WO2006080171A1

WO2006080171A1 - 免疫増強剤

Info

Publication number: WO2006080171A1
Application number: PCT/JP2005/023844
Authority: WO
Inventors: Shiro Kanegasaki; Takuya Tamatani
Original assignee: Effector Cell Institute, Inc.
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2006-08-03
Also published as: CN101119743A; EP1854474A1; JPWO2006080171A1; AU2005326226A1; CN101119743B; CA2596232A1; KR20070099013A; US7662781B2; US20090054318A1; HK1113463A1; AU2005326226B2; EP1854474A4

Abstract

従来試みられてきた免疫療法は必ずしも充分な効果を得ることができず、制癌剤や放射線等による細胞への直接的攻撃に頼らざるを得なかった。本発明は、生体が本来的に有する免疫力を高めることにより従来の治療方法よりも副作用が少ない、しかもより効果的な治療方法を提供することを目的とする。即ち、本発明は、MIP-1α又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤である。

Description

明細書

免疫増強剤

技術分野

本発明は、免疫増強剤に関わり、例えば、ガン治療、ガン転移予防或いは花粉症等の免疫異常疾患の治療に役立つ免疫増強剤に関わる。背景技術

生体内においては、毎日多くのガン細胞が発生している。多くの場合、発生したガン細胞は異常細胞の排除システムおよび免疫システムにより取り除かれている。加齢あるいはエイズなどの免疫疾患、免疫抑制剤の投与により免疫機能が低下するとガン発生率が上昇することが、免疫システムによるガン排除の可能性を裏付けている。このことから免疫を賦活することによりガンを撲滅せしめる免疫療法が近年注目を集めている。しかし現在行われているガンの免疫療法では、多くの場合十分なガンに対する免疫が誘導されず、効果的な治療とはなっていない。

ガンに対する免疫誘導において、樹状細胞が重要な働きをしていることが知られている。我々はすでに MIP- Ι α及びその機能的誘導体が炎症局所あるいはガン局所に樹状細胞を集積させる能力があること、さらに血中に樹状細胞前駆細胞を数十倍のオーダーで動員させうることを見出してレヽる (Yoneyama H et al.， J Exp Med. Vol.193(1) pp.35-49 (2001), Zhang Y et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol.96, pp. 201-209 (2004)) 。また免疫誘導のマウスモデルにおいて、 MIP-1ひを免疫局所で発現させると、榭状細胞の集積が起こり、抗原特異的な免疫が誘導されることが報告されている（McKay PF et al., Eur. J. immunol., Vol.34, pp. 1011- 1020 (2004)) 。

放射線療法は外科手術、化学療法、ホルモン療法などと組み合わせて利用され、癌細胞の増殖と転移を抑制するために用いられてきた。しかし、癌細胞を完全に排除することは困難であり、免疫系の抑制、食欲減退、貧血、白血球減少、血小板減少などの副作用も見られている。電子線による定位放射線治療では癌組織局所的に治療するので副作用はより低下するが、癌細胞を根絶することは困難である。それに伴い、電子線照射によつて癌組織に誘導した炎症反応や癌細胞に特異的な τ細胞、樹状細胞の機能を発展 ·增強させ、より強力にする手段の開発が望まれてきた。

癌の転移という現象が癌患者の予後を決定する最も重要な因子であることは周知の事実である。しかしながら "転移"のメカニズムの解明、および有効な治療法は未だ確立していないのが現状である。癌転移に直接 · 間接に関与する生体成分も幾つか発見され、それらに対する抗体も作製され、癌転移動物モデルである程度の効果をしめしてはいるものの、ヒトに適用するには至っていない。また、既存の化学療法剤は固形腫瘍に対しては有効であるが、転移に関しては抗癌作用程の効果を示さないものが多い。また、癌細胞の転移抑制に関する薬剤開発が進んでいないという問題点もある。このような現状から、効果的に癌細胞転移を抑制し、癌患者の予後を改善する薬剤の開発が望まれてきた。

MIP- 1 (Macrophage I nf l ammatory Prote i n- 1 ) は、アミノ酸糸勺 7 0個からなる C-Cケモカインフアミリ一に属する分子である。活性化リンパ球、単球などから産生放出され、樹状細胞、単球、 Th l 細胞などの遊走を誘導する。 MIP- Ι αは、未熟樹状細胞において発現しているケモ力インレセプターである CCR 1、 CCR5 に対するリガンドとして知られている。（例えば、中野英樹、細胞工学 Vo l . 19， No . 9， 1304 - 1310 (2000)参照）。

ΜΙΡ·1 αと同様の生物活性を有する ΜΙΡ-l c 機能的誘導体も知られており、例えば、 ΜΙΡ- 1 αについては、 MlP- l ctの 26番目の Asp を Ala に置換し、アミノ末端が Serより始まる 69アミノ酸よりなる MIP- 1 ct 変異体（以下、 eMIP と言う）が知られている。この ΜΙΡ- 1 _α変異体は著しく改善された抗凝集能を有すると共に野生型と同等の活性を有することが見出され、癌化学療法の副作用である血中の顆粒球減少症の改善について検討されている（E. Marshall et al.， European Journal of Cancer, Vol. 34, No. 7， pp. 1023.1029 (1998))。

