JP2003231699A - 腫瘍壊死因子結合リガンド - Google Patents

腫瘍壊死因子結合リガンド

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JP2003231699A JP2003024901A JP2003024901A JP2003231699A JP 2003231699 A JP2003231699 A JP 2003231699A JP 2003024901 A JP2003024901 A JP 2003024901A JP 2003024901 A JP2003024901 A JP 2003024901A JP 2003231699 A JP2003231699 A JP 2003231699A
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Deborah Ann Rathjen
アン ラスジェン，デボラ
Roger Aston
アストン，ロジャー
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＴＮＦアルファの異なる活性を選択的に阻害
したり、促進したりする抗体。 【解決手段】 ＴＮＦアルファの異なるトポグラフィッ
ク領域に対して特異的な、モノクローナル抗体等のリガ
ンド。これらのリガンドは、TNFに結合すると、腫瘍退
行、内皮プロコアギュラントの誘導、腫瘍フイブリン沈
着の誘導、細胞毒性、受容体結合の活性が、選択的に影
響を受ける。リガンドの好ましい例としては、抗体、Ｆ
（ａｂ）断片、再構成抗体（ＣＤＲ移植ヒト化抗体）単
一ドメイン抗体（dAbs）、単一鎖抗体、血清結合タンパ
ク質、受容体等が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ヒト腫瘍壊死因
子アルファ（ＴＮＦ）に結合するリガンドであって、こ
の結合によってＴＮＦの生物学的活性が修飾されるもの
に関する。ここでいう修飾は、すでに明らかにされてい
るような、ＴＮＦアルファに結合してＴＮＦアルファの
活性すべてを阻害する抗体によるものとは異なるもので
ある。新規の発見は、ＴＮＦアルファの異なる活性を選
択的に阻害したり、促進したりするものである。また、
本発明は、ＴＮＦに結合する分子を含む組成物と、ＴＮ
Ｆに対して活性を示す分子およびＴＮＦを用いた治療方
法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）は、活
性マクロファージによって産生されるもので、バシラス
・カルメッテグエリン（Bacillus Calmette-Guerin）ま
たはコリネバクテリリウム・パルバム（Corynebacteriu
m parvum）によってプレセンシタイズされ、エンドトキ
シン（ＬＰＳ）によってチャレンジされた実験動物の血
清中において最初に発見された。ＴＮＦの計画的な（sy
stematic）投与によって、出血性の壊死が、マウスの移
植可能な腫瘍に見出されることがあった。一方、インビ
トロ系ではＴＮＦは腫瘍細胞系に対して細胞溶解性また
は細胞増殖抑制性効果を示す。
【０００３】宿主保護効果に加えて、ＴＮＦは敗血症、
悪液質、そして脳マラリア（cerebral malaria）の原因
となる因子とみなされてきた。ＴＮＦに対する多クロー
ン性ウサギ血清によるマウスの受動免疫は、感染に先立
ってされた場合、中毒ショックのイニシエート剤である
ＬＰＳエンドトキシンの致死効果からマウスを守ること
が示されている。
【０００４】ＴＮＦをコードする遺伝子はクローン化さ
れており、潜在的なガン治療剤としてこのモノカインの
有用性を調査することを可能にしている。
【０００５】一方、ステージ１臨床治験における癌患者
へのＴＮＦ点滴によって腫瘍が退行するが、一方で血小
板減少症、リンパ球減少症、肝毒性、腎臓障害、そして
高血圧症などのような副作用が報告されている。ＴＮＦ
の臨床での使用に伴うこれらの顕著な副作用は、数多く
の知られているＴＮＦの効果から予測されるものであ
り、そのいくつかは第１表に挙げられている。
【０００６】第１表 ＴＮＦの生物学的活性 抗腫瘍活性 抗ウイルス活性 抗寄生虫活性 機能 腫瘍細胞に対する細胞毒性作用 （腫瘍起因性）血管形成作用 発熱原活性 リポタンパク質リパーゼ阻害化 好中球活性化 破骨細胞活性 内皮細胞、単球、そして腫瘍細胞プロコアグラント活性
の誘導 内皮細胞上の表面抗原誘導 ＩＬ-６誘導 ｃ-ｍｙｃおよびｃ-ｆｏｓの誘導 EGF受容体の誘導 ＩＬ-１の誘導 ＴＮＦ合成の誘導 ＧＭ-ＣＳＦ合成の誘導 プロスタグランジンおよびコラゲナーゼ合成増加 急性相タンパク質Ｃ３の誘導
【０００７】とくに重要な点は、内皮および抹消血単球
のＴＮＦ活性化の結果として起こる凝固活性化にある。
播種性血管内凝固は中毒ショック（toxic shock）に関
連しており、また胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳
癌、子宮癌、メラノーマ、急性白血病、骨髄腫、骨髄増
殖性症候群、そして骨髄芽性白血症などを含む多くの癌
に関連している。腫瘍退行活性には影響がないが、凝固
活性化のような好ましくない効果が除去またはマスクさ
れるようなＴＮＦ活性の修飾は、明らかにより一層癌治
療に有益なものとなるが、一方でＴＮＦ活性の完全な廃
止が中毒ショックの完全治癒に求められる。
【０００８】部位特異性抗体（多クローンおよびモノク
ローン）の利用によるホルモン活性の分離によってホル
モン活性を強めることができる（Aston 1989, Mol. Imm
unol. 26, 435）。今日、３次元構造が既知のＴＮＦ分
子の特定領域に対する機能または抗原性を同定する試み
がほとんどなされていない。そのような領域に対する機
能の同定は、治療目的に合ったモノクローン抗体および
他のリガンドの開発を可能とする。アミノ酸１から１５
に対するポリクローン性抗体は、ＴＮＦによるHeLa R1
9細胞受容体結合を阻害することが報告されている（Soc
her et al., 1987, PNAS 84, 8829）。一方で、ＴＮＦ
上の未決定の構造的エピトープを認識するモノクローン
抗体がインビトロ系でＴＮＦの細胞毒性活性を阻害する
ことが報告されている（Bringman and Aggarwal, 1987,
Hybridoma 6, 489）。しかし、これらの抗体が他のＴＮ
Ｆ活性に対してどのような効果を示すかは明らかではな
い。
【０００９】本発明者は、ヒトＴＮＦに対して活性を示
す一連のモノクローン抗体群を作った。そして、ＴＮＦ
の抗腫瘍効果（インビトロおよびインビボ系）と、ＴＮ
Ｆ受容体結合と、凝固の活性化（インビトロおよびイン
ビボ系）に関しての影響について特徴づけ、そしてそれ
らのトポグラフィックな特異性を定義した。このような
アプローチによって、本発明者はＴＮＦアルファの異な
るトポグラフィック領域が、異なる活性に関係している
ことを発見した。したがって、本発明者は、ＴＮＦアル
ファ活性を選択的に高めるか阻害するリガンドまたは抗
体の同定を可能とし、それによってＴＮＦアルファを含
む改善された治療薬や治療方法を提供する。
【００１０】本発明の第一の発明は、ヒトＴＮＦに結合
可能なリガンドからなるもので、このリガンドがＴＮＦ
に結合すると、ＴＮＦの下記生物学的活性が阻害され
る。 １．腫瘍退行 ２．内皮プロコアギュラントの誘導 ３．腫瘍フイブリン沈着の誘導 ４．細胞毒性 ５．受容体結合
【００１１】本発明の全ての態様における好ましい実施
形態では、リガンドは抗体、Ｆ（ａｂ）断片、再構成抗
体（ＣＤＲ移植ヒト化抗体（grafted humanised antibo
dies））単一ドメイン抗体（dAbs）、単一鎖抗体、血清
結合タンパク質、受容体、そして天然の阻害剤から選択
される。また、リガンドは合成されたタンパク質または
ぺプチドであって前記断片のひとつと類似している。し
かし、好ましくは、リガンドはモノクローン抗体または
そのＦ（ａｂ）断片である。
【００１２】本発明の第二の発明は、ヒトＴＮＦに結合
可能なリガンドからなるものであって、ＴＮＦへのリガ
ンドの結合によって、残基１-１８、５８-６５、１１５
-１２５、そして１３８-１４９からなるトポグラフイッ
ク領域、または残基１-１８、１０８-１２８からなるト
ポグラフイック領域、または残基５６-７９、１１０-１
２７、そして１３５-１５５からなるトポグラフイック
領域が実質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに
対する結合から遮るようにして、リガンドがＴＮＦに結
合することによって、ＴＮＦによる内皮プロコアギュラ
ント誘導、腫瘍退行、腫瘍フイブリン沈着誘導、細胞毒
性、そして受容体結合の活性を阻害することを特徴とす
るものである。
【００１３】本発明の第三の発明は、主として残基１-
２０からなるトポグラフィック領域と、残基５６-７７
からなるトポグラフイック領域と、残基１０８-１２７
からなるトポグラフイック領域と、そして残基１３８-
１４９からなるトポグラフイック領域からなる群から選
択される少なくとも２つの領域において、ヒトＴＮＦに
結合可能なリガンドからなるものである。
【００１４】本発明の第三の発明にもとづく好適な実施
態様では、リガンドはトポグラフイック領域１-１８、
５８-６５、１１５-１２５、そして１３８-１４９にお
いてヒトＴＮＦと結合する。このような配列からなる領
域をトポグラフイックにして第２３図に示した。
【００１５】本発明の第三の発明にもとづくより好適な
実施態様では、リガンドはトポグラフイック領域１-１
８および１０８-１２８においてヒトＴＮＦと結合す
る。このような配列からなる領域をトポグラフイックに
して第２４図に示した。
【００１６】本発明の第二の発明にもとづくより好適な
実施態様では、リガンドはトポグラフイック領域５６-
７９、１１０-１２７、そして１３６-１５５においてヒ
トＴＮＦと結合する。このような配列からなる領域をト
ポグラフイックにして第２５図に示した。
【００１７】本発明の第一、第二および第三の発明にも
とづく特に好適な実施態様では、リガンドは、ＭＡｂ
１、ＭＡｂ４７、そしてＭＡｂ５４と命名されたモノク
ローン抗体からなる群から選択されるモノクローン抗体
である。ＭＡｂ１、ＭＡｂ４７、そしてＭＡｂ５４を産
生するハイブリドーマからなる細胞系統の試料は、英国
（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, Unit
ed Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニ
マルセルカルチャーズ（European Collection ofAnimal
Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（V
accine Researchand Production Laboratory）、公衆衛
生ラボラトリーサービス（Pubic HealthLaboratory Ser
vice）、応用微生物学研究センター（Centre for Appli
ed Microbiology and Research）へ寄託された。ＭＡｂ
