得る（実施例Ｉを参照のこと）。所望であれば、１つ以上の
コントロールの器官または組織あるいはコントロールの器官または組織の一部が
サンプリングされ得る。例えば、乳ガンまたはメラノーマ腫瘍を有するマウスに
、ファージペプチド提示ライブラリーを注射し、次いで約１〜５分後、このマウ
スに麻酔をかけて、液体窒素中で凍結するかあるいは好ましくは心臓を通して灌
流するかのいずれかでファージの循環を終結させ、腫瘍および１つ以上のコント
ロールの器官をそれぞれから収集し、腫瘍およびコントロールの器官に存在する
ファージを回収し、そしてそれぞれの腫瘍に選択的にホーミングするペプチドを
同定した（実施例Ｉ、ＩＩ、およびＶＩを参照のこと）。

【０１０９】 提供される実施例では、動物を屠殺して、選択された腫瘍およびコントロール
の器官または組織を収集した。しかし、腫瘍にホーミングする分子を含む支持体
を回収するためには、その腫瘍の一部のみを収集すればよく、そして同様に、器
官または組織の一部のみをコントロールとして収集すればよいことを認識すべき
である。したがって、例えば、ファージによって発現されるペプチドのような分
子が、所望に応じて、同じ被験体に２回めまたはそれ以上投与され得るように、
腫瘍の一部がバイオプシーによって収集され得る。同じ被験体へ２回めに投与さ
れるべき分子が、タグ化されるかまたは例えば支持体に連結される場合、そのタ
グまたは支持体は、スクリーニングのその後のラウンドを妨害しないように、非
毒性および生分解性であるべきである。

【０１１０】 ファージライブラリーのインビトロスクリーニングは、抗体または細胞表面レ
セプターに結合するペプチドを同定するために、これまでに使用されている（Ｓ
ｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）。例えば、ファージペプチド提示
ライブラリーのインビトロスクリーニングは、インテグリン接着レセプター（Ｋ
ｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２４：３７３−３８０（１９９
４ａ）、これは参考として本明細書中に援用される）およびヒトウロキナーゼレ
セプター（Ｇｏｄｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ ９１：７１２９−７１３３（１９９４））に特異的に結合した新規ペプチド
を同定するために使用されてきた。しかし、このようなインビトロ研究は、選択
されたレセプターにインビトロで特異的に結合し得るペプチドがまた、インビボ
でそのレセプターと結合するかどうか、あるいはその結合ペプチドまたはレセプ
ターが体内で特定の器官に独特であるかどうかについての見識は提供しない。さ
らに、インビトロ方法は、人工の系において、所定の十分に特徴付けられた標的
分子を使用して行われる。例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら（前出、１９９４）は、組
換えウロキナーゼレセプターを発現する細胞を利用した。しかし、このようなイ
ンビトロ方法は、標的分子に関する事前の知識を必要とし、そしてインビボでの
有用性に関する情報は（あるにしても）ほとんど得られない点で制限される。

【０１１１】 培養物中の細胞に対するインビトロパニングはまた、細胞により発現されるレ
セプターに特異的に結合し得る分子を同定するために使用されている（Ｂａｒｒ
ｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：２９９−３０５（１９９６）、これは本明細
書中で参考として援用される）。しかし、インビボで細胞により発現される細胞
表面分子は、細胞が培養で増殖される場合、しばしば変化する。従って、培養物
中の細胞を用いるインビトロパニング法はまた、培養物中の細胞へのその結合に
より同定される分子がインビボで同じ結合能力を有する保証はない点で、限定さ
れる。さらに、インビトロパニングを用いて、スクリーニングにおいて使用され
る腫瘍細胞にのみホーミングするが、他の細胞型にはホーミングしない分子を区
別することは可能ではない。

【０１１２】 対照的に、インビボパニングは、標的分子の事前の知識または入手可能性を必
要とせず、そしてインビボで発現される細胞表面標的分子に結合する分子を同定
する。また、「非標的化」組織がスクリーニングの間に存在するので、ホーミン
グの特異性を欠く腫瘍ホーミング分子を単離する可能性は、著しく低減される。
さらに、インビボパニングによる腫瘍ホーミング分子の獲得において、例えば、
代謝活性によるインビボでの循環中の分解に特に感受性であり得る任意の分子は
回収されない。従って、インビボパニングは、インビボで選択的にホーミングす
る分子および腫瘍に存在する標的分子を同定することにより、以前の方法に勝る
の重大な利点を提供する。

【０１１３】 しかし、一旦、標的分子が同定されると、インビトロスクリーニング方法は、
さらなる腫瘍ホーミング分子の同定のために有用である。例えば、本明細書で記
載されるＮＧＲレセプターは、血管形成血管系にホーミングするさらなる腫瘍ホ
ーミング分子の同定のために有用な標的分子である。インビトロスクリーニング
の方法は、当該分野において周知である。例えば、ＮＧＲレセプターは、分子ラ
イブラリーに接触され得、そしてインビトロでの結合についてスクリーニングさ
れ得る。所望であれば、ＮＧＲレセプターは、例えば、ビードあるいはプレート
のような固体の支持体に固定され得る。ＮＧＲレセプターは、共有結合性または
非共有結合性の相互作用を介して、支持体に直接結合し得るか、または、ＮＧＲ
レセプターに結合する分子を介して間接的に固定され得る。例えば、ＮＧＲレセ
プターに結合する抗体は、ＮＧＲレセプターを固定するために用いられ得る（実
施例Ｘを参照のこと）。このライブラリーは、インビトロにおいて、ＮＧＲレセ
プターと接触し、そして結合活性についてスクリーニングされる。タグ化された
分子を有するライブラリーは、ＮＧＲレセプターに結合する分子を同定するため
に、特に有用である。

【０１１４】 一旦、標的分子に結合するさらなる分子が同定されれば、これらのさらなる分
子は、新しく同定された分子が、インビボでその標的分子に結合し得、そして血
管形成血管系にホーミングし得るかどうかを決定するためにインビボで試験され
得る。例えば、ＮＧＲレセプターに結合する新しく同定された分子は、インビボ
において、本明細書に記載された方法を用いて、その分子をスクリーニングする
こと、および新しく同定された分子が血管形成血管にホーミングし得るかどうか
を決定することにより、さらに特徴づけられ得る。従って、ＮＧＲレセプターの
ような標的分子の同定は、ＮＧＲレセプターに結合する、および血管形成血管に
ホーミングする分子を決定するために有利に用いられ得る。

【０１１５】 インビボパニングの開示された方法が働く機構は十分に規定されていないが、
１つの可能性は、分子（例えば、ファージ上で発現されたペプチド）が、腫瘍中
の血管を裏打ちする内皮細胞上に存在する標的分子を認識し、そしてこれに結合
することである。証拠は、例えば、種々の器官における血管組織が互いに異なり
、しかもこのような差違が身体における細胞間輸送の調節に関与し得ることを示
す。例えば、リンパ球は、リンパ節または他のリンパ組織に、一部分は、それら
の組織中の内皮細胞による特異的「宛名（ａｄｄｒｅｓｓ）」分子の発現により
ホーミングする（Ｓａｌｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ ８９：１１４３６−１１４４０（１９９２）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌ
ｌ ７６：３０１−３１４（１９９４））。同様に、種々の白血球は、一部分は
、炎症シグナルにより誘導される内皮細胞マーカーの発現により、炎症部位を認
識し得る（ＢｕｔｃｈｅｒおよびＰｉｃｋｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：６０
−６６（１９９６）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、前出、１９９４を参照のこと）。従っ
て、内皮細胞マーカーは、例えば、薬物（これは、腫瘍ホーミング分子に連結さ
れ得る）を被験体における腫瘍に向けるための潜在的な標的を提供する。

【０１１６】 いくつかの場合において、ガン細胞の特異的器官への転移もまた、器官特異的
マーカー（器官特異的内皮細胞マーカー（ＦｉｄｌｅｒおよびＨａｒｔ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２１７：９９８−１００３（１９８２））を含む）の腫瘍細胞による
認識のためであり得る。多くのガンの転移パターンは、循環腫瘍細胞が、遭遇し
た最初の血管床において優先的にトラップされるということを仮定することによ
り説明され得る。従って、肺および肝臓は、ガン転移の最も頻繁な部位である。
しかし、いくつかのガンは、循環経路により説明されない転移パターンを示す。
このようなガンの転移は、選択的に発現される宛名分子（例えば、ガンが転移す
る器官において発現される内皮細胞表面分子）の存在によるものであり得る（Ｇ
ｏｅｔｚら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６５：１９２−１８９（１９９６）；
Ｚｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８：９５６８
−９５７２（１９９１）；Ｐａｕｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ
．９：１７５−１８９（１９９０）；Ｎｉｃｏｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９４８：１７５−２２４（１９８８）を参照のこと）。
このような器官特異的内皮細胞マーカーに結合する分子の同定は、特定の器官へ
の腫瘍細胞転移を予防する手段を提供し得る。

【０１１７】 乳房ガン腫、黒色腫およびカポジ肉腫に対してインビボパニングを使用して、
腫瘍に選択的にホーミングする種々のペプチドを発現するファージが同定された
（それぞれ、表１、２および３を参照のこと）。ファージの大きなサイズ（９０
０〜１０００ｎｍ）およびファージを循環させた短い時間（３〜５分）のために
、実質的な数のファージが、循環系（特に脳および腎臓における）を出たであろ
うことはありそうもない。組織染色研究は、同定された腫瘍ホーミング分子が主
に内皮細胞表面マーカー（これは、器官特異的様式で発現されるようである）に
ホーミングし、そしてそれに結合したことを示した。これらの結果は、インビボ
パニングが内皮細胞特異性を同定および分析するために使用され得ることを示す
。培養物中の内皮細胞を用いたこのような分析は、培養細胞がそれらの組織特異
的差違を失う傾向にあるので可能ではない（ＰａｕｌｉおよびＬｅｅ、Ｌａｂ．
Ｉｎｖｅｓｔ．５８：３７９−３８７（１９８８））。

【０１１８】 インビボパニングが行われた条件は、内皮細胞マーカー全般に結合する腫瘍ホ
ーミングペプチドを同定したが、腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージの
特異的な存在もまた、特にペプチド投与後のよりおそい時点で、腫瘍実質におい
て観察された（実施例Ｖ）。これらの結果は、ペプチドを発現するファージが、
恐らく血管の有窓性質により腫瘍の血管を通過し得ることを証明し、そしてイン
ビボパニング法が腫瘍細胞により発現される標的分子ならびに内皮細胞により発
現される標的分子の同定に有用であり得ることを示す。

【０１１９】 ファージペプチドディスプレイライブラリーは、本質的にＳｍｉｔｈおよびＳ
ｃｏｔｔ（前出、１９９３；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１３：２６５−２７０（１９９５）； Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．２４５：３４６−３６９（１９９４ｂ）もまた参照のこと、これら
の各々は本明細書中に参考として援用される）に記載のように構築された。実質
的にランダムなアミノ酸配列を有するペプチドをコードするオリゴヌクレオチド
は「ＮＮＫコドン」（ここで「Ｎ」はＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、そして「Ｋ」
はＧまたはＴである）に基づいて合成された。「ＮＮＫコドン」は３２のトリプ
レットをコードし、これは２０のアミノ酸およびアンバー停止コドンをコードす
る（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、前出、１９９０）。いくつかのライブラリー
において、システインをコードする少なくとも１つのコドンもまた各オリゴヌク
レオチドに含まれ、その結果、環状ペプチドは、ジスルフィド結合を通じて形成
され得る（実施例Ｉ）。オリゴヌクレオチドは、ベクターｆｕｓｅ ５において
遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇＩＩＩ）をコードする配列と共にインフレームで挿
入され、その結果ペプチド−ｇＩＩＩ融合タンパク質が発現され得る。発現後、
この融合タンパク質は、ベクターを含むファージの表面上に発現される（Ｋｏｉ
ｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂ；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９
３）。

【０１２０】 インビボパニング後、ヒト乳房ガン腫、マウス黒色腫またはヒトカポジ肉腫腫
瘍に選択的にホーミングするそれらの能力に基づいて単離されたファージは、少
数の異なるペプチド配列のみを示した（それぞれ、表１、２および３を参照のこ
と）。スクリーニングの１つは、α_V含有インテグリンに選択的に結合すること が以前に証明された（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９５；ＷＯ ９５／１４
７１４）ペプチドの内容において、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ｒ
ＧＤ）インテグリン認識配列（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅ
ｌｌ． Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． １２：６９７ （１９９６））を含んだペ
プチド配列を明らかにした。残存する腫瘍ホーミングペプチドの大部分の配列は
、内皮細胞レセプターに対する公知のリガンドといずれの有意な類似性も示さな
かった。しかし、腫瘍ホーミングペプチドのうち１つは、インテグリン結合ペプ
チドに存在するモチーフに類似する弱いインテグリン結合モチーフである、アス
パラギン−グリシン−アルギニン（ＮＧＲ）モチーフを含んでいた（Ｒｕｏｓｌ
ａｈｔｉら、米国特許第５，５３６，８１４号、１９９６年７月１６日発行、こ
れは本明細書中に参考として援用される；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４
ａもまた参照のこと）。他のスクリーニングは、多くのＮＧＲ含有ペプチドを示
した（表１を参照のこと）。ＮＧＲペプチドの弱いインテグリン結合能力にもか
かわらず、インテグリンレセプターは、本明細書中で例示される（実施例ＶＩＩ
Ｉ）ＮＧＲ腫瘍ホーミングペプチドにより認識される標的分子でなくてもよい。
本明細書中で使用する用語「インテグリン」は、ヘテロダイマー細胞表面接着レ
セプターを意味する。

【０１２１】 乳房腫瘍にホーミングしたファージにより発現されるペプチドは、ペプチドＣ
ＧＲＥＣＰＲＬＣＱＳＳＣ（配列番号２）およびＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（
配列番号３；表１；実施例ＩＩを参照のこと）を含んでいた。同様に、ペプチド
ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）およびＣＧＳＬＶＲＣ（配列番号５）を含む
腫瘍ホーミングペプチドは、乳房腫瘍を有するマウスに投与された他の２つのフ
ァージライブラリーから同定された（表１）。これらのモチーフのいくつか、な
らびに新規のモチーフがまた、マウス黒色腫およびヒトカポジ肉腫でのスクリー
ニングにおいて単離された（表２および３を参照のこと）。これらの結果は、腫
瘍ホーミング分子がインビボパニングを用いて同定され得ることを証明した。

【０１２２】 ３つの主な腫瘍ホーミングモチーフが現れた。上記で議論されたように、１つ
のモチーフは、ペプチド構造ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）に埋められた、
α_Vインテグリンに選択的に結合することが知られている（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら 、前出、１９９５；ＷＯ ９５／１４７１４）配列ＲＧＤ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ
，前出、１９９６）を含んでいた。α_Vβ₃およびα_Vβ₅インテグリンは、血管形
成血管のマーカーであるので（Ｂｒｏｏｋｓら、前出、１９９４；Ｆｒｉｅｄｌ
ａｎｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１５００（１９９５））、ペプチドＣ
ＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）（ＲＧＤ−４Ｃと称する）を発現するファージ
は、腫瘍標的化について調べられ、そして本明細書中に開示されるように高度に
選択的な様式で腫瘍にホーミングした（実施例ＩＩＩを参照のこと）。さらに、
ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージによるホーミングは
、遊離ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）ペプチドの同時投与により阻害された
。

【０１２３】 別の乳房腫瘍ホーミングペプチドは、弱いインテグリン結合活性を有すること
が以前に示されたＮＧＲモチーフ（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２６８：２０２０５−２０２１０（１９９３）、これは参考として本
明細書に援用されている）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ａ；ＷＯ ９
５／１４７１４）を含む、配列ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）を有
していた。ＮＧＲ含有ペプチドが同定されたので、２つのさらなるペプチド、線
状ペプチドＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）および環状ペプチドＣＶＬＮＧＲＭＥＣ
（配列番号７）（これらの各々はＮＧＲモチーフを含む）について腫瘍ホーミン
グを調べた。ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）を発現するファージの
ように、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）またはＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）
を発現するファージは腫瘍にホーミングした。さらに、ファージがヒト乳房ガン
腫において、ならびにマウス黒色腫を有するマウスおよびヒトカポジ肉腫異種移
植片を有するマウスの腫瘍において選択的に蓄積したので、腫瘍ホーミングは、
腫瘍型依存性でも、種依存性でもなかった。

【０１２４】 種々のペプチド（ＲＧＤおよびＮＧＲ含有ペプチドを含む）は、一般に、腫瘍
血管に結合した。最小の環状ＮＧＲペプチドであるＣＮＧＲＣ（配列番号８）は
、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）配列に基づいて合成された。ＣＮ
ＧＲＣ（配列番号８）ペプチドが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）
、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）またはＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）のいず
れかを発現するファージと同時注入された場合、乳房ガン腫異種移植片中でのフ
ァージの蓄積は阻害された。しかし、ＣＮＧＲＣ（配列番号８）ペプチドは、Ｎ
ＧＲファージのホーミングを阻害した量より１０倍までの高い量で投与された場
合でさえも、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ペプチドを発現
するファージのホーミングを阻害しなかった。対照的に、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣ
ＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ペプチドは、ＮＧＲファージのホーミングを部分的
に阻害したが、必要とされた量は、ＣＮＧＲＣペプチド（配列番号８）の量より
５〜１０倍高かった。これらの結果は、ＮＧＲペプチドおよびＲＧＤペプチドが
、腫瘍血管系において異なるレセプター部位に結合することを示す。

【０１２５】 第３のモチーフであるＧＳＬ（グリシン−セリン−ロイシン）もまた、乳房ガ
ン腫、悪性黒色腫またはカポジ肉腫を有するマウスにおいてインビボパニング後
に同定された。ＧＳＬペプチドであるＣＧＳＬＶＲＣ（配列番号５）を発現する
ファージのホーミングは、遊離ＣＧＳＬＶＲＣ（配列番号５）ペプチドの同時投
与により阻害された。ＲＧＤペプチドおよびＮＧＲペプチドのように、ＧＳＬペ
プチドを発現するファージもまた腫瘍の血管に結合した。本明細書中に開示され
るように、腫瘍ホーミングペプチドに存在する保存されたＲＧＤ、ＮＧＲおよび
ＧＳＬモチーフの同定を考慮して、このようなモチーフを含むペプチドは、腫瘍
ホーミングペプチドとして、そして特にガンの化学療法剤または腫瘍に対する診
断剤のような部分を標的化し得る結合体を形成するために有用であり得ることが
認識される。

【０１２６】 １３アミノ酸までを含む種々のペプチドライブラリーが構築され、そしてＮＧ
ＲペプチドであるＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）は、乳房腫瘍に対
するインビボパニングの結果として得られた。ランダムペプチドライブラリーを
スクリーニングすることにより得られたこのＮＧＲペプチドは、腫瘍ホーミング
ペプチドであった（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）。さらに、ペプチドライブラ
リーが、式ＣＸＸＸＮＧＲＸＸ（配列番号１３）またはＣＸＸＣＮＧＲＣＸ（配
列番号１４）（これらの各々は、ＮＧＲ配列に偏っている）に基づいて構築され
、そして乳房腫瘍に対するインビボパニングに使用された場合、かなり多くのＮ
ＧＲペプチドが得られた（表１を参照のこと）。

【０１２７】 これらの結果は、本発明の腫瘍ホーミングペプチドがアミノ酸配列ＲＧＤまた
はＮＧＲまたはＧＳＬを含み得ることを示す。このような腫瘍ペプチドは、５つ
のアミノ酸（例えば、ＣＮＧＲＣ（配列番号８））と同じくらい小さくあり得る
。このような腫瘍ホーミングペプチドはまた、長さが少なくとも１３アミノ酸（
これは、本明細書中で例示される最も長いペプチドである）であり得るだけでな
く、所望であれば、長さが２０アミノ酸または３０アミノ酸または５０〜１００
アミノ酸まででもあり得る。本発明の腫瘍ホーミングペプチドは、化学合成によ
り好都合に生成される。

【０１２８】 免疫組織化学分析は、約４分間循環させられ、続いてマウス心臓を通して灌流
されたファージについての組織染色とファージ注射の２４時間後に分析された組
織とを比較することにより行った（図３を参照のこと）。投与の２４時間後、フ
ァージは循環中に本質的に残存せず、従って灌流は必要とされない（Ｐａｓｑｕ
ａｌｉｎｉら、前出、１９９７）。ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）
ファージ投与の４分後に調べられた試料において、強力なファージ染色は、腫瘍
血管系において観察されたが、正常な内皮において観察されなかった（実施例Ｖ
；図３Ｅ、３Ｇ、３Ｈおよび３Ｊと比較せよ）。比較において、腫瘍染色は２４
時間で強力であり、そして血管の外側から腫瘍実質へ広がったようであった（図
３Ａ〜３Ｄおよび３Ｆ（腫瘍）と図３Ｉおよび３Ｋ〜３Ｖ（非腫瘍）とを比較せ
よ）。ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）およびＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）フ
ァージは、類似した染色パターンを示した（実施例Ｖ）。対照的に、コントロー
ル器官および組織は免疫染色をほとんどまたは全く示さず、これは腫瘍血管に対
するＮＧＲモチーフの特異性を確認した。しかし、脾臓および肝臓が、期待され
たようにファージを捕獲した。なぜなら網内皮細胞系による取り込みは、ファー
ジによるペプチド発現の存在とは独立した、ファージ粒子の一般的な特性である
からである（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９７）。

