KR100704140B1 - 혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 포함하는, 종양 및 전이를 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 포함하는, 종양 및 전이를 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 종양 및 종양 전이의 치료를 요하는 포유동물에게 혈관형성을 억제하기에 충분한 치료학적 양의 길항제를 사이토킨-특이적 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 치료학적 양의 항-종양 면역요법제, 예를 들어, 사이토킨 및 재조합 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄를 갖는 항-종양 항체/사이토킨 융합 단백질과 배합하여 투여함을 포함하여, 상기 포유동물에서 종양 및 종양 전이를 치료하는 방법을 교시한다.
종양, 종양 전이, 혈관형성, αvβ3 인테그린 길항제, 항-종양 면역요법제, 사이토킨, 재조합 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄, 항-종양 항체/사이토킨 융합 단백질

Description

혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 포함하는, 종양 및 전이를 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 키트{A pharmaceutical composition for treatment of tumors and metastases comprising an angiogenesis inhibiting agent and anti-tumor immunotherapeutic agent and a kit comprising the same}
관련된 특허원의 상호 참조
본원은 1999년 2월 12일에 출원된 미국 가특허원 제60/119,721호를 우선권으로 청구한다.
정부 권리의 진술
본원에 기재된 연구의 일부는 미국을 대표하여 활동하는 국립 보건원(NIH: National Institutes of Health)로부터의 허가에 의해 일부 지원되었다. 미국 정부는 본 발명의 소정의 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 항-혈관형성 요법 및 표적화된 항-종양 면역요법의 병용 투여를 기초로 하는 요법을 사용한 원발성 종양 및 전이의 억제 방법에 관한 것이다.
새로운 혈관의 생성 또는 혈관형성은 악성 질환의 성장에 있어서 중요한 역할을 하며, 혈관형성을 억제하는 제제를 개발하는데에 대단한 관심을 유발시켜 왔다[참조예: Holmgren, L., O'Reilly, M.S. & Folkman, J. (1995) "Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression", Nature Medicine 1, 149-153; Folkman, J. (1995) "Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease", Nature Medicine 1, 27-31; O'Reilly, M.S., et al., (1994) "Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma", Cell 79, 315-328; Kerbel, R.S. (1997) "A cancer therapy resistant to resistance", Nature 390, 335-336; Boehm, T., et al., (1997) "Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance", Nature 390, 404-7; 및 Volpert, O.V., et al., (1998) "A human fibrosarcoma inhibits systemic angiogenesis and the growth of experimental metastases via thrombospondin-1", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95, 6343-6348].
혈관형성을 억제하는 αvβ3 인테그린 길항제의 용도는 충실성 종양에의 혈액 공급을 감소시킴으로써 충실성 종양 성장을 억제하는 방법에 있어 공지되어 있다[참조예: 합성 폴리펩타이드, 모노클로날 항체, 및 αvβ3 수용체에 결합하고 혈관형성을 억제하는 αvβ3의 유사체(mimetic)와 같은 αvβ3 길항제의 용도를 기술하고 있는 미국 특허 제5,753,230호(Brooks & Cheresh) 및 미국 특허 제5,766,591호(Brooks & Cheresh)].
또한, 암종 전이와 같은 확립된 종양의 면역 반응-매개된 억제를 촉진시키는 항체-사이토킨 융합 단백질 요법이 기술되어 있다. 예를 들어, 사이토킨 인터류킨 2(IL-2)는, 각각의 항체 KS1/4 및 ch14.18의 사용에 의해 종양 관련 항원 상피 세포 접착 분자(Ep-CAM, KSA, KS1/4 항원) 또는 디시알로강글리오사이드 GD2와 면역반응성인 모노클로날 항체 중쇄에 융합되어, 2종의 별개의 융합 단백질, 즉 융합 단백질 ch14.18-IL-2 및 KS1/4-IL-2를 각각 형성시킨다[참조예: 미국 특허 제5,650,150호(Gillies)].
종양 구획을 특이적으로 표적화하는 요법과 공동상승작용성인 혈관형성의 혈관계-특이적 억제제의 동정은 효과적인 암 치료법을 최적으로 개선시킬 것이다.
혈관형성은, 세포외 매트릭스 성분과의 세포 상호작용에 의존하는 과정인, 내피 세포의 침입, 이동 및 증식을 특징으로 한다. 이와 관련하여, 인테그린 αvβ3의 내피 접착 수용체는 항-혈관형성 치료 전략을 위한 혈관계-특이적 표적이 됨으로써 주요 작동자인 것으로 제시되어 있다[참조: Brooks, P.C., Clark, R.A. & Cheresh, D.A. (1994) "Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis", Science 264, 569-571; Friedlander, M., et al., (1995) "Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v integrins", Science 270, 1500-1502]. 혈관형성에 있어서 혈관 인테그린 αvβ3에 대한 요건은, 이식된 사람 종양에 의한 새로운 혈관의 생성을 인테그린 αvβ3 또는 항-αvβ3 항체 LM609의 펩타이드 길항제의 전신 투여에 의해 완전히 억제되는 몇몇 생체내 모델에 의해 입증되어 있다[참조: Brooks, P.C., et al., (1994) Science supra; Brooks, P.C., et al., (1994) "Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels", Cell 79, 1157-1164]. 쥐 하이브리도마 LM609는, 1987년 9월 15일에 부다페스트 조약하의 국제 기탁 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC: American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌 소재)에 기탁되어, ATCC 기탁번호 제HB 9537호를 부여받았다. 이러한 길항제는 증식성 혈관형성 혈관 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 촉진시키는 인테그린 αvβ3의 결합을 차단하여, 종양의 증식에 필수적인 과정인, 새롭게 형성된 혈관의 성숙을 붕괴시킨다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor)는, 내피 세포 분열유발을 자극시킬 수 있는 선택적 혈관형성 성장 인자로서 동정되어 있다. 사람 종양 생검은 악성 세포에 의한 VEGF mRNA 및 인접하는 내피 세포에서의 VEGF 수용체 mRNA의 발현이 증진되었음을 보여준다. VEGF 발현은 괴사의 무혈관 부위에 인접하는 종양의 영역에서 가장 두드러지는 것으로 보인다[개관용 참조: Thomas et al., (1996) "Vascular Endothelial Growth Factor, a Potent and Selective Angiogenic Agent", J. Biol. Chem. 271(2): 603-606]. 효과적인 항-종양 요법은 VEGF 수용체를 표적화하여 혈관형성을 억제하는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다 [참조: Witte L., et al., (1998) "Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2(Flk1/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy", Cancer Metastasis Rev 17(2):155-61].
파종성 악성 종양의 효과적인 치료법에 대한 주요 장애는 치료제의 전달에 대해 충분히 확립된 혈관 공급이 결핍된 미세전이를 특징으로 하는 최소 잔류 질환을 포함한다. 이와 관련하여, 신규한 면역요법 전략은 사이토킨을 종양 미세환경에 전달하는 종양 구획-특이적 모노클로날 항체를 사용하는데 있어서 효율적인 것으로 입증되었다. 이는 모노클로날 항체의 특유한 종양-특이적 표적화 능력 및 사이토킨의 면역조절 기능을 유지시키도록 생성된 재조합 항체-사이토킨 융합 단백질에 의해 달성된다. IL-2를 종양 구획으로 전달하는 항체-IL-2 융합 단백질의 사용은 종양 미세환경에 침입하는 이펙터(effector) 세포의 활성화를 유도하며, 3종의 상이한 유전적 동계 마우스 종양 모델에서의 확립된 미세전이의 효율적인 제거를 유발시킨다[참조: Becker, J.C., et al., (1996) "T cell-mediated eradication of murine metastatic melanoma induced by targeted interleukin 2 therapy", J Exp. Med 183, 2361-2366; Xiang, R., et al., (1997) "Elimination of established murine colon carcinoma metastases by antibody-interleukin 2 fusion protein therapy", Cancer Res. 57, 4948-4955; Lode, H.N., et al., (1998) "Natural Killer cell-mediated eradication of neuroblastoma metastases to bone marrow by targeted interleukin-2 therapy", Blood 91, 1706-1715]. 종양 전이의 초기 단계에서 매우 효과적이더라도, 이러한 종양 구획-지시된 접근법은 단지 완전히 발달된 혈관 구획을 특징으로 하는 종양 성장의 후반 단계에서 전이의 성장을 지연시킬 수 있었다. 이점에서, 본 발명자들은 특이적 혈관 및 종양 구획-지시된 치료 전략의 보충적 이점이 연속 및 동시 병용할 경우에 공동상승작용할 것인지의 여부에 대한 의문을 제시하였다.
이는 결장 암종, 흑색종 및 신경모세포종의 3종의 유전자 동계 마우스 종양 모델에서 시험하며, 이중 마지막 모델은 특발성 간 전이를 특징으로 한다. 모든 3종 모델은 사람에서의 질환과 밀접한 유사성을 나타낸다. 흑색종 및 신경모세포종 모델은, 상기 신경외배엽 악성 종양내에서의 충분히 확립된 종양-관련 항원인 디시알로강글리오사이드 GD2를 발현시키고[참조: Irie, R.F., Matsuki, T. & Morton, D.L. (1989) "Human monoclonal antibody to ganglioside GM2 for melanoma treatment", Lancet 1, 786-787; Handgretinger, R., et al., (1995) "A phase I study of human/mouse chimeric antiganglioside GD2 antibody ch14.18 in patients with neuroblastoma", Eur. J Cancer 31A, 261-267], 결장 암종 모델은, 사람에 있어서 수동적 면역요법을 위해 성공적으로 활용되는 표적 분자인 상피 세포 접착 분자(Ep-CAM, KSA, KS1/4 항원)의 발현을 특징으로 한다[참조: Riethmuller G., et al., (1994) "Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Duke's C colorectal carcinoma", Lancet 343, 1177-1183]. 이들 항원은 사람/마우스 키메라 항-GD2 항체(ch14.18-IL-2)[참조: Gillies, S.D., et al., (1992) "Antibody-targeted interleukin 2 stimulates T-cell killing of autologous tumor cells", Proc. Natl. Acad Sci. (U.S.A.) 892, 1428-1432] 및 사람화 항-Ep-CAM(항-KSA, 항-KS1/4 항원) 항체 KS1/4-IL-2[참조: Xiang, R., et al., (1997) supra.; Gillies, S., et al., (1998) "Antibody-IL-12 fusion proteins are effective in SCID mouse models of prostrate and colon carcinoma metastases", J Immunol. 160, 6195-6203]와의 항체-인터류킨-2 융합 단백질에 의해 표적화된 상기 모델에서의 종양 구획을 특이적으로 윤곽화한다. 몇몇 동물 모델에서 기술된 바와 같은, 이들 종양 모델의 혈관 구획은 새롭게 형성된 혈관 상에서의 인테그린 αvβ3의 발현에 의해 한정된다[참조: Brooks, P.C., et al., (1994) supra]. 본원에 제시된 데이터는 종양 및 원발성 종양과 원격 전이의 혈관 구획을 특이적으로 표적화하는 동시 및 연속적 치료의 공동상승작용적 효능을 입증한다. 이러한 공동상승작용의 메카니즘은, 단지 병용 요법으로 치료한 동물에서의 혈관 형성 감소 및 염증 증가에 의해 제공된다. 이러한 관찰은, 항-혈관형성을 종양-특이적 항-종양 면역요법 접근법과 병용할 경우의 유리한 효과를 강조한다.
발명의 요지
본 발명은, 종양 세포의 치료를 요하는 환자에게 종양 세포 증식 억제량의 혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 투여함을 포함하여, 상기 환자에서 종양 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다. 종양 세포 증식의 억제는 종양 또는 종양 전이를 나타내는 종양 세포 성장의 억제, 추가의 종양 전이 형성의 억제, 및 또한 종양 세포 사멸을 포함한다. 혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제는 실질적으로 동시에 및 연속적으로 투여할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은, 환자에게 하나 이상의 혈관형성 억제제 및 하나 이상의 항-종양 면역요법제를 병용 투여하여, 환자에서 종양 또는 종양 전이를 치료하는 방법을 기술한다. 상기 환자에서 종양 세포 증식의 유효한 억제는 이러한 방식으로 달성할 수 있다.
상기 환자에게 수술적 처치 전, 동안 또는 후에 상기한 치료학적 조성물을 제공하여, 종양 전체 또는 일부를 제거할 수 있다. 투여는, 적합한 제형의 직접 투입; 종양 매스에의 전신 또는 국부적 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 피하(s.c.), 근육내(i.m.) 또는 직접 주사; 및/또는 경구 투여에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 혈관형성 억제제는 새로운 혈관의 형성(혈관신생) 또는 존재하는 모세관 네트워크의 종양 세포에 근접한 조직으로의 확대를 억제할 수 있는 것이다. 적합한 혈관형성 억제제는 혈관형성 억제 활성을 갖는 펩타이드, 예를 들어, 종양 관련 항원 PSA일 수 있다. 다른 적합한 혈관형성 억제제는 VEGF 관련 혈관형성의 길항제, 예를 들어, 세포 표면 상의 VEGF 수용체의 길항제일 수 있다. 바람직한 혈관형성 억제제는 세포에 결합하는 αvβ3 인테그린의 길항제이다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 αvβ3 길항제는, 표적화된 조직 또는 세포에 투여할 경우에 종양 또는 종양 전이 관련 조직에서 혈관형성을 억제할 수 있는 것이다. 이러한 길항제는 αvβ3 수용체에 결합하여 혈관형성을 억제하는 특유의 선형 또는 사이클로-폴리펩타이드, 선형 또는 사이클로-RDG-함유 폴리펩타이드, 항체, 또는 αvβ3의 유사체일 수 있다.