１は、１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は
８９０８０３０１である。ＭＡｂ５４は、１９８９年８
月３１日に寄託され、その登録番号は８９０８３１０３
である。ＭＡｂ４７は、１９８９年１２月１４日に寄託
され、その登録番号は８９１２１４０２である。
【００１８】本発明の第四の発明は、本発明の第一、第
二または第三の発明にもとづくリガンドと組み合わさっ
てＴＮＦを含む組成物からなるものであって、ＴＮＦに
対してリガンドが結合することを特徴とする。
【００１９】本発明の第五の発明は、本発明の第一、第
二または第三の発明にもとづくリガンドもしくは本発明
の第四の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与す
ることからなる中毒ショック治療方法からなるものであ
る。
【００２０】本発明の第六の発明は、ヒトＴＮＦに結合
可能なリガンドからなるものであって、このリガンドは
ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント
誘導活性を阻害し、内皮細胞上の受容体へのＴＮＦ結合
を阻害し、そしてＴＮＦによる腫瘍フイブリン沈着誘導
および腫瘍退行活性を促進させるが、一方で細胞毒性は
影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性について
は影響を受けないかあるいは促進されることを特徴とし
ている。
【００２１】本発明の第七の発明は、ヒトＴＮＦに結合
可能なリガンドに関するものであって、このリガンドは
ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント
誘導活性を阻害し、内皮細胞上の受容体へのＴＮＦ結合
を阻害し、そしてＴＮＦによる腫瘍フイブリン沈着誘導
および腫瘍退行活性を促進させ、ＴＮＦの細胞毒性及び
受容体結合活性は影響されず、ＴＮＦへのこのリガンド
の結合は、残基１-３０、１１７-１２８、そして１４１
-１５３からなるトポグラフイック領域によって規定さ
れるＴＮＦのエピトープが自然発生的な生物学的活性リ
ガンドへの結合を遮られることを特徴とする。
【００２２】本発明の第八の発明は、残基１-３０、１
１７-１２８、そして１４１-１５３からなるトポグラフ
イック領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドから
なる。
【００２３】この第八の発明の好適な実施態様では、リ
ガンドは残基１-２６、１１７-１２８、そして１４１-
１５３のトポグラフィック領域においてヒトＴＮＦへ結
合する。そのような配列からなる領域は、トポグラフイ
ックに第２６図に示した。
【００２４】本発明の第六、第七および第八の発明にも
とづく好適な実施態様では、リガンドは、ＭＡｂ３２と
命名されたモノクローン抗体である。ＭＡｂ３２を産生
するハイブリドーマからなる細胞系統の試料は、英国
（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, Unit
ed Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニ
マルセルカルチャーズ（European Collection of Anima
l Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所
（Vaccine Research and Production Laboratory）、公
衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laborator
y Service）、応用微生物学研究センター（Centre for
Applied Microbiology and Research）へ１９８９年８
月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０２で
ある。
【００２５】本発明の第九の発明は、本発明の第六、第
七または第八の発明にもとづくリガンドと組み合わさっ
てＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成物
は、そのＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴
とする。投与されたサイトカインの活性を修飾するため
にモノクローン抗体（MAb）とともにＴＮＦを投与する
ことを開示した文献はいままでのところない。
【００２６】本発明の第十の発明は、本発明の第六、第
七または第八の発明にもとづくリガンド、又は本発明の
第九の発明における組成物のどちらか一方を投与するこ
とを含むもので、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する
腫瘍処置方法からなるものである。
【００２７】本発明の第十一の発明は、ヒトＴＮＦの残
基１-１８へ結合するリガンド（ペプチド３０１）から
なるものである。
【００２８】本発明の第十二の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドからなるものであって、このリガンド
はＴＮＦへ結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラン
ト誘導活性を阻害し、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着誘導
および腫瘍退行を促進させるが、ＴＮＦの細胞毒性は影
響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響され
ないかあるいは促進され、リガンドのＴＮＦへの結合
は、残基１ー１８からなるトポグラフイック領域によっ
て規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的
な生物学的活性リガンドへの結合を遮られることを特徴
とするものである。
【００２９】本発明の第十三の発明は、本発明の第１１
または第１２の発明にもとづくリガンドと組み合わさっ
てＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成物
は、そのＴＮＦに対してリガンドが結合していることを
特徴とするものである。
【００３０】本発明の第十四の発明は、本発明の第十一
または第十二の発明にもとづくリガンド、又は本発明の
第十三の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与す
ることを含む、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する腫
瘍処置方法からなるものである。
【００３１】本発明の第十五の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドからなるものであって、このリガンド
はＴＮＦへ結合すると、ＴＮＦの細胞毒性および腫瘍退
行活性は影響されず、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント
誘導、及び腫瘍フイブリン沈着誘導の活性を阻害する
が、ＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響されないことを
特徴とするものである。
【００３２】本発明の第十六の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドからなるものであって、このリガンド
は、ＴＮＦへ結合すると、ＴＮＦの細胞毒性および腫瘍
退行の活性は影響されないが、ＴＮＦの内皮プロコアギ
ュラント誘導およひ腫瘍フイブリン沈着誘導の活性は阻
害され、さらにＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響され
ず、。リガンドのＴＮＦへの結合は、残基２２-４０，
４９-９７、１１０-１２７、そして１３６-１５３から
なるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦの
エピトープが実質的に自然発生的な生物学的活性リガン
ドにへ結合するのを妨げることを特徴とする。
【００３３】本発明の第十七の発明は、残基２２-４
０，４９-９７、１１０-１２７、そして１３６-１５３
からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦへ結
合するリガンドからなるものである。そのような配列か
らなる領域は、トポグラフイックに第２７図に示した。
【００３４】本発明の第十七の発明の好適な実施態様で
は、残基２２-４０，４９-９６、１１０-１２７、そし
て１３６-１５３からなるトポグラフイック領域におい
てヒトＴＮＦへ結合するリガンドからなるものである。
この領域はＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する
【００３５】本発明の第十五、第十六および第十七の発
明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ４２と命名
たモノクローン抗体である。このＭＡｂ４２を産生する
ハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton
Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingd
om）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセル
カルチャーズ（European Collection of Animal Cell C
ultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine
Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボ
ラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Servic
e）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied
Microbiology and Research）へ１９８９年８月３日に
寄託され、その登録番号は８９０８０３０４である。
【００３６】本発明の第十八の発明は、本発明の第十
五、第十六または第十七の発明にもとづくリガンドと組
み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものであっ
て、ＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とす
るものである。
【００３７】本発明の第十九の発明は、本発明の第十
五、第十六または第十七の発明にもとづくリガンド、又
は本発明の第十八の発明にもとづく組成物のどちらか一
方を投与することを含むもので、ＴＮＦの作用によって
腫瘍の増殖を阻害する腫瘍処置方法からなるものであ
る。
