CN101119743A - 免疫增强剂 - Google Patents

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Abstract

以往所尝试的免疫疗法不一定获得满意的效果，仍要依赖抗癌药物或放射线对癌细胞的直接杀伤作用。本发明的目的是提供通过提高生物体原有的免疫力，与以往治疗方法相比副作用小，而且具有更好效果的治疗方法。即，本发明是以MIP－1α或其功能性衍生物为有效成分的免疫增强剂。

Description

免疫增强剂
技术领域
本发明涉及免疫增强剂，涉及例如有助于癌症治疗，预防癌症转移或花粉症等免疫异常疾病的治疗的免疫增强剂。
背景技术
在生物体内，每天都会产生许多的癌细胞。多数情况下，产生的癌细胞会被异常细胞清除系统及免疫系统清除。在衰老或艾滋病等免疫疾病、免疫抑制剂的给药导致免疫机能降低时，则癌症发生率上升，由此证明可通过免疫系统去除癌症。近年来，基于这一原理通过免疫激活而根除癌症的免疫疗法日益受到瞩目。但是，现在进行的癌症免疫疗法，多数情况下并不能充分诱导对于癌症的免疫，无法实现有效的治疗。
已知在对于癌症的免疫诱导中树突细胞发挥着重要的作用。我们已经发现，MIP-1α及其功能性衍生物具有在炎症局部或癌症局部集聚树突细胞的能力，进而可以动员血液中数十倍级树突细胞的前体细胞(Yoneyama H et al.，J Exp Med.Vol.193(1)pp.35-49(2001)，Zhang Y et al.，J Natl.Cancer Inst.，Vol.96，pp.201-209(2004))。另外，已有报道在免疫诱导的小鼠模型中，MIP-1α在免疫局部的表达能够引起树突细胞的集聚，诱导抗原特异性免疫(McKay PFet al.，Eur.J.immunol.，Vol.34，pp.1011-1020(2004))。
放射线疗法可与外科手术、化学疗法、激素疗法等相结合应用，可用于抑制癌细胞的增殖和转移。但是，完全排除癌细胞是很困难的，还会出现免疫系统的抑制、食欲减退、贫血、白细胞减少、血小板减少等副作用。利用电子射线进行的定位放射线治疗中，对癌症组织局部进行治疗，因此副作用进一步降低，但很难根除癌细胞。因此，人们希望开发能够发展、增强通过电子射线照射诱导到癌症组织中的炎症反应或对癌细胞特异的T细胞、树突细胞功能的更强力治疗方法。
众所周知，癌症的转移现象是决定癌症患者预后的最重要因素。但是，现实情况是尚未弄清楚“转移”的机理及确定有效的治疗方法。虽然发现了一些与癌症转移直接、间接相关的机体成分，也制成了相应的抗体，在癌症转移动物模型中显示一定程度的疗效，但是还不能适用于人类。另外，已有的化疗制剂对固体肿瘤有效，但对于转移多数不能显示抗癌作用这样的效果。另外，还存在有关抑制癌细胞转移的药剂的开发尚没有太大进展的问题。针对这一现状，希望开发有效地抑制癌细胞转移，改善癌症患者预后的药剂。
MIP-1α(Macrophage Inflammatory Protein-1α)，是属于由约70个氨基酸组成的C-C趋化因子家族的分子。由活化的淋巴细胞、单核细胞等产生释放，诱导树突细胞，单核细胞，Th1细胞等的游走。已知MIP-1α是对于在未成熟树突细胞中出现的趋化因子受体CCR1、CCR5的配体(例如，参见中野英树，细胞工学，Vol.19，No.9，1304-1310(2000))。
已知具有与MIP-1α相同生物活性的MIP-1α功能性衍生物，例如，对于MIP-1α，已知MIP-1α的第26个Asp取代为Ala，氨基末端由从Ser开始的69个氨基酸组成的MIP-1α变异体(以下称为eMIP)。发现该MIP-1α变异体具有显著地改善的抗凝集功能，同时具有与野生型同等的活性，对改善癌症化疗引起的血液中粒细胞减少症的副作用进行了研究(E.Marshall et al.，European Journal ofCancer，Vol.34，No.7，pp.1023-1029(1998))。
已知用作为两亲性高分子一种的用部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物化学修饰的新制癌菌素作为抗癌药(通用名称：净司他丁斯酯)(特公平1-33119号)。已知其进入血液中后，基本选择性地集聚于固体肿瘤中，并长时间保持在肿瘤内，显示所谓的EPR效果，因此可作为癌症特异的靶向型抗癌药使用。另外，也已知用两亲性高分子进行化学修饰了的多肽性激动剂或其功能性衍生物(WO01/83548)。进而，已知用聚乙二醇修饰的黄嘌呤氧化酶对肿瘤细胞也显示EPR效果(特开平11-060499号)。在这些情况中，任何一种都是使用对肿瘤细胞具有直接攻击性的物质达到抗肿瘤效果，就是通过使攻击性物质在靶部位选择性集聚，以对正常的细胞或组织产生较小影响为目的。
