JP4841727B2 - 抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 - Google Patents
抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4841727B2 JP4841727B2 JP2000598179A JP2000598179A JP4841727B2 JP 4841727 B2 JP4841727 B2 JP 4841727B2 JP 2000598179 A JP2000598179 A JP 2000598179A JP 2000598179 A JP2000598179 A JP 2000598179A JP 4841727 B2 JP4841727 B2 JP 4841727B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tumor
- antigen
- immunotherapeutic agent
- cytokine
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、１９９９年２月１２日出願の特許６０／１１９，７２１の米国仮出願に基づき優先権を主張する。
（政府の権利の記載）
ここに記載される研究のうちの幾つかは、部分的には、アメリカ合衆国の利益に基づいてなされる国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成によって支持されている。アメリカ合衆国政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（技術分野）
抗血管新生治療及びターゲッテッド抗腫瘍免疫治療の組み合わせ施行に基づく治療を用いる、原発腫瘍及び転移を阻害するための方法に関する。
【０００３】
（背景）
新規血管の生成、すなわち血管新生は、悪性疾患の成長においてキイの役割を果たし、血管新生を阻害する薬剤の開発に多大な関心を生み出している（例えば、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｌ．，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）「Ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｂａｌａｎｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，１４９−１５３；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，ｖａｓｃｕｌａｒ，ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，２７−３１；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）「Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｙ ａ Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ｃｅｌｌ ７９，３１５−３２８；Ｋｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．（１９９７）「Ａ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ ３９０，３３５−３３６；Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）「Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ ３９０，４０４−７；及びＶｏｌｐｅｒｔ，Ｏ．Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）「Ａ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｖｉａ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９５，６３４３−６３４８を参照）。
【０００４】
血管新生の阻害へのαｖβ３インテグリンアンタゴニストの使用が固形腫瘍への血液供給を減少させることによる固形腫瘍の成長を阻害する方法において公知である。例えば、αｖβ３受容体に結合して血管新生を阻害する合成ポリペプチド、モノクローナル抗体及びαｖβ３の模倣体のようなαｖβ３アンタゴニストの使用を記載する米国特許第５，７５３，２３０号（Ｂｒｏｏｋｓ ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ）及び米国特許第５，７６６，５９１号（Ｂｒｏｏｋｓ ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ）を参照のこと。
【０００５】
加えて、確立された腫瘍、例えば、カルチノーマの転移の免疫応答介在阻害を促進する抗体−サイトカイン融合タンパク質治療が記述されている。例えば、サイトカイン・インターロイキン２（ＩＬ−２）が、それぞれ抗体ＫＳ１／４及びｃｈ１４．１８を用いることにより、２つの別々の融合タンパク質の状態でそれぞれ腫瘍関連抗原上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原）又はジシアロガングリオシドＧＤ２と免疫反応するモノクローナル抗体重鎖に融合され、それぞれ融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２及びＫＳ１／４−ＩＬ−２が形成されている。例えば、米国特許第５，６５０，１５０号（Ｇｉｌｌｉｅｓ）を参照のこと。
【０００６】
腫瘍コンパートメントを特異的に標的とする治療と相乗作用する血管新生の脈管構造特異的阻害剤を同定することにより有効なガン治療が最適に仕立てられるであろう。
【０００７】
血管新生は、細胞外マトリックス成分との細胞相互作用に依存する複数のプロセスである内皮細胞の浸潤、移動及び増殖を特徴とする。この脈絡において、インテグリンαｖβ３の内皮接着受容体が、抗血管新生治療戦略の脈管構造特異的標的を提供することによりキープレーヤーであることが示された。（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ． ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．（１９９４）「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，５６９−５７１；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）「Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｌｐｈａ ｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，１５００−１５０２）。血管新生における血管インテグリンαｖβ３の必要性が、移植されたヒト腫瘍による新規血管の生成がインテグリンαｖβ３のペプチドアンタゴニスト又は抗αｖβ３抗体ＬＭ６０９の全身投与のいずれかによって完全に阻害されている幾つかのイン・ビボモデルによって示された。（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ 前出；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）「Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ」，Ｃｅｌｌ ７９，１１５７−１１６４）。ネズミ・ハイブリドーマＬＭ６０９は、１９８７年９月１５日にブダペスト条約の下での国際寄託局としてのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）に寄託されており、ＡＴＣＣ名ＨＢ９５３７が割り当てられている。このようなアンタゴニストは、増殖性血管新生性血管細胞のアポトーシスを促進するインテグリンαｖβ３のライゲーションを遮断し、それにより腫瘍の増殖に必須である新たに形成される血管の成熟を中断させる。
【０００８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激し得る選択的血管新生性増殖因子として同定されている。ヒト腫瘍の生検では悪性細胞によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの強化された発現及び隣接内皮細胞におけるＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡが示される。ＶＥＧＦの発現は壊死の無血管性領域に隣接する腫瘍の領域において最大であるように思われる。（再検討のためには、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）「Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ａｇｅｎｔ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１（２）：６０３−６０６を参照のこと）。有効な抗腫瘍治療は、モノクローナル抗体を用いる血管新生の阻害にＶＥＧＦ受容体のターゲッティングを利用することができる（Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２（Ｆｌｋ１／ＫＤＲ） ａｓ ａｎ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １７（２）；１５５−６１）。
【０００９】
汎発性悪性腫瘍の有効治療の主な障害には、治療薬を送達するための十分に確立された血管供給を欠く微小転移を特徴とする最少残留疾患が含まれる。これに関しては、新規免疫治療策が、サイトカインを腫瘍微小環境に指向させるのに腫瘍コンパートメント特異的モノクローナル抗体を用いる上で効率的であることが立証された。これは、モノクローナル抗体の独自腫瘍特異的ターゲッティング能力及びサイトカインの免疫調節機能を維持するように生成された組換え抗体−サイトカイン融合タンパク質によって達成された。腫瘍コンパートメント内にＩＬ−２を指向させるのに抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いることで、３つの異なる同系マウス腫瘍モデルにおいて、腫瘍微小環境に浸潤する効果細胞の活性化が誘発され、確立された微小転移の効率的な根絶が生じた。（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９６）「Ｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８３，２３６１−２３６６；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）「Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，４９４８−４９５５；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）「Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｔｏ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｌｏｏｄ ９１，１７０６−１７１５）。腫瘍転移の早期段階では完全に有効であるものの、この腫瘍コンパートメント指向アプローチは、十分に発達した血管コンパートメントを特徴とする腫瘍成長の後期段階では転移の成長を遅延させることのみが可能であった。ここで、我々は、連続及び同時組み合わせにおいて用いるときに相乗的である特異的血管及び腫瘍コンパートメント指向治療の相補的利点が存在するのかどうかという問題に取り組んだ。
【００１０】
これは大腸カルチノーマ、メラノーマ及び神経芽細胞種の３種類のネズミ腫瘍モデルにおいて試験し、後者は突発性肝転移を特徴とするものであった。３種類全てのモデルはヒトにおける疾患と密接な類似性を示す。メラノーマ及び神経芽細胞種モデルは、神経外胚葉性悪性腫瘍のようなものにおいて十分確立されている腫瘍関連抗原であるジシアロガングリオシドＧＤ２を発現し（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｍａｔｓｕｋｉ，Ｔ．＆ Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．（１９８９）「Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＭ２ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」，Ｌａｎｃｅｔ １，７８６−７８７；Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）「Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｈ１４．１８ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」，Ｅｕｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３１Ａ，２６１−２６７）、大腸カルチノーマモデルは、ヒトにおける受動免疫療法にうまく利用されている標的分子である上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原）の発現を特徴とする。（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）「Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｒｅｓｅｃｔｅｄ Ｄｕｋｅ’ｓ Ｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ｌａｎｃｅｔ ３４３，１１７７−１１８３）。これらの抗原は、ヒト／マウスキメラ抗ＧＤ２抗体（ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２）（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８９２，１４２８−１４３２）、及びヒト化抗Ｅｐ−ＣＡＭ（抗ＫＳＡ、抗ＫＳ１／４抗原）抗体ＫＳ１／４−ＩＬ−２（Ｘｉａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９７）前出；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ，（１９９８）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＩＬ−１２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔｒａｔｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０，６１９５−６２０３）との抗体−インターロイキン−２融合タンパク質が標的とするこれらのモデルの腫瘍コンパートメントを特異的に描き出す。これらの腫瘍モデルの血管コンパートメントは、幾つかの動物モデルにおいて記載されるように、新たに形成された血管上でのインテグリンαｖβ３の発現によって定義される（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）前出）。ここに提示されるデータは、原発腫瘍及び遠隔転移の腫瘍及び血管コンパートメントを特異的に標的とする同時及び連続治療の相乗的効力を示す。この相乗作用の機構は、この組み合わせ治療で治療した動物のみにおける血管新生の減少及び炎症の増加によって提供される。これらの観察は、抗血管新生剤と腫瘍特異的抗腫瘍免疫治療アプローチとの組み合わせの有益な効果を強調する。
【００１１】
（発明の要約）
本発明は、腫瘍細胞の治療をそのような治療を必要とする患者において行うための方法であって、該患者に腫瘍細胞増殖阻害量の血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤を投与することを含む方法に向けられている。腫瘍細胞の増殖の阻害には、既存の腫瘍もしくは腫瘍転移の腫瘍細胞の増殖の阻害、さらなる腫瘍転移の形成の阻害、及び腫瘍細胞の死さえも包含され得る。血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤は実質的に同時に投与できることはもちろん、連続して投与することもできる。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、患者における腫瘍又は腫瘍転移を治療するための方法であって、少なくとも１種類の血管新生阻害剤及び少なくとも１種類の抗腫瘍免疫治療剤の組み合わせを患者に投与することによる方法を記述する。該患者における腫瘍細胞の増殖の有効な阻害はこのようにして達成することができる。
【００１３】
患者には、腫瘍の全て又は一部を除去するため、前記治療用組成物を外科的処置の前、その最中又はその後に投与することができる。投与は直接浸漬により；全身性もしくは局所化静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内、又は腫瘍塊への直接注射により；及び／又は適切な処方の経口投与により達成することができる。
【００１４】
本発明の方法において用いるのに適切な血管新生阻害剤は、新規血管の形成（血管新生）又は既存の毛細血管網の腫瘍細胞近傍の細胞への拡大を阻害することができるものである。適切な血管新生阻害剤は血管新生阻害活性を有するペプチド、例えば、腫瘍関連抗原ＰＳＡであり得る。他の適切な血管新生阻害剤はＶＥＧＦ関連血管新生のアンタゴニスト、例えば、細胞表面上のＶＥＧＦ受容体のアンタゴニストであり得る。好ましい血管新生阻害剤は細胞に結合するαｖβ３インテグリンのアンタゴニストである。本発明の方法において用いるためのαｖβ３アンタゴニストは、標的組織又は細胞に投与したときに腫瘍又は腫瘍転移関連組織における血管新生を阻害できるものである。このようなアンタゴニストは、αｖβ３に結合し、かつ血管新生を阻害する、αｖβ３の独自の直線もしくはシクロ−ポリペプチド、直線もしくはシクロ−ＲＧＤ含有ポリペプチド、抗体、又は模倣体であり得る。
【００１５】
αｖβ３アンタゴニストが抗体である場合、そのようなものが、αｖβ３もしくはαｖβ３受容体に対する抗原結合特異性を有するポリクローナル、モノクローナル、又はそれらの抗原結合断片であり得ることが意図されている。αｖβ３インテグリンに結合する好ましいモノクローナル抗体はＬＭ６０９として識別されるモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ９５３７）である。
【００１６】
好ましい血管新生阻害剤は、標的細胞上のインテグリン受容体を阻害し得るαｖβ３受容体アンタゴニストであるポリペプチドである。αｖβ３アンタゴニストの最も好ましい実施形態は合成ＲＧＤ含有ペプチド・シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ）（配列番号１１）等である。この一般型の環状ペプチドは米国特許第５，２６２，５２０号（Ｐｌｏｗら）に記載されている。非ＲＧＤ含有ペプチドは米国特許第５，７８０，４２６号（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら）に記載されている。
【００１７】
本発明の方法において用いるのに適する抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍関連抗原ターゲッティング成分に結合した細胞エフェクター成分を含む免疫治療剤である。適切な細胞エフェクター成分には細胞毒性化学物質、細胞毒性放射性同位体、及び細胞情報伝達剤、例えば、サイトカインが含まれ得る。
【００１８】
適切な腫瘍ターゲッティング成分は、腫瘍細胞の周囲組織マトリックス上又はその内部に存在する腫瘍関連抗原に結合するポリペプチド鎖、例えば、受容体タンパク鎖又は免疫グロブリン鎖である。
【００１９】
免疫治療剤の標的に用いることができる腫瘍関連抗原には、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＥＧＦ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、Ｅｐ−ＣＡＭ（ＫＳＡ）、ＩＬ−２受容体、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ（ＣＤ１５）、メラノーマ関連プロテオグリカンＭＣＳＰ、ＰＳＡ及びトランスフェリン受容体からなる群より選択される腫瘍関連抗原が含まれる。
【００２０】
好ましい免疫治療剤はサイトカインポリペプチドであるエフェクター成分を有し、このサイトカインポリペプチドは免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖であるターゲッティング成分に結合している。Ｉｇポリペプチド鎖は腫瘍関連抗原に結合する可変領域を含む。前記免疫グロブリン鎖は、適切な相補鎖と組み合わせられたとき（すなわち、重鎖は軽鎖を補完する）、腫瘍関連抗原に特異的である抗体活性部位を定義することが好ましい。
【００２１】
免疫治療剤の腫瘍ターゲッティングＩｇ部分は全免疫グロブリン鎖アミノ酸配列を含んでいてもよく、又は少なくともその断片がそのタンパク質の抗原結合特異性部分を含む。したがって、適切なＩｇポリペプチド鎖は、少なくとも、腫瘍関連抗原に特異的なＩｇ可変領域を有する。
【００２２】
本発明の方法において用いるのに適する、それらに由来する抗体及びポリペプチド鎖は、いかなる哺乳動物起源のものでもあり得るアミノ酸配列を有する。そのような抗体タンパク質が予想される患者と同じ起源のものではない場合、その抗体タンパク質の断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ又は加工済みＦｖ一本鎖抗体タンパク質を用いることができる。抗体タンパク質の抗原性をさらに低下させるため、抗体アミノ酸配列の改変を果たし、患者の正常抗体成分により類似するものと考えられるタンパク質を作製することによってそれを低下させることができる。例えば、ヒト患者に投与するため、抗体をヒト化するための様々なプロセスにより、モノクローナルネズミ抗体アミノ酸配列をよりヒトらしく見えるように改変することができる。
【００２３】
その代わりに、抗体は、ヒト起源のもの（ヒトＩｇ遺伝子によって遺伝的にコードされる）ではあるが、自身の本来のＩｇ遺伝子の代わりにヒトＩｇ遺伝子を発現するように形質転換されたトランスジェニック動物において産生されるものであってもよい。例えば、ヒトＩｇタンパク質をコードするヒト起源ＤＮＡを発現するトランスジェニックマウスを構築することができる。そのようなトランスジェニックマウスからのモノクローナル抗体の産生はネズミＢ細胞ハイブリドーマを生じ、これはヒト起源のアミノ酸配列を有する抗体をコードするヒトＤＮＡを発現する。これは、ヒト患者の治療において用いるための抗体の免疫原性を大きく低下させる。
【００２４】
ヒト患者を治療するのに、請求される発明の方法において用いるための好ましい抗体は、ヒト化抗ＧＤ２腫瘍関連抗原モノクローナル抗体ｃｈ１４．１８及び抗ＫＳ１／４腫瘍関連抗原（別名Ｅｐ−ＣＡＭ及びＫＳＡ）モノクローナル抗体ＫＳ１／４である。
【００２５】
本発明を具現する方法、組成物及びキットにおいて用いるのに適する免疫治療剤の細胞エフェクター成分は、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、Ｅｐｏ、ＦＧＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ガンマ−ＩＰ−１０、ＩＦＮアルファ、ＩＦＭベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ、ＬＴ、ＭＣＰ−１〜ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＳＭ、ＰＢＰ、ＰＢＳＦ、ＰＧＦＤ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＴＧＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＮＦアルファ、Ｔｐｏ及びＶＥＧＦからなる群より選択されるサイトカインである。ケモカインである適切なサイトカインは、Ｃ１０、ＥＭＦ−１、ＥＮＡ−７８、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、ＧＣＰ−２、ＨＣＣ−１、Ｉ−３０９、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、リンホタクチン（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＧＳＡ、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＮＡＰ−２、ＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ−１及びＳＤＦ−１からなる群より選択することができる。前記免疫治療剤のサイトカイン部分は全サイトカインタンパク質アミノ酸配列であっても、サイトカイン特異的生物学的応答を誘発するのに十分なそのような融合タンパク質の断片であってもよい。
【００２６】
好ましい実施形態において、免疫治療剤のサイトカイン部分はＩＬ−２の生物学的活性を有する。
【００２７】
Ｉｇポリペプチドに結合するサイトカインポリペプチドを含む免疫治療剤において、サイトカインポリペプチド鎖とＩｇポリペプチド鎖との間の適切な結合には直接ポリペプチド結合、２つの鎖の間にポリペプチドリンカーを有する結合、又はビオチニル化及びアビジン−ビオチン複合体の使用を含む他の鎖間化学的結合が含まれる。好ましい結合は直接又はポリペプチドリンカーで間隔を空けたポリペプチド結合である。この直接結合は、融合タンパク質免疫治療剤をコードする適切な発現ベクターで形質転換された宿主細胞からの単一融合タンパク質としての免疫治療剤の発現を可能にする。
【００２８】
したがって、本発明の方法において用いるのに好ましい免疫治療剤はサイトカイン成分及び腫瘍関連抗原ターゲッティング成分を有する二官能性融合タンパク質であり、このターゲッティング成分は腫瘍関連抗原に対する特異性を有するＩｇポリペプチドである。このような好ましい免疫治療剤の例にはＧＤ２を標的とする融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＩＬ２、及びＫＳ１／４腫瘍関連抗原（別名Ｅｐ−ＣＡＭ及びＫＳＡ）を標的とする融合タンパク質ＫＳ１／４−ＩＬ２が含まれる。
【００２９】
その代わりに、本発明の方法、組成物及びキットにおいて用いるのに適する他の免疫治療剤は細胞毒性剤である細胞エフェクター成分を有することができる。適切な細胞毒性剤は腫瘍細胞に対する直接細胞毒性効果を有するもの、すなわち、免疫毒素、放射性同位体、細胞毒性薬等である。上記サイトカイン免疫治療剤と同様に、細胞毒性ペプチドを腫瘍関連抗原ターゲッティングＩｇポリペプチドに直接、又はリンカーペプチドもしくは鎖によって間隔を空けて結合させ、融合タンパク質を形成することができる。化学的細胞毒素をターゲッティングＩｇ鎖に化学的に結合させることができる。抗体鎖を担持する放射性同位体を構築することもできる。
【００３０】
本発明の他の側面は、血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤を含む治療用組成物を包含する。抗腫瘍免疫治療剤は、細胞エフェクター成分に結合する腫瘍関連抗原特異的成分を有することによって腫瘍又は腫瘍転移細胞を標的とすることが好ましい。本発明の好ましい治療用組成物において、抗腫瘍免疫治療剤は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖である腫瘍ターゲッティング成分に結合するサイトカインポリペプチドであるエフェクター成分を有する二官能性タンパク質であり、ここで、Ｉｇ鎖は腫瘍関連抗原に結合する可変領域を有する。
【００３１】
本発明のさらに別の側面は腫瘍又は腫瘍転移を治療するためのキットである。このキットは、血管新生阻害剤、例えば、前記腫瘍又は前記腫瘍転移において血管新生を阻害することが可能なαｖβ３アンタゴニストを収容するパッケージ；サイトカイン活性及び腫瘍抗原特異性を有する二官能性タンパク質成分；及び腫瘍及び腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するための使用説明書を含む。このキットは、腫瘍又は腫瘍転移の治療へのキット成分の使用を指示する明確な標識を含んでいてもよい。
【００３２】
（図面の簡単な説明）
本発明の好ましい実施形態を以下の添付の図面を参照して以下に記載する。これらの図面において：
図１は、原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示す。図１Ａは、ＮＸＳ２神経芽細胞腫を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｂは、ＣＴ２６−ＫＳＡ大腸カルチノーマを皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｃは、Ｂ７８−Ｄ１４メラノーマ細胞を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【００３３】
図２は、血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍治療の効果を図式的に示す。図２Ａは、インテグリンαｖアンタゴニスト、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質のいずれか、及びそれらの組み合わせを用いる血管及び腫瘍コンパートメント治療に続く、原発腫瘍の血管密度についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。図２Ｂは、それぞれ、血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の白血球浸潤についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【００３４】
図３は、突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の連続組み合わせの効果を図式的に示す。突発性肝転移の数は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【００３５】
図４は、突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の実質的に同時の組み合わせの効果を図式的に示す。原発腫瘍の除去の前（図４Ａ）又はその後（図４Ｂ）に開始された、インテグリン又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）を用いる治療からの結果が示される。突発性肝転移は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
原発腫瘍及び遠隔転移の抑制及び根絶はガンの代替治療策、例えば、血管新生の阻害及び標的設定免疫治療の主な目的である。
【００３７】
（１）（抗血管新生性）血管新生阻害治療及び（２）抗腫瘍免疫治療としてここで言及される２つの治療様式の組み合わせ使用により、腫瘍及び腫瘍転移内の腫瘍細胞の治療で有効性に予期せざる相乗効果が存在することが今や見出されている。特には、組み合わせαｖアンタゴニスト治療及び抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質治療が記載される。
【００３８】
血管及び腫瘍コンパートメントに向けられた２つの独自の単一治療；それぞれ、腫瘍血管特異的抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び腫瘍特異的抗体−インターロイキン−２融合タンパク質、の間に相乗作用が生じることが見出された。
【００３９】
これらの単一治療の同時及び連続組み合わせは、神経芽細胞腫の免疫原性に劣る相乗作用モデルにおける突発性肝転移を根絶した。これは、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト又は抗体−ＩＬ−２融合タンパク質のいずれかを用いる単一治療を施した対照と対照的であり、これらの対照は適用した用量レベルで部分的に有効であるだけであった。