【００３８】本発明の第二十の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮ
Ｆの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、ＴＮ
Ｆの内皮プロコアギュラント誘導活性には影響を与えな
いが、細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性を阻
害することを特徴とするものである。
【００３９】本発明の第二十一の発明は、ヒトＴＮＦに
結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、Ｔ
ＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、Ｔ
ＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性には影響を与え
ないが、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結
合活性を阻害し、このリガンドのＴＮＦへの結合は、残
基１２-２２，３６-４５、９６-１０５、そして１３２-
１５７からなるトポグラフイック領域によって規定され
るＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的
リガンドによって遮る事を特徴とするものである。
【００４０】本発明の第二十二の発明は、残基１２-２
２，３６-４５、９６-１０５、そして１３２-１５７か
らなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦへ結合
するリガンドからなるものである。この領域はＴＮＦア
ルファの３Ｄ構造に近似する。そしてトポグラフイック
に第２８図に示した。
【００４１】本発明の第二十、第二十一および第二十二
の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ２５と
指定しれたモノクローン抗体である。このＭＡｂ２５を
産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国
（Porton Down, Salisbury,Wilthshire SP4 OJG, Unite
d Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニ
マルセルカルチャーズ（European Collection of Anima
l Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所
（Vaccine Research and Production Laboratory）、公
衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laborator
y Service）、応用微生物学研究センター（Centre for
Applied Microbiology and Research）へ１９８９年１
２月１４日に寄託され、その登録番号は８９１２４０１
である。
【００４２】本発明の第二十三の発明は、ヒトＴＮＦに
結合するリガンドからなるものであって、このリガンド
はＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活
性を促進させ、一方で、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、
内皮プロコアギュラント誘導、そしてＴＮＦの受容体結
合活性を阻害することを特徴とするものである。
【００４３】本発明の第二十四の発明は、ヒトＴＮＦに
結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、Ｔ
ＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、Ｔ
ＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント誘
導、そして受容体結合活性を阻害し、このＴＮＦへのリ
ガンドの結合は、残基１-２０および７６-９０からなる
トポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピ
トープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドへ結合
するのを遮ぎる事を特徴とするものである。
【００４４】本発明の第二十五の発明は、残基１-２０
および７６-９０からなるトポグラフイック領域におい
てヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものである。
これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似す
る。そしてトポグラフイックに第２９図に示した。
【００４５】本発明の第二十五の発明の好適な実施態様
では、リガンドは残基１-２８および７６-９０からなる
トポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結合する。
【００４６】本発明の第二十三、第二十四および第二十
五の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ２１
と命名されたモノクローン抗体である。このＭＡｂ２１
を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英
国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, Un
ited Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブア
ニマルセルカルチャーズ（European Collection of Ani
mal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所
（Vaccine Research and Production Laboratory）、公
衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laborator
y Service）、応用微生物学研究センター（Centre for
Applied Microbiology and Research）へ１９９０年１
月２５日に寄託され、その登録番号は９００１２４３２
である。
【００４７】本発明の第２６の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮ
Ｆの腫瘍フイブリン沈着活性には影響が及ばず、しかし
ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント
誘導活性、そして受容体結合活性が阻害されることを特
徴とするものである。
【００４８】本発明の第２７の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮ
Ｆの腫瘍フイブリン沈着活性には影響せず、ＴＮＦの細
胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント誘導、そし
て受容体結合活性が阻害され、このＴＮＦへのリガンド
の結合は、残基２２-４０、６９-９７、１０５-１２
８、そして１３５-１５５からなるトポグラフイック領
域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自
然発生的な生物学的リガンドへ結合するのを遮ぎるもの
である事を特徴とする。
【００４９】本発明の第二十八の発明は、残基２２-４
０、６９-９７、１０５-１２８、そして１３５-１５５
からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結
合するリガンドからなるものである。これらの領域は、
ＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する。そしてトポグラ
フイックに第３０図に示した。
【００５０】本発明の第二十六、第二十七および第二十
八の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ５３
と命名されたモノクローン抗体である。このＭＡｂ５３
を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英
国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, Un
ited Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブア
ニマルセルカルチャーズ（European Collection of Ani
mal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所
（Vaccine Research and Production Laboratory）、公
衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laborator
y Service）、応用微生物学研究センター（Centre for
Applied Microbiology and Research）へ１９９０年１
月２５日に寄託され、その登録番号は９００１２４３３
である。
【００５１】本発明の第二十九の発明は、ヒトＴＮＦに
結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、Ｔ
ＮＦの腫瘍フイブリン沈着、内皮プロコアギュラント誘
導、細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性は影響
されない事を特徴とするものである。
【００５２】本発明の第三十の発明は、ヒトＴＮＦに結
合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮ
Ｆの腫瘍フイブリン沈着、内皮プロコアギュラント誘
導、細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性は影響
されず、このＴＮＦへのリガンドの結合は、残基２２-
３１および１４６-１５７からなるトポグラフイック領
域によって規定されるＴＮＦのエピトープが、実質的に
自然発生的な生物学的リガンドへ結合することを遮ぎる
ものである事を特徴とする。
【００５３】本発明の第三十一の発明は、残基２２-３
１および１４６-１５７からなるトポグラフイック領域
においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるもので
ある。これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近
似する。そしてトポグラフイックに第３１図に示した。
【００５４】本発明の第二十九、第三十および第三十一
の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ３７と