另外，已知通过用作为两亲性高分子的一种的聚乙二醇衍生物修饰蛋白质，可以延迟生物体内的清除，或降低抗原性(Yoshimoto et al.，Jpn.J.Cancer Res.，77，1264(1986)，Abuchowski et al.，CancerBiochem.Biophys.，7，175(1984)，特开昭61-178926号公报，特开昭62-115280号公报，特再表WO96/28475号公报，特表平10-513187号公报，特开平11-310600号公报，特表2000-517304号公报)。进而，已知用聚乙二醇修饰了的白介素-1，白介素-6，干扰素等(特开平5-117300号公报，特开平6-256394号公报，特开平9-25298号公报)。
发明内容
如上所述，以往所尝试的免疫疗法不一定获得充分的效果，不得不依赖由抗癌药或放射线等对癌细胞的直接攻击。本发明的目的是提供通过提高生物体原有免疫力而与以往的治疗方法相比副作用小，而且更有效的治疗方法。
即，本发明人们，着眼于MIP-1α及其功能性衍生物，例如eMIP产生的的免疫力的增强作用，进而尝试用这些两亲性高分子化学修饰这些物质，发现化学修饰后的物质其活性不仅未受阻碍，其活性还提高，发明了以这些物质为有效成分的免疫增强剂，完成了本发明。
因此，本发明是具有如下特征的免疫疗法用药物组合物：(1)是以MIP-1α或其功能性衍生物为有效成分的免疫增强剂，进而，(2)是在引发炎症状态下通过给予MIP-1α或其功能性衍生物用于治疗癌症目的的免疫增强剂，其中，(3)作为引发炎症的手段，可以选择放射线照射，给予佐剂，患部的冷冻和熔解，超声波照射等，(4)含有(a)含有佐剂作为有效成分的药物和(b)含有以MIP-1α或其功能性衍生物作为有效成分的药物的免疫疗法用组合物，(a)及(b)同时或经时给药。
另外，本发明为(5)为预防癌症转移的以MIP-1α或其功能性衍生物作为为有效成分的免疫增强剂，或者，(6)为治疗免疫异常疾病的以MIP-1α或其功能性衍生物作为有效成分的免疫增强剂，(7)免疫异常疾病为花粉症的(6)记载的免疫增强剂。
作为本发明中可使用的MIP-1α的功能性衍生物，(7)可以选择eMIP，另外，(9)可以选择用两亲性高分子化学修饰了的MIP-1α或eMIP。其中，(10)作为两亲性高分子，可以使用部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物或聚乙二醇衍生物。
附图说明
图1表示对3LL癌症小鼠并用eMIP和放射线疗法的效果。
图2表示电子射线放射后16天内eMIP引起的远位效果增强作用的改变。
图3表示电子射线放射后第17天eMIP的远位效果的增强作用。
图4表示对3LL肿瘤并用佐剂(P.acnes)疗法和eMIP的治疗效果。
图5表示eMIP对3LL肺转移的抑制效果。
图6表示3LL iv移植小鼠的肺重量。
图7表示各Bu-SMA-BB10010级分在280nm处的吸光度。
图8表示Bu-SMA-BB10010及原料BB10010的Native-PAGE电泳的结果。
具体实施方式
已知本发明中有效成分的代表例MIP-1α是属于CC亚族的趋化因子，是受体CCR1或CCR5的配体(激动剂)。人成熟型MIP-1α由70个氨基酸构成，而已知由CD8+T细胞或HTLV-1感染细胞MT4培养上清液中得到的MIP-1α具有66个氨基酸。已知人MIP-1α中，由于个体差异存在基因复制数不同的非等位基因LD78β，与70个氨基酸型的MIP-1α的序列有3个残基不同的MIP-1α。其中任何一种都可以在本发明中使用。
可在本发明中使用的MIP-1α或其功能性衍生物是指对趋化因子受体CCR1或CCR5的配体及其衍生物，是具有作为激动剂的作用的物质。即，MIP-1α的功能性衍生物是MIP-1α的衍生物，作为激动剂显示与MIP-1α同样的生物活性，作为该生物学同等物的代表例可以列举出eMI P(同前，European Journal of Cancer，Vol.14，No.7，pp.1023-1029(1998))。