【００４０】
さらに、インテグリンαｖアンタゴニスト及び腫瘍特異的抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる同時治療は、３種類の相乗作用ネズミ腫瘍モデル、すなわち、メラノーマ、大腸カルチノーマ及び神経芽細胞腫において劇的な原発腫瘍の退行を生じた。しかしながら、単一治療単独として用いた各々の薬剤は腫瘍成長の遅延のみを誘発した。
【００４１】
抗腫瘍応答には腫瘍微小環境における腫瘍血管密度の同時５０％減少及び炎症細胞の５倍の増加が伴った。その後、組み合わせ治療を施した動物においてのみ腫瘍の壊死が示されたが、各々の薬剤を単一治療として適用した場合には示されなかった。これらの結果は、これらの相乗作用治療様式が転移性癌の将来の治療に新規かつ有効なツールを提供することを示す。
【００４２】
本発明は、ここに記載される相乗作用治療の実施に有用な腫瘍及び腫瘍転移の治療方法、治療用組成物及び治療用キット（パッケージ化システム）を記載する。
【００４３】
１．治療用組成物
本発明の方法を実施する上で有用である様々な治療用組成物が記述される。これらの組成物は、（抗血管新生性）血管新生阻害剤、例えば、αｖβ３アンタゴニスト及び抗腫瘍剤、例えば、腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質を単独で、又は様々な組み合わせで含む。
【００４４】
Ａ．血管新生阻害剤
それらで治療した組織において血管新生を阻害する血管新生阻害剤を本発明の組成物及び方法において用いることができる。好ましい血管新生阻害剤はαｖアンタゴニスト、特にはαｖβ３アンタゴニストである。血管新生阻害（抗血管新生）αｖβ３アンタゴニストは、ペプチド、ＲＧＤ含有ペプチド、抗αｖβ３抗体、抗αｖβ３受容体抗体、又はαｖβ３模倣体であり得る。αｖβ３アンタゴニストの例は米国特許第５，７５３，２３０号（Ｂｒｏｏｋｓ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ）及び米国特許第５，７６６，５９１号（Ｂｒｏｏｋｓ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ）の教示に記載されており、これらのαｖβ３アンタゴニストの調製及び使用に関連する開示は参照することによりここに明確に組み込まれる。
【００４５】
好ましいアンタゴニストはＲＧＤ含有ペプチド、例えば、環状ペプチド・シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ）（配列番号１１）である。αｖβ３アンタゴニストとして機能する有機模倣体、及び非ＲＧＤ含有環状ペプチドを含むさらなるアンタゴニストが文献に記載されている。例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、国際公開ＷＯ９７／４５１３７（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９１５８）を参照のこと。
【００４６】
アンタゴニストとしての使用に適するαｖβ３アンタゴニストを同定するためのアッセイは参照される米国特許に記載されており、したがって、本発明を実施するための代替アンタゴニストは容易に同定できるものと考えられる。
【００４７】
適切な抗αｖβ３モノクローナル抗体を改変して、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、及び加工済みＦｖ又は一本鎖抗体（ＳＣＡ）を含むそれらの抗原結合性断片を含むようにすることができる。このような断片を調製するための方法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと）。抗体の使用を記述する本発明の方法にも、全抗体からそれらの抗原結合性断片への適切な改変が組み込まれる。適切なモノクローナル抗体の１つはＬＭ６０９（ＡＴＣＣ ＨＢ９５３７）として識別される。
【００４８】
他のαｖβ３受容体アンタゴニストが血管新生の阻害において有効であることが示されており、本発明の方法における使用に適切である。例えば、化学的受容体アンタゴニスト、例えば、（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［３−（ピリジン−２−イルアミノ）−１−プロピルオキシ）−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸（ＳＢ−２６５１２３として知られる）が様々な哺乳動物モデル系において試験されている（例えば、Ｋｅｅｎａｎ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ８（２２）：３１７１−６；Ｗａｒｄ ＫＷ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ２７（１１）：１２３２−４１を参照のこと）。
【００４９】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が選択的血管新生性成長因子として同定されている。したがって、代わりの、もしくはさらなる血管新生阻害剤は血管新生性成長を阻害するのに十分なＶＥＧＦ活性を有する阻害剤であり得る。そのような阻害剤は、競合性阻害剤もしくはＶＥＧＦ結合／不活性化分子、又はＶＥＧＦ受容体アンタゴニストであり得る。例えば、可能性のある阻害剤は、ＶＥＧＦ標的／受容体への結合で競合するＶＥＧＦの非血管新生性化学的模倣体、修飾非血管新生性ＶＥＧＦ誘導体、血管新生活性を阻害するのに十分なＶＥＧＦに特異的に結合する抗体、又は、おそらくは、ＶＥＧＦに結合する他の特異的タンパク質（例えば、単離したＶＥＧＦ受容体タンパク質）、又はＶＥＧＦ受容体に結合してＶＥＧＦとの相互作用を遮断する抗体であり得る。
【００５０】
他の化合物、例えば、単離された腫瘍関連抗原ＰＳＡが血管新生を阻害するその化合物の能力に基づいて同定されている。
【００５１】
Ｂ．抗腫瘍免疫治療剤
このような本発明の方法において用いるための方法及び組成物では、少なくとも１種類の（抗血管新生性）血管新生阻害性治療薬と少なくとも１種類の抗腫瘍免疫治療剤との組み合わせ投与が意図されている。好ましい抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍ターゲッティング成分を細胞エフェクター成分、例えば、サイトカイン、免疫毒素、放射性薬剤等と組み合わせている。腫瘍ターゲッティング成分は、好ましくは、少なくとも、腫瘍関連抗原に対する抗体の抗原結合部分を含む。好ましい実施形態の１つにおいて、エフェクター成分はサイトカインである。
【００５２】
ａ）腫瘍関連抗原
腫瘍関連抗原は、それによって本発明の方法、組成物及びキットにおいて用いるための免疫治療剤が最終的に腫瘍細胞に標的設定する標的である。腫瘍関連抗原は、当該技術分野において、特定の型の癌に相関するものと認識されている。ほとんど全ての場合において腫瘍関連抗原は細胞表面抗原であり、これは癌腫瘍の起源に関連する正常細胞には通常見出せない様式で発現する。他の腫瘍関連抗原は、成熟正常組織に関連して通常は見出せない分泌分子又は細胞外マトリックス関連成分である。
【００５３】
幾つかの腫瘍関連抗原は組織の早期発生段階に発現するタンパク質であり、通常は成熟組織に伴うことはない（時には癌胎児性タンパク質と呼ばれる）。他の腫瘍関連抗原は正常成熟組織が発現するが、癌細胞がより多量に発現する。腫瘍関連抗原は、正常に発現した細胞マーカー又は細胞外成分の成熟形態であってもよい。さらに別の腫瘍関連抗原は、タンパク質、脂質もしくは細胞外成分のグリコシル化の代替もしくは異常形態、又は新規炭水化物部分に関連する。
【００５４】
したがって、腫瘍関連抗原は広範に変化し、少なくとも部分的には、本発明によって治療しようとする腫瘍の型を定義する。腫瘍の型及びそれらによって発現する腫瘍抗原の多様性は多岐にわたり、今や癌の技術分野において十分に研究されている。
【００５５】
癌の多くのさらなるマーカーが研究の最中にあり、ひとたび腫瘍関連抗原であるものと同定されて特徴付けられると、それらも所望の腫瘍又は転移部位に対するターゲッティング免疫治療に適する標的抗原である。
【００５６】
抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原モノクローナルを用いる、遺伝子治療ベクターの癌細胞へのターゲッティングが報告されている。（Ｋｕｒａｎｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８９（１１）：１２１２−９（１９９８））。同様に、抗ガングリオシドＧＭ３抗体又は抗Ｌｅｗｉｓ−Ｘ抗原抗体を用いるリポソームのターゲッティングも報告されている（Ｎａｍ，Ｓ．Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ １１（１）：９−１６（１９９９））。
【００５７】
以下で論じられるように、同定された抗原を、その抗原に特異的に結合する適切な抗体を産生させるようにするための方法が当該技術分野において公知である。この方式で、腫瘍抗原を同定することができ、かつ本発明において有用であるモノクローナル抗体を作製することができる。腫瘍抗原の調製を再検討するには、Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ｅｄｓ．Ｓｅｌｌ ａｎｄ Ｗａｈｒｅｎ，１９８２における教示を参照のこと。抗原及び／又はサイトカイン等の調製に適用可能な、標準的な生化学的及び分子生物学的教示は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ ＮＹ）に見出すことができる。
【００５８】
腫瘍細胞表面抗原は特定のクラスの腫瘍、又は個々の型の腫瘍に特異的であり得る。腫瘍関連抗原に関連し、それらをコードする核酸及び／又はアミノ酸配列の多くは、様々なサービス、すなわち、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ）によってインターネットを介してアクセス可能な公共のコンピュータデータベースから入手可能であり、一般には名称及び受付番号によって識別される（アクセス可能な配列情報の型の幾つかの非限定的な例は、「受付番号参照」というコメントによって参照される）。
【００５９】
好ましい腫瘍関連抗原標的には、ＡＦＰ（受付番号ＮＰ００１１２５を参照）、ＣＡ１２５（受付番号ＮＰ００５８９０を参照）、ＣＥＡ（受付番号ＡＡＡ６２８３５を参照）、ＣＤ１９（受付番号Ｐ１５３９１を参照）、ＣＤ２０（受付番号Ｐ１１８３６を参照）、ＣＤ４４（受付番号Ｐ１６０７０を参照）、ＣＤ４５（受付番号Ｐ０８５７５を参照）、ＥＧＦ受容体（受付番号Ｐ００５３３を参照）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（受付番号ＡＡＡ５８６３７を参照）、Ｅｐ−ＣＡＭ（ＫＳＡ）（受付番号Ｐ１６４２２、ＡＡＡ３６１５１を参照）、ＩＬ−２受容体（受付番号Ｐ１４７８４、ＮＰ０００１９７、Ｐ０１５８９を参照）、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ（ＣＤ１５）、メラノーマ関連プロテオグリカンＭＣＳＰ（受付番号ＮＰ００１８８８を参照）、ＰＳＡ（受付番号Ｐ０７２８８を参照）、ＰＭＳＡ、トランスフェリン受容体（受付番号ＮＰ００３２１８、ＮＰ００３２２５、ＡＡＦ０４５６４を参照）、膵臓カルチノーマ・マーカータンパク質ＧＡ７３３−１（受付番号Ｐ０９７５８を参照）、葉酸受容体（受付番号ＮＰ０００７９３を参照）、Ｌ６（受付番号Ｐ３０４０８を参照）及びＣＯ−０２９（受付番号Ａ３６０５６、Ｐ１９０７５を参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
ターゲッティング免疫治療剤に特に好ましい腫瘍関連抗原標的は、ここに記載されるように、ＧＤ２及びＫＳＡ（Ｅｐ−ＣＡＭ；ＫＳ１／４抗原）である。
【００６１】
腫瘍関連抗原タンパク質は商業的に入手可能であり、又は当該技術分野において公知の標準組換えＤＮＡ及び細胞培養、タンパク質発現技術を用いて産生させることができる。例えば、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）は、販売のため、ジシアロガングリオシドＧＤ２（Ｇ０７７６）、ジシアロガングリオシドＧＤ３（Ｇ５９０４）、モノシアロガングリオシドＧＭ１（Ｇ７６４１）、モノシアロガングリオシドＧＭ２（Ｇ４６５１）、消化管腫瘍抗原Ｃａ１９−９（Ｇ８６６０、Ｇ８５３５）、癌胎児性抗原ＣＥＡ（Ｃ４８３５）、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ三糖（Ｌ５１５２）、及びＬｅｗｉｓ−Ｙ（Ｌ７４０１）を列挙する。
【００６２】
これらの腫瘍関連抗原の多くに特異的である抗体は商業的に入手可能である。（例えば、ＵＳＢ、ＲＤＩ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ）。例えば、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）は多くのモノクローナル抗体、例えば、抗ＡＦＰ（Ａ８４５２）、抗ＣＥＡ（Ｃ２３３１）、抗ＥＧＦ受容体（Ｅ３１３８）、抗ＩＬ−２可溶性受容体、（Ｉ５６５２、Ｉ５７７７、Ｉ５９０２）、抗ＣＤ１９（Ｆ３８９９）、抗ＣＤ２０（Ｃ８０８０）、抗ＣＤ４４（Ｃ７９２３）、及び抗ＣＤ４５（Ｃ７５５６）を販売する。
【００６３】
たとえ商業的に入手可能でないとしても、モノクローナル抗体を作製する公知方法を用いて、腫瘍関連抗原に特異的な抗体を、その抗原を免疫原として産生させることができる。例えば、抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原ネズミ抗体重鎖及び軽鎖可変ドメインが記述されている（受付番号ＡＡＢ２５７９８及びＡＡＢ２５７９９を参照）。同様に、抗アシアロＧＭ１ガングリオシドネズミ抗体重鎖及び軽鎖可変ドメイン（受付番号ＡＡＤ０９１９４及びＡＡＤ０９１９５）。抗ＧＤ２ガングリオシドモノクローナル抗体重鎖及び軽鎖については結晶構造が解析されている（受付番号２５５４８４１、２５５４８４２を参照）。葉酸受容体に結合する抗体が報告されており（結合タンパク質）、卵巣癌のマーカーとして同定されている（受付番号ＮＰ０００７９３を参照）。抗ＣＡ１２５モノクローナル可変領域重鎖及び軽鎖核酸配列も報告されており、カセットベクターへの挿入に用いられている（受付番号ＡＡＢ３３４５４、３３４５５）。
【００６４】
特に好ましい抗体は、ここに記載されるｃｈ１４．１８及びＫＳ１／４抗体である。
【００６５】
ｂ）モノクローナル抗体及びそれらの抗原結合部分等
Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に公開されたモノクローナル抗体の産生方法の出現以来、改良された方法が当該技術分野において公知となっている（例えば、Ｄｅａｎ，Ｃ．Ｊ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，１９９８） ｃｈａｐｔｅｒ ４；及びＡｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ ＮＹ，１９９２） ｃｈａｐｔｅｒ １１を参照）。これは、今や、特定の抗原に結合するモノクローナル抗体を産生させる定型的なやり方である。所望であれば、高親和性結合抗体を選択するためのスクリーニングプロトコルも改善されている。
【００６６】
典型的には、ハイブリドーマを産生させるための宿主はマウス又は他の齧歯類起源である。
【００６７】
ヒト患者に対するネズミモノクローナルでの繰り返し治療の障壁の１つは、その治療に応答して患者が産生するＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）である。この障壁を克服する方法には、マウスタンパク質の抗原性アミノ酸の代わりに抗原性が低いものと思われるヒトタンパク質配列を用いることによるネズミ抗体タンパク質のヒト化が含まれる。他の方法は結合特異性決定アミノ酸残基又は領域のヒトタンパク質フレームワークへのグラフト化を含む。
【００６８】
ファージ発現系において抗体タンパク質を発現する能力は、結合を改善するか、又は免疫原性を減少させるように突然変異誘発を受けている抗体の選択を可能にする（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）を参照のこと。近年、トランスジェニックマウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子の置換により、ヒト核酸配列起源のものである抗体、したがってモノクローナル抗体を産生させるのにネズミ宿主を用いることが可能となっている。
【００６９】
断片化によって抗体のサイズを減少させて抗原性を減少させ、又はより小さな治療用分子を作製することも可能である。例えば、適切な酵素での消化により、又は組換えＤＮＡ法によってより小さいタンパク質を産生させることにより、全抗体タンパク質を縮小することができる。適切な断片は少なくとも全分子の抗原結合部分を含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖ（一本鎖抗体；ＳＣＡ）構築体が含まれ得る。
【００７０】
上述の通り、本発明のヒトの治療方法において用いるための治療薬の全てのモノクローナル抗体ベースの成分が免疫原性及び潜在的なＨＡＭＡを減少させるような改変から恩恵を受け得ることが想像される。
【００７１】
また、特定の腫瘍関連抗原に特異的に結合し得る特異的受容体タンパク質を上述の免疫治療剤のターゲッティング成分として利用することもできる。機能的には、標的腫瘍関連抗原に対する受容体の特異性及び親和性に依存して、特異的受容体は特異的抗体と同様にターゲッティングに有用であり得る。必ずしも腫瘍関連ではない類似タンパク質への交差反応性結合の衝撃を最小にするように注意を払うべきである。
【００７２】
ｃ）サイトカイン
一実施形態において、本発明の抗腫瘍免疫治療構築体は、好ましくはサイトカインである細胞エフェクター部分を組み込む。
【００７３】
本発明の抗腫瘍治療薬のエフェクター成分は様々なサイトカインのいずれをも、そのサイトカインの受容体を担持する細胞によるサイトカイン特異的生物学的応答を誘発するために含むことができる。サイトカインは十分に特徴付けられており、したがって、本発明はそのように限定されるものと解釈されるものではない。サイトカインにはサブクラスとしてケモカインと呼ばれる分子が含まれる。本発明の脈絡において、ケモカインはサイトカイン・スーパーファミリーの一メンバーと考えられる。したがって、サイトカインという用語は、ここで用いられる場合、一般にサイトカイン及びケモカインの両者を指す。サイトカイン技術の説明については、Ｃａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９４を参照のこと。ケモカイン技術の説明については、Ｖａｄｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９７を参照のこと。サイトカインに関連する多くの核酸及び／又はアミノ酸配列は、様々なサービス、すなわち、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター；ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｌｈ．ｇｏｖ）によってインターネットを介してアクセス可能な公共のデータベースから入手可能であり、一般には名称及び受付番号によって識別される（ここで引用される配列情報へのアクセスの幾つかの非限定的な例は、識別番号への参照を伴う「受付番号参照」というコメントによってこれを参照する）。
【００７４】
哺乳動物由来のサイトカインは種特異的であることもあり、突然変異及び／又は対立遺伝子多様性のため種内で変化することもある。治療しようとする哺乳動物の種に従い、使用に適するサイトカインを選択することができる。複数の対立遺伝子が存在する場合、サイトカインの活性に従って選択することができ、又は対立遺伝子変種の混合物を選りすぐりのサイトカインとして用いることができる。したがって、本発明の方法の獣医学的使用を治療しようとする動物の種に対してあつらえることができ、又は、標的の種に由来するものが利用可能ではない場合、より密接に関連する種に由来するサイトカインの選択が選択される。ヒトの治療には、既知であるならばヒト相同体を用いることが好ましい。
【００７５】
本発明において用いるの適するサイトカインには、ＢＤＮＦ（受付番号４５０２３９３参照）、ＣＮＴＦ（受付番号４７５８０２０参照）、ＥＧＦ（受付番号ｐ０１１３３参照）、Ｅｐｏ（受付番号４５０３５８９参照）、ＦＧＦ（受付番号ＣＡＢ６１６９０参照）、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ（受付番号ＣＡＡ２７２９０参照）、ＧＭ−ＣＳＦ（受付番号４５０３０７７参照）、Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ガンマ−ＩＰ−１０（受付番号Ｐ０２７７８参照）、ＩＦＮアルファ（受付番号Ｐ０１５６３参照）、ＩＦＮベータ（受付番号Ｐ０１５７４参照）、ＩＦＮガンマ（受付番号Ｐ０１５７９参照）、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８（受付番号Ｐ０１５８３、Ｐ０１５８４、Ｐ０１５８５、Ｐ０８７００、Ｐ０５１１２、Ｐ０５１１３、Ｐ０５２３１、Ｐ１３２３２、Ｐ４１３２４、Ｐ１５２４８、Ｐ２２３０１、Ｐ２０８０９、Ｐ２９４５９、Ｐ４６６５８、Ｐ３５２２５、Ｐ４０２２２、Ｐ４０９３３、Ｑ１４００５、ＮＰ００２１８１、Ｑ１４１１６参照）、ＬＩＦ（受付番号ＡＡＣ０５１７４参照）、ＬＴ（受付番号４５０４０３１参照）、ＭＣＰ−１〜ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ（受付番号４５０３０７５参照）、ＭＩＦ（受付番号４５０５１８５参照）、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＮＧＦ（受付番号４５０５３９１参照）、ＮＴ−３（受付番号Ｐ２０７８３参照）、ＮＴ−４（受付番号Ｐ３４１３０参照）、ＯＳＭ（受付番号Ｐ１３７２５参照）、ＰＢＰ（受付番号４５０５６２１参照）、ＰＢＳＦ、ＰＧＦＤ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ（受付番号Ｐ２１５８３参照）、ＴＧＦアルファ（受付番号Ｐ０１１３５参照）、ＴＧＦベータ（受付番号Ｐ０１１３７参照）、ＴＮＦアルファ（受付番号Ｐ０１３７５参照）、Ｔｐｏ（受付番号Ｐ４０２２５参照）又はＶＥＧＦ（受付番号ＡＡＤ０３７１０参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
本発明において用いるのに適するケモカインには、Ｃ１０（受付番号Ｐ３３８６１参照）、ＥＭＦ−１（受付番号Ｐ０８３１７参照）、ＥＮＡ−７８（受付番号Ａ５５０１０参照）、エオタキシン（受付番号ＢＡＡ８４５７９参照）、ＧＣＰ−２（受付番号Ｐ８０１６２参照）、ＨＣＣ−１（ｇ１００４２６７参照）、Ｉ−３０９（受付番号ｇ４５０６８３３参照）、ＩＬ−８（受付番号ＡＡＡ５９１５８参照）、ＩＰ−９（受付番号ＣＡＡ７５５１０参照）、ＩＰ−１０（受付番号４５０４７０１参照）、リンホタクチン（受付番号４５０６８５３参照）、ＭＣＰ−１（受付番号４５０６８４１参照）、ＭＣＰ−２（受付番号Ｐ８００７５参照）、ＭＣＰ−３（受付番号ＣＡＢ５９７２３．１参照）、ＭＣＰ−４（受付番号Ｑ９９６１６参照）、ＭＧＳＡ（受付番号Ｐ０９３４１参照）、ＭＩＧ（受付番号Ｐ３５６２５参照）、ＭＩＰ−１アルファ（受付番号Ｐ１０８５５参照）、ＭＩＰ−１ベータ（受付番号Ｐ１３２３６参照）、ＭＩＰ−２、ＮＡＰ−２（受付番号Ｐ２０７７５参照）、ＰＦ４（受付番号４５０５７３３参照）、ＲＡＮＴＥＳ（受付番号４５０６８４７参照）、ＳＣＭ−１（受付番号Ｐ４７９９２参照）又はＳＤＦ−１（受付番号Ｐ４８０６１参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明において用いるのに好ましいサイトカインにはＩＬ−２及びＩＬ−１２、又は少なくとも無傷の分子全体のエフェクター活性の一部を保持する、それらの生物学的に活性な断片が含まれる。
【００７７】
本発明において用いるのに好ましいサイトカインはＩＬ−２である。
【００７８】
本発明の方法において用いるのに適するサイトカインは、適切な核酸配列から、標準分子生物学技術を用いて調製することができる。遺伝子を発現させるための方法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８５：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ ＮＹ，１９９１）を参照のこと）。また、サイトカインは商業的源から入手することもできる（すなわち、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）。
【００７９】
ｄ）抗腫瘍／サイトカイン免疫治療剤
本発明の実施に適するこれらの抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍ターゲッティング成分に連結する、好ましくはサイトカインである細胞エフェクター成分を組み込む。腫瘍結合成分とエフェクター成分との連結は様々な方法によって達成することができる。
【００８０】
１）抗体融合タンパク質
腫瘍抗原を担持する細胞又は組織をサイトカイン機能の標的とし、かつサイトカインを用いることにより、腫瘍抗原を担持し、もしくはそれに関連する細胞に対する免疫応答を補強する免疫治療用抗癌試薬が記述されている。これらの免疫治療剤は抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質と呼ばれ、これは、この融合タンパク質が、サイトカインと予め選択された腫瘍関連抗原と免疫反応する組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチドとの融合を含むためである。
【００８１】
ここで用いられる場合、免疫治療用抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質剤は、抗原結合部分を少なくとも含む抗体タンパク質断片とサイトカインの生物学的シグナル伝達機能を保持するのに十分なサイトカインのエフェクター部分を少なくとも含むサイトカインとの融合構築体を包含する。本発明の融合タンパク質は直接であっても、リンカーペプチド（１つもしくは複数）によって架橋されていてもよい。
【００８２】
抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質は当該技術分野において公知であり、特には、例えば、米国特許第５，６５０，１５０号（Ｇｉｌｌｉｅｓ）に記載され、融合タンパク質の調製及び使用に関連するその開示は参照することにより明白にここに組み込まれる。
【００８３】
融合タンパク質は細胞表面抗原である様々な腫瘍抗原のいずれに対するものでもよく、そのようなことから本発明はそのように限定されるものと解釈されるものではない。例えば、モノクローナル抗体から誘導される組換えＩｇ重鎖の調製が公知であるように、サイトカイン及びＩｇ重鎖を用いる融合タンパク質の調製が公知である。加えて、モノクローナル抗体の調製は確立された技術であり、腫瘍抗原に対するそのような抗体の調製方法が公知である。モノクローナル抗体の調製に関する教示には「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｅｄｓ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ，１９８５が含まれる。
【００８４】
典型的には、Ｉｇポリペプチド鎖は、細胞表面腫瘍抗原を担持する細胞に特異的なＮ末端可変領域を含むＩｇ重鎖又は軽鎖ポリペプチドである。融合タンパク質は、典型的には、サイトカインのアミノ末端アミノ酸へのペプチド結合によって結合する、カルボキシ末端であるＩｇポリペプチドを有する。Ｉｇポリペプチドが重鎖である場合、そのＩｇ重鎖は、典型的には、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインをさらに含み、任意にＣＨ３ドメインをさらに含んでいてもよい。しかしながら、所望であれば、そのような定常領域ドメインを除去して、結果として生じる融合タンパク質構築体の免疫原性、サイズ、又は非特異的結合を減少させることができる。重鎖及び軽鎖ドメインの会合を容易にするため、重鎖Ｆｖが軽鎖Ｆｖに結合している連結Ｆｖ分子を構築することが望ましい。この結合は一方の鎖のカルボキシ末端から他方のアミノ末端へのものであり、再折り畳み／ドメイン会合の後に抗原結合ポケットを立体的に大きく変化させることのないようにするのに十分な長さである。
【００８５】
好ましい融合タンパク質はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原ＧＤ２と免疫反応するＩｇ重鎖を含む。別の実施形態において、好ましい融合タンパク質はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原Ｅｐ−ＣＡＭ（別名ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原）と免疫反応するＩｇ重鎖を含む。これらの実施形態の例示的な融合タンパク質は、以下に、それぞれ、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２及びＫＳ１／４−ＩＬ−２として記述されている。
【００８６】
２）抗体結合体
代わりの免疫治療用構築体を本発明の方法及び組成物において用いることができる。例えば、高親和性ビオチン−アビジン系を利用して、ビオチン（又はアビジン）に連結する腫瘍関連抗原特異的抗体鎖、及び適切な結合体（アビジン又はビオチン）に連結するサイトカインを含む独立のビオチニル化タンパク質を、適切な連結を用いて構築することができる。使用時に、ビオチニル化抗体タンパク質をイン・ビトロ又はイン・ビボで、投与の前又は後にサイトカインタンパク質に結合させ、ビオチン−アビジン複合体によって連結する腫瘍抗原結合成分及びエフェクターサイトカイン成分を有する二官能性免疫治療剤を作製することができる。
【００８７】
ビオチニル化抗体及びタンパク質は当該技術分野において公知であり、商業的に入手可能な試薬を用いて調製することができる。ビオチニル化腫瘍抗原ターゲッティング抗体を利用する特徴の１つはビオチン分子が複数のアビジン結合部位を有することであり、これは、各々が抗体に結合するというエフェクター成分、例えば、アビジン連結サイトカインのより大きな相乗作用、又は２つ以上のエフェクター成分の組み合わせ使用を可能にする。他の直接化学的結合方法及び試薬も当該技術分野において公知であり、直接又は介在リンカーを用いての、エフェクター分子への抗体の結合に適用されている。（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｙｏｕ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，１９９８） ｃｈａｐｔｅｒ １７；及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６）を参照）。したがって、本発明の免疫治療剤は、抗原結合部分を少なくとも含む抗体タンパク質断片とサイトカインの生物学的シグナル伝達機能を保持するのに十分なサイトカインのエフェクター部分を少なくとも含むサイトカインとの間に、上述のビオチニル化構築体をも包含する。
【００８８】
ｅ）他の免疫治療剤
本発明を具現する方法、組成物、及びキットにおいて用いるのに適する抗腫瘍免疫治療剤はサイトカインではないエフェクター部分を組み込むことができる。細胞エフェクター成分は毒素又は他の方法で腫瘍に損傷を与える細胞毒性剤でもあり得ることが想像される。したがって、他の有用な抗腫瘍治療薬には、抗原結合部分を少なくとも含む抗体タンパク質断片と放射性同位体、免疫毒素、細胞毒性ペプチド又は細胞毒性剤との構築体が含まれ得る。
【００８９】
１）放射標識抗体
腫瘍ターゲッティングモノクローナル抗体及び放射標識同位体を含む放射免疫結合体が抗癌剤として用いられている。モノクローナル抗体の抗原結合特異性は腫瘍部位に局在化するターゲッティング能力を提供し、これに対して放射標識は細胞毒性を提供する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６） ｃｈａｐｔｅｒ ８を参照）。これらの放射免疫結合体は本発明の方法において抗腫瘍治療薬としての使用に適するものであり得る。
【００９０】