命名されたモノクローン抗体である。このＭＡｂ５３を
産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国
（Porton Down, Salisbury,Wilthshire SP4 OJG, Unite
d Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニ
マルセルカルチャーズ（European Collection of Anima
l Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所
（Vaccine Research and Production Laboratory）、公
衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laborator
y Service）、応用微生物学研究センター（Centre for
Applied Microbiology and Research）へ１９８９年８
月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０３で
ある。
【００５５】本発明の第三十二の発明は、ヒトＴＮＦに
結合するリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮ
Ｆの内皮プロコアギュラント誘導活性は影響されず、一
方で、細胞毒性、腫瘍退行、腫瘍フイブリン沈着、そし
てＴＮＦの受容体結合活性を阻害することを特徴とす
る。
【００５６】本発明の第三十三の発明は、ヒトＴＮＦに
結合可能なリガンドであって、このリガンドはＴＮＦに
結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導は影
響されず、一方、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、腫瘍フ
イブリン沈着、そして受容体結合活性は阻害され、この
ＴＮＦへのリガンドの結合は、残基２２-４０および４
９-９８からなるトポグラフイック領域によって規定さ
れるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学
的リガンドへ結合するのを遮ぎる物であることを特徴と
する。
【００５７】本発明の第三十四の発明は、残基２２-４
０からなるトポグラフイック領域、残基４９-９８から
なるトポグラフイック領域、そして残基６９-９７から
なるトポグラフイック領域からなる群から選択される少
なくともひとつの領域においてヒトＴＮＦに結合するリ
ガンドからなるものである。
【００５８】本発明の第三十四の発明の好適な実施態様
では、リガンドは残基４９-９８からなるトポグラフイ
ック領域においてヒトＴＮＦと結合する。この領域は、
トポグラフイックに第３２図に示した。
【００５９】本発明の第三十四の発明のより好適な実施
態様では、リガンドは残基２２-４０および７０-８７か
らなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合
する。この領域は、ＴＮＦの３Ｄ構造に近似し、トポグ
ラフイックに第３２図に示されている。
【００６０】本発明の第三十二、第三十三および第三十
四の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ１１
またはＭＡｂ１２と命名されたモノクローン抗体であ
る。
【００６１】本発明の第三十五の発明は、ヒトＴＮＦに
結合することが可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合
すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性を阻
害する事を特徴とする。
【００６２】本発明の第三十六の発明は、ヒトＴＮＦに
結合することが可能なリガンドからなるものであって、
ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント
誘導を阻害し、ＴＮＦへのリガンドの結合は、残基１０
８-１２８からなるトポグラフイック領域によって規定
されるＴＮＦのエピトープが、実質的に自然発生的な生
物学的リガンドへ結合するのを遮ぎるものである事を特
徴とする。
【００６３】本発明の第三十七の発明は、残基１０８-
１２８からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮ
Ｆへ結合するリガンドからなる。
【００６４】本発明の第三十五、第三十六および第三十
七の発明の好適な実施態様では、リガンドは、ＭＡｂ
１、ＭＡｂ３２、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５３
そしてＭＡｂ５４と命名されたモノクローナル抗体から
なる群から選択されるリガンドである。
【００６５】ここで述べられているＴＮＦの生物学的活
性は、「腫瘍退行」、「内皮プロコアギュラント」「腫
瘍フイブリン沈着誘導」、「細胞毒性」、そして「受容
体結合」という用語の意味は下記の方法によって決定さ
れる。
【００６６】「単一ドメイン抗体」という用語は、ワー
ドらの文献（Nature 341, 544-546,1989）に開示された
ような抗体断片を意味するように使用される。本発明を
より一層明らかにするために、好ましい態様を下記の実
施例と添付された図面をもとにして記載する。
【００６７】動物および腫瘍細胞系統 すべての実験において用いられたマウスは、ＣＳＩＲＯ
動物施設から入手した生後１０-１２週間の雌でＢＡＬ
Ｂ／Ｃ系統のマウスである。ＭｅｔｈＡ固形腫瘍および
ＭｅｔｈＡ腹水腫瘍の細胞株は、オルド博士（Dr. Lloy
d J. Old, Sloan Kettering Cancer Centre）に提供し
て頂いた。また、ＷＥＨＩ-１６４繊維肉腫系統は、チ
ャウドリ博士（Dr. Geeta Chauhdri, John Curtin Scho
ol of Medical Research, Autralian National Univers
ity）に提供して頂いた。
【００６８】ハイブリドーマの融合と産生 完全フロイトアジュバント中の１０μｇのヒト組換え体
ＴＮＦをマウスの腹腔内に注入してマウスを免疫した。
その一ヶ月後に、完全フロイントアジュバントに中の１
０μｇのＴＮＦを投与した。六週間後および融合四日前
に、ＰＢＳ中の１０μｇのＴＮＦでマウスをブーストし
た。免疫されたマウスから得た脾臓細胞をラスジェンと
アンダーウッドの方法（Rathjen & Underwood, Mol. Im
munol. 23, 441. 1986）にもとづいてミエローマｓｐ２
／０と融合させた。ラジオイムノアッセイによって抗Ｔ
ＮＦ抗体を産生することが判明した細胞系統をマウス腹
腔マクロファージからなる支持細胞層（feeder layer）
上で限界希釈によりサブクローン化した。さらに、抗体
のサブクラスは、ＥＬＩＳＡ（Misotest, Commonwealth
Serum Laboratories）によって決定した。
【００６９】ラジオイムノアッセイ 標準的な方法によってラクトぺルオキシダーゼを用いて
ＴＮＦをヨウ素化した。ハイブリドーマの培地の上清
（５０μｌ）を125Ｉ-ＴＮＦ（20,000 cpm/50ul）とと
もに一晩、４℃でインキュベートとした。そして、１０
０μｌのＳａｃ-Ｃｅｌ（ロバ抗マウス／ラット免疫グ
ロブリン被覆セルロース，Wellcome Diagnositics）を
添加し、さらに室温（２０℃）で２０分間インキュベー
トした。このインキュベーションに続いて、１ｍｌのＰ
ＢＳを添加し、そして試験管を２，５００ｒｐｍで５分
間遠心した。この遠心後、上清をデカントして、沈澱物
の放射活性を測定した。
【００７０】抗体-抗体拮抗アッセイ モノクローン抗体間の特性比較を行なうために、固定化
抗原（ＬＡＣＴ）または抗体（ＰＡＣＴ）のどちらか一
方を用いて拮抗アッセイを行なった（Aston &Ivanyi, 1
985, Pharmac. Therapeut. 27, 403）。
【００７１】ＰＡＣＴ １％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）
によって非特異的結合部位をブロックするのに先立っ
て、フレキシブルなマイクロタイタートレーを、モノク
ローン抗体（マウス腹水から得られた硫酸ナトリウム沈
澱グロブリンを100μｇ／mlで含む重炭酸ナトリウム緩
衝液、0.05M、pH9.6）で一晩、４℃で静置してコートし
た。固定された抗体への125Ｉ-ＴＮＦの結合は、種々の
濃度の二次抗ＴＮＦモノクローン抗体存在下で決定し
た。抗体およびＴＮＦは同時に添加され、そしてＰＢＳ
（４回）による洗浄に先立って２４時間インキュベート
された。そして、ウエルの結合放射活性を測定した。１
００％結合は、異種のモノクローン抗体の非存在下で決
定され、一方１００％拮抗は、過剰な同種のモノクロー
ン抗体存在下で決定された。すべての希釈はＢＳＡ／Ｐ
ＢＳにて行なった。
【００７２】ＬＡＣＴ プロテインＡで精製済み、且つ放射能で標識したモノク
ローン抗体の、ＴＮＦ被覆マイクロタイターウエルへの
結合は、種々の濃度の二次モノクローン抗体存在下で決
定した。マイクロタイタープレートは前記のようにして
ＴＮＦ（５０μｇ／ｍｌ）がコートされている。125Ｉ-
モノクローン抗体（３０，０００ｃｐｍ）を添加して２
４時間保つ前に、拮抗する抗体（５０μｌ）をプレート
上で４時間、４℃でプレインキュベートした。ウエルに
結合した放射能の測定は、ＰＢＳでウエルを４回洗った
後に行なった。１００％結合は、拮抗する抗体の非存在
下で決定され、一方１００％拮抗は、過剰の未標識モノ
クローン抗体存在下で決定された。
【００７３】ＷＥＨＩ-１６４細胞毒性試験 組換えＴＮＦ活性のバイオアッセイをエスペヴィックと
ニッセンマイヤーの方法（Espevik & Nissen-Meyer, J.
Immunol. Methods 95, 99. 1986）にもとづいて実施し
た。ＴＮＦ活性に対するモノクローン抗体の効果は、Ａ
ＢＴ９０にある細胞培養へモノクローン抗体を添加する
ことによって決定した。
【００７４】腫瘍退行実験 モノクローン抗体によるＴＮＦ誘導性腫瘍退行の変化を
３種類の腫瘍モデルを用いて実施した。すなわち、３種
類の腫瘍モデルは、皮下腫瘍ＷＥＨＩ-１６４、Ｍｅｔ
ｈＡサルコーマ、そして腹水ＭｅｔｈＡ腫瘍である。皮
下腫瘍は、約５Ｘ１０5細胞を注射することによって誘
導された。これによって約１４日後に１０-１５ｍｍの
腫瘍が形成された。マウスの腹腔に、ヒト組換えＴＮＦ
（１０μｇ）と、モノクローン抗体（２００μｌ腹水グ
ロブリン）とを４日間つづけて注射した。対照群は、Ｐ
ＢＳのみ、あるいはＴＮＦと牛ウシ成長ホルモンに対す
るモノクローン抗体とを注射した。それぞれの実験の開
始時には、固形腫瘍の場合にはカリパスで腫瘍サイズ
を、そして腹水症マウスの場合には体重を測定した。こ
れらの測定は実験中、日々実施された。
【００７５】ラジオレセプターアッセイ コンフルエントに増殖したＷＥＨＩ-１６４細胞を培地
から回収し、１％ＢＳＡ含有ハンク平衡塩溶液（Hank's