【０１２９】 免疫染色はまた、ＧＳＬモチーフ含有ペプチドＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４
）を発現するファージの投与後に観察され、そしてＮＧＲペプチドのものと同様
に、血管（この場合、黒色腫腫瘍内）に局在化した（以下を参照のこと；実施例
ＶおよびＶＩもまた参照のこと）。同様に、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドＲＧＤ
−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）を発現するファージの乳房腫瘍を有
するマウスへの投与後の免疫染色は、腫瘍の血管に局在化したが、脳、腎臓また
は種々の他の非腫瘍組織において観察されなかった（実施例ＩＩＩおよびＶを参
照のこと；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９７もまた参照のこと）。これ
らの結果は、種々の腫瘍ホーミングペプチドが、一般的に、腫瘍血管系にホーミ
ングすることを証明する。

【０１３０】 腫瘍にホーミングする分子を同定するためのインビボパニング法の一般的な適
用性は、同系黒色腫を有するマウスに、多様な集団のペプチドを発現するファー
ジを注射することにより調べられた（実施例ＶＩ）。Ｂ１６マウス黒色腫モデル
はこれらの研究のために選択された。なぜなら、形成する腫瘍は高度に脈管化し
、そしてこの腫瘍系統の生物学は、十分に特徴付けられているからである（Ｍｉ
ｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２：４６３１−４６３８（１９８２）を参
照のこと）。さらに、Ｂ１６黒色腫細胞はマウス起源であるので、宿主と腫瘍細
胞ドナーとの間の種差異は、例えば、正常な器官への分布と比較して、ファージ
の腫瘍への分布に影響しない。本明細書中に開示されるように、Ｂ１６黒色腫細
胞に対するインビボパニングは、腫瘍ホーミングペプチド（例えば、ＧＳＬ成分
含有ペプチドＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４；表２もまた参照のこと）を含む）
を明らかにし、そして抗ファージ抗体を用いた腫瘍および他の器官の免疫組織化
学染色は、ＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４）発現ファージが黒色腫において免疫
染色をもたらすが、皮膚、腎臓または他のコントロール器官において染色を本質
的にもたらさなかったことを証明した（実施例ＶＩ）。染色パターンは、一般的
に、黒色腫内の血管に従うが、血管に厳密に限定されなかった。

【０１３１】 インビボパニングはマウスにおいて行われたが、少なくともＮＧＲ、ＲＧＤま
たはＧＳＬモチーフを含むペプチドはまた、ヒト血管系を標的化し得るようであ
る。ＮＧＲファージは、移植されたヒト乳房腫瘍の血管に結合するが、正常な組
織の血管に結合せず、これはこのモチーフが患者における腫瘍標的化に特に有用
であり得ることを示す。ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）ペプチドは、ヒト患
者の腫瘍血管に選択的に発現される（Ｍａｘら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７
１：３２０（１９９７）；Ｍａｘら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ． ７２：７０
６（１９９７））、ヒトα_Vインテグリンに結合する（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前 出、１９９５）。成分／ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）結合体を使用して、
その成分を腫瘍に標的化することは、その成分が腫瘍細胞自体に標的化されるさ
らなる利点を提供する。なぜなら乳房ガン腫細胞は、例えば、α_Vβ₃インテグリ
ンを発現し得るからである（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９７）。実際
、多くのヒト腫瘍は、特定の腫瘍（例えば、悪性黒色腫）の進行に関与し得る、
このインテグリンを発現する（Ａｌｂｅｌｄａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０
：６７５７−６７６４（１９９０）；Ｄａｎｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｎｃｅｒ
６１：４９１−４９６（１９９５）；Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：２０１８−２０２２（１９９２）；Ｓａ
ｎｄｅｒｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂ
ｉｏｌ．５８：２３３−２４０（１９９２）；Ｍｉｔｊａｎｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１０８：３０６７−３０７８（１９９５））。ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣ
ＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ペプチドと異なって、ＮＧＲペプチドは、ＭＤＡ−
ＭＤ−４３５乳房ガン腫細胞に結合しないようである。しかし、ＮＧＲペプチド
は、治療的に有効な量のドキソルビシンを乳房腫瘍に送達し得た（実施例ＶＩＩ
ＩおよびＸＶ）。これは、腫瘍ホーミング分子が腫瘍血管系にのみホーミングす
る（すなわち、腫瘍細胞に直接ホーミングしない）場合でさえも、このような血
管系標的化が、この分子に連結された成分の効果を与えるのに十分であることを
示す。

【０１３２】 α_Vβ₃インテグリンは、血管形成血管系における内皮細胞により発現されるの
で、本明細書中に開示されるような方法を用いて、血管形成を受けている腫瘍血
管系はインビボで標的化され得るか否か決定するための実験が行われた。ペプチ
ドＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出
、１９９５を参照のこと）（これはα_Vβ₃インテグリンに結合することが知られ
る）を発現するファージは、ヒト乳房ガン腫細胞、マウス黒色腫細胞またはヒト
カポジ肉腫細胞から形成された腫瘍を有するマウスに注射された（実施例Ｖを参
照のこと）。ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージは、各
々の腫瘍に選択的にホーミングしたが、このようなホーミングは、コントロール
ファージでは起こらなかった。例えば、ヒト乳房ガン腫細胞の移植により形成さ
れた腫瘍を有するマウスにおいて、選択されていないコントロールファージと比
較して、２０〜８０倍多い数のＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１
）ファージが腫瘍に蓄積した。

【０１３３】 ファージについての組織染色は、腫瘍内の血管においてＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣ
ＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージの蓄積を示したが、脳、腎臓または他のコ
ントロール器官においては染色は観察されなかった。ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧ
ＤＣＦＣ；配列番号１）ファージによる腫瘍ホーミングの特異性は競合実験によ
り証明され、ここで遊離ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ペプ
チドの同時注射は、ＲＧＤファージの腫瘍ホーミングを著しく低減させたが、非
ＲＧＤ含有コントロールペプチドの同時注射は、ＲＧＤファージのホーミングに
影響を及ぼさなかった（実施例ＩＩＩを参照のこと）。これらの結果は、α_Vβ₃ 標的分子が腫瘍中の内皮細胞の管腔表面上で発現され、そしてα_V含有インテグ リンに結合するペプチドが、このインテグリンに、従って血管形成を受ける血管
系に選択的に結合し得ることを証明する。

【０１３４】 これらの研究の結果は、腫瘍ホーミング分子がインビボパニングにより同定さ
れ得、そしていくつかの場合において、腫瘍ホーミング分子が、腫瘍中の脈管組
織に、ならびにおそらく、循環系からのファージの容易な退出を可能にする血管
の有窓性性質に起因して、腫瘍実質にホーミングし得ることを示す。このような
腫瘍ホーミング分子が腫瘍にホーミングする能力のために、この分子は、連結成
分の腫瘍への標的化に有用である。従って、本発明は、成分に連結された腫瘍ホ
ーミング分子を含む結合体を提供し、このような結合体は、成分を腫瘍細胞に標
的化するために有用である。

【０１３５】 特定の腫瘍にホーミングする分子が、同じまたは類似した組織学的型の別の腫
瘍に選択的にホーミングする能力は、例えば、これらの実験のためにヌードマウ
スにおいて増殖されたヒト腫瘍または同系マウスにおいて増殖されたマウス腫瘍
を用いて決定され得る。例えば、種々のヒト乳房ガン細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４
３５乳房ガン腫（Ｐｒｉｃｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７１７−７２１
（１９９０））、ＳＫＢＲ−１−ＩＩおよびＳＫ−ＢＲ−３（Ｆｏｇｈら、Ｊ．
Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５９：２２１−２２６（１９７５））、な
らびにマウス乳房腫瘍株（ＥＭＴ６（Ｒｏｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
５７：７０６−７１４（１９９４））およびＣ３−Ｌ５（ＬａｌａおよびＰａ
ｒｈａｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５４：６７７−６８４（１９９３））を
含む）を含む）は、容易に入手可能であり、そしてヒト乳ガンのモデルとして一
般的に使用される。このような乳房腫瘍モデルを用いて、例えば、多様な乳房腫
瘍に対する同定された乳房腫瘍ホーミング分子の特異性に関する情報が得られ得
、そして広い範囲の異なる乳房腫瘍にホーミングするか、または最も好ましい特
異性プロフィールを提供する分子が同定され得る。さらに、このような分析は、
例えば、腫瘍支質についての新たな情報を生じ得る。なぜなら内皮細胞のものと
同様に、支質細胞遺伝子発現は、インビトロで再現され得ない方法で腫瘍により
改変され得るからである。

【０１３６】 分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）の腫瘍への選択的ホーミングは、
特定の細胞標的分子（例えば、腫瘍中の細胞に存在する細胞表面レセプター）の
ペプチドによる特異的認識によるものであり得る。ホーミングの選択性は、１つ
のみまたは少数の異なる細胞型で発現される特定の標的分子に依存し、その結果
分子は、腫瘍に主としてホーミングする。上記で議論されるように、同定された
腫瘍ホーミングペプチドは、少なくとも部分的に、腫瘍に存在する血管において
内皮細胞表面マーカーを認識し得る。しかし、ほとんどの細胞型、特に器官また
は組織に独特である細胞型は、独特の標的分子を発現し得る。従って、インビボ
パニングは、特定の型の腫瘍細胞（例えば、乳ガン細胞）に選択的にホーミング
する分子を同定するために使用され得、そして特異的ホーミングは、適切な競合
実験を行うことにより証明され得る。

【０１３７】 ドキソルビシンを用いたマウスにおけるヒト乳ガン異種移植片の処置を、本発
明を例示するためのモデルとして選択した。ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）
およびＣＮＧＲＣ（配列番号８）はドキソルビシンに結合され（実施例ＶＩＩ）
、そしてペプチド／ドキソルビシン結合体を使用して、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３
５乳ガン細胞に由来する腫瘍を有するマウスを処置した（実施例ＶＩＩＩおよび
ＸＶ）。マウスは、腫瘍を有するマウスにおいて使用される、より一般的に使用
される５０〜２００μｇ／マウス（Ｂｅｒｇｅｒら、「Ｔｈｅ Ｎｕｄｅ Ｍｏ
ｕｓｅ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
１９９１））と比較して、５μｇ／週のドキソルビシン等価物（すなわち、遊離
ドキソルビシンまたはペプチド／ドキソルビシン結合体のドキソルビシン成分の
いずれか）で処置された。結合体は遊離薬物より有効であると推測されるので、
より低い用量が選択された。

【０１３８】 ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体で
処置されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を有するマウスは、遊離ドキソルビシンで
処置されたマウスより、有意により小さな腫瘍、局所リンパ節へのより少ない蔓
延、およびより少ない肺転移を有した（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）。ドキソ
ルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体で処置され
たマウスのすべては、遊離ドキソルビシンで処置されたマウスのすべてが広範に
蔓延した疾患により死んだ時間を超えて生存した。用量増大実験において、腫瘍
を有するマウスは、３サイクルの間、３週間毎に３０μｇ／マウスのドキソルビ
シン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体で処置され、次
いで長期間、さらなる処置なく観察された。結合体処置マウスはすべて、コント
ロールドキソルビシン処置マウスが死んだ後、６ヶ月を超えて生存した（実施例
ＶＩＩＩ）。これらの結果は、原発性腫瘍増殖および転移が結合体で処置された
マウスにおいて有意に阻害され、そして治癒していたかもしれないことを示す。

【０１３９】 ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体を
受けたマウスの多くは、著しい皮膚潰瘍および腫瘍壊死を示し；このような徴候
は、遊離ドキソルビシンまたは非関連ペプチドに結合されたドキソルビシンで処
置されたマウスにおいて観察されなかった（実施例ＶＩＩＩ）。組織病理学的分
析は、遊離ドキソルビシンで処置されたマウスと比較して、結合体で処置された
腫瘍において脈管構造の著しい破壊を明らかにした。さらに、腫瘍がマウスから
取り出され、そして腫瘍細胞が培養物中にプレーティングされた場合、ドキソル
ビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体を受けたマウ
スの腫瘍に由来する細胞の生存能力は、遊離ドキソルビシンで処置されたマウス
の腫瘍に由来する細胞より約３倍低かった（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）。こ
れらの結果は、腫瘍ホーミング分子に連結された化学療法剤を含む結合体の、腫
瘍を有するマウスへの投与が、腫瘍処置において薬剤単独の投与より有効である
ことを証明する。

【０１４０】 非常に大きな、大きさを適合させた乳房腫瘍を有するマウスにおける２００μ
ｇ／ドキソルビシン等価物の投与により毒性が決定された。ドキソルビシン／Ｒ
ＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体で処置されたマウスのす
べては１週間を超えて生存したが、一方遊離ドキソルビシンで処置されたマウス
のすべては、薬物投与の４８時間以内に死んだ（実施例ＶＩＩＩ）。これらの結
果は、大きな腫瘍における腫瘍ホーミングペプチド／ドキソルビシン結合体の蓄
積が薬剤の全身毒性を低減し得ることを示す。

【０１４１】 同様の毒性および処置効力の結果が、乳房腫瘍を有するマウスがドキソルビシ
ン／ＣＮＧＲＣ（配列番号８）結合体を用いて処置された場合に得られた。ＣＮ
ＧＲＣ（配列番号８）結合体で処置されたマウスにおける腫瘍は、コントロール
群における腫瘍より有意に小さく；結合体は、ほとんど完全に腫瘍増殖を抑制し
た。生存に対する強力な効果もまた生じた。遊離ドキソルビシンまたは非関連ペ
プチドに結合されたドキソルビシンは、使用された用量では、ビヒクル単独と比
較して腫瘍増殖に対する効果をあるにしてもほとんど有さなかった。

【０１４２】 遊離ドキソルビシンおよびドキソルビシン／ペプチド結合体の細胞傷害性活性
は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を用いてインビトロで比較された。細胞が遊離ド
キソルビシン、ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号
１）または非関連ペプチドに結合されたドキソルビシンに３０分間暴露された場
合、細胞死は、ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号
１）結合体で処理された培養物でのみ起こった。比較すれば、細胞は、暴露の２
４時間後、すべての処理により殺傷された。これらの結果は、ドキソルビシン／
ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体の増強した細胞取り込
みが起こることを示す。

【０１４３】 本明細書中で開示されるように、本発明の腫瘍ホーミング分子は、腫瘍の小さ
な血管の内皮裏打ちに結合し得る。腫瘍内の血管系構造は、恐らく、連続的な新
血管形成（これは、腫瘍増殖に必要とされる新たな血管の形成をもたらす）のた
めに明瞭である。腫瘍内の血管系形成した新生血管の明瞭な特性は、内皮細胞お
よび血管周囲細胞における特異的マーカーの存在に反映され（Ｆｏｌｋｍａｎ，
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５１０（１９９７）；Ｒｉｓａｕ
，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：９２６−９３３（１９９５）；Ｂｒｏｏｋｓら、前出、
１９９４）；これらのマーカーは、本発明の腫瘍ホーミング分子により標的化さ
れるようである。

【０１４４】 腫瘍ホーミング分子が腫瘍における血管を標的化する能力は、全身処置の方法
または腫瘍細胞を直接標的化する方法を超える実質的な利点を提供する。例えば
、腫瘍細胞は生存のために脈管供給に依存し、そして血管の内皮裏打ちは循環プ
ローブに容易に接近可能である。逆に、固形腫瘍細胞に到達するために、化学療
法剤は、潜在的に長い拡散距離、密接に詰められた腫瘍細胞、および血管外遊出
を妨げる高い間隙圧力を有する密集した繊維性支質を克服しなければならない（
ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６４：１
５５−１７４（１９９４））。

【０１４５】 さらに、腫瘍脈管構造が標的化される場合、内皮の部分的露出が、冒された腫
瘍血管全体を通る血流を止めさせる閉塞血栓の形成を導き得るので、すべての標
的細胞の殺傷は必要とされなくてもよい（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、
前出、１９９４）。さらに、直接的な腫瘍標的化とは異なり、腫瘍血管系標的化
において固有の増幅機構がある。ただ１個の毛細血管ループは、１００個までの
腫瘍細胞に栄養を供給し得、それらの各々は、血液供給に重大に依存する（Ｄｅ
ｎｅｋａｍｐ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．９：２６７−２８２（１
９９０）；Ｆｏｌｋｍａｎ，前出、１９９７）。

【０１４６】 腫瘍における内皮細胞はまた、腫瘍細胞の変異およびクローン進化により発達
し得るにつれて、細胞表面標的レセプターを失いも、そして薬物耐性表現型を発
達させもしないようである。なぜなら、内皮細胞は、それらの高い増殖速度にも
かかわらず遺伝的に安定だからである（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、前
出、１９９４；Ｆｏｌｋｍａｎ，前出、１９９５；Ｆｏｌｋｍａｎ，前出、１９
９７）。このことについて、化学療法剤で処置された腫瘍は一般的に薬物耐性を
発達させるが、一方、正常な組織（例えば、骨髄）はこのような耐性を発達させ
ないことが、医学腫瘍学者により長い間認識されている。従って、正常な組織に
対する毒性（例えば、化学療法により誘導された骨髄抑制）は、腫瘍細胞が薬物
耐性になった後でさえも処置の間生じ続ける。腫瘍を供給する血管における内皮
細胞は非腫瘍細胞であるので、それらは、骨髄細胞に類似した様式で、化学療法
剤に対する耐性を発達させないことが予想される。実際に、薬物耐性は、実験動
物でも臨床試験でも、長期の抗血管形成治療の間に観察されなかった（Ｆｏｌｋ
ｍａｎ，前出、１９９７）。

【０１４７】 選択された腫瘍への成分のホーミングを指向する目的のための、薬剤（例えば
、薬物、または他の有機分子もしくは生物学的分子）より大きな成分の腫瘍ホー
ミング分子への連結は、ＲＧＤ含有ペプチドをファージ上で発現することにより
例示され、ここでペプチドは、ファージの乳房腫瘍血管系へのホーミングを指向
した（実施例Ｖ）。これらの結果は、本発明の腫瘍ホーミング分子が他の成分（
例えば、チャンバーのあるマイクロデバイス、またはリポソーム、または細胞（
例えば、白血球（ＷＢＣ）（これは細胞傷害性Ｔ細胞もしくはキラー細胞であり
得る）を含む）に連結され得、ここで腫瘍ホーミング分子／ＷＢＣ結合体の投与
の際に、この分子は、腫瘍へのＷＢＣのホーミングを指向し、ここでＷＢＣはそ
のエフェクター機能を発揮し得ることを示す。

【０１４８】 腫瘍ホーミング分子への成分の連結は、連結された成分の腫瘍へのホーミング
を指向する分子をもたらし得る。例えば、脳ホーミングペプチドのＲＢＣへの連
結は、脳へのＲＢＣのホーミングを指向した（米国特許第５，６２２，６９９号
；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６を参照のこ
と）。この結果は、本発明の腫瘍ホーミング分子はまた、細胞型または送達系を
選択された腫瘍に指向するために、細胞型に、あるいは物理的、化学的または生
物学的送達系（例えば、リポソームもしくは他のカプセル化デバイス）（これは
、薬剤（例えば、薬物）を含み得る）に連結され得ることを示す。例えば、イン
ビボパニングにより同定された腫瘍ホーミング分子は、白血球（ＷＢＣ）（例え
ば、細胞傷害性Ｔ細胞またはキラー細胞）に連結され得、ここで腫瘍ホーミング
分子／ＷＢＣ結合体の投与の際に、この分子は、腫瘍へのＷＢＣのホーミングを
指向し、ここでＷＢＣはそのエフェクター機能を発揮し得る。同様に、腫瘍ホー
ミング分子は、リポソームまたはチャンバーのあるマイクロデバイス（例えば、
透過性膜もしくは半透膜を含む）に連結され得、ここで選択された腫瘍に送達さ
れるべき薬剤（例えば、薬物）は、リポソームまたはマイクロデバイス内に含ま
れる。このような組成物はまた、例えば、核酸分子を腫瘍細胞に送達するために
有用であり得、それによりインビボ標的化遺伝子治療を行うための手段を提供す
る。