已确认在本发明中作为免疫增强剂使用的MIP-1α等，如果用以部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物或聚乙二醇衍生物为代表的两亲性高分子进行化学修饰，维持其活性的同时改善其血液中稳定性。因此，本发明中使用的MIP-1α的功能性衍生物优选用两亲性高分子进行化学修饰，这样用两亲性高分子化学修饰了的MIP-1α及其生物学上同等衍生物，在本说明书中称为“MIP-1α的功能性衍生物”。
作为在本发明中用于进行化学修饰MIP-1α及其生物学同等物的两亲性高分子的优选例，可以列举部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物，进而，作为其烷基部分的例子可以列举可以是直链或也可以是支链的碳原子数1到5的烷基，这些烷基也可用低级烷氧基取代。更具体来说，可以列举出甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，2，3-二甲基-1-丙基，2-戊基，3-甲基-2-丁基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，甲基溶纤剂，乙基溶纤剂等。
优选的部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物的例子为在特公平1-33119号中记载的部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物，平均分子量为1000～10000，聚合度1至100，优选3至35的共聚物。
作为在本发明中用于进行化学修饰MIP-1α或其生物学同等物的两亲性高分子的优选的其它例子，可以列举出聚乙二醇(以下有时候也记为PEG)的衍生物。此处，聚乙二醇衍生物表示以-O-(CH2CH2O)n-表示的PEG部分(n为20到280的整数)具有能与激动剂或其生物学同等物的肽链相结合的残基的化合物。作为聚乙二醇衍生物的例子，可以列举具有能结合到肽链的氨基(N末端氨基，赖氨酸残基的氨基)上的残基的化合物。作为聚乙二醇衍生物的其他例子，可以列举具有能结合到肽链的羧基(C末端的羧基，天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基)上的残基的化合物。
进而，作为本发明中使用的两亲性高分子的其他例子，可以列举出聚乙烯吡咯酮等。
本发明的用两亲性高分子化学修饰了的MIP-1α及其生物学同等物，可以根据不同情况使两亲性高分子与MIP-1α及其生物学同等物通过连杆臂(linker arm)进行化学结合、部分精制得到。即，使两亲性高分子与MIP-1α或其生物学同等物在缓冲液中进行反应，其后用柱色谱进行精制，分离溶出的各级分。
以两亲性高分子为部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物的情况为例，更具体来说，首先使通过苯乙烯与马来酸酐的自由基共聚得到的苯乙烯-马来酸共聚物(SMA)的酸酐溶于异丙基苯等有机溶剂，搅拌下向该溶液中滴入正丁醇使其反应，将无水环部分丁基酯化，可以得到部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物(Bu-SMA)。所得Bu-SMA与激动剂或其生物学同等物的结合可通过如下方法进行，即使两者在0.3M的pH为8.5的碳酸氢钠溶液中反应，在Bu-SMA中的酸无水环与激动剂或其生物学同等物中的氨基之间形成酰胺键。Bu-SMA相对于MIP-1
α或其生物学同等物的键数可以为1以上，优选3至10，更加优选6至8。
使用PEG作为两亲性高分子，修饰MIP-1α或其生物学同等物的肽链的氨基时，优选在PEG的末端，导入可以与氨基反应的官能团，如羧基。为了结合到MIP-1α或其生物学同等物的肽中的氨基上，优选将该官能团变换为反应性基团，例如为使羧基变换为反应基团，优选活性酯化法，混合酸酐法等。
具体来说，在活性酯的情况下可以列举对硝基苯基酯、五氟苯基酯等苯基酯类，N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯等二羧酸亚胺酯，N-羟基哌啶酯等羟基类活性酯等。这些活性酯的制备可以按常法进行，例如，通过使用二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等缩合剂使PEG衍生物的羧基与对应于上述活性酯的醇体在-20℃至室温下反应1至24小时进行。或者也可以通过使PEG衍生物的羧基与对应于上述活性酯的卤化物在三乙基胺等碱的存在下在0℃到80℃下反应1至72小时进行制备。在混合酸酐法的情况下，可以通过在N-甲基吗啉，N-乙基哌啶等碱的存在下，与异丁基氯甲酸酯，乙基氯甲酸酯，异戊酰氯等在-20℃到0℃下反应1到30分钟进行制备酯。
