MXPA01008110A - Metodos para el tratamiento de tumores y metastasis utilizando una combinacion de terapias anti-angiogenicas e inmunoterapia. - Google Patents

Abstract

La invencion muestra los metodos para tratar tumores y metastasis tumoral en un mamifero que comprende administrar a un mamifero que necesita del tratamiento, una cantidad terapeutica de un antagonista suficiente para inhibir la angiogenesis en combinacion con una cantidad terapeutica de un agente inmunoterapeutico anti-tumoral, tal como por ejemplo una proteina de fusion, con anticuerpo/citocina de antigeno anti-tumoral que tiene una citocina y una cadena polipeptidica de inmunoglobulina recombihante suficiente para provocar una respuesta biologica por citocina-especifica.

Description

MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES Y METÁSTASIS UTILIZANDO UNA COMBINACIÓN DE TERAPIAS ANTI- ANGIOGÉNICAS E INMUNOTERAPIAS Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos para la Patente No. de Serie 60/119,721, presentada el 12 de febrero de 1999.

Declaración de derechos gubernamentales Algo del trabajo expuesto en la presente se ha apoyado en parte por concesiones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) que actúan a nombre de los Estados Unidos de América. El gobierno de los Estados Unidos de América puede tener ciertos derechos en la invención.

Campo técnico La invención se relaciona con los métodos para inhibir tumores primarios y metástasis utilizando una terapia basa ja en la administración combinada de una terapia an i-angiogénica y una inmunoterapia anti-tumoral blanco.

Antecedentes La generación de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis, desempeña una función clave en el desarrollo de una enfermedad maligna y ha generado mucho interés en el desarrollo de agentes que inhiben la angiogénesis (véase por ejemplo, Holmgren, L., O'Reilly, M. S. & Folkman, J. (1995) "Dormancy of micrometastases : balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis supresión", Nature Medicine 1, 149-153; Folkman, J. (1995) "Angiogenesis in cáncer, vascular, rheumatoid and other disease", Nature Medicine 1, 27-31; O'Reilly, M. S., et. al., (1994) "Angiostatin : a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma", Cell 79, 315-328; Kerbel, R. S. (1997) "A cáncer therapy resistant to resístanse", Nature 390, 335-336; Boehm, T., et. al., (1997) "Ant iangiogenic therapy of experimental cáncer does not induce acquired drug resístanse", Nature 390, 404-7; y Volpert, O. V., et . al., (1998) "A human fibrosarcoma inhibits systemic angiogenesis and the growth of experimental metastases via thrombospondin-1 " , Proc. Nati. Acad. Sci. (U. S. A.) 95, 6343-6348). El uso de antagonistas de integrina avß3 para inhibir la angiogéiiesis es conocido en los métodos para inhibir el crecimiento de tumores sólidos mediante la reducción del suministro de sangre al tumor sólido. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,753,230 (Brooks & Cheresh) y Patente de los Estados Unidos No. 5,766,591 (Brooks & Cheresh) que describen el uso de antagonistas avß3 tales como por ejemplo polipéptidos sintéticos, anticuerpos monoclonales y miméticos de avß3 que se unen al receptor avß3 e inhiben la angiogénesis. Además, se han descrito las terapias de proteina de fusión anticuerpo-citocina, que estimulan la inhibición mediada por la respuesta inmune de tumores determinados tales como por ejemplo, metástasis de carcinoma. Por ejemplo, la citocina interleucina 2 (IL-2) se ha fusionado a un inmunorreactivo de cadena pesada de anticuerpo monoclonal con la molécula de adhesión celular epitelial de los antigenos asociados con el tumor, en dos proteinas de fusión separadas, (antigeno Ep-CAM, KSA, KSl/4) o el disialogangliósido GD2 mediante el uso de los anticuerpos KS1/4 y chl4.18, respectivamente, para formar las proteinas de fusión Chl4.18-IL-2 y KS1/4-IL-2, respectivamente. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5, 650, 150 (Gillies) . La identificación de inhibidores de angiogénesis por vasculatura-especificos que son sinérgicos con las terapias que específicamente tienen como blanco el compartimiento del tumor, permitirán adaptar un tratamiento para el cáncer óptimamente eficaz. La angiogénesis se caracteriza por la invasión, migración y proliferación de células endoteliales, procesos que dependen de interacciones celulares con componentes de matriz extracelular. En este contexto, el receptor de adhesión endotelial de la integrina avß3 mostró ser un elemento clave al proporcionar un blanco por vasculatura-especifico para las estrategias de tratamiento anti-angiogénico . (Brooks, P. C, Clark, R. A. & Cheresh, D. A. (1994) "Requirement of vascular integrin alfa v beta 3 for angiogenesis", Science 264, 569-571; Friedlander, M., et. al., (1995) "Definition of two angiogenic pathways by distinct alfa v integrins", Science 270, 1500-1502). El requerimiento para la integrina vascular avß3 en la angiogénesis se demostró por diversos modelos in vi vo en donde la generación de nuevos vasos sanguíneos por tumores humanos transplantados se inhibió completamente ya sea por la administración sistémica de antagonistas peptidicos de integrina avß3 o anticuerpo anti-avß3 LM609. (Brooks, P. C, et . al., (1994) Science s upra ; Brooks, P. C, et. al., (1994) "Integrin alfa v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels", Cell 79, 1157-1164). El hibridoma murino LM609 se ha depositado con la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) como la International Depository Authority bajo el Tratado de Budapest, y se le asignó la Designación ATCC HB 9537, el 15 de septiembre de 1987. Estos antagonistas bloquean la ligación de la integrina avß3 que estimula la apoptósis de las células vasculares angiogénicas proliferativas y por lo tanto interrumpe la maduración de vasos sanguíneos que se están formando recientemente, un acontecimiento esencial para la proliferación de tumores. El Faccor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) se ha identificado como un factor de crecimiento angiogénico selectivo que puede estimular la mitogénesis celular endotelial. Las biopsias de tumor humano exhiben una expresión intensificada de los" ARNm del VEGF por células malignas y los ARNm receptores del VEGF en células endoteliales adyacentes. La expresión del VEGF parece ser mayor en las regiones de tumores adyacentes a las áreas de necrosis a vasculares, (para revi si ón véase Thomas et al., (1996) "Vascular Endothelial Growth Factor, a Potent and Selective Angiogenic Agent", J. Biol. Chem. 271(2): 603-606).

Las terapias anti-tumorales eficaces pueden utilizar un receptor del VEGF blanco para inhibir la angiogénesis utilizando anticuerpos monoclonales. (Witte L. et al., (1998) "Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2 (Flkl/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy", Cáncer Metástasis Rev 17 (2) : 155-61. Un obstáculo principal para el tratamiento eficaz de las malignidades diseminadas incluye la enfermedad residual minima caracterizada por micrometástasis que carecen de un suministro vascular bien establecido para suministrar los terapéuticos. Con respecto a esto, una estrategia inmunoterapéutica novedosa probó ser eficaz en la utilización de anticuerpos monoclonales de compartimiento especifico tumoral para dirigir las citoci?as hacia el microentorno tumoral. Esto se logró mediante proteinas de fusión anticuerpo-citocina recombinante, generadas para mantener la capacidad blanco especifica para el tumor único de los anticuerpos monoclonales y las funciones inmunomodulatorias de las citocinas. El uso de una proteina de fusión anticuerpo-IL-2 para dirigir IL-2 en el compartimiento tumoral inducido por la activación de las células efectoras que invaden el microentorno tumoral y dieron por resultado en una erradicación eficaz de micrometástasis determinada en tres diferentes modelos de tumor de ratón singeneico. (Becker, J. C, et. al. (1996) "T cell-mediated eradication of murine metastatic melanoma induced by targeted interleukin 2 therapy", J Exp. Med 183,2361-2366; Xiang, R., et . al., '1997) "Elimination of established murine colon rarcino a metastases by antibody-interleukin 2 fusión protein therapy", Cáncer Res. 57,4948-4955; Lode, H. N., et . al., (1998) "Natural killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bone marrow by targeted interleukin-2 therapy", Blood 91, 1706-1715) . Aunque muy eficaz en las etapas tempranas de la metástasis tumoral, este planteamiento dirigido al compartimiento tumoral únicamente podria retardar el desarrollo de la metástasis en etapas posteriores del crecimiento tumoral caracterizado por un compartimiento vascular desarrollado completamente. Aqui, nos dirigimos a la cuestión de que si existe una ventaja complementaria de estrategias para el tratamiento vascular especifico y las estrategias de tratamiento dirigidas al compartimiento tumoral que sean sinérgicas cuando se utilizan en combinaciones secuenciales y simultáneas. Esto se probó en tres modelos de tumor murino singeneico de carcinoma de colon, melanoma y neuroblastoma, el último caracterizado por metástasis hepática espontánea. Los tres modelos exhibieron similitudes cerradas para las enfermedades en seres humanos. Les modelos de melanoma y neuroblastoma expresan disialogangliosido GD2, un antigeno asociado con el tumor bien establecido en estas malignidades neuroectodérmicas (Irie, R. F., Matsuki, T. & Morton, D. L. (1989) "Human monoclonal antibody to ganglioside GM2 for melanoma treatment", Lancet 1, 786-787; Handgretinger, R., et . al., (1995) "A phase I study of human/mouse chimeric antiganglioside GD2 antibody chl4.18 in patients with neuroblastoma", Eur. J Cáncer 31A, 261-267) y el modelo de carcinoma de colon se caracteriza por la expresión de la molécula de adhesión celular epitelial (antigeno Ep-CAM, KSA, KS1/4), una molécula blanco aprovechada exitosamente para inmunoterapia pasiva en el hombre (Riethmuller G., et. al., (1994) "Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Duke's C colorectal carcinoma", Lancet 343, 1177-1183). Estos antigenos específicamente delinean el compartimiento del tumor en estos modelos blanco por las proteinas de fusión anticuerpo-interleucina-2 con anticuerpo anti-GD2 quimérico de humano/ratón (chl4.18-IL-2) (Gillies, S. D., et. al., (1992) "Antibody-targeted interleukin 2 stimulates T-cell killing of autologous tumor cells", Proc. Nati. Acad Sci. (U.S.A.) 892, 1428-1432) y anti-Ep-CAM humanizado (antigeno anti-KSA, anti-KSl/4) anticuerpo KS1/4-IL-2 (Xiang, R., et. al. (1997) supra.; Gillies, S., et. al, (1998) "Antibody-IL-12 fusión proteins are effective in SCID mouse models of prostrate and colon carcinoma metastases", J Immunol. 160, 6195-6203). El compartimiento vascular de estos modelos de tumor, según se describe en diversos modelos animales, se define por la expresión de la integrina avß3 de vasos • sanguíneos formados recientemente. (Brooks, P. C, et al., (1994) supra . ) Los datos presentados aqui demuestran una eficacia sinérgica de tratamientos simultáneos y secuenciales específicamente que tienen como blanco los compartimientos tumorales y vasculares de tumores primarios y metástasis distantes. Un mecanismo para este sinergismo se proporciona por una disminución en la formación de vasos sanguíneos y un aumento en la inflamación únicamente en animales tratados con la terapia de combinación. Estas observaciones destacan el efecto benéfico del anti-angigénico combinante con planteamientos inmunoterapéuticos específicos tumorales anti-tumorales .