【０１４９】 １つの実施態様において、腫瘍ホーミング分子は、被験体の外部で検出可能で
ある成分に連結され、それによりインビボ診断画像化研究を行うために有用な組
成物を提供する。例えば、検出可能に標識された腫瘍ホーミングペプチドを用い
るインビボ画像化は、被験体における腫瘍の存在を同定し得る。このような研究
のために、成分（例えば、γ線放出放射性核種（例えば、インジウム−１１１ま
たはテクネチウム（ｔｅｃｈｎｉｔｉｕｍ）−９９））は腫瘍ホーミング分子に
連結され得、そして被験体への投与後、固体シンチレーション検出器を用いて検
出され得る。同様に、陽電子放出放射性核種（例えば、炭素−１１）または常磁
性スピン標識（例えば、炭素−１３）はその分子に連結され得、被験体への投与
後、成分／分子の局在は、それぞれ、陽電子放出軸横断（ｔｒａｎｓａｘｉａｌ
）断層撮影法または磁気共鳴画像法を用いて検出され得る。このようは方法は、
他の方法を用いては検出され得ない、原発腫瘍ならびに転移病巣を同定し得る。
被験体におけるガンの存在が同定されたので、本発明の別の実施態様において、
腫瘍ホーミング分子は、成分を腫瘍に指向するために、細胞傷害性薬剤（例えば
、リシン）またはガン化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）に連結されるか、
あるいは化学療法薬物または他の細胞傷害性薬剤を含み得る、チャンバーのある
マイクロデバイスに連結され得る。このような組成物の使用は、腫瘍を選択的に
殺傷する手段を提供するが、一方ガン患者における正常組織を実質的に助命し、
従って本発明の結合体は、ガン患者を診断または処置するために有用な医薬品を
提供する。

【０１５０】 当業者は、種々の腫瘍ホーミング分子が腫瘍にのみ選択的にホーミングし得る
か、または腫瘍および選択された器官のファミリー（いくつかの場合において、
腫瘍に対する正常組織対応物を含む）に選択的にホーミングし得ることを認識す
る。従って、当業者は、行われる手順に基づいて被験体への投与のための腫瘍ホ
ーミングペプチドを選択する。例えば、腫瘍にのみホーミングする腫瘍ホーミン
グ分子は、腫瘍へ治療を指向するために有用であり得る。比較において、腫瘍だ
けでなく、１つ以上の正常な器官または組織にも選択的にホーミングする腫瘍ホ
ーミング分子は画像化方法において使用され得、これにより腫瘍以外の器官また
は組織へのホーミングは、内部画像化コントロールを提供する。このような内部
コントロールは、例えば、処置に応答した腫瘍の大きさの変化を検出するために
有用であり得る。なぜなら、正常な器官は、大きさが変化すると期待されず、従
って、腫瘍の大きさと比較され得るからである。

【０１５１】 インビボパニングにより同定される腫瘍ホーミングペプチドは、固体状態ペプ
チド合成の慣用的な方法を用いて必要とされる量で合成され得るか、または商業
的な供給源（例えば、Ａｎａｓｐｅｃ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）から購入され
得、そして所望の成分は分子に連結され得る。分子への成分の連結に有用ないく
つかの方法は、分子の特定の化学的特徴に依存して、当該分野で公知である。例
えば、応用免疫学の分野において慣用的に使用されるような、ハプテンをキャリ
アタンパク質に連結する方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１
９８８；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、前出、１９９６を参照のこと）。

【０１５２】 いくつかの場合において、薬物は、例えば、結合手順または利用される化学基
に依存して、結合または誘導体化の際に細胞傷害効力を失い得ることが認識され
る（Ｈｕｒｗｉｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：１１７５−１１８１（１
９７５）；Ｔｒａｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１；２１２−２１５（１９９３
）；Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９３：７
２６９−７２７３（１９９６））。さらに、本発明の腫瘍ホーミングペプチドを
生じるファージは、５つほどのペプチドを提示することが認識される。従って、
個々のペプチドの親和性は、効果的な腫瘍ホーミングにはあまりにも低く、そし
て１価ではなく多価のペプチド結合体が使用されなければならない可能性がある
。しかし、本明細書中で開示されるように、ドキソルビシンは、複数の腫瘍ホー
ミングペプチドとの結合体として使用された場合に細胞傷害活性を維持し（実施
例ＶＩＩＩおよびＸＶを参照のこと）、従って上記で議論される潜在的な懸念を
減らした。

【０１５３】 治療薬剤または診断薬剤のような成分は、例えば、カルボジイミド結合を用い
て腫瘍ホーミングペプチドに結合され得る（ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃ
ｈｅｋ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９（１９８０）、これ
は本明細書中に参考として援用される）（実施例ＶＩＩを参照のこと）。あるい
は、成分は、Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
３：７２６９−７２７３（１９９６）；およびＮａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１７９４−１７９９（１９８８）（これら
の各々を本明細書中で参考として援用する）に記載されるように、ホーミング分
子に結合され得る。

【０１５４】 カルボジイミドは、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'（ここで、ＲおよびＲ'は脂肪
族または芳香族であり得る）を有する化合物の基を含み、そしてペプチド結合の
合成のために使用される。調製手順は、単純であり、比較的早く、そして穏やか
な条件下で行われる。カルボジイミド化合物はカルボキシル基を攻撃して、それ
らを遊離アミノ基のための反応部位に変える。カルボジイミド結合体は、抗体生
成のために種々の化合物をキャリアに結合するために使用されてきた。

【０１５５】 水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）は、腫瘍ホーミングペプチドへの成分の結合に特に有用
である。そしてこれは、ドキソルビシンを腫瘍ホーミングペプチドに結合するた
めに使用された（実施例ＶＩＩ）。ドキソルビシンおよび腫瘍ホーミングペプチ
ドの結合は、アミノ基（ドキソルビシンにより提供される）およびカルボキシル
基（ペプチドにより提供される）の存在を必要とする。ＣＮＧＲＣ（配列番号８
）ペプチドへのドキソルビシンのＥＤＣカップリングは、ドキソルビシン／ＣＮ
ＧＲＣ（配列番号８；実施例ＶＩＩを参照のこと）を得るために、ペプチド（カ
ルボキシル基）の１：１モル比を用いて行われた。

【０１５６】 ペプチド結合の直接形成のためにカルボジイミドを使用することに加えて、Ｅ
ＤＣはまた、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）
エステル）を調製するために使用され得る。次いで、アミノ基にのみ結合するＮ
ＨＳエステルは、ドキソルビシンの単一のアミノ基とのアミド結合の形成を誘導
するために使用され得る。組み合せたＥＤＣおよびＮＨＳの使用は、一般的に、
結合体形成の収率を増加させるために結合に使用される（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒお
よびＷｉｌｃｈｅｋ、前出、１９８０）。

【０１５７】 成分を腫瘍ホーミング分子に結合するための他の方法もまた使用され得る。例
えば、グルタルアルデヒド架橋が使用され得るように、過ヨウ素酸ナトリウム酸
化、それに続く適切な反応体の還元的アルキル化が使用され得る。しかし、本発
明の結合体を生成する方法はどれが選択されるかにかかわらず、腫瘍ホーミング
分子はその標的化能力を維持すること、および成分がその関連機能を維持するこ
とを決定しなければならないことが理解される。実施例ＶＩＩＩおよびＸＶにお
いて開示されたか、さもなければ当該分野で公知の方法は、成分／腫瘍ホーミン
グ分子結合体の活性を確認し得る。

【０１５８】 形成された成分／腫瘍ホーミング分子結合体の収率は、慣用的な方法を用いて
決定される。例えば、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動または他の定性的も
しくは定量的方法が使用され得る（例えば、Ｌｉｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ．７３５：３５７−３６６（１９９６）；Ｒｏｓｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒ．４２５：４１９−４１２（１９８８）を参照のこと、これらの各々は本明
細書中に参考として援用される；実施例ＶＩＩもまた参照のこと）。特に、当業
者は、結合反応の収率を決定するための方法の選択が、部分的に、特定の成分お
よび腫瘍ホーミング分子の物理的および化学的特徴に依存することを認識する。
結合後、反応産物を脱塩して、任意の遊離ペプチドも遊離薬物も除去する。

【０１５９】 被験体に投与される場合、腫瘍ホーミング分子／成分結合体は、例えば、結合
体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物として投与される。薬
学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、そして例えば、水溶液（例
えば、水または生理学的緩衝化生理食塩水）、あるいは他の溶媒またはビヒクル
（例えば、グリコール、グリセロール、オイル（例えば、オリーブオイル）もし
くは注射可能な有機エステル）を含む。

【０１６０】 薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、結合体の吸収を安定させるか、また
は増加させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このよ
うな生理学的に受容可能な化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、
スクロースもしくはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸もしく
はグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤もしく
は賦形剤を含む。当業者には、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可
能な化合物を含む）の選択が、例えば、組成物の投与経路に依存することが公知
である。薬学的組成物はまた、薬剤（例えば、ガン治療剤）を含み得る。

【０１６１】 当業者には、腫瘍ホーミング分子を含む薬学的組成物が、種々の経路（例えば
、経口的または非経口的（例えば、静脈内的）を含む）により被験体に投与され
得ることは公知である。組成物は、注射または挿管により投与され得る。薬学的
組成物はまた、リポソームまたは他のポリマーマトリクス（これは、その中に薬
物（例えば、化学療法剤）を取り込み得る）に連結された腫瘍ホーミング分子で
あり得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，第１巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ １９８４）、こ
れは本明細書中に参考として援用される）。例えば、リン脂質または他の脂質か
らなるリポソームは、作製および投与するのが比較的単純である、非毒性の、生
理学的に受容可能な、かつ代謝可能なキャリアである。

【０１６２】 本明細書中で開示される診断方法または治療方法のために、腫瘍ホーミング分
子／成分結合体の有効量は、被験体に投与されなければならない。本明細書中で
使用する用語「有効量」は、所望の効果を生じる結合体の量を意味する。有効量
は、しばしば、腫瘍ホーミング分子に連結された成分に依存する。従って、治療
目的に投与される薬物／分子結合体の量と比較して、より少ない量の放射性標識
分子が画像化に必要とされ得る。特定の目的のための特定の分子／成分の有効量
は、当業者に周知の方法を用いて決定され得る。

【０１６３】 腫瘍ホーミング分子の投与経路は、部分的に、分子の化学構造に依存する。例
えば、ペプチドは、それらが消化管において分解され得るので、経口的に投与さ
れる場合、特に有用ではない。しかし、ペプチドを内因性プロテアーゼによる分
解にあまり受けないようにするか、または消化管を通してより吸収可能にするよ
うに、ペプチドを化学的に改変するための方法は、周知である（例えば、Ｂｌｏ
ｎｄｅｌｌｅら、前出、１９９５；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ、前出、１９
９５；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、前出、１９９５を参照のこと）。このような
改変は、インビボパニングにより同定されたペプチドで行われ得る。さらに、Ｄ
−アミノ酸、他の天然に生じないアミノ酸もしくは化学的に改変されたアミノ酸
を含み得るか；またはペプチド構造を模倣する有機分子であり得るか；またはペ
プトイド（例えば、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプトイド）であり得
る、ペプチド模倣物のライブラリーを調製するための方法は当該分野で公知であ
り、そして腫瘍にホーミングし、そして経口投与に安定な分子を同定するために
使用され得る。

【０１６４】 本明細書中に開示された方法を用いて得られた腫瘍ホーミング分子はまた、標
的分子（例えば、細胞表面レセプター）もしくは腫瘍ホーミングペプチドにより
認識されるレセプターに対するリガンドを同定するために、または標的分子を実
質的に単離するために有用であり得る。例えば、腫瘍ホーミングペプチドは、固
体支持体（例えば、クロマトグラフィーマトリクス）に連結され得る。次いで、
連結されたペプチドは、特定の標的分子を結合させるために、適切に処理された
腫瘍試料をカラムに通過させることによるアフィニティクロマトグラフィーに使
用され得る。次いで、腫瘍ホーミング分子との複合体を形成する標的分子はカラ
ムから溶出され、そして実質的に単離された形態で収集され得る。次いで、実質
的に単離された標的分子は、周知の方法を用いて特徴付けられ得る。腫瘍ホーミ
ングペプチドはまた、検出可能な成分（例えば、放射性核種、蛍光分子、酵素ま
たはビオチン）に連結され得、そして例えば、腫瘍における標的分子の存在を検
出するか、または種々の単離工程間に標的分子を追跡するために、これを使用し
て試料をスクリーニングし得る。

【０１６５】 当然、腫瘍試料における標的分子の存在を同定する際に、当業者は、実質的に
単離された形態で標的分子を容易に得ることができるということになる。例えば
、標的分子を含む試料は、カラムに付着された関連する腫瘍ホーミング分子を含
むカラムに通過され得、それにより実質的に単離された形態で標的分子を得る手
段を提供する（実施例Ｘを参照のこと）。従って、本発明は、実質的に単離され
た標的分子をさらに提供し、これは腫瘍ホーミング分子に特異的に結合し、そし
て本明細書中に開示される方法を用いて得られ得る。

【０１６６】 本発明の方法は、種々の腫瘍に選択的にホーミングし得る、腫瘍ホーミングペ
プチドを同定するために使用された。システイン残基は、ペプチドの環状化がも
たらされ得るようにいくつかのペプチドにおいて含まれたことが認識されるべき
である。実際に、少なくとも２つのシステイン残基を含むを含むペプチドは、自
発的に環状化する。しかし、このような環状ペプチドはまた、線状形態で存在す
る場合に活性であり得（例えば、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９３を参照の
こと）、そして本明細書中に開示されるように、線状ペプチドＮＧＲＡＨＡ（配
列番号６）はまた、腫瘍ホーミング分子として有用であった（実施例ＶＩＩＩ；
表１もまた参照のこと）。従って、いくつかの場合において、本明細書中で開示
された、さもなければ腫瘍ホーミングペプチドとして同定されたペプチドにおけ
る１つ以上のシステイン残基は、ペプチドの腫瘍ホーミング活性に有意に影響す
ることなく欠失され得る。本発明のペプチドの腫瘍ホーミング活性のための、シ
ステイン残基またはシステイン残基のＮ末端もしくはＣ末端側のアミノ酸残基の
必要性を決定する方法は、慣用的であり、そして当該分野で周知である。

【０１６７】 腫瘍ホーミングペプチドは、例えば、上記で議論されたように所望の部分を選
択された腫瘍に標的化するために有用である。さらに、腫瘍ホーミングペプチド
は、試料中の標的分子の存在を同定するために使用され得る。本明細書中で使用
される用語「試料」は、身体から単離される、細胞、組織、器官またはそれらの
部分（腫瘍を含む）を意味するために、その最も広い意味において使用される。
試料は、例えば、組織学的切片、または生検により得られた標本、または組織培
養に置かれたまたはそれに適応された細胞であり得る。所望の場合、試料は、例
えば、ホモジナイゼーション（これは、腫瘍ホーミング分子が結合する標的分子
を単離するための最初の工程であり得る）により処理され得る。

【０１６８】 腫瘍ホーミングペプチド（例えば、乳癌ホーミングペプチド）は、乳癌におい
て発現された標的分子を同定するために使用され得る。例えば、乳癌ホーミング
ペプチドは、マトリクス（例えば、クロマトグラフィーマトリクス）に付着され
て、ペプチドアフィニティマトリクスを生成し得る。乳癌のホモジナイズされた
試料は、標的分子の腫瘍ホーミングペプチドへの特異的結合を可能にする条件下
で、ペプチドアフィニティマトリクスに適用され得る（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｍ．Ｐ．Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）、第１８２巻、これは本明細書中に参考として
援用される；例えば、３５７〜３７９頁を参照のこと）。結合しなかった物質お
よび非特異的に結合した物質は除去され得、そして特異的に結合した乳癌由来標
的分子は、実質的に精製された形態で単離され得る。正常な乳房組織における標
的分子の存在または非存在もまた決定され得る。このような分析は、腫瘍標的化
の方法への洞察を提供し得る。

【０１６９】 本明細書中に開示されるように、腫瘍ホーミング分子を特異的に結合する、標
的分子は、腫瘍試料とこのような腫瘍ホーミング分子とを接触させ、そして腫瘍
ホーミング分子により結合された標的分子を同定することにより同定され得る。
並行して、腫瘍ホーミング分子は、腫瘍に対応する非腫瘍組織試料と接触される
。腫瘍試料における標的分子の存在は、腫瘍ホーミング分子が対応する非腫瘍組
織試料の成分に結合しないことを決定することにより同定され得る。従って、本
発明は、腫瘍において発現され、そして腫瘍ホーミング分子により特異的に結合
される、標的分子の存在を同定するための方法を提供する。

【０１７０】 ＮＧＲモチーフを含む非常に多くの腫瘍ホーミングペプチドが同定されたので
、例えば、ＮＧＲ配列を含む腫瘍ホーミングペプチドは、ＮＧＲレセプターを単
離するために使用され得る。従って、ＮＧＲ腫瘍ホーミングペプチドは固体マト
リクスに連結され得、そして腫瘍の適切に処理された試料（これは、ＮＧＲペプ
チドを特異的に結合する）は、ＮＧＲペプチド−マトリクス上を通過させられ得
る。次いで、ＮＧＲ腫瘍ホーミングペプチドに対する標的分子であるＮＧＲレセ
プターは、実施例Ｘに記載のように、実質的に単離された形態で得られ得る。標
的分子を参照して使用される場合、用語「実質的に単離された」は、標的分子が
存在する総タンパク質の少なくとも３０％を含むことを意味するが、標的分子は
、総タンパク質の少なくとも５０％、または総タンパク質の８０％、または総タ
ンパク質の９０％もしくは９５％、あるいはそれ以上を含み得る。ゲル電気泳動
および銀染色のような方法は、精製プロトコル後、試料における標的分子の相対
量を決定するために使用され得、従って、実質的に単離された標的分子を同定す
るために使用され得る。

【０１７１】 当業者は、実質的に単離された標的分子が、標的分子を特異的に結合する抗体
を得るための免疫原として使用され得ることを認識する。本明細書中で使用する
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにこのよ
うな抗体の抗原結合フラグメントを含む、その最も広い意味で使用される。腫瘍
ホーミング分子により標的化される標的分子を特異的に結合する、本発明の抗体
に関して、用語「抗原」は、標的分子ポリペプチドまたはそのペプチド部分を意
味する。抗体または標的分子を結合する抗体の抗原結合フラグメントは、少なく
とも約１×１０⁵Ｍ^-1、好ましくは少なくとも約１×１０⁶Ｍ^-1、そしてより好ま
しくは少なくとも約１×１０⁸Ｍ^-1の標的分子またはそのペプチド部分に対する 特異的結合活性を有することにより特徴付けられる。従って、標的分子（これは
、血管形成血管系により発現される）に対する特異的結合活性を保持する、抗体
のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦｄおよびＦｖフラグメントは、抗体の定義内に含 まれる。

【０１７２】 さらに、本明細書中で使用する用語「抗体」は、天然に生じる抗体、ならびに
天然に生じない抗体（例えば、単鎖抗体、キメラ、２価およびヒト化抗体を含む
）、ならびにその抗原結合フラグメントを含む。このような天然に生じない抗体
は、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換え的に生成され得るか、ま
たは例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９
８９）（これは本明細書中に参考として援用される）により記載されるように、
可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニン
グすることにより得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ融合、単鎖およ
び２価抗体を作製するこれらのおよび他の方法は、当業者に周知である（Ｗｉｎ
ｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４：２４３−２４
６（１９９３）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８
９）；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２）；Ｂｏｒ
ｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版（Ｏｘｆｏ
ｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；これらの各々は本明細
書中に参考として援用される；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８も
また参照のこと）。

【０１７３】 本発明の標的分子を特異的に結合する抗体は、本明細書中に開示されるように
得られ得る実質的に単離された標的分子を、または例えば、標的分子の酵素的分
解およびゲル精製により得られ得る標的分子のペプチド部分を、免疫原として使
用して惹起され得る。標的分子の非免疫原ペプチド部分は、ハプテンをキャリア
分子（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモ
シアニン（ＫＬＨ））にカップリングすることにより免疫原性にされ得る。種々
の他のキャリア分子およびハプテンをキャリア分子にカップリングするための方
法は当該分野で周知であり、そして例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出
、１９８８により記載される。

【０１７４】 本発明の特に有用な抗体は、標的分子上の腫瘍ホーミング分子結合部位に結合
する抗体であり、このような抗体は、抗体と、標的分子に結合する特定の腫瘍ホ
ーミング分子との結合の競合阻害を検出することにより容易に同定可能な抗体で
ある。逆に、腫瘍ホーミング分子を結合することに関与しない標的分子エピトー
プに結合する抗体もまた価値がある。なぜなら、このような抗体（それ自体が「
腫瘍ホーミング分子」であり得る）は、それに結合した別の腫瘍ホーミング分子
を有する標的分子に結合され得るからである。