αvβ3 길항제가 항체일 경우에, 이것은 폴리클로날, 모노클로날이거나, αvβ3 또는 αvβ3 수용체에 항원 결합 특이성을 갖는, 이의 항원 결합 단편일 수 있음을 고려한다. αvβ3 인테그린에 결합하는 바람직한 모노클로날 항체는 LM609(ATCC HB 9537)로서 동정된 모노클로날 항체이다.
바람직한 혈관형성 억제제는 표적 세포 상에서 인테그린 수용체를 억제할 수 있는 αvβ3 수용체 길항제인 폴리펩타이드이다. αvβ3 길항제의 가장 바람직한 양태는 합성 RGD-함유 펩타이드 사이클로(RGDfN-MeV)(서열 11) 등이다. 이러한 일반적 유형의 사이클릭 펩타이드는 미국 특허 제5,262,520호(Plow et al.)에 기술되어 있다. 비-RDG 함유 펩타이드는 미국 특허 제5,780,426호(Palladino et al.)에 기술되어 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 항-종양 면역요법제는 종양 관련 항원 표적화 성분에 결합된 세포 이펙터 성분을 포함하는 면역요법제이다. 적합한 세포 이펙터 성분은 세포독성 화학물질, 세포독성 방사성 동위원소, 및 세포 시그날 전달제, 예를 들어, 사이토킨을 포함할 수 있다.
적합한 종양 표적화 성분은 종양 세포의 주위 조직 매트릭스위에 또는 내에 존재하는 종양 관련 항원에 결합하는 폴리펩타이드 쇄, 예를 들어, 수용체 단백질 쇄 또는 면역글로불린 쇄이다.
면역요법제의 표적으로 사용할 수 있는 종양 관련 항원은 AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, EGF 수용체, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM(KSA), IL-2 수용체, 루이스(Lewis)-Y, 루이스-X(CD 15), 흑색종-관련 프로테오글리칸 MCSP, PSA 및 트랜스페린 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 관련 항원을 포함한다.
바람직한 면역요법제는 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 쇄인 표적화 성분에 결합된 사이토킨 폴리펩타이드인 이펙터 성분을 갖는다. Ig 폴리펩타이드 쇄는 종양 관련 항원에 결합하는 가변 영역을 포함한다. 적합한 보충성 쇄(즉, 중쇄는 경쇄를 보충한다)와 병용할 경우에, 상기 면역글로불린 쇄가 종양 관련 항원에 특이적인 항체 활성 부위를 한정하는 것이 바람직하다.
면역요법제의 종양 표적화 Ig 부분은 전체 면역글로불린 쇄 아미노산 서열, 또는 단백질의 항원 결합 특이성 부분을 포함하는 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 이와 같이, 적합한 Ig 폴리펩타이드 쇄는 종양 관련 항원에 특이적인 하나 이상의 Ig 가변 영역을 가질 것이다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 항체 및 이로부터의 폴리펩타이드 쇄는 포유동물 기원일 수 있는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 항체 단백질이 예정된 환자와 동일한 기원이 아닐 경우, 항체 단백질의 단편, 예를 들어, F(ab')2, Fab, Fv 또는 조작된 Fv 단일 쇄 항체 단백질을 사용할 수 있다. 항체 단백질의 항원성을 보다 저하시키기 위해, 항체 아미노산 서열의 변형을 달성하여, 당해 단백질을 환자의 정상 항체 성분과 보다 유사한 형태가 되도록 함으로써 이를 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 항체의 사람화를 위한 다양한 방법에 의해 사람 환자에 투여하기 위해, 모노클로날 쥐 항체 아미노산 서열을 변형시켜, 보다 사람과 유사한 형태가 되도록 할 수 있다.
또는, 항체는 사람 기원(사람 Ig 유전자에 의해 유전학적으로 암호화됨)일 수 있으나, 이들 자체의 고유 Ig 유전자 대신에 사람 Ig 유전자를 발현시키도록 형질전환된 형질전환 동물에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 사람 Ig 단백질을 암호화하는 사람 기원 DNA를 발현시키는 형질전환 마우스를 작제할 수 있다. 상기 형질전환 마우스로부터의 모노클로날 항체의 생성은 사람 기원 아미노산 서열을 갖는 항체를 암호화하는 사람 DNA를 발현시키는 마우스 B-세포 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 이는 사람 환자를 치료하는데 사용하는 상기 항체의 면역원성을 상당히 저하시킬 것이다.
사람 환자를 치료할 경우에, 청구된 본원의 방법에서 사용하기에 바람직한 항체는 사람화 항-GD-2 종양 관련 항원 모노클로날 항체 ch14.18 및 항-KS1/4 종양 관련 항원(Ep-CAM 및 KSA로서도 공지되어 있음) 모노클로날 항체 KS1/4이다.
본 발명을 구체화하는 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기에 적합한 면역요법제의 세포-이펙터 성분은 BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, 감마-IP-10, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL- 16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 내지 MCP-3, M-CSF, MIF, MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF 알파, TGF 베타, TNF 알파, Tpo 및 VEGF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이토킨이다. 케모킨인 적합한 사이토킨은 C10, EMF-1, ENA-78, 에오탁신, GCP-2, HCC-1, I-309, IL-8, IP-10, 림포탁틴, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 및 SDF-1로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 위에서 언급한 면역요법제의 사이토킨 일부는 전체 사이토킨 단백질 아미노산 서열이거나 사이토킨-특이적 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 이러한 융합 단백질의 단편일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 면역요법제의 사이토킨 부분은 IL-2의 생물학적 활성을 갖는다.
Ig 폴리펩타이드에 결합된 사이토킨 폴리펩타이드를 포함하는 면역요법제에 있어서, 사이토킨 폴리펩타이드 쇄와 Ig 폴리펩타이드 쇄 사이의 적합한 접합부는 직접 폴리펩타이드 결합, 2개의 쇄 사이에 폴리펩타이드 링커를 갖는 접합부, 또는 비오티닐화 및 아비딘-비오틴 복합체의 사용을 포함한 쇄 사이의 다른 화학적 결합부를 포함한다. 바람직한 접합부는 직접 또는 폴리펩타이드 링커 스페이싱 폴리펩타이드 결합부이다. 이러한 직접 결합부는 융합 단백질 면역요법제를 암호화하는 적합한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로부터의 단일 융합 단백질로서의 면역요법제의 발현을 가능하게 한다.
이와 같이, 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 면역요법제는 사이토킨 성분 및 종양 관련 항원에 대한 특이성을 갖는 Ig 폴리펩타이드 쇄인 종양 관련 관련 항원 표적화 성분을 갖는 이작용성 융합 단백질이다. 이러한 바람직한 면역요법제의 예는 GD2 표적화된 융합 단백질 ch14.18-IL-2, 및 KS1/4 종양 관련 항원(Ep-CAM 및 KSA로도 공지되어 있음) 표적화된 융합 단백질 KS1/4-IL-2를 포함한다.
또는, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기에 적합한 또 다른 면역요법제는 세포독성제인 세포 이펙터 성분을 가질 수 있다. 적합한 세포독성제는 종양 세포에 대한 직접적 세포독성 효과를 갖는 것, 즉, 면역독소, 방사성 동위원소, 세포독성 약물 등이다. 상기한 사이토킨 면역요법제와 같이, 세포독성 펩타이드를 종양 관련 항원 표적화 Ig 폴리펩타이드에 결합시켜, 융합 단백질을 직접적으로 또는 링커 펩타이드 또는 쇄에 의해 스페이싱시켜 형성시킬 수 있다. 화학적 세포독소를 표적화 Ig 쇄에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 방사성 동위원소 보유 항체 쇄를 작제할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 포함하는 치료학적 조성물을 포함한다. 항-종양 면역요법제가 세포 이펙터 성분에 결합된 종양 관련 항원 특이성 성분을 보유함으로써 종양 또는 종양 전이를 표적화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 치료학적 조성물에 있어서, 항-종양 면역요법제는, 종양 관련 항원에 결합하는 가변 영역을 포함하는 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 쇄인 종양 표적화 성분에 결합된 사이토킨 폴리펩타이드인 이펙터 성분을 갖는 이작용성 단백질이다.
본 발명의 또 다른 국면은 종양 또는 종양 전이를 치료하기 위한 키트이다. 당해 키트는 혈관형성 억제제, 예를 들어, 상기 종양 또는 상기 종양 전이에서 혈관형성을 억제할 수 있는 αvβ3 길항제; 사이토킨 활성 및 종양 항원 특이성을 갖는 이작용성 단백질 성분; 및 종양 및 종양 전이에서의 종양 세포 치료에 대한 지침서를 포함하는 팩키지를 포함한다. 당해 키트는 또한 종양 또는 종양 전이를 치료하기 위한 키트 성분의 용도를 지시하는 특수 라벨링을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 하기 첨부된 도면을 참조로 하여 아래에 기술한다.
도 1은, 항-혈관형성 αv 인테그린 길항제와, 항체-Il-2 융합 단백질을 사용하는 항-종양 구획-특이적 면역요법과의 병용 요법의 원발성 종양에 대한 효과를 그래피로 도시한다. 도 1A는 NXS2 신경모세포종의 피하 주사(2x106개)에 의해 유도된 원발성 종양으로부터의 결과를 도시한다. 도 1B는 CT26-KSA 결장 암종의 피하 주사(2x106개)에 의해 유도된 원발성 종양으로부터의 결과를 도시한다. 도 1C는 B78-D 14 흑색종 세포의 피하 주사(2x106개)에 의해 유도된 원발성 종양으로부터의 결과를 도시한다.
도 2는, 항-혈관 및 항-종양 병용 요법의 혈관생성 및 항-종양 면역 반응에 대한 효과를 도시한다. 도 2A는 인테그린 αv 길항제, ch14.18-IL-2 융합 단백질 또는 이의 배합물을 사용한 혈관 및 종양 구획 치료에 따른 원발성 종양의 혈관 밀도에 대한 결과(*P<0.001, 스튜던트 T-시험)를 도시한다. 도 2B는 각각의 혈관 및 종양 구획 치료 후의 원발성 종양의 백혈구 침윤에 대한 결과를 도시한다(*P<0.001, 스튜던트 T-시험).
도 3은, 항-혈관형성 αv 인테그린 길항제 및 항체-IL-2 융합 단백질을 사용하는 항-종양 구획-특이적 면역요법의 연속적 병용의 특발성 간 신경모세포종 전이에 대한 연속적 병용 효과를 그래프로 도시한다. 특발성 간 전이의 수는 간 병소(n=8)의 육안적 계수에 의해 측정한다(**P<0.01, 윌콕슨 순위-합 시험(Wilcoxon Rank-Sum Test)).
도 4는, 항-혈관형성 인테그린 αv 길항제 및 항-IL-2 융합 단백질을 사용하는 항-종양 구획-특이적 면역요법을 실질적으로 동시에 병용할 경우에 특발성 간 신경모세포종 전이에 미치는 영향을 그래프로 도시한다. 원발성 종양의 제거 전(도 4A) 또는 후(도 4B)에 개시된 인테그린 또는, 길항제(17.5㎍/h) 및 종양-특이적 ch14.18-IL-2 융합 단백질(5㎍ x 5h)로 치료한 결과를 제시한다. 특발성 간 전이는 간 병소(n=8)의 육안적 계수에 의해 측정한다(**P<0.01, 윌콕슨 순위-합 시험).
원발성 종양 및 원격 전이의 억제 및 근절이 혈관형성의 억제 및 표적화된 면역요법과 같은, 암에 대한 대체 치료 전략의 주요 목표이다.
본 발명에 이르러, (1) (항-혈관형성) 혈관형성 억제 요법 및 (2) 항-종양 면역요법으로 본원에서 불리는 2가지 치료 방식의 병용에 의해 종양 및 종양 전이에서 종양 세포를 치료하는데 있어 효과면에서 예상외의 공동상승작용이 존재한다는 것을 발견하였다. 특히, 병용된 αv 길항제 요법 및 항-종양 항원/사이토킨 융합 단백질 요법을 기술한다.
본 발명에 이르러, 공동상승작용이 혈관 및 종양 구획에 대해 지시된 2가지 특유의 단독요법; 각각 종양 혈관-특이적 항-혈관형성 인테그린 αv 길항제 및 종양-특이적 항체-인터류킨-2 융합 단백질 사이에서 발생함이 밝혀졌다.