也可以将PEG衍生物直接导入MIP-1α或其生物学同等物的肽链上，也可以通过连杆臂导入。例如，将含赖氨酸的短氨基酸序列导入目的肽链中，用PEG衍生物修饰其赖氨酸的氨基。在修饰反应中，优选使用相对于被修饰的肽链含有的氨基数10至30倍摩尔的PEG衍生物。
在使用PEG作为两亲性高分子修饰MIP-1α或其生物学同等物的肽链的羧基的情况下，优选在PEG的末端导入能与羧基反应的官能团，例如氨基。
期待所得的用两亲性高分子修饰了的MIP-1α或其生物学同等物，通过所谓的EPR效果，选择性集聚在固体肿瘤等靶部位。
本发明的MIP-1α或其功能性衍生物可作为免疫增强剂而提供。即，MIP-1α可直接或间接作为相关炎症性疾病，内脏器官损伤，癌症的发病预防剂或治疗剂而提供。优选制成注射剂使用，作为注射剂以外的剂型，例如，也可以以栓剂，鼻腔制剂的形式应用。也可以与通常使用的抗癌药并用。
本发明的MIP-1α或其功能性衍生物，优选在癌症局部诱导炎症，提供了免疫诱导可能性后给予。即，优选通过放射线照射、给予佐剂、患处的冻结熔解、超声波照射这样的的方法，癌症局部引发了炎症，在预计诱发了充分的炎症反应时，给予MIP-1α或其功能性衍生物。
已知在癌症的放射线疗法中，不仅伤害癌细胞，还可以在放射线照射部位上诱发炎症，其结果是即使在照射部位以外的癌症部位也能诱导免疫反应(abscopal effect/远端效应)。发现通过将本发明的MIP-1α或其功能性衍生物与通常实施的放射线疗法并用，可以增强因放射线照射引起的远端效应，可进-步增强临床效果。
本发明的MIP-1α或其功能性衍生物与通常应用的佐剂并用，可增强佐剂引起的免疫应答，增强临床效果。作为佐剂，可以与通常使用的芸芝多糖，溶血性链球菌制剂，香菇多糖，倍司他汀(bestatin)或痤疮丙酸杆菌(P.acnes)等并用。
本发明的MIP-1α或其功能性衍生物通过与诱导癌症组织坏死的冻结熔解疗法并用可以诱导癌症组织的坏死、退缩。进而，本发明的MIP-1α或其功能性衍生物可以通过单独或与通常使用的抗癌制剂或放射线，冻结熔解疗法，超声波疗法的并用以抑制肿瘤转移为目的而使用。
本发明的MIP-1α或其功能性衍生物也适用于花粉症等免疫缺陷引起的疾病。MIP-1α或其功能性衍生物可以单独使用或与通常使用的抗过敏剂，抗组胺剂等并用。
本发明涉及的免疫增强剂，优选非经口给予作为有效成分的MIP-1α或其功能性衍生物，即蛋白质，例如，优选和水，或其他药学上允许的液体的无菌性溶液或混悬液等注射剂的剂型给药。注射用无菌组合物可以用注射用水这样的赋形剂、天然植物油等根据使有效成分溶解或混悬等通常的制剂手段配制处方。作为注射用水性溶液，可以使用例如生理盐水，含葡萄糖或其他助剂的等渗液等(例如，D-山梨醇，D-甘露醇，氯化钠等)，也可以与适当的溶解助剂，例如，醇类(例如乙醇等)，多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)，非离子表面活性剂(例如聚山梨酸酯80TM、HCO-50等)等并用。作为油性溶液，可以使用例如芝麻油、棕榈油、大豆油等，也可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯，苯甲醇等并用。另外，也可配混缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)，无痛剂(soothing agent)(例如苯扎氯铵，盐酸普鲁卡因等)，稳定剂(例如人血清白蛋白，聚乙二醇等)，防腐剂(例如苯甲醇，苯酚等)，抗氧化剂等。
本发明所得的结合有Bu-SMA的MIP-1α或其生物学同等物，可以以水溶性或油性注射用剂的形式使用。水溶性注射用剂型可以主要用于静脉内给药。对于油性注射剂，例如，可以通过固定在肿瘤营养动脉上游的插管向肿瘤组织等靶部位给予均匀分散于碘化油等油剂中的结合有Bu-SMA的MIP-1α或其生物学同等物。本发明人等发现结合有Bu-SMA的激动剂或其生物学同等物在血液中与白蛋白结合作为高分子化合物发挥作用以及Bu-SMA结合物可溶于油剂中，其结果，可期待如将油剂化了的结合有Bu-SMA的MIP-1α或其生物学同等物注射于局部动脉，由于所谓的EPR效果而在固体肿瘤等靶部位选择性集聚。
这样所得的制剂，可以给予例如人或哺乳动物。本发明的有效成分的给药量，因对象疾病，给药对象，给药途径等而不同，非经口给药时，该有效成分的-次给药量，例如，给予成人(体重60kg)时，一次约0.01～20mg左右，优选0.1～10mg左右。即使在其他动物的情况下，也可以换算成每60kg量给药。本发明涉及的免疫增强剂，作为注射剂以外的剂型，也可以以例如栓剂、鼻腔制剂等的形式应用。