【０１７５】 標的分子（例えば、ＮＧＲレセプター）を特異的に結合する抗体は、組織試料
（これは、溶解物または組織学的切片であり得る）における標的分子の存在また
はレベルを決定するために有用である。試料における標的分子の存在またはレベ
ルの同定は、周知のイムノアッセイおよび免疫組織化学的方法を用いてなされ得
る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、１９８８）。標的分子に特異的な抗体
はまた、試料から標的分子を実質的に単離するために使用され得る。さらに、本
発明の抗体は、例えば、標的分子に結合する腫瘍ホーミング分子のペプチド模倣
物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、または腫瘍標的化のため
の道具として使用され得る。

【０１７６】 腫瘍ホーミング分子の性質のために血管形成血管系（例えば、腫瘍における血
管形成血管系）において発現される標的分子を得る際に、それが存在する場合、
標的分子に対する天然に生じるリガンドが、同定され得る。このような標的分子
（「オーファンレセプター」に類似する）に対するリガンドを同定するための方
法は、当該分野で周知であり、そして例えば、生物学的試料をスクリーニングし
てリガンドを同定する工程を含む。標的分子に対する天然リガンドを同定するた
めの便利なスクリーニングアッセイは、推定天然リガンドが、標的分子への、標
的分子を特異的に結合する腫瘍ホーミング分子（例えば、実質的に単離された標
的分子を得るために使用される腫瘍ホーミングペプチド）の結合を競合阻害する
能力を利用し得る。

【０１７７】 標的分子、および例えば、標的分子に対する天然リガンド、または標的分子を
特異的に結合する腫瘍ホーミングペプチドについての競合結合アッセイを含むス
クリーニングアッセイはまた、腫瘍ホーミング分子のペプチド模倣物を同定する
ための手段を提供する。上記で議論されるように、このようなペプチド模倣物は
、それらが小さく、貯蔵に比較的安定であり、適切な量で便利に生成され得、そ
して経口的に投与され得る点で、腫瘍ホーミングペプチド以上の利点を提供し得
る。腫瘍ホーミングペプチドのペプチド模倣物は、上記のような競合結合アッセ
イにおいてペプチド模倣物のライブラリーをスクリーニングすることにより同定
され得る。

【０１７８】 開示されたインビボパニング法は、腫瘍における異なる４種類の標的分子を検
出するために使用され得る。第１に、腫瘍血管系は活発な血管形成を受けるので
、一般的に血管形成血管系、または特に血管形成腫瘍血管系に特徴的な標的分子
が同定され得る。第２に、腫瘍の起源の組織に特徴的な血管標的分子が同定され
得る。第３に、腫瘍の特定の型の血管系において発現される標的分子が同定され
得る。第４に、腫瘍支質または腫瘍細胞の標的分子は、腫瘍血管系の有窓性性質
（これは、潜在的な腫瘍ホーミング分子が循環を去り、そして腫瘍実質に接触さ
せることを可能にする）により同定され得る。

【０１７９】 本明細書中にさらに開示されるように、全くではないが、いくつかの腫瘍ホー
ミング分子はまた、腫瘍内に含まれない血管形成血管系にホーミングし得る。例
えば、ＲＧＤモチーフまたはＧＳＬモチーフのいずれかを含む腫瘍ホーミング分
子もまた、網膜新生血管系に有効にホーミングしたが（Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｖｅ
ｓｔ． Ｏｐｈｔａｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．３５：１０１−１１１（１９
９４）、これは本明細書中に参考として援用される）、ＮＧＲモチーフを含む腫
瘍ホーミングペプチドは、網膜新生血管系に腫瘍血管系より低い程度で蓄積した
。従って、本発明はまた、非腫瘍性の新生血管系にホーミングするペプチド、な
らびに非腫瘍新生血管系に比較して腫瘍血管系に優先的にホーミングするペプチ
ドを提供する。さらに、これらの結果は、腫瘍血管系が、他種の血管形成血管系
により実質的に発現されない標的分子を発現することを示す。従って、本発明は
、腫瘍に存在する血管形成血管系により特異的に発現された標的分子、ならびに
腫瘍に関連しない血管形成血管系により発現された標的分子を同定するための手
段を提供する。本明細書中に開示される方法は、このようなホーミングペプチド
を区別するために、そして種々の標的分子を単離するために使用され得る。

【０１８０】 標的分子を得るための腫瘍試料の使用に対する代替として、培養した腫瘍細胞
または内皮細胞の抽出物（どの細胞型が標的分子を発現するかに依存する）が、
試料中の標的分子の濃度を高めるために開始材料として使用され得る。しかし、
このような細胞の特徴は組織培養への適合に際して変化し得ることが認識される
。従って、このような前選択工程が試みられる場合、注意を働かせなければなら
ない。標的分子の存在は、例えば、ファージ結合アッセイおよび細胞付着アッセ
イ（例えば、Ｂａｒｒｙら、前出、１９９６を参照のこと）を使用することによ
って証明され得る。

【０１８１】 特定の標的分子を発現する細胞株が同定され得、そして細胞の表面ヨウ素化を
使用して、標的分子を標識し得る。次いで、細胞は、例えば、オクチルグルコシ
ドを用いて抽出され得、そして抽出物はマトリックス（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯ
ＳＥ）に結合させた腫瘍ホーミングペプチド（表１および表２を参照のこと）を
使用するアフィニティークロマトグラフィーによって分画され得る（Ｈｅｒｍａ
ｎｓｏｎ、前出、１９９６を参照のこと）。精製された標的分子はマイクロ配列
決定され得、そして抗体が調製され得る。所望の場合、オリゴヌクレオチドプロ
ーブが調製され得、そして標的分子をコードするｃＤＮＡクローンを単離するた
めに使用され得る。あるいは、抗標的分子抗体を使用して、発現ライブラリーか
らｃＤＮＡクローンを単離し得る（Ａｒｇｒａｖｅｓら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂ
ｉｏｌ． １０５：１１８３−１１９０（１９８７）（これは、本明細書中で参
考として援用される）を参照のこと）。

【０１８２】 標的分子の単離に対する代替として、標的分子をコードする核酸が、哺乳動物
細胞発現クローニング系（例えば、ＣＯＳ細胞系）を使用して単離され得る。適
切なライブラリーは、例えば、原発腫瘍細胞由来のｍＲＮＡを使用して調製され
得る。核酸は、例えば、ｐｃＤＮＡＩＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中
へクローン化され得る。標的分子のｃＤＮＡを発現する細胞は、腫瘍ホーミング
ペプチドへの結合によって選択され得る。精製されたファージは、ペプチドのキ
ャリアとして使用され得、そして、例えば、抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いてコートされた磁気
ビーズに結合され得る。ペプチドコーティングに結合する細胞は、磁気を使用し
て回収され得、そしてプラスミドが単離され得る。次いで、回収されたプラスミ
ド調製物はプール中へ分割され得、そしてＣＯＳ細胞トランスフェクションにお
いて試験され得る。手順は、ＣＯＳ細胞に腫瘍ホーミングペプチドを結合する能
力を付与し得る単一のプラスミドが得られるまで繰り返され得る。

【０１８３】 以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定するよ
うには意図されない。

【０１８４】

【実施例】

（実施例Ｉ インビボパニング） 本実施例は、腫瘍へホーミングするペプチドを発現するファージを同定するた
めの、ファージライブラリーを調製するための方法およびインビボパニングを使
用してライブラリーをスクリーニングするための方法を示す。

【０１８５】 （Ａ．ファージライブラリーの調製） ファージディスプレイライブラリーを、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら（前出、１９９５
；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂ）によって記載されるように融合５ベ
クターを使用して構築した。ＣＸ₅Ｃ（配列番号９）、ＣＸ₆Ｃ（配列番号１０）
、ＣＸ₇Ｃ（配列番号１１）、およびＣＸ₃ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃ（配列番号１２）と命名
したペプチドをコードするライブラリーを調製した。ここで「Ｃ」はシステイン
を示し、そして「Ｘ_N」は別々に選択したアミノ酸の所定の数字を示す。これら のライブラリーは、少なくとも２つのシステイン残基がペプチド内に存在する場
合、環状ペプチドを表し得る。さらに、規定されたシステイン残基を含まないラ
イブラリーもまた構築した。このようなライブラリーは、主に直鎖状ペプチドの
生成を生じるが、環状ペプチドもまたランダムな可能性に起因して生じ得る。

【０１８６】 配列ＣＸＸＸＮＧＲＸＸ（配列番号１３）に基づく偏向ライブラリーもまた構
築した。さらに、いくつかの場合において、ＣＸＸＸＮＧＲＸＸ（配列番号１３
）ライブラリーを、ＮＧＲ配列に隣接するシステイン残基の組み込み（すなわち
、ＣＸＸＣＮＧＲＣＸ（配列番号１４；表１を参照のこと）によってさらに偏向
させた。

【０１８７】 規定したシステイン残基を含むライブリーを、「Ｃ」がコドンＴＧＴによって
コードされ、そして「Ｘ_N」がＮＮＫによってコードされるように（ここで、「 Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ，およびＴの等モル混合物であり、そしてここで「Ｋ」はＧお
よびＴの等モル混合物である）構築したオリゴヌクレオチドを使用して作製した
。従って、ＣＸ₅Ｃ（配列番号９）によって表されるペプチドを、配列ＴＧＴ（ ＮＮＫ）₅ＴＧＴ（配列番号１４）を有するオリゴヌクレオチドによって表し得 る。オリゴヌクレオチドを３サイクルのＰＣＲ増幅によって２本鎖にし、精製し
、そして、発現に際して、ペプチドが遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ末端に融合タ
ンパク質として表されるように融合５ベクター中に遺伝子ＩＩＩタンパク質をコ
ードする核酸に連結した。

【０１８８】 ベクターをＭＣ１０６１細胞へエレクトロポレーションによってトランスフェ
クトした。細菌を２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンの存在下で２４時間培養し、
次いでファージをポリエチレングリコールを使用して２回沈澱させることによっ
て上清から回収した。各ライブラリーは、約５×１０⁹〜５×１０¹⁴形質導入単 位（ＴＵ；個々の組換えファージ）を含んだ。

【０１８９】 （Ｂ．ファージのインビボパニング） 腫瘍を、以下の実施例ＩＩおよび実施例ＩＩＩにおいて記載するようにマウス
に移植した。１×１０⁹〜１×１０¹⁴ ＴＵを含むファージライブラリーの混合 物を、２００μｌ ＤＭＥＭで希釈し、そして麻酔（ＡＶＥＲＴＩＮ （０．０
１５ｍｌ／ｇ）；米国特許第５，６２２，６９９号；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉおよ
びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６を参照のこと）したマウスの尾静脈に注
射した。１〜４分後、マウスを液体窒素中で急速凍結した。ファージを回収する
ために、屠殺体を、室温で１時間部分的に解凍し、腫瘍およびコントロール器官
を回収し、そして重量を測定し、次いで１ｍｌ ＤＭＥＭ−ＰＩ（プロテアーゼ
インヒビター（ＰＩ）；フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；１ｍ
Ｍ）、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含む
ＤＭＥＭ）中で粉砕した。

【０１９０】 あるいは、ライブラリーのマウスへの導入後、ライブラリーの循環は心臓を通
る灌流によって停止される。簡略には、マウスをＡＶＥＲＴＩＮで麻酔し、次い
で心臓を露出させ、そして０．５ｍｍカニューレを通して１０ｃｃシリンジへ連
結した０．４ｍｍ針を左心室へ挿入した。右心房を切開し、そして５〜１０ｍｌ
のＤＭＥＭをゆっくりと投与し、約５〜１０分間にわたって全身を灌流した。灌
流の効率を組織学的分析によって直接的にモニターした。

【０１９１】 腫瘍および器官試料を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む氷冷ＤＭＥ
Ｍ−ＰＩで３回洗浄し、次いで１ｍｌ Ｋ９１−ｋａｎ細菌とともに１時間直接
的にインキュベートした。０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌの
ＮＺＹ培地（ＮＺＹ／ｔｅｔ）を、細菌培養物に添加し、混合物を３７℃振盪機
中で１時間インキュベートし、次いで１０μｌまたは１００μｌアリコートを１
２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む寒天プレート（ｔｅｔ／寒天）にプレ
ートした。

【０１９２】 腫瘍から回収したファージを含む独立したコロニーを５ｍｌ ＮＺＹ／ｔｅｔ
中で１６時間増殖させた。独立したコロニーから得た細菌培養物をプールし、そ
してファージを精製し、そして２回目のインビボパニングのために上記のように
マウスに再注射した。一般に、３回目のパニングもまた行った。ファージＤＮＡ
を最終回のインビボパニングから得た独立した細菌コロニーから精製し、そして
選択したファージによって発現されるペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定し
た（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂを参照のこと）。 （実施例ＩＩ：乳癌に対するインビボパニングによる腫瘍ホーミングペプチドの
同定） 本実施例は、インビボパニングを種々の腫瘍へホーミングする腫瘍ホーミング
ペプチドを同定するために乳癌に対して行い得ることを示す。

【０１９３】 ヒト４３５乳癌細胞（Ｐｒｉｃｅら、前出（１９９０））をヌードマウスの乳
房の脂肪パッドに接種した。腫瘍が約１ｃｍの直径に達した場合、ファージ標的
実験（ここで、特定のペプチドを発現するファージを腫瘍保有マウスに投与した
）またはインビボパニングのいずれかを行った。

【０１９４】 乳癌保有マウスにＣＸ₃ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃ（配列番号１２）（ここで、Ｘ₃は独立し
て選択される、無作為のアミノ酸の３つの群を示す）ペプチドのライブラリーを
発現する１×１０⁹ファージを注射した。ファージを４分間循環させ、次いでマ ウスを麻酔し、麻酔をかけている間に液体窒素中で急速凍結し、そして腫瘍を取
り出した。ファージを腫瘍から単離し、そして２回のさらなるインビボパニング
に供した。

【０１９５】 ３回目のパニングの後、ファージを定量し、そしてクローン化したファージに
よって発現されるペプチド配列を決定した。クローン化したファージは、種々の
異なるペプチドを発現し、これには表１に示すものが挙げられる。同様に、ＣＸ ₇ Ｃ（配列番号１１）およびＣＸ₅Ｃ（配列番号９）ライブラリーをスクリーニン
グし、そして乳癌ホーミングペプチドを同定した（表１）。これらの結果は、乳
癌に対するインビボパニングが腫瘍ホーミング分子を同定し得ることを示す。

【０１９６】

【表１】 （実施例ＩＩＩ：ＲＧＤペプチドを発現するファージの腫瘍へのインビボ標
的化） ヒト４３５乳癌細胞をヌードマウスの乳房脂肪パッドに接種した。腫瘍が約１
ｃｍの直径に達した場合、特定のＲＧＤ含有ペプチドを発現するファージを腫瘍
保有マウスに投与した。以下に議論する結果と類似の結果がまた、ヒトメラノー
マＣ８１６１細胞の移植によって、またはマウスＢ１６メラノーマ細胞の移植に
よって形成された腫瘍を保有するヌードマウスを用いて得られた。

【０１９７】 ＲＧＤ含有ペプチドＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１；Ｋｏｉ
ｖｕｎｅｎら、前出、１９９５を参照のこと）を発現する１×１０⁹ファージま たはコントロール（挿入なし）ファージをマウスに静脈内注射（ｉｖ）し、そし
て４分間循環させた。次いで、マウスを急速凍結させるか、または麻酔下で心臓
を通して灌流し、そして種々の器官（腫瘍、脳、および腎臓を含む）を取り出し
、器官中に存在するファージを定量した（米国特許第５，６２２，６９９号；Ｐ
ａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６を参照のこと）
。

【０１９８】 ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ：配列番号１）ペプチドを発現する約２〜
３倍多いファージを、脳および腎臓と比較して乳癌において検出した。これは、
ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１；ＲＧＤ−４Ｃファージ）ペプチドが乳癌への
ファージの選択的ホーミングを生じることを示す。並行した研究において、非選
択ファージ（種々の多様なペプチドを発現する）を腫瘍保有マウスに注射し、そ
して種々の器官をファージの存在について調べた。腫瘍と比較して、はるかに多
くのファージが腎臓に存在し、そして、より少ない程度には、脳に存在した。従
って、非選択ファージよりも８０倍多くのＲＧＤ発現ファージが、腫瘍において
濃縮された。これらの結果は、ＲＧＤ含有ペプチドを発現するファージが、おそ
らく、腫瘍中で形成している血管のα_Vβ₃インテグリンの発現に起因して腫瘍へ
ホーミングすることを示す。

【０１９９】 乳房腫瘍ホーミングペプチドの特異性を、競合実験によって実証した。ここで
、５００μｇの遊離ペプチドＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ（配列番号１６；Ｐａｓｑ
ｕａｌｉｎｉら、前出、１９９７を参照のこと）の、腫瘍ホーミングペプチドを
発現するファージとの同時注入は、腫瘍中のファージの量を約１０倍減少させた
が、不活性なコントロールペプチドＧＲＧＥＳＰ（配列番号１７）との同時注入
は、本質的に効果を有さなかった。これらの結果は、脈管形成血管系上で発現さ
れるインテグリンに結合し得るペプチドを提示するファージが、器官または組織
（例えば、そのような血管系を含む腫瘍）にインビボで選択的にホーミングし得
ることを実証する。

【０２００】 （実施例ＩＶ：腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージのインビボ標的
化） 本実施例は、腫瘍にホーミングするペプチドを発現するファージをインビボ標
的化を記載する。

【０２０１】 腫瘍において蓄積されるペプチドの１つは、構造ＣＸ₃ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃを有する ライブラリーに由来した（Ａｒａｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−３８
０（１９９８）、これは、本明細書中に参考として援用される）。このペプチド
、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）は、配列ＮＧＲ（アスパラギン−
グリシン−アルギニン）を含み、これは、弱い細胞接着モチーフとしてとして以
前同定された（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２０２
０５−２０２１０（１９９３）；Ｈｅａｌｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：３９４
８−３９５５（１９９５）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用され
る）。ＮＧＲモチーフを含み得る他の２つのペプチド（そうでなければ、ＣＮＧ
ＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）ペプチドとは本質的に異なる）を、インビ
ボにおいて種々の腫瘍へホーミングする能力について試験した。それらのうちの
一方は、直鎖状ペプチドＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）であり（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ
ら、前出（１９９３））、そして他方は、環状ペプチドＣＶＬＮＧＲＭＥＣであ
る。

【０２０２】 腫瘍ホーミングペプチドを提示するファージを乳癌異種移植片から回収した。
簡潔には、ファージを、サイズを合わせたＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来腫瘍（約１
０００ｍｍ³）を有するマウスの尾静脈に１０⁹形質導入単位（ＴＵ）で注射し、
そして灌流後に回収した。３連でプレートすることから、腫瘍またはコントロー
ル組織（脳）から回収されたファージの平均数および平均値の標準誤差（ＳＥＭ
）を図１に示す。図１Ａ（左パネル）は、腫瘍（黒棒）および脳（斜線棒）に由
来するＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）の回収を示す。ＣＮＧＲＣＶ
ＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）ファージ（ＣＮＧＲＣ）由来の最小の環状ＮＧＲ
ペプチドを合成し、そして５００μｇのＣＮＧＲＣ（配列番号８）ペプチドをフ
ァージとともに同時注射し、このペプチドは、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配
列番号３）ファージの蓄積を、図１Ｂに示したように阻害した。ＣＮＧＲＣ（配
列番号８）ペプチドはまた、２つの他のＮＧＲ提示ファージを、乳癌異種移植片
における蓄積を阻害した。図１Ａ（中央パネル）は、ＣＧＳＬＶＲＣ（配列番号
５）ファージの回収および可溶性ペプチドＣＧＳＬＶＲＣ（配列番号５）（５０
０μｇ）による腫瘍ホーミングの阻害を示す。図１Ａ（右パネル）は、ＲＧＤ−
４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージ（陽性コントロール）および
非選択ファージライブラリー混合物（陰性コントロール）の回収を示す。

【０２０３】 図１Ｂ（左パネル）において、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号
１）可溶性ペプチドの漸増量を、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）フ
ァージを注射した。図１Ｂ（右パネル）において、ＣＮＧＲＣ（配列番号８）は
可溶性ペプチドの漸増量を、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）
ファージを注射した。ＣＮＧＲＣ（配列番号８）ペプチドによる、ＣＮＧＲＣＶ
ＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）ファージホーミングの阻害を図１Ａに示す。ＲＧ
Ｄ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージの、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤ
ＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ペプチドによる阻害を上記に記載する。

【０２０４】 図１に示されるように、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３）ファージ
は、異種移植片化されたヒト乳癌に特異的にホーミングした。同様の結果が、他
のＮＧＲ提示ファージでも得られた。腫瘍ホーミングは、腫瘍の型または腫瘍の
種に依存しない；ヒト乳癌（ならびにヒトカポジ肉腫およびマウスメラノーマ（
データは示さず））において選択的に蓄積されたファージを、図１Ａに示される
ように選択において使用した。