Sumario de la invención La presente invención se dirige a un método para tratar una célula tumoral en un paciente que necesita de este tratamiento, que comprende administrar al paciente una cantidad de un agente inhibidor de angiogénesis y un agente inmunoterapéutico anti-tumoral para inhibir la proliferación celular tumoral. La inhibición de la proliferación celular tumoral puede abarcar la inhibición del crecimiento de células tumorales en tumores existentes o metástasis tumoral, la inhibición de la formación de metástasis tumoral adicional e incluso la muerte de células tumorales. El agente para inhibir la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se pueden administrar substancialmente de manera concurrente asi como secuencialmente . En una modalidad, la presente invención describe un método para tratar un tumor o metástasis tumoral en un paciente mediante la administración al paciente de la combinación de al menos un agente para la inhibición de angiogénesis y al menos un agente inmunoterapéutico anti-tumoral. Una inhibición eficaz de la proliferación celular tumoral en el paciente se puede alcanzar de esta forma. El paciente puede recibir las composiciones terapéuticas mencionadas anteriormente antes de, durante o después de la intervención quirúrgica para eliminar todo o parte de un tumor. La administración se puede llevar a cabo via la inmersión directa; sistémica o intravenosa localizada (i.v.), intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.) o inyección directa en una masa tumoral; y/o mediante la administración oral de las formulaciones adecuadas . Un agente para la inhibición de angiogénesis adecuado para utilizarse en los métodos de la invención es que puede inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización) o agrandamiento de las redes capilares existentes en los tejidos cerca de una célula tumoral. Los agentes para la inhibición de la angiogénesis adecuados pueden ser péptidos con actividad para la inhibición de angiogénesis, tales como por ejemplo, el antigeno asociado con el tumor PSA. Otros agentes para la inhibición de angiogénesis adecuados pueden ser antagonistas de la angiogénesis asociada con el VEGF, por ejemplo antagonistas del receptor del VEGF sobre la superficie de las células. Un agente para la inhibición de angiogénesis preferido es un antagonista de integrina avß3 que se une a las células. Un antagonista avß3 para utilizarse en los métodos de la invención es aquel que inhibe la angiogénesis en un tejido asociado con tumor o metástasis tumoral, cuando se administra al tejido o células blanco. Estos antagonistas pueden ser lineales únicos o ciclo-polipéptidos , polipéptidos lineales o que contienen ciclo-RGD, anticuerpos, o miméticos de avß3 que se unen al receptor avß e inhiben la angiogénesis.' Cuando el antagonista avß3 es un anticuerpo, éste se contempla que puede ser policlonal, monoclonal o un antigeno que se une al fragmento del mismo, que tiene una especificidad de unión al antigeno para avß3 o al receptor avß3. Un anticuerpo monoclonal preferido que se une a la integrina avß3 es el anticuerpo monoclonal identificado como LM609 (ATCC HB 9537) . Un agente para la inhibición de angiogénesis preferido es un polipéptido que es un antagonista receptor avß3 que puede inhibir al receptor de integrina sobre células blanco. Una modalidad más preferida de un antagonista avß3 es el péptido ciclo (RGDf -MeV) que contiene RGD sintético (SEQ ID NO: 11) y lo semejante. Los péptidos cíclicos de este tipo general se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,262,520 (Plow et al.). Los péptidos que no contienen RGD se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,780,426 (Palladino et al.). Un agente inmunoterapéutico anti-tumoral adecuado para utilizarse en los métodos de la invención es un agente inmunoterapéutico que comprende un componente efector celular unido a un componente blanco de antigeno asociado con el tumor. Los componentes efectores celulares adecuados pueden incluir químicos citotóxicos, radioisótopos citotóxicos y agentes de señalización celular tales como por ejemplo, citocinas. Los componentes blanco para tumor adecuados son cadenas polipeptidicas que se unen a los antigenos asociados con el tumor presentes en la matriz de tejido circundante o en la misma de una célula tumoral tal como por ejemplo, cadenas proteinicas receptoras o cadenas de inmunoglobulina. Los antigenos asociados con el tumor que se pueden utilizar para los r I ancos de los agentes inmunoterapéuticos incluyen -..n antigeno asociado con el tumor seleccionado del grupo que consiste de Receptor AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, EGF, receptor GD2, GD3, GM1, GM2 , Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA) , IL-2, proteoglicano MCSP PSA, asociado con Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), melanoma y receptor de transferrina . El agente inmunoterapéutico preferido tiene un componente efector que es un polipéptido de citocina unido a un componente blanco que es una cadena polipeptidica de inmunoglobulina (Ig). La cadena polipeptidica de Ig comprende una región variable que se une a un antigeno asociado con el tumor. Se prefiere que la cadena de inmunoglobulina, cuando se combina con la cadena complementaria adecuada (es decir, una cadena pesada complementa una cadena ligera) define un sitio activo del anticuerpo que es especifico para un antigeno asociado con el tumor . La porción Ig blanco del tumor del agente inmunoterapéutico puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena de inmunoglobulina total, o al menos el fragmento del cual comprende el antigeno que une la porción de especificidad de la proteina. De esta forma, una cadena polipeptidica de Ig adecuada tendrá al menos una región variable Ig especifica para un antigeno asociado con el tumor. Un anticuerpo y las cadenas polipeptidicas del mismo, adecuado para utilizarse en los métodos de la invención, tendrá una secuencia de aminoácidos que puede ser de cualquier origen mamífero. Cuando esta proteina de anticuerpo no es del mismo origen del paciente considerado, se pueden utilizar los fragmentos de la proteina de anticuerpo, tales como por ejemplo, la proteina de anticuerpo de cadena simple F (ab') 2, Fab, Fv o Fv manipulada por ingeniería genética. Para reducir adicionalmente la antigenicidad de la proteina de anticuerpo, la modificación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se puede llevar a cabo para reducirla al hacer que la proteina parezca más similar a los componentes de anticuerpo normales del paciente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de anticuerpo murino monoclonal se pueden modificar para que parezcan más humanas, para la administración a pacientes humanos mediante una variedad de procesos para la humanización del anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo puede ser de origen humano (codificado genéticamente para genes Ig humanos) pero producido en un animal transgénico transformado para expresar los genes Ig humanos en lugar de sus propios genes Ig naturales. Por ejemplo, los ratones transgénicos se pueden estructurar para que expresen ADN de origen humano que codifica para las proteinas Ig humanas. La generación del anticuerpo monoclonal proveniente de estos ratones transgénicos dará por resultado en hibridomas B-célula murino que expresan ADN humano que codifica para anticuerpos que tienen secuencias de aminoácidos de origen humano. Esto reducirá bastante la inmunogenicidad de estos anticuerpos para utilizarse en el tratamiento de pacientes humanos. Para el tratamiento de pacientes humanos, los anticuerpos preferidos para utilizarse en el método de la invención reivindicada son los anticuerpos monoclonales de antigeno asociados con el tumor anti-GD2 humanizado chl4.18 y el anticuerpo monoclonal KS1/4 de antigeno asociado con el tumor anti-KSl/4 (también conocido como Ep-CAM y KSA) . Un componente efector celular de un agente inmunoterapéutico adecuado para utilizarse en los métodos, las composiciones y equipos que incluyen la presente invención es una citocina seleccionada del grupo que consiste de BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 a través de MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo y VEGF. La citocina adecuada que es una qumiocina, se puede seleccionar del grupo que consiste de CIO, EMF-1, ENA-78, Eotaxina, GCP-2, HCC-1, 1-309, IL-8, IP-10, linfotactina, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MlP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 y SDF-1. La porción de citocina del agente inmunoterapéutico mencionado anteriormente puede ser la secuencia de aminoácidos completa de la proteina citocina, o un fragmento de esta proteina de fusión suficiente para producir una respuesta biológica especifica para citocina. En una modalidad preferida, la porción de citocina del agente inmunoterapéutico tiene actividad biológica de IL-2. En un agente inmunoterapéutico que comprende un polipéptido de citocina unido a un polipéptido Ig, una unión adecuada entre una cadena polipeptidica de citocina y una cadena polipeptidica Ig incluye un enlace polipeptidico directo, una unión que tiene un enlazante polipeptidico entre las dos cadenas, u otro enlace químico entre las cadenas que incluyen el uso de biotinilación y el complejo avidina-biotina . Una unión preferida es cualquier enlazante directo o polipeptidico separado del enlace polipeptidico. Este enlace directo permite la expresión del agente inmunoterapéutico como una proteina de fusión simple, de una célula hospedera transformada con un vector de expresión adecuado que codifica para el agente inmunoterapéutico de la proteina de fusión. De esta forma, un agente inmunoterapéutico preferido para utilizarse en los métodos de la invención es una proteina de fusión bifuncional que tiene un componente de citocina y un componente blanco de antigeno asociado con el tumor en donde el componente blanco es una cadena polipeptidica Ig que tiene una especificidad para un antigeno asociado con el tumor. Ejemplos de estos agentes inmunoterapéuticos preferidos incluyen la proteina de fusión blanco GD2 chl4.18-IL2, y la proteina de fusión blanco KS1/4-IL2 del antigeno asociado con el tumor KS1/4 (también conocida como Ep-CAM y KSA) . De manera alternativa, otro agente inmunoterapéutico adecuado para utilizarse en los métodos, composiciones y equipos de la invención puede tener un componente efector celular que sea un agente citotóxico. Un agente citotóxico adecuado es uno que tiene un efecto citotóxico directo en la célula tumoral, es decir, inmunotoxinas , radioisótopos, farmacocitotóxico y lo semejante. Los agentes inmunoterapéuticos de citocina similares descritos anteriormente, los péptidos citotóxicos pueden estar unidos al polipéptido Ig blanco del antigeno asociado con el tumor para formar una proteina de fusión ya sea de manera directa, o separado por un péptido enlazante o cadena. Se puede realizar el enlace quím::: de las citotoxinas químicas a las cadenas Ig blanco. También se puede construir un radioisótopo q„e porte las cadenas de anticuerpo . Otro aspecto de la invención abarca una composición terapéutica que comprende un agente inhibidor de angiogénesis y un agente inmunoterapéutico anti-tumoral. Se prefiere que el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se dirija al tumor o a las células de metástasis tumoral al tener un componente de especificidad de antígeno asociado con el tumor unido a un componente efector celular. En una composición terapéutica preferida de la invención, el agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una proteina bifuncional que tiene un componente efector que es un polipéptido de citocina unido a un componente blanco de tumor que es una cadena polipeptídica de inmunoglobulina (Ig), en donde la cadena Ig comprende una región variable que se une a un antígeno asociado con el tumor. Incluso otro aspecto de la presente invención es un equipo para tratar un tumor o metástasis tumoral. El equipo comprende un paquete que contiene un agente para inhibir la angiogénesis, tal como por ejemplo un antagonista avß3 capaz de inhibir la angiogénesis en el tumor o la metástasis tumoral; un componente de proteína bifuncional que tiene una actividad de citocina y una especificidad de antígeno tumoral; e instrucciones para tratar las células tumorales an tumores y metástasis tumoral. El quipo también incluye etiquetado especifico que indica el uso de los componentes del equipo para tratar un tumor o metástasis tumoral.

Breve descripción de los dibujos Modalidades preferidas de la invención se describen más adelante con referencia a los dibujos acompañantes, en donde: La Figura 1 representa gráficamente el efecto de una terapia combinada con el antagonista de integrina av anti-angiogénica y la inmunoterapia de compartimiento-específica anti-tumoral con proteinas de fusión con anticuerpo-IL-2 en tumores primarios. La Figura 1A representa los resultados de los tumores primarios inducidos por inyección subcutánea (2xl06) de neuroblastoma NXS2. La Figura IB representa los resultados de tumores primarios inducidos mediante inyección subcutánea (2xl06) de carcinoma de colon CT26-KSA. La Figura 1C representa los resultados de tumores primarios inducidos por inyección subcutánea (2xl06) de células de melanoma B78-D 14. La Figura 2 representa gráficamente el efecto de terapias antivascular y antitumoral combinadas sobre la vascularización y la respuesta inmune anti-tumoral. La Figura 2A representa los resultados de la densidad de vasos sanguíneos de tumores primarios después del tratamiento por compartimiento vascular y tumoral ya sea con el antagonista av de integrina, l"a proteína de fusión chl4.18-IL-2 y una combinación de los mismos (*P < 0.001, Prueba T de Student). La Figura 2B representa los resultados de la infiltración de leucocitos de tumores primarios después de los tratamientos por compartimiento vascular y tumoral, respectivamente (*P < 0.001, Prueba T de Student). La Figura 3 representa gráficamente el efecto de una combinación secuencial de un antagonista de integrina av anti-angiogénica y una inmunoterapia por compartimiento-específica antitumoral con la proteína de fusión anticuerpo-IL-2 sobre la metástasis de neuroblastoma hepática espontánea. El número de metástasis espontánea de hígado se determino mediante conteos macroscópicos de focos de hígado (n=8) (**P <0.01, Prueba de Wilcoxon Rank-Sum) . La Figura 4 representa gráficamente el efecto de la combinación prácticamente simultánea del antagonista av de integrina anti-angiogénica y la inmunoterapia por compartimiento específica antitumoral con la proteína de fusión^del anticuerpo IL-2 sobre la metástasis espontánea de neuroblastoma hepático. Los resultados del tratamiento con la integrina o el antagonista (17.5 µg/h) y la proteína de fusión de tumor chl4.18-IL-2 (5 µgx5) se inició antes (Figura 4A) o después (Figura 4B) de que se mostró la eliminación del tumor primario. La metástasis espontánea de hígado se determino mediante conteos macroscópicos de focos de hígado (n=8) (*P < 0.01, Prueba de Wilcoxon Rank-Sum).

Descripción detallada de la invención La supresión y erradicación de tumores primarios y metástasis distante es una meta principal de las estrategias de tratamiento alternativo para el cáncer, tal como por ejemplo, la inhibición de angiogénesis e inmunoterapia blanco. En la actualidad se ha descubierto que existe una sinergia inesperada en la efectividad en el tratamiento de células tumorales en tumores y metástasis tumoral mediante el uso combinado de las dos modalidades terapéuticas 'denominadas en la presente como (1) terapia de inhibición de angiogénesis (anti-angiogénica) y (2) inmunoterapia anti-tumoral. En particular, se describe la terapia del antagonista av y la terapia de la proteina de fusión con antigeno-citocina anti-tumoral combinada. Se ha encontrado que se presenta una sinergia entre las dos únicas monoterapias dirigidas contra los compartimientos vascular y tumoral, respectivamente, un antagonista av de integrina anti-angiogénica de vasculatura-específica y las proteínas de fusión con anticuerpo-interleucina-2 específicas de tumor. La combinación simultánea y secuencial de estas monoterapias erradica de manera eficaz la metástasis espontánea de hígado en un modelo singeneico inmunogénico de manera deficiente de neuroblastoma. Esto estuvo en contraste con controles sometidos a monoterapias ya sea con un antagonista av de integrina anti-angiogénica o proteínas de fusión anticuerpo-IL-2, lo cual únicamente fue eficaz parcialmente en los niveles de dosis aplicados. Además, los tratamientos simultáneos con el antagonista av de integrina y las proteínas de fusión anticuerpo-IL-2 especificas de tumor indujeron regresiones de tumor primario dramáticas en tres modelos de tumor murino singeneico, es decir melanoma, carcinoma de colon y neuroblastoma. Sin embargo, cada agente utilizado como monoterapia solo, indujo únicamente un retraso en el crecimiento tumoral . La respuesta anti-tumoral se acompañó por una reducción simultánea del 50% en la densidad de los vasos del tumor y un aumento de cinco veces en las células inflamatorias en el microentorno tumoral. Subsecuentemente, la necrosis tumoral se demostró únicamente en animales que recibieron la terapia de combinación, pero no cuando se aplicó cada agente como monoterapia. Los resultados mostraron que estas modalidades de tratamiento enérgico proporcionaron una herramienta novedosa y eficaz para terapias futuras de cáncer metastático. La invención describe los métodos para el tratamiento de tumores y metástasis tumoral, las composiciones terapéuticas y los equipos terapéuticos (sistemas empaquetados) útiles para practicar las terapias sinérgicas descritas en la presente. 1. Composiciones terapéuticas Se describen una variedad de composiciones terapéuticas que son útiles para practicar los métodos de la invención. Las composiciones incluyen reactivos para inhibir la angiogénesis (anti-angiogénesis) tales como por ejemplo los agentes antagonistas avß3 y antitumorales tales como por ejemplo, proteínas de fusión de antígeno-citocina tumorales, ya sea solos o en diversas combinaciones.