２）免疫毒素−抗体
モノクローナル抗体と様々な源から誘導されるタンパク質毒素との結合体も抗腫瘍治療について試験されている。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６） ｃｈａｐｔｅｒ ８を参照）。このような結合体は本発明の方法における使用に適するものであり得る。
【００９１】
３）薬物細胞毒素−抗体
モノクローナル抗体と化学的に合成した、及び／又は様々な源から精製した薬物毒素との結合体も抗腫瘍治療に用いることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６）を参照）。このような結合体は本発明の方法において用いるのに適するものであり得る。
【００９２】
４）多特異的抗体
酵素的消化、又はコードするＤＮＡ配列の操作によって産生される抗体断片の操作は、異なる結合特異性を有する２つの抗体を結合するハイブリッド分子である二特異的抗体（ＢｓＡｂｓ）の作製を可能にする。このようにして、標的腫瘍への特異的結合を細胞エフェクター医薬品（すなわち、サイトカイン、薬物又は毒素）への結合と組み合わせ、腫瘍細胞の治療を局在化することができる（例えば、Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，１９９８）ｃｈａｐｔｅｒ １２を参照）。このような二官能性又は他の様式で多官能性の抗体は本発明の方法における使用に適するものであり得る。
【００９３】
２．治療方法
腫瘍及び腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するための本発明の治療方法は、血管新生阻害（抗血管新生）治療及び抗腫瘍免疫治療の組み合わせ使用に基づく。２つ以上の型の血管新生阻害剤を２つ以上の型の抗腫瘍免疫治療剤と組み合わせて用いることができる。この組み合わせ使用は同時に、連続的に、又は治療の間に期間を挟んでなすことができる。特定の治療薬のいずれをも治療の過程で２回以上投与することができる。本発明の方法では血管新生阻害治療薬及び抗腫瘍免疫治療剤の組み合わせ使用が考慮されており、これは、個々の治療薬各々の腫瘍細胞増殖阻害効果の相乗作用を生じることが可能であり、個々の成分を単独で投与することによって見出されるものよりも有効な治療を生じる。したがって、一側面において、本発明の方法は、単独で投与した場合には有効な血管新生又は抗腫瘍細胞活性を生じないであろう量の血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤を、組み合わせて患者に投与することを包含する。
【００９４】
本発明の方法は、工程の点で、本発明を実施するための様々な様式を含む。例えば、アンタゴニスト及び抗腫瘍免疫治療剤（例えば、好ましい実施形態における抗原／サイトカイン融合タンパク質）を混合後に、すなわち同時に投与することができ、又は連続的に、すなわち別々に投与することができる。さらに、アンタゴニスト及び融合タンパク質を、投与間の約３週間の間隔内で、すなわち、実質的に最初の活性剤の直後から最初の薬剤の投与後約３週間までで、別々に投与することができる。加えて、順序を変更することができる、すなわち、αｖβ３アンタゴニストを融合タンパク質の投与前に投与することができ、又は投与を逆の順番で実施することができることが意図されている。
【００９５】
一実施形態において、本発明の方法は、腫瘍又は転移の治療を必要とする患者に、血管新生阻害量の血管新生阻害剤、例えば、αｖβ３アンタゴニスト、及び生物学的応答を誘発するのに十分な量の抗腫瘍免疫治療剤を投与することも包含する。例えば、サイトカイン及び組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖を有する二官能性融合タンパク質であって、Ｉｇ鎖が腫瘍関連細胞表面抗原を担持する腫瘍細胞に特異的な可変領域を含み、かつＩｇ鎖がペプチド結合によってサイトカインに結合している二官能性融合タンパク質のような場合には、サイトカイン特異的生物学的応答を誘発するのに十分なものである。並びに、免疫治療剤が細胞毒性剤を含む場合、その量は標的腫瘍細胞内に細胞毒性生物学的応答を誘発するようなものである。
【００９６】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍塊の一部又は全てが除去される外科的手順と共に実施することができる。これに関して、この方法は外科的手順に続いて実施することができる。その代わりに、第１の活性剤の投与と第２の活性剤の投与との間隔に外科的手順を実施することもできる。この方法の例は、以下に記載される本発明と外科的腫瘍除去との組み合わせである。
【００９７】
この方法による治療は、典型的には、治療用組成物を１回以上の投与サイクルで投与することを含む。例えば、同時投与が実施される場合、αｖβ３アンタゴニスト及び抗腫瘍免疫治療剤の両者を含む治療用組成物を約２日〜約３週間の期間にわたって１つのサイクルで投与する。その後、この治療サイクルを、開業医の判断に従い、必要に応じて繰り返すことができる。同様に、連続的な適用が意図される場合、個々の治療薬各々の投与時間を、典型的には、同じ期間をカバーするように調整する。サイクル間の間隔は約ゼロから２ヶ月まで変化し得る。
【００９８】
投与は周期的単位投与、連続輸液、蠕動送達、大量瞬時投与等によって達成することができる。経路には静脈内、皮下、筋肉内、同所注射、同所輸液、経口適用等が含まれ得る。
【００９９】
本発明の方法において用いられる治療用組成物は、公知のように、活性剤を薬学的に許容し得る担体中に含み、したがって、本発明は、組成物中の活性剤（１種類もしくは複数種類）の濃度が列挙される活性剤をここに記載される量だけ送達（投与）するのに十分なものである限り、組成物に関して限定されるものと解釈されるものではない。
【０１００】
典型的には、抗腫瘍免疫治療剤、例えば、抗原ターゲッティング／サイトカイン融合タンパク質の投与量は、毎日体重キログラム当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１ｍｇ、より好ましくは約０．６ｍｇである。
【０１０１】
抗腫瘍免疫治療剤、例えば、抗原標的設定細胞毒性剤の投与量は、放射線の照射量が望ましい放射線用量に依存して適切に調整できる場合、毎日体重キログラム当たり、典型的には０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１ｍｇ、より好ましくは約０．６ｍｇであり得る。放射線治療に適することが見出されている同位体には、５７−コバルト；６７−銅；９９ｍ−テクネチウム；１２３−ヨウ素；１３１−ヨウ素；及び１１１−インジウム等である。放射性医薬品及び投与量は放射性同位体及び標的組織に依存して変化する。悪性新生物の免疫放射線治療は、免疫治療剤が腫瘍部位及び／又は細胞を標的とするため、伝統的な放射線治療よりも高い用量を用いることができる。例えば、Ｂ細胞を標的とする放射性免疫治療剤を用いるＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療は、０．４ｍＣｕｉ／体重ｋｇ（１ｍＣｕｉ＝３７Ｍｂｑ）の最大寛容用量を有することが見出された。（Ｗｉｔｚｉｇ，ＴＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）「Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ＣＤ２０（＋） Ｂ−ｃｅｌｌ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ． １７（１２）：３７９３−８０３）。しかしながら、特定の腫瘍又は腫瘍転移に標的設定された放射性免疫治療は、このリンパ腫の治療よりも高い寛容用量を可能にし得る。ヌードマウスにおいて、１８．５Ｍｂｑの１１１−インジウム標識抗体の２用量の投与が寛容であった。（Ｓａｇａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｎｄｉｕｍ−１１１ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３５（８）：１２８１−５）。
【０１０２】
αｖβ３アンタゴニストの典型的な投与量は、毎日体重キログラム当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約２０〜１００ｍｇ、より好ましくは約５０ｍｇである。
【０１０３】
癌が動物界全体を通して見出され、かつここに記載される原理が、血管新生をαｖβ３アンタゴニスト及び免疫系におけるサイトカインによって阻害することが可能である全ての動物に適用されることは理解される。したがって、本発明は全ての哺乳動物、特にはヒトに対して実施することができる。
【０１０４】
さらに、成長するために血管新生を必要とし、したがって本方法の組み合わせ治療様式の候補である様々な腫瘍が存在することは公知である。血管新生を誘発する成長を生じ得る腫瘍には、神経外胚葉、上皮及び同様の組織から生じる腫瘍が含まれる。例示的な腫瘍及び腫瘍転移には、アデノーマ、血管肉腫、星状細胞腫、上皮カルチノーマ、胚細胞種、グリア芽細胞腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、奇形腫等が含まれる。
【０１０５】
３．治療用システム
一実施形態において、本発明では、本発明の方法を実施するのに必要な試薬を提供するパッケージング及び／又はキットを含むシステムが意図されている。腫瘍又は腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するためのキットは、
ａ）腫瘍又は腫瘍転移内の血管新生を阻害することが可能な血管新生阻害剤、例えば、αｖβ３アンタゴニスト；
ｂ）サイトカイン及び組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖を有し、Ｉｇ鎖が腫瘍関連細胞表面抗原を担持する腫瘍細胞に特異的な可変領域を含み、Ｉｇ鎖がペプチド結合によってサイトカインに結合する抗腫瘍免疫治療剤、例えば、二官能性融合タンパク質試薬；及び
ｃ）方法において腫瘍及び腫瘍転移の治療に該試薬を用いるための使用説明書；
のパッケージを含む。
【０１０６】
本発明のキットにおける試薬は、典型的には、ここに記載される治療用組成物として処方され、したがって、キットに収容して配布するのに適する様々な形態のうちのいずれでもよい。このような形態には、液体、粉末、錠剤、懸濁液及び本発明のアンタゴニスト及び／又は融合タンパク質を提供するための同様の処方が含まれ得る。これらの試薬は、本発明に従って別々に投与するのに適する別々の容器で提供することができ、又は、その代わりに、パッケージ中に単一の容器で組成物の状態に組み合わせて提供することができる。
【０１０７】
同様に、そのようなパッケージは、上記成分の代わりに、又はそれらに加えて、他のあらゆる抗腫瘍免疫治療剤、例えば、上記のものを含んでいてもよい。
【０１０８】
このパッケージは、ここに記載される治療方法に従い、１回以上の投与に十分な量の試薬を含むことができる。典型的には、パッケージは、ここに記載される治療の１サイクルに十分な量を含む。パッケージのラベルにより、本発明の方法による腫瘍及び／又は転移の治療的処置への封入される試薬の組み合わせ又は連続使用を指示することができる。このようなパッケージのラベルは各々の試薬バイアル、及び／又は材料の完全なパッケージに貼付することができる。
【０１０９】
本発明のキットは、パッケージに収容される材料の「使用説明書」も含む。これらの使用説明書は、本発明による腫瘍又は腫瘍転移の治療へのアンタゴニスト及び融合タンパク質の組み合わせ使用の方法に関連する。腫瘍、患者及び疾患状態に依存してこれらの方法が広範に変化し得る限り、使用説明書はそれに従って投与の手順を指定するように変化させることができる。本発明は、本発明の方法によるアンタゴニスト及び融合タンパク質の組み合わせ使用に関する特徴以外に、使用説明書の性質に限定されるものと考えられるものではない。
【０１１０】
同様に、試薬には抗腫瘍免疫治療用細胞毒性剤、例えば、放射標識同位体に結合した腫瘍抗原結合抗体、又は細胞毒性剤、例えば、細胞毒性ペプチドもしくは細胞毒性薬等が含まれ得る。
【０１１１】
４．合成ペプチドの調製
ａ．合成手順
下記表１に列挙される直線及び環状ポリペプチドは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＲＢ，（１９６９）「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３２：２２１−９６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＲＢ，（１９６９）「Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，ＪＡＭＡ ２１０（７）：１２４７−５４；及びＦｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｌ．，（１９９０）「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５（３）：１６１−２１４によって記載される標準固相合成技術を用いて合成した。
【０１１２】
まず２グラム（ｇ）のＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＭｅ（配列番号１）を６０ミリリットル（ｍｌ）のメタノールに溶解し、これに１．５ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して混合物を形成した。次に、この混合物を２０度Ｃ（２０℃）で３時間攪拌した。蒸発させた後、残滓を水中にとり、希ＨＣｌでｐＨ３に酸性化して酢酸エチルで抽出した。その抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて再度蒸発させ、生じたＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号２）をジオキサン中の２Ｎ ＨＣｌ ２０ｍｌと共に２０℃で２時間攪拌した。生じた混合物を蒸発させてＨ−Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号３）を得、続いてそれを１８００ｍｌのジクロロメタン及び２００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の混合液に溶解した後、０℃に冷却した。その後、０．５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）、０．３ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び０．２３ｍｌのＮ−メチルモルホリンを攪拌しながら連続的に添加した。
【０１１３】
生じた混合物を０℃でさらに２４時間、次いで２０℃でさらに４８時間攪拌した。この溶液を濃縮し、混合床イオン交換器で処理して塩を除去した。生じる樹脂を濾過によって除去した後、清澄化溶液を蒸発させ、残滓をクロマトグラフィーによって濾過することでシクロ（Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号４）を回収した。
【０１１４】
一文字コードアミノ酸残基略語を用いて表１に列挙され、ペプチド数の指示によって同定される以下のペプチドを同様に得た：シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号５）；シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号６）；シクロ（Ａｒｇ−ＤＡｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号８）；シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＤＶａｌ）（配列番号７）；及びシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（メチル化はバリン残基のアミド結合のα−アミノ窒素に位置する）（配列番号１１）。
【０１１５】
６６２０３と命名される、ペプチド６２１８４のものと同一の配列を有するペプチドは、６２１８４に存在するＴＦＡ塩ではなく塩ＨＣｌを含むことによってのみ後者と区別される（配列番号５）。同じことがペプチド６９６０１及び６２１８５（配列番号６）並びに８５１８９及び１２１９７４（配列番号１１）に言える。
【０１１６】
ｂ．交互合成手順
ｉ．シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）、ＴＦＡ塩の合成
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＮａ（配列番号１４）は、固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型手順を用いて、ＮＭｅＶａｌ、ＤＰｈｅ、Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）、Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）を段階的様式で４−ヒドロキシメチル−フェノキシメチル−ポリスチレン樹脂（Ｗａｎｇ型樹脂）に連続的に添加することによって合成する（ペプチド合成の通例のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型の方法を適用する）。ポリスチレン樹脂及びアミノ酸残基前駆体はＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ又はＦｌｕｋａ ｃｈｅｍｉｃａｌ社から商業的に入手可能である。アミノ酸残基の連続添加が完了した後、ＴＦＡ／ジクロロメタンの１：１混合液を用いて樹脂をペプチド鎖から除去することでＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨ生成物（配列番号１５）を得る。次に、ピペリジン／ＤＭＦの１：１混合液でＦｍｏｃ基を除去することで粗製Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨ前駆体（配列番号１６）を得、次にそれをＨＰＬＣによって通例の様式で精製する。
【０１１７】
環化のため、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍｌ中に０．６ｇのＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨ（上で合成）（配列番号１６）の溶液を８５ｍｌのジクロロメタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈し、５０ｍｇのＮａＨＣＯ３を添加する。ドライアイス／アセトン混合物中で冷却した後、４０μｌのジフェニルホスホリルアジド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。室温で１６時間整地した後、溶液を濃縮する。その濃縮物をゲル濾過し（イソプロパノール／水 ８：２中のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム）、次にＨＰＬＣによって通例の様式で精製する。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｈ２Ｏ（９８：２）で処理することによりシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（ここでは「シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ）」とも呼ばれる；配列番号１１）×ＴＦＡを得、次にこれをＨＰＬＣによって通例の様式で精製する；ＲＴ＝１９．５；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：５８９。
【０１１８】
ｉｉ．「内部塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ）」の合成
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＴＦＡを水中に懸濁させた後、真空下で蒸発させてＴＦＡを除去することにより、上で生成した環状ペプチドからＴＦＡ塩を除去する。形成された環状ペプチドを「内部塩」と呼び、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）と命名する。この環状ペプチドは内部電子的に互いに相殺する２つの反対に帯電する残基を含んで全体として無荷電の分子を形成するため、「内部塩」という用語を用いる。これらの荷電残基のうちの一方は酸性部分を含み、他方の荷電残基はアミノ部分を含む。この酸性部分及びアミノ部分が互いに近接する場合、酸性部分をアミノ部分によって脱プロトン化することができ、これにより全体として中性電荷を有するカルボン酸／アンモニア塩が形成される。
【０１１９】
ｉｉｉ．シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＨＣｌを得るためのＨＣｌ処理
８０ｍｇのシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）を０．０１Ｍ ＨＣｌに５〜６回溶解し、各々の溶解操作の後に凍結乾燥する。引き続くＨＰＬＣによる精製でシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＨＣｌを得る；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：５８９。
【０１２０】
ｉｖ．シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＭｅＳＯ３Ｈを得るためのメタンスルホン酸処理
８０ｍｇのシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）を０．０１Ｍ ＭｅＳＯ２Ｈ（メタンスルホン酸）に５〜６回溶解し、各々の溶解操作の後に凍結乾燥する。引き続くＨＰＬＣによる精製でシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＭｅＳＯ３Ｈを得る；ＲＴ＝１７．８；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：５８９。
【０１２１】
環化の代替方法はスルフヒドリル部分を有する非環式ペプチド前駆体の側基鎖の誘導体化を含み、正常生理学的ｐＨ条件（ｐＨ７．５）よりも僅かに高いものに露出される場合、分子内に存在する他のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を分子内で形成して環状ペプチドを形成する。加えて、チオエステル環化ペプチドを精製するため、非環式ペプチド前駆体のＣ末端カルボン酸部分をその分子内に存在する遊離スルフヒドリル部分と反応させることができる。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
５．腫瘍特異的抗体−サイトカイン融合体の生成及び特徴付け
ａ．タンパク質及び脈管構造特異的インテグリンαｖアンタゴニスト：
ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２及びｈｕＫＳ１／４−ＩＬ−２抗体−サイトカイン融合タンパク質の構築及び特徴付けはこれまでに記述されている（Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９７）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．ら（１９９２）前出）。両構築体の抗原結合特性はそれらのそれぞれの抗体のものと同一であり、特異的ＥＬ−２活性は商業的に入手可能なｒｈＩＬ−２と等しかった。インテグリンαｖβ３アンタゴニスト環状ペプチド１２１９７４（シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ））（配列番号１１）及び対照ペプチド１３５９８１（シクロ（ＲＡＤｆＮ−ＭｅＶ）（配列番号１３）を合成し、特徴付けした。
【０１２４】
６．細胞系及び動物モデル
全ての細胞系及びそれぞれの動物モデルは実質的に従来記述される通りに確立した（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９６）；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９６）；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９８）前出）。ＮＸＳ２及びＣＴ２６−ＫＳＡ細胞上にインテグリンαｖβ３細胞が存在しないことは抗マウスＣＤ６１（インテグリンβ３鎖）抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて示した。両細胞系は、陽性対照として用いられるインテグリンαｖβ３陽性Ｂ１６ＦＧ３及びＢ７８−Ｄ１４ネズミメラノーマ細胞とは対照的に、ＦＡＣＳ分析においてシグナルがないことが明らかになった（１μｇ抗マウスＣＤ６１ｍＡｂ／１０６細胞）。さらに、ＮＸＳ２細胞は、陽性対照として用いられる抗ＧＤ２抗体ｃｈ１４．１８（１０μｇ／ｍｌ、４℃、２４ｈ）とは対照的に、抗マウスＣＤ６１ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、４℃、２４ｈ）でコートしたプラスチックに付着することができなかった。しかしながら、全ての腫瘍細胞はＦＡＣＳによってαｖインテグリンを発現し、かつビトロネクチンに付着し、インテグリンαｖβ５の存在が示される。
【０１２５】
全ての外科的手順について、マウスはケタミン注射（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）及び同時メトファン吸入（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＬ）によって麻酔した。インテグリンαｖアンタゴニスト及び対照ペプチドを投与するための浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）、モデル２００１、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）は１７．５μｇ／ｈの送達速度で用いた。これらのポンプは製造者のガイドラインに従って取り扱い、無菌条件下で背部皮下組織に移植した。全てのポンプは移植後第７日に取り替え、抗血管処理の第１０日に除去した。全ての動物実験はＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行った。
【０１２６】
７．組織学及び免疫組織化学
原発腫瘍のアセトン固定凍結切片を４％ヤギ血清と共にインキュベートして非特異的結合を遮断した。抗マウスＣＤ３１及び抗マウスＣＤ４５ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）（１：１００）とのインキュベーション及びローダミン標識ヤギ抗ラット抗体（１：３００）での染色を加湿チャンバー内、室温で行った。各々のインキュベーションの後にＰＢＳで洗浄した（×３）。高出力野（ＨＰＦ）当たりの血管及び白血球細胞カウントを顕微鏡により２００×倍で決定した（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）「Ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ｂｌｏｃｋｓ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ． ９６，１８１５−１８２２）。代表的な領域を、それぞれ、２００×（血管）及び８００×（白血球細胞）で写真撮影した。
【０１２７】
８．原発腫瘍は抗体ＩＬ−２融合タンパク質と組み合わせたインテグリンαｖで治療したマウスにおいてのみ退行する
血管新生阻害治療（インテグリンαｖアンタゴニスト）及び免疫治療（抗体ＩＬ−２融合タンパク質）の相乗効果を３種類全ての同系モデルにおいて、それぞれ、確立された皮下腫瘍（１１０−１３０μｌ）を有するマウスで決定した。
【０１２８】
図１は、抗血管新生αｖインテグリンアンタゴニストと抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍免疫治療コンパートメント特異的免疫治療との組み合わせ治療の原発腫瘍に対する効果を図式的に示す。図１Ａは、ＮＸＳ２神経芽細胞腫の皮下注射（２×１０６）によって誘発された原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｂは、ＣＴ２６−ＫＳＡ大腸カルチノーマの皮下注射（２×１０６）によって誘発された原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｃは、Ｂ７８−Ｄ１４メラノーマ細胞の皮下注射（２×１０６）によって誘発された原発腫瘍からの結果を示す。確立された腫瘍（１１０−１３０ｍｍ３）の治療は、腫瘍特異的抗体−ＩＬ−２融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ−２（１０μｇ、大腸カルチノーマ）及びｃｈ１４．１８−ＩＬ−２（５μｇ、神経芽細胞腫、１０μｇ、メラノーマ）（×５）の毎日の静脈内注射、並びに血管特異的インテグリンαｖアンタゴニスト又は対照ペプチドの浸透圧ポンプを１７．５μｇ／ｈ（頂部）で７日間用いての連続皮下輸液によって開始した。治療開始の時間は黒い矢印によって示す。各実験群（ｎ＝６）におけるマウスの原発腫瘍のサイズはマイクロキャリパ測定によって決定した（幅×長さ×幅／２）（平均±標準誤差）。治療開始時の確立された腫瘍のサイズと比較した組み合わせ治療を施したマウスの原発腫瘍サイズの退行は、全ての対照（Ｐ＞０．０５）とは対照的に、３種類の異なる同系腫瘍モデルにおいて統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定）。
【０１２９】
まず、各々の治療様式の最適下量を確立し、それらの引き続く組み合わせての使用を開始した。インテグリンαｖアンタゴニスト及びＩＬ−２融合タンパク質で治療したマウスのみが、３種類全てのモデルにおいて、５０〜９０％の範囲の腫瘍退行を提示した（Ｐ＜０．００１）。実際、神経芽細胞腫及び大腸カルチノーマ細胞を接種した動物の半分はそれらの原発腫瘍を完全に拒絶した（データは示さず）。これは、最良で、対照と比較してそれぞれ成長を遅延させる、単一治療として用いられる各々の方策とは対照的であった。続いて、各々の治療様式及びそれらの組み合わせの血管及び腫瘍コンパートメントに対する効果を分析した。
【０１３０】
確立された原発神経芽細胞腫（腫瘍細胞接種の２０日後に外科的に除去）の組み合わせ抗血管新生及び腫瘍特異的免疫治療に続く組織学を行った。簡単に述べると、ホルマリン固定原発腫瘍をパラフィンに埋め込み、続いてヘマトキシリン／エオシン染色した。壊死領域及び白血球浸潤を同定した。
【０１３１】
図２は、血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍免疫治療治療の効果を図式的に示す。確立された原発神経芽細胞腫を有するマウス（ｎ＝６）に、各々の治療を単独で施す対照を含めて、図１に記載されるように脈管構造特異的インテグリンＣＣ、アンタゴニスト、非特異的ペプチド対照及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる組み合わせ治療を施した。治療の最後に、ｓ．ｃ．腫瘍を外科的に除去した。各々の腫瘍の凍結切片を、それぞれ血管内皮細胞（ＣＤ−３１）及び白血球浸潤（ＣＤ４５）に特異的な抗体を用いる免疫組織化学によって分析した。後者は、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質によって誘発される腫瘍コンパートメント特異的免疫応答の十分に確立されたマーカーである（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９６）前出；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９６）前出；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９８）前出）。
【０１３２】