【０２０５】 図１Ｂ（左パネル）において示されるように、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣ
ＦＣ；配列番号１）ファージは、乳癌腫瘍に選択的にホーミングし、そしてその
ホーミングは、遊離ＲＧＤ−４Ｃペプチド（上記に記載）によって容易に阻害さ
れる。しかし、ＲＧＤ−４Ｃファージの腫瘍ホーミングは、このペプチドがＮＧ
Ｒファージのホーミングを阻害したペプチドよりも、より大きな量で使用された
場合ですら、ＣＮＧＲＣペプチド（図１Ｂ、左パネル）によって阻害されなかっ
た（図１Ａ、左パネル）。図１Ｂ（右パネル）において示されるように、ＮＧＲ
ファージの腫瘍ホーミングを、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１
）ペプチドによって部分的に阻害したが、このペプチドは、ＣＮＧＲＣペプチド
の５〜１０倍未満の強さであった。関係のない環状ペプチド、ＧＡＣＶＦＳＩＡ
ＨＥＣＧＡ（配列番号１９）は、いずれかのファージの腫瘍ホーミング能力に効
果を有さなかった（データは示さず）。要約すると、これらの結果によって、２
つのペプチドを提示するＲＧＤおよびＮＧＲは、腫瘍血管の異なるレセプター部
位に結合するが、ＲＧＤおよびＮＧＲレセプター部位が関連し得ることが示され
る。

【０２０６】 ペプチドを発現するファージの腫瘍ホーミング能力をさらに特徴付け、そして
定量するために、ＣＮＧＲＣ（配列番号８）、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦ
Ｃ；配列番号１）、およびコントロールファージ（挿入なしｆｄ−ａｍｐおよび
ｆｄ−ｔｅｔ）を、サイズを合わせたＭＤＡ−ＭＢ−４３５由来腫瘍（約１００
０ｍｍ³）を有するマウスの尾静脈に１０⁹形質導入単位（ＴＵ）で注射し、そし
て灌流後に腫瘍および脳組織から回収した。異なる選択マーカーを有する挿入な
しファージ（テトラサイクリンのかわりにアンピシリン）を、同じ腫瘍保有動物
内の特異性を評価するために同じ用量（ｉｎｐｕｔ）でＮＧＲファージとともに
同時注射した。割合を、同じ組織から回収された同時注射したコントロールアン
ピシリン耐性ファージ数を使用して算出した。このファージをテトラサイクリン
（ホーミングファージ）またはアンピシリン（コントロールファージ）選択プレ
ート上に３連でプレートすることによって定量した。種々のさらなるコントロー
ルファージを腫瘍保有マウスに別個に注射した。これらのコントロールは、以下
を含んだ：挿入なしのｆｄ−ｔｅｔファージ；非選択ファージライブラリー混合
物；他の正常な血管ベッドに対して選択されたファージまたはそれにホーミング
することが示されたファージ；およびＮＧＲに関連しないペプチドを提示するフ
ァージ。ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージは、陽性コ
ントロールとして作用した。

【０２０７】 ＮＧＲファージは、コントロールのアンピシリン耐性ファージより１０倍より
多く同時注射実験で腫瘍中に蓄積された（図２）。ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤ
ＣＦＣ；配列番号１）ファージはまた、腫瘍に選択的に結合した。対照的に、Ｎ
ＧＲファージより多くのアンピシリンファージが、脳および他の試験されたコン
トロール器官から回収された（図２）。さらに、ＮＧＲファージの、非感染性で
あるように操作された１０倍を超えるファージ粒子との同時注射は、腫瘍ホーミ
ングに影響をおよぼさなかった。過剰の非感染性ファージ粒子の包含は、脾臓お
よび肝臓などのような細網内皮組織を含む器官においてファージの捕捉を確かに
減少した。

【０２０８】 （実施例Ｖ：腫瘍ホーミングペプチドの免疫組織化学的分析） 本実施例は、免疫組織化学的試験による腫瘍ホーミング分子の位置を同定する
方法を提供する。

【０２０９】 腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージの位置を、免疫化学的方法によっ
て、腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージ（「ペプチド−ファージ」）の
腫瘍保有マウスへの投与５分後または投与２４時間後のいずれかで得た組織学的
切片において同定した（図３）。ペプチド−ファージの投与の５分後に得た試料
について、マウスをＤＭＥＭで灌流し、そして種々の器官（腫瘍を含む）を取り
出し、そしてＢｏｕｉｎ溶液中で固定した。２４時間で得た試料について、ペプ
チド−ファージは循環に残存せず、従って灌流を必要としなかった。組織学的切
片を調製し、そして抗Ｍ１３（ファージ）抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ；米国特許第５，６２２，６９９号；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏ
ｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６を参照のこと）と反応させた。結合した抗Ｍ１３
抗体の可視化を、製造業者の説明書に従ってペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓ
ｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を用いて実施した。

【０２１０】 実施例ＩＩＩにおいて考察されるように、腫瘍ホーミングペプチドＲＤＧ−４
Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１；「ＲＧＤファージ」ともよばれる）を発
現するファージを、乳房腫瘍を保有するマウスに静脈内投与した。さらに、ＲＧ
Ｄファージを、マウス黒色腫またはヒトカポジ肉腫を保有するマウスに投与した
。ファージの循環を終了し、そしてマウスを上記のように屠殺し、そして腫瘍の
試料、ならびに腫瘍、脳、腎臓、肺、および肝臓に隣接する皮膚の試料を回収し
た。ファージについての免疫組織化学的染色は、乳房腫瘍、ならびに黒色腫およ
びカポジ肉腫に存在する血管におけるＲＧＤファージの蓄積を示したが、コント
ロール器官においてはほとんどまたは全く染色は観察されなかった。

【０２１１】 類似の実験を、腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージ（ＣＮＧＲＣＶＳ
ＧＣＡＧＲＣ；配列番号３；「ＮＧＲファージ」）を用いて実施し、それをＭＤ
Ａ−ＭＢ−４３５乳ガンによって形成される腫瘍に対するインビボパニングによ
って同定した。これらの実験において、ＮＧＲファージまたはペプチドを発現し
ないコントロールファージを、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳ガンによってか、または
ヒトＳＬＫカポジ肉腫異種移植片によって形成される腫瘍を保有するマウスに投
与し、次いでマウスを上記のように屠殺し、そして腫瘍、ならびにコントロール
器官（脳、リンパ節、腎臓、膵臓、子宮、乳房脂肪パッド、肺、腸、皮膚、骨格
筋、心臓、および腎杯の上皮、膀胱、ならびに尿管を含む）を回収した（図３を
参照のこと）。組織学的試料を調製し、そして上記のように免疫染色によって試
験した。

【０２１２】 ＮＧＲファージの投与の４分後に屠殺したマウスから得た試料において、乳房
腫瘍（図３Ｅ）およびカポジ肉腫（図３Ｈ）の両方の血管系の免疫染色を観察し
た。挿入のないコントロールファージを投与されたマウス中のこれらの腫瘍（そ
れぞれ、図３Ｇおよび図３Ｊ）の内皮において、染色は非常にわずかかまたは全
く観察されなかった。ＮＧＲファージの投与の２４時間後に屠殺したマウスから
得た試料において、腫瘍試料の染色は、脈管の外側、乳房腫瘍実質（図３Ｂおよ
び図３Ｆ）およびカポジ肉腫実質（図３Ｄおよび図３Ｉ）中に拡大したようであ
った。再度、挿入のないコントロールファージを投与したマウス中のこれらの腫
瘍（それぞれ、図３Ａおよび３Ｃ）から調製した試料において、染色はわずかに
観察されたか、または全く観察されなかった。さらに、ＮＧＲファージを投与し
たマウスの種々のコントロール器官（図３Ｋ〜３Ｖ）において、染色はわずかに
観察されたか、または全く観察されなかった。

【０２１３】 他の実験において、ＮＧＲ腫瘍ホーミングペプチド、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号
６）またはＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列番号７）を発現するファージの、腫瘍保有
マウスへの投与後、同様の結果が得られた。また、以下に考察されるように、Ｇ
ＳＬ腫瘍ホーミングペプチド、ＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４）を発現するファ
ージを用いて同様の結果を得、それを、黒色腫のインビボパニングによって同定
した（以下の実施例ＶＩを参照のこと）。

【０２１４】 これらの結果は、腫瘍ホーミングペプチドが、腫瘍、特に腫瘍中の血管系に選
択的にホーミングすること、そして例えば乳ガンに対するインビボパニングによ
って同定した腫瘍ホーミングペプチドもまた、他の腫瘍（カポジ肉腫および黒色
腫を含む）に選択的にホーミングすることを実証する。さらに、これらの結果は
、免疫組織化学的分析が、腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージの位置を
同定するための簡便なアッセイを提供することを実証する。

【０２１５】 （実施例ＶＩ：黒色腫腫瘍に対するインビボパニングによる腫瘍ホーミング
ペプチドの同定） 腫瘍ホーミングペプチドを同定するためのインビボパニング法の一般的な適用
可能性を、移植したマウス黒色腫腫瘍に対するインビボパニングを実施すること
によって試験した。

【０２１６】 黒色腫を保有するマウスを、高度に血管形成化した腫瘍を産生するＢ１６Ｂ１
５ｂマウス黒色腫細胞の移植によって生成した。Ｂ１６Ｂ１５ｂマウス黒色腫細
胞を、ヌードマウス（２月齢）の乳房脂肪パッド中に皮下注射し、そして腫瘍を
、直径が約１ｃｍになるまで成長させた。インビボパニングを上記で開示される
ように実施した。ＣＸ₅Ｃ（配列番号９）、ＣＸ₆Ｃ（配列番号１０）、またはＣ
Ｘ₇Ｃ（配列番号１１）のライブラリーを発現する約１×１０¹²形質導入単位の ファージを静脈内注射し、そして４分間循環させた。次いで、マウスを液体窒素
中で急速凍結するか、または麻酔下で心臓を介して灌流し、腫瘍組織および脳（
コントロール器官）を取り出し、そして上記のようにファージを単離した。３回
のインビボパニングを実施した。

【０２１７】 Ｂ１６Ｂ１５ｂ腫瘍から回収した８９のクローン化ファージ中の挿入物につい
て、アミノ酸配列を決定した。これらのファージによって発現されるペプチドを
、２つの主な配列ＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４；配列決定されたクローンの５
２％）およびＷＧＴＧＬＣ（配列番号１８；クローンの２５％；表２を参照のこ
と）によって表した。選択したペプチドの１つを発現するファージの再感染によ
って、腫瘍へホーミングするファージは、脳へホーミングするファージと比較し
て約３倍の富化を生じた。

【０２１８】

【表２】 マウス器官中で腫瘍ホーミングペプチドを発現するファージの局在化もまた、
腫瘍および種々の他の組織の免疫組織化学的染色によって試験した（実施例Ｖを
参照のこと）。これらの実験において、１×１０⁹ｐｆｕのコントロール（挿入 なし）ファージ、または腫瘍ホーミングペプチドＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４
）を発現するファージを、腫瘍保有マウス中に静脈内注射し、そして４分間循環
させた。

【０２１９】 免疫染色は、ＣＬＳＧＳＬＳＣ（配列番号４）腫瘍ホーミングペプチドを発現
するファージを注入したマウスから得た黒色腫において明白であった。一般に、
黒色腫の染色は腫瘍内の血管に局在化したが、いくつかの染色もまた腫瘍実質中
に存在した。挿入のないコントロールファージを注射したマウスから得た腫瘍に
おいて、またはいずれかのファージを注入したマウスから得た皮膚もしくは腎臓
試料において、染色は本質的に全く観察されなかった。しかし、肝臓洞および脾
臓において免疫染色が検出され、これはファージがＲＥＳを含む器官において非
特異的に捕捉され得ることを示した。

【０２２０】 同様の方法を用いて、インビボパニングを、ＳＬＫヒトカポジ肉腫を保有する
マウスにおいて実施した。腫瘍ホーミングペプチドを同定し、これを表３に開示
する。同時に、これらの結果は、インビボパニング法が、腫瘍ホーミングペプチ
ドを発現するファージを同定するためのファージライブラリーをスクリーニング
するための一般的に適用可能な方法であることを実証する。

【０２２１】

【表３】 （実施例ＶＩＩ） （腫瘍ホーミングペプチド／ドキソルビシン結合体の調製および特徴付け） 本実施例は、化学療法剤ドキソルビシンのような部分を腫瘍ホーミングペプチ
ドに結合するための方法、および結合産物を特徴付けするための方法を提供する
。

【０２２２】 ペプチドＣＮＧＲＣ（配列番号８）、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１；ＲＧ
Ｄ−４Ｃ；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前
出、１９９７）、ＣＧＳＬＶＲＣ（配列番号５）、およびＧＡＣＶＦＳＩＡＨＥ
ＣＧＡ（配列番号１９）を合成し、高希釈下で環化し、そしてＨＰＬＣによって
均一に精製した。ペプチドのドキソルビシン（Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｍｉｌｗａｕ
ｋｅｅ ＷＩ）への結合を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ； Ｓｉｇｍａ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ； Ｓｉｇｍａ）を用いて、上記
のように（ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ， 前出、１９８０； Ｈ
ａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， 前出、１９８８； Ｈｕｒｗｉｔｚら、前出、１
９７５）実施した。未反応ドキソルビシンおよびペプチドを、リン酸緩衝化生理
食塩水を用いるＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ２５カラムクロマトグラフィーによって、
ドキソルビシン／ペプチド結合体から取り出した。結合体を貯蔵のために凍結乾
燥し、そして使用前に滅菌水中に再懸濁した。

【０２２３】 結合体のドキソルビシン濃度（実施例ＶＩを参照のこと）を、標準的な分光光
度計において４９０ｎｍで、溶液の吸光度を測定することにより決定した；この
波長は、ドキソルビシンのみを検出し、このペプチドを検出しない。ドキソルビ
シンの較正曲線を作成して、使用前に濃度を計算するために使用した。ドキソル
ビシンの種々のペプチドに対する結合体は、この曲線に影響しなかった。この手
順は、投与された結合体の各々がドキソルビシン等価物の同量を含有することを
、確実にする。

【０２２４】 ＨＰＬＣ、質量分析法、キャピラリー電気泳動およびＮＭＲ分析を実施して、
結合体を特徴付けした。ＨＰＬＣ蛍光をＩＮＴＥＲＳＩＬ ＯＤＳ−２カラム（
４．６×１５０ｍｍ）および０．０８％トリエタノールアミン／０．０２％リン
酸（８５％）／２７％アセトニトリルからなる移動相を使用して１ｍＬ／分で実
施した。蛍光検出は、４９０ｎｍでの励起および５６０ｎｍ波長での発光で実施
し、そしてドキソルビシン（ｄｏｘ）についておよび主要ピークについての保持
時間（ＲＴ）および曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。各結合体は、独特の保持
時間を有し、ペプチドに依存して以下の通りであった：ドキソルビシン／ＣＤＣ
ＲＧＤＣＦＣ（配列番号１）、ＲＴ ７．４分、ＡＵＣ ２６％；ドキソルビシ
ン／ＣＮＧＲＣ（配列番号８）、ＲＴ ４．７分、ＡＵＣ ５６％；およびドキ
ソルビシン／ＧＡＣＶＦＳＩＡＨＥＣＧＡ（配列番号１９）、ＲＴ ７．７分、
ＡＵＣ ４３％。比較として、ドキソルビシンの保持時間は１０．６分であり、
そして種々の反応において、ＡＵＣは約５％であった。

【０２２５】 キャピラリー電気泳動（ＣＥ；Ｌｉｕら、前出、１９９６）を非コート石英ガ
ラスキャピラリー（内径７５μｍおよび５０ｃｍの有効分離長）内で実施した。
ＣＥ検出系は、ＵＶ吸収検出器およびアルゴンレーザー（４８８ｎｍで発光する
）を備えていた。レーザー光線は、光ファイバーケーブルを介して検出器にまで
伝送され、そしてキャピラリーウインドウを照らし、そして蛍光シグナルを発光
フィルターを通して収集する。ドキソルビシンのペプチドへの結合は、各々の結
合体の電気泳動特性を変化させた。これは、本発明の方法が、結合反応の進行を
同定する迅速なスクリーニング方法として使用され得ることを示す。

【０２２６】 ペプチドにドキソルビシンを結合する別の方法もまた使用した（Ｎａｇｙら、
前出 １９９６；Ｎａｇｙら、前出 １９９８）。この方法によって調製された
ドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ結合体は、ＨＰＬＣにおいて均一であることが見出
された。質量分析法は、このドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ（配列番号８）結合体
が、カップリング化学から推定される質量（推定質量１１９２．２）と一致した
、１つの優勢な質量数（１１９２．６）を有したことを示した。同様の結果が、
ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ペプチドがドキソルビシンに
カップルした場合に、得られた。

【０２２７】 ドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ結合体の一次元ＮＭＲ分析は、遊離のドキソルビ
シンから生じる共鳴の証拠を明らかにしなかった。二次元ＮＭＲ分析は、ドキソ
ルビシンペプチド種の正確な分子構造の決定を可能にし得る。

【０２２８】 これらの結果は、ガン化学療法剤であるドキソルビシンのような部分が、本発
明の腫瘍ホーミングペプチドに効率的に連結されて、均一なドキソルビシン／腫
瘍ホーミングペプチド結合体を産生し得ることを実証する。

【０２２９】 （実施例ＶＩＩＩ） （ドキソルビシン／腫瘍ホーミングペプチド結合体を用いる腫瘍療法） 本実施例は、ドキソルビシン／腫瘍ホーミングペプチド結合体が、ドキソルビ
シン単独の使用を超える腫瘍を処置するための治療的利点を提供することを実証
する。

【０２３０】 結合体のドキソルビシン濃度（実施例ＶＩを参照のこと）を、標準的な分光光
度計において４９０ｎｍで溶液の吸光度を測定することにより決定した。この波
長はドキソルビシンのみを検出し、そのペプチドは検出しない。ドキソルビシン
についての較正曲線を作成し、そして使用前に濃度を計算するために使用した。
種々のペプチドに対するドキソルビシンの結合体は、この曲線に影響しなかった
。この手順は、各々の投与された結合体が同じ量のドキソルビシン等価物を含ん
でいたことを確実にする。

【０２３１】 さらに、腫瘍ホーミングペプチド／ドキソルビシン結合体で処置したマウスの
腫瘍から得られた腫瘍細胞の生存度を、遊離のドキソルビシンで処置したマウス
からの腫瘍の生存度と比較した。これらの実験において、乳房腫瘍を保有するマ
ウスを腫瘍に関して大きさを合致させ、次いでドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（
ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）または遊離のドキソルビシンの３０μｇの等
価物で静脈内に処置した。処置の５日後、マウスを安楽死させ、そして腫瘍を取
り出した。腫瘍の組を重量測定し、そして粉砕し、そして細胞懸濁物をプレート
した（１５０ｍｍプレートあたり２ｇの腫瘍組織）。

【０２３２】 細胞数をプレーティングの２４時間後および７日後で決定した。ドキソルビシ
ン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体を受けるマウスの
腫瘍由来の腫瘍細胞の生存度は、遊離のドキソルビシンで処置したマウスの腫瘍
由来の細胞の、約３分の１であった。これらの結果は、腫瘍を保有するマウスへ
の腫瘍ホーミング分子に連結された化学療法剤を含む結合体の投与が、腫瘍細胞
の生存度を低減させることにおいて、薬剤単独の投与より有効であることを実証
する。

【０２３３】 （Ａ．細胞傷害性のインビトロ特徴付け） ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン細胞を、１×１０⁵細胞／ウェルで９６ウェ ルプレートにプレーティングした。細胞を漸増量のドキソルビシン、ドキソルビ
シン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体、またはドキソ
ルビシン／ＧＡＣＶＦＳＩＡＨＥＣＧＡ（配列番号１９；コントロール）結合体
（０．１〜１０μｇ／ウェルのドキソルビシン等価物）で、３０分間または一晩
のいずれかでインキュベートした。インキュベーション後、薬剤をＰＢＳでの徹
底的な洗浄により除去し、次いで新鮮な培地を添加し、そしてインキュベーショ
ンを継続した。生存細胞数を２４時間でクリスタルバイオレット染色（Ｋｏｉｖ
ｕｎｅｎら、前出、１９９４を参照のこと）により決定した。

【０２３４】 遊離のドキソルビシン、ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ
；配列番号１）結合体、またはドキソルビシン／ＧＡＣＶＦＳＩＡＨＥＣＧＡ（
配列番号１９）に３０分間曝露した細胞において、細胞死は、ドキソルビシン／
ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体で処置した培養物にお
いてのみ存在していた。しかし、薬剤を３０分後に除去しなかった場合、細胞は
２４時間後にすべての処置により殺傷された。これらの結果は、増強された細胞
の取込が、ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）
結合体について起こっていたことを示す。