両親媒性高分子の一種である部分ブチルエステル化スチレン一マレイン酸共重合体で化学的に修飾されたネオカルチノスタチンが制癌剤（一般名称：ジノスタチンスチマラマー）として既に知られている（特公平 1 _ 3 3 1 1 9号）。これは、血中に投与されたとき、固形腫瘍にほぼ選択的に集積し、長時間にわたり腫瘍内に維持されるという、所謂、 E P R効果を示すことが知られており、ガン特異的ターゲッティング型の制癌剤として使用されている。また、両親媒性高分子で化学修飾されたペプチド性ァゴニスト又はその機能的誘導体も知られている（WO 01/83548) 。更に、ポリエチレングリコールで修飾されたキサンチンォキシダーゼも腫瘍細胞に対して E P R効果を示すこと

が知られている（特開平 1 1一 060499 号）。これらは、何れも、腫瘍細胞に対して直接的な攻撃性を有する物質を用いて抗腫瘍効果を達成するものであり、攻撃性物質を標的患部に選択的に集積させることにより、正常な細胞や組織への影響を少なくすることを目的としている。

また、両親媒性高分子の一種であるポリエチレンダリコール誘導体でタンパク質を修飾することにより、生体内クリアランスを遅延させ、或いは抗原性を低下させることは知られている（Yoshimoto et al. , Jpn. J. Cancer Res. , 77, 1264(1986)、 Abuchowski et al. , Cancer Biochem. Biophys., 7, 175(1984)、特開昭 61— 178926 号公報、特開昭 62— 115280号公報、特再表 W096/28475号公報、特表平 10— 513187号公報、特開平 11一 310600 号公報、特表 2000— 517304 号公報、）。更に、ポリエチレンダリコールで修飾されたィンターロイキン一 1、インターロイキン— 6、インターフェロン等が知られている（特開平 5—117300 号公報、特開平 6— 256394号公報、特開平 9— 25298号公報)。発明の開示

上述の様に従来試みられてきた免疫療法は必ずしも充分な効果を得ることができず、制癌剤や放射線等による細胞への直接的攻撃に頼らざるを得なかった。本発明は、生体が本来的に有する免疫力を高めることにより従来の治療方法よりも副作用が少ない、しかもより効果的な治療方法を提供することを目的とする。

即ち、本発明者等は、 ΜΙΡ·1α及びその機能的誘導体、例えば eMIP による免疫力の増強作用に着目し、更には、これ等の両親媒性高分子による化学修飾を試み、化学修飾された物質がその活性を阻害されることなく、寧ろ活性が向上することを見出し、これ等を有効成分とする免疫増強剤を発明するに至った。

ここに、本発明は（ 1 ) ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、更には、（2) 炎症を生起させた状態で ΜΙΡ- 1α又はその機能的誘導体を投与することによりガンを治療するための免疫増強剤であり、ここで、（3) 炎症を生起させる手段として、放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射等を選ぶことができ、（4) (a ) アジュバントを有効成分として含有する医薬と、

(b) ΜΙΡ-1_α又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とからなる免疫療法用組成物であって、（a ) 及び（b) を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫療法用医薬組成物である。また、本発明は、（ 5) ガン転移を予防するための ΜΙΡ-lct又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、或いは、（6) 免疫異常疾患を治療するための ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤であり、

( 7) 免疫異常疾患が花粉症である（6 ) 記載の免疫増強剤である。本発明で使用しうる MIP-1ひの機能的誘導体として、（ 7) eMIP を選ぶことができ、また、（ 9) 両親媒性高分子で化学修飾された MIP- 1α又は eMIP を選ぶことができる。ここで、（10)両親媒性高分子として部分アルキルエステル化スチレン—マレイン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体を用いることができる。図面の簡単な説明