balanced salt solution, HBSS, Gibco）で１回洗浄し
た。１００μｌの未標識ＴＮＦ（1-10,000ng/試験管）
またはモノクローン抗体（10倍希釈液シリーズ、腹水グ
ロブリンで１対１０ないし１対１００，０００）を５０
μｌの125Ｉ-ＴＮＦ（50,000cpm）へ添加した。その
後、ＷＥＩ-１６４細胞を添加した（2 X 106細胞を含む
200μｌ）。この混合物を振とうウオーターバスで３７
℃、３時間インキュベーションした。このインキュベー
ションの終了時に、１ｍｌのＨＢＳＳを添加し、そして
細胞を16,000rpm、３０秒の遠心処理した。上清を捨て
て、細胞沈澱物に結合した125Ｉ-ＴＮＦを測定した。す
べての希釈は、１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで行なった。
【００７６】内皮細胞でのＴＮＦによるプロコアギュラ
ント誘導 ウシ大動脈内皮細胞（継代１０）を、３７℃、５％ＣＯ
2の条件下で10%ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン、
ストレプトマイシン、そして２-メルカプトエタノール
を含むRPMI-1640中で増殖させた。ＴＮＦによるプロコ
アギュラント誘導活性のために、細胞をトリプシン処理
し、そして２４穴（ウエル）コスタートレイに播種した
（Bevilacqua et al., PNAS 83, 4533, 1986によるプロ
トコール）。ＨＢＳＳで、コンフルエントな細胞単層を
洗浄した後にＴＮＦ（0-500単位／培養）と、モノクロ
ーン抗体（希釈は、腹水グロブリン１：２５０に）とを
添加した。４時間後、細胞を回収して凍結し、ソニケー
ション処理した。全体の細胞プロコアギュラント活性
を、３７℃で正常なドナー血小板・血漿欠乏（normaldo
nor platelet-poor plasma）のリカルシフイケーション
（recalcification）時間によって決定した。100μｌの
クエン酸処理済 (citrated)血小板欠乏血漿を、100μｌ
の塩化カルシウム（30mM）と100μｌの細胞ライセート
に添加し、クロット（血ぺい）形成時間を記録した。い
くつかの実験では、腫瘍細胞培養の上清をＴＮＦおよび
（または）モノクローン抗体（最終濃度２対１）によっ
て処理された内皮細胞に添加した。
【００７７】ＴＮＦおよびモノクローン抗体によって処
理されたマウスへの125Ｉフイブリノーゲンの取り込み インビボ系でのフイブリン形成に対するモノクローン抗
体とＴＮＦとの効果について試験するために、BALB/cマ
ウスの皮下にWEHI-164細胞（105細胞／動物）を注射し
た。７-１４日後、腫瘍の直径が約１cmに達した時点
で、動物の腹腔内に、ＴＮＦ（10ug/動物）および125Ｉ
-ヒトフイブリノーゲン（7.5ug/動物、122μCi/mg，Ame
rsham）を、単独で、あるいはヒトＴＮＦに対するモノ
クローン抗体（200μｌ／動物腹水グロブリン）ととも
に注射した。ウシ成長ホルモンに対するモノクローン抗
体は、対照用のモノクローン抗体として用いられた。Ｔ
ＮＦの注入２時間後、マウスの組織への125Ｉ-フイブリ
ノーゲンの取り込みを、組織片を除去して試料とし、そ
の重量を測定し、そしてガンマカウンターで試料の放射
能を測定した。
【００７８】ヒトＴＮＦと反応する１３種類のモノクロ
ーン抗体が単離された。これらのモノクローン抗体は、
それぞれＭＡｂ１、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ２
０、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２５、ＭＡｂ３１、ＭＡｂ３
２、ＭＡｂ３７、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５
３、そしてＭＡｂ５４と定められた。ヒトＴＮＦ生物活
性に対するこれらのモノクローン抗体の効果を第２表に
示した。
【００７９】第２表から明らかなように、いくつかのモ
ノクローン抗体は、ヒトＴＮＦにより、凝固活性及び抗
腫瘍活性を阻害したが（ＭＡｂ１、４７および５４）、
すべての抗腫瘍活性を阻害するすべての抗体が、インビ
ボおよびインビトロで凝固活性を阻害したわけではない
（ＭＡｂ１１、１２、２５および５３）。実際、腫瘍退
行を阻害するＭＡｂ２１はインビボで凝固活性化を促進
させた。
【００８０】
【表１】
【００８１】ＴＮＦ上のエピトープを分かち合うための
拮抗的結合についてのテストで示されたＭＡｂ１、４７
および５４は、ＴＮＦの完全中和に必要とされる高いＴ
ＮＦレベルである中毒ショックおよび他の細菌、ウイル
スおよび寄生虫感染の状態を治癒する上で要求される特
徴を備えている。ＭＡｂ３２のような他のモノクローン
抗体は、癌治療の際にＴＮＦと一緒に投与されることが
好ましい。なぜなら、腫瘍退行を阻害しないが、凝固を
阻害するからである。このような治療方法は、ＴＮＦに
よる凝集活性を促すような癌治療に用いられる細胞毒性
剤（cytotoxicdrugs）と組み合わせる場合に特に指摘さ
れる（例えば、ビンブラスチン、アシクロビル（acyclo
vir）、ＩＦＮアルファ、ＩＬ-２、アクチノマイシン
Ｄ、ＡＺＴ、ラジオセラピイ、アドリアミシン、マイト
マイシンＣ、シトシンアラビノシド、ドウノルビシン
（dounorubicin）、シス・プラチン、ビンクリスチン、
５-フルオロウラシル、ブレオマイシン（Watanabe N et
al. 1988. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 10 117-
127）、またはＴＮＦレベルが低い段階の疾患（例えば
免疫不全症候群）および癌、例えばカポジサルコーマ、
ノンホジキンズリンホーマおよびスクアマウスセルカル
シノーマ（squamous cell carcinoma）に関連した免疫
不全症候群を有する患者）。
【００８２】モノクローン抗体ＭＡｂ１は、以下の特徴
を有することがわかった。 １．ヒト組換え体ＴＮＦアルファと結合する。しかし、
ヒトリンパ毒（ＴＮＦベータ）またはヒトインターフェ
ロンとは結合しない。同様にＭＡｂ１は、組換え体マウ
スＴＮＦ（第１図）と交差反応しない。 ２．ＭＡｂ１は免疫グロブリン型がＩｇＧ１、Ｋであ
る。親和性は約４，４Ｘ１０-9モル／リットルである
（第２図）。 ３．ＭＡｂは、培養中のWEHI-164マウスフイブロサルコ
ーマ細胞上の組換え体ヒトＴＮＦの細胞毒性効果を中和
する。インビトロ系で１μｇのＭＡｂ１は、約１５６．
２５単位のＴＮＦを中和する（第３図）。 ４．ＭＡｂ１は、インビボ系で下記のマウス腫瘍モデ
ル：WEHI-164皮下ソリッド腫瘍（subcutaneous solid t
umour）、Meth A 皮下ソリッド腫瘍、そしてMeth A腹水
症腫瘍（ascites tumour）においてＴＮＦの腫瘍退行活
性を中和する（第４図、第５図および第９図）。 ５．ＭＡｂ１は、マラリア病原虫に感染したマウスにお
いて、ヒトＴＮＦによって引き起こされる大脳損傷を抑
える。 ６．ラジオリセプターアッセイにおいて、ＭＡｂ１は、
WEHI-164上にある受容体（レセプター）へのＴＮＦの
結合を抑える（第３表）。 ７．ＭＡｂ１は、ウシ大動脈内皮培養細胞上のプロコア
ギュラント誘導活性（組織因子）を阻害する（第６
図）。 ８．ＭＡｂ１は、ＴＮＦ処理されたマウスの腫瘍への12
5Ｉフイブリノーゲン取り込みを減少させる（第７
図）。 ９．ＭＡｂ１は、125Ｉ-ＴＮＦの結合に対して拮抗す
る。したがって下記のモノクローン抗体：２１、２５、
３２、４７、５４、そして３７と、オーバラッピングし
たエピトープを分かち合う。 １０．ＭＡｂ１は、下記のモノクローン抗体：１１、１
２、４２、５３、３１、そして２０と、125Ｉ-ＴＮＦの
結合に対して拮抗しない（第８図）。
【００８３】
【表２】
【００８４】ＭＡｂ３２は、ＩｎＧ２ｂ，Ｋ抗体で、ヒ
トＴＮＦアルファに対する親和性はスキャッチャード分
析よれば、８．７７Ｘ１０-9moles/lである。しかし、
このモノクローン抗体は、ヒトＴＮＦベータ（リンパ毒
（lymphotoxin））やマウスＴＮＦアルファとは反応し
ない。
【００８５】第３図に示したように、ＭＡｂ３２は、イ
ンビトロ系でのWEHI-164アッセイの結果によれば、ＴＮ
Ｆ細胞毒性を阻害しない。
【００８６】モノクローン抗体３２は、ＴＮＦ投与量が
１０μｇ／日であるBALB/cマウスに皮下経由で移植され
た、腫瘍であるWEHI-164繊維肉腫に対するＴＮＦ誘導腫
瘍退行活性を不安定に抑制する（第１０図および第１１
図を見よ）。このような特徴は、ＴＮＦに対して生じた
すべての抗体に当てはまるわけではなく（第９図）、受
容体を介した腫瘍細胞へのＴＮＦ取込み増大を許すＭＡ
ｂ３２に特異的な結合部位に当てはまる（第８図、第４
表）。
【００８７】
【表３】
【００８８】ＴＮＦ投与量が低いときのＭＡｂ３２によ
るＴＮＦ活性の促進とは、少なくとも１０分の１以下の
ＴＮＦが、同程度の腫瘍退行を達成するのに必要とされ
ることである（第１１図および第１８図参照）。結果
は、１日目(day 1)では２．５μｇおよび１μｇＴＮＦ
と、２日目（day 2）では５μｇ、２．５μｇと１μｇ
であった。統計学的違いは、ｔ検定でｐ＜０．０１であ
った。このようなＴＮＦ活性増大の程度は、またレシピ
エントの生存率を上げることになる。なぜなら、低濃度
のＴＮＦを使用するので毒性効果が生じることはない。
第１９図は、ＭＡｂ３２の単一の価からなるＦａｂ断片
が、ＭＡｂ３２全体と同様にしてＴＮＦ誘導腫瘍退行を
促進させることを示している（下記参照）。
【００８９】ＭＡｂ３２は、ＴＮＦと培養細胞とをイン
キュベーションすることによって正常に誘導される内皮
細胞の凝固因子（clotting factors）発現を阻害する
（第６図）。この応答は、事前に同定されていないＴＮ
Ｆ受容体によって媒介されるものであるが、これは、他
の細胞で発見された受容体と異なるものである。
【００９０】逆に言えば、ＭＡｂ３２は、放射性同位元
素で標識されたフイブリノーゲンの取り込みによって示
されるような腫瘍床内での凝固のインビボ系での活性化
を促進させる（第７図）。このことは、単球／マクロフ
ァージ・プロコアギュラントの活性化にもとづくもので
あり、さらにＴＮＦによって誘導される腫瘍退行の機構
を明らかにすることを可能とするものであろう。
【００９１】ＭＡｂ３２を用いた実験で得られた結果
を、第２表において他のものと比較した。
【００９２】内皮細胞に対するＴＮＦの結合を阻害する
能力について、ＭＡｂ３２とＭＡｂ４７ともアッセイし
た。
【００９３】ウシ大動脈内皮細胞(BAE)（継代１１）を
２４穴の培養皿（コーニング社製）に播種した。この培
養皿の各ウエルには事前にゲラチン（0.2%）をコートし
ておいた。また、20%ウシ胎児血清を含むマッコイ５Ａ
（修飾）メジウム中でコンフルエントとなるように増殖
させた。このメジウムは、ラジオイムノアッセイにおけ
る希釈溶液（未標識ＴＮＦおよびＭＡｂ）としても用い
られた。ＢＡＥ細胞を未標識ＴＮＦ（0-100ng）または
ＭＡｂ（1/100-1/100,000）に希釈された腹水グロブリ
ン）と、ヨウ素化ＴＮＦ（50,000cpm）との存在下にお
いて１時間インキュベートした。この時間が経過した
後、メジウムを捨てて、細胞を洗った。その後、細胞を
１Ｍの水酸化ナトリウムで溶解した。溶解された細胞を
結合放射性ＴＮＦについてを測定し、細胞に特異的に結
合した標識ＴＮＦを決定した。
【００９４】ＭＡｂ３２、ＭＡｂ４７、そして対照のＭ
Ａｂに関するのアッセイで得られた結果は、第１２図に
示した。
【００９５】ＴＮＦおよび抗ＴＮＦモノクローン抗体存
在下で培養されたＢＡＥ細胞を用いた凝固（血ぺい形
成；クロッテイング）アッセイにおいて得られた結果
は、ＢＡＥラジオレセプターアッセイで得られた結果と
関係している。すなわち、内皮細胞の表面上への凝固因
子誘導を阻害するモノクローン抗体は、またＴＮＦがそ
の受容体へ結合することも阻害する（ＴＮＦ単独の場合
と比較して凝固時間が増加する）。これは、ＭＡｂ３２
および４７によって示される。
【００９６】WEHI-164細胞へのＴＮＦ結合を阻害しない
ＭＡｂ３２は、内皮細胞へのＴＮＦ結合を阻害しない。
このような結果は、ＴＮＦ分子上に異なる機能部位が存
在していること、またこのような部位が異なる細胞型の
異なる受容体サブ集団と相互作用するというよいうな仮
説を支持するものとなる。したがって、ＴＮＦの規定さ
れた領域に結合するリガンドは、特定の受容体サブタイ
プへ結合することを限定することによってＴＮＦの生物
学的活性を修飾する。
【００９７】第１２図に示すように、ＭＡｂ４７は、内
皮細胞に作用するＴＮＦの特に強力な阻害剤であって、
１／１００ないし１／１０，０００希釈での特異的結合
の率は、事実上ゼロである。
【００９８】インビトロ系での、ヒトカルシノーマ細胞
上のＭＡｂ３２と複合体を形成するヒトＴＮＦに関する
受容体結合実験 ＭＡｂ３２は、ヒトＴＮＦの抗腫瘍活性を促進させるこ
とが示されている。この促進効果に隠されているメカニ
ズムには、特定の（腫瘍）受容体サブタイプに対するＴ
ＮＦの結合を制限することが含まれるが、非腫瘍細胞に
対するＴＮＦ毒性が続いて減少する他のもの（内皮）は
含まれない。このメカニズムは、インビトロ系におい
て、腫瘍細胞によるＴＮＦの取り込みを促進させること
は必要ではない。また、ＭＡｂ３２は、ある種のヒトカ
ルシノーマ細胞系上のＴＮＦ受容体に対するヒトＴＮＦ
の直接的結合を可能とさせる。
【００９９】材料と方法 下記のヒトカルシノーマ細胞系統を用いて、ＭＡｂ３２
存在下におけるＴＮＦによる受容体媒介取り込み促進に
ついてアッセイした。
【０１００】ヒトカルシノーマ細胞系統：Ｂ１０、Ｃａ
Ｃｏ、ＨＴ２９、ＳＫＣ０１（これらは結腸カルシノー
マ）、５６３７（膀胱カルシノーマ）、ＭＭ４１８Ｅ
（メラノーマ）、ＩＧＲ３（メラノーマ）、そして Ｍ
ＣＦ（胸部カルシノーマ）。
【０１０１】細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシンリ
ン／ストレプトマイシン、そしてＬ-グルタミンを添加
したＲＰＭＩ-１６４０（ＭＭ４１８Ｅ）、ＤＭＥＭ
（ＣａＣｏおよびＩＧＲ３）またはイスコーブ修飾ＤＭ
ＥＭ（Ｂ１０、ＨＴ２９、ＳＫ０１、Ｓ６３７、ＭＣＦ
７）のどれかによって増殖させた。受容体アッセイは、
既に知られている内皮細胞に対する方法にもとづいて行
なったが、以下の点を変えた。すなわち、ヨウ素化ＴＮ
Ｆとのインキュベーション時間を３時間まで延長した。
例外として、Ｂ１０の場合はインキュベーション時間を
１時間とした。
【０１０２】結果 メラノーマ細胞系統ＭＭ４１８ＥおよびＩＧＲ３（第１
３図および第１４図）、膀胱カルシノーマ５６３７（第
１５図）、そして胸部カルシノーマＭＣＦ７（第１６
図）によって、ＭＡｂ３２存在下において、ＴＮＦ取り
込み促進が観察された。ＭＡｂ３２は、Ｂ１０（第１７
図）によって示されるような他の細胞系統においてＴＮ
Ｆ受容体相互作用に対してなんら影響を与えなかった。
ＭＡｂ４７は、ＷＥＨＩ-１６４細胞および内皮細胞へ
のＴＮＦ結合を阻害し、またＴＮＦ媒介腫瘍退行を阻害
するが、これはＴＮＦ媒介腫瘍退行を、試験したすべて
の細胞系統において、顕著にＴＮＦ結合を阻害すること
が観察された（第１３図-第１７図）。
【０１０３】結論 受容体結合実験によれば、ＴＮＦの抗腫瘍活性を高める
ような役割をＭＡｂ３２が有するというような第二の機
構が存在することを示す。ＴＮＦの働きを高めるこの第
二の経路は、ＭＡｂ３２の存在下での腫瘍全受容体によ
るＴＮＦの取り込み増加にもとづくものである。
【０１０４】ＷＥＨＩ-１６４皮下腫瘍を有するマウス
（Ｎ＝５動物／群）を用いて、上記方法にもとづいて腫
瘍退行を調べた。腫瘍の大きさは、実験継続期間中、毎
日測定した。ＭＡｂ３２を用いて得られた結果は、第２
２図に示した。その結果によれば、処理完了時点（２日
目； day 2）で、腫瘍領域の平均＋／-ＳＤ％の変化を
示した。対照ＭＡｂ-ＴＮＦ処理群と、ＭＡｂ３２-ＴＮ
Ｆ処理群との間に認められる違いは、統計学的に顕著で
あった（ｔ検定 ｐ＜０．０１レベル）。
【０１０５】ＭＡｂ３２の一価ＦＡｂ’断片を用いた結
果は、第１９図に示されている。腫瘍の大きさは、実験
継続期間中、毎日測定した。処理完了時点（２日目；
day 2）で、腫瘍領域の平均＋／-ＳＤ％の変化を示し
た。 対照ＭＡｂ-１０Ｆ処理群と、ＭＡｂ３２-ＴＮＦ
処理群との間に認められる違いは、統計学的に顕著であ
った（ｔ検定 ｐ＜０．０１レベル）。
【０１０６】ＴＮＦ誘導腫瘍退行：抗ペプチド３０１血
清の効果 第２０図は、ＴＮＦ＋対照ＭＡｂ（ウシ成長ホルモンに
対する抗体）、ＴＮＦ＋ＭＡｂ３２、あるいはＴＮＦ＋
抗ぺプチド３０１血清（グロブリン分画）によって３日
間処理された腫瘍を有するマウスにおける腫瘍領域の変
化率を示すものである。対となっていない（unpaired）
ｔ-検定において、対照群は、試験群（ＭＡｂ３２、抗
血清３０１）の両方と顕著に異なった。一方、ＭＡｂ３
２とペプチド抗血清３０１群とは、互いに顕著な違いが
認められなかった。（対照群対ＭＡｂ３２、ｐ＜０．０
０２； 対照群対抗ペプチド３０１、ｐ＜０．０２
５）。したがって、ＭＡｂ３２の特異性を有する部分を
含むペプチドを用いて調製した抗血清は、ＴＮＦの腫瘍
退行促進も引き起こさせる。
【０１０７】第９図に示すように、拮抗（競合）結合実
験によって１３種類のモノクローン抗体が２つのメイン
グループに分類された。すなわち、ＭＡｂ１、２１、４
７、５４、３７、３２、そして２５のグループと、ＭＡ
ｂ１１、１２、５３、そして４２のグループである。よ
って、つぎの実験は、これらのモノクローン抗体によっ
て認識されたヒトＴＮＦ上の領域を同定することであ
る。
【０１０８】モノクローン抗体により認識される、ヒト
ＴＮＦ上の領域の同定 １．７ないし１０個のアミノ酸配列程度の長さからなる
重なり合ったペプチドは、ゲイセンらの方法（Geysen e
t al., 1984, PNAS 81, 3998-4002）にもとづいてポリ
プロピレン・ピン上で合成された。重なり合いはそれぞ
れ６残基および９残基のもので、ペプチドは全体で全Ｔ
ＮＦアミノ酸配列を覆っている。このペプチドは、ＥＬ
ＩＳＡによってＭＡｂとの反応性が調べられた。全ＴＮ
Ｆと事前のインキュベーションによってＴＮＦ反応性が
吸収されたＭＡｂもまた、ペプチドとの反応性について
調べられ、そして負の対照群として作用した。
【０１０９】２．ＴＮＦの長めのペプチドは、下記の通
りに合成された。このペプチドは、下記のプロトコール
にもとづいてヒツジから抗血清を調製するのに用いられ
た。オバルブミンにコンジュゲートされ、完全フロイン
ドアジュバント中に乳濁化されたＴＮＦペプチドによっ
て一次接種されたメリノヒツジ（Merino sheep）に、４
週間の間隔で、ペプチド・オボアルブミンでブースト
し、ラジオイムノアッセイにより、抗ＴＮＦ抗体の存在
をアッセイした。その結果、ペプチド２７５、３０１、
３０５、３０６、そして３０７のみが全ＴＮＦと反応す
る血清から得られた。よって、陽性血清をＭＡｂとの拮
抗結合アッセイ（PACTアッセイ）に用いた。
【０１１０】下記のペプチドが合成された。これらのペ
プチドは、それぞれのアミノ酸を表わすために従来の３
文字コードを用いた。ＴＮＦ配列領域は括弧で示した。 「配列表１」 ペプチド２７５ H-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-OH (111-
120) ペプチド３０１ H-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-
Val-Ala-His-Val-Val-Ala-OH (1-18) ペプチド３０２ H-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-
Leu-Tyr-Leu-Ile-OH (43-58) ペプチド３０４ H-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-
Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-OH (63-83) ペプチド３０５ H-Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-
Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln-Val-OH (132-150) ペプチド３０６ H-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-
Gln-Leu-OH (13-26) ペプチド３０７ H-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Ala-
Asn-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-OH (22-40) ペプチド３０８ H-Gly-Leu-Tyr-Leu-Ile-Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-
Gly-Gln-Gly-OH (54-68) ペプチド３０９ H-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-
Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-COOH (73-9
4) ペプチド３２３ H-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-OH
(79-89)
【０１１１】これらのペプチドは、下記の一般的なプロ
トコールにしたがって合成された。すべてのペプチド
は、固相ペプチド合成法であるＦｍｏｃ-ポリアミノ法
（Atherton et al., 1978, J. Chem. Soc. Chem. Commu
n., 13, 537-539）によって合成された。用いられた固
形樹脂は、ペプシン(PepSyn)ＫＡであって、４-ヒドロ
キシメチルフェノキシ酢酸を官能化リンカーとして用い
たキエセルグール支持体（Kieselguhr support）上のポ
リジメチルアクリルアミドゲルである（Athertonet al.