【０２３５】 （Ｂ．ドキソルビシン／腫瘍ホーミングペプチド結合体のインビボ特徴付け
） 雌性２月齢Ｂａｌｂ ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ
Ｄａｗｌｅｙ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）をこれらの研究に使用し、そして
Ｂｕｒｎｈａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物施設指針に従って飼育した。ＭＤＡ−
ＭＢ−４３５乳ガン細胞（Ｐｒｉｃｅら、前出、（１９９３））を、ヌードマウ
スの乳房脂肪パッド中に注射し、そして腫瘍増殖をモニターした（Ｐａｓｑｕａ
ｌｉｎｉら、前出、１９９７）。腫瘍を、以下に議論する毒性実験以外の処置実
験の開始前に約１ｃｍ³の大きさ（マウスの体重の約５％）にまで増殖させた。

【０２３６】 毎週、ドキソルビシン／ペプチド結合体またはコントロール処置（５μｇ／マ
ウス／週のドキソルビシン等価物）を静脈内投与した。いくつかの実験において
、示されるように、３０μｇ／マウスの用量を３週間ごとに投与した。ドキソル
ビシン単独での処置は、「ドキソルビシンコントロール」といい、そしてドキソ
ルビシンの非腫瘍ホーミングコントロールペプチドＧＡＣＶＦＳＩＡＨＥＣＧＡ
（配列番号１９）との結合体での処置は、「結合体コントロール」という。結合
体コントロール群と比較してドキソルビシンコントロール群において得られた結
果は、有意には異ならなかった。さらなるコントロールとして、いくつかの実験
において腫瘍ホーミングペプチドをドキソルビシンと連結することなく混合し、
そしてこの混合物を腫瘍保有マウスに投与した。このような処置は、上記のドキ
ソルビシンコントロールで得られた結果とは統計的に異ならない結果を生じた。

【０２３７】 マウスを、各処置の前にトリブロモエタノールに基づく麻酔混合物（ＡＶＥＲ
ＴＩＮ；ＰａｐａｉｏａｎｎｏｕおよびＦｏｘ、Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．４３：１８
９−１９２（１９９３））で麻酔にかけた。麻酔により、尾部静脈注射（最終容
量、２００μｌ）が容易になり、そして正確な連続的３次元の腫瘍サイズの測定
が可能になった。腫瘍容積の計算は、卵形の容積についての式：Ｖ＝４／３（Π
ａｂｃ）（ここでａ、ｂ、およびｃは、３次元の各々の測定径の１／２である）
に基づいていた。

【０２３８】 剖検において、ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番
号１）結合体で処置したＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍保有マウスは、ドキソルビシ
ンコントロール処置マウスより有意により小さい腫瘍（ｔ検定、ｐ＝０．０２）
、限局性リンパ節に対してより少ない広がりで（ｔ検定、ｐ＜０．０００１）、
より低い肺転移の発生率およびより少ない転移病巣（ｔ検定、ｐ＜０．０００１
）を有した。ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１
）結合体で処置したすべてのマウスは、ドキソルビシンコントロールマウスおよ
び結合体コントロールマウスが死んだ時期を超えて生存した（Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ
検定、ｐ＜０．０００１；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＝０．０００７）。本質的
に同一の結果が、５つの別々の実験で得られた。これらの結果は、ドキソルビシ
ン／腫瘍ホーミングペプチドが、原発腫瘍の増殖を低減することおよび腫瘍の転
移を予防することにおいてドキソルビシン単独を超える治療的利点を提供するこ
とを示す。

【０２３９】 肉眼試験および組織病理学的試験をマウスにおいて実施した。ドキソルビシン
／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）の５μｇのドキソルビシン
等価物で処置したマウスにおける多くの腫瘍は、顕著な皮膚の潰瘍化および腫瘍
壊死を呈したが、そのような徴候は、ドキソルビシンコントロール群でも結合体
コントロール群においても観察されなかった。組織病理学的分析は、ドキソルビ
シンコントロール群と比較して、ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤ
ＣＦＣ；配列番号１）結合体で処置した腫瘍における血管系の明白な破壊を示し
た。

【０２４０】 用量漸増実験において、腫瘍保有マウスをドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（Ｃ
ＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）で、３０μｇ／マウスで、三週間毎に３サイク
ル処置し、そして長期間さらなる処置なしに観察した。ドキソルビシン／ＲＧＤ
−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）で処置したマウスはすべて、ドキソ
ルビシンコントロールマウスおよび結合体コントロールマウスが死んだ６ヶ月後
を超えて生きたままであった。この結果は、ドキソルビシン／腫瘍ホーミングペ
プチド結合体での処置が、治療的効果を有し得ることを示す。

【０２４１】 急性毒性研究もまた実施した。これらの実験において、極度に大型の腫瘍（体
重の約２５％）を保有するマウスを、２００μｇ／マウスのドキソルビシンまた
はドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）結合体で
処置した。ドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）
結合体で処置したすべてのマウスは、１週間より長く生存したが、すべてのドキ
ソルビシンコントロールマウスは、処置の４８時間以内に死滅した。これらの結
果は、大型の腫瘍におけるドキソルビシン／ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ
；配列番号１）結合体の蓄積が、結合体化ドキソルビシンの循環レベルを低減さ
せ、従ってその毒性を低減させたことを示唆する。

【０２４２】 同様の結果が、ドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ（配列番号８）結合体を用いて得
られた。３連の実験の各々において、ドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ（配列番号８
）で処置したマウスにおける腫瘍は、ドキソルビシンコントロール群および結合
体コントロール群における腫瘍より有意に小さかった。ドキソルビシン／ＣＮＧ
ＲＣ（配列番号８）結合体での処置は、ほとんど完全に腫瘍の増殖を抑制したが
、遊離のドキソルビシンおよびコントロールペプチドと結合体化したドキソルビ
シンは、ビヒクル単独での処置と比較して本質的に腫瘍増殖において効果がなか
った。生存における顕著な効果もまた観察され、そしてドキソルビシン／ＣＮＧ
ＲＣ（配列番号８）で処置した動物のいくつかは、長期間生存した（Ｌｏｇ−Ｒ
ａｎｋ検定、ｐ＝０．００６４；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＝０．０３４３）。
さらに、ドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ（配列番号８）結合体は、遊離のドキソル
ビシンより毒性が少なかった。これらの結果は、化学療法剤および腫瘍ホーミン
グ分子を含む結合体がガンの処置における治療的利点を提供することを確証する
。

【０２４３】 （実施例ＩＸ） （ＮＧＲリガンドとＣＤ１３／ＡＰＮとの相互作用） この実施例は、ＮＧＲ含有ペプチドとＣＤ１３／ＡＰＮとの相互作用を記載す
る。

【０２４４】 アフィニティーパニングにおけるフィブロネクチンおよびＲＧＤ含有フィブロ
ネクチンフラグメントに結合する最少のレセプター配列を単離するためのファー
ジディスプレイペプチドライブラリーの使用は、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０：１１８９〜１１９６（１９９５）に記載され、こ
れは本明細書において参考として援用される。主なモチーフ、ＣＷＤＤ（Ｇ／Ｌ
）ＷＬＣを取得して、これがインテグリンのＲＧＤ結合部位の構造的模倣物であ
ることを示した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９５）。Ｗ（Ｄ／Ｎ）Ｄ
ＧＷＬ配列（ＲＧＤ結合ペプチド、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９５）
に対して相同な配列についての、タンパク質データベースの検索により、隣接す
るシステインを除き、同一のペプチド配列が、アミノペプチダーゼ中に見出され
た。Ｗ（Ｄ／Ｎ）ＤＧＷＬ配列は、細菌からヒトまでのアミノペプチダーゼにお
いて、高度に保存されていた。このことは、このモチーフが機能的に関連するド
メインを表すことを示している（Ｆａｖａｌｏｒｏら、前出（１９８８）；Ｒａ
ｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９０：２０５〜２１
８（１９９３）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。
ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮは、密接に関連したＷＮＤＧＷＬ配列を含有す
る（Ｌｏｏｋら、前出、（１９８９）；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５７
：２５９３〜２６００（１９９６）、これらの各々は、本明細書において参考と
して援用される）。

【０２４５】 （固定化ＣＤ１３／ＡＰＮに対するＣＮＧＲＣファージの結合） ＮＧＲ配列が逆方向のＲＧＤ配列と密接に類似すると仮定して、ＮＧＲ含有フ
ァージが、ＣＤ１３／アミノペプチダーゼ（ＣＤ１３／ＡＰＮ）に結合するのか
否か決定するために試験した。カポジ肉腫腫瘍細胞のオクチルグルコシド抽出物
を、ＣＤ１３／ＡＰＮ供給源として使用した。Ａｌａ−ｐＮＡまたはＬｅｕ−ｐ
ＮＡを基質として使用し、４０５ｎｍにおけるこのサンプルの吸光度をモニター
することにより、これらの抽出物において、アミノペプチダーゼ酵素活性を測定
した（Ｌｏｏｋら、前出（１９８９）；Ｔａｙｌｏｒ、前出（１９９３）；Ａｍ
ｏｓｃａｔｏら、前出（１９８９）、これらの各々は、本明細書において参考と
して援用される）。特異性を、ｏ−フェナントロリン（アミノペプチダーゼＮの
特異的インヒビター）による阻害を示すことにより、確認した。

【０２４６】 図４Ａは、カポジ肉腫細胞抽出物由来のアミノペプチダーゼ活性が、ＣＤ１３
抗体を用いてコートしたマイクロタイターウェルに特異的に結合するが、ＢＳＡ
でコートしたウェルには特異的に結合しないことを示す。ＣＤ１３抗体単独は、
アミノペプチダーゼ活性を有しない。さらに、アミノペプチダーゼＮインヒビタ
ーであるｏ−フェナントロリンは、抗体に捕獲された腫瘍抽出物由来の活性を阻
害した。

【０２４７】 図４Ｂにおいて、ＮＧＲ含有ファージを、ＣＤ１３に結合する能力についてア
ッセイした。カポジ肉腫腫瘍細胞のオクチルグルコシド抽出物由来のＣＤ１３は
、抗ＣＤ１３抗体ＷＭ１５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ
）を用いて予めコートしたマイクロタイターウェルに結合した（Ｆａｖａｌｏｒ
ｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｍａｔｏｌ．６９：１６３〜１７１（１９８８）、これ
を本明細書において参考として援用する）。種々のファージを、１ウェルあたり
２×１０⁹形質導入単位（ＴＵ）でウェルに添加した。結合したファージを、記 載されたように、細菌の感染によって定量した（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出（１
９９３）；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９５）。データは、３連のウェ
ルの平均値および標準誤差として表した。図４Ｂに示すように、３つの異なるフ
ァージ（各々は、異なる状況においてＮＧＲモチーフをディスプレイする）が、
固定化されたＣＤ１３に対して、強力かつ選択的に結合することを示した。２つ
のＲＧＤファージは、有意な結合を示さず（図４Ｂ）、そして種々の無関係のコ
ントロールファージもまた、結合しなかった。これらの結果は、ＣＤ１３が、Ｒ
ＧＤよりも良好に、ＮＧＲモチーフを認識することを示す。

【０２４８】 ＣＤ１３によるＮＧＲ結合の特異性を確認するために、ＮＧＲ可溶性ペプチド
が相互作用を阻害する能力を研究した。ＣＮＧＲＣ（配列番号８）、ＣＲＧＤＧ
ＷＣ（配列番号２２０）、またはＧＡＣＶＦＳＩＡＨＥＣＧＡ（配列番号１９）
（無関係のコントロール）のいずれかのペプチドを、２００μｇ／ウェルで、フ
ァージ結合アッセイに添加し、そして結合したファージを細菌の感染によって定
量した。示されたデータを、３連のウェルの平均値および標準誤差として示した
。

【０２４９】 図４Ｃに示すように、ＮＧＲ環状ペプチドは、ＮＧＲファージ結合をブロック
したが、ＲＧＤまたは無関係なペプチドはブロックしなかった。これらの結果は
、ペプチド配列ＮＧＲを発現するファージ、およびＮＧＲペプチドがＣＤ１３関
連分子に特異的結合することを実証する。

【０２５０】 （ＣＤ１３／ＡＰＮトランスフェクト細胞を用いるファージ結合アッセイ） ＣＮＧＲＣファージは、ＣＤ１３を用いてトランスフェクトされた細胞に特異
的に結合する。内在性ＣＤ１３を発現しない２つの細胞株である、Ｍｏｌｔ−４
ヒトＴ細胞白血病細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳ガン腫細胞株を使用して
、ＣＤ１３を用いてトランスフェクトされた細胞に対するＣＮＧＲＣ（配列番号
８）ファージの結合をアッセイした。手短には、モック（ｍｏｃｋ）トランスフ
ェクトしたＭｏｌｔ−４細胞（「Ｍｏｌｔ−４／ｍｏｃｋ」）およびＣＤ１３を
用いてトランスフェクトした細胞（「Ｍｏｌｔ−４／ＣＤ１３」）を、ＣＮＧＲ
Ｃ（配列番号８）ファージとともにか、または挿入を欠くコントロールＦｄファ
ージとをもに、インキュベートした（１サンプルあたり２×１０⁹形質導入単位 （ＴＵ））。合成ペプチドであるＣＮＧＲＣ（配列番号８）またはネガティブコ
ントロールであるＣＡＲＡＣ（配列番号２２１）を、２５０μｇ／ｍｌおよび５
００μｇ／ｍｌで、細胞とともにプレインキュベートした。広範な洗浄の後、結
合したファージを上記のように細菌の感染により定量した。図５に示すように、
ＣＮＧＲＣファージが、Ｍｏｌｔ−４／ＣＤ１３およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５／
ＣＤ１３トランスフェクト細胞に対して結合したが、空のコントロールベクター
を用いてトランスフェクトした親細胞株に対しては結合しないことが見出された
。さらに、この結合はＣＮＧＲＣ（配列番号８）ペプチドによってブロックされ
たが、コントロールペプチドによってはブロックされなかった。このことは、Ｃ
ＮＧＲＣ（配列番号８）の結合が特異的であることを実証した（図５）。これら
の結果は、ＣＤ１３遺伝子の移入が、細胞にＮＧＲファージに結合する能力を与
えることを示す。

【０２５１】 （実施例Ｘ：ＮＧＲレセプターのアフィニティー精製および高親和性リガン
ドのスクリーニング） この実施例は、ＮＧＲレセプターのアフィニティー精製およびＮＧＲレセプタ
ーの高親和性リガンドのスクリーニングを記載する。

【０２５２】 （ＣＤ１３／ＡＰＮ陽性細胞からの抽出物の、固定化ＣＮＧＲＣペプチド上
でのアフィニティークロマトグラフィーは、ＣＤ１３／ＡＰＮを生じる） ＣＤ１３／ＡＰＮのＮＧＲペプチドとの相互作用をさらに特徴づけするために
、ＣＮＧＲＣペプチド上でのアフィニティークロマトグラフィーを行った。ＣＮ
ＧＲＣペプチドをＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ ＮＪ）にカップリングすることにより、カラムを調製した。溶出を、可溶
性ＣＮＧＣＲペプチドを使用して行った。実験は、ＨＬ−６０細胞抽出物を使用
して行った。なぜなら、この細胞は、ＡＰＮアッセイを妨害し得るほかのプロテ
アーゼを発現せずに、ＣＤ１３／ＡＰＮを発現することが知られているからであ
る（Ｘｕら、前出、（１９９７））。従って、ＨＬ−６０細胞抽出物において、
すべての検出可能な細胞表面酵素活性は、抗ＣＤ１３ブロッキング抗体によって
阻害可能であり、このことは、特異性を確実にする。ＣＤ１３／ＡＰＮでトラン
スフェクトされたＭｏｌｔ−４およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の抽出物もまた
、ネガティブコントロールとして使用されるモックトランスフェクト対応物の抽
出物とともに、アフィニティークロマトグラフィーを使用することにより特徴づ
けした。

【０２５３】 手短には、抗ＣＤ１３モノクローナル抗体ＷＭ１５を用いて、ネガティブコン
トロールとして正常なマウスＩｇＧを使用して、ＥＬＩＳＡにおいてＣＤ１３免
役反応性の存在について、各画分のアリコートを試験することによって、ＣＤ１
３を検出した。この画分はまた、ＡｌａｐＮＡを基質として使用して、ＣＤ１３
酵素活性について分析した。全ての場合において、Ｍｏｌｔ−４／ＣＤ１３、Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４３５／ＣＤ１３またはＨＬ−６０細胞抽出物を使用して、ＣＮＧ
ＲＣペプチドを用いるＣＮＧＲＣカラムの溶出は、機能的なＣＤ１３／ＡＰＮを
含有する画分を生じた（図６）。ＣＤ１３免役反応性は、ＩｇＧを使用するコン
トロールサンプルにおいては、観察されなかった。そして、ＭＭＰ−特異的基質
を使用する場合、酵素活性は見出されなかった。さらに、コントロールペプチド
（ＣＡＲＡＣ；配列番号２２１）でのアフィニティークロマトグラフィーは、Ｃ
Ｄ１３／ＡＰＮを全く生じず、そしてＣＡＲＡＣペプチドは、ＣＮＧＲＣカラム
から全く活性を溶出しなかった。さらに、分画された抽出物がＣＤ１３ネガティ
ブ細胞由来である場合、ＣＤ１３活性が、ＣＮＧＲＣカラムから回収されなかっ
た（図６を参照のこと）。

【０２５４】 （アフィニティークロマトグラフィーによる内皮ＮＧＲレセプターの単離） 特定のインテグリンの単離のために開発されたものに基づくプロトコルを、ア
フィニティークロマトグラフィーを使用するＮＧＲレセプターを単離するために
使用する。オクチルグルコシドでの抽出によって調製された公知の血管形成刺激
因子であるＴＮＦαで処理した腫瘍抽出物および培養内皮細胞を、レセプター供
給源として使用する。レセプターの存在を、ファージ結合アッセイおよび上記の
イムノブロット分析を使用して確認する。この特異的なファージは、コントロー
ルファージよりも活性化内皮細胞に対してより大きい結合を示す。ファージでの
細胞結合アッセイを、前述したように実施する（Ｂｅｒｒｙら、前出（１９９６
）、これは本明細書中で参考として援用される）。

【０２５５】 この抽出物を、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥに結合されるペプチドのカラムに流し、そ
して結合された物質を、可溶性ペプチドで１ｍｇ／ｍｌで溶出する。上記の二次
ＮＧＲライブラリーのスクリーニングの間で単離される高親和性ペプチドを使用
する。ＮＧＲ含有ファージに結合しない細胞を、コントロール抽出物を作製する
ために使用し、そしてペプチドカラムからのコントロール溶出を、無関係の環状
ペプチドと共に実施する。この溶出物を、抗ＣＤ１３および抗ＮＧＲレセプター
ファージ抗体でプローブ化する。所望ならば、抗ＮＧＲレセプター抗体を、ペプ
チドアフィニティークロマトグラフィーと代替的に、または引き続いてアフィニ
ティークロマトグラフィーについて使用する。ＮＧＲペプチドアフィニティー単
離により得られるＮＧＲレセプター調製物は、ＮＧＲ反応性フラグメントを含み
、そしてＣＤ１３抗体と反応する。

【０２５６】 （ＮＧＲレセプターについての高親和性リガンドを同定するための二次ＮＧ
Ｒライブラリーのスクリーニング） ＮＧＲレセプターについてのさらなる高親和性リガンドを同定するために、二
次ＮＧＲライブラリーを構築する。３つのこのようなライブラリーであるＸ₂Ｃ ＮＧＲ ＣＸ₂（配列番号：２２２）、ＣＸ₂（Ｃ／Ｘ）ＮＧＲ （Ｃ／Ｘ）Ｘ₂Ｃ （配列番号：２２３）、およびＣＮＧＲＣＸ₆（配列番号：２２４）（ここで、 「Ｃ」は、システインであり、そして「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を調製し
た。これらの二次ライブラリーにおいて、多重折り畳み配置を可能にするＮＧＲ
配列が、異なる状況において表される。より高い親和性が環状ペプチドで達成さ
れ得ることから、このライブラリーは、異なる環状の立体配置のＮＧＲトリペプ
チドを特徴とする。この二次ライブラリーを、リガンドについてのベストフィッ
トの配列／コンホメーションを選択するために、標的レセプターに対してスクリ
ーニングする。これは、多くの系において経験的に実証されてきている（Ｓｐａ
ｒｋｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５５：４９８−５０９（１９９
５）；Ｍａｒｔｅｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１１２９−２１
１３６（１９９５）；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−
４６４（１９９６）、これらはそれぞれ本明細書において参考として援用される
）。