図 1は、 3LL 坦癌マウスにおける eMIP の放射線療法との併用効果を示す。

図 2は、電子線放射後 16 日間の eMIP によるアブスコパル効果の增強作用の変化を示す。

図 3は、電子線放射後 17 日目における eMIP のアブスコパル効果の増強作用を示す。

図 4は、 3LL腫瘍に対するアジュバント（尸 . ac/je 療法と eMIPの併用治療効果を示す。

図 5は、 eMIPによる 3LLの肺転移の抑制効果を示す。

図 6は、 3LL iv移植マウスの肺重量を示す。

図 7 は、 Bu- SMA-BB10010 のフラクション毎の 280nm における吸光度を示す。

図 8 は、 Bu- SMA-BB10010及び原料である BB10010 の Native- PAGE電気泳動の結果を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明における有効成分の代表例である M I P - 1 αは C Cサブファミリーに属するケモカインとして知られており、レセプター CCR1 や CCR 5のリガンド（ァゴニスト）である。ヒト成熟型 ΜΙΡ— 1 αは 70 のアミノ酸よりなるとされているが、 CD 8 +Τ細胞や HTLV— 1感染細胞 ΜΤ4培養上清から得られるものは 66アミノ酸を有することが知られている。ヒト ΜΙΡ— 1 αには、個人により遺伝子コピー数の異なる非対立遺伝子 LD78 /3が存在し、 70アミノ酸型 ΜΙΡ— 1 αとは配列が 3残基異なるものが知られている。これ等は何れも本発明において使用できる。本発明で使用できる ΜΙΡ-l c 又はその機能的誘導体とは、ケモカインレセプターである C C R 1または C C R 5に対するリガンド及びその誘導体であって、ァゴニストとしての作用を有する物質を云う。即ち、 MIP _ 1 _αの機能的誘導体とは、 ΜΙΡ _ 1 ひの誘導体であって、ァゴニストとして ΜΙΡ— 1 a と同様の生物活性を示すものであり、かかる生物学的同等物の代表例として eMIP (既出、 European Journal of Cancer, Vol. 14, No. 7， pp. 1023— 1029(1998))を挙げることができる。本発明において免疫增強剤として使用される ΜΙΡ-Ι α等は部分アルキルエステル化スチレン一マレイン酸共重合体ゃポリエチレンダリコール誘導体で代表される両親媒性高分子で化学的に修飾すると、その活性が維持されると共に、血中安定性が改善されることが確認された。かくして、本発明で使用される ΜΙΡ-Ι αの機能的誘導体は両親媒性高分子で化学的に修飾されることが好ましく、この様に両親媒性高分子で化学的に修飾された ΜΙΡ- Ι α及びその生物学的に同等な誘導体も、本明細書において「ΜΙΡ-1 αの機能的誘導体」と呼ぶこととする。

本発明において MIP-1 ひ又はその生物学的同等物を化学修飾するために用いられる両親媒性高分子の好ましい例として、部分アルキルエステル化スチレン一マレイン酸共重合体を挙げることができ、更に、そのアルキル部分の例としては、直鎖または分枝していてもよい炭素数が 1 乃至 5 であるアルキル基を挙げることができ、これ等アルキル基は低級アルコキシ基で置換されていても良い。より具体的には、メチル、ェチル、プロピノレ、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 s—ブチル、 t—ブチル、 n—ペンチル、 3—メチノレ一 1 一プチノレ、 2—メチノレ一. 1 ーブチル、 2 , 3 _ジメチノレ一 1 _プロピル、 2—ペンチノレ、 3—メチノレ一 2—ブチノレ、 3 _ペンチノレ、 2—メチノレ一 2—ブチノレ、メチノレセロソルブ、ェチルセ口ソルブ等を挙げることができる。

好ましい部分アルキルエステル化スチレン—マレイン酸共重合体の例は、特公平 1— 3 3 1 1 9号に記載されている、部分ブチルエステル化スチレン—マレイン酸共重合体であって、平均分子量が 1 0 0 0 〜 1 0 0 0 0で、重合度が 1乃至 1 0 0、好ましくは 3乃至 3 5のものが選ばれる。

本発明において MIP- Ι α又はその生物学的同等物を化学修飾するために用いられる両親媒性高分子の好ましい他の例として、ポリエチレンダリコール（以下 p E Gと記す場合もある）の誘導体を挙げることができる。ここで、ポリエチレングリコール誘導体とは、一 O— ( C H ₂ C H ₂ θ ) η -で表される P E G部分（nは 2 0乃至 2 8 0の整数）がァゴニスト又はその生物学的同等物のぺプチド鎖と結合し得る残基を有する化合物を意味する。ポリエチレングリコール誘導体の例としては、ペプチド鎖のァミノ基（N末ァミノ基、リジン残基のァミノ基）に結合できる残基を有するものを挙げることができる。ポリエチレングリコール誘導体の他の例として、ペプチド鎖のカルボキシル基（C末カルボキシル基、ァスパラギン酸残基、グルタミン酸残基のカルボキシル基）に結合できる残基を有するものを挙げることができる。更に、本発明において用いられる両親媒性高分子の他の例として、ポリビュルピロリドンその他を挙げることができる。

本発明に関わる両親媒性高分子で化学修飾された MIP- 1 _α及びその生物学的同等物は、両親媒性高分子と ΜΙΡ- 1 _α及びその生物学的同等物を、場合によりリンカ一アームを介して化学結合させ、部分精製することにより得ることができる。即ち、両親媒性高分子と ΜΙΡ-l ct又はその生物学的同等物とを緩衝液中で反応させ、その後カラムクロマトグラフィを用いて精製し、溶出する各フラクションを分離する。

両親媒性高分子が部分アルキルエステル化スチレン一マレイン酸共重合体である場合を例にとり、より具体的に説明すれば、まず、スチレンと無水マレイン酸のラジカル共重合により得られるスチレン一マレイン酸共重合体（SMA) の酸無水物をクメン等の有機溶媒に溶解させ、この溶液に n—ブタノールを攪拌下に滴下して反応させ、部分的に無水環をブチルエステル化することで、部分ブチルエステル化スチレン一マレイン酸共重合体（Bu-SMA) を得ることができる。かくして得られる Bu-SMA とァゴニスト又はその生物学的同等物との結合は、両者を pH 8.5 の重炭酸水素ナトリウム 0.3M溶液中で反応させ、 Bu-SMA 中の酸無水環とァゴニスト又はその生物学的同等物中のァミノ基との間にアミド結合を形成させることにより行なうことができる。 MIP- Ι α又はその生物学的同等物に対する Bu-SMA の結合数は 1以上であればよく、好ましくは 3乃至 1 0、より好ましくは 6乃至 8である。