1975, J. Am. Chem. Soc. 97, 6584-6585）。
【０１１２】カルボキシル末端のアミノ酸は、ＤＣＣ／
ＤＭＡＰメジエーテッド・シンメトリカル・アンヒドリ
ド・エスエリフィケーション（DCC/DMAP-mediated symm
etrical-anhydride esterification）によって固体支持
体に結合する。
【０１１３】すべてのＦｍｏｃ基は、ピペリジン／ＤＭ
Ｆ洗浄によって除去され、またペプチド結合はペンタフ
ルオロフェニル活性エステルを介して、あるいは直接的
にＢＯＰ／ＮＭＭ／ＨＯＢｔ（カストロ試薬）（Fourni
er et al., 1989. Int. J. Peptide Protein Res., 33,
133-139）によって、第５表に示したあるアミノ酸を除
き形成された。
【０１１４】アミノ酸に対して選ばれる側鎖保護は、合
成後に残される、システイン上のＡｃｍを除き、クリー
ビング（cleavage）中に付随的に除去された。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】開裂と精製 ペプチド３０１、３０２、３０５ は、９５％ＴＦＡお
よび５％チオアニソール（1.5h）によって樹脂からクリ
ービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1%
TFA水溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製さ
れた。
【０１１７】ペプチド３０３、３０４は、 ９５％ＴＦ
Ａおよび５％フェノール（5ー6 h）によって樹脂からク
リービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1
% TFA溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製さ
れた。
【０１１８】ペプチド３０６、３０８は、 ９５％ＴＦ
Ａおよび５％水（1.5 h）によって樹脂からクリービン
グされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶
液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１１９】ペプチド３０９は、 ９５％ＴＦＡおよび
５％チオアニソールによって樹脂からクリービングさ
れ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶液、
緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１２０】ペプチド３０７は、 ９３％ＴＦＡ、３．
１％アニソール、２．９７％エチルメチルスルフィド、
そして０．９５％エタンジチオールからなる混合物（3
h）によって樹脂からクリービングされ、そして逆相Ｃ
４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN
20% A）によって精製された。
【０１２１】結果 ７および１０量体（mers）を用いたモノクローン抗体Ｅ
ＬＩＳＡの典型的な結果を第２１図に示す。ヒツジ抗ペ
プチド血清（第６表参照）を用いたＰＡＣＴの結果とと
もに、ＴＮＦの下記領域は抗ＴＮＦモノクローン抗体の
結合部位を含む。
【０１２２】 ＭＡｂ１ ： 残基 1-18、 58-65、 115-125、138-149 ＭＡｂ１１ ： 残基 49-98 ＭＡｂ１２ ： 残基 22-40、 70-87 ＭＡｂ２１ ： 残基 1-18、 76-90 ＭＡｂ２５ ： 残基 12-22、36-45、96-105、 132-157 ＭＡｂ３２ ： 残基 1-26、 117-128、 141-153 ＭＡｂ３７ ： 残基 22-31、 146-157 ＭＡｂ４２ ： 残基 22-40、 49-96、 110-127、 136-153 ＭＡｂ４７ ： 残基 1-18、 108-128 ＭＡｂ５３ ： 残基 22-40、 69-97、 105-128、 135-155 ＭＡｂ５４ ： 残基 56-79、 110-127、 136-155
【０１２３】
【表５】
【０１２４】結論 各モノクローン抗体によって認識される領域のマッピン
グによって、グループＩ（ＭＡｂ１，２１，４７，５
４，３７，３２，そして２５）のモノクローン抗体は、
ＭＡｂ３７と５４とを除き、残基１-１８の領域におい
てＴＮＦと結合する。一方、グループＩＩ（ＭＡｂ１
１，１２，５３，そして４２）は、ＴＮＦ３次元構造の
いわゆるパリンドローム・ループを取り囲む残基７０-
９６の領域においてＴＮＦと結合する。内皮細胞プロコ
アギュラント誘導活性を阻害するモノクローン抗体（Ｍ
Ａｂ１，３２，４２，４７，５４，そして５３）はずべ
て、ＴＮＦ３次元構造のループ構造をふたたび取り囲む
残基１０８-１２８の領域においてＴＮＦと結合し、ま
たこの領域は内皮細胞上にはあるが、腫瘍細胞上にはな
いＴＮＦ受容体に作用する。インビボ系でＴＮＦの腫瘍
退行と抗ウイルス活性とを促進させるＭＡｂ３２は、残
基１-２６，１１７-１２８，そして１４１-１５３と関
係したループ領域のすべてに結合する唯一の抗体であ
る。したがって、これらの領域の結合は、正常細胞に対
する毒性の低減が生じ始めるのと同様に、ＴＮＦ生物学
的活性の促進にとって重要なものとなる。
【０１２５】第２表から明らかなように、ＭＡｂ１、４
７、そして５４はＴＮＦの生物学的活性に対して同一の
効果を示す。上記に示した結果から、これら３種類のモ
ノクローン抗体は、ＴＮＦ分子の類似領域へ結合する。
したがって、主に残基１-２０の領域、残基５６-７７の
領域、残基１０８-１２８の領域、そして残基１３８-１
４９の領域からなる群から選択される少なくとも２つの
領域においてＴＮＦに結合するリガンドは、ＭＡｂ１、
４７および５４と同様にしてＴＮＦの生物学的活性に対
する効果を示す。同様に、主に残基１-２０および７６-
９０からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンド
は、モノクローン抗体２１と同様に、ＴＮＦの生物学的
活性に対して効果を示す。主に残基２２-４０および６
９-９７からなる領域においてＴＮＦと結合するリガン
ドは、モノクローン抗体１２と同様に、ＴＮＦの生物学
的活性に対して効果を示す。主に残基１-３０、１１７-
１２８、そして１４１-１５３からなる領域においてＴ
ＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体３２と同
様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に
残基２２-４０、４９-９７、１１０-１２７、そして１
３６-１５３からなる領域においてＴＮＦと結合するリ
ガンドは、モノクローン抗体４２と同様に、ＴＮＦの生
物学的活性に対して効果を示す。主に２２-３１および
１４６-１５７からなる領域においてＴＮＦと結合する
リガンドは、モノクローン抗体３７と同様に、ＴＮＦの
生物学的活性に対して効果を示す。主に２２-４０、６
９-９７、１０５-１２８、そして１３５-１５５からな
る領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクロ
ーン抗体５３と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して
効果を示す。
【０１２６】本発明者は、以下のことをはっきりと示し
た。すなわち、ＴＮＦの生物学的活性は、ＴＮＦへのリ
ガンドの結合によって変更されてしまう。また、生物学
的活性への効果はリガンドの特異性の関数である。例え
ば、残基１-２６、１１７-１２８、１４１-１５３から
なる領域においてＴＮＦへのＭＡｂ３２の結合は、ＴＮ
Ｆの内皮プロコアギュラント活性の誘導を引き起こし、
また内皮細胞上の受容体に対するＴＮＦの結合は阻害さ
れた状態となり、ＴＮＦによる腫瘍退行活性および腫瘍
フイブリン沈着活性は促進された状態となる。細胞毒性
については何等影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体活
性は影響されないか、あるいは促進される。ＴＮＦの生
物学的活性に対するこのような効果は、ＭＡｂ３２によ
って認識されるＴＮＦのエピトープが自然発生的な生物
学的活性リガンドへの結合を妨害することによって起こ
る。したがって、ＭＡｂ３２によって作られた同様の効
果もまた、ＴＮＦの領域に結合するリガンドによって作
られ、ＭＡｂ３２によって認識されたエピトープは、自
然発生的な生物学的に活性なリガンドへの結合から阻害
される。この結合の妨害は、立体障害または他の機構に
よるものであろう。
【０１２７】したがって、本願に開示された種々のモノ
クローン抗体によって認識されるエピトープの、自然発
生的生物学的活性リガンドへの結合阻害は、本発明の範
囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図は、ＴＮＦに対するＭＡｂ１の滴定検
定の結果を示すものである。
【図２】 第２図は、ＴＮＦ ＭＡｂ１スキャッチャー
ドプロットと、親和性の測定とを示すものである。
【図３】 第３図は、ＷＥＨＩ-１６４細胞におけるＴ
ＮＦ毒性に対する抗ＴＮＦモノクローン抗体１および３
２の効果を示すものである。
【図４】 第４図は、ＴＮＦに誘導された、Ｍｅｔｈ
Ａ 固形（solid）腫瘍の退行に対するＭＡｂ１の効果
を示すものである。
【図５】 第５図は、ＴＮＦに誘導されたＭｅｔｈ Ａ
腹水腫瘍の退行に対するＭＡｂ１および２５の効果を
示すものである。
【図６】 第６図は、ＴＮＦによる内皮細胞プロコアギ
ュラント活性の誘導に対する抗ＴＮＦモノクローン抗体
の効果を示すものである。
【図７】 第７図は、腫瘍を有するマウスの腫瘍部へ
の、標識されたフイブリノーゲンの取り込み、及び抗Ｔ
ＮＦモノクローン抗体の効果を示すものである。
【図８】 第８図は、ＴＮＦのエピトープを概略的に説
明するための図である。
【図９】 第９図は、ＷＥＨＩ-１６４腫瘍のＴＮＦ誘
導性退行に対する抗ＴＮＦモノクローン抗体の効果を示
すものである。
【図１０】 第１０図は、２つの実験におけるＭＡｂ３
２によるＴＮＦ退行活性の促進を示すものである。
【図１１】 第１１図は、１日目および２日目のＭＡｂ
３２投与量応答によるＴＮＦ誘導性腫瘍退行の促進を示
すものである。
【図１２】 第１２図は、ウシ大動脈内皮細胞上の受容
体に対する、放射性標識ＴＮＦの結合を示すものであ
る。
【図１３】 第１３図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイ
を示すもので、このＴＮＦは、下記のものとメラノーマ
細胞系統ＭＭ４１８Ｅ上で複合体を形成して用いられ
た。
【図１４】 第１４図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイ
を示すもので、このＴＮＦは、下記のものとメラノーマ
細胞系統ＩＧＲ３上で複合体を形成して用いられた。
【図１５】 第１５図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイ
を示すもので、このＴＮＦは、下記のものと膀胱カルシ
ノーマ細胞系統５６３７上で複合体を形成して用いられ
た。
【図１６】 第１６図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイ
を示すもので、このＴＮＦは、下記のものと胸部カルシ
ノーマ細胞系統ＭＣＦ７上で複合体を形成して用いられ
た。
【図１７】 第１７図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイ
を示すもので、このＴＮＦは、下記のものと結腸カルシ
ノーマ細胞（colon carcinoma cell）系統Ｂ１０上で複
合体を形成して用いられた。
【図１８】 第１８図は、下記の抗体によるインビボ系
（in vivo）でのＴＮＦ媒介腫瘍退行効果を示すもので
ある。
【図１９】 第１９図は、対照モノクローン抗体、ＭＡ
ｂ３２、そしてＭＡｂ３２の一価ＦＡｂ’断片によるイ
ンビボ系でのＴＮＦ媒介腫瘍退行効果を示すものであ
る。
【図２０】 第２０図は、下記抗体によるＴＮＦ誘導腫
瘍退行の効果を示すものである。
【図２１】 第２１図は、アミノ酸長が１０個のオーバ
ーラップペプチドとＭＡｂ３２との反応性を示すもので
ある。
【図２２】 第２２図は、ＴＮＦ分子の三次元（３Ｄ）
構造を模式的に示すものである。
【図２３】 第２３図は、残基１-２０、５６-７７、１
０８-１２７、そして１３８-１４９からなる領域をトポ
グラフイック（立体的）に示したものである。
【図２４】 第２４図は、残基１-１８および１０８-１
２８からなる領域を立体的に示したものである。
【図２５】 第２５図は、残基５６-７９、１１０-１２
７および１３６-１５５からなる領域を立体的に示した
ものである。
【図２６】 第２６図は、残基１-２６、１１７-１２８
および１４１-１５３からなる領域を立体的に示したも
のである。
【図２７】 第２７図は、残基２２-４０、４９-９７、
１１０-１２７、そして１３６-１５３からなる領域を立
体的に示したものである。
【図２８】 第２８図は、残基１２-２２、３６-４５、
９６-１０５、そして１３２-１５７からなる領域を立体
的に示したものである。
【図２９】 第２９図は、残基１-２０および７６-９０
からなる領域を立体的に示したものである。
【図３０】 第３０図は、残基２２-４０、６９-９７、
１０５-１２８、そして１３５-１５５からなる領域を立
体的に示したものである。
【図３１】 第３１図は、残基２２-３１および１４６-
１５７からなる領域を立体的に示したものである。
【図３２】 第３２図は、残基４９-９８からなる領域
を立体的に示したものである。
【図３３】 第３３図は、残基２２-４０および７０-８
７からなる領域を立体的に示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アストン，ロジャー オーストラリア国 2120 エヌエスダブリ ュ ウェスト ペナント ヒルズ ハイ ロード 2430 ロット Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA43 CA04 DA02 EA04 GA05 GA11 GA18 HA03 HA08 HA12 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA05 DA13 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA75 DA76 EA28 EA50 FA72 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＴＮＦ−αに特異的に結合する蛋白質リ
    ガンドであって、ＴＮＦ−αへの結合に関して、モノク
    ローナル抗体Ｍａｂ１、５３、又は５４と競合するもの
    であり、ＴＮＦ−αへ結合すると、ＴＮＦ−αの内皮プ
    ロコアギュラント誘導の活性が阻害されることを特徴と
    する蛋白質リガンド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の蛋白質リガンドであっ
    て、ＴＮＦ−αの、ＴＮＦ−α受容体への結合を阻害す
    ることを特徴とする蛋白質リガンド。
  3. 【請求項３】 ＴＮＦ−αに特異的に結合する蛋白質リ
    ガンドであって、ＴＮＦ−αの残基４９−１０５内にあ
    る、ＴＮＦ−αの領域に結合するものであり、ＴＮＦ−
    αへ結合すると、ＴＮＦ−αの内皮プロコアギュラント
    誘導の活性を阻害することを特徴とする蛋白質リガン
    ド。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の蛋白質リガンドであっ
    て、ＴＮＦ−αの残基４９−９７内にある、ＴＮＦ−α
    の領域に結合することを特徴とする蛋白質リガンド。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の蛋白質リガンドであっ
    て、残基５６−７９、残基５８−６５、残基７６−９
    ０、残基９６−１０５、残基４９−９６、及び残基６９
    −９７からなる群より選択されるＴＮＦ−α残基内の、
    ＴＮＦ−αの領域に結合することを特徴とする蛋白質リ
    ガンド。
  6. 【請求項６】 請求項１乃至５のいずれか一項記載の蛋
    白質リガンドであって、該蛋白質リガンドは、抗体、Ｆ
    （ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（dAbs）再構成抗体、
    単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から
    選択されることを特徴とする蛋白質リガンド。
  7. 【請求項７】 請求項１乃至６のいずれか一項記載の蛋
    白質リガンドであって、モノクローナル抗体であること
    を特徴とする蛋白質リガンド。
  8. 【請求項８】 ＴＮＦ−αに特異的に結合できる蛋白質
    リガンドであって、モノクローナル抗体ＭＡｂ１、ＭＡ
    ｂ２５、ＭＡｂ５３、又はＭＡｂ５４により認識される
    エピトープに結合することを特徴とする蛋白質リガン
    ド。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の蛋白質リガンドであっ
    て、ＴＮＦ−αの、ＴＮＦ−α受容体への結合を阻害す
    ることを特徴とする蛋白質リガンド。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載の蛋白質リガンドであ
    って、ＴＮＦ−αへの結合が、ＴＮＦ−αの内皮プロコ
    アギュラント誘導の活性を阻害することを特徴とする蛋
    白質リガンド。
  11. 【請求項１１】 請求項８乃至１０のいずれか一項記載
    の蛋白質リガンドであって、該リガンドは、抗体、Ｆ
    （ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（dAbs）再構成抗体、
    単一鎖抗体、そして血清結合タンパク質からなる群から
    選択されることを特徴とするヒトＴＮＦ結合蛋白質リガ
    ンド。
  12. 【請求項１２】 請求項８乃至１１のいずれか一項記載
    の蛋白質リガンドであって、モノクローナル抗体である
    ことを特徴とする蛋白質リガンド。
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