【０２５７】 二次ＮＧＲファージペプチドライブラリーを以下のように構築する。ファージ
提示ライブラリーを、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：
１３１５−１３１７（１９８５）；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８−２５７（１９９３）；ならびにＫｏｉｖｕ
ｎｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４５：３４６−３４９（１９
９４）（これらはそれぞれ参考として援用される）に記載されるように作製する
。簡潔に述べると、ＦＵＳＥ５プラスミドをＱｉａｇｅｎのＭａｘｉ−ｐｒｅｐ
５００カラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を使用してトラ
ンスフェクトされたＭＣ１０６１細胞から単離する。このプラスミドを、Ｓｆｉ
Ｉ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ
）を使用して、１４ｂｐの「スタッファー」を取り出すように切断し、そしてＱ
ＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。ファ
ージにより提示されるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを商業的に購入
し、そしてライブラリープライマー（５’−ＴＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣ
ＣＣ−３’；配列番号：２０２）を利用して二本鎖ＤＮＡに転換する。２μｇの
オリゴヌクレオチドおよび４μｇのプライマーを１０μｌの容量で、６５℃、２
分間でアニ−ルさせ、そして室温まで冷却する。プライマー伸長を、ＳＥＱＵＥ
ＮＡＳＥ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ）で、６０分間、３７℃で、１０ｍＭ、および５ｍＭ ジチオ
トレイトールを含む５０μｌの反応容量で実施し、そして二本鎖オリゴヌクレオ
チドをＱＩＡｑｕｉｃｋヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精
製する。このオリゴヌクレオチドを引き続いてＢｇｌＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で一晩、３７℃で消化
し、上記のように精製し、そしてＦＵＳＥ５ベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇ
ｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）を使用して連結する。次
いで、このプラスミドをＣｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ装置（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）
を利用してＭＣ１０６１細菌にトランスフェクトする。約２５μｌの細菌および
約１００ｎｇのプラスミドに２．５ｋＶの刺激を加え、そしてすぐにＳ．Ｏ．Ｃ
．培地に移し変える。全部で１００〜２００のエレクトロポレーションを、約１
０⁹のクローンを達成するために実施する。ＣＸ₂ＣＮＧＲＣＸ₂（配列番号：２ ２２）二次ライブラリーの調製のために、プライマー５’−ＣＡＣＴＣＧＧＣＣ
ＧＡＣＧＧＧＧＣＴＴＧＴＮＮＫＮＮＫＴＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＮＮＫ
ＮＮＫＧＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号：２０２）を使
用する（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＫはＴまたはＣである
）。ＣＸ₂（Ｃ／Ｘ）ＮＧＲ （Ｃ／Ｘ）Ｘ₂Ｃ（配列番号：２２３）二次ライブ
ラリーの調製については、プライマー、５’−ＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧ
ＧＣＴＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＡＴＧＧＧＡＧＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＧ
ＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号：２０３）を使用する。ＣＮ ＧＲ ＣＸ₆（配列番号：２２４）二次ライブラリーの調製については、プライマ ー５’−ＣＡＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＡＧＡＴＧ
ＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡ
Ａ−３’（配列番号：２０４）を使用する。二次ＮＧＲファージライブラリーを
、上記のように、固定化されたＣＤ１３結合する能力についてまたはＣＤ１３ト
ランスフェクト細胞に対してスクリーニングし、そして結合リガンドを同定する
。この二次ＮＧＲライブラリーをまた、腫瘍または他の血管形成血管系へのホー
ミングについてスクリーニングし得る。

【０２５８】 （ヒト腫瘍異種移殖片で免疫したウサギ由来のコンビナトリアルｓｃＦｖラ
イブラリーのスクリーニング） ＮＧＲレセプターについてのさらなる高親和性リガンドを同定するために、コ
ンビナトリアルｓｃＦｖライブラリーをヒト腫瘍異種移殖片で免疫したウサギか
ら調製する。この腫瘍異種移殖片をＰａｓｑｕａｌｉｎｉら、前出、１９９７、
およびＡｒａｐ、前出、１９９８に記載されるように樹立する。この腫瘍を免疫
のためにＰＢＳ中でホモジェナイズし、そしてウサギに２週間ごとに皮下注入す
る。少なくとも４回の注射を与え；ウサギの免疫応答を、２回目および３回目の
免疫後に腫瘍組織片の免疫染色により評価する。免疫したウサギの血清由来の抗
体を固定化ＣＤ１３、およびポジティブコントロールとしてのヒトインテグリン
α_Vβ₃およびα_Vβ₅への結合について試験する。免疫したウサギ由来の脾臓およ
び骨髄を採取し、そして同じように処置したウサギ由来の組織をプールし、そし
てＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｃｉｎｃ
ｉｎｎａｔｉ ＯＨ）を使用する全ＲＮＡ調製のために使用する。全ＲＮＡの逆
転写を、ＲＴ ＰＣＲについての１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＡＭＶ；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で実施す
る。以下に列挙するＰＣＲプライマーを使用して、Ｖ_k（９つのプライマーの組 み合わせ）、Ｖ₁（１つのプライマーの組み合わせ）およびＶ_g（４つのプライマ
ーの組み合わせ）コード配列を第１鎖のｃＤＮＡから増幅する。先行研究におい
ては、全ての組み合わせが３５０ｂｐの範囲のＰＣＲ産物を生じた。以下に列挙
する重複伸長型ＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖコード配列を、ｓｃＦｖ
コード配列をファージミドベクターｐＣｏｍｂ３ＨにＳｆｉＩクローニングした
後、Ｖ_kおよびＶ₁をそれぞれＶｇと融合させることによりアセンブルする。固定
化したＣＤ１３に対する得られたｓｃＦｖライブラリーの選択を実施する。

【０２５９】 以下のプライマーをＶ_k増幅のために使用する（Ｆ＝正方向プライマー、Ｂ＝ 逆方向プライマー；５’から３’への方向における配列；Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／
Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｈ＝
Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）：

【０２６０】

【化１】 以下のプライマーをＶ₁増幅のために使用する：

【０２６１】

【化２】 以下のプライマーをＶ_g増幅のために使用する：

【０２６２】

【化３】 以下のプライマーをｓｃＦｖ融合物を調製するために使用する：

【０２６３】

【化４】 （実施例ＸＩ：ＣＤ１３／ＡＰＮ陽性細胞に投与されるドキソルビシン−Ｃ
ＮＧＲＣ結合体の選択的細胞障害性） インビトロのバイオアッセイを、細胞へのＣＮＧＲＣ−ドキソルビシン（ＣＮ
ＧＲＣ−ｄｏｘ）（ＣＮＧＲＣ；配列番号：８）結合体のレセプター結合を測定
するために開発した。ＴＮＦαで活性化させた内皮細胞を使用した。あるいは、
この試験細胞をＣＤ１３／ＡＰＮでトランスフェクトした。このアッセイは、簡
単なインキュベーション期間の後に、細胞に結合しなかった薬物を洗浄により除
去し得るという事実に基づく。洗浄後のドキシルビジン単独またはコントロール
ペプチドと共役したドキソルビシンと比較したドキシルビジン結合体の細胞障害
性効果には、定量的な差異が存在する。なぜならこの薬物は、結合したペプチド
のレセプターが存在する場合は、細胞に結合したままであるからである。

【０２６４】 この系を、活性化内皮細胞と一緒に使用した。なぜならＣＤ１３の発現は、ヒ
ト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のような内皮細胞を刺激する場合に、アップ
レギュレートすることが示されているからである（図７を参照のこと）。ＣＤ１
３は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＮＦα、公知の内皮細胞アクチベーターサイ
トカインのような増殖因子での内皮細胞の刺激に際して誘導されることが観察さ
れた。

【０２６５】 簡潔に述べると、血管形成因子によるＣＤ１３のアップレギュレーションを研
究するために、内皮細胞を図７に示されるように異なる条件で培養し、そしてこ
の細胞の表面を抗ＣＤ１３モノクローナル抗体であるＷＭ１５でＣＤ１３につい
て染色した。ＣＤ１３発現の割合を、１０％ ＦＣＳを加えた通常の組織培養培
地中での細胞増殖において検出したレベルに基づいて計算した。

【０２６６】 ドキソルビシンおよび標的化ドキソルビシンのインビトロ細胞障害性を、活性
化ＨＵＶＥＣ（図８Ａ）またはＣＤ１３トランスフェクト４３５乳癌細胞（図８
Ｂ）を使用して評価した。これらの細胞株はドキソルビシンに対して感受性であ
る。細胞の単層を、ドキソルビシンまたはＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；
配列番号：１）、ＣＮＧＲＣ（配列番号：８）またはＣＡＲＡＣ（配列番号：２
２１）のドキソルビシン−ペプチド結合体と、１μｇ／ウェルの濃度で３連、２
セットで２０分間インキュベートした。３連の１セットを、薬物を添加して２０
分後にＤＭＥＭで３回洗浄し、結合していない薬物を除去した（右側）。未処理
の単層をコントロールとして使用した。２４時間後、付着した細胞を固定し、そ
してクリスタルバイオレットにより定量した。

【０２６７】 このＣＮＧＲＣ−ドキソルビシン結合体は、コントロール細胞よりもＣＤ１３
発現細胞でより効果があった（図８を参照のこと）。これらの結果は、ＣＮＧＲ
Ｃ−ドキソルビシンがＣＤ１３依存性細胞障害性活性をインビトロで有すること
、およびＣＮＧＲＣ（配列番号：８）ペプチドがＣＤ１３陽性細胞にドキソルビ
シンのような毒性部分を誘導し得ることを実証する。

【０２６８】 （実施例ＸＩＩ：マウスおよびヒトの血管形成血管系におけるＣＤ１３発現） これらの実験は、ＣＤ１３が、血管形成血管系において発現されるが通常の血
管系では検出されないことを実証する。

【０２６９】 上記のように、静脈内に注入したＮＧＲを含むファージは、腫瘍血管系にホー
ミングするが、他の組織における通常の血管にはホーミングしない。異なる技術
を使用して組織へのＣＮＧＲＣ（配列番号：８）ファージの結合を決定するため
に、そしてヒト組織を分析するために、組織切片におけるＣＮＧＲＣ（配列番号
：８）ファージおよびＦｄコントロールファージの免疫組織化学的染色を実施し
た。ペプチドＣＮＧＲＣ（配列番号：８）を提示するファージまたはインサート
がないコントロールファージをヒト乳癌および正常な乳組織と一緒にインキュベ
ートした。Ｍ１３ファージ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対する抗体を染色のために
使用した。この結果は、ＣＮＧＲＣファージが組織切片においてヒト腫瘍管に結
合するが、正常な管には結合しないことを示した。ネガティブコントロールとし
て使用した、インサートがないファージ（ｆｄファージ）は、正常な組織切片ま
たは腫瘍組織切片には結合しなかった。

【０２７０】 表４に示されるように、ＣＤ１３は、多くの数の腫瘍細胞およびＨＵＶＥＣで
発現された。しかし、ＣＤ１３は、正常な器官の血管系では検出されなかった（
表５）。従って、マウスおよびヒト組織における血管系でのＣＤ１３発現の分析
に基づいて、ＣＤ１３は、血管形成管では発現されるが、正常な管では検出され
得なかった。

【０２７１】

【表４】 免疫染色をＣＤ１３、ＷＭ１５および１Ｈ４に対する２つのモノクローナル抗体
を使用して実施した。

【０２７２】

【表５】 ＊試験したヒト腫瘍：乳、結腸、胃、および食道癌。抗マウス、抗ＣＤ１３抗体
（Ｒ３−６３および２Ｍ７）での正常マウス組織および腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ−４
３５およびカポージ肉腫）の分析は、同様の結果を示した。

【０２７３】 共焦点顕微鏡検査を腫瘍血管系におけるＣＤ１３の細胞局在性を研究するため
に実施した。共焦点顕微鏡を腫瘍管におけるＣＤ１３の免疫蛍光染色を検出する
ために使用した。この画像を、組織形態を明らかにするために免疫蛍光および微
分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像を重ね合わせることにより、または直接免疫
蛍光により入手した。ヒト乳癌組織切片を抗ＣＤ１３抗体（ＷＭ１５）またはコ
ントロールＩｇＧと一緒にインキュベートした。マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ
−結合体化二次抗体を使用して抗ＣＤ１３局在を明らかにした。ネガティブコン
トロールは一次抗体を省いた。ヒト乳癌の連続切片、胃腺癌および結腸癌の組織
切片を抗ＣＤ１３抗体で染色した。公知の周皮細胞マーカーであるＡＰＡに対す
る抗体を、局在化の目的のために使用した。

【０２７４】 固定した赤血球（ＲＢＣ）の自己蛍光は可視であった。抗ＣＤ１３モノクロー
ナル抗体とインキュベートした組織切片において、小腫瘍管における内皮細胞の
みが特異的な免疫反応性を示した。ＣＤ１３発現は、乳癌、結腸直腸癌および胃
癌を含む複数の腫瘍型における内皮細胞および周皮細胞に制限された。同様の染
色パターンがＮＧＲファージで得られた。それぞれの場合において、反応性は、
腫瘍の血管系で検出され得たが、正常組織の血管系では検出され得なかった（表
５を参照のこと）。予測されるように、ＡＰＡは、内皮細胞では検出されなかっ
たが、腫瘍血管において位置する周皮細胞において存在した。これらの結果は、
ＣＤ１３が血管形成血管系において発現されるが、正常な血管系では検出されな
いことを実証する。

【０２７５】 （実施例ＸＩＩＩ：ＮＧＲファージは、網膜新生血管系よりも腫瘍血管系に
対して優先的にホーミングする） これらの結果は、ＮＧＲファージが、網膜血管系と比較して腫瘍血管系に優先
的にホーミングすることを実証する。

【０２７６】 新脈管形成の１つの実験的なモデルである酸素誘導性新脈管形成を使用して、
新脈管形成におけるＣＤ１３の役割を評価した（Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９０５−９０９（１９９５
）；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ．Ｓｃｉ
．３５：１０１−１１１（１９９４）、これらのそれぞれは、本明細書において
参考として援用される）。ＮＧＲファージは、酸素により誘導される血管形成網
膜新血管系に結合し、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファー
ジから得た結果と同様の結果を与えた。ＣＮＧＲＣ、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧ
ＤＣＦＣ；配列番号１）およびインサートを欠くコントロールのｆｄのファージ
を乳癌異種移殖片、正常網膜または血管形成網膜から回収した。簡単に述べると
、１０⁶形質導入単位（ＴＵ）のファージを、サイズが適応するＭＤＡ−ＭＢ− ４３５由来の腫瘍（約１０００ｍｍ³）を有するマウスの尾部静脈、または酸素 に曝露されたｐ１７マウスの尾部静脈に注入した（Ｐｉｅｒｃｅら、前出、１９
９５；Ｓｍｉｔｈら、前出、１９９４）。同じ数の形質導入単位のアンピシリン
コントロールファージを、異なるテトラサイクリンファージの特異性を評価する
ために同時注入した。それぞれの場合において、ファージを灌流後に回収した。
比率を、アンピシリン選択プレートおよびテトラサイクリン選択プレート上に３
連でプレーティングした後に組織から回収したファージの数の平均値を使用して
計算した。

【０２７７】 酸素に曝露しなかったマウスは、網膜の血管形成管を発達せず（コントロール
）、そしてこのマウスにも正常網膜へのファージ分圧ホーミングを評価するため
に注入した。１週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを７５％の酸素で５日間にわたっ
て曝露し、次いで室内の空気中にさらに５日間飼育した（図９Ａ）。増殖性血管
新生応答を、６μｍの横断面における網膜から硝子体中にまで伸長する新たな管
の核を計数することにより定量した。このモデルを、静脈内注入されたファージ
の新しく形成された血管形成管への結合を評価するために使用した。この系にお
いてホーミングするファージを試験するために、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣ
ＦＣ；配列番号１）ペプチド（これはα_Vインテグリンに選択的に結合する）を 提示するファージまたはＣＮＧＲＣ−ファージを、免疫組織化学的分析に先立っ
て静脈内に注入した。このα_Vインテグリンは、これらの管においてアップレギ ュレートされることが示されてきた。ファージ染色は、新生血管形成においてＲ
ＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）およびＣＮＧＲＣファージで見
られた。一方、正常な管はネガティブであった。

【０２７８】 網膜または腫瘍の血管形成血管系におけるＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ
；配列番号１）およびＣＮＧＲＣファージホーミングの平行比較は、この２つの
ファージが反対方向のホーミングの優先性を有することを示した：ＲＧＤ−４Ｃ
（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）ファージは、網膜からＣＮＧＲＣファージ
よりも多く回収され、一方ＣＮＧＲＣファージは、腫瘍からより多く回収された
（図９Ｂ）。それぞれのファージのホーミングはまた、適切な同族ペプチドによ
り阻害され、そしてこの阻害は、コントロールファージでは観察されなかった（
図９Ｂ）。これらの結果は、ＮＧＲレセプターの発現が、他の新脈管形成の型よ
りも腫瘍の新脈管形成の間で高いものであり得ることを示す。

【０２７９】 （実施例ＸＩＶ：新脈管形成におけるＣＤ１３の役割） これらの実験は、新脈管形成においてＣＤ１３が機能的に重要であることを実
証する。

【０２８０】 サイトカイン誘導性新脈管形成（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ ７９：１１５７
−１１６４（１９９４））および腫瘍誘導性新脈管形成（Ｆｏｒｋｍａｎ、前出
（１９９５）；Ａｒａｐら、（前出）、これらはそれぞれ本明細書において参
考として援用される）に関連するいくかの実験モデルを、新脈管形成におけるＣ
Ｄ１３の役割を評価するために使用した。

【０２８１】 新脈管形成におけるＣＤ１３についての機能的な役割をＣＤ１３のアンタゴニ
ストを使用することにより実証した。具体的には、ＣＤ１３のインヒビターであ
るベスタチン、およびＣＤ１３の酵素活性をブロックするモノクローナル抗体を
、いくつかの新脈管形成アッセイにおいて試験した。これらのアッセイは、ＣＡ
Ｍにおけるサイトカイン誘導性新脈管形成、酸素誘導性網膜新生血管形成、およ
び腫瘍誘導性新脈管形成を含んだ。

【０２８２】 網膜における酸素誘導性新脈管形成は、ＣＤ１３のアンタゴニストで動物を処
置することにより阻害された。簡単に述べると、酸素誘導性網膜新生血管形成の
阻害を、ＣＤ１３アンタゴニストの注入において決定した。１週齢のＣ５７ＢＬ
／６Ｊマウスを７５％の酸素雰囲気に５日間にわたって曝露し、次いで室内の大
気中で１週間にわたって飼育した。ＰＢＳまたはラットＩｇＧで処置したコント
ロールマウスにおいて、増殖性新生血管応答が生じ、そしてこれを上記のように
定量した。抗マウスＣＤ１３阻害抗体であるＲ３−６３および２Ｍ７（２５０μ
ｇ／マウス／日）またはベスタチン（２００μｇ／マウス／日）を腹腔内に注入
し、そして阻害効果を決定した。ＣＤ１３アンタゴニスト抗体およびベスタチン
で処置した動物は、コントロール（ＩｇＧおよびビヒクル）で処置したマウスで
観察された血管形成応答の２０〜３０％のみを示した。

【０２８３】 ＣＤ１３アンタゴニストはまた、ＣＡＭにおけるｂＦＧＦ誘導性新脈管形成を
抑制した。簡単に述べると、新脈管形成を１０日齢のニワトリ胚由来のＣＡＭに
おいて、以前に無血管性であった領域上に移殖したｂＦＧＦフィルターにより誘
導した。様々な処置を局所的に適用し、そして３日後に、このフィルターおよび
周辺のＣＡＭを切除し、そしてホルマリン中に固定した。

【０２８４】 図１０Ａは、二重盲検様式で二人の観察者によって実体顕微鏡下で観察された
、ＣＡＭの焦点面内の板に侵入する血管の数を示す。各々の棒は、各々の群にお
ける８つのＣＡＭからの血管の数の平均値および標準誤差を表す。ＣＤ１３酵素
活性のインヒビターで処理した板に侵入する血管は有意により少なかった（ｐ< ０．０５）。これらの結果はまた、抗血管形成処理において使用された阻害性抗
体が、ニワトリＣＤ１３を認識すること、およびＣＤ１３がＣＡＭ血管形成血管
系において発現されることを実証する。

【０２８５】 抗マウスＣＤ１３アゴニストの効果をまた、腫瘍保有マウスにおいて研究した
。サイズ適応化４３５乳癌腫瘍を保有するマウスを３つの群（１群あたり５匹の
マウス）に分けた。抗マウスＣＤ１３阻害性抗体であるＲ３−６３および２Ｍ７
（５００μｇ／マウス／日）またはベスタチン（２００μｇ／マウス／日）を腹
腔内注入した。コントロール群においては、マウスをＰＢＳまたはラットＩｇＧ
で処置した。図１０Ｂで示されるように、腫瘍の増殖は、コントロールであるラ
ットＩｇＧまたはビヒクルのみの注入を受けたマウスにおいて見られた腫瘍増殖
との比較では遅延した。ベスタチン処置は、抗ＣＤ１３抗体で観察された処置と
類似の結果を生じた（ｐ<０．０５）。

【０２８６】 これらの結果は、ＣＤ１３がＮＧＲリガンドについての特定のレセプターとし
て働く、腫瘍血管系の新規のマーカーであり、そして新脈管形成においては機能
的な役割を果たすことを示す。