両親媒性高分子として P E Gを用いて、 ΜΙΡ-Ι α又はその生物学的同等物のペプチド鎖のアミノ基を修飾する場合は、 P E Gの端末に、アミノ基と反応し得る官能基、例えば、カルボキシル基を導入することが好ましい。 MIP- 1 ひ又はその生物学的同等物のぺプチド中のアミノ基に結合させるためには、該官能基を反応性基に変換することが好ましく、力ルポキシル基の場合は、活性エステル法、混合酸無水物法等が好ましい例である。

具体的には、活性エステルの場合、 p —二トロフヱニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステノレ等のフエ二ノレエステル類、 N—ヒドロキシフタルイミドエステル、 N—ヒドロキシスクシンィミドエステル等のジカルボン酸イミドエステル、 N—ヒドロキシピペリジンエステル等のヒドロキシル系活性エステル等が挙げられる。これ等の活性エステルの調製は、常法に従って行うことができ、例えば、 P E G誘導体のカルボキシル基と上記の活性エステルに対応するアルコール体とをジシク口へキシルカルボジィミドゃ 1 —ェチル一 3—（3 —ジメチルァミノプロピル）カルボジィミド等の縮合剤を用いて一 2 0 °C乃至室温にて 1乃至 2 4時間反応させることにより行うことができる。或いは、 P E G誘導体のカルボキシル基と上記活性エステルに対応するハロゲン化物とを、トリェチルァミン等の塩基の存在下に、 0 °C乃至 8 0 °Cで 1乃至 7 2時間反応させることによっても調製することができる。混合酸無水物法の場合は、 N—メチルモルホリン、 N—ェチルビペリジン等の塩基の存在下に、イソブチルクロ口ホルメート、ェチノレクロ口ホルメート、塩ィ匕ィソバレリル等と一 2 0 乃至0でで 1乃至3 0分間反応させることにより調製することができる。

P E G誘導体を MIP- 1ひ又はその生物学的同等物のぺプチド鎖に直接導入することもできるが、リンカ一アームを介して導入することもできる。例えば、リジンを含む短いアミノ酸配列を目的とするペプチド鎖に導入し、そのリジンのアミノ基を P E G誘導体で修飾する。修飾反応においては、修飾されるぺプチド鎖に含まれるァミノ基数に対して 1 0 乃至 3 0倍モルの P E G誘導体を用いることが好ましい。

両親媒性高分子として P E Gを用いて、 MIP- 1ひ又はその生物学的同等物のぺプチド鎖のカルボキシル基を修飾する場合は、 P E Gの端末に、カルボキシル基と反応し得る官能基、例えば、アミノ基を導入することが好ましい。

かくして得られる両親媒性高分子で化学修飾された ΜΙΡ- Ι α又はその生物学的同等物は、所謂、 EPR 効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待される。

本発明による ΜΙΡ-Ι αまたはその機能的誘導体は免疫賦活剤として提供される。すなわち、 MIP- l etが直接 · 間接に関与する炎症性疾患、臓器障害、癌の発症予防剤または治療剤として提供される。注射剤として用いられることが好ましいが、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。一般的に使用されている杭がん剤と併用することも可能である。

本発明による ΜΙΡ-l ctまたはその機能的誘導体は、がん局所に炎症を誘導し、免疫誘導可能性を高めた上で投与することが好ましい。すなわち、放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射といった方法により、ガン局所に炎症を生起させ、充分炎症反応が誘起されたと予想される時点で、 MIP-1ひまたはその機能的誘導体を投与することが好ましい。

ガンの放射線療法においては、単にガン細胞を傷害せしめるだけではなく、放射線照射局所に炎症反応を誘起し、その結果照射部位以外のガンにおいても免疫反応を誘導することができることが知られている ( abscopal ef f ectZアブスコパル効果）。本発明による MIP- 1 αまたはその機能的誘導体は一般的に施行されている放射線療法と併用することにより、放射線照射によって生起されるアブスコパル効果を増強し、臨床的効果を更に増強することが可能であることが見出された。

本発明による ΜΙΡ-1 _αまたはその機能的誘導体は一般的に使用されているアジュバントと併用しアジュバントによって生起される免疫応答を増強し臨床的効果を増強することが可能である。アジュバントとしては、一般的に使用されているクレスチン、ピシバニール、レンチナン、べスタチンあるいは尸. ac/7es等と併用することが可能である。

本発明による ΜΙΡ-Ι αまたはその機能的誘導体は、癌組織の壊死を誘導する凍結融解療法と併用することで癌組織の壊死 · 退縮を誘導することができる。更に、本発明による ΜΙΡ- 1 ctまたはその機能的誘導体は単独あるいは一般的に用いられている抗癌剤あるいは放射線 . 凍結融解療法 ·超音波療法との併用により腫瘍転移抑制作用を目的として使用することができる。

