ES2623653T3

ES2623653T3 - Anticuerpos anti-MIF

Info

Publication number: ES2623653T3
Application number: ES14163839.5T
Authority: ES
Inventors: Randolf Kerschbaumer; Friedrich Scheiflinger; Manfred Rieger; Michael Thiele; C. Geert Mudde; Jürgen Muellberg; Rene Hoet
Original assignee: Baxalta GmbH; Dyax Corp; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Dyax Corp; Baxalta Inc
Priority date: 2008-01-04
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: KR20160105943A; US20090220521A1; RU2010132647A; KR20100102197A; CN103724430B; ZA201004973B; IL206715A; CA2711029A1; RU2509777C2; AU2008346517B2; CN103724430A; SI2231707T1; BRPI0821682A2; ES2791333T3; US20150023978A1; JP2011510616A; WO2009086920A1; KR101654678B1; US8668909B2; NZ611117A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la región que se abarca los aa 50-68 o la región que abarca los aa 86-102 de MIF humano, e inhibe la función biológica de MIF humano, para su uso en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo.

Description

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bacterianos (por ejemplo, pBR322 y sus derivados) o vectores eucariotas. Aquellas secuencias que codifican para el anticuerpo pueden dotarse de secuencias reguladoras que regulan la replicación, la expresión y/o la secreción a partir de la célula huésped. Estas secuencias reguladoras comprenden, por ejemplo, promotores (por ejemplo, CMV

o SV40) y secuencias señal. Los vectores de expresión también pueden comprender marcadores de selección y amplificación, tales como el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa y timidina-cinasa. Los componentes de los vectores usados, tales como marcadores de selección, replicones, potenciadores, pueden o bien obtenerse comercialmente o bien prepararse por medio de métodos convencionales. Los vectores pueden construirse para la expresión en diversos cultivos celulares, por ejemplo, en células de mamífero tales como CHO, COS, HEK293, NSO, fibroblastos, células de insecto, levadura o bacterias tales como E. coli. En algunos casos, se usan células que permiten la glicosilación óptima de la proteína expresada.

El gen de cadena ligera del anticuerpo anti-MIF y el gen de cadena pesada del anticuerpo anti-MIF pueden insertarse en vectores separados o se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales, por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligamiento de extremos romos si no están presentes sitios de restricción.

La producción de anticuerpos anti-MIF o partes de unión a antígeno de los mismos puede incluir cualquier método conocido en la técnica para la introducción de ADN recombinante en células eucariotas mediante transfección, por ejemplo, mediante electroporación o microinyección. Por ejemplo, la expresión recombinante del anticuerpo anti-MIF puede conseguirse mediante la introducción de un plásmido de expresión que contiene la secuencia de ADN que codifica para el anticuerpo anti-MIF bajo el control de una o más secuencias reguladoras tales como un promotor fuerte, en una línea celular huésped adecuada mediante un método de transfección apropiado que da como resultado células que tienen las secuencias introducidas integradas de manera estable en el genoma. El método de lipofección es un ejemplo de un método de transfección que puede usarse según la presente invención.

La producción de anticuerpos anti-MIF también puede incluir cualquier método conocido en la técnica para el cultivo de dichas células transformadas, por ejemplo, de una manera continua o discontinua, y la expresión del anticuerpo anti-MIF, por ejemplo, constitutiva o tras la inducción.

El tipo de célula huésped según la presente invención puede ser cualquier célula eucariota. En una realización, la célula es una célula de mamífero con la capacidad para realizar modificaciones postraduccionales de anticuerpos anti-MIF. Por ejemplo, dicha célula de mamífero se deriva a partir de una línea celular de mamífero, tal como, por ejemplo, una línea celular seleccionada del grupo que consiste en células SkHep, CHO, HEK293 y BHK. En una realización, el anticuerpo anti-MIF se expresa en una línea celular CHO con déficit de DHFR, por ejemplo, DXB11, y la adición de G418 como un marcador de selección. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican para genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, se producen los anticuerpos cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células huésped. Pueden recuperarse anticuerpos anti-MIF a partir del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Adicionalmente, la producción de anticuerpos anti-MIF puede incluir cualquier método conocido en la técnica para la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de afinidad. En una realización, el anticuerpo anti-MIF puede purificarse a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de exclusión molecular.