【０２８７】 （実施例ＸＶ：ドキソルビシン／腫瘍ホーミングＮＧＲペプチド結合体を使
用する腫瘍治療） この実施例は、ドキソルビシンに結合したＮＧＲペプチドでのインビボ腫瘍治
療を記載する。

【０２８８】 ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）およびＣＮＧＲＣで作られ
た薬物結合体は、より効果的であり、そして遊離薬物よりも毒性が低いことが見
出された（Ａｒａｐら、前出 （１９９８）、これは本明細書において参考とし
て援用される）。同様の結果が、複数の腫瘍型を有するマウスを薬物結合体で処
置したときに観察された。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−由来乳癌および
ホジキンリンパ腫を保有するマウスを、以下のようにドキソルビシン−ＣＮＧＲ
Ｃペプチド結合体で処置した。

【０２８９】 簡単に述べると、サイズ適応化腫瘍（約１０００ｍｍ³）を有するマウスを、 以下のように４つの処置群に無作為化した（一群あたり６匹の動物）：ビヒクル
のみ、遊離ドキソルビシン、ドキソルビシン−コントロールペプチド、およびド
キソルビシン−ＣＮＧＲＣ（配列番号：８）。マウスを５μｇ／マウス／週のド
キソルビシン等価物で処置し、そして１日目および２８日目の間の腫瘍体積の差
異を決定した（図１１Ａ）。図１１Ｂは、図１１Ａにおけるマウスのカプラン−
メイアー（Ｍｅｉｅｒ）生存曲線を示す。

【０２９０】 ＣＮＧＲＣ結合体の毒性を試験するために、大きな（約５０００ｍｍ³）ＭＤ Ａ−ＭＢ−４３５乳癌を保有するマウス（１群あたり４匹の動物）を無作為化し
、ドキソルビシン等価物の２００μｇ／マウスで、単用量の遊離のドキソルビシ
ンまたはドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ結合体を受容させた。データを図１１Ｃに
おいてカプラン−メイアー（Ｍｅｉｅｒ）生存曲線として示す。

【０２９１】 大きな（約５０００ｍｍ³）のホジキンリンパ腫を保有するマウス（１群あた り８匹の動物）を無作為化して、２用量の遊離ドキソルビシン＋未結合ＣＮＧＲ
Ｃペプチドまたはドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（配列番号：８）結合体を、４０
μｇ／マウスのドキソルビシン等価物を受容させた。データを図１１Ｄにおける
カプラン−メイアー（Ｍｅｉｅｒ）生存曲線として示す。

【０２９２】 この実験は、乳癌（図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃ）（Ａｒａｐら、前出、１
９９８）およびホジキンリンパ腫（図１１Ｄ）を保有するマウスにおけるドキソ
ルビシン−ＣＮＧＲＣ結合体の効果を示す。ドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（配列
番号：８）で処置した腫瘍保有マウスは、未結合ペプチドのドキソルビシン混合
物またはドキソルビシン単独で処置したマウスよりもより長く生存した（図１１
Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄ）（Ａｒａｐら、前出、１９９８）。治癒もまた観察さ
れ、これはコントロール処置動物では見られなかった。類似の結果が、ドキソル
ビシン−ＣＮＧＲＣ（配列番号：８）結合体を黒色腫およびカポージ肉腫の異種
移殖片において試験したときに得られた。さらに、ＣＮＧＲＣファージのターゲ
ッティングおよびドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（配列番号：８）結合体のインビ
ボでの抗腫瘍効果は、腫瘍細胞が、ホジキンリンパ腫、Ｃ８１６１黒色腫および
カポージ肉腫のような場合においてＣＤ１３／ＮＧＲレセプターを発現するか、
あるいはＭＤＡ−ＭＤ−４３５乳癌においてと同様にＣＤ１３を発現しないかに
関わらず、等価に有効であった。

【０２９３】 これらの結果は、化学療法薬を、ＮＧＲレセプターにホーミングするＮＧＲ腫
瘍ホーミングペプチドを使用して、全ての固形腫瘍における一般的な特性である
血管形成血管系に対して標的化させることが可能であることを実証する。

【０２９４】 本発明を開示された実施例を参照して記載してきたが、様々な改変が本発明の
精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本
発明は以下の請求の範囲によってのみ制限される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 合成ペプチドによるインビボファージホーミングの阻害を示す図である。乳癌
腫異種移植からのファージディスプレイイング腫瘍ホーミングペプチドの回復を
、ファージの注入または種々のペプチドとファージの同時注入後測定した。（Ａ
）左のパネル：ＮＧＲ腫瘍ホーミングペプチド、腫瘍からの（黒色の棒）、およ
び脳からの（斜線の棒）ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３；「ＮＧＲフ
ァージ」）の回復、および可溶性ペプチドＣＮＧＲＣ（配列番号８）による腫瘍
ホーミングの阻害。中央パネル：ＣＧＳＬＶＲＣ−ファージの回復および可溶性
ペプチドＣＧＳＬＶＲＣによる腫瘍ホーミングの阻害。右のパネル：ＲＧＤ−４
Ｃファージ（ポジティブコントロール；ＲＧＤ−４Ｃファージ中のペプチド挿入
物は、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ；配列番号１）および非選択ファージライブラリーミ
ックス（ネガティブコントロール）の回復。（Ｂ）左のパネル：増加する量のＲ
ＧＤ−４Ｃ可溶性ペプチドを、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ−ファージとともに
注入した。右のパネル：増加する量のＣＮＧＲＣ可溶性ペプチドを、ＲＧＤ−４
Ｃファージとともに注入した。

【図２】 ポジティブコントロール（ＲＧＤ−４Ｃ）およびネガティブコントロール（ｆ
ｄ−ｔｅｔ）ファージに対するＮＧＲファージによる腫瘍ホーミングの特異性を
示す。

【図３】 Ａ〜Ｖは、ヒト乳癌腫またはヒトカポシ肉腫をもつヌードマウス中への静脈内
注入後、腫瘍および正常組織におけるＮＧＲファージの免疫組織化学的染色を示
す。サンプルは、ファージの投与後、４分（図中、３Ｅ、３Ｇ、３Ｈおよび３Ｊ
）または２４時間（図中３Ａ〜３Ｄ、３Ｆ、３Ｉ、および３Ｋ〜３Ｖ）。図中３
Ａ、３Ｃ、３Ｇおよび３Ｊは、挿入物のないファージ（コントロールファージ）
を受けたマウスからであり、そして図中３Ｂ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｈ、３Ｉお
よび３Ｋ〜３Ｖは、ＮＧＲファージを受けたマウスからである。図中３Ａ、３Ｂ
、３Ｅ、３Ｆおよび３Ｇは乳腫瘍サンプル；図中３Ｃ、３Ｄ、３Ｈ、３Ｉおよび
３Ｊはカポシ肉腫サンプル；図中３Ｋは脳；図中３Ｌは、リンパ節；図中３Ｍは
腎臓；図中３Ｎは膵臓；図中３Ｏは子宮；図中３Ｐは乳房脂肪パッド；図中３Ｑ
は肺；図中３Ｒは腸；図中３Ｓは皮膚；図中３Ｔは骨格筋；図中３Ｕは心臓およ
び図中３Ｖは尿管上皮である。倍率：図３Ａ〜３Ｄ、４０倍；図３Ｅ〜３Ｖ、２
００倍。

【図４】 ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）およびＣＤ１３／ＡＰＮへのＣＮ
ＧＲＣ−ファージ結合の単離を示す。（Ａ）ＣＤ１３基質Ａｌａ−ｐＮＡまたは
Ｌｅｕ−ｐＮＡを用いることにより検出された免疫単離ＣＤ１３中のアミノペプ
チダーゼ酵素活性。（Ｂ）カポシ肉腫腫瘍細胞オクチルグルコシド抽出物から免
疫単離されたＣＤ１３へのファージ結合。示されたペプチドを保持するファージ
を、マイクロタイターウェル上にコートされた抗−ＣＤ１３抗体ＷＭ１５を用い
て固定化されたＣＤ１３への結合について試験した。（Ｃ）ＮＧＲ−含有環状ペ
プチド（ＣＮＧＲＣ；配列番号８）によるＣＤ１３へのＮＧＲ−ファージ結合の
阻害。ＲＧＤ含有環状ペプチドによらす、または非関連ペプチドにより阻害され
なかった。

【図５】 ＮＧＲ含有ペプチドを発現するファージの、ＣＤ１３でトランスフェクトした
細胞への結合を示す。コントロールＭｏｌｔ−４細胞およびＣＤ１３でトランス
フェクトしたＭｏｌｔ−４細胞へのＣＮＧＲＣ−ファージの結合、ならびにＣＮ
ＧＲＣ環状ペプチドによる結合の阻害。

【図６】 ＮＧＲペプチドカラムおよびＣＮＧＲＣペプチドを用いた溶出を用いるＨＬ−
６０細胞抽出物からのＣＤ１３のアフィニティ精製を示す。ＣＤ１３は、ＷＭ１
５モノクローナル抗体を用いることによりフラクション中で検出し、そして正常
マウスＩｇＧをネガティブコントロールとして用いた。各画分のサンプルを、Ａ
ｌａ−ＰＮＡを用いることによりアミノペプチダーゼ酵素活性について、および
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ＭＭＰ基質を用いることにより活性
について分析した。

【図７】 血管形成因子による培養細胞中のＣＤ１３のアップレギュレーションを示す。
ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における血管形成因子によるＣＤ１３のアップ
レギュレーション。

【図８】 インビトロのドキソルビシン／ＣＮＧＲＣ（ＣＮＧＲＣ−ｄｏｘ）のＣＤ１３
依存性細胞傷害性活性を示す。（Ａ）活性化ＨＵＶＥＣにおけるインビトロのＣ
ＮＧＲＣ−ドキソルビシンのＣＤ１３−依存性細胞傷害性活性。（Ｂ）ＣＤ１３
トランスフェクトＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌腫細胞におけるインビトロのＣＮＧ
ＲＣ−ドキソルビシンのＣＤ−１３依存性活性。

【図９】 乳癌腫異種移植片、正常網膜および血管形成網膜からのＣＮＧＲＣファージ、
ＲＧＤ−４Ｃファージ、およびコントロールファージ（挿入のないｆｄ）の回収
を示す。（Ａ）実験デザインを示す。（Ｂ）アンピシリン耐性ファージに対する
回収されたテトラサイクリン耐性ファージの比が示される。

【図１０】 ニワトリ漿尿膜中のｂＦＧＦ誘導血管形成の抑制およびＣＤ１３アンタゴニス
トによる腫瘍増殖の阻害を示す。（Ａ）ＣＤ１３アンタゴニスト、抗−ＣＤ１３
抗体、ベスタチンおよびアクチノニンは、ｂＦＧＦ誘導血管形成を抑制する。（
Ｂ）ＣＤ１３アンタゴニスト抗体の注入に際する４３５乳癌腫腫瘍の増殖の阻害
。

【図１１Ａ】 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−由来乳癌腫およびホジキンリンパ腫を保持するマウス
のドキソルビシン−ＣＮＧＲＣペプチド結合体を用いた処置を示す。サイズがマ
ッチした腫瘍（約１０００ｍｍ³）をもつマウスを、４つの処置グループにラン ダムに分けた（１グループあたり６匹の動物）：ビヒクルのみ、遊離のドキソル
ビシン（ｄｏｘ）、ドキソルビシン−コントロールペプチド（ｄｏｘ−ｃｔｒｌ ｐｅｐ）、およびドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（ｄｏｘ−ＣＮＧＲＣ）。（Ａ
）マウスを、ドキソルビシン−当量の５μｇ／マウス／週で処理した。１日と２
８日との間の腫瘍容積における差異を示す。

【図１１Ｂ】 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−由来乳癌腫およびホジキンリンパ腫を保持するマウス
のドキソルビシン−ＣＮＧＲＣペプチド結合体を用いた処置を示す。サイズがマ
ッチした腫瘍（約１０００ｍｍ³）をもつマウスを、４つの処置グループにラン ダムに分けた（１グループあたり６匹の動物）：ビヒクルのみ、遊離のドキソル
ビシン（ｄｏｘ）、ドキソルビシン−コントロールペプチド（ｄｏｘ−ｃｔｒｌ
ｐｅｐ）、およびドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（ｄｏｘ−ＣＮＧＲＣ）。（Ｂ
）パネルＡにおけるマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。

【図１１Ｃ】 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−由来乳癌腫およびホジキンリンパ腫を保持するマウス
のドキソルビシン−ＣＮＧＲＣペプチド結合体を用いた処置を示す。サイズがマ
ッチした腫瘍（約１０００ｍｍ³）をもつマウスを、４つの処置グループにラン ダムに分けた（１グループあたり６匹の動物）：ビヒクルのみ、遊離のドキソル
ビシン（ｄｏｘ）、ドキソルビシン−コントロールペプチド（ｄｏｘ−ｃｔｒｌ
ｐｅｐ）、およびドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（ｄｏｘ−ＣＮＧＲＣ）。（Ｃ
）大（約５０００ｍｍ³）ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌腫を保持するマウス（グル ープあたり４匹の動物）は、遊離のドキソルビシンまたはドキソルビシン−ＣＮ
ＧＲＣ結合体の単回用量を、ドキソルビシン−当量の２００μｇ／マウスで受け
た。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。

【図１１Ｄ】 ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−由来乳癌腫およびホジキンリンパ腫を保持するマウス
のドキソルビシン−ＣＮＧＲＣペプチド結合体を用いた処置を示す。サイズがマ
ッチした腫瘍（約１０００ｍｍ³）をもつマウスを、４つの処置グループにラン ダムに分けた（１グループあたり６匹の動物）：ビヒクルのみ、遊離のドキソル
ビシン（ｄｏｘ）、ドキソルビシン−コントロールペプチド（ｄｏｘ−ｃｔｒｌ
ｐｅｐ）、およびドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ（ｄｏｘ−ＣＮＧＲＣ）。（Ｄ
）大（約５０００ｍｍ³）ホジキンリンパ腫を保持するマウス（グループあたり ８匹の動物）は、遊離のドキソルビシン＋非結合体化ＣＮＧＲＣペプチド、また
はドキソルビシン−ＣＮＧＲＣ結合体の２回用量を、ドキソルビシン−当量の４
０μｇ／マウスで受けた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。

【図１２】 ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞ
れ、配列番号２００および２０１）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 47/48 ４Ｃ２０６ 51/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 7/00 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 7/00 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/574 Ａ 33/574 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA29 AA34 BB24 CB01 CB09 CB17 DA36 FA18 FA29 FB03 FB05 FB08 4C076 AA22 BB13 CC14 DD21 EE41 4C084 AA17 NA14 ZB262 4C085 HH03 JJ03 KB07 KB09 KB15 LL07 4C086 AA01 AA02 EA10 MA01 MA05 NA14 ZB26 4C206 AA01 AA02 CB29 GA19 MA01 MA05 NA14 ZB26 4H045 AA20 BA13 BA14 BA15 BA16 DA56 FA74

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍の血管形成血管系にホーミングする腫瘍ホーミング分子
   を同定する方法であって： （ａ）実質的に純粋なＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮを、１つ以上の分子と接
   触させる工程；および （ｂ）該ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮに対する分子の特異的結合を測定する
   工程を包含し、 ここで、特異的結合の存在が、該分子を、腫瘍の血管形成血管系にホーミング
   する腫瘍ホーミング分子として同定する、方法。
2. 【請求項２】 （ｃ）インビボでＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮ結合分子
   を投与する工程；および （ｄ）該ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮ結合分子の、腫瘍の血管形成血管系へ
   の結合を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記実質的に純粋なＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮが、支
   持体に固定化される、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 血管形成血管系にホーミングするホーミング分子を同定する
   方法であって： （ａ）実質的に純粋なＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮを、１つ以上の分子と接
   触させる工程；および （ｂ）該ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮに対する分子の特異的結合を測定する
   工程を包含し、 ここで、特異的結合の存在が、該分子を、血管形成血管系にホーミングするホ
   ーミング分子として同定する、方法。
5. 【請求項５】 （ｃ）インビボでＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮ結合分子
   を投与する工程；および （ｄ）該ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮ結合分子の、血管形成血管系への結合
   を測定する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記実質的に純粋なＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮが、支
   持体に固定化される、請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 被験体における腫瘍の血管形成血管系に成分を向ける方法で
   あって、該被験体に、ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮに対して特異的結合を示
   す腫瘍ホーミング分子に連結された成分を含む結合体を投与し、それによって該
   成分を腫瘍の血管形成血管系に向ける工程を包含する、方法。
8. 【請求項８】 前記腫瘍ホーミング分子が、配列ＮＧＲを含むペプチドであ
   る、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記成分が細胞傷害剤である、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記成分が薬物である、請求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記薬物が癌の化学療法剤である、請求項１０に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 前記癌の化学療法剤がドキソルビシンである、請求項１１
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記腫瘍ホーミングペプチドが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧ
    ＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列
    番号７）、およびＣＮＧＲＣ（配列番号８）からなる群から選択される配列を含
    む、請求項８に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記成分が細胞傷害剤である、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記成分が薬物である、請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記薬物が癌の化学療法剤である、請求項１５に記載の方
    法。
17. 【請求項１７】 前記癌の化学療法剤がドキソルビシンである、請求項１６
    に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記腫瘍ホーミング分子が、ＣＤ−１３様アミノペプチダ
    ーゼのインヒビターである、請求項７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記インヒビターが、ベスタチン、アクチノニンおよびｏ
    −フェナントロリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記成分が細胞傷害剤である、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記成分が薬物である、請求項１９に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記薬物が癌の化学療法剤である、請求項２１に記載の方
    法。
23. 【請求項２３】 前記癌の化学療法剤がドキソルビシンである、請求項２２
    に記載の方法。
24. 【請求項２４】 被験体の腫瘍における血管形成を阻害する方法であって、
    該被験体に、ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮに対して特異的結合を示す腫瘍ホ
    ーミング分子に連結された成分を含む結合体を投与し、それによって該成分を血
    管形成血管系に向ける工程を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 前記腫瘍ホーミング分子が、配列ＮＧＲを含むペプチドで
    ある、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記成分が細胞傷害剤である、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記成分が薬物である、請求項２５に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記薬物が癌の化学療法剤である、請求項２７に記載の方
    法。
29. 【請求項２９】 前記癌の化学療法剤がドキソルビシンである、請求項２８
    に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記腫瘍ホーミングペプチドが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧ
    ＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列
    番号７）、およびＣＮＧＲＣ（配列番号８）からなる群から選択される配列を含
    む、請求項２５に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記成分が細胞傷害剤である、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記成分が薬物である、請求項３０に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記薬物が癌の化学療法剤である、請求項３２に記載の方
    法。
34. 【請求項３４】 前記癌の化学療法剤がドキソルビシンである、請求項３３
    に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記腫瘍ホーミング分子が、ＣＤ−１３様アミノペプチダ
    ーゼのインヒビターである、請求項２４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記インヒビターが、ベスタチン、アクチノニンおよびｏ
    −フェナントロリンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記成分が細胞傷害剤である、請求項３５に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記成分が薬物である、請求項３５に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記薬物が癌の化学療法剤である、請求項３８に記載の方
    法。
40. 【請求項４０】 前記癌の化学療法剤がドキソルビシンである、請求項３９
    に記載の方法。
41. 【請求項４１】 被験体における腫瘍の血管形成血管系を造影する方法であ
    って： （ａ）該被験体に、ＣＤ１３／アミノペプチダーゼＮに対して特異的結合を示す
    腫瘍ホーミング分子に連結された検出可能な成分を含む結合体を投与し、それに
    よって該結合体が、該血管形成血管系に特異的に結合する工程；および （ｂ）該結合体を検出する工程、を包含する、方法。
42. 【請求項４２】 前記検出可能な成分が放射線核種である、請求項４１に記
    載の方法。
43. 【請求項４３】 前記腫瘍ホーミング分子が、配列ＮＧＲを含むペプチドで
    ある、請求項４１に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記腫瘍ホーミングペプチドが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧ
    ＲＣ（配列番号３）、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号６）、ＣＶＬＮＧＲＭＥＣ（配列
    番号７）、およびＣＮＧＲＣ（配列番号８）からなる群から選択される配列を含
    む、請求項４３に記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記検出可能な成分が放射線核種である、請求項４４に記
    載の方法。
46. 【請求項４６】 前記放射線核種が、インジウム−１１１、テクネチウム−
    ９９、炭素−１１および炭素−１３からなる群から選択される、請求項４５に記
    載の方法。
47. 【請求項４７】 前記腫瘍ホーミング分子が、ＣＤ−１３様アミノペプチダ
    ーゼのインヒビターである、請求項４１に記載の方法。
48. 【請求項４８】 前記インヒビターが、ベスタチン、アクチノニンおよびｏ
    −フェナントロリンからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記検出可能な成分が放射線核種である、請求項４７に記
    載の方法。
50. 【請求項５０】 前記放射線核種が、インジウム−１１１、テクネチウム−
    ９９、炭素−１１および炭素−１３からなる群から選択される、請求項４９に記
    載の方法。