本発明による ΜΙΡ-Ι αまたはその機能的誘導体は花粉症等の免疫不全による疾病にも適用することができる。 ΜΙΡ-Ι αまたはその機能的誘導体単独あるいは一般的に使用されている抗ァレルギ一剤、抗ヒスタミン剤等と併用することが可能である。

本発明に関わる免疫増強剤は、有効成分である ΜΙΡ- Ι α又はその機能的誘導体、即ちタンパク質を非経口的に投与するのが好ましく、例えば、水、若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液体との無菌性溶液又は懸濁液などの注射剤の形で投与されることが好ましい。注射の為の無菌組成物は注射用水のようなビヒクル、天然植物油などを用いて有効成分を溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤手段に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D _マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルァルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコ二ゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血淸アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。

本発明で得られる Bu-SMA が結合した ΜΙΡ-Ι α又はその生物学的同等物は、水溶性または油性注射用剤の形で用いることができる。水溶性注射用剤は主に静脈内投与に使用される。油性注射剤は、例えば、リピオドールなどの油剤に均一に分散させた Bu-SMA が結合した ΜΙΡ- 1 α 又はその生物学的同等物を腫瘍栄養動脈上流に固定したカテーテルにより腫瘍組織等の標的患部に投与される。 Bu-SMA が結合したァゴニスト又はその生物学的同等物が血中でアルブミンと結合して高分子化合物として挙動すること及び Bu-SMA 結合物が油剤に可溶となることが本発明者等により見出されており、その結果、油剤化された Bu-SMA 結合 ΜΙΡ- 1 _α又はその生物学的同等物を局所動脈に注射すれば、所謂、 EPR 効果により固形腫瘍等の標的患部へと選択的に集積することが期待される。

このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトまたは哺乳動物対して投与することができる。本発明の有効成分の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、非経口的に投与する場合の該有効成分の 1回投与量は、例えば、成人（体重 6 O k g として）に投与する場合、一回につき約 0 . 0 1〜 2 0 m g程度、好ましくは約 0 . 1〜 1 O m g程度である。他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。本発明に関わる免疫増強剤は、注射剤以外の剤形として、例えば、座剤、鼻腔製剤の形で利用することもできる。参考例 1

M I P - 1 αの製法

ヒト MIP-Ι α遺伝子を PCR法により取得した。該ヒト MIP-Ι α遺伝子を発現シャトルベクター pNCM02 に組み込み、大腸菌にて增幅した。該ヒト MIP-1 α遺伝子発現べクタ一を Brevibacillus choshinensis (B. choshinensis ) HPD31S5 に導入した。該ヒト ΜΙΡ-Ι α遺伝子導入 Β. choshinensis を培養して、その上清を採取した。該培養上清に 4 0 % 飽和になるように硫酸アンモニゥムを加え、沈殿生成後、遠心にて上清を分離して、さらに 6 0 %飽和になるように硫酸アンモニゥムを加え、沈殿生成後遠心にて該沈殿物を回収した。該沈殿物をトリス塩酸バッファー（pH 8.0) に溶解し、該溶解物を陰イオン交換クロマトダラフィ一（Q Sepharose; アマ一シャム社製）にかけ分画した。各画分のうち MIP-1 αを含む画分を集め、硫酸アンモニゥムを加えて溶解した (終濃度 1.5M ) 。該溶解物を疎水性クロマトグラフィー (RESOURCE PHE; アマ一シャム社製）にかけ分画した。各画分のうち ΜΙΡ-l ctを含む画分（非吸着画分）を集め、硫酸アンモニゥムを加えて硫安沈殿を行った（終濃度 60%飽和）。沈殿物をトリス塩酸バッファー（pH 8.0) に溶解し、該溶解物を再度陰イオン交換クロマトグラフィー（RESOURCE Q; アマ一シャム社製）にかけ分画した。各画分のうち MIP-1 αを含む画分を集め、トリス塩を除く目的で 20mM NH4HCO3 (pH 8.5) に対して透析を行った。この処理により生じた沈殿を遠心することにより精製ヒト ΜΙΡ- l ctを得た。これを凍結乾燥後 P B Sに溶解させ、以下の実験に用いた。

参考例 2

eMIPの製法（発現と精製） eMIP の cDNAは、ヒト MIP - 1 a cDNA をテンプレートとし Quik Change Kit (Stratagene 社）を用いて、部位特異的変異により調製した。すなわち、 125ng の変異プライマー RQ1:5 ' - CCAGCGAAGCCGGCAGGTCT GTGCTGACCCAG-3 ' ( 配列番号 1 ) 、 RQ2:5 ' - CTGGGGTCAGCACAGACCTGCCGGCTTCGCTTGG -3，（酉己歹 (J番号 2 )、テンプレートプラスミド DNAlOng に 50/i Md NTP を含む 50 1 の反応系に Pfu- turbo (2.511/ i 1) 1 1 添加し、 95°C 30 秒の変性に続き、 95°C 30 秒、 55°C 1分、 68度 7分を 12サイクルおこなった後、反応系に制限酵素 Dpnl を 1 _μ 1添加し、 37°Cで 1 時間反応することによりテンプレート DNAを切断することにより、変異プラスミドのみを回収した。変異部位が正しく置換されたことを DNA配列解析により確認した後、分裂酵母発現プラスミドベクタ一 _PTL2M5 に挿入した。このプラスミドを用いて Schizosaccharamyces pombeを形質転換し、 eMIP発現株を得た。続いて、 100 μ g / ml抗生物質 G418を含む YPD培地（0.5% Yeast Extract, 2% Peptone, 2% Glucose) 16L でジャーフアーメンターにて 30°C、 48時間培養することにより、培地中に分泌発現させた。この培地上清を 0.45 μ m のフィルターを用いて、ろ過除菌したものを精製の出発材料とした。組換え eMIP 蛋白の精製は、 AKTA- prime システム（アマシャムバイォサイエンス社）を用いて行った。すなわち、培地上清にギ酸緩衝液