A. Inhibidor de angiogénesis Los inhibidores de la angiogénesis que inhiben la angiogénesis en tejidos tratados con los mismos se pueden utilizar en las composiciones y métodos de la invención. Un inhibidor de angiogénesis preferido es un antagonista av, y en particular un antagonista avß3. Un antagonista avß3 para inhibir la angiogénesis (anti-angiogénesis) puede ser un péptido, un péptido que contiene RGD, un anticuerpo anti-avß3, un anticuerpo receptor anti-avß3 o un mimético avß3. Ejemplos de antagonistas avß3 se describen en las enseñanzas de la Patente de los Estados Unidos No. 5,753,230 (Brooks & Cheresh) y Patente de los Estados Unidos No. 5,766,591 (Brooks & Cheresh), las exposiciones de las mismas que se relacionan con la preparación y uso de un antagonista avß3 se incorporan específicamente en la presente como referencia . Los antagonistas preferidos son péptidos que contienen RGD, tales como por ejemplo el péptido cíclico ciclo (RGDfN-MeV) (SEQ ID NO.: 11). Los antagonistas adicionales se han descrito en la literatura e incluyen miméticos orgánicos y péptidos cíclicos que no contienen RGD que funcionan como antagonistas avß3. Véase, por ejemplo, Brooks et al., Publicación Internacional No. WO 97/45137, (PCT/US97/09158) . Los ensayos para la identificación de un antagonista avß3 adecuado para utilizarse como un antagonista se describen en las Patentes de los Estados Unidos ya mencionadas y por lo tanto se considera que los antagonistas alternos se pueden identificar fácilmente para practicar la presente invención . El anticuerpo monoclonal anti-avß3 adecuado se puede modificar para abarcar los fragmentos de unión del antígeno del mismo, que incluye F (ab) 2, Fab, y Fv manipulado por inge*niería genética o el anticuerpo de cadena simple (SCA) . Los métodos para preparar estos fragmentos son conocidos en ia técnica (véase por ejemplo, Hermanson, G.T., Bioconj ugate Techniques , Academic Press, 1996) . Los métodos de la invención que describen el uso del anticuerpo también incorporan la modificación adecuada del anticuerpo completo para los fragmentos de unión del antígeno del mismo. Un anticuerpo monoclonal adecuado se identifica como LM609 (ATCC HB 9537). Otros antagonistas del receptor avß3 han mostrado ser eficaces para inhibir la angiogénesis y podrían ser adecuados para utilizarse en los métodos de la invención. Por ejemplo, los antagonistas receptores químicos tales como por ejemplo ácido (S)-10,ll-dihidro-3-[3- (piridin-2-ilamino) -1-propiloxi]- 5H-dibenzo [a, d] ciclohepteno-10-acético (conocido como SB265123) se han probado en una variedad de sistemas de modelo de mamífero, (véase pro ejemplo, Keenan RM et al., (1998) Bioorg Med Chem Lett 8(22): 3171-6; Ward KW et al., (1999) Drug Metab Pispos 27(11): 1232-41 ) . El Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) se ha identificado como un factor de crecimiento angiogénico selectivo. De esta forma, un agente para inhibir la angiogénesis, alternativo o adicional puede ser un inhibidor de la actividad del VEGF suficiente para inhibir el crecimiento angiogénico. Tal inhibidor podria ser un inhibidor competitivo o una molécula de unión/inactivación del VEGF, o un antagonista receptor del VEGF. Por ejemplo, los posibles inhibidores podrían ser un mimético químico no angiogénico del VEGF para competir en la unión con el blanco/receptor del VEGF, un derivado del VEGF no angiogénico modificado, un anticuerpo que se une específicamente al VEGF suficiente para inhibir la actividad angiogénica o posiblemente otra proteína específica que se une al VEGF (tal como por ejemplo, la proteína receptora del VEGF aislada) , o un anticuerpo que se une al receptor del VEGF y bloquea la interacción con el V?GF. Otros compuestos que se han identificado sobre la base de la capacidad del compuesto para inhibir la angiogénesis, por ejemplo el antígeno PSA asociado con el tumor aislado.

B . Inmunoterapéutico anti-tumoral Los métodos y composiciones para utilizarse en estos métodos de la invención contemplan la administración combinada de al menos un agente terapéutico para la inhibición de angiogénesis (anti-angiogénesis ) con al menos un agente inmunoterapéutico anti-tumoral. El agente inmunoterapéutico anti-tumoral preferido combina un componente blanco del tumor con un componente efector celular tal como por ejemplo, una citocina, inmunotoxina, agente radioactivo o lo semejante. El componente blanco tumoral de preferencia comprende al menos la porción de unión al antígeno de un anticuerpo dirigido hacia un antígeno asociado con el tumor. En una modalidad preferida, el componente efector es una citocina. a) Antígenos asociados con el tumor Los antígenos asociados con el tumor son el blanco por el cual el agente inmunoterapéutico para utilizarse en los métodos, composiciones y equipo de la invención se dirige últimamente' a la célula tumoral. Los antigenos asociados con el tumor se reconocen en la técnica para estar correlacionados con ciertos tipos de cáncer. En la mayoría de los casos, los antígenos asociados con el tumor son antigenos superficiales celulares que se expresan de una forma no normal encontrada para las células normales asociadas con el origen del tumor canceroso. Otros antígenos asociados con el tumor son moléculas secretadas o componentes relacionados con la matriz extracelular que no se encuentran normalmente en asociación con tejido normal maduro. Algunos antígenos asociados con tumores son proteinas expresadas en las etapas tempranas de desarrollo del tejido, y no se asocian normalmente con los tejidos maduros (algunas veces denominados proteínas oncofetales ) . Otros antígenos asociados con el tumor se expresan por las células maduras normales, aunque se expresan en mayores cantidades por las células cancerosas. Los antígenos asociados con el tumor pueden ser formas mutadas de marcadores celulares expresados normalmente o componentes extracelulares. Todavía otros antígenos asociados con el tumor se relacionan con formas alteradas o inusuales de glucosilación de proteínas, lípidos o componentes extracelulares o entidades de carbohidrato novedosas. De esta forma, los antígenos asociados con el tumor pueden variar ampliamente y definir, al menos en parte, el tipo de tumor que será tratado por la presente invención. La variedad de los tipos de tumor y los antígenos tumorales que se expresan en la presente son diversos y todavía bien estudiados en las técnicas del cáncer. Muchos marcadores adicionales para tumores están bajo investigación, y una vez identificados y caracterizados para ser un antígeno asociado con tumor, también son un antígeno blanco adecuado para el agente inmunoterapéutico blanco hacia un tumor deseado o sitio de metástasis. Se ha reportado el banco de los vectores de terapia génica para células cancerosas que utilizan antigenos .monoclonales ant i - ewis-Y . (Kurane S et al., Jpn J. Cáncer Res 89 •' 11 ' : 1212-9 (1998)). De manera similar, también se r. J reportado el blanco de los liposomas que utilizan anticuerpo GM3 anti-gangliósido o anticuerpo del antígeno anti-Lewis-X . (Nam, S. M, et al., Oncol Res 11(1): 9-16 (1999) . Human Cáncer Markers, The Humana Press Inc., eds. Sell and Wahren, 1982. Como se analizará más adelante, los métodos en la técnica son conocidos para tomar un antígeno identificado para generar los anticuerpos adecuados que se unirán específicamente a ese antígeno. De este modo, los antigenos tumorales se pueden identificar y se pueden producir los anticuerpos monoclonales que son útiles en la presente invención. Para una revisión de la preparación de antígenos tumorales, véanse las enseñanzas en Human Cáncer Markers, The Humana Press Inc., eds. Sell and Whren, 1982. Las técnicas biológicas, bioquímicas y moleculares estándar aplicables* para preparar los antígenos y/o citocinas y lo semejante se pueden encontrar en, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning 2nd ed. (Cold Spring Harbor Press, CSH NY) . Los antígenos de superficie celular tumoral pueden ser específicos para una clase de tumores o para un tipo individual de tumor. Muchas de las secuencias de ácidos nucleicos y/o aminoácidos relacionadas y que codifican para los antígenos asociados con el tumor están disponibles de bases de datos públicas de computadora que se pueden acceder mediante el Internet a través de diversos servicios, es decir, la NCBI (Centro Nacional para la Información de Biotecnología; www3.ncbi.nlm.nih.gov) y se identifican en general por el nombre y el número de acceso (algunos ejemplos no limitantes de los tipos de información de secuencia accesible se les hace referencia por el comentario "véase el número de acceso") . Los blancos de antígeno asociados con el tumor preferido se incluyen, de manera enunciativa: AFP (Véase el Acceso NP 001125), CA125 (Véase el Acceso NP 005890), CEA (Véase el Acceso AAA62835), CD19 (Véase el Acceso P15391), CD20 (Véase el Acceso P11836), CD44 (Véase el Acceso P16070), CD45 (Véase el Acceso P08575), Receptor EGF (Véase el Acceso P00533), GD2, GD3, GM1, GM2 , Her-2/Neu (Véase el Acceso AAA58637), Ep-CAM (KSA) (Véase el Acceso P16422, AAA36151), receptor IL-2 (Véase el Acceso P14784, NP 000197, P01589), Proteoglicano MCSP asociado con melanoma Lewis-Y, Lewis-X (CD 15) (Véase el Acceso NP 001888), PSA (Véase el Acceso P07288), PMSA receptor de Transferrina (Véase el Acceso NP 003218, NP 003225, AAF04564), Proteína con marcador de carcinoma pancreático GA733-1 (Véase el Acceso P09758), receptor folato (Véase el Acceso NP 000793), L6 (Véase el Acceso P30408) y CO-029 (Véase el Acceso A36056, P19075) . Los blancos de an.: eno asociados con tumor particularmente preferidos pira dirigir los agentes inmunoterapéuticos son GD;, y KSA (antígeno Ep-CAM; KS1/4), como se describe en la presente. Las proteinas de antigeno asociadas con el tumor están disponibles comercialmente o se pueden generar utilizando ADN recombinante estándar y cultivo celular, técnicas para la expresión de proteina conocidas en este campo. Por ejemplo, Sigma (St. Louis, MO) se lista para vender disialogangliósido GD2 (G 0776) , Disialogangliósido GD3 (G 5904), monosialogangliósido GM1 (G 7641), monosialogangliósido GM2 (G 4651), antígeno tumoral gastrointestinal Ca 19-9 (G 8660, G 8535), antígeno carcinoembriónico CEA (C4835) , trisacárido de Lewis-X (L 5152), y Lewis-Y (L 7401). Los anticuerpos específicos para muchos de estos antígenos asociados con tumores están disponibles comercialmente. (Por ejemplo, USB, RDI, Accurate Chemical and Scientific Corp., Zymed Lab). Por ejemplo, Sigma (St. Louis, MO) vende muchos anticuerpos monoclonales tales como por ejemplo, anti-AFP (A 8452), anti-CEA (C2331), receptor anti-EGF (E 3138), receptor soluble de anti-IL-2, (I 5652, I 5777, i 5902), anti-CD19 (F 3899), anti-CD20 (C8080), anti-CD44 (C7923), y anti-CD45 (C7556). Incluso si no están disponibles comercialmente, se puede generar la utilización de métodos conocidos para producir anticuerpos monoclonales, anticuerpos específicos para antígenos asociados con tumores que utilizan el antígeno como un inmunógeno. Por ejemplo, se han descrito los dominios variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos murino del antígeno anti-Lewis-Y (Véase el acceso AAB25798 y AAB25799) . De manera similar, se han descrito los dominios variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo murino de gangliósido anti-asialo GMl (Véase el acceso AAD09194 y AAD09195). Una estructura cristalina se ha resuelto para una cadena pesada y ligera de anticuerpo monoclonal de gangliósido anti-GD2 (Véase el acceso 2554841, 2554842). Se han reportado anticuerpos que unen el receptor folato (proteína de unión) , identificado como un marcador para el cáncer ovárico (Véase el acceso NP 000793). También se ha reportado la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada y ligera de la región monoclonal variable anti-CA125, y se ha utilizado para la inserción en un vector cassette (Véase el acceso AAB33454, 33455). Las modalidades particularmente preferidas son los anticuerpos chl4.18 y KS1/4 descritos en la presente . b) Anticuerpo monoclonal y porciones de unión del antígeno del mismo, y lo semej ante Desde el advenimiento de los métodos para generar anticuerpos raonoclonales publicado primero por Kohler y Milstein, los métodos mejorados se han vuelto bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Dean, C. J. in Methods in Molecular Biology Vol. 80: Imm unochemi ca l Pro tocol s , 2nd ed. (Pound, J. D. editor, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) chapter 4; and Ausbel, F. M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed. (Current Protocols, John Wiley & Sons, NY NY, 1992) capítulo 11). En la actualidad es una práctica de rutina generar un anticuerpo monoclonal que se una a un antígeno en particular. También se han mejorado los protocolos de selección para la selección de anticuerpos de unión con alta afinidad, si se desea. Típicamente, los hospederos para la producción de hibridomas se derivan de ratón u otros roedores . Una barrera para el tratamiento repetido con monoclonales murinos para pacientes humanos es el HAMA (anticuerpos anti-ratón de humano) generados por el paciente en respuesta al tratamiento. Los métodos para superar esta barrera incluyen la humanización de las proteínas de anticuerpo murino al sustituir los aminoácidos antigénicos de la proteina de ratón por secuencias de proteína humana, que se asumen para ser menos antigénicos. Otros métodos incluyen el injerto de los residuos de aminoácidos que determinan la especificad de unión o las regiones en las estructuras de la proteina humana. La capacidad de expresar la proteina de anticuerpo en sistemas de exhibición fago permite la selección de anticuerpos que se han sometido a mutagénesis ya sea para mejorar la unión o para reducir la inmunogenicidad (véase por ejemplo, Antibody Engineering (McCafferti, J. et al. editors, Oxford University Press, 1996). Recientemente, la sustitución de genes de inmunoglobulina humana en ratones transgénicos ha permitido el uso de hospederos murinos para generar anticuerpos y de esta forma anticuerpos monoclonales, que son de origen de secuencia de ácido nucleico humano. Los anticuerpos también se pueden reducir de tamaño mediante fragmentación para permitir una antigenicidad reducida o para crear moléculas terapéuticas más pequeñas. Por ejemplo, una proteína de anticuerpo completa se puede reducir, ya sea por la digestión con las enzimas adecuadas o mediante la producción de proteínas más pequeñas por métodos de ADN recombinante. Los fragmentos adecuados incluirán al menos una porción de unión al antigeno de la molécula completa y pueden comprender Fab, F (ab) 2, F (ab) 3, Fv o construcciones de cadena simple Fv (anticuerpo de cadena simple; SCA) . Se anticipa que todos los componentes basados en anticuerpos monoclonales de los agentes terapéuticos para utilizarse en los métodos de la invención para el tratamiento de seres humanos, pueden beneficiarse de la modificación para reducir la inmunogenicidad y HAMA potencial, como se describió anteriormente. También es posible utilizar la proteina receptora especifica que se puede unir específicamente a un antígeno asociado con tumor particular, como el componente blanco de los agentes inmunoterapéuticos descritos anteriormente. Funcionalmente, un receptor específico puede ser tan útil como un anticuerpo específico para el blanco que depende de la especificidad y afinidad del receptor para el antigeno asociado con tumor blanco. Se debe tener cuidado de reducir al mínimo el impacto de la unión cruzada-reactiva a proteínas similares que no están asociadas necesariamente con el tumor. c) Citocinas En una modalidad, las construcciones inmunoterapéuticas anti-tumorales de la invención incorporan una porción efectora celular que de preferencia es una citocina. El componente efector de los agentes terapéuticos anti-tumorales de la invención puede comprender cualquiera de una variedad de citocinas para inducir una respuesta biológica de citocina-especifica por una célula que porta un receptor para la citocina. Las citocinas están bien caracterizadas, y por lo tan o, la invención no pretende estar limitada de esta forma. Las citocinas incluyen como una subclase las moléculas denominadas como quimiocinas. En el contexto de la presente invención, una quimiocina se considera un miembro de la superfamilia de citocinas. Por lo tanto, el término citocina, en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere genéricamente tanto a citocinas como a quimiocinas. Para una descripción de las técnicas de citocina, véase Callard and Gearing, The Cytokine Facts Book, Academic Press, Inc., 1994. Para una descripción de las técnicas de quimiocina, véase Vaddi et al, The Chemokine Facts Book, Academic Press, Inc., 1997. Muchas de las secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos relacionadas con las citocinas están disponibles de las bases de datos públicas que se pueden accesar vía el Internet a través de diversos servicios, es decir, el NCBI (Centro Nacional para la Información de Biotecnología; www3. ncbi . nlm. ni . gov) y se identifican en general por el nombre y el número de acceso (algunos ejemplos no limitantes de acceso para la información de secuencia citados en la presente se refieren a esto por el comentario "véase el acceso" con referencia al número de identificación. Las citocinas provenientes de mamíferos pueden ser especies específicas y también pueden variar dentro de una especie debido a mutación y/o variación alélica. Una citocina adecuada se puede seleccionar para utilizarse de acuerdo con la especie de mamífero que será tratado. Cuando existen alelos múltiples, la selección se puede realizar de acuerdo con la actividad de la citocina, o una mezcla de variantes alélicas se puede emplear como la citocina de elección. De esta forma, el uso veterinario de los métodos de la invención se puede ajustar a las especies de animales que serán tratados, o a una selección de una citocina proveniente de una especie relacionada más estrechamente si una de las especies blanco no está disponible. Para el tratamiento de humanos, se prefiere que el homólogo humano se utilice en donde se conoce. Las citocinas adecuadas para utilizarse en la presente invención incluyen de manera enunciativa: BDNF (véase el acceso 4502393), CNTF (véase el acceso 4758020), EGF (véase el acceso p01133), Epo (véase el acceso 4503589), FGF (véase el acceso CAB61690), Flt3L, G-CSF (véase el acceso CAA27290), GM-CSF (véase el acceso 4503077), I-309/TCA-3, gamma-IP-10 (véase el acceso P027/8), IFN alfa (véase el acceso P01563), IFN beta (véase el acceso P01574), IFN gamma (véase el acceso P01579), IL-1 a través de IL-18 (véase el acceso P01583, P01584, P01585, P08700, P05112, P05113, P05231, P13232, P41324, P15248, P22301, P20809, P29459, P46658, P35225, P40222, P40933, Q14005, NP002181, Q14116), LIF (véase el acceso AAC05174), LT (véase el acceso 4504031), MCP-1 a través de MCP-3, M-CSF (véase el acceso 4503075), MIF (véase el acceso 4505185), MlPlalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NGF (véase el acceso 4505391), NT-3 (véase el acceso P20783), NT-4 (véase el acceso P34130), OSM (véase el acceso P13725), PBP (véase el acceso 4505621), PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF (véase el acceso P21583), TGF alfa (véase el acceso P01135), TGF beta (véase el acceso P01137), TNF alfa (véase el acceso P01375), Tpo (véase el acceso P40225) o VEGF (véase el acceso AAD03710) . Las quimiocinas adecuadas para utilizarse en la invención incluyen de manera enunciativa: CIO (véase el acceso P33861), ?MF-1 (véase el acceso P08317), ENA-78 (véase el acceso A55010), Eotaxina (véase el acceso BAA84579), GCP-2 (véase el acceso P80162), HCC-1 gl004267), 1-309 (véase el acceso g4506833), IL-8 (véase el acceso AAA59158), IP-9 (véase el acceso CAA75510), IP-10 (véase el acceso 4504701), Linfotactina (véase el acceso 4506853), MCP-1 (véase el acceso 4506841), MCP-2 (véase el acceso P80075), MCP-3 (véase el acceso CAB59723.1), MCP-4 (véase el acceso Q99616 MGSA (véase el acceso P09341), MIG (véase el acceso P35625), MlP-lalfa (véase el acceso P10855), MlP-lbeta (véase el acceso P13236), MIP-2, NAP-2 (véase el acceso P20775), PF4 (véase el acceso 4505733) , FA TES (véase el acceso 4506847), SCM-1 (véase ei acceso P47992) o SDF1 (véase el acceso P48061). L a s citocinas preferidas para utilizarse en la presente invención incluyen IL-2 e IL-12, o fragmentos biológicamente activos de las mismas, que retienen al menos una porción de la actividad efectora de la molécula intacta completa.