参考例1
MIP-1α的制法
利用PCR法获得人MIP-1α基因。将该人MIP-1α基因组合入表达穿梭载体pNCMO2中，用大肠杆菌进行扩增。将该人MIP-1α基因表达载体导入Brevibacillus choshinensis(B.choshinensis)HPD31S5中。培养导入了该人MIP-1α基因的B.choshinensis，收集上清液。向该培养上清液中加入硫酸铵以形成40％饱和溶液，生成沉淀后，离心分离上清液，进一步加入硫酸铵以形成60％饱和溶液，生成沉淀后离心回收该沉淀物。将沉淀物溶解于Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并将该溶解物用阴离子交换色谱(Q Sepharose；Amersham公司制)分级。收集各级分中含有MIP-1α的级分，加硫酸铵溶解(终浓度1.5M)。将该溶解物用疏水性色谱法(RESOURCE PHE；Amersham公司制)分级。收集各级分中含有MIP-1α的级分(未吸附级分)，加入硫酸铵进行硫酸铵沉淀(终浓度60％饱和)。将沉淀物溶于Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，并将该溶解物再用阴离子交换色谱(RESOURCE Q；Amersham公司制)分级。收集各级分中含有MIP-1α的级分，为除去Tris盐对20mM NH4HCO3(pH8.5)进行透析。通过离心由该处理生成的沉淀，得到精制的人MIP-1α。将精制的人MIP-1α冷冻干燥后溶于PBS，用于以下实验。
参考例2
eMIP的制法(表达与精制)
以人MIP-1αcDNA为模板(template)，使用Quik Change Kit(Stratagene公司)通过定点特异突变法制备eMIP的cDNA。即，向含125ng的变异引物(mutation primer)RQ1：5’-CCAGCGAAGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCAG-3’(序列号1)和RQ 2：5’-CTGGGGTCAGCACAGACCTGCCGGCTTCGCTTGG-3’(序列号2)、10ng模板质粒DNA和50μM dNTP的50μl反应系统中添加1μlPfu-turbo(2.5U/μl)，在95℃下变性30秒，然后在95℃下30秒，在55℃下1分钟，在68℃下7分钟进行12个循环后，向反应系统中添加1μl限制酶DpnI，通过在37℃下反应1小时切断模板DNA，由此只回收变异质粒。通过DNA序列分析确认变异部位已正确取代后，插入到裂殖酵母表达质粒载体pTL2M5中。应用该质粒来转化Schizosaccharamyces pombe，获得eMIP表达株。然后，在16L含100μg/ml抗生素G418的YPD培养基(0.5％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中用发酵罐在30℃下，培养48小时，在培养基中表达分泌。用0.45μm过滤器过滤除菌上清液，将得到的产物作为精制的起始原料。
采用AKTA-prime系统(Amersham Bioscience公司制)精制重组eMIP蛋白。即，向培养上清液中添加甲酸缓冲液(0.5M Formic acid(pH4.0))，添加吐温20以使终浓度为0.01％。将该样品添加到阳离子交换柱SP-XL(6根5mi尺寸色谱柱相连，Amersham Bioscience公司制)，以2ml/min送液吸附后，用含1M氯化钠的甲酸缓冲液(pH7.0)梯度洗脱。用10-20％SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)确认后，回收峰级分。将回收物对10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析后，添加到肝素亲和柱(4根5mi尺寸色谱柱连接，Amersham Bioscience公司制)，以2ml/min送液吸附后，用含1M氯化钠的磷酸缓冲液(pH7.0)梯度洗脱。用10-20％SDS-PAGE确认后，回收峰级分。收率为每16L培养物中含175mg，对生理磷酸缓冲液(PBS(-)(pH7.4))透析后用于动物实验。
参考例3
Bu-SMA结合eMIP的制法