(0.5M Formic acid(pH4.0) ) を添加し、終濃度 0.01%になるように Tween20 を加えた。このサンプルを、陽イオン交換カラム SP- XL (5ml サイズを 6本連結したもの、アマシャムバイオサイエンス社）に 2ml / rain にて、送液し吸着させた後、 1M 塩化ナトリウムを含むギ酸緩衝液

(pH7.0) によりグラジェント溶出した。 10- 20% SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE)にて確認した後、ピーク画分を回収した。これを lOmM リン酸緩衝液（pH7.0)に対して透析した後、へパリンァフィ二ティーカラム（5ml サイズを 4 本連結したもの、アマシャムバイオサイエンス社）に 2ml I min にて、送液し吸着させた後、 1M 塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（pH7. 0) によるグラジェント溶出した。 10-20% SDS- PAGEにて確認した後、ピーク画分を回収した。収率は、 16Lの培養あたり 175 mg であり、生理的リン酸緩衝液（ PBS (-) (pH7. 4) )に透析した後、動物実験に用いた。

参考例 3

Bu-SMA結合 eMIPの製法

参考例 3で得られた eMIP を濃度が 2mg/ml となるように、 0. 8M重炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH8. 5) に溶解させた。この溶液 1ml に対し、ジェチノレホノレムアミドに溶解した Bu- SMA 2. 6mg (モノレ比にして、 Bu- SMA： eMIP=10： 1)を徐々に加え、ー晚、 27 度で反応させた。反応終了後、反応混合物をゲルろ過ク口マトグラフィー（充填剤：バイオラッド社製 Bio- Ge lP60、移動相： 20mM 重炭酸水素アンモニゥム溶液（pH8. 5) 、力ラムサイズ： 1. 6 X 83cm) に付して Bu- SMA 結合 eMIP を精製した。 2ml ごとに 90 本の試験管に分離した（図 7 ) 。次いで、 280nm における吸光度に基づき、試験管番号 16〜18に溶出した画分（6ml) を凍結乾燥させて白色粉末状の Bu-SMA結合 eMIP (以下において、「Bu- SMA- eMIP」と表示する）を得た。

得られた Bu-SMA-eMIP および原料である eMIP の Nat ive- PAGE (未変性 10- 20%グラジェントポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を図 8に示す。両者の泳動距離は、明らかに異なっている。これは、 eMIP の'リジンのァミノ基が SMAによって修飾されたことにより表面のプラスチャージが減少し、より陽極側に泳動されやすくなったためと考えられる。この両者の泳動距離の差およびフラクション No. 16〜18 の Bu-SMA - eMIP と、未反応の Bu-SMA および eMIP のアミノ基を蛍光試薬 Fluorescamine(0.3mg/ml in acetone)と反応させ、分光蛍光計で、励起波長 390nm、蛍光波長 475nm で測定し、定量し、 1分子に 2〜3 個の SMA が結合していると見積もられた。

実施例 1

eMIP の放射線療法との併用

1 ) 実験方法

7週齢，雌性 C57BL/6 マウスと Lewis lung carcinoma (3LL) を用レ、、固形腫瘍における電子線照射と eMIPの併用効果を評価した。

3LL 4X10⁵ 個を側腹部皮下移植後、固形癌の径が lcni 程度になった時点（19 日後）で固形癌の大きさを揃えて再群分けし、癌組織に電子線を照射。翌日に eMIPを尾静脈より投与。以後週 1回 eMIP投与を継続し、計 4回投与した。対照薬として 5Fuを用い、電子線照射の翌日から 25mg/kgで週 2回腹腔内に投与した。

腫瘍体積は以下に示す Janik らの式に従って算出した。

(腫瘍体積） = (腫瘍の長径） X (腫瘍の短径） 2 X0.5236

2) 実験結果

3 LL 肺癌細胞の増殖において、電子線照射では 2 , 6 , 10 Gy で線量依存的に固形癌の増殖が抑制された。 eMIP 50 · g/mouse 単独でも抑制する傾向は見られたが、有意な作用ではなかった。電子線照射と eMIP 50 · g/mouseを併用すると、 eMIP.は電子線 6および 10Gyの腫瘍抑制作用を有意に増強した（図 1A，B) 。

図 1 (A) は eMIP と電子線 6Gy の併用効果を示す。 3LL担癌マウス (n = 5 ) の固形癌径 1 c m前後の時点で電子線照射し、翌日に eMIP を iv 投与し、以後週 1回 iv 投与した。図において Iは eMIP を投与した日を示す。