이들 단독 요법의 동시 및 연속적 병용은 신경모세포종의 불량한 면역원성 공동상승작용적 모델에 있어 특발성 간 전이를 효과적으로 근절한다. 이는, 적용된 투여량 수준에서 단지 부분적으로 효과적인 항-혈관형성 인테그린 αv 길항제 또는 항체-IL-2 융합 단백질을 사용하는 단독요법에 적용시킨 대조군과는 대조적이다.
또한, 인테그린 αv 길항제 및 종양-특이적 항체-IL-2 융합 단백질을 사용한 동시 치료는 3종의 공동상승작용적 쥐 종양 모델, 즉 흑색종, 결장 암종 및 신경모세포종에 있어서 현저한 원발성 종양 퇴행을 유도한다. 그러나, 단독요법으로서 단독으로 사용된 각각의 제제는 단지 종양 성장의 지연만을 유도한다.
항-종양 반응은 종양 혈관 밀도의 동시 50% 감소 및 종양 미세환경에서의 염증성 세포의 5배 증가를 수반한다. 후속적으로, 종양 괴사는 병용 요법을 제공받은 동물에서만 입증되며, 각각의 제제를 단독요법으로 적용할 경우에는 입증되지 않는다. 이러한 결과는, 이들 공동상승작용적 치료 방식이 전이 암의 추가 요법에 대한 신규하고 효과적인 수단을 제공함을 제시한다.
본 발명은, 본원에 기술된 공동상승작용적 요법을 실행하는데 유용한, 종양 및 종양 전이의 치료 방법, 치료학적 조성물 및 치료학적 키트(팩키징 시스템)를 기술한다.
1. 치료학적 조성물
본 발명의 방법을 실행하는데 있어서 유용한 다양한 치료학적 조성물을 기술한다. 당해 조성물은 αvβ3 길항제와 같은 (항-혈관형성) 혈관형성 억제 시약 및 종양 항원/사이토킨 융합 단백질과 같은 항-종양 제제를 단독으로 또는 다양한 배합물로 포함한다.
A. 혈관형성 억제제
본 발명의 조성물과 방법으로 치료할 조직에서 혈관형성을 억제하는 혈관형성 억제제를 당해 조성물과 방법에서 사용할 수 있다. 바람직한 혈관형성 억제제는 αv 길항제, 특히 αvβ3 길항제이다. 혈관형성 억제 (항-혈관형성) αvβ3 길항 제는 펩타이드, RGD-함유 펩타이드, 항-αvβ3 항체, 항-αvβ3 수용체 항체 또는 αvβ3 유사체일 수 있다. 전형적인 αvβ3은 미국 특허 제5,753,230호(Brooks & Cheresh) 및 미국 특허 제5,766,591호(Brooks & Cheresh)의 교시에 기술되어 있으며, 본원에 참고로 구체적으로 인용되어 있는 이의 기술은 αvβ3 길항제의 제조법 및 용도에 관한 것이다.
바람직한 길항제는 RGD-함유 펩타이드, 예를 들어, 사이클릭 펩타이드 사이클로(RGDfN-MeV)(서열 11)이다. αvβ3 길항제로서 작용하는 유기 유사체 및 비-RGD 함유 사이클릭-펩타이드를 포함한 추가의 길항제가 문헌[참조예: Brooks et al., International Publication No. WO 97/45137, (PCT/US97/09158)]에 기술되어 있다.
길항제로서 사용하기에 적합한 αvβ3 길항제의 동정을 위한 검정법이 참조된 미국 특허에 기술되어 있으므로, 본 발명의 방법을 실행하기 위해 대체 길항제를 용이하게 동정할 수 있는 것으로 간주된다.
적합한 항-αvβ3 모노클로날 항체를, F(ab)2, Fab, 및 조작된 Fv 또는 단일 쇄 항체(SCA)를 포함한 이의 항원 결합 단편을 포함하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 단편을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조예: Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996]. 항체 사용을 기술하는 본 발명의 방법은 또한 전체 항체의 이의 항원 결합 단편으로의 적합한 변형법을 포함한다. 한 적합한 모노클로날 항체는 LM609(ATCC HB 9537)로서 동정되어 있다.
기타 αvβ3 수용체 길항제는 혈관형성을 억제하는데 유용한 것으로 제시되어 있으며, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합할 것이다. 예를 들어, (S)-10,11-디하이드로-3-[3-(피리딘-2-일아미노)-1-프로필옥시]-5H-디벤조[a,d]사이클로헵텐-10-아세트산(SB-265123으로 공지되어 있음)과 같은 화학적 수용체 길항제를 다양한 포유동물 모델 시스템에서 시험하였다[참조예: Keenan RM et al., (1998) Bioorg Med Chem Lett 8(22): 3171-6; Ward KW et al., (1999) Drug Metab Dispos 27(11):1232-41].
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 선택적 혈관형성 성장 인자로서 동정되어 있다. 이와 같이, 대체 또는 추가의 혈관형성 억제제는 혈관형성 성장을 억제하기에 충분한 VEGF 활성의 억제제일 수 있다. 이러한 억제제는 경쟁적 억제제 또는 VEGF 결합/불활성화 분자, 또는 VEGF 수용체 길항제일 수 있다. 예를 들어, 가능한 억제제는 VEGF 표적/수용체로의 결합에 대해 경쟁하는 비-혈관형성 화학적 유사체, 변형된 비-혈관형성 VEGF 유도체, 혈관형성 활성을 억제하기에 충분히 VEGF와 특이적으로 결합하는 항체, 또는 VEGF와 결합하는 가능한 또 다른 특이적 단백질(예를 들어, 분리된 VEGF 수용체 단백질), 또는 VEGF 수용체에 결합하여 VEGF와의 상호작용을 차단하는 항체일 수 있다.
기타 화합물이 혈관형성을 억제하는 화합물, 예를 들어, 분리된 종양 관련 항원 PSA에 대한 능력을 기초로 하여 동정되었다.
B. 항-종양 면역요법제
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 방법과 조성물은 하나 이상의 (항-혈관형성) 혈관형성 억제 치료제와 하나 이상의 항-종양 면역요법제의 병용 투여를 고려한다. 바람직한 항-종양 면역요법제는 종양 표적화 성분을 세포 이펙터 성분, 예를 들어, 사이토킨, 면역독소, 방사성 제제 등과 배합한다. 종양 표적화 성분은 바람직하게는 종양 관련 항원에 대해 유도된 항체의 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 이펙터 성분은 사이토킨이다.
a) 종양 관련 항원
종양 관련 항원은 표적물이 되어 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 사용되는 면역요법제가 궁극적으로 종양 세포로 표적화된다. 종양 관련 항원은 특정 유형의 암과 서로 관련되는 것으로 당해 분야에 인지되어 있다. 거의 모든 경우에, 종양 관련 항원은 암 종양의 기원과 관련된 정상 세포에서 통상적으로 발견되지 않는 방식으로 발현되는 세포 표면 항원이다. 다른 종양 관련 항원은 성숙한 정상 조직과 관련하여 통상적으로 발견되지 않는 분비된 분자 또는 세포외 매트릭스 관련된 성분이다.
특정의 종양 관련 항원은, 조직의 초기 발생 단계에서 발현되고 통상적으로 성숙한 조직과 관련되지 않는 단백질(때때로 종양태아성 단백질로 칭함)이다. 다른 종양 관련 항원은 정상의 성숙한 세포에 의해 발현되지만, 암 세포에 의해 보다 다량 발현된다. 종양 관련 항원은 통상적으로 발현된 세포 마커 또는 세포외 성분의 변형된 형태일 수 있다. 또한, 다른 종양 관련 항원은 단백질, 지질 또는 세포외 성분의 글시리코실화의 변형되거나 비통상적인 형태, 또는 신규한 탄수화물 성분과 관계가 있다.
이와 같이, 종양 관련 항원은 광범위하게 변화하며, 본 발명에 의해 치료할 종양의 유형을 최소한 일부 한정할 수 있다. 다양한 종양 유형 및 이에 의해 발현되는 종양 항원은 다양하며, 지금까지 암 분야에서 충분히 연구되어 있다.
종양에 대한 다수의 추가 마커는 연구 중이며, 일단 종양 관련 항원인 것으로 동정되고 특성화되면, 이들은 또한 면역요법제를 목적하는 종양 또는 전이 부위에 대해 표적화하는데 적합한 표적 항원이다.
항-루이스-Υ 항원 모노클로날을 사용하여 유전자 요법 벡터를 암 세포에 대해 표적화하는 것이 문헌[참조: Kurane S et al., Jpn J. Cancer Res 89(11):1212-9 (1998)에 보고되어 있다. 유사하게는, 항-강글리오사이드 GM3 항체 또는 항-루이스-X 항원 항체를 사용한 리포좀의 표적화가 문헌[참조: Nam, S.M., et al,. Oncol Res 11(1): 9-16 (1999)]에 보고되어 있다.
아래에 논의된 바와 같이, 당해 분야의 방법은, 동정된 항원을 당해 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적합한 항체를 생성시키는데 이용하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법에서 유용한 종양 항원을 동정할 수 있고, 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 종양 항원의 제조법을 개관하기 위해, 문헌[참조: Human Cancer Markers, The Humana Press Inc., eds. Sell and Wahren, 1982]의 교시를 참조한다.
항원 및/또는 사이토킨 등을 제조하는데 적용가능한 표준 생화학 및 분자 생물학 기법은 문헌[참조예: Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning second ed. (Cold Spring Harbor Press, CSH NY)]에서 찾아볼 수 있다.
종양 세포 표면 항원은 종양의 부류 또는 종양의 각각의 유형에 특이적일 수 있다. 종양 관련 항원에 관련되고 이를 암호화하는 다수의 핵산 및/또는 아미노산 서열은 다양한 서비스에 의해 인터넷을 통해 접근하기 쉬운 공개 컴퓨터 데이터베이스, 즉, NCBI(국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information); www3.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수가능하고, 일반적으로 명칭 및 기탁 번호에 의해 동정된다(접근하기 쉬운 서열 정보의 유형의 몇몇 비제한적 예는 주석 "기탁 번호 참조"에 의해 언급된다).
바람직한 종양 관련 항원 표적은 AFP(기탁 번호 제NP 001125호 참조), CA125(기탁 번호 제NP 005890호 참조), CEA(기탁 번호 제AAA62835호 참조), CD19(기탁 번호 제P15391호 참조), CD20(기탁 번호 제P11836호 참조), CD44(기탁 번호 제P16070호 참조), CD45(기탁 번호 제P08575호 참조), EGF 수용체(기탁 번호 제P00533호 참조), GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu(기탁 번호 제AAA58637호 참조), Ep-CAM(KSA)(기탁 번호 제P16422호 및 제AAA36151호 참조), IL-2 수용체(기탁 번호 제P14784호, 제NP000197호 및 제P01589호 참조), 루이스-Y, 루이스-X(CD 15), 흑색종-관련된 프로테오글리칸 MCSP(기탁 번호 제NP 001888호 참조), PSA(기탁 번호 제P07288호 참조), PMSA, 트랜스페린 수용체(기탁 번호 제NP 003218호, 제NP 003225호 및 제AAF04564호 참조), 췌장 암종 마커 단백질 GA733-1(기탁 번호 제P09758호), 엽산염 수용체(기탁 번호 제NP 000793호 참조), L6(기탁 번호 제P30408호 참조) 및 CO-029(기탁 번호 제A36056호 및 제P19075호 참조)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
면역요법제의 표적화를 위해 특히 바람직한 종양 관련 항원 표적은 본원에 기술된 GD2 및 KSA(Ep-CAM, KS1/4 항원)이다.
종양 관련 항원 단백질은 상업적으로 구입가능하거나, 당해 분야에 공지된 표준 재조합 DNA 및 세포 배양물, 단백질 발현 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 시그마(Sigma, St. Louis, MO)는 디시알로강글리오사이드 GD2(G 0776), 디시알로강글리오사이드 GD3(G 5904), 모노시알로강글리오사이드 GM1(G 7641), 모노시알로강글리오사이드 GM2(G 4651) 위장 종양 항원 Ca 19-9(G 8660, G 8535), 암배아성 항원 CEA(C4835), 루이스-X 트리사카라이드(L 5152) 및 루이스-Y(L 7401)를 판매용으로 카달로그에 기재하고 있다.
다수의 상기 종양 관련 항원에 특이적인 항체는 상업적으로 구입가능하다(예: USB, RDI, Accurate Chemical and Scientific Corp., Zymed Lab). 예를 들어, 시그마(St. Louis, MO)는 다수의 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-AFP(A 8452), 항-CEA(C2331), 항-EGF 수용체(E 3138), 항-IL-2 가용성 수용체(I 5652, I 5777, I 5902), 항-CD19(F 3899), 항-CD20(C8080), 항-CD44(C7923) 및 항-CD45(C7556)을 판매하고 있다.
상업적으로 구입할 수 없는 경우에도, 모노클로날 항체를 제조하는 공지된 방법을 이용하고, 면역원으로서 항원을 사용하여 종양 관련 항원에 특이적인 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항-루이스-Y 항원 쥐 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 기술되어 있다(기탁 번호 제AAB25798호 및 제AAB25799호 참조). 유사하게는, 항-아시알로 GM1 강글리오사이드 쥐 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 기술되어 있다(기탁 번호 제AAD09194호 및 제AAD09195호). 항-GD2 강글리오사이드 모노클로날 항체 중쇄 및 경쇄에 대한 결정구조가 밝혀졌다(기탁 번호 제2554841호 및 제2554842호 참조). 난소 암에 대한 마커로서 동정된, 엽산염 수용체에 결합하는 항체(결합 단백질)가 보고되어 있다(기탁 번호 제NP 000793호 참조). 항-CA125 모노클로날 가변 영역 중쇄 및 경쇄 핵산 서열이 또한 보고되어 있으며, 카세트 벡터내로의 삽입에 사용된다(기탁 번호 제AAB33454호 및 제AAB33455호 참조).
특히 바람직한 항체는 본원에 기술된 ch14.18 및 KS1/4 항체이다.
b) 모노클로날 항체 및 이의 항원 결합 부분 등
코흘러(Kohler) 및 밀슈타인(Milstein)에 의해 처음으로 공개된 모노클로날 항체를 생성시키는 방법의 출현 이후, 개선된 방법이 당해 분야에 익히 공지되었다[참조예: Dean, C.J. in Methods in Molecular Biology Vol. 80: Immunochemical Protocols, 2nd ed. (Pound, J.D. editor, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) chapter 4; 및 Ausbel, F.M., et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed. (Current Protocols, John Wiley & Sons, NY NY, 1992) chapter 11]. 이는 현재 특정 항원에 결합하는 모노클로날 항체를 생성시키는 일상적인 수행방법이다. 선별 프로토콜은 또한 필요에 따라 고-친화성 결합 항체의 선별을 위해 개선되었다.
전형적으로는, 하이브리도마의 제조를 위한 숙주는 유도된 마우스 또는 다른 설치류이다.
사람 환자에 대한 쥐 모노클로날을 사용한 반복된 치료에 대한 한가지 장애물은 당해 치료에 대한 반응으로 환자에 의해 생성된 HAMA(human anti-mouse antibody: 사람 항-마우스 항체)이다. 이러한 장애물을 극복하는 방법은, 보다 덜 항원성인 것으로 간주되는 마우스 단백질의 항원성 아미노산을 사람 단백질 서열로 대체함에 의한 쥐 항체 단백질의 사람화를 포함한다. 다른 방법은 결합 특이성 결정 아미노산 잔기 또는 영역을 사람 단백질 골격에 이식시킴을 포함한다.
항체 단백질을 파아지 디스플레이 시스템에서 발현시키는 능력은 결합을 향상시키거나 면역원성을 저하시키는 돌연변이유발에 적용된 항체의 선택을 가능하게 한다[참조예: Antibody Engineering, McCafferty, J., et al. editors, Oxford University Press, 1996]. 최근에, 사람 면역글로불린 유전자의 형질전환 쥐내로의 치환은, 항체, 이를테면, 사람 핵산 서열 기원인 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 쥐 숙주의 사용을 가능하게 하였다.
저하된 항원성을 가능하게 하거나, 보다 소형인 치료학적 분자를 생성시키는 단편화에 의해 항체의 크기를 감소시킬 수도 있다. 예를 들어, 적합한 효소를 사용하여 분해하거나 재조합 DNA 방법에 의해 보다 소형인 단백질을 제조함으로써 전체 항체 단백질을 감소시킬 수 있다. 적합한 단편은 전체 분자 중의 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함할 수 있고, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fv 또는 단일 쇄 Fv(단일 쇄 항체; SCA) 작제물을 포함할 수 있다.
사람을 치료하기 위한 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 치료제의 모든 모노클로날 항체계 성분은 상기한 바와 같은 면역원성 및 잠재적인 HAMA를 감소시키는 변형에 의해 이익을 수득할 수 있는 것으로 간주된다.
상기한 면역요법제의 표적화 성분으로서 특정 종양 관련 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 수용체 단백질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 기능적으로는, 특이적 수용체는 표적 종양 관련 항원에 대한 수용체 특이성 및 친화성에 따른 표적화에 대한 특이적 항체만큼 유용할 것이다. 반드시 종양과 관련된 것은 아닌 유사한 단백질에의 교차-반응성 결합의 영향을 최소화하는데 주의하여야만 한다.
c) 사이토킨
한 실시양태에서, 본 발명의 항-종양 면역요법성 작제물은 바람직하게는 사이토킨인 세포 이펙터 부분을 포함한다.
본 발명의 항-종양 치료제의 이펙터 성분은 사이토킨에 대한 수용체를 보유하는 세포에 의해 사이토킨-특이적 생물학적 반응을 유도하는 임의의 다양한 사이 토킨을 포함할 수 있다. 사이토킨은 충분히 특성화되어 있으므로, 본 발명은 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 사이토킨은 케모킨으로 호칭되는 분자를 하위부류로서 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 케모킨은 사이토킨 아상과(superfamily)의 일원으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 사이토킨은 일반적으로 사이토킨 및 케모킨 둘 다를 의미한다. 사이토킨 분야의 기술에 대해서는, 문헌[Callard and Gearing, The Cytokine Facts Book, Academic Press, Inc., 1994]을 참조한다. 케모킨 분야의 기술에 대해서는, 문헌[Vaddi et al., The Chemokine Facts Book, Academic Press, Inc., 1997]을 참조한다. 사이토킨과 관련된 다수의 핵산 및/또는 아미노산 서열은 다양한 서비스에 의해 인터넷을 통해 접근하기 쉬운 공개 컴퓨터 데이터베이스, 즉, NCBI(국립 생명공학 정보 센터; www3.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수가능하고, 일반적으로 명칭 및 기탁 번호에 의해 동정된다(본원에 인용된 서열에의 접근법의 몇몇 비제한적 예는 동정 번호를 참조로 하여 주석 "기탁 번호 참조"에 의해 언급한다).
포유동물로부터의 사이토킨은 종 특이적일 수 있고, 또한 돌연변이 및/또는 대립유전자 변이로 인해 종내에서 변화할 수도 있다. 적합한 사이토킨은 치료할 포유동물의 종에 따라 용도를 선택할 수 있다. 다중 대립유전자가 존재할 경우, 사이토킨 활성에 따라 선택할 수 있거나, 대립유전자 변이체를 조합하여 선택된 사이토킨으로서 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법의 수의학적 용도는 치료할 동물의 종, 또는 표적 종으로부터 입수가능하지 않을 경우에 선택된 보다 밀접하게 관련된 종으로부터의 사이토킨 선택에 맞게 적합화시킬 수 있다. 사람 치료의 경우, 공지되어 있는 사람 동족체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 사이토킨은 BDNF(기탁 번호 제4502393호 참조), CNTF(기탁 번호 제4758020호 참조), EGF(기탁 번호 제p01133호 참조), Epo(기탁 번호 제4503589호 참조), FGF(기탁 번호 제CAB61690호 참조), Flt3L, G-CSF(기탁 번호 제CAA27290호 참조), GM-CSF(기탁 번호 제4503077호 참조), I-309/TCA-3, 감마-IP-10(기탁 번호 제P02778호 참조), IFN 알파(기탁 번호 제P01563호 참조), IFN 베타(기탁 번호 제P01574호 참조), IFN 감마(기탁 번호 제P01579호 참조), IL-1 내지 IL-18(기탁 번호 제P01583호, 제P01584호, 제P01585호, 제P08700호, 제05112호, 제P05113호, 제P05231호, 제P13232호, 제P41324호, 제P15248호, 제P22301호, 제P20809호, 제P29459호, 제P46658호, 제P35225호, 제P40222호, 제P40933호, 제Q14005호, 제NP002181호, 제Q14116호 참조), LIF(기탁 번호 제AAC05174호 참조), LT(기탁 번호 제4504031호 참조), MCP-1 내지 MCP-3, M-CSF(기탁 번호 제4503075호 참조), MIF(기탁 번호 제4505185호 참조), MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NGF(기탁 번호 제4505391호 참조), NT-3(기탁 번호 제P20783호 참조), NT-4(기탁 번호 제P34130호 참조), OSM(기탁 번호 제P13725호 참조), PBP(기탁 번호 제4505621호 참조), PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF(기탁 번호 제P21583호 참조), TGF 알파(기탁 번호 제P01135호 참조), TGF 베타(기탁 번호 제P01137호 참조), TNF 알파(기탁 번호 제P01375호 참조), Tpo(기탁 번호 제P40225호 참조) 또는 VEGF(기탁 번호 제AAD03710호 참조)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 케모킨은 C10(기탁 번호 제P33861호 참조), EMF-1(기탁 번호 제P08317호 참조), ENA-78(기탁 번호 제A55010호 참조), 에오탁신(기탁 번호 제BAA84579호 참조), GCP-2(기탁 번호 제P80162호 참조), HCC-1(기탁 번호 제g1004267호 참조), I-309(기탁 번호 제g4506833호 참조), IL-8(기탁 번호 제AAA59158호 참조), IP-9(기탁 번호 제CAA75510호 참조), IP-10(기탁 번호 제4504701호 참조), 림포탁틴(기탁 번호 제4506853호 참조), MCP-1(기탁 번호 제4506841호 참조), MCP-2(기탁 번호 제P80075호 참조), MCP-3(기탁 번호 제CAB59723.1호 참조), MCP-4(기탁 번호 제Q99616호 참조), MGSA(기탁 번호 제P09341호 참조), MIG(기탁 번호 제P35625호 참조), MIP-1알파(기탁 번호 제P10855호 참조), MIP-1베타(기탁 번호 제P13236호 참조), MIP-2, NAP-2(기탁 번호 제P20775호 참조), PF4(기탁 번호 제4505733호 참조), RANTES(기탁 번호 제4506847호 참조), SCM-1(기탁 번호 제P47992호 참조) 또는 SDF-1(기탁 번호 제P48061호 참조)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 사이토킨은 IL-2 및 IL-12, 또는 전체 온전한 분자의 이펙터 활성 중 최소 일부를 보유하는, 생물학적으로 활성인 이의 단편을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 사이토킨은 IL-2이다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 사이토킨은 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 적합한 핵산 서열로부터 제조할 수 있다. 유전자 발현 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조예: Goeddel, D.V. editor, Methods in Enzymology Vol 185: Gene Expression Technology (Academic Press, Inc., NY NY, 1991)]. 사이토킨은 또한 상업적 공급원(즉, 시그마, St. Louis MO)으로부터 구입가능하다.
d) 항-종양/사이토킨 면역요법제
본 발명을 수행하는데 적합한 이들 항-종양 면역요법제는 종양 표적화 성분에 결합된, 바람직하게는 사이토킨인 세포-이펙터 성분을 포함한다. 종양 결합 성분과 이펙터 성분과의 결합은 다양한 방법에 의해 달성할 수 있다.
1) 항체 융합 단백질
사이토킨 기능을 종양 항원을 보유하고 있는 세포 또는 조직에 대해 표적화하고, 이에 의해 사이토킨을 사용하여 종양 항원을 보유하거나 이와 관련된 세포에 대한 면역 반응을 유발시키는 면역요법성 항암 시약이 기술되어 있다. 이들 면역요법제는, 융합 단백질이 예비선택된 종양 관련 항원과 면역반응하는 재조합 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 쇄와 사이토킨과의 융합물을 포함하기 때문에 항-종양 항원/사이토킨 융합 단백질로 언급된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 면역요법성 항-종양 항원/사이토킨 융합 단백질 제제는 적어도 항원 결합 부분을 포함하는 항체 단백질 단편과, 사이토킨 생물학적 시그날 전달 기능을 보유하기에 충분한 적어도 사이토킨의 이펙터 부분을 포함하는 사이토킨과의 융합 작제물을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 직접적이거나 링커 펩타이드(들)에 의해 가교될 수 있다.
항-종양 항원/사이토킨 융합 단백질은 당해 분야에 공지되어 있고, 특히 미국 특허 제5,650,150호(Gillies)에 기술되어 있으며, 융합 단백질의 제조법 및 용 도에 관한 당해 문헌의 기술은 참고로 본원에 명백하게 인용되어 있다.
융합 단백질은 세포 표면 항원인 다양한 종양 항원 중의 하나에 대해 유도될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 사이토킨 및 Ig 중쇄를 사용한 융합 단백질의 제조법은 공지되어 있으며, 이는 모노클로날 항체로부터 유래된 재조합 Ig 중쇄의 제조법이다. 또한, 모노클로날 항체의 제조법은 확립된 기술 분야이며, 종양 항원에 대한 상기 항체를 제조하는 방법이 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 제조법에 관한 교시는 문헌[참조: "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., eds, Reisfeld and Sell, 1985]을 포함한다.
전형적으로는, Ig 폴리펩타이드 쇄는 세포 표면 종양 항원을 보유하는 세포에 특이적인 N-말단 가변 영역을 포함하는 Ig 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드이다. 융합 단백질은 전형적으로, 사이토킨의 아미노 말단 아미노산에의 펩타이드 결합에 의해 카복시-말단에서 결합된 Ig 폴리펩타이드를 갖는다. Ig 폴리펩타이드가 중쇄인 경우, Ig 중쇄는 또한 전형적으로 CH1 및 CH2 도메인을 포함하고, 임의로 CH3 도메인을 추가로 함유할 수 있다. 그러나, 필요한 경우, 이러한 불변 부위 도메인을 제거하여, 면역원성, 크기, 또는 생성된 융합 단백질 작제물의 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 중쇄 및 경쇄 도메인 연합을 용이하게 하기 위해, 중쇄 Fv가 경쇄 Fv에 연결되어 있는 결합된 Fv 분자를 작제하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 연결은 한 쇄의 카복시 말단과 다른 쇄의 아미노 말단 사이에 존재하고, 재폴딩/도메인 연합 후에 항원 결합 포켓을 현저하게 입체적으로 변형시키지 않을 만큼 충분히 길다.
바람직한 융합 단백질은 종양 관련 항원 GD2와 면역반응하는 사이토킨 IL-2 및 Ig 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 바람직한 융합 단백질은 종양 관련 항원 Ep-CAM(KSA, KS1/4 항원으로도 공지되어 있음)와 면역반응하는 사이토킨 IL-2 및 Ig 중쇄를 포함한다. 이러한 실시양태의 전형적인 융합 단백질은 아래에 각각 ch14.18-IL-2 및 KS1/4-IL-2로 기술되어 있다.
2) 항체 접합체
대체 면역요법성 작제물을 본 발명의 방법과 조성물에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 고 친화성 비오틴-아비딘 시스템을 이용하고, 적합한 결합 형태를 사용하여 비오틴(또는 아비딘)에 결합된 종양 관련 항원 특이적 항체 쇄 및 적합한 접합체(아비딘 또는 비오틴)에 결합된 사이토킨을 포함하는 독립적인 비오티닐화 단백질을 작제할 수 있다. 사용시, 비오티닐화 항체 단백질을 투여 전 또는 후에 시험관내 또는 생체내에서 사이토킨 단백질과 배합하여, 비오틴-아비딘 복합체에 의해 결합된, 종양 항원 결합 성분 및 이펙터 사이토킨 성분을 갖는 이작용성 면역요법제를 생성시킬 수 있다.
비오티닐화 항체 및 단백질은 당해 분야에 공지되어 있으며, 시판되고 있는 시약을 사용하여 제조할 수 있다. 비오티닐화 종양 항원 표적화 항체의 사용시 한가지 특징은, 비오틴 분자가 아비딘 결합된 사이토킨과 같은 이펙터 성분의 각각의 결합된 항체 또는 하나 이상의 이펙터 성분의 병용에 대한 보다 큰 강화작용을 가능하게 할 수 있는 다중 아비딘 결합 부위를 갖는다는 점이다. 다른 직접적인 화학적 접합 방법 및 시약이 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체를 직접적으로 또는 개입 링커를 사용하여 이펙터 분자에 접합시키는데 적용되어 왔다[참조예: Haugland and You, in Methods in Molecular Biology Vol. 80: Immunochemical Protocols, 2nd ed. (Pound, J.D. editor, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) chapter 17; 및 Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996]. 이와 같이, 본 발명의 면역요법제는 또한 적어도 항원 결합 부분을 포함하는 항체 단백질 단편과, 사이토킨 생물학적 시그날 전달 기능을 보유하기에 충분한 적어도 사이토킨의 이펙터 부분을 포함하는 사이토킨 사이에 상기한 바와 같은 항체 비오티닐화 작제물을 포함한다.
e) 다른 면역요법제
본 발명을 구체화하는 방법, 조성물 및 키트에서 사용하기에 적합한 항-종양 면역요법제는 사이토킨이 아닌 이펙터 부분을 포함할 수 있다. 세포 이펙터 성분이 또한 독소 또는 달리 종양을 손상시키는 세포독성제일 수 있다는 점을 고려한다. 이와 같이 다른 유용한 항-종양 치료제는 적어도 항원 결합 부분을 포함하는 항체 단백질 단편과, 방사성 동위원소, 면역독소, 세포독성 펩타이드 또는 세포독성 약물 사이에 작제물을 포함할 수 있다.
1) 방사성표지-항체
종양 표적화 모노클로날 항체 및 방사성표지 동위원소를 포함하는 방사성 면역 접합체는 항암제로서 사용되어 왔다. 모노클로날 항체의 항원 결합 특이성은 종양 부위에 국부화시키는 표적화 능력을 제공하는 한편, 방사성표지는 세포독성 특성을 제공한다[참조: Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996) chapter 8]. 이들 방사성 면역 접합체는 본 발명의 방법에서 항-종양 치료제로서 사용하기에 적합할 수 있다.
2) 면역독소-항체
다양한 공급원으로부터 유래된 모노클로날 항체와 단백질 독소와의 접합체를 또한 항-종양 치료에 대해 시험한다[참조: Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996) chapter 8]. 이러한 접합체는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합할 수 있다.
3) 약물 세포독소-항체
다양한 공급원으로부터 화학적으로 합성되고/되거나 정제된 모노클로날 항체와 약물 독소와의 접합체를 또한 항-종양 치료에 사용할 수 있다[참조: Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques (Academic Press, Ny NY, 1996)]. 이러한 접합체는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다.
4) 다중-특이적 항체
효소 분해에 의해 또는 항체 암호화 DNA 서열의 조작에 의해 생성된 항체 단편의 조작은, 항체를 상이한 결합 특이성과 조합시킨 하이브리드 분자인 이-특이성 항체(BsAbs)의 생성을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 표적 종양에의 특이적 결합을 세포 이펙터 약제(즉, 사이토킨, 약물 또는 독소)에의 결합과 조합시켜, 종양 세포의 치료를 국부화시킬 수 있다[참조예: French, R.R., in Methods in Molecular Biology Vol. 80: Immunochemical Protocols, 2nd ed. (Pound, J.D. editor, Humana Press, Inc., Totowa NJ, 1998) chapter 12]. 이러한 이- 또는 달리 다작용성 항체는 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다.
2. 치료학적 방법
종양 및 종양 전이에서 종양 세포를 치료하기 위한 본 발명의 치료학적 방법은 혈관형성 억제 (항-혈관형성) 요법 및 항-종양 면역요법의 병용을 기초로 한다. 1종 이상의 혈관형성 억제제를 1종 이상의 항-종양 면역요법제와 배합하여 사용할 수 있다. 병용은 동시에, 연속적으로 또는 치료 사이의 기간 중의 개입으로 발생할 수 있다. 임의의 특수 치료제를 치료 과정 동안 1회 이상 투여할 수 있다. 본 발명의 방법은 각각의 개별 치료제의 종양 세포 증식 억제 효과의 공동상승작용 증강을 유발시킬 수 있는 혈관형성 억제 치료제 및 항-종양 면역요법제의 병용을 제공하여, 각각의 성분을 단독으로 투여할 경우에 수득할 수 있는 것보다 효과적인 치료법을 수득할 수 있다. 이와 같이, 한 국면에서, 본 발명의 방법은, 동일한 양을 단독으로 제공할 경우에는 효과적인 혈관형성 억제 또는 항-종양 세포 활성을 발생시키지 않을 수 있는 양의 혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 배합하여 환자에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 방법은 단계적으로 본 발명을 수행하는 다양한 양태를 포함한다. 예를 들어, 길항제 및 항-종양 면역요법제(예를 들어, 바람직한 실시양태에서 종양 항원/사이토킨 융합 단백질)를 혼합 후에, 즉 동시에 투여할 수 있거나, 연속적으로, 즉 개별적으로 투여할 수 있다. 또한, 길항제 및 융합 단백질을 투여 사이에, 즉, 제1 활성제를 투여한 뒤 실질적으로 직후부터 제1 제제를 투여한 후 약 3주까지 약 3주의 시간 간격 이내에 개별적으로 투여할 수 있다. 또한, 순서를 변경할 수 있는, 즉 αvβ3 길항제를 융합 단백질 투여 전에 투여할 수 있거나, 역순으로 투여할 수 있음을 고려한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종양 또는 전이 치료를 요하는 환자에게 혈관형성 억제량의 혈관형성 억제제, 예를 들어, αvβ3 길항제, 및 생물학적 반응을 유도하기에 충분한 양의 항-종양 면역요법제를 투여함을 포함한다. 예를 들어, 이작용성 융합 단백질이 사이토킨과, 종양 관련 세포 표면 항원을 보유하는 종양 세포에 특이적인 가변 영역을 포함하고, 펩타이드 결합에 의해 사이토킨에 결합된 재조합 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 쇄를 가질 경우에 사이토킨-특이적 생물학 적 반응을 유도하기에 충분하다. 또한, 면역요법제가 세포독성제를 포함할 경우에, 상기 양이 표적 종양 세포에서 세포독성-생물학적 반응을 유도하기에 충분하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 종양 매스의 일부 또는 전체를 제거하는 수술 처치와 함께 수행할 수 있다. 이와 관련하여, 당해 방법은 수술 처치 후에 수행할 수 있다. 또는, 수술 처치를 제1 활성제 및 제2 활성제의 투여 사이의 간격 동안 수행할 수 있다. 이러한 방법의 전형적인 예는 본 발명의 방법과 하기한 수술적 종양 제거와의 조합이다.
본 발명에 따르는 치료는 전형적으로 치료학적 조성물의 투여를 1주기 이상의 투여로 포함할 것이다. 예를 들어, 동시 투여를 수행할 경우에, αvβ3 길항제와 항-종양 면역요법제를 둘 다 포함하는 치료학적 조성물을 약 2일 내지 약 3주의 기간에 걸쳐 단일 주기로 투여한다. 이후, 치료 주기를 주치의의 판단에 따라 필요한 경우에 반복할 수 있다. 유사하게는, 연속적인 적용을 고려할 경우에, 각각의 개별 치료제에 대한 투여 시간은 전형적으로 동일한 기간을 포함하도록 조정할 수 있다. 주기 사이의 간격은 약 0에서 2개월까지 변화시킬 수 있다.
투여는 주기적 단위 투여량, 연속적 주입, 연동 전달, 거환 주사 등에 의해 달성할 수 있다. 경로는 정맥내, 피하, 근육내, 동소 주사, 동소 주입, 경구 적용 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 치료학적 조성물은 활성제를 익히 공지된 바와 같은 약제학적으로 허용된 담체내에 포함하며, 따라서, 본 발명은, 조성물 중의 활성제의 농도가 본원에 기술된 양으로 언급한 활성제의 전달(투여)에 충분한 이상 조성물과 관련하여 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
전형적으로는, 항-종양 면역요법제, 예를 들어, 항원 표적화/사이토킨 융합 단백질의 투여량은 0.01 내지 10mg/kg 체중/1일, 바람직하게는 약 0.1 내지 1mg/kg 체중/1일, 보다 바람직하게는 약 0.6mg/kg 체중/1일이다.
항-종양 면역요법제, 예를 들어, 항원 표적화된 세포독성제의 투여량은 전형적으로 0.01 내지 10mg/kg 체중/1일, 바람직하게는 약 0.1 내지 1mg/kg 체중/1일, 보다 바람직하게는 약 0.6mg/kg 체중/1일일 수 있고, 여기서, 방사선 조사량은 목적하는 방사선 조사량에 따라 적합하게 조정할 수 있다. 방사선 치료에 적합한 것으로 밝혀진 방사성 동위원소는 57-코발트, 67-구리, 99m-테크네듐, 123-요오다이드, 131-요오다이드 및 111-인듐 등을 포함한다. 방사성 약제 및 투여량은 방사성 동위원소 및 표적 조직에 따라 달라질 수 있다. 악성 신생물의 면역방사선 요법은 종래의 방사선 요법보다 많은 조사량을 사용할 수 있는데, 이는 면역요법제가 종양 부위 및/또는 세포에 대해 표적화되기 때문이다. 예를 들어, B-세포를 표적으로 하는 방사성면역요법제를 사용한 B-세포 비-호지킨 림프종의 치료는 0.4mCui/kg 체중(1mCui=37Mbq)의 최대 내성 조사량을 갖는 것으로 밝혀졌다[참조: Witzig, TE et al., (1999) "Phase I/II trial of IDEC-Y2B8 radioimmunotherapy for treatment of relapsed or refractory CD20(+) B-cell non-Hodgikin'e lymphoma" J. Clin. Oncol. 17(12): 3793-803]. 그러나, 특이적 종양 또는 종양 전이에 대해 표적화된 방사선면역요법은 림프종의 치료보다 높은 내성 조사량을 가능하게 한다. 누드 마우스에서, 111-인듐-표지된 항체의 18.5Mbq의 2회 투여량의 투여에 내성이 있다[참조: Saga T, et al., (1999) "Radioimmunotherapy of human glioma xenografts in nude mice by indium-111 labelled internalising monoclonal antibody" Eur. J. Cancer 35(8):1281-5].