将参考例3所得的eMIP溶解于0.8M碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)以使其浓度为2mg/ml。向1ml该溶液中缓慢加入溶于了二乙基甲酰胺的Bu-SMA 2.6mg(摩尔比Bu-SMA∶eMIP＝10∶1)，在27℃下反应一夜。反应结束后，将反应混合物添加到凝胶过滤色谱(填充剂：Bio-GelP60，Bio-Rad Laboratories公司制，流动相：20mM碳酸氢铵溶液(pH8.5)，柱尺寸：1.6×83cm)，精制Bu-SMA结合eMIP。每2ml为1个试管，共分离到90个试管中(图7)。然后，根据280nm处的吸光度，将试管编号16～18中洗脱的级分(6ml)冷冻干燥，得到白色粉末状的Bu-SMA结合eMIP(以下称为“Bu-SMA-eMIP”)。
所得Bu-SMA-eMIP及作为原料的eMIP的Native-PAGE(未改性10-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果如图8所示。两者的泳动距离有明显的区别。可以认为是因为由于eMIP的赖氨酸的氨基被SMA修饰，表面的正电荷减少，更易向阳极方向泳动。根据两者泳动距离的差异及将级分第 16～18号的Bu-SMA-eMIP、未反应的Bu-SMA及eMIP的氨基与荧光试剂Fluorescamine(在丙酮中，0.3mg/ml)反应，用荧光分光光度计，在激发波长390nm，荧光波长475nm下进行测定定量，可推测每1分子结合了2～3个SMA。
实施例1
eMIP与放射线疗法的并用
1)实验方法
采用7周龄，雌性C57BL/6小鼠及路易士(lewis)肺癌(3LL)，评价电子射线照射与eMIP并用对固体肿瘤的效果。
将4×105个3LL移植至侧腹部皮下后，固体肿瘤直径在1cm左右时(19天后)根据固体肿瘤的大小对动物重新分组，然后对癌症组织进行电子射线照射。次日通过尾静脉给予eMIP。以后每周1次继续给予eMIP，共计给予4次。用5Fu为对照药，从电子射线照射的次日开始按25mg/kg每周腹腔内给予2次。
按下面所示的Janik等人的公式计算出肿瘤体积。
(肿瘤体积)＝(肿瘤的长径)×(肿瘤的短径)2×0.5236
2)实验结果
在3LL肺癌细胞的增殖中，电子射线照射按2、6、10Gy可照射线量依赖性地抑制固体肿瘤的增殖。即使单独使用50·g/小鼠eMIP也可见抑制的倾向，但没有明显的作用。如果电子射线照射与50·g/小鼠eMI P并用，eMIP明显增强了电子射线6及10Gy的肿瘤抑制作用(图1A，B)。
图1(A)表示eMIP与电子射线6Gy的并用效果。在3LL癌症小鼠(n＝5)的固体肿瘤直径达到1cm左右时进行电子射线照射，次日静脉内给予eMIP，以后每周1次静脉内给予eMIP。图中
Figure A20058004752400151
表示给予了eMIP的日期。
图1(B)表示电子射线照射至第16天时的eMI P的抗肿瘤作用(n＝5)。“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01(ANOVA)，“#”表示p＜0.05(t-实验)。
实施例2
远端效应的增强作用
1)实验方法
采用7周龄、雌性C57BL/6小鼠及路易士肺癌(3LL)，对左右侧腹部移植的固体肿瘤电子射线照射及与eMIP并用的效果进行比较评价。
4×105个3LL细胞移植至C57BL/6小鼠右侧腹部皮下(原发性肿瘤)，同时2×105个3LL细胞移植至左侧腹部皮下(子瘤)。右侧腹部的肿瘤直径至约1cm时(第19天)按肿瘤直径对动物再次分组，用直线加速器对右侧腹部的肿瘤进行电子射线照射(电子射线放射量6Gy)。电子射线照射次日，静脉内给予eMIP。此后，在8天后及15天后再次给予eMIP，共给予3次。测定左右侧腹部的肿瘤直径，根据肿瘤体积评价抗肿瘤作用。
按下面所示的Janik等人的公式计算肿瘤体积。
(肿瘤体积)＝(肿瘤的长径)×(肿瘤的短径)2×0.5236
2)实验结果
图2表示电子射线照射后至16天的两侧腹部肿瘤体积的变化，第17天的结果如图3所示。予以说明的是，在图2及图3中，(A)表示对右侧腹部肿瘤电子射线照射的变化，(B)表示对左侧腹部肿瘤电子射线照射的变化。
如图2(A)的“-■-”所示，虽然通过对右侧腹部肿瘤进行电子射线照射，右侧腹部肿瘤的增殖受到抑制，但如图2(B)“-■-”所示，对侧的左侧腹部肿瘤未受到抑制。有趣的是，通过并用eMIP，按2μg/小鼠的剂量给药，未进行电子射线照射的左侧腹部肿瘤显著抑制了60％以上。另外，对手电子射线照射的右侧腹部肿瘤，按2及10μg/小鼠的剂量给药，显著增强了电子射线的抗肿瘤效果(图3)。予以说明的是，图4中，“*”表示与对照组(Cont)相比显著性p＜0.05，“**”表示p＜0.01(ANOVA)。