図２Ａは、インテグリンａ、アンタゴニスト、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質及びそれらの組み合わせのいずれかを用いる血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の血管密度の結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。図２Ｂは、それぞれ血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の白血球浸潤の結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【０１３３】
インテグリンαｖアンタゴニストを投与されたマウスは原発腫瘍の成長遅延と同時に血管新生の５０％減少を示し（図２）、血管コンパートメントの有効なターゲッティングが示された。この場合、腫瘍コンパートメントは直接には影響を受けない（図１）。対照的に、抗−ＧＤ２−ＩＬ−２融合タンパク質のみで治療したマウスでは明瞭な白血球浸潤が明らかとなったが、これはこの抗腫瘍コンパートメント指向治療の十分に確立された特徴であり（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９６）前出；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９６）前出；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９８）前出）、ｓ．ｃ．腫瘍の成長の実質的な低下につながる（図１）。
【０１３４】
しかしながら、インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗−ＧＤ２−ＩＬ−２融合タンパク質の組み合わせで治療したマウスのみで、抗−ＧＤ２−ＩＬ−２融合タンパク質単独で治療したマウスと比較して腫瘍への白血球の浸潤の５倍の増加が明らかとなり、かつ血管新生の同様の減少が示された。炎症細胞の増加は組織学及び免疫組織化学によって立証され、マクロファージの流入のためであったが、これは細胞残滓の除去の間に壊死組織において頻繁に見られるパターンである。実際、このような壊死領域は、各々の成分で別々に治療した対照とは反対に、組み合わせ治療の後に腫瘍内にのみ存在していた。
【０１３５】
９．連続及び同時血管及び腫瘍ターゲッティングは突発性肝転移の根絶を誘発する
原発腫瘍の成功に終わる治療に加えて、より関連のある疑問は、遠隔転移がこのような組み合わせ抗血管及び抗腫瘍特異的治療策によって影響を受けるかどうかである。これには、突発性肝転移を特徴とする神経芽細胞腫モデルにおいて取り組んだ。このために、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニストでの原発腫瘍の治療を抗体ＩＬ−２融合タンパク質による抗腫瘍免疫治療と連続的に組み合わせた。
【０１３６】
図３は、抗血管新生αｖインテグリンアンタゴニストと抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫療法との連続組み合わせの突発性肝神経芽細胞腫転移に対する効果を図式的に示す。この抗血管治療は、確立された原発腫瘍を有するマウスにおいて、図１について記載されるように合計１０日間で開始した。原発腫瘍を外科的に除去した後、５μｇのｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質を毎日ｉ．ｖ．注射することにより（×５）、マウスに腫瘍コンパートメント特異的免疫療法を施した。突発性肝転移の数は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【０１３７】
両薬剤で連続的に治療したマウスのみが、単一治療として用いられる各々の薬剤での治療が無効である（Ｆ＜０．０１）（図３）全ての対照とは反対に、肝転移の１．５−２対数減少を提示した。実際、組み合わせ治療を施したマウスの４／８では肝転移が全く存在しないことが明らかになったが、これに対して残りの動物は１−５小転移性病変のみを示した。本質的に、インテグリンαｖ、アンタゴニストとｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質との同時組み合わせによって同様の結果が得られた。（図４頂部）。
【０１３８】
図４は、抗血管新生インテグリンαｖアンタゴニストと抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫療法との同時組み合わせの突発性肝神経芽細胞腫転移に対する効果を図式的に示す。突発性転移は、２×１０６ＮＸＳ２神経芽細胞腫細胞ｓ．ｃ．での原発腫瘍の誘発に続いて誘発された。インテグリン、又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）での治療を原発腫瘍の除去の前（図４Ａ）又はその後（図４Ｂ）に開始した。突発性肝転移は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【０１３９】
両薬剤で治療したマウスでのみ、原発腫瘍除去の前又は後のそれらの投与に依存して、肝転移の完全な非存在（図４Ａ）又は＞１．５対数減少（図５Ｂ）が明らかとなった（Ｐ＜０．０１）。これは、各々の薬剤を単一治療として用いた場合に治療が無効であった全ての対照と反対であった。
【０１４０】
１０．相乗作用組み合わせ及び有効治療
悪性腫瘍の血管コンパートメントにおける血管の破壊は癌と闘うための強力な方策である。腫瘍脈管構造の内皮細胞をターゲッティングすることにより、腫瘍をうまく治療することができる。血管新生性血管上に発現するαｖインテグリンとの相互作用によって脈管構造を標的とするペプチドアンタゴニスト（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ 前出；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．ら，（１９９５）前出）は血管の形成を抑制し、それに続く腫瘍の成長を劇的に退行させる。これは、３つの活発に成長する原発腫瘍及び１つの突発的に転移する腫瘍を治療することによって示された。用いられるインテグリンαｖアンタゴニストは主としてαｖβ３に対するものであったが、これは密接に関連するインテグリンαｖβ３も結合する。試験した大腸カルチノーマ及び神経芽細胞腫は明らかにαｖβ３を欠くが、幾らかのαｖβ５を発現するようである。メラノーマモデルもαｖβ３を発現する。しかしながら、このインテグリンアンタゴニストの効果は、神経芽細胞腫モデルについて示されるように（図２）、３種類の全ての動物モデルにおいて明らかに腫瘍脈管構造に制限される。重要なことには、腫瘍脈管構造へのターゲッティングの抗腫瘍効果は腫瘍コンパートメントに対する同時攻撃によって増幅され、これは原発腫瘍及び突発性転移の両者に対して有効である。これは特に関連性があり、それは、原発腫瘍の切除の後に血管新生阻害剤の循環レベルが減少することから治療に先立つ原発腫瘍の除去が神経芽細胞腫転移の成長及び汎発を増加させるという他の腫瘍モデルにおいて十分文書化されている知見ためである（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｌ．ら，（１９９５）前出；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，（１９９５）前出）。血管及び腫瘍コンパートメントへの同時ターゲッティングは非常に有効であることが立証されているが、それは、これが腫瘍細胞の栄養状態の低下と腫瘍細胞の活発な破壊とを組み合わせ、それが原発腫瘍の退行及び遠隔転移の根絶につながるためである。これは、同系モデルにおいてｓ．ｃ．腫瘍の成長の抑制のみを生じる２つの異なる抗血管新生治療策（Ｍａｕｃｅｒｉ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｎａｔｕｒｅ ３９４，２８７−２９１）を用いる単一血管コンパートメント指向アプローチとは対照的である。
【０１４１】
本方策において、腫瘍コンパートメント特異的応答には、腫瘍特異的抗体−ＩＬ−２融合タンパク質によって活性化され、かつ腫瘍微小環境を指向する炎症細胞が介在する。重要なことには、この抗血管新生策は、十分に確立された血管供給を有する原発腫瘍の成長抑制においては非常に有効であるものの、単一治療として用いられたときに遠隔微小転移に対する同様の効力を欠く（図３、４）。しかしながら、乏しい血管新生を特徴とする小腫瘍負荷を伴うそのような最小残留疾患設定においては、組み合わせ治療において用いられる抗腫瘍コンパートメント治療アームが単一治療として用いられたときに非常に有効である（Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら，（１９９７）前出；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら，（１９９８）前出）。この状況において、抗血管新生治療の役割の１つは、微小転移誘発血管新生及びそれに続く転移病巣の拡大を抑制することである。（Ｖｏｌｐｅｒｔ，Ｏ．Ｖ．ら，（（１９９８）前出）。これは、その次に、腫瘍コンパートメント指向治療によるそのような微小転移の根絶を容易にするが、これは最小残留疾患設定において最適に有効である（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９６）前出）。
【０１４２】
原発腫瘍及び汎発性転移の有効な治療は臨床腫瘍学における大きな挑戦のままである。この報告における結果は、特異的抗血管新生及び免疫治療の組み合わせが原発腫瘍の退行及び微小転移の根絶において相乗作用することを示す。両治療様式、すなわち、αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−インターロイキン−２融合タンパク質が現在単一治療として臨床評価の最中であるため、それらの組み合わせの相乗作用は癌治療に対する新規かつ有効なツールを提供する。
【０１４３】
本発明の特定の実施形態を記載する前記の例は説明のためのものであり、もちろん、本発明を具体的に限定するものと解釈されるべきではない。さらに、現在公知であるか又は後に開発される、当業者の範囲内にあるような本発明の変形は、以下で請求される本発明の範囲内に入るものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示し、ＮＸＳ２神経芽細胞腫を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【図１Ｂ】 原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示し、ＣＴ２６−ＫＳＡ大腸カルチノーマを皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【図１Ｃ】 原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示し、Ｂ７８−Ｄ１４メラノーマ細胞を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【図２Ａ】 血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍治療の効果を図式的に示し、インテグリンαｖアンタゴニスト、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質のいずれか、及びそれらの組み合わせを用いる血管及び腫瘍コンパートメント治療に続く、原発腫瘍の血管密度についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【図２Ｂ】 血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍治療の効果を図式的に示し、それぞれ、血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の白血球浸潤についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【図３】 図３は、突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の連続組み合わせの効果を図式的に示す。突発性肝転移の数は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【図４Ａ】 突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の実質的に同時の組み合わせの効果を図式的に示し、原発腫瘍の除去の前に開始された、インテグリン又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）を用いる治療からの結果が示される。
【図４Ｂ】 突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の実質的に同時の組み合わせの効果を図式的に示し、原発腫瘍の除去の後に開始された、インテグリン又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）を用いる治療からの結果が示される。
【配列表】
（関連出願への相互参照）
本願は、１９９９年２月１２日出願の特許６０／１１９，７２１の米国仮出願に基づき優先権を主張する。
（政府の権利の記載）
ここに記載される研究のうちの幾つかは、部分的には、アメリカ合衆国の利益に基づいてなされる国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成によって支持されている。アメリカ合衆国政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（技術分野）
抗血管新生治療及びターゲッテッド抗腫瘍免疫治療の組み合わせ施行に基づく治療を用いる、原発腫瘍及び転移を阻害するための方法に関する。
【０００３】
（背景）
新規血管の生成、すなわち血管新生は、悪性疾患の成長においてキイの役割を果たし、血管新生を阻害する薬剤の開発に多大な関心を生み出している（例えば、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｌ．，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）「Ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｂａｌａｎｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，１４９−１５３；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．（１９９５）「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，ｖａｓｃｕｌａｒ，ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １，２７−３１；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）「Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｙ ａ Ｌｅｗｉｓ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ｃｅｌｌ ７９，３１５−３２８；Ｋｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．（１９９７）「Ａ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ ３９０，３３５−３３６；Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）「Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ ３９０，４０４−７；及びＶｏｌｐｅｒｔ，Ｏ．Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）「Ａ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｖｉａ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９５，６３４３−６３４８を参照）。
【０００４】
血管新生の阻害へのαｖβ３インテグリンアンタゴニストの使用が固形腫瘍への血液供給を減少させることによる固形腫瘍の成長を阻害する方法において公知である。例えば、αｖβ３受容体に結合して血管新生を阻害する合成ポリペプチド、モノクローナル抗体及びαｖβ３の模倣体のようなαｖβ３アンタゴニストの使用を記載する米国特許第５，７５３，２３０号（Ｂｒｏｏｋｓ ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ）及び米国特許第５，７６６，５９１号（Ｂｒｏｏｋｓ ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ）を参照のこと。
【０００５】
加えて、確立された腫瘍、例えば、カルチノーマの転移の免疫応答介在阻害を促進する抗体−サイトカイン融合タンパク質治療が記述されている。例えば、サイトカイン・インターロイキン２（ＩＬ−２）が、それぞれ抗体ＫＳ１／４及びｃｈ１４．１８を用いることにより、２つの別々の融合タンパク質の状態でそれぞれ腫瘍関連抗原上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原）又はジシアロガングリオシドＧＤ２と免疫反応するモノクローナル抗体重鎖に融合され、それぞれ融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２及びＫＳ１／４−ＩＬ−２が形成されている。例えば、米国特許第５，６５０，１５０号（Ｇｉｌｌｉｅｓ）を参照のこと。
【０００６】
腫瘍コンパートメントを特異的に標的とする治療と相乗作用する血管新生の脈管構造特異的阻害剤を同定することにより有効なガン治療が最適に仕立てられるであろう。
【０００７】
血管新生は、細胞外マトリックス成分との細胞相互作用に依存する複数のプロセスである内皮細胞の浸潤、移動及び増殖を特徴とする。この脈絡において、インテグリンαｖβ３の内皮接着受容体が、抗血管新生治療戦略の脈管構造特異的標的を提供することによりキープレーヤーであることが示された。（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ． ＆ Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．（１９９４）「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，５６９−５７１；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）「Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｌｐｈａ ｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，１５００−１５０２）。血管新生における血管インテグリンαｖβ３の必要性が、移植されたヒト腫瘍による新規血管の生成がインテグリンαｖβ３のペプチドアンタゴニスト又は抗αｖβ３抗体ＬＭ６０９の全身投与のいずれかによって完全に阻害されている幾つかのイン・ビボモデルによって示された。（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ 前出；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）「Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ」，Ｃｅｌｌ ７９，１１５７−１１６４）。ネズミ・ハイブリドーマＬＭ６０９は、１９８７年９月１５日にブダペスト条約の下での国際寄託局としてのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）に寄託されており、ＡＴＣＣ名ＨＢ９５３７が割り当てられている。このようなアンタゴニストは、増殖性血管新生性血管細胞のアポトーシスを促進するインテグリンαｖβ３のライゲーションを遮断し、それにより腫瘍の増殖に必須である新たに形成される血管の成熟を中断させる。
【０００８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激し得る選択的血管新生性増殖因子として同定されている。ヒト腫瘍の生検では悪性細胞によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの強化された発現及び隣接内皮細胞におけるＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡが示される。ＶＥＧＦの発現は壊死の無血管性領域に隣接する腫瘍の領域において最大であるように思われる。（再検討のためには、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）「Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ， ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ａｇｅｎｔ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１（２）：６０３−６０６を参照のこと）。有効な抗腫瘍治療は、モノクローナル抗体を用いる血管新生の阻害にＶＥＧＦ受容体のターゲッティングを利用することができる（Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２（Ｆｌｋ１／ＫＤＲ） ａｓ ａｎ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １７（２）；１５５−６１）。
【０００９】
汎発性悪性腫瘍の有効治療の主な障害には、治療薬を送達するための十分に確立された血管供給を欠く微小転移を特徴とする最少残留疾患が含まれる。これに関しては、新規免疫治療策が、サイトカインを腫瘍微小環境に指向させるのに腫瘍コンパートメント特異的モノクローナル抗体を用いる上で効率的であることが立証された。これは、モノクローナル抗体の独自腫瘍特異的ターゲッティング能力及びサイトカインの免疫調節機能を維持するように生成された組換え抗体−サイトカイン融合タンパク質によって達成された。腫瘍コンパートメント内にＩＬ−２を指向させるのに抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いることで、３つの異なる同系マウス腫瘍モデルにおいて、腫瘍微小環境に浸潤する効果細胞の活性化が誘発され、確立された微小転移の効率的な根絶が生じた。（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９６）「Ｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８３，２３６１−２３６６；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）「Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，４９４８−４９５５；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）「Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｔｏ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｌｏｏｄ ９１，１７０６−１７１５）。腫瘍転移の早期段階では完全に有効であるものの、この腫瘍コンパートメント指向アプローチは、十分に発達した血管コンパートメントを特徴とする腫瘍成長の後期段階では転移の成長を遅延させることのみが可能であった。ここで、我々は、連続及び同時組み合わせにおいて用いるときに相乗的である特異的血管及び腫瘍コンパートメント指向治療の相補的利点が存在するのかどうかという問題に取り組んだ。
【００１０】
これは大腸カルチノーマ、メラノーマ及び神経芽細胞種の３種類のネズミ腫瘍モデルにおいて試験し、後者は突発性肝転移を特徴とするものであった。３種類全てのモデルはヒトにおける疾患と密接な類似性を示す。メラノーマ及び神経芽細胞種モデルは、神経外胚葉性悪性腫瘍のようなものにおいて十分確立されている腫瘍関連抗原であるジシアロガングリオシドＧＤ２を発現し（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｍａｔｓｕｋｉ，Ｔ．＆ Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．（１９８９）「Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＭ２ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」，Ｌａｎｃｅｔ １，７８６−７８７；Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）「Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｈ１４．１８ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」，Ｅｕｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３１Ａ，２６１−２６７）、大腸カルチノーマモデルは、ヒトにおける受動免疫療法にうまく利用されている標的分子である上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原）の発現を特徴とする。（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）「Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｒｅｓｅｃｔｅｄ Ｄｕｋｅ’ｓ Ｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ｌａｎｃｅｔ ３４３，１１７７−１１８３）。これらの抗原は、ヒト／マウスキメラ抗ＧＤ２抗体（ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２）（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８９２，１４２８−１４３２）、及びヒト化抗Ｅｐ−ＣＡＭ（抗ＫＳＡ、抗ＫＳ１／４抗原）抗体ＫＳ１／４−ＩＬ−２（Ｘｉａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９７）前出；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ，（１９９８）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＩＬ−１２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔｒａｔｅ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０，６１９５−６２０３）との抗体−インターロイキン−２融合タンパク質が標的とするこれらのモデルの腫瘍コンパートメントを特異的に描き出す。これらの腫瘍モデルの血管コンパートメントは、幾つかの動物モデルにおいて記載されるように、新たに形成された血管上でのインテグリンαｖβ３の発現によって定義される（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）前出）。ここに提示されるデータは、原発腫瘍及び遠隔転移の腫瘍及び血管コンパートメントを特異的に標的とする同時及び連続治療の相乗的効力を示す。この相乗作用の機構は、この組み合わせ治療で治療した動物のみにおける血管新生の減少及び炎症の増加によって提供される。これらの観察は、抗血管新生剤と腫瘍特異的抗腫瘍免疫治療アプローチとの組み合わせの有益な効果を強調する。
【００１１】
（発明の要約）
本発明は、腫瘍細胞の治療をそのような治療を必要とする患者において行うための方法であって、該患者に腫瘍細胞増殖阻害量の血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤を投与することを含む方法に向けられている。腫瘍細胞の増殖の阻害には、既存の腫瘍もしくは腫瘍転移の腫瘍細胞の増殖の阻害、さらなる腫瘍転移の形成の阻害、及び腫瘍細胞の死さえも包含され得る。血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤は実質的に同時に投与できることはもちろん、連続して投与することもできる。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、患者における腫瘍又は腫瘍転移を治療するための方法であって、少なくとも１種類の血管新生阻害剤及び少なくとも１種類の抗腫瘍免疫治療剤の組み合わせを患者に投与することによる方法を記述する。該患者における腫瘍細胞の増殖の有効な阻害はこのようにして達成することができる。
【００１３】
患者には、腫瘍の全て又は一部を除去するため、前記治療用組成物を外科的処置の前、その最中又はその後に投与することができる。投与は直接浸漬により；全身性もしくは局所化静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内、又は腫瘍塊への直接注射により；及び／又は適切な処方の経口投与により達成することができる。
【００１４】
本発明の方法において用いるのに適切な血管新生阻害剤は、新規血管の形成（血管新生）又は既存の毛細血管網の腫瘍細胞近傍の細胞への拡大を阻害することができるものである。適切な血管新生阻害剤は血管新生阻害活性を有するペプチド、例えば、腫瘍関連抗原ＰＳＡであり得る。他の適切な血管新生阻害剤はＶＥＧＦ関連血管新生のアンタゴニスト、例えば、細胞表面上のＶＥＧＦ受容体のアンタゴニストであり得る。好ましい血管新生阻害剤は細胞に結合するαｖβ３インテグリンのアンタゴニストである。本発明の方法において用いるためのαｖβ３アンタゴニストは、標的組織又は細胞に投与したときに腫瘍又は腫瘍転移関連組織における血管新生を阻害できるものである。このようなアンタゴニストは、αｖβ３に結合し、かつ血管新生を阻害する、αｖβ３の独自の直線もしくはシクロ−ポリペプチド、直線もしくはシクロ−ＲＧＤ含有ポリペプチド、抗体、又は模倣体であり得る。
【００１５】
αｖβ３アンタゴニストが抗体である場合、そのようなものが、αｖβ３もしくはαｖβ３受容体に対する抗原結合特異性を有するポリクローナル、モノクローナル、又はそれらの抗原結合断片であり得ることが意図されている。αｖβ３インテグリンに結合する好ましいモノクローナル抗体はＬＭ６０９として識別されるモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ９５３７）である。
【００１６】
好ましい血管新生阻害剤は、標的細胞上のインテグリン受容体を阻害し得るαｖβ３受容体アンタゴニストであるポリペプチドである。αｖβ３アンタゴニストの最も好ましい実施形態は合成ＲＧＤ含有ペプチド・シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ）（配列番号１１）等である。この一般型の環状ペプチドは米国特許第５，２６２，５２０号（Ｐｌｏｗら）に記載されている。非ＲＧＤ含有ペプチドは米国特許第５，７８０，４２６号（Ｐａｌｌａｄｉｎｏら）に記載されている。
【００１７】
本発明の方法において用いるのに適する抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍関連抗原ターゲッティング成分に結合した細胞エフェクター成分を含む免疫治療剤である。適切な細胞エフェクター成分には細胞毒性化学物質、細胞毒性放射性同位体、及び細胞情報伝達剤、例えば、サイトカインが含まれ得る。
【００１８】
適切な腫瘍ターゲッティング成分は、腫瘍細胞の周囲組織マトリックス上又はその内部に存在する腫瘍関連抗原に結合するポリペプチド鎖、例えば、受容体タンパク鎖又は免疫グロブリン鎖である。
【００１９】
免疫治療剤の標的に用いることができる腫瘍関連抗原には、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＥＧＦ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、Ｅｐ−ＣＡＭ（ＫＳＡ）、ＩＬ−２受容体、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ（ＣＤ１５）、メラノーマ関連プロテオグリカンＭＣＳＰ、ＰＳＡ及びトランスフェリン受容体からなる群より選択される腫瘍関連抗原が含まれる。