図 1 (B) は電子線照射 16 日目における eMIP の抗腫瘍作用を示す ( n = 5 ) 。「*」は pく 0.05 を、「**」は p<0.01 (AN0VA)を、「」は pく 0.05 (t- test)を夫々示す。

実施例 2

アブスコパル効果の増強作用

1 ) 実験方法

7週齢，雌性 C57BL/6 マウスと Lewis lung carcinoma (3LL) を用い、左右側腹部に移植した固形腫瘍に対する電子線照射と、 eMIP の併用効果とを比較して評価した。

3LL 4X10⁵個を C57BL/6マウスの右側腹部皮下に移植（ primary tumor) し、同時に 3LL 2X 10⁵個を左側腹部皮下に移植した（secondary tumor) ₀ 右側腹部の腫瘍径が約 1 era になった時点（19 日目）で腫瘍径で再群分けを行い直線加速器により右側腹部の腫瘍に電子線照射を行った（電子線放射量 6Gy) 。電子線照射の翌日に eMIP を静脈内投与した。以後、 8 日後及び 1 5 日後の計 3回投与した。左右側腹部の腫瘍径を測定し、腫瘍体積により抗腫瘍作用を評価した。

腫瘍体積は以下に示す Janik らの式に従って算出した。

(腫瘍体積） = (腫瘍の長径） X (腫瘍の短径） ² X0.52³⁶

2) 実験結果

電子線照射後 16 日までの両側腹部腫瘍体積の変化を図.2に、 17 日目の結果を図 3に示した。なお、図 2及び図 3において、（A) は、右側腹部腫瘍に対する電子線照射の変化を示し、（B) は左側腹部腫瘍に対する電子線照射の変化を示す。

図 2 (A) の「—画一」が示すように、右側腹部腫瘍に対する電子線照射により右側腹部腫瘍の増殖は抑制されたが、図 2 (B) の「—固一」が示すように、逆側の左側腹部腫瘍は抑制されなかった。興味深いことに、 eMIP の併用により、 2μ g/マウスの投与で電子線照射していない左側腹部腫瘍を 60%以上有意に抑制した。また、電子線照射した右側部腫瘍においても 2 及び 10 g/マウスの投与で電子線の抗腫瘍効果を有意に増強した（図 3) 。なお、図 4において、「*」はコントロール群（Cont) に对する有意さが pく 0.05 であることを意味し、「**」は p <0.01 (ANOVA) であることを意味する。

かかる結果は、 eMIP がアブスコパル効果を増強することを示すもので、 eMIP が放射線照射した腫瘍部位における炎症や免疫応答の増強だけではなく、全身的な抗腫瘍免疫応答を活性化することを示している。実際、放射線照射及び eMIP の投与を行った 3LL担癌マウスでは、脾臓中に _Ίーィンターフェ口ン産生細胞が増加しており、その増加は対照及び放射線照射したのみのマウスより有意に高かった。

この結果から、 eMIP は電離放射線治療において、照射した腫瘍だけではなく転移巣などの非照射部位の腫瘍に対しても有効な治療法を提供すると言うことができる。

実施例 3

eMIPとアジュバントとの併用効果

1) 実験方法

8-10 週齢，雌性 C57BL/6 マウスと Lewis lung carcinoma (3LL) を用い、固形腫瘍におけるアジュバント療法と eMIP の併用効果を評価した。

3 LL 2 X 10⁵ 個を皮下移植後、 1, 8， 15, 22 日目に 20 g の Prop ιοπι bacterium acnes (11828； American Type Culture Collection, Manassas, VA)死菌を 40 しの PBS に懸濁したものを同所皮下注射し、 2, 9, 16, 23 日目に 20 ugの eMIPを 100 μ 1 の PBSに溶解したものを尾静脈より投与した。

腫瘍の増殖は、腫瘍部の長径を測定することにより算定した。 2 ) 実験結果

3 LL 肺癌細胞の増殖において、アジュバント（P. acnes) 単独で有意な増殖抑制活性がみられた。さらにアジュバントに加え eMIPを週に一回投与することにより、腫瘍の増殖はほぼ完全に抑制された。 eMIP 単独では、有意な抑制効果は認められなかった（図 4 A) 。マウスの生存率もコントロール、 eMIP 単独では 70- 100 日で全例死亡したが、ァジュバント投与単独で 5 0 %、アジュバントに加えて eMIPを週一回投与することにより 1 0 0 %のマウスが 100 日以上生存した（図 4 B) 。図 4 Aは、 3 L Lを皮下注射し、 1 , 8, 15, 22 日目に ac es死菌を皮下注射し、 2， 9, 16, 23 日目に eMIPを尾静脈より投与した結果を示す。腫瘍の増殖は、腫瘍部の長径を測定することにより算定した。 *P<0.05 *Ρ<0·05。図 4 Βは Αと同一実験におけるマウスの生存率を示す。