αvβ3 길항제의 전형적인 투여량은 10 내지 1000mg/kg 체중/1일, 바람직하게는 약 20 내지 100mg/kg 체중/1일, 보다 바람직하게는 약 50mg/kg 체중/1일이다.
암이 동물계 전체에 걸쳐 발견되며, 본원에 기술된 원리가, 혈관형성이 면역 계내에서 αvβ3 길항제 및 사이토킨에 의해 억제될 수 있는 모든 동물에 적용되는 것으로 이해된다. 이와 같이, 본 발명은 모든 포유동물, 특히 사람에 대해 수행될 수 있는 것으로 고려된다.
또한, 성장하기 위해 혈관형성을 필요로 하는 다양한 종양이 존재하여, 본 발명의 방법의 병용 요법 방식에 대한 후보물이 존재하는 것으로 공지되어 있다. 혈관형성을 유도하는 성장을 유발시킬 수 있는 종양은 신경외배엽, 상피 및 기타 조직으로부터 유래하는 종양을 포함한다. 전형적인 종양 및 종양 전이는 선종, 혈관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배아종, 교모세포종, 신경교종, 과오종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근모세포종, 육종, 기형종 및 기타 종양을 포함한다.
3. 치료학적 시스템
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 시약을 제공하는 팩키징 및/또는 키트를 포함하는 시스템을 고려한다. 종양 또는 종양 전이에서 종양 세포를 치료하기 위한 키트는:
a) 종양 또는 종양 전이에서 혈관형성을 억제할 수 있는 αvβ3 길항제와 같은 혈관형성 억제제;
b) 종양 관련 세포 표면 항원을 보유하는 종양 세포에 특이적인 가변 영역을 포함하고, 펩타이드 결합에 의해 사이토킨에 결합되어 있는 재조합 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 쇄와 사이토킨을 갖는 이작용성 융합 단백질 시약과 같은 항-종양 면역요법제; 및
c) 종양 및 종양 전이를 치료하는 방법에서 시약 사용에 대한 지침서의 팩키지를 포함한다.
본 발명의 키트내의 시약은 전형적으로 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 조성물로서 제형화되므로, 키트내에 배치하기에 적합한 임의의 다양한 형태일 수 있다. 이러한 형태는 본 발명의 길항제 및/또는 융합 단백질을 제공하기 위한 용제, 산제, 정제, 현탁제 및 기타 제형을 포함한다. 시약은 본 발명의 방법에 따라 개별적으로 투여하기에 적합한 별개의 용기내에 제공할 수 있거나, 또는 팩키지내 단일 용기내에서 조성물로 배합하여 제공할 수 있다.
유사하게는, 이러한 팩키지는 상기한 성분 대신에 또는 이외에, 상기한 바와 같은 임의의 다른 항-종양 면역요법제를 함유할 수 있다.
당해 팩키지는 본원에 기술된 치료 방법에 따르는 시약의 1회 이상의 투여량에 대해 충분한 양을 함유할 수 있다. 전형적으로는, 당해 팩키지는 본원에 기술된 바와 같은 1주기 치료에 대해 충분한 양을 함유할 수 있다. 팩키지 라벨링은, 본 발명의 방법에 따라, 종양 및/또는 전이의 치료학적 치료를 위해 동봉된 시약의 병용 또는 연속적 사용을 지시할 수 있다. 이러한 팩키지 라벨링은 각각의 시약 바이알 및/또는 재료의 완전한 팩키지에 부착될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 팩키지내에 함유되어 있는 재료의 "사용 지침서"를 함유한다. 당해 지침서는 본 발명의 방법에 따르는 종양 또는 종양 전이를 치료하기 위한 길항제 및 융합 단백질의 병용 방법에 관한 것이다. 당해 방법이 종양, 환자 및 질환의 상태에 따라 광범위하게 달라질 수 있는 한, 지침서는 이에 따르는 투여 방식을 변경하여 명시할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법에 따르는 길항제 및 융합 단백질의 병용에 관한 특수사항 이외의 지침사항의 본질에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
유사하게는, 시약은 항-종양 면역요법성 세포독성제, 예를 들어, 방사성표지 동위원소에 결합된 종양 항원 결합 항체, 또는 세포독성제, 예를 들어, 세포독성 펩타이드 또는 세포독성 약물 등을 포함할 수 있다.
4. 합성 펩타이드의 제조
a. 합성 과정
아래 표 1에 기재된 선형 및 사이클릭 폴리펩타이드를 문헌[참조예: Merrifield, RB, (1969) "Solid-Phase Peptide Synthesis", Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol Biol., 32:221-96; Merrifield, RB, (1969) "The synthesis of biologically active peptides and proteins", JAMA 210(7):1247-54; 및 Fields, G.B. and Noble, R.L., (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res., 35(3):161-214]에 기술된 바와 같은 표준 고체상 합성 기법을 이용하여 합성한다.
BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe(서열 1) 2그램(g)을 우선 메탄올 60밀리리터(ml)에 용해시키고, 이에 2N 수산화나트륨 용액 1.5ml를 가하여, 혼합물을 형성시킨다. 다음, 혼합물을 20℃에서 3시간 동안 교반시킨다. 증발시킨 후, 잔사를 물에 용해시키고, 묽은 HCl을 사용하여 pH 3으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 다시 증발시키고, 생성된 BOC-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(서열 2)를 디옥산 중의 2N HCl 20ml와 함께 2시간 동안 20℃에서 교반시킨다. 생성된 혼합물을 증발시켜, H-Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val-OH(서열 3)를 수득한 다음, 이를 디클로로메탄 1800ml와 디메틸포름아미드(DMF) 200ml와의 혼합물에 용해시킨 후, 0℃로 냉각시킨다. 이후, 디사이클로헥실카보디이미드(DCCI) 0.5g, 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 0.3g 및 N-메틸모르폴린 0.23ml를 교반하면서 연속적으로 가한다.
생성된 혼합물을 0℃에서 추가의 24시간 동안 교반시킨 다음, 20℃에서 추가 의 48시간 동안 교반시킨다. 용액을 농축시키고, 혼합 상 이온 교환기로 처리하여, 염으로부터 이를 유리시킨다. 생성된 수지를 여과에 의해 제거한 후, 정화된 용액을 증발시키고, 잔사를 크로마토그래피에 의해 정제하여, 사이클로(Gly-DArg-Gly-Asp-Phe-Val)(서열 4)을 회수한다.
단일 문자 코드 아미노산 잔기 약자를 사용하여 표 1에 기재되고 펩타이드 번호 지정에 의해 동정된 다음 펩타이드를 유사하게 수득한다: 사이클로(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val)(서열 5); 사이클로(Arg-Ala-Asp-DPhe-Val)(서열 6); 사이클로(Arg-DAla-Asp-Phe-Val)(서열 8); 사이클로(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal)(서열 7); 및 사이클로(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(여기서, 메틸화는 발린 잔기의 아미드 결합의 알파-아미노 질소에서 발생한다)(서열 11).
펩타이드 62184의 서열과 동일한 서열을 갖는, 66203으로 지정된 펩타이드는 단지 62184(서열 5)에 존재하는 TFA 염이 아닌 염 HCl을 함유함으로써 후자와 상이하다. 펩타이드 69601 및 62185(서열 6) 및 85189 및 121974(서열 11)에 대해서도 마찬가지이다.
b. 대체 합성 과정
i. 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11), TFA 염의 합성
연속적으로 NMeVal, DPhe, Asp(OBut), Gly 및 Fmoc-Arg(Mtr)를 단계적으로 4-하이드록시메틸-페녹시메틸-폴리스티렌 수지(왕(Wang) 유형 수지)에 가하여 고체상 메리필드(Merrifield) 유형 과정을 이용하여 Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa(서열 14)를 합성한다(펩타이드 합성의 통상의 메리필드 유형 방법을 적용시킨다). 폴리스티렌 수지 및 아미노산 잔기 전구체는 알드리히(Aldrich), 시그마 또는 플루카 케미칼 캄파니즈(Fluka chemical companies)로부터 시판되고 있다. 아미노산 잔기의 연속적 첨가의 종료 후, 이어서 TFA/디클로로메탄의 1:1 혼합물을 사용하여 수지를 펩타이드 쇄로부터 제거하여, Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH 생성물(서열 15)을 수득한다. 이어서, 피페리딘/DMF의 1:1 혼합물을 사용하여 Fmoc 그룹을 제거하여, 조 Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH 전구체(서열 16)를 수득하고, 이를 통상의 방식으로 HPLC로 정제한다.
폐환을 위해, DMF(디메틸포름아미드; 알드리히) 15ml 중의 Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH(위에서 합성됨)(서열 16) 0.6g의 용액을 디클로로메탄(알드리히) 85ml로 희석시키고, NaHCO3 50mg을 가한다. 드라이 아이스/아세톤 혼합물 중에서 냉각시킨 후, 디페닐포스포릴 아지드(알드리히) 40㎕를 가한다. 실온에서 16시간 동안 정치시킨 후, 용액을 농축시킨다. 농축물을 겔-여과(이소프로판올/물 8:2 중의 Sephadex G10 칼럼)시킨 다음, 통상의 방식으로 HPLC로 정제한다. TFA(트리플루오로아세트산)/H2O(98:2)로 처리하여, 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(본원에서 "사이클로(RGDfN-MeV)"로도 호칭됨; 서열 11) x TFA를 수득하고, 이어서 이를 통상의 방식으로 HPLC로 정제한다; RT = 19.5; FAB-MS (M+H): 589.
ii. "내부 염"의 합성
사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) x TFA를 물에 현탁시킨 다음, 진공하에 증발시켜 TFA를 제거함으로써, TFA 염을 위에서 제조된 사이클릭 펩타이드로부터 제거한다. 형성된 사이클릭 펩타이드는 "내부 염"으로 호칭되며, 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11)로 지정된다. 사이클릭 펩타이드가 서로 내부-전기학적으로 균형이 잡힌 2개의 반대로 하전된 잔기를 함유하여 전체적으로 비하전된 분자를 형성하기 때문에, 용어 "내부 염"이 사용된다. 하전된 잔기 중의 하나는 산 성분을 함유하고, 나머지 하나의 하전된 잔기는 아미노 성분을 함유한다. 산 성분 및 아미노 성분이 서로 밀접하게 근접하여 존재할 경우, 산 성분은 아미노 성분에 의해 탈보호되어, 이는 전체적인 중성 전하를 갖는 카복실레이트/암모늄 염 종을 형성한다.
iii. 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) x HCl을 제공하는 HCl 처리
사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) 80mg을 0.01M HCl에 5 내지 6회 용해시키고, 각각의 용해 작업 후 동결 건조시킨다. HPLC에 의해 후속적으로 정제하여, 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) x HCl을 수득한다; FAB-MS (M+H): 589.
iv. 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) x MeSO 3 H를 제공하는 메탄 설폰산 처리
사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) 80mg을 0.01M MeSO3H(메탄 설폰산)에 5 내지 6회 용해시키고, 각각의 용해 작업 후 동결 건조시킨다. HPLC에 의해 후속적으로 정제하여, 사이클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(서열 11) x MeSO3H를 수득한다; RT = 17.8; FAB-MS (M+H): 589.
폐환의 대체 방법은 비사이클릭 펩타이드 전구체의 측쇄 그룹을 설프하이드릴 성분으로 유도체화시키고, 표준 생리학적 pH 조건(pH 7.5)보다 경미하게 높은 pH에 노출시킬 경우, 분자내에 존재하는 다른 설프하이드릴 그룹과의 디설파이드 결합을 분자내적으로 형성시켜 사이클릭 펩타이드를 형성시킴을 포함한다. 또한, 비사이클릭 펩타이드 전구체의 C-말단 카복실레이트 성분을, 티오에스테르 폐환 펩타이드를 제조하기 위해 분자내에 존재하는 유리 설프하이드릴 성분과 반응시킬 수 있다.
펩타이드 명칭 아미노산 서열 서열 번호
62181 사이클로(GrGDFV) 4
62184(66203*) 사이클로(RGDfV) 5
62185(69601*) 사이클로(RADfV) 6
62187 사이클로(RGDFv) 7
62186 사이클로(RaDFV) 8
62175 사이클로(ARGDfL) 9
62179 사이클로(GRGDfL) 10
121974(85189*) 사이클로(RGDfN-MeV) 11
112784 사이클로(RGEfN-MeV) 12
135981 사이클로(RADfN-MeV) 13
* 별표로 지시된 펩타이드를 HCl 중에서 제조하며, 이는 동일한 라인 상에 지시된 펩타이드와 서열이 동일하다; 별표가 없는 펩타이드는 TFA 중에서 제조한다. 소문자는 D-아미노산을 나타내고, 대문자는 L-아미노산을 나타낸다.
5. 종양-특이적 항체-사이토킨 융합체의 생성 및 특성 분석
a. 단백질 및 혈관계-특이적 인테그린 α v 길항제:
ch14.18-IL-2 및 huKS1/4-IL-2 항체-사이토킨 융합 단백질의 작제 및 특성 분석은 이미 기술되어 있다[참조: Xiang, R., et al., (1997); Gillies, S., et al., (1992) supra]. 양쪽 작제물의 항원 결합 특성은 이들 각각의 항체의 것과 동일하고, 특이적 IL-2 활성은 시판용 rhIL-2와 동등하다. 인테그린 αvβ3 길항성 사이클릭 펩타이드 121974(사이클로(RGDfN-MeV))(서열 11) 및 대조 펩타이드 135981(사이클로(RADfN-MeV))(서열 13)을 합성하여 특성 분석한다.
6. 세포주 및 동물 모델
모든 세포주 및 각각의 동물 모델을 이미 기술한 바와 같이 실질적으로 확립시킨다[참조: Becker, J.C., et al., (1996); Xiang, R., et al., (1996); Lode, H.N., et al., (1998) supra]. NXS2 및 CT26-KSA 세포 상에서의 인테그린 αvβ3의 부재를 항-마우스 CD61(인테그린 β3 쇄) 항체(Pharmingen, La Jolla, CA)를 사용하여 입증한다. 양쪽 세포주는 양성 대조군으로서 사용된 인테그린 αvβ3-양성 B16FG3 및 B78-D14 쥐 흑색종 세포와 대조적으로 FACS 분석에서 시그널(1㎍ 항-마우스 CD61 mAb/106개 세포)이 없는 것으로 나타난다. 또한, NXS2 세포는 양성 대조군으로서 사용된 항-GD2 항체 ch14.18(10㎍/ml, 4℃, 24시간)과는 대조적으로 항-마우스 CD61 mAb(10㎍/ml, 4℃, 24시간)로 피복된 플라스틱에 부착시키는 것이 불가능하다. 그러나, 모든 종양 세포는 FACS에 의해 αv 인테그린을 발현시키고, 비트로넥틴 상에 부착하는데, 이는 인테그린 αvβ5의 존재를 지적한다.
모든 수술 처치의 경우, 마우스는 케타민 주사(100mg/kg 복강내) 및 동시의 메토판 흡입(Pitman-Moore, Mundelein, IL)에 의해 마취시킨다. 인테그린 αv 길항제 및 대조 펩타이드의 투여를 위해 삼투성 펌프(AlzetR, model 2001, Palo Alto, CA)를 17.5㎍/시간의 방출 속도로 사용한다. 이들 펌프는 제조업체의 지침에 따라 취급하고, 멸균 조건하에 배부 피하 조직에 이식시킨다. 모든 펌프는 이식한 후 7일째에 교체하고 항-혈관 치료 10일째에 제거한다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 보호 및 사용에 대한 NIH 지침서(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행한다.
7. 조직학 및 면역조직화학
원발성 종양의 아세톤-고정된, 동결 절편을 4% 염소 혈청과 항온처리하여, 비-특이적 결합을 차단한다. 항-마우스 CD31 및 항-마우스 CD45 mAbs(Pharmingen, La Jolla, CA)(1:100)와의 항온처리 및 후속적인 로다민-표지된 염소 항-래트 항체(1:300)로의 염색을 사람화 챔버내에서 실온에서 수행한다. 각각의 항온처리 후 PBS(x3)로 세척한다. 고배율상(HPF)당 혈관 및 백혈구 카운트를 200x 배율에서 현미경으로 관찰한다[참조: Brooks, P.C., et al., (1995) "Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin", J. Clin. Inves. 96, 1815-1822]. 대표적인 영역을 200x(혈관) 및 800x(백혈구)에서 각각 촬영한다.
8. 원발성 종양은 항체 IL-2 융합 단백질과 배합된 인테그린 α v 길항제로 치료한 마우스에서만 퇴행한다
혈관형성 억제 요법(인테그린 αv 길항제) 및 면역요법(항체 IL-2 융합 단백질)의 공동상승작용 효과는 3종의 공동상승작용 모델 모두에서 각각 확립된 피하 종양(110-130㎕)을 갖는 마우스에서 측정된다.
도 1은, 항-혈관형성 αv 인테그린 길항제 및 항체-IL-2 융합 단백질을 사용하는 항-종양 구획-특이적 면역요법과의 병용 요법의 원발성 종양에 대한 효과를 그래프로 도시한다. 도 1A는 NXS2 신경모세포종의 피하 주사(2x106개)에 의해 유도된 원발성 종양으로부터의 결과를 도시한다. 도 1B는 CT26-KSA 결장 암종의 피하 주사(2x106개)에 의해 유도된 원발성 종양으로부터의 결과를 도시한다. 도 1C는 B78-D 14 흑색종 세포의 피하 주사(2x106개)에 의해 유도된 원발성 종양으로부터의 결과를 도시한다. 확립된 종양(110-130㎣)의 치료는 종양-특이적 항체-IL-2 융합 단백질 huKS1/4-IL-2(10㎍, 결장 암종) 및 ch14.18-IL-2(5㎍, 신경모세포종, 10㎍, 흑색종)(x5)의 매일 정맥내 주사 및 17.5㎍/시간으로 7일 동안 삼투성 펌프를 사용한 혈관계-특이적 인테그린 αv 길항제 또는 대조 펩타이드의 연속적 피하 주입에 의해 개시한다(상단). 치료 개시 시간은 흑색 화살표로 나타낸다. 각각의 실험군(n=6)에서 마우스의 원발성 종양의 크기는 미세캘리퍼 측정(너비x길이x너비/2)(평균±표준 오차)에 의해 측정한다. 치료 개시시 확립된 종양의 크기와 비교하여 병용 치료를 제공받은 마우스의 원발성 종양 크기에서의 퇴행은 모든 대조군(P>0.05)과 비교하여 3종의 상이한 공동상승작용 종양 모델(P<0.001, 윌콕슨 순위합 시험)에서 통계학적으로 유의하다.
먼저, 각각의 치료학적 방식에 대한 준최적량을 확립하고, 이의 병용을 개시한다. 단지 인테그린 αv 길항제 및 IL-2 융합 단백질로 치료한 마우스만이 전체 3종 모델에서 50 내지 90%(P<0.001)의 범위의 종양 퇴행을 제공한다. 실제로, 신경모세포종 및 결장 암종 세포를 접종한 동물의 절반이 제시되지 않은 이들의 원발성 종양 데이터를 배제한다. 이는 기껏해야 대조군과 비교하여 각각 성장을 지연시키는 단독요법으로서 사용되는 각각의 방법과 대조적이다. 각각의 치료 방식 및 이들의 병용의 혈관 및 종양 구획에 대한 효과를 후속적으로 분석한다.
종양 세포 접종 후 20일째에 수술로 제거한, 확립된 원발성 신경모세포종 종양의 항-혈관형성 요법 및 종양-특이적 면역요법의 병용 후의 조직학을 수행한다. 요약하면, 포르말린-고정된 원발성 종양을 파라핀 함몰 및 후속적인 헤마톡실린/에오신 염색에 적용시킨다. 괴사 부위 및 백혈구 침윤이 동정된다.
도 2는, 항-혈관 및 항-종양 병용 요법의 혈관화 및 항-종양 면역 반응에 대한 효과를 도시한다. 각각의 요법을 단독으로 제공받은 대조군을 포함하여, 도 1에 대해 기술한 바와 같이 혈관계-특이적 인테그린 cc, 길항제, 비-특이적 펩타이드 대조군 및 종양-특이적 ch14.18-IL-2 융합 단백질로의 병용 치료를 확립된 원발성 신경모세포종 종양을 갖는 마우스(n=6)에게 제공한다. 치료 말기에, 피하 종양을 수술로 제거한다. 각각의 종양의 동결 절편을 혈관 내피 세포(CD-31) 및 백혈구 침윤(CD45)에 대해 각각 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 분석한다. 후자는 ch14.18-IL-2 융합 단백질에 의해 유도된 종양 구획-특이적 면역 반응에 대해 익히-확립된 마커이다[참조: Becker, J.C., et al., (1996) supra; Xiang, R., et al., (1996) supra; Lode, H.N., et al., (1998) supra].
도 2A는 인테그린 αv 길항제, ch14.18-IL-2 융합 단백질 또는 이의 배합물을 사용한 혈관 및 종양 구획 치료후 원발성 종양의 혈관 밀도에 대한 결과(*P<0.001, 스튜던트 T-시험)를 도시한다. 도 2B는 각각의 혈관 및 종양 구획 치료 후의 원발성 종양의 백혈구 침윤에 대한 결과(*P<0.001, 스튜던트 T-시험)를 도시한다.
인테그린 αv 길항제를 제공받은 마우스는 원발성 종양의 성장 지연과 동시에 일어나는 혈관화에서 50% 감소율(도 2)을 나타내며, 이는 혈관 구획의 효과적인 표적화를 입증한다. 이 경우, 종양 구획은 직접적으로 영향을 받지 않는다(도 1). 대조적으로, 단지 항-GD2-IL-2 융합 단백질만으로 치료한 마우스는 항-종양 구획-지시된 요법의 익히-확립된 특성인 명백한 백혈구 침윤을 나타내며[참조: Becker, J.C., et al., (1996) supra; Xiang, R., et. al., (1996) supra; Lode, H.N., et. al., (1998) supra], 이는 실질적인 피하 종양 성장을 저하시킨다(도 1).
그러나, 인테그린 αv 길항제 및 항-GD2-IL-2 융합 단백질의 배합물로 치료한 마우스만이 항-GD-2-IL-2 융합 단백질로 치료한 마우스와 비교하여 종양으로의 백혈구 침윤의 5배 증가를 나타내고, 혈관형성에서 유사한 감소를 나타낸다. 염증 세포의 증가는 조직학 및 면역조직화학에 의해 입증되고, 세포 파편의 제거 동안 괴사 조직에서 빈번하게 나타나는 패턴인 대식세포의 유입에 기인한다. 실제로, 이러한 괴사 부위는 각각의 성분으로 개별적으로 치료한 대조군과 대조적으로 병용 치료 후의 종양에서만 나타난다.
9. 연속 및 동시 혈관 및 종양 표적화는 특발성 간 전이의 근절을 유도한다
원발성 종양의 성공적인 치료 이외에, 보다 문제가 되는 쟁점은, 원격 전이가 항-혈관 및 항-종양-특이적 병용 요법에 영향을 받는지의 여부이다. 이는 특발성 간 전이를 특징으로 하는 신경모세포종 모델에서 밝혀졌다. 이러한 목적을 위해, 항-혈관형성 인테그린 αv 길항제를 사용한 원발성 종양의 치료는 항체 IL-2 융합 단백질에 의해 항-종양 면역요법과 연속적으로 병용한다.
도 3은, 항-혈관형성 αv 인테그린 길항제 및 항체-IL-2 융합 단백질을 사용하는 항-종양 구획-특이적 면역요법의 특발성 간 신경모세포종 전이에 대한 연속적 병용 효과를 그래프로 도시한다. 항-혈관 치료는, 도 1에서 기술한 바와 같이 확립된 원발성 종양을 갖는 마우스에서 개시하여 총 10일 동안 수행한다. 원발성 종양의 수술 제거 후, 마우스에게 ch14.18-IL-2 융합 단백질의 매일 정맥내 주사(x5)에 의해 종양 구획-특이적 면역요법을 제공한다. 특발성 간 전이의 수는 간 병소(n=8)의 육안적 계수에 의해 측정한다(**P<0.01, 윌콕슨 순위-합 시험).
제제 둘 다를 연속적으로 사용하여 치료한 마우스만이, 단독요법으로서 사용된 각각의 제제가 효과없는(P<0.01) 전체 대조군과는 대조적으로 간 전이에서 1.5 내지 2 로그 감소를 나타낸다(도 3). 실제로, 병용 요법에 적용시킨 4/8마리 마우스는 간 전이의 완전한 부재를 나타내는 한편, 나머지 동물은 단지 1 내지 5개의 소형 전이 병소를 나타낸다. 본질적으로, 유사한 결과가 인테그린 αv 길항제와 ch14.18-IL-2 융합 단백질과의 동시 병용에 의해 수득된다(도 4 상단).
도 4는, 항-혈관형성 인테그린 αv 길항제와 항-IL-2 융합 단백질을 사용하는 항-종양 구획-특이적 면역요법과의 동시 병용의 특발성 간 신경모세포종 전이에 대한 영향을 그래프로 도시한다. 특발성 전이는 2x106개 NXS2 신경모세포종 세포를 보유한 원발성 종양을 피하 도입하여 유도한다. 피하원발성 종양의 제거 전(도 4A) 또는 후(도 4B)에 개시된 인테그린 또는, 길항제(17.5㎍/h) 및 종양-특이적 ch14.18-IL-2 융합 단백질(5㎍/h)로 치료한 결과를 제시한다. 특발성 간 전이는 간 병소(n=8)의 육안적 계수에 의해 측정한다(**P<0.01, 윌콕슨 순위-합 시험).
제제 둘 다를 사용하여 치료한 마우스만이 원발성 종양 제거 전 또는 후의 이들 제제의 투여에 따라 간 전이에서 완전 부재(도 4A) 또는 >1.5 로그 감소(도 5B)를 나타낸다. 이는 각각의 제제가 단독요법으로서 사용되는 경우에 치료가 효과없는 전체 대조군과는 대조적이다.
10. 공동상승작용성 병용 및 효과적인 요법
악성 종양의 혈관 구획에서의 혈관의 붕괴는 암에 대항하는 강력한 전략이다. 종양 혈관계의 내피 세포를 표적화함으로써, 종양을 성공적으로 치료할 수 있다. 혈관형성성 혈관 상에서 발현하는 αv 인테그린과의 상호작용을 통해 혈관계를 표적화하는 펩타이드 길항제[참조: Brooks, P.C., et al., (1994) Science supra; Friedlander, M., et al., (1995) supra]는 혈관 형성을 억제하고 후속적인 종양 성장을 현저하게 퇴행시킨다. 이는 3종의 공격적으로 성장하는 원발성 종양을 치료하고 1종의 특발적으로 전이하는 종양을 치료함으로써 입증된다. 사용된 인테그린 αv 길항제는 αvβ3 길항제에 본질적으로 지시되는 한편, 이는 또한 밀접하게 관련된 인테그린 αvβ3에 결합한다. 검사된 결장 암종 및 신경모세포종 종양은 명백하게 αvβ3가 결여되어 있으나, 아마 소정의 αvβ5를 발현시킬 것이다. 흑색종 모델은 또한 αvβ3를 발현시킨다. 그러나, 이러한 인테그린 길항제의 효과는 신경모세포종 모델에 대해 입증된 바와 같이 명백하게 전체 3종 동물 모델에서 종양 혈관계에 한정되어 있다(도 2). 중요하게는, 종양 혈관계를 표적화하는 항-종양 효과는 종양 구획 상에서의 동시 공격에 의해 증폭되고, 이는 원발성 종양 및 특발성 전이 둘 다에 대해 효과적이다. 이는, 치료 전의 원발성 종양의 제거가 신경모세포종 전이의 성장 및 파종을 증가시키기 때문에 특히 적절하며, 이러한 결과는 원발성 종양의 절제 후 혈관형성 억제제의 순환 수준의 감소로 인한 다른 종양 모델에서 충분히 입증되어 있다[참조: Holmgren, L., et al., (1995) supra; Folkman, J., (1995) supra]. 혈관 및 종양 구획의 동시 표적화는, 종양 세포 육성 저하를 종양 세포의 활성 파괴와 연합시켜 원발성 종양의 퇴행 및 원격 전이의 근절을 유도하기 때문에 매우 효과적인 것으로 입증되어 있다. 이는, 공동상승작용적 모델에서 피하 종양 성장의 억제만을 유발하는 2종의 상이한 항-혈관형성 치료 전략을 사용하는 단일 혈관 구획-지시된 접근법과는 대조적이다[참조: Mauceri, H.J., et al., (1998) "Combined effects of angiostatin and ionizing radiation in antitumor therapy", Nature 394, 287-291].
본 전략에 있어서, 종양 구획-특이적 반응을 종양-특이적 항체-IL-2 융합 단백질에 의해 활성화되고 종양 미세환경으로 유도되는 염증 세포에 의해 매개시킨다. 중요하게는, 항-혈관형성 방법은, 충분히 확립된 혈관 공급으로의 원발성 종양의 성장 억제에서 매우 효과적이더라도, 단독요법으로서 사용할 경우에 원격 미세 전이에 대한 유사한 효능이 결여된다(도 3 및 도 4). 그러나, 불량한 혈관형성을 특징으로 하는 소형 종양 부하를 갖는 이러한 최소 잔류 질환 셋팅에서, 병용 요법에서 사용된 항-종양 구획 치료는 단독요법으로서 사용할 경우에 매우 효과적이다[참조: Xiang, R., et al., (1997) supra; Lode, H.N., et al., (1998) supra]. 이러한 상황에서, 항-혈관형성 치료의 한가지 역할은 미세전이-유도된 혈관신생 및 전이 병소의 확대를 억제하는 것이다[참조: Volpert, O.V., et al., (1998) supra]. 이는 교대로 최소 잔류 질환 셋팅에서 최상으로 효과적인 종양 구획-지시된 요법에 의해 상기 미세전이의 근절을 용이하게 한다[참조: Becker, J.C., et al., (1996) supra].
원발성 종양 및 파종성 전이의 효과적인 치료는 임상적 종양학에서의 주요 목표로 남아 있다. 이러한 보고에서의 결과는 특이적 항-혈관형성 및 면역요법의 병용은 원발성 종양의 퇴행 및 미세 전이의 근절에서 공동상승작용한다. 양쪽 치료 방식, 즉, αv 인테그린 길항제 및 항-인터류킨-2 융합 단백질은 현재 단독요법으로서 임상 평가하에 있기 때문에, 이의 병용의 공동상승작용은 암 요법에 대해 신규하고 효과적인 수단을 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태를 기술하는 선행 실시예는 예시적인 것이며, 물론 본 발명을 구체적으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 더우기, 당해 분야의 숙련가의 이해 범위내에 있을 수 있는, 현재 공지되거나 이후 개발되는 본 발명의 이러한 변형은 이후 청구하는 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
<110> The Scripps Research Institute Lexigen Pharmaceuticals Corporation <120> Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies <130> 5-1998-061838-8 5-2001-026054-9 <150> US 60/119,721 <151> 1999-02-12 <160> 16 <170> KOPATIN 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> BLOCKED - BOC <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> ACETYLATION - OMe <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <223> Description of Artificial Sequence:starting material <400> 1 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> BLOCKED - BOC <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <223> Description of Artificial Sequence:first product <400> 2 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <223> Description of Artificial Sequence:2nd product <400> 3 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Arg <220> <221> CHAIN <222> (1)..(6) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(GrGDFV) <400> 4 Gly Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo RGDfV) <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <400> 5 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(RADfV) <400> 6 Arg Ala Asp Phe Val 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Val <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(RGDFv) <400> 7 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> D-Ala <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(RaDFV) <400> 8 Arg Ala Asp Phe Val 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1)..(6) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(ARGDfL) <400> 9 Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> D-Phe <220> <221> CHAIN <222> (1)..(6) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(GRGDfL) <400> 10 Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(RGDfmV) <400> 11 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(RGEfmV) <400> 12 Arg Gly Glu Phe Val 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220> <221> CHAIN <222> (1)..(5) <223> cyclo <220> <223> Description of Artificial Sequence:cyclo(RGEfmV) <400> 13 Arg Ala Asp Phe Val 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION - FMOC, Mtr <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> OBut <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal, -ONa <220> <223> Description of Artificial Sequence:Alt Syn Start Prod <400> 14 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> FORMYLATION , FMOC, Mtr <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> -OBut <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220> <223> Description of Artificial Sequence:Alt Syn Prod <400> 15 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Mtr <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> -OBut <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> METHYLATION, NMeVal <220> <223> Description of Artificial Sequence:Alt Syn Product <400> 16 Arg Gly Asp Phe Val 1 5

Claims (51)

  1. a) αvβ3 길항제 및
    b) 사이토킨, 및 AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, EGF 수용체, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM(KSA; KS1/4 항원), IL-2 수용체, 루이스(Lewis)-Y, 루이스-X(CD 15), 흑색종-관련 프로테오글리칸 MCSP, PSA 및 트랜스페린 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 종양 관련 항원 표적에 결합하는 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 항-종양 면역요법제
    를 종양 세포 증식 억제량으로 포함하는, 종양 세포 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, αvβ3 길항제 및 항-종양 면역요법제가 실질적으로 동시에 투여되는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, αvβ3 길항제 및 항-종양 면역요법제가 약 3주의 시간 간격내에 연속적으로 투여되는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, αvβ3 길항제가 항-종양 면역요법제 투여 전에 투여되는 약제학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 항-종양 면역요법제가 αvβ3 길항제 투여 전에 투여되는 약제학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 종양 또는 종양 전이를 환자로부터 수술로 제거하면서 약 3주의 시간 간격 동안 투여되는 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 종양 또는 종양 전이를 환자로부터 수술로 제거한 후에 투여되는 약제학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, αvβ3 길항제가 10 내지 1000mg/kg 체중/1일의 투여량으로 투여되는 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 항-종양 면역요법제가 0.01 내지 10mg/kg 체중/1일의 투여량으로 투여되는 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, αvβ3 길항제가 펩타이드, RGD-함유 펩타이드, 항-αvβ3 모노클로날 항체, 항-αvβ3 수용체 모노클로날 항체 및 αvβ3 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, RGD-함유 펩타이드가 아미노산 잔기 서열 사이클로(RGDfN-MeV)(서열 11)를 갖는 약제학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 사이토킨이 BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, 감마-IP-10, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1, MCP-2, MCP-3, M-CSF, MIF, MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF 알파, TGF 베타, TNF 알파, Tpo 및 VEGF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 사이토킨이 케모킨이고, C10, EMF-1, ENA-78, 에오탁신, GCP-2, HCC-1, I-309, IL-8, IP-10, 림포탁틴, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 및 SDF-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, 항-종양 면역요법제가 사이토킨 IL-2 및 종양 관련 항원 GD2와 면역반응하는 Ig 중쇄를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 항-종양 면역요법제가 사이토킨 IL-2 및 종양 관련 항원 KSA(Ep-CAM; KS1/4 항원)와 면역반응하는 Ig 중쇄를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 종양 세포가 신경외배엽 세포 또는 상피 세포인 약제학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 종양 세포가 선종, 혈관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배아종, 교모세포종, 신경교종, 과오종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근모세포종, 육종 및 기형종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. a) 종양 또는 종양 전이에서 혈관형성을 억제할 수 있는 αvβ3 길항제,
    b) 사이토킨, 및 AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, EGF 수용체, GD2, GD3, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM(KSA; KS1/4 항원), IL-2 수용체, 루이스(Lewis)-Y, 루이스-X(CD 15), 흑색종-관련 프로테오글리칸 MCSP, PSA 및 트랜스페린 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 종양 관련 항원 표적에 결합하는 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드를 포함하는 항-종양 면역요법제, 및
    c) 종양 및 종양 전이를 치료하는 방법에서 당해 제제의 사용에 대한 지침서
    를 포함하는, 종양 또는 종양 전이에서의 종양 세포 치료용 키트.
  37. 삭제
  38. 제36항에 있어서, αvβ3 길항제가 펩타이드, RGD-함유 펩타이드, 항-αvβ3 모노클로날 항체, 항-αvβ3 수용체 모노클로날 항체 및 αvβ3 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  39. 제38항에 있어서, RGD-함유 펩타이드가 아미노산 잔기 서열 사이클로(RGDfN-MeV)(서열 11)를 갖는 펩타이드인 키트.
  40. 삭제
  41. 제36항에 있어서, 사이토킨이 BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, 감마-IP-10, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 내지 MCP-3, M-CSF, MIF, MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, PF-4, RANTES, SCF, TGF 알파, TGF 베타, TNF 알파, Tpo 및 VEGF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  42. 제36항에 있어서, 사이토킨이 케모킨이고, C10, EMF-1, ENA-78, 에오탁신, GCP-2, HCC-1, I-309, IL-8, IP-10, 림포탁틴, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1알파, MIP-1베타, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 및 SDF-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 제36항에 있어서, 항-종양 면역요법제가 사이토킨 IL-2 및 종양 관련 항원 GD2와 면역반응하는 Ig 중쇄를 포함하는 융합 단백질인 키트.
  46. 제36항에 있어서, 항-종양 면역요법제가 사이토킨 IL-2 및 종양 관련 항원 KSA(Ep-CAM; KS1/4 항원)와 면역반응하는 Ig 중쇄를 포함하는 융합 단백질인 키트.
  47. 제36항에 있어서, 종양 세포 또는 종양 전이 세포가 신경외배엽 세포 또는 상피 세포인 키트.
  48. 제36항에 있어서, 종양 세포 또는 종양 전이 세포가 선종, 혈관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배아종, 교모세포종, 신경교종, 과오종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근모세포종, 육종 및 기형종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  49. 제36항에 있어서, αvβ3 길항제 및 항-종양 면역요법제가 별개의 용기내에 제공되는 키트.
  50. 제36항에 있어서, αvβ3 길항제 및 항-종양 면역요법제가 단일 용기내에서 배합되는 키트.
  51. 제36항에 있어서, αvβ3 길항제 및 항-종양 면역요법제가 단일 용기내에서 배합되고 병용에 대한 라벨이 부착되어 있는 키트.
KR1020017010132A 1999-02-12 2000-02-11 혈관형성 억제제 및 항-종양 면역요법제를 포함하는, 종양 및 전이를 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이를 포함하는 키트 KR100704140B1 (ko)

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