【００２０】
好ましい免疫治療剤はサイトカインポリペプチドであるエフェクター成分を有し、このサイトカインポリペプチドは免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖であるターゲッティング成分に結合している。Ｉｇポリペプチド鎖は腫瘍関連抗原に結合する可変領域を含む。前記免疫グロブリン鎖は、適切な相補鎖と組み合わせられたとき（すなわち、重鎖は軽鎖を補完する）、腫瘍関連抗原に特異的である抗体活性部位を定義することが好ましい。
【００２１】
免疫治療剤の腫瘍ターゲッティングＩｇ部分は全免疫グロブリン鎖アミノ酸配列を含んでいてもよく、又は少なくともその断片がそのタンパク質の抗原結合特異性部分を含む。したがって、適切なＩｇポリペプチド鎖は、少なくとも、腫瘍関連抗原に特異的なＩｇ可変領域を有する。
【００２２】
本発明の方法において用いるのに適する、それらに由来する抗体及びポリペプチド鎖は、いかなる哺乳動物起源のものでもあり得るアミノ酸配列を有する。そのような抗体タンパク質が予想される患者と同じ起源のものではない場合、その抗体タンパク質の断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ又は加工済みＦｖ一本鎖抗体タンパク質を用いることができる。抗体タンパク質の抗原性をさらに低下させるため、抗体アミノ酸配列の改変を果たし、患者の正常抗体成分により類似するものと考えられるタンパク質を作製することによってそれを低下させることができる。例えば、ヒト患者に投与するため、抗体をヒト化するための様々なプロセスにより、モノクローナルネズミ抗体アミノ酸配列をよりヒトらしく見えるように改変することができる。
【００２３】
その代わりに、抗体は、ヒト起源のもの（ヒトＩｇ遺伝子によって遺伝的にコードされる）ではあるが、自身の本来のＩｇ遺伝子の代わりにヒトＩｇ遺伝子を発現するように形質転換されたトランスジェニック動物において産生されるものであってもよい。例えば、ヒトＩｇタンパク質をコードするヒト起源ＤＮＡを発現するトランスジェニックマウスを構築することができる。そのようなトランスジェニックマウスからのモノクローナル抗体の産生はネズミＢ細胞ハイブリドーマを生じ、これはヒト起源のアミノ酸配列を有する抗体をコードするヒトＤＮＡを発現する。これは、ヒト患者の治療において用いるための抗体の免疫原性を大きく低下させる。
【００２４】
ヒト患者を治療するのに、請求される発明の方法において用いるための好ましい抗体は、ヒト化抗ＧＤ２腫瘍関連抗原モノクローナル抗体ｃｈ１４．１８及び抗ＫＳ１／４腫瘍関連抗原（別名Ｅｐ−ＣＡＭ及びＫＳＡ）モノクローナル抗体ＫＳ１／４である。
【００２５】
本発明を具現する方法、組成物及びキットにおいて用いるのに適する免疫治療剤の細胞エフェクター成分は、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、Ｅｐｏ、ＦＧＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ガンマ−ＩＰ−１０、ＩＦＮアルファ、ＩＦＭベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ、ＬＴ、ＭＣＰ−１〜ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＳＭ、ＰＢＰ、ＰＢＳＦ、ＰＧＦＤ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ、ＴＧＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＮＦアルファ、Ｔｐｏ及びＶＥＧＦからなる群より選択されるサイトカインである。ケモカインである適切なサイトカインは、Ｃ１０、ＥＭＦ−１、ＥＮＡ−７８、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、ＧＣＰ−２、ＨＣＣ−１、Ｉ−３０９、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、リンホタクチン（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＧＳＡ、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＮＡＰ−２、ＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ−１及びＳＤＦ−１からなる群より選択することができる。前記免疫治療剤のサイトカイン部分は全サイトカインタンパク質アミノ酸配列であっても、サイトカイン特異的生物学的応答を誘発するのに十分なそのような融合タンパク質の断片であってもよい。
【００２６】
好ましい実施形態において、免疫治療剤のサイトカイン部分はＩＬ−２の生物学的活性を有する。
【００２７】
Ｉｇポリペプチドに結合するサイトカインポリペプチドを含む免疫治療剤において、サイトカインポリペプチド鎖とＩｇポリペプチド鎖との間の適切な結合には直接ポリペプチド結合、２つの鎖の間にポリペプチドリンカーを有する結合、又はビオチニル化及びアビジン−ビオチン複合体の使用を含む他の鎖間化学的結合が含まれる。好ましい結合は直接又はポリペプチドリンカーで間隔を空けたポリペプチド結合である。この直接結合は、融合タンパク質免疫治療剤をコードする適切な発現ベクターで形質転換された宿主細胞からの単一融合タンパク質としての免疫治療剤の発現を可能にする。
【００２８】
したがって、本発明の方法において用いるのに好ましい免疫治療剤はサイトカイン成分及び腫瘍関連抗原ターゲッティング成分を有する二官能性融合タンパク質であり、このターゲッティング成分は腫瘍関連抗原に対する特異性を有するＩｇポリペプチドである。このような好ましい免疫治療剤の例にはＧＤ２を標的とする融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＩＬ２、及びＫＳ１／４腫瘍関連抗原（別名Ｅｐ−ＣＡＭ及びＫＳＡ）を標的とする融合タンパク質ＫＳ１／４−ＩＬ２が含まれる。
【００２９】
その代わりに、本発明の方法、組成物及びキットにおいて用いるのに適する他の免疫治療剤は細胞毒性剤である細胞エフェクター成分を有することができる。適切な細胞毒性剤は腫瘍細胞に対する直接細胞毒性効果を有するもの、すなわち、免疫毒素、放射性同位体、細胞毒性薬等である。上記サイトカイン免疫治療剤と同様に、細胞毒性ペプチドを腫瘍関連抗原ターゲッティングＩｇポリペプチドに直接、又はリンカーペプチドもしくは鎖によって間隔を空けて結合させ、融合タンパク質を形成することができる。化学的細胞毒素をターゲッティングＩｇ鎖に化学的に結合させることができる。抗体鎖を担持する放射性同位体を構築することもできる。
【００３０】
本発明の他の側面は、血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤を含む治療用組成物を包含する。抗腫瘍免疫治療剤は、細胞エフェクター成分に結合する腫瘍関連抗原特異的成分を有することによって腫瘍又は腫瘍転移細胞を標的とすることが好ましい。本発明の好ましい治療用組成物において、抗腫瘍免疫治療剤は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖である腫瘍ターゲッティング成分に結合するサイトカインポリペプチドであるエフェクター成分を有する二官能性タンパク質であり、ここで、Ｉｇ鎖は腫瘍関連抗原に結合する可変領域を有する。
【００３１】
本発明のさらに別の側面は腫瘍又は腫瘍転移を治療するためのキットである。このキットは、血管新生阻害剤、例えば、前記腫瘍又は前記腫瘍転移において血管新生を阻害することが可能なαｖβ３アンタゴニストを収容するパッケージ；サイトカイン活性及び腫瘍抗原特異性を有する二官能性タンパク質成分；及び腫瘍及び腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するための使用説明書を含む。このキットは、腫瘍又は腫瘍転移の治療へのキット成分の使用を指示する明確な標識を含んでいてもよい。
【００３２】
（図面の簡単な説明）
本発明の好ましい実施形態を以下の添付の図面を参照して以下に記載する。これらの図面において：
図１は、原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示す。図１Ａは、ＮＸＳ２神経芽細胞腫を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｂは、ＣＴ２６−ＫＳＡ大腸カルチノーマを皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｃは、Ｂ７８−Ｄ１４メラノーマ細胞を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【００３３】
図２は、血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍治療の効果を図式的に示す。図２Ａは、インテグリンαｖアンタゴニスト、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質のいずれか、及びそれらの組み合わせを用いる血管及び腫瘍コンパートメント治療に続く、原発腫瘍の血管密度についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。図２Ｂは、それぞれ、血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の白血球浸潤についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【００３４】
図３は、突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の連続組み合わせの効果を図式的に示す。突発性肝転移の数は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【００３５】
図４は、突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の実質的に同時の組み合わせの効果を図式的に示す。原発腫瘍の除去の前（図４Ａ）又はその後（図４Ｂ）に開始された、インテグリン又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）を用いる治療からの結果が示される。突発性肝転移は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
原発腫瘍及び遠隔転移の抑制及び根絶はガンの代替治療策、例えば、血管新生の阻害及び標的設定免疫治療の主な目的である。
【００３７】
（１）（抗血管新生性）血管新生阻害治療及び（２）抗腫瘍免疫治療としてここで言及される２つの治療様式の組み合わせ使用により、腫瘍及び腫瘍転移内の腫瘍細胞の治療で有効性に予期せざる相乗効果が存在することが今や見出されている。特には、組み合わせαｖアンタゴニスト治療及び抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質治療が記載される。
【００３８】
血管及び腫瘍コンパートメントに向けられた２つの独自の単一治療；それぞれ、腫瘍血管特異的抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び腫瘍特異的抗体−インターロイキン−２融合タンパク質、の間に相乗作用が生じることが見出された。
【００３９】
これらの単一治療の同時及び連続組み合わせは、神経芽細胞腫の免疫原性に劣る相乗作用モデルにおける突発性肝転移を根絶した。これは、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト又は抗体−ＩＬ−２融合タンパク質のいずれかを用いる単一治療を施した対照と対照的であり、これらの対照は適用した用量レベルで部分的に有効であるだけであった。
【００４０】
さらに、インテグリンαｖアンタゴニスト及び腫瘍特異的抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる同時治療は、３種類の相乗作用ネズミ腫瘍モデル、すなわち、メラノーマ、大腸カルチノーマ及び神経芽細胞腫において劇的な原発腫瘍の退行を生じた。しかしながら、単一治療単独として用いた各々の薬剤は腫瘍成長の遅延のみを誘発した。
【００４１】
抗腫瘍応答には腫瘍微小環境における腫瘍血管密度の同時５０％減少及び炎症細胞の５倍の増加が伴った。その後、組み合わせ治療を施した動物においてのみ腫瘍の壊死が示されたが、各々の薬剤を単一治療として適用した場合には示されなかった。これらの結果は、これらの相乗作用治療様式が転移性癌の将来の治療に新規かつ有効なツールを提供することを示す。
【００４２】
本発明は、ここに記載される相乗作用治療の実施に有用な腫瘍及び腫瘍転移の治療方法、治療用組成物及び治療用キット（パッケージ化システム）を記載する。
【００４３】
１．治療用組成物
本発明の方法を実施する上で有用である様々な治療用組成物が記述される。これらの組成物は、（抗血管新生性）血管新生阻害剤、例えば、αｖβ３アンタゴニスト及び抗腫瘍剤、例えば、腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質を単独で、又は様々な組み合わせで含む。
【００４４】
Ａ．血管新生阻害剤
それらで治療した組織において血管新生を阻害する血管新生阻害剤を本発明の組成物及び方法において用いることができる。好ましい血管新生阻害剤はαｖアンタゴニスト、特にはαｖβ３アンタゴニストである。血管新生阻害（抗血管新生）αｖβ３アンタゴニストは、ペプチド、ＲＧＤ含有ペプチド、抗αｖβ３抗体、抗αｖβ３受容体抗体、又はαｖβ３模倣体であり得る。αｖβ３アンタゴニストの例は米国特許第５，７５３，２３０号（Ｂｒｏｏｋｓ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ）及び米国特許第５，７６６，５９１号（Ｂｒｏｏｋｓ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ）の教示に記載されており、これらのαｖβ３アンタゴニストの調製及び使用に関連する開示は参照することによりここに明確に組み込まれる。
【００４５】
好ましいアンタゴニストはＲＧＤ含有ペプチド、例えば、環状ペプチド・シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ）（配列番号１１）である。αｖβ３アンタゴニストとして機能する有機模倣体、及び非ＲＧＤ含有環状ペプチドを含むさらなるアンタゴニストが文献に記載されている。例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、国際公開ＷＯ９７／４５１３７（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９１５８）を参照のこと。
【００４６】
アンタゴニストとしての使用に適するαｖβ３アンタゴニストを同定するためのアッセイは参照される米国特許に記載されており、したがって、本発明を実施するための代替アンタゴニストは容易に同定できるものと考えられる。
【００４７】
適切な抗αｖβ３モノクローナル抗体を改変して、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、及び加工済みＦｖ又は一本鎖抗体（ＳＣＡ）を含むそれらの抗原結合性断片を含むようにすることができる。このような断片を調製するための方法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照のこと）。抗体の使用を記述する本発明の方法にも、全抗体からそれらの抗原結合性断片への適切な改変が組み込まれる。適切なモノクローナル抗体の１つはＬＭ６０９（ＡＴＣＣ ＨＢ９５３７）として識別される。
【００４８】
他のαｖβ３受容体アンタゴニストが血管新生の阻害において有効であることが示されており、本発明の方法における使用に適切である。例えば、化学的受容体アンタゴニスト、例えば、（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［３−（ピリジン−２−イルアミノ）−１−プロピルオキシ）−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸（ＳＢ−２６５１２３として知られる）が様々な哺乳動物モデル系において試験されている（例えば、Ｋｅｅｎａｎ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９８） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ８（２２）：３１７１−６；Ｗａｒｄ ＫＷ ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ２７（１１）：１２３２−４１を参照のこと）。
【００４９】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が選択的血管新生性成長因子として同定されている。したがって、代わりの、もしくはさらなる血管新生阻害剤は血管新生性成長を阻害するのに十分なＶＥＧＦ活性を有する阻害剤であり得る。そのような阻害剤は、競合性阻害剤もしくはＶＥＧＦ結合／不活性化分子、又はＶＥＧＦ受容体アンタゴニストであり得る。例えば、可能性のある阻害剤は、ＶＥＧＦ標的／受容体への結合で競合するＶＥＧＦの非血管新生性化学的模倣体、修飾非血管新生性ＶＥＧＦ誘導体、血管新生活性を阻害するのに十分なＶＥＧＦに特異的に結合する抗体、又は、おそらくは、ＶＥＧＦに結合する他の特異的タンパク質（例えば、単離したＶＥＧＦ受容体タンパク質）、又はＶＥＧＦ受容体に結合してＶＥＧＦとの相互作用を遮断する抗体であり得る。
【００５０】
他の化合物、例えば、単離された腫瘍関連抗原ＰＳＡが血管新生を阻害するその化合物の能力に基づいて同定されている。
【００５１】
Ｂ．抗腫瘍免疫治療剤
このような本発明の方法において用いるための方法及び組成物では、少なくとも１種類の（抗血管新生性）血管新生阻害性治療薬と少なくとも１種類の抗腫瘍免疫治療剤との組み合わせ投与が意図されている。好ましい抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍ターゲッティング成分を細胞エフェクター成分、例えば、サイトカイン、免疫毒素、放射性薬剤等と組み合わせている。腫瘍ターゲッティング成分は、好ましくは、少なくとも、腫瘍関連抗原に対する抗体の抗原結合部分を含む。好ましい実施形態の１つにおいて、エフェクター成分はサイトカインである。
【００５２】
ａ）腫瘍関連抗原
腫瘍関連抗原は、それによって本発明の方法、組成物及びキットにおいて用いるための免疫治療剤が最終的に腫瘍細胞に標的設定する標的である。腫瘍関連抗原は、当該技術分野において、特定の型の癌に相関するものと認識されている。ほとんど全ての場合において腫瘍関連抗原は細胞表面抗原であり、これは癌腫瘍の起源に関連する正常細胞には通常見出せない様式で発現する。他の腫瘍関連抗原は、成熟正常組織に関連して通常は見出せない分泌分子又は細胞外マトリックス関連成分である。
【００５３】
幾つかの腫瘍関連抗原は組織の早期発生段階に発現するタンパク質であり、通常は成熟組織に伴うことはない（時には癌胎児性タンパク質と呼ばれる）。他の腫瘍関連抗原は正常成熟組織が発現するが、癌細胞がより多量に発現する。腫瘍関連抗原は、正常に発現した細胞マーカー又は細胞外成分の成熟形態であってもよい。さらに別の腫瘍関連抗原は、タンパク質、脂質もしくは細胞外成分のグリコシル化の代替もしくは異常形態、又は新規炭水化物部分に関連する。
【００５４】
したがって、腫瘍関連抗原は広範に変化し、少なくとも部分的には、本発明によって治療しようとする腫瘍の型を定義する。腫瘍の型及びそれらによって発現する腫瘍抗原の多様性は多岐にわたり、今や癌の技術分野において十分に研究されている。
【００５５】
癌の多くのさらなるマーカーが研究の最中にあり、ひとたび腫瘍関連抗原であるものと同定されて特徴付けられると、それらも所望の腫瘍又は転移部位に対するターゲッティング免疫治療に適する標的抗原である。
【００５６】
抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原モノクローナルを用いる、遺伝子治療ベクターの癌細胞へのターゲッティングが報告されている。（Ｋｕｒａｎｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８９（１１）：１２１２−９（１９９８））。同様に、抗ガングリオシドＧＭ３抗体又は抗Ｌｅｗｉｓ−Ｘ抗原抗体を用いるリポソームのターゲッティングも報告されている（Ｎａｍ，Ｓ．Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ １１（１）：９−１６（１９９９））。
【００５７】
以下で論じられるように、同定された抗原を、その抗原に特異的に結合する適切な抗体を産生させるようにするための方法が当該技術分野において公知である。この方式で、腫瘍抗原を同定することができ、かつ本発明において有用であるモノクローナル抗体を作製することができる。腫瘍抗原の調製を再検討するには、Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ｅｄｓ．Ｓｅｌｌ ａｎｄ Ｗａｈｒｅｎ，１９８２における教示を参照のこと。抗原及び／又はサイトカイン等の調製に適用可能な、標準的な生化学的及び分子生物学的教示は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ ＮＹ）に見出すことができる。
【００５８】
腫瘍細胞表面抗原は特定のクラスの腫瘍、又は個々の型の腫瘍に特異的であり得る。腫瘍関連抗原に関連し、それらをコードする核酸及び／又はアミノ酸配列の多くは、様々なサービス、すなわち、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ）によってインターネットを介してアクセス可能な公共のコンピュータデータベースから入手可能であり、一般には名称及び受付番号によって識別される（アクセス可能な配列情報の型の幾つかの非限定的な例は、「受付番号参照」というコメントによって参照される）。
【００５９】
好ましい腫瘍関連抗原標的には、ＡＦＰ（受付番号ＮＰ００１１２５を参照）、ＣＡ１２５（受付番号ＮＰ００５８９０を参照）、ＣＥＡ（受付番号ＡＡＡ６２８３５を参照）、ＣＤ１９（受付番号Ｐ１５３９１を参照）、ＣＤ２０（受付番号Ｐ１１８３６を参照）、ＣＤ４４（受付番号Ｐ１６０７０を参照）、ＣＤ４５（受付番号Ｐ０８５７５を参照）、ＥＧＦ受容体（受付番号Ｐ００５３３を参照）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（受付番号ＡＡＡ５８６３７を参照）、Ｅｐ−ＣＡＭ（ＫＳＡ）（受付番号Ｐ１６４２２、ＡＡＡ３６１５１を参照）、ＩＬ−２受容体（受付番号Ｐ１４７８４、ＮＰ０００１９７、Ｐ０１５８９を参照）、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ（ＣＤ１５）、メラノーマ関連プロテオグリカンＭＣＳＰ（受付番号ＮＰ００１８８８を参照）、ＰＳＡ（受付番号Ｐ０７２８８を参照）、ＰＭＳＡ、トランスフェリン受容体（受付番号ＮＰ００３２１８、ＮＰ００３２２５、ＡＡＦ０４５６４を参照）、膵臓カルチノーマ・マーカータンパク質ＧＡ７３３−１（受付番号Ｐ０９７５８を参照）、葉酸受容体（受付番号ＮＰ０００７９３を参照）、Ｌ６（受付番号Ｐ３０４０８を参照）及びＣＯ−０２９（受付番号Ａ３６０５６、Ｐ１９０７５を参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
ターゲッティング免疫治療剤に特に好ましい腫瘍関連抗原標的は、ここに記載されるように、ＧＤ２及びＫＳＡ（Ｅｐ−ＣＡＭ；ＫＳ１／４抗原）である。
【００６１】
腫瘍関連抗原タンパク質は商業的に入手可能であり、又は当該技術分野において公知の標準組換えＤＮＡ及び細胞培養、タンパク質発現技術を用いて産生させることができる。例えば、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）は、販売のため、ジシアロガングリオシドＧＤ２（Ｇ０７７６）、ジシアロガングリオシドＧＤ３（Ｇ５９０４）、モノシアロガングリオシドＧＭ１（Ｇ７６４１）、モノシアロガングリオシドＧＭ２（Ｇ４６５１）、消化管腫瘍抗原Ｃａ１９−９（Ｇ８６６０、Ｇ８５３５）、癌胎児性抗原ＣＥＡ（Ｃ４８３５）、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ三糖（Ｌ５１５２）、及びＬｅｗｉｓ−Ｙ（Ｌ７４０１）を列挙する。
【００６２】
これらの腫瘍関連抗原の多くに特異的である抗体は商業的に入手可能である。（例えば、ＵＳＢ、ＲＤＩ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ）。例えば、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）は多くのモノクローナル抗体、例えば、抗ＡＦＰ（Ａ８４５２）、抗ＣＥＡ（Ｃ２３３１）、抗ＥＧＦ受容体（Ｅ３１３８）、抗ＩＬ−２可溶性受容体、（Ｉ５６５２、Ｉ５７７７、Ｉ５９０２）、抗ＣＤ１９（Ｆ３８９９）、抗ＣＤ２０（Ｃ８０８０）、抗ＣＤ４４（Ｃ７９２３）、及び抗ＣＤ４５（Ｃ７５５６）を販売する。
【００６３】
たとえ商業的に入手可能でないとしても、モノクローナル抗体を作製する公知方法を用いて、腫瘍関連抗原に特異的な抗体を、その抗原を免疫原として産生させることができる。例えば、抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原ネズミ抗体重鎖及び軽鎖可変ドメインが記述されている（受付番号ＡＡＢ２５７９８及びＡＡＢ２５７９９を参照）。同様に、抗アシアロＧＭ１ガングリオシドネズミ抗体重鎖及び軽鎖可変ドメイン（受付番号ＡＡＤ０９１９４及びＡＡＤ０９１９５）。抗ＧＤ２ガングリオシドモノクローナル抗体重鎖及び軽鎖については結晶構造が解析されている（受付番号２５５４８４１、２５５４８４２を参照）。葉酸受容体に結合する抗体が報告されており（結合タンパク質）、卵巣癌のマーカーとして同定されている（受付番号ＮＰ０００７９３を参照）。抗ＣＡ１２５モノクローナル可変領域重鎖及び軽鎖核酸配列も報告されており、カセットベクターへの挿入に用いられている（受付番号ＡＡＢ３３４５４、３３４５５）。
【００６４】
特に好ましい抗体は、ここに記載されるｃｈ１４．１８及びＫＳ１／４抗体である。
【００６５】
ｂ）モノクローナル抗体及びそれらの抗原結合部分等
Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に公開されたモノクローナル抗体の産生方法の出現以来、改良された方法が当該技術分野において公知となっている（例えば、Ｄｅａｎ，Ｃ．Ｊ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，１９９８） ｃｈａｐｔｅｒ ４；及びＡｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ ＮＹ，１９９２） ｃｈａｐｔｅｒ １１を参照）。これは、今や、特定の抗原に結合するモノクローナル抗体を産生させる定型的なやり方である。所望であれば、高親和性結合抗体を選択するためのスクリーニングプロトコルも改善されている。
【００６６】
典型的には、ハイブリドーマを産生させるための宿主はマウス又は他の齧歯類起源である。
【００６７】
ヒト患者に対するネズミモノクローナルでの繰り返し治療の障壁の１つは、その治療に応答して患者が産生するＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）である。この障壁を克服する方法には、マウスタンパク質の抗原性アミノ酸の代わりに抗原性が低いものと思われるヒトタンパク質配列を用いることによるネズミ抗体タンパク質のヒト化が含まれる。他の方法は結合特異性決定アミノ酸残基又は領域のヒトタンパク質フレームワークへのグラフト化を含む。
【００６８】
ファージ発現系において抗体タンパク質を発現する能力は、結合を改善するか、又は免疫原性を減少させるように突然変異誘発を受けている抗体の選択を可能にする（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）を参照のこと。近年、トランスジェニックマウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子の置換により、ヒト核酸配列起源のものである抗体、したがってモノクローナル抗体を産生させるのにネズミ宿主を用いることが可能となっている。
【００６９】
断片化によって抗体のサイズを減少させて抗原性を減少させ、又はより小さな治療用分子を作製することも可能である。例えば、適切な酵素での消化により、又は組換えＤＮＡ法によってより小さいタンパク質を産生させることにより、全抗体タンパク質を縮小することができる。適切な断片は少なくとも全分子の抗原結合部分を含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖ（一本鎖抗体；ＳＣＡ）構築体が含まれ得る。
【００７０】
上述の通り、本発明のヒトの治療方法において用いるための治療薬の全てのモノクローナル抗体ベースの成分が免疫原性及び潜在的なＨＡＭＡを減少させるような改変から恩恵を受け得ることが想像される。
【００７１】
また、特定の腫瘍関連抗原に特異的に結合し得る特異的受容体タンパク質を上述の免疫治療剤のターゲッティング成分として利用することもできる。機能的には、標的腫瘍関連抗原に対する受容体の特異性及び親和性に依存して、特異的受容体は特異的抗体と同様にターゲッティングに有用であり得る。必ずしも腫瘍関連ではない類似タンパク質への交差反応性結合の衝撃を最小にするように注意を払うべきである。
【００７２】
ｃ）サイトカイン
一実施形態において、本発明の抗腫瘍免疫治療構築体は、好ましくはサイトカインである細胞エフェクター部分を組み込む。
【００７３】
本発明の抗腫瘍治療薬のエフェクター成分は様々なサイトカインのいずれをも、そのサイトカインの受容体を担持する細胞によるサイトカイン特異的生物学的応答を誘発するために含むことができる。サイトカインは十分に特徴付けられており、したがって、本発明はそのように限定されるものと解釈されるものではない。サイトカインにはサブクラスとしてケモカインと呼ばれる分子が含まれる。本発明の脈絡において、ケモカインはサイトカイン・スーパーファミリーの一メンバーと考えられる。したがって、サイトカインという用語は、ここで用いられる場合、一般にサイトカイン及びケモカインの両者を指す。サイトカイン技術の説明については、Ｃａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９４を参照のこと。ケモカイン技術の説明については、Ｖａｄｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９７を参照のこと。サイトカインに関連する多くの核酸及び／又はアミノ酸配列は、様々なサービス、すなわち、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター；ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｌｈ．ｇｏｖ）によってインターネットを介してアクセス可能な公共のデータベースから入手可能であり、一般には名称及び受付番号によって識別される（ここで引用される配列情報へのアクセスの幾つかの非限定的な例は、識別番号への参照を伴う「受付番号参照」というコメントによってこれを参照する）。
【００７４】
哺乳動物由来のサイトカインは種特異的であることもあり、突然変異及び／又は対立遺伝子多様性のため種内で変化することもある。治療しようとする哺乳動物の種に従い、使用に適するサイトカインを選択することができる。複数の対立遺伝子が存在する場合、サイトカインの活性に従って選択することができ、又は対立遺伝子変種の混合物を選りすぐりのサイトカインとして用いることができる。したがって、本発明の方法の獣医学的使用を治療しようとする動物の種に対してあつらえることができ、又は、標的の種に由来するものが利用可能ではない場合、より密接に関連する種に由来するサイトカインの選択が選択される。ヒトの治療には、既知であるならばヒト相同体を用いることが好ましい。
【００７５】