Una citocina preferida para utilizarse en la invención es IL-2. Las citocinas adecuadas, para utilizarse en los métodos de la invención, se pueden preparar de la secuencia de ácido nucleico adecuada utilizando técnicas biológicas moleculares estándar. Los métodos para la expresión de genes son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Goeddel, D. V. editor, Methods in Enzymology Vol 185: Gene Expressi on Technol ogy (Academic Press, Inc., NY NY, 1991). Las citocinas también están disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma, St. Louis MO) . d) Inmunoterapéutico anti-tumoral/citocina Estos agentes inmunoterapéuticos antitumorales adecuados para practicar la invención incorporan un componente célula-efector que de preferencia es una citocina, unido a un componente blanco tumoral. El enlace de un componente que se une al tumor con el componente efector se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos. 1 ) Proteinas de fusión al anticuerpo Se han descrito reactivos anti-cáncer inmunoterapéuticos que se dirigen a la función de citocina para una célula o tejidos que portan los antigenos tumorales, y al utilizar la citocina con lo cual reclutar una respuesta inmune contra células portadoras, o asociadas con el antígeno tumoral. Estos agentes inmunoterapéuticos se denominan como proteínas de fusión de antígeno/citocina antitumorales debido a que la proteína de fusión comprende una fusión de una citocina con una cadena polipeptídica de inmunoglobulina (Ig) recombinante que reacciona inmunológicamente con un antígeno asociado con el tumor preseleccionado. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el agente de la proteína de fusión con antígeno/citocina anti-tumoral, inmunoterapéutico abarca las construcciones de fusión entre los fragmentos de proteína del anticuerpo que comprende al menos una porción de unión con el antígeno y citocinas que comprenden al menos una porción efectora de la citocina suficiente para retener la función de señalización biológica con citocina. Las proteínas de fusión de la invención se pueden dirigir o se pueden puentear mediante un péptido o péptidos enlazantes. Las proteínas de fusión con antígeno/citocina anti-tumoral son conocidos en la técnica, y en particular están descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,650,150 (Gillies), las exposiciones de las mismas que se relacionan con la preparación y uso de las proteinas de fusión se incorporan expresamente en la presente como referencia.

La proteína de fusión se puede dirigir a cualquiera de una variedad de antígenos turaorales que son antígenos superficiales celulares y de esta forma la invención no pretende estar limitada. Por ejemplo, se sabe de la preparación de una proteína de fusión que utiliza una citocina y una cadena pesada de Ig, como es la preparación de una cadena pesada de Ig recombinante derivada de un anticuerpo monoclonal. Adicionalmente, la preparación de anticuerpos monoclonales es una técnica determinada, y se sabe la forma de preparar estos anticuerpos contra antígenos tumorales. Las enseñanzas que se relacionan con la preparación de anticuerpos monoclonales incluyen "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy", Alan R. Liss, Inc., eds, Reisfeld and Sell, 1985. Típicamente, la cadena polipeptidica de Ig es un polipéptido de cadena pesada o ligera de Ig que comprende una región variable N terminal específica para una célula que porta un antígeno tumoral superficial celular. La proteína de fusión típicamente tiene el polipéptido Ig unido al término carboxi mediante un enlace peptídico para el aminoácido aminoterminal de la citocina. Cuando el polipéptido Ig es una cadena pesada, la cadena pesada de Ig tipicamente comprende además dominios CH1 y CH2 y puede contener además opcionalmente un dominio CH3. Sin embargo, si se desea, estos dominios de región constante se pueden eliminar para reducir la inmunogenicidad, del tamaño o la unión no específica de la construcción de la proteína de fusión resultante. Con el fin de facilitar la asociación de aluminio de la cadena pesada y ligera, puede ser deseable construir una molécula Fv enlazada, en donde una Fv de cadena pesada se ata a una Fv de cadena ligera. La atadura está entre el extremo carboxi de una cadena para el amino terminal de la otra, y es tan grande que no altera estéricamente de manera importante el grupo que une al antígeno después de la asociación de repliegue/dominio. Una proteína de fusión preferida comprende la citocina IL-2 y una cadena pesada Ig que reacciona inmunológicamente con el antígeno GD2 asociado con el tumor. En otra modalidad, una proteína de fusión preferida comprende la citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antígeno Ep-CAM asociado con el tumor (también conocido como antígeno KSA, KS1/4). Ejemplos de proteínas de fusión de estas modalidades se describen más adelante como chl4.18-IL-2 y KS1/4-IL-2, respecti amente . 2 ) Conjugados de anticuerpo Las construcciones inmunoterapéuticas alternativas se pueden utilizar en los métodos y composiciones de la invención. Por ejemplo, la utilización del sistema de biotina-avindina de alta afinidad, proteínas biotiniladas independientes que comprenden una cadena de anticuerpo específica del antigeno asociado con el tumor unida a biotina (o avidina), y se puede construir utilizando el enlace adecuado una citocina enlazada al conjugado adecuado (avidina o biotina) . En uso, una proteína de anticuerpo biotinilada se puede combinar con la proteína de citocina in vi tro o in vi vo , antes o después de la administración para crear el agente inmunoterapéutico bi-funcional que tiene un componente de unión al antígeno tumoral y un componente de citocina efector, enlazado por el complejo biotina-avidina . Los anticuerpos biotinilados y las proteínas son conocidos en la técnica, y se pueden preparar utilizando reactivos disponibles comercialmente. Una caracteristica de la utilización de un anticuerpo blanco de antígeno tumoral biotinilado es que la molécula de biotina tiene múltiples sitios de unión con la avidina, lo cual permitirá una mayor potenciación del componente efector, tal como por ejemplo una citocina enlazada a avidina, a cada anticuerpo unido o el uso combinado de más de un componente efector. Otros métodos de conjugación química directos y reactivos también se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de conjugación para moléculas efectoras, ya sea directamente, o con un enlazante intermedio. (Véase por ejemplo, Haugland and You, in Methods in Molecular Biology Vol. 80: Immunochemi ca l Protocols, 2nd ed. (Pound, J. D. editor, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) capitulo 17; y Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996) ) . De esta forma, los agentes inmunoterapéuticos de la invención también abarcan las construcciones biotiniladas, como se describió anteriormente, entre los fragmentos de proteína de anticuerpo que comprenden al menos una porción de unión al antígeno y citocinas que comprenden al menos una porción efectora de la citocina suficiente para retener la función de señalización biológica de la citocina . e ) Otros inmunoterapéuticos Los agentes inmunoterapéuticos anti-tumorales adecuados para utilizarse en los métodos, composiciones y equipos que incorpora la invención pueden incluir una porción efectora que no sea una citocina. Se espera que el componente efector celular también pueda ser una toxina o de otra manera un agente citotóxico para dañar el tumor. Otros agentes terapéuticos anti-tumorales útiles de esta forma pueden incluir construcciones entre fragmentos proteínicos de anticuerpo que comprenden al menos una porción de unión al antígeno y radioisótopos, inmunotoxina, péptido citotóxico o fármacos citotóxicos. 1 ) Anticuerpo radiomarcado Los radioinmunoconjugados que comprenden el anticuerpo monoclonal blanco para el tumor y el isótopo radio-marcado se han utilizado como agentes anti-cáncer. La especificidad de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal proporciona la capacidad blanco para localizar los sitios tumorales, mientras que el radio-marca e proporciona las propiedades citotóxicas. (Véase, Hermanson, G. T. Bioconj ugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996) capítulo 8.) Estos radios inmunoconj ugados pueden ser adecuados para utilizarse como un agente terapéutico anti-tumoral en los métodos de la invención. 2 ) Inmunotoxina-anticuerpo Los conjugados de los anticuerpos monoclonales y las toxinas proteinicas derivadas de una variedad de fuentes también han sido probados para tratamientos anti-tumora les . (Véase, Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques 'Academic Press, Ny NY, 1996) capítulo 8.) Estos conjugados pueden ser adecuados para utilizarse -- los métodos de la invención . 3 ) Citocina-antícuerpo del fármaco Los conjugados de los anticuerpos monoclonales y las toxinas del fármaco químicamente sintetizadas y/o purificadas provenientes de una variedad de fuentes también se pueden utilizar para tratamientos anti-tumorales. (Véase Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996)). Estos conjugados pueden ser adecuados para utilizarse en los métodos de la invención. 4 ) Anticuerpo multi-especí fico La manipulación de fragmentos de anticuerpo generados por digestión enzimática, o al manipular secuencias de ADN codificante, permite la creación de anticuerpos bi-especificos (BsAbs) que son moléculas híbridas que combinan los dos anticuerpos con diferentes especificidades de unión. De esta forma, la unión específica a un tumor blanco se puede combinar con la unión a un producto farmacéutico efector celular (es decir, citocina, fármaco o toxina) para localizar el tratamiento de las células tumorales. (Véase, por ejemplo, French, R. R., in Methods in Molecular Biology Vol. 80: Immunochemi ca l Pro tocol s , 2nd ed. (Pound, J. D. editor, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 19^8) capítulo 12.) Este anticuerpo bi o de otra manera multifuncional puede ser adecuado para utilizarse en los métodos de la invención. 2. Métodos terapéuticos Los métodos terapéuticos de la presente invención para tratar células tumorales en tumores y metástasis tumoral se basan en el uso combinado de la terapia para inhibir la angiogénesis (anti-angiogénesis ) y la inmunoterapia anti-tumoral. Se puede utilizar más de un tipo de agente para inhibir la angiogénesis en combinación con más de un tipo de agente inmunoterapéutico anti-tumoral. El uso combinado se puede presentar simultáneamente, secuencialmente o con la intervención de un periodo de tiempo entre los tratamientos. Cualquiera de los agentes terapéuticos específicos se puede administrar más de una vez durante un curso' de tratamiento. El método de la invención proporciona el uso combinado de agentes terapéuticos para inhibir la angiogénesis y agentes inmunoterapéuticos anti-tumorales que pueden dar por resultado en una potenciación sinérgica del efecto de inhibición de la proliferación celular de tumores de cada agente terapéutico individual, que proporciona un tratamiento más efectivo que el encontrado al administrar un componente individual solo. De esta forma, en un aspecto, el método de la invención abarca administrar a un paciente, en combinación, una cantidad de un agente para inhibir la angiogénesis y un agente inmunoterapéutico anti-tumoral que podria no resultar en una inhibición de angiogénesis eficaz, o una actividad celular anti-tumoral si se proporciona en esa cantidad sola. El método de la invención comprende una variedad de modalidades para practicar la invención en los términos de los pasos. Por ejemplo, el antagonista y el agente inmunoterapéutico antitumoral (tal como por ejemplo, una proteína de fusión antígeno/citocina tumoral en una modalidad preferida) se puede administrar después de una mezcla, es decir, simultáneamente, o se puede administrar secuencialmente, es decir, por separado. Además, el antagonista y la proteina de fusión se pueden administrar por separado dentro de un intervalo de tiempo de aproximadamente 3 semanas entre las administraciones, es decir, prácticamente de inmediato después de que se administra el primer agente activo hasta aproximadamente 3 semanas después de que se administra el primer agente. Adicionalmente, se contempla que el orden puede variar, es decir, que el antagonista avß3 se podría administrar antes de la administración de la proteina de fusión o que la administración se puede conducir en el orden inverso. En una modalidad, el método de la invención también abarca administrar a r paciente que necesita del tratamiento de tumores : metástasis una cantidad para inhibir la angiogénes s de un agente para inhibir la angiogénesis, tal como por ejempio, un antagonista avß3, una cantidad de un agente inmunoterapéutico anti-tumoral suficiente para producir una respuesta biológica. Por ejemplo, suficiente para producir una respuesta biológica específica a la citocina en donde una proteína de fusión bifuncional tiene una citocina y una cadena polipeptidica de inmunoglobulina (Ig) recombinante, en donde la cadena Ig comprende una región variable específica para una célula tumoral que porta un antígeno superficial celular asociado con el tumor, y en donde la cadena Ig está unida mediante un enlace peptídico a la citocina. Y en donde un agente inmunoterapéutico comprende un agente citotóxico, la cantidad puede ser tal para producir una respuesta ci totóxica-biológica en células tumorales blanco. En otra modalidad, la invención se puede practicar junto con procedimientos quirúrgicos en donde las porciones o toda la masa tumoral se ha eliminado. Con respecto a esto, el método se puede practicar siguiendo un procedimiento quirúrgico. Alternativamente, el procedimiento quirúrgico se puede practicar durante el intervalo entre la administración del primer agente activo y el segundo agente activo. Un ejemplo de este método es la combinación del método actual con la eliminación quirúrgica del tumor descrita más adelante. El tratamiento de acuerdo con el método típicamente comprenderá la administración de las composiciones terapéuticas en uno o más ciclos de administración. Por ejemplo, en donde se practica una administración simultánea, una composición terapéutica que comprende tanto un antagonista avß3 y un agente inmunoterapéutico anti-tumoral se administra durante un periodo de tiempo de entre aproximadamente 2 dias y 3 semanas en un ciclo individual. En lo sucesivo, el ciclo de tratamiento se puede repetir según sea necesario de acuerdo con la opinión del médico. De manera similar, en donde se contempla una aplicación secuencial, el tiempo de administración para cada agente terapéutico individual se ajustará para cubrir típicamente el mismo periodo de tiempo. El intervalo entre los ciclos puede variar de entre aproximadamente cero y 2 meses . La administración se puede llevar a cabo mediante dosis unitarias periódicas, mediante infusión continua, mediante suministro peristáltico, mediante inyección en bolos y lo semejante. Las rutas pueden incluir inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular, ortotópica, infusión ortotópica, aplicación oral y lo semejante. Una composición terapéutica utilizada en un método de esta invención comprende el agente activo en un portador farmacéuticamente aceptable, como es bien sabido, y por lo tanto la invención no pretende limitarse con respecto a la composición siempre y cuando la concentración de los agentes activos en la composición sea suficiente para suministrar (administrar) el agente activo mencionado en las cantidades descritas en la presente. Típicamente, la dosis del agente inmunoterapéutico anti-tumoral, tal como por ejemplo, una proteína de fusión antígeno blanco/citocina es de 0.01 mg a 10 mg, de preferencia entre aproximadamente 0.1 y 1 mg y de mayor preferencia de entre aproximadamente 0.6 mg per kilogramo de peso corporal por día. La dosis del agente inmunoterapéutico antitumoral, tal como por ejemplo un agente citotóxico blanco del antígeno puede ser típicamente de 0.01 mg a 10 mg, de preferencia entre aproximadamente 0.1 y 1 mg, y de mayor preferencia de aproximadamente 0.6 mg por kilogramo de peso corporal por dia, en donde la dosis de radiación se puede ajustar adecuadamente dependiendo de la dosis de radiación deseada. Se ha encontrado que los isótopos adecuados para el tratamiento por radiación incluyen 57-Cobalto; 67-Cobre; 99m-Tecnecio; 123-Ioduro; 131-Ioduro; y 111-Indio, y lo semejante. Los productos radiofarmacéuticos y las dosis variaran dependiendo del radioisótopo y el tejido blanco. La terapia por inmunorradiación de neoplasmas malignos se puede utilizar a dosis mayores que la terapia por radiación tradicional, ya que el agente inmunoterapéutico se dirige al sitio del tumor y/o la célula. Por ejemplo, el tratamiento del linfoma que no es de Hodgkin B-celular con un agente radioinmunoterapéutico que se dirige a las células B se encontró que tiene una dosis máxima tolerada de 0.4 mCui/kg de peso corporal (1 mCui = 37 Mbq) . (Witzig, TE et al., (1999) "Phase I/II trial of IDEC-Y2B8 radioimmunotherapy for treatment of relapsed or refractory CD20 (+) B-cell non-Hodgkin ' e lymphoma" J. Clin. Oncol. 17 (12): 3793-803. Sin embargo, la radioinmunoterapia blanco para tumor específico o metástasis tumoral puede permitir dosis mayores toleradas, que el tratamiento " de linfomas. En ratones desnudos, se toleró la administración de dos dosis de 18.5 Mbq de anticuerpo marcado con Indio 111. (Saga T, et al., (1999) "Radioimmunotherapy of human glioma xenografts in nude mice by indium-111 labelled internalising monoclonal antibodi" Eur. J. Cáncer 35(8): 1281-5). La dosis típica de un antagonista avß3 es de 10 mg a 1000 mg, de preferencia de aproximadamente 20 a 100 mg, y de mayor preferencia de aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por día. Se debe entender que el cáncer se encuentra en todo el reino animal y que los principios descritos en la presente se aplican a todos los animales en donde se pueda inhibir la angiogénesis mediante un antagonista avß3 y esas citocinas en el sistema inmune. De esta forma se considera que la invención se puede practicar en todos los mamíferos y particularmente en seres humanos. Además, se sabe que existe una amplia variedad de tumores que requieren de vascularización con el fin de crecer y por lo tanto son candidatos para la modalidad de terapia combinada- de los métodos de la presente. Los tumores que pueden dar por resultado en crecimientos que inducen la angiogénesis incluyen tumores que surgen de tejidos neuroectodérmicos , epiteliales y lo semejante. Ejemplos de tumores y metástasis tumoral incluyen adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hamartoma, hemangioendotelioma , hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma , melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, teratoma y tumores semejantes. 3. Sistemas terapéuticos En una modalidad, la invención contempla sistemas que comprenden -caque y/o equipo que proporciona los reactivos r -"esarios para practicar los métodos de la presente invención. Un equipo para tratar células tumorales en un tumor o metástasis tumoral comprende un paquete de: a) un agente para inhibir la angiogénesis tal como un antagonista avß3 capaz de inhibir la angiogénesis en el tumor o metástasis tumoral; b) un agente inmunoterapéutico antitumoral, tal como por ejemplo un reactivo de proteína de fusión bifuncional que tiene una citocina y una cadena polipeptídica de inmunoglobulina (Ig) recombinante en donde la cadena Ig comprende una región variable específica para una célula tumoral que porta un antigeno superficial celular asociado; con el tumor, en donde la cadena Ig está unida mediante un enlace peptídico a la citocina; y c) instrucciones para utilizar los reactivos en los métodos para tratar tumores y metástasis tumoral. Un reactivo en un equipo de esta invención típicamente se formula como una composición terapéutica según se describe en la presente, y por lo tanto puede ser cualquiera de una variedad de formas adecuadas para distribución en un equipo. Estas formas pueden incluir un líquido, polvo, tableta, suspensión y una formulación semejante para proporcionar el antagonista y/o la proteína de fusión de la presente invención. Los reactivos se pueden proporcionar en los recipientes por separado adecuados para la administración por separado de acuerdo con los métodos de la presente, o alternativamente se pueden proporcionar en una composición en un recipiente individual en el paquete.

De manera similar, este paquete puede contener en lugar de, o en adición a los componentes descritos anteriormente, cualesquiera otros agentes inmunoterapéuticos anti-tumorales, tales como los descritos anteriormente. El paquete puede contener una cantidad suficiente para una o más dosis de reactivos de acuerdo a los métodos de tratamiento descritos en la presente. Tipicamente, un paquete contendrá una cantidad suficiente para un ciclo de tratamiento como se describe en la presente. Las etiquetas del paquete pueden indicar el uso combinado o secuencial de los reactivos contenidos para el tratamiento terapéutico del tumor y/o la metástasis, de acuerdo con los métodos de la invención. Estas etiquetas del paquete se pueden fijar a cada frasco de reactivo y/o al paquete completo de materiales. Un equipo de esta invención también contiene "instrucciones de uso" de los materiales contenidos en el paquete. Las instrucciones se relacionan con el método del uso combinado del antagonista y la proteína de fusión para tratar un tumor o metástasis tumoral de acuerdo con los métodos de la invención. En lo que respecta a los métodos, éstos pueden variar ampliamente dependiendo del tumor, el paciente y la condición de la enfermedad, por consiguiente, las instrucciones pueden variar para especificar los procedimientos de administración. La invención no se considera como limitante para la naturaleza de las instrucciones distintas de las que se relacionan particularmente con el uso combinado del antagonista y la proteina de fusión de acuerdo con los métodos de la presente invención. De manera similar, los reactivos pueden incluir agentes citotóxicos inmunoterapéuticos antitumorales, tales como per ejemplo el anticuerpo de unión al antigeno tumoral unido al isótopo radio-etiquetado, o un agente citotóxico tal como por ejemplo un péptido citotóxico o fármacos citotóxicos y lo semejante. 4. Preparación de péptidos sintéticos a . Procedimiento de síntesis Los polipéptidos lineales y cíclicos listados en la siguiente Tabla 1, se sintetizaron utilizando técnicas de síntesis en fase sólida estándar como, por ejemplo, los descritos por Merrifield, RB, (1969) "Solid-Phase Peptide Synthesis", Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol Biol., 32:221-96; Merrifield, RB, (1969) "The synthesis of biologically active peptides and proteins", JAMA 210 (7):1247-54; y Fields, G. B. and Noble, R. L . , (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res., 35(3): 161-214. En primer lugar se disolvieron dos gramos (g) de BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO 1) en 60 mililitros (ml) de metanol al cual se agregaron 1.5 ml de solución de hidróxido de sodio 2 N para formar una mezcla. La mezcla se agitó entonces durante 3 horas a 20 grados C (20°C) . Después de la evaporación, el residuo se extrajo en agua, se hizo ácido a pH 3 con HCl diluido y se extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó sobre Na2S04, se evaporó nuevamente y la BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 2) resultante se agitó a 20°C durante 2 horas con 20 ml de HCl 2 N en dioxano. La mezcla resultante se evaporó para obtener H-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 3) que se disolvió posteriormente en una mezcla de 1800 ml de diclorometano y 200 ml de dimetilformamida (DMF) seguido por enfriamiento a 0°C. Después de esto, se agregaron 0.5 g de diciciohexilcarbodiimida (DCCI), 0.3 g de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y 0.23 ml de N-metilmorfolina sucesivamente con agitación. La mezcla resultante se agitó durante unas 24 horas más a 0°C y luego a 20°C durante otras 48 horas. La solución se concentró y se trató con un intercambiador iónico de lecho para liberarla de las sales. Después la resina resultante se eliminó por filtración, la solución clarificada se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía lo que dio por resultado en la recuperación de ciclo (Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 4) .

Los siguientes péptidos, listados en la Tabla 1 que utilizan abreviaciones de residuos de aminoácidos con código de una sola letra y se identifican mediante una designación numérica del péptido, se obtuvieron análogamente: ciclo (Arg-Gly-Asp-DPhe-Val) (SEQ ID NO 5); ciclo (Arg-Ala-Asp-DPhe-Val) (SEQ ID NO 6); ciclo (Arg-DAla-Asp-Phe-Val ) (SEQ ID NO 8); ciclo (Arg-Gly-Asp-Phe-DVal) (SEQ ID NO 7); y ciclo (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (en donde el tratamiento con metilo está en el alfa-aminonitrógeno del enlace amida del residuo de valina) (SEQ ID NO 11) . Un péptido designado como 66203, que tiene una secuencia idéntica a la del péptido 62184, únicamente se difiere del último por contener una sal de HCl en lugar de la sal de TFA presente en 62184 (SEQ ID No. 5) . Lo mismo es verdadero para los péptidos 69601 y 62185 (SEQ ID No. 6) y para 85189 y 121974 (SEQ ID No. 11) . b . Procedimiento de síntesis alternativa i . Síntesis de la sal TFA de ciclo- (Arg-Gly-Asp.-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) La Fmoc-Arg (Mtr) -Gly-Asp (OBut) -DPhe-NMeVal- ONa (SEQ ID No. 14) se sintetizó utilizando procedimientos del tipo Merrifield en fase sólida al agregar secuencialmente NMeVal, DPhe, Asp (OBut), Gly y Fmoc-Arg (Mtr) de una forma por pasos a una resina de 4-hidroximetil-fenoximetil-poliestireno (resina del tipo Wang) (se aplicaron los métodos del tipo Merrifield acostumbrados para la síntesis del péptido) . La resina de poliestireno y los precursores de los residuos de aminoácidos (están disponibles comercialmente de las compañías químicas Aldrich, Sigma o Fluka). Después de terminar la adición secuencial de los residuos de aminoácido, la resina se eliminó entonces de la cadena peptídica utilizando una mezcla 1:1 de TFA/diclorometano que proporciona el producto Fmoc-Arg (Mtr ) -Gly-Asp (OBut ) -DPhe-NMeVal-OH (SEQ ID No. 15) . El grupo Fmoc se eliminó entonces con una mezcla 1:1 de piperidina/DMF que proporcionó el precursor Arg (Mtr) -Gly-Asp (OBut ) -DPhe-NMeVal-OH crudo (SEQ ID No. 16) que luego se purificó mediante HPLC en la forma acostumbrada. Para la ciclización, se diluyó una solución de 0.6 g de Arg (Mtr ) -Gly-Asp (OBut ) -DPhe-NMeVal-OH (sintetizada anteriormente) (SEQ ID No. 16) en 15 ml de DMF (dimetilformamida; Aldrich) con 85 ml de diclorometano (Aldrich), y se agregaron 50 mg de NaHC03. Después de enfriar en una mezcla de hielo seco/acetona, se agregaron 40 µl de azida de difenilfosforilo (Aldrich) después de permanecer a temperatura ambiente durante 16 horas, la solución se concentró. El concentrado se filtró en gel (columna Sephadex G10 en isopropanol /agua 8:2) y luego se purificó mediante HPLC de la forma acostumbrada. El tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético) /H20 (98:2) proporcionó la ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal ) (también denominada como "ciclo (RGDfN-MeV) " de la presente; SEQ ID NO 11) x TFA que luego se purificó mediante HPLC de la forma acostumbrada; TA = 19.5; FAB-MS (M+H) : 589. ii. Síntesis de "sal interna" La sal de TFA se eliminó del péptido cíclico producido anteriormente al suspender la ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) x TFA en agua seguida por la evaporación al vacio para eliminar el TFA. El péptido cíclico formado se denominó como una "sal interna" y se designó ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) . El término "sal interna" se utiliza debido a que el péptido cíclico contiene dos residuos cargados opuestamente los cuales se contra equilibran intra-electrónicamente entre sí para formar una molécula no cargada total. Uno de los residuos cargados contiene una entidad acida y el otro residuo cargado contiene una entidad amino. Cuando la entidad acida y la entidad amino están en proximidad cercana entre sí, la entidad ácido se puede desprotonar mediante la entidad amino que forma una especie carboxilato/sal de amonio con una carga neutra total. iii . Tratamiento con HCl para proporcionar la ciclo- (Arg-Gly- Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) Se disolvieron 80 mg de ciclo- (Arg-Gly-A=p-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) en HCl 0.01 M de cinco a seis veces y se liofilizó después de cada operación de disolución. La purificación subsecuente mediante HPLC proporcionó la ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal ) (SEQ ID NO 11) x HCl; FAB-MS (M+H) : 589. iv. Tratamiento con ácido metansulfónico para proporcionar ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) x MeSQ3H Se disolvieron 80 mg de ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) en MeS03H 0.01 M (ácido metansulfónico) de cinco a seis veces y se liofilizaron después de cada operación de disolución. La purificación subsiguiente mediante HPLC proporcionó la ciclo- (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO 11) x MeS03H; TA = 17.3; FAB-MS (M+H): 589. Los métodos al rna ivos de ciclización incluyen la derivación de ca er.as de grupo lateral de un precursor de péptido acrilico con entidades sulfhidplo y cuando se exponen a condiciones ligeramente superiores que las de pH fisiológico normal (pH 7.5), intramolecularmente forma enlaces disulfuro con otros grupos sulfhidrilo presentes en la molécula para formar un péptido cíclico. Adicionalmente, la entidad carboxilato C terminal de un precursor péptido aciclico puede hacerse reaccionar con una entidad sulfhidrilo libre presente dentro de la molécula para producir péptidos ciclizados con tioéster.

Tabla 1 Designación Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO del péptido 62181 ciclo (GrGDFV) 4 62184 (66203*) ciclo (RGDfV) 5 62185 (69601*) ciclo (RADfV) 6 62187 ciclo (RGDFv) 7 62186 ciclo (RaDFV) 8 62175 ciclo (ARGDfL) 9 62179 ciclo (GRGDfL) 10 121974 (85189*; ciclo (RGDfN-MeV) 11 112784 ciclo (RGEfN-MeV) 12 135981 ciclo (RADfN-MeV) 13 * Los péptidos designados con un asterisco se preparan en HCl y son idénticos en secuencia al péptido designado en la misma línea; los péptidos sin un asterisco se preparan en TFA. Las letras minúsculas indican un D-aminoácido; las letras mayúsculas indican un L-aminoácido . 5. Generación y caracterización de fusión de anticuerpo-citocina tumor-específico a . Proteínas y antagonista av de integrina para vasculatura específica La construcción y caracterización de proteínas de fusión anti-citocina chl4.18-IL-2 y huKSl/4-IL-2 se describieron anteriormente (Xiang, R., et. al., (1997); Gillies, S., et. al., (1992) supra ) . Las características de unión al antígeno de ambas construcciones fueron idénticas a aquellas de sus respectivos anticuerpos y la actividad EL-2 específica fue equivalente al rhIL-2 disponible comercialmente. El péptido 121974 cíclico antagonista avß3 de integrina (ciclo (RGDfN-MeV) ) (SEQ ID NO 11) y el péptido 135981 control (ciclo (RADfN-MeV) (SEQ ID NO 13) se sintetizaron y caracterizaron. 6. Líneas celulares y modelos animales Todas las lineas celulares y los modelos animales respectivos se establecieron substancialmente como se describió anteriormente (Becker, J. C, et. al., (1996); Xiang, R., et. al., (1996); Lode, H. N., et. al.; (1998) s upra ) . La ausencia de células avß3 sobre NXS2 y CT26-KSA de integrina se demostró utilizando un anticuerpo CD61 de anti-ratón (cadena ß3 de integrina) (Pharmingen, La Jolla, CA) . Ambas líneas celulares no revelaron señal (1 µg de células CD61 mAb/106 de anti-ratón) en análisis FACS en contraste con células de melanoma murino avß3-positivo B16FG3 y B78-D14 de integrina utilizadas como controles positivos. Además, las células NXS2 fueron incapaces de adherirse a la recubierta plástica con CD61 mAb antí-ratón (10 µg/ml 4°C, 24h) en contraste con el anticuerpo anti-GD2 chl4.18 (10 µg/ml, 4°C, 24h) utilizado como control positivo. Sin embargo, todas las células tumorales expresan la integrina av mediante FACS y se adhieren sobre la vitronectina, lo que indica la presencia de la integrina avßs. Para todos los procedimientos quirúrgicos, los ratones se anestesiaron por inyección de cetamina (100 mg/kg i.p.) e inhalación simultánea de metofano ( Pitman-Moore, Mundelein, IL) . Se utilizaron bombas osmóticas (Alzet®, modelo 2001, Palo Alto, CA) , para la administración del antagonista av de integrina y el péptido control a una velocidad de suministro de 17.5 µg/h estas bombas se manejaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se implantaron en el tejido subcutáneo dorsal bajo condiciones estériles. Todas las bombas se reemplazaron el día 7 después de la implantación y se retiraron en el día 10 del tratamiento anti-vascular . Todos los experimentos animales se realizaron de acuerdo con la guí a NIH para el Cuidado y el Uso de Animales de Labora torio . 1 . Histología e inmunohistoquímica Se incubaron secciones congeladas, fijadas con acetona de tumores primarios con suero de cabra al 4% para bloquear la unión no específica. Las incubaciones con mAbs anti-ratón CD31 y anti-ratón CD45 (Pharmingen, La Jolla, CA) (1:100) y la tinción subsecuente con anticuerpo anti-rata de cabra marcado con rodamina (1:300) se realizaron en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Cada incubación fue seguida por lavados con PBS (3 veces) . Los conteos de vasos y leucocitos por campo de alta potencia (HPF) se determinaron microscópicamente a un aumento de 200x (Brooks, P. C, et. al., (1995) "Anti-integrin alfa v beta 3 blocks human breast cáncer growth and angiogenesis in human skin", J. Clin. Inves. 96, 1815-1822) . Las áreas representativas se fotografiaron a 200x (vasos) y 800x (leucocitos) respectivamente. 8. Retiro de tumores primarios únicamente en ratones tratados con integrina av, antagonista combinado con proteínas de fusión del anticuerpo IL-2 El efecto sinérgico de la terapia para inhibir la angiogénesis (antagonista de integrina av) y la inmunoterapia (proteínas de fusión de anticuerpo IL-2) se determinó en ratones con tumores subcutáneos determinados (110-130 µl) en los tres modelos singeneicos, respectivamente.

La Figura 1, representa gráficamente el efecto de una terapia combinada con el antagonista de integrina av anti-angiogénico y la inmunoterapia por compartimiento-específica inmunoterapéutica anti-tumoral con proteínas de fusión anticuerpo-IL-2 en tumores primarios. La Figura 1A representa los resultados de los tumores primarios inducidos por inyección subcutánea (2xl06) de neuroblastoma NXS2. La Figura IB representa los resultados de los tumores primarios inducidos por inyección subcutánea (2xl06) de carcinoma de colon CT26-KSA. La Figura 1C representa los resultados de tumores primarios inducidos por inyección subcutánea (2xl06) de células de melanoma B78-D14. El tratamiento de tumores determinados (110-130 mm3) se inició por inyecciones intravenosas diarias de las proteínas de fusión anticuerpo-IL-2 tumorales-especificas huKSl/4-IL-2 (10 µg de carcinoma de colon) y chl4.18-IL-2 (5 µg de neuroblastoma, 10 µg de melanoma) (5 veces) e infusión subcutánea continua del antagonista de integrina av de vasculatura específica o el péptido control con una bomba osmótica durante 7 días a 17.5 µg/h (parte superior) . El tiempo para la iniciación del tratamiento se indica con una flecha negra. El tamaño de los tumores primarios de los ratones en cada grupo experimetal (n=6) se determinó por mediciones de microcalibrador (anchura por longitud por anchura/2) (media + error estándar) . El regreso en el tamaño del tumor primario de ratones que recibieron el tratamiento de combinación en comparación con el tamaño de los tumores determinados en el tiempo de iniciación del tratamiento fue estadísticamente significativo en los tres modelos de tumor singeneico diferentes (P < ' 0.001, prueba Wilcoxon Rank-Sum) en contraste con todos los controles (P > 0.05) . En primer lugar, las cantidades subóptimas para cada modalidad terapéutica se establecieron y se inició su uso subsiguiente en combinación. Únicamente los ratones tratados con el antagonista de integrina av y las proteínas de fusión IL-2 se presentaron con una regresión tumoral en los tres modelos que varían de 50 a 90% (P < 0.001). De hecho, la mitad de los animales inoculados con células de neuroblastoma y carcinoma de colon rechazaron por completo sus tumores primarios, datos no mostrados. Esto estuvo en contraste con cada estrategia que se utilizará remo monoterapia que, en el mejor de los casos, r^^rdó el crecimiento en comparación con el grupo -.trol, respectivamente. El efecto de cada modal: ; ¡i de tratamiento y su combinación en los compartimientos vascular y tumoral se analizó posteriormente. Se realizó la histología después de la inmunoterapia antiangiogénica y tumoral-específica combinada de tumores de neuroblastoma primarios determinados, retirados quirúrgicamente 20 días después de la inoculación de células tumorales. En resumen, los tumores primarios fijados con formalina se sometieron a inclusión en parafina y a tinción con hematoxilina/eosina posterior. Se identificaron las áreas necróticas y los infiltrados de leucocito. La Figura 2 representa gráficamente el efecto de terapias inmunoterapéuticas anti-vascular y anti-tumoral combinadas sobre la respuesta inmune a la vascularización y anti-tumoral. Los ratones (n=6) con tumores de neuroblastoma primarios determinados recibieron el tratamiento combinado con antagonista de integrina ce, de vasculatura-especí fico, un péptido no específico control y una proteína de fusión chl4.18-IL-2 tumoral-específica , según se describió para la Figura 1, que incluye controles que reciben cada terapia sola. Al finalizar el tratamiento, los tumores s.c. se retiraron quirúrgicamente. Las secciones congeladas de cada tumor se analizaron por inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos para células endoteliales de vasos sanguíneos (CD-31) y para la infiltración por leucocito (CD-45), respectivamente. La última es un marcador bien establecido para la respuesta inmune por compartimiento-específica tumoral inducida por la proteína de fusión chl4.18-IL-2 (Becker, J.C., et. al., (1996) s upra ; Xiang, R., et. al., (1996) s upra ; Lode, H. N., et. al., (1998) s upra ) .

La Figura 2A representa los resultados para la densidad de vasos sanguíneos de tumores primarios después del tratamiento por compartimiento vascular y tumoral ya sea con la proteína de fusión chl4.18-IL-2, antagonista, de la integrina a, y una combinación de los mismos (*P < 0.001, prueba T de Student). La Figura 2B representa los resultados para la infiltración de leucocitos de tumores primarios después de los tratamientos por compartimiento vascular y tumoral, respectivamente (*P < 0.001, prueba T de Student) . Los ratones que recibieron el antagonista de integrina v mostraron una disminución al 50% de la vascularización (Figura 2) coincidente con un retraso de crecimiento de tumores primarios, que demuestra el blanco efectivo del compartimiento vascular. En este caso, el compartimiento tumoral no se afectó directamente (Figura 1). Por contraste, los ratones tratados únicamente con la proteina de fusión anti-GD2-IL-2, revelaron un infiltrado leucocítico distinto, una característica bien establecida de esta terapia por compartimiento-dirigida anti-tumoral (Becker, J.C., et. al., (1996) - s upra ; Xiang, R., et . al., (1996) s upra ; Lode, H. N., et. al., (1998) s upra ) , que conduce a una reducción substancial en el crecimiento tumoral s.c. (Figura 1). Sin embargo, únicamente los ratones tratados con la combinación del antagonista de integrina av y la proteina de fusión anti-GD2-IL-2 revelaron un aumento en cinco veces de infiltración de leucocitos en el tumor en comparación con los ratones tratados con la proteina de fusión anti-GD2-IL-2 sola y mostraron una disminución similar en la vascularización. El aumento en las células inflamatorias se demostró mediante la histología e inmunoistoquímica y se atribuyó a un influjo de macrófagos, un patrón frecuentemente observado en tejidos necróticos durante la eliminación de desperdicio celular. De hecho, las áreas necróticas estuvieron únicamente presentes en tumores después del tratamiento de combinación en contraste con los controles tratados con cada componente por separado. 9. El blanco vascular y tumoral secuencial y simultáneo induce la erradicación de metástasis hepática espontánea Además de un tratamiento exitoso de tumores primarios, la pregunta más relevante es si las metástasis distantes se afectan por esta estrategia de tratamiento ant i-vascular y anti-tumoral especifica combinada. Esto se enfrenta en el modelo de neuroblastoma, caracterizado por metástasis hepática espontánea. Para este fin, el tratamiento del tumor primario con el antagonista de integrina av ant i-angiogénico se combinó secuencialmente con inmunoterapia anti-tumoral por la proteína de fusión de anticuerpo IL-2. La Figura 3 representa gráficamente el efecto de una combinación secuencial del antagonista de integrina av anti-angíogénico y la inmunoterapia por compartimiento-específica anti-tumoral con la proteína de fusión anticuerpo-IL-2 en metástasis de neuroblastoma hepático espontáneo. El tratamiento ant i-vascular se inició en ratones con tumores primarios determinados, como se describe para la Figura 1 durante un total de 10" días. Después del retiro quirúrgico de los tumores primarios, los ratones que recibieron la inmunoterapia por compartimiento-específica-tumoral por inyecciones i.v. diariamente de 5 µg de la proteína de fusión de chl4.18-IL-2 (5 veces) . El número de metástasis espontánea de hígado se determinó por conteos macroscópicos de focos de hígado (n=8) (**p < 0.01, prueba Wilcoxon Rank-Sum) . Únicamente los ratones tratados secuencialmente con ambos agentes se presentaron con una disminución 1.5-2 log en metástasis hepática en contraste con todos los controles, en donde el tratamiento con cada agente utilizado como monoterapia fue ineficaz (P < 0.01) (Figura 3) . De hecho, 4/8 de los ratones sometidos a la terapia combinada revelaron una ausencia completa de metástasis hepática, mientras que el resto de los animales mostró únicamente 1-5 de pequeñas lesiones metastáticas. En esencia, se obtuvieron resultados similares por combinaciones simultáneas del antagonista de integrina av, con la proteína de fusión chl4.18-IL-2 (parte superior de la Figura 4). La Figura 4 representa gráficamente el efecto de la combinación simultánea del antagonista de integrina av anti-angiogénica y la inmunoterapia por compartimiento-específica anti-tumoral con la proteína de fusión ant icuerpo-IL-2 en metástasis de neuroblastoma hepática espontánea. La metástasis espontánea se indujo después de la inducción de tumores primarios con células de neuroblastoma NXS2 2xl06 s.c. El tratamiento con integrina o, antagonista (17.5 µg/h) y la proteína de fusión chl4.18-IL-2 tumoral-especí fica (5 µgx5) se inició antes (Figura 4A) o después (Figura 4B) de la eliminación del tumor primario. Las metástasis espontáneas de higado se determinaron mediante conteos macroscópicos de focos de hígado (n=8) (*P < 0.01, prueba Wilcoxon Rank-S .r. . Únicamente los rat es tratados con ambos agentes revelaron ya sea .-.a ausencia completa (Figura 4A) o un una dismin-. -.on >1.5 log (Figura 5B) en metástasis hepática, (P < 0.01) dependiendo de su administración antes o después de la eliminación del tumor primario. Esto está en contaste con todos los controles en donde el tratamiento fue ineficaz cuando se utilizó cada agente como monoterapia. 10. Combinación sinérgica y terapia eficaz El rompimiento de vasos sanguíneos en el compartimiento vascular de tumores malignos es una estrategia poderosa para combatir el cáncer. Al tomar como blanco las células endoteliales de la vasculatura tumoral, el tumor se puede tratar exitosamente. Un antagonista peptídico, que toma como blanco la vasculatura a través de la interacción con las integrinas ocv expresadas en vasos sanguíneos angiogénicos (Brooks, P. C. et. al., (1994) Science s upra ; Friedlander, M., et. al., (1995) supra ) suprimió la formación de vasos sanguíneos e hizo retroceder de manera importante el crecimiento tumoral posterior. Esto se demostró mediante el tratamiento de tres tumores primarios que estaban creciendo agresivamente y un tumor espontáneamente por metástasis. Mientras que el antagonista de integrina av utilizado se dirigió principalmente a avß3, éste también se une a la integrina avß3 relacionada estrechamente. Los tumores de carcinoma de colon y neuroblastoma examinados carecieron claramente de avß3, aunque expresaron algo de avß3. El modelo de melanoma también expresa avß3. Sin embargo, el efecto de este antagonista de integrina se restringió claramente a la vasculatura tumoral en los tres modelos animales según se demostró por el modelo de neuroblastoma (Figura 2). De manera importante, el efecto anti-tumoral del blanco de la vasculatura tumoral se amplificó mediante un ataque simultáneo en el compartimiento tumoral, que es eficaz contra ambas metástasis de tumores primarios y espontáneas. Esto es particularmente importante, ya que la eliminación del tumor primario antes del tratamiento para el crecimiento y diseminación aumentados de metástasis de neuroblastoma, un hallazgo bien documentado en otros modelos de tumor debido a la disminución de los niveles en circulación de los inhibidores de angiogénesis después de la escisión del nivel primario (Holmgren, L., et. al., (1995) supra ; Folkman, J., (1995) supra ) . El blanco simultáneo de los comportamientos vascular y tumoral probó ser muy eficaz, ya que combina una disminución en la nutrición de la célula tumoral con la destrucción activa de las células tumorales, que conduce a una regresión de los tumores primarios y la erradicación de metástasis distante. Esto está en contraste con un enfoque por compartimiento-dirigido vascular simple que utiliza dos estrategias de tratamiento anti-angiogénico diferentes que dan por resultado únicamente en la supresión del crecimiento tumoral s.c. en un modelo singeneico (Mauceri, H. J. , et . al., (1998) "Combined effects of angiostatin and ionizing radiation in antitumor therapy", Nature 394, 287-291). En la estrategia de la presente, la respuesta del compartimiento-específica tumoral se media por las células inflamatorias que se activan y se dirigen hacia el microentorno tumoral mediante las proteínas de fusión anticuerpo-IL-2 de tu or-específicas. De manera importante, la estrategia anti-angiogénica, aunque muy eficaz én la supresión del crecimiento de tumores primarios con un suministro vascular bien establecido, carece de una eficacia similar contra micrometástasis distante cuando se utiliza como monoterapia (Figuras 3, 4). Sin embargo, en esta enfermedad residual mínima que se ajusta con pequeñas cargas tumorales caracterizadas por vascularización deficiente, el tratamiento por compartimiento anti-tumoral utilizado en la terapia de combinación es muy eficaz cuando se utiliza como monoterapia (Xiang, R., et. al., (1997) s upra ; Lode, H. N., et. al., (1998) s upra ) . En esta situación, una función del tratamiento anti-angiogénico es para suprimir la neovascularización inducida por micrometást as i s y el alargamiento posterior de los focos metis iticos (Volpert, O. V., et . al., (1998) s upra ) . ? " , a su vez, facilita la erradicación de estas •: -rometástasis mediante terapias por compartimient urigidas tumorales, que son óptimamente eficaces e r. el establecimiento de la enfermedad residual mínima (Becker, J. C., et . al., (1996) s upi a ) . Los tratamientos eficaces de tumores primarios y metástasis diseminada siguen siendo un reto principal en la oncología clínica. Los resultados de este reporte muestran que las combinaciones de anti-angiogénico específico e inmunoterapias sinergizan en la regresión de los tumores primarios y la erradicación de micrometástasis. Ya que ambas modalidades de tratamiento, es decir, los antagonistas de integrina av y las proteínas de fusión anticuerpo-interleucina-2 actualmente están bajo evaluación clínica como monoterapias, la sinergia de su combinación proporciona una herramienta novedosa y eficaz para la terapia del cáncer. Los ejemplos anteriores que describen ciertas modalidades de la invención son ilustrativos y no deben, por supuesto, interpretarse como específicamente limitantes de la invención. Además, estas variaciones de la invención, ahora conocidas o desarrolladas más tarde, que podrían estar dentro del alcance de alguien con experiencia en la técnica se deben considerar dentro del alcance de la presente invención reivindicada en lo sucesivo.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Lode, Holger N Gillies, Stephen D Cheresh, David A Reisfeld, Ralph A The Scripps Research Institute Lexigen Pharmaceuticals Corporation <120> MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES Y METÁSTASIS UTILIZANDO UNA COMBINACIÓN DE TERAPIAS ANTI-ANGIOGÉNICAS E INMUNOTERAPIA <130> tsri6811pc <140> <141> <150> 60/119,721 <151> 1999-02-12 <160> 16 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> BLOQUEADO - BOC <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> ACETILACIÓN - OMe <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: material de partida <400> 1 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> BLOQUEADO BOC <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <223> Descripción de la secuencia artificial primer producto <400> 2 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 2° producto <400> 3 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (6) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (GrGDFV) <400> 4 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (RGDFV) <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (5) <223> ciclo <400> 5 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (5) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (R-ADfV) <400> 6 Arg Ala Asp Phe Val 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Val <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (5) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secue: :ia artificial ciclo (RGDFv) <400> 7 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Ala <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (5) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial ciclo (RaDFV) <400> 8 Arg Ala Asp Phe Val 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (6) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (ARGDfL) <400> 9 Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (6] <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (GRGDfL) <400> 10 Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METILACIÓN, NMeVal <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (5) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (RGDfmV) <400> 11 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD RES <222> (5)" <223> METILACIÓN, NMeVal <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (S) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (RGEfmV) <400> 12 Arg Gly Glu Phe Val 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METILACIÓN, NMeVal <220> <221> CHAIN <222> (1) .. (5) <223> ciclo <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ciclo (RGEfmV) <400> 13 Arg Ala Asp Phe Val 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD RES <222> (1) <223> FORMILACIÓN - FMOC, Mtr <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> OBut <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METILACIÓN, NMeVal, -ONa <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Alt Syn Start Prod <400> 14 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMILACIÓN, FMOC, Mtr <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> -OBut <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METILACIÓN, NMeVal <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Alt Syn Prod <400> 15 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Mtr <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> -OBut <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METILACIÓN, NMeVal <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Alt Syn Product <400> 16 Arg Gly Asp Phe Val 1 5

Claims (51)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un método para tratar una célula tumoral en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad para inhibir la proliferación de la célula tumoral de: a) un agente para inhibir la angiogénesis; y b) un agente inmunoterapéutico anti-tumoral que comprende un componente efector celular y un componente blanco de antígeno asociado con el tumor.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el agente para inhibir la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se administran concurrentemente de manera substancial.
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde el agente para inhibir la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se administran secuencialmente dentro de un intervalo de tiempo de aproximadamente 3 semanas.
4. 4. El método según la reivindicación 3, en donde el agente para inhibir la angiogénesis se administra antes del agente inmunoterapéutico antitumoral .
5. 5. El método según la reivindicación 3, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se administra antes del agente para inhibir la angiogénesis .
6. 6. El método según la reivindicación 3, en donde la administración se efectúa mientras que se retira quirúrgicamente un tumor o metástasis tumoral del paciente durante el intervalo de tiempo.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en donde la administración se efectúa después de haber eliminado quirúrgicamente un tumor o metástasis tumoral del paciente.
8. 8. El método según la reivindicación 1, en donde el agente para inhibir la angiogénesis es un antagonista avß3.
9. 9. El método según la reivindicación 1, en donde el agente para inhibir la angiogénesis se administra a una dosis de 10 mg a 1000 mg por kilogramo de peso corporal por día.
10. 10. El método según la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se administra a una dosis -;e 0.01 mg a 10 mg por kilogramo de peso corporal ; -r dia.
11. 11. El método se?: .r. la reivindicación 8, en donde el antagonista avß3 se selecciona del grupo que consiste de un péptido, un péptido que contiene RGD, un anticuerpo monoclonar anti-avß3, un anticuerpo monoclonal receptor de anti-avß3 y un mimético de avß3-
12. 12. El método según la reivindicación 11, en donde el péptido que contiene RGD tiene la secuencia residual de aminoácidos ciclo (RGDfN-MeV) (SEQ ID NO.: 11) •
13. 13. El método según la reivindicación 1, en donde el componente efector celular del agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una citocina.
14. 14. El método según la reivindicación 13, en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste de BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gamma-IP-10, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo y VEGF.
15. 15. El método según la reivindicación 13, en donde la citocina es una quimiocina y se selecciona del grupo que consiste de CIO, EMF-1, ENA-78, Eotaxina, GCP-2, HCC-1, 1-309, IL8, IP-10, Linfotactina, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 y SDF-1.
16. 16. El método según la reivindicación 1, en donde el componente blanco de antígeno asociado con el tumor del agente inmunoterapéutico anti-tumoral es un polipéptido de inmunoglobulina (Ig) que comprende una región variable que se une a un blanco de antigeno asociado con el tumor.
17. 17. El método según la reivindicación 16, en donde el blanco de antigeno asociado con el tumor se selecciona del grupo que consiste de AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, Receptor EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (antígeno de KSA KS1/4), receptor IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), proteoglicano MCSP asociado con melanoma, PSA y Receptor de Transferrina.
18. 18. El método según la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral comprende citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antigeno GD2 asociado con el tumor.
19. 19. El método según la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral comprende citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antígeno KSA asociado con el tumor (antigeno Ep-CAM; KS1/4).
20. 20. El método según la reivindicación 1, en donde la célula tumoral es neuroectodérmica o epitelial .
21. 21. El método según la reivindicación 1, en donde la célula tumoral se selecciona del grupo que consiste de adenoma, angiosarcoma , astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, gliobiastoma , glioma, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangiosarcoma , hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma.
22. 22. Una composición terapéutica que comprende al menos un agente para inhibir la angiogénesis; y al menos un agente inmunoterapéutico anti-tumoral, el agente inmunoterapéutico antitumoral comprende un componente efector celular unido a un componente blanco de antígeno asociado con el tumor .
23. 23. La composición terapéutica según la reivindicación 22, que comprende: a) una cantidad de al menos un agente para inhibir la angiogénesis suficiente para inhibir la angiogénesis en un tumor o metástasis tumoral; y b) una cantidad de al menos un agente inmunoterapéutico anti-tumoral suficiente para producir una respuesta biológica.
24. 24. La composición según la reivindicación 22, en donde el agente para inhibir la angiogénesis es un antagonista avß3.
25. 25. La composición según la reivindicación 24, en donde el antagonista avß3 se selecciona del grupo que consiste de un péptido, un péptido que contiene RGD, un anticuerpo monoclonal anti-avß3, un anticuerpo monoclonal receptor anti- vß y un mimético 0Cvß3.
26. 26. La composición según la reivindicación 25, en donde el antagonista es un péptido que contiene RGD que tiene la secuencia residual de aminoácidos ciclo (RGDfN-MeV) (SEQ ID NO.: 11).
27. 27. La composición según la reivindicación 22, en donde el componente efector celular del agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una citocina.
28. 28. La composición según la reivindicación 27, en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste de BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gamma-IP-10 , - IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo y VEGF.
29. 29. La composición según la reivindicación 27, en donde la citocina es una quimiocina y se selecciona del grupo que consiste de CIO, EMF-1, ENA-78, Eotaxin, GCP-2, HCC-1, 1-309, IL-8, IP-10, Linfotactina, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 y SDF-1.
30. 30. La composición según la reivindicación 22, en donde el componente blanco de antígeno asociado con el tumor del agente inmunoterapéutico anti-tumoral es un polipéptido de inmunoglobulina (Ig) que comprende una región variable que se une a un blanco de antigeno asociado con el tumor.
31. 31. La composición según la reivindicación 30, en donde el blanco de antigeno asociado con el tumor se selecciona del grupo que consiste de AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, Receptor EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptor IL-2, Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), proteoglicano MCSP asociado con melanoma, PSA y Receptor de Transferrina.
32. 32. La composición según la reivindicación 22, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una proteina de fusión que comprende citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antigeno GD2 asociado con el tumor.
33. 33. La composición según la reivindicación 22, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una proteina de fusión que comprende citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antígeno KSA asociado con el tumor (antígeno Ep-CAM; KSl'-J).
34. 34. La composici... -egún la reivindicación 30, en donde el blanco de ar.tígeno asociado con el tumor es de una c-.j].a tumoral que es neuroectodérmica o epitelial.
35. 35. La composición según la reivindicación 30, en donde el blanco de antígeno asociado con el tumor es de una célula tumoral que se selecciona del grupo que consiste de adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma.
36. 36. Un equipo para tratar una célula tumoral en un tumor o metástasis tumoral que comprende un paquete que comprende: a) un agente para inhibir la angiogénesis capaz de inhibir la angiogénesis en el tumor o metástasis tumoral; b) un agente inmunoterapéutico anti-tumoral que comprende un componente efector celular y un componente blanco de antigeno asociado con el tumor; y c) instrucciones para utilizar los agentes en los métodos para tratar tumores y metástasis tumoral.
37. 37. El equipo según la reivindicación 36, en donde el agente para inhibir la angiogénesis es un antagonista avß3.
38. 38. El equipo según la reivindicación 37, en donde el antagonista avß3 se selecciona del grupo que consiste de un péptido, un péptido que contiene RGD, un anticuerpo monoclonal anti-avß3, un anticuerpo monoclonal receptor anti- vß3 y un mimético avß3.
39. 39. El equipo según la reivindicación 38, en donde el antagonista es un péptido que contiene RGD que tiene la secuencia residual de aminoácidos ciclo (RGDfN-MeV) (SEQ ID NO.: 11).
40. 40. El equipo según la reivindicación 36, en donde el componente efector celular del agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una citocina.
41. 41. El equipo según la reivindicación 40, en donde la citocina se selecciona del grupo que consiste de BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gamma-IPlO, IFN alfa, I FN beta, IFN gamma, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 a través de MCP-3, M-CSF, MIF, MlP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF alfa, TGF beta, TNF alfa, Tpo y VEGF.
42. 42. El equipo según la reivindicación 40, en donde la citocina es una quimiocina y se selecciona del grupo que consiste de CÍO, EMF-1, ENA-78, Eotaxin, GCP-2, HCC-1, 1-309, IL-8, IP-10, Linfotactma, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-lalfa, MlP-lbeta, MIP-2, NAP-2,. PF4, RANTES, SCM-1 y SDF-1.
43. 43. El equipo según la reivindicación 36, en donde el componente blanco de antigeno asociado con el tumor del agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una cadena de inmunoglobulina (Ig) que comprende una región variable que se une a un blanco de antígeno asociado con el tumor.
44. 44. El equipo según la reivindicación 43, en donde el blanco de antígeno asociado con el tumor se selecciona del grupo que consiste de AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, Receptor EGF, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), IL-2 receptor, Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), proteoglicano MCSP asociado con melanoma, PSA y Receptor de Transferrina.
45. 45. El equipo según la reivindicación 36, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una proteína de fusión que comprende citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antigeno GD2 asociado con el tumor.
46. 46. El equipo según la reivindicación 36, en donde el agente inmunoterapéutico anti-tumoral es una proteina de fusión que comprende citocina IL-2 y una cadena pesada de Ig que reacciona inmunológicamente con el antígeno KSA asociado con el tumor (antígeno Ep-CAM; KS1/4) .
47. 47. El equipo según la reivindicación 36, en donde el tumor o metástasis tumoral es neuroectodérmica o epitelial.
48. 48. El equipo según la reivindicación 36, en donde el tumor o metástasis tumoral se selecciona del grupo que consiste de adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial, germinoma, glioblastoma, glioma, hamartoma, bemangioendotelioma, hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma, meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma.
49. 49. El equipo según la reivindicación 36, en donde el agente para inhibir la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se proporcionan en recipientes por separado en el paquete.
50. 50. El equipo según la reivindicación 36, en donde el agente para inhibir la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se combinan en un recipiente individual en el paquete.
51. 51. El equipo según la reivindicación 36, en donde el agente para inhibir la angiogénesis y el agente inmunoterapéutico anti-tumoral se combinan en un recipiente individual en el paquete y se etiquetan para su uso combinado.