X ： eMIP + P. acnes, □ ： P. acnes のみ、〇： ΜΙΡ' Ια のみ、秦：未処理の場合を夫々示している。

図 4 Βにおける数値の統計上の有意差は下表の通りである。

ログラン！；'一 ^^コクソ'ン

実施例 4

eMIPの腫瘍転移抑制効果

1 ) 実験方法

Lewi s lung carc inoma ( 3LL) の肺転移の系を用レヽて eMIP の転移抑制作用を評価した。 7 週齢，雌性 C57BL/6 マウスを用いた。 3LL 10⁶ 個を尾静脈より注射し、 25 日後に肺を摘出し、重量測定、 Bouin ' solut ion で固定した後、実体顕微鏡下で肺転移した癌組織の数を測定した。 eMIPは 3LL移植 30分後に初回投与を行い、以後週 1回 4週連続投与した。また、 3LL 移 ¾ 7 日後からの投与開始する系でも eMIP の効果を検討した。対照薬とした 5 Fuは 1週 2回投与した。

2 ) 実験結果

結果を図 5 に示した。 eMIP は 3LL の肺転移を有意に抑制し、 5Fu25mg/mouse の投与では 78%の抑制率であった。 3LL移植 7 日後から投与開始しても eMIP は肺転移を抑制した。また、 3LL の肺転移により増加した肺重量も肺転移抑制効果と相関して抑制された（図 6 ) 。図 5において、 dayO : 3LL移植 30分後より eMIP投与開始、 day7： 3LL移植 7 日後より eMIP 投与開始の結果を示す。 Contro 群に対する有意差 *： p<0. 05, ** : p< 0. 01 (ANOVA) 。 n=10 (control 群）、 = 7 (e IP, 5 Fu投与群）。図 4において、 Control群に対する有意差 * : pく 0. 05、 ** : p< 0. 01 (AN0VA) 。 n=10 (control群）、 n =7 (eMIP, 5 Fu投与群）。産業上の利用可能性

本発明は、現在行われているガンの免疫療法を更に発展させ、ガンに対する免疫を誘導させる効果的な治療剤並びに花粉症等の免疫不全疾患の治療剤を提供する。

本発明においてガン局所に炎症反応を誘起した後、 MIP- 1 ひ又はその機能的誘導体を投与することにより、著明なガン増殖抑制および生存率の上昇がみられる。更に、 ΜΙΡ-Ι α又はその機能的誘導体を投与することにより腫瘍の転移、花粉症等の免疫不全による疾病等に対して顕著な改善効果が見られる。

かくして本発明により、 MIP- 1 α及びその機能的誘導体が免疫反応を著明に亢進し、免疫療法の効率を飛躍的に高めることが示され、 ΜΙΡ - 1 ひ及びその機能的誘導体の免疫増強剤としての可能性が明らかになったということができる。

Claims

請求の範囲

1. ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を有効成分とする免疫増強剤

2. 炎症を生起させた状態で ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を投与することを特徴とする請求項 1記載のガン治療用免疫増強剤

3. 炎症を生起させる手段が放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射から選ばれることを特徴とする請求項 2記載のガン治療用免疫増強剤

4. ( a ) アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ b ) MIP-1ひ又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とからなる免疫療法用組成物であって、（a ) 及び（b) を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫療法用医薬組成物

5. ガン転移を予防するために ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を投与することを特徴とする請求項 1記載の免疫増強剤

6. 免疫異常疾患を治療するために ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を投与することを特徴とする請求項 1記載の免疫増強剤

7. ΜΙΡ-lc の機能的誘導体が eMIPである請求項 1〜 6記載の免疫増強剤

8. ΜΙΡ-Ιαの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾された MIP-1 α又は eMIPであることを特徴とする請求項 1〜6記載の免疫増強剤

9. MIP-lo:の機能的誘導体が部分アルキルエステル化スチレン—マレィン酸共重合体又はポリエチレングリコール誘導体化学修飾された MIP-1ひ又は eMIPである請求項 1〜6記載の免疫増強剤

10. ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を投与する免疫増強方法

11. 炎症を生起させた状態で ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を投与する免疫増強によるガン治療方法

12. 炎症を生起させる手段が放射線照射、アジュバント投与、患部の凍結融解、超音波照射から選ばれることを特徴とする請求項 11 記載のガン治療方法

13. ( a ) アジュバントを有効成分として含有する医薬と、（ b ) MIP-1ひ又はその機能的誘導体を有効成分として含む医薬とを用い、

(a) 及び（b) を同時に又は経時的に投与することを特徴とする免疫増強方法

14. ΜΙΡ-Ια又はその機能的誘導体を投与するガン転移予防方法

15. ΜΙΡ-lct又はその機能的誘導体を投与する免疫異常疾患を治療方法

16. ΜΙΡ-lctの機能的誘導体が eMIPである請求項 10〜： 15記載の治療方法

17. ΜΙΡ-Ιαの機能的誘導体が両親媒性高分子で化学修飾された ΜΙΡ- 1α又は eMIPである請求項 10〜： 15記載の治療方法

18. ΜΙΡ-Ιαの機能的誘導体が部分アルキルエステル化スチレン—マレィン酸共重合体又はポリエチレンダリコール誘導体で化学修飾された MIP-lo;又は eMIPである請求項 10〜： 15記載の治療方法