本発明において用いるの適するサイトカインには、ＢＤＮＦ（受付番号４５０２３９３参照）、ＣＮＴＦ（受付番号４７５８０２０参照）、ＥＧＦ（受付番号ｐ０１１３３参照）、Ｅｐｏ（受付番号４５０３５８９参照）、ＦＧＦ（受付番号ＣＡＢ６１６９０参照）、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ（受付番号ＣＡＡ２７２９０参照）、ＧＭ−ＣＳＦ（受付番号４５０３０７７参照）、Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ガンマ−ＩＰ−１０（受付番号Ｐ０２７７８参照）、ＩＦＮアルファ（受付番号Ｐ０１５６３参照）、ＩＦＮベータ（受付番号Ｐ０１５７４参照）、ＩＦＮガンマ（受付番号Ｐ０１５７９参照）、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８（受付番号Ｐ０１５８３、Ｐ０１５８４、Ｐ０１５８５、Ｐ０８７００、Ｐ０５１１２、Ｐ０５１１３、Ｐ０５２３１、Ｐ１３２３２、Ｐ４１３２４、Ｐ１５２４８、Ｐ２２３０１、Ｐ２０８０９、Ｐ２９４５９、Ｐ４６６５８、Ｐ３５２２５、Ｐ４０２２２、Ｐ４０９３３、Ｑ１４００５、ＮＰ００２１８１、Ｑ１４１１６参照）、ＬＩＦ（受付番号ＡＡＣ０５１７４参照）、ＬＴ（受付番号４５０４０３１参照）、ＭＣＰ−１〜ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ（受付番号４５０３０７５参照）、ＭＩＦ（受付番号４５０５１８５参照）、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＰ−２、ＮＧＦ（受付番号４５０５３９１参照）、ＮＴ−３（受付番号Ｐ２０７８３参照）、ＮＴ−４（受付番号Ｐ３４１３０参照）、ＯＳＭ（受付番号Ｐ１３７２５参照）、ＰＢＰ（受付番号４５０５６２１参照）、ＰＢＳＦ、ＰＧＦＤ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＦ（受付番号Ｐ２１５８３参照）、ＴＧＦアルファ（受付番号Ｐ０１１３５参照）、ＴＧＦベータ（受付番号Ｐ０１１３７参照）、ＴＮＦアルファ（受付番号Ｐ０１３７５参照）、Ｔｐｏ（受付番号Ｐ４０２２５参照）又はＶＥＧＦ（受付番号ＡＡＤ０３７１０参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
本発明において用いるのに適するケモカインには、Ｃ１０（受付番号Ｐ３３８６１参照）、ＥＭＦ−１（受付番号Ｐ０８３１７参照）、ＥＮＡ−７８（受付番号Ａ５５０１０参照）、エオタキシン（受付番号ＢＡＡ８４５７９参照）、ＧＣＰ−２（受付番号Ｐ８０１６２参照）、ＨＣＣ−１（ｇ１００４２６７参照）、Ｉ−３０９（受付番号ｇ４５０６８３３参照）、ＩＬ−８（受付番号ＡＡＡ５９１５８参照）、ＩＰ−９（受付番号ＣＡＡ７５５１０参照）、ＩＰ−１０（受付番号４５０４７０１参照）、リンホタクチン（受付番号４５０６８５３参照）、ＭＣＰ−１（受付番号４５０６８４１参照）、ＭＣＰ−２（受付番号Ｐ８００７５参照）、ＭＣＰ−３（受付番号ＣＡＢ５９７２３．１参照）、ＭＣＰ−４（受付番号Ｑ９９６１６参照）、ＭＧＳＡ（受付番号Ｐ０９３４１参照）、ＭＩＧ（受付番号Ｐ３５６２５参照）、ＭＩＰ−１アルファ（受付番号Ｐ１０８５５参照）、ＭＩＰ−１ベータ（受付番号Ｐ１３２３６参照）、ＭＩＰ−２、ＮＡＰ−２（受付番号Ｐ２０７７５参照）、ＰＦ４（受付番号４５０５７３３参照）、ＲＡＮＴＥＳ（受付番号４５０６８４７参照）、ＳＣＭ−１（受付番号Ｐ４７９９２参照）又はＳＤＦ−１（受付番号Ｐ４８０６１参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明において用いるのに好ましいサイトカインにはＩＬ−２及びＩＬ−１２、又は少なくとも無傷の分子全体のエフェクター活性の一部を保持する、それらの生物学的に活性な断片が含まれる。
【００７７】
本発明において用いるのに好ましいサイトカインはＩＬ−２である。
【００７８】
本発明の方法において用いるのに適するサイトカインは、適切な核酸配列から、標準分子生物学技術を用いて調製することができる。遺伝子を発現させるための方法は当該技術分野において公知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８５：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ ＮＹ，１９９１）を参照のこと）。また、サイトカインは商業的源から入手することもできる（すなわち、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）。
【００７９】
ｄ）抗腫瘍／サイトカイン免疫治療剤
本発明の実施に適するこれらの抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍ターゲッティング成分に連結する、好ましくはサイトカインである細胞エフェクター成分を組み込む。腫瘍結合成分とエフェクター成分との連結は様々な方法によって達成することができる。
【００８０】
１）抗体融合タンパク質
腫瘍抗原を担持する細胞又は組織をサイトカイン機能の標的とし、かつサイトカインを用いることにより、腫瘍抗原を担持し、もしくはそれに関連する細胞に対する免疫応答を補強する免疫治療用抗癌試薬が記述されている。これらの免疫治療剤は抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質と呼ばれ、これは、この融合タンパク質が、サイトカインと予め選択された腫瘍関連抗原と免疫反応する組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチドとの融合を含むためである。
【００８１】
ここで用いられる場合、免疫治療用抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質剤は、抗原結合部分を少なくとも含む抗体タンパク質断片とサイトカインの生物学的シグナル伝達機能を保持するのに十分なサイトカインのエフェクター部分を少なくとも含むサイトカインとの融合構築体を包含する。本発明の融合タンパク質は直接であっても、リンカーペプチド（１つもしくは複数）によって架橋されていてもよい。
【００８２】
抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質は当該技術分野において公知であり、特には、例えば、米国特許第５，６５０，１５０号（Ｇｉｌｌｉｅｓ）に記載され、融合タンパク質の調製及び使用に関連するその開示は参照することにより明白にここに組み込まれる。
【００８３】
融合タンパク質は細胞表面抗原である様々な腫瘍抗原のいずれに対するものでもよく、そのようなことから本発明はそのように限定されるものと解釈されるものではない。例えば、モノクローナル抗体から誘導される組換えＩｇ重鎖の調製が公知であるように、サイトカイン及びＩｇ重鎖を用いる融合タンパク質の調製が公知である。加えて、モノクローナル抗体の調製は確立された技術であり、腫瘍抗原に対するそのような抗体の調製方法が公知である。モノクローナル抗体の調製に関する教示には「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｅｄｓ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ，１９８５が含まれる。
【００８４】
典型的には、Ｉｇポリペプチド鎖は、細胞表面腫瘍抗原を担持する細胞に特異的なＮ末端可変領域を含むＩｇ重鎖又は軽鎖ポリペプチドである。融合タンパク質は、典型的には、サイトカインのアミノ末端アミノ酸へのペプチド結合によって結合する、カルボキシ末端であるＩｇポリペプチドを有する。Ｉｇポリペプチドが重鎖である場合、そのＩｇ重鎖は、典型的には、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインをさらに含み、任意にＣＨ３ドメインをさらに含んでいてもよい。しかしながら、所望であれば、そのような定常領域ドメインを除去して、結果として生じる融合タンパク質構築体の免疫原性、サイズ、又は非特異的結合を減少させることができる。重鎖及び軽鎖ドメインの会合を容易にするため、重鎖Ｆｖが軽鎖Ｆｖに結合している連結Ｆｖ分子を構築することが望ましい。この結合は一方の鎖のカルボキシ末端から他方のアミノ末端へのものであり、再折り畳み／ドメイン会合の後に抗原結合ポケットを立体的に大きく変化させることのないようにするのに十分な長さである。
【００８５】
好ましい融合タンパク質はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原ＧＤ２と免疫反応するＩｇ重鎖を含む。別の実施形態において、好ましい融合タンパク質はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原Ｅｐ−ＣＡＭ（別名ＫＳＡ、ＫＳ１／４抗原）と免疫反応するＩｇ重鎖を含む。これらの実施形態の例示的な融合タンパク質は、以下に、それぞれ、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２及びＫＳ１／４−ＩＬ−２として記述されている。
【００８６】
２）抗体結合体
代わりの免疫治療用構築体を本発明の方法及び組成物において用いることができる。例えば、高親和性ビオチン−アビジン系を利用して、ビオチン（又はアビジン）に連結する腫瘍関連抗原特異的抗体鎖、及び適切な結合体（アビジン又はビオチン）に連結するサイトカインを含む独立のビオチニル化タンパク質を、適切な連結を用いて構築することができる。使用時に、ビオチニル化抗体タンパク質をイン・ビトロ又はイン・ビボで、投与の前又は後にサイトカインタンパク質に結合させ、ビオチン−アビジン複合体によって連結する腫瘍抗原結合成分及びエフェクターサイトカイン成分を有する二官能性免疫治療剤を作製することができる。
【００８７】
ビオチニル化抗体及びタンパク質は当該技術分野において公知であり、商業的に入手可能な試薬を用いて調製することができる。ビオチニル化腫瘍抗原ターゲッティング抗体を利用する特徴の１つはビオチン分子が複数のアビジン結合部位を有することであり、これは、各々が抗体に結合するというエフェクター成分、例えば、アビジン連結サイトカインのより大きな相乗作用、又は２つ以上のエフェクター成分の組み合わせ使用を可能にする。他の直接化学的結合方法及び試薬も当該技術分野において公知であり、直接又は介在リンカーを用いての、エフェクター分子への抗体の結合に適用されている。（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｙｏｕ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，１９９８） ｃｈａｐｔｅｒ １７；及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６）を参照）。したがって、本発明の免疫治療剤は、抗原結合部分を少なくとも含む抗体タンパク質断片とサイトカインの生物学的シグナル伝達機能を保持するのに十分なサイトカインのエフェクター部分を少なくとも含むサイトカインとの間に、上述のビオチニル化構築体をも包含する。
【００８８】
ｅ）他の免疫治療剤
本発明を具現する方法、組成物、及びキットにおいて用いるのに適する抗腫瘍免疫治療剤はサイトカインではないエフェクター部分を組み込むことができる。細胞エフェクター成分は毒素又は他の方法で腫瘍に損傷を与える細胞毒性剤でもあり得ることが想像される。したがって、他の有用な抗腫瘍治療薬には、抗原結合部分を少なくとも含む抗体タンパク質断片と放射性同位体、免疫毒素、細胞毒性ペプチド又は細胞毒性剤との構築体が含まれ得る。
【００８９】
１）放射標識抗体
腫瘍ターゲッティングモノクローナル抗体及び放射標識同位体を含む放射免疫結合体が抗癌剤として用いられている。モノクローナル抗体の抗原結合特異性は腫瘍部位に局在化するターゲッティング能力を提供し、これに対して放射標識は細胞毒性を提供する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６） ｃｈａｐｔｅｒ ８を参照）。これらの放射免疫結合体は本発明の方法において抗腫瘍治療薬としての使用に適するものであり得る。
【００９０】
２）免疫毒素−抗体
モノクローナル抗体と様々な源から誘導されるタンパク質毒素との結合体も抗腫瘍治療について試験されている。（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６） ｃｈａｐｔｅｒ ８を参照）。このような結合体は本発明の方法における使用に適するものであり得る。
【００９１】
３）薬物細胞毒素−抗体
モノクローナル抗体と化学的に合成した、及び／又は様々な源から精製した薬物毒素との結合体も抗腫瘍治療に用いることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｙ ＮＹ，１９９６）を参照）。このような結合体は本発明の方法において用いるのに適するものであり得る。
【００９２】
４）多特異的抗体
酵素的消化、又はコードするＤＮＡ配列の操作によって産生される抗体断片の操作は、異なる結合特異性を有する２つの抗体を結合するハイブリッド分子である二特異的抗体（ＢｓＡｂｓ）の作製を可能にする。このようにして、標的腫瘍への特異的結合を細胞エフェクター医薬品（すなわち、サイトカイン、薬物又は毒素）への結合と組み合わせ、腫瘍細胞の治療を局在化することができる（例えば、Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８０：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ，１９９８）ｃｈａｐｔｅｒ １２を参照）。このような二官能性又は他の様式で多官能性の抗体は本発明の方法における使用に適するものであり得る。
【００９３】
２．治療方法
腫瘍及び腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するための本発明の治療方法は、血管新生阻害（抗血管新生）治療及び抗腫瘍免疫治療の組み合わせ使用に基づく。２つ以上の型の血管新生阻害剤を２つ以上の型の抗腫瘍免疫治療剤と組み合わせて用いることができる。この組み合わせ使用は同時に、連続的に、又は治療の間に期間を挟んでなすことができる。特定の治療薬のいずれをも治療の過程で２回以上投与することができる。本発明の方法では血管新生阻害治療薬及び抗腫瘍免疫治療剤の組み合わせ使用が考慮されており、これは、個々の治療薬各々の腫瘍細胞増殖阻害効果の相乗作用を生じることが可能であり、個々の成分を単独で投与することによって見出されるものよりも有効な治療を生じる。したがって、一側面において、本発明の方法は、単独で投与した場合には有効な血管新生又は抗腫瘍細胞活性を生じないであろう量の血管新生阻害剤及び抗腫瘍免疫治療剤を、組み合わせて患者に投与することを包含する。
【００９４】
本発明の方法は、工程の点で、本発明を実施するための様々な様式を含む。例えば、アンタゴニスト及び抗腫瘍免疫治療剤（例えば、好ましい実施形態における抗原／サイトカイン融合タンパク質）を混合後に、すなわち同時に投与することができ、又は連続的に、すなわち別々に投与することができる。さらに、アンタゴニスト及び融合タンパク質を、投与間の約３週間の間隔内で、すなわち、実質的に最初の活性剤の直後から最初の薬剤の投与後約３週間までで、別々に投与することができる。加えて、順序を変更することができる、すなわち、αｖβ３アンタゴニストを融合タンパク質の投与前に投与することができ、又は投与を逆の順番で実施することができることが意図されている。
【００９５】
一実施形態において、本発明の方法は、腫瘍又は転移の治療を必要とする患者に、血管新生阻害量の血管新生阻害剤、例えば、αｖβ３アンタゴニスト、及び生物学的応答を誘発するのに十分な量の抗腫瘍免疫治療剤を投与することも包含する。例えば、サイトカイン及び組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖を有する二官能性融合タンパク質であって、Ｉｇ鎖が腫瘍関連細胞表面抗原を担持する腫瘍細胞に特異的な可変領域を含み、かつＩｇ鎖がペプチド結合によってサイトカインに結合している二官能性融合タンパク質のような場合には、サイトカイン特異的生物学的応答を誘発するのに十分なものである。並びに、免疫治療剤が細胞毒性剤を含む場合、その量は標的腫瘍細胞内に細胞毒性生物学的応答を誘発するようなものである。
【００９６】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍塊の一部又は全てが除去される外科的手順と共に実施することができる。これに関して、この方法は外科的手順に続いて実施することができる。その代わりに、第１の活性剤の投与と第２の活性剤の投与との間隔に外科的手順を実施することもできる。この方法の例は、以下に記載される本発明と外科的腫瘍除去との組み合わせである。
【００９７】
この方法による治療は、典型的には、治療用組成物を１回以上の投与サイクルで投与することを含む。例えば、同時投与が実施される場合、αｖβ３アンタゴニスト及び抗腫瘍免疫治療剤の両者を含む治療用組成物を約２日〜約３週間の期間にわたって１つのサイクルで投与する。その後、この治療サイクルを、開業医の判断に従い、必要に応じて繰り返すことができる。同様に、連続的な適用が意図される場合、個々の治療薬各々の投与時間を、典型的には、同じ期間をカバーするように調整する。サイクル間の間隔は約ゼロから２ヶ月まで変化し得る。
【００９８】
投与は周期的単位投与、連続輸液、蠕動送達、大量瞬時投与等によって達成することができる。経路には静脈内、皮下、筋肉内、同所注射、同所輸液、経口適用等が含まれ得る。
【００９９】
本発明の方法において用いられる治療用組成物は、公知のように、活性剤を薬学的に許容し得る担体中に含み、したがって、本発明は、組成物中の活性剤（１種類もしくは複数種類）の濃度が列挙される活性剤をここに記載される量だけ送達（投与）するのに十分なものである限り、組成物に関して限定されるものと解釈されるものではない。
【０１００】
典型的には、抗腫瘍免疫治療剤、例えば、抗原ターゲッティング／サイトカイン融合タンパク質の投与量は、毎日体重キログラム当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１ｍｇ、より好ましくは約０．６ｍｇである。
【０１０１】
抗腫瘍免疫治療剤、例えば、抗原標的設定細胞毒性剤の投与量は、放射線の照射量が望ましい放射線用量に依存して適切に調整できる場合、毎日体重キログラム当たり、典型的には０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約０．１〜１ｍｇ、より好ましくは約０．６ｍｇであり得る。放射線治療に適することが見出されている同位体には、５７−コバルト；６７−銅；９９ｍ−テクネチウム；１２３−ヨウ素；１３１−ヨウ素；及び１１１−インジウム等である。放射性医薬品及び投与量は放射性同位体及び標的組織に依存して変化する。悪性新生物の免疫放射線治療は、免疫治療剤が腫瘍部位及び／又は細胞を標的とするため、伝統的な放射線治療よりも高い用量を用いることができる。例えば、Ｂ細胞を標的とする放射性免疫治療剤を用いるＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療は、０．４ｍＣｕｉ／体重ｋｇ（１ｍＣｕｉ＝３７Ｍｂｑ）の最大寛容用量を有することが見出された。（Ｗｉｔｚｉｇ，ＴＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）「Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ＣＤ２０（＋） Ｂ−ｃｅｌｌ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ． １７（１２）：３７９３−８０３）。しかしながら、特定の腫瘍又は腫瘍転移に標的設定された放射性免疫治療は、このリンパ腫の治療よりも高い寛容用量を可能にし得る。ヌードマウスにおいて、１８．５Ｍｂｑの１１１−インジウム標識抗体の２用量の投与が寛容であった。（Ｓａｇａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）「Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｎｄｉｕｍ−１１１ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３５（８）：１２８１−５）。
【０１０２】
αｖβ３アンタゴニストの典型的な投与量は、毎日体重キログラム当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約２０〜１００ｍｇ、より好ましくは約５０ｍｇである。
【０１０３】
癌が動物界全体を通して見出され、かつここに記載される原理が、血管新生をαｖβ３アンタゴニスト及び免疫系におけるサイトカインによって阻害することが可能である全ての動物に適用されることは理解される。したがって、本発明は全ての哺乳動物、特にはヒトに対して実施することができる。
【０１０４】
さらに、成長するために血管新生を必要とし、したがって本方法の組み合わせ治療様式の候補である様々な腫瘍が存在することは公知である。血管新生を誘発する成長を生じ得る腫瘍には、神経外胚葉、上皮及び同様の組織から生じる腫瘍が含まれる。例示的な腫瘍及び腫瘍転移には、アデノーマ、血管肉腫、星状細胞腫、上皮カルチノーマ、胚細胞種、グリア芽細胞腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、奇形腫等が含まれる。
【０１０５】
３．治療用システム
一実施形態において、本発明では、本発明の方法を実施するのに必要な試薬を提供するパッケージング及び／又はキットを含むシステムが意図されている。腫瘍又は腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するためのキットは、
ａ）腫瘍又は腫瘍転移内の血管新生を阻害することが可能な血管新生阻害剤、例えば、αｖβ３アンタゴニスト；
ｂ）サイトカイン及び組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド鎖を有し、Ｉｇ鎖が腫瘍関連細胞表面抗原を担持する腫瘍細胞に特異的な可変領域を含み、Ｉｇ鎖がペプチド結合によってサイトカインに結合する抗腫瘍免疫治療剤、例えば、二官能性融合タンパク質試薬；及び
ｃ）方法において腫瘍及び腫瘍転移の治療に該試薬を用いるための使用説明書；
のパッケージを含む。
【０１０６】
本発明のキットにおける試薬は、典型的には、ここに記載される治療用組成物として処方され、したがって、キットに収容して配布するのに適する様々な形態のうちのいずれでもよい。このような形態には、液体、粉末、錠剤、懸濁液及び本発明のアンタゴニスト及び／又は融合タンパク質を提供するための同様の処方が含まれ得る。これらの試薬は、本発明に従って別々に投与するのに適する別々の容器で提供することができ、又は、その代わりに、パッケージ中に単一の容器で組成物の状態に組み合わせて提供することができる。
【０１０７】
同様に、そのようなパッケージは、上記成分の代わりに、又はそれらに加えて、他のあらゆる抗腫瘍免疫治療剤、例えば、上記のものを含んでいてもよい。
【０１０８】
このパッケージは、ここに記載される治療方法に従い、１回以上の投与に十分な量の試薬を含むことができる。典型的には、パッケージは、ここに記載される治療の１サイクルに十分な量を含む。パッケージのラベルにより、本発明の方法による腫瘍及び／又は転移の治療的処置への封入される試薬の組み合わせ又は連続使用を指示することができる。このようなパッケージのラベルは各々の試薬バイアル、及び／又は材料の完全なパッケージに貼付することができる。
【０１０９】
本発明のキットは、パッケージに収容される材料の「使用説明書」も含む。これらの使用説明書は、本発明による腫瘍又は腫瘍転移の治療へのアンタゴニスト及び融合タンパク質の組み合わせ使用の方法に関連する。腫瘍、患者及び疾患状態に依存してこれらの方法が広範に変化し得る限り、使用説明書はそれに従って投与の手順を指定するように変化させることができる。本発明は、本発明の方法によるアンタゴニスト及び融合タンパク質の組み合わせ使用に関する特徴以外に、使用説明書の性質に限定されるものと考えられるものではない。
【０１１０】
同様に、試薬には抗腫瘍免疫治療用細胞毒性剤、例えば、放射標識同位体に結合した腫瘍抗原結合抗体、又は細胞毒性剤、例えば、細胞毒性ペプチドもしくは細胞毒性薬等が含まれ得る。
【０１１１】
４．合成ペプチドの調製
ａ．合成手順
下記表１に列挙される直線及び環状ポリペプチドは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＲＢ，（１９６９）「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３２：２２１−９６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＲＢ，（１９６９）「Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，ＪＡＭＡ ２１０（７）：１２４７−５４；及びＦｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｌ．，（１９９０）「Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５（３）：１６１−２１４によって記載される標準固相合成技術を用いて合成した。
【０１１２】
まず２グラム（ｇ）のＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＭｅ（配列番号１）を６０ミリリットル（ｍｌ）のメタノールに溶解し、これに１．５ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加して混合物を形成した。次に、この混合物を２０度Ｃ（２０℃）で３時間攪拌した。蒸発させた後、残滓を水中にとり、希ＨＣｌでｐＨ３に酸性化して酢酸エチルで抽出した。その抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて再度蒸発させ、生じたＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号２）をジオキサン中の２Ｎ ＨＣｌ ２０ｍｌと共に２０℃で２時間攪拌した。生じた混合物を蒸発させてＨ−Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号３）を得、続いてそれを１８００ｍｌのジクロロメタン及び２００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の混合液に溶解した後、０℃に冷却した。その後、０．５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）、０．３ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び０．２３ｍｌのＮ−メチルモルホリンを攪拌しながら連続的に添加した。
【０１１３】
生じた混合物を０℃でさらに２４時間、次いで２０℃でさらに４８時間攪拌した。この溶液を濃縮し、混合床イオン交換器で処理して塩を除去した。生じる樹脂を濾過によって除去した後、清澄化溶液を蒸発させ、残滓をクロマトグラフィーによって濾過することでシクロ（Ｇｌｙ−ＤＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号４）を回収した。
【０１１４】
一文字コードアミノ酸残基略語を用いて表１に列挙され、ペプチド数の指示によって同定される以下のペプチドを同様に得た：シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号５）；シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号６）；シクロ（Ａｒｇ−ＤＡｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号８）；シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＤＶａｌ）（配列番号７）；及びシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（メチル化はバリン残基のアミド結合のα−アミノ窒素に位置する）（配列番号１１）。
【０１１５】
６６２０３と命名される、ペプチド６２１８４のものと同一の配列を有するペプチドは、６２１８４に存在するＴＦＡ塩ではなく塩ＨＣｌを含むことによってのみ後者と区別される（配列番号５）。同じことがペプチド６９６０１及び６２１８５（配列番号６）並びに８５１８９及び１２１９７４（配列番号１１）に言える。
【０１１６】
ｂ．交互合成手順
ｉ．シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）、ＴＦＡ塩の合成
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＮａ（配列番号１４）は、固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型手順を用いて、ＮＭｅＶａｌ、ＤＰｈｅ、Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）、Ｇｌｙ及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）を段階的様式で４−ヒドロキシメチル−フェノキシメチル−ポリスチレン樹脂（Ｗａｎｇ型樹脂）に連続的に添加することによって合成する（ペプチド合成の通例のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型の方法を適用する）。ポリスチレン樹脂及びアミノ酸残基前駆体はＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ又はＦｌｕｋａ ｃｈｅｍｉｃａｌ社から商業的に入手可能である。アミノ酸残基の連続添加が完了した後、ＴＦＡ／ジクロロメタンの１：１混合液を用いて樹脂をペプチド鎖から除去することでＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨ生成物（配列番号１５）を得る。次に、ピペリジン／ＤＭＦの１：１混合液でＦｍｏｃ基を除去することで粗製Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨ前駆体（配列番号１６）を得、次にそれをＨＰＬＣによって通例の様式で精製する。
【０１１７】
環化のため、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍｌ中に０．６ｇのＡｒｇ（Ｍｔｒ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨ（上で合成）（配列番号１６）の溶液を８５ｍｌのジクロロメタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈し、５０ｍｇのＮａＨＣＯ３を添加する。ドライアイス／アセトン混合物中で冷却した後、４０μｌのジフェニルホスホリルアジド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。室温で１６時間整地した後、溶液を濃縮する。その濃縮物をゲル濾過し（イソプロパノール／水 ８：２中のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム）、次にＨＰＬＣによって通例の様式で精製する。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｈ２Ｏ（９８：２）で処理することによりシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（ここでは「シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ）」とも呼ばれる；配列番号１１）×ＴＦＡを得、次にこれをＨＰＬＣによって通例の様式で精製する；ＲＴ＝１９．５；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：５８９。
【０１１８】
ｉｉ．「内部塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ）」の合成
シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＴＦＡを水中に懸濁させた後、真空下で蒸発させてＴＦＡを除去することにより、上で生成した環状ペプチドからＴＦＡ塩を除去する。形成された環状ペプチドを「内部塩」と呼び、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）と命名する。この環状ペプチドは内部電子的に互いに相殺する２つの反対に帯電する残基を含んで全体として無荷電の分子を形成するため、「内部塩」という用語を用いる。これらの荷電残基のうちの一方は酸性部分を含み、他方の荷電残基はアミノ部分を含む。この酸性部分及びアミノ部分が互いに近接する場合、酸性部分をアミノ部分によって脱プロトン化することができ、これにより全体として中性電荷を有するカルボン酸／アンモニア塩が形成される。
【０１１９】
ｉｉｉ．シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＨＣｌを得るためのＨＣｌ処理
８０ｍｇのシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）を０．０１Ｍ ＨＣｌに５〜６回溶解し、各々の溶解操作の後に凍結乾燥する。引き続くＨＰＬＣによる精製でシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＨＣｌを得る；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：５８９。
【０１２０】
ｉｖ．シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＭｅＳＯ３Ｈを得るためのメタンスルホン酸処理
８０ｍｇのシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）を０．０１Ｍ ＭｅＳＯ２Ｈ（メタンスルホン酸）に５〜６回溶解し、各々の溶解操作の後に凍結乾燥する。引き続くＨＰＬＣによる精製でシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）×ＭｅＳＯ３Ｈを得る；ＲＴ＝１７．８；ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：５８９。
【０１２１】
環化の代替方法はスルフヒドリル部分を有する非環式ペプチド前駆体の側基鎖の誘導体化を含み、正常生理学的ｐＨ条件（ｐＨ７．５）よりも僅かに高いものに露出される場合、分子内に存在する他のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を分子内で形成して環状ペプチドを形成する。加えて、チオエステル環化ペプチドを精製するため、非環式ペプチド前駆体のＣ末端カルボン酸部分をその分子内に存在する遊離スルフヒドリル部分と反応させることができる。
【０１２２】
【表１】
５．腫瘍特異的抗体−サイトカイン融合体の生成及び特徴付け
ａ．タンパク質及び脈管構造特異的インテグリンαｖアンタゴニスト：
ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２及びｈｕＫＳ１／４−ＩＬ−２抗体−サイトカイン融合タンパク質の構築及び特徴付けはこれまでに記述されている（Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９７）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．ら（１９９２）前出）。両構築体の抗原結合特性はそれらのそれぞれの抗体のものと同一であり、特異的ＥＬ−２活性は商業的に入手可能なｒｈＩＬ−２と等しかった。インテグリンαｖβ３アンタゴニスト環状ペプチド１２１９７４（シクロ（ＲＧＤｆＮ−ＭｅＶ））（配列番号１１）及び対照ペプチド１３５９８１（シクロ（ＲＡＤｆＮ−ＭｅＶ）（配列番号１３）を合成し、特徴付けした。
【０１２４】
６．細胞系及び動物モデル
全ての細胞系及びそれぞれの動物モデルは実質的に従来記述される通りに確立した（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９６）；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９６）；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９８）前出）。ＮＸＳ２及びＣＴ２６−ＫＳＡ細胞上にインテグリンαｖβ３細胞が存在しないことは抗マウスＣＤ６１（インテグリンβ３鎖）抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて示した。両細胞系は、陽性対照として用いられるインテグリンαｖβ３陽性Ｂ１６ＦＧ３及びＢ７８−Ｄ１４ネズミメラノーマ細胞とは対照的に、ＦＡＣＳ分析においてシグナルがないことが明らかになった（１μｇ抗マウスＣＤ６１ｍＡｂ／１０６細胞）。さらに、ＮＸＳ２細胞は、陽性対照として用いられる抗ＧＤ２抗体ｃｈ１４．１８（１０μｇ／ｍｌ、４℃、２４ｈ）とは対照的に、抗マウスＣＤ６１ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、４℃、２４ｈ）でコートしたプラスチックに付着することができなかった。しかしながら、全ての腫瘍細胞はＦＡＣＳによってαｖインテグリンを発現し、かつビトロネクチンに付着し、インテグリンαｖβ５の存在が示される。
【０１２５】
全ての外科的手順について、マウスはケタミン注射（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）及び同時メトファン吸入（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＬ）によって麻酔した。インテグリンαｖアンタゴニスト及び対照ペプチドを投与するための浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）、モデル２００１、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）は１７．５μｇ／ｈの送達速度で用いた。これらのポンプは製造者のガイドラインに従って取り扱い、無菌条件下で背部皮下組織に移植した。全てのポンプは移植後第７日に取り替え、抗血管処理の第１０日に除去した。全ての動物実験はＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行った。
【０１２６】
７．組織学及び免疫組織化学
原発腫瘍のアセトン固定凍結切片を４％ヤギ血清と共にインキュベートして非特異的結合を遮断した。抗マウスＣＤ３１及び抗マウスＣＤ４５ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）（１：１００）とのインキュベーション及びローダミン標識ヤギ抗ラット抗体（１：３００）での染色を加湿チャンバー内、室温で行った。各々のインキュベーションの後にＰＢＳで洗浄した（×３）。高出力野（ＨＰＦ）当たりの血管及び白血球細胞カウントを顕微鏡により２００×倍で決定した（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）「Ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ｖ ｂｅｔａ ３ ｂｌｏｃｋｓ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ． ９６，１８１５−１８２２）。代表的な領域を、それぞれ、２００×（血管）及び８００×（白血球細胞）で写真撮影した。
【０１２７】
８．原発腫瘍は抗体ＩＬ−２融合タンパク質と組み合わせたインテグリンαｖで治療したマウスにおいてのみ退行する
血管新生阻害治療（インテグリンαｖアンタゴニスト）及び免疫治療（抗体ＩＬ−２融合タンパク質）の相乗効果を３種類全ての同系モデルにおいて、それぞれ、確立された皮下腫瘍（１１０−１３０μｌ）を有するマウスで決定した。
【０１２８】
図１は、抗血管新生αｖインテグリンアンタゴニストと抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍免疫治療コンパートメント特異的免疫治療との組み合わせ治療の原発腫瘍に対する効果を図式的に示す。図１Ａは、ＮＸＳ２神経芽細胞腫の皮下注射（２×１０６）によって誘発された原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｂは、ＣＴ２６−ＫＳＡ大腸カルチノーマの皮下注射（２×１０６）によって誘発された原発腫瘍からの結果を示す。図１Ｃは、Ｂ７８−Ｄ１４メラノーマ細胞の皮下注射（２×１０６）によって誘発された原発腫瘍からの結果を示す。確立された腫瘍（１１０−１３０ｍｍ３）の治療は、腫瘍特異的抗体−ＩＬ−２融合タンパク質ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ−２（１０μｇ、大腸カルチノーマ）及びｃｈ１４．１８−ＩＬ−２（５μｇ、神経芽細胞腫、１０μｇ、メラノーマ）（×５）の毎日の静脈内注射、並びに血管特異的インテグリンαｖアンタゴニスト又は対照ペプチドの浸透圧ポンプを１７．５μｇ／ｈ（頂部）で７日間用いての連続皮下輸液によって開始した。治療開始の時間は黒い矢印によって示す。各実験群（ｎ＝６）におけるマウスの原発腫瘍のサイズはマイクロキャリパ測定によって決定した（幅×長さ×幅／２）（平均±標準誤差）。治療開始時の確立された腫瘍のサイズと比較した組み合わせ治療を施したマウスの原発腫瘍サイズの退行は、全ての対照（Ｐ＞０．０５）とは対照的に、３種類の異なる同系腫瘍モデルにおいて統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定）。
【０１２９】
まず、各々の治療様式の最適下量を確立し、それらの引き続く組み合わせての使用を開始した。インテグリンαｖアンタゴニスト及びＩＬ−２融合タンパク質で治療したマウスのみが、３種類全てのモデルにおいて、５０〜９０％の範囲の腫瘍退行を提示した（Ｐ＜０．００１）。実際、神経芽細胞腫及び大腸カルチノーマ細胞を接種した動物の半分はそれらの原発腫瘍を完全に拒絶した（データは示さず）。これは、最良で、対照と比較してそれぞれ成長を遅延させる、単一治療として用いられる各々の方策とは対照的であった。続いて、各々の治療様式及びそれらの組み合わせの血管及び腫瘍コンパートメントに対する効果を分析した。
【０１３０】
確立された原発神経芽細胞腫（腫瘍細胞接種の２０日後に外科的に除去）の組み合わせ抗血管新生及び腫瘍特異的免疫治療に続く組織学を行った。簡単に述べると、ホルマリン固定原発腫瘍をパラフィンに埋め込み、続いてヘマトキシリン／エオシン染色した。壊死領域及び白血球浸潤を同定した。
【０１３１】
図２は、血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍免疫治療治療の効果を図式的に示す。確立された原発神経芽細胞腫を有するマウス（ｎ＝６）に、各々の治療を単独で施す対照を含めて、図１に記載されるように脈管構造特異的インテグリンＣＣ、アンタゴニスト、非特異的ペプチド対照及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる組み合わせ治療を施した。治療の最後に、ｓ．ｃ．腫瘍を外科的に除去した。各々の腫瘍の凍結切片を、それぞれ血管内皮細胞（ＣＤ−３１）及び白血球浸潤（ＣＤ４５）に特異的な抗体を用いる免疫組織化学によって分析した。後者は、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質によって誘発される腫瘍コンパートメント特異的免疫応答の十分に確立されたマーカーである（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９６）前出；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９６）前出；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９８）前出）。
【０１３２】
図２Ａは、インテグリンａ、アンタゴニスト、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質及びそれらの組み合わせのいずれかを用いる血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の血管密度の結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。図２Ｂは、それぞれ血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の白血球浸潤の結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【０１３３】
インテグリンαｖアンタゴニストを投与されたマウスは原発腫瘍の成長遅延と同時に血管新生の５０％減少を示し（図２）、血管コンパートメントの有効なターゲッティングが示された。この場合、腫瘍コンパートメントは直接には影響を受けない（図１）。対照的に、抗−ＧＤ２−ＩＬ−２融合タンパク質のみで治療したマウスでは明瞭な白血球浸潤が明らかとなったが、これはこの抗腫瘍コンパートメント指向治療の十分に確立された特徴であり（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９６）前出；Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら（１９９６）前出；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら（１９９８）前出）、ｓ．ｃ．腫瘍の成長の実質的な低下につながる（図１）。
【０１３４】
しかしながら、インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗−ＧＤ２−ＩＬ−２融合タンパク質の組み合わせで治療したマウスのみで、抗−ＧＤ２−ＩＬ−２融合タンパク質単独で治療したマウスと比較して腫瘍への白血球の浸潤の５倍の増加が明らかとなり、かつ血管新生の同様の減少が示された。炎症細胞の増加は組織学及び免疫組織化学によって立証され、マクロファージの流入のためであったが、これは細胞残滓の除去の間に壊死組織において頻繁に見られるパターンである。実際、このような壊死領域は、各々の成分で別々に治療した対照とは反対に、組み合わせ治療の後に腫瘍内にのみ存在していた。
【０１３５】
９．連続及び同時血管及び腫瘍ターゲッティングは突発性肝転移の根絶を誘発する
原発腫瘍の成功に終わる治療に加えて、より関連のある疑問は、遠隔転移がこのような組み合わせ抗血管及び抗腫瘍特異的治療策によって影響を受けるかどうかである。これには、突発性肝転移を特徴とする神経芽細胞腫モデルにおいて取り組んだ。このために、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニストでの原発腫瘍の治療を抗体ＩＬ−２融合タンパク質による抗腫瘍免疫治療と連続的に組み合わせた。
【０１３６】
図３は、抗血管新生αｖインテグリンアンタゴニストと抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫療法との連続組み合わせの突発性肝神経芽細胞腫転移に対する効果を図式的に示す。この抗血管治療は、確立された原発腫瘍を有するマウスにおいて、図１について記載されるように合計１０日間で開始した。原発腫瘍を外科的に除去した後、５μｇのｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質を毎日ｉ．ｖ．注射することにより（×５）、マウスに腫瘍コンパートメント特異的免疫療法を施した。突発性肝転移の数は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【０１３７】
両薬剤で連続的に治療したマウスのみが、単一治療として用いられる各々の薬剤での治療が無効である（Ｆ＜０．０１）（図３）全ての対照とは反対に、肝転移の１．５−２対数減少を提示した。実際、組み合わせ治療を施したマウスの４／８では肝転移が全く存在しないことが明らかになったが、これに対して残りの動物は１−５小転移性病変のみを示した。本質的に、インテグリンαｖ、アンタゴニストとｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質との同時組み合わせによって同様の結果が得られた。（図４頂部）。
【０１３８】
図４は、抗血管新生インテグリンαｖアンタゴニストと抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫療法との同時組み合わせの突発性肝神経芽細胞腫転移に対する効果を図式的に示す。突発性転移は、２×１０６ＮＸＳ２神経芽細胞腫細胞ｓ．ｃ．での原発腫瘍の誘発に続いて誘発された。インテグリン、又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）での治療を原発腫瘍の除去の前（図４Ａ）又はその後（図４Ｂ）に開始した。突発性肝転移は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【０１３９】
両薬剤で治療したマウスでのみ、原発腫瘍除去の前又は後のそれらの投与に依存して、肝転移の完全な非存在（図４Ａ）又は＞１．５対数減少（図５Ｂ）が明らかとなった（Ｐ＜０．０１）。これは、各々の薬剤を単一治療として用いた場合に治療が無効であった全ての対照と反対であった。
【０１４０】
１０．相乗作用組み合わせ及び有効治療
悪性腫瘍の血管コンパートメントにおける血管の破壊は癌と闘うための強力な方策である。腫瘍脈管構造の内皮細胞をターゲッティングすることにより、腫瘍をうまく治療することができる。血管新生性血管上に発現するαｖインテグリンとの相互作用によって脈管構造を標的とするペプチドアンタゴニスト（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ 前出；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．ら，（１９９５）前出）は血管の形成を抑制し、それに続く腫瘍の成長を劇的に退行させる。これは、３つの活発に成長する原発腫瘍及び１つの突発的に転移する腫瘍を治療することによって示された。用いられるインテグリンαｖアンタゴニストは主としてαｖβ３に対するものであったが、これは密接に関連するインテグリンαｖβ３も結合する。試験した大腸カルチノーマ及び神経芽細胞腫は明らかにαｖβ３を欠くが、幾らかのαｖβ５を発現するようである。メラノーマモデルもαｖβ３を発現する。しかしながら、このインテグリンアンタゴニストの効果は、神経芽細胞腫モデルについて示されるように（図２）、３種類の全ての動物モデルにおいて明らかに腫瘍脈管構造に制限される。重要なことには、腫瘍脈管構造へのターゲッティングの抗腫瘍効果は腫瘍コンパートメントに対する同時攻撃によって増幅され、これは原発腫瘍及び突発性転移の両者に対して有効である。これは特に関連性があり、それは、原発腫瘍の切除の後に血管新生阻害剤の循環レベルが減少することから治療に先立つ原発腫瘍の除去が神経芽細胞腫転移の成長及び汎発を増加させるという他の腫瘍モデルにおいて十分文書化されている知見ためである（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｌ．ら，（１９９５）前出；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，（１９９５）前出）。血管及び腫瘍コンパートメントへの同時ターゲッティングは非常に有効であることが立証されているが、それは、これが腫瘍細胞の栄養状態の低下と腫瘍細胞の活発な破壊とを組み合わせ、それが原発腫瘍の退行及び遠隔転移の根絶につながるためである。これは、同系モデルにおいてｓ．ｃ．腫瘍の成長の抑制のみを生じる２つの異なる抗血管新生治療策（Ｍａｕｃｅｒｉ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｎａｔｕｒｅ ３９４，２８７−２９１）を用いる単一血管コンパートメント指向アプローチとは対照的である。
【０１４１】
本方策において、腫瘍コンパートメント特異的応答には、腫瘍特異的抗体−ＩＬ−２融合タンパク質によって活性化され、かつ腫瘍微小環境を指向する炎症細胞が介在する。重要なことには、この抗血管新生策は、十分に確立された血管供給を有する原発腫瘍の成長抑制においては非常に有効であるものの、単一治療として用いられたときに遠隔微小転移に対する同様の効力を欠く（図３、４）。しかしながら、乏しい血管新生を特徴とする小腫瘍負荷を伴うそのような最小残留疾患設定においては、組み合わせ治療において用いられる抗腫瘍コンパートメント治療アームが単一治療として用いられたときに非常に有効である（Ｘｉａｎｇ，Ｒ．ら，（１９９７）前出；Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら，（１９９８）前出）。この状況において、抗血管新生治療の役割の１つは、微小転移誘発血管新生及びそれに続く転移病巣の拡大を抑制することである。（Ｖｏｌｐｅｒｔ，Ｏ．Ｖ．ら，（（１９９８）前出）。これは、その次に、腫瘍コンパートメント指向治療によるそのような微小転移の根絶を容易にするが、これは最小残留疾患設定において最適に有効である（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９６）前出）。
【０１４２】
原発腫瘍及び汎発性転移の有効な治療は臨床腫瘍学における大きな挑戦のままである。この報告における結果は、特異的抗血管新生及び免疫治療の組み合わせが原発腫瘍の退行及び微小転移の根絶において相乗作用することを示す。両治療様式、すなわち、αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−インターロイキン−２融合タンパク質が現在単一治療として臨床評価の最中であるため、それらの組み合わせの相乗作用は癌治療に対する新規かつ有効なツールを提供する。
【０１４３】
本発明の特定の実施形態を記載する前記の例は説明のためのものであり、もちろん、本発明を具体的に限定するものと解釈されるべきではない。さらに、現在公知であるか又は後に開発される、当業者の範囲内にあるような本発明の変形は、以下で請求される本発明の範囲内に入るものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示し、ＮＸＳ２神経芽細胞腫を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【図１Ｂ】 原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示し、ＣＴ２６−ＫＳＡ大腸カルチノーマを皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【図１Ｃ】 原発腫瘍に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ２融合タンパク質での抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療を用いる組み合わせ治療の効果を図式的に示し、Ｂ７８−Ｄ１４メラノーマ細胞を皮下注射（２×１０６）することによって誘導した原発腫瘍からの結果を示す。
【図２Ａ】 血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍治療の効果を図式的に示し、インテグリンαｖアンタゴニスト、ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質のいずれか、及びそれらの組み合わせを用いる血管及び腫瘍コンパートメント治療に続く、原発腫瘍の血管密度についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【図２Ｂ】 血管新生及び抗腫瘍免疫応答に対する組み合わせ抗血管及び抗腫瘍治療の効果を図式的に示し、それぞれ、血管及び腫瘍コンパートメント治療の後の、原発腫瘍の白血球浸潤についての結果を示す（＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ検定）。
【図３】 図３は、突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性αｖインテグリンアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の連続組み合わせの効果を図式的に示す。突発性肝転移の数は肝病巣の顕微鏡カウントによって決定した（ｎ＝８）（＊＊Ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）。
【図４Ａ】 突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の実質的に同時の組み合わせの効果を図式的に示し、原発腫瘍の除去の前に開始された、インテグリン又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）を用いる治療からの結果が示される。
【図４Ｂ】 突発性肝神経芽細胞腫転移に対する、抗血管新生性インテグリンαｖアンタゴニスト及び抗体−ＩＬ−２融合タンパク質を用いる抗腫瘍コンパートメント特異的免疫治療の実質的に同時の組み合わせの効果を図式的に示し、原発腫瘍の除去の後に開始された、インテグリン又はアンタゴニスト（１７．５μｇ／ｈ）及び腫瘍特異的ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２融合タンパク質（５μｇ×５）を用いる治療からの結果が示される。
【配列表】
Claims (22)
- ＲＧＤ含有ペプチド、抗αｖβ３モノクローナル抗体及び抗αｖβ３受容体モノクローナル抗体からなる群から選択される血管新生阻害剤としてのαｖβ３アンタゴニスト及び、抗腫瘍免疫治療剤としての抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質の患者の腫瘍細胞を治療するための医薬組成物の製造のための使用であって、該血管新生阻害剤と該抗腫瘍免疫治療剤は、腫瘍細胞増殖阻止量、患者に投与され、かつ該抗腫瘍抗原は少なくとも腫瘍抗原に対する抗体の抗原結合部分を含むものである使用であって、前記血管新生阻害剤は配列番号１１で表されるシクロＲＧＤ含有ペプチドであって、前記抗腫瘍免疫治療剤はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原ＫＳＡ（Ｅｐ−ＣＡＭ；ＫＳ１／４抗原）と免疫反応するＩｇ重鎖を含む融合タンパク質である使用。
- 前記血管新生阻害剤及び前記該抗腫瘍免疫治療剤を同時に又は約３週間の間隔内で連続的に投与する、請求項１の使用。
- 前記血管新生阻害剤を前記抗腫瘍免疫治療剤の前に投与する、請求項２の使用。
- 前記抗腫瘍免疫治療剤を前記血管新生阻害剤の前に投与する、請求項２の使用。
- 前記抗腫瘍免疫治療剤と前記血管新生阻害剤の投与を、腫瘍又は腫瘍転移を前記患者から前記間隔内で外科的に除去する間に行う、請求項２の使用。
- 前記抗腫瘍免疫治療剤と前記血管新生阻害剤の投与を、腫瘍又は腫瘍転移を前記患者から外科的に除去した後に行う、請求項１の使用。
- 前記血管新生阻害剤を１日当たり体重キログラム当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇの投与量で投与する、請求項１の使用。
- 前記抗腫瘍免疫治療剤を１日当たり体重キログラム当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇの投与量で投与する、請求項１の使用。
- 前記腫瘍細胞が神経外胚葉性又は上皮性である、請求項１の使用。
- 前記腫瘍細胞が、アデノーマ、血管肉腫、星状細胞腫、上皮カルチノーマ、胚細胞種、グリア芽細胞腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫及び奇形腫からなる群より選択される、請求項１の使用。
- 腫瘍又は腫瘍転移を治療するための治療用組成物であって、ＲＧＤ含有ペプチド、抗αｖβ３モノクローナル抗体及び抗αｖβ３受容体モノクローナル抗体からなる群から選択される血管新生阻害剤としての少なくとも１つのαｖβ３アンタゴニスト及び、抗腫瘍免疫治療剤としての少なくとも１つの抗腫瘍抗原／サイトカイン融合タンパク質を含み、該抗腫瘍抗原は少なくとも腫瘍抗原に対する抗体の抗原結合部分を含む治療用組成物であって、前記血管新生阻害剤は配列番号１１で表されるシクロＲＧＤ含有ペプチドであって、前記抗腫瘍免疫治療剤はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原ＫＳＡ（Ｅｐ−ＣＡＭ；ＫＳ１／４抗原）と免疫反応するＩｇ重鎖を含む融合タンパク質である治療用組成物。
- ａ）腫瘍又は腫瘍転移内で血管新生を阻害するのに十分な量の、少なくとも１種類の血管新生阻害剤；及び
ｂ）サイトカインに特異的な生物学的応答を誘発するのに十分な量の、少なくとも１種類の抗腫瘍免疫治療剤、
を含む、請求項１１の治療用組成物。 - （ａ）該腫瘍又は該腫瘍転移内の血管新生を阻害することができる血管新生阻害剤として、ＲＧＤ含有ペプチド、抗αｖβ３モノクローナル抗体及び抗αｖβ３受容体モノクローナル抗体からなる群より選択されるαｖβ３アンタゴニスト、及び（ｂ）抗腫瘍免疫治療剤としての抗腫瘍抗原／サイトカインの融合タンパク質であって、該抗腫瘍抗原は少なくとも腫瘍抗原に対する抗体の抗原結合部分を含む、腫瘍又は腫瘍転移内の腫瘍細胞を治療するためのキットであって、前記血管新生阻害剤は配列番号１１で表されるシクロＲＧＤ含有ペプチドであって、前記抗腫瘍免疫治療剤はサイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原ＫＳＡ（Ｅｐ−ＣＡＭ；ＫＳ１／４抗原）と免疫反応するＩｇ重鎖を含む融合タンパク質であるキット。
- 前記ＲＧＤ含有ペプチドがアミノ酸残基配列シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）（配列番号１１）を有するペプチドである、請求項１の使用、請求項１１の組成物又は請求項１３のキット。
- 前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５からなる群から選択される、請求項１の使用、請求項１１の組成物又は請求項１３のキット。
- 前記抗腫瘍免疫治療剤の抗腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原標的に結合する可変領域を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖である、請求項１に記載の使用、請求項１１に記載の組成物又は請求項１３のキット。
- 前記腫瘍関連抗原標的が、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＥＧＦ受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ２、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、Ｅｐ−ＣＡＭ（ＫＳＡ）、ＩＬ−２受容体、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｌｅｗｉｓ−Ｘ（ＣＤ１５）、メラノーマ関連プロテオグリカンＭＣＳＰ、ＰＳＡ及びトランスフェリン受容体からなる群より選択される、請求項１６の使用、組成物又はキット。
- 前記抗腫瘍免疫治療剤が、サイトカインＩＬ−２、及び腫瘍関連抗原ＧＤ２と免疫反応するＩｇ重鎖を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の使用、請求項１１の組成物又は請求項１３のキット。
- 前記腫瘍又は腫瘍転移が、アデノーマ、血管肉腫、星状細胞腫、上皮カルチノーマ、胚細胞種、グリア芽細胞腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫及び奇形腫からなる群より選択される、請求項１３のキット。
- 前記血管新生阻害剤及び前記抗腫瘍免疫治療剤が前記パッケージ内に別々の容器又は単一容器内で提供される、請求項１３のキット。
- 前記腫瘍関連抗原標的が神経外胚葉性又は上皮性である腫瘍に由来する請求項１６の使用、組成物又はキット。
- 前記腫瘍関連抗原標的が、アデノーマ、血管肉腫、星状細胞腫、上皮カルチノーマ、胚細胞種、グリア芽細胞腫、神経膠腫、過誤腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫及び奇形腫からなる群より選択される、請求項１６の使用、組成物又はキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11972199P | 1999-02-12 | 1999-02-12 | |