Propiedades de anticuerpos anti-MIF

La invención se refiere a anticuerpos anti-MIF o a parte de unión a antígeno de los mismos, que presentan al menos una de las siguientes propiedades:

a) se unen a la región C-terminal o central de MIF humano,

b) inhiben la actividad de anulación de glucocorticoides (GCO),

c) inhiben la proliferación de líneas celulares tales como fibroblastos o células cancerosas (por ejemplo, NIH/3T3 o PC-3),

d) se unen a MIF activo,

e) no se unen a MIF no activo,

f) compiten con el anticuerpo anti-MIF III.D.9 de ratón.

En algunas realizaciones, MIF activo es una isoforma de MIF activo que se produce mediante el tratamiento de MIF

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humano con reactivos oxidantes leves, tales como cistina o mediante la inmovilización de MIF humano sobre un soporte tal como una placa de ELISA o perlas. En otras realizaciones, MIF activo es una isoforma de MIF activo que se produce in vivo tras la exposición de animales con bacterias. En otras realizaciones, MIF activo es una isoforma de MIF activo que se produce in vivo sobre la superficie de células (por ejemplo, THP1, CFB).

En algunas realizaciones, MIF no activo es MIF reducido (por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 7) o MIF almacenado intracelular.

En otras realizaciones, los anticuerpos anti-MIF o parte de unión a antígeno de los mismos se unen a MIF activo con una KD de menos de 500 nM.

Composiciones farmacéuticas de anticuerpos anti-MIF y métodos de tratamiento

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo anti-MIF o una parte de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de un sujeto que necesita tratamiento para estados relacionados con MIF, concretamente trastornos hiperproliferativos.

En algunas realizaciones, el sujeto que necesita tratamiento es un ser humano. Los trastornos hiperproliferativos, tales como enfermedades cancerosas, que pueden tratarse mediante los anticuerpos anti-MIF de la invención pueden implicar cualquier tejido u órgano e incluyen, pero no se limitan a, cánceres de cerebro, de pulmón, de células escamosas, de vejiga, gástrico, de páncreas, de mama, de cabeza, de cuello, de hígado, renal, de ovario, de próstata, colorrectal, de esófago, ginecológico, de nasofaringe o de tiroides, melanomas, linfomas, leucemias o mielomas múltiples. En particular, los anticuerpos anti-MIF de la invención son útiles para tratar carcinomas de mama, de próstata, de colon y de pulmón.

El tratamiento también puede implicar la administración de uno o más anticuerpos anti-MIF de la invención, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, solos o con un portador farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil de almacenamiento o eficacia del anticuerpo.

El anticuerpo anti-MIF de la invención y las composiciones farmacéuticas que lo comprenden pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen otros agentes antineoplásicos, antitumorales, antiangiogénicos, quimioterápicos o esteroides, dependiendo de la enfermedad que va a tratarse.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden estar en una variedad de formas, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como disoluciones líquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pastillas, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende de la aplicación terapéutica y el modo de administración previstos. Composiciones preferidas típicas están en forma de disoluciones inyectables o para infusión, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Tal como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

El anticuerpo anti-MIF puede administrarse una vez, pero más preferiblemente se administra múltiples veces. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse desde tres veces al día hasta una vez cada seis meses o más. La administración puede realizarse en un programa tal como de tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses.

La invención también abarca el uso de un anticuerpo anti-MIF o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos.

La invención abarca además un anticuerpo anti-MIF o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos.

Los anticuerpos anti-MIF o las partes de unión a antígeno de los mismos también pueden usarse para determinar el nivel de MIF en superficie celular en un tejido o en células derivadas a partir del tejido. En algunas realizaciones, el tejido es tejido enfermo. Entonces puede usarse el tejido en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, niveles de MIF total, niveles de MIF en superficie celular o ubicación de MIF.

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contiene el 10% de suero, anticuerpo 75 g/ml y 5 Ci/ml de 3H-timidina. Tras 16 horas incubación en un incubador de CO2 a 37ºC se lavan las células dos veces con 150 l de PBS fría por pocillo. Usando una pipeta de múltiples canales se añaden 150 l de una disolución de TCA al 5% (p/v) por pocillo y se incuban durante 30 minutos a 4ºC. Se lavan las placas con 150 l de PBS. A cada pocillo se le añaden 75 l de una disolución de NaOH 0,5 M con SDS al 0,5%, se mezclan y se almacenan a temperatura ambiente. Se miden las muestras en un contador  mezclando 5 ml de Ultima Gold (Packard) y 75 l de disolución de muestra. Se realiza cada determinación por triplicado y se comparan los valores con los valores del anticuerpo control mediante una prueba de la t. Se evalúan como positivos los anticuerpos que reducen significativamente la proliferación (P < 0,05). En la figura 8, columna 5, se resumen los resultados.

Ejemplo 4: Estudios de unión: Determinación de epítopos de anticuerpos anti-MIF

Se diluye cada péptido en tampón de acoplamiento para dar una concentración de péptido de normalmente 5 g/ml, se añade a microplacas (NUNC Immobilizer™ Amino Plate F96 Clear) y se incuban durante la noche a 4ºC (100 l/pocillo). Se usan MIF de longitud completa recombinante y PBS como controles. Se lava la placa 3 veces con 200 l de PBST y se añaden anticuerpos (4 g/ml en PBS) (100 l/pocillo) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Se lava la placa 3 veces con 200 l de PBST y se añade anticuerpo de detección (por ejemplo, anti-IgG humana específico de Fc/marcado con HRP, Sigma) (100 l/pocillo). Tras una incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave, se lava la placa 3 veces con 200 l de PBST. Se incuba cada pocillo con 100 l de disolución de TMB (T-0440, Sigma) durante 30 minutos en la oscuridad. Se detiene la reacción de tinción añadiendo 100 l de disolución de H2SO4 1,8 M por pocillo. Se miden las muestras a 450 nm.

Ejemplo 5: Competencia de anticuerpos anti-MIF humano con anticuerpo anti-MIF murino III.D.9

Se usa el anticuerpo Bax94 para la competencia con anticuerpos anti-MIF de ratón III.D.9. Se recubren placas de 96 pocillos (NUNC Maxisorp) con MIF humano recombinante. Se diluyen el anticuerpo anti-MIF murino II.D.9 y los anticuerpos anti-MIF humano en TBST/BSA al 2% y se mezclan, mientras que se mantiene la concentración final de

III.D.9 a 2 g/ml y se aumenta la concentración de anticuerpos anti-MIF humano desde 0 g/ml hasta normalmente 32 g/ml. Tras el lavado de la microplaca, se aplican los anticuerpos y se incuban a temperatura ambiente durante normalmente 2 horas. Tras el lavado, se incuba la placa con conjugado de anticuerpo anti-IgG de ratón (espec. de Fc) con peroxidasa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se incuba la placa con disolución de TMB y se detiene la reacción de tinción añadiendo disolución de H2SO4. El ajuste de la curva de competencia resultante permite el cálculo de la inhibición máxima de la unión a III.D.9. En la figura 8, columna 6, se resumen los resultados.

Ejemplo 6: Supervivencia aumentada de anticuerpos anti-MIF en el modelo en animal vivo de peritonitis por E. coli

Se llevan a cabo los experimentos según Calandra et al. (Nature Immunology, 2000) usando ratones NMRI hembra (25-30 g, 6-10 semanas de edad) a los que se les inyecta por vía intraperitoneal 6000 UFC de una suspensión de

E. coli 0111:B4 en mucina al 15% y hemoglobina al 4%. Se inoculan dos o tres colonias (E. coli 0111:B04) a partir de un cultivo en placa de agar de nutrientes en 10 ml de TSB y se incuban durante la noche a 36ºC con agitación. Se diluye el cultivo en solución salina fisiológica hasta la(s) concentración/concentraciones requerida(s), durante la noche el cultivo alcanza normalmente 2*109 UFC/ml, y se mezcla con mucina y hemoglobina (1 volumen de inóculo diluido, 2 volúmenes de mucina al 15%, 2 volúmenes de hemoglobina al 4%). Puesto que la mezcla de inóculo tiende a sedimentarse, se mezcla entre inyecciones. Se usa una aguja grande (por ejemplo, de calibre 23) para las inyecciones para evitar el bloqueo de la aguja por material particulado en la mezcla de inyección. Se administran por vía intraperitoneal anticuerpo Bax94 (IgG4) y un anticuerpo control de isotipo correspondiente 2 horas antes de la exposición bacteriana. La dosificación de anticuerpo es normalmente de 800 g/ratón y se usan 20 ratones para cada grupo. Pudo mostrarse un efecto estadísticamente significativo sobre la supervivencia/tiempo hasta la muerte para los isotipos IgG1 e IgG4 de anticuerpos anti-MIF humano. La figura 6 muestra los resultados obtenidos para el anticuerpo Bax94 y el anticuerpo Bax152 (IgG4). Se usan datos estadísticos de Kaplan-Meier para la evaluación de las curvas de supervivencia.

Ejemplo 7: Especificidad de unión para MIF activo

Los anticuerpos anti-MIF descritos en esta invención pueden distinguir entre MIF activo y no activo, que se generan mediante oxidación o reducción leve, respectivamente. Se valora la distinción entre estos confórmeros mediante ELISA o resonancia de plasmón superficial.

ELISA para la valoración de la unión diferencial de los anticuerpos:

 Transformación de MIF en su conformación activa mediante oxidación leve.

Se incuba MIF humano recombinante (0,5 mg/ml en PBS) durante 3 h a 37ºC con un exceso de 3 veces

(volumen) de una disolución saturada de L-cistina en PBS (L-cistina  0,4-0,5 mM). Entonces se dializa el MIF dos veces frente a PBS en un casete de diálisis Slide-A-Lyzer® con un punto de corte de peso molecular de 7 kDa (Pierce).

5  Transformación de MIF en su conformación no activa.

Se reduce MIF a una concentración de 0,5 mg/ml mediante incubación durante la noche con ditiotreitol 8-16 mM (concentración final) a 4ºC.

10  Protocolo de ELISA.

Se recubren los anticuerpos anti-MIF en microplacas de 96 pocillos (NUNC Maxisorp™) a una concentración de 5 g/ml (dilución en tampón de recubrimiento). Tras el lavado de la placa con TBST (solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1% (v/v)) y el bloqueo con TBST/BSA al 2% (TBST y albúmina sérica bovina al 2%

15 (p/v)), se añaden series de diluciones de MIF o bien activo o bien no activo y se incuban a temperatura ambiente durante 1-2 h. Se detecta MIF unido usando un anticuerpo anti-MIF de conejo policlonal y un anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con peroxidasa del rábano (Biorad). Se usa TBST/BSA al 2% para diluir MIF, el anticuerpo anti-MIF de conejo y el conjugado de peroxidasa para reducir la unión no específica. La figura 7 muestra los resultados de ELISA obtenidos con el anticuerpo Bax94.

20 Valoración de la unión diferencial de los anticuerpos por Biacore.

Se examina la cinética de unión de MIF activo y no activo al anticuerpo Bax94 mediante análisis de resonancia de plasmón superficial usando un sistema Biacore 3000. Por tanto, se inmovilizan 10000 unidades de respuesta 25 de Bax94 en un chip sensor con una matriz de CM5 (= dextrano carboximetilado) y se incuban con MIF activo o no activo, MIFhu en tampones redox de glutatión prorreductores y prooxidantes, que oscilan entre GSH 4,8 mM/GSSG 0,2 mM (GSSG = glutatión oxidado) y GSSG 5 mM en tampón HBS-EP (GE Healthcare). Como control, se usa MIF para el análisis de unión en una segunda célula de flujo que contiene un anticuerpo control de isotipo inmovilizado. Se extraen las unidades de respuesta de unión de anticuerpo control y anticuerpo Bax94

30 para la evaluación.

Ejemplo 8: Detección de MIF activo en la superficie de células THP-1

Se incuban células con el anticuerpo anti-MIF Bax94. Se lavan las células con PBS helada y se resuspenden en

35 tampón de lisis celular frío (Cell Signaling Technology®). Se bloquean perlas magnéticas de proteína G Dynabeads® (Invitrogen) con TBST + leche en polvo desnatada al 5% (p/v), se lavan y se añaden a las células lisadas. Se lleva a cabo inmunoprecipitación a 4ºC durante la noche. Entonces se lavan las perlas con tampón de lisis celular y TBST y se someten a ebullición en tampón de muestra de SDS-PAGE (sin agentes reductores). Se someten las muestras a SDS-PAGE no reductora para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

40 Ejemplo 9: Unión de anticuerpos anti-MIF a MIF unido a membrana

Se lavan células THP-1 con PBS helada y se resuspenden en tampón de tinción celular frío (Biolegend) complementado con IgG de ratón 200 g/ml. Se añaden anticuerpos anti-MIF marcados con FITC o TRITC para dar

45 una concentración final de normalmente 200-500 nM y se realiza la incubación a 4ºC. Se lavan posteriormente las células con tampón de tinción celular helado y se resuspenden en tampón de tinción celular complementado con la disolución de viabilidad celular Via-Probe™ (BD Biosciences). Se miden las células en un sistema de citometría de flujo FACS Canto™ II (BD Biosciences) y se compara la mediana del desplazamiento de FITC/TRITC de las poblaciones celulares viables con el anticuerpo control de isotipo marcado con colorante.

50 Ejemplo 10: Determinación de la afinidad de fragmentos Fab de anticuerpos anti-MIF mediante Biacore

Normalmente, se inmovilizan 40 unidades UR de MIF recombinante humano en un chip sensor con una matriz de CM5 (= dextrano carboximetilado) (Biacore). Se inyectan fragmentos Fab a un intervalo de concentración de

55 normalmente 6-100 nM diluidos en HBS-EP. Tras cada ciclo, se regenera el chip con NaOH 50 mM + NaCl 1 M. Se calculan las afinidades según el modelo de Langmuir 1:1. En la figura 8, columna 7, se resumen los resultados.

Ejemplo 11: Efecto beneficioso de anticuerpos anti-MIF en un modelo animal de glomerulonefritis semilunar

60 Se someten a prueba los anticuerpos anti-MIF en un modelo de rata de glomerulonefritis semilunar descrito por Frederick W. K. Tam et. al. (Nephrol Dial Transplant, 1999, 1658-1666). Se induce nefritis nefrotóxica en ratas Wistar Kyoto macho mediante una inyección intravenosa individual de suero de membrana basal glomerular anti-rata. En la configuración preventiva del experimento, se comienza el tratamiento con anticuerpos anti-MIF y un anticuerpo control de isotipo correspondiente en el momento de la inducción de nefritis (día 0) mediante inyección

65 intraperitoneal del anticuerpo. Normalmente se repite el tratamiento cada dos días y se sacrifican los animales en el

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día 7 para análisis histológicos. Se recoge orina antes del experimento (nivel inicial) y antes de la terminación del experimento (día 7). En una configuración terapéutica, se comienza el tratamiento con anticuerpo anti-MIF 4 días tras la inducción de la enfermedad y se repite cada dos días. Normalmente se sacrifican las ratas en el día 8. Se recoge orina antes del experimento (nivel inicial), antes del comienzo del tratamiento (día 4) y antes del sacrificio de los animales (día 8). La dosificación de anticuerpo es normalmente de 1-20 mg/kg por inyección y se usan de 6 a 8 ratas para cada grupo. Se determina la gravedad de la enfermedad midiendo proteinuria, infiltración de macrófagos en el glomérulo y daño histológico (formación semilunar). En un experimento preventivo, el tratamiento con anticuerpo anti-MIF Bax69 (10 mg/kg por dosis) durante 7 días da como resultado una reducción de proteinuria del 47% en comparación con animales tratados con anticuerpo control. El tratamiento de una enfermedad establecida (experimento terapéutico) da como resultado una reducción de proteinuria dependiente de la dosis del 16% (10 mg/kg de Bax69 por dosis) y del 34% (20 mg/kg de Bax69 por dosis) en comparación con animales tratados con anticuerpo control.

Ejemplo 12: Efecto beneficioso de anticuerpos anti-MIF en un modelo animal para colitis ulcerosa (transferencia adoptiva de células T vírgenes en ratones Rag-/-)

Se sacrificaron ratones C57BL/6 y se aíslan células CD45RBhi (células T vírgenes) mediante clasificación FACS de la población de células de bazo. Se inyectan i.p. células CD45RBhi (5 x 105) en ratones C57BL/6 Rag-/-(de 7-9 semanas de edad), que desarrollan colitis ulcerosa tras aproximadamente 2 semanas (de Jong et al., Nature immunology, 2001, 1061-1066). Se inyectan por vía intraperitoneal anticuerpos anti-MIF y el anticuerpo control de isotipo dos veces a la semana (1 mg/ratón/dosis). En una configuración preventiva, se comienza el tratamiento en el momento de la inyección de células T. En una configuración terapéutica, se comienza el tratamiento 4 semanas tras la inducción de la enfermedad. Se monitorizan los ratones semanalmente para determinar el peso y el desarrollo de la enfermedad. Normalmente ocho semanas tras la transferencia de células CD4CD45RBhi a receptores C57BL/6 Rag-/-, se calcula el índice de actividad de enfermedad (DAI) y se recogen secciones del colon para determinar la puntuación del índice de histología (HI). Se determinan el índice de actividad de la enfermedad (DAI) y el índice de histología (HI) al final del modelo animal (DAI se basa en cuatro parámetros: encorvamiento y debilitamiento (puntuado con 0 ó 1), engrosamiento del colon (0-3) y consistencia de las deposiciones (0-3)). En un experimento terapéutico, se usan anticuerpos anti-MIF Bax69 y BaxA10 para el tratamiento de una enfermedad establecida y se reduce significativamente el DAI medio en aproximadamente el 60% (Bax69) y aproximadamente el 40% (BaxA10) en comparación con ratones tratados con control de isotipo. Además, se reduce la puntuación de HI medio en aproximadamente el 33% tras el tratamiento con Bax69.

Ejemplo 13: Efecto beneficioso de anticuerpos anti-MIF en un modelo animal para colitis ulcerosa (modelo anti-CD40 agonista)

Este modelo se basa en la activación de macrófagos y células dendríticas mediante un anticuerpo anti-CD40 agonista, que induce una patología intestinal que se parece a EII en ratones Rag1-/-.

Se adquieren ratones Rag-1-/-de edad/sexo coincidentes (de 4-5 semanas) de Jackson Laboratories y se mantienen durante dos semanas antes del experimento en la instalación para animales. Se disuelven el anticuerpo monoclonal frente a CD40 agonista (FGK45, IgG2a) o IgG2a de rata control de isotipo en PBS a 1 mg/ml. A cinco grupos (cada grupo de 10 ratones) se les inyectan i.p. 200 g de anticuerpo monoclonal anti-CD40 agonista y de esos grupos se tratan cuatro con anticuerpos anti-MIF en el día 0 y el día 1 (2 x 1 mg/ratón). Al sexto grupo (10 ratones) sólo se le inyecta control de isotipo (IgG2a de rata, control sano). Se pesan los ratones durante los siguientes 7 días. En el día 7, se calculó el índice de actividad de enfermedad (DAI) y se recogieron secciones del colon para determinar la puntuación del índice de histología (HI). La puntuación de DAI se basa en: encorvamiento (0-1); debilitamiento (0-1), consistencia de las deposiciones (0-3) y engrosamiento del colon (0-3). La puntuación de histología se basó en grosor (0-3), elongación de criptas, inflamación (0-3) y absceso (0-1). El tratamiento con anticuerpos anti-MIF Bax94, BaxA10 y Bax69 reduce significativamente la puntuación de DAI (BaxA10: reducción del 48%; Bax94: reducción del 62%; Bax69: reducción del 73%) en comparación con ratones tratados con control de isotipo. Además, también se reducen las puntuaciones de HI medio mediante estos anticuerpos.

Ejemplo 14: Inhibición de crecimiento tumoral en ratones desnudos Mf1 por anticuerpos anti-MIF

Se recogen células de adenocarcinoma de próstata humanas (PC-3) a partir de cultivos en crecimiento exponencial y se mezclan con Matrigel con factor de crecimiento agotado. Se inoculan por vía subcutánea 2*106 células en 0,25 ml de Matrigel en el costado derecho de ratones desnudos Mf1. Se comienza el tratamiento con anticuerpo anti-MIF Bax94 y el control de isotipo C3 un día tras la inoculación (0,6 mg de anticuerpo/ratón/día) y se repite cada dos días. Normalmente se comienza la medición de los tamaños de los tumores dos semanas tras la inyección de células y se realiza cada dos días. Se calculan los volúmenes usando la fórmula V = 0,5*a*b2 (en la que “a” es el diámetro más largo y “b” es el diámetro más corto). Se reduce significativamente el crecimiento tumoral de ratones tratados con Bax94 y el volumen medio de los tumores analizados 28 días tras la inducción tumoral es 4,3 veces superior dentro del grupo tratado con control de isotipo en comparación con el grupo tratado con Bax94.

En una configuración terapéutica del experimento se comenzó el tratamiento con anticuerpos una semana tras el

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Claims

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