这些结果说明eMIP增强远位效果，因此说明eMIP不仅增强放射线照射的肿瘤部位的炎症或免疫应答，而且活化全身的抗肿瘤免疫应答。
实际上，在进行了放射线照射以及给予eMIP的3LL癌症小鼠中，脾脏中的γ-干扰素生成细胞增加，其增加程度与对照组及仅放射线照射的小鼠组相比显著提高。
由这一结果可这样说，在电子放射线治疗中，eMIP不仅对照射了的肿瘤而且对转移部位等非照射部位的肿瘤也提供有效的治疗方法。
实施例3
eMIP与佐剂的并用效果
1)实验方法
采用8-10周龄、雌性C57BL/6小鼠及路易士肺癌(3LL)，评价对固体肿瘤采用佐剂疗法与eMIP并用的治疗效果。
2×105个3LL细胞移植至皮下后，在第1，8，15，22天在相同部位皮下注射20μg的短小棒状杆菌(Propionibacterium acnes)(11828；American Type Culture Collection，Manassas，VA)的死菌混悬于40l PBS中的混悬液，在第2，9，16，23天通过尾静脉给予20μg的eMIP溶解于100μl PBS中的溶液。
通过测定肿瘤部位的长径计算出肿瘤的增殖。
2)实验结果
观察到单独使用佐剂(P.acnes)对3LL肺癌细胞的增殖具有显著的增殖抑制活性。进而，除给予佐剂外，每周给予一次eMIP，基本可以完全抑制肿瘤的增殖。单独使用eMIP未见显著的抑制效果(图4A)。关于小鼠的生存率，对照组、单独使用eMIP组在70-100天内全部死亡，单独给予佐剂的小鼠生存率为50％，给予佐剂且每周给予一次eMIP，100％的小鼠都生存100天以上(图4B)。
图4A表示皮下注射3LL、第1，8，15，22天皮下注射P.acnes死菌、第2，9，16，23天尾静脉给予eMIP的结果。通过测定肿瘤部位的长径计算出肿瘤的增殖。*P＜0.05。图4B表示与A相同实验中小鼠的生存率。×表示eMIP+P.acnes，口表示仅给予P.acnes，○表示仅给予MIP-1α，●表示未经处理的情况。
图4B中数值在统计上的显著差异如下表所示。
  时序检验(Logrank test)   差异显著性检验(Wilcoxon test)
  X^2value   p value   显著差异   Z^2value   p value   显著差异
  MIP1-αV.S.control   5.0443E-01   4.7756E-01   没有显著差异   2.0936E-02   8.8495E-01   没有显著差异
  MIP1-αV.S.P.acnes   1.3305E+01   2.6463E-04   p＜0.0005   1.2626E+01   3.8056E-04   p＜0.0005
  MIP1-αV.S.P.acnes+MIP1-α   1.5059E+01   1.0418E-04   p＜0.0005   1.3432E+01   2.4742E-04   p＜0.0005
  Control V.S.P.acnes   7.3482E+00   6.7131E-03   p＜0.01   6.7866E+00   9.1848E-03   p＜0.01
  Control V.S.P.acnes+MIP1-α   1.5730E+01   7.3062E-05   p＜0.0001   1.2886E+01   3.3114E-04   p＜0.0005
  P.acnes V.S.P.acnes+MIP1-α   4.9617E+00   2.5915E-02   p＜0.05   5.0662E+00   2.4396E-02   p＜0.05
实施例4
eMIP抑制肿瘤转移的效果
1)实验方法
用路易士肺癌(3LL)的肺转移系统评价eMIP的转移抑制作用。采用7周龄、雌性C57BL/6小鼠。尾静脉注射106个3LL细胞，25天后将肺取出，测定重量，用Bouin溶液固定后，在实体显微镜下测定肺转移了的癌症组织数。移植3LL 30分钟后初次给予eMIP，以后每周1次连续给予4周。另外，也采用3LL移植7天后开始给药的系统研究了eMIP的效果。5Fu作为对照药1周给予2次。
2)实验结果
结果示于图5。eMIP显著抑制3LL的肺转移，按25mg/小鼠的剂量给予5Fu的抑制率为78％。3LL移植7天后开始给予eMIP，也抑制肺转移。另外，3LL的肺转移导致的肺重量增加也与肺转移抑制效果相关而受到抑制(图6)。图5中显示，0天：3LL移植30分钟后开始给予eMIP的结果，7天：3LL移植7天后开始给予eMIP的结果。与对照组相比有显著差异：*：p＜0.05，**：p＜0.01(ANOVA)。n＝10(对照组)，n＝7(给予eMIP、5Fu组)。图4中，与对照组相比有显著差异：*：p＜0.05，**：p＜0.01(ANOVA)。n＝10(对照组)，n＝7(给予eMIP、5Fu组)。
本发明提供使现行的癌症免疫疗法进一步发展的、诱导对癌症的免疫的有效治疗药剂以及用于花粉症等免疫缺陷疾病治疗的药剂。
在本发明中，在癌症局部诱发炎症反应后，通过给予MIP-1α或其功能性衍生物可见显著的癌症增殖抑制及生存率提高作用。进而，通过给予MIP-1α或其功能性衍生物可见对癌症转移，花粉症等免疫缺陷导致的疾病具有显著的改善效果。
因此根据本发明显示MIP-1α及其功能性衍生物可显著提高免疫反应，飞跃性提高免疫疗法的效率，MIP-1α及其功能性衍生物用作免疫增强剂的可能性变得很明确。
序列表
<110>艾菲克特细胞研究所
<120>免疫增强剂
<130>
<150>JP 2005-23224
<151>2005-1-31
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>智人(homo sapiens)
<400>1
CCAGCGAAGC CGGCAGGTCT GTGCTGACCC AG      32
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>智人
<400>2
CTGGGGTCAG CACAGACCTG CCGGCTTCGC TTGG    34

Claims (18)

1.一种免疫增强剂，其特征是以MIP-1α或其功能性衍生物作为有效成分。
2.权利要求1中记载的癌症治疗用免疫增强剂，其特征是在发生炎症的状态下给予MIP-1α或其功能性衍生物。
3.权利要求2中记载的癌症治疗用免疫增强剂，其特征是炎症发生的手段选自放射线照射，给予佐剂，患处的冻结熔解，超声波照射。
4.一种免疫疗法用药物组合物，其特征是包含(a)含有以佐剂为有效成分的药物与(b)含有以MIP-1α或其功能性衍生物为有效成分的药物，(a)及(b)同时或经时给药。
5.权利要求1中记载的免疫增强剂，其特征是为了预防癌症转移，给予MIP-1α或其功能性衍生物。
6.权利要求1中记载的免疫增强剂，其特征是为了治疗免疫异常疾病，给予MIP-1α或其功能性衍生物。
7.权利要求1～6中任一项记载的免疫增强剂，其特征是MIP-1α的功能性衍生物为eMIP。
8.权利要求1～6中任一项记载的免疫增强剂，其特征是MIP-1α的功能性衍生物为用两亲性高分子化学修饰了的MIP-1α或eMIP。
9.权利要求1～6中任一项记载的免疫增强剂，其特征是MIP-1α的功能性衍生物为部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物或聚乙二醇衍生物化学修饰了的MIP-1α或eMIP。
10.一种免疫增强方法，其特征是给予MIP-1α或其功能性衍生物。
11.一种通过免疫增强治疗癌症的方法，其特征是在发生炎症的状态下，给予MIP-1α或其功能性衍生物。
12.权利要求11中记载的癌症治疗方法，其特征是发生炎症的手段选自放射线照射，给予佐剂，患处的冻结熔解，超声波照射。
13.一种免疫增强方法，其特征是使用(a)含有以佐剂为有效成分的药物与(b)含有以MIP-1α或其功能性衍生物为有效成分药物，(a)及(b)同时或经时给药。
14.一种癌症转移预防方法，其特征是给予MIP-1α或其功能性衍生物。
15.一种免疫异常疾病的治疗方法，其特征是给予MIP-1α或其功能性衍生物。
16.权利要求10～15中任一项记载的治疗方法，其特征是MIP-1α的功能性衍生物为eMIP。
17.权利要求10～15中任一项记载的治疗方法，其特征是MIP-1α的功能性衍生物为用两亲性高分子化学修饰了的MIP-1α或eMIP。
18.权利要求10～15中任一项记载的治疗方法，其特征是MIP-1α的功能性衍生物为用部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物或聚乙二醇衍生物化学修饰了的MIP-1α或eMIP。
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