| US60/119,721 | 1999-02-12 | ||
| PCT/US2000/003483 WO2000047228A1 (en) | 1999-02-12 | 2000-02-11 | Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011111073A Division JP2011207892A (ja) | 1999-02-12 | 2011-05-18 | 抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002536419A JP2002536419A (ja) | 2002-10-29 |
| JP4841727B2 true JP4841727B2 (ja) | 2011-12-21 |
Family
ID=22385967
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000598179A Expired - Fee Related JP4841727B2 (ja) | 1999-02-12 | 2000-02-11 | 抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 |
| JP2011111073A Pending JP2011207892A (ja) | 1999-02-12 | 2011-05-18 | 抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011111073A Pending JP2011207892A (ja) | 1999-02-12 | 2011-05-18 | 抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7115261B1 (ja) |
| EP (1) | EP1156823B1 (ja) |
| JP (2) | JP4841727B2 (ja) |
| KR (1) | KR100704140B1 (ja) |
| CN (1) | CN1192796C (ja) |
| AT (1) | ATE412433T1 (ja) |
| AU (1) | AU776790B2 (ja) |
| BR (1) | BR0008161A (ja) |
| CA (1) | CA2360106C (ja) |
| CZ (1) | CZ303155B6 (ja) |
| DE (1) | DE60040651D1 (ja) |
| DK (1) | DK1156823T3 (ja) |
| ES (1) | ES2313883T3 (ja) |
| HU (1) | HU229520B1 (ja) |
| MX (1) | MXPA01008110A (ja) |
| NO (2) | NO331072B1 (ja) |
| PL (1) | PL200919B1 (ja) |
| PT (1) | PT1156823E (ja) |
| RU (1) | RU2236251C2 (ja) |
| SI (1) | SI1156823T1 (ja) |
| SK (1) | SK287357B6 (ja) |
| WO (1) | WO2000047228A1 (ja) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6911204B2 (en) | 2000-08-11 | 2005-06-28 | Favrille, Inc. | Method and composition for altering a B cell mediated pathology |
| JP2004536786A (ja) * | 2001-03-02 | 2004-12-09 | メディミューン，インコーポレイテッド | インテグリンαｖβ３拮抗薬を他の予防薬もしくは治療薬と組み合わせて投与することによる炎症性疾患または自己免疫疾患の予防または治療方法 |
| TWI315982B (en) | 2001-07-19 | 2009-10-21 | Novartis Ag | Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof |
| JP2005502723A (ja) * | 2001-09-20 | 2005-01-27 | シェーリング コーポレイション | 免疫応答のアジュバントとしてのケモカイン |
| CN100390282C (zh) * | 2001-12-04 | 2008-05-28 | 默克专利有限公司 | 具有调节的选择性的il-2融合蛋白 |
| EP1469860A4 (en) * | 2002-01-24 | 2005-09-07 | Yissum Res Dev Co | ANTICANCER COMBINATION AND USE THEREOF |
| US8435529B2 (en) | 2002-06-14 | 2013-05-07 | Immunomedics, Inc. | Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy |
| GB0209896D0 (en) * | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
| GB0217017D0 (en) * | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Bioacta Ltd | Peptide 2 |
| US7659241B2 (en) | 2002-07-31 | 2010-02-09 | Seattle Genetics, Inc. | Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease |
| CA2497497A1 (en) * | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Proteinexpress Co., Ltd. | Regulators for implantation |
| JP2004196770A (ja) * | 2002-10-24 | 2004-07-15 | Effector Cell Institute Inc | 樹状細胞前駆体の血中レベル上昇剤 |
| US8147832B2 (en) * | 2003-08-14 | 2012-04-03 | Merck Patent Gmbh | CD20-binding polypeptide compositions and methods |
| US7196061B2 (en) * | 2003-09-10 | 2007-03-27 | Wyeth | Compounds that modulate neuronal growth and their uses |
| MY145073A (en) * | 2004-07-09 | 2011-12-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-glypican 3 antibody |
| GB0417487D0 (en) | 2004-08-05 | 2004-09-08 | Novartis Ag | Organic compound |
| CU23297A1 (es) * | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
| CN101119743B (zh) * | 2005-01-31 | 2012-09-26 | 株式会社Eci | 免疫增强剂 |
| US20070087005A1 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Lazar Gregory A | Anti-glypican-3 antibody |
| NZ599683A (en) * | 2005-12-20 | 2013-11-29 | Sbi Biotech Co Ltd | Anti-ilt7 antibody |
| US8574577B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-11-05 | The Scripps Research Institute | VEGF antibodies comprising modular recognition domains |
| US8454960B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-06-04 | The Scripps Research Institute | Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains |
| US8557243B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | EFGR antibodies comprising modular recognition domains |
| US8557242B2 (en) | 2008-01-03 | 2013-10-15 | The Scripps Research Institute | ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains |
| AU2008346734A1 (en) | 2008-01-03 | 2009-07-16 | The Scripps Research Institute | Antibody targeting through a modular recognition domain |
| ES2531629T3 (es) * | 2008-01-04 | 2015-03-18 | Baxter International Inc. | Anticuerpos anti-MIF |
| ES2342529B1 (es) * | 2008-10-07 | 2011-05-11 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Oncostatina m como potenciador de la actividad inmunoestimuladora de celulas epiteliales humanas. |
| CA2743394C (en) * | 2008-11-17 | 2018-01-02 | Koebenhavns Universitet | Il-4-derived peptides for modulation of the chronic inflammatory response and treatment of autoimmune diseases |
| EP3257953B1 (en) | 2009-03-12 | 2018-09-26 | Cancer Prevention And Cure, Ltd. | Methods of identification, assessment, prevention and therapy of lung diseases and kits thereof including gender-based disease identification, assessment, prevention and therapy |
| ES2363358B1 (es) * | 2009-04-03 | 2012-06-21 | FUNDACIÓ INSTITUT DE RECERCA HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON (Titular al | Agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación celular indeseable. |
| KR101426125B1 (ko) * | 2009-07-06 | 2014-08-06 | 에르피오 세러퓨틱스 인코포레이티드 | 암 세포의 전이 예방을 위한 화합물, 조성물 및 방법 |
| US20120100166A1 (en) | 2010-07-15 | 2012-04-26 | Zyngenia, Inc. | Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof |
| US9539324B2 (en) | 2010-12-01 | 2017-01-10 | Alderbio Holdings, Llc | Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions |
| US9078878B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-07-14 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75 |
| US11214610B2 (en) | 2010-12-01 | 2022-01-04 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| US9067988B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-06-30 | Alderbio Holdings Llc | Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies |
| US9884909B2 (en) | 2010-12-01 | 2018-02-06 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF compositions and use thereof |
| US8728473B2 (en) | 2010-12-01 | 2014-05-20 | Alderbio Holdings Llc | Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies |
| RS62238B1 (sr) | 2011-02-10 | 2021-09-30 | Roche Glycart Ag | Mutantni interleukin-2 polipeptidi |
| RU2013139267A (ru) * | 2011-02-10 | 2015-03-20 | Рош Гликарт Аг | Улучшенная иммунотерапия |
| CN103703371A (zh) * | 2011-04-29 | 2014-04-02 | 癌症预防和治疗有限公司 | 使用分类系统及其试剂盒识别和诊断肺部疾病的方法 |
| EA201892619A1 (ru) | 2011-04-29 | 2019-04-30 | Роше Гликарт Аг | Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2 |
| WO2012162561A2 (en) | 2011-05-24 | 2012-11-29 | Zyngenia, Inc. | Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses |
| EP2537933A1 (en) | 2011-06-24 | 2012-12-26 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines |
| RU2013156435A (ru) | 2011-07-06 | 2015-08-20 | МорфоСис АГ | Терапевтические комбинации анти-cd20 и анти-gm-csf антител и их применения |
| KR20140048292A (ko) | 2011-08-23 | 2014-04-23 | 로슈 글리카트 아게 | 항-mcsp 항체 |
| AU2012320597C1 (en) | 2011-10-07 | 2015-10-15 | Baxalta GmbH | oxMIF as a diagnostic marker |
| CN102634485A (zh) * | 2012-03-15 | 2012-08-15 | 上海市浦东新区公利医院 | 一种表达il-17的胶质瘤细胞株 |
| US9382329B2 (en) | 2012-08-14 | 2016-07-05 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells |
| TWI693073B (zh) | 2012-12-21 | 2020-05-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑 |
| JP6584956B2 (ja) | 2012-12-21 | 2019-10-02 | アステラス インスティテュート フォー リジェネレイティブ メディシン | 多能性幹細胞から血小板を生産するための方法およびその組成物 |
| CA2907181C (en) | 2013-03-15 | 2023-10-17 | Viktor Roschke | Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses |
| KR20150145260A (ko) | 2013-04-19 | 2015-12-29 | 싸이튠 파마 | 감소된 혈관 누출 증후근에 대한 사이토카인 유도체 치료 |
| AU2014309199B2 (en) * | 2013-08-20 | 2018-04-19 | Merck Sharp & Dohme Llc | Treating cancer with a combination of a PD-1 antagonist and dinaciclib |
| EP2915569A1 (en) | 2014-03-03 | 2015-09-09 | Cytune Pharma | IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| JP6827319B2 (ja) | 2014-05-08 | 2021-02-10 | 中外製薬株式会社 | Ｇｐｃ３標的治療剤療法が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤 |
| MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
| WO2016086044A1 (en) * | 2014-11-24 | 2016-06-02 | University Of Iowa Research Foundation | Methods of treating cancer |
| JP7096667B2 (ja) | 2015-07-01 | 2022-07-06 | 中外製薬株式会社 | Ｇｐｃ３標的治療剤が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤 |
| US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
| US11779604B2 (en) | 2016-11-03 | 2023-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods |
| CN106906184B (zh) * | 2017-02-27 | 2021-04-23 | 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 | 一种促进肺癌细胞生长的方法 |
| EP4353318A3 (en) | 2017-03-31 | 2024-07-17 | The Regents of the University of California | Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant cancers |
| EP3607089A4 (en) | 2017-04-04 | 2020-12-30 | Lung Cancer Proteomics, LLC | PLASMA-BASED PROTEIN PROFILING FOR EARLY PROGNOSIS OF LUNG CANCER |
| EA201992765A1 (ru) | 2017-05-24 | 2020-03-25 | Новартис Аг | Белки на основе антител с привитым цитокином и способы их применения в лечении рака |
| CN111562362B (zh) * | 2020-04-02 | 2022-05-20 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 一组用于预测三阴乳腺癌免疫联合抗血管生成治疗效果的标志物及其应用和试剂盒 |
| CN111440244B (zh) * | 2020-04-09 | 2021-03-16 | 诺未科技（北京）有限公司 | 靶向vegfr2的转移性癌疫苗 |
| CN111909962A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-11-10 | 药鼎(北京)国际细胞医学技术有限公司 | 一种治疗肝癌的病毒构建体及其用途和构建方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09132593A (ja) * | 1995-09-15 | 1997-05-20 | Merck Patent Gmbh | 環状接着阻害剤 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262520A (en) | 1989-12-01 | 1993-11-16 | The Scripps Research Institute | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding |
| US5314995A (en) * | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| JPH09506761A (ja) * | 1990-11-09 | 1997-07-08 | ステファン ディー．ギリーズ | サイトカインの免疫複合体 |
| US5650150A (en) | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US5837682A (en) * | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
| US5780426A (en) | 1995-06-07 | 1998-07-14 | Ixsys, Incorporated | Fivemer cyclic peptide inhibitors of diseases involving αv β3 |
| EP0910382B1 (en) * | 1996-04-26 | 2003-06-11 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Squalamine in combination with other anti-cancer agents for treating tumors |
| DE69739907D1 (de) | 1996-05-31 | 2010-07-22 | Scripps Research Inst | 3 vermittelter angiogenesis hemmers |
-
2000
- 2000-02-11 MX MXPA01008110A patent/MXPA01008110A/es active IP Right Grant
- 2000-02-11 CZ CZ20012791A patent/CZ303155B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 JP JP2000598179A patent/JP4841727B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-11 DK DK00910138T patent/DK1156823T3/da active
- 2000-02-11 AT AT00910138T patent/ATE412433T1/de active
- 2000-02-11 CN CNB008061343A patent/CN1192796C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-11 WO PCT/US2000/003483 patent/WO2000047228A1/en active IP Right Grant
- 2000-02-11 SK SK1113-2001A patent/SK287357B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 RU RU2001124907/15A patent/RU2236251C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 DE DE60040651T patent/DE60040651D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-11 BR BR0008161-2A patent/BR0008161A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 KR KR1020017010132A patent/KR100704140B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 CA CA2360106A patent/CA2360106C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-11 PL PL350329A patent/PL200919B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 PT PT00910138T patent/PT1156823E/pt unknown
- 2000-02-11 SI SI200031012T patent/SI1156823T1/sl unknown
- 2000-02-11 EP EP00910138A patent/EP1156823B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-11 AU AU32280/00A patent/AU776790B2/en not_active Ceased
- 2000-02-11 HU HU0200128A patent/HU229520B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-02-11 US US09/502,732 patent/US7115261B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-11 ES ES00910138T patent/ES2313883T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-10 NO NO20013906A patent/NO331072B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-26 US US11/527,029 patent/US7365054B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-04-21 US US12/148,629 patent/US7833976B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-12-03 NO NO20101696A patent/NO20101696L/no not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-05-18 JP JP2011111073A patent/JP2011207892A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09132593A (ja) * | 1995-09-15 | 1997-05-20 | Merck Patent Gmbh | 環状接着阻害剤 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4841727B2 (ja) | 抗血管新生治療及び免疫治療の組み合わせを用いる腫瘍及び転移の治療方法 | |
| JP5390055B2 (ja) | 免疫サイトカインの取り込み増強剤との併用治療による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介免疫応答の増強 | |
| EP2364995A1 (en) | Conjugation product | |
| JP2002511432A (ja) | 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強 | |
| US20040033210A1 (en) | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor | |
| JP2003096096A (ja) | 腫瘍壊死因子結合リガンド | |
| AU784173B2 (en) | Modified cytokines for use in cancer therapy | |
| US7622105B2 (en) | Modified cytokines for use in cancer therapy | |
| Scherf et al. | Cytotoxic and antitumor activity of a recombinant tumor necrosis factor-B1 (Fv) fusion protein on LeY antigen-expressing human cancer cells. | |
| ZA200106455B (en) | Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies. | |
| Pastan et al. | Cytotoxic and Antitumor Activity of a Recombinant Tumor Necrosis Factor-B1 (Fv) Fusion Protein on Le’Antigen-expressing Human Cancer Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070207 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100302 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100526 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100602 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100902 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110518 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110518 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110719 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110920 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111005 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141014 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |